BIOMATERIALE COLAGENICE POPULATE CU CELULE STEM PENTRU ÎNLOCUIRI VALVULARE Doctorand Marius Mihai Harpa Conducător de doctorat Klara Brînzaniuc Motto… [307392]
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE TÎRGU MUREȘ
ȘCOALA DE STUDII DOCTORALE
TÎRGU MUREȘ 2016
TEZĂ DE DOCTORAT
BIOMATERIALE COLAGENICE POPULATE CU CELULE STEM PENTRU ÎNLOCUIRI VALVULARE
Doctorand: [anonimizat]:
[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat] – Pulmonary heart valve replacement using stabilized acellular xenogeneic scaffolds; effects of seeding with autologous stem cells., [anonimizat] 2015, Vol 23, nr. 4, pg. 415-430 DOI: 10.1515/rrlm-2015-0046
Marius Harpa, I Movileanu, L Sierad, O Cotoi, H Suciu, T Preda, D Nistor, C Sircuta, K Branzaniuc, R Deac, S Gurzu, L Harceaga, P Olah, D Simionescu, M Dandel, A Simionescu. “In vivo testing of xenogeneic acellular aortic valves seeded with stem cells”, [anonimizat], Sept 2016, vol. 24, nr. 3, DOI: 10.1515/rrlm-2016-0031
[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat] – [anonimizat] 2016;13(1):1-9
[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat] a [anonimizat] C Methods, 2015 Dec, 21(12), 1284-96, doi: 10.1089/ten.TEC.2015.0170. – Co-coresponding author
Articole în extenso publicate în reviste B+:
[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat] – [anonimizat], ACTA MEDICA TRANSILVANICA June 2015;20(2):38-39
Rezumate publicate în reviste B+:
[anonimizat] H, [anonimizat], Cordos B, [anonimizat] – Six months in vivo testing of acellular valvular xenografts in a [anonimizat], Dec 2015, vol. 61, suppl 8, pg 4
[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat] – A [anonimizat]. [anonimizat] 2014, vol. 60, suppl 4, pg 62
Premiul 1 la Sectiunea Chirurgie Cardiaca E-posters – [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat]. „[anonimizat], [anonimizat]”. [anonimizat], Romania, 18-21 Septembrie, 2014, Revista Medico-Chirurgicală a Societății de Medici și Naturaliști din Iași, Vol. 118, Iulie-Septembrie 2014, nr. 3, Supl. 1, pg. 87, ISSN 0048-7848
Premiul I la Secțiunea Preclinic a Congresului Marisiensis 2016 – Movileanu Ionela, Harpa M., Cotoi O.S., Preda Terezia, Simionescu Agneta, Simionescu D., Adipose tissue derived stem cells – the medicine of the future?, Acta Medica Marisiensis, 2016, Vol 62, Supp 4, pg 2.
Movileanu Ionela, Harpa M., Deac R., Suciu H., Olah P., Simionescu D., Testing of valvular xenografts seeded with stem cells on animal model, Acta Medica Marisiensis, 2015, Vol 61, Supp 2, pg 57-58.
Prezentări orale și Postere la Conferințe Internaționale și Naționale:
Marius M. Harpa, Ionela Movileanu, Allison Kennamer, Nicholas Rierson, Ovidiu Cotoi, Horatiu Suciu, Victor Raicea, Terezia Preda, Dan Nistor, Klara Branzaniuc, Radu Deac, Simona Gurzu, Lucian Harceaga, Peter Olah, Carmen Sircuta, Agneta Simionescu, Michael Dandel, Dan Simionescu – How Close Are We to Fully Engineering a Living Heart Valve? A Tale of Scaffolds, Stem Cells, Bioreactors and Sheep. Heart Valve Society, 2016 Annual Scientific Meeting, 17-19 March 2016, Marriott Marquis, New York City, New York
Marius Harpa, Terezia Preda, Ionela Movileanu, Ovidiu Cotoi, Dan Simionescu. ”Adipose Tissue‐Derived Stem Cell Sourcing for Heart Valve Tissue Regeneration; Selection of the Optimal Anatomical Site and Harvesting Procedure in Sheep”. 6th Biennial Meeting on Heart Valve Biology and Tissue Engineering, London, September 10th‐12th, 2014.
Marius Harpa, Dan Simionescu, Agneta Simionescu, Radu Deac, Horatiu Suciu, Peter Olah, Klara Branzaniuc. ”Stem cell seeded collagen scaffolds for heart valve replacement – tissue engineering and experimental research. 14th National Congress of Romanian Society for Anatomy, Timisoara, May 16-18, 2013.
Leslie N. Sierad, Eliza Laine Shaw, Allison Kennamer, Rebekah Odum, Marius Harpa, Ovidiu Cotoi, Terezia Preda, Radu Deac, Victor Raicea, Horatiu Suciu, Lucian Harceaga, Klara Branzaniuc, Imre Egyed, Zoltan Pavai, Annamaria Szanto, Agneta Simionescu, Dan T. Simionescu. “Pre-clinical Testing of Stem Cell-Seeded Biological Scaffolds for Heart Valve Tissue Engineering”. 8th Symposium on Biologic Scaffolds for Regenerative Medicine, Silverado Resort, Napa, CA, April 24-26, 2014.
Leslie N. Sierad, Eliza Laine Shaw, Allison Kennamer, Rebekah Odum, Marius Harpa, Ovidiu Cotoi, Terezia Preda, Radu Deac, Victor Raicea, Horatiu Suciu, Lucian Harceaga, Klara Branzaniuc, Imre Egyed, Zoltan Pavai, Anamaria Szanto, Bogdan Petcu, Agneta Simionescu, Dan T. Simionescu. Bioreactor Technologies for Clinical Translation of Tissue Engineered Heart Valves”. 14th Biannual Meeting of the International Society for Applied Cardiovascular Biology (ISACB), Cleveland, OH, April 2-5, 2014.
Allison R. Kennamer, Leslie N. Sierad, Ovidiu Cotoi, Marius Harpa, Terezia Preda, Dan T. Simionescu. “Progress Toward Interstitial Recellularization of Aortic Heart Valve Scaffolds”. Biomaterials Day Symposium, Clemson, SC, November 2013.
Allison R. Kennamer, Leslie N. Sierad, Ovidiu Cotoi, Marius Harpa, Terezia Preda, Victor Raicea, Horatiu Suciu, Dan T. Simionescu. “Interstitial Cell Seeding and Conditioning of Aortic Heart Valve Scaffolds”. Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Society – Americas (TERMIS-AM), Atlanta, GA, November 2013.
CUPRINS incă nerealizat
INTRODUCERE
STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII
1. NOȚIUNI GENERALE
1.1. Noțiuni de anatomie
1.2 Noțiuni de histologie
1.3 Noțiuni de fiziologie
2. PATOLOGIA VALVULARĂ
2.1. Patologia valvulară congenitală
2.2. Patologia valvulară dobândită
3. TRATAMENTUL VALVULOPATIILOR
3.1 Proteze valvulare mecanice
3.2 Proteze valvulare biologice
3.3 Proteze valvulare mecanice vs. proteze valvulare biologice
4. ROLUL MEDICINII REGENERATIVE ÎN PATOLOGIA VALVULARĂ
4.1 Sursa regenerării – celulele stem
4.2 Suportul celulelor stem – scaffold-urile
4.3 Sistemele de precondiționare – Bioreactoarele
4.4 Rezultatele primelor studii
CONTRIBUȚIA PERSONALĂ
1. Ipoteza de lucru/obiective
2. Metodologie generală
3. Titlu studiu 1
3.1. Ipoteză/Obiective
3.2. Material și metodă
3.3. Rezultate
3.4. Discuții
3.5. Concluzii
4. Titlu studiu 2
4.1. Ipoteză/Obiective
4.2. Material și metodă
4.3. Rezultate
4.4. Discuții
4.5. Concluzii
5. Titlu studiu 5
5.1. Ipoteză/Obiective
5.2. Material și metodă
5.3. Rezultate
5.4. Discuții
5.5. Concluzii
6. Discuții (generale)
7. Concluzii (generale)
8. Originalitatea tezei
REFERINȚE
ANEXE
ABREVIERI UTILIZATE ÎN TEXT
ADN – acid deoxiribonucleic
Adv – adventiția
AGO – aria geometrică a orificiului valvular
AP – artera pulmonară
ARN – acid ribonucleic
CCD – cuspa coronară dreaptă
CCS – cuspa coronară stângă
CNC – cuspa non-coronară
DAPI – 4',6-diamidino-2-phenylindole
DMEM – mediu de cultură Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DMSO – dimetil sulfoxid
DOC – deoxicolat
DPBS – Dulbecco's phosphate-buffered saline
EDTA – acid etilendiaminotetraacetic
FBS – ser bovin fetal
FGF – fibroblast growth factor
GAG – glicosaminoglicani
IHC – imunohistochimie
L – lumen
MCC – malformație cardiacă congenitală
ME – matrice extracelulară
MMP – matrix-metalo-proteine
PBS – Phosphate-buffered saline
PGG – penta-galloyl glucoză
rpm – rotații pe minut
SDS – Sodium Dodecyl Sulfat
SJM – Saint Jude Medical (Inc.)
TEVD – tract de ejecție al ventriculului drept
TGF – transforming growth factor
TNF – tumor necrosis factor
TRIS –trisaminometan
VD – ventricul drept
VM – valvă mecanică
VS – ventricul stâng
VT – valvă tisulară
Introducere
Structura complexă a cordului este cunoscută încă din cele mai vechi timpuri, de la disecțiile experimentale realizate pe model animal și pe cadavre umane. Dacă filozoful grec Aristotel, în secolul al 4-lea î.Hr, definea cordul ca cel mai important organ din corpul uman, în secolul al 2-lea, Galen afirma că inima se identifică cu sufletul omului. Cercetările ulterioare (Andres de Laguna, Leonardo daVinci, Servetus, Colombo, Harvey) au demonstrat că inima este o dublă pompă, musculară, alcătuită din patru cavități și patru valve cardiace care asigură un flux sangvin unidirecțional prin cele două sisteme de circulație atașate cordului.
Anatomia inimii – Enrique Simonet – 1890
Progresia imagisticii noninvazive cardiace de înaltă rezoluție a dus la o mai clară înțelegere, nu doar a componentelor anatomice ale cordului, ci și a proceselor fiziologice și a celor de fiziopatologie. Unele dintre cele mai frecvente patologii prezente în cadrul clinicilor de cardiologie și chirurgie cardiacă este reprezentată de valvulopatii – afecțiuni ale aparatelor valvulare, fie de natură congenitală, fie dobândite, datorate unor procese degenerative, infecțioase, etc.
Tratamentul disponibil în prezent este reprezentat de cel medicamentos, cel chirurgical, respectiv cel intervențional. În cadrul tratamentului de natură chirurgicală opțiunile disponibile sunt: valvuloplastia sau înlocuirea valvulară. În cazul înlocuirilor valvulare, există numeroase opțiuni, acestea fiind clasificabile în două mari grupe: proteze mecanice și valve biologice, toate acestea deținând un număr considerabil de avantaje și dezavantaje, de aceea alegerea tipului de valvă se face individualizat, în funcție de patologia valvulară, vârsta, comorbiditățile și complianța la tratament a pacientului. Necesitatea de multiple intervenții în cadrul valvulopatiilor congenitale, apariția fenomenului de rejet, degenerescența și calcificarea valvelor biologice, terapia anticoagulantă indispensabilă protezelor mecanice, fac din actualele substituente valvulare un model departe de a fi numit ideal.
Medicina regenerativă țintește depășirea acestor dezavantaje dorindu-se obținerea unui model valvular care respectă mărimea și forma valvei native, să fie non-trombogenă, non-imunogenă, durabilă, cu o bună hemodinamică, capabilă de a se integra în organismul gazdei. Aceste criterii odată îndeplinite, vor conduce, cel puțin teoretic, la capacitatea de creștere a valvei odată cu dezvoltarea somatică a pacientului, de unde ar deriva și aplicabilitatea în chirurgia cardiacă pediatrică.
STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII
Noțiuni generale
Cordul, parte integrată a aparatului cardio-vascular, reprezintă elementul central al acestui sistem. Anatomia și histologia acestuia sunt perfect adaptate pentru a-și îndeplini funcția de pompare ritmică în cadrul celor două sisteme circulatorii.
1.1 Aspecte anatomice
Cordul deține patru valve, cu rolul de a asigura unidirecționalitatea fluxului sangvin, grupate două câte două, în funcție de poziționarea acestora (Figura 1).
Valvele atrio-ventriculare, situate între atrii și ventriculi, permit pasajul fluxului sanguin dinspre atriul stâng spre ventriculul omonim în cazul valvei mitrale și între atriul și ventriculul drept, valva tricuspidă. Pe lângă rolul deținut în umplerea camerelor ventriculare, acestea joacă un rol important în atingerea presiunilor intraventriculare necesare ejecției în marile vase și împiedicarea refulării fluxului înspre atrii la momentul sistolei ventriculare. Sunt alcătuite din cuspe valvulare – două în cazul valvei mitrale, trei în cazul celei tricuspide, inserate bazal la nivelul inelului valvular, iar marginal atașate prin cordaje tendinoase, mușchilor papilari – structuri musculare de tip miocardic, localizate intraventricular. Rolul mușchilor papilari este cel de susținere a valvelor atrioventriculare închise în timpul sistolei prin intermediul cordajelor tendinoase, structuri alcătuite din țesut fibros, inserate între mușchiul papilar și cuspă.
Valvele semilunare sunt valve alcătuite din trei cuspisuri, cu o structură mai simplă, a căror inserție le dă denumirea de semilunare. Valvele semilunare, aortică și pulmonară, direcționează fluxul sangvin dinspre ventriculi spre vasele bazei cordului, împiedicând reîntoarcerea acestuia în timpul diastolei către ventriculi. Asigură fluxul sanguin unidirecțional înspre circulația sistemică, respectiv pulmonară.
Un rol decisiv în fiziologia cordului este reprezentat de aparatul fibros al miocardului sau „scheletul inimii”, care servește ca și platformă de sprijin pentru elementele contractile și aparatul valvular. Cortina mitro-aortică are o importanță deosebită în stabilitatea aparatului valvular mitral și a valvei aortice, și a bazei ventriculului stâng. Este mărginită de o parte și alta de trigonul fibros drept și stâng. Cel drept este perforat de fasciculul His, prezintă o expansiune fibroasă spre partea posterioară a trunchiului pulmonar, una spre musculatura atriilor (tendonul Todaro) și se continuă cu partea membranoasă a septului interventricular, formând corpul fibros central. Așa numitele inele valvulare, formate din fibre elastice și colagen, inserate în acest aparat fibros, conferă stabilitate joncțiunilor atrio-ventriculare și valvei aortice, și în același timp o dinamică corespunzătoare în buna funcționalitate a cordului.
Figura 1. Anatomia valvelor cardiace (adaptat după [1])
Valva aortică
Joacă un rol esențial în hemodinamica sistemică prin poziționarea ei la baza rădăcinii aortice. Pe lângă asigurarea unui flux unidirecțional, laminar, în circulația sistemică, este responsabilă, în parte, și de perfuzia coronariană. Asemenea valvei pulmonare, este o valvă semilunară, alcatuită din trei cuspe. Structura acesteia este una mai simplă comparativ cu valvele atrio-ventriculare, fără a mai fi necesară prezența unui aparat subvalvular care să îi asigure funcționalitatea. Această denumire derivă din modul în care cuspele sunt atașate de peretele arterial: o manieră curbilinie, semilunară. În dreptul fiecărei cuspe, există o dilatare a peretelui arterial, așa-numitele sinusuri Valsalva. Două din aceste sinusuri dau naștere ostiumului arterei coronare stângi, respectiv drepte, astfel fiind denumite cuspele și sinusurile: drepte, stângi, respectiv non-coronare.
Rădăcina aortică are o structură particulară, alcătuită din trei inele de tip circular și unul cu aspect de coroană (inserția valvulelor). Cel mai cranial reper al valvei este reprezentat de comisurile cuspelor, linia imaginară ce le unește pe toate trei formând joncțiunea sino-tubulară (primul inel). Aceasta reprezintă de fapt limita superioară a rădăcinii aortice către aorta ascendentă. Importanța deosebită derivă din faptul că dilatarea rădăcinii aortice la acest nivel duce la incompetența valvei aortice [2, 3]. Din punct de vedere anatomic, nivelul la care peretele arterial se atașează de musculatura ventriculară, formează joncțiunea ventriculo-arterială (al 2-lea inel). Prin atașarea de tip semilunar a valvulelor, baza acestora depășesc joncțiunea arterio-ventriculară și descriu cel de-al 3-lea inel virtual (Figura 2).
Figura 2. Schema rădăcinii aortice. Linia de atașare a cuspelor (roșu) se întinde pe toată lungimea rădăcinii aortice, de la nivelul joncțiunii sino-tubulare (albastru), până la nivelul inelului bazal virtual (verde) format de punctele cele mai inferioare ale inserției valvulelor. Astfel, atașamentul cuspelor descriu o linie în formă de coroană, care depășește joncțiunea ventriculo-arterială (galben) (adaptat după [4])
Astfel, la nivelul sinusurilor drept și stâng, inserția bazei cuspei se face în mușchi, iar valvula non-coronară se atașează de țesutul fibros al continuității mitro-aortice. În dreptul fiecărei comisuri se delimitează inferior câte un triunghi: cel dintre valvula dreaptă și non-coronară, situat superior de partea membranoasă a septului interventricular, în apropiere de traiectul fasciculului His; cel delimitat de cuspa dreaptă și cea stângă se învecinează cu tractul de ejecție al ventriculului drept; cel de-al treilea dintre valvula stângă și cea non-coronară se continuă practic cu cortina mitro-aortică, comisura de la acest nivel corespunzând cu mijlocul valvulei anterioare (aortice) a valvei mitrale.
Desigur, cele mai importante componente ale valvei aortice sunt cuspele. Acestea au o zonă de ancorare, mai groasă, la „inelul valvei” fie că vorbim de peretele aortic sau masa musculară a ventriculului stâng. Partea centrală devine mult mai subțire, chiar transparentă, până la marginea liberă, la mijlocul careia de identifică o porțiune mai îngroșată: nodulul Arantius, care contribuie la o mai bună coaptare centrală a cuspelor.
Buna funcționare a valvei aortice și asigurarea unui flux laminar către circulația sistemică se realizează doar prin participarea coordonată a tuturor componentelor rădăcinii aortice [5, 6]. Acest proces susține totodată performanța ventriculului stâng și perfuzia coronariană. Continua adaptabilitate a dimensiunilor și formei rădăcinii aortice, în conformitate cu necesitățile ventriculului stâng, este un factor cheie în funcționalitatea ei, fapt ce o definește ca fiind o structură dinamică [7]. Se consideră că deschiderea valvei aortice este inițiată de mișcări specifice ale anumitor elemente, care conduc la modificări de formă ale rădăcinii de la nivelul joncțiunii sino-tubulare și până la inelul valvular [6-10].
De asemenea, datorită prezenței de elemente contractile și nervoase la nivelul cuspelor, neurotransmițătorii, hormonii și agenții farmacologici pot fi capabili de a modifica tensiunea la acest nivel [11]. Stimularea in vitro a demonstrat capacitatea contractilă atât la nivelul cuspelor, cât și la nivelul inelului valvular, sinusurilor și joncțiunii sino-tubulare [12, 13].
La sfârșitul sistolei ventriculare, cuspele valvei se închid pasiv, pe o linie de coaptare centrală, datorită gradientului de presiune, împiedicând astfel refluxul sanguin în tractul de ejecție al ventriculului stâng.
Valva pulmonară
Structură localizată în partea distală a tractului de ejecție al ventricului drept, are rolul de a menține unidirecționalitatea fluxului sangvin în mica circulație. Asemănător structurii de la nivelul aortei, valva pulmonară este alcătuită din trei cuspisuri semilunare, atașate la peretele arterial, fiecare deținând la mijlocul marginii libere, o îngroșare fibroasă – nodulul Arantius, iar de-o parte și de alta a acestora, borduri denumite „Lunulae valvularum semilunarum”[14].
Cele trei cuspisuri sunt denumite după poziționarea lor, astfel: cuspisul anterior, cuspisul drept și cuspisul stâng. Asigurând fluxul dinspre ventriculul drept spre circulația pulmonară, acest sistem valvular este supus unor gradiente presionale mult reduse față de cele sistemice. Datorită acestor condiții hemodinamice permisive și datorită poziționării valvei cel mai anterior dintre toate cele patru valve, face ca procedurile chirurgicale la nivelul valvei pulmonare să fie considerate cu un risc mai redus.
Valva mitrală
Situată între atriul și ventriculul stâng, valva mitrală împreună cu aparatul său subvalvular contribuie la geometria și performanța ventriculului stâng [15].
Este alcătuită din inelul valvular, două cuspe: anterioară (aortică) și posterioară (murală), cordaje tendinoase și doi mușchi papilari – anterior și posterior (Figura 3).
Inelul valvular mitral are o parte anterioară, mai rigidă, delimitată de cele două trigoane fibroase, puternic ancorat în corpul fibros central al cordului; partea posterioară, corespunzătoare valvulei murale, este una mobilă, contractilă, fiind în contact cu peretele liber al ventriculului [15].
Cordajele tendinoase sunt niște structuri complexe formate din fibre elastice și de colagen, care interconectează mușchii papilari de cuspele valvei mitrale. Inserția acestora se face de la nivelul marginii libere, corp și până la baza valvulelor, pentru a reduce cât mai mult stress-ul și tensiunea în planul valvei și conduce la o mai îndelungată durabilitate [16].
Figura 3. Continuitatea mitro-aortică (stânga) CCD – cuspa coronară dreaptă, CNC – cuspa non-coronară, CCS – cuspa coronară stângă. Aparatul subvalvular mitral (dreapta) (adaptat după [17])
Cuspa posterioară este îngustă și se extinde pe două treimi din circumferința inelului valvular. Conform nomenclaturii lui Carpentier, prezența unor indentații la nivelul marginii libere, împarte cuspa posterioară, dinspre comisura antero-laterală spre comisura postero-medială, în 3 scallop-uri sau segmente: P1, P2, P3. Cuspa anterioară, mai lată și mai scurtă, puternic ancorată în aparatul fibros al inimii și în strânsă legătură cu cuspa coronară stângă și non-coronară a valvei aortice, ocupă o treime din circumferința inelului atrio-ventricular stâng. Poate fi de asemenea împarțită în trei segmente: A1, A2, A3, corespunzătoare celor de pe cuspa murală.
Relația intimă cu corpul fibros central și cu trigonul fibros drept oferă valvei mitrale rezistența necesară stress-ului mecanic la care este supusă în timpul sistolei ventriculare, însă trebuie luat în considerare riscul de lezare a nodului atrioventricular și a fascicului His în disecțiile sau suturile efectuate la acest nivel. De asemenea, raportul intim al inelului mitral posterior cu traiectul arterei circumflexe nu este de neglijat.
Valva tricuspidă
Este poziționată la nivelul orificiului atrioventricular drept, orificiu cu o dimensiune mai mare decât cel stâng. Valva este constituită, după cum precizează și numele ei, din trei cuspisuri – anterioară, posterioară și septală. Cuspa anterioară este cuspa reprezentată cel mai bine. Partea bazală a cuspelor este inserată la nivelul orificiului atrio-ventricular, iar vârfurile acestora sunt inserate prin intermediul cordajelor tendinoase la nivelul mușchilor papilari.
Deși există o mare varietate anatomică în ceea ce privește numărul mușchilor papilari, de la doi până la nouă, de obicei se întâlnesc trei mușchi: anterior, posterior și septal [18]. Cuspisul septal, cel mai puțin dezvoltat din cele trei, nu este inserat la nivelul orificiului, ci la nivelul părții membranoase a septului interventricular. Astfel la acest nivel atriul drept se învecinează direct cu ventriculul stâng. Ancorarea cuspisului septal se realizează prin intermediul unor cordaje tendinoase rudimentare la mușchiul papilar posterior sau chiar la trabeculele septului interventricular. Inelul valvei tricuspide este mult mai puțin reprezentat de fibre de colagen, inserția parietală a valvei coincizând cu șanțul atrioventricular, implicit un raport strâns cu artera coronară dreaptă.
Asemenea valvei mitrale, valva tricuspidă demonstrează o mobilitate remarcabilă grație modului de ancorare a cordajelor tendinoase la valvule și a acestora din urmă la inelul valvular. Totodată, suprafața de contact cu fricțiune minimă față de fluxul sanguin și o arie de coaptare corespunzătoare a valvulelor participă la o bună hemodinamică [19].
1.2 Aspecte histologice
Valvele cardiace, părți integrante ale cordului, sunt componente care sunt în legătură strânsă cu structurile anatomice ale cordului, o parte din aspectele histologice a acestuia regăsindu-se la nivelul lor. Valvele cardiace sunt structuri vii, alcătuite din celule, matrice extracelulară și substanță fundamentală.
Manufacturarea unei valve cardiace prin bioinginerie tisulară presupune, nu doar o bună cunoaștere a anatomiei, ci și o analiză detaliată a aspectelor histologice a componentelor valvulare. Valvele semilunare, respectiv, valvele atrioventriculare, sunt asemănătoare morfologic și histologic, deși acestea funcționează în regimuri de presiune diferite [20].
Valvele cardiace native sunt exemplele ideale de hemodinamică, design, durabilitate și adaptabilitate.
1.2.1. Valva aortică
Analiza histologică a valvei aortice privește nu doar structura valvulelor, ci a întregii rădăcini aortice care participă activ la etapa proprie din cadrul ciclului cardiac. Limita anatomică a ventriculului stâng și aortă nu corespunde cu delimitarea hemodinamică pe care o realizează atașarea cuspelor asemenea unei coroane. Astfel parte din ventriculul stâng devine supravalvular, supus presiunilor aortice, respectiv baza peretelui aortic, în tringhiurile formate de inserția cuspelor, aparține ventricului stâng, supus la presiunile locale [21].
Cuspele valvei aortice sunt niște structuri complexe alcătuite din straturi externe de fibre de colagen: fibrosa către aortă și ventricularis către ventriculul stâng, susținute de un strat central intens hidratat numit spongiosa, care asigură mobilitatea straturilor externe și atenuarea forțelor în cadrul ciclului cardiac [22-24].
Componentele principale ale stratului spongiosa sunt fibrele de colagen și glicozaminoglicani (GAG), care există ca atare (acid hialuronic) sau legați de proteine (decorina, biglicani) [25-27]. Colagenul predominant este cel de tip I, element structural esențial în valvă. Elastina are specificitate pentru partea ventriculară și are un rol important în biomecanica valvei [28, 29]. Per ansamblu este evident că factorii determinanți ai durabilității valvei sunt arhitectura matricii extracelulare și componentele ei [30]. Se pare că straturile fibrosa și ventricularis exprimă proprietăți mecanice unice [31]: datorită fibrelor de colagen dispuse circumferențial, fibrosa este responsabilă per ansamblu de a face față forțelor mecanice și ventricularis asigură rezistența necesară tensiunii radiale prin densitatea mare de fibre de elastină dispuse radiar.
Celulele endoteliale acoperă suprafața cuspelor, oferind un strat protectiv, non-trombogenic. Acestea sunt capabile de a interacționa cu factori umorali și mecanici, prin expresia la suprafața lor a diverse molecule de adeziune și receptori și de a sintetiza produși activi biologic [7]. Este binecunoscut faptul că alinierea celulelor endoteliale la nivel valvular este perpendiculară față de fluxul sanguin, total opus față de poziționarea celulelor endoteliale la nivelul vaselor. Această observație nu face altceva decât să întărească ipoteza conform căreia această aliniere specifică a celulelor este determinată de forțele mecanice prezente la acest nivel, caracteristică întâlnită și la nivelul fibrelor de colagen. Singura excepție se observă la nivelul nodulilor Arantius, unde alinierea celulelor este paralelă cu fluxul sanguin [32].
Celulele valvulare interstițiale reprezintă populația de celule predominante din cadrul valvei. Acestea secretă colagen de tip I și III, glicozaminoglicani, matrix-metaloproteinaze și inhibitorii acestora și alte enzime de degradare a matricei responsabile în remodelare [33-35]. Celulele valvulare interstițiale exprimă o gamă largă de fenotipuri: pornind de la pasivii fibroblaști (caracterizați prin expresia de vimentină, antigenul de suprafață al fibroblastului și expresie scăzută alfa-actină și MMP-13), până la celulele interstițiale activate, asemenea miofibroblaștilor (caracterizați prin proliferare, migrare, înaltă expresie de vimentină, alfa-actină și MMP -13) [36-40]. Celulele interstițiale activate sunt considerate celule pivot în structura și funcționalitatea valvulară [36]. Fenotipul acestor fibroblaști este de fapt un răspuns adaptativ la acest mediu creat de matricea extracelulară, forțe mecanice, factori solubili [41].
Comunicarea dintre celule, și dintre celule și matrice este una din funcțiile pe care le îndeplinesc spre o bună funcționalitate a valvei [7]. Acest lucru se realizează prin prezența integrinelor la suprafața celulelor care acționează ca senzori și transduceri ale semnalelor mecanice produse de fluxul sanguin la interfața cu valva [7].
Aportul de oxigen se face prin două surse: vase de sânge, a căror densitate crește proporțional cu grosimea cuspei, precum și prin difuziune de la suprafață. Metabolismul valvular este mai intens decât nivelul care poate fi susținut doar prin difuziune [42, 43].
Interacțiunea dintre forțele mecanice, celulele interstițiale și matricea extracelulară influențează procesul de remodelare locală, esențială în durabilitatea valvulară. Reproducerea acestor procese și structuri stă la baza obținerii unei valve prin bioinginerie, rezultând un imens potențial terapeutic în activitatea clinică a înlocuirii valvulare.
Cuspele valvei aortice se atașează printr-o rețea densă de fibre de colagen, așa numitul „inel valvular aortic”, de musculatura ventriculului stâng, respectiv de țesutul fibros al continuității mitro-aortice [44]. Mici vase de sânge sunt prezente la acest nivel și mai mult decât atât, au fost evidențiate și structuri neuronale [19].
Arterele sunt conectate la ventriculi prin intermediul unor țesuturi asemănătoare tendoanelor, însă fără a fi bine delimitate de țesutul muscular și cel al peretelui aortic. Structura histologică a sinusurilor Valsalva respectă aranjamentul celor trei straturi ale aortei: intima, media și adventiția. Intima este acoperită de un strat de celule endoteliale, dispuse longitudinal, în fluxul sanguin, caracteristică specifică vaselor de sânge. Media este compusă din structuri dispuse circular: celule musculare netede, fibre elastice și de colagen tipul II și III și proteoglicani. Adventiția este formată din fibre de colagen de tipul I, dispuse longitudinal. Singura deosebire semnificativă față de aorta ascendentă este aceea că peretele sinusurilor este mai subțire [19, 45].
1.2.2. Valva pulmonară
Histologia valvei pulmonare este aproape identică cu cea a valvei aortice, motiv pentru care se folosește ca și substitut al celei din urmă în operațiile Ross [46].
Regimul presional scăzut și-a pus amprenta asupra morfologiei valvulare și a componentelor acesteia. Inelul valvular pulmonar este mai slab reprezentat, deși inserția semilunară a valvulelor se păstrează. Joncțiunea ventriculo-arterială este mai bine delimitată, fiecare bază a atașamentelor cuspelor depășind această linie și se ancorează în infundibulul ventriculului drept. Histologia cuspelor este asemănătoare cu cea aortică, însa densitatea fibrelor de colagen și elastice este mai diminuată.
1.2.3. Valva mitrală
Din punct de vedere histologic structura cuspelor este una duală, cu o parte spongioasă – lamina spongiosa – privind înspre atriu și o parte fibroasă – lamina fibrosa – către ventricul [19]. Spongiosa conține fibroblaști [47], celule musculare netede [48, 49] și celule miocardice [50]. Atât lamina fibrosa cât și spongiosa sunt acoperite cu un strat de celule endoteliale, în contact cu fluxul sangvin. Conținutul în fibre de colagen este cel care determină rezistența valvulară la presiunile intraventriculare. De asemenea, au fost evidențiate structuri nervoase. Valvula mitrală anterioară deține o inervație mai bogată față de cea posterioară [11]. Contracția miocitelor de la acest nivel, indusă de impulsurile nervoase, contribuie la păstrarea geometriei valvulei anterioare și de a diminua șocul mecanic produs de închiderea bruscă a valvei [51].
Cordajele tendinoase sunt niște structuri cu rezistență crescută, alcătuite din fibre de colagen și elastină, dispuse longitudinal și paralel, acoperite de un strat de celule endoteliale [16]. Arhitectura și proporția fibrelor de colagen și elastină face posibilă transmiterea forțelor de la nivelul cuspelor către mușchii papilari în timpul sistolei ventriculare. Mai mult decât atât, elastina, în diastolă, contribuie la revenirea fibrelor de colagen la configurația inițială [1, 52].
Mușchii papilari, bazele de ancorare a cordajelor tendinoase, sunt prelungiri intraventriculare a miocardului. Miocite alungite sunt dispuse paralel sub forma așa numitelor discuri intercalate, crescând astfel eficiența contracției musculare. Bogat inervați și vascularizați, mușchii papilari pot fi afectați de ischemie, care se poate manifesta funcțional prin insuficiență valvulară mitrală [1, 53].
1.2.4. Valva tricuspidă
Mult mai puțin studiată comparativ cu corespondenta ei din inima stângă, majoritatea caracteristicilor histologice sunt identice. Inelul valvular, deși mai puțin reprezentat, are, asemenea inelului valvei mitrale, o formă tridimensională, compliantă cu modificările geometrice ale ventriculului drept în fazele ciclului cardiac. Dimensiunea minimă a inelului valvei tricuspide este atinsă în timpul relaxării izovolumetrice, iar cea maximă în intervalul corespunzător contracției izovolumetrice a ventriculului drept [54].
Structura valvulelor este asemănătoare valvei mitrale, straturile spongiosa și fibrosa – o rețea densă de fibre de colagen, acoperite de celule endoteliale [19].
Aspecte fiziologice
Aceste structuri, localizate la baza marilor vase și între atrii și ventriculi, sunt definite ca și elemente cu o cinetică pasivă, o cinetică determinată de gradientele de presiune realizate de-o parte și de alta a lor.
Valvele atrio-ventriculare
Localizate la limita dintre atrii și ventriculi, acestea se deschid, permițând trecerea sângelui către ventriculi, la începutul diastole ventriculare, în timpul umplerii rapide a acestuia. Umplerea ventriculară, pune în tensiune cordajele tendinoase ducând la o reducere a orificiului util, datorită apropierii cuspelor.
La momentul sistolei ventriculare, presiunea intraventriculară o depășește pe cea atrială, ducând la împingerea cuspelor spre atrii și alipirea acestora determinând închiderea valvelor.
Elementele cu importanță în acest proces sunt reprezentate de mușchii papilari și de cordajele tendinoase. Contracția mușchilor papilari duce la punerea în tensiune a corzilor tendinoase, iar acestea împiedică răsfrângerea cuspelor înspre atrii, opunându-se regurgitării.
Valvele semilunare
Situate la limita dintre tracturile de ejecție ventriculare și marile vase, ambele sunt alcătuite din trei cuspisuri, ancorate la nivelul unor inele valvuare, aortic respectiv pulmonar. Deschiderea valvelor sigmoide se realizează la momentul ejecției ventriculare, când presiunea dezvoltată intraventricular o depășește pe care din vase. Imediat după deschidere, acestea plutesc pe tot parcursul ejecției în torentul sangvin, dar nu se lipesc de peretele arterial datorită prezenței unei regiuni mai dilatate – sinusurile.
Închiderea valvelor semilunare se realizează datorită decelerării coloanei sangvine, deteminată de scăderea presiunii intraventriculare.
Valva aortică este supusă la regimuri presionale considerabil mai mari față de valva pulmonară. Fiecare componentă a rădăcinii aortice, având proprietăți unice, conlucrează pentru a minimaliza stress-ul la nivelul cuspelor, dovedindu-se a fi eficiente într-o varietate de condiții hemodinamice [55]. Cuspele valvei aortice sunt expuse unui climat hemodinamic unic, caracterizat prin forțe de frecare, de pliere și tensionare în sens radial și circumferențial, care variază în intensitate și direcție cu fiecare ciclu cardiac [56]. Rădăcina aortică își modifică diametrul, forma și rigiditatea pentru a asigura deschiderea și închiderea valvei, coaptarea valvulelor și ejecția coloanei de sânge cu o rezistență minimă. Acest concept de dinamism activ este menținut de viabilitatea celulelor, de interacțiunea dintre ele, precum și a acestora cu matricea extracelulară. Homeostazia locală se menține în limite normale prin buna funcționare a receptorilor mecano-sensibili, a canalelor și mediatorilor paracrini, a proteinelor matricei extracelulare, a enzimelor și inhibitorilor acestora [56].
Patologia valvulară
Bolile cardiace valvulare reprezintă o problemă majoră de sănătate publică, cauzând morbiditate și mortalitate semnificativă la nivel mondial [57, 58]. În țările în curs de dezvoltare, această patologie este predominantă la pacienții pediatrici și tineri adulți, etiologia fiind de origine reumatică [59, 60]. În schimb, în țările industrializate, etiologia patologiei cardiace devine predominent degenerativă, afectând decadele 7 și peste de viață [61, 62]. Astfel, 1 din 8 oameni cu vârsta de peste 75 ani suferă de o afecțiune valvulară [63]. În condițiile creșterii speranței de viață și a îmbătrânirii populației la nivel mondial, prevalența bolilor valvulare cardiace are tendință de creștere [57].
Din datele ce provin dintr-un studiu prospectiv (Euro Heart Survey), în care au fost recrutați 5001 pacienți cu valvulopatii semnificative, din 25 de state europene dintre care și România, reiese faptul că stenoza aortică a fost cea mai frecventă (43,1%), apoi insuficiența mitrală (31,5%), insuficiența aortică (13,3%) și stenoza mitrală (12,1%). Afectarea valvulară multiplă a fost prezentă în 20% din cazuri, iar valvulopatiile cordului drept în 1,2% din cazuri [64].
Principalele cauze care duc la disfuncționalitatea valvelor cardiace sunt: calcificarea cuspelor, endocardita, febra reumatică, degenerarea mixomatoasă și malformațiile congenitale. Aceste procese pot afecta oricare din cele patru valve ale cordului, dar așa cum am amintit mai sus, valvele cordului stâng sunt cele mai susceptibile datorită regimului presional înalt al circulației sistemice.
Tratamentul valvulopatiilor
La mijlocul secolului XX s-au realizat primele încercări de corectare a valvulopatiilor, însă ratele reușitelor au fost scăzute datorită numeroaselor complicații apărute în lipsa sistemului de circulație extracorporeală. Primele proceduri folosite în tratamentul stenozelor au fost cele reprezentate de comisurotomiile pe cord închis respectiv deschis – valvulotomia realizată de Cuttler și Levine, la 1923, transformă stenoza mitrală într-o insuficiență mitrală. Dilatația digitală este realizată pentru prima dată în 1948 de Henry Souttar. Elementele ce stau la baza primelor intervenții de înlocuire valvulară sunt reprezentate de invenția sistemului de circulație extracorporeală, introducerea heparinei și a dicumarolului.
Fără îndoială, preferabil e ca aceste patologii să poată fi tratate prin diferite metode de plastie și prezervare a valvei native, ținându-se cont de afecțiunea valvei, antecedentele pacientului, vârsta și comorbiditățile acestuia [15]. Din păcate, 70% din abordările chirurgicale ale patologiilor valvulare se finalizează cu înlocuirea valvei [65]. În jur de 290.000 de înlocuiri valvulare sunt efectuate anual la nivel mondial, iar numărul se estimează a se tripla în următoarele 5 decade [66, 67].
Tabel 1. Avantajele și dezavantajele fiecărui substitut valvular comparativ cu prototipul ideal obținut prin bioinginerie tisulară (adaptat după [68])
Substituenții valvulari existenți în momentul de față sunt reprezentați de protezele mecanice și bioprotezele (valvele biologice). Protezele mecanice sunt extrem de durabile, dar creează susceptibilitate la accidente vasculare hemoragice datorită necesității terapiei anticoagulante. Evenimentele trombo-embolice se datorează forțelor de frecare mari, profilului non-fiziologic al valvei și distrucției elementelor sanguine [60]. În schimb, valvele biologice degenerează după 12-15 ani, iar necesitatea reintervenției limitează implantarea acestora la pacienți mai tineri de 65 de ani, conform rezultatelor trialurilor clinice randomizate [69, 70] și a studiilor ce au analizat efectele pe termen lung a protezelor valvulare în ceea ce privește mortalitatea și complicațiile datorate valvelor [71-73]. Avantajele și dezavantajele substituenților valvulari sunt enunțate în Tabelul 1.
În ciuda acestor rezultate, hotărârea asupra alegerii valvei se face individualizat de la un pacient la altul. Apariția celei de-a 3-a generații de valve tisulare, surclasează, aparent, protezele mecanice și pentru decada a 5-a și a 6-a de viață, însă rezultatele pe termen lung sunt așteptate. Deocamdată necesitatea reintervenției după înlocuiri valvulare cu bioproteze rămâne inevitabilă la pacienții mai tineri [74, 75]. În plus, îmbunătățirea metodelor de monitorizare a nivelului anticoagulării, necesar purtătorilor de proteze mecanice, a redus incidența complicațiilor hemoragice, fără a crește riscul trombembolic [76, 77].
O categorie aparte e reprezentată de allograft-urile valvulare. Deși există studii care prezintă rezultate rezonabile după implantarea acestora fie după decelularizare, fie după fixare cu glutaraldehide, problema disponibilității nu poate suplini necesarul în creștere.
Pentru grupul de pacienți pediatrici la care necesitatea reintervențiilor nu este de neglijat, procedura Ross [46], a adus rezultate promițătoare prin plasarea valvei pulmonare în poziție aortică. Totuși, studii mai recente, au indicat o rată de deteriorare a neo-valvei aortice, posibil datorită regimurilor presionale și a stress-ului biodinamic la care este supusă [78-81]. Graft-ul valvular implantat în poziție pulmonară necesită nu de puține ori reintervenție, ceea ce nu reduce riscul chirurgical.
Proteze valvulare mecanice
Primul prototip de proteză valvulară, imaginată la 1952 de către Charles A. Hufnagel a fost realizată dintr-un cadru de plexiglas, deținea în interior o structură de nylon îmbracată în silicon. Modelul acesta, reproducea un închizător de sticlă, brevetat în Statele Unite ale Americii încă de la 1858. Primele modele au fost introduse de Hufnagel și echipa condusă de el la nivelul aortei toracice. Datorită frecventelor complicații ca tromboza, embolismul și zgomotul comparat de pacienți „cu sunetul unei bombe”, un nou prototip se impunea să se inventeze.
Introducerea circulației extracorporeale în 1955 a reprezentat punctul de plecare a dezvoltării chirurgiei cardiace. Astfel, primele prototipuri valvulare care au asigurat supraviețuire pe termen lung au fost valvele cu bilă Starr-Edwards (Figura 4), care au fost implantate de Starr în poziție mitrală și de Harken în poziție aortică în 1960. Marele dezavantaj al acestui prototip era acela că miocardul trebuia să genereze o presiune importantă în timpul ejecției pentru a o putea deschide, astfel că gradientul de presiune transprotetic era unul semnificativ. De asemenea lovirea elementelor sangvine de componentele acesteia ducea la pancitopenie.
Valva cu bilă în carcasă Smeloff-Suttle a fost o variantă îmbunătățită, utilizând o bilă și o carcasă de dimensiuni mai reduse, însă performanțele hemodinamice s-au dovedit a fi insuficiente.
Valva cu bilă în carcasă Magovern-Cromie Sutureless a redus dimensiunile acesteia și a îndepărtat fragmente care ar putea determina pancitopenia; astfel carcasa a fost deschisă la polul apical, iar inelul pe care se realiza sutura a fost îndepărtat, acestea fiind modele care pentru implantare nu aveau nevoie de sutura convențională.
Figura 4. Tipuri de valve: valva bileaflet Saint Jude Medical (stânga sus), valva Starr-Edwards bilă în cușcă (dreapta sus), valvă biologică porcină cu stent (stânga jos), valva monodisc Bjork-Shiley (dreapta jos), adaptat după [82]
Un real progres s-a realizat cu apariția valvei cu disc Bjork-Shiley (tilting-disc) (Figura 4), folosindu-se de un mecanism de balasare a unui disc poziționat la nivelul inelului protezei, menținut în poziție de două structuri atașate inelului. Discul era fabricat din grafit și acoperit cu pirolit de carbon, iar inelul din oțel inoxidabil sau titan. Acest model venea ca și o soluție pentru creșterea dimensiunii jetului central sangvin care trece prin proteză, jet obstrucționat de prezența bilei, în cadrul modelelor amintite anterior. De asemenea și problema distrucției elementelor sangvine era redusă. Ulterior pentru a îmbunătăți performanțele hemodinamice, producătorii au imaginat un model convexo-concav, cu rezultate deloc dorite, apărând microfracturi la nivelul discului, rupturi ale elementelor de fixare a discului și în final desprinderea discului și embolizarea lui în circulație. Această valvă a fost implantată la peste 360.000 de pacienți. Momentan nu se mai fabrică, dar există companii care comercializează acest concept de valvă monodisc (de exemplu Medtronic Hall sau Aortech Ultracor).
1977, este anul în care Saint Jude Medical, introduce pe piață, valva cu același nume, bidisc (bileaflet), constituită din două hemidiscuri, care se închid și se deschid, formând un orificiu central și două periferice (Figura 4). Deși s-a reușit perfecționarea biomaterialelor folosite în alcătuirea protezelor, utilizarea terapiei anticoagulante rămâne obligatorie. De asemenea au fost îmbunătățite și proprietățile hemodinamice, existând un gradient mai redus transprotetic, iar trombogenicitatea și turbulența fluxului au fost ameliorate. În momentul actual, valva SJM este cea mai utilizată proteză în înlocuirile valvulare.
1.5.2. Valve biologice
Având în vedere dezavantajele care caracterizează protezele mecanice se impunea găsirea unei alternative pentru pacienții la care anticoagularea permanentă nu era o opțiune de dorit – vârsta înaintată, cei cu rezistență congenitală la acestea sau contraindicație de anticoagulare, iar din punct de vedere economic, soluții care să înlăture cheltuielile cu tratamentul hemoragiilor datorate supradozării, evenimentelor trombembolice și a frecventelor determinări ale parametrilor de coagulare. Astfel în 1960 au apărut primele idei și concepte referitoare la protezarea valvulară cardiacă cu valve de proveniență biologică. Perioada cuprinsă între anii 1960 și 1970 este presărată cu numeroase premiere în ceea ce privește bioprotezele valvulare. În 1962 Ross și Boyes realizează prima înlocuire valvulară cu un allograft, obținut de la cadavru. Doi ani mai târziu (1964) este implantat primul xenograft, folosindu-se o valvă aortică porcină de către Duran și Gunning. După un an (1965) se folosesc primele xenografturi pretratate cu mercur, crom și formalină realizate de echipa condusă de Jean-Paul Binet. Ross realizează la 1967 operația realizată și în prezent, a cărui nume i-a rămas de-a lungul timpului – procedura Ross, plasând valva pulmonară ca și autograft în poziție aortică, cu reimplantarea arterelor coronare. În 1968 Alain Frederic Carpentier evidențiază rolul jucat de glutaradehidă în stabilizarea xenograft-urilor. Aceasta are rol în prevenția reacției de natură imună și degradării colagenului. Glutaraldehida este o dialdehidă ce reacționează cu grupările amino libere (capetele N-terminale). Rolurile stabilizării chimice sunt multiple:
prin fixarea celulelor aflate în matrice, sunt reduse metabolismul și reactivitatea, antigenicitatea acestora [83]
scade trombogenicitatea protezei [84]
crește rezistența la degradare, îmbunătățește proprietățile mecanice [85]
sterilizează țesutul;
scade antigenicitatea țesuturilor xenografice [86]
Tipuri de bioproteze, în funcție de proveniența protezei biologice :
Valve autologe: au apărut în anii ’70, fiind realizate manual din țesut propriu non-valvular (de exemplu: fascia lata sau pericard autolog). Datorită faptului că manufacturarea ei era destul de pretențioasă, iar cele implantate s-au dovedit a avea o durabilitate extrem de limitată, utilizarea lor a încetat. Mai recent există anumite kitt-uri pe care se montează intraoperator, pericard autolog (de exemplu: Carpentier Edwards Perimount pericardial prothesis). Pericardul autolog este ușor de recoltat odată cu intervenția chirurgicală cardiacă, însă este dificil de manipulat datorită faptului că marginile au tendința de a se rula, ceea ce face procedura mai anevoioasă și consumatoare de timp [87].
Autograft-urile valvulare: descrise prima dată de Donald Ross în 1967 [46], procedură care presupune plasarea propriei valve pulmonare în poziție aortică și implantarea unui homograft în poziție pulmonară [88]. Deși a avut rezultate promițătoare, mai ales în patologia pediatrică, necesitatea reintervențiilor datorate degenerării neo-valvei aortice pe termen lung, disfuncționalității homograft-ului, și intervenția chirurgicală laborioasă (dublă înlocuire valvulară) limitează utilizarea ei. Un studiu efectuat pe 30 de pacienți pediatrici au demonstrat creșterea autograft-ului pulmonar în paralel cu creșterea somatică a pacienților [89]. Cu toate acestea, autograft-urile sunt susceptibile dilatării cu regurgitare aortică secundară [90].
Homograft-urile valvulare (sau allograft-uri): sunt recoltate în general de la cadavre, dar și de la pacienți aflați în moarte clinică sau din cordul explantat al receptorului transplantului cardiac. Sterilizarea se efectuează prin diferite soluții cu antibiotice și prin fixare sau crioprezervare [82]. Au fost utilizate pe scară largă, îndeosebi în înlocuirile de valvă aortică și pulmonară și în cazul procedurii Ross ca și substituent al valvei pulmonare [91, 92]. Homograft-urile crioprezervate nu sunt cross-linkate și manifestă proprietăți hemodinamice bune. Dezavantajul constă în disponibilitatea redusă, tehnici de implantare mai dificile și procese de degenerare imună, îndeosebi la receptorii tineri [68]. Chiar dacă performațele hemodinamice pot fi adecvate, procesele de crioprezervare și dezghețare pot produce deteriorări structurale ale matricei, reducând durabilitatea in vivo [92]. La pacienții tineri, rata de degenerare valvulară variază între 71 și 87% la 10 ani [93].
Heterograft-urile valvulare pot proveni din valve porcine (Figura 4) sau din pericard bovin. Cele porcine sunt reprezentate de valve fixate în glutaraldehidă și ancorate la un inel (Hancock II Porcine – Medtronic sau Biocor Porcine – St Jude Medical).
Cele provenite din țesut pericardic bovin sunt montate la fel pe un inel rigid. Modelul conceput de Ionescu-Shiley nu s-a dovedit mai durabil decât valvele porcine, motiv pentru care a fost abandonat. Varianta îmbunătățită de Carpentier-Edwards prin fixarea pericardului sub stent și nu prin sutura directă a cuspelor rămâne să iși dovedească durabilitatea pe termen lung. În plus, valvele de dimensiuni mici par să dezvolte gradient transvalvular semnificativ.
Valvele biologice fără stent oferă condiții hemodinamice mai aproape de valorile fiziologice, dispunând de un orificiu valvular de dimensiuni mai mari. Dezavantajul acestor proteze este faptul că necesită un chirurg experimentat și un timp de ischemie mult crescut.
Este cunoscut faptul că matrix-metalo-proteinazele sunt responsabile de degradarea și remodelarea țesuturilor. Graft-urile obținute prin cross-linking (de ex. fixare cu glutaraldehidă), inhibă acțiunea acestor proteinaze. Astfel, valva devine mai durabilă, însă incapabilă de remodelare [94], caracteristică principală a substituenților valvulari biologici actuali.
Rolul medicinei regenerative în patologia valvulară
Medicina regenerativă sau bioingineria tisulară este o tehnologie promițătoare care are ca și scop crearea unui substitut unic, optim, utilizând scaffold-uri tridimensionale sintetice sau biologice, populate cu celule stem sau celule diferențiate, capabile de regenerare, remodelare și potențial de creștere [95, 96]. Acestă ramură tehnologică a oferit deja strategii terapeutice promițătoare în tratarea a diverse țesuturi afectate. De exemplu, a fost aplicat un tratament bazat pe medicină regenerativă, în cazuri de boli degenerative sau absența congenitală a unor organe complexe precum trahea, esofagul sau musculatura scheletică [97, 98]. Primul succes, în 1994, a fost reproducerea cartilajului traheal utilizând tehnici de inginerie tisulară [99]. Ulterior, a fost abordat și aparatul cardiovascular.
Medicina regenerativă, un domeniu relativ nou al medicinei și al cercetării științifice se află într-o perpetuă căutare pentru a realiza un nou substituent valvular care prin proprietățile sale să depășească performanțele actualelor opțiuni. În acest sens cercetători din toate colțurile lumii imaginează diferite modele protetice, având ca și element comun utilizarea de celule, ca și sursă a regenerării.
Obținerea acesteia, proteza valvulară perfectă, va conferi pacientului valvular o serie de avantaje, pe care alternativele actuale nu le pot oferi: capacitatea de creștere concomitent cu rata de creștere a organismului, astfel în cazul pacienților pediatrici nu ar mai fi necesare reintervenții pentru schimbarea protezei depășite de cordul în creștere; îndepărtarea terapiei anticoagulante – odată cu endotelizarea valvei, aceasta nu mai prezintă triggeri pentru procesele coagulării; durabilitatea crescută este conferită de capacitatea de regenerare a celulelor care o populează, prin sinteza de fibre de colagen și elastină, menținând în permanență structura matricei extracelulare; nu există nici un răspuns de tip imun împotriva protezei deoarece acesta este populată de celule aparținând aceluiași pacient.
O valvă cardiacă obținută cu ajutorul ingineriei tisulare se produce prin plasarea unor celule în interiorul sau pe suprafața unui schelet, cunoscut în literatura de specialitate ca și scaffold, având o geometrie întocmai cu cea a valvei native. După plasarea celulelor la nivelul scaffold-ului, acestea vor fi menținute pentru o perioadă într-un mediu in vitro, astfel încât celulele să poată produce propria lor matrice colagenică, iar scaffold-ul inițial să se resoarbă. Întregul proces poate fi modulat prin adăugarea din exterior a diferiților factori de creștere și de diferențiere, prin modificarea parametrilor fizico-chimici. Pentru realizarea acestui prototip valvular se folosesc numeroase tipuri de scaffold-uri și celule, iar pentru precondiționarea lor, pregătirea lor pentru parametrii hemodinamici caracteristici pentru mediul in vivo, se folosesc ansambluri de dispozitive numite bioreactoare. Acestea au rolul de a simula forțele ce acționează la nivelul valvelor în circulație, în condiții normale.
Având în vedere efectele secundare ale medicației sau lipsa durabilității substituenților valvulari actuali, se impune, de urgență, o nouă terapie strategică pentru îmbunătățirea rezultatelor pe termen lung. Noile descoperiri în medicina regenerativă au permis manipularea unui spectru mai larg de celule, celule stem sau progenitoare, inclusiv celule endoteliale, mezenchimale, și plasarea lor pe diverse design-uri valvulare, fie ele biologice sau sintetice.
Substituentul valvular cardiac optim trebuie să posede următoarele caracteristici [100-103]:
absența imunogenității
potențial de creștere proporțional cu dezvoltarea somatică a pacientului
profil hemodinamic durabil excelent
disponibilitate în diverse mărimi
risc trombembolic minim, în lipsa tratamentului anticoagulant
incidență scăzută de degenerare structurală
lipsa calcificării
Aceste proprietăți sunt critice atunci când pacientul este unul pediatric, la care intervențiile trebuie să aibă efecte durabile, pentru a se evita reintervențiile riscante. Deși până acum scaffold-ul ideal nu există, progrese remarcabile s-au realizat în această direcție.
Sursa regenerării – celulele
Sursa de regenerare, elementul central al terapiei în cadrul medicinii este reprezentat de celule. Repopularea unui scaffold acelular, fie el biologic sau sintetic, se poate face în două moduri:
in vitro – culturi celulare în diferite stadii de diferențiere, de la celule stem până la celule specializate (celule endoteliale, celule interstițiale) vor fi puse în contact cu matricea extracelulară în medii de cultură corespunzătoare. Expunerea bruscă a acestui produs la factorii mecanici fiziologici, odată cu implantarea in vivo, poate conduce la decesul celulelor. De aceea procedeee de precondiționare, adică supunerea valvei, in vitro, la forțe care să mimeze mediul natural, s-au dovedit benefice. Design-ul bioreactoarelor s-a îmbunătățit constant, simularea mecanică fiind tot mai aproape de constantele fiziologice
in vivo – scaffold-ul acelular cu proprietăți mecanice și biologice adecvate va fi implantat în organismul gazdă, asteptând ca recelularizarea să se producă spontan
O soluție comprehensivă a terapiei valvulare necesită o generație de valve care să conțină celule regenerative. Pe de o parte, se pot utiliza celule stem multipotente capabile să genereze toate componentele țesutului cardiac (celule vasculare, cardiomiocite, celule stromale), iar pe de altă parte utilizarea de celule progenitoare, cu capacitate de diferențiere restricționată și predictibilă spre anumite fenotipuri celulare ar putea fi preferată din motive de siguranță și etică medicală [68].
Celulele stem
Acestea sunt definite ca și celule imature ce au capacitate de autoregenerare – multiplicare de tip mitotic cu păstrarea statusului de imaturitate și de diferențiere către diferite fenotipuri celulare, ca în final să ajungă la stadiul de celulă complet diferențiată, înlocuind celulele lipsă de la nivel tisular [104].
Aflate la limita dintre medicină și biologie celulară, reprezintă un real interes nu doar la momentul prezent, ci și în trecut, fiind prezentate ca alternative de terapie, cu foarte popularul și controversat experiment din 1997, cel al primului mamifer clonat, oaia Dolly [105].
Adițional rolului de suplinire a celulelor tisulare lipsă în cadrul organismului, este anticipat un rol în screening-ul toxicologic, precum și în dezvoltarea produselor farmaceutice [106].
Locul de recoltare al acestor celule, este diversificat incluzând organe ce derivă din toate cele trei foițe embrionare (endoderm, ectoderm, mezoderm), astfel: piele, țesut adipos, sânge, măduva osoasă, mușchi scheletic, placentă.
Scopul terapiei cu aceste celule este acela de a crea elementele matricei extracelulare, ca și suport și structură a noului organ. Pentru a duce la împlinirea acestei funcții, celulele sunt așezate inițial pe “schelete” provizorii (scaffold-uri), care pot avea fie origine sintetică [107], fie biologică [108], ce imită geometria și structura organului vizat.
Celulele stem sunt numite:
autologe – dacă provin de la același organism
allogenice – dacă provin de la un alt organism, dar din aceeași specie
xenogenice – dacă au ca și sursă un organism din altă specie [109]
Gradul de imaturitate este invers proporțional cu proprietatea de plasticitate (capacitate de diferențiere către diferite fenotipuri tisulare (Figura 5) [110].
Figura 5. Clasificarea celulelor stem bazată pe potențialul de diferențiere (adaptat după [110])
Clasificarea acestor tipuri celulare se realizează în funcție de capacitatea de diferențiere deținută, în cinci categorii [106], astfel:
Totipotente – Celule stem totipotente – după cum precizează prefixul cuvântului (toti = întreg), aceste celule se pot diferenția în oricare din celulele organismului uman. Aceste celule apar imediat după fertilizare și în primele diviziuni ale embrionului. La doar câteva zile distanță, după numeroase multiplicări, dau naștere blastocistului, o sferă alcătuită din numeroase celule. În interiorul blastocistului ia naștere o cavitate și masă celulară internă. Această masă celulară internă conține celule mai specializate decât cele totipotente – celulele pluripotente.
Pluripotente – sunt celule mai specializate, derivând din cele totipotente, sunt celulele care dau naștere celor trei foițe, sursa tuturor organelor și sistemelor: endoderm, mezoderm și ectoderm. În anul 2012 a fost decernat premiul Nobel pentru medicină lui Shinya Yamanaka și lui John Gurdon pentru realizarea primelor celule pluripotente din celule somatice cu ajutorul tehnicilor moleculare de genetică.
Multipotente – celule stem multipotente, sunt celulele cunoscute ca și celule progenitoare, având capacitatea de multiplicare și diferențiere spre diferite linii, însă acestea sunt într-un număr mai limitat, în cadrul aceluiași țesut, de exemplu: celula progenitoare hematopoietică ce formează toate linile celulare ale sângelui.
Oligopotente – celule cu o capacitate de diferențiere mai redusă.
Unipotente – diferențierea celulară se realizează doar înspre o linie.
Clasificarea în funcție de origine cuprinde [106]: celule stem embrionare, celule stem fetale, celule stem perinatale, celule stem adulte, IPs (induced pluripotent stem cells).
Celule stem embrionare – celule recoltate de la nivelul embrionului, în stadiul de blastocist (zilele 3-5 după fecundare), de la nivelul masei interne. Acestea au capacitate de diferențiere către oricare tip de celulă și țesut a organismului.
Celulele stem fetale și celulele cordonului ombilical – reprezintă candidați în terapia in utero a diverse malformații congenitale, a căror incidență a crescut datorită progresului în imagistica cardiacă prenatală. Acestea sunt capabile de diferențiere în celule endoteliale și cardiomiocite [111, 112]. Clinica Mayo a anunțat primul trial cu celule stem provenite din cordonul ombilical în terapia copiilor cu sindrom de cord stâng hipoplazic (www.mayo.edu).
Celule stem adulte – celule recoltate de la nivelul țesuturilor deja formate, având rolul de a înlocui celulele distruse în cadrul acestor țesuturi [113]. Sunt preferate țesuturi cu un turn-over ridicat, unde celulele sușă, nediferențiate reprezintă o populație semnificativă (piele, măduva hematogenă, mucoasa tractului gastro-intestinal, țesut adipos). Odată cu îmbunătățirea tehnicilor de prelevare și cultivare ale acestora, s-a reușit izolarea de celule stem adulte din orice țesut. Sunt celulele cel mai des implicate în studii preclinice și clinice din motive de siguranță și accesabilitate a țesuturilor adulte [68].
celule stem induse pluripotente (iPs – induced pluripotent stem cells) – sunt obținute prin reprogramare ex vivo de celule fetale sau adulte somatice (fibroblaști) prin intermediul vectorilor retrovirali [68]. Astfel, acestea se caracterizează prin plasticitate ridicată în celule din toate cele trei foițe embrionare, deci în toate tipurile de celule ale organismului [114, 115]. Diferențierea in vitro în celule vasculare și cardiace, înainte de transplantarea autologă [116, 117], le fac extrem de atractive în medicina regenerativă. Totuși, limitarea în aplicabilitatea clinică se datorează riscului teratogen derivat din integrarea genomică a vectorilor virali [118].
Avantajele utilizării celulelor stem adulte în comparație cu cele embrionare sunt reprezentate de imuno-compatibilitatea celulelor autologe, ușurința de diferențiere către o linie celulară și disponibilitatea acestora [119]. Celulele stem adulte localizate în afara măduvei osoase hematogene sunt denumite celule stem tisulare, celule ce se găsesc în cadrul unui microclimat – nișa (climatul celular ce înconjoară celule, oferindu-le condițiile pentru regenerare) [120].
După identificarea celui mai fezabil loc pentru recoltarea celulelor, acestea sunt izolate și multiplicate în condiții in vitro. Multiplicarea și diferențierea lor către anumite linii celulare se poate face fie prin îmbogățirea mediului de cultură cu factori de creștere și de diferențiere [121] sau prin manipulare genomică folosind implementarea de gene la nivel nuclear [122].
Suportul celulelor – scaffold-urile
Scaffold-ul, o componentă de bază a ingineriei tisulare, suportul celulelor, este microclimatul în care acestea se vor dezvolta, înmulți și specializa către stadiile finale de diferențiere.
Corespunzând cuvântului românesc “schelă”, este o structură tridimensională, poroasă și biocompatibilă, cu rolul de a oferi suport fizic celulelor și stimuli biochimici pentru o dezvoltare adecvată a celulelor ce îl populează [123-126].
Oferă un suport temporar celulelor, degradându-se și fiind înlocuit de componentele matricei extracelulare, sintetizate de către celule. Pentru o funcționare și o durabilitate adecvată este esențial ca cele două procese: cel de distrucție al scaffold-ului și cel de secreție de către celule diferențiate, să se desfășoare concomitent în mod egal, fără predominanța unuia dintre ele [1].
Celulele ce populează scaffold-ul, încep treptat să secrete proteinele matricei, înlocuind acest suport provizoriu extern cu o structură cu origine autologă. Acest proces poate să fie inițiat in vitro (în bioreactoare) și continuat in vivo sau întreg procesul poate avea loc doar in vivo.
Pentru ca această structură să fie considerată ideală, trebuie să îndeplinească o serie de proprietăți (adaptat după [127]):
Geometrie – să mimeze cât mai fidel anatomia țesutului de înlocuit
Activitate biologică – stimulează atașarea rapidă a țesuturilor pe suprafața sa (fără formare de țesut cicatriceal/fibros) și crearea de legături stabile pe termen lung care să prevină tensiuni la nivelul interfaței sau debutul unui răspuns inflamator din partea organismului gazdă.
Biocompatibilitate – abilitatea de a permite activități celulare fiziologice, inclusiv la nivel molecular, fără efecte toxice locale și/sau sistemice asupra gazdei.
Stabilitate chimică și biologică, biodegradabilitate – aceste caracteristici depind de natura aplicabilității: dacă scaffold-ul trebuie să rămână in situ pentru o perioadă nedefinită, sunt necesare materiale cu o stabilitate crescută, iar dacă scaffold-ul se dorește să fie folosit doar temporar, el trebuie să se degradeze progresiv într-o perioadă de timp prestabilită, urmand ca în final să fie înlocuit de țesut autolog.
Structură poroasă – scaffold-ul trebuie să dețină o structură poroasă cu o valoare crescută a raportului suprafață/volum. Diametrul acestor pori trebuie să fie minim 100 μm (valoarea ideală în cazul țesutului osos), care să permită penetrarea celulelor, creșterea ulterioară a țesutului, facilitarea vascularizației structurii și un transport adecvat al nutrienților.
Complianță și proprietăți mecanice – performanța mecanică a scaffold-ului, determinată de proprietățile biomaterialului și de structura poroasă, trebuie să fie suficientă încât să suporte atât manevrele procedurilor de implantare cât și stress-ul caracteristic noului țesut în care se va transforma. Este necesară complianța elastică (rigiditate scăzută) adecvată în cazul țesuturilor moi, pentru aplicațiile non-osoase.
Proprietăți biologice – proprietăți speciale, ca de exemplu: promovarea dezvoltării angiogenezei, stimularea diferențierii celulare și efectul antibacterian, se pot obține prin eliberarea din scaffold a unor ioni adecvați. Aceste proprietăți sunt de obicei adăugate scaffold-urilor din sticlă bioactivă, printr-un design atent al compoziției acesteia.
Ușurința fabricării – scaffold-ul trebuie să fie facil de ajustat în mărimi și forme potrivite pentru aria afectată sau distrusă pe care noul țesut o va înlocui.
Potențialul comercial – scaffold-ul trebuie realizat utilizând o tehnică automatizată și reproductibilă; trebuie să fie realizat și sterilizat în conformitate cu standardele internaționale pentru producția comercială și utilizarea sa clinică.
După obținerea scaffold-ului, există două tipuri de abordare pentru a realiza plasarea celulelor la nivelul acestuia, în funcție de modul în care se desfășoară aceasta:
In vitro: se utilizează un bioreactor sau alte mijloace de însămânțare, activități ce se desfășoară în laborator
In vivo: repopularea celulară se realizează prin introducerea scaffold-ului acelular în organismul gazdă, urmând ca procesul să decurgă prin mijloace fiziologice proprii organismului.
Există două mari categorii de scaffold-uri:
Scaffold-uri sintetice
Sunt realizate din polimeri, cu rețele interconectate de pori ce permit dezvoltarea, migrarea celulară și totodată aportul de nutrienți și posibilitatea de îndepartare a produșilor de catabolism a celulelor [94].
De-a lungul timpului o serie de materiale au fost investigate cu scopul de a realiza scaffold-ul ideal:
Acid polihidroxialcanoat [128]
Acid polilactic [129]
Acid poliglicolic [130]
Poliglactina [131]
Primele modele au fost cele din acid poliglicolic și din acid polilactic. Modul de resorbție a acestora se realizează prin hidroliză. Aceste tipuri de scaffold-uri aveau o serie de avantaje ca: biocompatibilitatea, absorbabilitatea și posibilitatea de atașare a celulelor. Există însă o serie de dezavantaje reprezentate de faptul că au pereți groși, nepliabili și duri [94]. Într-un final apărea fibroza ducând la remanieri ale tuturor structurilor. Ulterior s-a decis schimbarea materialului de bază, în favoarea acidului poli-4-hidroxibutirat. Încă de la primul contact cu acesta s-a putut observa faptul că este mai malebil decât cele anterioare, însă timpul pentru hidroliză era mai îndelungat [132]. Există în derulare proiecte care combină diferite tipuri de polimeri de primă generație cu poli-4-hidroxibutirat.
În încercarea de a realiza porozitatea potrivită, de-a lungul timpului au fost concepute o serie de metode, având moduri de acțiune diferite:
Extragerea particulelor minerale – sare
Înghețarea spumei gazoase [133]
Separare de fază
Uscare la rece [134]
Imprimare 3D
Sintetizare laser selectivă
Stereolitografia
Electro-spinningul
Încapsularea celulară
Pe de o parte, avantajele utilizării de polimeri sunt disponibilitatea practic fără limită a materiei prime, maleabilitatea și posibilitatea combinării a diferite concentrații de polimeri pentru obținerea unui scaffold care întrunește specificațiile de complianță a mediului în care va fi introdus. Pe de altă parte, procesul de degradare prin hidroliză poate afecta proprietățile mecanice ale structurii. În plus, există anumite suspiciuni asupra citotoxicității produșilor rezultați din degradarea polimerilor [100, 101, 135]. Spre deosebire de cele biologice, procesul de sterilizare este facil și nu există riscul de transmitere de boli.
Scaffold-uri biologice
Decelularizarea este procesul prin care se obțin scaffold-uri biologice. Prin acest procedeu de la nivelul unui țesut sunt îndepărtate celulele, purtătoare de antigene și markeri specifici, precum și microorganisme. În urma înlăturării acestora mai rămane doar structura tridimensională a țesutului, matricea extracelulară, alcătuită din colagen, fibre de elastină și reticulină, împreună cu substanța fundamentală. Un marker al eficienței procesului de decelularizare a unui țesut este analiza conținutului acestuia în acizi nucleici (ADN și ARN). O decelularizare completă elimină toate celulele țesutului, îndepărtând inclusiv și pe cele microbiologice, astfel o decelularizare perfectă implică în sine și o sterilizare a scaffold-ului.
Pentru realizarea decelularizării se folosesc diverse soluții, cu un mod de acțiune diferit:
Detergenți ionici – Sodium dodecyl sulfat; Deoxycholic acid – având proprietăți de alterare a structurii proteice, aceștia sunt considerați, detergenți mai agresivi, deținând rolul de distrugere a structurilor celulei, inclusiv a nucleului.
Detergenți non-ionici – cel mai cunoscut este Triton X-100 – sunt detergenți cu acțiune moderată, fără acțiune la nivel proteic. Efectul lor se realizează la nivelul legăturilor dintre lipide sau lipide și proteine.
Agenții de chelare – EDTA (Acidul etilendiaminotetraacetic), izolează ionii metalici divalenți (Ca2+, Mg2+) cu rol în atașarea celulelor la matricea extracelulară.
Enzime – tripsina, nucleaze – se folosesc pentru acțiunea lor proteolitică, distrugând structurile de ancorare ale celulelor la schelet și acizii nucleici de la nivel nuclear.
Sistemele de precondiționare – Bioreactoarele
În domeniul bioingineriei tisulare cardiace, bioreactorul se definește ca fiind un device capabil să asigure un microclimat biologic și fiziologic specific cordului și sistemului circulator. Mai exact, funcționalitatea acestuia se referă la capacitatea de a menține în viață, în condiții mecanice și chimice corespunzătoare, țesutul produs în laborator.
Un factor important de luat în considerare în cadrul bioingineriei tisulare cardiace este comportamenul mecanic al graft-ului. Anterior oricărei validări preclinice, performanțele dinamice ale valvei trebuie evaluate ex vivo. Această urmărire trebuie efectuată înainte și după însămânțarea cu celule, pentru a înțelege cum acestea influențează remodelarea matricei [68]. Proprietățile hidrodinamice și durabilitatea trebuie evaluate atât în condiții statice, cât și în condiții de flux pulsatil, caracteristic sistemului cardiovascular. Elasticitatea, respectiv rigiditatea sunt investigate prin teste mecanice uniaxiale și biaxiale [136].
Există două categorii de bioreactoare: statice și dinamice.
Cerințele de bază sunt reprezentate de posibilitatea monitorizării oxigenului și bioxidului de carbon dizolvat, pH, temperatură, concentrația de nutrienți [137].
Cele statice pot fi considerate simplele cutii Petri sau unele modificate în care scaffold-uri acelulare, fie ele biologice sau sintetice, pot fi populate cu celule. S-au efectuat anumite teste celulare în condiții de microgravitate sau zero-gravitate, în bioreactoare speciale, pentru a investiga comportamentul și proliferarea micro-organismelor [138].
Bioreactoarele dinamice presupun crearea unui sistem circulator închis, în care mediu de cultură să fie propulsat în regim presional pulsatil, simulând presiunea fluxului sanguin in vivo (80-120 mmHg pentru presiunea sistemică sau 20-40 mmHg pentru circulația pulmonară, frecvență de 60-90 bătăi/minut, volum bătaie de 50-60 ml) [137]. Propulsia lichidului poate să fie asigurată prin diverse tipuri de pompe (peristaltice, pneumatice sau centrifugale), iar prezența unui compartiment cu o membrană elastică care imită complianța pereților arteriali, va crea unda presională fiziologică [139]. Intercalarea de rezistențe de flux, distal de valvă, poate simula vasoconstricția periferică.
În acest sens, bioreactoarele utilizate în bioingineria tisulară a valvelor cardiace se numesc duplicatoare de puls. Deși majoritatea dintre ele se folosesc pentru teste valvulare hidrodinamice [140, 141], cele mai complexe dintre ele pot fi considerate adevărate sisteme de regenerare organică [142, 143].
Primul bioreactor de acest gen, proiectat de Sodian și echipa sa [144], a arătat că celule provenite din artera carotidă ovină însămânțate static pe un scaffold din poli-hidroxi-alcanoat și plasate în bioreactor, s-au aliniat în direcția fluxului, formând totodată un strat de colagen și glicozaminoglicani, însă fără elastină. Mai târziu, Hoerstrup [145], a folosit o combinație mai elastică de polimeri, acid poliglicolic și poli-4-hidroxibutirat, rezultând un scaffold care însămânțat static cu miofibroblaști ovini și ulterior dinamic în bioreactor cu celule endoteliale s-a dovedit disfuncțional in vivo printr-un răspuns inflamator. Numeroși cercetători au abordat acest domeniu, reușind cu succes să repopuleze scaffold-uri, fie ele biologice sau polimerice, însă odată implantate în modele animale, acestea s-au deteriorat [146].
Un pas înainte a fost ideea augmentării progresive a presiunii și frecvenței de la valori minime, care a influențat structura macroscopică și dezvoltarea tisulară [147]. Biosinteza de elastină s-a dovedit a fi mai problematică, Seliktar raportând faptul că stimularea biomecanică nu e suficientă, ci compoziția scaffold-ului deține un rol important [142]. Mai mult decât atât, s-a dovedit că simpla expunere la sisteme pulsatile nu sunt suficiente pentru regenerarea tisulară, ci e necesară aplicarea de forțe de tensiune ciclice pentru stimularea producerii de matrice extracelulară [148].
Un domeniu recent descoperit, dar în plină ascensiune, conturează un bioreactor care să poată simula acest „pattern” complex al fiziologiei aparatului cardiovascular. Dacă valvele concepute a fi implantate în circulația pulmonară sunt aproape de a fi eligibile, provocarea pentru valve aortice abia a început. Structura complexă tridimensională a valvei aortice, precum și climatul mecanic extrem al circulației sistemice, fac acest concept unul greu de atins. Nu e suficientă arhitectura scaffold-ului și repopularea acestuia. Comunicarea intra- și intercelulare prin molecule de semnalizare poate readuce balanța metabolică și mecanică la echilibrul fiziologic.
CONTRIBUȚIE PERSONALĂ
Testarea in vivo de xenografturi valvulare aortice acelulare însămânțate cu celule stem
Introducere
Obținerea unei valve cardiace prin bioinginerie tisulară reprezintă o preocupare de actualitate. Presupusele avantaje ale acestui tip de valvă înlătură neajunsurile alternativelor valvulare existente în momentul de față. Repopularea acestora cu celule autologe ar asigura durată de viață îndelungată fără risc trombogenic sau imunogenic și mai mult decât atât viabilitatea țesutului conferă adaptabilitate față de cordul receptor. De aici reiese și aplicabilitatea în patologia cardiacă pediatrică.
Numeroase modele valvulare obținute prin inginerie tisulară au fost testate in vivo pe animale sau oameni, dar rezultatele rămân încă controversate [3, 149-151].
Ingineria tisulară, știința care utilizează scaffold-uri, culturi de celule și factori de creștere mecanici sau chimici, poate oferi, cel puțin teoretic, un astfel de prototip valvular. Scaffold-urile pot fi de origine biologică, prin decelularizarea de allo- sau xenograft-uri valvulare sau sintetice constituite din polimeri. Repopularea cu celule a acestor suporturi se poate realiza cu celule aflate în diferite stadii de diferențiere: de la celulele stem cu diverse origini (măduva hematogenă, țesutul adipos) până la celule diferențiate (celule endoteliale, celule musculare netede, fibroblaști ).
Criteriile care ar trebui să le îndeplinească o valvă obținută prin inginerie tisulară sunt:
Rezistență, proprietăți mecanice și hemodinamice adecvate de a funcționa imediat după implantare.
Stabilitate chimică parțială, în sensul de a limita degenerarea, dar în același timp de a permite remodelarea și implicit, creșterea durabilității.
O suprafață indemnă care să înlăture riscul de trombogenicitate.
Un suport lipsit de elemente antigenice care să asigure non-imunogenicitatea.
Astfel, deși este unanim acceptat că un criteriu fundamental și indispensabil este hemodinamica valvei, proprietățile biologice ideale ale graftului valvular rămân, pe moment, speculative.
Am optat pentru utilizarea unui scaffold biologic, deoarece acesta respectă geometria valvei native considerată ca fiind ideală.
Allograft-urile ca sursă a scaffold-urilor, deși reprezintă o bună alternativă, au o disponibilitate limitată, ceea ce le reduce aplicabilitatea clinică.
Obținerea unei matrici extracelulare provenind dintr-un xenograft valvular ar înlătura inconvenientul indisponibilității. Alegerea unei specii animale cu o anatomie cât mai apropiată de cea umană poate reprezenta sursa acestor xenograft-uri. Multe studii au dovedit faptul că modelul animal porcin are o configurație anatomică foarte asemănătoare cu cea a omului. Inconvenientul principal al înlocuitorilor valvulari de origine xenografică este caracterul antigenic. Acest deficit poate fi exclus prin procese de decelularizare.
Limita între procedeul de decelularizare completă și supraexpunerea la diverși produși chimici și fizici a graftului, care poate degrada structura matricei extracelulare, e necesar a fi identificată.
Un alt aspect al cercetării ar fi modul de repopulare a scaffold-ului acelular. Sursa celulelor, modul de propagare, necesitatea diferențierii celulare in vitro sau a precondiționării valvei înainte de implantare sunt subiecte care le vom discuta în studiul de față.
Ipoteza de lucru
Ne-am propus să validăm acest scenariu prin testarea in vivo, pe un model animal ovin, a unui xenograft valvular porcin decelularizat, însămânțat cu celule stem provenite din țesut adipos propriu gazdei (Figura 6). Animalul va fi urmărit timp de șase luni în ceea ce privește funcționalitatea valvei. Au fost implantate 7 conducte valvulate, dintre care 6 însămânțate cu celule stem autologe, constituind grupul de lucru, și un conduct valvulat acelular, reprezentând animalul de control.
Avantajele utlizării unui scaffold biologic sunt disponibilitatea, prezervarea structurii matricei extracelulare ceea ce se traduce printr-o hemodinamică corespunzătoare și prezența nișelor restante dupa procesul de decelularizare care poate favoriza repopularea celulară [152-154].
Pentru a preveni degradarea prematură a scaffold-ului, retracția cupselor și calcificarea, în cursul decelularizării a fost adoptată și o stabilizare tisulară cu ajutorul penta-galloyl glucozei (PGG) [155-157].
Însămânțarea cu celule, capabile de a resintetiza componentele matricei extracelulare, a scaffold-ului decelularizat, pare a fi crucială în prevenția degenerării structurale a graft-ului [158].
Repopularea scaffold-urilor s-a realizat prin însămânțarea de celule stem derivate din țesutul adipos propriu organismului în care a fost implantat xenograft-ul valvular. Alegerea acestei surse celulare s-a facut datorită ușurinței cu care se poate obține un număr mare de celule, datorită plasticității și capacității de a se diferenția în celule specifice țesutului valvular [159, 160].
Figura 6. Planul general de lucru. (1) Berbecuți de 25-35 kg sunt aduși în biobază și pregătiți pentru operații. (2) Se colectează țesut adipos (2-3 grame) din zona interscapulară de la fiecare animal. (3-4) Se izolează celule stem din țesut adipos, se cultivează și propagă in vitro. Se menține evidența fiecarei culturi, pentru a implanta valve însămânțate doar cu celule stem autologe. (A) valve de porc se decelularizează separat și extemporaneu în aparatul de decelularizare prin perfuzie. (5) Celulele stem se injectează în valvele de porc decelularizate. (6) Valvele însămânțate se condiționează mecanic în rotator. (B) Pericard bovin se decelularizează separat și extemporaneu prin imersie. (7) Valva însămânțată și condiționată se montează în conduct de pericard decelularizat. (8) Conductul conținând valva decelularizată injectată cu celule autologe se implantează ca un shunt extra-cardiac între ventriculul drept (VD) și artera pulmonară (AP).
Materiale și metode
Obținerea xenograft-urilor aortice: decelularizare și stabilizare
Au fost recoltate corduri porcine de la un abator local, imediat după sacrificarea animalului și transportate în gheață în laborator.
Rădăcina aortică este izolată de la nivelul cordului. Limita superioară este la 2 cm deasupra joncțiunii sino-tubulare, subvalvular păstrându-se 4 cm de țesut miocardic, respectiv valvula mitrală anterioară. Țesutului miocardic i-am redus grosimea până la 2 mm, devenind astfel concordant cu grosimea valvulei mitrale anterioare. Acestă bază de țesut subvalvular este necesară fixării valvei în aparatul folosit pentru decelularizare. Se verifică integritatea valvulelor (fără bicuspidie valvulară, fără cuspe sudate sau perforații, deschidere corespunzătoare, cu bună suprafață de coaptare). Se ligaturează partea proximală a arterelor coronare cu fir de Ticron 2.0.
Sistemul de decelularizare a rădăcinii aortice prin perfuzie
Pentru o decelularizare completă am folosit, în laboratorul nostru – TERMLab (Tissue Engineering and Regenerative Medicine Laboratory – Catedra de Anatomie, UMF Tg. Mureș), sistemul PDcell (Aptus Bioreactors, Central, SC, USA).
Rădăcinile aortice sunt expuse la soluții de detergenți, agenți chelatori și enzime prin presiune ciclică și perfuzie cu o pompă peristaltică. Rădăcinile aortice sunt montate la partea inferioară (baza) pe inele speciale din metal și la partea superioară (aorta) pe o montură tubulară, care permite fluxul de fluide unidirecțional prin valvă (Figura 7 –a). Lumenele arterelor coronare fiind obturate, iar fluxul lichidului fiind controlat, se poate obține un gradient presional între interiorul și exteriorul rădăcinii aortice.
Figura 7. Montarea rădăcinilor aortice în sistemul de decelularizare: a – fixarea bazei rădăcinii la inelul metalic și conectarea tubulaturii la capătul distal al aortei; b – ocuparea celor 5 poziții de decelularizare; c,d – vedere de sus, respectiv de jos a sistemului complet montat.
Sistemul de perfuzie manufacturat din inox, acril și policarbonat este conceput să perfuzeze până la 5 rădăcini aortice (Figura 7 – b,c,d). Sistemul utilizează o pompă peristaltică, un rezervor, o valvă de reducție care creează presiune și două compartimente (unul cu presiune mare în compartimentul inferior și intra-aortic și unul de presiune joasă în compartimentul superior, extraaortic) care toate împreună direcționează fluxul prin și în exteriorul valvelor. Astfel sistemul expansionează ciclic rădăcinile aortice favorizând difuziunea lichidelor transmural (prin peretele aortic), cuspele fiind prezervate de gradient presional.
Aparatul este dotat cu două transductoare de presiune care afișează permanent presiunile intra- și extravalvulare, implicit și gradientul presional, prin interfața computer tip Labview (Figura 8).
Figura 8. Interfața LabView de monitorizare a presiunii în procesul de decelularizare: linia galbena reprezintă presiunea intra-aortică (84 mmHg), cea verde, presiunea extra-aortică (30 mmHg), cea roșie semnificând gradientul de presiune transmural (54 mmHg)
La fiecare 30 secunde, tractul de ejecție este oburat de o supapă pentru 2 minute și valva este supusă unui gradient de presiune de 40-60 mmHg (timp în care rădăcina aortică se extinde) după care urmează 30 secunde de relaxare, după care ciclul se reia.
Pentru studiul de față am realizat patru cicluri de decelularizare, din care au rezultat 20 rădăcini aortice decelularizate. La finele fiecărui ciclu s-a realizat histologia uneia din cele 5 produse obținute pentru controlul calității.
Procedura de decelularizare a rădăcinii aortice prin perfuzie
Se pregătesc 5 rădăcini aortice, se spală de trei ori cu apă bidistilată și se montează în inele metalice – Figura 9 – A, B, C.
Se asamblează aparatul de decelularizare și se calibrează transductorii de presiune – Figura 9 – D.
Se introduce în sistem azidă de sodiu 0.02%, perfuzată cu presiune ciclică timp de 24 de ore.
Se drenează circuitul și se reumple cu hidroxid de sodiu 0,1 M, se perfuzează timp de două ore.
Se îndepărtează reziduurile de NaOH prin spălarea circuitului cu apă bidistilată.
Se introduce soluția de decelularizare compusă din 50 mM TRIS, 1% SDS, 1% DOC, 1% Triton X100, 0.2% EDTA, pH 7.4±0.05, în 4L de apă bidistilată necesari umplerii sistemului.
Se perfuzează sistemul cu presiune ciclică timp de 16 zile, cu schimbarea soluției de decelularizare la fiecare 4 zile.
După spălarea circuitului cu apă bidistilată, se perfuzează azidă de sodiu 0.02% timp de 20 de ore.
Azida de sodiu 0.02% este reintrodusă în sistem după o perfuzie de etanol și o spălare cu apă bidistilată.
Se perfuzează azidă de sodiu în 1xDPBS pentru 20 de ore.
RN-ază – DN-ază timp de 4 zile la 37⁰C.
Azidă de sodiu 0.02% în 1xDPBS pentru 20 de ore.
Sterilizare cu acid peracetic 0.1%, ulterior cu plasarea valvelor în recipiente sterile în 1xDPBS timp de 20 de ore pe agitator.
Înlocuirea 1xDPBS cu 0.15% PGG. Învelirea recipientelor cu folie de aluminiu, plasare pe agitator timp de 22 de ore.
Pasul ”Rapid-Glut” prin imersia valvelor timp de 15 minute în glutaraldehidă 0.7%.
Neutralizare cu soluție de glicină 1%, două cicluri a câte 15 minute.
Conservarea valvelor la 4⁰C în soluție de 1xDPBS, până la trei luni.
O valvă se analizează macroscopic și histologic pentru controlul calității decelularizării – Figura 9 – E, F, G, H.
Figura 9. Procesul de decelularizare și caracterizarea rădăcinilor aortice postprocedural: A-C Disecția și montarea rădăcinilor aortice porcine, prin fixarea bazei în inele metalice și canularea porțiunii distale aortice; D – sistemul de decelularizare în funcțiune; E – prezervarea structurii valvulare postprocedural; F – cuspă valvulară aortică înainte (stânga) și după (dreapta) decelularizare; histologie reprezentativă a cuspei cu colorația tricromă Masson, înainte (G) și după (H) decelularizare (colagen – galben, elastina – maro)
Testarea mecanică
S-au aplicat teste mecanice radiale și circumferențiale comparative asupra cuspelor (n=5) native, decelularizate și decelularizate + stabilizate cu PGG, conform protocolului [161].
Analiza ADN
ADN a fost extras din peretele aortic, sinus, cuspă și țesut muscular subvalvular (n=4) și purificat cu Dneasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) înainte de a fi analizat prin electroforeză în gel de agaroză. De asemenea probele au fost cuantificate prin citirea absorbției la 260 nm cu NanoDrop 2000c (Thermo Scientific). Cantitatea de ADN a fost exprimată în ng⁄mg țesut uscat.
Histologie și imunohistochimie
Pentru analiza histologică, probele colectate de la nivelul peretelui aortic, sinus, cuspă și țesut muscular au fost fixate în formalină 10%, apoi în parafină pentru a realiza secțiuni de 5 µm, colorate cu hematoxilină eozină (H&E) și DAPI pentru nuclei și Pentacrom Movat pentru analiza de ansamblu. Pentru cuantificarea componentelor matriceale s-au utilizat: colorația Voerhoff van Gieson pentru fibrele elastice, colorația tricromă Masson pentru fibrele de colagen și albastru alcian pentru glicozaminoglicani⁄proteoglicani.
Imunohistochimia a fost realizată pentru colagen de tipul IV.
Celule stem: recoltare, cultură, însămânțare
În prima fază s-au efectuat câteva recoltări de țesut adipos de la ovine de 30-35 kg, din diferite zone anatomice. S-au disociat celulele stem cu colagenază și s-au cultivat în mediu de cultură pentru studii in vitro. La finele studiului s-a ales zona interscapulară ca zonă de preferință pentru recoltarea de celule stem. Regiunea de recoltare a fost aleasă după mai multe considerente: accesul la partea dorsală presupune o poziționare mai facilă a animalului pe masa de operație, iar după recoltare un risc infecțios mai redus până la vindecarea plăgii. Regiunea interscapulară deține un țesut adipos mai bine reprezentat, față de regiunea perilombară (2 culturi eșuate de la acest nivel, fără izolare de celule stem după prepararea țesutului). Având în vedere că celulele stem din țesutul adipos sunt de tip pericite (celule progenitoare rezidente în jurul capilarelor), s-a urmărit colectarea de țesut adipos cât mai vascularizat. S-a evitat regiunea ventrală/inghinală datorită potențialului infecțios, atât pre- cât și post-recoltare.
Protocol recoltare tesut adipos de la ovine
1. Sedare 0,04-0,05 mg/kgC Detomidina, ulterior pe masca cu Sevoflurane.
2. Animalul se rade în zona de elecție, se realizează antisepsia tegumentului cu Betadine.
3. Izolare cu câmpuri sterile; incizia tegumentului și disecția țesuturilor până la țesutul subcutanat.
4. Se reperează țesutul adipos bine vascularizat – Figura 10 – a.
5. Țesutul adipos recoltat se introduce în mediul de cultură steril și se transportă rapid la laborator – Figura 10 – b.
6. Antiseptizarea zonei și închiderea plăgii cu fire izolate. Aplicare antiseptic local.
7. Administrare Atipamezol în doza de 1:1 față de doza de sedare cu Detomidina pentru trezire.
8. Administrare antialgic intramuscular. Supravegherea funcțiilor vitale ale animalului.
După recoltarea țesutului adipos (aprox. 1 cm3), celulele stem au fost izolate utilizând colagenaza [162]. Pe scurt, acest procedeu presupune mărunțirea țesutului adipos recoltat (Figura 10 – c), incubarea acestuia timp de o oră în colagenază tip I într-o soluție tampon (PBS), adăugând și 1 mM de CaCl2, centrifugare pentru separarea celulelor stem de adipocite și plasarea în flask-uri. În condiții standard de culturi celulare (incubator – 37oC și 5% CO2) (Figura 10 –d), s-au realizat 4-5 pasaje până la obținerea numărului de celule necesare (Figura 10 – e). Fiecare flask a fost atent marcat cu numărul de identificare a animalului pentru ca valva însămânțată cu celulele respective, să se întoarcă în organismul gazdă.
După tripsinizarea culturii de celule, acestea au fost centrifugate și resuspendate în 3 ml de mediu de cultură.
Figura 10. Recoltare, cultură și însămânțarea celulelor stem: a. Recoltare țesut adipos subcutanat; b. Introducerea țesutului adipos în mediul de cultură; c. Procesul de izolare al celulelor stem din țesutul adipos; d. Cultura de celule stem în incubator; e. Aspect microscopic în contrast de fază al celulelor stem; f. Însămânțarea internă în cuspele valvei; g. Însămânțare externă prin plasarea conductului valvulat în suspensie de celule (preluat din [163])
Însămânțarea scaffold-ului acellular s-a realizat atât intern, prin injectare directă în baza cuspelor – minim 5 mil. celule/cuspă, utilizând un ac de 30G, cât și extern, prin suspendarea de celule în mediul de cultură în care va sta valva până la implantare (în incubator la 37oC și 5% CO2)(Figura 10 – f, g). Fiecare valvă însămânțată, pregătită de implantarea in vivo, a avut o alta echivalentă (martor), care a fost trimisă spre examinare histologică.
Pentru a demonstra abilitatea celulelor izolate spre mai multe linii celulare, am utilizat kit-uri de diferențiere (PROMO CELL) ce conțin amestecuri de factori de creștere care determină celulele stem adulte să se diferențieze separat în adipocite, osteoblaste și condrocite. La finele perioadei se colorează cu colorații histologice specifice pentru lipogeneză, condrogeneză și osteogeneză.
Pentru studiul de față s-au realizat 6 culturi celulare, urmate de însămânțarea lor în scaffold-urile obținute prin decelularizare. Implantarea acestora in vivo s-a efectuat în animalele din care au provenit celulele.
Realizarea conductului valvulat
În ideea testării valvelor elaborate de noi în poziție pulmonară, am optat pentru implantarea unui conduct valvulat, amplasat extra-anatomic între ventriculul drept și trunchiul pulmonar.
Pentru realizarea acestuia am folosit pericard bovin decelularizat [164], un țesut areactiv, nonimunogen, permisiv proceselor de endotelizare trans-anastomotică. Astfel, am inserat rădăcina aortică prin sutura (Surjet cu fir Polipropilenă 6.0) extremității proximale și distale a acesteia la un conduct pericardic, corespunzător diametrului valvei (Figura 11).
Pericardul bovin conține o densitate mai mare de proteine structurale, dispuse multistratificat, comparativ cu pericardul uman, care îi conferă proprietăți elastice adecvate geometriei complexe a tractului de ejecție a ventricului drept [87, 165].
Figura 11. Manufacturarea conductului valvulat: (a.,b) Aparat valvular decelularizat; (c) Pericard bovin decelularizat; (d) Sutura proximală; (e) Expunerea extremității distale a rădăcinii; (f.,g) Sutura distală; (h) Închiderea conductului; (i) Aspect final conduct valvulat (preluat din [163])
Implantarea conductului valvulat în animalul de experiență
Procedurile chirurgicale s-au desfășurat în cadrul Stației Experimentale a UMF Tîrgu Mureș respectând ghidurile de specialitate (Guide for the care and use of laboratory animals – NIH Publication No. 85-23, revised 1996), protocol acceptat de Comisia de Etică a Universității de Medicină și Farmacie Târgu Mureș (AUP #8/04.02.2012).
Implanturile au fost efectuate pe 7 berbeci tineri (25-35 kg), procurați de la o fermă locală. După examenul clinic efectuat de medicul veterinar și deparazitare internă și externă, berbecii au fost plasați în țarcuri special amenajate și pregătiți pentru intervenția chirurgicală.
La 6 dintre aceștia li s-a implantat un conduct valvulat însămânțat cu celule stem, iar unul a fost animalul de control la care s-a introdus un conduct valvular acelular.
Protocolul anestezic
În ziua precedentă intervenției, animalele au fost supuse la dietă alimentară și cu șase ore înainte, la restricție lichidiană.
Premedicația constă în administrarea de Detomidina 0,04-0,05 mg/kgC sau Medetomidina 0,03-0,05 mg/kgC, i.m. cu 30 de minute înainte de inducție.
Se amplasează cateter venos periferic de 18G la nivelul venei brahiale stângi. Inducția se realizează prin administrarea intravenoasă de:
1. Atropina 0,02 mg/kgC
2. Propofol 1 mg/kgC
3. Ketamina 0,04 mg/kgC 12
Se intubează orotraheal animalul, cu canula cu balonas, cu diametrul de 8-8,5 și se ventilează mecanic în mod controlat de volum cu Vt de 10 ml/kgC, frecvența respiratorie de 18/min, PEEP de 3 cm H2O, cu amestec de aer 60% și oxigen 40%. Se decomprimă rumenul prin introducerea unei sonde Faucher.
Menținerea anesteziei s-a făcut pe pivot volatil cu Sevofluran 1,5%-2.5% și bolus de Propofol 1mg/kgC repetat la nevoie (40-50 min). Se asigură analgezia cu Ketamina 0,04mg/kg C la 30 minute iar relaxarea musculară prin administrarea unei doze de Atracurium de 0,5 mg/kgC administrată în momentul inciziei chirurgicale.
Necesarul de lichide se asigură prin infuzie continuă de soluții cristaloide, Ringer lactat și glucoză 5% într-un ritm de 10 ml/kgC/h ajustat în funcție de necesități. Se menține temperatura constantă atât cu ajutorul încălzitorului extern cât și prin administrare de soluții încălzite.
Trezirea/reversia anesteziei: s-a administrat ultima doză de Propofol cu 60 de minute înainte de sfârșitul operației, menținând concentrația de Sevofluran de 1% până în momentul suturii la piele. S-a administrat analgezie postoperatorie, antiinflamatorii nesteroidiene și s-a ventilat manual animalul cu oxigen în concentrație de 100% până la trezirea acestuia. Vt spontan de 10ml/kgC, rată respiratorie 20-25/minut. S-au aspirat secrețiile bucale și faringiene și animalul a fost extubat în momentul în care și-a reluat mișcările de rumegare/masticație.
Monitorizarea intraoperatorie a parametrilor hemodinamici, electro-fiziologici, respiratori, temperatura și diureza s-a realizat prin (Figura 12):
-ECG-3 derivatii
-Tensiunea arterială invazivă – pe cateter arterial 20 G montat pe artera femurală stângă
-Presiunea venoasă centrală – pe cateter 8 F, 4 lumene montat pe vena jugulară externă stângă, fixat la 15 cm de locul puncției
-Saturația oxigenului prin plasarea unui pulsoximetru la nivel lingual.
-Temperatura centrală prin plasarea senzorului de temperatură la nivel esofagian
-Diureza prin intermediul unui cateter Foley.
Figura 12. – Pregătirea preoperatorie – a. Stația experimentală UMF Tîrgu Mureș; b. Animal intubat oro-traheal, pulsoximetru lingual; c. Cateter venos periferic la nivelul venei brahiale stângi; d. Imagine de ansamblu: intubare oro-traheală, cateter venos central și periferic, monitorizare ECG, pulsoximetrie (preluat din [163])
Protocolul chirurgical
Animalul se poziționează în decubit lateral drept. După realizarea antisepsiei regionale cu Betadine, se izolează locul de incizie cu câmpuri sterile.
După incizia tegumentului pe o lungime de aproximativ 10 cm, se disecă planurile anatomice (subcutan și cele două planuri musculare). Se practică toracotomie laterală stângă prin spațiul intercostal III. Prin incizia pleurei parietale, reclinul lobului pulmonar superior stâng se practică pericardiotomia, care expune în prim plan tractul de ejecție al ventriculului drept cu emergența trunchiului pulmonar.
Se administrează sistemic 2,5 mg/kgc heparină. Se clampează lateral ventriculul drept și se efectuează ventriculotomie pe aproximativ 3 cm.
Se anastomozează capătul proximal al conductului valvulat la acest nivel prin sutură continuă Surjet cu fir Polipropilenă 4.0, armată pe bandeletă de Teflon, ulterior anatomoza capătului distal la trunchiul pulmonar în aceeași manieră (sutură Surjet cu fir Polipropilena 5.0), după prealabila clampare laterală a acestuia.
După declampare, se practică ligatura trunchiului pulmonar la origine, obținându-se astfel redirecționarea întregului flux sanguin prin conductul valvulat (Figura 13).
Figura 13. – Timpii operatori ai implantului conductului valvulat în poziție pulmonară extra-anatomică: a. Expunerea tractului de ejecție al ventriculului drept și trunchiului pulmonar; b. Clamparea laterală a ventriculului drept și ventriculotomia; c. Anastomoza proximală a conductului prin sutura Surjet cu fir Prolene 4.0 armată pe bandeletă de teflon; d. Clamparea laterală a trunchiului pulmonar; e. Aspectul final al conductului implantat; f. Ligaturarea arterei pulmonare native și măsurarea gradientului transvalvular pre-și postligaturare; g. Parametrii măsurați intraoperator; h. Animal postoperator (preluat din [163])
Se măsoară invaziv presiunea intraventriculară dreaptă și în trunchiul pulmonar, atât înainte cât și după ligatura trunchiului pulmonar, pentru aprecierea gradientului transvalvular, precum și identificarea vreunei modificări de hemodinamică. Se verifică etanșeitatea suturilor, cu controlul hemostazei. Pericardul și pleura stângă se lasă deschisă pentru evitarea tamponadei cardiace. Drenajul cavității pleurale stângi se realizează prin contraincizie. Expansionarea plămânului se practică înaintea costo-adducției. Refacerea planurilor prin sutură în straturi anatomice, plasarea de fire izolate la tegument și antiseptizarea tegumentului încheie intervenția chirurgicală.
Îngrijirea postoperatorie
Drenajul toracic a fost suprimat după 24 ore sau adaptat după caz. Ulterior animalul a fost mutat într-un țarc individual, cu monitorizarea frecvenței cardiace și respiratorii, saturație de oxigen, temperatura, diureză și i s-a administrat medicația standard (antibiotic, antialgic, antiinflamator, diuretic, anticoagulant cu heparină fracționată, antiagregant și corticoterapie), adaptată după caz. Anticoagularea s-a administrat o lună postoperator, iar antiagregarea a la long. Funcționalitatea xenograft-ului implantat a fost evaluată periodic prin echocardiografie transtoracică sub sedare (contractilitate globală, dimensiunea cavităților, măsurarea gradientului și velocității fluxului sanguin în conduct, aprecierea gradului de insuficiență valvulară, mobilitatea cuspelor).
Rezultate
Eficacitatea decelularizării prin sistemul de perfuzie
Macroscopic, rădăcinile aortice au părut a fi intacte după protocolul de decelularizare comparativ cu țesutul nativ. S-a observat decolorarea acestora îndeosebi la nivelul țesutului muscular.
Probe din cuspă, țesut muscular, sinus și perete preluate la 8 și 16 zile de perfuzie și probe după decelularizare prin imersie au fost analizate în vederea identificării prezenței de celule prin histologie și analiza ADN și comparate cu țesutul nativ. Colorația DAPI a evidențiat lipsa nucleilor de la nivelul cuspelor, țesutului muscular și sinusurilor după procedura de imersie și după 8 zile de perfuzie. Însă la nivelul mediei peretelui aortic a fost observat un număr mare de nuclei celulari, ceea ce semnifică o difuziune insuficientă a soluțiilor de decelularizare prin peretele mai gros, dens și bogat în fibre elastice. După expunerea țesuturilor la perfuzie timp de 16 zile, colorația DAPI nu a marcat nuclei la nivelul mediei, ceea ce demonstrează o decelularizare completă (Figura 14) [166].
Acest aspect a fost confirmat și prin colorația hematoxilină eozină. Analiza ADN impune utilizarea tratamentului cu nucleaze pentru validarea datelor histologice după 16 zile de decelularizare prin perfuzie (Figura 15).
Figura 14. Rezultatele decelularizării: A 1-2 Aspect macroscopic rădăcina aortică nativă; A 3-4 Aspect macroscopic rădăcină aortică decelularizată; B Primul rând sunt imagini histologice (colorația DAPI – nucleii sunt marcați cu albastru) reprezentative pentru toate componentele rădăcinii aortice. Rândul al 2-lea reprezintă decelularizarea prin imersie, rândul al 3-lea decelularizare prin perfuzie la 8 zile (D8) – care evidențiază celule remanente la nivelul peretelui aortic, indicate de săgeți. Rândul al 4-lea sunt imagini după 16 zile de decelularizare prin perfuzie (D16) care demonstrează lipsa completă a nucleilor la nivelul tuturor componentelor rădăcinii aortice (adaptat după [166])
Figura 15. Histologia rădăcinii aortice decelularizate. A – Colorația H&E evidențiind histologia rădăcinii aortice native, după 8 zile (D8), respectiv după 16 zile (D16) de decelularizare prin perfuzie. Săgeata localizează nuclei remanenți în D8. B – Nu se evidențiază nuclei remanenți după D16 în toată grosimea peretelui aortic (L – lumen, Adv – adventiția). H&E marchează nucleii cu albastru și matricea extracelulară în roz (adaptat după [166])
Figura 16. Histologia rădăcinii aortice pre- și post decelularizare. A – Colorația pentacromă Movat evidențiază colagenul în galben, elastina în maro și celulele musculare în roșu. D8 – 8 zile de decelularizare. D16 – 16 zile de decelularizare. B – Imagini reprezentative de IHC pentru colagen de tipul IV, a rădăcinii aortice native, respectiv după 16 zile de decelularizare prin perfuzie – maro: reacție IHC pozitivă, albastru: nuclei. Inserțiile: imagini IHC negative de control (adaptat după [166])
Colorația pentacromă Movat pune în evidență prezervarea integrității matricei extracelulare, a fibrelor de colagen și elastină, fără modificări vizibile în structura tisulară după decelularizare completă (Figura 16 – A).
IHC evidențiază prezervarea fibrelor de colagen IV la nivelul membranei bazale (Figura 16 – B).
Glicozaminoglicanii deși prezenți în toate secțiunile de țesut nativ (albastru cu Movat), nu au mai fost detectați după decelularizare. Această observație a fost confirmată și prin analiza digitală a imaginilor secțiunilor colorate separat pentru fibrele elastice, colagen și glicozaminoglicani (Figura 17).
Figura 17. A – Colorația H&E a componentelor rădăcinii aortice înainte (Nativ) și după procesul de 16 zile de decelularizare. A se observa conservarea fibrelor elastice și de colagen și lipsa glicozaminoglicanilor (GAG) după decelularizare. B – Cuatificarea cantității de fibre elastice, colagen și glicozaminoglicani înainte (albastru) și după (roșu) decelularizare (adaptat după [166])
Rezultatele cantitative au arătat o conservare excelentă a fibrelor de elastină și colagen (p≥0,05) și o reducere semnificativă statistic a conținutului de glicosaminoglicani după decelularizare completă (p≤0,05), în concordanță cu rezultatele din literatură privind scaffold-urilor decelularizate [152, 167, 168].
Proprietățile mecanice biaxiale a cuspelor acelulare și a celor tratate în plus cu PGG nu au fost diferite din punct de vedere statistic când au fost testate în direcție radială sau circumferențială (Figura 18).
Figura 18. Testarea mecanică comparativă a cuspei native, decelularizate și decelularizate + PGG
De asemenea, parametrii hemodinamici incluzând și aria de deschidere a valvei au fost prezervate la testarea în bioreactor [166].
Celule stem: izolare, cultură, însămânțare
Recoltarea țesutului adipos a decurs fără incidente. Sedarea ușoară a animalelor nu le-a afectat în nici un fel funcțiile vitale, imediat după administrarea antagonistului, reluându-și activitatea fiziologică. Nu s-au evidențiat infecții la nivelul plăgii, iar firele au fost extrase după 10 zile.
Izolarea celulelor stem din țesutul adipos proaspăt recoltat s-a realizat conform protocolului. Din toate recoltările efectuate au rezultat culturi celulare cu obținerea numărului de celule necesar pentru însămânțare. Nu s-a observat contaminarea culturilor celulare.
Celulele stem adulte izolate de noi din țesut adipos ovin și menținute în cultură înainte de implantare și-au păstrat plasticitatea și capacitatea de diferențiere, demonstrat prin utilizarea kit-ului de diferențiere PROMO CELL. Acest test confirmă proprietățile biologice ale celulelor stem ovine, ele fiind capabile în prezența factorilor de creștere corespunzători să se diferențieze pe linia adipocitară, condrocitară și osteocitară (Figura 19).
Însămânțarea rădăcinilor aortice s-a realizat conform protocolului, cu maxim două zile anterior implantării.
Figura 19. Celule stem adulte și capacitatea lor de diferențiere: a – celule stem adulte în microscopie în contrast de fază; b – diferențiere pe linia adipocitară (colorație Oil Red O); c – linia condrocitară (colorația Alcian Blue); d – linia osteoblastică (colorația Alizarin Red S)
Implantarea xenograft-urilor valvulare
Intervențiile chirurgicale au decurs fără incidente sau accidente. Nu s-a înregistrat nici un deces intraoperator.
Recuperarea postoperatorie a fost rapidă, după suprimarea drenajului toracic la 12-24 h după intervenție. Alimentația a fost reluată la normal din ziua următoare. Animalele și-au reluat activitatea fiziologică, nefiind înlesnite în vreun fel de prezența cateterului venos central pe care s-a administrat tratament antibiotic preventiv timp de 5 zile și antialgice la nevoie, după caz. Nu s-au observat infecții la nivelul plăgii.
Examenul clinic zilnic nu a identificat afecțiuni respiratorii, cardiace, digestive sau de altă natură, afebrilitate. Frecvența respiratorie, cardiacă, saturația oxigenului au fost în limite normale, iar diureza păstrată.
Prima ecocardiografie transtoracică efectuată în decursul primei luni postoperator, nu a decelat modificări semnificative, cu valva implantată normofuncțională, cord cu contractilitate păstrată, fără spațiu pericardic patologic.
Urmărirea postoperatorie
Echocardiografia transtoracică s-a efectuat lunar la toate animalele.
Evoluția a fost însă diferită la cei 6 berbeci cu valve însămânțate cu celule stem, față de cel de control (valvă decelularizată acelulară). La cea din urmă, echografiile au pus în evidență un conduct valvulat normofuncțional, fără semne directe sau indirecte (cavități drepte nereacționate) de stenoză sau insuficiență valvulară. Clinic cu evoluție bună, dezvoltare somatică fiziologică, iar parametrii hemodinamici, respiratori, diureză în limite normale.
La celelalte 6 animale, evoluția a fost progresiv nefavorabilă, începând cu săptămâna a 4-a. Clinic, animalele au inceput să manifeste dispnee și să acumuleze lichid de ascită (semne de insuficiență ventriculară dreaptă). Paraclinic, cu saturația de oxigen în ușoară scădere, iar ecografic s-a decelat îngroșarea progresivă a cuspelor, cu diminuarea mobilității lor, ceea ce a condus la stenoză și insuficiență valvulară semnificativă (Figura 20 – 1, 2), aspect ce s-a corelat cu simptomatologia.
Analiza explantelor
Luând în considerare, evoluția nefavorabilă a animalelor cărora li s-au implantat scaffold-uri acelulare însămânțate cu celule stem, în funcție de starea lor clinică, am eutanasiat câte 2 animale la 1, 3 și respectiv 4 luni de la intervenția chirurgicală. Astfel am putut observa degenerarea progresivă a valvei, cu apariția unui țesut fibros acoperind ambele anastomoze, proximală și distală, segmentele de pericard și cuprinzând încet și cuspele. În stadiu avansat (la 4 luni) țesutul fibros a înglobat complet cuspele, rezultând un orificiu valvular diminuat, complet nefuncțional, stenotic și cu regurgitare severă în același timp (Figura A, B, C – 3, 4).
Figura 20. Aspecte echocardiografice (1,2) și imagini macroscopice reprezentative ale explantelor (3,4) în stadii progresive ale patologiei. A – imagini la o lună; B – imagini la 3 luni; C – imagini la 4 luni de la implantare; D – imagini la 4 luni a valvei de control acelulare
Explantul valvei acelulare s-a realizat la 4 luni de la implantare. Macroscopic, valva părea fără modificări morfologice, cu cuspe integre, mobile, fără trombi sau focare de calcificare vizibile (Figura 20 – D 3, 4).
Histologia explantelor
Figura 21. Histologia explantelor. Imagini reprezentative ale valvelor însămânțate cu celule stem (A-D) și neînsămânțată (E-H) la 4 luni de la implantare. (A,E) imagine de ansamblu a cuspei și sinusului, cu evidențierea țesutului fibros care acoperă întreaga suprafață (A). (B,F) imagini centrate pe baza cuspei, porțiunea mijlocie (C, G) și marginea liberă a cuspei (D,H). Colorație hematoxilină eozină: nuclei – mov, matrice extracelulară – roz. Imaginea suplimentară din F – colorație Alizarin Red: mici focare de calcificare în peretele aortic al explantului
Histologic toate valvele explantate au prezentat cuspisurile intacte. În valvele pre-injectate cu celule stem, am găsit țesut fibros bogat în fibroblaste și colagen, de 100-300 µm grosime ce acoperă toate suprafețele, înglobând cuspisurile și deci imobilizându-le complet. Nu am observat nici o celulă infiltrată sau pre-injectată în nici una din țesuturile explantate. Cuspisurile nu au prezentat semne de tromboză sau calcificare (Figura 21).
Discuții
Există multiple ipoteze de lucru pentru obținerea unei valve prin inginerie tisulară. Strategia noastră are ca și punct de plecare un biomaterial cu o structură morfologică considerată ideală (valvă aortică porcină) care să constituie suportul celulelor stem. Prin expunerea acestor componente la stimuli mecanici fiziologici, ne așteptam ca celulele stem să se diferențieze în celule valvulare care să mențină homeostazia matricei. Potențialul regenerativ al acestora ar determina viabilitatea valvei, adaptarea și remodelarea ei în funcție de noile condiții hemodinamice în care va fi implantată.
Implantarea unui xenograft nu este posibilă decât prin înlăturarea caracterului antigenic. Acest lucru se poate obține fie prin fixarea în glutaraldehidă, ceea ce înseamnă devitalizarea completă a matricei (cu degenerare progresivă și componente celulare remanente care vor constitui focare de calcificare ulterioare), fie prin decelularizare. Mai mult decât atât, repopularea in vivo a unor scaffold-uri acelulare de către miofibroblaști activați, a inițiat un proces de fibroză și retracție a cuspelor.
Ipoteza noastră este că utilizarea unei matrici extracelulare stabilizate [169] în care să însămânțăm celule stem autologe ar putea combate aceste inconveniente și să reprezinte un suport real de regenerare tisulară.
Concret, pentru testarea in vivo, am decelularizat rădăcina aortică porcină utilizând un sistem de perfuzie inovativ, am tratat matricea cu PGG și o fixare rapidă cu glutaraldehidă. Produsul rezultat s-a dovedit a fi o rădăcină aortică funcțională cu matricea extracelulară integră cu proprietăți mecanice prezervate. Tratarea cu PGG, un polifenol non-citotoxic, reduce efectul colagenazei și elastazei asupra matricei, rezultând astfel un produs mai stabil [157, 159, 164, 170].
Există date care susțin că matricele stabilizate chimic ar reduce rata de infiltrare cu miofibroblaști și consecutiv retracția. În plus neutralizarea rezidurilor de aldehidă cu glicină diminuează efectul citotoxic [159].
Tratarea scaffold-urilor cu anumite substanțe bioactive au fost propuse pentru înlăturarea efectului citotoxic al agenților chimici folosiți în crearea matricei și pentru stimularea recelularizării in vivo [100, 165, 171].
Utilizarea glutaraldehidei este controversată în sensul că ar putea promova calcificarea. De aceea în protocolul nostru am aplicat doar o scurtă expunere la această substanță. Calcificarea graft-urilor, în special a celor valvulare, este o problemă majoră deoarece duce la disfuncționalitate și la necesitatea reintervenției. Riscul de calcificare este mai mare la copii decât la adulți, deoarece pacienții tineri mobilizează calciul în contextul remodelării osoase, accelerând astfel procesul de calcificare. Posibile soluții sunt reprezentate de tratamente anti-calcificare [87, 100].
Repopularea structurii acelulare am efectuat-o cu celule stem adulte derivate din țesut adipos. Însămânțarea s-a realizat prin injectarea interstițială la nivelul bazei cuspelor, considerând că celulele se vor răspândi în rețeaua de fibre a matricei, iar sub efectul stimulilor mecanici să se diferențieze în celule specifice valvulare.
Implantarea valvei rezultate s-a efectuat prin intercalarea ei într-un conduct de pericard. Pentru a reduce riscul de calcificare am utilizat pericard bovin decelularizat și stabilizat, fapt ce s-a dovedit a fi eficient, deoarece nu au fost identificate focare de calcificare la acest nivel. Conductele valvulate au fost implantate în poziție pulmonare, ca shunt-uri extra-anatomice între ventriculul drept și artera pulmonară, cu ligatura trunchiului pulmonar nativ. Modelul animal de testare au fost berbeci tineri.
Evoluția imediată postoperatorie a fost favorabilă pentru toate animalele. Animalul de control la care s-a implantat o valvă decelularizată fără celule stem injectate a fost favorabilă, clinic stabil, fără semne de afectare de organe. Echografic s-a evidențiat valva care s-a dovedit a fi normofuncțională. Explantarea la 4 luni, atât macroscopic cât și histologic, a confirmat aspectul morfologic normal, mobilitate păstrată a cuspelor, fără trombi sau nuclei de calcificare.
Comportamentul in vivo al valvelor populate cu celule stem a fost însă diferit. Animalele au început să manifeste simptome și semne de insuficiență cardiacă dreaptă după prima lună de la implantare. Progresia fenomenului a fost variabilă de la un animal la altul, dar s-a manifestat la tot lotul. Acest tablou clinic s-a dovedit a fi efectul disfuncționalității xenograft-ului valvular. Atât ecografic, cât și histologic s-a decelat o îngroșare a cuspelor determinată de apariția unui proces de fibroză care a înglobat progresiv cuspele valvulare. Histologic, cuspele au rămas intacte. Nu au fost identificate celule interstițiale nici la nivelul bazei cuspelor, unde au fost injectate celule, și nici la nivelul marginii libere. Nu au fost prezente celule de tip inflamator și nici focare de calcificare.
Consultarea literaturii asupra acestui fenomen, ne-a arătat că Obrien și colaboratorii [172] au investigat comportamentul unor valve acelulare nefixate, comparativ cu valve crioprezervate în poziție pulmonară pe model animal ovin. Rezultatele au arătat o infiltrare masivă a matricei cu fibroblaști și miofibroblaști, iar allografturile crioprezervate nu au prezentat același aspect. Quinn și echipa sa [173] au investigat performanța și morfologia unor allografturi decelularizate în poziție pulmonară pe model animal ovin. După 20 de săptămâni a fost observată popularea autologă celulară a peretelui arterial și variabil la nivelul cuspelor și absența calcificării. Însă cuspele și-au diminuat mobilitatea, comparativ cu cele crioprezervate cu calcificare moderată și celularitate redusă.
În această ordine de idei, putem afirma că infiltrarea cu celule gazdă variază în funcție de modul de elaborare a implantului, și dăunează pe termen lung datorită efectului profibrotic și de retracție a miofibroblaștilor activați infiltrați.
Modelul animal ovin e recomandat de FDA pentru testarea de noi prototipuri de valve, motiv pentru care literatura de specialitate abundă în articole care raportează testări de valve mecanice, biologice sau hibride [131, 151, 174-179]. Acest animal a rămas cel de primă intenție pentru valve obținute prin inginerie tisulară și pentru scaffold-urile valvulare acelulare [178] [180-184]. Ovinele au câteva avantaje: anatomia este asemănătoare cu cea umană, reproductibilitatea și ritmul către calcificare și tromboză este accelerat. Însă se pare că dezvoltă un răspuns fibrotic exagerat față de implanturi [185].
Nu este clar în momentul de față ce anume inițiază acest proces fibrotic, ce îl face să progreseze și de ce unele implanturi dau reacție fibrotică minoră, iar altele devin complet acoperite de acest țesut. Acest fenomen este prezent și în practica clinică, pe subiecți umani, la înlocuirile valvulare cu proteze mecanice sau homografturi care conțineau celule remanente [186, 187].
Toate implanturile efectuate de noi, însămânțate cu celule stem au prezentat acest fenomen, care progresiv au imobilizat cuspele valvulare și au determinat disfuncția acestora. Ipoteza noastră vis-a-vis de acest proces e că prezența acestor celule stem, precum și a altor celule remanente este posibil să fi inițiat sau exacerbat dezvoltarea acestui țesut fibros. Este cunoscut faptul că celulele stem derivate din țesut adipos secretă numeroase citokine și factori de creștere (TGF, FGF sau TNF)[188], iar eficacitatea terapiei cu celule stem se datorează efectelor lor paracrine [189, 190]. Astfel e posibil ca celulele stem injectate la nivelul cuspelor să fi secretat anumiți agenți pro-fibrotici care au stimulat manifestarea acestui proces. Nu este însă cunoscut dacă este specific celulelor stem, și noi investigații sunt necesare pe această cale.
Pentru a înțelege mai bine de ce celulele stem injectate nu au mai fost identificate după implantare, am efectuat un alt studiu în care am utilizat același tip de scaffold obținut prin decelularizare, le-am însămânțat cu celule stem și au fost testate într-un bioreactor în condiții presionale pulmonare (vezi al 3-lea studiu). După 4 săptămâni, celulele au murit și insule de debride celulare erau prezente în baza cuspelor. Grupul de control a constat în același tip de valve, dar rotate în mediu de cultură pentru a li se asigura schimbul de gaze și nutrienți. Acestea au menținut un procent de 50% de celule viabile. Putem afirma faptul că supraviețuirea celulelor nu a depins de scaffold sau de tratamentul de stabilizare a valvei.
Aceste rezultate sugerează faptul că expunerea celulelor la condiții de presiune pulmonară și stress mecanic determină moartea celulelor. Din câte știm, acesta este primul raport care demonstrează vulnerabilitatea celulelor stem adulte la stimuli mecanici specifici ciclului cardiac [189]. Un alt studiu [191] a supus un monostrat de celule stem adulte la forțe equibiaxiale în sisteme FlexerCell pentru a le studia proprietățile. Aceste condiții nu au distrus celulele. Aceste concluzii ridică diverse întrebări privitoare la ce tip de stimuli mecanici sau chimici determină efecte distructive celulare [192-194].
În momentul de față nu știm dacă celulele progenitoare sunt capabile de a repopula întreaga valvă sau dacă scaffold-urile acelulare pot trece testul timpului.
Grupul nostru de cercetare a demarat alte studii pentru îmbunătățirea metodelor de însămânțare, marcarea celulelor și urmărirea lor după injectare, diferențierea celulelor către celule specifice valvulare in vitro, etc.
Concluzii
Dezvoltarea tehnicilor de inginerie tisulară direcționează domeniul înlocuirilor valvulare în această direcție.
Rădăcina aortică trebuie văzută ca un ansamblu de componente fiecare cu structura și fiziologia proprie, de aceea fiecare trebuie să primească considerația potrivită.
Rădăcinile aortice porcine acelulare stabilizate cu PGG sunt scaffold-uri obținute prin inginerie tisulară păstrând hemodinamică adecvată, neafectate de rejet imun, calcificare sau tromboză, atunci când sunt implantate în poziție pulmonară în model animal ovin.
În scopul de a repopula suportul acelular, au fost injectate în interstițiul bazei cuspelor, celule stem adulte derivate din țesut adipos autolog. După 4 săptămâni de funcționalitate in vivo, s-a constatat absența celulelor interstițiale, fie injectate sau infiltrate, probabil datorită vulnerabilității celulare la factorii mecanici specifici ciclului cardiac. Mai mult decât atât, apariția unui proces fibrotic a înglobat progresiv cuspele, rezultând un conduct disfuncțional. Este posibil ca acest fenomen să fie inițiat de prezența celulelor stem moarte.
Sunt necesare mai multe studii privind manipularea celulelor stem, noi metode de însămânțare, adaptare și diferențiere pentru a înțelege comportamentul și potențialul celulelor stem în ingineria tisulară.
Este posibil ca o precondiționare a xenograft-ului repopulat cu celule, adică simularea condițiilor hemodinamice și mecanice fiziologice in vitro, să permită adaptarea progresivă a celulelor, astfel încât implantarea in vivo să nu constituie un factor declanșator a degradării lor.
Înlocuiri valvulare pulmonare folosind scaffold-uri xenogenice acelulare stabilizate; efectul însămânțării cu celule stem autologe
Introducere
Începând cu prima implantare a unui xenograft valvular aortic de către Duran și Gunning în 1964 [195], s-au înregistrat progrese reale în obținerea unui substitut valvular perfect. Alternativele actuale sunt protezele mecanice și valvele biologice, care deși și-au îmbunătățit proprietățile în ultimele decenii, prezintă niște dezavantaje care trebuie luate în calcul pentru fiecare pacient în parte. Dependența anticoagulării eficiente, implicit cu efectele sale secundare nedorite [196], pentru protezele mecanice și fenomenele de degenerare și calcificare a valvelor biologice [3], le fac imperfecte.
Medicina regenerativă și bioingineria tisulară încearcă să creeze un produs de laborator care să se apropie cât mai mult de caracteristicile valvei native. Fără îndoială, viabilitatea reprezintă elementul cheie în durabilitate, adaptabilitate, remodelare la modificările factorilor de mediu. Hemodinamică bună, geometrie corespunzătoare, durabilitate înaltă, non-imunogenitate, non-trombogenitate, absența focarelor de calicificare sunt atuurile unei valve de calitate. Dacă se adaugă și capacitatea de creștere și adaptabilitate la pacienți pediatrici, putem vorbi de un substitut ideal [149-151].
În contextul actual al cunoașterii, obținerea unei valve viabile presupune elaborarea unui suport, fie el biologic sau sintetic, care ulterior să fie populat cu celule specifice valvulare. Acestea vor fi răspunzătoare de menținerea integrității matricei extracelulare prin noi fibre de colagen și elastină care să remodeleze aparatul valvular în funcție de condițiile hemodinamice locale.
Celulele utilizate în bioingineria tisulară trebuie să fie disponibile, preferabil cu origine autologă, cu o bună capacitate de expansiune in vitro. Amplasarea și menținerea viabilității celulelor la nivelul scaffold-ului reprezintă o altă provocare. Prima opțiune e de a introduce această structură populată cu celule într-un bioreactor, care să o precondiționeze progresiv la stimulii mecanici specifici ciclului cardiac până la implantarea in vivo [38]. A doua posibilitate este ca aceasta să fie plasată direct in vivo pentru condiționare și maturare [197].
Cuantificarea performanței unei valve obținute prin inginerie tisulară trece de la stadiu de laborator la testarea in vivo pe un model animal care să aibă caracteristici anatomice și fiziologice asemănătoare cu ale omului. În acest sens, animalul acceptat este modelul animal ovin [1]. Verificarea performanței in vivo se face prin examinări funcționale periodice, ulterior prin analiza histologică a explantului după momentul de end-point al studiului.
Ipoteza de lucru
Obiectivul studiului nostru este de a compara comportamentul in vivo a unor valve pulmonare porcine acelulare cu valve pulmonare porcine acelulare însămânțate cu celule stem autologe derivate din țesut adipos pe model animal ovin.
Scaffold-urile biologice derivate din valve native au fost preferate datorită disponibilității acestora, prezervării proprietăților hemodinamice și prezența așa-numitor „nișe” după procesul de decelularizare [152-154]. Valvele tisulare fiind susceptibile la fenomene de degenerare și calcificare, am adăugat tratarea cu PGG (penta-galloil glucoză) pentru stabilizare tisulară [155-157]. A fost înlăturată fixarea cu glutaraldehidă din studiul anterior, pentru a depista dacă această expunere este într-adevăr citotoxică, iar debridele celulare rezultate pot fi responsabile de apariția acestui fenomen fibrotic.
Plasticitatea și capacitatea de diferențiere în celule specifice valvulare a celulelor stem adulte derivate din țesut adipos [159, 160], ne-a determinat să utilizăm această sursă de regenerare. Așteptarea noastră e ca acestea să confere viabilitate valvei și să sintetizeze componentele necesare menținerii integrității matricei extracelulare.
Materiale și metode
Obținerea scaffold-ului acelular
Am ales valva pulmonară porcină ca să obținem un xenograft valvular acelular (prin decelularizare). Față de studiul anterior, am considerat că pentru implantarea în poziție pulmonară în model animal ovin, ar fi mai potrivită utilizarea unui bioscaffold care provine din aceleași condiții hemodinamice.
Valva pulmonară porcină prezintă aceeași morfologie cu cea ovină sau umană, cu cele trei cuspisuri: anterioară, dreaptă și stângă, cu inserție semilunară. Joncțiunea ventriculo-arterială este mai bine delimitată, inserția cuspelor depășind această linie de demarcare și implantându-se la nivelul mușchiului ventricular pe toată circumferința ei, spre deosebire de valva aortică a cărei bază este în strânsă legătură cu valvula mitrală anterioară.
Datorită faptului că peretele trunchiului pulmonar e considerabil mai subțire, iar densitatea fibrelor de colagen și elastină e mai mică față de peretele aortic, decelularizarea se poate efectua cu succes prin procedee de imersie.
Corduri porcine proaspete au fost recoltate de la un abator local și transportate în recipiente speciale cu gheață în TERMLab (Tissue Engineering and Regenerative Medicine Laboratory) din cadrul UMF Târgu Mureș. După examinarea globală a cordului, s-a disecat rădăcina pulmonară. S-a inspectat valva pulmonară și după controlul calității (morfologie – valvă tricuspă, fără semne de endocardită sau trombi, comisuri libere, cuspe suple, mobile, fără perforații, coaptare centrală) se începe procesul de decelularizare. Metoda presupune plasarea valvelor pulmonare în recipiente de sticlă, imersia în soluțiile de decelularizare (100 ml soluție/valvă) și plasarea pe un agitator orbital.
Decelularizarea prin imersie constă în expunerea valvelor în 0,02% azidă, timp 24 h la 22ᵒC , pentru relaxarea matricei extracelulare. Inițializarea procesului de îndepărtare a celulelor începe cu 0,05 M NaOH pentru 1 h la 22ᵒC, expunerea la detergenți – 0,05% sulfat dodecil de sodiu, 0,5% Triton X-100, 0,5% deoxicolat de sodiu și 0,2% EDTA în 10 mM TRIS, pH 7,5, timp de 7 zile la 22ᵒC cu schimbarea soluției zilnic.
După spălare în apă bidistilată, înlăturarea acizilor nucleici s-a realizat prin imersia în 360 mU/ml deoxiribonuclează și 360 mU/ml ribonuclează în 5 mM MgCl2 în PBS pentru o zi la 37ᵒC.
Fiecare pas a fost precedat de o expunere de 20 de minute la o soluție de 70% etanol, apoi clătire cu PBS steril.
La final, valvele au fost incubate în 70% etanol pentru 3 h la 22ᵒC, apoi sterilizate în 0,1% acid peracetic în PBS, pH 7,4 pentru 2 h la 22ᵒC.
Pentru stabilizarea matricei extracelulare, valvele au fost tratate cu 0,1% PGG în 20% isopropanol [154], precum și o scurtă etapă de expunere la glutaraldehidă.
Pentru implantarea in vivo, am introdus valva într-un conduct de pericard bovin decelularizat și stabilizat cu PGG, printr-o procedură descrisă anterior [164]. Conductul valvulat rezultat va fi plasat extra-anatomic între ventriculul drept și artera pulmonară.
Controlul calității scaffold-ului
Validarea eficienței procedurii de decelularizare a rădăcinii pulmonare se realizează prin fixarea țesutului în formalină 10%, inserția în blocuri de parafină, efectuarea de secțiuni de 5 µm și colorarea cu DAPI pentru nuclei și H&E pentru structura generală.
ADN-ul a fost extras și purificat din probele tisulare (n=5) utilizând Kit-ul Qiagen, înainte de a se efectua electroforeza în gel de agaroză cu Ethidium Bromide.
Crearea conductului valvulat
Intercalarea valvei într-un conduct din pericard bovin decelularizat și stabilizat a permis implantarea in vivo în poziție extra-anatomică între ventriculul drept și trunchiul pulmonar.
După procesul de decelularizare, rădăcinile pulmonare au fost pregătite pentru manufacturarea conductului valvulat. Păstrarea a 5 mm de țesut miocardic din tractul de ejecție al ventriculului drept sub inserția bazei cuspelor și 5 mm din peretele arterial pulmonar deasupra liniei comisurale, a permis sutura proximală și distală a segmentelor de pericard (sutură Surjet, fir Polipropilena 6.0).
Izolarea, cultura și însămânțarea celulelor stem
Anterior implantării in vivo a valvei în animalul selectat, s-a recoltat țesut adipos interscapular din care s-au izolat celule stem adulte, conform procedurii descrise în studiul anterior. Plasticitatea celulelor stem derivate din țesut adipos a fost confirmată prin utilizarea kit-urilor de diferențiere (PromoCell, Inc). După cultura lor până la obținerea numărului dorit, au fost injectate interstițial la nivelul bazei cuspelor. 8-10 milioane de celule/cuspă au populat scaffold-ul acellular la acest nivel. Până în momentul intervenției chirurgicale, valva însămânțată a fost păstrată în mediu de cultură DMEM/FBS și incubată la 37ᵒC, 5%CO2 și 90% umiditate.
Animale și procedura chirurgicală
Procedurile chirurgicale s-au desfășurat în cadrul Stației Experimentale a UMF Tîrgu Mureș respectând ghidurile de specialitate (Guide for the care and use of laboratory animals – NIH Publication No. 85-23, revised 1996), protocol acceptat de Comisia de Etică a Universității de Medicină și Farmacie Târgu Mureș (AUP #8/04.02.2012).
Modelele animale alese au fost berbeci tineri (20-25kg). Au fost împărțiți în două grupuri: grupul A (n=7) au fost animalele cărora li s-a implantat xenograft-uri pulmonare decelularizate și grupul B (n=7) cu xenograft-urile decelularizate însămânțate intern cu celule stem autologe.
Sub anestezie generală (intubație oro-traheală și ventilație mecanică) și monitorizare EKG, tensiune arterială invazivă, temperatură centrală, pulsoximetrie și cateter venos central și periferic, se practică toracotomie stângă la nivelul spațiului intercostal III, cu expunerea cordului drept (tractul de ejecție al ventriculului drept și trunchiul pulmonar). După heparinizare sistemică (2,5 mg/kgc heparină), se clampează lateral cu ajutorul unei pense Satinsky, ventriculul drept. Se practică ventriculotomie și se anastomozează la acest nivel capătul proximal al conductului valvulat prin sutură Surjet armată pe bandelete de Teflon, cu fir Polipropilenă 4.0. Se declampează ventriculul drept, ulterior efectuându-se în aceeași manieră (dar cu fir Polipropilenă 5.0) anastomoza distală a conductului la nivelul trunchiului pulmonar înainte de bifurcația acestuia. Pentru direcționarea fluxului sanguin prin conductul valvulat extra-anatomic, s-a ligaturat artera pulmonară nativă la emergența din ventriculul drept (protocolul anestezic și chirurgical au fost detaliate în studiul anterior).
Au fost măsurate invaziv presiunile intraventriculare drepte și la nivelul trunchiului pulmonar înainte și după ligatura arterei pulmonare native, pentru a se detecta orice modificare hemodinamică care ar putea să influențeze funcționalitatea cordului drept.
Postoperator, a fost adminstrat tratament antibiotic preventiv, antialgic, anti-inflamator și diuretic la nevoie în primele 5 zile. Timp de 30 de zile s-a administrat tratament anticoagulant cu heparină fraxionată (Fraxiparina 2 x 0,3 ml, subcutan) și tratament antiagregant pe toată durata studiului (Aspenter 75 mg/zi per oral).
Supravegherea animalelor s-a realizat prin examen clinic periodic de către medicii veterinari, chirurgi și al cardiologului. Echocardiografia transtoracică s-a efectuat lunar pentru evaluarea funcționalității valvei implantate, precum și a funcției globale cardiace.
După 6 luni de la implantare, animalele au fost eutanasiate, iar explantele valvulare au fost analizate macroscopic și histologic. Excepție au făcut două animale, unul din fiecare grup, care au fost menținute în viață timp de 12 luni, pentru a evalua funcționalitatea valvelor pe termen lung.
Analiza histologică
Probele biologice obținute după explantare au fost prelucrate prin tehnici histologice standard. După fixare în formalină, inserarea în blocuri de parafină, au fost obținute secțiuni de 5 µm și au fost colorate cu hematoxilină eozină.
De asemenea au fost prelucrate două valve native (nedecelularizate) și 2 valve decelularizate pentru controlul calității. În plus o valvă cu celule injectate și una fără celule au fost analizate după 30 de minute de funcționare in vivo, datorită a două decese intraoperatorii, independente de valva implantată.
Rezultate
Obținerea scaffold-ului prin decelularizare
Validarea procesului de decelularizare s-a efectuat prin analize histologice și analiza ADN. Obținerea unui scaffold complet acelular este esențial pentru evitarea rejectului, fie el acut sau cronic, din partea organismului gazdă. Orice remanență celulară cu caracter antigenic poate compromite funcționalitatea valvei.
Figura 22. Validarea procedurii de decelularizare. A-D imagini representative cu colorația DAPI: nucleii cu albastru, fibrele de elastină cu verde a cuspei valvei pulmonare porcine native (A) și peretelui trunchiului pulmonar nativ (B), comparativ cu cuspa (C) și peretele pulmonar (D) decelularizate. E,F imagini representative cu H&E a rădăcinii pulmonare înainte (E) și după (F) decelularizare. G electroforeză în gel de agaroză cu Ethidium Bromide a AND-ului extras și purificat din pulmonara native (Fr – Fresh) și din cuspa (acellular cusp) și peretele arterial (acellular artery) decelularizate (5 benzi pentru fiecare). A se compara cu banda standard (Std). Scala A-D 100µm, E,F 500µm (preluat din [163])
Colorația H&E și nici mai sensibila DAPI nu a pus în evidență nuclei remanenți la nivelul secțiunilor analizate (Figura 22). De asemenea, am sesizat prezența de “pori”, spațiile în care au fost localizate celule native înainte de extracție.
Electroforeza nu a semnalat ADN restant la nivelul cuspelor sau peretelui arterial pulmonar (Figura 22 – G).
Procedura chirurgicală, urmărirea postoperatorie
Au fost înregistrate două decese (câte unul din fiecare grup) intra/perioperator. Un deces, datorat fibrilației ventriculare, a intervenit la sfârșitul intervenției chirurgicale, ireductibilă la ritm sinusal, iar al doilea prin insuficiență respiratorie imediat postoperator.
Intraoperator, au fost măsurate invaziv presiunile intraventriculare drepte și în trunchiul pulmonar la animalele cărora li s-au implantat valve decelularizate însămânțate cu celule stem autologe (n=7) (Tabel 1) [198].
Tabel 1. Valorile presionale măsurate invaziv (în mmHg) pre și post ligatura arterei pulmonare native. PmVDpre – presiunea medie ventricul drept preligatură; PmVDpost – presiunea medie artera pulmonară postligatură; PmAPpre – presiunea medie artera pulmonară preligatură; PmAPpost – presiunea medie artera pulmonară postligatură (adaptat după [198])
Media fiziologică a presiunii medii a ventriculului drept a fost de 20.14 mmHg (interval între 17-22), iar în artera pulmonară de 23,42 mmHg (interval între 21-26). Am direcționat fluxul sanguin prin conductul extra-anatomic legând originea arterei pulmonare. Presiune măsurate ulterior au avut valori apropiate ale presiunii medii: 21,42 mmHg (interval între 19-23) în ventriculul drept și 23,14 mmHg (interval între 21-26). Diferențele au reieșit ca nefiind semnificative statistic, demonstrate de valorile p la testul t pereche (p = 0,06, respectiv 0, 77, la un interval de confidență de 95%).
De menționat că în timpul intervenției chirurgicale, valorile tensionale sistemice s-au păstrat în intervalul 110-130/70-80 mmHg, frecvența cardiacă între 60-100/minut, iar saturația oxigenului măsurată de pulsoximetru a înregistrat valori de peste 94%.
În prima lună, evoluția animalelor a fost favorabilă, cu recuperare rapidă postoperatorie, fără complicații, prima ecografie efectuată a pus în evidență valve normofuncționale, cuspe mobile, cu coaptare centrală, cord în limite normale cu contractilitate globală păstrată în ambele grupuri de animale.
Figura 23. Imagini reprezentative ecografice ale grupului A. A, ax scurt, valvă deschisă, cuspe suple, mobile; B, ax scurt, valvă închisă, coaptare bună a cuspelor; C, ax lung, valvă închisă, arie bună de coaptare centrală; D, ax lung, semnal Doppler, regurgitare valvulară minimă; E, ventricul stâng (VS) și drept (VD) cu păstrarea raportului >1
Toate cele 6 animale din grupul A au supraviețuit până la termenul limită de 6 luni, fără vreun fel de complicații, cu dezvoltare somatică fiziologică, fără semne de insuficiență cardiacă sau alt organ. La examinarea echocardiografică s-au pus în evidență valve cu structură morfologică păstrată, cuspe suple, mobile, cu coaptare centrală, fără regurgitări sau stenoze semnificative; corduri cu cavități în limite normale, nereacționate (Figura 23).
Figura 24. Imagini reprezentative ecografice ale grupului B. A,B ax scurt, respectiv ax lung, valvă închisă, cuspe îngroșate, retractate, fără coaptare centrală a cuspelor; C, ax lung, valvă deschisă, cu diminuarea diametrului valvular, datorită îngroșării cuspelor și diminuării mobilității lor; D, ax lung, semnal Doppler, regurgitare valvulară semnificativă, care a produs progresiv dilatarea ventriculului drept și la inversarea raportului VS/VD < 1 (E), VS – ventricul stâng și VD – ventricul drept
În schimb, evoluția animalelor din grupul B s-a înrăutățit începând cu prima lună, acestea manifestând simptome și semne de insuficiență cardiacă dreaptă: dispnee, tahipnee, ulterior ascită. Deși debutul acestora a variat ca și moment de apariție, fenomenul a fost întâlnit la tot grupul B. Ecografiile lunare efectuate au surprins evoluția progresivă a disfuncționalității valvulare, în deplină concordanță cu starea clinică a animalului. Îngroșarea progresivă a cuspelor a dus la diminuarea mobilității și a ariei de deschidere a valvei, iar retracția a condus la regurgitare de la moderată spre severă (Figura 24). În aceste condiții hemodinamice, am observat și apariția regurgitării tricuspidiene secundar dilatării ventriculului drept. 2 din cele 6 animale au supraviețuit până la termen, celelalte fiind eutanasiate mai devreme (1, 2, 3, 4 luni) datorită simptomatologiei severe refractare la tratament medicamentos.
Analiza explantelor: macroscopic și histologie
Macroscopic, cuspele valvelor din grupul A au fost suple, mobile, integre, fără vegetații, trombi sau focare de calcificare vizibile (Figura 25 – A, B). În schimb, grupul B a prezentat un proces fibrotic care a acoperit întreaga suprafață a conductului, anastomoza proximală și distală, segmentele de pericard, înglobând progresiv cuspele (Figura 25 – C, D).
Figura 25. Aspectul macroscopic al valvelor explantate. A,B, Explante din grupul A după 6 luni de testare in vivo: cuspe suple, mobile, fără trombi sau calcificare; C, D, Explante din grupul B după 2, respectiv 3 luni de la implantare: țesut fibros înglobând progresiv cuspele, valva disfuncțională. Săgețile indică marginile libere ale cuspelor restante (preluat din [163])
Histologic, explantele valvulare din grupul A au păstrat integritatea cuspelor, fără trombi sau nuclei de calcificare. Depozite focale sau difuze de fibrină au fost observate la valva explantată după 30 de minute de funcționare in vivo. În grupul B a fost detectată prezența unui țesut fibros de 100-300 µm bogat în fibroblaști acoperind întreaga suprafață. Deși integre ca și structură, cuspele și-au pierdut mobilitatea datorită țesutului fibros care le-a fixat. Nu au fost puse în evidență celule în țestutul interstițial (celulele stem, celule inflamatorii sau fibroblaști). Nu au fost puse în evidență nuclei de calcificare (Figura 26).
Figura 26. Aspecte histologice ale explantelor în colorația H&E. A,C, Valve explantate din grupul A. B, D, Valve explantate din grupul B. A, B, Valve explantate după 30 de minute de funcționalitate in vivo (deces intra/perioperator independent de valvă). B, Săgeata indică locul unde au fost injectate celulele stem. A se observa un strat fin de fibrină la suprafață. C,D, Valve explantate la 6, respectiv 3 luni de la implantare. Nu se pun în evidență trombi, inflamație sau calcificare. D, Țesut fibros (Fib) care înglobează cuspa (Cusp). Scala de 500 µm în A, B, C, de 200 µm în D (preluat din [163])
Figura 27. Imagini ale explantelor la un an de funcționalitate in vivo. A – Explant valvă decelularizată fără celule stem implantate: cuspe mobile, translucide, fără focare de calcificare. B – Explant valvă decelularizată cu celule stem însămânțate: marcajele localizează cuspele înglobate de țesut fibros pe care le fixează de perete
Mai mult decât atât explantele la un an de funcționalitate in vivo a unui animal din fiecare grup ne întăresc concluziile asupra fiecărui tip de implant valvular. Valva decelularizată fără celule implantate in vitro și-a păstrat morfologia și funcția, fără apariția de focare de calcificare sau necroză. În schimb scaffold-ul acelular cu celule stem însămânțate a prezentat același aspect de fibroză excesivă care a imobilizat cuspele (Figura 27). Variabilitatea individuală de apariție a fenomenului fibrotic a permis supraviețuirea cvasi-asimptomatică a berbecului. Histologia acestor două valve au avut același aspect ca și valvele explantate la 6 luni.
Discuții
Patologia valvulară cardiacă necesită, nu rareori, înlocuirea valvei afectate. Deși reprezintă alternative rezonabile, protezele mecanice impun expunerea pacientului la riscurile anticoagulării, iar valvele biologice sunt limitate în privința durabilității. Scopul bioingineriei tisulare este crearea unui produs care să reproducă cât mai fidel comportamentul unei valve native. Scaffold-urile, celulele, stimulii mecanici și biologici sunt ingredientele care combinate sub diferite forme și proporții tind să contureze profilul substitutului valvular ideal.
Ipoteza noastră a fost aceea că scaffold-ul cel mai potrivit ar fi o valvă porcină acelulară însămânțată cu celule stem autologe. Sursa xenograft-urilor de origine porcină mult utilizată în specialitatea cardiacă și-a confirmat aplicabilitatea și asemănarea cu morfologia cardiacă umană. Milioane de valve porcine fixate cu glutaraldehidă au fost implantate în pacienți umani.
Prezența celulelor remanente induce procesul de calcificare [199], care apare după 10-15 ani la oameni și după doar câteva luni la ovine. De aceea îndepărtarea celulelor prin procese de decelularizare ar înlătura acest fenomen de nedorit. Mai mult decât atât, absența celulelor din interstițiul tisular prin decelularizare completă nu induce procese imune ale gazdei [151, 152].
Pentru a susține ideea decelularizării, există studii care susțin că homograft-uri decelularizate au rate de explantare și degenerare mai reduse decât cele crioprezervate (0-10% vs 30% la 5 ani) [200, 201]. Mai mult decât atât, implantarea homograft-urilor decelularizate s-a asociat cu recelularizare spontană [202, 203].
În acest sens, am creat scaffold-uri acelulare prin decelularizarea completă de rădăcini pulmonare porcine, utilizând detergenți și enzime, ulterior stabilizându-le cu PGG. Astfel, au rezultat valve funcționale, cu matricea extracelulară integră, cu proprietăți mecanice prezervate. PGG e un polifenol non-citotoxic care reduce susceptibilitatea fibrelor matricei la acțiunea colagenazei, crescând astfel durabilitatea scaffold-ului [157, 159, 164, 169].
Recelularizarea scaffold-ului reprezintă un alt aspect esențial. Abordarea noastră în repopularea valvelor pulmonare a fost izolarea de celule stem adulte derivate din țesut adipos. Injectarea lor în interstițiul valvei constituie, după cunosțintele noastre, printre primele încercări de acest tip. Implantarea in vivo va realiza expunerea la stimuli mecanici specifici, care cel puțin ipotetic, va facilita difuziunea celulelor în interstițiu și diferențierea în celule specifice valvulare.
Scaffold-uri acelulare și comportamentul lor in vivo
Controlul calității asupra decelularizării complete a valvelor pulmonare porcine s-a realizat prin examinarea histologică corespunzătoare (colorația H&E, DAPI) a componentelor valvulare. Modelul de testare in vivo a fost implantarea în poziție pulmonară extra-anatomică, prin plasarea valvei într-un conduct din pericard bovin decelularizat. Ligatura la origine a trunchiului pulmonar, va direcționa fluxul sanguin prin conductul valvulat. Utilizarea de pericard acelular se bazează pe faptul că acesta reprezintă un material ideal în chirurgia cardiacă [204], în ingineria tisulară valvulară [159], iar absența celulelor va reduce riscul de calcificare [164].
Modelul animal recomandat de FDA în testarea in vivo de noi proteze mecanice, valve biologice, homograft-uri crioprezervate sau produse biohibride este oaia [131, 151, 174, 176-178, 205]. Modelul animal ovin este accesibil, cu procedee ușor reproductibile, accelerează calcificarea valvulară și are o anatomie asemănătoare cu cea umană.
Astfel, am implantat conductul valvulat acelular stabilizat cu PGG, în ovine tinere, și le-am urmărit timp de 6 luni, constituind grupul A. Recuperarea animalelor postoperator a fost rapidă, negrevată de complicații, fără semne sau simptome de insuficiență organică. Ecocardiografia a evidențiat valve nomofuncționale, cu valvule suple, mobile, cu coaptare centrală, fără stenoză sau insuficiență valvulară semnificativă. Acest aspect s-a corelat și cu morfologia valvelor explantate la 6 luni, fără semne de inflamație, tromboză sau calcificare. Decelularizarea eficientă a valvei s-a confirmat prin lipsa oricărui semn de rejet imun. Funcționalitatea acestei valve la 12 luni de testare in vivo certifică durabilitatea acestui model valvular.
Putem afirma că acest conduct valvular acelular stabilizat cu PGG reprezintă o alternativă bună pentru înlocuirile valvulare.
Scaffold-urile însămânțate și performanța lor in vivo
Grupul B de animale a fost constituit din animale cărora li s-au implantat valve pulmonare decelularizate însămânțate cu celule stem autologe. Am ales acest tip de celule datorită potențialului de diferențiere în celule specifice valvulare odată fixate la matricea extracelulară și sub acțiunea stimulilor mecanici specifici [159, 160]. Plasticitatea celulelor a fost confirmată și prin diferențiere utilizând kituri specifice cu factori de creștere.
După implantare, animalele au fost supravegheate clinic și ecocardiografic. Spre deosebire de grupul A, cel de-al doilea grup a avut o evoluție diferită. După 4 săptămâni de funcționare in vivo, xenograft-urile valvulare au prezentat modificări morfologice care au condus la disfuncționalitatea acestora. Clinic, s-a tradus prin apariția de simptome și semne de insuficiență ventriculară dreaptă progresivă, cu tahipnee, dispnee, ascită. Ecocardiografic, s-a decelat degenerare valvulară prin îngroșarea progresivă a cuspelor, diminuarea mobilității lor și lipsa coaptării centrale, ceea ce a dus la stenoză și insuficiență semnificative concomitent. Secundar a apărut și dilatarea cavităților drepte.
Momentul de debut a modificărilor a fost diferit de la un animal la altul, dar fenomenul a fost omniprezent. Ovinele sunt cunoscute pentru susceptibilitatea lor de a dezvolta un răspuns fibrotic excesiv comparativ cu subiecții umani [185, 206], un fenomen încă insuficient înțeles și studiat.
În ciuda excluderii procedurii de fixare a scaffold-ului cu glutaraldehidă, substanță considerată citotoxică, procesul fibrotic s-a manifestat în grupul B, celulele stem injectate fiind singura variabilă între grupuri.
Comparând rezultatele noastre cu cele din literatură, ipoteza noastră este aceea că prezența celulelor injectate și eventual a altora remanente, au inițiat sau potențat procesul fibrotic. Efectul paracrin al celulelor stem derivate din țesut adipos mediat prin secreția de citokine și factori de creștere precum TGF, FGF și TNF [188, 190] poate fi de asemenea răspunzător de această reacție. Este încă neclar dacă doar celulele stem induc acest fenomen, de aceea investigații suplimentare sunt, în mod clar, necesare.
Limitări ale studiului
Studii suplimentare sunt necesare pentru evaluarea comportamentului celulelor stem injectate în interstițiul valvular. Este posibil ca acestea să fie vulnerabile la stress-ul mecanic indus de ciclul cardiac. În acest sens, poate fi necesară o pre-condiționare și adaptare a valvei și a celulelor injectate care să inducă progresiv intensitatea stimulilor mecanici până la valori fiziologice. Studii de precondiționare a valvelor în bioreactoare sunt în derulare în laboratorul nostru. Marcarea celulelor stem prin fluorescență sunt necesare pentru observarea comportamenului lor dupa implantare.
De asemenea noi metode de însămânțare, care să asigure o mai bună difuziune celulară în cadrul matricei sunt în lucru.
Un alt model animal ar putea fi adus în discuție pentru a înlătura această susceptibilitate a ovinelor la fenomene de tip fibrotic.
Concluzii
Valvele pulmonare porcine acelulare stabilizate reprezintă alternative excelente în înlocuirile valvulare. Acestea au demonstrat o hemodinamică adecvată, integritatea matricei extracelulare, fără răspuns inflamator sau imunologic din partea gazdei, fără focare de tromboză sau calcificare după 6 luni de funcționalitate in vivo, într-un model animal cunoscut că induce degenerarea valvulară. Menținerea acestei valve timp de 12 luni in vivo la unul dintre animale, a demonstrat potențialul de durabilitate a acestui model valvular.
Repopularea acestor valve acelulare cu celule stem provenite din țesut adipos autolog nu a constituit un demers în regenerare tisulară, și cel puțin în modelul animal ovin, prezența celulelor s-a asociat cu apariția unui fenomen fibrotic extensiv din partea organismului gazdă. Studii suplimentare privind modul de exploatare a potențialului celulelor stem în regenerare sunt necesare.
Condiționarea în bioreactor a scaffold-urilor valvulare însămânțate cu celule stem adulte
Introducere
Ipoteza noastră în cadrul studiilor anterioare a fost aceea că expunerea la stimuli mecanici specifici in vivo, va determina stimularea celulelor stem spre diferențiere către celule valvulare interstițiale. Însă funcționalitatea xenograft-urilor repopulate a început să se deterioreze după 4 săptămâni in vivo. Un proces fibrotic probabil secundar inadaptării celulelor stem și decesului acestora a inițiat acest fenomen. Rezultatele referitoare la efectul însămânțării scaffold-urilor acelulare, ne-a determinat să evaluăm viabilitatea și comportamentul celulelor stem după injectare.
Așa cum am amintit în partea generală a tezei, condiționarea unui scaffold se poate face atât in vivo, prin implantarea într-un model animal, cât și in vitro, prin introducerea valvelor într-un sistem circulator – bioreactor, care reproduce condițiile hemodinamice fiziologice.
Cuspele valvulare sunt expuse unui regim hemodinamic unic, caracterizat prin forțe de frecare marcante, plieri și tensionări ale cuspelor în direcție circumferențială și radială, care poate să varieze în intensitate și direcție în cadrul fiecărui ciclu cardiac [56, 189]. Adaptarea la aceste condiții, se realizează în mod fiziologic prin stratificarea morfologică a cuspelor în 3 straturi (fibrosa, spongiosa, ventricularis), fiecare dintre acestea având un rol cheie în funcționalitatea valvei (detaliate în anatomia, histologia și fiziologia valvelor din partea generală a tezei). Structura anisotropică a cuspelor, printr-o rigiditate circumferențială accentuată față de axul radial, este esențială în durabilitate și în distribuția stress-ului mecanic [159, 207]. Homeostazia locală se menține într-un echilibru perfect prin acțiunea complementară a receptorilor mecano-sensibili, a mediatorilor paracrini, a proteinelor matricei extracelulare, a enzimelor de degradare și a inhibitorilor acestora [56]. Toate aceste fenomene nu pot să existe fără prezența de celule valvulare interstițiale viabile.
Crearea unei valve prin bioinginerie tisulară presupune crearea unui scaffold, biologic sau sintetic, care să fie ulterior populat, in vitro sau in vivo, cu celule specifice. Deseori, aceste structuri, odată implantate în organism, datorită prezenței miofibroblaștilor, au devenit disfuncționale, prin apariția unui proces fibrotic extensiv [208].
Ipoteza de lucru
Scaffold-uri acelulare au fost obținute prin decelularizarea de rădăcini aortice porcine și apoi au fost stabilizate cu pentagaloil glucoză (PGG), pentru a reduce rata de degenerare și calcificare [155-157]. Acestea au fost însămânțate cu celule stem adulte umane derivate din țesut adipos, celule care sunt relevante din punct de vedere clinic și și-au dovedit plasticitatea, diferențierea către celule specifice valvulare [159, 160]. După introducerea rădăcinilor aortice populate într-un bioreactor, probele au fost analizate în sensul prezenței de markeri specifici celulelor valvulare.
Expunerea progresivă a rădăcinilor valvulare la stimuli mecanici specifici ar trebui să stimuleze celulele spre diferențierea în fenotipul celulelor valvulare.
Materiale și metode
Obținerea scaffold-ului valvular
Corduri porcine au fost obținute de la un abator local și transportate corespunzător în laborator. Au fost prelevate rădăcinile aortice, distal, 2 cm deasupra joncțiunii sino-tubulare, iar inferior 4-5 cm de țesut subvalvular (valvula mitrală anterioară, țesut endo-miocardic). Arterele coronare au fost ligaturate după emergența lor din sinusuri. Rădăcinile aortice au fost decelularizate printr-o procedură de imersie cu soluții de detergenți și enzime și ulterior sterilizate conform protocolului [154]. Valvele au fost stocate în PBS steril până la utilizare.
Eficiența decelularizării a fost analizată histologic prin colorația H&E și DAPI (n = 4 valve). ADN-ul a fost extras și purificat din probele tisulare (n=4) utilizând DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), înainte de a se efectua electroforeza în gel de agaroză cu Ethidium Bromide și fotospectometrie cantitativă cu NanoDrop 2000c (Thermo Scientific). Cantitatea de ADN s-a exprimat în ng/ml de țesut uscat.
Rezistența la colagenază
Pentru evaluarea stabilității colagenului în cadrul scaffold-ului acelular obținut, cuspe tratate cu PGG și netratate au fost liofilizate și probe de 25-30 g din acestea au fost incubate (n = 8/grup) cu 10U de colagenază (Sigma, tip I) la 37ᵒC pe agitator. După 3 zile, probele au fost extrase, spălate, liofilizate și a fost calculată pierderea de masă procentual.
Pentru a se stabili tipul de interacțiune dintre PGG și scaffold, probe uscate din cuspele scaffold-ului acelular tratate cu PGG (n = 8/grup) au fost incubate la temperatura camerei cu 100% DMSO pentru a rupe legăturile hidrofobe și separat cu 4M guanidin-HCl pentru a rupe legăturile de hidrogen. După 24 de ore, probele au fost spălate, liofilizate și expuse la colagenază, ca mai sus, ulterior fiind calculată pierderea de masă procentual.
Hemodinamica valvei
A fost utilizat bioreactorul HBVR2000-P (Aptus, LLC, Central, SC), setat pentru testarea funcționalității valvulare în condiții pulmonare: 65 bătăi/minut, 25-10 mmHg și 70 ml volum bătaie.
Funcționalitatea bioreactorului a fost testată cu o valvă mecanică SJM nr. 19 și cu o valvă biologică Edwards nr 19. Ulterior, rădăcini aortice native, scaffold-uri acelulare și scaffold-uri acelulare tratate cu PGG derivate din acestea au fost montate pe inele metalice (Aptus, LLC). Aceste dispozitive sunt compatibile și cu rotatorul de condiționare și cu bioreactorul, astfel încât transferul țesuturilor dintr-un dispozitiv în altul să se realizeze într-o manieră „no touch”.
Valvele (n = 4/tip valvă) au fost testate în condiții de circulație pulmonară: 25/10 mmHg, 70 ml volum-bătaie, 65 bătăi/minut. Filme video au fost realizate la 240 fps cu o cameră performantă, și fiecare video frame a fost transformată în imagine format .jpg utilizând software-ul Free Studio v. 6.4.. Image J (NIH Freeware) a fost utilizat pentru măsurarea aria geometrică a orificiului (AGO) valvular pentru fiecare frame.
Însămânțarea scaffold-urilor cu celule stem
Celule stem adulte umane derivate din țesut adipos (hADSCs, Life Technologies, Inc.) au fost cultivate, realizându-se 3-4 pasaje în mediu MesenPRO RS. Înainte de însămânțare, rădăcinile aortice au urmat o p rocedură de neutralizare prin incubare în recipiente rotative conținând 50% FBS în DMEM pentru 22 ore la 37ᵒC. Celulele au fost centrifugate și ulterior suspendate într-o soluție, astfel încât densitatea celulară să fie de 8-10 mil. celule/ml. Injectarea celulară propriu-zisă a fost precedată de introducerea a 1 ml de aer steril la baza fiecărei cuspe utilizând un ac de 33G x 1¼ inch. Suspensia de celule a fost injectată în porțiunile inflate ale cuspelor (4 mil celule/ml). Valvele au fost împărțite în mod aleator în două grupuri: 1. condiționare în bioreactor pulsatil; 2. condiționare prin rotații 3D.
Condiționarea in vitro
Condiționarea în bioreactorul pulsatil a presupus montarea a 3 valve acelulare sterile [154] în sistemul care conținea DMEM/10% FBS cu 1% antibiotic-antimicotic. Presiunea a fost crescută progresiv de la 10 mmHg, pe o perioadă de 14 zile, până la presiuni pulmonare de 25/10 mmHg, 70 ml volum-bătaie și 65 bătăi/minut. Valvele au fost menținute încă 10 zile în aceste condiții în bioreactor, însumând astfel 24 zile de condiționare in vitro. Mediul a fost schimbat la 3-4 zile. Monitorizarea video ne-a asigurat că funcționalitatea valvelor s-a menținut în toată această perioadă.
Condiționarea în rotator s-a realizat prin introducerea a 3 valve în recipiente acrilice sterile conținând același mediu de cultură. Recipientele au fost prevăzute cu filtre permeabile pentru aer. După fixarea recipientelor în rotator, acestea au fost mobilizate prin rotații, control susținut prin software-ul LabView. Viteza de rotație a fost progresiv augmentată de la 2,5 rpm (rotații pe minut) orizontale și 5 rpm verticale, pe parcursul a 10 zile, la 10 rpm orizontale și 4 rpm verticale. Au mai fost menținute în aceste condiții încă 14 zile, însumând un total de 24 zile de condiționare. Mediul a fost schimbat la 3-4 zile. Aceste mișcări de rotație au permis fluxul lichidului prin și în afara valvei, fără ca valvulele să fie supuse vreunei presiuni, ci doar mișcări minime ale cuspelor au fost realizate.
Toate valvele condiționate au fost fixate în 10% formalină, incluse în blocuri de parafină și au fost realizate secțiuni de 5 µm. S-au efectuat colorații cu hematoxilină eozină, DAPI pentru nuclei și imunohistochimie pentru vimentină, actina alpha a celulelor musculare și prolil-hidroxilaza, o enzimă implicată în sinteza de colagen [156].
Rezultate
Proprietățile valvelor
Histologia cu H&E, DAPI și electroforeza a demonstrat decelularizarea completă a cuspelor valvelor porcine (Figura 28).
Figura 28. Imagini histologice reprezentative în colorație H&E (A) și DAPI (B) a cuspelor native și decelularizate – a se observa lipsa nucleilor. Scala de 100 microni în toate imaginile histologice. C – Analiza ADN prin electroforeză în gel de agaroză cu Ethidium Bromide și fotospectometrie cantitativă cu NanoDrop a cuspei native (N), decelularizate (D) și a unui standard pur de ADN (S) (adaptat după [189])
Măsurătorile cantitative ale conținutului de ADN în cuspe au demonstrat o reducere de peste 95 de procente, deci o decelularizare corespunzătoare [152, 167, 168].
Aplicarea tratamentului cu PGG a cuspelor acelulare a condus la creșterea rezistenței față de digestia colagenazei cu aproximativ 50%. Interacțiunea PGG-colagen au fost parțial compromise de 100% DMSO și separat de 4M GuHCl, indicând faptul că legăturile PGG-ului cu colagenul se realizează prin punți de hidrogen și de asemenea prin legături hidrofobice (Figura 29).
Figura 29. Degradarea indusă de colagenază a cuspelor acelulare netratate (control – Ctrl), a cuspelor acelulare tratate cu PGG (PGG), cele ulterior tratate cu cu 100% DMSO și separat cu 4M GuHCl (adaptat după [189])
Pentru evaluarea funcționalității valvelor, bioreactorul a fost mai întâi validat prin introducerea în sistem a unei valve biologice convenționale și a unei proteze mecanice în condiții pulmonare. Analiza video a arătat cu aceste două mostre au funcționat corespunzător, fără modificări hemodinamice pe parcursul a mai multor cicluri. Maximul ariei geometrice a orificiului (AGO) valvelor cu diametru de 19, a atins 250 mm2. Curbele aproape simetrice de deschidere/închidere a valvelor demonstrează o funcționalitate adecvată (Figura 30).
Figura 30. Validarea hemodinamică a bioreactorului prin testarea a unei valve tisulare Edwards nr. 19 (VT) și a unei proteze mecanice SJM nr. 19 (VM). Aria orificiului valvular și imagini reprezentative ale valvelor în cadrul ciclului cardiac de 500 ms: în poziție închisă (1,7), poziții intermediare (2,6), maxim deschis (3) (adaptat după [189])
Figura 31. Hemodinamica și valorile AGO în cadrul ciclului cardiac ale unei valve porcine native (Nativ), valve porcine decelularizate (Decel) și a uneia decelularizate și stabilizate cu PGG (PGG) (adaptat după [189])
Ulterior, am testat comparativ funcționalitatea valvelor obținute de noi, o valvă porcină decelularizată și una acelulară la care s-a aplicat stabilizarea cu PGG, cu o valvă porcină nativă netratată. Testele au arătat că valvele au atins deschiderea maximă de 200-300 mm2 pentru valvele de 19-21 mm după 40-50 msec și au rămas deschise pentru 300-350 msec și s-au închis în 50-100 msec, fără regurgitare (Figura 31).
Condiționarea in vitro
Pentru a evalua comportamentul celulelor stem sub acțiunea unor stimuli mecanici, am injectat celule stem adulte umane derivate din țesut adipos, în scaffold-uri valvulare acelulare stabilizate cu PGG și le-am introdus în bioreactor pentru a fi supuse unor condiții hemodinamice similare circulației pulmonare timp de 24 de zile. Grupul de control a fost reprezentat de același tip de valve repopulate, însă acestea au fost menținute într-un rotator, sistem care a permis imersia valvei în mediu de cultură, și fluxul acestuia prin și în jurul valvei odată cu inițierea rotațiilor (Figura 32).
Figura 32. Condiționare in vitro de xenograft-uri valvulare acelulare repopulate cu celule stem adulte: A – rădăcină aortică porcină fixată în inelul metalic universal. B – injectare celule stem în stratul ventricularis la nivelul bazei cuspelor. C – 3 valve însămânțate plasate în recipiente separate, sterile, conținând mediu de cultură. Agitatorul orbital va asigura mișcări în plan orizontal, iar stativul rotator va realiza rotații în plan vertical. D – imagine de ansamblu asupra bioreactorului. Săgeata localizează poziția valvei. E – imagini ale valvei închisă-deschisă privită de sus. E – condiționarea progresivă a valvelor în sistemul de rotație – linia roșie (rotații orizontale și verticale, exprimate prin rotații pe minut – RPM) și în bioreactor – linia neagră (linie determinată de valorile presionale progresiv crescânde) (adaptat după [189])
Funcționalitatea valvelor supuse presiunilor bioreactorului s-a păstrat pe toată durata studiului. Miscările de rotație au determinat de asemenea mobilizarea valvulelor în rotator.
Histologia cuspelor post-procedural utilizând colorația H&E, DAPI (Figura 33) și imunohisto-chimia pentru vimentină a arătat că majoritatea celulelor (>95%) valvelor plasate în bioreactor au fost distruse, doar niște debride celulare au fost identificate.
Figura 33. Histologia scaffold-urilor acelulare repopulate cu celule stem pre- și post condiționare. A, D, G – imagini cuspe imediat după injectarea celulelor stem (T=0). B, E, H – 24 zile după condiționarea în rotator. C, F, I – 24 zile după condiționarea în bioreactor. Colorație H&E și DAPI (albastru – nuclei). Scala de 100 µm în imaginile 10x și 20 µm în imaginile 40x. * – insule de celule injectate (adaptat după [189])
Cuspele supuse sistemului de rotație au pierdut aproximativ 50% din celule comparativ cu timpul 0 (T=0), dar totuși de 4-5 ori mai multe celule față de valvele condiționate în bioreactor.
Cele mai multe celule care au supraviețuit rotațiilor au exprimat vimentină (Figura 34), dar nu au fost pozitive la SMA (Figura 35) sau PHA (Figura 36).
Figura 34. Imunohistochimie pentru vimentină (pozitiv – maro) în cuspe native (A, D), cuspe însămânțate după 24 ore de condiționare în rotator (B, E), cuspe însămânțate după 24 ore de condiționare în bioreactor (C, F). Scala de 100 microni în imaginile 10x și 20 microni în imaginile 40x. imaginile suplimentare reprezintă controale negative IHC (adaptat după [189])
Figura 35. Imunohistochimie pentru actină specifică pentru celule musculare (pozitiv – maro) în cuspe native (A, D), cuspe însămânțate după 24 ore de condiționare în rotator (B, E), cuspe însămânțate după 24 ore de condiționare în bioreactor (C, F). Scala de 100 microni în imaginile 10x și 20 microni în imaginile 40x. imaginile suplimentare reprezintă controale negative IHC. Săgețile localizează celule pozitive IHC la actină (adaptat după [189])
Figura 36. Imunohistochimie pentru prolil-hidroxilază (pozitiv – maro) în cuspe native (A, D), cuspe însămânțate după 24 ore de condiționare în rotator (B, E), cuspe însămânțate după 24 ore de condiționare în bioreactor (C, F). Scala de 100 microni în imaginile 10x și 20 microni în imaginile 40x. imaginile suplimentare reprezintă controale negative IHC. Săgețile din D localizează celule ce exprimă PHA (adaptat după[189])
Discuții
O decelularizare completă a valvei aortice porcine și stabilizarea ei cu PGG creează un xenograft valvular funcțional din punct de vedere al prezervării matricei extracelulare și a proprietăților mecanice. Aplicarea tratamentului cu PGG în etapele finale ale decelularizării, un polifenol non-citotoxic care stabilizează fibrele de colagen și elastină, reduce susceptibilitatea la efectul colagenazei și crește durabilitatea scaffold-ului după implantarea in vivo [157, 159, 164, 169]. În studiul de față am arătat că PGG se leagă de colagen prin multiple punți de hidrogen și interacțiuni hidrofobe, ceea ce ar putea explica durabilitatea prelungită a scaffold-ului [154, 159, 164, 189].
Viabilitatea unei valve presupune prezența de celule care să asigure metabolismul local, integritatea matricei extracelulare prin sinteza de fibre de colagen și elastină, interacțiuni intercelulare care sunt indispensabile remodelării și regenerării tisulare pentru menținerea funcționalității valvulare.
Procedurile inițiale de repopulare a scaffold-urilor acelulare, au presupus însămânțarea statică datorită simplicității cu care se putea realiza, într-un laborator de culturi celulare, fără echipamente sofisticate. Rezultatele însă, au demonstrat o eficiență scăzută, o distribuție neuniformă a celulelor în cadrul scaffold-ului, îndeosebi în interiorul acestuia, chiar dacă au fost folosite materiale biocompatibile, cu pori de dimensiuni mari [68]. De aceea, doar în straturile superficiale ale scaffold-ului au fost observate fenomene de regenerare [209].
Diverse metode pentru facilitarea penetrării celulelor în interiorul scaffold-ului au fost descrise: centrifugare [210, 211], presiune joasă [212] sau perfuzie în bioreactor care s-a dovedit a fi cea mai eficientă [209].
În acest sens, ipoteza noastră a fost de a repopula scaffold-ul acelular cu celule stem adulte, care sub stimuli mecanici specifici vor difuza și se vor diferenția în celule valvulare. Acest proces l-am realizat prin injectarea directă de celule în baza cuspelor.
Simularea climatului fiziologic, a regimului presional, a fost realizat prin plasarea valvelor într-un bioreactor, care progresiv pe parcursul a câtorva zile a reprodus stimularea mecanică specifică circulației pulmonare. Grupul de control a fost constituit din valve introduse într-un sistem de rotație, care nu a supus cuspele la stress mecanic accentuat, dar suficient astfel încât să fie asigurat schimbul de gaze și nutrienți dintre valvă și mediul de cultură.
După 24 de zile în bioreactor, majoritatea celulelor injectate au decedat, lăsând în urmă doar niște debride celulare în fiecare cuspă. Comparativ, valvele menținute în rotator, au păstrat viabilitatea a aproximativ 50% din celule. Acest lucru denotă vulnerabilitatea celulelor stem adulte la stress-ul mecanic specific valvelor cardiace.
Yacoub et al [160, 191] au supus un monostrat de celule stem adulte umane derivate din țesut adipos la 10% tensiune equibiaxială în sistemul FlexerCell, iar aceste condiții mecanice nu a afectat viabilitatea celulelor. Studiul nostru a reprodus stimuli mecanici specifici cardiaci, care ar putea ridica suspiciunea că celulele stem sunt vulnerabile la mișcările tipice valvulare de pliere, tensionare, forțe de frecare [192, 206].
Sistemul de rotație a menținut viabilitatea unei proporții din celule injectate și mai mult decât atât celulele remanente au exprimat vimentină, dar nu și actină sau prolil-hidroxilază. Acești markeri pot fi luați în considerare în diferențierea in vitro a celulelor stem în celule interstițiale valvulare [56].
Concluzii
Valvele porcine acelulare stabilizate cu PGG reprezintă scaffold-uri valvulare adecvate în bioingineria tisulară. Însă odată însămânțate cu celule stem adulte provenite din țesut adipos, nu pot menține viabilitatea celulară când sunt supuse condițiilor circulației pulmonare.
De aceea, este probabil necesară o precondiționare mecanică progresivă mai îndelungată pentru adaptarea celulelor la stimuli mecanici specifici valvulari și o ulterioară diferențiere a celulelor.
Perspective de viitor
Alegerea scaffold-ului și a tipului de celule este de importanță crucială pentru atingerea scopului terapeutic dorit. Celulele trebuie să fie capabile de regenerare tisulară și, de asemenea, să asigure remodelarea matricei extracelulare în concordanță cu necesitățile organismului gazdă. Poate o combinație de celule ar reprezenta o soluție. Pacienții pediatrici reprezintă grupa de vârstă cu cea mai mare cerere al unui produs obținut prin bioinginerie tisulară care să ofere funcționalitate durabilă, să înlăture necesitatea reintervențiilor de multe ori laborioase și riscante.
Produsele obținute din medicina regenerativă și bioingineria tisulară reprezintă o categorie așa-numită a produselor medicale de terapie avansată. Materia primă a acestor produse, scaffold-ul și celulele, precum și asocierea lor, trebuie manufacturate și controlate conform standardelor de calitate (GMP – Good Manufacturing Practice). Astfel, comportamentul celulelor în cadrul scaffold-urilor trebuie monitorizate în privința conservării proprietăților mecanice, a eficienței și siguranței, prin teste preclinice, prin implantare în modele animale adecvate. Ulterior, după demonstrarea calităților produsului și menținerii funcționalității a graft-ului in vivo, se poate trece la teste clinice experimentale, iar apoi să fie introduse în practica clinică de rutină.
Ce pași am reușit să realizăm pentru obținerea valvei ideale?
Scaffold-ul cu origine xenogeneică
Indisponibilitatea allograft-urilor în practica clinică, ne obligă să ne orientăm strategiile către abordarea unui xenograft. Am demonstrat că putem obține un scaffold aortic și pulmonar complet decelularizat (cuspe, țesut miocardic subvalvular, sinusuri, perete aortic) într-un sistem de perfuzie inovativ, respectiv prin imersie. Prezervarea structurii matricei extracelulare și a proprietăților mecanice au fost evidențiate histologic, pe teste mecanice in vitro și in vivo, după implantarea în model animal ovin.
Sursa celulară
Datorită capacității de diferențiere a celulelor stem adulte derivate din țesut adipos înspre celule musculare netede, celule endoteliale și fibroblaști [213], am ales această sursă celulară pentru repopularea scaffold-urilor. După prelevare de țesut adipos din regiunea interscapulară, am izolat celule stem din care am obținut culturile celulare necesare.
Însămânțarea internă a graft-urilor acelulare cu celule stem adulte
Studiile din literatură au evidențiat faptul că popularea scaffolf-ului cu celule plasate superficial, dispar odată cu expunerea valvei la fluxul sanguin. De aceea am optat pentru însămânțarea internă prin injectare directă de celule la nivelul bazei cuspelor.
Xenograft-uri valvulare acelulare funcționale in vivo timp de 6 luni pe model animal ovin în poziție pulmonară
Grupul de animale cărora le-am implantat valve acelulare stabilizate cu PGG și-au păstrat funcționalitatea până la termenul limită de 6 luni. Ovinele au avut o evoluție fiziologică postoperator, fără semne sau simptome de insuficiență de organ. Aspectul macroscopic și histologic al explantelor nu a arătat degenerare, calcificare sau inflamație.
Ce proceduri trebuie îmbunătățite?
Diferențierea celulară
Studiile efectuate de noi evidențiază vulnerabilitatea celulelor stem față de stimulii mecanici fiziologici după implantarea in vivo și chiar și după expunerea lor în bioreactor. Diferențierea celulelor stem in vitro către fenotipurile specifice valvulare și ulterior plasate la nivelul scaffold-ului, probabil, le va menține vitalitatea după expunerea la fluxul sanguin.
Precondiționarea în bioreactor a scaffold-urilor repopulate
Anterior implantării in vivo, graft-urile repopulate cu celule diferențiate trebuie expuse progresiv la stimuli mecanici până la intensitatea celor fiziologici, pentru a le permite o bună difuziune și atașare în cadrul matricei, precum și formarea de legături intercelulare și dintre celule și suportul lor, interacțiuni atât de importante în metabolismul local. Bioreactorul poate simula aceste condiții hemodinamice, dar expunerea bruscă a valvei repopulate conduce la decesul celulelor. De aceea creșterea progresivă a regimului presional poate fi o soluție în adaptarea celulelor.
Astfel, din studiile efectuate până acum reiese faptul că diferențierea și însămânțarea celulelor, precum și condiționarea graft-urilor valvulare repopulate sunt puncte critice ale succesului medicinei regenerative.
Ne-am propus ca următoarele studii să aibă următoarele axe de cercetare:
Diferențierea celulelor stem adulte în celule musculare netede, fibroblaști și celule endoteliale prin utilizarea de factori de creștere specifici; analize privind expresia de gene și proteine vor valida aceste fenotipuri celulare
Însămânțarea internă prin metode îmbunătățite de injectare a celulelor valvulare interstițiale în interiorul scaffold-ului, la nivelul tuturor componentelor lui: cuspe și rădăcina aortică
Însămânțarea externă prin plasarea de celule endoteliale pe toată suprafața scaffold-ului care vine în contact cu fluxul sanguin prin utlizarea de sisteme de rotație 3D
Condiționarea mecanică a scaffold-urilor repopulate, inițial prin introducerea lor în sisteme de rotație, ulterior în bioreactoare, cu regimuri presionale progresiv crescânde
Evaluarea viabilității celulare în cadrul scaffold-ului, anterior implantării in vivo
Implantarea ortotopică a graft-urilor repopulate în poziție aortică/pulmonară cu utilizarea circulației extracorporeale
Figura 37. Posibile strategii de viitor pentru management-ul terapeutic al nou-născuților cu malformații cardiace congenitale (MCC) (adaptat după [68])
Un scenariu de strategie terapeutică ideală e ilustrat în figura 37. Dezvoltarea metodelor de diagnostic neo-natal sau chiar intrauterin, permite o abordare chirurgicală reconstructivă, bazată pe medicina regenerativă, fără necesitatea reintervențiilor atât de problematice în rândul copiilor.
Chiar dacă în momentul de față ne aflăm în stadiul de pionierat în acest domeniu vast, încă insuficient cunoscut, premizele și scopul sunt încurajatoare.
REFERINȚE
1. Paul A. Iaizzo, R.W.B., Alexander J. Hill, James D. St. Louis, Heart Valves From Design to Clinical Implantation. 2013.
2. Furukawa K1, O.H., Cao ZL, Doi K, Narita Y, Minato N, Itoh T., Does dilatation of the sinotubular junction cause aortic regurgitation? Ann Thorac Surg, 1999 Sep. 68(3):949-53.
3. Simionescu DT, C.J., Jaeggli M, Wang B, Liao J Form Follows Function: Advances in Trilayered Structure Replication for Aortic Heart Valve Tissue Engineering. J. Health Eng., 2012 Jun. 3(2): p. 179-202.
4. Journals, O. The surgical anatomy of the aortic root. Multimedia Manual Cardio-Thoracic Surgery 2016 http://mmcts.oxfordjournals.org/content/2007/0219/mmcts.2006.002527/F10.expansion]; ISSN 1813-9175].
5. Yacoub, M.H., Kilner, P.J., Birks, E.J., Misfeld, M., The aortic outflow and root: a tale of dynamism and crosstalk. Ann. Thorac. Surg, 1999. 68, S37-S43.
6. Dagum, P., Green, G.R., Nistal, F.J., et al, Deformational dynamics of the aortic root: modes and physiologic determinants. Circulation, 1999. 100, II54-II62.
7. Boccaccini, A.R., Harding, S. E. , Heart Valve Tissue Engineering, in Myocardial Tissue Engineering. 2011: Springer-Verlag Berlin Heidelberg. p. 245.
8. Higashidate, M., Tamiya, K., Beppu, T., Imai, Y., Regulation of the aortic valve opening. In vivo dynamic measurement of aortic valve orifice area. J. Thorac. Cardiovasc. Surg, 1995. 110, 496-503.
9. Thubrikar, M., Nolan, S.P., Bosher, L.P., Deck, J.D., The cyclic changes and structure of the
base of the aortic valve. Am. Heart J, 1980. 99, 217-224.
10. Thubrikar, M., Piepgrass, W.C., Shaner, T.W., Nolan, S.P., The design of the normal aortic valve. Am. J. Physiol, 1981. 241, H795-H801.
11. Marron K, Y.M., Polak JM et al Innervation of human atrioventricular and arterial valves. Circulation, 1996. 94:368-375.
12. Taylor, P.M., Allen, S.P., Yacoub, M.H., Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. J. Heart Valve Dis, 2000. 9,150-158.
13. Hafizi, S., Taylor, P.M., Chester, A.H., Allen, S.P., Yacoub, M.H., Mitogenic and secretory responses of human valve interstitial cells to vasoactive agents. J. Heart Valve Dis, 2000. 9,454-458.
14. Seres Sturm, L., Brinzaniuc, K., Nicolescu, C., Anatomia trunchiului. 2004: Targu Mures: University Press.
15. Yacoub MH, C.L., Novel approaches to cardiac valve repair: from structure to function: Part I. Circulation, 2004 Mar 2. 109(8):942-50.
16. Millington-Sanders C, M.A., Lawrence L, Stolinski C, Structure of chordae tendineae in the left ventricle of the human heart. J Anat, 1998 May. 192 ( Pt 4)():573-81.
17. Carpentier A, A.D., Filsoufi F., Carpentier's reconstructive valve surgery. 2010: Maryland Heights: Saunders-Elsevier.
18. Aktas EO, G.F., Kocak A, Boydak B, Yavuz IC, Variations in the papillary muscles of normal tricuspid valve and their clinical relevance in medicolegal autopsies. Saudi Med J, 2004 Sep. 25(9):1176-85.
19. Sievers, M.M.a.H.-H., Heart valve macro- and microstructure. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci., 2007 Aug 29. 362(1484): 1421–1436.
20. Stradins, P., Lacis, R., Ozolanta, I., Purina, B., Ose, V., Feldmane, L., Kasyanov, V., Comparison of biomechanical and structural properties between human aortic and pulmonary valve. Eur J Cardiothorac Surg, 2004 Sep. 26(3):634-9.
21. Anderson, R., Clinical anatomy of the aortic root. Heart, 2000. 84(6):670-3.
22. Schoen, F.J.a.L., R.J. , Tissue heart valves: current challenges and future research perspectives. J Biomed Mater Res, 1999. 47(4): p. 439-65.
23. Talman, E.A.a.B., D.R. , Glutaraldehyde fixation alters the internal shear properties of porcine aortic heart valve tissue. Ann Thorac Surg, 1995. 60(2 Suppl): p. S369-73.
24. Talman, E.A.a.B., D.R., Internal shear properties of fresh porcine aortic valve cusps: implications for normal valve function. J Heart Valve Dis, 1996. 5(2): p. 152-9.
25. Simionescu, D., Alper R. and Kefalides N.A. , Partial characterization of a low molecular weight proteoglycan isolated from bovine parietal pericardium. Biochem Biophys Res Commun, 1988. 151(1): p. 480-6.
26. Simionescu, D., Iozzo, R.V. and Kefalides, N.A., Bovine pericardial proteoglycan: biochemical, immunochemical and ultrastructural studies. Matrix, 1989. 9(4): p. 301-10.
27. Simionescu, D.T.a.N.A.K., The biosynthesis of proteoglycans and interstitial collagens by bovine pericardial fibroblasts. Exp Cell Res, 1991. 195(1): p. 171-6.
28. Schoen, F.J., Aortic valve structure-function correlations: role of elastic fibers no longer a stretch of the imagination. J Heart Valve Dis, 1997. 6(1): p. 1-6.
29. Schachar, N., et al., Metabolic and biochemical status of articular cartilage following cryopreservation and transplantation: a rabbit model. J Orthop Res, 1992. 10(5): p. 603-9.
30. Schoen, F.J., Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation, 2008. 118(18): p. 1864-80.
31. Stella, J.A.a.S., M.S. , On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. J Biomech Eng, 2007. 129(5): p. 757.
32. Deck, J.D., Endothelial-Cell Orientation on Aortic-Valve Leaflets. Cardiovascular Research, 1986. 20(10): p. 760-767.
33. Simionescu, D.T., J.J. Lovekamp, and N.R. Vyavahare, Degeneration of bioprosthetic heart valve cusp and wall tissues is initiated during tissue preparation: an ultrastructural study. J Heart Valve Dis, 2003. 12(2): p. 226-34.
34. Simionescu, D.T., J.J. Lovekamp, and N.R. Vyavahare, Glycosaminoglycan-degrading enzymes in porcine aortic heart valves: implications for bioprosthetic heart valve degeneration. J Heart Valve Dis, 2003. 12(2): p. 217-25.
35. Simionescu, D.T., J.J. Lovekamp, and N.R. Vyavahare, Extracellular matrix degrading enzymes are active in porcine stentless aortic bioprosthetic heart valves. J Biomed Mater Res, 2003. 66A(4): p. 755-63.
36. Liu, A.C., V.R. Joag, and A.I. Gotlieb, The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. Am J Pathol, 2007. 171(5): p. 1407-18.
37. Taylor, P.M., et al, The cardiac valve interstitial cell. Int J Biochem Cell Biol, 2003. 35(2): p. 113-8.
38. Ku, C.H., et al, Collagen synthesis by mesenchymal stem cells and aortic valve interstitial cells in response to mechanical stretch. Cardiovasc Res, 2006. 71(3): p. 548-56.
39. Latif, N., et al, Characterization of structural and signaling molecules by human valve interstitial cells and comparison to human mesenchymal stem cells. J Heart Valve Dis, 2007. 16(1): p. 56-66.
40. Mendelson, K.a.F.J.S., Heart valve tissue engineering: concepts, approaches, progress, and challenges. Ann Biomed Eng, 2006. 34(12): p. 1799-819.
41. Komuro, T., Re-evaluation of fibroblasts and fibroblast-like cells. Anat. Embryol, 1990. 182, 103-112.
42. Weind, K., Ellis, CG., Boughner, DR, The aortic valve blood supply. J Heart Valve Dis, 2000 Jan. 9(1):1-7.
43. Weind, K., Ellis, CG., Boughner DR, Aortic valve cusp vessel density: relationship with tissue thickness. J Thorac Cardiovasc Surg., 2002 Feb. 123(2):333-40.
44. Missirlis YF, A.C., Ultrastructure of the human aortic valve. Acta Anat (Basel), 1977. 98(2):199-205.
45. Sauren, A., Kuijpers, W., van Steenhoven, AA., Veldpaus, FE, Aortic valve histology and its relation with mechanics-preliminary report. J Biomech Eng, 1980. 13(2):97-104.
46. Ross, D., Replacement of aortic and mitral valves with a pulmonary autograft. Lancet, 1967 Nov 4. 2(7523):956-8.
47. Filip DA, R.A., Simionescu M, Interstitial cells of the heart valves possess characteristics similar to smooth muscle cells. Circ Res, 1986. 59:310-320.
48. Icardo JM, C.E., Atrioventricular valves of the mouse: III Collagenous skeleton and myotendinous junction. Anat Rec, 1995. 243:367-375.
49. Icardo JM, C.E., Atrioventricular valves of the mouse: II Light and transmission electron microscopy. Anat Rec, 1995. 241:391-400.
50. Fenoglio JJ Jr, T.D.P., Wit AL et al Canine mitral complex Ultrastructure and electromechanical properties. Circ Res, 1972. 31:417-430.
51. Itoh A, K.G., Swanson JC et al, Active stiffening of mitral valve leaflets in the beating heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2009. 296:H1766-1773.
52. Becker AE, d.W.A., Mitral valve apparatus A spectrum of normality relevant to mitral prolapse. Br Heart J, 1979. 42:680-689.
53. Laske TG, S.M., Iaizzo PA, The cardiac conduction system. In: Iaizzo PA (ed) The handbook of cardiac anatomy, physiology, and devices, 2nd. 2009, Totowa NJ: edn. Humana Press.
54. Barker TA, W.I., Surgical anatomy of the mitral and tricuspid valve, ed. P.D. Bonser RS, Haverich A (eds) Mitral valve surgery. 2011, Springer, London.
55. David TE, G.G., Feindel CM, Regesta T, Armstrong S, Maganti MD, Surgical treatment of active infective endocarditis: A continued challenge. J Thorac Cardiovasc Surg, 2007. 133: p. 144-149.
56. Chester AH, E.-H.I., Butcher JT, Latif N, Bertazzo S, Yacoub MH, The living aortic valve: From molecules to function. Glob Cardiol Sci Pract, 2014. 2014: p. 52-77.
57. Nkomo VT, G.J., Skelton TN, Gottdiener JS, Scott CG, EnriquezSarano M, Burden of valvular heart diseases: a population based study. Lancet, 2006. 368: p. 1005-1011.
58. Rosamond W, F.K., Furie K et al, Heart disease and stroke statistics 2008 update: a report from the American Heart Association statistics committee and stroke statistics subcommittee. Circulation, 2008. 117: p. E25E146.
59. VT, N., Epidemiology and prevention of valvular heart diseases and infective endocarditis in Africa. Heart 2007. 93: p. 1510-1019.
60. Zilla P, B.J., Human P, Bezuidenhout D, Prosthetic heart valves: catering for the few. Biomaterials, 2008. 29: p. 385-406.
61. Iung B, B.G., Butchart EG et al, A prospective survey of patients with valvular heart disease in Europe: the Euro Heart Survey on valvular heart disease. Eur. Heart J, 2003. 24: p. 1231-1243.
62. Goldbarg SH, E.S., Miller MA, Fuster V, Insights into degenerative aortic valve disease. J. Am. Coll. Cardiol, 2007. 50: p. 1205-1213.
63. Anita Mol, A.I.S., Carlijn VC Bouten and Frank PT Baaijens, Tissue engineering of heart valves: advances and current challenges. Expert Review of Medical Dev ices, 2009 May. 6.3: p. 259.
64. Ginghina, C., Mic tratat de cardiologie. Ed. Acad. Rom, 2010. Cap 16 – Valvulopatiile: p. 401.
65. Friedewald VE, B.R., Borer JS et al, The editor's roundtable: cardiac valve surgery. Am. J. Cardiol, 2007. 99: p. 1269-1278.
66. Yacoub MH, T.J., Will heart valve tissue engineering change the world? Nat. Clin. Pract. Cardiovasc, 2005. Med. 2: p. 6061.
67. Mikos AG, H.S., Ochareon P et al, Engineering complex tissues. Tissue Eng, 2006. 12: p. 3307-3339.
68. Elisa Avolio, M.C.a.P.M., Stem cell therapy and tissue engineering for correction of congenital heart disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology – Review, 2015. 3 (29).
69. Hammermeister K, S.G., Henderson WG, Grover FL, Oprian C, Rahimtoola SH, Outcomes 15 years after valve replacement with a mechanical versus a bioprosthetic valve: final report of the Veterans Affairs randomized trial. J. Am. Coll. Cardiol, 2000. 36: p. 1152-1158.
70. Oxenham H, B.P., Wheatley DJ et al, Twenty year comparison of a Bjork-Shiley mechanical heart valve with porcine bioprostheses. Heart, 2003. 89: p. 715-721.
71. Jamieson WRE, V.L.O., Miyagishima RT et al, Performance of bioprostheses and mechanical prostheses assessed by composites of valverelated complications to 15 years after mitral valve replacement. J. Thorac. Cardiovasc. Surg, 2005. 129: p. 1301-1308.
72. Chan V, J.W., Germann E et al, Performance of bioprostheses and mechanical prostheses assessed by composites of valverelated complications to 15
years after aortic valve replacement. J. Thorac. Cardiovasc. Surg, 2006. 131: p. 1267-1273.
73. Eichinger WB, H.I., Ruzicka DJ et al, Twenty year experience with the St. Jude Medical Biocor bioprosthesis in the aortic position. Ann. Thorac. Surg, 2008. 86: p. 1204-1211.
74. Lund O, B.M., Risk corrected impact of mechanical versus bioprosthetic valves on longterm mortality after aortic valve replacement. J. Thorac. Cardiovasc. Surg, 2006. 132: p. 2026.
75. Brown ML, S.H., Lahr BD et al, Aortic valve replacement in patients aged 50 to 70 years: improved outcome with mechanical versus biologic prostheses. J. Thorac. Cardiovasc Eng Technol Surg, 2008. 135: p. 878-884.
76. Koertke H, M.K., Boethig D et al, INR selfmanagement permits lower anticoagulation levels after mechanical heart valve replacement. Circulation, 2003. 108(Suppl.II): p. 75-78.
77. Koertke H, Z.A., Tenderich G et al, Low dose oral anticoagulation in patients with mechanical heart valve prostheses: final report from the SelfManagement
Anticoagulation trial II. Eur. Heart J, 2007. 28: p. 2479-2484.
78. Koolbergen DR, H.M., de Heer E et al, Structural degeneration of pulmonary homografts used as aortic valve substitute underlines early graft failure. Eur. J. Cardiothorac. Surg, 2002. 22: p. 802-807.
79. Jennings LM, B.M., Booth C, Watterson KG, Fisher J, The pulmonary bioprosthetic heart valve: its unsuitability as an aortic valve replacement. J. Heart Valve Dis, 2002. 11: p. 668-678.
80. Schoof PH, T.J., van Suylen R et al, Degeneration of the pulmonary autograft: an explant study. J. Thorac. Cardiovasc. Surg, 2006. 132: p. 1426-1432.
81. Klieverik LMA, T.J., Bekkers JA, RoosHesselink JW, Witsenburg M, Bogers AJJC, The Ross operation: a Trojan horse? Eur. Heart J, 2007. 28: p. 1993-2000.
82. Bloomfield, P., Choice of heart valve prothesis. Heart, 2002. 87: p. 583-589.
83. Magilligan Dj, O.C., Klien S, Riddle JM, Smith D, Plateled adherence to bioprosthetic cardiac valves. Am J Cardio, 1984. 53: p. 945-949.
84. Walley VM, K.W., Patterns of failure in Ionescu-Shiley bovine pericardial bioprosthetic valves. J Thorac Cardiovasc Surg, 1987. 93: p. 925-933.
85. AE, W., Use of glutaraldehyde and formaldehyde to process tissue heart valves. Bioengineering, 1977. 2: p. 1-8.
86. Dahm M, H.M., Mayer E, Prufer D, Groh E, Oelert H, Relevance of immunologic reactions for tissue failure of bioprosthetic heart valves. Ann Thorac Surg, 1995. 60: p. S348-S352.
87. Pok, S., andJacot,J.G, Biomaterials advances in patches for congenital heart defect repair. J.Cardiovasc.Transl.Res, 2011. 4: p. 646–654.
88. Al-Halees, Z., Pieters,F.,Qadoura,F.,Shahid,M.,Al-Amri,M.,andAl-Fadley,F, The Ross procedure is the procedure of choice for congenital aortic valve disease. J.Thorac.Cardiovasc.Surg, 2002. 123: p. 437–441.
89. Simon, P., Aschauer,C.,Moidl,R.,Marx,M.,Keznickl,F.P.,Eigenbauer,E.,et al, Growth of the pulmonary autograft after the Ross operation in childhood. Eur.J.Cardiothorac.Surg, 2001. 19: p. 118–121.
90. Dohmen, P.M., Lembcke,A.,Hotz,H.,Kivelitz,D.,and Konertz,W.F., Ross operation with a tissue-engineered heart valve. Ann.Thorac.Surg, 2002. 74: p. 1438–1442.
91. Gabbieri, D., Dohmen,P.M.,Linneweber,J.,Lembcke,A.,Braun, J.P.,and Konertz,W, Ross procedure with a tissue-engineered heart valve in complex congenital aortic valve disease. J.Thorac.Cardiovasc.Surg, 2007. 133: p. 1088–1089.
92. Neumann, A., Cebotari,S.,Tudorache,I.,Haverich,A.,and Sarikouch,S, Heart valve engineering: decellularized allograft matrices in clinical practice. Biomed.Tech.(Berl), 2013. 58: p. 453–456.
93. Ruel, M., Kulik,A.,Lam,B.K.,Rubens,F.D.,Hendry,P.J.,Masters,R.G.,et al, Long-term outcomes of valve replacement with modern prostheses in young adults. Eur.J.Cardiothorac.Surg, 2005. 27: p. 425–433.
94. D. Schmidt, U.A.S., S.P. Hoerstrup, Tissue engineering of heart valves using decellularized xenogeneic or polymeric starter matrices. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2007. 362: p. 1505–1512.
95. Cheema, F.H., Polvani,G.,Argenziano,M.,and Pesce,M, Combining stem cells and tissue engineering in cardiovascular repair-a step forward to derivation of novel implants with enhanced functionand self-renewal characteristics. RecentPat.Cardiovasc.DrugDiscov, 2012. 7: p. 10–20.
96. Smit, F.E., and Dohmen,P.M, Cardiovascular tissue engineering: where we come from and where are we now? Med.Sci.Monit.BasicRes, 2015. 21: p. 1–3.
97. Macchiarini, P., Jungebluth,P.,Go,T.,Asnaghi,M.A.,Rees, L.E.,Cogan,T.A.,et al, Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet, 2008. 372: p. 2023–2030.
98. Badylak, S.F., Weiss,D.J.,Caplan,A.,andMacchiarini,P, Engineered whole organs and complex tissues. Lancet, 2012. 379: p. 943–952.doi:10.1016/S0140-6736(12)60073-7.
99. Vacanti, C.A., Paige,K.T.,Kim,W.S.,Sakata,J.,Upton,J.,and Vacanti,J.P, Experimental tracheal replacement using tissue-engineered cartilage. J.Pediatr.Surg, 1994. 29: p. 201–204.discussion:204–205.doi:10.1016/0022-3468(94)90318-2.
100. Butcher, J.T., Mahler,G.J.,andHockaday,L.A, Aortic valve disease and treatment: the need for naturally engineered solutions. Adv.DrugDeliv.Rev, 2011. 63: p. 242–268.
101. Dean, E.W., Udelsman,B.,andBreuer,C.K., Current advances in the translation of vascular tissue engineering to the treatment of pediatric congenital heart disease. YaleJ.Biol.Med, 2012. 85: p. 229–238.
102. Kalfa, D., and Bacha,E., New technologies for surgery of the congenital cardiac defect. Rambam Maimonides Med.J, 2013. 4: p. e0019.doi:10.5041/RMMJ.10119.
103. Alsoufi, B., Aortic valve replacement in children: options and outcomes. J.SaudiHeartAssoc, 2014. 26: p. 33–41.doi:10.1016/j.jsha.2013.11.003.
104. Sachin Avasthi, R.N.S., Ajai Singh, Stem Cell: Past, Present and Future- A Review Article. Internet Journal of Medical Update, 2008. Vol. 3.
105. Wilmut I, S.A., McWhir J, Kind AJ, Campbell KH, Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 1997. 385810- 813.
106. Dusko Ilic, a.J.M.P., Stem cells in regenerative medicine: introduction. British Medical Bulletin, 2011. 98: p. 117–126.
107. Li C, V.C., Jin HJ, Kim HJ, Kaplan DL, Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials, 2006. 27: p. 3115.
108. Zhang, W., Walboomers, X.F., Wolke, J.G., Bian, Z., Fan, M.W., and Jansen, J.A, Differentiation ability of rat postnatal dental pulp cells in vitro. Tissue Eng, 2005. 11: p. 357.
109. Gianluca Sampogna, S.Y.G., Antonello Forgione, Regenerative medicine: Historical roots and potential strategies in modern medicine. Journal of Microscopy and Ultrastructure, September 2015. 3(3): p. 101-107.
110. Trucco, M., Regeneration of the pancreatic β cell. The Journal of Clinical Investigation, January 2005 115(1): p. http://dx.doi.org/10.1172/JCI23935.
111. Chen, M.Y., Lie,P.C.,Li,Z.L.,and Wei,X., Endothelial differentiation of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells in comparison with bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp.Hematol., 2009. 37: p. 629–640.doi:10.1016/j.exphem.2009.02.003.
112. Wu, K.H., Mo,X.M.,Zhou,B.,Lu,S.H.,Yang,S.G.,Liu,Y.L.,et al., Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J.Cell.Biochem., 2009. 107: p. 926–932.doi:10.1002/jcb.22193.
113. B. Barrilleaux, D.G.P., D.J. Prockop, K.C. O’Connor, Review: ex vivo engineering of living tissues with adult stem cells. Tissue Eng, 2006. 12: p. 3007-19.
114. Takahashi, K., Tanabe,K.,Ohnuki,M.,Narita,M.,Ichisaka, T.,Tomoda,K.,et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007. 131: p. 861–872.doi:10.1016/j.cell.2007.11.019.
115. Yu, J., Vodyanik,M.A.,Smuga-Otto,K.,Antosiewicz-Bourget,J.,Frane,J.L.,Tian,S.,et al., Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007. 318: p. 1917–1920.doi:10.1126/science1151526.
116. Lundy, S.D., Zhu,W.Z.,Regnier,M.,andLaflamme,M.A., Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. StemCellsDev, 2013. 22: p. 1991–2002.doi:10.1089/scd.2012.0490.
117. Yoder, M.C., Differentiation of pluripotent stem cells into endothelial cells. Curr.Opin.Hematol, 2015. 22: p. 252–257.doi:10.1097/MOH.0000000000000140.
118. Mayshar, Y., Ben-David,U.,Lavon,N.,Biancotti,J.C.,Yakir,B.,Clark,A.T.,et al., Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. CellStemCell, 2010. 7: p. 521–531.doi:10.1016/j.stem.2010.07.017.
119. Prockop, D.J., Gregory, C.A., and Spees, J.L, One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proc. Natl. Acad. Sci, 2003. 100: p. 1191-7.
120. Marshall GP 2nd, L.E., Zheng T, et al, In vitro-derived "neural stem cells" function as neural progenitors without the capacity for self-renewal. Stem Cells, 2006. 24(3): p. 731-8.
121. M. Dhanasekaran, S.I., R. Poojitha, A. Kanmani, J. S. Rajkumar, D. Sudarsanam Plasticity and banking potential of cultured adipose tissue derived mesenchymal stem cells. Cell and Tissue Banking, 2012.
122. Behnaz Bakhshandeh, M.H., Nasser Ghaemi, Masoud Soleimani, Down-regulation of miRNA-221 triggers osteogenic differentiation in human stem cells. Biotechnology Letters, 2012.
123. P, S.A.D.M.E.I.S.N., Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends. J Porous Mater, 2012. 19: p. 181.
124. S, H., Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater, 2005. 4: p. 518.
125. S.N, L.T.V.B., Three-dimensional tissue fabrication. Adv Drug Deliv Rev, 2004. 56: p. 1635.
126. M, C.E.C.D.P.C.V., Fabrication of porous substrates: a review of processes using pore forming agents in the biomaterial field. J Pharm Sci, 2008. 97: p. 1135.
127. F. Baino, G.N., C. Vitale-Brovarone, Bioceramics and scaffolds: a winning combination for tissue engineering. Front. Bioeng. Biotechnol, 2015. 3: p. 202.
128. Sodian R, S.J.S., Martin D.P, Fabrication of trileaflet heart valves from polyhydroxyalkanoate biopolyester for use in tissue engineering. Tissue Eng, 2000. 6: p. 183–188.
129. Shinoka T, S.-T.D., Ma P.X, Creation of viable pulmonary artery autografts through tissue engineering. J. Thorac. Cardiovasc. Surg, 1998. 115: p. 536–546.
130. Shinoka T, M.P.X., Shum-Tim D, Tissue engineered heart valves. Autologous valve leaflet replacement study in a lamb model. Circulation, 1996. 94,Suppl. II: p. 164-168.
131. Shinoka T, B.C., Tanel RE, Zund G, Miura T, Ma PX, et al, Tissue engineering heart valves: valve leaflet replacement study in a lamb model. Ann Thorac Surg, 1995 Dec. 60(6 Suppl): p. S513-6.
132. Sodian R, H.S.P., Sperling J.S, Evaluation of biodegradable, three-dimensional matrices for tissue engineering of heart valves. ASAIO J, 2000. 46: p. 107–11.
133. T.G, N.Y.S.Y.J.J.P., A novel fabrication method of macroporous biodegradable polymer scaffolds using gas foaming salt as a porogen additive. J Biomed Mater Res, 2000. 53:1.
134. G, W.K.T.C.H.K.N., A novel method to fabricate bioabsorbable scaffolds. Polymer, 1995. 36:837.
135. Fallahiarezoudar, E., Ahmadipourroudposht,M.,Idris,A.,and MohdYusof,N., A review of: application of synthetic scaffold in tissue engineering heart valves. Mater.Sci.Eng.CMater.Biol.Appl, 2015. 48: p. 556–565.doi: 10.1016/j.msec.2014.12.016.
136. Ghanbari, H., Viatge,H.,Kidane,A.G.,Burriesci,G.,Tavakoli,M.,and Seifalian,A.M, Polymeric heart valves: new materials,emerging hopes. Trends Biotechnol., 2009. 27: p. 359–367.
137. Alessandro Gandaglia, A.B., Filippo Naso, Michele Spina, Gino Gerosa, Cells, scaffolds and bioreactors for tissue-engineered heart valves: a journey from basic concepts to contemporary developmental innovations. European Journal of Cardio-thoracic Surgery, 2011. 39: p. 523-531.
138. Hoehn A, K.D., Stodieck LS, A modular suite of hardware enabling spaceflight cell culture research. J Gravit Physiol 2004. 11: p. 39-49.
139. Ruel J, L.G., A new bioreactor for the development of tissueengineered heart valves. Ann Biomed Eng, 2009. 37: p. 674—81.
140. Reul H, P.K., Durability/wear testing of heart valve substitutes. J Heart Valve Dis, 1998. 7: p. 151-7.
141. Dumont K, Y.J., Verbeken E, Segers P, Meuris B, Vandenberghe S, Flameng W, Verdonck PR, Design of a new pulsatile bioreactor for tissue engineered aortic heart valve formation. Artif Organs, 2002. 26: p. 710—4.
142. Seliktar D, N.R., Galis ZS, Mechanical strain-stimulated remodeling of tissue-engineered blood vessel constructs. Tissue Eng, 2003. 9: p. 657—66.
143. Solan A, M.S., Moses M, Niklason L, Effect of pulse rate on collagen deposition in the tissue-engineered blood vessel. Tissue Eng, 2003. 9: p. 579—86.
144. Sodian R, H.S., Sperling JS, Daebritz SH, Martin DP, Schoen FJ, Vacanti JP, Mayer Jr JE, Tissue engineering of heart valves: in vitro experience. Ann Thorac Surg, 2000. 70.
145. Hoerstrup SP, S.R., Daebritz S, Wang J, Bacha EA, Martin DP, Moran AM, Guleserian KJ, Sperling JS, Kaushal S, Vacanti JP, Schoen FJ, Mayer Jr JE, Functional living trileaflet heart valves grown in vitro. Circulation, 2000. 102: p. 44—9.
146. Zeltinger J, L.L., Alexander HG, Kidd ID, Sibanda B, Development and characterization of tissue-engineered aortic valves. Tissue Eng, 2001. 7: p. 9-22.
147. Flanagan TC, C.C., Koch S, Tschoeke B, Sachweh JS, Schmitz-Rode T, Jockenhoevel S, The in vitro development of autologous fibrinbased tissue-engineered heart valves through optimised dynamic conditioning. Biomaterials, 2007. 28: p. 3388—97.
148. Robinson PS, J.S., Evans MC, Barocas VH, Tranquillo RT, Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng Part A, 2008. 14: p. 83—95.
149. Sohier J, C.I., Sarathchandra P, Latif N, Chester AH, Yacoub MH, The potential of anisotropic matrices as substrate for heart valve engineering. Biomaterials, 2014 feb. 35(6): p. 1833-44.
150. Weber B, D.P., Scherman J, Sanders B, Emmert MY, Grunenfelder J, et al, Off-the-shelf human decellularized tissue-engineered heart valves in a non-human primate model. Biomaterials, 2013 Oct. 34(30): p. 7269-80.
151. Tudorache I, C.A., Baraki H, Meyer T, Hoffler K, Sarikouch S, et al, Orthotopic replacement of aortic heart valves with tissue engineered grafts. Tissue Eng Part A, 2013 Aug. 19 (15-16): p. 1686-94.
152. Badylak, S.F., Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng, 2014. 42(7): p. 1517-27.
153. Mercuri JJ, P.S., Dion G, Gill SS, Liao J, Simionescu DT, Regenerative Potential of Decellularized Porcine Nucleus Pulposus Hydrogel Scaffolds: Stem Cell Differentiation, Matrix Remodeling, and Biocompatibility Studies. Tissue Eng Part A, 2013. 19 (7-8): p. 952-66.
154. Sierad LN, S.A., Albers C, Chen J, Maivelett J, Tedder ME, et al, Design and Testing of a Pulsatile Conditioning System for Dynamic Endothelization of Polyphenol-Stabilized Tissue Engineered Heart Valves. Cardiovasc Eng Technol, 2010 Jun. 1 (2): p. 138-53.
155. Isenburg JC, S.D., Starcher BC, Vyavahare NR, Elastin stabilization for treatment of abdominal aortic aneurysms. Circulation, 2007. 115 (13): p. 1729-37.
156. Chow JP, S.D., Warner H, Wang B, Patnaik SS, Liao J, et al, Mitigation of diabetes-related complications in implanted collagen and elastin scaffolds using matrixbinding polyphenol. Biomaterials, 2013 Jan. 34 (3): p. 685-95.
157. Pennel T, F.G., Bezuidenhout D, Simionescu A, Chuang TH, Zilla P, et al, The performance of cross-linked acellular arterial scaffolds as vascular grafts; pre-clinical testing in direct and isolation loop circulatory models. Biomaterials, 2014 Aug. 35 (24): p. 6311-22.
158. Cushing, M.C., Jaeggli,M.P.,Masters,K.S.,Leinwand,L.A., andAnseth,K.S, Serum deprivation improves seeding and repopulation of acellular matrices with valvular interstitial cells. J.Biomed.Mater.Res, 2005. A75: p. 232–241.
159. Tedder ME, S.A., Chen J, Liao J, Simionescu DT, Assembly and testing of stem cell-seeded layered collagen constructs for heart valve tissue engineering. Tissue Eng Part A, 2011 Jan. 17 (1-2): p. 25-36.
160. Colazzo F, A.F., Saratchandra P, Carubelli I, Chester AH, Yacoub MH, et al, Shear stress and VEGF enhance endothelial differentiation of human adipose-derived stem cells. Growth Factor, 2014 Oct. 32 (5): p. 139-49.
161. Liao J, J.E., Sacks MS, Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet. Biomaterials, 2008 Mar. 29 (8): p. 1065-74.
162. Gimble J, G.F., Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy, 2003. 5 (5): p. 362-9.
163. Harpa MM, M.I., Sierad LN, Simionescu D. et al, Pulmonary heart valve replacement using stabilized acellular xenogeneic scaffolds; effects of seeding with autologous stem cells. RRLM, 2015. 23 (4): p. 415-30.
164. Tedder ME, L.J., Weed B, Stabler C, Zhang H, Simionescu A, et al, Stabilized collagen scaffolds for heart valve tissue engineering. Tissue Eng Part A, 2009 Jun. 15 (6): p. 1257-68.
165. Strange, G., Brizard,C.,Karl,T.R.,andNeethling,L, An evaluation of Admedus ’tissue engineering process-treated(ADAPT) bovine pericardium patch (CardioCel)for the repair of cardiac and vascular defects. ExpertRev.Med.Devices, 2015. 12: p. 135–141.
166. Sierad LN, S.E., Bina A, Brazile B, Rierson N, Patnaik SS, et al, Functional Heart Valve Scaffolds Obtained by Complete Decellularization of Porcine Aortic Roots in a Novel Differential Pressure Gradient Perfusion System. Tissue Eng Part C Methods, 2015 Dec. 21(12): p. 1284-96.
167. Keane TJ, B.S., The host response to allogeneic and xenogeneic biological scaffold materials. J Tissue Eng Regen Med, 2014 Feb 18.
168. Londono R, B.S., Biologic Scaffolds for Regenerative Medicine: Mechanisms of In vivo Remodeling. Ann Biomed Eng, 2014 Sep 12.
169. Chuang TH, S.C., Simionescu A, Simionescu DT, Polyphenol-stabilized tubular elastin scaffolds for tissue engineered vascular grafts. Tissue Eng Part A, 2009 Oct. 15 (10): p. 2837-51.
170. Asoh K, W.M., Hickey E, Nagiub M, Chaturvedi R, Lee KJ, et al, Percutaneous pulmonary valve implantation within bioprosthetic valves. Eur Heart J, 2010 Jun. 31(11): p. 1404/9.
171. Dohmen, P.M., daCosta,F.,Holinski,S.,Lopes,S.V.,Yoshi,S., Reichert,L.H.,et al, Is there a possibility for a glutaraldehyde-free porcine heart valve to grow? Eur.Surg.Res, 2006. 38: p. 54–61.doi:10.1159/000091597.
172. O'Brien MF, G.S., Walsh S, Black KS, Elkins R, Clarke D, The SynerGraft valve: a new acellular (nonglutaraldehyde-fixed) tissue heart valve for autologous recellularization first experimental studies before clinical implantation. Semin Thorac Cardiovasc Surg, 1999 Oct. 11(4 Suppl 1): p. 194-200.
173. Quinn RW, H.S., Bert AA, Drake BW, Bustamante JA, Fenton JE, et al, Performance and morphology of decellularized pulmonary valves implanted in juvenile sheep. Ann Thorac Surg, 2011 Jul. 92 (1): p. 131-7.
174. Dijkman PE, D.-M.A., Frese L, Hoerstrup SP, Baaijens FP, Decellularized homologous tissue-engineered heart valves as off-the-shelf alternatives to xeno- and homografts. Biomaterials, 2012 Jun. 33(18): p. 4545-54.
175. Converse GL, A.M., Quinn RW, Buse EE, Cromwell ML, Moriarty SJ, et al, Effects of cryopreservation, decellularization and novel extracellular matrix conditioning on the quasi-static and time-dependent properties of the pulmonary valve leaflet. Acta Biomater, 2012 Jul. 8(7): p. 2722-9.
176. Syedain ZH, M.L., Reimer JM, Tranquillo RT, Tubular heart valves from decellularized engineered tissue. Ann Biomed Eng, 2013 Dec. 41(12): p. 2645-54.
177. Lisy M, P.J., Brockbank KG, Fritze O, Schleicher M, Schenke-Layland K, et al, The performance of ice-free cryopreserved heart valve allografts in an orthotopic pulmonary sheep model. Biomaterials, 2010 Jul. 31(20): p. 5306-11.
178. Hopkins RA, J.A., Wolfinbarger L, Moore MA, Bert AA, Lofland GK, Decellularization reduces calcification while improving both durability and 1-year functional results of pulmonary homograft valves in juvenile sheep. J Thorac Cardiovasc Surg, 2009 Apr. 137(4): p. 907-13, 13e1-4.
179. Khorramirouz R, S.S., Akbarzadeh A, Muhammadnejad A, Heidari R, Kajbafzadeh AM, Effect of three decellularisation protocols on the mechanical behaviour and structural properties of sheep aortic valve conduits. Adv Med Sci, 2014 Sep. 59(2): p. 299-307.
180. Fallon AM, G.T., Cox JL, Matheny RG, In vivo remodeling potential of a novel bioprosthetic tricuspid valve in an ovine model. J Thorac Cardiovasc Surg, 2014 Jul. 148(1): p. 333-40 e1.
181. Lichtenberg A, C.S., Tudorache I, Sturz G, Winterhalter M, Hilfiker A, et al, Flow-dependent re-endothelialization of tissue-engineered heart valves. J Heart Valve Dis, 2006 Mar. 15(2): p.:287-93; discussion 93-4.
182. Dohmen PM, O.S., Yperman J, Flameng W, Konertz W, Lack of calcification of tissue engineered heart valves in juvenile sheep. Semin Thorac Cardiovasc Surg, 2001 Oct. 13(4 Suppl 1): p. 93-8.
183. Goldstein S, C.D., Walsh SP, Black KS, O'Brien MF, Transpecies heart valve transplant: advanced studies of a bioengineered xeno-autograft. Ann Thorac Surg, 2000 Dec. 70(6): p. 1962-9.
184. I, V., Heart valve tissue engineering. Circ Res, 2005 Oct. 14;97(8): p. 743-55.
185. Hilbert SL, Y.R., Souza J, Wolfinbarger L, Jones AL, Krueger P, et al, Prototype anionic detergent technique used to decellularize allograft valve conduits evaluated in the right ventricular outflow tract in sheep. J Heart Valve Dis, 2004 Sep. 13(5).
186. Sakamoto Y, H.K., Okuyama H, Ishii S, Shingo T, Kagawa H, Prevalence of pannus formation after aortic valve replacement: clinical aspects and surgical management. J Artif Organs, 2006. 9(3): p. 199-202.
187. AK, D., Recurrent pannus formation causing prosthetic aortic valve dysfunction: is excision without valve re-replacement applicable? J Cardiothorac Surg, 2012. 7: p. 62.
188. Semon JA, M.C., Zhang X, Sharkey SA, Beuttler MM, Shah FS, et al, Comparison of human adult stem cells from adipose tissue and bone marrow in the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cell Res Ther, 2014. 5(1): p. 2.
189. Kennamer A, S.L., Pascal M, Rierson N, Albers C, Harpa M, et al, Bioreactor conditioning of valve scaffolds seeded internally with adult stem cells. Tiss Eng Reg Med, 2015. 1(1):in press.
190. Gimble JM, B.B., Frazier T, Rowan B, Shah F, Thomas-Porch C, et al, Adipose-derived stromal/stem cells: a primer. Organogenesis, 2013 Jan-Mar. 9(1): p. 3-10.
191. Colazzo F, C.A., Taylor PM, Yacoub MH, Induction of mesenchymal to endothelial transformation of adipose-derived stem cells. J Heart Valve Dis, 2010 Nov. 19(6): p. 736-44.
192. Schoen FJ, H.C., Anatomic analysis of removed prosthetic heart valves: causes of failure of 33 mechanical valves and 58 bioprostheses, 1980 to 1983. Hum Pathol, 1985. 16(6): p. 549-59.
193. NM, R., The role of Lrp5/6 in cardiac valve disease: LDL-density-pressure theory. J Cell Biochem, 2011 Sep. 112(9): p. 2222-9.
194. NM, R., Bicuspid aortic valve disease: the role of oxidative stress in Lrp5 bone formation. Cardiovasc Pathol. , 2011 May-Jun. 20(3): p. 168-76.
195. CG, D., The Behavior of Aortic Valve Homografts in Man and Animals. Coeur Med Interne, 1964. 64: p. 301-5.
196. Martijn WA, v.G.W., Jamieson E, Pieter A, Kappetein J, Ye Guy JF, Marinus JC, Eijkemans, GL, Grunkemeier, Bogers Ad JJC, Takkenberg JM, Patient outcome after aortic valve replacement with a mechanical or biological prosthesis: weighing lifetime anticoagulant related event risk against reoperation risk. J Thorac Cardiovasc Surg, 2009. 137: p. 881-886.
197. Zilla P, H.P., Bezuidenhout D, Bioprosthetic heart valves: the need for a quantum leap. Biotechnol Appl Biochem, 2004 Aug. 40(Pt 1): p. 57-66.
198. Harpa M, B.K., Movileanu I et al, Implantation of valvular collagen biomaterials seeded with autologous stem cells – intraoperative hemodynamic measurements in an animal model. Acta Medica Transilvanica, 2015. 20 (2): p. 38-39.
199. Schoen FJ, L.R., Pathology of substitute heart valves: new concepts and developments. J Card Surg, 1994 Mar. 9(2 Suppl): p. 222-7. DOI: 10.1111/j.1540-8191.1994.tb00932.x.
200. Cebotari, S., Tudorache,I.,Ciubotaru,A.,Boethig,D.,Sarikouch,S.,Goerler, A.,et al, Use of fresh decellularized allografts for pulmonary valve replacement may reduce the reoperation rate in children and
young adults:early report. Circulation, 2011. 124(11Suppl.): p. S115–S123.
201. Ruzmetov, M., Shah,J.J.,Geiss,D.M.,and Fortuna,R.S., Decellularized versus standard cryopreserved valve allografts for right ventricular outflow tract reconstruction:a single-institution comparison. J.Thorac.Cardiovasc.Surg, 2012. 143: p. 543–549.
202. daCosta, F.D., Dohmen,P.M.,Duarte,D.,vonGlenn,C.,Lopes,S. V.,Filho,H. H.,et al, .Immunological and echocardiographic evaluation of decellularized versus cryopreserved allografts during the Ross operation. Eur.J.Cardiothorac.Surg, 2005. 27: p. 572–578.
203. Dohmen, P.M., daCosta,F.,Yoshi,S.,Lopes,S.V.,daSouza,F. P.,Vilani,R.,et al., Histological evaluation of tissue-engineered heart valves implanted in the juvenile sheep model: is there a need for in-vitro seeding? J.Heart Valve Dis, 2006. 15: p. 823–829.
204. Deac RF, S.D., Deac D, New evolution in mitral physiology and surgery: mitral stentless pericardial valve. Ann Thorac Surg, 1995 Aug. 60(2 Suppl): p. 433-8.
205. Paniagua Gutierrez JR, B.H., Korossis S, Mirsadraee S, Lopes SV, da Costa F, et al, Regenerative potential of low-concentration SDS-decellularized porcine aortic valved conduits in vivo. Tissue Eng Part A, 2015 Jan. 21(1-2): p. 332-42.
206. FJ, S., Pathologic findings in explanted clinical bioprosthetic valves fabricated from photooxidized bovine pericardium. J Heart Valve Dis, 1998 Mar. 7(2): p. 174-9.
207. Simionescu, D.T., et al., Form Follows Function: Advances in Trilayered Structure Replication for Aortic Heart Valve Tissue Engineering. J Healthc Eng, 2012. 3(2): p. 179-202.
208. Voges I, B.J., Entenmann A, Scheid M, Scheewe J, Fischer G, et al, Adverse results of a decellularized tissue-engineered pulmonary valve in humans assessed with magnetic resonance imaging. Eur J Cardiothorac Surg, 2013. 44: p. e272-279.
209. Dai, W., Dong,J.,Chen,G.,and Uemura,T, Application of low-pressure cell seeding system in tissue engineering. Biosci.Trends, 2009. 3: p. 216–219.
210. Godbey, W.T., Hindy,S.B.,Sherman,M.E.,and Atala,A., A novel use of centrifugal force for cell seeding into porous scaffolds. Biomaterials, 2004. 25: p. 2799–2805.doi:10.1016/j.biomaterials.2003.09.056.
211. Roh, J.D., Nelson,G.N.,Udelsman,B.V.,Brennan,M.P.,Lockhart, B.,Fong,P.M.,et al, Centrifugal seeding increases seeding efficiency and cellular distribution of bone marrow stromal cells in porous biodegradable scaffolds. TissueEng., 2007. 13: p. 2743–2749.doi:10.1089/ten.2007.0171.
212. Torigoe, I., Sotome,S.,Tsuchiya,A.,Yoshii,T.,Takahashi, M.,Kawabata,S.,et al., Novel cell seeding system into a porous scaffold using a modified low-pressure method to enhance cell seeding efficiency and bone formation. CellTransplant, 2007. 16: p. 729–739.doi:10.3727/000000007783465109.
213. Helder MN, K.M., Klein-Nulend J, Wuisman PI., Stem cells from adipose tissue allow challenging new concepts for regenerative medicine. Tissue Eng, 2007. 13: p. 1799-1808.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: BIOMATERIALE COLAGENICE POPULATE CU CELULE STEM PENTRU ÎNLOCUIRI VALVULARE Doctorand Marius Mihai Harpa Conducător de doctorat Klara Brînzaniuc Motto… [307392] (ID: 307392)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.