Biosenzori

CUPRINS

I. PARTEA TEORETICĂ

INTRODUCERE

1.1 Definiție

1.2 Scurt istoric

CLASIFICAREA BIOSENZORILOR

CARACTERISTICILE BIOSENZORILOR

STRUCTURA BIOSENZORILOR

4.1 Componenta biologică- bioreceptorul

4.1.1 Microorganisme

4.1.1.1 Biosenzorul pentru asimilarea zaharurilor

4.1.1.2 Biosenzorul pentru determinarea concentrației

de glucoză

4.1.1.3 Biosenzorul pentru determinarea concentrației

acidului acetic

4.1.1.4 Biosenzori pentru determinarea concentrației

de alcool

4.1.1.5 Biosenzorul pentru determinarea concentrației

de acid formic

4.1.1.6 Biosenzorul pentru determinarea concentrației

de cefalosporine

4.1.1.7 Biosenzorul pentru determinarea concentrației

de amoniac

4.1.2 Țesuturi animale și vegetale

4.1.2.1 Biosenzorul pentru glutamină

4.2 Componenta fizică- traductorul

BIOSENZORI AMPEROMETRICI

BIOSENZORI POTENȚIOMETRICI

6.1 Electrodul ion-selectiv

6.1.1 Electrozi de sticlă pentru cationi

6.1.2 Electrozi de sticlă pentru pH

6.1.3 Electrozii membrană solidă

6.2 Electrodul de enzimă 6.2.1 Electrodul pentru glucoză 6.2.2 Electrodul pentru aminoacizi

6.2.3 Electrodul pentru penicilină

BIOSENZORI OPTICI

BIOSENZORI CALORIMETRICI

APLICAȚII

9.1 Senzori pentru glucoză

9.2 Senzori pentru acetilcolină

9.3 Senzori pentru alcool

9.4 Senzori pentru aminoacizi

9.5 Senzori pentru glucolat

9.6 Senzori pentru L-lactat

9.7 Senzori pentru peroxidaze

9.8 Paste de carbon modificate cu țesuturi și celule

II. PARTEA PRACTICĂ

III. CONCLUZII

I. PARTEA TEORETICĂ

1. INTRODUCERE [34]

1.1 Definiție

Un biosenzor este un sistem care detectează, înregistrează, transformă și transmite informația rezultată în urma unei schimbări fizice sau prezenței în sistem a diferitelor elemente chimice sau materiale biologice. Pe scurt, biosenzorul este un sistem analitic care transformă răspunsul biologic într-un semnal electric.

Nu este ușor să faci diferența între un senzor și un sistem analitic complex. Cromatografia în fază gazoasă, spectrometria în infraroșu și spectrometria de masă pot fi considerate senzori chimici. Senzorul chimic este un sistem care transformă informația chimică, pornind de la concentrația unui component specific, într-un semnal analitic folositor.

Biosenzorii constituie o subgrupă a senzorilor chimici în care moleculele biologice gazdă, cum sunt anticorpii naturali sau artificiali, enzimele sau receptorii și hibrizii lor, sunt echivalente cu liganzii sintetici și sunt integrați într-un proces de recunoaștere chimică.

Biosenzorii îmbină într-un singur sistem detector, sensibilitatea chemosenzorilor cu selectivitatea proceselor de recunoaștere enzimatică și biologice.

Biosenzorii moderni au evoluat prin combinarea a doua discipline separate: tehnologia informațională (microcircuite și fibre optice, procesare numerică a datelor, teoria generală a sistemelor cu comportare neliniară) și biologia moleculară. Prima furnizează electrozi miniaturali sau senzori optici, tehnici de prelucrare si procesare a informației, iar a doua pune la dispoziție  biomolecule care recunosc o substanță țintă.

În prezent, biosenzorii reprezintă un domeniu care se dezvoltă cu rapiditate, cu o creștere anuală de aproximativ 60%. Aplicațiile cele mai multe se înregistrează în domeniul medical dar și în alte domenii cum sunt industria alimentară cât și cea a mediului. În momentul de față, la nivel global, se cheltuie în jur de 12.000.000.000 £ pe an din care 30% sunt investiți în domeniul medical. Descoperirile din acest domeniu sunt numeroase și cuprind numeroase discipline cum sunt: biochimia, chimia fizică, electrochimia, ingineria electronică și ingineria de software.

1.2 Scurt istoric

În 1950, Leland C. Clark Jr., a inventat un electrod destinat a fi folosit pentru  măsurarea oxigenului dizolvat în sângele bolnavilor operați. Acesta este format dintr-un electrod de platină și un electrod cu o membrană de plastic permeabilă la gaze. Polaritatea electrodului a fost astfel stabilită încât intensitatea curentului prin circuit să depindă de viteza de difuzie a oxigenului prin membrană, viteză ce este direct proporțională cu concentrația externă a oxigenului.

În 1962, Clark extinde folosirea acestui "electrod de măsurare a oxigenului" la determinarea nivelului de glucoză în sânge. El a îmbrăcat senzorul pentru oxigen cu un strat subțire de gel ce conține un biocatalizator, o enzimă numită gluco-oxidaza, urmat de o membrană semipermeabilă de dializă ce permite glucozei să difuzeze în senzor, dar oprește enzima să difuzeze în afară. Cu cât intră o cantitate mai multă de glucoză, cu atât mai mult oxigen este consumat de enzimă. Deci, o cantitate mică de oxigen existentă se traduce prin existența unui nivel ridicat de glucoză.

În 1969, G. Guilbault inventează un sistem de măsurare a cantității de uree în fluidele corpului. Dispozitivul folosește o enzimă, urează, ce transformă ureea în bioxid de carbon și amoniac. Electrodul sesizează schimbările în concentrația ionilor de amoniu. Acest dispozitiv prezintă o îmbunătățire, deoarece se bazează pe o detecție potențiometrică (un fel de senzor potențiometric), o tehnică care este folosită foarte mult de atunci. În timp ce senzorii lui Clark măsoară trecerea curentului prin electrod, senzorul potențiometric măsoară tensiunea necesară pentru menținerea curentului la zero. Electrodul nu consumă nici un fel de reactanți, de aceea este mai puțin susceptibil la erori cauzate de schimbările survenite în mediul extern. În plus, sistemul potențiometric are o curbă logaritmică de răspuns, astfel încât se pot urmării concentrații de 100 de ori mai mari.   

În deceniile ce au urmat, peste 100 de enzime au fost folosite în biosenzori. Cercetătorii în domeniu au descoperit, că se pot folosi nu numai enzimele singulare, ci și țesuturi sensibile la aminoacizi și la alte biomolecule importante. De exemplu, folosirea pulpei de banană pentru măsurarea dopaminei, miezul de porumb pentru piruvat, frunza de castravete pentru cisteină, sfecla de zahăr pentru tirozină, ficatul de iepure pentru guanină și pudra de mușchi de iepure pentru monofosfatul de adenozină.

Rechnitz a mers și mai departe în folosirea unor părți din sisteme biologice. Unul din senzorii săi conține o antenulă, un mic organ de simț, de la un crab albastru, supus disecției pentru a-i folosi fibrele nervoase la un electrod. Acest dispozitiv poate măsura concentrația unor droguri, precum și a toxinelor din mediu. Noile descoperiri biotehnice au îmbunătățit astfel biosenzorii.

În 1970, J.B.Angel și K.D.Wise au construit multielectrozi în miniatură pe un cip siliconic ce poate face măsurători pe țesuturi neurale. Toate cercetările în acest sens au condus la adoptarea unei tehnici generale de combinare a componentelor chimice cu circuitele integrate într-un singur sistem. Unii cercetători au miniaturizat biosenzorii electronici, alții au dezvoltat un întreg sistem bazat pe sensibilitate optică – în 1969, G.Vurek și R.Bowman au prezentat unul dintre primii senzori pe fibre optice folosit la analize clinice. 

Biosenzorii au început să fie folosiți cu succes și în alte domenii decât cele medicale.
Astfel, Isao Kurube și Shuichi Suzuki au măsurat necesarul biochimic de oxigen, ce reprezintă un indiciu al prezenței materiilor organice în apa uzată. Biosenzorul, bazat pe drojdie, face o citire a rezultatelor în 30 minute față de 5 zile în care se obțin rezultatele prin metode convenționale. Biosenzorii sunt folosiți și pentru a determina calitatea hranei și prospețimea ei (pentru pește, carne, etc.). Cu mare succes sunt folosiți în industrie, pentru a determina compoziția chimică a materialelor de-a lungul proceselor. Aceste măsurători sunt importante în special în biotehnologie, unde în mod curent nu se pot monitoriza culturile de microorganisme, procesele de fermentație ce produc proteine active și alte produse ca interferon sau insulină.

2. CLASIFICAREA BIOSENZORILOR [2]

În principal, biosenzorii se clasifică din punct de vedere al configurație electronice. Un număr mare de cercetări au fost realizate de către grupuri științifice din întreaga lume și implică existența a cinci clase de biosenzori:

Biosenzori amperometrici – se bazează pe reacția dintre componenta enzimatică (enzima) de pe electrodul senzorului și componenta chimica din mediul înconjurător. Reacția produce un curent electric ce variază cu concentrația componentei chimice. ( ex: senzorul glucozei)

Biosenzori potențiometrici – asemănători cu biosenzorii amperometrici, se bazează pe o reacție chimică sau fizică care determină o schimbare detectabilă de potențial. Astfel de senzori sunt utilizați pentru monitorizare nivelelor de dioxid de carbon, amoniac și alte gaze dizolvate în sânge sau alte lichide biologice.

Biosenzori optici – pot detecta modificările de culoare sau de transmitere a luminii printr-un mediu în urma unor reacții.

Biosenzori calorimetrici – detectează schimbările în cantitatea de căldură eliberată atunci când enzima reacționează cu alte materiale biologice. De exemplu, o scădere a cantității de căldură produsă în urma unei reacții enzimatice poate semnala prezența unui material toxic care a blocat enzima și a încetinit reacția. Termosenzorii sunt folosiți în testele clinice pentru determinarea colesterolului cât și a altor substanțe, pentru detectarea materialelor periculoase (toxice), pentru monitorizarea industrială a proceselor de fermentație. Aceste procese sunt primordiale pentru obținerea a numeroase produse, pornind de la uleiul de soia sau iaurt și până la antibiotice, vitamine și enzime industriale.

Biosenzori piezoelectrici.

3. CARACTERISTICILE BIOSENZORILOR [1]

Un biosenzor trebuie să posede o serie de caracteristici:

Biocatalizatorul trebuie sa aibă o specificitate mare, sa fie stabil în condițiile de păstrare și față de o serie de analize. Excepție fac kit-urile enzimatice colorimetrice care prezintă a mare stabilitate și permit un mare număr de analize (peste 100).

Reacția nu trebuie să fie influențată de parametrii fizici (de exemplu: temperatura și pH-ul). Astfel, analiza probelor se va realiza fără un pre-tratament. Dacă reacția implică cofactori sau coenzime, este necesară imobilizarea acestora alături de enzimă.

Răspunsul trebuie să fie clar, precis, reproductibil și liniar, fără a recurge la diluții sau concentrări. De asemenea, nu trebuie să fie influențat de zgomotul electric de fond.

Dacă biosenzorul este folosit pentru monitorizarea unor situații clinice invazive, proba analizată trebuie să fie în cantitate redusă, biocompatibilă și să nu aibă efecte toxice sau antigenice. Dacă se folosește în procese biotehnologice fermentative, biosenzorul trebuie să fie sterilizabil. Sterilizarea se realizează de preferință prin autoclavare, cu excepția biosenzorilor enzimatici care nu rezistă la tratamentul cu temperaturi crescute și în condiții de umiditate. În ambele cazuri, biosenzorul nu trebuie să sufere procese de colmatare sau proteoliză.

Biosenzorul trebuie să aibă dimensiuni reduse, să fi portabil, să aibă un cost redus de producție și să poată fi utilizat de personal cu calificare inferioară.

4. STRUCTURA BIOSENZORILOR [2]

Biosenzorii sunt formați din două componente:

4.1 Componenta biologică (bioreceptorul)

4.2 Componenta fizică (traductorul sau detectorul)

Tabelul nr.1 Componente care se folosesc la construirea unui biosenzor

Fig.1 Structura biosenzorului (a) bioreceptor, (b) transformator, (c) amplificator, (d) procesor, (e) afișaj

4.1 Componenta biologică – bioreceptorul

În diferitele aplicații ale biosenzorilor, cele mai utilizate molecule bioreceptoare au fost enzimele. În prezent, o serie de alte molecule, cum sunt anticorpii,t un mare număr de analize (peste 100).

Reacția nu trebuie să fie influențată de parametrii fizici (de exemplu: temperatura și pH-ul). Astfel, analiza probelor se va realiza fără un pre-tratament. Dacă reacția implică cofactori sau coenzime, este necesară imobilizarea acestora alături de enzimă.

Răspunsul trebuie să fie clar, precis, reproductibil și liniar, fără a recurge la diluții sau concentrări. De asemenea, nu trebuie să fie influențat de zgomotul electric de fond.

Dacă biosenzorul este folosit pentru monitorizarea unor situații clinice invazive, proba analizată trebuie să fie în cantitate redusă, biocompatibilă și să nu aibă efecte toxice sau antigenice. Dacă se folosește în procese biotehnologice fermentative, biosenzorul trebuie să fie sterilizabil. Sterilizarea se realizează de preferință prin autoclavare, cu excepția biosenzorilor enzimatici care nu rezistă la tratamentul cu temperaturi crescute și în condiții de umiditate. În ambele cazuri, biosenzorul nu trebuie să sufere procese de colmatare sau proteoliză.

Biosenzorul trebuie să aibă dimensiuni reduse, să fi portabil, să aibă un cost redus de producție și să poată fi utilizat de personal cu calificare inferioară.

4. STRUCTURA BIOSENZORILOR [2]

Biosenzorii sunt formați din două componente:

4.1 Componenta biologică (bioreceptorul)

4.2 Componenta fizică (traductorul sau detectorul)

Tabelul nr.1 Componente care se folosesc la construirea unui biosenzor

Fig.1 Structura biosenzorului (a) bioreceptor, (b) transformator, (c) amplificator, (d) procesor, (e) afișaj

4.1 Componenta biologică – bioreceptorul

În diferitele aplicații ale biosenzorilor, cele mai utilizate molecule bioreceptoare au fost enzimele. În prezent, o serie de alte molecule, cum sunt anticorpii, proteinele (acizii nucleici), biomembranele, celulele și organitele celulare, țesuturile și chiar unele organe au fost încorporate în structura biosenzorilor. În principiu, orice biomoleculă sau sistem molecular care are capacitatea de a recunoaște substratul țintă (analitul) poate fi utilizat ca bioreceptor.

Bioreceptorul este responsabil de selectivitatea senzorului.

Bioreceptorul necesită medii corespunzătoare pentru a-și păstra integritatea structurală, precum și capacitatea de biorecunoaștere.

4.1.1. MICROORGANISME

4.1.1.1 Biosenzorul pentru asimilarea zaharurilor

Este alcătuit din celule vii de Brevibacterium lactofermentum imobilizate pe o bandă de nylon cu ochiuri (1 cm × 1 cm, 20 ochiuri), care e atașată la un electrod de oxigen. Cantitatea totală de zahăr asimilat corespunde cantității de oxigen consumată de

microorganimele imobilizate. Dacă sistemului i se adaugă o cantitate de glucoză se observă o creștere a consumului de oxigen de către micro-organisme. Scăderea concentrației de oxigen dizolvat în soluție determină reducerea marcantă a curentului în timp, până când se atinge o valoare constantă. Există o dependență liniară între reducerea curentului și concentrația glucozei (1mM), fructozei (1mM) și sucrozei (0.8 mM). Cantitatea totală de zahar asimilat a fost calculată prin însumarea valorilor obținute în urma celor trei experimente (glucoza, fructoza și sucroza), diferența dintre concentrația observată și cea calculată fiind de maximum 8 %. O aplicație a acestui tip de biosenzor o reprezintă fermentarea pentru producerea acidului glutamic.

4.1.1.2 Biosenzorul pentru determinarea concentrației de glucoză

Este alcătuit din celule întregi de Pseudomonas fluorescens, imobilizate și un electrod de oxigen. Biosenzorul este introdus într-o soluție etalon care e saturată în molecule de oxigen și se realizează măsurători în aceeași manieră ca la biosenzorul pentru asimilarea zahărului. Valoarea constantă a curentului se atinge în 10 minute la 30 de grade. Timpul exact depinde de concentrația glucozei adăugate. Apoi biosenzorul este scos din soluția etalon și introdus într-o soluție de glucoză. Se înregistrează o creștere treptată a curentului și se revine la nivelul inițial după 15 minute la 30 de grade.

Biosenzorul este foarte puțin sensibil pentru fructoză, galactoză, manoză și zaharoză, iar în cazul aminoacizilor nu s-a obținut nici un răspuns. De aceea, selectivitatea biosenzorului pentru glucoză este mare. Acest tip de biosenzor este aplicat pentru determinarea glucozei din melasă.

4.1.1.3 Biosenzorul pentru determinarea concentrației acidului acetic

Este alcătuit dintr-o drojdie imobilizată, Trichosporon brassicae, o membrană gaz-permeabilă din Teflon și un electrod de oxigen. Membrana poroasă care încorporează micro-organismul este atașată la suprafața membranei de Teflon a electrodului de oxigen și este acoperită de o a doua membrană gaz-permeabilă din Teflon. Astfel, micro-organismele sunt blocate între cele două membrane poroase.

Mecanismul acestui sistem este asemănător cu cel descris în cazul biosenzorului pentru determinarea glucozei. Proba a fost ținută la un pH mult mai scăzut decât valoarea

pH-ului acidului acetic (4,75 la 30˚C) deoarece ionii acetat nu pot străbate membrana. Se determină astfel răspunsul obținut în cazul unor soluții de acid acetic de diferite concentrații (18, 36, 54 si 72 mg l-1). Curbele de calibrare obținute arată dependența liniară între scăderea de curent și concentrația acidului acetic până la 72 mg l-1.

Acest biosenzor nu e selectiv față de compușii volatili (de exemplu: acidul formic, metanolul), și nici față de nutrienții nevolatili (de exemplu: glucoza, ionii fosfat). Chiar dacă Trichosporon brassicae utilizează acidul propionic, acidul n-butiric și etanolul, aceștia nu sunt prezenți în general în mediile fermentative, sau sunt prezenți dar în concentrații foarte mici neafectând astfel determinarea acidului acetic. Un astfel de biosenzor pentru măsurarea acidului acetic este comercializat acum în Japonia.

4.1.1.4 Biosenzori pentru determinarea concentrației de alcool

Este binecunoscut faptul că numeroase microorganisme utilizează alcoolul ca sursă de carbon. De aceea, pentru determinarea cantității de alcool este posibilă realizarea unui biosenzor, la nivelul căruia sunt imobilizate microorganisme ce utilizează alcool.

În cazul biosenzorului pentru determinarea concentrației de etanol construcția electrodului și imobilizarea microorganismelor se face în același mod ca la biosenzorul pentru determinarea concentrației de glucoză. S-a demonstrat că există o dependență liniară între reducerea curentului și concentrația etanolului, până la o concentrație maximă de 22,5mg l-1 și o concentrație minimă de 2 mg l-1. Biosenzorul nu e selectiv față de compușii volatili(de exemplu: metanolul, acidul formic, acidul acetic, acidul propionic) cât și față de cei nevolatili (de exemplu: carbohidrații, aminoacizii și alți ioni) (vezi tabelul nr.2). Dacă biosenzorul este acoperit cu o membrană gaz-permeabilă, doar compușii volatili pot penetra membrana. S-a demonstrat astfel, că selectivitatea biosenzorului pentru etanol este mare.

Tabelul nr.2

O bacterie încă neidentificată (AJ3993) a fost utilizată pentru determinarea concentrației de metanol cu ajutorul unui biosenzor cu o configurație asemănătoare cu cea a biosenzorului pentru determinarea concentrației de etanol. S-a demonstrat că există o dependență liniară între scăderea curentului și concentrația metanolului până la o valoare de 22,5mg l-1.

4.1.1.5 Biosenzorul pentru determinarea concentrației de acid formic

De obicei, acidul formic este atât un intermediar în metabolismul celular (găsindu-se în urină, sânge și sucul gastric), cât și un produs rezultat în urma a numeroase reacții chimice. Probele enzimatice, spectrofotometric sensibile, care includ format-dehidrogenza, malat-dehidrogenaza și tetrahidrofolicacid-sintetaza, nu sunt recomandate pentru monitorizarea on-line. O serie de bacterii anaerobe, cum sunt Escherichia coli, Citrobacter freundii și Rhodospirillum rubrum, produc hidrogen rezultat din acidul formic.

Au loc următoarele reacții:

Acid formic Ferodoxina redusă + CO2

hidrogenaza                                                               
Ferodoxina redusă Ferodoxina oxidată + H2

format dehidrogenaza                            
Acid formic Citocrom c redus + CO2

hidrogenaza                         

Citocrom c redus Citocrom c oxidat + H2

Astfel, determinarea acidului formic este posibilă folosind ca și microorganism C. freundii. Principiul acestui biosenzor este ilustrat în Fig.2.

Fig.2

Un astfel de biosenzor selectiv este alcătuit dintr-un microorganism imobilizat (C. freundii), două membrane gaz-permeabile de Teflon și un electrod tip „fuel-cell”. S-a obținut o relație liniară între curentul “steady state” și concentrația acidului formic până la valori maxime de 1000 mg l-1 și valori minime de 10 mg l-1. Acest biosenzor nu recunoaște compușii nevolatili (de exemplu: glucoza, acidul piruvic și ionii fosfat). Chiar dacă compuși volatili (de exemplu: acidul acetic, acidul propionic, acidul n- butiric, metanolul și etanolul), pot trece prin membrana poroasă de Teflon nu a fost generat un curent electric datorită faptului că C. freundii nu poate utiliza acești compuși pentru obținerea de hidrogen.

4.1.1.6 Biosenzorul pentru determinarea concentrației de cefalosporine

De obicei, antibioticele sunt determinate cantitativ prin metode turbidimetrice sau titrimetrice, dar aceste metode necesită operații complicate care nu sunt indicate pentru determinări rapide. Cefalosporinele libere sunt instabile și de aceea e dificilă utilizarea lor în prepararea de biosenzori enzimatici. S-a descoperit că, C. freundii produce cefalosporine. Pentru realizarea biosenzorului pentru determinarea concentrației de cefalosporine s-au folosit celule întregi de C. freundii imobilizate într-o membrană de colagen. Această membrană de colagen este apoi introdusă într-o membrană reactoare.

O serie de soluții probă, de diferite concentrații de cefalosporine, sunt introduse în reactor (o membrană cu un spațiu liber în centru), determinând creșterea în timp a potențialului la electrod până când se atinge o valoare maximă. S-a obținut o relație liniară între logaritmul concentrației de cefalosporine și variația maximă a potențialului. Folosind acest tip de biosenzor s-au identificat următoarele cefalosporine: acidul 7-fenil-acetilamidodezacetoxi-sporanic, cefaloridina, cefalotina și cefalosporina C. Stabilitatea acestuia a fost examinată folosind o soluție de fenilcetil-7ADCA de concentrație 125 μgml-1.

Procedeul a fost efectuat de mai multe ori pe zi, neobservându-se nici o schimbare în variația potențialului chiar și după o săptămână. Această metodă a fost utilizată la determinarea cefalosporinei C din culturi de Cephalosporium acremonium. Rezutatele au fost comparate cu cele obținute în cazul metodei bazate pe cromatografia de înaltă performanță (HPLC). Erorile relative ale metodei utilizând microorganisme imobilizate sunt de 8%. Metoda este folosită îndeosebi pentru analiza continuă a cefalosporinelor din culturi de fermentație.

4.1.1.7 Biosenzorul pentru determinarea concentrației de amoniac.

Determinarea amoniacului este o analiză clinică importantă. S-au realizat o serie de senzori potențiometrici pentru determinarea amoniacului, însă s-au observat interferențe cu diferiți ioni metalici și amine volatile. De aceea, a fost necesară realizarea unor senzori amperometrici pentru determinarea amoniacului. Bacteriile azotate utilizează amoniacul ca sursă energetică, consumarea oxigenului realizându-se în modul următor:

Nitromonas sp.                                                               
NH3 + 3/2 O2 NO2 + H2O + H+

Nitrobacter sp.                                                               
NO2 + 1/2 O2 NO3-

Astfel, oxigenul asimilat de bacterie poate fi direct determinat, imobilizând bacteria pe un electrod de oxigen.

Un biosenzor pentru determinarea concentrației de amoniac este alcătuit dintr-o bacterie imobilizată, o membrană gaz-permeabilă de Teflon și un electrod de oxigen. S-a observat o dependență liniară între scăderea de curent și concentrația amoniacului până la o concentrație maximă de 42 μg ml-1 și o concentrație minimă de 0,1 μg ml-1. Sensibilitatea biosenzorului este aproximativ egală cu cea a unui electrod de sticlă. Biosenzorul nu a răspuns la compuși volatili (de exemplu: acidul acetic, etanol, amine) sau nutrienți nevolatili (de exemplu: glucoza, aminoacizii și ionii metalici). Curentul generat de biosenzor rămâne stabil pentru mai mult de 10 zile și un număr de 200 de teste.

Determinarea amoniacului în probe de urină a fost realizată folosind atât biosenzori microbieni cât și o metodă convențională. Rezultatele obținute au fost asemănătoare utilizând ambele metode, metoda cu biosenzori microbieni având o valabilitate mai mare, pe termen lung.

Tabelul nr.3 Exemple de microorganisme imobilizate la nivelul diferiților biosenzori

4.1.2. ȚESUTURI VEGETALE SAU ANIMALE

Țesuturile vegetale și animale sunt utilizate cu succes ca și componente biocatalitice în construirea biosenzorilor. Această clasă de materiale biocatalitice menține enzimele de interes în mediul lor natural, ceea ce determină o stabilizare semnificativă a activității lor enzimatice. În numeroase cazuri, s-a observat că biosenzorii bazați pe țesuturi prezintă o durată de funcționare mult mai mare în comparație cu biosenzorii ce folosesc enzimele corespunzătoare, izolate. În plus, s-a demonstrat că țesuturile prezintă o activitate specifică crescută, suficientă pentru folosirea lor în construirea unor anumiți biosenzori, atunci când enzimele izolate nu au reușit acest lucru.

Tabelul nr.4 prezintă o serie de biosenzori ce folosesc țesuturi și alte sisteme asemănătoare.

Tabelul nr.4

4.1.2.1 Biosenzorul pentru glutamină

O porțiune subțire, cuprinzând celulele corticale din rinichiul de porc, a fost imobilizată la suprafața unei probe sensibilă la amoniac. În aceste celule se găsește o concentrație mare de glutaminază, enzimă ce catalizează următoarea reacție:

glutaminaza                                                               
Glutamina + H2O Glutamat + NH3

La interacțiunea glutaminei din probă cu stratul biocatalitic imobilizat, sub acțiunea glutaminazei , este produsă o cantitate de amoniac. Se va obține o concentrație constantă de amoniac atunci când există un echilibru între cantitatea de amoniac produsă și cantitatea de amoniac epuizată de pe suprafața probei. Simpla difuzie a amoniacului înapoi în soluția probei e responsabilă de epuizarea amoniacului. Deoarece proba de amoniac este un sistem potențiometric, răspunsul senzorului e dependent de logaritmul concentrației de glutamină.

Biosenzorului realizat din rinichi de porc are o selectivitate mare fața de glutamină. O serie de alți compuși (ureea, L-alanina, L-arginina, L-histidina, L-valina, L-serina, L-glutamatul, L-aspargina, L-aspartatul, D-alanina, D-aspartatul, glicina si creatinina) pot să interfereze cu glutamina, însa nu s-a înregistrat un răspuns semnificativ.

S-a urmărit răspunsul senzorului fața de unii D-aminoacizi si glicină, deoarece aceste substanțe se găsesc într-o cantitate destul de mare în celulele rinichiului de porc (Dixon si Kleppe 1965). Glutaminaza catalizează dezaminarea oxidativă a unor D-aminoacizi în prezența apei și a oxigenului. Nu s-a detectat însă nici un răspuns fața de D-aminoacizi în condițiile de funcționare ale biosenzorului pentru glutamină. Acest lucru se poate datora absenței FAD-ului din cadrul sistemului tampon (Guilbault si Hrabankova 1971).

Pentru ca biosenzorul să posede o mare selectivitate, este necesară adăugarea unui agent antimicrobial care să împiedice contaminarea cu bacterii a porțiunii de țesut. Neadăugarea unui agent antimicrobian corespunzător va duce la contaminarea bacteriană a țesutului cu apariția la suprafața probei a unor activități biocatalitice ce alterează drastic selectivitatea senzorului. În cazul senzorului pentru glutamina se adaugă ca și conservant 0.02% nitrit de sodiu.

4.2. Componenta fizica – traductorul

Traductorul, care joaca rolul de detector, recunoaște analitul ,traduce schimbarea chimica sau fizica pe care o transforma intr-un semnal electric măsurabil. Detectorul nu este selectiv.

Tipuri de traductori convenționali:

amperometrici

potențiometrici

optici

Alte tipuri de traductori :

calorimetrici

conductometrici

piezoelectrici

De obicei, reacțiile de biorecunoaștere produc specii chimice care pot fi măsurate prin metode electrochimice.

5. BIOSENZORI AMPEROMETRICI [2]

Biosenzorii amperometrici funcționează prin producerea unui curent electric atunci când între doi electrozi a fost aplicat un potențial. În general, timpul de răspuns este scurt si sensibilitatea este similară cu cea a biosenzorilor potențiometrici. Cel mai simplu exemplu de biosenzor amperometric este biosenzorul lui Clark cu electrod pentru oxigen. (Fig.3)

Fig.3 Schema unui biosenzor amperometric simplu

Biosenzorul amperometric simplu este alcătuit din doi electrozi pereche : un electrod (catod) de platină la care specia țintă, reactantul O2 sau produsul de reacție H2O2, este redusă și un electrod de referință (anod), Ag/AgCl sau calomel. Când se aplică un potențial de –0.6 V între cei doi electrozi, se generează un curent electric proporțional cu concentrația oxigenului. În mod normal, ambii electrozi sunt introduși într-o soluție saturată de clorura de potasiu (KCl). Acest compartiment cu electrozi este separat de un biocatalizator (aici reprezentat de glucozoxidaza GOD), printr-o membrană subțire, permeabilă numai pentru oxigen. Soluția analitului este separată de biocatalizator printr-o alta membrana permeabila atât pentru reactant (i) cât și pentru produșii de reacție (teflon, politetrafluoroetilena). Diametrul biosenzorului este de aproximativ 1mm dar se poate micșora la 0.25 mm folosind un catod din Pt si un anod format dintr-un ac de oțel acoperit cu argint cu o membrană încorporată.

Au loc următoarele reacții :

Ag anod     4Ag0 + 4Cl- 4AgCl + 4e-   

Pt catode     O2 + 4H+ + 4e- 2H2O   

Reducerea cantității de oxigen de la suprafața catodului determină ca concentrația oxigenului de la acest nivel sa fie aproape zero. De aceea proporția acestei reduceri electrochimice depinde de proporția difuziunii oxigenului din volumul soluției, care este dependentă atât de gradientul de concentrație cât și de concentrația totală a oxigenului în soluție. Se observă, că o cantitate mică, dar importantă, din oxigenul existent în soluție se consumă în acest proces; electrodul de oxigen măsoară rata procesului care este departe de a fi în echilibru, în timp ce electrozii ion-selectivi sunt folosiți în condiții de echilibru. Astfel electrodul de oxigen este mult mai sensibil la schimbările de temperatură în comparație cu senzorii potențiometrici.

O aplicație a acestui tip simplu de biosenzor este determinarea concentrației de glucoză folosind o membrană cu glucozoxidaza imobilizată. Reacția duce la reducerea concentrației de oxigen pe măsura ce acesta difuzează spre catod printr-o membrană biocatalitică, lucru demonstrat prin înregistrarea scăderii curentului electric dintre electrozi. (Fig. 4)

β-D-glucoza + O2 D-glucono-1,5-lactona + H2O2

Fig.4 Răspunsul unui electrod amperometric utilizând glucozoxidaza.

Alte oxidaze pot fi folosite în aceeași manieră pentru a analiza substratele lor (de exemplu: alcooloxidaza, D- si L- aminoacid-oxidaza, colesterol-oxidaza, galactozo-oxidaza si uratoxidaza).

O metodă alternativă pentru determinarea ratei de reacție este măsurarea concentrației de peroxid de hidrogen (H2O2) prin aplicarea directă a unui potențial de +0.68 V la nivelul electrodului de platină corelat cu electrodul de Ag/AgCl, producând următoarele reacții :

Pt anod     H2O2 O2 + 2H+ + 2e-   

Ag catod     2AgCl + 2e- 2Ag0 + 2Cl-

O mare problemă a acestui tip de biosenzori este dependența lor de concentrația oxigenului dizolvat. Acest lucru poate fi evitat prin utilizarea unor ‘mediatori’ care transferă electronii direct la electrod împiedicând astfel reducerea co-substratului de oxigen.

Pentru ca acești mediatori să poată fi utilizați, ei trebuie să posede o serie de proprietăți:

Trebuie să reacționeze rapid cu forma redusă a enzimei.

Trebuie să fie suficient de solubili (atât sub formă redusă cât si sub formă oxidată) pentru a putea difuza rapid între suprafața activă a enzimei și suprafața electrodului. Această solubilitate nu trebuie să fie nici foarte mare pentru a nu se produce pierderi de mediator din micromediul biosenzorului în soluția analitului.

Mediatorul nu trebuie sa fie toxic.

Potențialul de regenerare al mediatorului, oxidat la electrod, trebuie să fie scăzut și independent de pH.

Forma redusă a mediatorului nu trebuie să reacționeze imediat cu oxigenul.

Ferocianii reprezintă o familie de mediatori des folosiți. Reacția lor poate fi reprezentată după cum urmează:

S-au descoperit însa electrozi care pot transfera direct electronii de la nivelul enzimei reduse fără a mai fi nevoie de astfel de mediatori. Ei prezintă un înveliș conducător electric alcătuit dintr-o sare organică, cum este N-metilfenazina (NMP+) la cation și radicalul tetracianochinodimetan (TCNQ.-) la anion.( Fig.5)

Fig. 5 (a)Ferocianat, compusul părinte pentru numeroși mediatori

(b)TMP+, partea cationică a cristalelor conducătoare organice.

(c)TCNQ.-, partea anionică a cristalelor conducătoare organice.

Multe flavoenzime sunt absorbite de astfel de conducători organici datorită legăturilor dintre săruri, prin sarcinile pozitive și negative, în mediul hidrofobic. Astfel de electrozi enzimă pot fi realizați prin simpla introducere a electrodului într-o soluție enzimatică și pot rămâne stabili câteva luni. Acești electrozi pot fi implicați în reacții ce depind de dehidrogenaze NAD(P)+-dependente pentru că permit oxidarea formelor reduse ale acestor coenzime. (Fig. 6)

Fig.6 Cele trei generații de biosenzori amperometrici utilizați în cazul flavonoxidazei.

Prima generație de electrozi care utilizează H2O2 produs de reacție.(E0 = +0.68 V)

A doua generație de electrozi care utilizează un mediator (ferocian) pentru transferul electronilor, produși de reacție, la electrod. (E0 = +0.19 V)

A treia generație de electrozi care utilizează direct electronii produși de reacție. (E0 = +0.10 V)

Toate potențialele la electrozi sunt legate de electrodul Cl-/AgCl,Ag0 .

Reacțiile care au loc la nivelul enzimei sunt următoarele :

Substrat(2H) + FAD-oxidaza Produs + FADH2-oxidaza   

Această reacție este urmată de următorul proces :

(a)
biocatalizator

FADH2-oxidaza + O2 FAD-oxidaza + H2O2   

electrod

H2O2 O2 + 2H+ + 2e-   

(b)
biocatalizator

FADH2-oxidaza + 2 Ferocianat+ FAD-oxidaza + 2 Ferocian + 2H+   

electrod 

2 Ferocianat 2 Ferocian+ + 2e-   

(c)
biocatalizator/ electrod

FADH2-oxidaza FAD-oxidaza + 2H+ + 2e-   

Curentul (i) produs de acești biosenzori amperometrici este direct proporțional cu viteza de reacție (vA), prin această reacție :

 i = nFAvA           

unde:

n – numărul de electroni transferați,

A- suprafața electrodului,

F – numărul lui Faraday.

vA – viteza de reacție.

Curentul produs este proporțional cu concentrația analitului și independent atât de cinetica enzimei cât și de cinetica electrochimică.

6. BIOSENZORI POTENȚIOMETRICI [2]

Măsurarea pH-ului este una dintre cele mai utilizate metode în laboratorul chimic.

Un electrod de sticlă sau un alt electrod de membrană sunt utilizați pentru măsurarea potențialului de membrană pe baza diferenței dintre concentrațiile ionilor de [H+] sau a altor ioni pozitivi (Ag+, K+, NH4+, Na+ , Li+, Ca2+, Mg2+, Cd2+, Cu2+) sau negativi (I-, Br-, Cl-, CN-, SCN-, F-, NO3-, ClO4-, BF-) din cadrul membranei.

Avantajele acestui sistem de măsurare sunt viteza crescută, selectivitatea mare și costurile moderate și în plus materialul utilizat nu se distruge și nu se consumă pe parcursul procesului.

Fig.7 Biosenzorul potențiometric simplu.

Membrana semipermeabilă (a) înconjoară biocatalizatorul (b) fixat lângă membrana activă de sticla (c) a unei probe de pH (d). Potențialul electric (e) este generat între electrodul Ag/AgCl (f) intern introdus într-o soluție de HCldil. (g) și un electrod de referință extern (h).

Tipuri de electrozi ce pot fi utilizați:

Electrod ion – selectiv

Electrod enzimă

Electrodul ion-selectiv poate fi definit ca fiind un sistem care produce un potențial electric direct proporțional cu logaritmul activității unui ion aflat în soluție. Termenul „specific” este utilizat uneori pentru a indica faptul că electrodul răspunde unui anumit ion specific din soluție. Datorită faptului că un electrod nu poate fi cu adevărat specific unui singur ion, este mai adecvată folosirea termenului de „ion-selectiv”.

Atunci când se folosește un electrod ion-selectiv pentru măsurarea potențiometrică a activității unui anumit ion din soluție, trebuie să se țină seama de faptul că sistemul este influențat de activitatea ionului. De aceea, speciile care pot complexa ionul sau care îi pot scădea activitatea trebuie să fie îndepărtate sau mascate.

Există trei tipuri de electrozi ion-selectivi utilizați ca biosenzori:

6.1.1 Electrozi de sticlă pentru cationi (de exemplu electrozii normali de pH) la care elementul sensibil este o membrană de sticlă hidratată și foarte subțire care generează o diferență de potențial electric pe cele două fețe ale membranei, datorită competiției, dependentă de concentrație, dintre cationi pentru locurile de legare. Selectivitatea membranei este determinată de compoziția sticlei.

Selectivitatea pentru ionii H+ este mai mare decât cea pentru ionii NH4+.

(a) H+ cation,

glucozooxidase                                         H2O                        
D-glucoza + O2 D-glucono-1,5-lactona + H2O2 D-gluconat + H+

penicilinaza                            
penicilina Acid penicilinoic + H+

ureaza (pH 6.0) a
H2NCONH2 + H2O + 2H 2NH4+ + CO2

ureaza (pH 9.5) b
H2NCONH2 + 2H2O 2NH3 + HCO3- + H+

lipaza                        
Lipide neutre + H2O glicerol + Acizi grași + H+

a Poate fi folosită și pentru biosenzorii potențiometrici deNH4+ si CO2 (gaz)

b Poate fi folosită și pentru biosenzorii potențiometrici de NH3 (gaz)

(b) NH4+ cation,

L-amino acidoxidaza
L-amino acid + O2 + H2O keto acid + NH4+ + H2O2   

  asparaginaza   
L-asparagina + H2O L-aspartat + NH4+  

  ureaza (pH 7.5)
H2NCONH2 + 2H2O + H+ 2NH4++ HCO3-   

6.1.2 Electrozii de sticlă pentru pH sunt acoperiți de o membrană selectivă gaz-permeabilă pentru CO2, NH3 sau H2S. Difuziunea gazului prin aceasta membrană determină schimbarea de pH a unei soluții, între membrană și electrod, modificare care mai apoi este cuantificată.

6.1.3 Electrozii membrană solidă, la care membrana de sticlă este înlocuită de o membrană subțire, specifică pentru un anumit ion conductor. Aceasta este realizată dintr-un amestec de sulfură de argint  și o halogenură de argint. Electrodul de iod este folosit pentru determinarea ionilor iodură atât în reacția peroxidului de hidrogen cât și în cazul ionului cianură.

(c) I- anion,

peroxidaza
H2O2 + 2H+ + 2I- I2 + 2H2O    

(d) CN-anion,

β-glucozidaza                                                 
amigdalina + 2H2O 2glucoza + benzaldehida + H+ + CN-   

O parte dintre electrozii ion-selectivi utilizați în realizarea electrozilor enzimă sunt prezentați in tabelul nr. 5

Tabelul nr.5 Electrozi ion-selectivi

Răspusul unui electrod ion-selectiv este dat de relația:

Unde :

E – potențialul (V)

E0 – constantă caracteristică electrodului ion-selectiv extern

R -constanta gazelor

T – temperatura absolută (k)

z – număr de electroni

F – nr. lui Faraday

[i] – concentrația unor specii ionice libere

Se observă că există o proporționalitate directă între potențialul și concentrația unor specii ionice libere. Datorită acestei dependențe, biosenzorii cu electrozi ion-selectivi acoperă o largă arie analitică și prezintă o slabă acuratețe și precizie. De obicei, acești biosenzori detectează concentrații de 10-4 – 10-2 M. Timpul de răspuns este de 1-5 minute permițând realizarea de 30 de analize într-o oră.

În cazul biosenzorilor care produc sau consumă ioni de H+ pentru a determina o schimbare semnificativă de potențial trebuie folosite soluții tampon. Relația între modificarea pH-ului și concentrația substratului este complexă și poate determina unele efecte neliniare cum sunt variația pH-ului și efectul de tamponare datorat proteinelor. Cu toate acestea, astfel de cazuri se înregistrează atunci când există o relație liniară între schimbarea vizibilă de pH și concentrația substratului. 

Cercetări recente privind electrozii ion-selectivi se referă la producerea de tranzistori ion-selectiv cu efect de câmp (ISFET) iar biosenzorii corespunzători sunt folosiți ca enzime imobilizate pe tranzistori cu efect de câmp. Suprafețele ion-selective ale acestor dispozitive electrice sunt acoperite cu membrane enzimatice iar biosenzorul răspunde la schimbarea de potențial electric printr-un curent de ieșire. Astfel, acestea devin dispozitive potențiometrice, deși produc schimbări directe ale curentului electric. Principalul avantaj al acestor dispozitive este dimensiunea foarte redusă, sub 0,1 mm2 care permite fabricarea în serie, la preț scăzut, folosind tehnologia circuitelor integrate.

Ca un exemplu prezentăm FET uree selectiv (ENFET conținând urează imobilizată și un electrod de referință conținând glicină) cu o variație de răspuns de numai 15% (0,05 – 10 mg ml-1 ) pe perioada de utilizare de o lună. O serie de analiți pot fi determinați cu biosenzori miniaturali ce conțin serii de ISFET și ENFET. Sensibilitatea tranzistorului cu efect de câmp, poate fi totuși afectată de compoziția, forța ionică și concentrația soluțiilor analizate.

Fig.8 Diagrama unei secțiuni din ENFET

Dimensiunea reală a suprafeței active este de aproximativ 500 μm lungime, de 50 μm lățime si 300 μm grosime. Principala parte a biosenzorului este un cip de tip p cu două arii de tip n, sursa negativă si drena pozitivă. Cipul este izolat de un strat subțire (0.1 μm) de silicagel (SiO2) care formează grila FET-ului. Deasupra acestei grile se găsește un strat subțire dintr-un material H+-sensibil. Cipul este izolat de un strat subțire de siliciu (grosimea 0,1 μm) care formează suprafața tranzistorului cu efect de câmp. Deasupra acestei suprafețe este un strat subțire de material H+ sensibil (oxid de tantal), o membrană ion-selectivă protectoare, biocatalizatorul și soluția de analit, care este separată de partea sensibilă a FET de către un înveliș inert fotopolimeric poliimidic. Atunci când un potențial este aplicat la electrozi, un curent trece prin FET, curent ce depinde de potențialul pozitiv detectat la poarta ionului selectiv și de atracția consecutivă a electronilor în stratul de depleție. Curentul (I) este comparat cu cel înregistrat de un electrod ISFET similar, dar necatalitic cufundat în aceeași soluție.

Electrodul enzimă

În cazul electrodului enzimă, enzima este de obicei imobilizată ceea ce determină reducerea materialul folosit pentru realizarea unor analize de rutină. Stabilitatea enzimei poate fi crescută prin incorporarea ei într-un gel matriță adecvat.

Există două metode pentru a imobiliza enzima:

modificarea chimică a moleculelor prin introducerea unor grupări insolubile

incorporarea enzimei într-o matriță inertă, cum este de exemplu gelul de poliacrilamidă. Tehnica imobilizării chimice este cea mai folosită pentru a realiza electrozi probă.

În cadrul procesului electrodul enzimă parcurge cinci etape:

substratul este transportat la suprafața electrodului,

substratul difuzează prin membrană în partea activă,

reacția are loc pe partea activă,

produsul format în urma reacției cu enzima este transportat prin membrană la suprafața electrodului,

produsul este măsurat la nivelul suprafeței electrodului.

Tabel nr.6 Exemple de electrozi enzimă

Exemple de electrozi enzimă bazați pe electrozi ion-selectivi:

6.2.1 Electrodul pentru glucoză – util pentru diagnosticarea și monitorizarea diabetului

Nagy si colaboratorii (1973) realizează electrodul pentru glucoză bazat pe un senzor iodic de membrană.

Glucozooxidaza

Glucoza + O2 Acid gluconic + H2O2 (1)

Peroxidaza

H2O2+ 2I- + 2H+ 2H2O+ I2 (2)

6.2.2 Electrodul pentru aminoacizi

Guilbault si Nagy (1973) realizează un tip de senzori pentru L- fenilalanină în sânge: un strat reactiv de L-aminoacidoxidază/ peroxidază, plasat pe un electrod iodură selectiv. Această probă este sensibilă la scăderea de activitate a iodurii la electrodul de suprafată, conform reacțiilor:

Oxidaza

L-fenilalanina H2O2 (1)

Peroxidaza

H2O2+ 2H+ + 2I- I2 + 2 H2O (2)

6.2.3 Electrodul pentru penicilină – utilizat pentru monitorizarea conținutului de penicilină

Electrodul se bazează pe folosirea unui electrod de pH pe care s-a imobilizat o penicilinază. Timpul de răspuns este foarte scurt < 30 secunde.

Penicilinaza

Penicilina Acid penicilinoic

7. BIOSENZORI OPTICI [2]

Există două arii de dezvoltare a biosenzorilor optici, respectiv determinarea schimbărilor între reactanți și produșii de reacție după absorbția luminii sau măsurarea luminii generată de un proces luminescent. Ultima, implică utilizarea unor benzi test colorimetrice. Pentru ca această metodă să funcționeze este nevoie ca unul dintre reactanții sau produșii de reacție ai procesului de biorecunoaștere să fie conectați la o moleculă indicator colorimetrică, fotometrică sau luminescentă. O fibră optică este folosită pentru a transmite semnalul luminos de la sursă la detector.

Cea mai cunoscută aplicabilitate a acestei tehnologii este monitorizarea sângelui în cazul diabeticilor. În acest caz, benzile conțin glucozoxidaza, peroxidaza din hrean și un cromogen (de exemplu : o-toluidina sau 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina). Peroxidul de hidrogen, produs prin oxidarea aerobă a glucozei, oxidează cromogenul formând un compus mai intens colorat.

peroxidază
cromogen (2H) + H2O2 X + 2H2O        

Examinarea benzilor colorate se poate face folosind un aparat de măsurare a reflectanței portabil, precum și prin compararea directă cu o scară martor de culori. În prezent, există o mare varietate de benzi test enzimatice. Una dintre cele mai importante descoperiri din ultimul timp, sunt biosenzorii cu molecule luminescente, ca de exemplu, luciferaza din licurici (Photinus-luciferin 4-monooxigenaza ATP-hidrogenaza) pentru detectarea prezenței unor bacterii în alimente sau probe clinice.

luciferaza                                                        
ATP + D-luciferin + O2 oxiluciferina + AMP + pirofosfat + CO2 + lumina

(562 nm)   

Bacteriile se leagă specific iar moleculele de ATP eliberate (numărul lor fiind proporțional cu numărul bacteriilor existente) reacționează cu D-luciferinul, în prezența oxigenului, producând o lumină galbenă în vizibil.

Lumina produsă poate fi determinată fotometric, folosind un sistem cu fotodiode de voltaj scăzut. Sensibilitatea sistemului este mai mare (< 104 celule ml-1, < 10-12 M ATP) decât cea a detectorilor simpli cu fotoni care folosesc fotodiode. Luciferaza este o enzimă scumpă, care se poate obține doar din coada licuriciului. Folosirea luciferazei imobilizate reduce mult din costurile analizelor.

8. BIOSENZORI CALORIMETRICI [2]

Multe dintre reacțiile catalizate de către enzime sunt exoterme, producând căldură, aceasta putând fi folosită atât pentru măsurarea vitezei de reacție, cât și pentru determinarea concentrației analitului. Schimbările de temperatură se măsoară, de obicei, cu ajutorul unor termosenzori, ce se găsesc la intrarea și la ieșirea unor coloane mici, împachetate ce conțin enzime imobilizate într-un mediu cu temperatură constantă. În aceste condiții, bine controlate, mai mult de 80% din căldura produsă în reacție poate fi înregistrată chiar în fluxul soluției de analizat. Calculul se poate realiza cunoscând variația entalpiei și cantitatea reacționată. Dacă 1mM de reactant se transformă complet în produs de reacție, generându-se 100 kJ mol-1, atunci fiecare mililitru de soluție produce 0,1J de căldură. Atunci când randamentul este de 80% variația de temperatură va fi de 0,02°C. În general, pentru ca un biosenzor să poată fi utilizat, necesită sesizarea unor temperaturi cu o rezoluție de 0,0001°C.

Tabelul nr.7 Căldura produsă în reacții catalizate de enzime.

Termosenzorii funcționează prin schimbarea rezistenței lor electrice cu temperatura, conform relației:

ln(R1/R2)= B(1/T1-1/T2)

Atunci : R1/R2= e B(1/T1-1/T2)

Unde : R1, R2- rezistențele termosenzorilor

T1, T2- temperaturi absolute

B- constanta caracteristică termosenzorului

Dacă variația temperaturii este foarte mică atunci:

B(1/T1) – (1/T2)<<1.

Atunci când x<<1

ex1 + x

Unde, x = B(1/T1) – (1/T2)

Relația devine :

R1= R2 {1+ B (T1- T2 / T1T2)}          

Deoarece T1 T2

ΔR / R= (B / T12) ΔT

Scăderea relativă a rezistenței electrice (ΔR/R) a termosenzorului este direct proporțională cu creșterea temperaturii (ΔT). Valoare lui (B/T12) este constantă.

B/T12= -4%°C-1.

Variația de rezistență este transformată într-o variație proporțională de potențial folosind o punte Wheatstone care conține un fir rezistor de precizie, înaintea amplificării. În practică, s-a demonstrat că există o corelare directă între activitatea enzimei și răspunsul produsului. O mare problemă a acestor biosenzori o reprezintă dificultatea cu care se stabilește valoarea temperaturii caracteristice mediului și cea a termosenzorului de referinț ă. O variație de numai 1°C la nivelul ambilor termosenzori produce o modificare a rezistenței relative a termosenzorilor echivalentă cu 0,01°C. Menținerea unei temperaturi constante se realizează prin introducerea în cadrul structurii biosenzorului a unei piese de aluminiu bine izolată termic. (Fig.9)

Fig.9 Schema unui biosenzor calorimetric

S- proba analizată,

P- produșii de reacție

a- fluxul soluției de analizat

b- camera de termostatare exterioară

c- schimbător de căldură

d- cutie de aluminiu

e- termosenzor de referință

f- bioreactorul ce conține biocatalizatorul, la nivelul căruia are loc reacția

g- termosenzor

h- soluție de evacuare

l- sistem electronic extern care determină variația rezistenței, precum și a temperaturii

În cazul termosenzorilor sensibilitatea (10-4 M) și domeniul de linearitate (10-4 – 10-2 M) sunt mici. O sensibilitate mai mare se poate obține în reacțiile exoterme. (de exemplu: catalaza). Sensibilitatea mică a sistemului poate fi mărită substanțial prin creșterea căldurii produsă în reacție. Acest lucru se poate realiza prin cuplarea mai multor reacții, toate contribuind la căldura degajată. ADP-ul este unul dintre reactanți iar glucoza, fosfoenolpiruvatul, NADH și oxigenul sunt adăugate în exces pentru a asigura un maxim al reacției. Cele patru enzime (hexokinaza, piruvatkinaza, lactat dehidrogenaza si lactat oxidaza) sunt co-imobilizate pe suprafața bioreactorului.

Fig. 10 Schema reacțiilor catalizate de hexokinaza, piruvatkinaza și lactooxigenaza

9. APLICAȚIILE BIOSENZORILOR

Chiar dacă practica medicinii moderne, în examinarea unui pacient, se bazează încă foarte mult pe consultul medical tradițional , în ultimul secol se urmărește descoperirea unor tehnici biomedicale, atât pentru determinarea unor parametrii biochimici precum și pentru urmărirea răspunsului la tratament al bolnavului. Măsurătorile chimice și biochimice în medicină fac acum obiectul unei discipline noi, („patologie chimică” cunoscută mai nou sub numele de „biochimie clinică”). Această ramură nou formată a laboratorului, a evoluat rapid pe baza descoperirii unor metode analitice mult mai sofisticate și a unor echipamente automate.

Acest capitol urmărește să identifice câteva dintre posibilele domenii de aplicabilitate ale biosenzorilor cât și să explice avantajele introducerii în practica medicală a unor astfel de sisteme.

Principalele domenii de aplicabilitate ale biosenzorilor sunt:

Medicină – monitorizarea oxigenului din sânge, glucozei din sânge, presiunii sângelui, ratei bătăilor inimii, coagulării, gravidității, bolilor infecțioase, stresului, durerii, ECG, EMG, EEG, ENG, etc. Instrumentele medicale care folosesc biosenzori pot fi utilizate pentru urmărirea pacienților în timpul terapiei intensive, cât și de către aceștia pentru monitorizarea bolilor cronice. Există, de asemenea, sisteme portabile ce incorporează biosenzori miniaturali.

Controlul și monitorizarea unor factori care perturbă mediului înconjurător, cum ar fi poluanții industriali din aer și apă.

Interfața om-mașină, de exemplu: recunoașterea vocii sau a imaginii, verificări biometrice, securitatea unor sisteme, jucării interactive și educative, etc.

Analiza calității și controlul altor procese în domeniul biotehnic.

Alte aplicații: descoperirea unor produse noi în medicina chineză tradițională cât și în domeniul cosmetic.

9.1 Senzori pentru glucoză [3-10]

Atenția specialiștilor în senzori s-a concentrat asupra bolnavilor de diabet din mai multe motive. Diabetul reprezintă o boală ce se caracterizează prin lipsa parțială sau totală a unui mediator/efector (hormon) insulinic, o proteină produsă de cel mai nou biosenzor natural descoperit, celulele B ale insulei lui Langerhans din pancreas (Malaisse si colaboratorii 1979). Insulina are un timp scurt de viață în sânge (de la 4 la 5 minute), și de aceea concentrația sa, un factor determinant al acțiunii sale, depinde de rata de secreție. Celulele B sunt sensibile la acțiunea unui număr mare de substanțe, una dintre cele mai importante fiind glucoza din sânge. Concentrația glucozei în sânge este menținută la valori constante (3,5-5,5 mmol/l) ca urmare a numeroaselor acțiuni biochimice ale insulinei. În cazul unui diabet, există o deficiență de insulină ceea ce duce la creșterea nivelului de glucoză în sânge, cu consecințe negative pe termen scurt asupra sănătății iar pe termen lung o alterare iremediabilă a țesutului. Tratamentul evident este administrarea de insulină, dar fără o monitorizare atentă a nivelului de glucoză în sânge pacienții cu diabet pot prezenta perioade cu o scădere a nivelului de glucoză în sânge iar la o administrare excesivă de insulină, nivele foarte scăzute.

Cea mai studiata enzimă, pentru realizarea electrozilor-enzimă modificată în pastă de carbon este glucozoxidaza (GOD). Cei mai importanți senzori pentru glucoză sunt prezentați în Tabelul nr 8. GOD a fost prima enzimă care a fost amestecată cu o pastă de carbon formată din pudră de carbon și ulei de silicon. Electrodul GOD- pastă de carbon a fost utilizat într-un sistem injectabil. Determinările s-au bazat pe oxidarea electrochimică directă a peroxidului de hidrogen rezultat la aplicarea unui potențial de +0,9 V (Ag/AgCl) (pH 6,5). S-a obținut un răspuns liniar pentru o concentrație 0,5 – 30 mM de glucoză. Rezultate similare au fost raportate și în cazul experimentelor realizate de Amine și colaboratorii, precum și de Wang și colaboratorii, la aplicarea unor potențiale de 0,9 V până la 1,1 V. Alte încercări au urmărit incorporarea enzimei în rezine epoxi grafitate folosindu-se astfel acceptorul natural al enzimei. Fără nici un catalizator, potențialul necesar pentru oxidarea peroxidului de hidrogen a fost foarte mare, de +1,15 V (Ag/AgCl). Curba de calibrare s-a realizat cu concentrații de 10 M până la 30 mM. S-a înregistrat o scădere a potențialului până la +0,9 V prin adăugarea unui amestec format pudre de aur și paladiu.

O altă metodă pentru detectarea glucozei este co-imobilizarea GOD si HRP într-o pastă de carbon, ceea ce permite detectări sub 0 V, aceasta datorită utilizării unui mediator pentru HRP. Cu toate acestea, majoritatea electrozilor pastă de carbon GOD- modificați utilizează un mediator artificial (vezi Tabelul nr.8). O serie de mediatori artificiali au fost amestecați cu pasta de carbon ce conține enzima GOD fie imobilizată pe mediator, fie aflată direct în pastă.

Exemple de mediatori: ferocianii și monomerii sau polimerii derivați, benzochinone sau benzochinone ce conțin polimeri, tetratiofulvalenă (TTF), tetracianochinodimetan (TCNQ), săruri de TTF-TCNQ, albastru Meldola, verde metilen, și 1-(N,N-dimetilamino)-4-(4-morfolin)benzen. Cu ajutorul lor, potențialul care trebuie aplicat scade substanțial. Utilizarea acestor mediatori nu elimină însă riscul interferării cu alte reacții, datorită faptului că mediatorii catalizează electrooxidarea produșilor care interferă.

Chiar dacă momentan există peste 1200 de articole referitoare la biosenzorii amperometrici pentru GOD, încă nu sunt soluționate toate problemele legate de detectarea nivelelor de glucoză din sânge. De aceea, se caută în continuare noi modalități de a construi senzori pentru glucoză folosind alte enzime. Două dintre cele mai importante enzime sunt dehidrogenaza NAD+-glucozo-dependentă (GDH) și dehidrogenaza PQQ –glucozo-dependentă (GDH-PQQ). În 1991, GDH a fost prima oară utilizată, fiind introdusă în pasta de carbon alături de cofactor și mediatorul redox monomeric, solubil în apă. Mediatorul permite detectări în jurul unui potențial de 0 mV. Electrodul a fost acoperit cu o membrană, pentru a preveni contactul dintre compușii solubili în apă și soluția de contact. Un nou progres s-a realizat prin înlocuirea mediatorului monomeric cu unul polimeric. GDH-PQQ a fost o singură dată cuplată cu pasta de carbon, și atunci numai la suprafață. Este o enzimă interesantă prin faptul că este insensibilă la oxigenul molecular, cofactorul este legat iar turn-over-ul față de glucoză este mult mare decât cel al lui GOD. Deoarece are o stabilitate mică nu se prea folosește.

Tabelul nr.8 Senzori amperometrici pentru glucoză

9.2 Senzori pentru acetilcolină [11,12]

Colin oxidaza, acetil colinesteraza și butil colinesteraza sunt enzime folosite pentru determinarea enzimatică a neurotransmițătorului acetilcolină. Acetil colinesteraza și colin oxidaza au fost co-imobilizate prin introducerea într-o pastă de carbon, fie utilizând TTF monomeric, fie un polimer ferocianic flexibil care permite contactul cu situsul activ al colinesterazei. Au existat numeroase încercări de a imobiliza aceste două enzime pe un suport anorganic inert, însă au eșuat.

9.3 Senzori pentru alcool [13]

Au fost realizați numeroși senzori pentru alcool bazați pe alcool dehidrogenaza NAD+-dependentă (ADH), alcool dehidrogenaza PQQ-dependentă(ADH-PQQ) sau alcool oxidaza. Senda și colaboratorii au amestecat NAD+ în pasta de carbon având ADH adsorbită la suprafața electrodului acoperit de o membrana de dializă. Bilitewski și Schmid au amestecat cofactorul și ADH în pastă iar electrodul rezultat are reactivitate față de etanol, 1-propanol, 2-propanol și 1- butanol. Wang și colaboratorii au arătat că ADH poate fi imobilizată împreună cu cofactorul într-o rezină epoxică de grafit care are reactivitate față de etanol, alcool alilic, 1-propanol, 2-propanol și 1- butanol. În acest caz, detectarea s-a bazat pe oxidarea directă a NADH-ului produs la un potențial mare de +0,7 V. Atunci când ADH-ul este imobilizat în fază organică, acesta prezintă o selectivitate diferită de cea obținută în fază apoasă. Folosind o pastă de carbon ce conține ruteniu activat, Wang și colaboratorii au reușit să scadă potențialul necesar la +0,6 V pentru același sistem. Într-un alt experiment realizat de Wang și colaboratorii, s-a introdus în pasta de carbon alături de NAD și cofactor și silicagel. Silicagelul prezintă câteva avantaje la utilizare cum sunt: scăderea potențialului aplicat necesar pentru oxidarea NADH, menținerea cofactorului și a enzimei în pasta de carbon. Gorton și colab., Domingues și colab., Chi și colab. au demonstrat că prin adăugarea în pasta de carbon a unor mediatori cum sunt fenoxazina (monomer) și fenotiazina (polimer) potențialul aplicat scade foarte mult la valori apropiate de 0 V.

Alcool oxidaza (AOD) poate fi obținută din diferite specii de drojdii cum sunt Candida, Pichia, și Hansenula. Toate alcooloxidazele au arătat o selectivitate apropiată nu numai față de alcoolii alifatici, incluzând și metanolul, dar și față de o serie de alți mici compuși organici asemănători ca structură și conținând grupări hidroxil. Numeroase încercări de a găsi mediatori artificiali care să funcționeze împreună cu AOD au eșuat. Stabilitatea enzimei, atât în soluție cât și imobilizată pe un suport inert și folosită în mediu apos, este limitată.

Pentru determinarea glicerolului, au fost utilizate două glicerol-dehidrogenaze, una NAD+- dependentă și alta legată cu un cofactor flavinic. Prin co-imobilizarea glicerol dehidrogenazei NAD+-dependente cu diaforaza și vitamina K3 într-o pastă de carbon, detectarea glicerolului se face la potențiale foarte mici.

Tabelul nr.9 Senzori pentru alcool

9.4 Senzori pentru aminoacizi

D- și L- aminoacid oxidazele (DAAOD și respectiv LAAOD), sunt două enzime cu o largă selectivitate dar o specificitate stereoselectivă absolută. LAAOD este una dintre primele enzime imobilizate pe suprafața unui mediator din cadrul unei paste de carbon modificată și este folosită pentru detectarea L-leucinei. Ambele enzime au fost cu succes co-imobilizate împreună cu diferite peroxidaze (HRP și ARP), în pastă de carbon.

L-glutamat dehidrogenaza și L-glutamat oxidaza sunt exemple de enzime redox cu o mai mare specificitate decât aminoacid oxidazele. L-glutamat este un aminoacid care prezintă importanță în studiile clinice precum și în analiza alimentelor.

Tabelul nr.10 Senzori pentru aminoacizi

9.5 Senzori pentru glicolat

Glicolat oxidaza este una dintre primele enzime care a fost imobilizată pe suprafața unui electrod pastă de carbon modificată cu un mediator (1,1’-dimetilferocian). Această enzimă funcționează, de asemenea, într-o pastă de carbon cu ferocian flexibil, conținând polimeri sensibili la concentrații mici de glicolat.

9.6 Senzori pentru L-lactat [14-16]

După glucoză, L-lactat-ul a fost unul dintre cele mai studiate substraturi pentru construirea unor senzori enzimatici amperometrici. L-lactat este un intermediar în metabolismul carbohidratului, reprezentând astfel, un indicator important în controlul metabolic precum și în cazul unor erori de ordin clinic. În principal, sunt cinci enzime redox active față de acest compus: L-lactat dehidrogenaza (LDH, NAD+ dependentă), L-lactat PQQ-dehidrogenaza, citocromul b2, L-lactat oxidaza (LOD) și L-lactat monooxigenaza ( o oxigenază care are un cofactor legat). Toate aceste enzime catalizează reacția de oxidare a lactatului la piruvat, cu excepția L-lactat monooxigenazei ai cărei produși de oxidare sunt acetatul și CO2.

Miki și colab. au co-imobilizat LDH-ul și diaforaza pe suprafața unui electrod pastă de carbon modificată cu vitamina K3 iar Gorton și colab. au imobilizat LDH-ul într-o pastă de carbon modificată cu un mediator polimeric astfel încât NADH să poată fi oxidat electrocatalitic. Recent, Wang și colab. au arătat că adosul de silicagel la LDH și la pasta de carbon NAD+-modificată determină creșterea ratei de oxidare a NADH-ului produs.

Tabelul nr.11 Senzori pentru L-lactat

9.7 Senzori pentru peroxidaze [17]

Pentru alcătuirea senzorilor, există numeroase peroxidaze ce se pot utiliza, însă doar HRP și peroxidazele din fungi, cum este Athromyces ramosus (ARP) au fost utilizate în combinație cu pasta de carbon și electrozii epoxidici de grafit pentru detectarea peroxidului de hidrogen și a peroxizilor organici, sau în combinație cu un peroxid de hidrogen care produce oxidarea. Un număr mare de mediatori , (atât în soluție cât și în pastă), au fost folosiți pentru a realiza catalizarea transferului de electroni de la electrod la părțile oxidate ale enzimei. În anumite condiții, peroxidazele pot participa la oxidarea aerobă a donorilor de hidrogen prin oxigenul molecular. Această activitate este stimulată de prezența Mn2+.

Tabelul nr.12 Senzori pentru peroxidaze

9.8 Paste de carbon modificate cu țesuturi sau celule [18-31]

În loc să se încerce stabilizarea enzimelor pure în cadrul configurației biosenzorilor, o serie de celule întregi, țesuturi sau organite pot fi folosite. Enzimele se află astfel în mediul lor natural cu întregul necesar de stabilizatori și activatori. Exemple de țesuturi, celule și organite introduse în pastele de carbon modificate sunt : banana (polifenol oxidaza), ciuperci (tirozina), hrean (peroxidaza), sfeclă (oxalat-oxidaza), Saccharomyces cerevisiae (alcool-dehidrogenaza), zucchini (ascorbat-oxidaza), ananas (peroxidaza), găoace (polifenol-oxidaza), gulie (peroxidaza), semințe de roșie (alcool dehidrogenaza), butași de mazăre (diamino-oxidaza), papaya (papaia), spanac (acid cinamic-hidrolaza), Hansenula anomala (citocrom b2), spanac (catecol oxidaza), ovăz (poliamino-oxidaza, peroxidaza), Gluconobacter industrius (glucozo-PQQ-dehidrogenaza), spanac (glicolat-oxidaza, peroxidaza). Electrozii modificați, bazați pe celule și țesuturi sunt sensibili la o varietate de substraturi. Sunt utilizate în deosebi materialele biologice bogate în peroxidază, tirozinază și polifenol oxidază.

Tabelul nr.13 Electrozi pastă de carbon ce conțin țesuturi de plante și celule întregi

II. PARTEA PRACTICĂ [34]

1. Experimental:

Reactivi – p.a. – Chimopar București

Sol. NaH2PO4 0,05 M în apă distilată (pH=7,4)

NaOH 1 M

Paracetamol de calitate farmaceutică

Apă distilată (conductibilitate <2S/cm)

2. Aparatură:

Potențiostat PGSTAT 30 AutoLab Ecochemie (Olanda) cu GPES Software

Cole Palmer pH-metru ChemCadet

Celulă voltametrică clasică cu trei electrozi

electrod de referință Ag/AgCl

electrod auxiliar de Pt

electrod indicator

agitator IKA (Germania)

centrifugă

3.Metodă

Pregătirea pastei de carbon

Partea cea mai importantă a electrodului este suprafața activă a acestuia. Suprafața activă a electrodului cu pastă de carbon este semisolidă, fiind alcătuită dintr-o matrice hidrofobă de alcani superiori, în interiorul căreia se găsesc particule de grafit. La suprafața electrodului, grafitul formează insule electroconducătoare în mijlocul unei ”mări” electroizolatoare.

Pregătirea suprafeței electrodului cu pastă de carbon se face prin șlefuirea sa pe o suprafață de hârtie, până ce aspectul acestuia devine ca o oglindă.

Sensibilitatea, exactitatea și precizia determinărilor depind, însă, de reproductibilitatea cu care se poate genera suprafața activă a electrodului.

Fenomenele de adsorbție a unor specii chimice din soluție pe electrod modifică comportamentul acestuia, modificând-ui sensibilitatea, adesea negativ. Pentru eliminarea acestui inconvenient, după un număr de determinări, se impune reșlefuirea electrodului.

Electrodul trebuie curățat de specii electroactive adsorbite înaintea determinărilor, ceea ce implică efectuarea unor baleieri de potențial în intervalul ales, în soluția de lucru, fără analit.

Prepararea materialului biologic

Materialul biologic a fost preparat conform E.A.Cummings, P.Mailley, S. Linquette-Mailley, B.R.Eggins,* E.T. McAdams și S.McFadden, Analyst, 1998, 123. 1975-1980.

Merele Washington Red („bot de iepure”) au fost curățate de coajă, au fost tăiate cubulețe, spălate cu apă distilată, triturate la mojar și lăsate aproximativ 1 oră pentru oxidarea fenolilor din compoziția mărului.

Pasta obținută a fost centrifugată la 4500 rpm, timp de 20 de minute. După centrifugare, s-a recuperat partea inferioară și s-a pus la uscat la temperatura camerei, peste noapte pe sticlă de ceas.

Prepararea biosenzorului

Materialul biologic, în proporții diferite [CPE 20 %(m/m), CPE 30 %(m/m), CPE 50 %(m/m)], a fost adăugat în pasta de carbon Methrom. Amestecul se pune în mojar și se triturează cu alcool etilic până la omogenizare.

Prepararea soluției de analizat paracetamol 10-3 M în apă

S-au cântărit 0,00378 g de paracetamol și s-au dizolvat în apă distilată aducându-se într-un balon cotat de 25 ml.

Prepararea soluției de NaH2PO4 0,05M în apă

S-au cântărit 6,9 g NaH2PO4x H2O și s-au dizolvat în 1000 ml de apă distilată. Soluția de NaH2PO4 0,05M a fost ajustată la pH=7,4 cu ajutorul unei soluții de NaOH 1M. Soluția de NaOH 1M s-a obținut prin cântărirea a 2g NaOH în 50 ml de apă distilată.

4. Analiza amperometrică

Tirozinaza, enzimă prezentă în pulpa de măr, catalizează oxidarea unor mono- și o-difenoli la o-chinone, în prezența oxigenului. De aceea, determinările amperometrice au fost realizate în atmosferă saturată de oxigen cu ajutorul unei soluții tampon fosfat (5 ml NaH2PO4 0,05M pH=7,4). S-au realizat trei experimente diferite, ce presupun introducerea în soluția tampon a electrodului pastă de carbon modificată (cu conținut diferit de material biologic 20%, 30%, 50%). Potențialul care s-a aplicat a fost de –0,2 V.

Au fost adăugate prin injectare volume diferite din soluția de paracetamol 10-3 M și s-a urmărit, pentru fiecare experiment în parte, variația curentului după fiecare injectare, corespunzătoare reducerii enzimatice a o-chinonei formată enzimatic.

5. Rezultate și discuții

S-a observat că la adăugarea unui volum de paracetamol în celula electrochimică, apare un semnal, iar acesta se datorează unui proces de oxidare enzimatică, urmată de o reducere electrochimică .(Fig.14)

Fig. 14 Profilul unei reacții electro-enzimatice

Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul nr. 14

Tabelul nr. 14

Fig. 11 Variația intensității curentului în funcție de concentrație (pastă de carbon modificată 20% măr)

Fig. 12 Variația intensității curentului în funcție de concentrație (pastă de carbon modificată 30% măr)

Fig.13 Variația intensității curentului în funcție de concentrație (pastă de carbon modificată 50% măr)

Raportul dintre pasta de carbon și materialul biologic introdus în aceasta influențează în mod deosebit proprietățile electrice și analitice ale electrodului.

Proprietățile electrochimice ale biosenzorului au fost evaluate pentru trei proporții diferite între pasta de carbon și materialul biologic ales (PC/MB): 20, 30 și 50%. Amestecul dintre o fază hidrofobă (pasta de carbon) și o fază hidrofilă (materialul biologic) poate duce la separarea amestecului. Acest amestec poate fi comparat cu o matrice hidrofobă ce conține o rețea hidrofilă. În cazul pastei de carbon modificate ce conține peste 50% material biologic s-a observat o degradare a acesteia, determinând deplasarea unor părți în soluție. Instabilitatea se poate datora și penetrării matricii de către soluția în care se face analiza, ținând cont de faptul că este vorba de un sistem hidrodinamic, determinarea se face sub agitare continuă.

S-a demonstrat de asemenea, că în cazul unei paste de carbon modificate, cu un conținut ridicat de material biologic (în cazul de față 50%), semnalul electric obținut este mare, dar instabil.

Există o serie de alți factori care influențează semnalul analitic:

valoarea optima a potențialului este de –0,2 V, potențial de oxidare a paracetamolului, evitând oxidarea sau reducerea soluției tampon

pH-ul influențează proprietățile unui cuplu redox, modificându-i potențialul de echilibru. Pentru o substanță, se poate întâmpla să se oxideze doar într-un anumit domeniu de pH. Paracetamolul are un semnal analitic bun la o valoare a pH-ului de 7,4, creată de soluția de tampon fosfat monosodic. Alegerea tamponului trebuie să țină cont și de faptul că acesta trebuie să fie electro-inert, adică să nu aibă proprietăți redox în condițiile studiului efectuat și să nu influențeze semnalul analitului într-o măsură semnificativă. În cazul biosenzorilor enzimatici, alegerea soluției tampon și a pH-ului acesteia trebuie să mențină activitatea enzimată.

III. CONCLUZII

Tehnicile electroanalitice reprezintă, în momentul de față, una dintre cele mai promițătoare abordări ale problemelor analizei farmaceutice, fapt confirmat de numărul mare de articole apărute în literatură.

Proiectele care se derulează, urmăresc folosirea unor aparate pentru diagnosticarea unor boli, fără a determina fiecare parametru individual. Astfel, cu ajutorul unei singure picături de sânge din plica degetului, se vor obține rezultatele în câteva secunde, evitându-se astfel timpul destul de lung până la așteptarea rezultatelor de la laborator cât și vizitele repetate ale pacienților.

Aceste sisteme nu necesită o pregătire specială, ele aducând beneficii atât doctorilor cât și pacienților. Se pot realiza determinări simultane a peste 6 parametrii, toate datorate unei singure fâșii test care se introduce în analizator. Acesta este mai mic decât un telefon mobil și incorporează electrozi în miniatură, (similari circuitelor integrale), reducându-se astfel cantitățile de materie primă care se utilizează, și ca urmare și costurile. Fâșiile test nu necesită refrigerare și posedă de asemenea un instrument automat de calibrare.

Inițial s-a urmărit punerea lor în practică în două dintre domeniile medicale de risc: cardiac (determinarea colesterolului total, HDL-colesterolului, LDL-colesterolului, trigliceride) și renal (determinarea creatininei, ureei, sodiului și potasiului). În momentul de față se pot realiza determinări legate de sarcină, funcția ficatului și nivelul statinelor.

Tabelul nr. 17 Alte domenii de interes ale biosenzorilor

Metodele electrochimice sunt metode analitice sensibile, dar nu sunt selective. Progresele realizate în ultimul timp privind dezvoltarea unor electrozi specifici a făcut posibilă mărirea selectivității acestor metode. Au fost publicate numeroase articole referitoare la electrozii pastă de carbon modificată enzimatic. Enzimele sunt sisteme selective, uneori chiar specifice, însă prezintă o mare instabilitate în timp. S-a urmărit astfel, găsirea unor modalități de a păstra enzimele în mediul lor natural (țesuturi, celule, organe) care le conferă o mai mare stabilitate. Utilizarea unor paste de carbon modificate cu ajutorul materialelor de origine biologică are și un mare inconvenient, și anume răspunsul se obține foarte lent. Pentru minimalizarea lui se dorește adăugarea în pastele de carbon a unor aditivi care pot modifica timpul de răspuns.

În prezentul studiu, s-a investigat comportamentul unui biosenzor care se bazează pe un electrod pastă de carbon modificată cu țesut din măr ce conține tirozinază.

S-a putut demonstra astfel că biosenzorii care conțin țesuturi vegetale pot sta la baza determinării calitative amperometrice a paracetamolului, dar pentru determinări cantitative este necesară o optimizare a unor parametri ce pot influența răspunsul analitic. În acest sens studii viitoare vor avea în vedere: raportul pastă de carbon/material biologic, pH-ul soluției, valoarea optimă a potențialului.

model HANDHELD model SUBMERSIBLE

MICROCHIP

Biosenzor pentru determinarea nivelului de glucoză din sânge

BIBLIGRAFIE

Spichiger-Keller, Ursula E., Chemical Sensors and biosensors for medical and biological applications – Weinheim; Wiley- VCH, 1998

I. Turner, Anthony P. F; II. Karube, ISAO; III. Wilson, George S., Biosensors:Fundamentals and applications – Oxford univers

W. Matuszewski, M. Trojanowicz, Analyst 1988, 113, 735.

A. Amine, J.-M. Kauffmann, G,J. Patriarche, Talanta 1991, 38, 107

J. Wang, J.-H. Wu, Y. Lu, R. Li, J. Sanchey, Anal. Chim. Acta 1990, 228,251

F. Cespedes, E. Martinez- Fabregas, J. Bartoli, S. Algret, Anal. Chim. Acta 1993, 273, 409.

F. Cespedes, E. Martinez- Fabregas, S. Algret, Anal. Chim. Acta 1993, 284, 21.

J. Wang, Flow Injection Analysis (FIA) Based on Enzymesor Antibodies, Germany 1991, pg. 277-28

J. Wang,, Electroanalysis 199

P. N. Bartlett, P. Tebbutt, R. P. Whitaker, Prog. React. Kinet. 1991, 16,55

G. Marko- Varga, Electroanalysis 1992,4, 403

L. Boguslavskz, P. D. Hale, L. Geng, T. A. Skotheim, H.-S. Lee Solid State Ionics 1993, 60,189

J. Wang, E. Gonzalez Romero, A. Reviejo, J. Electroanal. Chem. 1993, 353,113

K. Miki, T. Ikeda, S. Todoriki, M. Senda,Anal. Sci1989, 5,269

L. Gorton, G. Marko-Varga, B. Persson, Y. Huan, H. Jarskog, E. Johansson, S. Ghobadi, Mosbach Symposiunm on Biochemical Tehnologz London, 1995

J. Wang, J. Liu Anal. Chim. Acta 1993, 284,385

M. H. Smit, G. A. Rechnitz, Anal. Chem. 1992, 64,245

J. Wang, N. Naser, H. S. Kwon, M. Y. Cho, Anal. Chem. Acta1992, 264,7

J. Wang, N. Naser, U. Wollenberger, Anal. Chem. Acta1993, 281,19

J. Wang, N. Naser, A. Ciszewski, Electroanalysis 1992, 4, 777

S.A. Glazier, G.A. Rechnitz, Anal. Chem. Acta 1991, 243,1

J. Wang, K. Varughese, Anal. Chem. 1990 , 62, 318

J. Wang, N. Naser, M. Ozsoz, Anal. Chem. Acta1990, 234, 315

M.S. Lin, S.Y. Tham, G.A. Rechnitz, Electroanalysis 1990, 2, 511

A. Navaratne, M.S. Lin, G.A. Rechnitz Anal. Chem. Acta1990 237,107

J. Wang, M. Ozsoz Electroanalysis 1991, 3, 655

D. Wijesuriya, G.A. Rechnitz Anal. Chem. Acta1991 243,1

J. Wang, J.-H. Wu, S. Martinez J. Sanchez, Anal. Chim. Acta 1991, 63,398

J. Wang, N. Naser Bioelectrochem. Bioener. 1992, 25,1171

M.S. Lin, M. Hare, G.A. Rechnitz, Electroanalysis 1992, 4,521

K. Takayama, T. Kurosaki, T. Ikeda, J. Electoanal. Chem. 1993, 356, 295

K. Kalcher, J.-M.Kauffmann, J.Wang, I. Svancara, K. Vytras, Z. Yang Electroanalzsis 1995 7, 5

www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/index.htlm dupa martin Chaplin, Christpher Bucke Enzyme Tehnology, Cambrige University Press, 1990

E.A.Cummings, P.Mailley, S. Linquette-Mailley, B.R.Eggins,* E.T. McAdams și S.McFadden, Analyst, 1998, 123. 1975-1980.

BIBLIGRAFIE

Spichiger-Keller, Ursula E., Chemical Sensors and biosensors for medical and biological applications – Weinheim; Wiley- VCH, 1998

I. Turner, Anthony P. F; II. Karube, ISAO; III. Wilson, George S., Biosensors:Fundamentals and applications – Oxford univers

W. Matuszewski, M. Trojanowicz, Analyst 1988, 113, 735.

A. Amine, J.-M. Kauffmann, G,J. Patriarche, Talanta 1991, 38, 107

J. Wang, J.-H. Wu, Y. Lu, R. Li, J. Sanchey, Anal. Chim. Acta 1990, 228,251

F. Cespedes, E. Martinez- Fabregas, J. Bartoli, S. Algret, Anal. Chim. Acta 1993, 273, 409.

F. Cespedes, E. Martinez- Fabregas, S. Algret, Anal. Chim. Acta 1993, 284, 21.

J. Wang, Flow Injection Analysis (FIA) Based on Enzymesor Antibodies, Germany 1991, pg. 277-28

J. Wang,, Electroanalysis 199

P. N. Bartlett, P. Tebbutt, R. P. Whitaker, Prog. React. Kinet. 1991, 16,55

G. Marko- Varga, Electroanalysis 1992,4, 403

L. Boguslavskz, P. D. Hale, L. Geng, T. A. Skotheim, H.-S. Lee Solid State Ionics 1993, 60,189

J. Wang, E. Gonzalez Romero, A. Reviejo, J. Electroanal. Chem. 1993, 353,113

K. Miki, T. Ikeda, S. Todoriki, M. Senda,Anal. Sci1989, 5,269

L. Gorton, G. Marko-Varga, B. Persson, Y. Huan, H. Jarskog, E. Johansson, S. Ghobadi, Mosbach Symposiunm on Biochemical Tehnologz London, 1995

J. Wang, J. Liu Anal. Chim. Acta 1993, 284,385

M. H. Smit, G. A. Rechnitz, Anal. Chem. 1992, 64,245

J. Wang, N. Naser, H. S. Kwon, M. Y. Cho, Anal. Chem. Acta1992, 264,7

J. Wang, N. Naser, U. Wollenberger, Anal. Chem. Acta1993, 281,19

J. Wang, N. Naser, A. Ciszewski, Electroanalysis 1992, 4, 777

S.A. Glazier, G.A. Rechnitz, Anal. Chem. Acta 1991, 243,1

J. Wang, K. Varughese, Anal. Chem. 1990 , 62, 318

J. Wang, N. Naser, M. Ozsoz, Anal. Chem. Acta1990, 234, 315

M.S. Lin, S.Y. Tham, G.A. Rechnitz, Electroanalysis 1990, 2, 511

A. Navaratne, M.S. Lin, G.A. Rechnitz Anal. Chem. Acta1990 237,107

J. Wang, M. Ozsoz Electroanalysis 1991, 3, 655

D. Wijesuriya, G.A. Rechnitz Anal. Chem. Acta1991 243,1

J. Wang, J.-H. Wu, S. Martinez J. Sanchez, Anal. Chim. Acta 1991, 63,398

J. Wang, N. Naser Bioelectrochem. Bioener. 1992, 25,1171

M.S. Lin, M. Hare, G.A. Rechnitz, Electroanalysis 1992, 4,521

K. Takayama, T. Kurosaki, T. Ikeda, J. Electoanal. Chem. 1993, 356, 295

K. Kalcher, J.-M.Kauffmann, J.Wang, I. Svancara, K. Vytras, Z. Yang Electroanalzsis 1995 7, 5

www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/index.htlm dupa martin Chaplin, Christpher Bucke Enzyme Tehnology, Cambrige University Press, 1990

E.A.Cummings, P.Mailley, S. Linquette-Mailley, B.R.Eggins,* E.T. McAdams și S.McFadden, Analyst, 1998, 123. 1975-1980.