BIOSENZORI PE BAZĂ DE HRP PENTRU DOZAREA ACETAMINOFENULUI [629543]

BIOSENZORI PE BAZĂ DE HRP PENTRU DOZAREA ACETAMINOFENULUI
SI SCREENINGUL POTENTIIALELOR ANTIDOTURI
INTRODUCERE
Îmbunatatirea “Calitatii vietii” este unul dintre cele mai importante obiective ale eforturilor cercetării
globale. Bineîn teles calitatea vie tii este strâns corelată cu controlul bolilor, a calit ătii si siguran tei
medicamentelor si a mâncării si cu calitatea mediului înconjurător. În toate aceste domenii o
monitorizare continuă, sensibilă, rapidă, exactă si precisă este necesară pentru a controla parametrii
cheie. Biosenzorii, un nou concept de senzori dezvolta ti în ultim ii 40 de ani reprezintă dispozitive
promi tătoare în acest context.
Un biosenzor, conform definitiei IUPAC, este un dispozitiv integrat, care este capabil să genereze
informa tie analitică cantitativă sau semi -cantitativă folosind un element biologic cu rol de recunoastere
(recept orul biochimic) ce este fixat în contact spatial cu un traductor fizic. De fapt , acest sistem
transformă reactia dintre un analit si componenta biologică într -un semnal detectat si monitorizat de
către traductor, semnal ce reflectă concentra tia substratulu i.
În domeniul medical au fost dezvoltati biosenzori pentru glucoză, fructoză, etanol, lactat, colesterol,
pentru diferiti compusi din sânge (electrolti, uree, amoniu, glucoză sau hematocrit), biosenzori pentru
proteina A si IgG (imunosenzori).
SCOP
Scopul acestei teze este de a dezvolta si de a explora biosenzorii amperometrici enzimatici ce folosesc ca
si biocomponent peroxidaza din hrean sau tirozinaza, ca si traductor diferite tipuri de electrozi (electrozi
pastă de carbon, electrozi de carbon vitros sa u electrozi impimati) precum si diferite tehnici de
imobilizare a enzimei la suprafata electrozilor (particule magnetice pe bază de siliciu, film pe bază de
alcoxid de zirconiu si polietilenimină sau particule magnetice cu streptavidină), aplicate în anali za
farmaceutică si biomedicală la dozarea paracetamolului la concentratii micromolare, la screeningul
antidoturilor în caz de intoxicatie cu paracetamol .

Un biosenzor pe bază de peroxidază imobilizată prin intermediul particulelor
magnetice de siliciu pentru studiul biotransformării si studii de inhibitie pentru acetaminofen
A fost dezvoltat un biosenzor cu HRP pentru dozarea paracetamolului din produse farmaceutice si
pentru investigarea tiolilor care sunt inhibitori ai semnalului biosenzorului.
Imobil izarea H RP-ului s -a realizat prin retentie la suprafat a si în interiorul microparticulelor nanoporoase
magnetizate de siliciu, acest ea fiind apoi fixate la suprafat a unui electrod pastă de carbon cu ajutorului
unui magnet.
Nanostructura poroasă a micropar ticulelor a permis imobilizarea unei cantităti ridicate de enzimă , iar
datorită proprietati lor magnetice imobilizarea enzimei s -a realizat în strânsă proximitate cu suprafa ta
electrodului, particulele fiind atrase la suprafata acestuia de un magnet fixat î n interiorul electrodului.
Mod de lucru

BIOSENZORI PE BAZĂ DE HRP PENTRU DOZAREA ACETAMINOFENULUI
SI SCREENINGUL POTENTIIALELOR ANTIDOTURI
Această configuratie a fost aplicată la studiul oxidării biocatalitice a acetaminofenului în prezenta apei
oxigenate. În prima etapă, în prezenta apei oxigenate, peroxidaza este oxidată la Compusul I . Apoi acest
comp us în reactie cu acetaminofenul este redus generând HRP -ul initial si Nacetilparabenzochinonimina .
(NAPQI). În ultima etapă NAPQI, generată de către HRP -MMPs, este electroredusă la suprafata
electrodului ,iar curentul generat este înregistrat. Semnalul amp erometric rezultat este proportional cu
concentratia acetaminofenului.
Răspunsul amperometric al biosenzorului
Comportamentul electrocatalitic al biosenzorului enzimatic fată de reducerea electrochimică a
acetaminofenului a fost studiată prin tehnica amperometrică. Răspunsul amperometric a fost diferit
când HRP -ZrO2 -PEI GCE a fost păstrat peste noapte în 0.1M tampon fosfat, într -o soluti e de 1.13×10−4M
acetaminofen si 0.2mM H2O2 sau într -o solutie 1.13 x10−4M acetaminofen. Aceste diferente pot apărea
datorită hidratării diferite a filmului.
Pentru a îmbunătăti răspunsul senzorului HRP -ZrO2 -PEI GCE, diferite cantităti de enzimă au fost
imobilizate la suprafata electrodului. Un studiu amperometric realizat timp de 18 zile a arătat faptul că ,
crescând cant itatea de enzimă de la suprafata electrodului (de la 0.3mg la 0.6 mg) limita de detectie de
1.17 x 10−7M acetaminofen si domeniul de linearitate de la 1.96 x 10−5M la 2.55 x 10−4M acetaminofen
ale biosenzorului nu s -au schimbat.
S-a observat o mai bună rep etabilitate cu cresterea timpul ui ce poate fi explicată de o mai bună
hidratare si o rearanjare mai stabilă a filmului. Micsorarea răspunsului biosenzorului în timp se
datorează inactivării enzimei si/sau pierderii acesteia de la suprafata electrodului.

Figura 1. Reprezentarea schematică a peroxidării acetaminofenului (APAP) (pH 7.4) de către
peroxidaza din hrean (HRP) imobilizată la nivelul microparticulelor magnetice (HRP -MMPs) urmată
de electroreducerea NAPQI la nivelul electrodului pastă de carbon mag netizat
Biosenzorul a permis dozarea acetaminofenului la concentra tii în domeniul micromolar si studiul
comparativ a unor deriva ti tiolici, care se stiu că reac tionează cu compusii oxida ti ai paracetamolului si

BIOSENZORI PE BAZĂ DE HRP PENTRU DOZAREA ACETAMINOFENULUI
SI SCREENINGUL POTENTIIALELOR ANTIDOTURI
care sunt folosi ti ca produsi de detoxifiere în caz de intoxica tie cu paracetamol. În prezen ta tiolilor are
loc o adi tie nucleofilă ducând la reducerea NAPQI s i prin urmare si la scăderea semnalului amperometric
(Figura 2).

Figura 2. Oxidarea paracetamolului la NAPQI urmată de reducerea de către gl utation

Domeniul de linearitate a curentului înregistrat versus concentra tia APAP a fost determinat între 2 × 10 –
6 si 5.7 × 10 -5 M (R2 = 0.9993, RSD a pantei = 20%, n = 5). Limita de detec tie a acestei metode pentru
acetaminofen este 0,75ng/ml. Biosenzoru l a fost aplicat la determinarea paracetamolului d in forme
farmaceutice (Perdolan) folosind metoda adit iei standard. Rezultatele obtinute cu ajutorul biosenzorului
au fost 198.0 ± 0.8 mg/tabletă, n = 9. Voltametria ciclică, prin măsurarea curentului de oxi dare, în
domeniul de poten tial de la – 0.2 la 0.9 V, a fost folosită ca metodă de referin tă pentru determinarea
paracetamolului din tabletele de Perdolan . Prin această metodă s -au ob tinut 199.8 ± 0.6 mg/tabletă, n =
9. Asadar rezultatele ob tinute cu ajutorul biosenzorului sunt comparabile cu cele ob tinute prin
voltametrie ciclică si cu cele declarate de către producător; si anume 200 mg/tabletă. Diferi ti compusi
care se conjugă printr -o legătură sulfhidril cu produsul de oxidare generat enzimatic din acetaminofen,
NAPQI, au fost investiga ti ca poten tiale antidoturi în caz de supradozare cu paracetamol. IC50,
concentra tia de inhibitor care reduce cu 50% semnalul ini tial, a fost calculate pentru fiecare din
inhibitorii studia ti pentru a compara puterea l or inhibitorie. Dintre poten tialele antidoturi investigate
cisteina a fost cea mai puternică urmată de glutation, lizinat de N -acetilcisteină si în final captopril.
Biosenzorul cu HRP reprezintă un dispozitiv analitic capabil să genereze enzimatic specii reactive oxidate
care pot fi reduse electrochimic. Acesta poate fi utilizat si la alte investiga tii pentru a analiza peroxidarea
si a altor medicamente sau la screeningul altor inhibitori a procesului de peroxidare. Usurin ta procedurii
experimentale precum si disponibilitatea comercială a HRP -ului fac utilizarea biosenzorului cu HRP
atractivă pentru analize de laborator de rutină.
Bibliografie :
– Castillo J, Gaspar S, Leth S, Niculescu M, Mortari A, Bontidean I, et all. Biosensors for life
quality Design, development and applications. Sens Actuators B 2004;102:179 -194
-Clark LC, Lyons C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann
NY Acad Sci 1962;102:29 -45
-Thevenot DR, Toth K, Durst RA, Wilson GS. Electrochemical biosensors: recommended
definitions and Classification. Biosens Bioelectron 2001;16:121 -131
– Dzyadevych SV, Arkhypova VN, Soldatkin AP, Elskaya AV, Martelet C, Jaffrezic -Renault N.
Amperometric enzyme biosensors: Past, present and future. ITBM -RBM 2008;29:171 -180

BIOSENZORI PE BAZĂ DE HRP PENTRU DOZAREA ACETAMINOFENULUI
SI SCREENINGUL POTENTIIALELOR ANTIDOTURI
– Flanagan RJ, Meredith TJ. Use of N -acetylcysteine in clinical toxicology. Am J Med
1991;91:131 -139