Biosenzori Pentru Analize Imunochimice Asistate de Nanoparticule

Cuprins

Lista acronimelor

IDA = interdigitated array (matrice de microelectrozi interdigitați)

LOAC = lab-on-a-chip

MEMS = Micro Electro Mechanical Systems (sisteme micro-electro-mecanice)

NP = nanotransportori

PDMS = polidimetil siloxan

PECVD = Plasma Electro Chemical Vapour Deposition (depunere chimică în plasmă din stare de vapori)

PEG = polietilen glicol

RIE = reactive ion etching (gravură cu ioni reactivi) / DRIE = deep RIE

SE = senzor electrochimic

SM = senzor magnetic

sppm = (particule) superparamagnetice

Introducere

Tema aleasă – Biosenzori pentru analize imunochimice asistate de nanoparticule – reprezintă o provocare nu numai prin prisma noutății ce o aduce în domeniu, ci îndeosebi datorită rezultatelor remarcabile obținute: cartografierea arhitecturii țesuturilor tumorale bazată pe rezonanța electromagnetică la suprafața nanoparticulelor. Practic au fost modelați nanotransportori (NPs) cu aplicații în cartografierea melanomului. Scopul experimentului a fost de investigare histopatologică a țesutului tumoral, după administrarea intravenoasă a NPs.

Prezenta lucrare reprezintă o cercetare științifică efectuată pentru dezvoltarea unui dispozitiv integrat de tipul “lab-on-a-chip”. Noutatea dispozitivului constă în integrarea pe un cip a platformei microfluidice împreună cu senzorul electrochimic și senzorul magnetorezistiv, dar și în achiziționarea și modularea semnalelor de ieșire ale ambilor senzori.

Un prim pas îl reprezintă înțelegerea conceptului de “lab-on-a-chip”. ”Acesta este un dispozitiv care integrează una sau mai multe funcții pe un chip cu o suprafață foarte mică (mm2 – cm2). Baza procesului de fabricare a lab-on-a-chip este fotolitografia. Definim litografia ca fiind procedeul de transfer al desenului (motivelor) de pe un șablon (mască fizică sau virtuală) pe plachetă. Atunci când transferul imaginii de pe șablon spre plachetă are loc prin intermediul luminii procesul poartă numele de fotolitografie sau proces fotolitografic. Tehnica fotolitografică oferă posibilitatea localizării pe placheta de siliciu a operațiilor de: oxidare, dopări, metalizări, urmărind zone foarte bine definite și pe suprafețe din ce în ce mai mici, cu scopul de a realiza dispozitive electronice fundamentale și de a le interconecta pentru a obține microcircuite

Această tehnologie, bazată pe litografie a apărut pentru prima dată în anul 1966 odată cu dezvoltarea senzorilor de presiune. Imediat după apariția acestor senzori, cât și a celor de tip ”airbag” sau a altor microsenzori mecanici, a început dezvoltarea dispozitivelor de analiză a fluidelor (conexiuni capilare, mixere, valve, pompe, dispozitive de dozare, etc).

Primul dispozitiv testat de tipul “lab-on-a-chip” a apărut în anul 1979 și a fost conceput de către S.C. Terry – Stanford University. La sfârșitul anilor 1980 au apărut dispozitive performante în acest domeniu – micropompe, senzori de puls – deoarce s-a investit mai mult în diferite grupuri de cercetare din Europa.”[1] Un mai mare interes în cercetarea și comercializarea acestor dispozitive a venit la mijlocul anilor 1990 când s-a dovedit că această tehnică oferă instrumente importante în aplicații precum electroforeza capilară – aceasta permite separarea moleculelor încărcate electric în funcție de mobilitatea proprie într-un tampon cu un pH dat și funcție de fluxul electroosmotic. Electroosmoza este procesul legat de miscarea unui fluid raportată la un perete solid sub acțiunea câmpului electric

“Folosirea dispozitivelor microfluidice bazate pe tehnologia MEMS (Micro Electro Mechanical Systems) a îmbunătățit semnificativ performanțele multor aplicații biosenzoriale. Sistemele microfluidice folosesc de obicei probe foarte mici pentru analiză, oferă reacții rapide în timp și sunt mult mai ieftin de folosit in comparație cu dispozitivele uzuale de analiză. În plus, dispozitivele microfluidice pot fi proiectate pe module și integrate ulterior, pentru atingerea unui grad mai ridicat de funcționalitate.

O altă direcție importantă este reprezentată de dezvoltarea dispozitivelor BioMEMS. Activitatea de cercetare a acestora este orientată către designul si fabricarea de microsisteme si microdispozitive pentru aplicații biomedicale și din aria agroalimentară. Această industrie poate furniza soluții state-of-the-art datorită abordării hibride care combină tehnologia clasică în siliciu cu materiale polimerice ieftine și flexibile.”[2]

În ultimii ani au fost folosite diferite geometrii de microelectrozi pentru dispozitivele de tipul “lab-on-a-chip” în încercarea de a spori senzitivitatea lor la detecție. O geometrie care a atras un interes deosebit este cea cu micro-electrozi interdigitați (IDA – interdigitated array). ”Configurația acestei geometrii este următoarea: un electrod este folosit la un potențial pentru a conduce reducerea (O+ne-R), în timp ce al doilea electrod este folosit la un alt potențial pentru a conduce oxidarea (RO+ne-). Speciile produse la un electrod difuzează la celălalt electrod, formându-se procesul numit ciclu redox. Ciclul dintre cei doi electrozi poate duce la un curent foarte mare de amplificare. Acest lucru a fost demonstrat prima data de către Bard în anul 1986, folosind ca model doi electrozi fotolitografici, și anume electrodul generator, respectiv colector. Miscșorând dimensiunea electrozilor și decalajul interelectrodic se mărește eficiența ciclului deoarece mai puțini ioni difuzează înapoi în soluție.”[3]

Fig.1 Structura electrodului IDA

“IDA constă într-o serie de electrozi de tipul unor microbenzi paralele în care microbenzile alternante sunt conectate între ele formând un set de electrozi interdigitați, asemănători unor degete. Dimensiunile tipice pentru un ”deget” de tip microbandă individuală sunt de 100-200 nm înălțime, 1-10 m lățime și 5-10 mm lungime. Separarea (spațiul) tipică dintre degete este de 1-10 m. Potențialul fiecărui set de electrozi interdigitați poate fi controlat în mod independent de celelalte seturi ale aceluiași electrod de referință. Prin dimensiunile spațiilor reduse dintre ei și prin folosirea unei rețele, spre deosebire de o singură pereche de microelectrozi de tip generator/colector, microelectrozii interdigitați au ca rezultat o eficiență de colectare sporită (mai mare de 0,98), dând IDA un avantaj în detectarea urmelor cantităților de specii electroactive.”[4]

Spațiul îngust IDA oferă senzitivitate ridicată și un timp de reacție scurt. Electrodul IDA cere, de asemenea, o mostră de volum mică pentru măsurători practice. Aceste caracteristici fac electrozii IDA potriviți pentru detectarea substanțelor biologice și pentru detectarea în cromatografie lichidă sau analiza injecției de flux. Electrodul IDA nu numai că are senzitivitate ridicată, dar se bucură, de asemenea, și de o selectivitate ridicată, prin designul formei sale. Acesta este un tip de filtru chimic care reține reactanți obiectivi din reacții adiacente. Ne putem aștepta, așadar, ca electrodul IDA să devină parte dintr-un sistem electrochimic inteligent. Mai mult decât atât, microelectrozii sunt potriviți pentru experimente electrochimice în solvenți non-polari, solvenți de conductibilitate redusă și polimeri ion-conductibili, în care macroelectrozii nu pot fi folosiți din cauza scăderii semnificative de potențial.

Toate aceste idei vor fi reluate si explicate pe parcursul prezentei lucrări.

Principalul obiectiv al acestei cercetări este dezvoltarea unui dispozitiv integrat de tipul lab-on-a-chip cu un microbiosenzor electrochimic pentru detecția reacțiilor biomoleculare (imune) de la suprafața particulelor magnetice, care sunt suspendate prin intermediul microseparatorului magnetic. Dispozitivul integrat este un sistem microfluidic, așa numit lab-on-a-chip, compus dintr-un senzor electrochimic cu microelectrozi integrați, un separator magnetic si o platformă microfluidică. Reacția imunochimică a perechilor antigen – anticorp marcate cu nanoparticule superparamagnetice, prezintă atât schimbări ale relaxării lor magnetice datorate reducerii mobilității și magnetizației de saturație, în funcție de cantitatea de antigen sau anticorpi atașată, cât și schimbări ale concentrației speciilor electrochimice, capacității stratului electric dublu, a impedanței transferului de sarcină și impedanței Warburg a transferului de masă la suprafața nanoparticulelor superparamagnetice. Suprafața particulelor poate fi funcționalizată cu diverse specii biochimice, acizi nucleici, proteine, (anticorpi specifici) sau alte celule, care sunt atașate suprafeței particulei magnetice.

Biosenzorul integrat va fi proiectat, fabricat și caracterizat. Etapele de realizare sunt:

sinteza și caracterizarea nanoparticulelor;

modelarea dispozitivului;

proiectarea măștilor fotolitografice;

tehnici de microfabricație pentru realizarea biosenzorului;

caracterizarea prin spectroscopie electrochimică.

Se vor experimenta metode de sudură a celor trei module: proiectare, fabricație, caracterizare.

Procedurile de caracterizare sunt:

caracterizarea separatorului magnetic;

determinarea domeniului dinamic al microsenzorului electrochimic prin detecția particulelor magnetice conjugate cu fosfataza alcalină;

contribuția timpului de incubare asupra intensității semnalului;

efectul trecerii nanoparticulelor magnetice peste electrodul counter asupra intensității semnalului.

Capitolul 1

1.1 Principiul de funcționare

Scopul proiectului este dezvoltarea (proiectarea, fabricarea și caracterizarea) unui dispozitiv integrat lab-on-a-chip alcătuit dintr-o platformă microfluidică cu 7 microcanale, un bioseznor eletrochimic de tip IDA si o platformă magnetoforetică pentru detecția antigenei specifice pentru melanom care semnalizează formarea perechilor antigen-anticorp pe electrodul de suprafață.

Imunoanaliza magnetică este un tip nou de tehnică analitică bazată pe mostre foarte mici de substanță prelevată în locul enzimelor convenționale, radioizotopi sau imunoanalize fluorescente.

Melanomul, una dintre cele mai agresive tumori, aparține categoriei de tumori imunogenice. Cunoașterea antigenei asociate melanomului a făcut posibilă în ultimii ani introducerea imunoterapiei.

Etapele de analiză imunomagnetică sunt următoarele:

Fig. 1.1 Secvența de analiză imunomagnetică

Injectarea de nanoparticule superparamagnetice împreună anticorpul primar;

Separarea nanoparticulelor superparamagnetice;

Injectarea soluției mostră;

Incubația antigenei specifice melanomului;

Îndepartarea antigenelor cu ajutorul unei soluții buffer;

Direcționarea și incubația enzimei anticorp secundar;

Îndepărtarea anticorpilor secundari necuplați în perechi anticorp-antigenă;

Injectarea substratului de enzime pentru detecția electrochimică.

Principiul detecției electrochimice:

Detecția electrochimică este folosită la scară largă pentru determinarea oxidării si reducerii compușilor organici si anorganici. Senzorul electrochimic constă într-o pereche de electrozi de lucru interdigitați,un electrod de numărare (Au) și un electrod de referință (Ag/AgCl). Senzorul electrohimic în configurație IDA este proiectat să se potrivească cu dimensiunile camerei de reacție (2 mm lungim si 1 mm lățime). Distanța dintre “degetele” microeletrozilor este de 10 m. Dimensiunile electrodului de referință si electrodului counter (numărător) este 100×300 m pentru fiecare.

Fabricația microelectrozilor IDA

Perechile de electrozi (Au, 40 perechi “degete”), electrodul de numărare (Au) și electrodul de referință sunt realizate prin litografie UV și depunere prin pulverizare.

Un strat de oxid de siliciu de 2 m a fost crescut pe plăcuța de siliciu;

Stratul următor este cel de metal Cr/Au (30nm/300nm) care este depus prin pulverizare la suprafața dioxidului de siliciu (SiO2);

Un nou strat este cel de fotorezist pozitiv aplicat la o frecvență de 3000 rpm;

Urmează coacerea plăcii în cuptor la 90oC timp de 30 minute;

Fotorezistul este expus 10 secunde la lumină UV (460 nm lungime de undă, 7mJ/cm2);

Se developează și se usucă;

Stratul de metal Cr/Au este modelat prin masca de fotorezist.

Electrozii IDA au fost realizați pe plăci de siliciu de 4”, tip p <100> cu rezistivitate de 10-50 Ωcm. Am fabricat trei versiuni diferite de electrozi IDA. Primul tip are o structură coplanară – electrozii de generare și colectare sunt în același plan, al doilea design – cel de pieptene și cea de-a treia versiune este cea de electrozi IDA construiți de-a lungul electrodului de referință de pe cip. Toate cele trei modele de cipuri integrate au fost proiectate pentru a fi folosite în sisteme microfluidice.

Oxidarea:

Dioxidul de siliciu este crescut termic la 1.5 μm într-un spațiu uscat la temperatura de 1150oC în cuptoare Lindberg timp de 7 ore. Temperatura este crescută cu 15oC/min și răcita prin convecție naturală. Acest strat de SiO2 are rol de izolator între placheta de siliciu monocristalin și straturile de metal care alcătuiesc electrozii.

Fotolitografia:

Etalarea fotorezistului

Pentru o mai bună aderare a fotorezistului placheta este încălzită timp de 3 minute la 150°C. Fotorezistul pozitiv Shipley 1813 a fost aplicat la o frecvență 3000rpm timp de 1 minut pentru a obține o grosime de 1 m.

Pre-coacerea

Fotorezistul este precopt pe plită timp de 1 minut la 100°C.

Expunerea

Fotorezistul a fost expus la lumină UV folosind mașină de aliniere Karl Suss MA-6 care fixează placheta prin vidare.

Developarea

Fotorezistul este developat în soluție de developare 1:4 cu apă. Ulterior plachetele sunt clătite cu apă deionizată, uscate cu azot și inspectate la microscop.

Post-coacerea

Plachetele au suferit un tratament termic timp de 1 minut la 120°C. Această etapă polimerizează fotorezistul și îl pregătește pentru gravarea cu ioni reactivi. Înainte de lift-off se sare peste acest pas până ce fotorezistul post-copt este dizolvat ușor în acetonă și face lift-off-ul eficient.

Depunerea metalului:

Platina sau aurul sunt folosite ca materiale pentru electrozi. Depunerea metalului trebuie efectuată imediat după ce a avut loc fotolitografia pentru a evita contaminarea. Se aplică un strat de adeziune care trebuie să îndeplinească unele cerințe: în primul rând trebuie să fie inert din punct de vedere chimic în prezența reactivilor folosiți în detecția electrochimică a mostrelor biologice; în al doilea rând întregul strat trebuie sa fie inert electrochimic; un alt aspect important îl reprezintă compatibilitatea cu procedura de fabricație. Metalele tradiționale, precum crom și titan, erau folosite cu precădere datorită aderenței foarte bune la oxidul de siliciu. Cromul însă a fost exclus din cauza reactivității cu lichidele, mai ales când este aplicat un potențial electric. În cazul titanului, oxidul acestuia formează la temperatura camerei o suparafață care acționeză ca un strat de pasivizare și este inert din punct de vedere chimic. Materialele folosite pentru electrozii metalici sunt platina și aurul folosind tehnica depunerii prin pulverizare catodică la o presiune de până la 3×10-7 Torr. În primul rând se depune un strat de 30 nm de Ti, apoi 300 nm Au. Viteza de depunere a Ti este de 0.5nm/secundă, platina și aurul 3nm/s. Viteza de depunere și grosimea se măsoară prin schimbarea de frecvență a unui cristal cu cuarț. Limita pentru grosimea stratului de metal depinde de procesul de lift-off. Depunerea în strat mai gros a platinii încălzește placheta peste temperatura critică și transformă fotorezistul de sub aceasta, făcându-l insolubil în acetonă.

Lift-off:

După evaporare, plachetele se scufundă în acetonă și se agită timp de 1 minut, la temperatura camerei. Soluția de acetonă este schimbată pentru a ne asigura că nu există bucățele de metal care s-au despins și ar putea adera la plachetă și generând un scurt între două ”degete” ale electrodului IDA. Înainte de depunerea Si3N4 (nitrură de siliciu), plachetele sunt curățate aproximativ 1 minut cu soluție piranha caldă (H2O2: H2SO4 = 3:7) pentru a ne asigura că întreag stratul organic a fost eliminat. Apoi plachetele sunt clătite cu apă deionizată timp de 1 minut și se usucă cu azot.

Clorinarea Ag:

Argintul poate fi clorinat electrochmic în soluție de clor. Soluția de KCl (clorură de potasiu) este larg utilizată. O metodă alternativă este clorinarea neelectrică cu FeCl3.

Ag + FeCl3 → AgCl + FeCl2

După galvanizarea Ag, plăcuța a fost înmuiată în soluție apoasă 1% de clorură ferică pentru 20 de minute. În timpul procesului de clorinare culoarea s-a transformat din alb în gri închis. Ag s-a depus de o grosime de 250 nm, apoi a fost înmuiat în soluție de clorură ferică timp de 40 de minute. Interfața dintre AgCl și Ag a fost fluctuantă din cauza creșterii neuniforme a particulelor de Ag. Adâncimea medie a clorinării este de 3.7 m.

Stabilitatea electrodului de referință Ag/AgCl:

Stabilitatea electrodului de referință este atent investigată deoarece este foarte important să se aplice potențialul într-un mod reproductibil. Abaterea datorită unei concentrații variate de Cl- este tolerabilă dacă experimentele sunt realizate în aceleași soluții buffer și potențialul este stabil în soluție. Este binecunoscut faptul că solubilitatea AgCl este un parametru important în soluții cu concentrații ridicate de Cl-. Această problemă, neglijabilă pentru electrozi macroscopici, poate deveni critică atunci când stratul de AgCl este de doar câțiva micrometri. Potențialul peliculei de Ag / AgCl și Ag clorinat au fost măsurate față de electrodul counter în fosfat 0,1 M la pH 7,5.

PECVD pentru Si3N4

În timpul testării imunochimice, atât electrozii IDA, cât și metalul de interconectare dintre “degete” nu trebuie să fie expus fluidelor biologice, pentru a evita scurtcircuitul. Un strat de polimer precum fotorezistul este cea mai simplă alegere deoarece nu este necesară o etapă de gravură. Cu toate acestea, acești polimeri nu sunt compatibili cu etapele ulterioare de curățare. Astfel, trebuie să aplicăm un strat anorganic, care este tolerant la etapa de curățare. Stratul de pasivare poate fi realizat folosind procedeul de depunere chimică de vapori în plasmă PECVD. SiO2 și Si3N4 sunt straturi izolatoare folosite în microfabricație.

Îndepărtarea fotorezistului și curățarea:

După RIE, de cele mai multe ori, fotorezistul se dizolvă în acetonă. Apoi, fotorezistul transformat chimic sau termic este îndepărtat în soluție piranha. Curățarea completă a suprafeței electrodului este critică pentru performanța sa electrochimică. Contaminarea organică, chiar și doar un strat molecular, poate afecta proprietatea catalitică a electrodului în mod semnificativ.

Decuparea de pe plachetă

Fiecare senzor trebuie să fie decupat de pe plachetă. Există o mașină automată cu disc diamantat controlată de un calculator, căreia i se pot seta coordonatele și presiunea care trebuie aplicată pentru a tăia placheta. Dimensiunile cipului sunt stabilite și marcate pe plachetă prin masca M1 (capitolul 2.1 Proiectarea măștilor fotolitografice).

1.2 Modelarea dispozitivului

Modelarea dispozitivului reprezintă o etapă foarte importantă care trebuie realizată înainte de a începe microfabricația propriu-zisă pentru a evita probleme care țin de incompatibilitate între materiale, grosimea straturilor ce ar putea influența funcționalitatea dispozitivului și, desigur, trebuie ținut cont și de factorul financiar. Precedând fabricării, modelarea ne poate scoate din situația realizării unei linii de producție necorespunzătoare așteptărilor și, chiar dacă în straturi micrometrice, se lucrează cu materiale prețioase (Au, Pt, Ti, etc.), aparaturile sunt extrem de costisitoare și sensibile, și, un alt aspect deosebit de important, prin modelare se câștigă timp. Deși pot exista dubii în privința produsului-model în balanță cu produsul-real, rezultatele obținute au fost remarcabile prin prisma preciziei detaliilor obținute.

Fig.1.2 Detaliu modelare

În figura 1.2 este ilustrată zona de ieșire din camera de reacție și turnurile de contact, dar ceea ce vreau sa subliniez prin această captură este precizia modelării – se pot observa imperfecțiuni ale corodării sticlei (mici “franjuri” în zona orificiilor), acest lucru întâmplându-se întradevăr și în realitate.

Fig.1.3 Canalele microfluidice

Se observă în fig.1.3 forma canalelor microfluidice ca niște “jgheaburi” care reprezintă calea de acces în camera de reacție a nanoparticulelor supuse testului. Tot în această figură se observă electrodul de counter (galben intens), electrodul IDA (galben pipit), cu verde este oxidul de pasivare ce acoperă senzorul electrochimic excepție făcând camera de reacție și electrozii laterali, iar cu albastru este figurată sticla Pyrex.

Etapele principale de realizare a dispozitivului LOAC sunt:

Fig.1. Flux tehnologic SE

Fig.1.5 Flux tehnologic SM

Fig.1.6 Dispozitivul LOAC

Observație: Schemele nu sunt realizate la scară, ci doar cu aspect orientativ.

Fig.1.7 Dispozitivul LOAC 3D

În fig.1.7 este o imagine 3D a dispozitiviului. Se observă platforma microfluidică cu cele șapte microcanale, camera de reacție între cele două orificii de intrare a probelor biologice acumulate din microcanale, respectiv de ieșire, electrodul de referință, electrodul de numărare și electrodul IDA în interiorul camerei de reacție, traseele și padurile de aur.

Fig.1.8 Detaliu 3D camera de reacție

Așa cum am spus, modelarea dispozitivului a oferit rezultate foarte bune , dar mai ales a permis modificarea unor diverși parametrii astfel încât rezultatul final, și anume LOAC fizic palpabil, să fie cel optim.

Capitolul 2

2.1 Proiectarea măștilor fotolitografice

2.1.1. Setul de măști fotolitografice:

S-a folosit un număr total de 11 măști fotolitografice: 5 pentru realizarea senzorului electrochimic și 6 pentru cel magnetic. Acestea au fost proiectate în LEDIT. În figurile de mai jos sunt prezentate măștile transparente suprapuse pentru un cip senzor electrochimic și pentru un cip senzor magnetic din cadrul dispozitivului LOAC.

Fig.2.1 Senzorul electrochimic

Fig.2.2 Senzorul magnetic

Suportul de implementare tehnologică pentru senzorul electrochimic îl reprezintă o plachetă de siliciu monocristalin cu diametrul de 4 inch (100 mm), iar pentru senzorul magnetic s-a folosit o plachetă din sticlă Pyrex Corning 7740 de aceeași dimensiune cu placheta de siliciu. Pe o plachetă de această dimensiune se obțin 22 dispozitive LOAC. “Sandwich-ul” SM – SE se formează prin lipirea plachetei prelucrate de Pyrex la placheta prelucrată din siliciu monocristalin cu ajutorul unui strat de SU8 depus prin tehnica de roluire între cele două plachete. Aderența lipirii se asigură prin durizare la cald a sandwich-ului. Separarea in cipuri a LOAC se face ulterior, prin decupare de pe una din fețele sandwich-ului format de către cele două suporturi: placheta de siliciu monocristalin cu diametrul de 4 inch și grosime 550 m pentru SE și placheta m de sticlă Pyrex de același diametru, dar groasă de 750 m pentru SM.

Fig.2.3 Camera de reacție a SE

Figura 2.3 reprezintă un detaliu al SE, și anume camera de reacție în care se observă: la intrare electrodul de referință (verde turcoaz) de dimensiune 300 m, la ieșire electrodul de număre, sau counter (gri închis) de lățime 100 m, iar central sunt cei doi electrozi de lucru interdigitați – 2×25 perechi, fiecare “deget” având o lățime individuală de 10 m și un interval de interdigitare tot de 10 m.

Fig.2.4 Camera de reactive a SM

În fig.2.4 se observă transversal canalului fluidic cele 49 trasee de polarizare (verde închis) a celor 4900 de pătrate magnetic (negru) cu latura de 10 m fiecare al căror amplasament este aranjat prin aliniere si lipire SM la SE deasupra și între electrozii interdigitați ai SE. Dimensiunile celor două tipuri de senzori sunt: 10×25 mm2 SE și 10×20 mm2 SM. Diferența de lungime a cipului SM decopertează zona de conector SATA II construită în cipul SE (10×5 m2), în lateral.

În continuare sunt prezentate geometriile aferente fiecărei măști componente a layoutului dispozitivului LOAC.

Senzorul electrochimic

Fig.2.5 Masca M1

Masca M1 – corodare oxid intercip pe adâncimea completă de 500 nm, oxid termic crescut pe placheta de silicu monocristalin. Imaginea proiectată grafic prezintă un layout de tip corodare în geometrie și delimitează cipul pe placheta de 4 inch de siliciu.

Fig.2.6 Masca M2

Masca M2 – depunere și configurare a metalului (Au), grosime 330 nm. Imaginea proiectată grafic prezintă un layout de tip corodare în câmp.

Fig.2.7 Masca M3

Masca M3 – depunere, clorinare și configurare argint Ag, grosime 200 nm. Layout de tip corodare în câmp. Cu ajutorul aceste măști se configurează electrodul de referință.

Fig.2.8 Masca M4

Masca M4 – depunere și configurare oxid de pasivare cu grosime de 2 m. Layout de tip corodare în geometrie.

Fig.2.9 Masca M5

Masca M5 – canal chimic – depunere și configurare SU8 cu grosime 5 m. Layout de tip corodare în geometrie. SU8 se comport ca un fotorezist negativ.

Senzorul magnetic

Fig.2.10 Masca M6

Masca M6 reprezintă de fapt prima mască a senzorului magnetic. Este masca pătratelor magnetice. Acestea se obțin prin tehnica lift-off, sunt în număr de 4900, iar latura fiecărui pătrat are 10 m. Sunt poziționate în zona camerei de reacție între electrozii interdigitați ai SE. Layout de tip corodare în câmp.

Fig.2.11 Pătrate magnetice

Figura 2.11 reprezintă un zoom al fig.2.10 – pătrate magnetice.

Fig.2.12 Masca M7

Figura 2.12 este masca necesară realizării orificiilor. Corodarea este omogenă și izotropă, incompletă (600 m din cei 750 m cât este grosimea sticlei Pyrex). Layout de tip corodare în geometrie.

Fig.2.13 Masca M8

Masca M8 – depunere si configurare metal (Au) de grosime 330 nm, asigură polarizarea pătratelor magnetice. Traseele din metal sunt configurate astfel încât fiecare acoperă complet câte un rând de pătrate magnetice (fig.2.14). Layout de tip corodare în câmp.

Fig.2.14 Detaliu din camera de reacție

Fig.2.15 Masca M9

Masca M9 – depunere și configurare oxid de pasivare de grosime 2 m. Layout-ul este de tip corodare în geometrie.

Fig.2.16 Masca M10

În fig.2.16 este figurat canalul magnetic care implică depunerea și configurarea unui strat de 5 m de SU8. Layout-ul este de tip corodare în geometrie.

Fig.2.17 Masca M11

Ultima mască modelată este cea a microcanalelor sumator fluidic. Corodarea este omogenă și izotropă, incompletă (220 m din 750 m cât este grosimea sticlei Pyrex). Diametrul rezervoarelor fluidice este de 1000 m și lățimea canalelor pentru sumator este de 150 m. Layout-ul este de tip corodare în geometrie. Spre deosebire de cele 5 măști anterioare folosite pentru realizarea senzorului magnetic, masca M11 este de verso, aceasta însemnând că s-a efectuat corodarea plachetei de sticlă Pyrex pe fața cealaltă decât unde au avut loc procesările pentru măștile M6-M10.

Observație: Din suprapunerea structurală a corodării după M7 – orificiu <600 m de pe fața plachetei de sticlă Pyrex cu corodarea după M11 – microcanale sumator <220 m de pe verso, se obțin după lipirea plachetelor de suport cele două turnuri, de intrare de la sumator și de ieșire a microcanalului, aflate în amonte și în aval de camera de reacție pusă la comun dintre SM și SE.

2.1.2 Semne de aliniere a măștii curente de procesat la structuri tehnologice obținute anterior:

Pentru a se asigura alinierea între măștile de procesare structurală a geometriilor de layout au fost proiectate perechi de semne de aliniere incluse în fiecare mască finală de crom pe cuarț în lateralele periferice ale plachetelor de suport. În decursul procesului de aliniere, între masca de crom pe cuarț ce trebuie procesată și semnele de aliniere deja existente structural și obținute după procesări tehnologice cu măști precedente, se folosesc geometriile perechi de tip "plus", incluse în layout în lateralele plachetelor la periferie, celelalte caractere alfanumerice de lângă "plus" fiind numai precizări poziționale ale plus-ului la care se face alinierea.

A. Semne de aliniere pentru cele 5 măști ale senzorului electrochimic SE obținut prin procesare structurală tehnologică pe suport siliciu monocristalin de 4 inch diametru sunt:

Fig.2.18a Semne de aliniere măști SE – față

Fig.2.18b Semne de aliniere măști SE – verso

Alinierea se face succesiv în ordinea cronologică a etapelor fluxului tehnologic, respectiv M2 la semnul "1 plus" de după procesarea cu M1, M3 la semnul "2 plus" de după procesarea cu M2, M4 la semnul "2 plus" de după procesarea cu M2, M5 la semnul "2 plus" de după procesarea cu M2 dar și la semnul "4 plus" de după procesarea cu M4. Un amănunt interesant este alinierea pentru lipirea finală a celor două plachete suport (SM la SE) la care se foloseste semnul "M" (inclus în masca M3 – pătrate magnetice) care trebuie să apară lângă cifra "2" asociată (inclusă în masca M2 – metal aur) și dedicată pozițional, pentru ca alinierea să fie corectă, adică pătratele magnetice din constituirea SM să se aranjeze deasupra și între traseele "fire" metalice interdigitate din constituirea SE prin lipirea celor două suporturi adică Pyrex pe siliciu monocristalin.

Explicarea semnelor de aliniere:

semnul structural "1 plus" este obținut ca rezultat al corodării în geometrie de layout procesată cu masca M1 – corodare oxid termic intercip și este de fapt un "plus" săpat (gol la interior geometrie) prin corodare în oxidul termic de pe placheta de siliciu monocristalin.

Primul semn de aliniere "2 plus" este proiectat în cadrul măștii M2 – metal aur ce se va procesa ca majoritatea uzuală a măștilor cu fotorezist pozitiv, masca de layout este de tip corodare în câmpul geometriilor, deci în cromul de pe masca fizică de cuartz geometria "2 plus" este opacă la iluminare externă. Rezultă deci că alinierea "2 plus" la "1 plus" reprezintă centrarea plusului opac corespondent din masca fizică M1 în conturul "1 plus" săpat deja prin corodare în oxidul termic. Este evident faptul că conturul "1 plus" săpat gol trebui sa fie mai mare decât conturul "2 plus" opac din masca fizică. Practic brațele plusului de aliniat au 30 m lățime și conturul plusului săpat gol este de 10 m nefiind necesară o precizie de aliniere drastică de această dată. Următoarele semne de aliniere "2 plus" sunt identice rezultând pe suportul din oxid termic înca 4 plusuri din metal aur pline pentru alinieri ulterioare.

Semnul de aliniere "3 plus negat" format din patru pătrate identice este inclus în masca M3 – argint/clorinare cu layout de tip corodare în câmp, pentru procesarea mascării cu fotorezist pozitiv, deci în masca M3 fizică de crom pe cuartz cele 4 pătrate sunt opace la iluminarea externă. Alinierea va căuta centrarea printre cele patru pătrate opace din masca M3 de aliniat a semnului "2 plus" rămas format structural pe oxidul termic din metalul de aur după procesarea cu masca M2 corespondentă.

Semnul de aliniere "4 plus" este inclus în masca M4 – oxid pasivare cu layout de tip corodare în geometrie ce este de procesat folosind fotorezist pozitiv, deci în masca fizică de cuartz semnul "4 plus" este de tip transparent la iluminarea externă. Alinierea se face căutand a se vedea prin semnul "4 plus" transparent din masca fizică M4 semnul subdus structural "2 plus" correspondent, deja construit anterior

Obervație: După procesarea măștii M4, oxidul de pasivare este eliminat din jurul semnului "2 plus" corespondent pentru a facilita alinierea măștii M5 ulterioare, deci semnul "2 plus" este perfect evidențiat pe suportul din oxid termic din împrejurul câmpului cu oxid de pasivare, situație ce se repetă și pentru următoarele două semne de aliniere de tip "2 plus".

Cele două semne de aliniere "5 plus" și "5 plus negat" (adică patru pătrate opace) incluse în masca M5 – canal SU8 sunt proiectate știind că SU8 se comportă ca un fotorezist negativ, layoutul pentru M5 este de tip corodare în geometrie. Deci alinierea se va face centrând între cele patru pătrate opace din M5 semnul de aliniere de tip "2 plus". Dacă masca M5 se va folosi ca variantă tehnologică pentru corodare în câmp a unui strat de metal pentru lipire în sandwich cu fotorezist pozitiv (deci invers decât în cazul SU8) atunci pentru aliniere M5 la M2 se va folosi tot semnul "5 plus negat" de aliniat la semnul "2 plus" plin creat anterior și alinierea se verifică după procesarea stratului la centrarea semnului "42plus" în semnul "5 plus" de astă dată gol (săpat) împrejur.

Observație: După procesarea mascării M5, SU8 este eliminat de peste ultimul semn structural de tip "2 plus" pentru a se putea efectua alinierea ulterioară a M6 – pătrate magnetice la masca structurală M2 la care semnul "M plus negat" trebuie aliniat lângă structura "2 plus" plin descoperită de sub SU8 anterior.

B. Semne de aliniere pentru cele 6 măști ale senzorului magnetic SM obținut prin procesare structurală tehnologică pe suport sticlă Pyrex de 4 inch diametru sunt:

2.19a Semne de aliniere măști SM – față

2.19a Semne de aliniere măști SM – verso

Este de ținut minte că fiecare tip de culoare a geometriei în layout-ul grafic reprezintă o mască specifică, măștile sunt numerotate de la M6 până la M9 cu cifra corespondentă, masca M10 este notată "0" și masca de verso M11 este notată "S" (notație de la "microcanale Sumator"). De asemeni este de precizat că pentru aliniere corectă față-spate (verso) semnul de aliniere "S" din cadrul layout M11 trebuie să apară lângă semnul de aliniere "M" din cadrul layout M6, litera corespondentă ca notație fiind aleasă de la "pătrate Magnetice".

Explicarea semnelor de aliniere

1. Semnele de aliniere structurale de tip "6 plus" plin sunt obținute după proces de lift-off cu masca M6 – pătrate magnetice care este de tip layout cu corodare în câmp pentru fotorezist pozitiv și sunt în număr de 6 semne identice exceptând poziționarea specifică fiecărei alinieri ulterioare, poziționare precizată de caracterul alfanumeric asociat.

2. Masca M7 – orificiu – este de tip layout cu corodare în geometrie, procesare cu fotorezist pozitiv, deci semnul specific de aliniere inclus în masca fizică este un "7 plus" transparent ce trebuie să înconjoare perfect semnul structural "6 plus" plin centrat în plusul transparent. Depărtarea perechii de semne de aliniere "76" de la semnele ulterioare este datorată supracorodării pe sub mascare în cazul corodării omogene și izotrope a sticlei de Pyrex folosită ca suport structural, supracorodare ce se întinde maxim cu valoarea adâncimii de corodare impusă a fi <600 m. Respectiva depărtare de ~600 m evită deteriorarea semnelor structurale folosite la alinieri ulterioare.

3. Masca M8 – polarizare pătrate magnetice este de tip layout corodare în câmp pentru fotorezist pozitiv, deci în timpul procesului de aliniere semnul "8 plus negat" format din patru pătrate trebuie să se centreze în jurul semnului structural "6 plus" plin.

4. Masca M9 – oxid pasivare este de tip layout corodare în geometrie pentru fotorezist pozitiv deci în timpul procesului de aliniere semnul "9 plus" transparent din masca fizica M9 trebuie aliniat la semnul structural "6 plus" plin.

5. Masca M10 – canal SU8 este de tip layout corodare în geometrie pentru fotorezist negativ deci în timpul procesului de aliniere semnul "0 plus negat" din masca fizică M10 trebuie aliniat la semnul structural "6 plus" plin, cu verificarea centrării semnului "6 plus" plin între cele patru pătrate ale semnului "0 plus negat" dacă se folosește strat de metal (în loc de SU8) și fotorezist pozitiv.

6. Masca M11 – sumator canale fluidice este de tip layout cu corodare în geometrie pentru fotorezist pozitiv, și este mască de verso (spre deosebire de măștile precedente care erau măști de față). Fiind masca de verso alinierea corectă se face dacă se citește "natural" alăturarea "S plus" transparent lângă "M plus" plin structural anterior configurat.

Aliniere finală

Se face alinierea "M plus negat" (din placheta suport Pyrex obținut structural anterior la procesarea SM) la "2 plus" plin (din placheta suport siliciu monocristalin obținut structural anterior la procesarea SE) pentru o citire "naturală" "M2". Prin alinierea finală este pregătit pentru lipire aderentă sandwich-ul Pyrex la siliciu monocristalin. Este de remarcat că ambele semne de aliniere structurate pentru aliniere finală se află subduse în interiorul sandwich-ului SM per SE.

2.2 Proiectarea tehnologiei de fabricație:

Măștile realizate în LEDIT au fost fabricate pe sticlă Soda Lime acoperită cu crom. Sistemul automatizat DWL 66fs permite imprimarea geometriilor proiectate cu ajutorul unui fascicul laser direct pe un strat subțire de fotorezist depus pe masca fotolitografică. Cromul se corodează în soluție umedă prin stratul de fotorezist imprimat. Înainte de fiecare folosire, fiecare mască fizică este spălată cu acetonă și detergent pentru a îndepărta orice reziduu rămas de la fabricarea măștii sau de la o expunere anterioară.

DWL 66fs este un sistem de litografiere cu laser Diode cu lungimea de unda de 405 nm. Cu ajutorul acestuia sunt expuse atât măști cât și plachete cu dimensiuni cuprinse intre 2,5 inch si 6 inch. Proiectarea măștii poate fi realizată în orice program de editare care foloseste formatele CIF, DXF, HPGL, GDSII sau Gerber, deoarece pe această stație de conversie este convertit într-un fișier cu extensie LIC, care apoi este transferat printr-o conexiune de tip FTP către sistemul de scriere.

Echipamentul este dotat cu două capete de scriere de 2 mm cu rezoluția maximă de 0,6 microni, respectiv 10 mm cu rezoluția maximă de 2,5 microni. În funcție de rezoluția dorită scrierea unei măști poate varia între câteva ore pentru capul de 10 mm și câteva zile pentru cel de 2 mm.

Mișcarea precisă de-a lungul axelor x, y ale mesei pe care stă poziționată masca în timpul expunerii este controlată cu ajutorul unui interferometru cu laser. Pentru laser există patru filtre care pot fi schimbate și combinate in funcție de condițiile de expunere necesare.

De asemeni este și o cameră video pentru a putea realiza o inspecție calitativă a măștii după developare și corodare. Cu ajutorul camerei se pot face și măsurători pe masca obținută și se poate face și alinierea măștii.

Procesarea chimică este de fapt o suită de etape: developare, corodare și îndepărtare fotorezist.

Pentru a putea ințelege derularea acestui proces este bine de știut din ce se compune de fapt o mască.

Masca expusă de noi are substrat soda lime, peste care a fost depus un strat de crom (cu grosime 900A), peste care vine fotorezist pozitiv de tip AZ 1518 (cu grosime 0,6 microni).

Primul proces pe care îl suferă masca, după inscripționarea cu laser, este developarea adică fotorezistul pozitiv care a fost expus în timpul executării măștii se solubilizează în developant.

În fereastra deschisă în stratul de fotorezist se face apoi corodarea stratului de crom. Operația de corodare se face pe cale umedă cu ajutorul unei soluții de acid percloric (HClO4) și nitratului ceric de amoniu (NH4)2[Ce(NO3)2] conform reacției:

3 Ce(NH4)2(NO3)6 + Cr → 3 Cr(NO3)3 + 3 Ce(NH4)2(NO3)5

Odată ce a fost facută și corodarea cromului, ultima etapă în acest punct este reprezentată de îndepărtarea stratului de fotorezist rămas pe mască.

Ultimul pas din toată această suită este cea de efectuare a superpoziției măștilor în cazul în care avem de-a face cu un set. Efectuarea superpoziției reprezintă de fapt aducerea în aceeași poziție a semnelor de aliniere existente pe mască pentru a verifica dacă acestea se suprapun perfect (simularea procesului de fotogravură din tehnologie).

Capitolul 3

3.1 Oxidarea termică și depunerea din starea de vapori

3.1.1 Oxidarea termică

Fabricarea dispozitivelor începe cu o plachetă de siliciu monocristalin <100>. Pentru curățarea inițială a plachetei, aceasta este imersată în soluție Piranha timp de 30 minute, după care se clătește în apă deionizată și se usucă prin centrifugare. Soluția Piranha este un amestec de acid sulfuric (H2SO4) și apă oxigenată (H2O2) în proporție 2:1 la temperatura de 120OC. La această temperatură acidul sulfuric îndepărtează toate reziduurile anorganice de pe substraturi, în timp ce prezența peroxidului are rolul de a îndepărta carbonul prin convertirea acestuia în dioxid de carbon. Acestă soluție de curățare nu este recomandată pentru plachetele care au depuse straturi metalice.

Placheta curată este introdusă într-un cuptor de oxidare la temperatura de 1100oC în atmosferă umedă de oxigen, timp de 45 min, și se crește un strat de oxid termic cu grosimea de 500 nm. Acest strat va servi ca izolație electrică pentru traseele de aur care vor fi depuse ulterior.

Fig. 3.1 Oxidare termică

După oxidare, placheta trece printr-un proces de curățare în soluție Piranha pentru a elimina posibilele contaminări. Înainte de metalizare, placheta este deshidratată pe plita electrică la temperatura de 110oC timp de 10 minute.

3.1.2 Depunerea din starea de vapori (CVD)

În sistemele CVD sunt introduși unul sau mai mulți precursori volatili care se descompun, reacționează și se depun pe plachetă. Produșii de reacție sunt evacuați din incintă prin sistemul de vidare. Pentru descompunerea precursorilor volatili este necesară o sursă externă de energie.

Reacțiile chimice din sistemele CVD sunt de 5 tipuri:

piroliză: SiH4 → Si + 2H2

hidroliză: 2AlCl3 + H2O → Al2O3 + 6HCl

reducție: SiCl4 +2H2 → Si + 4 HCl

oxidare: SiH4 +O2 → SiO2 + 2H2

compunere: 3SiH2Cl2 + 4NH3 → Si3N4 + pH + 6H2

Cele mai utilizate sisteme CVD sunt LPCVD (depunere din fază de vapori la presiuni scăzute) și PECVD (depunere din fază de vapori amplificată de plasmă).

LPCVD: Sistemele LPCVD folosesc incinte de depunere vidate la presiuni sub 10 Pa, au viteză de depunere bună și contaminare redusă straturilor subțiri. Tehnica se bazează pe reacția la suprafață dintre plachetă și gazele de reacție. Din acest motiv, este necesar controlul foarte bun al temperaturii. Procesul este foarte uniform, pemițând depunerea materialelor inclusiv pe suprafețe neplanare.

Această tehnică necesită temperaturi înalte (în jur de 400oC) pentru inițierea depunerii.

PECVD: În cazul sistemelor PECVD se înlocuiește sursa de temperatură înaltă din sistemele LPCVD cu o sursă de plasmă. Straturile depuse au aderență foarte bună, acoperire foarte uniformă. Mai mult, sistemele PECVD permit controlarea tensiunilor interne din straturile depuse. Este posibilă depunerea straturilor dielectrice precum oxid de siliciu, carbură de siliciu, nitrură de siliciu, oxinitrură sau chiar siliciu amorf.

Principalii parametrii de depunere sunt:

Frecvența de excitare RF: în prezent, cele mai performante sisteme PECVD au două surse RF, una de frecvență înaltă (13.56 MHz) și alta de frecvență joasă (100 – 400 kHz). Prin alternarea frecvenței se pot controla tensiunile interne remanente tensile sau compresive din straturile subțiri depuse, fiind posibilă obținerea straturilor cu tensiuni interne nule.

Puterea RF controlează viteza de depunere. Cu cât puterea este mai mare, cu atât viteza de depunere este mai mare.

Presiunea determină uniformitatea depunerii, dar în același timp afectează tensiunile interne remanente în stratul depus.

Temperatura depunerii are un efect important asupra materialului depus prin modificarea structurii cristaline a acestuia. De exemplu, în funcție de temperatură se poate depune siliciu amorf sau siliciu policristalin.

Fig.3.2 Depunere oxid PECVD

3.2 Fotogravura

3.2.1 Curățarea substratului

Curățarea substratului este cea mai importantă operație din timpul procesului de fotolitografie. Un substrat curat este esențial pentru a evita contaminarea, chiar și în cazul plachetelor noi.

Există patru categorii de contaminanți care pot să producă fotolitografia defectuoasă:

Particule – pot fi îndepărtate prin spălarea în jet de apă deionizată;

Reziduuri organice – compuși pe bază de carbon care pot fi curățați prin spălări succesive în acetonă alcool izopropilic (IPA) și apă deionizată;

Reziduuri anorganice – acizi de la spălări anterioare;

Straturi de oxid nedorite – de exemplu oxidul nativ (3 – 5 nm) de pe plachetele de siliciu. Pentru îndepărtarea oxidului nativ, plachetele de siliciu se imersează câteva secunde în acid fluorhidric.

Pentru îndepărtarea acestor contaminanți au fost dezvoltate mai multe procese chimice de curățare, cea folosită pentru dispozitivul meu fiind soluția Piranha. Aceasta este un amestec de acid sulfuric (H2SO4) și peroxid (H2O2) în proporție 2:1 la temperatura de 120OC. La această temperatură acidul sulfuric îndepărtează toate reziduurile anorganice de pe substraturi, în timp ce prezența peroxidului are rolul de a îndepărta carbonul prin convertirea acestuia în dioxid de carbon. În general, soluțiile piranha sunt refolosite și se reîmpropătează periodic prin adăugarea unor cantități mici de peroxid. Acest pas de curățare nu este recomandat pentru plachetele care au depuse straturi metalice.

3.2.2 Promovarea aderenței

Adeziunea fotorezistului la substrat este cel mai important factor pentru obținerea unui proces fotolitografic de calitate. În primul rând, pentru îmbunătățirea aderenței, plachetele trebuie deshidratate pentru a îndepărta apa de pe suprafață. Acest lucru se obține prin tratament termic la 120°C pentru 15 minute în etuvă sau pe o plită electrică. Alți factori care pot influența aderența sunt unghiul de contact al fotorezistului cu suprafața, timpul dintre expunere și tratamentele termice, rugozitatea suprafeței, tipul fotorezistului, tensiunile interne ale fotorezistului sau contaminarea suprafeței.

3.2.3 Etalarea fotorezistului

Principala tehnică întâlnită pentru etalarea fotorezistului este centrifugarea. Fotorezistul în forma sa inițială de prepolimer conține un solvent care îl fluidizează. Centrifugarea permite întinderea uniformă a fotorezistului pe toată suprafața plachetei.

Fig.3.3 Pașii principali pentru etalarea fotorezistului: a) aplicarea, b) întinderea, c) uniformizarea

Etalarea fotorezistului se face în trei pași:

Aplicarea fotorezistului (fig.3.3a). Aplicarea se poate face static sau dinamic. Aplicarea statică se referă la aplicarea manuală sau automată a fotorezistului pe placheta în stare de repaus. Aplicarea dinamică înseamnă aplicarea fotorezistului în timp ce placheta se rotește cu viteză mică. În cazul aplicării dinamice, întinderea fotorezistului are loc în același timp cu aplicarea acestuia.

Întinderea fotorezistului (fig.3.3b). În timpul acestui pas se obține întinderea fotorezistului aplicat, pe toată suprafața plachetei. Întinderea se obține prin rotirea plachetei cu viteze mici, aproximativ 500 rpm, până cînd toată suprafața este acoperită (aproximativ 5 – 10 secunde).

Uniformizarea fotorezistului (fig.3.3c). În pasul final de etalare, placheta este învârtită cu viteză mare, între 2000 și 5000 rpm, pentru a se obține grosimea dorită de fotorezist dar și unformizarea acestuia. Viteza de rotație pentru obținerea unei grosimi dorite depinde în primul rând de vâscozitatea fotorezistului. Cu cât vâscozitatea este mai mică și viteza de rotație mai mare, cu atât grosimea fotorezistului depus este mai mică.

3.2.4 Tratament termic pre-expunere

“După etalarea fotorezistului, acesta conține cu până la 15% mai puțin solvent.”[5] Evaporarea solventului poate induce tensiuni interne reziduale în stratul subțire de fotorezist. Pentru reducerea tensiunilor interne și pentru a promova aderența, este necesar un tratament termic. În funcție de tipul fotorezistului, tratamentul se face la temperaturi cumprinse între 65oC și 120oC în etuvă sau pe plită electrică. Pentru acest tratament este recomandată folosirea plitei electrice deoarece permite evaporarea treptată a solventului rămas în fotorezist. Datorită acestei evaporări, grosimea fotorezistului poate să scadă cu până la 25%.

3.2.5 Alinierea măștilor și expunerea fotorezistului

Urmează faza de alinere a măștii la substrat, apoi se poate face expunerea fotorezistului. În timpul alinierii, distanța dintre mască și substrat este de aproximativ 30 µm, iar în timpul expunerii masca este adusă în contact cu substratul. Contactul dintre cele două suprafețe este absolut esențial pentru obținerea unui transfer bun al geometriilor de pe mască. Odată ce masca și substratul sunt aliniate, se poate face expunerea fotorezistului.

În funcție de tipul fotorezistului folosit, pozitiv sau negativ, zona expusă poate să fie întărită sau slăbită. Astfel, zonele întărite sunt mai rezistente la soluțiile de developare, pe substrat obținându-se ferestre deschise în fotorezist prin îndepărtarea zonelor slăbite (nepolimerizate). În fig.3.4 este prezentată schematic expunerea fotorezistului pozitiv sau negativ.

Fig.3.4 Definirea geometriilor în fotorezist pozitiv sau negative

3.2.6 Tratament post-expunere

“Tratamentul post-expunere se aplică în funcție de aplicația pentru care a fost creată masca. Acesta poate să fie folositor sau nu. În cazul în care masca de fotorezist urmează să fie folosită în procese de corodare umedă sau uscată, tratamentul post-expunere este obligatoriu. În timpul acestui tratament sunt evaporate toate urmele de solvent și developant și se finalizează procesul de polimerizare a fotorezistului. Astfel fotorezistul devine mai rezistent la acțiunea soluțiilor de corodare, iar suprafața acestuia devine hidrofobă, prevenind soluțiile de corodare să îl penetreze prin posibilele defecte apărute.”[6]

În cazul procedeelor de lift-off, întărirea fotorezistului nu este de dorit deoarece se dorește îndepărtarea rapidă a acestuia în acetonă după realizarea procesului de fotogravură.

În timpul acestui tratament, fotorezistul se poate fluidiza, putând să genereze pereți înclinați. Tratamentul trebuie făcut cu atenție pentru a reduce tensiunile interne reziduale ce pot să apară în stratul subțire de fotorezist. Cu cât acest tratament este mai îndelungat, cu atât îndepărtarea fotorezistului va fi mai dificilă.

3.2.7 Developarea

După expunere placheta a fost introdusă în soluția de developare pe bază de NaOH timp de 30 s după care a fost efectuat un tratament termic la 100oC timp de 30 min. Pentru plachetele cu strat de mascare de oxid, un strat de de SiO2 a fost crescut termic. Pentru configurarea măștii de oxid, acesta a fost corodat în acid fluorhidric (49%), HF, prin mască de fotorezist HPR. După corodarea oxidului, fotorezistul a fost îndepărtat în acetonă și placheta a fost curățată în soluție Piranha.

3.2.8 Corodarea

Corodarea constă în transferal geometriilor imprimate pe masca fotolitografică în straturile de sub aceasta. Acest subiect va fi discutat detaliat în subcapitolul 3.3 Corodarea.

3.2.9 Îndepărtarea fotorezsitului

În cele mai multe cazuri, după procesarea substratului, fotorezistul trebuie îndepărtata pentru a permite procesarea ulterioară. Fotoreziștii pozitivi pot fi îndepărtați în acetonă și alcool izopropilic (IPA), sau în tricloretilenă (TCE). Fotoreziștii negativi pot fi îndepărtați în metil-etil-ketonă (MEK) sau în metil-izobutil-ketonă (MIBK).

3.3 Corodarea

Corodarea este un pas important în microfabricație și constă în transferul geometriilor imprimate pe masca fotolitografică în straturile de sub aceasta.

Pașii principali ai procesului de corodare sunt:

depunerea stratului care trebuie corodat,

definirea fotorezistului,

corodarea stratului prin masca de fotorezist,

îndepărtarea măștii de fotorezist.

Fig.3.5 Pașii principali ai procesului de corodare

Corodarea poate fi de două feluri: umedă sau uscată. Înainte de descrierea proceselor de corodare este necesar să definim câțiva termeni importanți.

Izotropia corodării: Transferul perfect vertical al topografiei măștii fotolitografice în straturile de sub aceasta se numește corodare anizotropă. Soluția de corodare poate să atace straturile în toate direcțiile, nu numai perpendicular pe substrat, provocând și corodarea pe sub masca fotolitografică. Acest fenomen se numește supracorodare.

Fig.3.6 Corodarea anizotropă (a) și izotropă (b)

Considerând B ca fiind parametrul de subcorodare, izotropia poate fi studiată pentru două cazuri: atunci cănd se deschide o fereastră în stratul corodat (Figura 3.7a) sau atunci când se fabrică o insulă (Figura 3.7b). Parametrul B poate fi definit ca:

unde Dm este dimensiunea geometriei de pe mască și De este dimensiunea rezultată în urma corodării măsurată de la punctul de contat dintre mască si stratul corodat. Dacă B=0 atunci procesul este anizotrop. Altfel, procesul este izotrop, iar dimensiunea subcorodării, U, este dată de:

Fig.3.7: Proces de corodare izotropă

Selectivitatea. Selectivtatea este parametrul procesului de corodare care indică raportul dintre vitezele de corodare a diferitelor materiale. Trebuie luate în considerare două aspecte: selectivitatea stratului corodat în raport cu stratul de mascare – Sfm, și selectivitatea stratului corodat în raport cu substratul – Sfs.

Selectivitatea în raport cu stratul de mascare este dată de relația:

unde vf este viteza de corodare a stratului subțire în direcție verticală, iar vm este viteza de corodare a stratului de mascare.

Selectivitatea în raport cu substratul este dată de relația:

unde vs este viteza de corodare a substratului.

Acești parametri sunt foarte importanți. Daca valoarea raportului Sfm este mai mic sau egal cu 1, înseamnă că stratul de mascare ales se corodează mai repede decât stratul subțire care trebuie să fie corodat. Cu cât acest parametru este mai mare cu atât stratul de mascare are o rezistență mai bună la corodare si va proteja mai bine straturile aflate sub el. Raportul Sfs indică rezistența la corodare a materialului de sub stratul care trebuie corodat. În funcție de aplicația finală a dispozitivului, acest parametru poate să fie critic. Practic, dacă parametrul Sfs are valoare mare, corodarea se va opri când soluția de corodare ajunge la substrat. Altfel, există riscul transferului geometriilor în straturile inferioare.

Acești parametri trebuie cunoscuți înainte de a începe procesele de corodare pentru a putea calcula grosimea minimă necesară pentru stratul de mascare dar și pentru a alege soluția optimă de corodare.

3.3.1 Corodarea umedă

Procesul de corodare umedă constă în imersarea plachetei care conține stratul de corodat și stratul de mascare într-o soluție lichidă de corodare. Procesul se poate aplica cu succes pentru geometrii cu dimensiuni minime de 3 μm. Pentru dimensiuni mai mici de 3 μm, corodarea umedă nu mai poate avea loc datorită tensiunilor superficiale si a fenomenului de capilaritate, care nu mai dă voie lichidului să patrundă la suprafața ce trebuie corodată. După finalizarea corodării, plachetele trebuie imersate într-o soluție de neutralizare a agenților chimici (de obicei apă deionizată), apoi sunt clătite și uscate. Pentru a obține o uniformitate bună este recomandată încălzirea soluțiilor și agitarea lor. Soluțiile de corodare trebuie alese cu grijă pentru a obține o selectivitate cât mai bună. De asemenea, timpul de corodare trebuie optimizat pentru evitarea supracorodării.

Vom discuta despre corodarea izotropă în amestec de HNO3 și HF diluat în H2O sau CH3COOH.

Corodarea izotropă a siliciului în amestecul amintit anterior este o reacție de tip redox. HNO3 prezent în soluția de corodare oxidează suprafața siliciului în timp ce HF dizolvă stratul de oxid generat. Apa sau acidul acetic se adaugă pentru diluarea soluției, astfel putându-se controla viteza de corodare. Diluarea soluției cu acid acetic prezintă avantajul că previne disocierea acidului nitric, astfel păstrând mai bine abilitatea acestuia de a oxida siliciul. [7]

Si + HNO3 + 6HF H2SiF6 +HNO3 + H2O + H2

Soluția este foarte agresivă, viteza de corodare fiind puternic dependentă de concentrație. O soluție de HNO3 (69%)/ HF (49%) în raport volumic de 2:1 poate genera viteze de corodare de până la 50 µm/min. [8] De asemenea, viteza de corodare este puternic dependentă și de temperatura soluției: la temperatura camerei, o soluție de HF (20%)/HNO3 (45%)/ CH3COOH (35%) în raport 1:4:3 este de aproximativ 40 µm/min, iar la 50OC aceeași soluție poate ajunge la viteze de corodare de aproximativ 90 µm/min [9]. Agitarea soluției de corodare are un rol important atât pentru obținerea unei uniformități bune, dar poate ajuta și la creșterea vitezei de corodare prin îndepărtarea rapidă a produșilor de reacție de la suprafață. De exemplu, o soluție de corodare de HF (49%)/HNO3 (69%)/ CH3COOH (35%) în raport 1:2:3 poate atinge viteze de corodare între 4 și 20 µm/min, în funcție de viteza de agitare.

Corodarea umedă a straturilor metalice

Titanul se corodează umed în soluție de H2O/HF (49%)/H2O2 (30%) în raport 20:1:1.

Cromul se corodează selectiv la temperatura camerei în soluție de Cr-7 (Cyantek) cu compoziția 9% (NH4)2Ce(NO3)6 + 6% HClO4 + 85% H2O. Aceeași soluție poate fi folosită cu succes pentru corodarea Cu sau Ag.

Aurul se corodează în soluție pe bază de iod. O soluție des folosită este AU-5 (Cyantek). Conține 5%I2 +10% KI +85% H2O. Ca strat de mascare poate fi folosit fotorezistul.

3.3.2 Corodarea uscată

Corodarea uscată este o tehnică de transfer al geometriilor din stratul de mascare prin folosirea ionilor generați în plasmă. Corodarea se obține prin procese fizice (bombardament ionic) sau chimice (reacții chimice la suprafață).

Corodarea uscată permite transferul geometriilor de dimensiuni submicronice, care în general nu pot fi efectuate prin corodare umedă datorită hidrofobicității straturilor de mascare și a forțelor capilare. Procesele de corodare uscată permit de asemenea corodări perfect anizotrope, permițând obținerea pereților verticali în straturile corodate.

Corodarea uscată în plasmă se împarte în două categorii mari:

Descărcare luminiscentă

Fascicul de ioni

Procedeul cel mai des întâlnit este corodarea în plasmă cu descărcare luminiscentă, numită corodare cu ioni reactivi (RIE). Corodarea cu ioni reactivi combină efectul fizic al bombardamentului ionic și corodarea prin reacția chimică la suprafață.

Caracteristicile principale ale proceselor de corodare uscată sunt:

viteza de corodare este dictată de:

configurația sistemului

compoziția plasmei

densitatea ionilor din plasmă

presiunea de lucru

defecte induse de radiație – în plasma folosită pentru corodare sunt generați fotoni cu energie mare, atomi, ioni, electroni care pot să inducă defecte în straturile corodate sau în straturile de mascare

uniformitatea – una din caracteristicile princpale ale corodării în plasmă este dată de micro-încărcarea locală. Micro-încărcarea locală reprezintă modificarea vitezei de corodare în funcție de aria corodată. Cu alte cuvinte, cu cât aria corodată este mai mare, cu atât viteza de corodare este mai mare

Sistemul de corodare cu ioni reactivi este format dintr-o incintă vidată în care sunt plasați doi electrozi plan paraleli. Gazul de corodare este introdus în incintă și se activează generatorul de radio frecvență (13.56 MHz). Prin excitarea moleculelor de gaz, se obține o descărcare luminiscentă în plasmă. Placheta se așează pe electrodul inferior care este conectat la împământare, în cazul plasmei planare și se așează tot pe electrodul inferior, dar care este conectat la generatorul de radiofrecvență în cazul corodării cu ioni reactivi (RIE).

Fig.3.8 Schema unui sistem de corodare cu plasmă planară

Speciile reactive generate în plasmă difuzează către substrat unde interacționează chimic și generează produși volatili care sunt evacuați. Mecanismul de reacție poate fi explicat în 6 pași:

1. Moleculele de gaz disociază în specii reactive datorită interacției cu particule energetice (electroni) din plasmă;

2. Speciile reactive difuzează către suprafață;

3. La contactul cu suprafața, speciile reactive sunt absorbite;

4. Speciile reactive absorbite reacționează cu substratul și formează produși de reacție;

5. Produșii de reacție sunt desorbiți la suprafață;

6. Produșii de reacție difuzează și sunt evacuați prin sistemul de vidare.

Corodarea anizotropă adâncă a siliciului folosind procesul Bosch

Cercetarea experimentală se referă la corodarea anizotropă adâncă a siliciului pentru aplicații în microfluidică și dispozitive Micro-Electro-Mecanice (MEMS).

Caracteristicile procesului Bosch:

proces în 2 pași: pasivare-corodare;

stratul de pasivare este un fluorocarbon cu proprietăți similare Teflon-ului;

stratul de pasivare se depune din octofluorobutan, C4F8;

pasul de corodare se face cu SF6;

pereții verticali prezintă ripluri orizontale;

viteză mare de corodare;

selectivitate mare față de fotoreziști si SiO2;

Sistemul de corodare PlasmaLab 100 produs de

Oxford Instruments este un sistem de corodare cu

plasma cuplată inductiv.

Sistemul este dotat cu două inele de fixare, pentru plachete de 3 inch și, respectiv, 4 inch. Cioburi de plachete sau plachete mai mici pot fi procesate dacă

sunt lipite pe plachete de 3 sau 4 inch. Echipamentul

are două surse de radio-frecvență, Fig.3.9 Sistemul de corodare PlasmaLab100

puterea fiind controlată individual. Temperatura electrodului inferior poate fi variată controlat între -20oC și +80oC iar placheta este răcită cu Heliu.

Corodarea siliciului în DRIE este independentă de structura cristalină, facând posibilă corodarea unor geometrii inaccesibile în soluții umede de corodare anizotropă care sunt limitate de anumite plane cristaline. În microfluidică această libertate a permis fabricarea unor microcanale noi, cu profile unice de curgere: canale îngustate, radiale, meandre sau spirale.

DRIE este esențial pentru fabricarea unor dispozitive cu dimensiuni reduse. Este capabil să reproducă cu acuratețe aproape orice geometrie obținută cu ajutorul fotolitografiei. Studiile legate de dinamica fluidelor necesită DRIE pentru a fabrica cu acuratețe microcanale și orificii sau chiar membrane.

DRIE permite fabricarea unor structuri cu raport dimensional mare. Astfel se pot fabrica piloni, orificii sau microcanale cu raport dimensional de 10:1 până la 20:1, în cazuri speciale fiind raportate rapoarte de până la 40:1 sau chiar mai mari.

Procesul Bosch alternează un pas de corodare cu unul de pasivare. În timpul pasivării se obține un strat de fluorocarbon similar Teflon-ului, inert la acțiunea chimică a ionilor de fluor. În timpul pasului de corodare, stratul de pasivare este îndepărtat de pe suprafețele orizontale prin pulverizare catodică (sputtering), în timp ce suprafețele verticale nu sunt afectate. Astfel, în timpul corodării cu procesul Bosch, pe pereții verticali apar ripluri orizontale.

Fiecare pas, durează câteva secunde. În funcție de timpul de corodare/pasivare, se poate controla dimensiunea riplurilor orizontale. Cu cât pasul de corodare este mai lung, cu atât viteza de corodare este mai mare, dar crește și înălțimea riplurilor orizontale. Cei doi pași trebuie controlați cât mai bine. Un pas lung de corodare însoțit de un pas scurt de pasivare poate genera defecte în geometria finală fabricată. În cazul în care pasul de pasivare este prea lung în raport cu pasul de corodare, stratul de fluorocarbon devine prea gros pentru a fi îndepărtat într-un mod eficient prin sputtering, scăzând mult viteza de corodare, sau chiar inhibând total corodarea.

Aplicații posibile:

canale microfluidice fabricate în siliciu;

micro-matrițe pentru fabricarea canalelor microfluidice în polimeri;

fabricarea dispozitivelor MEMS;

3.4 Depunerea metalelor prin sputtering

Echipamentele de acest tip folosesc o incintă vidată (precum cea prezentată în figura 3.9) în care materialul țintă este plasat pe catod. În plasmă de Ar sunt generați ioni, care sunt accelerați către potențialul negtaiv al catodului. Datorită bombardamentului ionic, atomii din materialul țintă sunt pulverizați, ejectați de la suprafață, traversează plasma și condensează pe placheta așezată pe anod.

Prin introducerea gazelor de reacție, O2 sau N2, se poate depune o gamă variată de materiale. Această tehnică permite obținerea unei acoperiri foarte bune (conforme) chiar și pe suprafețele neplanare. Depunerea prin sputtering nu este recomandată pentru tehnicile lift-off.

Depunerea de Ti/Pt s-a efectuat pe instalația de depuneri în vid Neva. Este un echipament de o generație mai veche, iar metoda folosită este e-beam (evaporare cu fascicol de electroni), adică cu tun electronic format din filament de wolfram, grilă wehnelt, bobină pentru defelxie și creuzetul în care se află materialul ce urmează a fi evaporat.

În incintă se poziționează substratul (în speță plachete) pe platane care în timpul depunerii se rotesc pentru a obține uniformitatea startului depus.

Se selectează parametrii metalului ce urmează a fi evaporat. Când s-a atins vidul de start (0.2 Torr) începe depunerea propriu-zisă: filametul este încălzit de un curent de 30-50 A și se află la un potențial de -10 kV. Grila wehnelt focalizează fascicolul de electroni emiși de filament, iar bobina imprimă o curbură de 270° fascicolului datorită câmpului magnetic. Fascicolul de electroni va lovi cu energie mare în metalul ce se află în creuzet producând încălzirea și topirea metalului.

Tabelul 3.1: Informații despre depunerea Ti/Pt:

Depunerea de Ti/Pt s-a efectuat pe instalația de depuneri în vid Edwards. Metoda folosită este sputtering (pulverizare catodică cu magnetron în plasma de argon în DC).

Mecanismul constă în existența unui magnetron (câmpul magnetic produs de de magneți permanenți dispuși pe fața opusă a țintei de pulverizare și care joacă rol de catod). Pentru aprinderea descărcării se folosește un al doilea electrod cu rol de anod. Astfel ionii din plasma descărcării ajunși în vecinătatea catodului sunt accelerați de câmpul electric al regiunii de sarcină spațială din fața acestuia și, bombardând catodul (ținta), produc efecte termice (încălzirea catodului), pulverizarea (extragerea de atomi sau grupe de atomi din materialul țintei), efectuându-se în același mod depunerea de metal pe substrat.

În incintă se poziționează plachetele, se selectează parametrii metalului ce urmează a fi depus, iar când s-a atins vidul optim începe depunerea.

Tabelul 3.2: Informații despre depunerea Ti/Au:

Fig.3.9 Schema sistemului de depunere prin sputtering

3.5 Tehnologia de corodare a sticlei:

Tehnica folosită este cea de corodare prin masca de Si amorf. Am folosit plachetă de sticlă Pyrex de 4 inch și grosime de 700 m. Înainte de prelucrarea propriu-zisă, placheta a trecut prin niște procese pregătitoare:

Tratament termic la 560OC timp de 6 ore in atmosfera de N2;

Spălare în soluție piranha (H2SO4/H2O2 2/1) fierbinte la 120OC pentru 20 minute;

Clătire în apă deionizată;

Uscare prin centrifugare;

Încălzire în etuvă la 120OC timp de 30 de minte.

Stratul de mascare de siliciu amorf a fost depus în sistemul PECVD la 300OC, 60W, SiH4 debit 60 sccm, presiune=580 mTorr. Stratul de mascare de Si amorf prezintă o tensiune internă de compresie cu valori între 500-600 MPa. Un strat de mascare care prezintă stres de comprimare (caracteristică generală pentru siliciu amorf și polisiliciu) este de preferat o mască ce prezintă stres de întindere, astfel încât stresul total să fie în jurul valorii "zero", utilizând și o modelare a parametrilor de depunere PECVD. Ca strat de mascare Si amorf prezintă trei avantaje:

Este inert în soluțiile pe bază de HF;

Este hidrofob – soluțiile de corodare penetrează greu prin eventualele goluri apărute la depunere;

Tensiunile interne pot fi controlate foarte bine printr-o arhitectură adecvată a condițiilor de depunere asistată de plasmă (temperatură joasă, presiune și putere mică), dar și printr-un tratament termic după depunere.

Pentru a obține straturi de Si amorf cu tensiuni interne mici, depunerea se face în doi pași: la frecvență mică și apoi la frecvență mare. Tratamentul termic aplicat poate reduce tensiunile interne în stratul depus. Pentru a obține tensiuni reziduale aproape de valoarea zero se folosesc depuneri multiple la frecvențe înalte și joase ale generatorului RF în scopul de a acoperi eventualele defecte de depunere și transformarea într-o suprafață hidrofobă. Folosind și masca de fotorezist peste siliciu amorf, calitatea gravurii în termeni de profunzime poate fi semnificativ îmbunătățită până la 500μm, iar generarea defectelor se poate evita.

Fig.3.10 Corodare în sticlă – vedere în secțiune

Pașii tehnologici au fost:

Etalarea fotorezistului cu 3000 rpm pentru a obține o grosime de 1.8 m;

Tratament termic timp de 1 minut la 90oC;

Expunerea fotorezistului 15-20 secunde;

Developarea fotorezistului 15 secunde;

Tratament termic timp de 2 minute și jumătate la 110 oC pe plita electrică cu viteză de rampare mică / tratament în etuvă timp de 30 secunde.

Suprafețele de sticlă gravată sunt cu atât mai rugoase cu cât timpul de corodare este mai lung, cu cât sticla conține mai mulți produși insolubili (diverși oxizi) și cu cât soluția HF de corodare a sticlei este mai concentrată. Calitatea suprafeței poate fi îmbunătățită prin adăugarea în soluția de corodare a unei componente care solubilizează acești produși insolubili: se adaugă HCl dacă sticla conține CaO sau MgO și se adaugă H3PO4, dacă sticla conține Al2O3.

3.6 Tehnologia microfluidică pe polimeri:

Una din metodele dezvoltate in ultimii ani pentru fabricarea microdispozitivelor fluidice este așa numita litografie „moale”, bazată pe auto-asamblare sau replicare. Această metodă de microfabricație este convenabilă datorită performanțelor ridicate și a costurilor scăzute, permițând până și fabricarea unor nano-dispozitive fluidice.

Litografia moale prezintă câteva avantaje unice asupra altor forme de litografie:

– costuri mici de fabricație pentru producția în masă;

– modelarea rapidă a unor arii mari;

– biocompatibilitate;

– transparență optică;

– proprietăți termice și electrice acceptabile;

– adecvate pentru aplicații pe suprafețe non-planare;

– nu necesită depuneri fotoreactive pentru prelucrare;

– materialele pot fi funcționalizate și permit modificarea proprietăților suprafeței.

Polidimetilsiloxanul (PDMS) este cel mai folosit polimer pentru litografie moale. O ștampilă din PDMS poate fi fabricată prin depunerea pre-polimerului pe o plachetă de siliciu ce conține forma negativă a dispozitivului fabricat în PDMS. Folosind metodele clasice de litografie, placheta de siliciu este prelucrată și tratată, după care se toarnă PDMS, se usucă si se îndepărtează.

PDMS-ul prezintă proprietăți unice datorită scheletului anorganic de siloxan combinat cu prezența grupurilor metil organice atașate de siliciu [6]. Principalele proprietăți ce recomandă PDMS-ul sunt:

temperaturi de tranziție scăzute, în stare fluidă la temperatura camerei;

poate fi convertit în elastomeri prin polimerizare;

este bine cunoscut, fiind foarte bine studiat și documentat;

prepolimeri și agenți de polimerizare sunt disponibili în comerț în cantități mari;

energia de interfață este scăzută și prezintă stabilitate chimică foarte bună;

nu este hidroscopic și nu se umflă datorită umidității;

stabilitate termică foarte bună până la 180oC;

transparent din punct de vedere optic până la 300nm;

este izotrop și omogen.

Fabricarea canalelor microfluidice în PDMS reprezintă o metodă simplă și reproductibilă pentru testarea curgerii în canale microfluidice. Pentru facilitarea curgerii fluidelor în microcanale este necesară modificarea controlată a suprafețelor acestora pentru a reduce unghiul de contact al fluidelor cu pereții microcanalelor.

Tehnicile de funcționalizare în plasmă a PDMS-ului sunt bine cunoscute și au fost implementate în majoritatea laboratoarelor de cercetare în domeniu.

Aplicații posibile:

canale microfluidice fabricate în PDMS;

micro-matrițe din PDMS;

micro-ștampile din PDMS;

depuneri metalice pe substrat de PDMS.

3.7 Sinteza și caracterizarea nanoparticulelor superparamagnetice:

Materiale:

FeCl3•6H2O (236489 Sigma-Aldrich), FeSO4•7H2O (215422 Sigma-Aldrich), NH4OH-28% v/v (320145, Sigma-Aldrich), HCl (320331, Sigma-Aldrich), Polietilen glicol-PEG6000 (81255, Fluka).

Preparare nanoparticule γ-Fe2O3:

Sărurile de FeCl3•6H2O și FeSO4•7H2O au fost dizolvate în apă distilată, în raport molar 2:1. Sub agitare continuă a fost adăugată, picatură cu picatură, o soluție de amoniac (NH4OH-28% v/v) până când pH-ul soluției a ajuns la 11.0. Ulterior această soluție a fost adusă la un pH acid (4.0) și precipitatul format a fost separat cu ajutorul unui magnet. Precipitatul astfel format a fost spălat cu apă distiliată de 5 ori. Caracterizarea cu raze X a indicat formarea γ-Fe2O3. Dimensiunea nanoparticulelor a fost apreciată atât cu ajutorul razelor X cât și prin utilizarea microscopiei de baleiaj de electroni (SEM).

Avantajele folosirii nanoparticulelor superparamagnetice:

se obține un raport mult mai mare între suprafață și volum;

distanțele de difuzie sunt mult reduse datorită dimensiunilor extrem de mici ale nanoparticulelor superparamagnetice dispersate în soluție;

cea mai lungă distanță pe care este nevoie să se deplaseze reactivii este 1/2 din distanța dintre două nanoparticule superparamagnetice;

nanoparticulele superparamagnetice reduc diluția produșilor enzimatici electroactivi;

reacțiile ce au loc la interfața nanoparticule superparamagnetice – electrolit pot fi ușor monitorizate în camera de sesizare, atât prin variația curentului electrodului „counter” al senzorului electrochimic interdigitat (IDA), cât și prin relaxarea magnetizației detectată de matricea de senzori magnetici.

Preparare γ-Fe2O3 modificate cu PEG6000:

Utilizând același raport molar între FeCl3•6H2O si FeSO4•7H2O, prin metoda co-precipitării au fost obținute nanoparticule de γ-Fe2O3 modificate cu PEG6000. Astfel au fost amestecate 0.670g FeCl3•6H2O, 0.348g FeSO4•7H2O și 2.0g PEG6000 într-un volum de reacție de 4mL (apă distilată). Amestecul de reacție a fost alcalinizat cu 800μL NH4OH și apoi adus la un pH acid (4.0) utilizându-se HCl (6M). Precipitatul format a fost separat cu ajutorul unui magnet, fiind spălat cu apă distiliată de 5 ori.

Derivatizarea nanoparticulelor de maghemită cu PEG6000 a fost confirmată cu ajutorul spectroscopiei în infraroșu cu transformata Fourier (FT-IR). Analiza SEM indică prezența polimerului PEG6000.

Caracterizare FTIR (transformata Fourier în infraroșu)

Spectrometria de absorbție moleculară în infraroșu este o tehnică analitică foarte utilizată în primul rând pentru analiza calitativă atât a substanțelor anorganice, dar în special a substanțelor organice, pe baza spectrelor de absorbție caracteristice, datorate vibrației atomilor în cadrul diferitelor grupări existente în moleculele analizate. Spectrometria cu transformata Fourier în infraroșu (FTIR) poate fi folosită pentru studierea proceselor chimice și a structurii compușilor chimici.

Pentru studierea configurației legăturilor chimice formate prin funcționalizarea nanoparticulelor magnetice de oxid de fier cu PEG (polietilen glicol), s-a folosit un spectrometru FTIR Bruker Tensor 27, probele fiind înregistrate pe un domeniu spectral cuprins între 4000-400 cm-1. Starea de agregare a probelor fiind solidă, pulberi nanostructurate, s-a ales ca tehnică de prelucrare înglobarea probei în bromură de potasiu (KBr) și pastilarea acesteia, spectrele fiind înregistrate ulterior folosind modulul de transmisie.

Spectru pulbere de oxid de fier nanostructurat:

Fig.3.12 Spectru FTIR pentru proba de oxid de fier

În figura 3.12 este prezentat spectrul pentru o probă reprezentativă de oxid de fier nanostructurat. Proba este caracterizată prin benzile spectrale ce apar la 584 cm-1 și respectiv 444 cm-1, benzi ce pot fi atribuite modului de vibrație a legăturii Fe-O,  ν(Fe-O). Benzile spectrale de la 3421 cm-1 si 1617 cm-1 pot fi atribuite modului de întindere, ν(OH), și respectiv de deformare,  δ (OH), a legăturii O-H, iar împreună cu celelalte benzi din regiunea 1200-800 cm-1 pot fi puse pe seama alcoolului folosit în procesul de obținere a nanoparticulelor de oxid de fier.

Fig.3.13 Spectre FTIR pentru toate cele trei tipuri de probe: PEG, oxid de fier, oxid de fier funcționalizat cu PEG

Caracterizare prin difracție de raze X

Fig.3.14 Spectru obținut prin difracție de raze X

Tabelul 3.3: Date furnizate de sistemul de difracție cu raze X, Rigaku (vezi anexa 1)

Peak list

Observații:

1) Sinteza nanoparticulelor superparamagnetice a fost făcută de specialiștii în chimie din IMT.

2) Caracterizarea nanoparticulelor superparamagnetice a fost făcută cu aparate dedicate, graficele și tabelele obținute fiind extrase din program.

Modelarea interacției dintre particulele sppm și senzorul realizat din Permalloy

Poziționarea plachetei de Si în sistemul cu magneți permanenți:

Fig.3.15 Placheta de Si și circuitul magnetic plasate în instalația de depunere în vid, Balzers;

axa de anizotropie indusă va fi orientată după direcția lui Bpol.

Fig.3.16 Arhitectura și structura valvei de spin (structurii GMR) depuse.

Dacă se reprezintă rezistența în funcție de intensitatea câmpului magnetic se obține o curbă hysterezis asemănătoare. Valva de spin prezintă o stare ON (feromagnetică) și o stare OFF (antiferomagnetică). Pentru a deschide valva se aplică fie un câmp magnetic, fie un curent electric valvei de spin. Pentru a o închide o polarizăm negativ. Valva de spin este o capcană magnetică perfectă: deschidem valva, captăm moleculele de interes, le atașăm unor nanotransportori magnetici și apoi, în starea off a valvei, se eliberează moleculele. Putem detecta modificările de stare prin măsurarea variației magnetorezistenței în funcție de câmpul aplicat.

Fig.3.17 Modificarea magnetizației valvei de spin în funcție de câmpul magnetic aplicat

În fig.3.18 este schematizat procesul de biodetecție în cazul utilizării ca element de detecție un senzor magnetic spintronic. Fluidul ce conține diverși antigeni curge deasupra senzorului acoperit cu anticorpi având astfel loc procesul de detecție selectivă, așa cum este ilustrat în figura 3.18. După ce are loc procesul de biodetecție selectivă este introdus din nou un fluid cu anticorpi de aceeași natură, însă marcați cu particule superparamagnetice. Un aspect esențial în detecție este prezența unui câmp magnetic extern deoarece aceste nanoparticule prezintă un moment magnetic zero în absența câmpului. Tot în fig.3.18 este schițat ansamblul ce rezultă în urma acestui proces de biodecție sub forma unei nanoparticule sppm plasată pe suprafața senzorului prin intermediul unui strat de imobilizare. Câmpul magnetic aplicat magnetizează aceste nanoparticule sppm care la rândul lor creează un câmp magnetic ce poate fi detectat de către senzorul GMR (în acest caz).

Fig.3.18 Schema detecției utilizând anticorpi marcați cu nanoparticule sppm și senzori spintronici.

Isens=10 mA apă+particule sppm, t=0 t=15 min t=30 min

Fig.3.19 Experiment ce evidențiază interacția particulelor sppm cu suprafața senzorului. Se remarcă, după ce apa s-a evaporat, cum nanoparticulele s-au localizat preferențial pe suprafața senzorului (stânga jos).

Rezultanta dintre câmpul magnetic perpendicular pe suprafață și câmpul magnetic generat de senzor face ca nanoparticulele, inițial dispersate uniform în lichid, să ramână în interiorul suprafeței iar cele din exterior să se aglomereze spre margini. Se observă că, deși senzorul din stânga sus se află în același câmp magnetic extern ca și cel din stânga jos, pe el nu se obține aceeași acumulare de nanoparticule. Acest lucru se datorează faptului că prin acest senzor curentul trece prin cele două brațe alăturate, nu prin diagonală.

Capitolul 4

Caracterizarea dispozitivului:

Voltamograma ciclică a senzorului IDA este prezentată în fig.4.1. Soluția buffer conține 10mM de K3Fe(CN)6 (ferocianură de potasiu). Fiecare electrod a fost scanat de la -0.45 la 0.55 V cu viteza de 200 mV/sec față de electrodul de referință de Ag/AgCl. Graficul din fig.4.1 arată că performanțele electrodului de aur se mențin timp de 3 zile de folosiri intense. Prima voltamogramă ciclică din fiecare zi tinde să fie puțin deplasată față de restul, dar electrodul revine în parametrii inițiali de funcționare după câteva măsurători. Astfel, este de dorit să se efectueze cel puțin 5 măsurători înainte de prima utilizare, pentru a inițializa electrozii, în special dacă IDA nu a fost folosit perioade lungi de timp.

Fig.4.1 Voltamograme ciclice pentru IDA de aur pentru verificarea stabilității

În diagrama Nyquist, impedanța este reprezentată ca și vector de lungime |Z|. Unghiul dintre vector și axa absciselor este diferența de fază . Difuzia poate crea impedanță Warburg care depinde de frecvența potențialului de perturbație. La frecvențe mari, impedanța Warburg este mică din moment ce reactanții care difuzează nu se deplasează foarte departe. Pe diagrama Nyquist, impedanța Warburg apare ca o linie diagonală cu panta 1. Pe diagrama Bode, impedanța Warburg arată o diferență de fază de 45o. Acest circuit modelează celulele pentru care polarizația este dată de o combinație de procese cinetice și de difuzie. Diagrama Nyquist pentru acest circuit apare în figura 4.2. Coeficientul Warburg determinat este aproximativ 150 W sec-1/2, Rct = 600 , și Cdl = 0.25 µF. O altă metodă de caracterizare este diagrama Bode. Valoarea absolută a impedanței |Z| și diferenței de fază au fost plotate în raport cu frecvența. Spre deosebire de o diagramă Nyquist, diagrama Bode arată explicit informația despre frecvență. Din diagrama Bode putem observa că limita inferioară a frecvenței a coborât la 10 Hz, iar faza se apropie de 45o la frecvențe reduse (fig.4.3).

Compatibilitatea dimensională a IDA cu entitățile biologice îl fac o alegere normală pentru abilitatea sa de a detecta reacții biologice la suprafața electrodului fără a fi necesar un pas de amplificare, obținându-se astfel bio-senzitivitate fără etichete. Comparat cu dimensiunea celulelor melanom (diametru de 9 – 12 μm), senzorul IDA este compatibil din punct de vedere dimensional.

Fig.4.2 Diagrama Nyquist

Fig.4.3 Diagrama Bode cu variația modulului fazei și impedanței în gama de frecvențe stabilite

Linia de celule melanom B16 este asigurată de INCD în Patologie și Științe Biomedicale "Victor Babeș" și au fost cultivate în Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, cu conținut crescut de glucoză 4.5 mg/mL) suplimentat cu 10% ser fetal de bovină și 100 IU/ml penicilină-streptomicină într-un incubator la 37oC cu 5% CO2. Melanomul B16 a fost obținut prin inocularea a 3×105 celule în 100μl de PBS (phosphate buffered saline – menține pH constant) în partea dreaptă a unor femele șoarece de șase săptămâni. Cuantificarea numărului de celule a fost monitorizat la scară largă cu Tecan GENios Pro. Luând în considerare impedanța totală a celulei biologice prin includerea rezistivității și capacității membranei celulare, prezența membranelor intacte pe electrozi contribuie la capacitatea și/sau rezistivitatea senzorului, și determină un semnal electric. Deci, membranele celulare atașate de electrozi acționează ca și rezistori pe suprafața senzorului și afectează rezistivitatea interfacială. Rezistivitatea interfacială este cel mai bine reprezentată ca și rezistența transferului electronic de sarcină în prezența unei probe redox ([Fe(CN)6]3−/4−) și poate fi monitorizată selectiv. Fig.4.4 prezintă un grup reprezentativ de diagrame Nyquist pentru răspunsurile impedanței spectroscopice ale unui biosenzor IDA la diferite cantități de celule melanom.

Fig.4.4 Detecția IDA a celulelor melanom și anticorpilor anti-melanom.

În fig.4.4 este figurat spectrul de impedanțe Nyquist al biosenzorului IDA cu diferite cantități de celule melanom imobilizate pe suprafață.

A = numai electrolit,

B = numai anticorpi antimelanom,

C = 500 celule melanom,

D = 1000 celule melanom,

E = 1500 celule melanom.

Frecvența scade de la stînga la dreapta. Amplitudinea tensiunii: 10 mV; Electrolit: 10 mM [Fe(CN)6]3−/4− (1:1) în 0.01 M PBS, pH 7.4.

Am considerat o structură de tip disc, din Permalloy, plasată deasupra unei benzi conductoare, nemagnetice, cu rol de polarizare a senzorului. Un câmp magnetic extern este aplicat ca in Fig.4.6 (a). De interes este profilul câmpului magnetic când nanoparticula sppm, 100 nm în diametru, este deplasată de-a lungul axei Oy la o distanță de 200 nm deasupra suprafeței senzorului (distanța echivalentă cu grosimea unui strat de protecție plasat pe senzor). Profilul câmpului magnetic și al forței de interacție sunt prezentate în fig.4.6 (b), respectiv fig.4.6 (c).

Fig.4.6 (a) Setup-ul utilizat pentru simulări, (b) profilul câmpului magnetic și (c) profilul forțelor care se aplică nanoparticulei datorită prezenței discului de Permalloy (10 nm) și a câmpurilor aplicate; Hbias=100 Oe (Ibias=10,5 mA) iar Happl=200 Oe.

Se remarcă faptul că forța tinde să localizeze nanoparticulele pe marginea senzorului. Dacă particulele s-au aflat inițial pe suprafața centrală a senzorului atunci ele vor rămâne localizate în această regiune. Această observație permite realizarea unui setup ce permite localizarea în mod spontan a nanoparticulelor magnetice.

O comportare asemănătoare am observat experimental și dacă se aplică un câmp magnetic extern perpendicular pe suprafața senzorului iar pe o diagonala acestuia se aplică un curent, Isens ca în fig.4.5. În acest experiment am utilizat un chip cu 4 senzori realizați în IMT, din Permalloy (20 nm) și diametrul zonei circulare de 1 mm; nanoparticulele sppm de maghemită au fost, de asemenea, obținute în IMT cu un diametru mediu de 10 nm. Folosind un fir de Cu (0,2 mm diametru) în formă de V alungit (unghi de 10 grade), prin care trece curent, au fost colectate nanoparticule superparamagnetice din soluția în care se află în suspensie. Vârful pe care se află colectate nanoparticulele a fost pus pe suprafața picăturii de apă, moment în care a fost întrerupt curentul prin vârful de Cu. Particulele au fost eliberate în picătură. A fost urmarită distribuția nanoparticulelor superparamagnetice pe suprafața plachetei cu senzori în următoarele condiții: curent aplicat prin doi senzori și câmp magnetic aplicat perpendicular pe suprafața plachetei cu senzori. Distribuția nanoparticulelor deasupra senzorilor a fost înregistrată folosind un microscop cu cameră digitală.

Concluzii

Așa cum am expus în introducere scopul prezentei lucrări este de a realiza un dispozitiv care să detecteze reacțiile biomoleculare de la suprafața particulelor magnetice, presupunând descrierea detaliată a etapelor de proiectare, fabricare și caracterizare a LOAC. De asemenea am descris mecanismul de operare al unui dispozitiv lab-on-a-chip fabricat prin tehnici clasice de fotolitografie. S-a demonstrat că senzitivitatea crescută a acestui tip de senzor este datorată dimensiunilor și proiectării corecte. Microelectrozii sunt potriviți pentru experimente electrochimice în solvenți nonpolari și conductivitate redusă pentru detecția activității celulare, unde macroelectrozii nu pot fi folosiți datorită scăderii potențialului și a zgomotului de fond, demonstrând astfel utilitatea și aplicabilitatea electrozilor IDA.

S-au observat avantajele integrării nanoparticulelor superparamagnetice, și anume pierderi prin histerezis aproape nule, posibilitatea de a fi funcționalizate după tipul biomoleculelor analizate, o mai mare sensibilitate atât a biosenzorului electrochimic, cât și a senzorului magnetorezistiv.

Pe baza rezultatelor obținute în cadrul acestui proiect a fost deschisă o nouă direcție de cercetare în România privind laboratoarele de analiză imunochimică pe un cip, concretizată și prin continuarea cercetării în sensul optimizării proceselor de depunere a straturilor metalice subțiri, optimizarea arhitecturii valvelor de spin, caracterizarea senzorului magnetic, caracterizarea dispozitivului integrat, inclusiv prin determinarea curenților maximi pe electrodul counter la trecerea nanoparticulelor superparamagnetice.

Toate experimentele au fost realizate în zona tehnologică a IMT București, iar pentru procesele de microfabricație și funcționalizări în plasmă am folosit notele tehnice ale laboratorului de micro și nanofluidică (Andrei Marius Avram și Marioara Avram).

Un nou proiect ce vine în completarea celui prezentat și se va derula în cadrul IMT constă într-un dispozitiv LOAC pentru determinarea apoptozei celulare – noutatea acestuia va consta în aceea că cele trei module (microfluidic, electrochimic, magnetic) vor fi complet separate și încastrate în PDMS cu posibilitatea de a culisa ca “sertarele dulapului”, astfel încât să se poată alege microelectrozii, structurile magnetice și platforma microfluidică potrivite dimensiunii biocelulelor de analizat

Fig.Cz.1 LOAC culisant

Bibliografie

[1] http://en.wikipedia.org/wiki/Lab-on-a-chip

[2] http://biomems.fbk.eu/en/BioMEMS+home

[3] D. Dascălu, curs Microsenzori – MON 2013

[4] http://www.als-japan.com/1051.html

[5] C. Iliescu and A. Avram, “Metallization over nonplanar surfaces” in “Chemical Mineralogy, Smelting and Metallization” E.D. McLaughlin and L.A. Breaux, Eds, Nova Science Publishers Inc 2009

[6] F.E.H. Tay, C. Iliescu, J. Jing and J. Miao, “Defect-free wet etching through Pyrex glass using Cr/Au mask,” Microsystem Technologies, vol. 12, no. 10-11, 2006, pp. 935-939

[7] W. Kern and C. A. Deckert, “Chemical Etching” in “Thin Film processes”, JL Vossen, W Kern, Eds, Orlando, Academic Press, 1978

[8] B. Schwartz and H. Robbins, „Chemical etching of silicon III: Temperature studying the acid system” J. Electrochem. Soc., vol. 108, pp. 365-372, 1961; GTA Kovacs, NI Maluf, KE Petersen, Bulk Micromachinig of Silicon, Proceedings of IEEE, vol. 86, 1536-1551, 1998

[9] J.C. Greenwood, “Ethylene-Diamine-Cathecol-Water mixture shows preferential etching of p-n junction”, J. Electrochem. Soc., vol. 116, pp. 1325-1326, 1969

[10] M. Avram, C. Balan, I. Petrescu, V. Schiopu, C. Marculescu, A. Avram, “Gold Nanoparticle Uptake by Tumor Cells of B16 Mouse Melanoma”, Plasmonics (2012)

[11] M. Volmer, M. Avram, „Microbeads Detection Using Spin-Valve Planar Hall Effect Sensors”, Journal of Nanoscience and Nanotechnology, Vol. 12, 2012

[12] C.Iliescu, H.Taylor, M. Avram, J.Miao, S. Franssila, „A practical guide for the fabrication of microfluidic devices using glass and silicon”, Biomicrofluidics 6, 016505 (2012)

[13] A. Avram, C. Marculescu, C.M. Balan, C. Voitincu, C. Pirvulescu, M. Volmer, A. Popescu, M. Mihailescu, M. Avram, „Microbiosensor for electrical impedance spectroscopic study of melanoma cells”, CAS 2012, Sinaia

[14] M. Volmer, M. Avram, „On magnetic nanoparticles detection using planar Hall effect sensors”, CAS 2012, Sinaia

[15] A. Avram, M. Volmer, V. Șchiopu, I. Petrescu, M. Avram, „Study of Melanoma Cells Apoptosis Induced by Magnetic Hyperthermia”, International Conference on Nanotechnology in Medicine – NANOMED2012, 7-9 November 2012, University College London, UK

[16] Avram M., Petrescu I., Volmer M., Bălan C. M., Mărculescu C., Avram. A., Cellular uptake of gold covered maghemite superparamagnetic nanoparticles and their effects on mouse melanoma B16 cells, Euromat 2011, Montpellier, France, Sept. 12-15

[17] C. Iliescu, M. Avram, B. Chen, A. Popescu, V. Dumitrescu, D.P. Poenar, A. Sterian, D. Vrtacnik, S. Amon, P. Sterian, „Residual stress in thin films PECVD depositions: a review”, JOAM, vol.13, No.4, (2011)

[18] M. Volmer, M. Avram, „Micromagnetic Simulations on Detection of Magnetic Labelled Biomolecules Using MR Sensors”, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 321 (2010)

[19] Jaephil Do, Teză de Doctorat – A disposable polymer lab-on-a-chip with micro/nano bisensor for magnetic nano bead-based immunoassay, Universitatea din Seul, august 2006

[20] Ramakrishna Sista, Lucrare de dizertație – Development of a digital microfluidic lab-on-a-chip for automated immunoassay with magnetically responsive beads, Universitatea din Florida, martie 2007

[21] Sang Kyung Kim, Teză de Doctorat – Redox cycling for an in-situ enzyme labeled immunoassay on interdigitated array electrodes, Institutul de Tehnologie din Georgia, august 2004

Anexa 1: Echipamente și programe utilizate