CAP. 1. GENETICA DROJD IILOR. METODE MODERNE DE [605243]

CAP. 1. GENETICA DROJD IILOR. METODE MODERNE DE
INVESTIGA ȚIE A GENOMULUI DROJDIILOR

1.1 ASPECTE GENERALE DE GENETIC Ă A DROJDIILOR

Drojdiile au ocupat întotdeauna un loc important în istoria omenirii, datorit ă utilizării lor
în producerea pâinii, a berii și a vinului. Începând îns ă din secolul al XIX-lea, odat ă cu cercet ările
întreprinse de L. Pasteur, drojdiile au devenit subiectul a numeroase studii științifice, care au
permis atât elucidarea u nor aspecte de biologie și, mai târziu, genetic ă a celulei eucariote, cât și
ameliorarea unor procedee industriale și biotehnologice.
Primele observa ții privind ciclul de via ță al drojdiilor au fost f ăcute chiar la începutul
secolului XX, cunoscând de atunci o permanentă dezvoltare. Ele prezint ă un interes deosebit mai
ales în înțelegerea reglajului diviziunii celulare, care es te strâns legat de procesele de recombinare
intercromozomale si de mecanismele de repara re a materialului genetic afectat de diver și factori
mutageni.
Descoperirea și izolarea primelor secven țe cromozomale (originea replic ării – ARS,
centromeri – CEN , telomere – TEL) dateaz ă din jurul anilor 1980, în pr ezent, cel mai bine studiate
fiind cele de la Saccharomyces cerevisiae . Pe lângă implicarea lor în replicarea ADN ( ARS), în
desfășurarea diviziunii celulare (CEN ) și în menținerea cromozomilor ( TEL), aceste secven țe și-
au găsit o aplicabilitate practic ă în construirea de vectori folosi ți p entru clonarea, exprimarea și
chiar secre ția unor compu și heterologi de interes biotehnologic sau profilactic. În acest sens, un
aport deosebit l-a avut și descoperirea în unele tulpini de drojii, a plasmidei 2 m, o
macromolecul ă de ADN ce prezint ă mecanisme de replicare și reglaj independente de materialul
genetic cromozomal.
Studiul genomului nuclear a fost completat cu stabilirea metodelor de determinare a
conținutului în baze azotate al ADN ș i cu apari ția, în 1984, a primelor tehnici de
electrocariotipare. Acestea din urm ă, permit separarea prin electroforez ă a cromozomilor întregi
de drojdie sub influen ța unui câmp electric pulsator și studiul relativ u șor al complementului
cromozomal prin analiza gelurilor astfel ob ținute.
Genomul extracromozomal al drojdiilor este reprezentat, în afar ă de plasmida 2 m, de
sistemul killer si de ADN mitocondrial. Sistemul killer a fost descris pentru prima dat ă în 1963,
ca fiind determinat de existen ța în citoplasm ă a unor particule de tip viral ce determin ă sinteza
unor toxine care, eliminate în mediu pot determ ina moartea celulelor se nsibile. Caracterizarea
acestor particule a însemnat un pas important în în țelegerea interac țiilor dintre speciile de drojdii
din cuvele de fermenta ție din industria berii și vinului.

Elucidarea structurii ADN mitocondrial și studiul mutaț iilor care pot afecta diferite gene
mitocondriale, au permis acumularea de da te referitoare la pr ocesele de respira ție celular ă și la
diverse căi metabolice specifice.
În concluzie, se poate spune c ă o caracterizare genetic ă complex ă a drojdiilor, cuprinde
date privind morfologia și ciclul de via ță și analize asupra structurii fi ne a genomului lor nuclear
și extranuclear.
Studiul genomului nuclear cuprinde date despre:
– structura secven țelor origini ale replic ării ORI sau ARS ( Autonomously Replicating
Seaquences = secven țe de replicare autonom ă), a centromerilor ( CEN ) și a telomerilor
(TEL);
– conținutul în baze azotate
– cariotipul – num ărul, dimensiunea și polimorfismul cromozomilor.
Studiul genomului extranuclear se referă la:
– genomul mitocondrial;
– profilul plasmidial (prezen ța plasmidei 2 m sau 2 m – like);
– sistemul killer.

1. 1. 1. Ciclul de via ță.
Primele studii privind ciclul de via ță al drojdiilor dateaz ă de la începutul secolului XX și
au dus la eviden țierea unei alternan țe între faza haploid ă și diploidă, pentru specii apar ținând
genului Saccharomyces . Cercetă ri ulterioare au relevat faptul c ă, în timp ce unele specii pot
prezenta ambele faze, altele exist ă în natură numai sub una dintre aceste forme, cealalt ă putând fi
indusă prin modificarea anumitor caract eristici ale mediului de cre ștere.
La marea majoritate a drojdiilor apari ția de noi celule este rezultatul procesului de
înmugurire multilateral ă, un tip de diviziune celulară în care mugurii apar pe o suprafa ță mare a
celulei. Acest tip este în cont rast cu înmugurirea bipolar ă – în care mugurii apar numai la polii
celulei. Alte specii prezint ă înmugurire unipolar ă (mugurii apar numai la un pol al celulei).
Drojdiile genului Schizosaccharomyces difer ă de alte tipuri de drojdii deoarece se divid exclusiv
prin fisiune, proces reprezentat de apari ția unui perete celular aproximativ în centrul celulei,
împărțind-o pe aceasta în două părți. În contrast cu înmugurirea, cel ulele care se divid prin fisiune
prezintă o constric ție slabă sau nu prezint ă de loc constric ție la nivelul peretelui celular nou
format.
În afar ă de formarea de celule noi prin înmugurir e sau fisiune, unele specii pot dezvolta
hife sau pseudohife. Hife le se caracterizeaz ă prin lipsa constric țiilor la nive lul pereților

despărțitori, spre deosebire de pseudohife care prezint ă pereți despărțitori, formându-se prin
înmugurire.
Drojdiile se pot reproduce “sexuat”, cu formare de ascospori, pot forma teliospori sau
bazidiospori. Ascosporii prezint ă forme variate și aspecte diferite a suprafe ței observate la
microscop. Cea mai întâlnit ă formă este cea de p ălărie, dar mai pot avea și forme sferice, ovale,
alungite, elipsoidale, cu pliuri pe suprafa ță. Bazidiosporii pot apare din teliospori sau din hife și
au formă elipsoidal ă sau alungit ă.
Speciile de drojdii care se reproduc “sexuat” prezint ă celule 2 de tipuri de împerechere
opuse. La S. cerevisiae , tipurile de împerechere s unt determinate de prezen ța uneia dintre cele 2
gene alele a sau , plasate la nivelul locului MAT (mating type): MAT a și, respectiv, MAT , pe
brațul drept al cromozomului III. Prezen ța genelor determin ă sinteza și secreția în mediu a unor
proteine, denumite factori de împerechere , care sunt recunoscute de celulele tipului opus de
împerechere, declan șând o serie de evenimente care duc în final la formarea de diploizi MAT a/
MAT .
Unele tulpini de drojdii prezint ă o genă HO care codific ă o endonucleaz ă care produce o
breșă monocatenar ă la nivelul locusurilor de împerechere MAT , producând interconversia
locusului de împerechere , adică schimbarea tipului de împerechere al celulelor în cel de tip opus
(pentru S. cerevisiae, celulele de tip a devin  și invers). Astfel de tulpini se numesc homotalice.
Tulpinile care prezint ă alela nefunc țională ho, nu manifest ă procesul de interconversie și se
numesc tulpini heterotalice .

1. 1. 2. Analiza genomului nuclear
(A) Secvenț ele ARS, CEN și TEL
Secvențele ARS au fost descrise pentru prima dat ă în 1979 la S. cerevisiae, sunt circa 400
secvențe /genom și se succed la fiecare 30 – 40 kpb. La nivelul lor începe replicarea ADN din
cromozomi.
O secven ță ARS este constituit ă din 2 domenii (Fig. 1):
(1) domeniul A – format din 11 pb, cu secven ță relativ înalt conservat ă la toate speciile de drojdii
(ACS – ARS consensus seaquence) și procent de A/T ridicat (73- 82%):
5' (A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T) 3'
La nivelul acestei secven țe se leagă un complex format din 6 proteine ( ORC – origin of
replication complex) de tip helicaze și ATP-aze, implicate în procesele de ini țiere a replic ării
ADN.
Mutațiile de la nivelul acestei regiuni duc la blocarea replică rii ADN.
(2) domeniul B – este constituit din 3 subdomenii:

B11 – se leagă de complexul ORC , odată cu domeniul A
B21 – cu rol structural
B31 – este situs de legare pentru proteina Abf1p
Domeniul B are func ție dublă: (i) asigură modificarea conformaț ională a ADN (plierea) la
acest nivel, anterior leg ării complexului ORC, facilitând astfel ac țiunea ulterioar ă a acestuia; ( ii)
prin asocierea cu proteina Abf1p, împiedic ă asamblarea ADN de la nivelul secvenț ei ARS în
structuri nucleozomale, ceea ce îl face accesibil interac țiunii cu proteinele necesare replic ării.
Deleția domeniului B duce la anularea func ției secven ței ARS.

Fig. 1. Structura secven ței ARS la drojdii

Secvențele CEN
Clarke și Carbon (1980) au izolat prima secven ța centromeric ă din cromozomul III de la
S. cerevisiae. Importan ța deosebit ă a centromerilor rezid ă în faptul că la nivelul lor se formeaz ă
kinetocorii la care se ata șează fibrele fusului nuclear de diviziune.
Secvențele CEN au aproximativ 120 pb, fiind plasat e în interiorul unei regiuni mai mari
de 250 pb, cu rezisten ță cerscută la atacul nucleazelor. Nucleozomii de la acest nivel au o
structură ușor modificată față de restul fibrei de cromatin ă, prezentând o histonă Cse4p, care
interacționează cu histona H4.
Secvențele CEN sunt formate din 2 regiuni înalt omoloage ( CDE I și CDE III ) care
flancheaz ă o regiune unic ă (CDE II ), fiecare dintre acestea interacț ionând cu una sau mai multe
proteine (Fig. 2).

Fig. 2. Structura secven ței CEN la drojdii

Regiune CEN Dimensiune Proteină ataș ată Observații
CDE I 9 pb CBF1 (dimer) Mutațiile de
blochează funla acest nivel reduc, dar nu
cția CEN
CDE II 78 – 86 pb
st nivel reduc, dar nu Cse4, Mif2 Secvență de baze conservat ă la toate speciile
de drojdie
Conținut – 90% A/T
Mutațiile de la ace
blochează funcția CEN
CDE III 11 pb CBF 3 (tetramer:
3A, 3B, 3C, 3D) Mutațiile punctiforme de la acest nivel
inactiveaz ă funcționarea CEN
Proteina CBF 3 asigur ă asocierea cu fusul de
diviziune și este implicat ă în deplasarea
cromozomilor în cursul diviziunii celulare.

Trebuie subliniat faptul ca CDE I și CDE III pot prezenta varia ții ale secven ței de baze
azo
TCCGAAA

Secvențel e TELtate, pe când CDE II este conservată la toa
te drojdiile :
CDE I: A/G TCAC A/G TG
CDE III: TGTTT T/C TGNTT

zintă terminațiile cromozomilor și sunt extensii lineare, monocatenare
ale mo
rele sunt formate din secven țe repetate în tandem de 5 – 8 pb, cu grad
înalt de
EL sunt înrudite cu cele de la ciliatul Tetrahymena , fiind formate
din sec
sau T (G) 1-3(TG) 1-6
TT
ângă aceste termina ții de ADN monocatenar, în structur a telomerelor la drojdii, intr ă
și 2 reg
nucleosom
i în care histonele sunt hiperacetilate. Telom
erele repre
leculelor de ADN din care sunt constitui ți aceștia. Ele au rolul de a proteja capetele
cromozomilor împotriva recombin ării, fuziunii cu al ți cromozomi sau a degrad ării lor de c ătre
nucleaze. De asemenea, joac ă un rol important în determinarea num ărului de runde de replicare
pentru o celul ă normală.
În general, telome
similitudine chiar între eucariote îndep ărtate și deci, relativ puternic conservate în cursul
evoluției. Între genuri ș i specii diferite apar însă variații în ceea ce prive ște structura secven țelor
și, mai ales, dimensiunile lor.
La drojdii, secven țele T
vențe T(G) 1-3 repetate de un num ăr variabil de ori:
Saccharomyces cerevisiae TGTGGGTGTGGTG
Candida glabrata
GGGGTCTGGGTGCTG
Candida albicans GGTGTACGGATGTCTAACTTC
Kluyveromyces lactis GGTGTACGGATTTGATTAGGTATGT

Pe l
iuni subtelomerice notate Y' și X (Fig.3), formate din ADN dublucatenar constituit din
secvențe repetate C 1-3 A/TG 1−3, împachetate în structuri denumite telosomi , care sunt de fapt

Regiunea Y' este plasată în imediata vecină tate a telomerelor, spre cap ătul
cromozomilor, având o dimensiune de 5,2 – 6,7 kpb. Ea poate exista în 0 – 4 copii / telomer.
Regiun
țe mici repetitive cu dimensiuni de 35 – 560
pb.
area ADN dublucatenar crom ozomal la acest nivel. ea Y' se poate „ muta” de pe un cromozom pe al tul în timpul diviziunii celulare mitotice
sau meiotice, prin recombinare mediat ă de RAD52.
Regiunea X se găsește spre interiorul crom ozomului, spre centromer și are o dimensiune
variabilă: 0,3 – 3,75 kpb, fiind compus ă din 5 secven
În interiorul celor dou ă regiuni Y' și X, au fost identificate secven țe ARS cu rol în
replic

Fig. 3. Structura secven ței TEL la drojdii
Dimensiunea și func ne nucleare:
– TEL1 și TEL2 – controleaz ă lungimea telemorelor;
azei;
ferit de cel obi șnuit de replicare
e, telomeraz ă, care utilizează
secvenț
tion Effect), datorat
mple
Determinarea conminutului în baze azotate reprezintă , la ora actu
ală, o caracteristic ă
ate, pentru fiecare spec ie de drojdie studiat ă fiind
stabilitețiile
asociate telomerelor sunt reglate de ge
– PIF1 – ADN helicaz ă care inhib ă replicarea necontrolat ă a telomerelor;
– EST1 – codific ă polimeraza din componen ța telomer
– TLC1 – determin ă sinteza ARN din structura telomerazei .
Replicarea telomerelor se realizeaz ă după un mecanism di
a ADN dublucatenar, implicând ac țiunea unei ribonucleoprotein
a repetitiv ă monocatenar ă TG ca matri ță în sinteza catenei pereche.
Telomerele au capacitatea de a represa transcrierea genelor plasate în vecin ătatea
telomerelor, fenomen numit „efect de pozi ție” (TPE – Telomere Posi
co xării histonelor cu proteine Rap1, Sir3 și Sir4. Fenomenul este metastabil, adic ă, într-o
populație de celule, o gen ă telomer-linkat ă este transcris ă în unele celule, iar în altele nu. Cu toate
acestea, gen
ele implicate în metabolismul anumitor zaharuri ( SUC – sucroză , MAL – maltoz ă,
MEL – melibioz ă), se gă sesc plasate preferen țial în apropierea telomerelor.

(B) Conț inutul în baze azotate a ADN
me
nționată în toate determinatoarele de specialit
procentele între care variaz ă aceste valori. De regulă , datele se refer ă la procentul molar
de guanin ă și citozină al ADN, notat mol % GC . S-a constatat ca, în general, procentul GC al

drojdiilor ascomicete este de apr oximativ 30 – 50% în timp ce la dr ojdiile basidiomicete este de
50 – 70%. Exceptând zona îngusta a valorilor de 48 – 52% unde apar unele suprapuneri, clasa
drojdiilor imperfecte poate fi determinat ă satisfăcător prin calcular ea procentului GC.
Estimarea con ținutului în G+C al moleculelor de ADN se poate realiza prin metode
directe și indirecte:

ADN cu ob ținerea unui amestec de nucleotide din care se determin ă, de fapt,
ă și citozină din molecul ă, densitatea unei molecule de ADN
lor azotate
guanina
vent utilizat ă, fiind simpl ă și cu un grad înalt de
rbția ADN dubl
u ► Metode directe – tehnica HPLC (“ high performance liquid chromatography ”); s
e
bazează pe hidroliza
procentul tuturor bazelor azotate;
► Metode indirecte – se bazeaz ă pe faptul c ă proprietățile fizice ale ADN sunt puternic
influențate de con ținutul în guanin
este cu atât mai mare cu cât con ținutul său în guanin ă și citozină este mai ridicat existând o rela ție
lineară între densitatea de plutire a diferitelor tipuri de ADN și conținutul lor în G+C.
Conținutul G+C se poate determina indirect, prin tehnica densit ății de plutire a ADN
(“buoyant density ”) – densitatea ADN dublu-catenar cre ște linear cu proporț ia baze
și citozina; substratul chimic al acestei rela ții constă în existen ța a trei pun ți de hidrogen
între perech
ile de baze G-C, care devin astfel mai compacte și mai dense decât pe rechile de baze
A-T, unite doar prin dou ă punț i de hidrogen.
Metoda care permite aprecierea con ținutului în G+C prin determinarea “ temperaturii de
topire ” – Tm a ADN este îns ă cel mai frec
reproductibilitate. Tm ( melting midpoint) reprezint ă temperatura în grade Celsius la care, dintr-o
masă de molecule ADN, jum ătate din ele se g ăsesc în stare dublu catenar ă și jumătate în stare
monocatenar ă (sunt denaturate), respectiv temperatura de ech ilibru între ADN dublucatenar
(ADNdc) și ADN monocatenar (ADNmc). Termenul de topire (melting) este utilizat deoarece
încălzirea furnizeaz ă energia necesar ă ruperii leg ăturilor de hidrogen. Denaturarea începe în
regiunile bogate în A-T ș i continuă progresiv în cele cu con ținut crescut în G+C, astfel încât
valorile Tm depind direct de acesta; ele cresc propor țional cu mol % GC, datorit ă cantității mai
mari de energie necesar ă pentru a desface cele trei leg ături de hidrogen dintre guanin ă și citozină,
spre deosebire de perechea A-T, care prezint ă numai dou ă legă turi de hidrogen.
Bazele purinice și pirimidinice din structura ADN absorb radia țiile UV cu =260nm ,
lungime de und ă care este folosit ă pentru determinarea cantitativ ă a ADN. Abso
catenar nativ la 260nm este mai mic ă decât absorb ția mononucleotidelor sale componente,
fenomenul fiind denumit efect hipocromic și se datoreaz ă interactiunilor electronice dintre bazele
azotate “stivuite” din structura dublu-helical ă a ADN nativ, fapt ce diminueaz ă cantitatea de
lumină pe care o poate absorbi fiecare baz ă. Dacă ADN dublu catenar nativ este supus denatur ării
termice se produce o cre ștere a absorb ției luminii la 260nm de circa 40% în func ție de tipul de

ADN, fenomen cunoscut sub denumirea de efect hipercromic . Acest efect cre ște cu conținutul în
A-T, iar temperatura de topire cu con ținutul în G+C.
Prin înc ălzirea la temperaturi cuprinse între 60-1000
și se separ ă în molecule m
onocatenare. C moleculele de ADN sufer ă o rupere
a legăturilor de hidrogen ce leag ă bazele azotate
Dinamica procesului de denaturare termic ă este urmarită prin efectul hipercromic – creșterea
capacității de absorb ție a radia țiilor UV, la lungimea de und ă de 260nm și care are loc în timpul
denaturării. Valorile absorban ței la 260nm (A 260) se înscriu în grafic, rezultând curba de shift
hipercromic (Fig. 4 a ; b)

(a)

(b)

Fig. 4. Aspectul general al curbei de shif t hipercromic pentru tulpin i de drojdii izolate din medii
poluate cu com u și petrolieri
(a – Rhodotorula glutinis ; – Candida parapsilosis )

În funcție de e relații matematice.
entru drojdii se folosesc cele stabilite de Owen (1985) și Frank (1971):
(C) St
pariția și dezvoltarea tehnicilor electroforetice sp eciale care permit se pararea în stare
in caracterizarea setu rilor de cromozomi
aparț inân
p
b
Tm se poate exprima mo l % GC, folosind numeroas
P
% mol G+C = 2.08 x Tm – 106,4 ( dup ă Owen, 1985 )
% mol G+C = 2.44 x (Tm – 53.9) ( dup ă Frank, 1971)

ructura cariotipului ; electrocariotiparea.
A
tactă a moleculelor de ADN cromosomal au facut posibil ă
d unor eucariote inferioare (protozoare și fungi) care, de altfel, prezint ă dificultăți în
aplicarea analizelor clasice citogenetice și genetice. Astfel, în cazul drojdiei Saccharomyces
cerevisiae, analiza grupelor de linkage era, pân ă nu de mult, singura metod ă de numărare și
diferențiere între cromozomi. Prin cartare genetic ă s-a stabilit existen ța a 16 cromosomi cu o
dimensiune medie cuprins ă între 500 – 1000 kpb. Dimensiunile reduse și lipsa diferenț ierii
cromozomilor în timpul mitozei și meiozei, au constituit un impediment în realizarea cariotipului la
drojdii prin metode clasice aplicabile la celelalte eucariote.

Ideea utiliz ării unei separ ări electroforetice în stare intact ă a moleculelor de ADN
cromozomale ca alternativ ă la cariotiparea prin metode cl asice a fost mult timp vehiculat ă, dar acest
lucru a f
i
izărilor moleculare de tip Southern blott cu
sonde m
gth polymorphis
m
– CLP),
riginal a fost utilizate de Schwartz și Cantor (1984) pentru orice sistem
de elec
a moleculelor de ADN; (3) rezolu ția benzilor
electroforetice; (4) suprafa ța de gel care permite o bun ă separare (Tab. 1). ost posibil numai în 1982 când Schwartz și co
lab. au reu șit construirea unui nou sistem de
electroforez ă și au arătat că mobilitățile electrice ale moleculelor de ADN de câteva sute de kpb
sunt strâns dependente de dimensiunile lor când sunt supuse migr ării în geluri de agaroz ă în
prezența a 2 câmpuri electrice alternative. Apari ția electroforezei în câmp electric pulsator
(pulsed field gel electrophoresis – PFGE) și modificările ulterioare aduse de al ți cercetători acestei
tehnici au creat premisele unei noi abord ări a studiului cromozomilor de drojdii. Tehnica PFGE
permite separarea moleculelor de ADN cu dimens iuni cuprinse între 50 – 10 000 kpb (10 Mb).
Câmpurile electrice pulsatorii sunt aplicate în diferite direc ții. Tehnica este optim ă pentru separarea
cromozomilor de S. cerevisiae care au de la 200 kb la 3 Mb. Tehnica a mai fost aplicat ă cu succes și
la specii apar ținând genurilor Schizosaccharomyces , Torulaspora, Kluyveromyces,
Zygosaccharomyces, Hanseniaspora, Candida.
Pentru speciile de drojdii care nu prezint ă ciclu sexuat șpentru care nu pot fi realizate în
laborator experimente de încruci șări, realizarea hibrid
arcate corespunz ătoare unor gene markeri pentru fiecare cromozom în parte (cromozomi
separați prin PFGE) a permis stabi lirea grupelor de linkage. De asemenea, combinarea tehnicii
PFGE cu restric ția cro mosomilor separa ți electroforetic a permis realizarea h ărților genetice .
Tehnica PFGE are o larg ă utilizare și în construirea sau definirea unor biblioteci de cromozomi
cu rol în clonarea genelor și în cartare. În acest sens, în ultimii ani cea mai important ă utilizare a
PFGE a fost izolarea secven țelor genomice mari inserate în vectorii de tip YAC.
Posibilitatea separ ării intacte a cromosomilor a relevat faptul c ă majoritatea speciilor sunt
caracterizate de un polimorfism de lungime al cromozomilor (chromosome len
proces datorat rearanjamentelor cromozomale din timpul mitozei și meiozei sau care apar
ca urmare a unor muta ții.
Termenul de PFGE r ămane însă confuz din cauza num ărului mare de acronime utilizate în
cursul anilor. Termenul o
troforeză care utilizeaz ă câmpuri electrice alternative. Ulte rior au fost atribuite diferite
denumiri unor sisteme PFGE care implic ă variaț ii ale geometriei electrozilor, omogenit ății și
reorientării câmpului electric. Marea ma joritate a acestor nume sunt utilizate pentru a descrie un
anumit tip de design al aparatului (geometr ia electrozilor, circuitul electric, etc) și nu un anumit
mecanism de separare a moleculelor de ADN.
Diferenț ele majore dintre aceste sisteme se refer ă la: (1) posibilitatea ob ținerii de benzi
electroforetice clare; (2) viteza de separare

Toate tehnicile PFGE pot fi utilizate pentru separarea moleculelor de ADN de până la 1
Mb ; tehnicile difer ă însă prin gradul de dependen ță a mobilit ății moleculelor func ție de masa lor,
prin claritatea și gradul de curbur ă a benzilor electroforeti ce rezultate în final.

Acronim Sistem de electroforez ă Referințe
PFGE Pulsed field gradient gel electrophoresis Schwartz și Cantor (1984)
OFAGE Orthogonal field alternating gel Carle și Olson (198
electrophoresis 4)
TAFE Transverse alternating ge l electrophoresis Gardiner și colab. (1986)
FIGE Field inversion gel electrophoresis Carle și colab. (1986)
CHEF Contour clamped homogenous el
field ectric Chu ș i colab. (1986)
RGE Rotating gel electrophoresis Cross-filed gel electrophoresis Serwer (1987)
7) Southern și colab. (198
Rotaphor Rotating electrodes gel electrophoresis Biometra
Waltzer ) Cross field gel electrophoresis Anand și colab. (1989
PACE controlled 1988) Programmable autonomouslyelectrodes Clark și colab. (
ZIFE Zero integrated field electrophoresis Turmel și colb. (1990)
ST/RIDE Simultaneous tangential/ rectangular inversion decussate electrophoresis Kolble și Sim (1991)
Tab. 1. Acronime pentru sisteme PFGE (
aram
S e t extrem ii ale diferi ților
parametrii, cum su u câmp (înainte /
invers ozei, compoziț ia și concentra ția tamponului după Birren, 1993)
P etrii care afecteaz ă sistemele PFGE
istemele de lectroforez ă speciale de tip PFGE sun de sensibile la varia ț
nt: schimbarea timpului de migrare într-o anumit ă direcție sa
– forward / reverse), tipul și concentra ția agar
de electroforez ă (Tab. 2).
Parametrii controla ți în
gelul de electroforez ă Condițiile de migrare Caracteristicile probelor
Unghiul de reorientare
Omogenitatea campului electrIntervalul de schimbare a Concentra ția ADN
ic directiei de migrare
Tipul de agaroz ă Concentra ția sărurilor
Gradientul de voltaj
Temperatura
Concentra ția tamponului de
electroforez ă Contaminarea cu proteine
Tab. 2. Factorii care influ obilitatea p E
*Modificările acestor para atât viteza de separare a moleculelor de ADN cât ș i
intervalul de dimensiuni ale acesto ă tehnica respectiv ă.

unei
nor benzi electroforetice cu o rezolu ție cât mai mare. În acest scop sunt luate în considera ție
informaențează rez oluția și m robelor* în sistemele PFG
metrii influen țează
ra pentru care poate fi aplicat
Optim
izarea parametrilor de electroforez ă în teniciile PFGE, urm ărește asigurarea
bune separ ări a moleculelor de ADN cromozomal de diferite dimensiuni, precum și obținerea
u
țiile referitoare la :

Gradientul de voltaj – reprezint ă diferența dintre poten țialele electrice ale electrozilor din
sistemul de electroforez ă. Aceasta este de fapt for ța care determin ă migrarea moleculelor de ADN
în gel.
nțează atât
viteza d
a probelor în prezen ța diferitelor
tampoa
cis,
importa
ne cu tărie ionică slabă. Un câmp electric de 10 V/cm,
sau ma
Se exprim ă în volți/ cm de gel. Alegerea unui anumit voltaj este critic ă pentru scala de
dimensiuni ale moleculelor de ADN care pot fi izolate și influențează viteza de migrare a
probelor. Pentru a ob ține rezolu ții comparabile în geluri care au aplicate voltaje diferite, trebuie
schimbate atât timpul de migrare cât și intervalul de schimbare a sensului de migrare.
Gelul de agaroz ă este ob ținut prin utilizarea u nui tip special de agaroz ă (Agarose for
Pulsed Field Electrophoresis R unning Gel – SIGMA). Concentra ția agarozei influe
e separare a moleculelor cât și scala de dimensiuni a moleculelor ce pot fi separate prin
electrocarotipare. Astfel, concentra ții mari ale agarozei duc la sc ăderea mobilit ății moleculelor,
dar fără un efect clar asupra pattern-ului de separare a acestora. De fapt, rezolu ția benzilor este
bună în cazul folosirii unei agaroze cu dimens iuni ale porilor de ci rca 120 nm (concentra ție 1%).
Descreșterea concentra ției agarozei este asociat ă cu : viteza de migrare mai mare ; separarea unor
molecule de dimensiuni mai mari ; benzile din ge l sunt mai difuze. Astfel, pentru separarea unor
molecule de circa 1-2500 kb, se folose ște agaroză de concentraț ie 1%, iar pentru dimensiuni mai
mari ale ADN se fole ște agaroză de concentra ție 0.7 – 0.8%.
Tamponul de electroforez ă. Mobilitatea și rezo
luția probelor de ADN sunt influen țate de
tamponul de electroforez ă. Deși diferența între mobilitate
ne folosite (Tris-acetat sau Tris-b orat) este de numai circa 20%, aceast ă diferență este
semnificativ ă în cazul separ ării moleculelor de ADN mai mari de 2 Mb. Viteza de migrare a
ADN este cu 25% mai mare în tampoane cu t ărie ionică mai mică – TBE 0.5X sau TAE 0.5X.
Forma câmpului electric. Unghiurile de reorientare. Se pare c ă unele aspecte legate de
forma câmpului electric sunt critice pentru reuș ita tehnicilor de electrocariotipare. Mai pre
nte sunt unghiurile formate între cele 2 câmpuri elect rice aplicate. Ob ținerea unei rezolu ții
bune presupune reorientarea unghi urilor de migrare cu peste 100 %. Sistemele standard sunt
proiectate pentru un unghi de 120o. Noile sisteme comercializate au posibilitate de varia ție a
unghiului de reorientare. Unghiur ile de reorientare mici (106o) permit separarea mai rapid ă a
moleculelor de ADN mai mari de 2 Mb.
Timpul de puls. În experimentele de el ectrocariotipare, moleculele de ADN migreaz ă în
geluri de agaroză în prezen ța unor tampoa
i puțin, este aplicat alternativ în dou ă direcț ii. Pentru a migra în gel, moleculele de ADN
trebuie să-și schimbe direc ția de miș care ca ră spuns la schimbarea direc ției câmpului electric.
Separarea moleculelor se datoreaz ă faptului c ă timpul necesar schimb ării direcției de migrare
depinde de m ărimea moleculelor de ADN. De cele ma i multe ori, timpul necesar reorient ării
moleculelor cre ște odată cu dimensiunea lor. Ca urmare, un parametru cheie în sistemele PFG îl

constituie timpul de puls – care reprezint ă timpul pentru care câmpul el ectric este aplicat într-o
anumită direcț ie înainte ca aceasta s ă fie schimbată .
În general, dimensiunea maxim ă a moleculelor de ADN care pot fi izolate depinde de
timpul de puls. Astfel, acesta variaz ă de la 0.1 sec pentru separarea de molecule cu dimensiuni
mai mici de 100 kb, pân ă la 1000 sec sau mai mult pentru molecule de circa 10 Mb.

Tipuri de tehnici PFGE
 Tehnica OFAGE (ortogonal field alternat ion gel electrophoresis) introdusă de Carle
și Olson rechi de electrozi astfel plasa ți încât produc câmpuri electrice în
diagonal
p mai mare (aproape
dublu) p
e, în compara ție cu o tulpina marker – S. cerevisiae YPH 80 (Sigma).

XI
V și V în 1984, utilizeaz ă 2 pe
ă la unghiuri mai m
ari de 90o. Datorită neomogenit ății câmpului aplicat moleculele de
ADN migreaz ă pe o traiectorie curb ă departându-se de centru, asigurând totu și apariția unor benzi
clare (Fig. 4). Actualmente tehnica a fost înlocuit ă cu altele mai performante.
 În tehnica FIGE (field inversion gel electrophoresis) – Olson și Carle (1985) – este
schimbată cu 180o polaritatea câmpului electric la fiecare ciclu cu un tim
entru direc ția spre anod. Rela ția între viteza de migrare și dimensiunea moleculelor de
ADN este complex ă și, de regul ă, impune cre șterea timpului de schimbare a direc ției de migrare,
proces numit “ramping”. La unele drojdii care prezint ă cromozomi de dimensiuni mari, cum este
cazul celor din genul Saccharomyces , s-a reușit separarea cromosomilor f ără “ramping” (Spencer,
1989).
În Fig. 5 este reprezentat profilul (pattern-ul) cromozomal al unei tulpin i de laborator de S.
cerevisia

cromozomi 1 2 3 4 5 6
C
X

III

IX
III
VI

I

Fig. 5. Pattern-ul electroforetic al cromozomilor de S. cerevisiae evdențiat
prin tehnica FIGE (godeuri: 1-5 – S. cerevisiae S288c, 6 – S. cerevisiae
YPH80)

Se observ ea a 7 cromozomi din cei 16: I – 245 kb; VI – 280 kb; III – 360 kb; IX –
450 kb și VIII (care co-migreaz ă datorită dimensiunilor apr opiate) – 555 kb; XI – 680 kb. ă separar
; V

Cea de-a 7-a band ă electrofoetic ă (notată cu C) este reprezentat ă de molecule de ADN
cromozomal care înc ă nu s-au separat în condi țiile de desf ășurare a electroforezei .
FIGE este un sistem foarte simplu în care un dispozitiv pemite schimbarea periodic ă a
polarității electrozilo r într-un sistem convenț ional de electroforez ă. În sistemele FIGE se ține cont
de 4 pa
u câmpuril e electrice forward și reverse cu
durate
Astfel, s-a constatat c ă în cazul aplic ării
unui timrametrii: gradientel e de voltaj pentru direc ția înainte și invers (forward și reverse) și durata
de migrare a probelor în fiecare dintre cele 2 direc ții. Pentru a impune migr area înainte a probelor
de ADN, produsul dintre gradientul de voltaj și timpul de schimbare trebuie s ă fie mai mare
pentru direc ția forward decât pentru direc ția reverse.
După modul de selectare a parametrilor menț ionaț i, se cunosc mai multe tipuri de FIGE:
(i) standard FIGE – este folosit acela și voltaj pentr
diferite; (ii) FIGE asimetric sau AVFIGE – pentru cele dou ă câmpuri electrice cu durate
egale sunt utilizate voltaje diferite; (iii) ZIFE – zero integrated field el ectrophoresis – pentru cele
două câmpuri difer ă atât durata cât ș i voltajele (Tab. 3)
Mobilitatea moleculelor de ADN în câmp electric func ție de mărimea lor este mai
accentuat ă în cazul FIGE decât al altor tehni ci PFGE.
p de puls egal sau a unor vo ltaje egale pentru cele 2 direcț ii de m igrare, moleculele de
dimensiuni mici și mari migreaz ă rapid, cele de dimensi uni intermediare migreaz ă mai încet, iar
moleculele cu dimensiuni apropiate de limita de detectabilitate, sunt aproape imobile. Cu cât
proporția între timpii de puls sau voltajul celor 2 direc ții (înainte și invers) de migrare descre ște,
cu atât cre ște dimensiunea moleculei de ADN pentru care se înregistreaz ă mobilitatea cea mai
scăzută. Cu toate acestea, tehnica FIGE nu este eficient ă pentru separarea moleculelor cuprinse
între 1 – 10 Mb. Grosimea be nzilor electroforetice cre ște substran țial cu cât moleculele se apropie
de dimensiuni de ordinul Mb, ceea ce înseamn ă o rezoluție slabă.

Sistemul Avantaje Dezavantaje
GV – acela și FIGE
erit Aparat ieftin, u șor de
construComigrare pronun țată a
fragmentelor (inversia de bandă );
benzi difuze ană la 3 TS – dif it.
; rzoluție de p
Mb.
GV – diferit AVFIGE
TS – acela și ptimă pentru
molecule de ADN de 1-
50kb. în
ă
ii de migrare. Rezoluție o Necesită aparatură care să asigure
plus voltaje diferite pentru cele doudirecț
GV – diferit ZIFE
TS – diferit Rezoluție superioar ă;
fenomenul de inversie debandă e
ste minim. u cele dou ă Timp de migrare mai lung; necesit ă
aparatură care să asigure în plus
voltaje diferite pentrdirecții de migrare.

ație între diferitele t Tab. 3. Compar ipuri de
GV – gradientul de voltaj pentru cele dou ă câmpuri (direc ții) – timp de schimbare a
direcției de migrare a moleculelor de ADN în câmp e mpul de ac țiune a câmpurilor electrice)
sisteme FIGE ( Birren, 1993 )
forward și rever se; TS
lectric (ti

(1989) , Meese și Meltzer (1990) foloseș te o arie hexagonal ă în care sunt plasa ți mulți electrozi mici
conectaț
se pe gel și, cu to
ate că sunt omogene producând benzi
clare, inte
nomously controlled electrode). Acest sistem permite controlul
precis și v
1. 1. 3. ANALIZA GENOMULUI EXTRANUCLEAR
importan ță deosebită în studiile de genetic ă a d rojdiilor o au analizele efectuate pe ADN
m t este aproximativ aceea și pentru toate speciile
de drojd
d o dimensiune de 25 kpb
și un con Tehnica CHEF (contour clamped homogeneous electric fields) descrisă de
Chu
i în serie astfel încât câmpurile electrice se întretaie în unghiuri de 120o. Benzile rezultate
sunt mai clare și pe acela și gel poate fi înc ărcat un num ăr mare de probe. O variant ă a acestei
tehnici este RGE (rotating gel) în care se utilizeaz ă câmpuri electrice întret ăiate omogene rezultate
prin rotirea gelului cu 90o la fiecare ciclu.
 În TAFE (transverse alternating field electrophoresis) – Gardiner și Patterson
(1989) – câmpurile electrice s unt transver
nsitatea câmpului și unghiurile de orientare a moleculelor în cursul migr ării variază în
lungimea gelului. Deoarece aparatul folosit este vertical, gelul este mai greu de manipulat și
dimensiunea lui este limitat ă.
 Cel mai sofisticat și flexibil sistem utilizat la ora actual ă în electrocariotipare este
PACE (programmable auto
arierea tuturor parametrilor, f ăcând astfel posibil studiul rela ției dintre mobilitatea ADN și
timpul de schimbare a direc ției de migrare, voltaj, unghiur ile câmpurilor electrice aplicate,
concentra ția agarozei și temperatura.

(A) Structura ADN mitocondrial
O
itocondrial (ADNmt). Structura genetic ă a ADNm
ii, cu men țiunea că între diferite genuri sau chiar între speciile aceluia și gen pot apare
diferențe în ceea ce prive ște dimensiunea și chiar conformaț ia ADNmt.
Pentru Saccharomyces cerevisiae , ADNmt este reprezentat de o molecul ă de ADN
dublucatenar ă covalent închis ă, complexat ă cu proteine histon-like, avân
ținut foarte ridicat de AT comparativ cu cel nuclear: 75 – 80% (Fig. 6).
La nivelul ADNmt există gene codificatoare pentru:
 subunități ale citocrom oxidazei c – CO 2, CO 3, CO 1: oxi1, oxi2 și, respectiv, oxi3
 apoproteina citocromului b: cyt b
 3 subunități – 6, 8 și 9 – ale complexului de sintez ă al ATP
 ATP-aza mitocondrial ă
 subunitățile ologmicin sensibile ale ATP-azei: oli2, aap1

 24 specii moleculare de ARN, grupate într-un cluster
S din subunitatea 30S și
nă formând RNazaP cu rol în maturarea ARNt
siae, subunit ățile complexului NADH
deh i de
drojdii.  specii moleculare ale ARN ribozomal (ARNr): ARNr 15
ARNr 21S din subunitatea 50S
 proteina din subunitatea ARNr 30S: var 1
 ARN 9S – complexeaz ă o protei
Un fapt interesant este acela c ă la S. cerevi
idrogenaz ă sunt codificate de gene nucleare și nu mitocondriale, ca în cazul altor speci

ARNr 21S
CO2
CO3
ARNr 15S
CO1oxi 1
oxi 2
par
oxi 3aap 1
ATPaza 8oli 2
ATPaza 6oli 1ATPaza 9var
box
Citocrom b
oli 2, aap 1 – gene care codifica pentru subunitatile
oligomicin – sensubile ale ATPazei
oxi 1, 2, 3 – gene care codifica pentru subunitatile
citocrom-oxidazei (CO 2, 3, 1)
box – codifica pentru citocrom b
par – functie inca nedeterminata
var – proteina a subunitatii ribozomale miciintroni exoni

Fig. 6. Harta genetic ă a ADN mitocondrial la S. cerevisiae
În genomul dro din 5% dintre
gene, 2 dintre genele purt ătoare fiind însă situate la nivelul ADNmt: (I) oxi3; (II) cob box .
d

jdiilor, in tronii sunt rar întâlni ți, fiind prezen ți la mai pu țin
Codul genetic mitocondrial prezintă abateri de la cel universal, 3 codoni fiind tradu și
iferit :

Codon Codul genetic universal Codul genetic mitocondrial
UGA STOP Trp

Au fost determinate masel leculare ale ADNmt a unor specii de drojdii:
Saccharomyces cerevisiae – 15.4 X 106 Da – 54 X 106 Da; Schizosaccharomyces pombe – 12.5 X
106 Da;
GC pentru C. kefyr și maxima de 26.1% mol GC pentru C.
zeylandoAUA Ile
Met
CUA Leu Thr
e mo
Kluyveromyces lactis – 2 4 X 106 Da; Yarrowia lipolytica – 29 X 106 Da; Williopsis
(Hansenula) mrakii – 36.4 X 106 Da. Pentru toate aceste specii ADNmt se prezint ă sub form ă
circular covalent închis ă (CCC), cu excep ția lui W. mrakii pentru care ADNmt este linear. Pentru
diferite specii de Candida s-au determinat dimensiunile ADN mt ca fiind cuprinse între 19 kpb
pentru C. glabrata și 52 kpb pentru C. tropicalis . De asemenea, majoritatea speciilor și tulpinilor de
Candida prezintă ADNmt sub form ă covalent circular închis ă (CCC), numai pentru pu ține tulpini
ADNmt se prezint ă sub form ă lineară.
Bak ș i colab. (1969) au stabilit con ținutul în guanin ă și citozină a ADNmt pentru 5 specii
de Candida, cu minima de 13.9% mol
ides și pentru Sacch. cerevisiae la care % mol GC a fost de 12.7%. În Fig. 7 este
reprezentat ă o schem ă generală de comparaț ie între diferite specii de Candida fiind urm ărite
dimensiunile ADNmt și conținuturile în GC a ADNmt și ADN nuclear.

Fig. 7. Compara ție între caracteriticile ADNmt de la diferite specii
aparț inând genului Candida ș i Lodderomyces

(B) ADN plasmidial 2 m

cerevisiae a fost determinat ă prezența unui ADN
extracromosomal, reprezentat de ADN plasmidial 2 m, denumit astfel dup ă dimensiunea
conturul
NA",
prezența
pb (Fig. 8). / 2 m – like
În nucleul unor tulpini de Saccharo
myces
ui său. Plasmida este împachetat ă în cromatina din nucleu și se replic ă numai o singur ă dată
în cursul unui ciclu celular, în timpul fazei S, independent de materialul genetic cromosomal.
ADN plasmidial 2 m are o dimensiune total ă de 6318 pb și este prezent în 60 – 100 copii /
celulă, numărul de copii crescând cu gradul de ploidie. Plasmida reprezintă un tip de "selfish D
sa nefiind asociat ă cu exprimarea unor caractere fenotipi ce deosebite, ci doar cu un aspect
ușor zimțat al coloniilor și cu un timp de genera ție de 1.5 – 3% mai mare pentru celulele gazd ă
(notate cir+), comparativ cu celulele care nu prezintă acest tip de ADN (notate ciro).
Din punct de vedere st ructural plasmida 2 m prezintă 2 regiuni unice (U1 și U2) de 2774
pb și, respectiv, 2346 pb, separate de 2 regiuni cu secven țe invers repetate (IR) de 599

Fig. 8. Structura plasmidei 2 m de la Saccharomyces cerevisiae

Cele două re
EP1 și REP2 – care codifică pentru proteine necesare segreg ării plasmidei și reglă rii
expresie
ginea replic ării plasmidei ;
ecvențe din
structura
secvență core de 8 pb la capetele c ăreia se leag ă proteina Flp1p prin
intermed
ăr redus de specii de drojdii. Toate giuni unice cuprind secven țele:
R
i genice;
REP3 (STB) – cu rol în segregarea plasmidei și menținerea num ărului de copii;
ARS – ori
FLP1 – codifică o recombinaz ă (Flp1p) care se leag ă specific la nivelul unei s
locusului FRT.
Locusul FRT este plasat la nivelul regiunii IR și este format din 3 secven țe de câte 13 pb
cu orientare invers ă și o
iul unui rest de Tyr. Complexul format din FRT și proteina Flp1p apare și are rol în
procesul de recombinare din timpul replică rii ADN plasmidial.
În afară de plasmida 2 m de la S. cerevisiae , până în prezent au fost identificate 6 structuri
plasmidiale similare ( plasmide 2  m – like ), numai la un num

aceste pl
cesul de recombinare
dintre re
struirea vectorilor de tip shuttle asmide au dimensiuni mici (4647 – 6615 pb) și conțin 2 regiuni cu secven țe invers repetate
care împart genomul în 2 p ărți aproximativ egale, cu secven țe unice (Tab. 4).
Toate aceste plasmide con țin 3 sau 4 regiuni codificatoar e dintre care una pentru o
proteină cu mare omologie de secven ță cu Flp1p ș i care este implicat ă în pro
giunile invers repetate. Toate plasmidele con țin cel puț in o secven ță ARS, fie la nivelul
uneia dintre regiunile unice, fie în imediata lor vecin ătate (Fig. 9).
De și principala aplicabilitate a plasmidei 2 m o constituie utilizarea secven ței ARS
uneori, al ături de secven țele REP1, REP2 și REP3 (STB) în con
pentru drojdii, determinarea prezen ței sale sau a plasmidelor 2 m – like, poate fi folosit ă ca un
indiciu privind posibila apartenen ță a unei tulpini necunoscute la una dintre speciile la care au
fost identificate aceste forme de ADN extracromosomal.

Dimensiune (pb) Plasmida Sursa de izolare
U1 U2 IR T
pSR Zygosaccharomyces rouxii 2654 1679 959 6251
pSB1 Zygosac 2300 6550 charomyces bailii 2900 675
pSB2 Zygosaccharomyces bailii 2457 2004 5415 477
pSB3 Zygosaccharomyces rouxii 3168 2665 391 6615
pSM1 Zygosaccharomyces fermentati 2552 2160 352 5416
pKD1 Kluyveromyces drosophilarum 2137 1928 346 4757
2 m Saccharomyces cerevisiae 2774 2346 599 6318
U1 – regiunea un ică; IR iunea repe – înt lasmid ă.

. 4. T e întal droj
țiilor
filogenetice dintre difer itele specii de drojdii g d ă, s-a observat c ă nu există o corelare între
acestea ică mare; U2 – regiunea unic ă m – reg invers tată; T reaga p
Tab ipuri de plasmide 2 m – lik nite la dii.

În ceea ce prive ște folosirea plasmidelor 2 m / 2  m – like în scopul stabilirii rela
az
și relațiile filogenetice determinate de similitudinea secven ței de baze a plasmidelor.
Astfel, plasmidele pSB3 ș i pSR1 sunt cel mai îndep ărtate plasmide dac ă se ia în considera ție
gradul de omologie între secven țele REP1; cu toate acestea, ambele plasmide au fost izolate, se
mențin și se propag ă la fel de bine în tulpini de Z. rouxii.

Fig. 9. Structura tipurilor de plasmide 2 m – like ( dup ă Broach, 1991 )

(C) Sistemul killer

Producerea de că tre unele specii de droj ii de exotoxine cu ac țiune antimicrobian ă mediată
de receptori membranari, reprezint ă un fenomen relativ bine cunoscut, descris pentru prima dat ă
la S. cerevisiae, de Bevan și Makower (1963). Capacitatea aces tor exotoxine de a determina
moartea celulelor apar ținând acelea și specii sau unor specii congenice, le-a conferit denumirea de
toxine killer . Sinteza lor este asigurat ă de: (a) elemente genetice citoplasmatice, cu transmitere
non-Mendelian ă, virus-like particles ( VLPs ), al căror material genetic este reprezentat de
molecule de ARN dublu-catenar ( Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii,
Hanseniaspora uvarum ); (b) plasmide ADN lineare ( Kluyveromyces lactis , Pichia acaciae,
Pichia pastoris ); (c) gene nucleare (num ăr redus de tulpini de Saccharomyces cerevisiae ; tulpini
aparț inând speciilor: Pichia farinosa, Williopsis mrakii, Pichia klyveri ).
Actualmente, cel mai bine studiat este sistemul killer de la Saccharomyces cerevisiae
(Fig. 10). Tulpinile cu poten țial killer aparținând acestei specii sunt incluse în trei grupe
principale: K1, K2 ș i K28. De și aceste toxine difer ă prin compozi ția de aminoacizi, structur ă și
modul de ac țiune, prezint ă mecanisme de sintez ă, procesare și secreție similare. Celulele
aparț inând aceluiaș i grup sunt rezistente reciproc la toxina secretat ă, pe când celulele de drojdie
aparț inând la grupe diferite (sau chiar specii dif
erite) sunt, de regul ă, sensibile reciproc. Astfel,
spre exemplu, toxina sintetizat ă de o tulpin ă sălbatică de Candida determin ă moartea celulelor
aparț inând speciilor C. glabrata, P. anomala, K. lactis, P. membranefaciens, Rh. rubra și S.

cerevisiae. Celulele producă toare de toxin ă killer sunt notate K+, celulele sensibile la toxin ă – K-
, iar cele care nu prezint ă caracer killer – K0.
Sinteza toxinelor este asigurat ă de prezen ța în citoplasm ă a două tipuri de particule VLP :
L-A și M.
 particule L-A
• denumite și particule helper ;
• au diametrul de 39 nm, iar prezen ța lor nu determin ă moartea celulei gazdă , comportându-se
asemănător virusurilor latente, f ără ciclu litic;
• materialul genetic este reprezentat de o molecul ă de ARN dublu-catenar de 4.6 kb, care se
replică asemănător retrovirusurilor;
• conține informa ția genetic ă necesară sintezei proteinelor capsidale și unei ARN polimeraze,
necesare pentru încapsidarea și replicarea atât a particulelor L-A, cât și M.
 particule M
• trei clase: M1, M2 și M28, responsabile de sinteza toxinelor kille r specifice (K1, K2 ș i,
respectiv, K28) și a factorului de imunitate;
• particule virale cu aceea și dimensiune ca L-A (39 nm) și al căror material genetic este
reprezentat de mai multe molecu le de ARN dublu-catenar de di mensiuni mici: M1 – 1.8 kb, M2 –
1.5 kb ș i M28 – 1.9 kb.

Fig. 10. Sistemul killer la S. cerevisiae – structur ă și mod de ac țiune

În literatura de specialitate au fost descrise și două grupe de gene nucleare care intervin în
menținerea și replicarea particulelor L-A și M: (1) 8 gene superkiller – SKI1 – SKI 8 – cu rol în

scăderea num ărului de copii al M1 și în represarea procesului de traducere a ARNm al M1 și L-
A; (2) 30 de gene maintenance of killer – MAK – importante în transmiterea ș i menținerea
fenotipului killer, ac ționând, în principal, la nivelul particulelor M și, mai pu țin, asupra L-A
(genele MAK 3, MAK 10 și PET18).
Deoarece fenotipul killer este caracteristic numai unui num ăr redus de specii de drojdii și,
respectiv, numai anumitor tulpini apar ținând acestor specii, poate fi utilizat și drept criteriu de
identificare taxonomic ă.