.biomaterial Sanguin

CUPRINS

Introducere

Capitolul II

NOȚIUNEA DE BIOMATERIAL:

II.1. Definiția noțiunii de biomaterial

II.2 Scurt istoric al biomaterialelor

II.3. Clasificarea biomaterialelor

II.4. Criterii de alegere a unui biomaterial polimeric

II.4.a. Protocolul de evaluare a biomaterialului

II.5 Aplicațiile diferitelor tipuri de biomateriale

II.6. Concluzii

Capitolul III

III. Noțiunea de biomaterial sanguin

III.1 Definiția biomaterialelor sanguine

III.2 Clasificarea biomaterialelor sanguine

III.3. Prorietățile biomaterialelor sanguine

Capitolul IV

Modalități de evaluare a toxicității biomaterialelor

IV.1. Indroducere

IV.2 Pregătirea probelor

IV.3 Metode de testare

IV.4 Efectele implanturilor

IV.5 Concluzii

39 pagini

Introducere

Sistemul cardiovascular este alcǎtuit din cord, vase de sânge și sânge. În alcătuirea sitemului vascular intră: vase de calibru diferit artere, arteriole, vene, venule și capilare având o structură adaptată specific funcției fiecărui sector vascular. Arterele trasportă sângele de la cord la organe, unde acestea se împart în arteriole. Arteriolele se divid mai departe în capilare care infiltrează țesuturile asigurând schimbul de substanțe nutritive și metaboliți. Capilarele converg apoi spre a forma venulele care ulterior vor forma venele.

Arterele sunt vasele de sânge cele mai frecvent afectate de boli. Peretele arterial este alcătuit din trei tunici: adventicea, media și intima. Tunica internă este alcătuită dintr-un strat de celule turtite numite endoteliu și care este neîntrerupt în întregul țesut vascular. Sub endoteliu se află stratul subendotelial alcătuit dintr-o rețea de fibre elastice colagene și de reticulină, iar sub acesta se află o membrană groasă și elastică care poartă numele de limitantă elastică internă. Tunica mijlocie sau media este alcătuită din fibre elastice și fibre musculare netede dispuse circular în proporții diferite în funcție de mărimea arterelor (artere de tip elastic și artere de tip muscular). La periferia tunicii medii se află o membrană elastică care o separă de tunica externă (limitanta elastica externa). Tunica externă sau adventicea este alcatuită din țesut conjunctiv elastic și câteva elemente musculare. În tunica mijlocie și în tunica externă se găsește și un număr mare de terminații nervoase vegetative [1]. Acestă structură complexă este capabilă să inhibe, în condiții fiziologice, hiperplazia intimală, tromboza și arteroscleroza.

Boala arterosclerotică cardiovasculară produce scaderea localizată a fluxului sangvin prin artere, evoluând până la obstrucția completă a vasului afectat.

Fotomicrograful unei artere parțial obstrucționate de o placă aterosclerotică.

Metode de tratament utilizate în ateroscleroză pot fi bypass-ul coronarian (CABG), angioplastia coronariană transluminală percutană (PTCA) sau montarea de stenturi în artere (Gerard J Tortora, Sandra Reynolds Grabowski, “Principles of Anatomy And Physiology”, 8th Edition , 606):.

Tratamentul constă în by-passing-ul zonei afectate prin utilizarea unei grefe artificiale sau a venei safenă.[2] În mod curent, în operațiile care presupun restabilirea fluxului sangvin printr-un vas cu diametrul mai mic de 6 mm se utilizeaza autogrefe de vena safenă. În cazul arterelor coronare se utilizează grefa arterială autologă (artera toracică internă, artera gastroepiploică, artera epigastrică inferioară și artera radială)[3,4,5].

Alogrefele crioconservate au fost de asemenea utilizate pentru by-pass-ul arterelor coronare dar ratele mari de ocluzie și problemele legate de apariția anevrismelor au condus la limitarea utilizării lor la situațiile în care nu sunt disponibile grefele autologe [6,7]. Funcționarea corespunzătoare a acestor grefe naturale este pusă pe seama prezenței celulelor endoteliale viabile pe suprafața luminală. Utilizarea autogrefelor venoase sau arteriale conduce la obținerea celor mai bune rezultate, însă nu este lipsită de prezența unor dezavantaje dintre care reaminitim necesitatea efectuării unui număr ridicat de proceduri chirurgicale, care sporesc riscurile și costurile operației în ansamblu. În plus, grefele vasculare prezintă pereți subțiri și pot fi deteriorate în cursul transplantării în sistemul arterial.

Prezența amputațiilor sau a recoltărilor anterioare de tesut face ca pacientul sa nu prezinte vene corespunzătoare grefării.

Grefele vasculare artificiale sunt utilizate în aceste cazuri. În mod curent grefele vasculare sunt realizate din poli(etilen tereftalat)(Dacron) sau ePTFE(poli(tetrafloretilenă)expandat). Gradul de reușită în cazul utilizării grefelor cu diametrul mare este satisfăcător, în cazul utilizării grefelor vasculare cu diametrul mai mic de 6 mm rezultatele sunt nesatisfăcătoare(15 – 20 % din grefele vasculare rămân viabile după 5 ani de la implantare) [8]. Biomaterialele poliuretanice se caracterizează printr-o largă posibilitate de utilizare în protezarea cardiovasculară, biocompatibilitatea acestora și integritatea citotisulara bună sunt consecințele metodelor de heparinizare și colagenizare la care sunt supuse aceste biomateriale.

=== Capitolul II ===

Capitolul II

NOȚIUNEA DE BIOMATERIAL:

II.1. Definiția noțiunii de biomaterial:

Conform definiției “National Institute of Health” – unanim acceptata de lumea stiințifică se consideră că un biomaterial este orice substanță (cu excepția substanțelor medicamentoase ) sau combinații de substanțe de natură sintetică sau naturală, care poate fi folosită pe o perioadă variabilă de timp ca dispozitiv sau element component al unui sistem implicat în tratarea, mărirea sau înlocuirea unui tesut, organ sau funcție a organismului.

Calitatea fundamentală a biomaterialelor este biocompatibilitatea prin care se înțelege un complex de caracteristici fizico – chimice și biochimice care fac posibilă acceptarea acestora de către țesuturile vii, ca o parte integrantă, fără manifestări repulsive sau toxice sub formă de inflamații, infecții [29].

II.2 Scurt istoric al biomaterialelor:

Istoria utilizării biomaterialului își are originea încă din antichitate.

Dezvoltarea biomaterialului a cunoscut mai multe etape în evoluția sa.

Prima etapă se referă la materialele ce au fost realizate pentru alte aplicații (pentru îmbrăcăminte, armament) și care păreau compatibile pentru aplicațiile medicale.

Biomaterialele ce aparțin acestei generații erau introduse în organism și se constată dacă erau tolerate sau nu. Nu există o selecție propiu-zisă pentru un anumit tip de aplicație medicală și nici o legislație care să reglementeze aspectele complexe ale contactului lor cu organismul. Primele grefe vasculare au fost obținute din nylon (poliamide alifatice PA6) la începutul anilor ’60.

Primele catetere au fost oase demineralizate sau pene golite în interior. Scopul biomaterialelor din prima generație a fost de a putea suplini funcția organului înlocuit fără a determina însă un răspuns din partea primitorului. Ele erau selecționate datorită prezenței unei combinații de proprietăți fizice specfice aplicațiilor medicale, intenția fiind de a utiliza materiale bioinerte (determină un răspuns minim din partea primitorului).

A doua etapă cuprinde ultimele trei decenii ale secolului XX. Materialele concepute și realizate special pentru aplicațiile medicale, optimizau procedurile medicale neinvazive sau minim invazive. Un tip de cateter epidural utilizat pentru anestezie obstetică și realizat dintr-un poliuretan zis “inteligent”(capabil să reacționeze controlat sub acțiunea unor stimuli chimici, electrici) poate fi un exemplu pentru această perioadă. La temperatura ambiantă cateterul respectiv este rigid pentru a putea fi introdus în mod corect, pe măsură ce se încălzește în contact cu organismul, polimerul devine din rigid flexibil, micșorând astfel traumatismul bolnavului.

Materialele aparținând generației a doua aveau ca scop determinarea unei reacții controlabile din partea țesuturilor în care erau implantate. În anii ’80 materialele bioactive erau utilizate în ortopedie și stomatologie.

A doua generație de biomateriale a condus la dezvoltarea materialelor biodegradabile (resorbabile). Consecința acestui lucru este diminuarea intervalului de timp în care biomaterialul se află în contact direct cu tesuturile datorită degradării precum și înlocuirea materialului cu țesutul.

Ultima etapă, cea de-a treia se referă la perspective de viitor și care vizează trecerea de la biomaterial și dispozitive medicale pasive care își îndeplinesc mecanic rolul, la materiale și dispozitive capabile să imite sisteme biologice, să recreeze organe și componente funcționale ale corpului omenesc.

Caracteristica biomaterialelor din generația a treia este capacitatea de a reacționa într-o manieră mult mai precisă cu proteinele și celulele de la nivel molecular. Aceste materiale asigură matrici care pot fi însămânțate in vitro cu celule în vederea unei implantări ulterioare sau pentru a atrage în mod specific celulele endogene funcționale in vivo. Conceptul este acela că o matrice poate conține o informație chimică și structură capabilă să controleze dezvoltarea țesuturilor într-un mod analog celui în care se realizează comunicarea celulă – celulă.
Adeziunea celulară reprezintă factorul declanșator al unei cascade de relații biochimice și exploatarea acestui comportament reprezintă un obiectiv în realizarea biomaterialelor folosite în ingineria tisulară. Domeniile de legătură ale matricii extracelulare pot fi mimate prin crearea unei suprafețe adezice celulare determinată de imobilizarea pe material a unor proteine specifice, peptide sau alte biomolecule. Există posibilitatea realizării unor dispozitive cu suprafețe care să prezinte un grad selectiv de adeziune celulară și care să posede potențialul de a organiza spațial o mixtură complexă de celule, cum este cazul celor întâlnite în alcătuirea țesuturilor. RGD (arginina – glicina – acid aspartic) și alte oligopeptide au fost încorporate în biomateriale pentru a stimula adeziunea, răspândirea și funcționalitatea celulară. Manipularea interacțiunilor celulare – integrine prin intermediul liganzilor sau a biomaterialelor sintetice poate îmbunăți unele aplicații cum ar fi vindecarea grefelor vasculare. În ingineria citotisulara scopul reprezintă înțelegerea modului de răspuns al celulelor la semnalele moleculare, înțelegerea capacității de integrare a mai multor semnale de intrare pentru a genera un răspuns dat și de a controla interacțiunile nespecifice dintre celule și biomaterial astfel încât acestea să conducă la interacțiuni de tip receptor ligant. Descoperirea de noi medicamente care au la bază proteine sau acizi nucleici și eliminarea toxicității sistemice au stimulat dezvoltarea unor noi polimeri implantabili precum și a unor sisteme de eliberare controlată a medicamentelor.[24] Eliberarea controlată a medicamentelor conferă un grad de regularitate a dozajului foarte ridicat. Mecanismele de eliberare lentă care au la bază biomateriale sunt utilizate pentru eliberarea factorilor de creștere cu scopul de a induce vascularizarea[25, 26].

Pentru a concluziona în prezent direcțiile de viitor includ descoperirea unor noi modalități de sinteză și fabricare a biomaterialelor, modalități de a controla răspunsul corpului uman la biomateriale și realizarea unor materiale care să interacționeze în organism cu componente moleculare specifice. Există posibilitatea ca în viitor să se poată asigura regenerarea in situ și restaurarea unor țesuturi cardiovasculare specifice și probabil a întregului cord [27, 28].

II.3. Clasificarea biomaterialelor

a.) Din punct de vedere chimic un biomaterial poate fi:

b.) Din punct de vedere al comportării făță de mediul viu biomaterialele se împart în două clase:

Resorbabile

Neresorbabile

c.) Din punct de vedere al destinației biomaterialelor [30]:

inginerie tisulară: realizarea de substituenți biologici de țesuturi sau organe, pe principii proliferării celulare in vitro, cu caracteristici morfo-fiziologice similar țesutului viu înlocuit:

regenerare tisulară: biosinteza unui nou țesut sau organ cu ajutorul unui biomaterial care favorizează proliferarea celulară in vivo în urma contactului direct cu zonele vii, inundate de fluide biologice;

protezare: înlocuirea unui tesut sau organ cu un biomaterial ce asigură

Biomaterial

Utilizat în starea fiziologică a zonei protezate, un timp cât mai îndelungat

asistența medicală: facilitarea unor activități medicale specifice (intervenții chirurgicale, terapie intensivă, administrare de medicamente) prin contact direct pe o perioadă limitată de timp.

Diagnosticare și monitorizare: obținerea de informații asupra stării fiziologice a organismelor vii (în urma contactelor endo sau exogen al unor biomateriale cu organe, țesuturi sau fluide) și prelucrarea adecvată a rezultatelor.

II.4. Criterii de alegere a unui biomaterial polimeric

Alegerea unui tip de biomaterial (polimeric) pentru o aplicație dată trebuie să țină cont atât de performațele intrinseci ale materialului, de natura sa chimică precum și de procesele de interfață ale acestora în contact cu materialul biologic.

Se are în vedere și posibilitatea de prelucrare a biopolimerului ales, prin procedee cât mai puțin costisitoare precum și existența unor tehnici de ansamblare și sudare ținând cont ca toate aceste operații trebuie executate în camere sterile.

Conceperea și alegerea unui anumit material pentru o aplicație dată trebuie să pornească de la caracteristicile cerute de această aplicație și să ia în considerare caracteristicile acestui biomaterial ( proprietățile fizico-mecanice și chimice, biocompatibilitatea, ușurința de prelucrare).

Criteriul I: Compoziția și structura sa chimică

Polimerii deseori nu sunt perfect puri. Alături de macromoleculele care îi alcătuiesc coexistă cantități mici de monomeri nereacționali sau decatalizator, precum și diferiți aditivi introduși pentru ameliorarea unora dintre proprietățile fizice, mecanice sau chimice.

În general aditivii prezenți în biomaterial trebuie precizați de fabricant, deoarece aceștia sunt responsabili de efectele adverse în ceea ce privește biocompatibilitatea.

O altă sursă de impurificare a biomaterialului polimeric are la bază diferite procese de degradare a marcomoleculelor ce pot interveni pe durata sterilizării, stocării sau chiar pe durata utilizării. Aceste procese de degradare chimică cu generarea de compuși micro moleculari, cu mobilitate mai mare și deci cu risc crescut de migrare în țesutul gazdă.

Criteriul II: Proprietăți fizico- mecanice și chimice:

duritatea

rezistența la tracțiune

modulul de elasticitate

alungirea

rezistența la oboseală (determinată de răspunsul materialului la solicitările ciclice)

rezistența la șoc

rezistența la abraziune și uzură

stabilitatea dimensională pe termen lung

umflarea în medii apoase

permeabilitatea la gaz și apă

posibilitatea de sterilizare

stabilitatea chimică la contactul cu țesutul gazdă

inerție chimică

Criteriul III: Prelucrabilitatea sa (ușurintă cu care un material polimeric poate fi transformat în produse finite)

Criteriul IV: Tipul de răspuns pe care biomaterialul il furnizează în contact cu țesutul gazdă.

Complicațiile cele mai frecvente în cazul unor interacțiuni defectuoase între biomaterial și țesutul gazdă sunt: tromboza și generarea unui tesut fibros care încapsulează biomaterialul implantat în țesuturile moi (răspuns imun – reacție la corpii străini).

Criteriul V: Numărul și tipul de componente ale dispozitivului medical și posibilitatea biomaterialului ales de a fi ansamblat pentru obținerea acestui dispozitiv.

Criteriul VI: Tipul de ansamblare utilizat pentru conexiuni.

Criteriul VII: Problema deșeurilor și ecologia mediului.

II.4.a. Protocolul de evaluare a biomaterialului:

– chimice

Polimerul – Testări: – fizico – chimice | date – evaluare – accept – fabricare

Candidat – mecanice | |

Reject teste de simulare

|

date

|

reject – evaluare

|

accept

Evaluarea chimică

Modificarea polimerilor, atunci când se dorește îmbunătătirea compatibilității cu sângele și a stabilității, nu trebuie să altereze proprietățile legate de menținerea elasticității și a flexibilității pe o perioadă mare de timp. Macromoleculele sunt susceptibile la variate moduri de degradare: hidrolitică, oxidativă, termică și biologică.

a.) Stabilitatea hidrolitică:

În organism degradările majore au la bază un mecanism hidrolitic de aceea este important ca polimerii să nu se modifice în organism dacă funcția pentru care sunt folosiți nu o cere.

b.) Stabilitatea oxidativă:

Substanțele cu masă moleculară mică nu sunt susceptibile la oxidare ca polimerii organici.

Metode de testare a stabilității chimice:

1. Spectroscopia IR – este folosită pentru a identifica speciile moleculare sau pentru a modela sistemul polimeric. De asemenea această metodă dă informații asupra analizei cantitative și asupra purității.

2. ATR (reflecția totală atenuată)

Această metodă de testare este importantă pentru ca prin cunoașterea efectelor preliminare de suprafață se poate preciza stabilitatea pe termen lung a materialului introdus în mediul fiziologic. ATR este folosit și pentru detectarea și identificarea suprafețelor contaminate, a suprafețelor oxidate și degradate în urma unui proces termic.

3. Cromatografia pe gel permeabil (CGP):

Unul dintre efectele comune indus de degradare constă în scăderea masei moleculare ce este imediat urmată de deteriorarea severă a proprietăților fizice. CGP separă moleculele după mărime găsindu-și aplicabilitatea în studii legate de distribuția masei moleculare.

4. Calorimetria diferențială

Analizele termice diferențiale (DTA) și calorimetria diferențială (DSC) sunt tehnici care măsoară schimburile de entalpie ale polimerilor în funcție de temperatură. Aplicațiile tipice includ: determinările procentului de cristalinitate, procentajul amestecului de polimeri și copolimeri, măsurarea temperaturii de tranziție.

2. Analize fizico – chimice

Determinare vâscozității:

Procedura experimenală constă în determinarea timpului de curgere a unei soluții de polimer de volum cunoscut ce trece printr-un capilar vâscozimetric. Această metodă se folosește la determinarea masei moleculare a unui polimer necunoscut. Determinarea masei moleculare furnizează date despre polimerii implicați în implanturile medicale. Pot fi detectate posibile degradări prin remarcarea de schimbări descendente în masa moleculară.

3. Analize mecanice

Analizele mecanice efectuate pe biomateriale sunt de două feluri:

analize mecanice statice care dau informații despre rezistența polimerului, forța, rezistența de efort.

Analize mecanice dinamice se realizează ajutorul tehnicilor spectroscopice. Aceste analize constau într – un răspuns vascoelastic din partea polimerului atunci când asupra lui se aplică o frecvență. Când frecvența și temperatura sunt variate se obține un spectru.

Testarea biologică

Aplicarea medicală a polimerului trebuie precedată de aprecierea compatibilității cu tesutul și sângele, a influenței asupra hemodinamicii, prin teste in vitro și in vivo, particularizate la timpul și forma de prelucrarea a polimerului ca și la domeniul de utilizare a acestuia. Chiar dacă există diferențe între comportamentul organismului animalelor de experiență și a acelui uman, testarea pe animale nu poate fi omisă.

Investigațiile conduse de Departamentul de Patologie al Universității din Vermont sugerează următoarele:

Implantarea suprafețelor sintetice în sistemul vascular poate determina formarea de trompi prin mecanism direct sau indirect.

Mecanismul direct constă în formarea inițială a depozitelor tromboembolice pe suprafața materialului, urmată de pierderea și de dislocarea de particule din depozit ce trec în circulația sistemică.

Mecanisul indirect constă în formarea de plachete și de emboli fibrinici de către sistemul sanguin însuși, ducând la posibilitatea de formare de corpusculi tromboplastici. Mecanismul este analog cu coagularea intravasculară.

Pentru a verifica biocompatibilitatea biomaterialului cu sângele sunt necesare două sau chiar mai multe dintre următoarele teste:

Metode de testare a biocompatibilității:

Teste pentru evaluarea toxicității materialelor:

II.5 Aplicațiile diferitelor tipuri de biomateriale

Tipuri de biomateriale și aplicațiile medicale

II.6. Concluzii

Direcțiile de viitor include descoperirea unor noi modalități de sinteză și fabricare a biomaterialelor, noi modalități de a controla răspunsul organismului uman la biomateriale precum și realizarea unor materiale capabile să interacționeze în organism cu componentele moleculare specifice. Ingineria tisulară va trebui să ofere soluții legate de restaurarea și regenerarea țesuturilor.

=== Capitolul III ===

Capitolul III

III. Noțiunea de biomaterial sanguin

III.1 Definiția biomaterialelor sanguine:

Orice biomaterial trebuie să îndeplinească următoarele caracteristici[31]:

Fezabilitate funcțională

Biostabilitate – să nu fie degradat la nivelul organismului (decât dacă acest lucru este impus din faza de proiectare)

Biocompatibilitate

Sa fie sterilizabil – sterilizarea să nu-i afecteze structura și funcțiile

Pentru interfața biomaterial – sânge, la caracteristicile enumerate adăugându-se următoarele caracteristici [32]:

să nu genereze trombi sau emboli

să nu determine distrucția celulelor sanguine

să nu alterneze proteinele plasmatice

să nu determine reacții toxice sau alergice

să nu determine reacții imunologice

să nu determine reacții citotoxice

– Pentru interfața polimer sânge cel mai important aspect îl constituie compatibilitatea cu fluidul biologic. Implantul trebuie să fie nontrombogen și să nu inducă hemoliza. La nivelul sângelui noțiunea de biocompatibilitate este echivalentă practic cu nontrombogenitatea.

Reacțiile tisulare ce apar la contactul cu materialul străin

Reacțiile tisulare depind atât de structura macro și micromoleculară a polimerului, de proprietățile lui de suprafață cât și de caracteristicile țesutului cu care vine în contact. Reacțiile ce apar pot fi:

o reacție rapidă și intensă de reject

o respingere pe termen lung ce apare după infiltrarea la zona de contact a polimorfonuclearelor și macrofagelor

izolarea acompaniată de reacție celulară

izolarea fără reacție celulară

Când un material vine în contact cu sângele are loc adsorbția proteinelor din fluid la suprafața biomaterialului. Inițial albumina domină cantitativ, ulterior fiind înlocuită de fibrinogen, imunoglobuline, fibronectine. După adsorbția proteinelor sub stratul va fi alterat ceea ce va determina adsorbția plachetelor pe stratul de proteine format. Plachetele ce se adsorb la acest nivel se agrega și astfel procesul de coagulare începe. În final plachetele individuale își pierd integritatea și formeaza trombuși roșii.

Sunt prezentate în următoarele imagini etapele formării unui trombus (Gerard J Tortora, Sandra Reynolds Grabowski, “Principles of Anatomy And Physiology”, 8th Edition , 566):

Reacție de adeziune

Reacție de eliberare

Reacție de agregare

III.2 Clasificarea biomaterialelor sanguine:

După timpul de contact cu sângele [33]:

dispozitive folosite pe termen scurt: membranele artificiale, tuburile și cateterele pentru transportul sângelui

dispozitive utilizate pe termen lung: implanturile “in situ” ca protezele vasculare și organele artificiale.

După caracteristicile netrombogene [34]:

– materiale care nu interacționează cu sângele:

suprafețe nereactive

suprafețe încărcate negative

structuri heterogene

hidrogeluri

material care inhibă formarea de trombi:

Suprafețe heparinizate

Suprafețe cu acțiune de autospalare

Materiale acoperite cu structuri antitrombogene proprii organismului (materiale endotelizate)

După destinație biomateriale utilizate pentru:

Catetere:

Polietilenă de joasă densitate

Poli (clorură de vinil)

Poli(dimetil siloxan)

Poli(eter – uretani)

Cauciuc siliconic

Grefe vasculare:

Poli(metil siloxan)

Poli(tetrafluor – etilenă)

Poli(tereftalat de etil)

Poliuretani

Valve:

Poli(eter uretan uree)

Polipropilenă

Poli(tetrafluor – etilenă)

Inimă artificială:

Poli(eter uretan ureea)

Polipropilenă

Polimeri siliconici

Aliaje metalice

III.3. Prorietățile biomaterialelor sanguine

Proprietățile specifice materialelor ce intra în contact cu fluidul sanguin se împart în două categorii[35]:

Proprietăți legate de destinație (biochimice și antitrombogene)

Proprietăți auxiliare:

fizico – mecanice (puritate, stabilitate, sorbție)

chimice

de trasfer

Structura optimă a biomaterialului este asigurată de proprietățile fizico – mecanice și biologice adecvate și este confirmată prin teste biologice.

1. Proprietăți legate de destinație:

O cerință impusă biopolimerilor medicali folosiți în aplicații cardiovasculare este aceea de a realiza suprafețe compatibile cu sângele. Evitarea complicațiilor legate de coagularea sângelui, modificarea mecanică sau chimică a globulelor roșii și afectarea capacității de trasport a oxigenului determină utilizarea unor polimeri antitrombogenici. Conform instrucțiunilor date de U.S. National Heart, Lung, Blood încă din 1964, un material pentru a fi compatibil cu sângele, acesta trebuie să îndeplinească următoarele condiții[36]:

să fie nontrombogenic;

să reziste în mediul fiziologic păstrându – și proprietățile fizice intacte ;

să aibă suprafețele neregulate acoperite cu reactanți fluizi;

să nu fie toxic;

acoperirea suprafețelor să se realizeze uniform ;

metoda aplicată să fie adaptată la materialele folosite chiar dacă principiul netrombogenitătii trebuie să fie satisfăcută de orice material sintetic;

produsele trebuie să fie fezabile și fiabile.

Pentru a diminua trombogenitatea pot fi folosite câteva tehnici:

însămânțarea celulelor endoteliale

realizarea de suprafețe heparinizate

realizarea de suprafețe electronegative

Pentru a crea materiale cu proprietăți biochimice și netrombogenice adecvate folosirii lor în acest scop trebuie să se tină cont de următoarele caracteristici:

1. Compatibilitatea polimerilor cu țesuturile:

Contactul dintre polimer și țesut determina reacții tisulare dependente de structură chimică, natura adaosurilor de prelucrare și a produselor de distribuție, dimensiunea și forma biomaterialului, locul și tehnica de implantare.
La locul inciziei se produc procese biochimice de vindecare ce implică influxul celulelor polimorfonucleare și edem, urmată de apariția monocitelor și fibroblastelor. Astfel țesutul colagenic generat favorizează refacerea țesutului operat. Compatibilitatea este condiționată de inerția biochimică a polimerului.

2. Efecte cancerigene

Malignitatea poate fi provocată de factori precum: interacțiunile chimice și fizico – chimice dintre componenții celulari și polimeri sau produși de degradare ai acestora, activarea chimică a proceselor celulare datorită prezenței compușilor macromoleculari. Riscul malignității este minim, forma și consitența implantului influentând procedeul în mai mare măsura decât natura chimică a polimerilor.[37]

Compatibilitatea polimerilor cu sângele

Principalele efecte ce pot apare la interacțiunile dintre polimer și sânge sunt: modificarea fluidității sângelui prin activarea mecanismelor de coagulare, alterarea proprietăților fizice ale globulelor roșii, urmată de hemoliza, lezarea endoteliului vascular și afectarea barierei capilare, agregarea eritrocitelor și modificarea proprietăților reologice ale sângelui.

Contactul sângelui cu suprafață străina are ca efect apariția coagulării . Implicarea suprafeței de contact în producerea trombozei a fost corelată cu caracteristicile de absorbție a unor componenți sanguini și prezența sarcinilor electrice superficiale. Distribuția acestor sarcini pe suprafața polimerilor depinde de orientarea grupelor funcționale dispuse superficial și de natură substanțelor absorbabile. Factorul determinant în coagularea sângelui este adsorbția de către suprafața a unor componenți ai sângelui, în concordanța cu energia liberă superficială.[38]

Compatibilitatea sângelui cu biomaterialele este în corelație cu adsorbția de proteine la suprafață, care determină fenomenele de adeziune celulară ulterioară. Plachetele nu pot adera la substraturile nefiziologice fără formare în prealabil, a unui strat de proteine absorbite constituit din fibrinogen. Biocompatibilitatea poate fi favorizată de o valoare redusă a tensiunii superficiale critice care determină modificări de configurație minimă ale proteinelor adsorbite.[39]

Utilizarea polimerilor în scopuri medicale elimină o serie de dificultăți legate de transplanturile de organe cum ar fi: incompatibilitatea genetică dintre donator și acceptor, necunoașterea structurii și mecanismelor de acțiune a antigenelor de histocompatibilitate și prelevarea și conservarea organelor înainte de a suferi modificări ireversibile[40].

Caracteristici legate de stabilitate și de influența mediului biologic al biomaterialului sanguin.[41]:

Datorită numărului mare de polimeri ce prezintă inerție chimică, a proprietăților fizice adecvate (duritate, flexibilitate, permeabilitate, adeziune, rezistența la șoc, tracțiune, alungire la rupere, torsiune, modul de elasticitate) ca și ca posibilităților de prelucrare, compușii macromoleculari au dobândit un rol important în realizarea de dispozitive ce vin în contact cu sângele. Proprietățile polimerilor utilizați ca biomateriale sunt dependente de puritate. Prezența antioxidanților, stabilizatorilor, materialelor de umplutură, urmelor de catalizatori și monomeri reziduali este nefavorabilă.

2. Proprietăți auxiliare

Proprietăți fizico – mecanice ale uretanilor

Nota: pcf – unitate de măsură pentru denstitate acceptată de Asociația pentru Studiul Materialelor.

Rezistența chimică a poliuretanilor:

În tabel s-au folosit următoarele simboluri:

E – excelent, neatacat

B – bun, slabe modificări

F – posibile modificări de dimensiuni de masă

S – săracă, considerabile modificări de material

N – nerecomandată, severe modificări

În cazul PU flexibili, prima litera este pentru polieter și secunda este pentru poliester.

=== Capitolul IV ===

Capitolul IV

Modalități de evaluare a toxicității biomaterialelor

IV.1. Indroducere

Există astăzi proceduri elaborate pentru câteva teste biologice utilizate precum și protocoale care ajută la determinarea tipului de test care trebuie sa fie utilizat. Sunt totuși standarde care se constrazic între ele în cazul câtorva aspecte importante legate de testarea biocompatibilității. Alte aspecte nu sunt tratate deloc de standardele existente. Este dificil de stabilit dacă un dizpozitiv medical întrunește toate cerințele necesare unui grad de securitate biologică.

Cerințele legate de testararea biocompatibilității biomaterialelor au fost adaptate din standardele clasice de toxicologie. Potențialele efecte biologice adverse sunt, în cele mai multe cazuri, similare celor determinate la substanțele chimice sau medicamentoase: iritații , sensibilizări, toxicitate de tesut și organ, mutagenitate, tumori, probleme reproductive.

Un material poate fi compatibil pentru o anumită utilizare și incompatibli în raport cu alt loc de implantare. Este obligatorie stabilirea efectului implantului asupra corpului, de la nivelul celular pâna la nivelul sistemic precum și a efectului organismului asupra implantului.

Stabilirea influenței corpului asupra implantului presupune observarea și estimarea unor modificări ale polimerului referitoare la: degradare, afectarea proprietăților mecanice, eroziune, structura moleculară, hidratare, eluția unor specii cu greutate moleculară mică. Forma suprafeței, absorbția superficială de proteine sau oxidarea lor, înconjurare cu tesut, calcifiere. Printre factorii determinanți în aprecierea toxicității unui material pot fi mentionați: frecvența unor componente toxice în polimer, viteza de difuzie din implant în biofază, concentrarea unor produse toxice în diferite puncte ale biofazei, eliminarea componentelor toxice prin difuzie sau degradare, prezența unor adaosuri în compusul macromolecular care influențează viteza de difuzie [42]. În principiu există trei tipuri de reacții, datorate caracteristicilor fizice ale implantului, proprietăților chimice ale acestuia și imunoreacțiilor. Efectele implantului datorate caracteristicilor fizice sunt: încapsularea epitelială a polimerului, cheratenizarea, îngroșarea țesutului conjunctiv al capsulei fibroase, formarea unei substanțe depozit și prezența celulelor gigantice.

Toxicitatea compușilor macromoleculari conduce la hiper sau hipotrofie epitelială, în funcție de intensitatea efectului nociv, inflamarea țesutului conjunctiv, acumularea glicoproteinelor acelulare, vacuolizarea țesutului gazdă. Reacțiile datorate prezenței antigenelor și infecției se caracterizează prin: inhibarea creșterii epiteliale, invazia teritoriului de către leucocite și proliferarea țesutului inflamator[43].

Substanțe toxice pot fi: monomeri reziduali, dizolvanți, plastifianți, stabilizatori, materiale de umplutură, agenți modificatori, urme de catalizatori, produse de distrucție formate în procesele tehnologice de sinteză, purificare și sterilizare a polimerilor sau prin acțiunea factorilor externi ( temperatura, radiații, medii agresive, solicitări mecanice).

Durata migrării substanțelor din compuși macromoleculari depinde de factori ca: temperatura, concentrația componentului migrator, starea și aria suprafeței polimerului, natura și volumul mediului de contact. La interfața polimer mediu se formează un amestec complex de substanțe cu diferite structuri, ceea ce impune determinarea parametrilor cinetici și termodinamici ai procesului de difuzie la limită de separație[44].

IV.2 Pregătirea probelor

Materialul din constituția dispozitivelor medicale reprezintă o provocare pentru toxicologi, ale căror experimente implică de obicei substanțe chimice care pot fi livrate unui sistem biologic de testare (culturi celulare) într-o doză măsurabilă. Materialele sunt alcătuite din polimeri, metale și alte substanțe solide, definirea dozelor specifice ale substanțelor de interes nu este posibilă. Prepararea extractelor fluide din biomaterialele de interes este cea mai potrivită modalitate de a realiza probe pentru determinarea reactivității biologice[45].

Conform standardelor fluidul utilizat pentru extracți precum și constituțiile de extracție trebuie să fie conform cu destinația dispozitivului medical. Mediile de extracție utilizate trebuie să corespundă mediilor în care produsul definit va fi utilizat. Soluțiile saline fiziologice și uleiul vegetal sunt de obicei suficiente pentru a furniza medii polare și nepolare. Soluția salină extrage componenții hidrosolubili, în timp ce uleiul vegetal extrage copmponenți hiposolubili; Ambele tipuri de componenți pot fi extrase de diferite fluide din corpul uman. Extracția trebuie să se desfașoare la temperaturi suficient de mari pentru a maximiza cantitatea de substanțe extractibile precum și pentru a simula temperaturile cele mai mari la care va fi expus dispozitivul înainte sau în timpul utilizării. Un număr de condiții de extracție specifice poate include: 370 C pentru 24h, 370C pentru 72h, 500C pentru 72 de ore, 700C pentru 24h și 1210C pentru 1h. În cazul majorității biomaterialelor extracțiile decurg în condiții statice. Utilizarea agitării poate conduce la o aproximare mai corectă a mediului în care să fie folosit dispozitivul și poate asigura contactul dintre mediul de extracțe și toate componentele dispozitivului.

IV.3 Metode de testare

Selectarea metodelor specifice de testare poate fi dificilă, depinzând de categoria efectelor biologice pentru care dispozitivul va fi testat. Unele metode sunt descrise în detaliu de diferite standarde ISO – 10993- 5.

Citotoxicitatea

“Teste pentru citotoxicitatea: metode in vitro” (ISO – 10993-5) conține protocoale care prevăd utilizarea mai multor teste alternative de laborator (metoda eluției este una dintre ele). Standardul descrie: prepararea probelor, liniile celulare optime, mediile de cultură, metodele de manipulare, incubare și numărarea celulelor. Este necesară utilizarea a câte trei flacoane pentru fiecare probă în parte și liste cu informațiile care trebuie incluse în raportul de testare.

Testele standard de determinare a citotoxicității utilizează culturi celulare în monostrat care sunt puse în contact direct sau indirect (fluide de extracție) cu biomaterialul testat. În cazul metodei eluției materialele de testare și control sunt plasate în medii de cultură separate în condiții standard. Fiecare fluid de extracție astfel obținut se aplică unei culturi celulare în monostrat înlocuind mediul care a asigurat nutriția celulelor până în acel moment. În acest fel celulelor le este furnizat un mediu de cultură proaspăt care conține substanțe extrase din materialele de testat. Culturile sunt apoi puse în incubator la 370 C și sunt permanent examinate la microscop la intervale de timp prestabilite, timp de trei zile. Celulele sunt examinate pentru a se depista semnele vizibile de toxicitate: modificarea dimensiunilor, apariției unor componenți celulari sau distrugerea configurației.

Metoda directă de evaluare a toxicității constă în aplicarea materialelor de testare și control direct pe monostraturi celulare acoperite cu mediu nutritiv sau cu un mediu semisolid de agar care protejează celulele de orice efecte fizice determinante de contactul cu probele. În timpul perioadei de incubație substanțele extrase vor migra în mediul nutritiv sau prin stratul de agar spre celule. După incubație monostraturile sunt analizate pentru a evalua prezența sau absența zonelor celulare afectate din jurul probei.

În timpul perioadei de incubație substanțele extrase vor migra în mediul nutritiv sau prin stratul de agar spre celule. După incubație monostraturile sunt analizate pentru a evalua prezența sau absența zonelor celulare afectate din jurul probei.

Hemocompatibilitatea

Conform standardelor (ISO – 10993 – 4) testarea hemocompatibilității depinde de categoria de contact sangvin în care se încadreaza biomaterialul sau dispozitivul deosebindu-se trei categorii:

Dispozitive de comunicare externă – cale indirectă de comunicare cu sângele;

Dispozitive de comunicare externă – sânge circulant;

Dispozitive implantabile.

Pentru fiecare categorie se recomandă următoarele teste:

Tromboză

Coagularea

Funcția plachetară

Hematologia

Imunologia

În cazul evaluării primare testele se efectueaza in vitro și cuprind: testarea activității complementului (imunologie), a gradului de hemoliză (hematologie) și a timpului parțial de tromboplastină (coagulare). Metodele de testare in vitro sunt mai rapide și mai puțin costisitoare decât metodele in vivo și nu necesită utilizarea animalelor. Activarea complementului este cel mai relevant test imunologic în cazul biomaterialelor care vin în contact cu sângele circulant. Testele in vitro de evaluare a activității complementului presupun determinarea cantitativă a hemoglobinei plasmatice. O creștere hemoglobinei plamatice este determinată de liza eritricitelor care indică faptul că biomaterialul care a fost pus în contact cu celulele prezintă activitate hemolitică. În cazul acestui tip de testare se foloseste sânge de iepure. Reacția neutrofilelor și a limfocitelor la biomaterilalele poate fi folosită ca un test hematologic eficace [46].

Genotoxicitatea

Exista trei tipuri de efecte genotoxice:

mutația genetică

aberațiile cromozomiale

afectarea ADN-ului

Testele de determinare a mutațiilor genice și a aberațiilor cromozomiale identifică leziuni de la nivelul moleculei de ADN în timp ce testele de determinare a afectării ADN-ului detectează modificări care pot duce la distrugeri ale celulei. Testele in vitro folosesc microorganisme și celule de mamifer.

USP (The United States Pharmacopoeia) a stabilit metode de preparare standard a biomaterialelor care urmează să fie supuse testelor de valoare a genotoxicității; ISO 10993- 12 “Sample Preparation and Reference Materials” descrie de asemenea metode de preparare a extractelor de biomateriale. Selectarea mediului de extracție potrivit este în funcție de tipul de sistem de testat ales. Sistemele de testare bacteriene sunt expuse la o soluție de 0.9% NaCl; Același procedeu se utilizează și pentru soluții de extracție pe bază de etanol sau dimetil sulfoxid. Sistemele de testat in vitro care include celule de mamifere necesită medii ce asigură creșterea celulară, mediul de cultură ales este și mediul de extracție. Modelele de testare in vivo implică utilizarea de medii de extracție standard apoase și neapoase capabile să extragă compuși hidrosolubili (polari) și compuși liposolubili (nepolari)[47].

Sensibilizarea

Reacția de hipersensibilizare sau sensibilizarea apare ca rezultat al contactului repetat sau prelungit cu substanțe chimice care interacționează cu sistemul imunitar al organismului. Majoritatea reacțiilor de acest tip, determinate de biomateriale, este mediată de celule epidermale și mai putin umoral sau de tipul antigen – anticorpi, se utilizează pielea animalelor de laborator pentru testarea sensibilității. Reacțiile de sensibilizare termică la animalele de laborator sunt marcate de înroșiri și umflături ale pielii.

Biomaterialele supuse testării determină reacții de sensibilizare prin intermediul compușilor chimici extractibili pe care-i conțin. În unele cazuri un individ poate dezvolta o reacție de acest tip după contactul repetat cu un biomaterial sau după un contact continuu, prelungit cum este cazul implanturilor.

Pentru testarea prezenței în structura biomaterialului a substanțelor chimice capabile să determine reacții de sensibilizare se utilizează porci de Guineea, animale care prezintă reacții de sensibilizare dermală foarte apropiată de cele ale omului. Testele de sensibilizare cu porcii de Guineea necesită o perioada de timp de 6 pâna la 8 săptămâni. Testul Buehler implică expunerea directă a biomaterialului pe spatele ras al animalului, sub un pansament ocluziv, timp minim 6 ore. Această procedură este repetată de trei ori pe săptămână timp de trei săptămâni. Această fază a testului se numește faza de inducție. După 2 săptămâni de pauză sau după o perioadă de recuperare, interval de timp care permite apariția unui răspuns întârziat, animalele sunt supuse unei ultime expuneri la un patch alcătuit din biomaterial. Acest model de testare este utilizat pentru dispozitive de tipul electrozilor epidermali deoarece în acest caz metoa de aplicare pe animale a biomaterialelor de tesat simulează utilizarea lor clinică.

Dermatită (eczema) se definește ca o reacție inflamatorie cutanată caracterizată clinic prin prurit și apariția stadială a eritemului, edemului veziculizației, eroziunilor și crustelor. Sunt două tipuri de dermatite de contact:

dermatite de contact ortoergice instalate rapid după un prim contact cu o substanță iritantă prin natura sau prin concentrație, limitată strict la zona de contact și determinând eritem, edem, flictenizare, sau necroza în funcție de durata contactului;

dermatite de contact alergice survenite după contacte repetate cu o substanță sensibilizantă, la anumiți indivizi, manifestându – se ca o eczemă ce depășește aria cutanată de contact.

Eczemele alergice de contact au la bază trei factori:

factorul imunopatologic:

Inducerea reacției imunitare prin aplicarea epicutanată a unor substanțe chimice și reacție tisulară care rezultă în urma acestei reacții. Schematic, acest factor ar fi:

faza de sensibilizare activă (inducere) cu formarea antigenului și implicarea celulelor Langerhans

faza de revelare

modularea sensibilității de contact.

epidemiologia și genetica:

Motivele pentru care numai anumiți subiecți dezvoltă reacții alergice de contact.

bazele moleculare:

Procese fizico – chimice care conduc la formarea antigenelor[48].

IV.4 Efectele implanturilor

Animalele de elecție în testarea implanturilor sunt: iepurii (ISO – 10993 – 6) șoarecii, șobolanii și porcii de Guineea.

După ce iepurii sunt anesteziați și pielea lor este rasă și dezinfectată, patru probe de testare sunt implantate în muschiul paralombar de o parte și patru probe cunoscute ca nereactive sunt implantate de partea opusă. Pentru a evalua folosirea pe termen scurt a biomaterialului ca implant se verifică răspunsul tisular după:1, 4, 12 săptămâni. Pentru testele pe termen lung intervalele de valoare sunt: 12, 26, 52, 78 săptămâni. Pentru fiecare interval de testare sunt necesare 3 sau mai multe animale.

La sfărșitul fiecărui interval specificat fiecare zonă de implanare este examinată cu lupa și este înregistrată mărimea capsulei care înconjoară implantul. Materialele reactive pot produce capsule cu diametre de 2 – 4mm în timp ce materialele nereactive nu produc în general capsule vizibile. [49].

Implantul este îndepartat, iar țesuturile sunt preparate pentru examinarea histopatologică. La nivel microscopic pot fi evaluate și întinderea reacției celulare la implant.

Reacțiile severe sunt marcate de prezența în număr ridicat a celulelor inflamatorii și de moartea celulelor musculare din jurul implantului[49].

Testele de evaluare e efectelor implanturilor se efectuează utilizând probe solide. Dacă un biomaterial este sub formă de pastă, gel, pulbere există posibilitatea acoperirii unei suprafețe de referința inerte din material polimeric sau din oțel inoxidabil a materialului respectiv. Preparatul astfel obținut se supune testelor standard descrise. Ca alternativă, unele materiale se pot plasa în interiorul unui tub inert care este ulterior implantat, urmând ca răspunsul tisular să fie apreciat la capetele tubului unde proba testată vine în contact cu țesutul viu.

IV.5 Concluzii

Metodele de valoare ale biomaterialelor stau la baza înțelegerii structurii acestora și a potențialelor afecte adverse pe care le pot avea la contactul cu țesutul viu. Se asigură tot odată posibilitatea standardizării caracteristicilor biomaterialelor de la un lot la altul. Testele care au ca scop evaluarea reactivități biologice trebuie să analizeze toți constituenții care intră în alcătuirea biomaterialului. În cazul biomaterialelor care intra în contact cu fluidul sangvin hemocompatibilitatea este caracteristica esențială.