Boli Prionice

Cuprinsul lucrarii

I. Introducere……………………………………………………………………………………………pag.1

Sumar……………………………………………………………………………………….pag.

Glosar………………………………………………………………………………………pag.

Scopul lucrării……………………………………………………………………………….pag.

II. Stadiul actual al cunoașterii……………………………………………………………………..pag.

Proteina prion normala………………………………………………………………………pag.

Proteina prion patologica…………………………………………………………………….pag.

Mecanismul de transformare al proteinelor prion normale în proteine patologice………….pag.

III. Scurt istoric al bolilor prionice……………………………………………………………….pag.

Etiologia bolilor prionice…………………………………………………………………pag.

Boli prionice la om………………………………………………………………………pag.

Boli prionice la animale…………………………………………………………………pag.

Studii asupra bolilor prionice………………………………………………………….. pag.

Diagnosticul bolilor prionice………………………………………………………pag.

Terapii utilizate in tratamentul bolilor prionice……………………………………..pag.

IV.Concluzii și perspective……………………………………………………………pag.

V.Bibliografie………………………………………………………………………………pag.

Scopul lucrarii

Scopul acestei lucrări de licenta este de a analiza stadiul actual al cunoașterii in domeniul bolilor prionice pentru a gasi noi abordari terapeutice ale acestor maladii, precum si metode de a reduce timpul necesar diagnosticului.

Un alt aspect important este acela de a gasi mijloace eficiente care sa impiedice aparitia unor eventuale epidemii, stiu fiind ca aceste boli sunt contagioase, iar agentul infectios (prionul) poate strabate bariera dintre specii, animal-om.

De asemenea, bolile prionice au simptome asemanatoare altor boli neurodegenerative (spre exemplu boala Alzheimer sau Parkinson) si rezultatele experimentale au aratat ca principala cauza a aparitiei acestora este asemanatoare cu cea a bolilor prionice si anume o conversie a unei conformatii spatiale normale a unei proteine intr-una patologica prin mecanisme inca neelucidate. De aceea, diagnosticul si tratamentul eficient al acestor boli prionice (incurabile la ora actuala) poate ajuta si in tratamentul bolilor neurodegenerative.

Este interesant de remarcat faptul ca aceste boli au multiple cauze : fie pot aparea sporadic, fie pot fi transmise genetic si ca, la ora actuala inca nu s-a gasit un tratament care sa le eradice. Manifestarea cu intarziere a simptomelor, precum si evolutia rapida a acestor boli ingreuneaza studiile de caz si implicit gasirea unei terapii eficiente.

Vom discuta in lucrarea de fata aspectele teoretice ale etiologiei bolilor prionice corelate cu datele experimentale obtinute de catre cercetatori. De asemenea, vom evidentia metodologia si vom analiza datele din literatura de specialitate. Datele analizate vor fi prelucrate si rezultatele obtinute vor fi comparate.

Pentru a putea întelege mecanismul de declanșare al bolilor prionice, este necesară analiza proteinei prion (normală, patologică) și a mecanismului de transformare in vivo și in vitro a formei normale în forma patologică, precum și cofactorii declanșatori ai mecanismului.

Studiile din domeniu arată că in vivo proteinele chaperon participă la plierea acestor proteine. Pe de altă parte, studiile experimentale sugerează, prin analize in vivo, că proteinele chaperon participă în mecanismul de transformare a proteinele prion normale în proteine prion patologice. In vitro însă, încă nu s-au putut reproduce prioni cu caracter infecțios, ceea ce a determinat forumularea mai multor ipoteze în ceea ce priveste modul în care proteinele prion ar putea să influențeze plierea.

Prionul – agent infecțios

Prionii sunt agenti infectiosi de natura proteica, care,desi nu au acizi nucleici, au propietatea de a se multiplica. Acesti agenti patogeni au un rol important in procesul de declansare a unor afectiuni ale sistemului nervos central, la om si la animale. Aceste afectiuni neurodegenerative sunt cunoscute sub numele de encefalopatii spongiforme transmisibile (EST).

Prionii se găsesc mai ales în sistemul nervos, unde – în formele normale – par a avea funcții importante. Studiile asupra unor moluște marine, Aplysia, sugerează că prionii au un rol important în formarea memoriei (Si si echipa, 2010).

În anii 1960 cercetătorii au descoperit că agenții care provocau EST nu aveau acizi nucleici; Tikvah Alper a sugerat primul că agentul infecțios este o proteină.

Definitia acestor agenti infectiosi, se bazeaza pe caracteristicile fundamentale ale prionilor, respectiv natura proteica, absenta acizilor nucleici si caracterul infectios care rezulta dintr-o pliere anormala a unei proteine.

Astfel, prionul infecțios este definit ca fiind o forma de agent patogen infecțios de natura proteică (constituit dintr-o proteină care are o conformație spațială sau un mod de pliere anormal) care, spre deosebire de agenții infecțioși cunoscuți în acest moment cum ar fi virușii, bacteriile sau paraziții, nu foloseste acizii nucleici ADN și ARN ca suport al informației patogene.

Acest termen (prion) a fost introdus pentru in biologia moleculara in 1982 de către omul de stiinta Stanley Prusiner de la Universitatea San Francisco și corespunde acronimului PRoteinaceous Infectious ONly particle (particula proteică infecțioasă).

Inainte de a se cunoaste natura acestui agent infectios, acesta era cunoscut sub denumirea de protovirinae, virinos, virus latent, virus conventional.

Teoria lui Prusiner statueaza ca acesti prioni sunt agenti infectiosi lipsiti de agenti nucleici, formati exclusiv din proteine, ceea ce este in contradictie cu dogma centrala a biologiei moleculare, prionul multiplicandu-se nu prin intermediul propriului agent nucleic al agentului prionic, ci prin intermediul acidului nucleic al celului gazda.

La ora actuală, oamenii de stiinta au reușit să descopere și să evidențieze prionii care produc boli la mamifere, oameni, diferite specii de animale, de prionii care se gasesc la ciuperci (cum ar fi Saccharomyces cerevisiae ).

Prionii mamiferelor sunt agenții infecțioși care produc encefalopatiile spongiforme transmisibile (EST) sau bolile prionice. Printre EST cele mai cunoscute la om se numara diferitele forme a bolii Creutzfeldt-Jakob, insomnia fatală familială (IFF), sindromul Gerstmann-Sträussler-Scheinker (SGSS), bola Kuru și la animale scrapia (oi și capre), encefalopatia spongiformă bovină (ESB).

Toate aceste boli se caracterizează printr-o degradare a sistemului nervos central a. Din punct de vedere anatomo-patologic se observa pe preparatele histologice de encefal formarea unor vacuole (care confera un aspect spongios creierului în cazul EST, de unde deriva și denumirea de spongiform), moartea neuronilor, multiplicarea necontrolată a astrocitelor și a microgliilor (nevroglii) precum și acumularea proteinei PrPC, pliată intr-o conformație spațială anormală numita PrPSc.

Cu toate acestea, există încă cercetatori care cred că bolile prionice sunt de fapt provocate de virusuri neconvenționale și că proteinele prionice sunt doar componente ale acestor virusuri.

Conform unei ipoteze recente (anul 2000) prionii ar fi niste epigene care ar putea fi transferate de la un organism la altul prin intermediul unui ADN cu rol de vector, dar nu si de gena.

Alta teorie sustine ca principalul responsabil (vector) de transmisia bolii prionice scrapie la oi si capre este un agent microbian. Proteina acestui agent microbian s-ar asemana cu PrPc(proteina celulara normala de la suprafata membranei plasmatice), fiind capabila a se replica in celula gazda prin folosirea ADN-ului gazdei mamifer. Simultan cu aceasta multiplicare, proteina microbiana ar putea declansa in celula gazda o reactie autoimuna si/sau degenerativa, un fenoment asemanator fiind descris fata de antigenul proteic al amibei Naegleria gruberii.

O alta ipoteza sustine ca expunerea bianuala in anii '80, in Anglia, a animalelor la avicidul phosmet (folosit la tratarea pasunilor pentru indepartarea pasarilor) si ingerarea acestor substante toxice odata cu furajele (absorbtia enterala) reprezinta primul pas de introducere in tesuturile animale, urmata de a doua ingestie cu ocazia prelucrarii industriale a prafului de oase si organe animale pentru hrana vitelor. Acest mecanism a dus la actiunea nociva, remanenta a concentratului de avicid din praful furajer asupra PrPc din SNC al bovinelor hranite cu derivati alimentari artificiali, avand drept rezultat aparitia isoformei patologice PrPres responsabila de aparitia ESB epidemic.

Conform acestei ipoteze, ESB determinata de actiunea omului formeaza o clasa noua de manifestari cronice neuroexcitotoxice intarziate induse de phosmet la bovinele sensibile.

Originea si aparitia prionilor. Proteina neuronala PrPc

Postulatul lui Koch descrie pașii necesari pentru a dovedi că un anumit agent provoacă o anumită boală; unul dintre aceștia este utilizarea agentului respectiv pentru inducerea bolii într-un organism sănătos. Pentru a dovedi că EST este într-adevăr provocată de proteina-prion, prioni aberanți, izolați și purificați, trebuie folosiți pentru a transmite boala. Acest lucru s-a realizat in februarie 2010, confirmând ipoteza “proteina-singură” (Wang si echipa, 2010).

PrP este produsul de clivaj al unei proteine normale de 33-35 kDa (PrPc).

Proteina prion normala PrPc este o glicoproteina care se intalneste la suprafata membranei plasmatice a tuturor celulelor din organism, cu cea mai mare concentratie pe suprafata celulelor neuronale.

Proteina prion normala PrPc are rol in:

– memorie (prin codificarea si conservarea stabila a informatiei). Este foarte abundenta in special in hipocamp (sediul memoriei). De altfel primul simptom al bolilor prionice (prin distrugerea PrPc si acumularea PrPres) este pierderea treptata a memoriei;

– in transmisia sinaptica (interactiuni cu receptorii de acetilcolina – in reglarea numarului de chemoreceptori pentru acetilcolina);

– rol trofic pentru celulele cerebeloase Purkinje carora le asigura longevitatea;

– rol in stabilirea conexiunilor celula-celula in ariile sinaptice, si intre celulele neuronale – celule gliale;

– rol in mentinerea somnului si reglarea intensitatii acestuia;

– rol in reglarea unor aspecte legate de metabolismul Cu++, determinand cresterea la stressul oxidativ prin exercitatea unei actiuni de echilibrare a nivelurilor Cu/Zn SOD (cantitatea exagerata de PrP ducand la scaderea rezistentei la acest tip de stres). Cu are un rol esential in protectia SNC fata de stresul oxidativ si fata de maladiile degenerative.

*Cu este un oligoelement esential pentru viata. Are doua grade de oxidare: +1 si +2. Cu2+ este mai stabil. Forta oxidanta a cuplului Cu+/Cu2+ este utilizata in diferite reactii de oxidoreducere, catalizate de enzime dependente de Cu. {n exces, Cu este toxic.

Cu poate reactiona cu H2O2 pentru a genera radicalul HO., un radical liber foarte reactiv, care produce leziuni importante ale macromoleculelor (ADN, proteine, lipide).

Dereglarea metabolismului Cu are ca rezultat cresterea ratei de producere a radicalilor liberi.

SNC este foarte sensibil la leziunile cauzate de radicalii liberi, pentru ca este un tesut sarac in enzime antioxidante (SOD Cu/Zn, catalaza si peroxidaze) si bogat in substraturi usor oxidabile (acizi grasi polinesaturati).

Perturbarea echilibrului Cu genereaza un stres oxidant care determina moartea neuronilor.

Proteina PrPc umana contine 253 aminoacizi (254 la soarece si 264 la bovine). Localizarea la suprafata celulei neuronale ar putea sa reflecte rolul in aderenta celulara, in legarea unui ligand sau o posibila functie de semnalizare. Partea N-terminala contine o secventa de 5 octapeptide repetate, bogate in glicina si prolina, care in vitro, leaga Cu si Zn. In vivo, PrPc ar putea avea rol in transportul si metabolismul Cu.

Expresia PrPc umana este codificata de gena PRNP, de pe bratul scurt al cromozomului 20. Aceasta gena are un cadru deschis de citire de 253 de codoni (ORF).

Unele EST la om sunt familiale (ereditare): boala Creuzfeld-Jacob (BCJ), boala Gerstman-Sträussler-Scheincker (BGSS), insomnia fatala familiala (IFF), sugerand o transmitere de tip autosomal dominant.

Aspectele diferite clinice, histopatologice sunt determinate de numeroase mutatii punctiforme care intereseaza codonii din regiunea ORF ai genei PRNP. Astfel, mutatiile in codonii 200, 210, 232 determina tabloul clinic al BCJ, mutatiile codonilor 117, 198, 217 se coreleaza cu BGSS, iar mutatiile situate la codonii 129, 178 cu IFF sau BCJ (secundar mutatiilor sinteza de valina va duce la aparitia BCJ, sinteza de metionina la IFF).

Polimorfismul codonilor poate fi factor asociat al diversitatii clinice.

PrP este izoforma patologica de tip PrPSC, PrPESB si PrPCJD a proteinei normalePrPc. Structura primara a ambelor proteine este identica (este constituita din aproximativ 250 de aminoacizi), dar structura secundara este diferita: PrPc are structura secundara de tip α-helix, pe cand cea a PrPs (scrapie) este de tip β-plisat, insotita de modificari ale structurii tertiare.

PrP se izoleaza din placile amiloide cerebrale, fiind componentul principal al acestora.

Morfologic, apar ca structuri filamentoase „SAF“(scrapie associated filaments).

PrP are greutate moleculara de 21-30kDa.

PrP purificata polimerizeaza sub forma de bastonase, cu dimensiuni de 10-20nm, care se aseamana cu amiloidul, ultrastructural si biochimic.

In SNC intalnim proteine PrPc si ARNm, cu precadere in neocortex, hipocampus, celule Purkinje si in neuronii motori spinali.

In neuroni PrPc este transportata prin axon, spre terminatia nervoasa si a fost localizata la nivelul sinapselor prin metoda imunoelectron-microscopiei.

PrPc este fagocitata intre membrana plasmatica si compartimentul endocitar.

Prionii au 2 origini: endogena si exogena (infectioasa).

Originiea exogena a prionilor a fost demonstrata experimental de Bassler (l986), prin inocularea intracerebrala a hamsterilor cu mojarat de creier de oaie, cu boala scrapie. Proteina patologica PrPsc endogena ar putea avea doua proveniente:

– prin reciclarea proteinei celulare, proces in care se face conversia PrPc la PrPsc ;

– prin mutatia punctiforma a genei Prn-p, codificatoare a proteinei normale.

Mutatiile punctiforme, extrem de rare la nivelul genei Prn-p, au drept consecinta formarea unei proteine prionice patologice, denumita dupa numele bolii la care a fost prima data studiata, PrP scrapie sau PrPsc.

Denumirea a fost pastrata pentru agentii patogeni (prioni) ai tuturor bolilor din aceasta familie, deoarece mecanismul de functionare este comun, inclusiv cu al maladiilor prionice umane.

Studiul secventei aminoacizilor la cele doua tipuri de proteine a demonstrat prezenta a peste l8 tipuri de mutatii punctiforme. Cele mai frecvente sunt cele care determina inlocuirea aminoacidului numarul 66 (glicocol din PrPc, cu prolina in PrPsc, sau a aminoacidului l02 (leucina) din PrPc, cu prolina in PrPsc.

Prusiner si Hsiao (l988) au stabilit existenta unei relatii directe intre mutatii si maladie, evidentiind prezenta acestora in structura PrPsc la toti pacientii cu maladii prionice.

Proteine normale și patologice

Structura proteinei prion normale PrPC

Proteina prionică celulară este exprimată fenotipic la nivelul sistemului nervos central și periferic, în țesutul limfatic și la nivelul joncțiunilor neuromusculare. Este o proteină situată la suprafață celulei, fiind ancorată de membrana celulară prin intermediul unei ancore glicolipidice.

In mod normal, această formă este produsă în creierul tuturor mamiferelor și este inofensivă, însă, în anumite condiții inca neelucidate poate adopta o formă mutanta, care reprezintă agentul infecțios implicat în dezvoltarea TSE.

Odată ajuns la nivelul creierului, acest agent patogen transformă proteinele prion normale în proteine infecțioase, care sunt depozitate fie extracelular ca plăci de amiloid fie intracelular ca fibrile sau "fâșii" prionice (agregate de prioni).

Din punct de vedere al structurii, prionul este o glicoproteină hidrofobă, cu o greutate moleculară de aproximativ 28KDa. Are in compoziția sa intre 208 si 220 de aminoacizi,numarul variind în funcție de specie. Prezintă un capăt amino NH2-terminal, o regiune centrală și un capăt carboxilic COOH-terminal.

Domeniul NH2-terminal conține intre 80 si 100 de aminoacizi, are o regiune alcătuită din cinci copii ale unei octarepetiții, existând cazuri în care acest număr este mai mare (de exemplu la bovine unde există șase astfel de copii).

Numeroase studii au arătat că aceste repetiții au un grad înalt de conservare, ceea ce înseamnă că îndeplinesc un rol important în funcționarea proteinei. La nivelul acestor repetiții se găsește un situs de legare pentru ionii unor metale (spre exemplu pentru ionii de cupru).

Acest domeniu se caracterizează prin prezența unor structuri helicale, sugerând că este implicat în conversia PrPc in PrPSc.

Capătul COOH-terminal conține 120 de aminoacizi, o secvență semnal pentru atașarea unui glicofosfatidil inozitol care reprezintă “ancora” cu care PrP este atasata de membrana celulară, și o regiune reprezentată de două resturi de cisteină unite prin două punți disulfidice. Proteina este procesată post-translațional astfel încât are loc o rearanjare a unui număr variabil de aminoacizi la nivelul ambelor domenii terminale.

Prionul sau proteina patologică PrPSc este o formă specială a proteinei normale PrPC care este prezenta în mod natural în organismele animale și este implicată în funcționarea normală a celulei în special la nivelul microdomeniilor raft (shelves) a membranei plasmatice.

Forma patogenă (PrPSc) este identică din punct de vedere al compoziției în aminoacizi cu proteina prionică normală, însă există diferențe la nivelul structurii secundare și terțiare. Metodele de analiza fizico-chimice, cum ar fi analizele RMN și dicroismul circular, au arătat că există diferențe între cele două izoforme la nivelul structurii secundare. Mai precis, PrPc este bogată în structuri a-helix, regiuni în care scheletul proteinic se răsucește sub forma specifică a unei spirale, în timp ce PrPSc este bogată în legături b-pliate. Miezul proteinic al PrP conține 3 a-helixuri și o structură b-pliată scurtă, restul moleculei prezentând o mobilitate crescută.

Originea diferențelor conformaționale dintre cele două forme este necunoscută. Ele ar putea fi determinate fie de organizarea terțiară a monomerilor PrPSc, fie ar putea rezulta din structura cuaternară diferită a polimerilor PrPSc.

Această proteină PrPC este prezenta la animale, ceea ce inseamna că toate mamiferele și deci și omul pot dezvolta boli prionice.

Se stie ca proteina PrPC este implicată în dezvoltarea sistemului nervos la embrion.

La adult, ea este exprimatăfenotipic la nivelul sistemului nervos central și periferic, în țesutul limfatic și la nivelul joncțiunilor neuromusculare în creier (În neuroni și celulele gliale). Proteina este implicată în procesele de diferentiere și de adeziune celulară.

De asemenea se crede că ar avea un rol antioxidant și protector în moartea celulară programată sau apoptoza. Această proteină ar avea de asemenea un rol în plierea altor proteine.

Potrivit cercetărilor efectuate de echipa Dr. Scott (decembrie 2006), proteina normală PrPC, studiată pe soarecii de laborator, apare în cantitati foarte mari (de pana la de 3 ori mai mult) în interiorul celulelor pancreasului specializate în producerea de insulina și că soarecii predispuși la diabet prezintă de 3 ori mai multa proteină PrPC în membrana plasmatică a celulelor producătoare de insulina. Cantitatea de proteină PrPC din pancreasul unui soarece sănatos se schimba în interval de 1 pana la 3 zile după administrarea unui concentratii crescute de zahar în sânge. Proteina PrPC ar putea fi implicată în aparitia diabetului de tip 1 (insulino dependent), boală caracterizată de un atac al sistemului imunitar a celulelor producatoare de insulina din pancreas.

Proteina patologică PrPSc rezultă dintr-o modificare la nivelul structurii tridimensionale a proteinei normale PrPC. Ea provocă bolile prionice (boala vacii nebune sau encefalopatia spongiformă bovină, boala Creutzfeldt-Jakob, scrapia la oi, insomnia fatală familială).

Mecanismul prin care prionul, agentul infecțios responsabil cu cauzarea acestor boli este în mare parte acceptat ca ipoteza de lucru de către comunitatea stiintifică : în timpul infecției, prionul pătrunde în neuronii gazdei unde, printr-un mecanism incă necunoscut se inmulteste, schimbând structura spațială a proteinei normale PrPC în proteina PrPSc, formă care nu mai este degradată enzimatic de proteaza K și prin urmare se acumulează în celula pe care o omoară, formând placi de depozit (amiloid) de proteină patologică în creier.

Una dintre principalele caracteristici a tuturor acestor boli este că nici un acid nucleic (ADN/ARN) n-a putut fi asociat cu prionul, cum a putut fi proteina PrPSc. De aceea putem vorbi de un agent transmisibil neconvențional (ATNC).

Bolile prionice sunt transmisibile de la un individ la altul și intr-o oarecare masura de la o specie la alta.

Două specii atipice de prioni patogeni, care se numesc BSE-H și low-type BSE-L, cu simptome asemănătoare celor întalnite la animalele de laborator infectate cu ESB, dar diferite de prionii care cauzează ESB, probabil cu apariție sporadică, au fost recent descoperiti.

Originea genetică bovină confirma ipoteza conform căreia agentul patogen cauzator al ESB ar fi el insuși un prion bovin mutagen.

Exista o relatie directa intre proteina normala si cea patologica. Proteina Prpsc, mutanta sau de origine infectioasa, actioneaza asupra echivalentului sau celular normal PrPc, in sensul ca, venind in contact cu aceasta, determina deplierea ei de la forma normala de α-helice si replierea ei intr-o conformatie noua, de tip β-pliere. In timpul infectiei prionice are loc o interactiune fizica inalt specifica intre PrPc si PrPsc si se produce conversia conformationala a proteinei, care face PrPsc rezistenta la degradarea cu proteaze si ii confera caracterul infectios si patogen.

Conversia PrPc in PrPsc este conformationala. Cele doua forme au aceiasi secventa de aminoacizi. Schimbarea conformatiei presupune o crestere cantitativa substantiala a structurii β-pliere, cu o usoara descrestere a structurii α-helix. PrPc are circa 42% structura α-helix si 3%, β-pliere, iar PrPsc are 30% structura α-helix si 43%, β- pliere.

“Replicarea” prionilor s-a studiat in vivo, prin inocularea experimentala a animalelor sensibile cu dilutii foarte mari de omogenat de creier infectat cu scrapie, sau de la bolnavi cu maladia Creutzfeldt-Jakob, in creierul acestora se acumuleaza mari cantitati de prioni (pana la l08 DL5o unitati infectioase). In vitro, numai unele linii celulare neuronale sunt sensibile la infectia cu prioni scrapie.

Mecanismul formarii PrPsc poate fi diferit pentru formele infectioase si pentru cele genetice. In primul caz, PrPsc exogen are rolul de catalizator pentru conversia PrPc endogen, la starea PrPsc. Prionii de provenienta exogena (prin infectie), interactioneaza cu moleculele normale de proteina prionica celulara (PrPc), pe masura ce acestea sunt sintetizate, imprimandu-le propria lor conformatie speciala(tip β-pliere), transformandu-le in proteine prionice (PrPsc). Fiind rezistente la degradarea enzimatica, proteinele prionice se acumuleaza in neuroni, determinand vacuolizarea si necroza lor. Prionii eliberati pe aceasta cale, sunt adsorbiti pe neuronii normali adiacenti, determinand extinderea procesului patologic. Locul neuronilor lizati este luat de celulele gliale.

In al II-lea caz, PrPc mutant(rezultat prin mutatii punctiforme in gena Prn-p) este transformat spontan la PrPsc.

Etapele propagării prionului (proteina PrPsc)

Când cantitatea de PrPSc depozitată atinge un nivel critic, se declanșează o cascadă auto-catalitică, care de obicei este ireversibilă și care determină modificarea proteinelor normale nou sintetizate. In cazul maladiilor prionice, aceste depozite nu sunt distruse, ceea ce duce la acumularea lor în celule, determinând vacuolizarea și necroza acestora. S-a constatat că în acest proces de conversie, PrPSc funcționează ca matriță pentru formarea unor noi molecule PrPSc.

Graham S. Jackson și colab. (2000), au urmărit experimental schimbarea conformației proteinei PrPC în cursul procesului de conversie. Pentru aceasta, ei au incubat PrPc, marcată cu 32S, cu un exces de PrPSc și au observat că se produce o proteină de novo, rezistentă la proteinaza K, pe care au desemnat-o PrPRES. După digestia cu protează, se observă că mobilitatea PrPRES în gel de elecrtoforeză SDS-PAGE este crescută, ceea ce indică o scădere a masei moleculare, punând în evidență faptul că are loc o schimbare conformațională în proteina prionică celulară, în cursul procesului de conversie.

Unii autori sugerează că procesul de conversie poate fi indus și de factori fiziologici, cum ar fi valoarea pH-ului, creșterea temperaturii sau nivelul diferit de glicozilare al proteinei normale. De asemenea, există unele supoziții, precum că în procesul de conversie PrPc in forma patologica PrPSc ar fi implicați anumiți cofactori, unii dintre aceștia aparținând familiei de proteine chaperone. Telling și colab. (1996), arată că există un alt factor auxiliar, numit “proteina X”, care facilitează această conversie prin legarea sa la un epitop discontinuu de la nivelul PrPc.

Cutoate acestea, se știe cu siguranță faptul că formarea PrPSc este un proces posttranslațional, care are loc doar după atașarea PrPc la membrana neuronală. Daude și colab. (1997) au arătat că în cazul formelor ereditare, acest proces are loc chiar la nivelul reticulului endoplasmic, înainte ca proteina normală să fie ancorată de membrană. Indivizii respectivi moștenesc direct forma mutantă, ceea ce explică absența plăcilor amiloide la nivelul țesutului cerebral.

Alte ipoteze

Au fost propuse variate ipoteze pentru a explica mecanismul care determină distrugerea celulelor neuronale și aspectul spongios al creierului. Acestea includ printre altele: efectul neurotoxic manifestat de o regiune a proteinei prionice, care cuprinde resturile de aminoacizi 106-126, precum și stress-ul oxidativ crescut la nivelul neuronilor ca urmare a depleției PrPC, care se presupune că funcționează ca un antioxidant.

In cazul celor mai multe proteine globulare are loc o pliere a monomerilor care duce la formarea unei conformații stabile. Când plierea este incorectă sau când apare o schimbare conformațională, ca urmare a substituției unui aminoacid sau a unei modificări chimice, proteinele nu mai pot fi degradate și se acumuleaza sub forma unor plăci amiloide.

Transmiterea prionilor

Mecanismul de transmitere al prionilor are la baza ipoteza de lucru enuntata de Prusiner si care statueaza ca prionii reprezinta forma modificata a unei proteine celulare normale (PrPc).

S.B.Prusiner (l986, l993) a demonstrat originea exogena a proteinei prionice prin transmiterea experimentala a maladiilor prionice. Depasirea barierei dintre specii este un proces intamplator, cu o perioada lunga de incubatie (de ordinul anilor).

Prin pasaje succesive la indivizi ai aceiasi specii, timpul de incubatie se scurteaza progresiv de la un pasaj la altul astfel propagarea agentului devine predictibila. Bariera de specie nu functioneaza intotdeauna.

Analiza barierei specie are importanta practica pentru evaluarea riscului ca omul sa dezvolte maladia Creutzfeldt-Jakob, dupa consumul creierului de oaie infectata cu scrapie sau de bovine infectate cu prionul encefalopatiei spongiforme.

Dupa inoculare, perioada de incubare a prionilor este de 1-3 ani.

Odata declansate, bolile prionice au o evolutie clinica rapida, de-a lungul mai multor luni sau ani.

Experientele efectuate pe oi si capre, prin inoculare intracerebrala, orala, subcutanata, intramusculara sau intravenoasa, au demonstrat existenta gradelor de sensibilitate a diferitelor rase de animale, mai ales dupa inocularea subcutanata. Acest rezultat sugereaza ca particularitatile genetice influenteaza in mare masura sensibilitatea la infectia prionica deoarece adeseori multe dintre animalele carora le-au fost inoculate prionii nu dezvolta maladia.

Cultivarea prionilor in laborator

Pentru cercetarea relatiei prioni-celula gazda s-au folosit animale (cimpanzei) si substraturi celulare de creier, la care s-au administrat suspensii de creier de la bolnavi cu boala Kuru sau BCJ.

Cimpanzeii carora le-au fost inoculati intracerebral suspensii de creier de la bolnavi de Kuru sau filtrate acelulare de la pacienti cu BCJ, au dezvoltat boala dupa oprioada de latenta de 1 an.

Culturi celulare

Conform studiilor, culturi celulare izolate din portiuni de creier inoculate cu agenti Kuru sau ai BCJ isi pastreaza infectivitatea pe o perioada de 25-70 zile de mentinere a acestora in vitro.

Eradicarea prionilor

Prionul este o proteină de talie mică aproximativ 30 kD, care poate fi distrusă numai la temperaturi ridicate (autoclavarea la temperatura de 134 °C timp de 18 minute) la o presiune atmosferică de 3 bari. Teoretic, dacă autoclavarea este făcută la o temperatura de 136 °C, prionul se protejează folosind o bariera biologică și nu este distrus.

De aceea, în practică s-a demonstrat că este esential se respecte temperatura de 134 °C timp de 18 minute. O marja de eroare de plus minus 1 °C este acceptată. Există de asemenea metode chimice cum ar fi apa de Javel proaspat diluată la un ph de 6 și amestecată cu soda la temperatura camerei timp de o ora.

Acest agent patogen, prionul, neavând metabolism propriu, nu este sensibil la iradiații folosite în mod normal în scopuri de sterilizare.

Mai mult, nici una dintre aceste metode nu ofera o eficacitate absoluta ; eficacitatea maxima este obținuta asociind tratamentului chimic un tratament termic.

Pentru siguranta și prevenirea raspândirii acestor boli la oameni și animale, este necesar ca, după efectuarea studiilor experimentale pe țesuturi infectate, aceste deseuri să fie incinerate.

În 2004 Institutul de genetică umana (IGH) din Montpellier a depus o cerere de acordare a brevetului de inventie pentru descoperirea degradării prionilor prin acțiunea combinată a cuprului și a unui agent oxidant (cum ar fi apa oxigenată).

Actiunea agentilor fizici si chimici asupra prionilor

PrP sunt rezistente la agentii care inactiveaza acizii nucleici: radiatii ionizante, radiatii u.v., nucleaze (DN-aze, RN-aze), proteze.

PrP sunt rezistente la agenti chimici ca: aldehidele (formaldehide, glutaraldehide), propiolactona, hidroxilamina, psoralen.

PrP sunt partial inactivate de: caldura (1000C), fenol, hidroxid de Na.

Agentii prionici sunt foarte rezistenti la metodele obisnuite de sterilizare, iar fixarea in formol a tesuturilor animale determina cresterea rezistentei agentilor prionici chiar si la autoclavare ulterioara la 1340C timp de o ora.

In prezent se considera drept sterilizare eficienta mentinerea probelor infectate 1 ora in solutii NaOH 1M urmata de autoclavare la 1340C timp de 30min, doar in cazul netratarii anterioare in etanol sau formol.

In 1999 literatura de specialitate moderna considera drept cel mai bun procedeu pentru distrugerea agentilor, tratamentul cu acid picric saturat 15 minute, urmat deautoclavare sub presiune la 1210C, 10 minute, tratament cu acid formic la 5 minute, si apoi cu guanidintiocianat 4M, 2 ore la +4 grade Celsius.

Rezistenta particulara a PrP ar fi expresia modificarilor sale conformationale, care determina deficiente de transportare la suprafata celulei si de catabolizare, consecinta fiind tendinta de a forma agregate fibrilare, cu acumulare anormala in substanta cerebrala si dezogarnizarea acesteia.

Istoricul bolilor prionice

• 1732 : Prima descriere a scrapiei

• 1917 : Prima descriere a bolii Creutzfeldt-Jakob

• 1936 : Prima descriere a sindromului Gerstmann-Sträussler-Scheinker.

• 1938 : Demonstrarea experimentală a caracterului transmisibil al scrapiei. Cuillé și Chelle au injectat oi cu un amestec compus din porțiuni din encefalul unor oi care au murit de scrapie. Animalele injectate au dezvoltat aceeași boală, demonstrând că scrapia era datorată unui agent infecțios.

• 1957 : Prima descriere a bolii kuru de către Gajdusek și Zigas.

• 1959 : Hadlow remarca că există numeroase asemanari din punct de vedere anatomo patologic intre scrapie și boala Kuru. Aceste observatii conduc la ideea că bola Kuru poate la rândul ei să fie cauzată de un agent infecțios.

• 1966 : Demonstratia făcută de grupul condus de Gajdusek a caracterului transmisibil al bolii Kuru la cimpanzei.

• 1967 : Alper și Pattison realizează studii de inactivare (sau distrugere) a agentului infecțios al scrapiei cu raze ionizante( radiații gamma sau X). Razele ionizante au dus la alterari și modificari a acizilor nucleici care se presupuneau că stateau la baza agentilor patogeni infecțioși. Cantitatea de raze ionizante necesară pentru a inactiva jumatate dintre moleculele infecțioase este proporțională cu marimea genomului și deci cu marimea agentului patogen. Rezultatele pe care acestia le-au obținut prin această metoda de determinare a marimii arată că agentul cauzator al scrapiei prezintă proprietati de rezistenta la acțiunea razelor ionizante fara nici o legatura cu rezultatele obținute în cazul virușilor, bacteriilor sau paraziților. Aceste observatii sugerează că agentul infecțios responsabil cu producerea acestei boli are o marime foarte mică, inferioară marimii virușilor, ceea ce conduce la ipoteza că acest agent infecțios ar putea să fie lipsit de acizi nucleici.

• 1967 : Griffith propune ipoteza numai proteina (sau protein only). Formulează ipoteza că agentul infecțios cauzator al scrapiei ar putea să fie o proteină care ar fi luat o conformație spațială anormală. Această proteină ar fi capabilă să transmita conformația sa anormală proteinei gazdei ceea ce ar putea să fie modul de transmitere și inmultire a acestui agent infecțios.

• 1968 : Grupul condus de Gajdusek a aratat că boala Creutzfeldt-Jakob este de asemenea transmisibila. Cercetările efectuate de Gajdusek au permis să se grupeze EST sub această terminologie și să se stabilească că acestea sunt datorate unui agent infecțios.

• 1978 : descoperirea bolii cronice cașectizanta a cervidelor (CWD)

• 1982 : Grupul condus de Prusiner realizează studii sistematice pentru inactivarea agentului patogen cauzator al scrabiei după ce a fost în prealabil inoculat unor hamsteri sirieni. Din cercetările echipei conduse de Prusiner reiese că toate tratamentele fizice și chimice care deteriorează acizii nucleici sunt incapabile să inactiveze agentul infecțios. Contrar acestor rezultate, toate procedeele chimice și fizice care distrug sau deteriorează proteinele determină o inactivare sau o încetinire importanta a multiplicării agentului infecțios. Prusiner propune să se introducă un nou termen pentru a defini acest tip de agent infecțios care pare să fie lipsit de acid nucleic și de natura în totalitate proteică : prionul. De asemenea, pune în discuție paradigma biologiei celulare a celor trei tipuri de agenti infecțioși : viruși, microbi și paraziți. Notiunea de prion este privita cu rezerve de comunitatea stiintifică.

• 1982 : Echipa lui Prusiner identifica o proteină care are legatura cu agentul infecțios. Ei denumesc această proteină PrP, abreviere pentru Protease Resistant Protein (proteina rezistenta acțiunii proteazelor), deoarece prezintă particularitatea de a fi partial rezistenta la acțiunea proteazelor (enzime care catalizează scindarea proteinelor în mici lanturi polipetidice).

• 1991 : Echipa lui Prusiner descopera că proteina PrP nu este codată de genomul agentului infecțios ci de genomul gazdei. Aceste rezultate arată că la indivizii infectati proteina normală PrP sau PrPC este transformată sau sufera o pliere în proteina patologică PrP sau PrPSc.

• 1986 : Prima descriere a encefalopatiei spongiforme bovine (ESB).

• 1986 : Prima descriere a insomniei fatale familiale (FFI).

• 1993 : Crearea în laborator a primilor soareci fara gena Prnp, care codifică proteina PrP, fara rezultatele asteptate. Acesti soareci care nu au exprimată proteina PrPC nu pot să mai contacteze o boală prion după o infectare experimentală prealabila.

• 1996 : Prima descriere a bolilor prionice de tip Creutzfeldt-Jakob.

In secolul al XVIII-lea, in Franta a fost descrisa o boala denumita generic tremblante. Aceasta boala este acum cunoscuta sub numele de scrapie, un termen care descrie tendinta animalelor afectate sa-si elimine pruritul, frecandu-si corpul de obiecte tari.

Aceasta boala a suscitat un interes pentru cercetatori inca de la aparitie, intrucat avea consecinte economice drastice in industria lanii. Acesta a fost motivul principal pentru care Guvernul Britanic a alocat fonduri pentru tratamentul scrapiei Societatii Roiale din Londra inca din anul 1910.

In 1922, Spielmeyer a introdus termenul “boala Creutzfeldt-Jakob” (CJD) pentru a descrie bolile neurologice umane care sunt caracterizate prin ataxie, dementa, pornind de la cazurile raportate anterior de Creutzfeldt (1920) si Jakob (1921).

Acest termen generic a fost intial folosit sa descrie o mare varietate de tulburari neurologice care nu indeplinesc criteriile moderne de diagnostic ale bolii CJD.

In anul 1950, Australia a inceput sa exploreze noile teritorii din Papua Noua Guinee, care se aflau sub suveraneitatea acesteia.

Incursiunile in aceste noi teritorii au condus la descoperirea unei noi boli, boala kuru. Primii medici care au studiat simptomele acestei boli au crezut ca acestea apar ca urmare a conditiilor de mediu sau din cauze genetice si etiologice necunoscute.

Printre simptomele bolii Kuru sunt ataxia sau tremurul care in timp duc la o progresie a dementei si ulterior apare mortea persoanei afectate.

Mai tarziu s-a descoperit ca aceasta boala era infectioasa si ca unele parti din creierul persoanelor afectate deveneau spongiforme precum se intampla in cazul scrapiei la bovine si bolii CJD la oameni.

In 1987, Beck si Daniel au putut demonstra ca acea boala transmisibila care se caracterizeaza prin prezenta unor vacuole de natura spongiforma in tesutul cerebral al oamenilor si animalelor, pierderea functiei neuronilor precum si proliferarea astrogliala cu sau fara formarea placilor de amiloid, este de natura infectioasa.

In acel moment, cand s-a stabilit natura infectioasa a bolii, natura agentului infectios nu era inca cunoscuta. Se presupunea ca este un virus datorita capacitatii acestuia de a trece prin filtre cu pori de mici dimensiuni, cum ar fi bariera hematocefalica. Perioada de incubare a acestor boli era in orice caz mai mare decat a bolilor infectioase cauzate de virusi, pana la 50 de ani in cazul bolii Kuru.

De aceea, cercetatorii au emis ipoteza ca era un virus cu perioada de incubatie extinsa, folosindu-se sintagma “slow virus”. Investigatiile ulterioare a naturii agentului infectios au exclus natura sa de agent de natura nucleozidica, respingandu-se ipoteza ca ar contine ADN (acid deoxiribonucleic).

Aceasta concluzie a aparut ca urmare a ineficientei tratamentului cu compusi care in mod normal inactiveaza acizii nucleici (spre exemplu razele ultraviolete). (Alper si echipa, 1966, 1967). Un argument in plus al validitatii acestui rezultat a fost ca aceste boli nu determina aparitia unui raspuns imun si mai mult nici un virus cunoscut la acea perioada nu a fost asociat cu aceasta boala.

In 1967, Griffith a sugerat ca agentul infectios ar putea fi o proteina.

Astfel, o sialoglicoproteina rezistenta la actiunea protezelor a fost izolata de Bolton si echipa sa in 1982, folosindu-se pentru a se infecta tesutul cerebral homogenate cu doza progresiva. Aceasta proteina se acumuleaza in tesuturile cerebrale si constituie componenta majora a portiunii de creier afectate de agent. (Griffith, 1967; Bolton si echipa , 1982, Prusiner si echipa 1982).

In anul 1982, Prusiner a folosit termenul de prion (particular INfectioasa de natura PROteica, in engleza proteinaceous infectious particle) pentru a se putea distinge acesti agenti infectiosi de virusi sau virioni.

Proteina componenta a acestor particule a fost numita PrP (Prusiner, 1982), descoperire pentru care mai tarziu a fost recompensat cu premiul Nobel.

Studiile in cristalografie de raza X pe prioni sugereaza ca, chiar daca acizii nucleici sunt prezenti in particula, dimensiunea acestora este prea mica pentru a putea fi exprimati fenotipic (Alper, 1993), confirmand ipoteza protein “ numai proteina”.

PATOGENIE

Intrarea in organism a agentilor prionici se face pe diferite cai :

– cale orala: este cazul bolii Kuru care a aparut datorita canibalismului practicat ca ritual de catre componentii unor triburi din Papua (Noua Guinee) prin ingestie de creier de la decedati, sau a encefalopatiei spongiforme bovine (ESB), care a aparut consecutiv hranirii bovinelor cu faina de carne, insuficient prelucrata termic, provenita de la oi si capre;

– parenteral: prin injectii cu preparate contaminate, transfuzii, interventii chirurgicale, transturi de organe;

– cai potentiale de contaminare iatrogena: creierul si alte tesuturi (duramater, cornee).

Diseminarea in organism dupa ingestie a prionilor se face prin diferite cai :

– pe cale limfatica: dupa o prima replicare in ganglionii regionali, invadeaza caile limfatice, apoi calea sanguina si, prin intermediul trombocitelor infectate, se localizeaza in tesutul reticulo-endotelial;

– pe cale nervoasa, centripet, pe traseele nervoase prin maduva la SNC.

Studii efectuate recente au demonstrat ca dupa infectarea cu agentul prionic infectios al tesutul cerebral al unui animal se declanseaza o suprastimulare a sistemelor cerebrale GABA si glutamat-ergice pe termen lung, ceea ce corespunde perioadei de latenta a bolii -emergenta primelor semne clinice- care duce la distrugerea sistemului inhibitor GABAergic al creierului si la un proces neurotoxic generalizat.

Aspecte anatomo-patologice

Din punct de vedere anatomo-patologic, toate encefalitele spongiforme (EST) se caracterizeaza prin degenerarea celulelor neuronale si vacuolizare progresiva a corpilor neuronali, dendritelor si axonilor, cu proliferare reactiva gliala astrocitara excesiva in zona corticala si subcorticala, cu depunerea unor fibre formate dintr-o isoforma patologica (PrPs ) a proteinei prionice celulare PrPc cu aspect tubulocular in prelungirile postsinaptice. In final apare un aspect spongios al materiei cenusii.

Aspecte clinice

Laora actuala se cunosc mai multe tipuri de boli prionice, care pot fi impartite in doua categorii in functie de specia la care apar :

– la animale: boala scrapie, ESB (bovina), encefalopatia transmisibila a nurcilor, a antilopei africane si elanilor, a felinelor si a strutilor;

– la om: boala kuru, boala Creutzfeldt-Jakob, sindromul Gerstman-Straussler (SGS), insomnia fatala familiala (IFF), boala Alper.

Modul de transmitere al bolilor prionice

Cel mai periculos tip de prioni este acela care provoacă vCJD – o formă a bolii vacii nebune care a trecut bariera dintre specii și a infectat oameni . vCJD a apărut prima oară în Marea Britanie în 1996 și de atunci se cunosc 168 de victime si 28 de morți numai în 2000; câteva cazuri au apărut și în alte țări, inclusiv în Franța, Italia, Irlanda, Canada și Statele Unite. Numărul exact al persoanelor afectate (infectate sau decedate) de această boală pe tot globul nu se cunoaște. Deși există încă îndoieli privind modul de infectare, principala cale de infecție pare a fi consumul de carne de vită infectată.

Cele mai multe dintre celelalte boli prionice, inclusiv CJD “normală”, sunt genetice sau au cauze necunoscute și afectează persoanele vârstnice. Noua variantă de CJD se deosebește de CJD prin aceea că afectează tinerii, iar prionii aberanți se regăsesc nu numai în creier, ci și în alte țesuturi precum sângele, amigdalele și apendicele; aceste date sugerează existența unor noi căi de transmitere a bolii către întreaga populație și nu numai către persoanele în vârstă.

Din cauza faptului că mecansimul de transmitere al prionilor nu a fost pe deplin inteles, la ora actuală se incerca indepartarea pe cât posibil a factorilor care ar declansa aceaste boli.

Ipoteza că aceste proteine ar putea fi prezente în sânge a fost luată în calcul de mai multe tari. Astfel, deoarce prionii s-ar putea transmite prin transfuzii sanguine, în Marea Britanie, sângele utilizat este deleucocitat (sunt îndepărtate leucocitele care ar putea contine prioni infecțioși). În multe alte țări (de exemplu Germania) este interzisă recoltarea de sânge pentru transfuzii de la persoanele care au locuit în Marea Britanie.

Boala poate fi transmisă și prin instrumente chirurgicale: prionii infecțioși sunt rezistenți la temperaturile ridicate, iradierea și tratamentele chimice obișnuite care distrug alți agenti patogeni cunoscuți, asadar este necesar conceperea unor metode de sterilizare care să asigure eradicarea acestor agenti patogeni.

Mai mult, s-au găsit prioni în epididimul și plasma seminală a berbecului (Gatti si echipa, 2002). Aceste descoperiri au condus la temeri privind posibila infectare prin donare de spermă ajungându-se chiar, în SUA, la interdicția donării de spermă de către europeni sau persoane care au locuit în Europa.

Cu toate acestea, un studiu recent, real estimează că probabilitatea de transmitere a prionilor prin spermă este foarte mică de aproximativ 1: 10 000 000 (Mortimer si Barratt, 2006).

În 2006, o echipă de cercetători din Elveția a detectat nivele scăzute de prioni normali în laptele cumpărat din magazine europene (Franscini si echipa, 2006). Alte studii au demonstrat că prionii aberanți se pot multiplica în glandele mamare ale oilor infectate cu scrapie (Ligios si echipa, 2005).

Împreună, aceste rezultate sugerează că prionii patologici pot fi prezenți în laptele animalelor bolnave de boli prionice. Cum simptomele bolii prionice apar după câțiva ani de la infectare, prionii patologici pot fi prezenți în laptele care este vândut înainte ca animalele să fie diagnosticate.

Cu toate acestea, riscul de a contacta o boala prionică prin ingestia de lapte contaminat este redus.

Diagnosticul bolilor prionice

In ultimii ani a fost studiat un numar mare de teste de laborator pentru diagnosticul ante-mortem al infectiei prionice, dar dificultatile intampinate s-au dovedit deosebit de mari deoarece metodele utilizate nu au dus totdeauna la detectia proteinei PrP in esantioanele analizate.

S-a constatat ca prezenta PrP nu poate fi detectata (sub valoarea de 1 milion de particule infectioase/g tesut cerebral) in stadiile timpurii ale infectiei (perioada asimptomatica). Proteina PrP nu a putut fi niciodata evidentiata in elementele urate albe ale sangelui si nici in mixturile de hormoni de crestere cu agent prionic prezent care au provocat bloala CJ.

Produsele patologice care sunt analizate sunt biopsii de tesut cerebral, ganglioni spinali, nervi periferici, sange sau LCR.

Metode de studiu

1. Examenul histopatologic direct al tesutului cerebral bioptic prezinta un risc major (in caz de CJ) de morbiditate si exista ca tesutul analizat sa nu contina zonele cu leziuni caracteristice maladiilor, obtinandu-se astfel rezultate fals-negative.

2. Examenul imuno-histo-chimic este folosit pentru evidentierea depozitelor de PrP din ganglionii splinali, enterici si nervi periferici in cazul bolilor BCJ, GSS, IFF, ESB si scrapie prin tratarea amprentelor de tesuturi cu anticorpi monoclonali marcati fluorescenti.

3. Tehnica de Western blotting (immunoassay) permite efectuare unui diagnostic preclinic, precoce al BCJ, prin detectarea markerului PrP in material bioptic de tesut tonsilar si apendicular uman, in LCR, sange si derivate de plasma (albumina, Ig) pana la doza infectanta de 5-l0 μg PrP si respectiv 10 UI/ml. Markerul PrP este evidentiat prin cuplare cu anticorpi monoclonali.

4. PET-blotting-ul este o metoda mult mai sensibila decat Western blotting-ul conventional. Cu aceasta metoda devine posibila detectarea PrPres si in perioada de incubatie, cu mult inainte de aaparitia semnelor clinice, si in cazul bolilor prionice cu niveluri foarte scazute de PrP. Tehnica este sensibila la detectarea PrP in tesuturi fixate in formol si incluse, in parafina. Cu aceasta metoda poate fi investigat tesut cerebral de arhiva provenind din cazuri BCJ sporadice si genetice, ESB si scrapie. Metoda a dat rezultate concludente si in cazurile in care tehnica imunchimia a dat rezultate fals negative.

5. PCR si cromatografia au fost introduse in ultimii ani in practica medicala pentru controlul produselor biofarmaceutice (derivate din plasma), utilizate in tratamentul coagulopatiilor.

PCR si hibridizarea dot blot (cu marcare 32P) se folosesc pentru determinarea variantelor alelice PrPc si selectarea variantelor codonului 171 arginina care s-a dovedit (la oi) corespunzator animalelor rezistente natural la scrapie, in vederea selectionarii, din turmele de oi, a exemplarelor rezistente la infectie, pentru crearea unor noi generatii de animale rezistente la focarele endemice (epidemii).

Diagnosticul bolii prionice de certitudine ramane actualmente evidentierea leziunilor histopatologice cerebrale, post-mortem.

Acesta este făcut pe baza prelevarii de țesut nervos obținut post mortem de la subiectul infectat și analizat microscopic.

Tehnicile biochimice sunt mai utilizate decât cele imunohistochimice deoarece acestea permit să se realizeze analize in serie pe mii de animale.

Pentru a diagnostica o boală prionică la om se urmaresc evidentierea caracteristicilor bolii :

1- Evidentierea celor trei semne de neuropatolgie caracteristice : pierderea neuronilor, inmultirea astrocitelor, prezenta vacuolelor spongiforme.

2- Evidentierea depozitelor de proteine prion prin tehnica imunohistochimică

3- Evidentierea proteinei prion patologică după tratamentul cu proteaza K prin tehnica Western-Blot.

Mai rar agentul patogen a putut fi evidențiat pe țesut cerebral obținut prin biopsie.

Totodată, dacă un subiect este suspectat că are boala Creutzfeldt-Jakob, studiul proteinei prion patologice poate fi realizat pe țesut prelevat din amigdală.

Totuși, din cauza faptului că encefalopatia spongiformă bovină din Marea Britanie a determinat apariția a 165 de cazuri de boală foarte asemănătoare BCJ, ulterior numită noua variantă a bolii Creutzfeldt–Jakob (vBCJ), a condus la aparitia unor noi metode de diagnostic și la înțelegerea mecanismelor fiziopatologice ale acestei afecțiuni neurodegenerative.

BCJ sporadică, forma cel mai frecvent întâlnită a unei boli prionice la om (aproximativ un caz la un milion de locuitori), este heterogenă clinic, putând să se manifeste prin simptome psihotice, depresie și schimbări de comportament și de personalitate.

Paraclinic, boala se caracterizează prin semne EEG specifice, printr-o reacție proteica pozitiva și prin alterarea semnalului la IRM cerebral.

Diagnosticul de certitudine constă în detectarea proteinei prionice (PrPCJD) în țesutul cerebral.

Există deja un test folosit în scop de diagnostic si anume testarea lichidului cefalorahidian, cu un procent de certitudine (specificitate) de 80–90% (adică unul-două rezultate fals negative din zece testări).

Un studiu publicat pe 7 august 2014 în New England Journal of Medicine propune o metodă nouă de diagnostic, prin detectarea PrP nu din LCR, ci din celulele recoltate prin periaj la nivelul epiteliului olfactiv.

Metoda descrisă a avut o sensibilitate de 97% (30 de rezultate pozitive din 31 de pacienți bolnavi testați) și o specificitate de 100% (nici un rezultat fals pozitiv la grupul de control), comparativ cu o sensibilitate de doar 77% la testarea LCR. De fapt, s-au obținut rezultate mai bune deoarece concentrația PrP a fost de zece până la o mie de ori mai mare în epiteliul olfactiv decât în LCR.

Un al doilea studiu publicat în New England Journal of Medicine sugerează posibilitatea de a folosi un test urinar pentru screeningul vBCJ la persoanele cu forme latente de boală, înainte de aparitia simptomelor. Testul a fost verificat pe mostrele de urină obținute de la 14 pacienți cu vBCJ, rezultatul fiind pozitiv în 13 dintre acestea; niciuna din cele 224 de probe de control nu a fost pozitivă (specificitate 100%). Chiar dacă estimările arată că proteina prionică are concentrații urinare infime (între 10–16 și 3×10–21/ml, adică între 40 și 100 de particule prionice oligomerice per mililitru de urină), testul ar putea fi utilizat pentru diagnosticul precoce al vBCJ.

Ambele metode se bazează pe amplificarea efectului prezenței proteinelor prionice, cu obținerea unor agregate proteice suficient de mari astfel incat sa fie detectate. Însă, conform unui alt studiu publicat în același număr al revistei NEJM , s-a demonstrat că există o tendință a proteinei normale de a forma oligomeri și fibrile chiar și în absența unor nuclee PrP, deci trebuie avuta o oarecare rezervă în privința acuratetii acestor metode de diagnostic timpuriu al bolilor prionice, mai ales în condițiile în care validarea este sever limitată de numărul mic de pacienți.

Epidemiologie

Maladiile prionice umane sunt exogene (natura infectioasa) sau endogene, adica sunt mostenite prin predispozitie genetica, iar altele au caracter sporadic (apar fara cauze cunoscute). Formele sporadice nu au etiologie infectioasa sau genetica si se datoreaza conversiei spontane a PrPc in proteina patologica PrPsc sau existentei unei mutatii somatice nedetectate in proteina, ce favorizeaza conversia la PrPsc.

Formele infectioase ale maladiei prionice sunt rezultatul transmiterii orizontale a prionilor infectiosi. Cele mai cunoscute sunt boala “kuru” si boala Creutzfeldt-Jacoob.

Ponderea cauzelor bolilor prionice este urmatoarea :

1. Bolile prionice, de natura infectioasa (5%)

2. Boli prionice sporadice (80%)

3. Boli prionice genetice (15%)

Desi la o analiza mai amanuntita a bolii kuru si mai recent a bolii CJD in varianta noua (vCJD), acestea sunt in majoritatea cazurilor de natura sporadica si nu genetica.

Boala CJD sporadica apare la o rata de 0.5 la un million de indivizi pe an ; aceasta rata de incidenta este universala si pana la acest moment a ramas constanta. Se crede ca apare ca rezultat a unei schimbari conformationale intr-o singura protein prion, fiind un eveniment stochastic care apare chiar si la oamenii sanatosi. O alta posibilitate este ca plierea gresita initiala a moleculei de prion sa apara ca urmare a unei mutatii somatice in gena prion dintr-un singur neuron.

Aproximativ 15% dintre bolile prionice apar ca urmare a mutatiei genei prion transmise ereditar. Aceasta gena se gaseste pe cromozomul 20p. Mai mult de 30 de mutatii patogene au fost descrise, toate cauzand aparitia bolilor autozomale dominant mostenite. Aceste mutatii ilustreaza mare variabilitate a variabilitatii fenotipice, chiar si in interiorul familiilor care au aceeasi mutatie.

Cea mai cunoscuta boala prionica ereditara este sindromul Gerstmann-Straussler-Scheinker. Aceasta boala apare de obicei in a a treia sau a patra decada a vietii si are simptome precum ataxie spinocerebeloasa cu sindrom piramidal si extrapiramidal. Dementa apare mult mai tarziu in cazul bolii CJD, iar moartea survine de obicei la cinci ani de la diagnostic.

Mutatia care cauzeaza GSS a fost prima oara identificata de Hsiao in 1989, pe care a denumit-o P102L, desi s-a aratat ca alte cateva mutatii ale genei proteinei prion cauzeaza boala. (Hsiao si echipa 1989).

In cateoria bolilor prionice sunt incluse si alte boli, in afara GSS si CJD, care pot avea simptome asemanatoare cu cele clasice dar care la care pot lipsi trasaturile histologice. De cele mai multe ori, imunohistochimia proteinei PrP este de obicei pozitiva. (Collinge si echipa, 1992).

In aceste cazuri pot aparea combinatii de simptome precum dementa progresiva, ataxia cerebrala, sindrom piramial si extrapiramidal, sindrom pseudobulbar, mioclone, chorea, convulsii si atrofii musculare evolutive (amiotrofie). Diagnosticul este confirmat prin secventierea genei proteinei prion.

Spectrul acestor boli a fost marit odata cu aparitia Insomniei Fatale Familiale (FFI) in 1986. Pacientii aveau insomnia progresiva si incurabila (Lugaresi si echipa, 1986). Desi pacientii diagnosticati cu IFF aveau astrocitoza corticala moderata, trasatura definitorie este atrofia anterior-ventrala si median-dorsala a nucleilor talamici.

Doi pacienti cu IFF aveau spongioza larg raspandita si semnale detectate prin electroencefalograma cu manifestare periodica. La aceeasi pacienti s-a descoperit o mutatie la codonul 178 a genei prion (Medori si echipa, 1922a, 1922b; Gambetti si echipa 1993), mutatie care era anterior atribuita bolii CJD.

Pentru a intelege mai bine mecanismele IFF, aceasta boala a fost analizata pe animalele de laborator (Collinge si echipa 1995, Tateishi si echipa 1995). S-a conchis asadar ca encefalopatia spngiforma apare ca rezultat al mutatiei genei prion (Medori si echipa, 1992; Kretzschmar si echipa 1995; Mastrianni si echipa, 1996) si ca prionii formati au caracter transmisibil. Toate aceste descoperiri au condus la concluzia ca singurul agent declansator si constituent al bolii este proteina prion.

Aceste decoperiri fac din bolile prionice un caz exceptional printre alte categorii de boli pentru ca au multiple cauze: mutatii genetice, caracter spontan sau infectios.

Incidenta cea mai scazuta a bolilor prionice este cea de natura dietetica, care apare ca urmare a ingestiei de alimente contaminate cu agenti infectiosi.

In literatura medicala de specialitate sunt multe cazuri de pacienti care au aceasta boala ca rezultat al contaminarii cu instrumente chirurgicale (Gibbs si echipa, 1994), injectarea de hormoni preparati prin prelevarea de tesut cadaveric din glanda pituitara contaminata (Rappaport si Graham, 1987), transplant de cornee (Kennedy si echipa 2001, Gottesdiener, 1989) si implantarea grefelor de dura mater cadaveric (Clavel si Clavel, 1996).

Aceste descopriri au revolutionat practica medicala: hormonii pituitari sunt fabricati prin tehnici de recombinare si prin tehnici de screening a donatorilor de organe in cazul transplantelor de organe si tesuturi.

Acest screening se realizeaza prin analiza arborelui genealogic al donatorului sau prin analiza potentialelor situatii de expunere la o boala prionica, prin folosirea anterioara a hormonilor de provenienta cadaverica sau a implanturilor de dura mater. Din cauza faptului ca la ora actuala nu exista nici un test rapid de diagnostic validat, procesul de screening, desi util in diagnostic, este anevoios.

In anii ’ 90 in Marea Britanie encefalopatia spongiforma bovina (BSE) a fost transmisa oamenilor (Hill si echipa, 1997a; Collinge si echipa, 1996). Originea BSE va ramane cel mai probabil necunoscuta, dar se crede ca acest caz de boala sporadica, a aparut la o singura vaca, prin schimbari conformationale intr-o molecula de proteina prion sau prin mutatia suferita de o singura gena a proteinei prion (mecanismele moleculare fiind asemanatoare cu cele ale bolii CJD de la oameni). Acest eveniment poate fi singular in cateva sute de ani.

Pe baza dovezilor istorice si a practicilor industriale de la aceasta data s-a incercat explicarea acestei epidemii care a depasit granitele dintre specii ; aceasta epidemie ar fi putut sa apara ca urmare a schimbarilor din practicile alimentare din anii 1980.

Astfel, parti din scheletul si maduva bovina au reintrat in lantul alimentar. Asa s-a transmis agentul infectios si la alte vaci care au dezvoltat boala BSE, producand in timp o epidemie de BSE la vaci, care a patruns in ultimul stagiu in lantul alimentar uman la scara industriala.

Transmisibilitatea BSE la oameni ca vCJD (Hill si echipa, 1997) a ridicat o vasta problema de sanatate nationala, ca urmare a mortii confirmate a 119 din cauza vCJD (Unitatea de supraveghere a CJD, 2002).

Aceste diagnostice reprezinta doar o mica fractie de boli prionice, sporadice sau ereditare, dar numarul persoanelor care sunt infectate cu agentul infectios in perioada de incubatie sau latent este necunoscut (Ghani si echipa, 1999; Hilton si echipa, 2000).

Se stie ca perioada de incubare a agentului patogen cauzator al bolii Kuru este de ordinal deceniilor si ca in cazul vCJD prionii bovini trebuie sa patrunda printr-o bariera de transmitere, ceea ce va mari perioada de incubatie.

Perioada mare de incubatie a vCJD implica mai multe riscuri: purtatorii asimptomatici vor transmite boala prin instrumente chirurgicale, donatii de sange, sau organe, crescand in mod semnificativ numarul de pacienti.

Desi simularile care s-au facut folosind modele matematice sugereaza ca este putin probabil ca in Marea Britanie sa apara o epidemie de vCJD (s-a luat in considerare marimea riscului de transmitere a vCJD prin intermediul instrumentelor chirurgicale, folosindu-se scenarii numerice si de modelare), nu exclud posibilitatea. (Departamentul de sanatate publica al Marii Britanii, 2001).

Realitatea acestor riscuri este confirmata de cazuri de transmitere a bolii prin instrumente chirurgicale (Gibbs si echipa, 1994), dar marimea riscului de epidemie ramane imposibil de cuantificat pana cand vor fi cuantificate in intregime datele purtatorilor asimptomatici. (Hilton si echipa, 2002; Ghani, 2002).

Abordari terapeutice ale bolilor prionice

Mecanismul implicat in patologia prionica nu este elucidat in totalitate la ora actuala 5 ceea ce a condus la o dezvoltare lenta a tratamentului terapeutic. 2

Totusi, este stiut ca prionii nu au nevoie de acizi nucleic sau alti cofactori pentru a se raspandi. 6,7

Si ca manifestarile clinice nu pot aparea in absenta proteinei prpc. 8

Importanta intelegerii rolului transformarii proteinei Prpc si acumularea in sistemul nervos prin formarea unor placi de amiloid este necesara nu numai pentru tulburarile neurodegenerative cauzate de prioni.

Neurodegenerarea cauzata de o schimbare conformationala a proteinei pare a fi mecanismul generic al patogenezei. 9,10

Rezultatele unor teste in vivo si in vitro au confirmat rolul mutatiei tau, amiloid-b si a-synucleazei in dezvoltarea patologiei regionale si a avansarii bolii in cazul maladiilor Alzheimer, dementa frontotemporala si Parkinson. 11,12

Existenta disfunctiei celulare impreuna cu propagarea proteinei infectioase precum si acumularea sub forma placilor de amiloid sunt o trasatura comuna a acestor boli desi nu conduc in toate cazurile la moarte neuronala. 9

In timp ce caracterul infectios pare a fi o trasatura exclusive a bolilor prionice 10, procesul generic de distrugere neuronala este comun mai multor boli neurodegenerative, ceea ce ar putea insemna ca dezvoltarea unor agenti terapeutici pentru bolile prionce pot fi folositi si pentru tratamentul altor boli. 13

Fundamentul terapeutic se axeaza pe prezumtia ca bolile prionice sunt rezultatul unei plieri gresite a proteinei prpc care se acumuleaza intr-o izoforma rezistenta la actiunea proteazelor. 6

Inhibarea directa a acestei conversii, degradarea Prppres, interferenta cu compusi moleculari importanti (Fab, glicozaminoglicani) sau oprirea expresiei Prpc si/sau localizarea la suprafata celulei raman importantele abordari terapeutice. 5, 14-16

Lamina este un receptor cu mare afinitate pentru proteina prion si constituie de asemenea unul dintre obiectele principale ale tratamentului terapeutic. Pe baza rezultatelor experimentale, se pare ca lamina functioneaza ca receptor atat pentru proteina prion normala cat si pentru forma infectioasa prpres 17 si ar putea sa joace un rol important in legarea prpres si transmiterea intracelulara. S-a observat ca siRNA din lamina prion receptor inhiba acumularea prpres in celulele neuroblastice N2a infectate.

Descoperirile demonstreaza ca activarea transcriptionala a prpc poate rezulta din legarea directa a p53 la regiunea promoter suspectata. 8

Generarea ab oligomerilor printr-o actiune a g secretazaei activeaza p53.

Intelegerea acestei interactii complexe sugereaza ca utilizarea inhibitorilor g secretazei repezinta o abordare terapeutica pentru a modula transcriptia Prpc dar si pentru a inlatura acumularea prpres. 8

Conform studiilor echipei de cercetatori conduse de Spilman 19 s-a demonstrat o reducere a acumularii prionilor in zona neocorticala si a hipocampului a soarecilor infectati ca urmare a administrarii pe cale orala a inhibitorilor g secretazei si a aquinacrinei.

Totusi, conform aceluiasi studiu, utilizarea in terapia antiprionica numai a inhibitorilor g secretazei nu au dus la o amelioare a simptomelor.

Mai multe studii au aratat ca 20,21, Nussbaum inlaturarea proteinei tau (proteina cu rol in marirea citotoxicitatii b amiloidului) are ca rezultat o protectie completa impotriva pierderii neuronale si a degradarii activitatii celulelor gliale de formele toxice ab de la soareci.

Prin urmare, aceste cercetari au starnit un mare interes pentru cercetatori deoarece pot avea efecte si pentru tratamentul altor boli neurodegenerative.

Experimentele in vivo si in vitro sugereaza ca b amiloidul interactioneaza cu prpc 22. Rezultatul este o activare kinazica si o hiperfosforilare a proteinei tau. 23

Numarul mare de proteine tau a fost observat si in cazul bolilor prionice in stadiu avansat si sunt un marker semnificativ atunci cand se compara cu bolile sporadice CJD 25.

Recent, aboradarile terapeutice se axeaza si pe actiunea a-synuclein, care este o componenta majora a incluziunilor filamentoase (se intalnesc in marea majoritate a bolilor neurodegenerative printre care se numara si Parkinson, dementa Lewy si atrofia multipla). 12.

Leziunile produse de a-synuclein se raspandesc progresiv in creier, corelandu-se indeaproape cu deficitele clinice. De asemenea, mai multe cercetari experimenatale au condus la concluzia ca forma patologica a-synuclein este transmisibila 12,26, demonstrandu-se astfel ca ca introducerea exogena a fibrilelor de a-synucleina induc patologia Lewy in culturile neuronale. 27

Recent, Masuda-Suzukake si colegii (12) au demonstrat ca injectiile intracerebrale a compusului insolubil sarkosyl a-sinucleina din creierul pacientilor cu dementa corporala Lewy sau a a-synuclein recombinanta cu un tip prezent la soarece induc hiperfosforilarea patologica a a-sinucleinei in vivo.

Mai mult, analizele biochimice au relevant ca transformarea a-synucleinei este asemanatoare celei a proteinei prion, care continua cu acumulari progresive si raspandirea pe intregul tesut neuronal. 12

In afara tratamentului medicamentos, exista si alte abordari terapeutice teoretice pentru tratamentul bolilor prionice. Unele date experimentale sugereaza ca se pot folosi si anticorpi monoclonali impotriva PrP pentru tratamentul profilactic. 5

Totusi, simularea in vivo a competentei celulare imune care recunoaste si neutralizeaza izoformele proteinelor pliate anormal trebuie sa fie de asemenea investigate.

Sistemele de inoculare care folosesc lentivirusi sau adenovirsuri cu compusi anti-prionici, inclusive anticorpi, interferenta de scurta durata a micro RNA sau a RNA antisns raman de asemenea de luat in considerare.

Preventia bolilor prionice

Se bazează pe :

• Detecția și eliminarea animalelor infectate

• Detecția subiectilor suspecti și izolarea lor pentru o cercetare medicală amănunțită.

Este greu de presupsus că se poate fabrica un vaccin antiprionic deoarece proteina prion este în mod normal prezenta în organism. De aceea, un grup de cercetători elvetieni au modifica genele soarecilor astfel incăt limfocitele să producă anticorpi care ar putea să distinga intre o proteină prion patologică PrPSc și una PrPC normală. Totuși, în acest moment, nu există nici un studiu care să-i demonstreze capacitatea curativa.

Cu toate acestea, mai multe molecule au fost testate și par a arata o încetinire a procesului neurodegenerativ al bolii Alzheimer. Printre acestea se numara quinacrina, un compus care se utilizează în tratamentele terapeutice anti-malarie și polisulfatul de Pentosan.

Principalele obstacole pentru a găsi un tratament cu adevarat eficace este ca aceste boli afectează encefalul, separat de circulatia sanguina de bariera hemato-cefalică (care impiedică trecerea majoritatii moleculelor), dar și că sistemul imunitar nu recunoaste acest tip de agenti infecțioși.

Totuși, potrivit unui studiu prezentat pe 28 mai 2007, la “American Academy of Neurology’s 59 th Annual Meeting”, în Boston, un vaccin ar putea preveni dezvoltarea unor boli neurologice asemănătoare ESB.

Pentru a dezvolta un vaccin care să stimuleze sistemul imun al soarecilor, cercetătorii au atașat prioni de o radacina de Salmonella modificată genetic, administrând-o apoi acestora.

Soarecii au fost apoi impartiti în două grupe, unul cu nivel mare de anticorpi în sânge și celalalt cu o concentratie mică a anticorpilor din sânge.

Primul grup nu a prezentat niciun simptom al bolii după 400 de zile. Cel de-al doilea grup a manifestat de asemenea o intarziere a perioadei de declanșare a bolii. In mod normal sunt necesare 120 de zile pentru ca soarecii care nu au fost vaccinati să manifeste boala.

Autorul studiului, Thomas Wisniewski, a afirmat că este necesară mai multa muncă înainte ca vaccinul să poate fi folosit și pentru oameni. "Versiunea umana a bolilor prionice se declansează de obicei spontan și rareori din cauza consumului de carne contaminată.

Dacă, însă, de exemplu, ar exista o izbucnire semnificativa a bolii cronice la căprioare și elani și dacă ar fi transmisibila oamenilor, atunci am avea nevoie de un asemenea vaccin pentru a proteja oamenii în zonele de vanatoare”, declara acesta.

O altă observatie a sa este aceea ca un vaccin ce reduce raspandirea bolilor prionice la animale micsorează posibilitatea ca aceasta să afecteze și oamenii.Provocari terapeutice

Tratamentul bolilor prionice

Investigarea posibilitatilor terapeutice pentru bolile rare pot deseori sa arate aspecte fiziologice particulare si pentru conditiile comune. 13 Neurodegenerarea cauzata de mecanismele de pliere anormala par a fi un fenomen generic 9 si prin urmare identificarea unui agent antiprionic poate avea implicatii terapeutice raspandite.

Totusi, aceste posibilitati terpeutice nu pot fi explorate cu usurinta din cauza particularitatilor comune bolilor prionice: progresia rapida clinica, rapida deteriorare a tesutului cerebral suferita de pacienti care dezvolta una dintre aceste boli.

De asemenea, schimbarile tesutului neuronal care devine spongiform si precum si pierderea sinapselor neuronale nu sunt diagnosticate din timp (doar post mortem prin analiza histologica a tesutului).

O leziune produsa de a-synucleina si o inmultire a proteinei tau se coreleaza de cele mai multe ori cu o progresie clinica a unei boli neurodegenerative. De aceea, este greu de diagnosticat timpuriu o moarte neuronala. Alaturi de dificultatea cu care se stabileste diagnosticul si durata perioadei de investigatie, traiectoria ireversibila a tulburarilor neurodegenerative fac ca un tratament rapid sa nu poate fi aplicat cu usurinta.

Asadar, diagnosticul exact timpuriu poate fi cheia succesului terapeutic si absolut necesar analizei progresei bolii. 13

Un diagnostic sigur nu poate fi pus in absenta unor criterii si prin urmare este necesara analiza suplimentara cand propagarile prionilor pot sa nu fie cauza neurodizabilitatii pacientilor.

Progresia rapida a deficitelor neurologice caracteristice bolilor prionice cauzeaza o rata mica de supravietuire a pacientilor.

Tratamentul profilactic este indicat pentru pacientii susceptibili sa dezvolte boli prionice de natura genetica. Acesta subcategorie de pacienti ar putea sa constituie o ocazie rara de a analiza potentialele beneficii ale agentilor antiprionici inainte ca moartea neuronala sa apara, putand sa ofere o privire de ansamblu asupra evolutei starii pacientilor pe termen lung.

Având în vedere caracterul indestructibil al prionilor, la ora actuală nu există nici un tratament care poate sa vindece un bonlav de o boala prionica.

Din cauza faptului că legaturile peptidice ale prionilor sunt foarte rezistente la temperaturi extreme (din studiile experimentale a reieșit că este necesar să se expuna țesutul nervos infectat cu prioni la o temperatura de 275°C combinat cu o presiune atmosferică de 100,000 PSI pentru a se observa distrugerea legaturilor covalente).

Totuși, pentru prima dată, cercetătorii au descoperit substanțe cu proprietăți anti-prionice, care ar putea sta la baza unor terapii salvatoare.

Cercetătorii de la institutul The Scripps Research Institute (TSRI) au identificat două medicamente care sunt deja aprobate pentru uz uman și care prezintă proprietăți anti-prionice.

Rezultatele studiului au fost publicate în Proceedings of the National Academy of Sciences.

Utilizând o tehnică numită high-throughput screening (HTS), care permite testarea rapidă a mai multor medicamente, printr-o combinație de metode fizico-chimice, ei au încercat să descopere compuși chimici care reduc nivelul formei normale a proteinelor prionice normale PrP, a căror structură spațială este modificată de către prioni. Au descoperit astfel doi compuși care reduc apariția proteinei PrP la suprafața celulelor cu aproximativ 70%.

Cele două substanțe sunt comercializate sub forma unor medicamente numite tacrolimus și astemizol.

Tacrolimus este un imunosupresant (reduce activitatea sistemului imunitar) administrat în cazul transplantului de organe, pentru a preveni respingerea transplantului de organe. Totuși, tacrolimus s-ar putea dovedi problematic ca medicament anti-prionic, din cauza unor efecte adverse, printre care se număra si neurotoxicitatea.

Astemizolul este un medicament antihistaminic care are potențialul de a fi folosit ca medicament anti-prionic. Deși în SUA a fost retras în 1999 de pe piața medicamentelor disponibile fără rețetă, deoarece ar fi cauzat aritmiii cardiace (atunci când a fost utilizat în doze mari), a rămas disponibil în industria farmaceutică în forma sa generică în peste 30 de țări, unde este considerat suficient de sigur pentru administrare. Acest medicament, astemizolul poate trece de bariera hemato-cefalica fiind eficient în doze relativ mici.

Astemizolul pare să stimuleze autofagia celulară (procesul prin care celulele macrofage elimină componentele nedorite din organism). Autofagia este stimulata în cazul mai multe boli neurodegenerative asociate cu anomalii de structură a proteinelor, precum maladiile Alzheimer, Parkinson și Huntington.

Studii viitoare asupra modului de acțiune al astemizolului asupra proteinei prion patologice ar putea duce la descoperirea unor noi abordări terapeutice pentru bolile prionice și afecțiunile cu simptome asemănătoare.

Progresele din informatica biomedicală au permis oamenilor de stiinta să identifice compuși care pot servi ca tratament pentru bolile prionice. Spre exemplu, cercetătorii au descoperit o proteină chaperon capabilă să se atașeze de proteina PrPC și să-i stabilizeze conformația spațială, ceea ce ar reduce posibilitatea plierii în conformația spațială patologică PrPSc.

O echipă de cercetători britanici a publicat un material in revista americana Science Translational Medicine, în care anunță testarea unui medicament care acționează asupra unui punct important al acestui mecanism – asupra enzimei denumite PERK, care are un rol important in sinteza de proteine.

Cunoscut după numele de laborator GSK2606414, acest produs este realizat de compania britanică GlaxoSmithKline. El a fost testat pe 29 de șoareci cu boli prionice, familie de boli din care face parte și maladia Creuzfeldt-Jakob. Reacțiile observate pe acești șoareci au fost comparate cu un grup de șoareci de control, șoareci cu boli prionice care nu au primit acest medicament.

Oamenii de știință au observat că șoarecii tratați astfel, la 7 săptămâni după îmbolnăvire, nu au manifestat pierderi de memorie în cadrul unui test de recunoaștere a unui obiect familiar, în timp ce rozătoarele tratate la 9 săptămâni după îmbolnăvire prezentau pierderi de memorie.

Șoarecii au fost uciși și autopsiați, iar în urma examinării la microscop s-a constat că nivelul de moarte neuronală la cei care au primit medicamentul era mult mai mic decât la cei care nu au primit tratamentul și mai mic la cei care au primit medicamentul după 7 săptămâni, comparativ cu cei care l-au primit după 9 săptămâni.

Experimentele terpeutice

1. Sulfatul de pentosan

Sulfatul de pentosan este o molecula de poliglicozid de dimensiuni mari care are o mica activitate heparin like. Fig 2. Se crede ca pps actioneaza in competitie cu heparin sulfat proteoglicani endogeni ca un co-receptor pentru protein prion PrP de pe suprafata celulara. 31

Cand este administrata direct pe ventriculii cerebrali a prpres soareci infectati, PPS prelungeste in mod significativ perioada de incubatie a procesului timpuriu de dezvoltare a bolii si inhiba formarea prpres in celulele de cultura. Totusi, experimentele echipei conduse de doctoral Albeit, promitatoare la inceput, au esuat sa arate o reversie a manifestarilor clinice sau o recuperare a deficitelor neurologice care se intalnesc la pacienti.

Administrarea continua intraventriculara a infuziilor de PPS (1-120 micro grame/kg/zi) a inceput la un pacient de 68 de ani suferind de boala sCJD, la 10 luni de la aparitia simptomelor. 32.

In timp ce deficitele existente ale pacientului nu s-au imbunatatit, s-a demonstrat o stopare in deterioararea neurologica pentru 4 luni (de la 2 pana la 8 luni de infuzie de PPS) si o rata de supravietuire de 27 de luni care a depasit orice rata de supravietuire de pana atunci, conform studiilor de specialitate.

De asemenea, un alt pacient diagnosticat cu vCJD a avut o rata de supravietuire de 51 de luni administrandu-i-se in mod continuu intraventricular a PPS cu o doza de 32 mg/kg/zi timp de 31 de luni. 33 PARRY si echipa

Mai mult, un studiu prospectiv condus de Tsuboi si echipa 30, a aratat o prelungire a ratei medie de supravietuire de 24.2 luni la 4 pacienti ca urmare a administrarii intraventriculare a infuziei de PPS (120 micrograme/kg/zi).

Un pacient traieste si acum dupa 6 ani de administrare continua a infuziei, desi nici o imbunatatire neurologica majora nu a fost observata. Totusi, luand in considerare o asa prelungire a vietii acestui pacient, trebuie sa fie luata in discutie patologia prionica, asa cum este descria la ora actuala.

2. Quiacrina

Quinacrina este un derivat al acridinei, de asemenea de mare interes pentru abordarile terapeutice ale bolilor prionice. Cel mai interesant este efectul acesui compus : inhiba formarea Prpres la celule neuroblasmatice infectate cu scrapie. 34. Aceasta functie inhibitorie se crede ca deriva din includerea unui lant de nitrogen la inelul quinolinic. 35. Datorita acestei capacitate, este folosit ca un medicament anti-malarie. In vivo insa nu s-a putut stabili vreun beneficiu a tratamentului cu quinacrina pentru bolile prionice.

Furukawa si echipa 37 au demonstrat un raspuns transient in halucinatiile vizuale si auditive la un numar mic de pacienti. Recuperarea motorie a membrelor si o miscare a ochiului au fost raportate la o femeie de 37 de ani care era diagnstica cu boala CJD secundar unei grefari cadaverice a durei mater ca urmare a administrarii de 300 mg de quinacrina pe zi. Totusi, la numai doua luni de administrare, stare pacientei s-a deterioarat si dizabilitatile motorii au reaparut.

Unui grup de alti 4 pacienti care suferau de boala CJD sporadic li s-a administrat 300 mg de quinacrina ; mutismul akinetic s-a imbunatatit in doua saptamani la un pacient.

Ceilalti trei pacienti au aratat o imbunatatire a raspunsurilor interactive a muschilor oculari, miscare voluntara, si raspunsuri la stimuli verbali si auditivi dupa o perioada de tratament care a durat 2 luni.

Un an dupa acest studiu, un altul a aratat o imbunatatire desi nesemnificativa ca urmare a administrarii quiacrinei pe un grup de 32 de pacienti care suferau de forme sporadice de CJD.

Nici un beneficiu patologic nu a fost observat.

Collinge si colegii 41 au ilustrat ca quinacrina nu este un agent terapeutic si nu poate influenta istoria naturala a bolii. Mai mult, din cei 207 pacienti care sufereau de CJD inclusi in acest studiu numai 26 au supravietuit si raspundeau tratamentului cu quiacrina. Ceea ce insemna ca doar 25% dintre pacienti au supravietuit ; 4 pacienti au prezentat o imbunatatire neurologica, iar doi au prezentat efecte adverse grave.

3. Cloropromazina

Cloropromazina este un inhibitor fosfolipazic A2, care reduce stresul oxidativ inflamatoriu si care poate sa incetineasca procesul neurodegenerativ. 43

Benito Leon 44 a tratat doi pacienti care suferau de insomnia fatala familiala cu quinacrina si cloropromazina fara nici rezultat. Mai mult, simptomele pacientilor s-au inrautatit. Acelasi tratament s-a administrat si la o pacienta cu varsta de 54 de ani care suferea de o varianta Heidenhain a bolilor prionice si pacientul a avut o stare care s-a stabilizat asftel incat a mai supravietuit inca 19 luni de la diagnosticul bolii. 45

O imbunatatire clinica ca urmare a administrarii correlate a quinacrinei si cloropromazinei s-a aratat la o femeie de 46 de ani care suferea de o forma a bolii CJD.

In vitro s-a aratat ca biosinteza colesterolului moduleaza evolutia infectei prionice in celulele neuronale. De aici, s-a putut deduce o posibila asociere intre infectia prionica si/sau susceptibilitatea de a avea o forma homeostazica alterata de colesterol.

Pe baza acestui studiu, o alta echipa de cercetatori condusi de doctoral Orru 48 au demonstrat ca adaugarea unor modulatori de colesterol sub forma esterica (progesteron, pioglitazona, verapamil si everolimus) la quinacrina si cloropromazina au imbunatatit efectul antiprionic prin reducerea plierii 10 EC50. In timp ce mecanismul nu este inca elucidat, aceste rezultate promitatoare pot constitui o investigare amanuntita viitoare.

4. Thioflavina

Thioflavina este folosita ca biomarker pentru a se identifica proteinele amiloidogenice si este caracterizata de o birefringenta pozitiva.

Thioflavina si compusii asemantatori pot inhiba productia de PrPres 49. S-a aratat ca thioflavina interfera cu agregarea proteinei PrP 185-288 si diminueaza ansmablul fibrogenic. Totusi, nu este nici un studiu care sa arate vreun effect al thioflavinei in cazul bolilor prionice.

5. Amfotericina B

In 1987, s-a demonstra ca antibioticul amfotericina B incetinea perioada de incubatie la hamsterii carora li se inoculase scrapie in tesutul cerebral. 52

In 1992, Xi si echipa sa 53 au aratat ca hamsterii infectati cu scrapie carora li s-a administrat amfotericina B prezinta o acumulare incetinita a Prpres cu 30 de zile, fara sa interfere ecu replicarea scrapiei. Hamsterii tratati cu amfotericina B au dezvoltat o boala prionica mai tarziu decat cei netratati. Demaimay si echipa 54 a aratat ca un tratament ulterior cu amfotericina a prelungit viata soarecilor infectati cu scrapie – intre 80 si 140 de zile postinoculare cu reducerea in acumularea Prpres.

Un derivat sintetic al amfotericinei B a putut sa previna replicarea agentului scrapiei la situl inocularii. Acest loc al inocularii continea astrocite, unde cantitatea mare de PrP era produsa. Grigoriev si echipa 55 au sugerat ca sistemul lizozomal ar putea fi tinta amfotericinei B. In vitro, studiile au aratat ca amfotericina B previne conversia Prpc (alfa helicala) la forma patologica Prpres (beta pliuri patologice). 56

In 1992, doi pacienti care erau diagnosticati cu CJD au fost tratati cu insucces cu amfotericina B. O pacienta de 71 de ani a fost internata timp de trei luni dupa aparitia dementei. I-a fost administrata Amfotericina B intravenos, la cinci zile de la internare cu o doza de 0.25-1 mg/g. Amfotericina B i-a fost administrate sase zile pe saptamana si doza maxima i-a fost administrata in ziua a opta. Dupa douazeci de zile de tratament, starea pacientei s-a inrautatit si aceasta a murit.

Cel de-al doilea pacient a fost o femeie de 50 de ani care a fost diagnosticata cu CJD la cinci luni de la aparitie, moment in care era deja imobilizata la pat, suferind de tulburari motorii. Amfotericina B s-a adminstrat la o saptamana dupa ce a fost internata. Tramentul presupunea administrarea de antibitotic in doze progresive, doza maxima fiind administrata in ziua 8. Tratamentul a continuat sa fie administrat sase zile pe saptamana prin injectii intravenoase cu eliberare lenta de compus. Starea de sanatate a pacientei s-a agravat si a murit la 8 luni de la aparitia bolii.

In concluzie, amfotericina B nu a avut efecte neurologice benefice pentru nici unul dintre acesti doi pacienti, si nu a prevenit progresia bolii.

6. Tetraciclinele

Tetraciclinele interactioneaza cu PrPsc, destabilizand structura fibrilelor de amiloid si facilitand fagia de catre proteinaza K a peptidelor PrP 58, 59.

Tetraciclinele par sa fie nu numai legate de agregatele PrP, dar si de alte peptide neurotoxice care inhiba intoxicarea celulelor neuronale si gliale, contribuind si la proliferarea astrogliala. 58,59

De Luigi si colegii 42 au efectuat studii experimentale care au arat nu numai eficienta tertaciclinelor in stadiile incipiente ale bolii, dar si ineficienta acestora cand sunt administrate in stadiile avansate ale bolii.

In primul experiment, un grup de hamsteri a fost infectat cu scrapie inoculata intramuscular si au primit o singura doza de 10 mg/kg de Doxycyclina administrata in acelasi loc al infectiei in mai putin de o ora.

Aceasta doza unica a crescut in mod semnificativ rata de supravietuire cu 64% ( de la 217 zile in grupul de control la 355 zile la grupul tratat cu doxycliclina).

O singura infuzie intracerebroventriculara de 25 de micrograme Doxyciclina sau Minocyclina care patrunde in lizozomi, a fost adminstrata 60 de zile dupa inoculare cand 50% dintre hamsteri au prezentat simptome ale acestei boli. Chiar si in acest stadiu avansat de neurodegenerare, rata de supravietuire a crescut cu 8.1% si respective 10%.

Aceste rezultate care reises din prelucrareaa datelor experimentale arata ca acesti doi compusi intarzie in mod semnificativ instalarea simpomelor clinice ale bolilor si prelungesc rata de supravietuire. 58

Mai mult, se crede ca tetraciclinele inhiba plierea gresita a proteinei Pr Psi prin urmare reduce gradul de infectie.

Implicatille acestei descoperiri sugereaza de asemenea ca aceasta abordare se poate extinde si la alte procese neurodegenerative care au drept cauza plierea gresita a proteinelor.

7. Antidepresivi triciclici

Antidepresivii triciclici, cum ar fi spre exemplu Desipramina ( fig 2) sunt compusi heterociclici care au inlaturat oprirea infectiei cu prioni in celulele de cultura (60).

Acest efect anti-prionic este datorat redistributiei formelor de colesterol din plasma membranara in compartimentul intracelular. Aceasta duce la destabilizarea membranara.

Interesant de remarcat este si efectul anti-prionic al desipraminei, quinacrinei, quinapyraminei impreuna cu simvastatin, un inhibitor al CoAcetil reductazei.

Nu este nici o data privind eficienta antiprionica care sa reiasa din experimente asupra oamenilor a antidepresivilor tetraciclici. Mai mult, din cauza efectului neurologic toxic al antidepresivelor tetraciclice asemanatoator cu cel al bolilor prion la oameni, nu sunt recomandate in terapie. 61

Studiul lui Klingenstein si al echipei sale de cercetatori (61) pun in discutie posibilitatea ca tratamentele viitoare ale bolilor prionice sa contina o combinatie de medicamente precum antidepresivii tetraciclici si derivati ai acridinei cum ar fi quinacrina si statina.

9. Clorura de Litiu

Clorura de litiu este folosita pentru tratamentul maniei sau disfunctiile bipolare, care se bazeaza pe autofagie, ducand la inlaturarea mutatiilor huntingtin si a a-synnuclein 1.

Aplicatia acestui principiu la celulele neuronale si neneuronale infectate cu prioni au demonstrat o reducere intensa in acumularea de Prpres ca rezultat al autofagiei indusa de clorura de litium. Cand a fost combinata cu Rapamycina, efectele antiprionice ale clorurii de litium au fost din nou evidentiate. 1

Aceasta combinatie synergica a fost de asemenea observata in cazul bolii Huntington. 62

Pentru a intelege cu adevarat acest mecanism, trebuie sa se efectueze mai multe experimente. Aceste descoperiri arata ca poate exista un fenomen generic al neurodegenerarii care are la baza o cauza de natura proteica.

10. Imunoterapiile

In anul 2004, s-a aratat ca raspunsurile umorale imune la proteine prion native de origine eucariotica se coreleaza cu protectia antiprionica. 63

Experimentele efectuate in vivo si in vitro au aratat ca anticorpi ai PrPC scad sau previn transformarea in PrPres. 64,65. Imunizarea, fie activa, fie pasiva poate stimula fagocitoza indusa a anticorpilor, disruperea lor in agregate peptidice, mobilizarea peptidelor toxice solubile, stimularea imunitatii celulare mediata si alte mecanisme. 66

Anticorpii monovalenti fragmentati in numeroase particule ale proteinei prion au fost ilustrati in vitro pentru a preveni oligomerizarea proteinei prion. Aceste regiuni sunt : codonii 90-110, regiunea helix codonii 145-160, capatul terminal carboxylic cu codonii 210-220 si regiunea octarepetitiva. 67

Sakaguchi si Arakawa 68 sugereaza ca aceasta intoleranta ar putea fi inlaturata prin imunizarea PrP cu o enterotoxina bacteriala sau administrate folosind o forma de Salmonella modificata genetic.

Campana si echipa sa 69 au aratat ca administrarea in creier a proteinelor prion specifice folosind un singur lant de diferite fragmente cu adenovirusi asociati transfera cu intarziere boala prionica la soarecii infectati. Lantul cu fragmentele variabile al proteinei PrP care include Arg(PrP 151) este in relatie cu adenovirusii si este cheia ancorarii Prpc la cavitatea anticorpului.

Federoff si echipa 70 au postulat ca imunizarea activa poate disrupe formatiile ab 1-42 la soareci si ca imunizarea pasiva a unui adenovirus recombinant antiprionic poate atenua progresia bolii si prelungi viata in modelele experimentale a bolilor prionice.

Cred ca aceste rezultate ale experimentelor preliminare vor putea conduce in viitor la cercetari imunologice atat a imunizarii active cat si a celei pasive la bolile prionice, asa cum se intampla in cazul bolii Alzheimer. Cu toate acestea, anticorpii nu pot traversa bariera hematocefalica. De aceea, trebuie administrati direct in tesutul cerebral.

Alte posibile abordari terpeutice

Bellingham si echipa sa 71 au aratat ca gena de expresie a proteinei prion este regulata de factorii de transcriptie SP1 si de factor metalic 1 de transcriptie. Proteina Menkes contine o mare cantitate de cupru.

Astfel fibroblastele care au deletia Menkes au un nivel ridicat de cupru. Daca celulele au deletia Menkes supraexprimata , atunci nivelul de cupru este redus. In liniile celulare cu un continut scazut de cupru, este scazuta de asemenea si numarul de proteina prion si mRNA.

Aceste descoperiri conduc la concluzia ca in viitor acesti factori de transcriere pot fi obiectul de studiu al terapiilor antiprionice. Receptorul laminar LRP/LR are o dimensiunde de 37kDa/67kDa si are un rol important in procesul de adeziune celulara, apoptoza,functia de ligare a virsurilor si a protienei prion.

Aceasta proteina cu functii multiple se gaseste pe membrane celulara, in citoplasma si nucleu. Experiementele in vitro care blocheaza receptorii LRP/LR cu anticorpi sau siRNA blocheaza receptorul si reduc infectiozitatea prionica. Asa cum am speficiat anterior, PPS si alti compusi heparinici se leaga la acest receptor. 72

Vectori lentivirali arata o slaba interactiva a siRNA impotriva receptorului laminic, precursor al mRNA-ului au prelungit faza preclinica a hamsterilor infectati cu scrapie. Numeroase alte studii au explorat factorii de transcriptie si receptorul laminic in incercarea de a elucida posibilele abordari terpeutice.

Dismutaza superoxida (DSO), un radical liber care a facut obiectul unor studii recente intr-un model “razator” si rezultaele experimentale preliminare a actiunii unui agent cu actiune similara DSO, a prelungit durata de viata a animalelor infectate cu scrapie, crescand posibilitatea ca un radical liber si stresul oxidativ sa aiba o actiune inhibitorie asupra bolilor prionice. 74

Concluzie

La ora actuala sunt dificultati in dezvoltarea unor noi tratamente a bolilor prionice. Abordarile terapeutice curente se bazaeaza pe rezultatele unor compusi pe un numar mic de pacienti.

Deoarece aceste boli sunt fatale, din punct de vedere etic este imposibila folosirea unuor grupuri de subiecti umani.

Factorii care conduc la aparitia acestor boli precum si rata scurta de supravietuire constutie o dificultate pentru studiile terapeutice.

Totusi, aceste limitary nu ar trebui sa descurajeze cercetarile privind tratamentul bolilor prionice.

Descoperirile recennte sugereaza ca patogeneza neurodegenerative implica plierea anormala a proteinei prion, a tau si a-synucleinei si a proteinelor b-amiloid care. De aceea, o intelegere a acestor procese ar putea sa conduca la o optimizare a modalitatilor terapeutice.

De asemenea, pentru studiul acestor boli, este nevoie de biomarkeri care pot indica raspunsuri clinice ale tratamentului. Acum se cunosc genele care determina aparitia acestor boli, iar subiectii care prezinta o susceptibilitate de a dezvolta o boala prionica pot fi identificate inainte de aparitia acesteia, astfel incat pot primi tratament preventiv, precum cei care mostenesc genele care determina aparitia bolii Alzheimer.

Aceste limitari sugereaza ca in viitor o colaborare internationala ar putea fi necesara pentru a imbunatati tratamentul terpeutic si pentru a coordona alte studii terapeutice similar celor ale grupurilor de studio pentru alte disfunctionaliotati cu un numar mic de pacienti cum ar fi grupul de studio al bolilor Huntington (GSH).

Astfel s-ar putea constitui un studio de grup al bolilor prionice. (GSBP)

Bibliografie

1) Brockes PJ., – Topics in prion cell biology, Current Opinion in Neurobiology, 1999, 571-577.

2) Daggett V., – Structure-function aspects of prion proteins, Current Opinion in Biotechnology, 1998, 9: 359-365.

3)Daude N, Lehmann S, Harris DA, – Identification of intermediate steps in the conversion of a mutant prion protein to a scrapie-like form in cultured cell, J Biol. Chem. 1997, 272: 11604-11612.

4) Foster J., Hunter N., – Transmissible spongiform encephalopathies: transmission, mechanism of disease, and persistence, Current Opinion in Microbiology, 1998, 1: 442-447.

5) Hope J., – Prions and neurodegenerative diseases, Current Opinion in Genetics & Development, 2000, 10: 568-574.

6) Gee H., – Molecular Evolution of Prions, Nature, 1996.

7) Graham SJ., Collinge J., – Prion disease-the propagation of infectious protein topologies, Microbes and Infection, 2000, 2: 1445-1449.

8) Graham SJ, Clarke AR., – Mammalian prion proteins, Current Opinion in Structural Biology, 2000, 10: 69-74.

9) Markus G., Aguzzi A., – Peripheral pathogenesis of prion diseases, Microbes and Infection, 2000, 2: 613-619.

10) Prusiner SB., Scott MR., – Genetics of Prions, Annu. Rev. Genet., 1997, 31: 139-175.

11) Rezaie P, Lantos PL, – Microglia and the pathogenesis of spongiform encephalopathies, Brain Research Reviews, 2001, 35:55-72.

12) Telling GC, Parchi P, DeArmond SJ, Cortelli P, Montagna P, Gabizon R, Prusiner SB, – Evidence for the conformational of the pathologic isoform of the prion protein enciphering and propagating prion diversity, Science, 1996, 274, 2079-2082.

13) Wadsworth JDF, Graham SJ, Collinge J.,Hill AF., – Molecular biology of prion propagation, Current Opinion in Genetics & Development, 1999, 9: 338-345.

14) Wickner RB, Edskes HK, Maddelein ML – Prions: Portable prion domains, Current Biology,. 2000,10: 335-337.

Prusiner, S. B. Science 252, 1515−1522 (1991).

Caughey, B. & Raymond, G. J. J. Biol. Chem. 266, 18217−18223 (1991).

Pan, K.-M. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 90, 10962−10966 (1993).

Prusiner, S. B. et al. Cell 63, 673−686 (1990).

Weissmann, C. Nature 349, 569−571 (1991).

Palmer, M. S., Dryden, A. J., Hughes, J. T. & Collinge, J. Nature 352, 340−342 (1991).

Kocisko, D. A. et al. Nature 370, 471−474 (1994).

Wells, G. A. H. & Wilesmith, J. W. Brain Pathol. 5, 91−103 (1995).

Bruce, M. et al. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 343, 405−411 (1994).

Collinge, J. et al. Nature 378, 779−783 (1995).

Bruce, M. E., Fraser, H., McBride, P. A., Scott, J. R. & Dickinson, A. G. în Prion Diseases in Human and Animals (eds Prusiner, S. B., Collinge, J., Powell, J. & Anderton, B.) 497−508 (Ellis Horwood, London, 1992).

Marsh, R. F. & Kimberlin, R. H. J. Infect. Dis. 131, 104−110 (1975).

Bessen, R. A. & Marsh, R. F. J. Virol. 66, 2096−2101 (1992).

Bessen, R. A. & Marsh, R. F. J. Virol. 68, 7859−7868 (1994

Bessen, R. A. et al. Nature 375, 698−700 (1995)

Windl, O. et al. Hum. Genet. 98, 259−264 (1996).

Weller, R. O. Psychol. Med. 19, 1−4 (1989).

Baker, H. F. et al. Lancet 337, 1286 (1991).

Collinge, J., Palmer, M. S. & Dryden, A. J. Lancet 337, 1441−1442 (1991).

Brown, P. et al. Neurology 44, 291−293 (1994).

Will, R. G. et al. Lancet 347, 921−925 (1996).

Collinge, J., Beck, J., Campbell, T., Estibeiro, K. & Will, R. G. Lancet 348, 56 (1996).

Parchi, P. et al. Ann. Neurol. 39, 669−680 (1996).