Biologia Moleculară în Dezvoltarea Genomicii

CAPITOLUL I

1.1. ACIZII NUCLEICI. STRUCTURĂ CHIMICĂ ȘI ACTIVITATE BIOLOGICĂ

Investigarea structurii și activității biologice a acizilor nucleici prezintă o importanță majoră, stând la baza studiilor de genomică, proteomică sau biotehnologii.

Aceste molecule poartă informația genetică necesară transmiterii caracterelor de la o generație la alta și totodată stau la baza sintezei proteinelor – moleculele de bază în alcătuirea tuturor structurilor celulare și controlul căilor metabolice.

Acizii nucleici sunt molecule prezente în toate celulele vii, inclusiv în virusuri, fiind descoperiți pentru prima dată în anul 1871 de către Friedrich Miescher. Studierea acizilor nucleici a constituit de-a lungul timpului o parte importantă a cercetărilor din biologie și medicină și formează fundamentul atât pentru studiile de genomică și criminalistică, cât și pentru biotehnologie și industria farmaceutică.

În natură se diferențiază două tipuri de acizi nucleici și anume acidul dezoxiribonucleic ADN și acidul ribonucleic – ARN, care se găsesc în proporții diferite în celule. Astfel, în celula bacteriei E. coli proporția ADN este de 1%, iar cea a ARN este de 6% (Tabelul 1.1).

Tabelul 1.1. Componentele moleculare ale unei celule E. coli

dupa Watson JD: Molecular Biology of the Gene, 2nd ed., Philadelphia,

PA: Saunders, 1972

1.1.1. ORGANIZAREA MOLECULARĂ A ACIZILOR NUCLEICI

Acizii nucleici, ADN și ARN sunt principalele molecule informaționale ale celulei.

Acidul dezoxiribonucleic (ADN) – macromolecula care are un rol unic de material genetic, este localizat în cazul celulelor eucariote în principal în nucleu, dar și în mitocondrii și cloroplaste.

Acizii ribonucleici (ARN) se diferențiază în funcție de rolul pe care îl îndeplinesc în celulă. Astfel, acidul ribonucleic mesager (ARNm) transportă informația de la ADN la ribosomi și servește ca matriță pentru sinteza proteinelor. Alte două tipuri de ARN: ARN ribosomal (ARNr) și ARN de transfer (ARNt) sunt implicate în sinteza proteinelor. În plus au fost caracterizate molecule ARN de dimensiuni mici, care îndeplinesc diferite funcții în celulele eucariote (Tabel 1.1).

Moleculele ARN citoplasmatic de dimensiuni mici (scRNA – “Small cytoplasmatic RNAs”) intră în alcătuirea particulei de recunoaștere a semnalului (SRP – signal recognition particle) și au implicații în procesul de procesarare a ARNt.

Moleculele ARN nuclear de dimensiuni mici (snRNA – “Small nuclear RNAs”) sunt implicate în procesul de eliminare a intronilor în timpul prelucrării și maturării moleculelor de ARNm. ARNsn formează complecși cu proteinele care stau la baza structurii particulelor ribonucleo-proteice (Sn RNPs – “Ribonucleoprotein particles”).

Moleculele ARN nucleolar de dimensiuni reduse (snoARN- “Small nucleolar RNAs”) sunt implicate în procesarea, maturarea și metilarea moleculelor ARNr.

Moleculele micro-ARN (miRNAs – “Micro RNAs”) sunt molecule de ARN de dimensiuni reduse, prezente în toate organismele vii, fiind implicate în reglarea expresiei genelor. Aceste molecule au capacitatea de a se lega la ARNm prevenind desfășurarea procesului de sinteză a proteinelor.

Moleculele siARN (siRNA – “Small interfering RNA“) sunt molecule de ARN de dimensiuni reduse, fiind implicate în reglarea genelor. Aceste molecule au capacitatea de a degrada anumite ARNm, împiedicând (la fel ca miARN) sinteza anumitor proteine.

ADN și ARN sunt polimeri ai nucleotidelor, alcătuite din baze purinice și pirimidinice legate la monozaharide fosforilate.

Din punct de vedere chimic, ADN este o polinucleotidă, adică un compus în structura căruia se repetă un set limitat de macromolecule numite nucleotide.

Tabel 1.1. Tipurile de ARN și funcțiile îndeplinite

Nucleotida ca unitate de bază a acizilor nucleici este o macromoleculă organică compusă din:

O glucidă, mai exact o monozaharidă, de tipul pentoză;

O bază azotată heterociclică, cu un număr de 6 atomi de tipul pirimidinei sau o variantă a acesteia condensată cu inelul imidazolic numită purină;

un rest de acid fosforic, adică o "grupare fosfat ".

Pentozele care intră în structura acizilor nucleici sunt 2-dezoxi-riboză pentru ADN sau riboză, pentru ARN (Fig. 1.1). În cazul moleculei de 2’ – dezoxi-riboză, gruparea OH din poziția 2’ este înlocuită de un atom de hidrogen.

Fig. 1.1 Structura monozaharidelor care intră în alcătuirea

acizilor nucleici

Dintre bazele heterociclice azotate ale ADN, două sunt purinice, adenina și guanina, iar alte două sunt pirimidinice, citozina și timina. În ARN, uracilul înlocuiește timina (Fig. 1.2).

Fig. 1.2 Structura bazelor azotate care intră în alcătuirea

acizilor nucleici

Bazele azotate se leagă în poziția 1 la 2’- dezoxi-riboză în ADN sau la riboză în ARN, pentru a forma nucleozide. Nucleotidele conțin în plus una sau mai multe grupări fosfat legate la atomul de carbon 5’ al nucleozidului.

Polimerizarea nucleotidelor pentru constituirea acizilor nucleici implică formarea legăturilor fosfodiesterice între fosfatul 5’ al unui nucleotid și hidroxilul 3’ al altui nucleotid.

Oligonucleotidele sunt polimeri care conțin câteva nucleotide, pe când polinucleotidele mari ca ARN și ADN conțin mii sau milioane de nucleotide. Un lanț polinucleotidic are o anumită direcție: o extremitate a lanțului se termină cu o grupare 5’ fosfat, iar cealaltă extremitate se termină cu o grupare 3’ hidroxil. Polinucleotidele sunt întotdeauna sintetizate în direcția 5’- 3’, un nucleotid liber fiind adăugat la gruparea 3’-OH a unui lanț în creștere (Fig. 1.3).

Informația stocată în ADN și ARN este transmisă prin aranjamentul bazelor azotate din lanțul polinucleotidic.

ADN este o moleculă dublu elicoidală, alcătuită din două lanțuri polinucleotidice în care bazele azotate sunt dispuse în interiorul macromoleculei; cele două lanțuri sunt unite prin legături de hidrogen care se stabilesc între perechile de baze complementare: adenina cu timina și citozina cu guanina („regula Watson Crick”) (Fig. 1.4).

De o deosebită importanță pentru procesele care au loc ”in vivo” (replicarea, repararea leziunilor, transcripția), dar și pentru dezvoltarea tehnicilor de investigație asupra acizilor nucleici este atât legea complementarității bazelor, cât și numărul legăturilor de hidrogen care se stabilesc între bazele azotate – două între adenină și timină și trei între guanină și citozină (Fig. 1.5). Legăturile spațiale care se stabilesc între bazele azotate timină-adenină și citozină – guanină determină dispunerea în sensuri opuse a celor două catene fiind orientate antiparalel.

î

Deci, cele două catene ale moleculei ADN formează o spirală dublu helicoidală, orientată spre dreapta, având un diametru de 2nm. Structurile celor două catene, rezultate din alternarea ribozelor și a grupărilor fosfodiesterice sunt răsucite în jurul axului ca balustrada unei scări, iar perechile de baze azotate reprezintă treptele acesteia. În configurația spațială a moleculei de ADN

fiecare spiră a elicei este alcătuită dintr-un fragment de 10,4 perechi de nucleotide, cu o distanță între două subunități adiacente de 3,4nm. Se generează două șanțuri laterale – unul cu dimensiunea de 12Å și cele de-al doilea de 24 Å, care au un rol important în recunoșterea și fixarea acelor tipuri de proteine cu care interacționează molecula de ADN.

Această structură helicoidală este considerată un simbol al lumii vii, fiind asociată cu funcțiile metabolice pe care le îndeplinesc acizii nucleici.

Consecința acestei complementarități este că un lanț polinucleotidic al ADN sau ARN poate acționa ca matriță pentru sinteza unui lanț complementar. Acizii nucleici sunt singurele molecule care sunt capabile să-și direcționeze propria autoreplicare. Informația transportată de către ADN și ARN determină sinteza proteinelor specifice, care controlează activitățile celulare.

În biologia moleculară dimensiunea fragmentelor de ADN poate fi evaluată în unități de masă sau de lungime. În mod convențional, pentru lungimea fragmentelor ADN se folodește termenul de perechi de baze (“base pairs”) cu prescurtarea bp sau kb („kilo base pairs”).

1.1.2. ORGANIZAREA SUPRAMOLECULARĂ A MOLECULEI ADN

În cazul celulelor eucariote dublul helix ADN este supus unui proces de condensare, datorită interacțiunii biochimice cu alte molecule cum ar fi histonele și proteinele reglatoare. Gradul de condensare este asociat cu etapa din ciclul celular în care se află celula la un moment dat.

Ciclul de viață al fiecărei celule este alcătuit din două etape importante și anume interfaza și diviziunea celulară. În continuare sunt prezentate cîteva aspecte ale ciclului celular legate de aspectele genetice.

Interfaza este alcătuită din faza G1 sau presintetică, faza S sau sintetică și faza G2 sau postsintetică. În faza G1 cantitatea de ADN corespunde unor cromosomi monocromatidici despiralizați, alcătuiți dintr-o moleculă ADN dublu catenară. În faza S sau sintetică are loc replicarea ADN nuclear astfel încât la sfârșitul ei cantitatea de ADN este dublată. Deci, la inițierea sintezei ADN, celula se află în condiții de diploidie (2n), la sfârșit ajungând în condiții de tetraploidie (4n). În faza G2 cantitatea de ADN corespunde unor cromosomi bicromatidici despiralizați, fiecare cromatidă fiind alcătuită dintr-o moleculă ADN dublu catenară. Cea de-a doua etapă a ciclului celular o reprezintă diviziunea celulară sau mitoza. La începutul mitoyei cromozomii bicromatidici se condensează, fiind vizibili la microscopul optic.

Primul nivel de organizare supramoleculară a moleculei ADN îl reprezintă filamentul cu nucleozomi, cu un diametru de 10 nm, denumit cromatină.

Nucleozomii sunt structuri sferice, alcătuite din 8 molecule de histone. Histonele sunt proteine bazice, care poartă grupări încărcate pozitiv datorită aminoacizilor lizină și arginină. Atât arginina cât și lizina au câte o grupare laterală amino, care poate să atragă protoni, devenind astfel grupări încărcate pozitiv ( ~~ NH2 + H+ → ~~ NH3+). Aceasta încărcare pozitivă a histonelor permite atașarea la grupările fosfat negative care intră în alcătuirea moleculei ADN. Familiile de histone sunt de tip H1, H2A, H2B, H3 și H4, fiecare cuprinzând un număr de subfamilii.

Centrul nucleozomului sau miezul proteic îl reprezintă un octamer care cuprinde un tetramer alcătuit din proteinele H3 și H4 (doi dimeri H3-H4) și doi dimeri H2A-H2B.

În jurul fiecărui miez proteic este înfășurat un fragment ADN cu o lungime de 147 bp sub forma a două spire. Doi nucleozomi vecini sunt uniți prin intermediul unor fragmente ADN cu lungimea de 20-60 bp, denumite ADN de legătură (ADN linker).

Structura de „mărgele pe sfoară” este menținută și de moleculele de histone H1, care reprezintă o punte între doi nucleozomi adiacenți, fiind localizate în afara nucleozomului, lângă ADN linker și interacționând cu subunitatea H2A a miezului nucleozomic (Fig. 1.6). Aspectul de „mărgele înșirate pe sfoară” a fost confirmat și prin microscopie electronică.

Fig. 1.6. Structura filamentului cu nucleozomi, care generează imaginea de „mărgele pe sfoară” a cromatinei

Legarea histonelor la ADN nu depinde de o anumită secvență a nucleotidelor, dar depinde de secvența de aminoacizi a histonelor. Acestea se fixează în șanțul mic al moleculei de ADN, contribuind la procesul de împachetare. În anumite etape ale ciclului celular are loc modificarea chimică prin metilare, fosforilare sau acetilare a numeroase situsuri în special ale histonelor H3 și H4, ceea ce conduce la modificarea interacțiunilor cu molecula de ADN. Astfel se modifică accesul proteinelor (în special factori de transcripție) la molecula de ADN.

Pe lângă histone, cromatina mai conține o cantitate mică dintr-o gamă largă de proteine non-histonice. Majoritatea acestora este reprezentată de factori de transcripție, care se atasează în șanțul mare al moleculei de ADN, în special în porțiunile reprezentate de promotori.

Histonele sunt unele dintre cele mai bine conservate molecule în cursul evoluției. Astfel, histona H4 la bovine diferă numai prin doi aminoacizi dintr-un total de 102, de histona echivalentă de la mazăre. Se poate spune că secvența aminoacizilor din histona H4 a rămas aproape constantă în 2 miliarde de ani de când, din punctul de vedere al evoluției plantele s-au diferențiat de animale. Proteina H3 s-a modificat ceva mai mult în timpul acestei perioade de evoluție, astfel că secvențele aminoacizilor în cazul celor două organisme mai sus menționate se diferențiază prin patru aminoacizi.

Este posibil să comparăm rata de modificare a histonelor cu cea a altor proteine în cursul evoluției. Se poate utiliza o mărime care evaluează perioada în care secvența unei proteine s-a modificat cu 1%, după despărțirea celor două linii evolutive. Această perioadă, pentru histonele H3 și H4 este de 300, respectiv 600 milioane de ani, cu mult mai mare decât cea întâlnită în cazul altor proteine studiate până acum (ex: 6 milioane de ani pentru hemoglobină). Structura înalt conservată a acestor două proteine sugerează faptul că ele joacă un rol critic în alcătuirea moleculei ADN, care a fost stabilit foarte devreme în evoluție și care a rămas neschimbat de atunci.

Au fost identificate 8 tipuri diferite de histone H1, care depind de tipul celulei, poziționarea în celulă și stadiul de diferențiere. În cazul nucleozomilor care sunt poziționați lângă centromeri histona H3 este înlocuită de CENP-A ("centromere protein A"). Dacă în această regiune histona H3 nu poate fi înlocuită de CENP-A structura și funcționarea centromerului se blochează. Histona H2A poate fi înlocuită cu o altă variantă H2A.Z în regiunea care separă eucromatina și heterocromatina.

De obicei histonele standard sunt încorporate în nucleozomii moleculei ADN nou sintetizată, în timpul fazei de sinteză S a ciclului celular. Mai târziu, unele sunt înlocuite cu alte variante ale histonelor, în funcție de condițiile din celule.

Dar, aranjarea ADN sub forma nucleozomilor nu este suficientă pentru a explica o structură atât de compactă care să permită împachetarea în interiorul nucleului. Astfel, pentru ca 46 de molecule de ADN uman, totalizând mai mult de 2m în lungime, să intre într-un nucleu cu un diametru de 10µm este necesară o împachetare mai avansată.

Al doilea nivel de organizare supramoleculară a moleculei ADN este fibra de cromatină, cu un diametru de 30nm, rezultată din spiralizarea sub forma unui solenoid a cromatinei. Fiecare spiră a solenoidului este alcătuită din 6 nucleozomi, fiind stabilizată de histona H1. Astfel, se consideră că unitatea fundamentală de organizare a moleculei ADN în nucleul interfazic este fibra de cromatină, cu diametrul de 30nm.

Analiza structurală a evidențiat că prin spiralizare se apropie regiuni ale ADN, care sunt amplasate la distanțe mari unele față de celelalte în molecula liniară. Astfel, este asigurată transmiterea corectă a informației genetice, dovedind implicarea modului de împachetare în funcționarea genomului.

Spiralizarea specifică sub forma de solenoid asigură accesul enzimelor care realizează transcripția, deoarece apare o alternare a zonelor puternic spiralizate cu cele nespiralizate.

Al treilea nivel de organizare rezultă prin plierea fibrei de cromatină de 30 nm în bucle laterale, numite și domenii, de lungimi diferite (20 – 100kb), având un diametru de 300nm. Buclele nu au numai un rol structural ci și funcțional deoarece se consideră că fiecare bucla ar putea fi o unitate de transcripție.

Al patrulea nivel de organizare îl reprezintă cromatida, care apare la începutul profazei prin condensarea fibrei de cromatină pliată în bucle laterale. În metafază are loc cel mai înalt grad de condensare al fibrei de cromatină, diametrul ajungând la 700 nm (Fig. 1.7).

Cromozomul aflat în metafază este alcătuit din două cromatide surori (atașate la nivelul centromerului). Fiecare cromatidă a cromozomului conține deci o singură moleculă de ADN, care a suferit mai multe procese succesive de compactare. Cea de-a doua cromatidă a luat naștere în timpul replicării, care a avut loc în faza S a ciclului celular.

           Se poate spune că molecula de ADN suferă o compactare de aproximativ 10.000 de ori și astfel poate să încapă în nucleu, care are un diametru de câțiva micrometri. Astfel, este asigurată împărțirea corectă a materialului genetic în timpul procesului de diviziune și totodată se asigură desfășurarea corespunzătoare a tuturor proceselor metabolice: replicare, transcripție, etc.

Fig. 1.7 Nivelurile de organizare supramoleculară ale moleculei ADN

(1) reprezentări schematizate ale fiecărui nivel de organizare;

(2) imagini vizualizate la microscop.

1.1.3. ORGANIZAREA SUPRAMOLECULARĂ A MOLECULEI ARN

Structura primară a moleculei de ARN este în general similară cu cea a ADN cu două excepții: monozaharidul este riboza care posedă o grupare hidroxil în poziția 2’ și timina este înlocuită de uracil.

Prezența timinei în loc de uracil în ADN influențează stabilitatea pe termen lung a acestei molecule, deoarece timina este implicată în procesele de reparare a ADN. Gruparea hidroxil de la atomul C2 al ribozei face ca molecula de ARN să fie mult mai labilă comparativ cu cea de ADN. Ca rezultat al acestei labilități, ARN poate fi clivat în mononucleotide în soluție alcalină, fenomen care nu apare în cazul moleculei de ADN. Hidroxilul de la atomul C2 pune la dispoziție o grupare chimică reactivă, care este implicată în reacțiile catalizate de ARN.

La fel ca ADN, ARN este o macromoleculă polinucleotidică, care poate fi mono (ARNmc) sau dublu catenară (ARNdc), liniară sau circulară. Poate de asemenea să participe la formarea unor molecule hibride ARNmc – ADNmc.
Spre deosebire de ADN care se găsește în celulele vii întotdeauna bicatenar, dublu helix, majoritatea moleculelor ARN sunt monocatenare (cu excepția particulelor virale), fiind posibilă adoptarea mai multor conformații. Diferențele de dimensiune și conformație permite moleculelor ARN să îndeplinească diferite funcții în celule.

Structura secundară a ARN se formează prin legarea fragmentelor monocatenare complementare. Astfel, structura ac de păr” (hairpin) se formează prin cuplarea bazelor azotate aflate la o distanță de 5 – 10 nucleotide una față de cealaltă, iar în cazul structurii sub formă de ”bucla” (loop) distanța dintre secvențele complemenare cuplate poate fi de zeci, sute sau chiar mii de nucleotide (Fig. 1.8).

Fig. 1.8 Structura secundară a moleculei de ARN

a – structura în „ac de păr” (hairpin;

b- structura sub formă de „buclă” (loop).

Aceste împachetări simple concură la formarea unor structuri terțiare mult mai complexe, specifice fiecărui tip de ARN. În cazul moleculei de ARNt se adoptă o structură tridimensională bine definită, care are o importanță deosebită în procesul de sinteză a proteinelor (Fig. 1.9).

Fig. 1.9. Modelul structurii moleculare a ARNt

Bucla 1 cuprinde situsul pentru fixarea temporară la ribozom, în timpul sintezei proteice;

Bucla 4 reprezintă situsul de recunoaștere pentru enzimele ~ ARN sintetaze, care sunt implicate în formarea complexului aminoacil~ ARNt;

Bucla 3 este numită și bucla anticodonului, la nivelul său fiind localizat tripletul care realizează recunoașterea specifică a codonului din ARNm, cu care poate forma legături de hidrogen în timpul fixării ARNt pe complexul ARNm – ribozom.

Moleculele ARNr au de asemenea structuri tridimensionale localizate, legate între ele cu regiuni mai flexibile.

Se observă adoptarea unei structuri secundare și terțiare și la moleculele de ARNm, în particular în zonele situate spre capetele moleculelor.

Prin urmare moleculele de ARN sunt asemănătoare cu proteinele, care au domenii structurate, conectate prin domenii liniare, mai puțin structurate și flexibile. Domeniile de împachetare ale moleculelor de ARN nu sunt asemănătoare cu cele ale proteinelor (α și β) dar în unele cazuri au și capacități catalitice. Astfel ARNr catalizează legarea la proteine pentru a da naștere precursorilor ribozomali.

1.2. PROTEINELE. STRUCTURA CHIMICĂ ȘI ACTIVITATEA BIOLOGICĂ

1.2.1. ORGANIZAREA MOLECULARĂ A PROTEINELOR

O celulă poate să conțină peste 100 de proteine, care îndeplinesc diferite funcții. Astfel, proteinele sunt componentele funcționale cele mai importante ale celulelor, alcătuite din 20 de aminoacizi.

Fiecare aminoacid este alcătuit dintr-un atom de carbon, numit carbon α, legat la o grupare carboxil (COO-), la o grupare amino (NH3+), la un atom de hidrogen și la o catenă laterală (radical) distinctă (Fig. 1.10).

Proprietăție chimice, specifice diferitelor catene ale aminoacizilor explică rolul fiecărui aminoacid în structura și funcția proteinei.

După proprietățile catenelor laterale aminoacizii se clasifică în patru categorii:

Șapte aminoacizi au catene nepolare alifatice, care nu interacționează cu apa (Fig. 1.11).

Trei aminoacizi cu catene laterale nepolare, aromatice (Fig. 1.12).

Cinci aminoacizi cu catene laterale polare, neutre (Fig. 1.13)

Trei aminoacizi cu catene laterale cu grupări bazice, încărcate pozitiv (Fig. 1.14).

Doi aminoacizi cu catene laterale acide, încărcate negativ (Fig. 1.15)

Aminoacizii hidrofobi sunt localizați de obicei în interiorul proteinelor. Aminoacizii cu grupări încărcate, acide sau bazice sunt hidrofili și sunt orientați spre suprafața proteinelor, intrând în contact cu soluția apoasă care alcătuiește matrixul compartimentelor celulare (citozol, mitocondrii, cloroplaste etc.).

Aminoacizii sunt legați între ei prin legături peptidice realizate între gruparea amino a unui aminoacid și gruparea carboxil a celui de-al doilea aminoacid (Fig. 1.16).

Fig. 1.11 Structura aminoacizilor cu grupări lateral nepolare, alifatice

Fig. 1.12 Structura aminoacizilor cu catene laterale nepolare, aromatice

Fig. 1.14 Structura aminoacizilor cu catene laterale cu grupări bazice,

încărcate pozitiv

Fig. 1.15 Structura aminoacizilor cu catene laterale acide,

încărcate negativ

Fig. 1.16 Reacția de formare a unei legături peptidice prin condensare

Polipeptidele sunt lanțuri liniare, alcătuite din sute sau mii de aminoacizi, cu o extremitate amino ( N – terminală) și o extremitate carboxil (C – terminală).

Polipeptidele, cu structuri specifice de aminoacizi reprezintă numai primul element al structurii unei proteine. Acestea adoptă de obicei conformații tridimensionale distincte, ca rezultat al interacțiunilor dintre aminoacizii care le compun. Deci, conformațiile proteinelor sunt determinate de secvența lor de aminoacizi.

1.2.2. ORGANIZAREA SUPRAMOLECULARA A PROTEINELOR

Proteinele au o structură supramoleculară organizată pe patru nivele, în funcție de gradul de condensare și împachetare.

Structura primară a unei proteine este dată de secvența de aminoacizi din lanțul polipeptidic.

Structura secundară este determinată de dispoziția aminoacizilor în anumite regiuni ale polipeptidului. Pauling și Corey (1951) au propus două tipuri de structuri secundare, în α helix și în pachete β (planuri pliate). Aceste două structuri secundare sunt menținute prin legăturile de hidrogen dintre grupările CO și NH ale legăturilor peptidice.

Un α helix se formează când o regiune a unui lanț polipeptidic se răsucește în jurul ei însăși; gruparea CO a unei legături peptidice formează o legătură de hidrogen cu gruparea NH a altei legături peptidice situată cu patru resturi în aval pe lanțul polipeptidic liniar.

În schimb, un pachet β este format când două porțiuni ale unui lanț polipeptidic se dispun alăturat și se leagă între ele prin legături de hidrogen. Asemenea pachete β pot fi formate între mai multe lanțuri polipeptidice, care pot fi orientate paralel sau antiparalel unele față de altele.

Structura terțiară este indusă de plierea lanțului polipeptidic ca rezultat al interacțiunii dintre radicalii aminoacizilor care se află în diferite regiuni ale secvenței primare. În majoritatea proteinelor, combinațiile în α helix și pachetele β – conectate prin regiuni flexibile în formă de buclă ale lanțului polipeptidic – se pliază în interiorul unor structuri globulare compacte, numite domenii.

Aceste domenii sunt unități de bază ale structurilor terțiare. Proteinele mici cum ar fi ribonucleaza au un singur domeniu, iar proteinele mari conțin mai multe domenii care sunt asociate frecvent cu funcții distincte. Porțiunile interne ale proteinelor pliate sunt alcătuite din aminoacizi hidrofobi aranjați în α helix sau pachete β; aceste structuri secundare sunt prezente în miezul hidrofob al proteinelor, deoarece prin legăturile de hidrogen se neutralizează caracterul polar al grupărilor CO și NH ale scheletului polipeptidic. Regiunile buclă care conectează aceste elemente ale structurii secundare sunt prezente pe suprafața proteinelor pliate, acolo unde componentele polare ale legăturilor peptidice formează legături de hidrogen cu apa sau cu radicalii polari ai aminoacizilor hidrofili.

Interacținile dintre radicalii aminoacizilor polari, realizate prin legături de hidrogen și legături ionice la suprafața proteinei sunt factori importanți ai structurii terțiare. În plus, legăturile disulfurice covalente între grupările sulfhidril ale resturilor de cisteină stabilizează structurile pliate ale multor proteine secretate sau ale proteinelor prezente pe suprafața celulară.

Cel de–al patrulea nivel al structurii unei proteine – structura cuaternară – este determinată de interacțiunile dintre diferite lanțuri poli-peptidice prezente în proteinele compuse din mai mult decât un polipeptid. De exemplu, hemoglobina este compusă din patru lanțuri polipeptidice menținute împreună prin aceleași tipuri de interacțiuni care determină structura terțiară. Conformațiile tridimensionale diferite ale proteinelor corespund funcțiilor variate pe care trebuie să le îndeplinească în biologia celulei (Fig. 1.17).

Fig. 1.17 Nivelurile de organizare supramoleculara ale lanțurilor polipeptidice

CAPITOLUL II

GENOMUL ȘI ORGANIZAREA GENICĂ

Notiunea de genom a fost introdusă pentru prima dată în anul 1920 de către un botanist pe nume Hans Winkler care a fuzionat cuvintele grecești "genesis" și "soma" pentru a descrie setul complet de gene.

În prezent, o dată cu dezvoltarea geneticii moleculare termenul de genom se referă la totalitatea materialului genetic dintr-o celulă, cuprinzând atât genele cât și secvențele necodante. Fiecare genom trebuie să conțină informația necesară pentru alcătuirea organismului și totodată sa-i permită creșterea și dezvoltarea.

Dimensiunea genomului este o noțiune care se referă la cantitatea de ADN conținută într-o copie a genomului. Ca unitate de măsură se folosesc de obicei picograme (pg), mai rar daltoni (Da). Cel mai adesea se exprimă ca număr de perechi de nucleotide sau perechi de baze (bp). Un picogram de ADN corespunde unui fragment cu lungimea de 978 Mb.

Cantitatea totală de ADN din genomul haploid este denumită valoarea C. Nu exista o corelație între valoarea C și complexitatea unui organism, fapt denumit în literatura de specialitate paradoxul valorii C.

Tabelul 2.1. Dimensiunea genomului și numărul de gene la diferite organisme

Genomul speciei Arabidopsis thaliana, planta model al cărei genom a fost secvențializat încă din anul 2000, conține un număr 1,57 x 108 perechi de baze (bp). Aproximativ 14% din acesta este constituit din transpozoni, iar restul constituie cele 25.498 de gene. Porumbul conține de 20 de ori mai mult ADN (2,8 x 109 bp), dar numărul de gene este numai de aproximativ 2 ori mai mare, deoarece 60% din genomul porumbului este constituit din transpozoni.

În anul 2014 a fost secvențiat genomul Genlisea tuberosa, o specie de plante carnivore din genul Genlisea, care are cel mai mic genom identificat până în prezent la angiosperme și anume 0,61x108bp. Se consideră că de-a lungul evoluției genului, genomurile unor specii Genlisea au suferit o reducere drastică a dimensiunii însoțită de o miniaturizare a cromozomilor.

Genomul speciei Paris japonica, un hibrid octoploid între patru specii, cu un număr de 40 de cromozomi a identificat în anul 2010 ca fiind cel mai mare genom al unei plante analizate până în prezent, cu o lungime de 1,5 x 1011bp. Este de 50 de ori mai mare decât cel uman, fiind cel mai mare genom al vreunui organism viu cunoscut.

Interesant este că dimensiunea genomului unui organism nu se corelează cu complexitatea sa sau cu nivelul evolutiv. Deși organisme unicelulare, cum ar fi drojdia de bere sau unele specii de plante au mult mai puțin ADN comparativ cu omul, totuși există plante care au o cantitate mult mai mare de ADN.

2.1. ORGANIZAREA GENOMULUI LA VIRUSURI

2.1.1. VIRUSURI BACTERIENE

Virusurile bacteriene sau bacteriofagii au genomuri reprezentate de macromolecule de ADN sau ARN de mărimi variabile. În prezent sunt cunoscute câteva mii de bacteriofagi și numai bacteria E. coli poate fi infectată de câteva sute de fagi. Astfel fagii care infectează E. coli pot fi împărțiți în 4 grupe :

2.1.1.1 FAGII CU GENOM ADN DIN SERIA “T”

Fagii cu genom ADN din seria T, au un singur genom reprezentat de o singură moleculă de ADN de dimensiuni variabile.

După pătrunderea genomului fagic în celula bacteriană are loc reproducerea a aproximativ 100 de fagi care sunt eliberați în mediu prin liza celulei gazdă, în numai câteva minute.

Bacteriofagul T4 – fag specific bacteriei E.coli are un genom ADN dublu catenar, alcătuit din 135 de gene, având o lungime de 169 kb.

Acest fag posedă un cap, în care se găsește împachetată o moleculă de ADN dublu catenar, în care este înregistrată informația genetică. Capul se continuă cu o coadă în forma unui cilindru, gol în interior, care se sfârșește cu o placă terminală de care sunt atașate 6 fibre proteice codale.

2.1.1.2. FAGII TEMPERAȚI CU GENOM ADN

Fagii temperați cu genom ADN după ce infectează celula gazdă pot determina liza celulei bacteriene, similar celor din seria T, dacă este urmat ciclul litic, sau genomul lor poate fi integrat în cromozomul bacterian. Ei rămân în această postură de provirus sau de bacteriofag temperat un timp nedefinit, fiind replicați o dată cu genomul celulei gazdă – ciclul lizogenic.

Din acest grup face parte fagul , care are un genom ADN, cu o lungime de 48 kb. Dacă este urmat ciclul litic are loc eliberarea în mediu a aproximativ 100 de fagi.

Dacă este urmat ciclul lizogenic, genomul fagic este integrat în cromozomul bacterian și sub această formă este replicat o dată cu acesta sute și mii de generații până ce intervin fenomene de afectare a ADN, cum ar fi radiațiile UV. Din această cauză genomul fagului este eliberat din cromozomul bacterian, se replică independent și are loc astfel trecerea de la ciclul lizogenic la cel litic. Celula bacteriană este astfel lizată și aproximativ 200 de fagi noi sunt eliberați în mediu.

Caracteristicile genetice ale bacteriofagului  au fost exploatate, astfel că a stat la bază dezvoltării un sistem de clonare a fragmentelor ADN în celule bacteriene.

2.1.1.3 FAGI CU GENOM ADN MONOCATENAR

Din grupul fagilor cu genom monocatenar fac parte : fagul X 174 (cu genom alcătuit din 5386 nucleotide), fagul G4 (5577 nucleotide) și fagul M13 (7200 de nucleotide)

Dintre bacteriofagii cu genom ADN replicarea este foarte bine cunoscută la fagul X 174, la care materialul genetic este reprezentat de o macromoleculă de ADN monocatenar circular, cu o lungime de 1,8 m. După ce materialul genetic viral pătrunde în celula bacteriană are loc rapid sinteza unei catene de ADN complementare, astfel că genomul viral devine bicatenar. Apoi, el are o replicare rapidă, formând aproximativ 20 de copii de ADN circular bicatenar. În același timp începe procesul de transcripție a informației genetice virale, se sintetizează ARNm, care împreună cu ribozomii celulari determină sinteza de proteine virale.

Cele 20 de copii bicatenare ale genomului viral servesc ca matriță pentru sinteza a aproximativ 200 de molecule de ADN monocatenare.

ADN viral monocatenar împreună cu proteinele virale dau naștere particulelor virale active, celula este lizată, iar particulele virale sunt eliberate în mediu.

2.1.1.4. FAGII CU GENOM ARN

Această categorie de fagi are un genom reprezentat de o moleculă de ARN de dimensiuni mici, alcătuită din aproximativ 3500 nucleotide, cuprinzând 3 gene. În acest caz genomul funcționează în celulele gazdă ca ARNm, conducând direct la sinteza proteinelor.

2.1.2. VIRUSURI ANIMALE

În cazul virusurilor animale genomul este constituit din acidul nucleic viral, care poate fi ADN, în cazul dezoxi-ribovirusurilor, sau ARN, la ribovirusuri, neavând niciodată ambii acizi nucleici. Majoritatea virusurilor animale conține genom de tip ARN.

Din punct de vedere al mărimii acidului nucleic, structurii și secvențelor de baze azotate virusurile sunt extrem de diverse.

Diferențele privitoare la dimensiunea geomului viral sunt considerabile de la o familie la alta, atât în ceea ce privește greutatea moleculară (1,5 – 150 x 106 daltoni) a numărului de nucleotide (5-231 kb), cât și cea a secvenței bazelor azotate.

Numărul de gene cuprins în genom poate fi extrem de restrâns: HIV conține 9 structuri genice, virusul gripal – 12, dar poate să ajungă până la 240 de gene. Prin urmare și numărul de proteine va fi diferit (2 – 250 proteine), în funcție de numărul și structura genelor.

Structura genomului viral se caracterizează printr-o mare diversitate, atât la virusurile ADN cât și la cele ARN.

Virusurile ADN pot prezenta următoarele structuri (Fig. 2.1):

Fig. 2.1 Structura genomului la dezox-iribovirusurile animale

monocatenare liniare – mc;

monocatenare circulare – mc;

dublu catenare liniare, cu secvențe terminale repetitive;

dublu catenare – dc, cu extermități închise covalent;

dublu catenare, circulare, închise necovalent, cu extremități monocatenare (dc- mc);

dublu catenare, circulare, închise covalent și suprarăsucite.

Ribovirusurile, sau virusurile ARN sunt, de asemenea, diverse ca structură, fiind monocatenare sau bicatenare, cu genomul într-un singur fragment sau divizat.

Astfel, genomul virusurilor ARN prezintă următoarele structuri (Fig. 2.2.):

Fig. 2.2 Structura genomului la ribovirusurile animale

monocatenare – mc liniar, într-un singur segment;

monocatenare – mc diploid, în care două molecule ARN identice sunt legate necovalent (retrovirusuri);

monocatenare – mc divizat, format din 8 molecule liniare inegale de ARN;

monocatenar – mc, cu două segmente, unul mare și altul mic;

monocatenar – mc, cu 3 structuri circulare;

dublu catenar –dc, cu 10 sau 12 segmente separate.

Genomul segmentat permite reasortarea materialului genetic între virusuri înrudite, fiind suportul material al variabilității unor virusuri (de exemplu virusul gripal).

Se poate concluziona că, în cazul virusurilor genomul conține întreaga informație genetică virală iar infectivitatea virală este atributul acidului nucleic intact conținut în particula virală. Atât ADN cât și ARN viral sunt capabili de autoreplicare în absența celorlalți constituienți virali, excepție făcând ARN viral, izolat, monocatenar de sens negativ. Celelalte procese, cum ar fi transcripția genelor și sinteza proteinelor se desfășoară cu ajutorul sistemelor enzimatice ale celulei gazdă.

2.2. ORGANIZAREA GENOMULUI LA PROCARIOTE

Celulele procariote nu prezintă nucleu adevărat, astfel că materialul genetic nu este separat de citoplasmă printr-o structură membranară.

Materialul genetic este reprezentat de cromozomul bacterian și de elementele genetice accesorii – plasmidele.

2.2.1 CROMOZOMUL BACTERIAN. ORGANIZARE MOLECULARĂ

Cromozomul bacterian nu se află amplasat într-un organit separat de restul celulei printr-o biomembrană, ci într-o regiune cu o formă neregulată, denumită nucleoid.

In cele mai multe cazuri cromozomul bacterian este reprezentat de o singură moleculă de ADN dublu catenară, circulară și super-spiralizată, alcătuită din secvențe unice de ADN.

Cel mai bine studiat până astăzi a fost cromozomul celulei bacteriene E. coli care este format din 4639 kb, cuprinzând 4377 de gene, dintre care 4290 codifică proteine, iar celelalte ARNr. Genomul a fost secventializat în totalitate, dar numai pentru o treime dintre gene a fost determinată și funcția.

Genomul procariot are astfel o dimensiune de circa 1000 de ori mai mare decât cea a genomului viral (4000 – 5000 kb față de 5 kb).

Nucleoidul este echivalentul cromatinei din celulele eucariote, fiind alcătuit din 60% ADN și în plus molecule mici de ARN si proteine. Proteinele care ajută la menținerea structurii super-spiralizate a acizilor nucleici sunt cunoscute ca proteine asociate cu nucleoidul, fiind diferite de histonele prezente în nucleul eucariot. Acestea nu stau la baza alcătuirii nucleosomilor, ci utilizeaza alte mecanisme pentru a iniția condensarea prin formarea unor bucle ADN („DNA looping”).

În E. coli, jumătate dintre gene sunt organizate în operoni, fiecare dintre aceștia codificând enzime implicate în anumite căi metabolice, sau proteine care interacționează pentru a forma o structură complexă, alcătuită din mai multe subunități.

Un operon reprezintă o unitate funcțională alcătuită dintr-o înlănțuire de gene structurale, puse sub controlul aceluiași promotor. Genele sunt transcrise împreună într-o moleculă de ARN mesager, care poate sta la baza sintezei unei singure proteine sau poate fi clivată în mai multe molecule ARNm, care fiecare codifică o anumită proteină, cu implicare într-o cale metabolică.

Având în vedere că un operon bacterian este transcris de la un punct de pornire, într-o singură moleculă de ARNm, toate genele care îl alcătuiesc sunt reglate împreună. De aceea ele sunt activate sau represate ca urmare a aceluiași factor. Transcripția operonului este controlată de interacțiunea dintre ARN polimerază și proteine specifice activatoare sau represoare.

Regiunea de reglare, în cazul unui operon procariot este alcătuită din mai multe elemente:

o secvență care leagă proteinele activatoare – situs CAP („catabolite activator protein”);

regiunea operator, care funcționează ca receptor de semnale și controlează transcripția genelor structurale;

regiunea promotor, care este adiacentă regiunii operator, fiind secvența care permite atașarea ARN polimerazei la molecula de ADN, inițiind transcripția informației genetice (Fig 2.3).

Fig. 2.3 Structura generală a unui operon din genomul bacterian

Regiunea promotor este alcătuită din două secvențe: TATAAT localizată pe catena ADN în poziția -10, în amonte de situs-ul de start pentru sinteza ARNm (+1) și TTGACA, în poziția -35.

În structura cromozomului bacterian sunt prezente secvențe de inserție – IS –elemente mobile cu lungimi de 1-2 kb, care pot fi inserate în diferite regiuni ale genomului bacterian. Sunt secvențe specifice de ADN ce includ o serie de gene structurale, care codifică una sau două enzime necesare pentru transpoziție, delimitate la extremități de regiuni alcătuite din repetiții directe sau inverse, care condiționează procesul.

2.2.2 ELEMENTELE GENETICE ACCESORII – PLASMIDELE

Plasmidele reprezintă o informație genetică accesorie, extra-cromozomială, ce favorizează existența celulei bacteriene în medii neobișnuite. Peste 300 din numărul total al plasmidelor cunoscute au fost identificate la E. coli.

O plasmidă este o moleculă mică de ADN dublu catenară, circular închisă, care are o replicare independentă. Datorită dimensiunilor reduse (1-2% din cromozomul bacterian) aceste structuri mai poartă denumirea de minicromozomi. În unele situații pot să existe și plasmide liniare, dar în cele mai multe situații sunt circulare.

Plasmidele sunt deci entități genetice care în condiții naturale se replică autonom, iar replicarea lor poate fi corelată sau nu cu cea a cromozomului. În plasmide sunt prezente cel puțin trei gene, dar numărul acestora poate să ajungă până la 100. Adesea plasmidele conțin gene care conferă rezistență la antibiotice, de exemplu rezistență la ampicilină, tetraciclină, kanamicină sau cloramfenicol.

Caracteristicile plasmidelor și anume dimensiunile reduse, capacitatea de autoreplicare și prezența genelor care conferă rezistență la antibiotice le recomandă pentru utilizarea ca vectori de clonare a moleculelor de ADN, în tehnologia ADN recombinat.

2.3. ORGANIZAREA GENOMULUI NUCLEAR LA EUCARIOTE

În celulele eucariote depozitarea informației genetice, reglarea și controlul activităților genetice sunt asigurate de structurile celulare care conțin ADN (nucleul, mitocondriile și cloroplastele).

Dar, organitul care asigură coordonarea activităților metabolice este nucleul, care conține aproximativ 99,5% din cantitatea de ADN a celulei.

Pe parcursul ciclului celular nucleul își modifică structura, în funcție de caracteristicile fiecarei etape.

2.3.1. ETAPELE CICLULUI CELULAR

Ciclul celular la o celulă tipic eucariotă prezintă patru faze succesive care însoțesc și diviziunea celulară și anume: Faza G1 – nu are loc sinteza ADN,; Faza S – sinteza ADN; Faza G2 – nu are loc sinteza ADN; și Faza M – mitoză.

Intervalul dintre sfârșitul și începutul unei noi faze M este denumit interfază, care de fapt incorporează cele trei faze menționate G1, S și G2. Acest interval (interfază) ocupă în mod normal 90% sau mai mult din totalul timpului ciclului celular (Fig. 2.4).

Faza G1 sau presintetică a fost considerată inițial ca o perioadă de gol sintetic. Ulterior s-a constatat că în G1 are loc o intensificare a transcripției și a sintezei proteinelor, procese aproape blocate în perioada mitotică. Principalele evenimente care caracterizează perioada G1 sunt desăvârșirea condensării cromatinei și reorganizarea nucleolului. Cantitatea de ADN corespunde unui cromozom monocromatidic, alcătuit dintr-o moleculă ADN dublu catenară.

Faza S sau sintetică, urmează perioadei G1. În acest timp se desfășoară replicarea ADN nuclear astfel încât la sfârșitul ei cantitatea de ADN este dublată. În acest moment cromozomii sunt bicromatidici, fiecare fiind alcătuit din două cromatide surori.

În același timp are loc și sinteza histonelor și a altor tipuri de proteine implicate în împachetarea ADN.

Deci, la inițierea sintezei ADN, celula se află în condiții de diploidie (2n), la sfârșit ajungând în condiții de tetraploidie (4n).

Faza G2 sau postsintetică separă perioada sintetică de cea mitotică. În această etapă are loc transcripția genelor și sinteza proteinelor cu aceiași intensitate ca în G1, asigurându-se condițiile necesare intrării celulei în mitoză.

Durata ciclului celular variază în funcție de tipul celular, specie și stadiul de dezvoltare. Celulele neproliferative părăsesc ciclul în G1, intrând în faza G0, în care rămân până când primesc un semnal de multiplicare.

Fig. 2.4. Procesele desfășurate în cadrul ciclului celular, urmărindu-se comportarea unui singur cromozom

Pentru cele aproximativ 1013 celule care alcătuiesc organismul uman, durata ciclului variază în limite foarte largi. Celulele epiteliale ce delimitează lumenul intestinal se divid foarte rapid (o dată sau de două ori pe parcursul a 24 de ore), în timp ce celulele musculare și neuronii își pierd complet capacitatea proliferativă după încheierea procesului de diferențiere. Cea mai mare parte a celulelor organismului uman au o durată a ciclului celular ce se încadrează între aceste extreme.

În general faza S are o durată constantă, pe când durata G1 este variabilă, în limite largi.

S-a constatat că timpul necesar parcurgerii perioadei G1 este influențat de o serie de factori extracelulari, cum ar fi elementele nutritive și factorii de creștere.

Deci, nucleul interfazic  este delimitat la exterior de un înveliș nuclear, alcătuit din două membrane concentrice, care sunt în contact din loc în loc, generând porii nucleari. Pe fața internă a învelișului nuclear se găsește o rețea fibroasa denumită lamina nucleară, care separă interiorul nucleului în care se află cromatina și nucleoplasma. Regiunile cromosomale pe care sunt amplasate genele care codifică ARN ribozomal sunt poziționate într-o anumită regiune nucleară, denumită nucleol. Nucleolul se diferențiază de restul nucleului prin densitatea ridicată, datorată unei acumulări de ARN ribozomal, proteine ribozomale și precursori ai ribozomilor.

Cromatina este alcătuită din molecula dublu catenară de ADN, care asigură atât transmiterea informației genetice cât și sinteză proteinelor. Fiecare fragment din moleculă de ADN are o secvență bine stabilită și are un anumit rol în viața celulei. În funcție de etapa ciclului celular în care se află, cromatina poate să prezinte diferite grade de condensare.

2.3.2. CLASIFICAREA CROMATINEI ÎN FUNCȚIE DE GRADUL DE CONDENSARE

Eucromatina este puțin condensată, evidențiată sub forma unor bucle alcătuite de fibra de cromatină (30 nm). Din punct de vedere morfologic este alcătuită din ADN nerepetitiv, în care predomină perechile de baze G-C și proteinele nehistonice, conținând gene structurale. Din punct de vedere funcțional reprezintă partea activă genetic, cu un grad ridicat de transcripție.

La drojdii buclele alcătuite din eucromatină sunt situate adesea în apropierea complexelor porilor nucleari, ceea ce sugerează favorizarea deplasării compușilor de transcripție spre citozol. Totuși, în celulele animale produșii de transcripție par să fie represati în apropierea suprafeței interne a învelișului nuclear.

Noțiunea de “genă” a fost introdusă prima dată în anul 1909 de către botanistul Wilhelm Johannsen și provine din limba greacă, de la cuvântul “genos”. După descoperirea ADN ca material genetic și odată cu dezvoltarea biotehnologiei și cu secvențializarea genomului uman, noțiunea de “genă” a început să se refere mai ales la înțelesul său din biologia moleculară, adică la segmentele de ADN care sunt transcrise în ARN și apoi traduse cel puțin parțial în proteine (Fig. 2.5).

Fig. 2.5. Structura unei gene eucariote

Heterocromatina este porțiunea foarte condensată, cu replicare tardivă în faza de sinteză (S) a ciclului celular. Din punct de vedere morfologic conține mai mult ADN repetitiv, în care predomină perechile de baze A-T și histonele. Din punct de vedere funcțional reprezintă partea inactivă genetic, fiind implicată în procesul de stabilizare a centromerului și telomerilor. La nivelul heterocromatinei rata recombinarilor este redusă.

În celulele eucariote au fost evidențiate două tipuri de heterocromatina: constitutivă și facultativă.

Heterocromatina constitutivă este o cromatină constant condensată în interfază. Ea este genetic inactivă, nu conține gene structurale și pe ea nu se face niciodată transcripție. Heterocromatina constitutivă conține așa-numitul ADN repetitiv sau satelit, reprezentat de secvențe scurte, repetate de un număr mare de ori.

Heterocromatina facultativa este o cromatină condensată temporar. Conține gene structurale care într-un anumit tip de celule sau într-un anumit stadiu de dezvoltare sunt represate, dar se pot transforma în anumite momente în eucromatină.

      Clasificarea menționată – eucromatina și heterocromatina s-a realizat în urma experimentelor de bandare și examinare la microscop. Dezvoltarea fără precedent a tehnicilor moderne de biologie moleculară, cum ar fi amplificarea ADN, hibridizare cu sonde moleculare sau chiar secvențializarea a permis clasificarea secvențelor ADN după structura lor și numărul de repetiții în care apar în genom.

Din punctul de vedere al numărului de repetiții în genomul celulelor eucariote există mai multe tipuri de secvențe ADN și anume: ADN nerepetitiv, ADN moderat repetitiv și ADN înalt repetitiv.

2.3.3. CLASIFICAREA CROMATINEI ÎN FUNCȚIE DE NUMĂRUL DE REPETIȚII

Analiza secvențelor ADN care intra în alcătuirea cromatinei a condus la clasificarea acestora în două categorii principale: gene unice sau duplicate și gene cu copii multiple.

2.3.3.1. GENE UNICE SAU DUPLICATE. STRUCTURĂ ȘI FUNCȚII

Genele care codifică proteine pot avea o singură copie sau pot să aparțină unor familii de gene. În organismele multicelulare numai 25-50% dintre genele care codifică proteine se găsesc într-o singură copie în genomul haploid.

O a doua categorie de gene sunt genele duplicate, cu secvențe foarte asemănătoare, dar nu identice, care se află la distanțe de 5 -50 kb una față de cealaltă. Un set de gene duplicate care codifică proteine similare, dar cu secvențe diferite de aminoacizi alcătuiesc o familie de gene, iar proteinele corespunzătoare alcătuiesc o familie de proteine. Unele familii de gene pot să conțină până la câteva sute de membri, dar cele mai comune cuprind până la 30 de tipuri. Exemple de familii de gene sunt cele care codifică proteinele citoscheletului.

Dimensiunile medii ale unei gene dintr-un organism eucariot variază mult, de la mai puțin 1 kb (genele care codifică histone), până la 2300kb în cazul unei gene care codifică o proteină neuronală sau 2200kb în cazul genei care codifică distrofina la om. Dimensiunea medie a genelor din organismele vertebrate este de 30kb, iar în organismul uman 20-50kb, spre deosebire de bacterii care au gene cu dimensiuni mult mai mici, deoarece conțin numai material codant.

Toate genele sunt alcătuite dintr-o regiune centrală și regiuni laterale sau secvente de reglare.

A. REGIUNEA CENTRALĂ SAU CODANTĂ A UNEI GENE

Regiunea centrală poartă numele de „cadru de lectură” sau ORF („open reading frame”).

Regiunea centrală a genei este transcrisă integral în ARN mesager precursor prin acțiunea ARN polimerazei II. Această regiune este alcătuită din succesiunea a două tipuri distincte de secvențe: exoni și introni, prezente sau nu în versiunea finală a ARNm matur, ce va părăsi nucleul. Pentru descoperirea structurii mozaic a genelor eucariote Richard Roberts și Philip Sharp au primit premiul Nobel în anul 1993.

Regiunea centrală a genei începe cu situsul de inițiere al transcrierii, după care urmează o regiune necodantă (transcrisă dar netradusă) cu o lungime de câteva sute de nucleotide denumită 5’UTR („untranslated region”). Această regiune conține la finalul ei codonul START– AUG, care marchează locul de începere a translației, corespunzând primului aminoacid al lanțului polipeptidic.

După codonul de inițiere a translației se succed exonii și intronii care alcătuiesc gena.

Exonii sunt secvențe transcrise în ARN mesager precursor și regăsite în molecula ARNm după maturare, fiind secvențe ce se exprimă și părăsesc nucleul. Exonii reprezintă regiunile funcționale din structura genei, care de obicei codifică anumite părți structurale și/sau funcționale distincte ale proteinei, numite domenii. Numărul exonilor variază de la o genă la alta (între 2 și mai mult de 50) precum și la diferite organisme.

Intronii sunt secvențe necodante, transcrise inițial în ARNm precursor dar secționate și eliminate ulterior din ARNm matur, ce va fi alcătuit prin asamblarea exonilor. Numărul intronilor este cu unul mai mic decât cel al exonilor iar lungimea lor este variabilă, neconcordantă cu cea a exonilor, de obicei mult mai mare. Important de precizat este faptul că aproape toți intronii încep întotdeauna cu dinucleotidele 5' GT și sfârșesc cu AG 3'. Aceste perechi de nucleotide au rolul unor semnale pentru secționarea precisă și corectă a intronilor. Rolul intronilor nu este încă bine  cunoscut, dar se știe că numărul și mărimea lor variază la diferite gene, fiind cel mai adesea mult mai mari în dimensiuni decât exonii pe care îi separă.

După ultimul exon din regiunea centrală transcrisă a genei există o secvență 3' UTR („untranslated region”), necodantă, transcrisă dar netradusa, care începe cu unul dintre codonii stop (TAA, TAG, TGA), responsabili cu oprirea translației sau sintezei proteinei.

La capătul 3’ al secvenței 3'UTR se găsește un oligonucleotid având succesiunea bazelor azotate AATAAA, care are rol în stoparea transcrierii și totodată în poliadenilarea moleculei ARNm. Astfel, la 15-30 nucleotide în aval de acest situs se produce desprinderea moleculei de ARN sintetizate de pe catena matriță a ADN și tot în acest punct reprezintă semnalul pentru procesul de poliadenilare (Fig. 2.6).

B. REGIUNILE LATERALE SAU SECVENȚELE DE REGLARE ALE UNEI GENE

Regiunea centrală a oricărei gene este flancată de două regiuni laterale, netranscrise, care au rolul de a semnaliza inițierea transcripției de către ARN polimerază și de a regla intensitatea ei; mutațiile apărute în aceste regiuni nu modifică structura de aminoacizi a proteinei codificate de genă ci numai nivelul ei de expresie (rata sintezei).

B.1. Regiunea laterală 5' este amplasată în amonte de regiunea centrală a genei, reprezentând locul unde se fixează ARN polimeraza pentru inițierea transcripției. Această regiune poartă numele de promotor și conține mai multe elemente (cis-activatoare) cu o secvență nucleotidică scurtă și precis definită. Pe aceste secvențe se fixează niște proteine reglatoare (trans-activatoare) denumite factori de transcripție care au rolul de a regla transcripția.

Promotorul eucariotelor superioare este divizat la rândul lui în regiuni care au structură și funcții diferite:

Elementele de bază ale promotorului sunt alcătuite din casetele „TATA box”, „CCAAT box” și regiunea promotor distală.

TATA box  (secvența TATAAA situată la circa 20-30 bp în amonte de situsul de inițiere al transcrierii este locul la care ARN polimeraza II se fixează la ADN prin intermediul factorilor de transcripție. La genele comune (“housekeeping genes”) – funcționale  în toate țesuturile, secvența TATA este înlocuită de secvența GC (sau insule CpG) datorită concentrației mari de dinucleotide 5’- CG- 3’. Procesul de formare a complexului transcripțional se va prezenta în capitolul 3.1.2.

CAAT box  (secvența GGT/CCAATCT) este situată în amonte de caseta TATA (la circa 50 -130 bp de situsul de inițiere a transcrierii) și fixează alți factori de transcripție cum ar fi C/EBP (CCAAT-box/Enhancer Binding Protein).

Regiunea promotor distală  conține o serie de elemente care determină expresia  specifică a anumitor gene fie într-un anumit tip celular fie la un anumit stadiu de dezvoltare ontogenetică. De exemplu, secvențele specifice unui tip de țesut sunt recunoscute de factori de transcripție specifici, inițiind expresia genei.

Elemente de răspuns (RE) care modulează transcripția unor gene în funcție de anumite semnale extracelulare ("expresie genică indusă"). Aceste semnale pot fi stimuli externi (molecule nutritive, concentrația unor ioni, temperatură, șoc) sau semnale de comunicare de la alte celule (hormoni, morfogeni) – care activează anumiți factori de transcripție ce se fixează pe elementele de răspuns ale anumitor gene și determină transcripția lor temporară.

Activatorii ("enhancers") sunt elemente de reglare pozitivă care măresc nivelul bazal al transcripției, inițiată de promotor. Funcția lor nu depinde de localizare (pot fi plasați și în regiunea 3’) sau orientare, fiind determinată de mai ales de fixarea unor factori de transcripție specifici anumitor țesuturi (stimulează activitatea unor gene specifice, de ex. cele pentru imunoglobuline).

Inhibitorii ("silencers") reduc nivelul transcripției și uneori represează funcția unor gene.

Acțiunea activatorilor și inhibitorilor este limitată la o anumită genă de către niște secvențe "izolatoare" ("insulators") care blochează răspândirea efectului unor “agenți” ce intensifică sau atenuează transcripția.

B.2. Regiunea laterală 3'

            Orice genă se termină în regiunea 3' cu o secvență netranscrisă, care flanchează "cadrul de lectură a genei" sau zona ei centrală. Această secvență nu este întru-totul cunoscută, dar existența ei certă îi conferă teoretic un rol structural sau funcțional. În această regiune se găsesc secvențe semnal care afectează procesarea, stabilitatea și durata de viață a ARNm. Se mai știe că la unele gene (ex. gena beta-globinei) în această regiune 3' a genei se pot găsi secvențe reglatoare de tip activator („enhancer”) (Fig. 2.7).

Fig. 2.7. Dispunerea secvențelor care alcătuiesc regiunile  laterale  sau  secvențele   de reglare  a  genei ale unei gene eucariote

2.3.3.2. GENE CU COPII MULTIPLE. STRUCTURA ȘI FUNCȚII

În cazul în care molecula ARN transcrisă este direct funcțională (ARNr, ARNt sau snARN), sau proteina codificată este necesară în cantități foarte mari în celulă este necesară prezența unui număr mare de gene identice sau gene cu copii multiple.

S-a demonstrat că o genă unică poate fi matriță pentru sinteza a 104 molecule ARNm, iar fiecare moleculă ARNm poate fi matriță pentru sinteza a 105 proteine. Deci o singură genă stă la baza sintezei a 109 molecule de proteine.

Atât la vertebrate cât și la nevertebrate, genele care codifică ARN ribozomal și alte tipuri de ARN, cum ar fi cel implicat în procesul de splicing ARN apar sub forma unor structuri repetate în tandem. Acestea se diferențiază de genele duplicate care alcătuiesc familiile de gene deoarece codifică proteine sau molecule de ARN funcțional identice.

A. GENELE RIBOSOMALE

Genele ribosomale, care codifică ARNr sunt transcrise cu ajutorul ARN polimerazei I. Se găsesc dispuse în unități repetate în tandem localizate în regiunile denumite "organizatori nucleolari", care formează nucleolii în nucleul interfazic (~ 300 copii în genomul uman). Aceste regiuni codifică trei subunități ribosomale 18 S, 5,8 S și 28 S. Cea de-a patra subunitate ARNr 5S este codificată de gene situate într-o altă regiune a nucleului. Deși porțiunile transcrise ale genelor ARNr sunt aceleași la fiecare individ, regiunile interne transcrise pot să difere (Fig. 2.8).

Fig. 2.8. Dispunerea secvențelor care alcătuiesc unitațile repetitive care codifică ARN ribosomal

NTS – regiuni netranscrise

ITS – regiuni interne transcrise

ETS – regiuni externe transcrise

Genele ribosomale sunt prezente în copii multiple în genom deoarece în cazul ARN implicat în biogeneza ribosomilor procesul amplificării în cursul translației nu este posibil – aceste molecule de ARN sunt produsul final al transcrierii genelor.

În fiecare celulă și cu precădere în cele active din punct de vedere metabolic, sinteza proteinelor este accentuată, necesitând un număr mare de ribozomi. Prin urmare sunt necesare cantități mari de ARN ribosomal, care să stea la baza formării subunităților ribozomale.

B. ADN MODERAT REPETITIV

Unele dintre secvențele ADN moderat repetiv codifică anumite proteine, sau ARN, iar altele reprezintă secvențe necodante, ale căror funcții sunt mai puțin cunoscute.

Genele pentru ARNt (~ 500 copii în genomul uman) și alte molecule mici de ARN sunt transcrise cu ajutorul ARN polimarezei III. Se gasesc dispuse în grupe de gene repetate în tandem fiind localizate pe diferiți cromozomi.

Genele care codifică moleculele ARN de dimensiuni reduse, implicate în procesul de eliminare a intronilor se găsesc într-un număr de

~ 500 copii în genomul uman.

Genele care codifică histone sunt prezente în număr variabil, în funcție de organism; astfel, la drojdii există doar două copii pentru fiecare tip de histone, la alte specii, de exemplu ariciul de mare se ajunge la un număr de 300-1000 de copii. Caracteristic pentru genele histonice este absența intronilor și a secvențelor terminale poly(A). S-a emis ipoteza că absența acestor structuri ar facilita sinteza și transportul foarte rapid prin citosol al histonelor.

Un procent foarte mare din ADN genomic este alcătuit din gene sau secvențe ADN necodante. Astfel se evidențiază ADN satelit, care are un rol structural și se gaseste în anumite regiuni cromozomiale cum ar fi centromerul, telomerul sau constricțiile secundare, alcătuind heterocromatina constitutivă. Se diferențiază două tipuri de ADN satelit și anume:

minisateliții hipervariabili (sau VNTR de la "variable number of tandem repeats"), alcătuiți din secvente scurte 10-100 bp, repetate în tandem de 20-50 de ori, dispersate în toți cromozomii, ocupând anumite regiuni precise, relativ scurte (1-5 kb);

microsateliții, secvențe de 1-13 bp (de cele mai multe 2, 3 sau 4 bp), repetate de 10 -100 de ori. Sunt formați cel mai adesea din repetiția unui dinucleotid, dar pot fi și secvențe tri sau tetranucleotidice, cu o structură variabilă, avand o distribuție uniformă în genom. Secvența CA este foarte frecventa în genomul uman și se găsește la fiecare mie de perechi de baze.

Secventele de mini și micro sateliți pot fi utilizate ca markeri genetici, deoarece sunt specifice fiecarui individ în parte. Se cunoaște că fiecare regiune alcătuită din secvențe scurte repetate se diferențiază din punctul de vedere al numarului de unități repetitive și totodată datorită secvențelor care mărginesc regiunea repetitivă. Pe baza acestor secvențe s-au dezvoltat tehnicile de amprentare, cu utilizare în cartarea genomurilor, analiza cromozomala, evaluarea variabilitații, identificarea speciilor sau a indivizilor și diagnostiul molecular. Se consideră că probabilitatea de a găsi doi indivizi identici, neîrudiți având același profil la nivelor

O altă categorie de secvențe repetate sunt IRS "interspersed repeated sequences"), alcătuite dintr-un număr mare de copii, răspândite în întregul genom. Acestea sunt cunoscute și sub numele de secvențe ADN moderat repetate și formează 25 – 50% din genom la mamifere și 45% la om.

Deoarece aceste secvențe au proprietatea unică de a se deplasa în genom, ele sunt denumite elemente transpozabile mobile, sau transpozoni. Procesul prin care aceste secvențe sunt copiate și inserate într-o nouă poziție în genom poartă numele de transpoziție.

Dacă transpoziția apare în celulele germinale, secvențele transferate în noile poziții sunt transferate generațiilor următoare. Astfel, elementele mobile s-au multiplicat și acumulat în genomul eucariot de-a lungul evoluției, constituind acum o parte semnificativă din genomul multor eucariote. Transpozonii nu sunt numai o sursă pentru creșterea cantității de ADN din genom, dar constituie un al doilea mecanism care, pe lângă recombinarea meiotică a produs o restructurare a materialului genetic de-a lungul evoluției.

Au fost evidențiate două clase de transpozoni, în funcție de mecanismul de inserare a secvențelor ADN.

Clasa I – Retrotranspozoni, sau transpozoni ARN, care acționează prin copierea unor fragmente ADN și inserția lor înapoi în genom, în poziții multiple (sistemul “copy – paste”). Prima dată are loc copierea secvențelor retrotranspozonilor în ARN, prin transcripție, după care are loc un proces de revers-transcripție prin care molecula de ARN este copiată în ADN, care este inserat înapoi în genom. Retrotranspozonii se comportă similar cu retrovirusurile, conducând la ipoteza posibilei origini evolutive a acestora. Au fost caracterizate trei categorii diferite de retrotranspozoni și anume:

Retrotranspozonii virali, care codifică revers-transcriptaza și au secvențe terminale repetitive cu lungime mare, denumite LTR (“long terminal repeats”).

Retrotranspozonii non-virali, care codifică revers-transcriptaza, dar nu posedă secvențe terminale repetitive cu lungime mare (LTR), se împart la rândul lor în două categorii:

Secvențele LINE ("long interspersed repeated sequences") cu lungimea de 6 kb, prezente în circa 900.000 copii, dispersate în genom; Secvențele LINE sunt probabil implicate în împerecherea corectă a cromozomilor omologi în meioză, ceea ce asigură desfășurarea optimă a mitozei.

Secvențele SINE ("short interspersed repeated sequences") sunt secvențe scurte de 100 – 400 bp, prezente în circa 500.000 de copii (13% din genomul uman), dispersate în cromozomi în 1,6 milioane de situsuri; dintre acestea 1,1 milioane sunt reprezentate de elementele Alu, denumite astfel deoarece conțin un singur situs de recunoaștere pentru enzima de restricție Alu I. Funcția lor nu este cunoscută, considerându-se că au o implicare în inițierea replicării în anumite puncte din genom.

Pseudogene, care provin din molecule ARNm maturate (au suferit procesele de eliminare a intronilor și poliadenilare). Aceste molecule sunt supuse unui proces de revers-transcripție, după care fragmentul ADN nou sintetizat este inserat înapoi în genom.

Clasa II – Transpozoni ADN, care se diferențiază de cei din clasa I prin mecanismul lor de transpoziție, care nu necesită un intermediar ARN. Astfel, transpozonii din clasa II se deplasează printr-un mecanism tăiere-inserare (“cut and paste”), cu ajutorul unei enzime specifice – transpozaza.

Mecanismele de transpoziție ale diferitelor tipuri de transpozoni sunt descrise amplu în capitolul 3.1.3.2.

2.4. GENOMUL  MITOCONDRIAL

Mitocondriile au dimensiuni destul de mari, astfel că pot fi vizualizate la microscopul optic, iar ADN mitocondrial (ADNmt) poate fi detectat prin microscopie în fluorescență.

Studiile comparative au evidențiat un număr diferit de molecule ADNmt, cu dimensiuni variabile, în mitocondriile diferitelor specii.

De cele mai multe ori genomul mitocondrial al celulelor animale este definit printr-un singur tip de ADN circular, bicatenar format din ~16kb, caracterizat printr-o mare densitate de gene, alcătuite numai din exoni, amplasate pe ambele catene (Fig. 2.9).

La organismele animale ADNmt codifică cele două tipuri de ARNr, care intră în alcătuirea ribozomilor mitocondriali, 22 molecule de ARNt, implicate în procesul de sinteză a proteinelor și 13 proteine implicate în lanțul de transport al electronilor și sinteza ATP.

Fig. 2.9 Structura genomului mitocondrial al unei celule animale

Proteinele sintetizate în mitocondriile celulelor animale sunt identificate ca fiind subunități ale unor complexe multimerice necesare în transportul electronilor, sinteza ATP și inserția proteinelor în membrana mitocondrială internă sau în spațiul intermembranar și sunt sintetizate cu ajutorul ribozomilor mitocondriali. Codul genetic utilizat la sinteza acestor proteine este diferit de cel standard și poate să difere chiar între specii.

Totuși, marea majoritate a proteinelor implicate în procesul de respirație celulară sunt codificate de ADN nuclear, sintetizate în citosol și importate în mitocondrii prin procese specializate de transport, care vor fi discutate în capitolele următoare.

O caracteristică a genomului mitocondrial vegetal este dimensiunea și complexitatea. Astfel, în cazul plantei model Arabidopsis thaliana, ADNmt are dimensiuni de 367 kb, iar ADN mitocondrial cu cele mai mari dimensiuni a fost identificat la plante din familia cucurbitaceelor, cu o lungime de aproximativ 2 Mb.

În cazul celulelor vegetale s-au evidențiat diferențe majore față de cele animale, deoarece marea majoritate a ADNmt nu codifică proteine. ADNmt vegetal este alcătuit din introni, pseudogene, elemente de ADN mobil, care nu părăsesc mitocondria și fragmente de ADN străin, provenit de la cloroplaste, ADN nuclear sau viral. Se consideră că aceste fragmente au fost inserate în genomul mitocondrial de-a lungul evoluției. Secvențele duplicate contribuie de asemenea la dimensiunile mari ale ADNmt vegetal.

În mitocondriile celulei vegetale este sintetizat un număr redus de proteine (15-20). Acestea sunt subunități componente ale lanțului de transfer al electronilor, sau parte a complexului ATPazic. Restul proteinelor necesare pentru desfășurarea procesului de respirație celulară sunt sintetizate în citozol și importate în mitocondrii.

O altă caracteristică importantă a moleculelor ADNmt vegetal este aceea că nu conțin un set complet de gene care codifică ARNt, dar conțin un număr de aproximativ 16 gene ARNt, specifice pentru 12-16 aminoacizi. Restul de molecule de ARNt (până la totalul de 20) sunt importate din citozol.

Spre deosebire de celulele animale, în cazul celor vegetale codul genetic utilizat la sinteza proteinelor în mitocondrii este identic cu cel standard.

Trebuie subliniat că atât în cazul celulelor animale cât și vegetale genomul mitocondrial al zigotului provine exclusiv de la ovul, deci de la mamă. Se poate spune că genele mitocondriale au o transmitere exclusivă pe cale maternă.

2.5. GENOMUL CLOROPLASTIC

Cloroplastele, de altfel ca toate plastidele au evoluat dintr-o bacterie endosimbiotică fotosintetizatoare ancestrală. Acest eveniment simbiotic care a condus la apariția cloroplastelor a avut loc mai recent (1,2-1,5 miliarde de ani), comparativ cu cel care a condus la apariția mitocondriilor (1,5 – 2,2 miliarde de ani). De aceea, în prezent ADNcp prezintă o diversitate mai redusă comparativ cu mitocondriile.

Cloroplastele pot fi întâlnite la toate celulele vegetale, reponsabile cu fotosinteza, astfel că într-o celulă tipică parenchimatică se găsesc în jur de 10-100 cloroplaste.

Similar cu mitocondriile, cloroplastele conțin copii multiple de ale genomului cloroplastic (ADNcp) și ribozomi, care stau la baza sintezei unui număr redus de proteine, pe baza codului genetic standard.

La plantele superioare ADNcp are o lungime de 120-160 bp lungime, în funcție de specie. Inițial s-a considerat că are o structură circulară, pentru că în organismul model Chlamydomonas reinhardtii harta genetică este circulară.

Totuși, studii recente au arătat ca ADNcp este de fapt alcătuit din concatemeri liniari cu lungime mare, legați “cap-coadă”, care suferă o serie de recombinări și care conduc la niște structuri aparent circulare, în urma adoptării unor conformații specifice (Fig. 2.10).

Studiile asupra ADN cloroplastic au avansat, astfel că în prezent a fost deja determinată secvența completă a câtorva ADNcp din plantele superioare.

Numărul mediu de gene se încadrează în intervalul 120 – 135. Astfel, cloroplastele plantei model Arabidopsis thaliana au un genom care cuprinde 76 de gene codante pentru proteine și 54 de gene care sintetizează ARNr și ARNt.

Totodată ADNcp codifică subunitățile unei ARN polimeraze asemănătoare cu cea bacteriană, iar multe gene sunt alcătuite din operoni, la fel ca în cazul bacteriilor. Unele gene cloroplastice conțin introni, dar aceștia sunt mai asemănători cu intronii specializați găsiți în unele gene bacteriene și în genele mitocondriale ale unor fungi și protozoare, decât cu cei nucleari.

Marea majoritate a proteinelor implicate în procesul de fotosinteză sunt codificate de ADN nuclear, sintetizate în citozol și importate în cloroplastele prin procese specializate de transport, care vor fi discutate în capitolele următoare.

La fel ca în cazul mitocondriilor, genomul cloroplastic provine exclusiv de la ovul, deci transmiterea genelor cloroplastice are o ereditate maternală.

Fig. 2.10. Structura ADN cloroplastic și procesul de replicare ADN, dependent de recombinare

(A) Capătul unui genom monomeric se recombină cu o altă moleculă și inițiază replicarea. Dacă se urmează calea (1) este generat un produs concatemeric “cap-coadă”. Are loc apoi secționarea cu o enzimă de restricție în două poziții (situsurile sunt marcate cu ), rezultând genomul cloroplastic; Dacă are loc o recombinare alternativa, din sens opus, este urmată calea (2), rezultând un produs concatemeric “cap-coadă” cu un segment inversat. Gemomul format în cel de-al doilea caz are o lungime mai mare comparativ cu prima variantă.

(B) O structură multigenomică produsă prin replicare dependentă de recombinare.

(C) Forme circulare ale genomului, produse prin recombinare moleculară („flipping”).

Structura ADNcp, menționată anterior subliniază înaltul grad de polimorfism, care a permis dezvoltarea unei game largi de markeri moleculari. Este posibilă astfel caracterizarea genetică a unor populații, evaluarea diversității, stabilirea gradului de înrudire și totodată analize filogenetice.

CAPITOLUL III

MECANISMELE MOLECULARE

ALE SINTEZEI ȘI PRELUCRĂRII PROTEINELOR

În celulele animale sinteza proteinelor are loc în două compartimente subcelulare, citoplasma și mitocondriile. În mitocondrii sunt codificate un număr de 10-12 proteine, dar marea majoritate a proteinelor necesare în aceste compartimente sunt sintetizate în citozol și importate în mitocondrii prin procese specializate de transport. Codul genetic care coordonează sinteza proteinelor în mitocondrii este diferit de cel standard.

În plante, sinteza proteinelor are loc în trei compartimente subcelulare. Citoplasma, plastidele și mitocondriile conțin sisteme diferite de sinteză a proteinelor. Aproximativ 75% dintre proteinele celulare sunt sintetizate în citoplasmă, unde ARNm este tradus. Într-o celulă activă din punct de vedere fotosintetic (de exemplu celule mezofilice tinere), aproximativ 20% dintre proteine sunt sintetizate în cloroplaste, prin translația ARNm transcris după genomul cloroplastic. O proporție mai mică de proteine (2-5%) sunt sintetizate în mitocondrii, fiind codificate de gene din genomul mitocondrial. În celulele vegetale este respectat codul genetic standard, în toate cele trei compartimente în care au loc sinteze proteice.

În general, mecanismul sintezei proteice este considerat un proces de traducere, translație a celor patru litere (A, T, G, C) ale alfabetului acizilor nucleici în alfabetul complet diferit al proteinelor.

Din punct de vedere teoretic secvența de aminoacizi dintr-o proteină reprezintă un analog al secvenței nucleotidice dintr-un anumit fragment de ADN, între aceste două macromolecule existând o colinearitate.

Acest proces de traducere sau translație necesită interacțiunea unui număr mai mare de 100 de macromolecule (ARNm, ARNt, enzime activatoare, factori proteici, ribozomi). Fiecărui aminoacid îi corespunde cel puțin o enzimă activatoare și cel puțin o moleculă de ARNt.

Sinteza proteică atât la procariote cât și la eucariote are loc în două etape și anume:

transcripția sau transcripția (transportul informației de la nivelul ADN-ului la ARNm);

translația sau traducerea informației ajunse la nivelul ribozomilor în secvențe specifice de aminoacizi din lanțul peptidic, care se sintetizează la nivelul respectivilor ribozomi.

În cazul celulelor procariote, atât transcripția cât și translația au loc în citoplasmă, iar în cazul celulelor eucariote procesele sunt separate în spațiu, astfel că transcripția – sinteza ARN se desfășoară în nucleu, iar translația, sau sinteza proteinelor are loc în citoplasmă (Fig. 3.1).

Fig. 3.1. Desfășurarea proceselor de transcripție și translație în celula procariotă, respectiv eucariotă

În ultima perioadă s-a demonstrat că sinteză proteinelor nu se finalizează o dată cu translația. După eliberarea lanțului polipeptidic sintetizat la nivelul ribozomilor, pentru a deveni activă, o proteină trebuie să fie supusă unor modificări post-translaționale de ordin chimic și conformațional, în urma cărora devine stabilă și funcțională. Apoi proteinele sunt orientate spre un organit țintă cu ajutorul unor secvențe de localizare. La destinație, secvențele care au avut rolul de a orienta deplasarea proteinei în celulă sunt eliminate, rezultând proteina, în forma funcțională finală (Fig. 3.2).

Fig. 3.2. Procesele care au loc de-a lungul transferului de informație, de la genă la proteina funcțional activă

3.1 MECANISMELE MOLECULARE ALE TRANSCRIERII GENETICE

Transcripția genetică este un fenomen complex, prin care se asigură transferul informației genetice de la ADN, care servește ca matriță pentru sinteza ARN. Toate tipurile de ARN sunt codificate la nivel de ADN, dar numai ARNm este capabil să transmită mai departe mesajul genetic la proteine.

Transcripția este mediată de ARN-polimerază, o enzimă care are capacitatea de a recunoaște secvențe specifice din molecula de ADN si de a iniția sinteza unei molecule ARN, pe baza complementarității bazelor azotate.

Spre deosebire de ADN-polimerază, ARN-polimeraza poate realiza sinteza de novo, fără a necesita un primer, ci numai molecula ADN matriță, pe care urmează să o copieze.

În celulele procariote se găsește cel mai adesea o singură ARN-polimerază, iar în celulele eucariote au fost caracterizate trei tipuri de ARN polimeraze, care sunt localizate în anumite regiuni ale nucleului, în funcție de produșii finali de sinteză.

În cadrul procesului de transcripție ARN-polimeraza recunoaște o secvență specifică de nucleotide dintr-o catenă de ADN, denumită promotor, la care se atașează; apoi, cele doua catene ale ADN se separa printr-un proces de denaturare fiziologica si incepe sinteza unei molecule ARN, în secvența căreia sunt prezente ribonucleotide ce stabilesc legături de hidrogen cu ADN, pe baza complementarității dintre bazele azotate. Se formează astfel un hibrid ADN-ARN temporar între ADN matriță și catena nou sintetizată de ARN. Aceasta catena ARN este sintetizata intotdeauna in directia 5’→3’, descifrand catena ADN pe care o copiaza in directia 3’→ 5’ (Fig. 3.3.). Astfel, la gruparea OH de la capatul 3’ al catenei ARN in formare sunt adaugati ribonucleozid-trifosfați, printr-o reactie de esterificare in urma careia se elibereaza grupări pirofosfat.

Transcripția realizată de ARN-polimerază este un proces similar cu replicarea, prezentand etapele de inițiere, elongare și terminare.

Fig. 3.3. Desfășurarea procesului de transcripție a genelor, în prezența ARN-polimerazei

Teoretic există posibilitatea ca oricare dintre cele două lanțuri ADN care alcătuiesc o genă să fie copiat în câte o moleculă de ARN. Deci, pentru o genă ar exista două lanțuri de ARN complementare, care ar codifica două proteine diferite. De fapt numai unul dintre cele două lanțuri ale genei este transcris, deci o genă codifică o singură proteină, promotorul având un rol determinant în acest proces.

3.1.1. MECANISMUL REACȚIEI DE TRANSCRIPȚIE ÎN CELULELE PROCARIOTE

În cazul celulelor procariote materialul genetic este organizat sub forma operonilor, care sunt alcătuiți din mai multe gene reglate împreună. Pentru transcripție există o singură ARN-polimerază care este responsabilă pentru sinteza tuturor celor trei specii de ARN (ARNr, ARNm și ARNt).

Cea mai cunoscută ARN-polimerază, care a stat la baza celor mai complexe studii a fost enzima extrasă și purificată din celulele bacteriene E. coli.

Aceasta are o masă moleculară de 49.000 Da și conține patru subunități diferite α2, β, β’, σ, care alcătuiesc două structuri de bază:

– subunitățile α2 β β’ formează structura centrală, corpul sau miezul enzimei, care este implicat în sinteza ARN, dar nu poate iniția reacția;

– subunitatea σ constituie structura implicată în legarea enzimei la promotor.

În condiții intracelulare normale, molecula de ARN-polimerază recunoaște și se leagă de situsurile de ințiere specifice – promotorii și transcrie numai una dintre catenele ADN dublu catenare.

Regiunea promotor la procariote este alcătuită din două secvente: TATAAT localizată pe catena ADN în poziția -10, în amonte de situs-ul de start pentru sinteza ARNm (+1) și TTGACA, în poziția -35. Componența regiunii de reglare a genelor în celulele procariote a fost descrisă detaliat în cadrul capitolului 2.2.1.

Legarea ARN-polimerazei la un anumit promotor este determinată de interacțiunea cu proteine de reglare, care afectează abilitatea ei de a recunoaște situsurile start. Aceste proteine de reglare pot să acționeze atât ca activatori cât și ca represori, accesul ARN-polimerazei la regiunea promotor fiind în multe cazuri reglată de interacțiunea lor cu regiunea denumită operator.

Sunt urmate apoi etapele specifice procesului de transcripție:

Subunitatea σ se asociază cu corpul enzimei, având rolul de a menține enzima într-o conformație aptă pentru a se lega la situsul de ințiere de pe ADN matriță (la nivelul promotorului).

Legarea ARN-polimerazei este urmată de separarea celor două catene ADN și schimbarea conformațională a enzimei. Apoi, primul nucleozid 5’-trifosfatat (cel de inițiere), care este întotdeauna ATP sau GTP se leagă la ARN-polimerază pentru a forma complexul de inițiere.

Legarea celui de-al doilea nucleozid 5’- trifosfatat, de obicei UTP sau CTP determină formarea primei legături internucleotidice. Prin atacul nucleofil al grupării 3’ – hidroxil al nucleozid- 5’- trifosfatului purinic de inițiere asupra atomului de fosfor α din cel de-al doilea nucleozid-trifosfat se formează prima legătură fosfodiesterică, eliberându-se pirofosfatul anorganic.

Se observă că nucleozid – trifosfatul purinic de inițiere își menține, după atașarea nucleotidului secundar și a resturilor nucleotidice succesive, gruparea 5’– trifosfat. Această grupare permite astfel recunoașterea capătului 5’-terminus al moleculei ARN.

Creșterea și sinteza catenelor de ARN.

O dată unite cele două resturi nucleotidice, creșterea catenei are loc rapid, transcripția făcându-se în direcția 5’-3’, antiparalelă direcției 3’-5’ din catena de ADN matriță. În cursul creșterii, un segment de ARN nou sintetizat formează un duplex hibrid ARN-ADN complementar, de tranziție, mult mai puțin stabil decât duplexurile ADN-ADN. De aceea catena de ARN are tendința de a se separa de ADN la bifurcația de transcripție.

După atașarea a 8-9 nucleotide factorul σ disociază de restul ARN-polimerazei, formând enzima activă care continuă replicarea ADN matriță. Factorul σ devine astfel disponibil pentru inițierea unei noi catene de ARN, cu o altă parte centrală a enzimei.

Creșterea catenei continuă de-a lungul matriței ADN până când molecula de ARN-polimerază primește semnalul stop pentru terminarea transcrierii. Semnalele stop specifice sunt necesare, deoarece altfel ARN ar fi sintetizat la infinit.

Maturarea sau prelucrarea lanțului ARN are loc în funcție de tipul celulei în care a avut loc transcripția și totodată de tipul de ARN transcris.

Deci, ARN-polimeraza atașează la capetele 3’–hidroxil ale catenei ARN, unități mononucleotidice, sintetizând ARN în direcția 5’-3’, antiparalelă catenei ADN folosită ca matriță. Ca în cazul ADN polimerazei, hidroliza enzimatică a pirofosfatului face ca reacția să decurgă în celulă în sensul sintezei ARN (Fig. 3.4).

Molecula ARN nou formată are o compoziție bazică complementară celei din catena matriță.

Fig. 3.4. Mecanismul molecular al reacției de transcripție

3.1.2. MECANISMUL MOLECULAR AL REACȚIEI DE TRANSCRIPȚIE ÎN CELULELE EUCARIOTE

Mecanismul de sinteză a unei noi molecule ARN, avînd ca matriță ADN este identic în celulele eucariote cu cel al procariotelor. La eucariote însă aparatul de transcripție este mult mai complex și mai puțin cunoscut decât la procariote. Într-o celulă eucariotă există trei tipuri de ARN-polimeraze nucleare. Ele ocupă poziții distincte în spațiul nuclear și fiecare tip de enzimă prezintă o structură complexă (Tabel 3.1 )

Tabelul 3.1 Caracterizarea și localizarea ARN-polimerazelor nucleare

U1, U2, U3, U4, U5, U6 – molecule de ARN de dimensiuni mici, implicate în procesul de eliminare a exonilor („RNA splicing”)

ARN-polimeraza I este localizată in nucleol, iar celelalte două se găsesc în nucleoplasmă. Cele trei ADN polimeraze prezente in nucleu sunt alcatuite din mai multe subunitati polipeptidice, avand mase moleculare de cel putin 500 kDa. In celulele eucariote au fost identificate ARN polimeraze si in organitele citoplasmatice – mitocondrii si cloroplaste, acestea avand dimensiuni mai reduse comparativ cu ARN polimerazele nucleare, fiind mai asemanatoare enzimelor caracterizate la procariote.

Fiecare celulă eucariotă conține între 2×104 și 2,3 x107 molecule de ARN-polimeraze. Celulele mamiferelor conțin aproximativ 4 x104 molecule de ARN-polimerază I și aproape același număr de molecule de ARN-polimerază III. Numărul lor depinde totuși de rata creșterii și de gradul de diferențiere al celulelor respective.

Mecanismul reacției de transcripție este similar celui din celulele procariote, având însă câteva deosebiri esențiale. La eucariote transcripția se produce pe ADN legat în nucleozomi. Pentru ca ARN-polimeraza să se poată lega la promotori este necesar ca molecula de ADN să sufere niște modificări de conformație. Totodată, în cazul celulelor eucariote se sintetizează precursori ai ARN, care necesită procese de maturare complexe. Există numai câteva specii de ADN mici și stabile, transcrise de ARN-polimeraza III, care nu suferă procese de maturare.

Spre deosebire de procariote, în celulele eucariote nici una dintre cele trei tipuri de ARN-polimeraze nu recunosc promotorul în mod direct ci prin intermediul unor factori de transcripție, inițiindu-se astfel procesul de transcripție. Factorii de transcripție au aceleași funcții pentru toate tipurile de ARN-polimeraze, numărul lor fiind mai mare în cazul ARN-polimerazei II.

Dacă ARN-polimerazele sunt universale, identice pentru toate celulele și țesuturile, factorii de transcripție sunt specifici pentru anumite țesuturi. Ei joacă un rol important în diferențierea celulară și menținerea tipurilor de celule.

Pe lângă acești factori de transcripție, implicați direct în sinteza ARN există și proteine care reglează desfășurarea procesului, în sensul că îl intensifică, atenuează sau blochează. Acestea sunt proteine reglatoare, care similar cu factorii de transcripție au capacitatea de a se lega la ADN. În această categorie de proteine intră receptorii hormonali steroidici, care transportă hormonii în nucleu și interacționează cu secvențele specifice ADN, inițiind, accelerând sau blocând transcripția unor gene.

Factorii de transcripție care intervin în proces sunt proteine multimerice, denumite TF II A, TF II B, etc. Factorul de transcripție cu cea mai mare dimensiune este TF II D, alcătuit dintr-o proteină de legare la regiunea TATA – TBP („TATA-box-binding protein”) și 13 factori asociați – TAF.

Procesul de transcripție parcurge în continuare mai multe etape:

Prima dată proteina TBP („TATA-box-binding protein”) se leagă la regiunea TATA, după care este posibilă și legarea factorului de transcripție TF II B. Acest factor de transcripție este o proteină monomerică, de dimensiuni puțin mai reduse comparativ cu TBP. Domeniul C-terminal al factorului de transcripție intră în contact atât cu TBP, cât și cu secvența ADN, într-o parte a regiunii TATA, în timp de domeniul N-terminal se extinde spre situsul de transcripție.

Factorul de transcripție TF II F formează un complex tetrameric cu ARN-polimeraza, după care se leagă la nivelul situsului start al transcrierii.

La complexul TF II F – ARN-polimerază-ADN se leagă și alți factori de transcripție (TF II E și TF II H), necesari pentru formarea complexului de preinițiere a transcrierii. Prima dată se leagă TF II E, un complex tetrameric, care crează situsul de legare pentru TF II H, care este un factor multimeric alcătuit din 10 subunități.

Activitatea de helicază a unei subunități din TF II H, utilizează energia furnizată de hidroliza ATP pentru a desface dublul helix ADN la nivelul situsului start al transcripției. Se permite astfel ARN-polimerazei să formeze un complex deschis în care ADN este disociat, iar catena ADN matriță (care urmează să fie transcrisă) se leagă la situsul activ al polimerazei.

ARN-polimeraza începe sinteza moleculei ARN, cu ajutorul ribonucleozid-trifosfaților prezenți în mediu.

În continuare are loc elongarea transcriptului, după același mecanism descris în cazul celulelor procariote.

În rezumat putem spune ca transcripția urmează următorii pași importanți: legarea factorilor de transcripție și menținerea duplexului ADN; menținerea stării active a genei țintă sub acțiunea altor factori transcripționali și legarea ARN-polimerazei; discocierea moleculei ADN și activarea ARN-polimerazei cu ajutorul energiei furnizate de hidroliza ATP; inițierea transcripției, a sintezei ARN; elongarea transcriptului.

Procesul de transcripție este specific fiecărui tip de ARN sintetizat, respectiv ARN-polimerază implicate. In urma reacțiilor de transcripție se formează precursori ai ARN, care suferă apoi multiple procese de prelucrare, pentru a rezulta forma lor activă. Particularitățile fiecărei clase de ARN plimeraze vor fi prezentate în continuare.

MECANISMUL MOLECULAR DE ACȚIUNE AL ARN-POLIMERAZEI I

ARN-polimeraza I este localizată în nucleol și catalizează în celulele eucariote sinteza a trei tipuri de ARN ribozomal și anume ARNr 28S, ARNr 18S și ARNr 5,8S, care vor intra în alcătuirea ribozomilor.

Studiile cele mai ample cu privire la structura și modul de acțiune s-au efectuat asupra ARN-polimerazei din celulele animale. În acest caz enzima transcrie genele care codifică ARNr, amplasate în copii multiple pe anumiți cromozomi, în regiuni speciale denumite organizatori nucleolari. Cromozomii sunt astfel dispuși în celulă încât toți organizatorii nucleolari sunt orientați într-o anumită regiune, denumită nucleol.

Deci, nucleolul este alcătuit din bucle mari de ADN care provin de la diferiți cromosomi, fiecare buclă conținând o serie de copii multiple ale genelor ARNr. În această regiune genele ARNr sunt transcrise cu o viteză foarte mare de către ARN-polimeraza I.

Deoarece au un aranjament repetitiv și pentru că trascrierea lor are loc cu o viteză foarte mare, genele ARNr dispuse în serie pot fi ușor evidențiate prin tehnicile de microscopie electronică. Pe o singură genă efectuează transcripția, în mod succesiv până la 100 de molecule de ARN-polimeraze I, ARN transcris dispunându-se perpendicular pe molecula de ADN. Astfel, fiecare „unitate de transcripție” are aspectul unui brad, structură ușor de vizualizat. Tot în nucleol ARNr este imediat împachetat cu proteinele ribozomale pentru a genera precursorii ribozomali.

A. MECANISMUL MOLECULAR AL TRANSCRIERII ARN RIBOZOMAL (ARNr) DE CĂTRE ARN-polimeraza I

Genele ribozomale din nucleul celulelor eucariote au copii multiple repetate în tandem și codifică precursori ai ARNr. Astfel, genele care codifică cele trei forme ale ARNr și anume 18S, 5,8 S și 28 S sunt toate transcrise ca o singură unitate, rezultând un produs cu o lungime foarte mare. Această moleculă conține, pe lângă cele trei tipuri ARNr și regiunile interne cât și cele externe transcrise. După aceea acest produs este împărțit în lanțuri polipeptidice mai scurte, necesare pentru asamblarea ribozomilor (Fig. 3.5).

Produsul inițial de transcripție reprezintă un precursor ARNr, cu masa 45 S, care se scindează apoi în două molecule cu mase de 32, respectiv 20S. Molecula 32 S se scindează la rândul ei, dând naștere moleculelor ARNr 28 S și 5,8 S. Molecula 20 S va genera în final, după prelucrare molecula ARNr 18 S. Moleculele de ARNr au o conformație complexă, alcatuita din regiuni monocatenare si bicatenare, formate datorita unor secvente complementare din structura lor.

Moleculele ARNr 28 S, 5,8 S și 5 S se vor asocia cu proteine și vor da naștere precursorilor subunității ribozomale mari. ARNr 5 S este transcris de o genă separată, care are și ea copii multiple, amplasate în afara nuleolului.

Molecula ARNr 18 S se va asocia cu proteine și va da naștere precursorilor subunității ribozomale mici.

Fig. 3.5 Sinteza moleculelor ARNr – transcripția precursorilor și prelucrarea ulterioară a acestora

B. MECANISMUL DE FORMARE A PRECURSORILOR RIBOZOMALI ÎN CELULELE EUCARIOTE

ARNr reprezintă aproximativ 80-85% din cantitatea totală de ARN celular, intrând în structura ribozomilor. Ribozomii sunt particule nucleoproteice citoplasmatice implicate în sinteza proteinelor, contribesajului uind la transformarea mesajului genetic dintr-o secvență de ribonucleotide din ARNm într-o secvență de aminoacizi din catena polipeptidică.

Ribozomii din celulele eucariote au o constantă de sedimentare de 80S fiind alcătuiți dintr-o subunitate mică de 40S și o subunitate mare de 60S. Ribozomii din organitele celulelor eucariote (mitocondrii și cloroplaste) sunt de tip procariot, avand o constanta de sedimentare de 70S.

Ribozomii conțin 40-60% ARN, restul fiind reprezentat de proteine bazice ribozomale (75-80 tipuri). In medie, diametrul unei particule ribozomale mature este de 12-23 nm.

Imediat după ce a avut loc sinteza moleculelor ARNr, în nucleol începe procesul de formare a precursorilor ribozomali care se vor deplasa în citoplasmă.

În final, subunitatea ribozomală mică conține o moleculă de ARNr 18 S care se asociază cu 33 tipuri de proteine ribozomale, iar în cea mare se găsesc trei tipuri de ARNr (28 S; 5,8 S și 5 S) și 50 tipuri de proteine ribozomale (Fig. 3.6). Molecula ARNr 5S este sintetizată în afara nucleolului și este transferată după transcripție la nivelul situsului de formare a precursorilor ribozomali, în nucleol.

Fig. 3.6. Componența și modul de alcătuire a ribozomilor dintr-o celulă eucariotă

MECANISMUL MOLECULAR DE ACȚIUNE AL ARN-POLIMERAZEI III

ARN-polimeraza III este localizată în nucleoplasmă și catalizează sinteza moleculele ARN cu dimensiuni reduse.

Celulele eucariote conțin un număr mare de molecule de ARN cu o lungime de 300 de nucleotide, sau chiar mai mici. Acestea sunt sintetizate de ARN-polimeraza III, în exteriorul nucleolului.

A. SINTEZA ARN RIBOZOMAL 5S (ARNr 5S)

În plus față de subunitățile ARNr 18 S, 5,8 S și 28 S, care provin din pre-ARNr, celulele eucariote mai conțin o moleculă mică, cu o lungime de 120 de nucleotide, cunoscută ca 5S ARNr.

Aceasta este transcrisă de pe o genă separată, aflată în altă parte pe cromozom (nu în nucleol), dar care posedă și ea copii multiple.

Produsul primar de transcripție al acestei gene este funcțional, ceea ce face ARNr 5S unic între celelalte molecule de ARN din celulele eucariote. Secvența care codifică acest tip de ARN este înalt conservată, fiind identică în toate celulele și totodată în mitocondrii și cloroplaste.

B.SINTEZA ARN DE TRANSFER (ARNt)

ARNt este implicat în activarea aminoacizilor din citoplasmă și în transportarea lor la locul de sinteză a proteinelor în ribozomi. El constituie aproximativ 15% din totalul ARN din celulă, comparativ cu ARNr care reprezintă 80-85%. Genele care codifică ARNt sunt prezente în copii multiple pe cromozomi, dar ele nu sunt așa de înalt repetitive ca ARNr 5S.

Prima dată sunt transcriși precursori ai ARNt care suferă apoi o serie de modificări: micșorarea lungimii, modificări chimice, care să permită adoptarea structurii lor secundare specifice și totodată să asigure buna lor funcționare.

Prelucrarea precursorilor ARNt are loc prin modificarea lungimii – scurtare cu 30-40 de nucleotide și totodată metilarea unui număr mare de baze azotate.

În mod practic s-a constatat că moleculele de ARNt conțin multe baze rare, dintre care cele mai multe sunt formele metilate ale nucleozidelor uzuale. Se consideră că metilarea are loc după transcripție și are ca scop:

să împiedice formarea de legături de hidrogen, în anumite puncte, între bazele complementare ale aceleiași molecule de ARNt, în așa fel încât să poată rezulta structura secundară caracteristică.

Să nu permită formarea de legături de hidrogen între bazele complementare din moleculele de ARNt și ARNm.

Să reducă susceptibilitatea ARNt la atacul hidrolitic al nucleazelor.

Din punctul de vedere al structurii lor primare după prelucrare, există mai multe tipuri diferite de ARNt, cel puțin unul pentru fiecare aminoacid, dar toate au o lungime medie de 75-80 de nucleotide și prezintă aceiași structură secundară.

Secvența de nucleotide a diferitelor tipuri de ARNt prezintă regiuni de complementaritate a bazelor azotate, la nivelul cărora au loc împerechieri intracatenare, astfel încât macromolecula realizează o structură secundară caracteristică, asemănătoare unei frunze de trifoi. Molecula de ARNt cuprinde patru bucle monocatenare, corespunzătoare celor patru regiuni dublu catenare formate prin împerecherea bazelor azotate complementare. Aceste bucle prezintă o mare importanță pentru funcțiile ARNt, la nivelul lor fiind localizate o serie de situsuri specifice (Fig 1.9- capitolul 1.1.3.).

C. SINTEZA ALTOR MOLECULE MICI DE ARN

ARN-polimeraza III contribuie și la transcripția altor molecule mici de ARN. Acestea sunt de obicei asociate cu proteine specifice și formează particulele ribonucleoproteice (RNPs). Ele pot funcționa în nucleu și atunci poartă numele de particule (snRNP) sau în citoplasmă, purtând denumirea de ribonucleo-proteice citoplasmatice (sc RNPs).

Rolul acestor particule depinde de tipul și structura lor (Tabelul 3.2)

Tabelul 3.2 Rolul și localizarea particulelor ribonucleoproteice (RNPs)

MECANISMUL MOLECULAR DE ACȚIUNE AL ARN-POLIMERAZEI II

ARN-polimeraza II este localizată în nucleoplasmă și catalizează sinteza moleculelor ARNm. Într-o celulă există o populație de molecule ARNm, a cărei structură depinde de genele care sunt transcrise la acel moment și poate să difere în funcție de tipul țesutului, etapa de dezvoltare ontogenetică sau de condițiile de mediu.

ARN mesager (ARNm) este numit și ARN informațional, deoarece este implicat direct în copierea informației genetice de pe matrița de ADN și în translația ei în proteine. De aceea, în funcție de mărimea mesajului genetic, moleculele de ARNm pot avea dimensiuni foarte variate. De asemenea, secvența primară de nucleotide este caracteristică fiecărui tip de ARNm, în funcție de mesajul genetic pe care îl poartă.

ARNm se sintetizează în nucleu, prin transcripția genelor corespunzătoare, sub forma unor precursori pre-ARNm. Aceaste molecule precursoare, reprezentând transcriptul primar al genelor, cuprind regiuni codificatoare (exoni) precum și regiuni necodificatoare (introni) și sunt supuse unor serii de modificări post-transcripționale care au ca scop atașarea unor structuri specifice la capetele moleculei de ARN și totodată eliminarea (excizia) intronilor.

După cum s-a arătat în fig. 2.6, structura zonei centrale a unei gene începe cu o regiune netranscrisă, urmată apoi de o regiune transcrisă, dar netradusă în proteină, care se notează de obicei 5’UTR („untranslated region”). Această regiune începe cu situsul de start al transcrieii și se încheie cu codonul start al translației.

La extremitatea 3’ a precursorilor ARNm se găsește o secvența notată 3'UTR, care începe cu codonul stop al translației.

Aceste regiuni transcrise dar netraduse joacă un rol important în prelucrările post-translaționale, inclusiv în stabilirea eficienței cu care ARNm se deplasează din nucleu în citoplasmă, în localizarea subcelulară și în stabilitatea acestuia. Importanța funcțională a acestor regiuni este subliniată de faptul că apariția unor mutații conduce la apariția anumitor afecțiuni.

A. STRUCTURA PRECURSORILOR ARNm

Lungimea medie a regiunii 3'UTR este aproximativ constantă în cadrul diferitelor specii, încadrându-se în intervalul 100-200 de nucleotide, în timp ce lungimea medie a secvenței 3'UTR este mult mai variabilă, de la 200 de nucleotide la plante până la 800 de nucleotide la om.

Regiunea genomică corespunzătoare regiunilor UTR ale unei molecule ARNm poate să conțină și introni, mai frecvent la capătul 5' decât 3'. Compoziția bazelor azotate în cele două regiuni poate de asemenea să difere. Astfel, conținutul G+C în secvența 5'UTR este mai mare, comparativ cu cel din 3'UTR. S-a evidențiat și o corelație interesantă între conținutul de G+C în regiunile 3'UTR sau 5'UTR și prezența acestor baze azotate (G și C) în cea de-a treia poziție a codonilor care alcătuiesc secvența codificatoare. De asemenea s-a constatat o corelație negativă între conținutul G+C în regiunile 3'UTR sau 5'UTR și lungimea acestora. Astfel se poate spune că genele localizate în regiunile bogate în G și C ale cromozomilor au regiuni netranscrise cu lungimi mai reduse.

Ținând cont de structura genelor se poate spune că un precursor al ARNm este alcătuit din mai multe regiuni, înainte de a fi prelucrată.

Regiunea netradusă 5’UTR („untranslated region”), cu rol în controlul translațional;

regiunea codificatoare: codonul de inițiere a translației – AUG, secvența de nucleotide (codoni) pentru sinteza polipeptidului și o secvență stop, reprezentată de unul dintre codonii stop- UAA, UGA sau UAG

Regiunea netradusă 3’UTR („untranslated region”), cu rol în localizarea celulară, transportul ARNm din nucleu în citoplasmă și stabilitatea ARNm.

B. MODIFICĂRI POST-TRANSLAȚIONALE ALE PRECURSORILOR ARNm

Pentru a ajunge la structura finală a moleculei mature, pre-ARNm trebuie să sufere mai multe modificări și anume: adăugarea unei grupări 7-metil guanozina (m7Gppp) la capătul 5’, poliadenilarea la capătul 3’ și eliminarea intronilor (”ARN splicing”). Astfel, molecula ARNm poate fi transferată în citoplasmă, unde își va îndeplini funcția de matriță pentru sinteza lanțurilor polipeptidice.

B1. MODIFICAREA CAPĂTULUI 5’AL MOLECULEI ARNm

Orice tip de moleculă de ARN începe cu un nucleozid 5’ trifosfatat (A sau G), care reprezintă primul nucleotid la care s-a legat ARN-polimeraza și care constituie punctul de pornire al sintezei ARN.

Imediat după începerea transcrierii, la capătul 5’ al ARNm este atașată o moleculă de 7-metil guanozină, sub acțiunea guanil transferazei. Se formează astfel o legătură 5’-5’ trifosfat cu primul nucleozid trifosfatat al ARNm (Fig. 3.7).

Acest capăt m7GpppAp protejează molecula ARNm de degradarea enzimatică, fiind implicat și în procesul de transfer în citoplasmă. De asemenea, leagă un factor proteic care este necesar inițierea sintezei lanțului polipeptidic.

Fig. 3.7 Atașarea capătului m7Gppp la molecula ARNm

B2. MODIFICAREA CAPĂTULUI 3’ AL MOLECULEI ARNm

După transcripția completă, la capătul 3’ al moleculei de ARNm se adaugă 100-250 de resturi de acid adenilic (poly A), proces care poartă numele de poliadenilare și are loc după următorul mecanism:

Secvența 5’–AAUAAA- 3’, amplasată la extremitatea 3’ a regiunii 3’ UTR mediază desprinderea moleculei de ARN sintetizate, de pe catena matriță, în aval cu 15-30 nucleotide.

Aceiași secvență este recunoscută de un complex alcătuit dintr-o endonuclează și o polimerază poly A care secționează pre-ARNm înainte de acest semnal și apoi adaugă 100-250 de resturi adenilate.

Acest capăt poly A este implicat în exportul ARNm din nucleu, stabilizează ARNm împotriva degradărilor exonucleolitice și pare să fie implicat în inițierea translației.

B3. ELIMINAREA INTRONILOR – ARN SPLICING

Studiile efectuate asupra ARNm au evidențiat că acesta are dimensiuni mult mai reduse, comparativ cu ADN pe care l-a transcris.

În anul 1977 s-a demonstrat că, la eucariote, ADN este format din exoni – secvențe de ADN codificatoare care sunt transcrise și traduse și introni – segmente de ADN care sunt transcrise, dar nu sunt traduse, interpuse între secvențele exonice codificatoare.

Deci ADN este un mozaic alcătuit din introni și exoni. În cadrul procesului de maturare intronii sunt eliminați printr-un proces de înnădire – „ARN splicing”.

Mecanismul reacției de eliminare a intronilor – ARN splicing

Poziția 5’ de secționare este reprezentată de o secvență GU, care separă intronul 1 de primul exon. În poziția de secționare 3’, este prezentă o secvență AG. În interiorul fiecărui intron există un punct de ramificare (branch point) care este reprezentat de un adenin-nucleotid.

Între poziția 5’ de secționare și punctul de ramificare, in interiorul intronilor sunt prezente secvențe bogate în UA. Între punctul de ramificare și poziția 3’ de secționare secvențele sunt bogate în U.

În prima etapă gruparea hidroxil de la un atom de C2’ al nucleotidei care constituie punctul de ramificare atacă nucleofil legătura fosfodiester care leagă ultima bază a primului exon cu prima bază a intronului.

Se formează un exon cu o grupare OH liberă la un capăt 3’ și o structură lariat, în care capătul 5’ al intronului este atașat printr-o legătură 2’-5’ de baza care constituie punctul de ramificare.

În timpul celei de-a doua etape, gruparea hidroxil 3’ a primului exon atacă nucleofil legătura fosfodiesterică care leagă atomul de C3’ al intronului cu atomul C5’ al celui de-al doilea exon, după următorul mecanism:

Astfel sunt legați doi exoni între ei și se elimină un intron (Fig.3.8). Energia necesară pentru formarea legăturilor între exoni este furnizată prin desfacerea legăturilor intron – exon.

Fig. 3.8 Mecanismul reacției de eliminare a intronilor (ARN splicing)

Procesul de eliminare a intronilor este mediat de molecule mici ribonucleoproteice (snRNP) și anume: U1, U2, și U4, U5 și U6. Aceștia se leagă la situsurile de secționare/ legare formând un complex ribonucleoproteic denumit spliceosome de dimensiuni mari (60 S) (Fig. 3.9).

Acești spliceosomi recunosc granița dintre introni și exoni iar, în final, recunosc segmente de exoni pe care le reunesc în ARN matur.

Deci, precursorii ARNm suferă modificări complexe, pentru a ajunge la forma de ARN matur, care se deplasează apoi în nucleul, unde stau la baza procesului de sinteză a proteinelor. Centralizarea proceselor de maturare care au loc în nucleu sunt prezentate în Figura 3.10.

Fig. 3.9 Mecanismul formării spliceosomilor în procesul de eliminare a intronilor

Se pare că intronii au fost prezenți în genele ancestrale, dar au fost pierduți în timpul evoluției de către organismele cu un ciclu de dezvoltare foarte rapid (eubacterii, drojdii), sub acțiunea unor presiuni de selecție. Poziția intronilor în unele gene, la eucariotele superioare, se consideră a fi veche de cel puțin 1 miliard de ani. Se consideră că acest mecanism comun de segmentare a genelor (exoni și introni) a apărut înainte de diferențierea regnului animal la fungi și plante.

S-a emis ipoteza că prin rearanjarea exonilor ce codifică elementele structurale ar fi putut să apară noi proteine în cursul evoluției. Rearanjarea exonilor este un mijloc rapid și eficient de a genera noi gene, deoarece aceste aranjări păstrează unitățile funcționale, dar permite acestora să interacționeze într-un mod nou.

Intronii sunt zone întinse de ADN care se pot rupe și recombina fără a avea vreun efect asupra proteinei codificate de gena respectivă.

Fig. 3.10 Procesele de sinteză și maturare a ARNm

Fig. 3.10. Etapele parcurse de molecula ARN, de la transcripție până la translație

Structura finală a moleculei ARNm, după ce a suferit toate modificările postranscripționale este prezentată în Fig. 3.11.

Fig. 3.11. Structura moleculei ARNm maturat

un capăt 5’ specific – m7Gppp;

regiune netranscriptibilă 5’ (UTR);

regiunea codificatoare: codonul de inițiere a translației – AUG, secvența de nucleotide (codoni) pentru sinteza polipeptidului și o secvență stop, reprezentată de unul dintre codonii stop- UAA, UGA sau UAG

regiune netranscriptibilă 3’ (UTR);

un capăt 3’ poly A;

3.1.3. MECANISMUL MOLECULAR AL PROCESULUI DE TRANSPOZIȚIE – ELEMENTE TRANSPOZABILE

Deși elementele transpozabile au fost descoperite pentru prima dată în celulele eucariote, ele se găsesc și în procariote. Procesul prin care aceste secvențe sunt copiate și inserate într-o nouă poziție în genom poartă numele de transpoziție.

Dacă transpoziția apare în celulele germinale, secvențele transferate în noile poziții sunt transferate generațiilor următoare. Astfel, elementele mobile s-au multiplicat și acumulat de-a lungul evoluției, constituind acum o parte semnificativă din genomul multor eucariote.

Transpozonii nu sunt numai o sursă pentru creșterea cantității de ADN din genom, dar constituie un al doilea mecanism care, pe lângă recombinarea meiotică produce o restructurare a materialului genetic de-a lungul evoluției.

Barbara McClintock a descoperit pentru prima dată elementele mobile, în timpul efectuării unor experimente la porumb, în anii 1940. Ea a caracterizat aceste structuri genice care se pot insera in interiorul anumitor gene, modificând fenotipul. Teoria ei a fost controversată până în momentul în care au fost identificate elemente mobile similare la bacterii, caz în care a fost posibilă caracterizarea secvențelor specifice de ADN și a fost descifrată baza moleculară a procesului de transpoziție.

O dată cu progresul cercetărilor asupra acestor elemente mobile, ele au fost împărțite în două categorii:

elemente transferate direct ca ADN – denumite transpozoni ADN

elemente la care transferul are loc via un intermediar ARN, care transcrie elementul ADN mobil cu ajutorul ARN-polimerazei și este apoi convertit din nou într-un fragment ADN bicatenar de către revers-transcriptază, denumite retrotranspozoni sau transpozoni ARN (Fig. 3.12).

Fig. 3.12 Mecanismul de acțiune al transpozonilor

3.1.3.1. PROCESUL DE TRANSPOZIȚIE LA PROCARIOTE

Majoritatea elementelor mobile la bacterii sunt de tip ADN. Primele investigații moleculare ale elementelor mobile au provenit din studii asupra

unei mutații la E. coli, produsă de o inserție spontană a unei secvențe cu lungimea de 1- 2 kb în mijlocul unei gene. Această secvență a fost denumită secvență de inserție, sau element IS. Apoi au mai fost identificate alte 20 de secvențe IS la bacterii.

Transpoziția la bacterii este un proces care apare rar, deoarece de obicei acest proces inactivează gene metabolice esențiale, care conduc la moartea celulelor. Structura generală a elementelor IS este prezentată în fig. 3.13.

Fig. 3.13. Structura generală a unui element IS bacterian

O repetiție inversă („inverted repeat”), cu lungimea de 50 bp este prezentă întotdeauna la ambele capete al situsului de inserție. Într-o astfel de structură, secvența 5’-3’ a unei catene este repetată în secvența complementară după cum urmează:

Între repetițiile inverse este amplasată o regiune care codifică transpozaza, o enzimă necesară pentru transpoziția elementului IS într-un nou situs.

La cele două extremități, lîngă repetițiile inverse sunt amplasate secvențe denumite repetiții directe („direct repeat”), cu lungimi de 5-11bp. Lungimea repetițiilor directe depinde de fiecare tip de element IS, dar secvențele lor depind de de situsul țintă în care se inserează o copie a IS.

Inserția unui astfel de element are loc după mecanismul „cut and paste”. Transpozaza mediază trei procese și anume: (1) excizează foarte precis elementul IS din ADN donor; (2) produce secționări în ADN țintă; (3) inserează elementul IS în ADN țintă.

În acest fel elementul IS a fost transferat într-un nou situs în genom, unde se menține pe parcursul proceselor de multiplicare bacteriană, până la momentul la care suferă o nouă transpoziție.

3.1.3.2. PROCESUL DE TRANSPOZIȚIE LA EUCARIOTE

În celulele eucariote, spre deosebire de procariote au fost evidențiați atât transpozoni ADN, cât și retrotranspozoni (transpozoni ARN).

A. TRANSPOZONI ADN

Mulți ani după ce Barbara McClintock a studiat efectul transpozonilor asupra fenotipului la porumb, experimentele de clonare și secvențializare au demonstrat care este structura transpozonilor ADN. Ei conțin o secvența terminală denumită repetiție inversă, care flanchează regiunea codificatoare pentru o transpozază. Această enzimă recunoaște secvențele terminale repetate și catalizează transpoziția într-un alt situs din genom.

Transpoziția ADN, care are loc după mecanismul „cut and paste” poate să conducă la creșterea numărului de copii ale transpozonului dacă apare în timpul fazei S a ciclului celular, atunci când are loc sinteza ADN.

Acest fenomen are loc atunci când secvența mobilă provine dintr-una dintre cele două catene ADN, dintr-o regiune cromozomală care a fost deja replicată și ADN țintă se află în regiunea care nu a fost încă replicată. La finalizarea procesului de replicare, la sfârșitul fazei S, secvența mobilă ajunsă în noua locație va fi de asemenea replicată, conducând la o creștere semnificativă a numărului de transpozoni din celulă.

Atunci când o astfel de transpoziție apare înaintea meiozei, una dintre cele patru celule germinale produse conține copii suplimentare ale transpozonilor. Repetarea acestui proces de-a lungul evoluției a condus la acumularea unui număr mare de transpozoni ADN în genomul unor organisme. ADN uman conține aproximativ 300.000 de copii de transpozoni cu secvență totală sau parțială, constituind aproximativ 3% din genom.

B.TRANSPOZONI ARN

Retrotranspozonii sau transpozonii ARN actíonează după sistemul “copy -paste”, care constă în copiere și atașare înapoi în genom, în poziții multiple.

Ca o primă etapă a unui astfel de proces se constituie transcripția secvenței mobile (retrotranspozon) într-o moleculă de ARN complementară. Apoi are loc un proces de revers-transcripție, în care molecula de ARN este transformată din nou în ADN, care este inserat înapoi în genom. Retrotranspozonii se comportă similar cu retrovirusurile, conducând la ipoteza posibilei origini evolutive a acestora. Au fost caracterizate trei categorii diferite de retrotranspozoni si anume:

Retrotranspozonii virali

Retrotransozonii virali sunt alcătuiți dintr-o regiune codificatoare, cu o lungime de 6- 11 kb, care conține toate genele specifice retrovirusurile, mai puțin cele care codifică proteinele învelișului viral (revers-transcriptaza, transpozaze). Această regiune este mărginită de secvențe terminale repetitive cu lungime mare, denumite LTR („long terminal repeats”), de asemenea specifice retrovirusurilor. Aceste fragmente, cu lungimi de 250-600 bp sunt caracteristice pentru integrarea ADN viral și critice pentru ciclul de viața al retrovirusului. La ambele extremități sunt amplasate repetiții directe care funcționează ca de situs specific de inserție sau situs țintă (Fig. 3.14).

Fig. 3.14 Structura generală a unui retrotranspozon LTR

(„long terminal repeats”),

Mecanismul după care are loc transpoziția este complex, fiind exploatate atât sistemele enzimatice ale celulei cât și cele codificate de transpozon.

Secvența LTR stângă funcționează ca un promotor care direcționează ARN-polimeraza celulară să inițieze transcripția. După finalizarea procesului, extremitatea stângă a ARN (corespunzătoare secvenței LTR din partea dreaptă) direcționează enzimele care procesează ARN din celula gazdă să secționeze transcriptul primar și să adauge secvența poly A, la capătul 3’.

Molecula ARNm astfel prelucrată este transportată în citoplasmă, unde are loc copierea într-o moleculă ADN, cu ajutorul revers-transcriptazei sintetizate anterior. Fragmentul ADN este transportat din nou în nucleu și inserat în genom cu ajutorul transpozazei.

Mecanismul de acțiune este similar cu cel al retrovirusurilor, al căror material genetic este copiat, transformat și apoi inserat în genom.

Retrotranspozoni non-virali

Retrotranspozonii non-virali alcătuiesc clasa celor mai abundente elemente mobile din genomul uman, care codifica revers-transcriptaza, dar nu poseda secvente terminale repetitive cu lungime mare (LTR).

Aceste secvențe mobile sunt moderat repetate și formează două clase în genomul mamiferelor: secvențele LINE ("long interspersed repeated sequences"), cu o lungime de 6kb, transcrise de ARN-polimeraza II si SINE ("short interspersed repeated sequences"), cu o lungime de 300bp, transcrise de RNA polimeraza III, având un sistem de acțiune similar.

LINE ("long interspersed repeated sequences")

ADN uman poate conține trei mari familii majore de secvențe LINE, care au mecanisme de transpoziție similare, dar diferă în funcție de secvență: L1, L2. L3. In prezent, în genomul uman se mai întâlnește numai familia L1, pentru celelalte două nu au mai fost identificate copii funcționale.

Secvențele LINE constituie 21% din genom, fiind inserate în 900.000 de poziții. Ele sunt flancate de situsuri specifice de inserție (situsuri țintă), alcătuite din repetiții directe și o regiune centrală cu o lungime de 6 kb. Regiunea centrală conține două cadre de citire ORF („open reading frames”): ORF 1, cu o lungime de 1 kb, care codifică o proteină de legare a ARN și ORF 2, cu o lungime de 4 kb, care codifică o proteină care prezintă o omologie înaltă cu revers-transcriptaza retrovirusurilor și a transpozonilor virali, dar prezintă în plus activitate endonucleazică (Fig. 3.15).

Fig. 3.15. Structura generală a unei secvențe LINE

("long interspersed repeated sequences")

Mecanismul de acțiune al secvențelor LINE diferă de cel al retrotanspozonilor, deoarece nu conțin secvențe terminale repetitive cu lungime mare – LTR („long terminal repeats”), care să medieze procesul de transcripție și de inserare în noul situs.

În cazul secvențelor LINE, genele care alcătuiesc regiunile ORF 1 și ORF 2 sunt transcrise cu ajutorul ARN-polimerazei celulare, care este direcționată de către un promotor, amplasat în partea stângă a secvenței ADN-LINE, reprezentat de o regiune bogată în A/T.

Apoi ARN-LINE este poliadenilat de mecanismele celulare specifice și exportat în citozol, unde sunt sintetizate proteinele ORF 1 și ORF 2. Copii multiple ale proteinei ORF 1, se leagă la ARN-LINE, iar proteinele ORF 2 se leagă la secvența poly A. Sub această formă, ARN-LINE este transportat înapoi în nucleu ca un complex cu proteinele ORF 1 și ORF 2 și este revers- transcris în nucleu de către proteina ORF 2.

Mecanismul de inserție presupune parcurgerea mai multor etape:

Proteina ORF 2 produce o secționare a a ADN cromosomal, la nivelul unei catene, într-o regiune bogată în A/T;

Molecula ARN-LINE se atașează la această catenă bogată în T (generată prin secționarea decalată) a ADN cromozomal, denumită regiunea monocatenară inferioară, prin secvența proprie poly A;

Revers-transcriptaza copiază ARN-LINE, având ca primer catena ADN cromosomal care a fost secționată;

ORF 2 transcrie ARN-LINE și apoi începe să copieze regiunea monocatenară superioară a cromozomului;

Enzimele celulare hidrolizează apoi ARN și extind capătul 3’ al ADN cromozomal, înlocuind catena ARN LINE cu ADN.

Un proces complet conduce la inserția unei copii a retrotanspozonilor într-un situs nou al ADN cromozomal. O regiune scurtă, cu repetiții directe este generată la situsul de inserție, datorită clivării inițiale a două catene ADN cromozomal, fără a necesita integrază pentru inserare.

SINE ("short interspersed repeated sequences")

ADN uman conține 13% secvențe SINE ("short interspersed repeated sequences"), care apar în aproximativ 1,6 milioane de situsuri.

Acestea variază în lungime de la 100 la 400 bp, nu codifică proteine, dar majoritatea conțin un capăt 3’ bogat în secvențe A/T similare cu cele ale secvențelor LINE.

Secvențele SINE sunt transcrise de aceiași ARN-polimerază nucleară care transcrie genele care codifică ARNt, 5S ARNr și alte molecule mici ARN –ARN-polimeraza III. Se consideră că proteinele ORF 1 și ORF 2, codificate de secvențele LINE mediază și revers-transcripția și integrarea, după același mecanism. În consecință, secventele SINE pot fi considerate ca paraziți ai secvențelor LINE, concurînd cu acestea în procesele menționate.

1,1 milioane dintre secventele SINE sunt elemente Alu, denumite astfel deoarece conțin un singur situs de recunoaștere pentru enzima de restricție Alu I. Aceste elemente prezintă o omologie de secvență considerabilă și probabil au evoluat dintr-un tip de ARN, care formează un complex ribonucleoproteic, denumit particulă de recunoaștere a semnalului (SRP). Această particulă se găsește în cantități mari în celule și este implicată în dirijarea anumitor proteine spre membrana reticulului endoplasmatic, în timpul transportului co-translațional (capitolul 3.4.2.). Secvențele Alu sunt răspândite în genomul uman în poziții în care inserția lor nu a afectat expresia genelor și anume: între gene, în introni, în regiunile 3 netraduse ale unor molecule ARNm

Pseudogene

În plus față de elementele mobile prezentate, mai există o largă varietate de molecule ARNm care sunt integrate în ADN cromosomal. Deoarece acestor secvențe le lipsesc intronii și nu posedă regiuni de flancare similare cu cele ale genelor funcționale, se consideră că ele nu pot fi simple gene duplicate care au devenit nefuncționale. De fapt ele par să fie retrotranspozoni ai unor molecule ARN prelucrate (maturate) și de aceea poartă numele de pseudogene. Majoritatea pseudogenelor sunt flancate de repetiții directe scurte, care mențin ipoteza că au fost generate de evenimente de retrotranspoziție care au implicat ARNm celular.

Aceste molecule sunt supuse unui proces de revers-transcripție, după care, fragmentul ADN nou sintetizat este inserat înapoi în genom.

Alte tipuri de secvențe sunt cele care reprezintă copii parțiale ale unor molecule ARN de dimensiuni reduse, cum ar fi snARN și ARNt. Similar cu pseudogenele procesate derivate de la ARNm, aceste copii nefuncționale sunt flancate de repetiții directe scurte și cel mai probabil rezultă din evenimente de retrotranspoziție rare, care s-au acumulat în cursul evoluției.

Analizând modul de acțiune al secvențelor mobile se poate spune că ADN a unui retrotranspozon viral (LTR) este sintetizată din forma sa ARN în citozol și transportată apoi în nucleu unde este integrată în ADN cromozomal de către integraza codificată de retrotranspozon. În contrast, forma ADN a unui retrotranspozon neviral este sintetizată în nucleu, fără a necesita integrază pentru inserția în genom.

Toate tipurile de transpozoni au avut o contribuție majoră la evoluția organismelor deoarece au contribuit la mai multe procese cum ar fi:

Generarea unor familii de gene prin duplicare;

Crearea unor gene noi prin modificarea exonilor existenți;

Formarea unor regiuni de reglare mai complexe care permit un control diferit al expresiei genelor;

În prezent cercetătorii acordă o atenție deosebită posibilității de exploatare a mecanismelor transpoziției pentru inserarea unor gene terapeutice ca o formă a terapiei genice, sau pentru identificarea unor gene la plante.

3.1.4 REGLAREA EXPRESIEI GENELOR

Celulele oricărui organism, indiferent de structura și funcția lor, posedă aceeași informație genetică, deoarece rezultă prin mitoze succesive din zigot, dar expresia genică este diferită. Unele gene, constitutive („housekeeping genes”) sunt exprimate în toate tipurile de celule, în toate etapele de dezvoltare, deoarece codifică proteine necesare permanent în celule. Altele sunt exprimate numai în țesuturi specifice, sau în stadii diferite ale dezvoltării, diferențierii, ciclului celular iar altele sunt complet și permanent inactivate.

Din această cauză a fost necesară dezvoltarea unor sisteme foarte complexe de reglare a genelor. Mecanismele de reglare a expresiei genelor au fost descifrate inițial la procariote; ele se bazează pe celebrul “model al operonului” descris în 1961 de către Jacob și Monod la E. coli. (Premiul Nobel, 1965).

Operonii regrupează într-o singură unitate funcțională mai multe gene de structură (ce codifică enzime diferite, implicate însă în același lanț metabolic, precum și gene de reglare a transcrierii. Genele reglatoare produc prin intermediul unor substanțe (represori) inactivarea sau activarea genelor de structură, de obicei sub acțiunea unor factori de mediu (inductori, corepresori).

Mecanismele de reglare evidențiate la procariote nu sunt valabile în totalitate la eucariote, datorită dimensiunilor mult mai mari ale genomului și împachetării complexe pe care o suferă fibrele de cromatină în nucleu. In acest caz sunt active mecanisme de reglare mult mai complexe, care acționează asupra tuturor etapelor parcurse până la obținerea unei proteine funcționale. Astfel a fost evidențiată o reglare pretranscripțională, transcripțională, postranscripțională, translațională și postranslațională.

3.1.4.1. REGLAREA PRE-TRANSCRIPȚIONALĂ A EXPRESIEI GENICE

In nucleul celulelor eucariote, moleculele de ADN formează cu histonele structuri compacte sub forma fibrelor de cromatină. Pentru a fi posibilă inițierea transcrierii este necesară modificarea structurii cromatinei, astfel încât factorii de expresie să poată interacționa cu promotorii. Aceste modificări structurale sunt în general datorate unor modificări ale histonelor sau metilării ADN. Aceste modificări sunt reversibile, ceea ce le face extrem de utile în reglarea expresiei genice și totodată au un potențial ereditar, adică se pot transmite de la o generație la alta, precum și în cursul diviziunilor celulare.

A. MODIFICĂRI CHIMICE

A.1. MODIFICAREA HISTONELOR

Modificările histonelor se asociază cu modificări ale structurii cromatinei. Atunci când cromatina se află într-o conformație puternic condensată, cu nucleozomi strâns legați între ei cu ajutorul histonei H1, este inactivă transcripțional. În schimb cromatina adoptă o conformație mai relaxată atunci când histonele suferă procese de metilare, acetilare sau fosforilare. Aceste reacții au loc asupra capetelor aminoterminale, bogate în aminoacizi precum lizina, arginina și serina, fiecare dintre aceste reacții interesând specific anumiți aminoacizi.

Un proces important este acetilarea histonelor produsă de enzimele histon-acetil transferaza (HAT) care disociază molecula ADN de pe complexul histonic, permițând începerea transcrierii.

An insight into how these modifications could affect chromatin structure came from solving the high-resolution X-ray structure of the nucleosome in 1997

O întelegere a modului în care procesele de modificare a histonelor pot să influențeze structura cromatinei a avut loc atunci când structura nucleosomului a fost descifrată cu ajutorul razelor X cu rezoluție înaltă, în anul 1997.

A.2.. MODIFICAREA ADN

În genomul uman metilarea ADN are loc aproape exclusiv în poziția 5' a citozinei din cadrul dinucleotidelor CpG, care sunt concentrate în anumite regiuni denumite insule CpG, localizate foarte adesea la nivelul regiunilor promotor a numeroase gene, precum și în interiorul unor gene. Reacțiile de metilare sunt mediate de enzime specifice – ADN-metiltransferaze și ADN-demetilaze, care au rolul de a adauga sau elimina grupări metil în poziții specifice ale bazelor azotate.

In general genele inactive au ADN metilat și histone deacetilate, ceea ce conduce la o creștere a gradului de condensare a cromatinei. În momentul în care o genă devine activă, grupările metil suplimentare sunt eliminate de la nucleotidele care alcătuiesc promotorul, iar histonele sunt acetilate.

Se consideră că prezența grupărilor metil atașate la ADN poate inhiba legarea unor factori de transcripție la secvențele lor țintă. În al doilea rând, represarea expresiei genice poate fi mediată de către o serie de proteine care au capacitatea de a recunoaște și a se lega specific la grupările metil atașate citozinei.

B. MODIFICĂRI STRUCTURALE

Structura ADN nu este fixă, rigidă, ea poate suferi o serie de modificări conformaționale care influențează interacțiunea dintre anumite secvențe ale ADN și diferite molecule exogene reglatoare. Trecerea de la forma B a ADN unor gene la forma Z ar putea fi vitală pentru reglarea activității genice.

3.1.4.2. IMPLICAȚII ALE MECANISMELOR EPIGENETICE ÎN CONTROLUL EXPRESIEI GENICE

Epigenetica se referă la modificări în expresia genelor controlate genetic, care nu implică schimbări în secvența nucleotidelor, dar se manifestă ca markeri chimici, adăugați după replicare, fie la ADN, fie la proteinele care intră în alcătuirea cromatinei.

Astfel, metilarea ADN este un proces care are loc după replicare, în care resturi citozinice din secvențele CpG sunt metilate, formând modele de metilare specifice genelor. Genele comune (“housekeeping genes”) au regiuni bogate în secvențe CpG în regiunea promotorului, care sunt nemetilate în toate tipurile de celule, în timp ce genele specifice unui tip de țesut sunt metilate în toate țesuturile, cu excepția țesutului în care genele sunt exprimate. Aceste modele de metilare sunt evident corelate cu expresia genelor. În plus, s-a demonstrat că cele mai eficiente mecanisme de inactivare a genelor implică metilarea ADN. Modelul de metilare este stabilit încă din fază embrionară și se menține pe tot parcursul vieții.

3.1.4.3. REGLAREA TRANSCRIPȚIONALĂ

A. REGLAREA TRANSCRIPȚIONALĂ INTERNĂ

Controlul transcripțional al expresiei genice vizează reglarea activității ARN-polimerazei II, enzima ce transcrie genele care codifică proteine și sintetizează ARNm. Reglarea transcripțională implică interacțiunea unor proteine – factori trans-reglatori cu secvențe specifice de pe ADN-elemente cis-reglatoare, proces care determină transcripția specifică a anumitor gene, într-un anumit moment pentru a se produce o cantitate adecvată dintr-o anumită proteină.

Elementele cis-reglatoare sunt secvențe scurte de ADN ale căror funcții sunt limitate la o anumită genă; după fixarea unor factori "trans-reglatori" specifici, denumiți factori de transcripție, aceste secvențe permit recunoașterea genei de către ARN-polimerază și reglează specificitatea și intensitatea transcripției, în funcție de nevoile celulare.

In capitolul 2.3.2.1 au fost descrise elementele reglatoare, care sunt constituite dintr-un promotor, alcătuit din casetele „TATA box”, „”CCAAT box” și regiunea promotor distală. Regiunea distală este alcătuită din elemente RE, care modulează transcripția unor gene în funcție de anumite semnale extracelulare ("expresie genică indusă"), activatorii ("enhancers") care măresc nivelul bazal al transcripției, inițiată de promotor și inhibitorii ("silencers"), care reduc nivelul trascripției și uneori represează funcția unor gene.

Activatorii pot fi amplasați fie în aval, fie în amonte de gena țintă, sau chair în interiorul genei pe care o controlează. Anumiți factori de transcripție, denumiți proteine care se leagă la activatori ("Enhancer-binding protein") se leagă la aceste regiuni de ADN situate chiar la câteva mii de baze distanță de gena țintă, care funcționează ca activatori, mărind rata de transcripție. Proteinele care se leagă la activatori au un situs care le permite leagarea la activatori și un altul care se atașează la factorii de transcripție legați în prealabil la nivelul promotorului. Se formează astfel o structură în formă de buclă, care permite activatorului să acționeze asupra complexului de transcripție (Fig. 3.16 ).

Fig. 3.16 Modul de acțiune a activatorilor ("enhancers") asupra transcrierii genelor

Inhibitorii ("silencers") sunt regiuni de control care, la fel ca activatorii pot fi localizate la mii de baze distanță de gena pe care o controlează. Totuși, în momentul în care leagă anumiți factori de transcripție, expresia genei controlate este represată.

Se poate spune că atât activatorii cât și inhibitorii pot să activeze gene situate la distanțe mari, acționând asupra promotorilor. În această situație există posibilitatea ca un activator sau inhibitor să acționeze asupra unei alte gene decât gena țintă. Pentru a preîntâmpina o astfel de situație, în genom există structuri specifice de ADN denumite secvențe "izolatoare" ("insulators"), cu o lungime de 42 bp situate între activatorii și promotorii, sau inhibitorii și promotorii unor gene adiacente. Astfel activarea unei gene de către un alt activator decât cel specific nu mai este posibilă, deci acțiunea activatorilor și inhibitorilor este limitată numai la gena țintă.

Factorii de transcripție trans-reglatori sunt proteine reglatoare care se fixează pe elementele cis-reglatoare ale ADN, de obicei, în marea încizură a dublei elice ADN și interacționează cu alți factori de transcripție, controlând inițierea transcripției. Toate aceste proteine transcripționale conțin un domeniu de fixare la ADN prin intermediul cărora proteina recunoaște atât genele "țintă" cât și regiunile de reglare ale acestora și un domeniu prin intermediul căruia interacționează cu alți factori de transcripție pentru a regla transcripția. Unele proteine trans pot conține un al treilea domeniu care este un situs de fixare pentru hormoni, ioni etc.

Fiecare genă posedă "un sistem de reglare" alcătuit din mai mulți factori transcripționali care nu sunt însă specifici unei singure gene. Numărul lor este mic dar acțiunea particulară este produsă prin combinația specifică a anumitori factori trans și elemente / secvențe cis. Situația este comparabilă cu scrisul sau muzica, în care un număr limitat de simboluri sau sunete permite o infinitate de combinații diferite.

B. REGLAREA TRANSCRIERII CA RĂSPUNS LA SEMNALE EXTRACELULARE (“EXPRESIA INDUCTIBILĂ A GENELOR”).

O varietate de mecanisme realizează reglarea transcripțională ca răspuns la semnale (stimuli) extracelulare, numiți generic liganzi; aceștia produc o modificare temporară și reversibilă a transcripției unor gene (“expresia inductibilă a genelor”). Indiferent de mecanism, punctul final în acest tip de reglare este același: un factor de transcripție inițial inactiv este activat specific de către o cale de semnalizare și apoi se fixează la secvențele reglatoare specifice (numite elemente de răspuns) (RE) din promotorul genelor țintă, activând transcripția lor. Pentru a răspunde imediat la un stimul, factorul transcripțional necesar trebuie să fie deja prezent în celulă sub o formă inactivă. Activarea sa se poate face prin mai multe procese.

B.1. ACTIVAREA TRANSCRIPȚIEI PRINTR-UN LIGAND INDUCTIBIL (CONTROLUL HORMONAL AL TRANSCRIERII)

Hormonii hidrofobi cu moleculă mică (de exemplu, hormonii steroizi) sau unele morfogene (de exemplu, acidul retinoic) difuzează prin membrana celulelor-țintă și se fixează pe un receptor intracelular, citoplasmatic sau nuclear; ei funcționează ca factori de transcripție inductibili. Fixarea ligandului la receptor produce activarea lui; complexul ligand (hormon) receptor se fixează pe ADN la RE (elementul de răspuns) localizat în promotorul mai multor gene țintă și activează transcripția lor.

B.2. ACTIVAREA TRANSCRIERII PRIN TRANSDUCȚIA SEMNALULUI

Anumiți factori extracelulari (hormoni peptidici, citokine, neurotransmițători) pot declanșa transcripția unor gene fără a intra în celule (nu pot trece prin membrana plasmatică). Ei se fixează pe un receptor specific de pe suprafața celulei (cu activitate kinazică sau care poate activa kinaze intracelulare) care, după fixarea ligandului, își schimbă conformația spațială și devine activ; în această stare el transmite semnalul ligandului altor molecule din celulă. Prin activarea transcripției unor gene specifice, acest proces, numit transducția semnalului, joacă un rol important în controlul diviziunii celulare, creșterii și diferențierii.

3.1.4.4. REGLAREA POST-TRANSCRIPȚIONALĂ

Reglarea expresiei genelor poate avea loc și prin intermediul unor mecanisme ce pot interveni post-transcripțional, modificând calitativ sau cantitativ formarea ARNm matur. Astfel, există situații prin care, pornind de la același precursor ARN s-au format molecule ARN matur diferite.

Mai frecvent este vorba de eliminarea intronilor sau poliadenilarea alternativă, prin care o genă codifică mai multe proteine; mai rar se întâlnește “editarea” ARN. Aceste mecanisme, deseori combinate, implică recunoașterea unor secvențe specifice din ARN de către proteine sau molecule de ARN reglatoare. Vom prezenta câteva din mecanismele mai cunoscute.

A. ELIMINAREA INTRONILOR (ARN SPLICING) ȘI POLIADENILAREA ALTERNATIVE SAU DIFERENȚIALE

În unele situații, în procesul de maturare a precursorilor ARNm se elimină nu numai intronii ci și unii exoni. De asemenea, numeroase gene conțin la nivelul regiunii lor 3'UTR două sau mai multe semnale de poliadenilare și, ca urmare, pot suferi procese de adenilare alternativă, cu specificitate tisulară. In alte cazuri, eliminarea alternativă a intronilor poate să evidențieze un asemenea situs alternativ de adenilare.

În acest fel, pornind de la un produs de transcripție primar se formează mai multe molecule diferite de ARNm matur care pot sta la baza sintezei unor proteine diferite.

B. STABILITATEA PRODUSULUI DE TRANSCRIPȚIE

O moleculă procesată de ARNm trebuie să părăsească nucleul pentru a furniza matrița necesară pentru sinteza unei proteine. Spre deosebire de ARNm procariotic, al cărui timp de injumătățire este de 1-5 minute, ARNm eucariot poate să se comporte foarte diferit din punctul de vedere al stabilitații. Unii produși de transcripție sunt instabili, deoarece posedă secvențe care indică degradarea rapidă (predominant, dar nu exclusiv în regiunea 3’ netranslatată).

REGLAREA TRANSLAȚIONALĂ

Există cu certitudine o reglare translațională a procesului de sinteză a proteinelor, dar aceasta este puțin cunoscută. Totuși, având în vedere că multe tipuri de ARNm posedă un număr mai mare de codoni „metionină”, abilitatea ribozomilor de a recunoaște și a iniția sinteza de la codonul AUG corect poate să afecteze expresia produsului genic. S-au evidențiat câteva situații în care s-a demonstrat că proteina a fost inițiată de un alt codon și nu de codonul start. Acest fenomen a fost apărut la E. coli de mai multe ori, dar recent a fost observat și în moleculele ARNm eucariot.

În ultimii ani s-a dovedit un nou model de reglare a genelor, care implică și controlul exercitat de molecule ARN de dimensiuni mici, necodante. Controlul acestor molecule se poate exercita atât la nivelul translației ARNm, cât și la stabilitatea ARNm sau prin intermediul modificărilor structurale ale cromatinei.

3.1.4.6. REGLAREA POSTRANSLAȚIONALĂ

După ce a avut loc translația, proteinele suferă o serie de modificări care includ glicozilarea, acetilarea sau formarea legăturilor bisulfurice, procese care vor fi prezentate în capitolul 3.4.

Totodată, după translație și procesare, pentru a fi funcționale proteinele sunt orientate spre locul unde își vor îndeplini funcția. Anumite secvențe ale ARNm localizate la nivelul extremităților 5' si 3' (regiunile UTR) pot determina localizarea țintită a acestor molecule la nivelul anumitor compartimente ale celulelor.

Multe proteine sunt degradate rapid, în timp ce altele sunt foarte stabile. Se pare ca degradarea rapidă este semnalizată de prezența anumitor secvențe de aminoacizi.

3.2. MECANISMELE MOLECULARE ALE PROCESULUI DE TRANSLAȚIE – SINTEZA PROTEINELOR

După ce moleculele de ARNm au suferit procele de maturare acestea se deplasează în citoplasmă, unde stau la baza sintezei lanțurilor polipeptidice, alcătuite dintr-un număr de 20 de aminoacizi esențiali.

În principiu, polimerii biologici ar putea fi sintetizați prin alinierea prealabilă a subunităților într-o ordine corectă și apoi legarea simultană a acestora. Dar în celulă procesul nu are loc în acest fel. Asamblarea proteinelor este un proces care se desfășoară treaptă cu treaptă, într-o singură direcție chimică. Sinteza proteinelor începe la capătul amino-terminal și se continuă spre capătul carboxil. Există un punct specific de pornire a sintezei, iar creșterea are loc într-o singură direcție, până la un punct terminus.

3.2.1. COMPUȘI IMPLICAȚI ÎN SINTEZA PROTEINELOR

3.2.1.1. ARNm – COD GENETIC

Acizii nucleici sunt polimeri liniari, care conțin patru tipuri de unități nucleotidice. ARN conține ribonucleotide de adenină (A), citozină (C), guanină (G) și uracil (U).

Deoarece patru nucleotide nu pot specifica aranjarea liniară a 20 de tipuri de aminoacizi, după principiul un nucleoid – un aminoacid, codificarea trebuie făcută de un grup de nucleotide; codul folosit trebuie să fie capabil să specifice cel puțin 20 de variante, deci cei 20 de aminoacizi.

S-a evidențiat că unitatea de codificare este alcătuită din trei nucleotide, care constituie un codon. Astfel, din punct de vedere matematic este posibilă existența a 64 de codoni. Dintre aceștia, 61 specifică un anumit aminoacid, deci un număr de aminoacizi au mai mult decât un singur codon (Tabelul 3.3.).

Semnificația fiecărui codon este aceiași la toate organismele cunoscute, ceea ce subliniază originea lor comună.

Tabelul 3.3. Semnificația codului genetic

Abrevieri pentru aminoacizi

ala  (A)   –   alanina                       gly (G)   –   glicina                        pro (P)   –   prolina

arg  (R)   –   arginina                      his (H)   –   histidina                      ser (S)   –   serina

asn (N)   –   asparagina                  ile (I)     –   isoleucina                     thr (T)   –   treonina

asp (D)   –   acidul aspartic            leu (L)   –   leucina                          trp (W)  –   triptofanul

cys  (C)   –   cisteina                       lys (K)   –   lizina                            tyr (Y)   –   tirozina

gln  (Q)   –   glutamina                   met (M) –   metionina                     val (V)   –   valina

glu  (E)   –   acidul glutamic           phe (F)  –   fenilalanina                   X       –   stop 

Codul genetic are o serie de caracteristici care asigură desfășurarea în condiții optime a procesului de sinteză a proteinelor.

Codul genetic este triplet deoarece 3 este prima putere a lui 4 (cele patru tipuri de nucleotide) care formează 64 de combinații, suficiente pentru cei 20 de amino acizi care se găsesc în structura proteinelor.

Codul genetic are un codon inițiator (AUG) și trei codoni stop (UAA, UAG, UGA), care reprezintă semnalele de început și de finalizare a sintezei lanțului polipeptidic. Codonii stop sunt numiți și "codoni nonsens" deoarece nu codifică nici un aminoacid. Ceilalți 61 de codoni sunt "codoni  sens" ce codifică cei 20 de aminoacizi.

Codul genetic este degenerat (redundant) deoarece mai mulți codoni  codifică un același  aminoacid – "codoni sinonimi".

Cu excepția metioninei și triptofanului, care sunt codificați de un singur codon, ceilalți 18 amino acizi sunt codificați de 2-6 codoni (deseori deosebiți prin al treilea nucleotid).

Degenerescența nu s-a stabilit la întâmplare deoarece aminoacizii cei mai reprezentați în proteine sunt cei care posedă cei mai mulți codoni și reprezintă un avantaj pentru celulă, deoarece unele mutații genice ce produc codoni sinonimi  nu modifică proteina codificată de genă (mutații silențioase).

Codul genetic este nesuperpozabil, deoarece codonii vecini nu au un nucleotid comun și fără semne de punctuație, deoarece codonii sunt adiacenți, definiți de simpla grupare de câte trei. În cazul în care are loc inserția sau delecția unui număr de 1 sau 2 nucleotide cadrul de citire este modificat, iar proteina sintetizată va avea o succesiune total diferită de aminoacizi.

Codul genetic este lipsit de ambiguitate întrucât un codon semnifică întotdeauna un anumit aminoacid, totdeauna același.

Codul genetic este universal, același la toate organismele, bacterie, plantă, animal sau om. În cazul mitocondriilor din celulele animale au fost identificate diferențe ale codului genetic.

Universalitatea codului genetic are o importanță deosebită în domeniul manipulării genomului sau al ingineriei genetice, deoarece o genă umană introdusă într-o celulă bacteriană, sau o genă bacteriană introdusă în genomul unei plante vor conduce la sinteza unei proteine identice cu cea din organismul de origine.

ARNt- MOLECULĂ ADAPTOR

Studiile efectuate cu privire la procesul de sinteză a proteinelor nu au evidențiat posibilitatea recunoașterii chimice directe dintre bazele acizilor nucleici și aminoacizii specifici. Aceasta înseamnă că tripletele de baze din ARNm nu pot selecta aminoacizii în mod direct. Pentru aceasta, sistemele celulare de sinteză proteică folosesc o categorie de molecule adaptor, reprezentate de ARN de transport (ARNt).

Moleculele de ARNt au rolul de traducători, deoarece ele produc translația informației codificate de un codon, într-un aminoacid. Acest lucru este posibil pentru că ARNt conține anticodonul pentru un anumit aminoacid, iar pe de altă parte, pentru că se leagă specific de acest aminoacid (Fig 3.17).

Fig. 3.17 Relația de asociere a unui codon cu un anticodon

Moleculele de ARNt sunt scurte (70-80 de nucleotide) și au o conformație spațială particulară. Secvența de nucleotide la toate tipurile de ARNt (pentru toți aminoacizii) se termină la capătul 3’cu tripletul CCA, iar aminoacidul se leagă la adenozina teminală a acestui triplet. O buclă a moleculei de ARNt conține un triplet de baze care se împerechează prin complementaritate cu codonul de pe ARNm, specific pentru aminoacidul pe care îl poartă legat.

Ribozomii, situsul de sinteză a proteinelor

Translația ARNm în proteine necesită un dispozitiv molecular complex, care se deplasează de-a lungul ARNm, recunoaște complexele ARNt – aminoacid, le așează pe poziție, după care leagă aminoacizii între ei pentru a forma un lanț polipeptidic. Un astfel de dispozitiv este constituit de către ribozom.

În celulele eucariote subunitățile ribozomale se formează prin asocierea ARNr proaspăt transcris cu proteinele ribozomale, care au fost transportate în nucleu după sinteza lor în citoplasmă. Când sinteza precursorilor ribozomali este terminată în nucleu (mai precis în nucleol), ele se deplasează în citoplasmă, prin intermediul porilor nucleari.

După deplasarea în citozol, precursorii subunităților ribozomale se asociază cu proteine și se împachetează în structuri foarte ordonate, proteinele reprezentând aproximativ jumătate din masa ribozomilor.

Fiecare compartiment subcelular în care are loc sinteza proteinelor conține ribozomii proprii. Astfel, celulele vegetale conțin trei tipuri diferite de ribozomi: citoplasmatici, plastidiali și mitocondriali. Toți ribozomii sunt alcătuiți din cele două subunități – subunitatea mică și subunitatea mare. În funcție de tipul celulei sau al compartimentului celular în care are loc sinteza, subunitățile ribozomale au o componența diferită (Tabelul 3.4).

Tabelul 3.3 Compoziția și proprietățile unor tipuri variate de ribozomi

Cele două subunități se asociază și disociază reversibil în timpul procesului de sinteză a proteinelor.

Subunitatea mică împerechează ARNt cu codonii de pe lanțul ARNm, în timp ce subunitatea mare catalizează formarea legăturilor peptidice care inseră aminoacidul într-un lanț polipeptidic.

Atunci când începe sinteza proteică, cele două subunități ribozomale se asociază cu o moleculă ARNm, la capătul 5’. Apoi, ribozomul se deplasează de-a lungul ARNm traducând secvența nucleotidică în secvența unui aminoacid. Ribozomul utilizează ARNt ca adaptori pentru a adăuga fiecare aminoacid în poziție corectă, la capătul lanțului polipeptidic. În final, când sinteza este terminată cele două subunități ale ribozomului se disociază.

Un ribozom conține patru situsuri de legare pentru moleculele implicate în sinteza proteinelor: unul pentru molecula de ARNm și trei numite A, P și E pentru ARNt – A, de la aminoacil-ARNt, P de la peptidil și E – ieșire (exit).

O moleculă de ARNt este menținută în situsurile A sau P numai dacă anticodonul său se împerechează cu un codon complementar de pe molecula ARNm legată la ribozom (Fig. 3.18).

Fig. 3.18 Reprezentarea grafică a unui ribozom, cu situsurile specifice de legare

3.2.2. MECANISMUL REACȚIEI DE SINTEZĂ A PROTEINELOR

3.2.2.1. REACȚIA DE ACTIVARE A AMINOACIZILOR ȘI SPECIFICITATEA DE AMINOACID

În prima etapă a sintezei proteice, care are loc în citozol, cei 20 de aminoacizi care servesc drept unități constituiente pentru proteine sunt esterificate cu ARNt corespunzători prin acțiunea unei clase de enzime, numite sisteme de activare a aminoacizilor, sau mai precis aminoacil-ARNt sintetaze, fiecare dintre ele fiind înalt specifică pentru un anumit aminoacid și pentru ARNt corespunzător.

În prima etapă molecula ATP reacționează cu aminoacidul și are loc eliminarea pirofosfatului, formându-se un intermediar legat de enzimă – aminoacil-acid adenilic. La acest intermediar, gruparea carboxil a aminoacidului este legată, printr-o legătură de tip anhidridă de gruparea 5’-fosfat din AMP; legătura macroergică anhidridică activează gruparea carboxil a aminoacidului.

În a doua etapă, gruparea aminoacil este transferată de pe AMP la capătul 3’ al ARNt corespunzător aminoacidului, urmată de eliberarea produșilor, un aminoacil-ARNt și acidul adenilic ((Fig. 3.19).

Gruparea aminoacil este esterificată prin carboxilul ei activat cu gruparea 2’ – hidroxi liberă a AMP terminal de la capătul 3’ al moleculei de ARNt și anume acela care poartă secvența terminală CCA.

Aminoacil ARN sintetazele sunt foarte specifice atât față de aminoacid cât și față de ARNt corespunzător. Acest lucru este foarte important pentru că, după ce aminoacil – ARNt s-a format, el este recunoscut numai prin tripletul anticodon din ARNt și nu prin restul de aminoacid.

Fig. 3.19 Reacția de activare a aminoacizilor, înainte de a avea loc încorporarea lor în lanțul polipeptidic

Deci, aminoacil ARNt sintetazele trebuie să posede două locuri foarte specifice de legare, unul penru aminoacid și unul pentru ARNt corespunzător și de asemenea un loc pentru legarea ATP.

Aceste enzime au o capacitate atât de mare de a deosebi diferiți aminoacizi naturali între ei, încât șansa unei erori în condițiile normale intracelulare este de 1:10.000.

3.2.2.2. INIȚIEREA LANȚULUI POLIPEPTIDIC

Procesul de inițiere este un proces complex, care are loc în mai multe etape și necesită participarea a trei proteine specifice, numite factori de inițiere (FI -1, FI-2, FI-3).

Mai întâi subunitatea mică formează un complex cu FI-3, care apoi se leagă de ARNm. La acest complex se adaugă o moleculă de FI-1. Apoi f Met-ARNt și GTP se leagă de FI-2 și complexul rezultat se combină cu complexul format de subunitatea 30S, FI-3, ARNm și FI-1 pentru a da naștere la o structură denumită complex de inițiere.

Complexul de inițiere se combină apoi cu subunitatea ribozomală mare, pentru a forma ribozomul complet, funcțional. În acest proces GTP-ul este hidrolizat la GDP și fosfat, iar cei trei factori de inițiere se disociază apoi de pe ribozom.

Este de presupus faptul că acest proces de inițiere mai sofisticat este necesar pentru a face ca aminoacil-ARNt de ințiere să se lege la situsul peptidil dispus în dreptul codonului de inițiere AUG, astfel încât ribozomul să înceapă translația la punctul corect de pe ARNm. Factorii de inițiere sunt utilizați în permanență pentru a iniția noi lanțuri.

S-a stabilit că translația codonilor din ARNm are loc în direcția 5’ → 3’; astfel, situsul P (peptidil) și A (aminoacil) de pe ribozom recunosc polaritatea lanțului ARNm.

CICLUL DE ELONGAȚIE

Elongația, sau alungirea lanțului are loc atunci cînd aminoacil-ARNt se leagă la situsul peptidil, poziționat pe codonul său de pe ARNm, având situsul A liber. Procesul de elongație decurge în trei etape principale:

Legarea noului aminoacil-ARNt

În prima etapă, noul aminoacil-ARNt este așezat pe situsul aminoacil (A); la început, noul aminoacil-ARNt se leagă de o proteină citoplasmatică specifică. În cazul celulelor procariote acest factor, denumit factor de elongație T, conține două subunități FE-Ts și FE-Tu. Factorul de elongație se combină cu GTP pentru a forma complexul FE-Tu-GTP se leagă apoi de aminoacl-ARNt pentru a forma complexul ternar FE-Tu-GTP-aminoacil-ARNt. Acest complex se leagă la ribozom, astfel încât aminoacil-ARNt să fie așezat pe situsul A, cu anticodonul său legat prin legături de hidrogen de codonul corespunzător din ARNm. În același timp, GTP este hidrolizat la GDP și P. GDP părăsește ribozomul sub formă de complex FE-Tu-GDP. Se pare că energia furnizată prin hidroliza GTP servește pentru a poziționaea corectă a aminoacil-ARNt pe situsul A.

Formarea legăturii peptidice (Fig 3.20)

Având f Met- ARNt pe situsul P și aminoacil – ARNt nou legat pe situsul A, prima legătură peptidică se formează printr-un atac nucleofil al grupării amino a aminoacil-ARNt asupra atomului de carbon de la gruparea carboxilică esterificată a f-Met-ARNt. Această reacție este catalizată de peptidil-transferază, care este prezentă pe subunitatea 50S a ribozomului.

Produsul de reacție este un dipeptidil – ARNt legat de situsul A ARNt liber rămâne legat de situsul P. La formarea noii legături peptidice nu este necesară intervenția GTP sau ATP, legătura făcându-se probabil pe socoteala energiei legăturii esterice dintre N – formilmetionină și ARNt .

Deși această descriere se referă la formarea primei legături peptidice a unui lanț polipeptidic, un proces identic are loc la fiecare ciclu de elongație.

Translocația

După formarea legăturii peptidice, peptidil ARNt, care tocmai a fost alungit cu încă o unitate, este legat încă de situsul A, poziționat în dreptul codonului corespunzător aminoacidului nou adăugat. Acum, în a treia etapă a ciclului de elongație ribozomul se deplasează la următorul codon de pe ARNm și mută, în același timp, peptidil – ARNt de pe situsul A pe situsul P.

Această translocație este un proces destul de complex, care are loc într-o succesiune de etape. O proteină specifică, numită factor de elongație G (FE – G) cât și GTP sunt necesare în această etapă.

La început, GTP se leagă de FE – G și complexul rezultat se leagă de ribozom. GTP este apoi hidrolizat la GDP și Pi. Această hidroliză pune la dispoziție energia necesară pentru realizarea unei modificări conformaționale care deplasează ribozomul la următorul codon de pe ARNm și trece peptidil – ARNt de pe situsul A pe situsul P. Situsul A este acum liber, cu un nou codon în poziție, gata să primească un nou aminoacil – ARNt declanșându-se astfel un nou ciclu de elongație. După etape de translocație FE – G disociază de pe ribozom.

Suita de evenimente din ciclul de elongație necesită o topologie înalt specifică a locurilor de legare a peptidil – ARNt , aminoacil – ARNt, ARNm , factori de elongație și GTP. Este de presupus că ribozomul trece printr-o serie de modificări specifice complexe ale formei sale în timpul fiecărui ciclu de formare a unei legături peptidice. Pare ca și cum ARNm ar aluneca printr-un șanț sau tunel din ribozom (aprox. 25 nucleotide/ribozom).

3.2.2.4. TERMINAREA LANȚULUI POLIPEPTIDIC

Completarea unui lanț polipeptidic și detașarea sa de pe ribozom necesită etape speciale. Terminarea sintezei lanțului polipeptidic este semnalată de unul din cei trei codoni de terminare (codoni stop) de pe ARNm . După ce ultimul rest de aminoacid, care este cel carboxil terminal a fost adăugat lanțului polipeptidic de pe ribozom, polipeptidul este încă atașat covalent prin gruparea sa carboxil – terminală la ARNt , care se află pe situsul A de pe ribozom. Desprinderea polipeptidil – ARNt de pe ribozom este inițiată de trei proteine numite factori de desprindere notați cu R1 , R2 și P3 . Aceștia se leagă de ribozom pentru a produce trecerea polipeptidil – ARNt de pe situsul A pe situsul P.

Legătura esterică dintre lanțul polipeptidic și ultimul ARNt este apoi hidrolizată, prin acțiunea unei peptidiltransferaze, a cărei acțiune catalitică și specificitate pare să fie modificată de factori de desprindere legați de ribozom.

O dată ce polipeptidul este desprins sunt eliberați și ultimul ARNt și ARNm . Ribozomul liber 70S se disociază în subunitățile sale 50S și 30S , proces care necesită prezența unuia dintre factorii specifici de inițiere și sinteza unui nou lanț polipeptidic poate începe.

3.3. MECANISMELE MOLECULARE DE MODIFICARE POSTRANSLAȚIONALĂ

Pentru a-și putea îndeplini funcțiile în celule, lanțurile polipeptidice sintetizate trebuie să se plieze în conformații tridimensionale distincte și uneori, mai multe lanțuri polipeptidice trebuie să se asambleze într-un complex funcțional. Apoi, multe proteine suferă modificări ulterioare care sunt foarte importante pentru funcționarea și localizarea lor corectă în celulă:

Plierea sau împachetarea lanțurilor polipeptidice;

Maturarea lanțurilor polipeptidice, care constă în clivarea unor secvențe, sau atașarea unor grupări (oligozaharide sau lipide).

3.3.1. MATURAREA LANȚURILOR POLIPEPTIDICE

Clivarea lanțului polipeptidic, proteoliza este o etapă importantă în maturarea multor proteine. De exemplu, metionina inițiatoare, de la capătul amino al multor polipeptide este înlăturată prin proteoliză, imediat după ce capătul NH2 iese din ribozom. De asemenea, secvențele semnal care orientează lanțurile polipeptidice spre destinații intracelulare precise sunt îndepărtate după ce și-au îndeplinit funcția.

Glicozilarea constă în modificarea proteinelor prin adiția oligozaharidelor, fiind un proces specific celulelor eucariote. Glicoproteinele astfel rezultate sunt de obicei secretate sau localizate pe suprafața celulei, dar există și unele proteine nucleare și citozolice glicozilate.

După situsul de atașare al lanțului lateral glucidic, glicolipidele pot fi clasificate în N- linkate sau O-linkate. În glicoproteinele O-linkate, atomul de oxigen din catena laterală a serinei și treoninei este situsul pentru atașarea oligozaharidului. În glicoproteinele N-linkate, oligozaharidul este atașat la atomul de azot din catena laterală a asparaginei.

Glicoproteinele situate pe suprafața celulară au grupările glucidice orientate spre exterior, având rol în semnalizarea celulară.

Atașarea lipidelor la proteinele asociate pe fața citozolică a membranei plasmatice a celulelor eucariote. Procesul poate fi realizat prin trei mecanisme:

N-miristoilarea, în care acidul miristic este atașat la un rest de glicină N-terminal.

Prenilarea, care permite atașarea unor lipide specifice la atomii de sulf din catenele laterale ale resturilor de cisteină localizate lângă capătul C-terminal al lanțului polipeptidic. În acest mod sunt modificate numeroase proteine asociate cu membrana plasmatică, implicate în controlul creșterii și diferențierii celulare.

Palmitoilarea constă în adaosul acidului palmitic la atomii de sulf ai catenelor laterale ale resturilor de cisteină, permițând astfel asocierea unor proteine pe fața internă a membranei plasmatice.

3.3.2. PLIEREA, ÎMPACHETAREA LANȚURILOR POLIPEPTIDICE

Conform principiului clasic al împachetării proteinelor, toată informația necesară pentru ca o proteină să adopte conformația tri-dimensională corectă este furnizată de secvența sa de aminoacizi. În plus, există macromolecule specializate, care facilitează plierea corectă a lanțurilor polipeptidice. Acestea pot fi chaperone (însoțitori moleculari) sau enzime.

Chaperonele, sau însoțitorii moleculari au rolul de a facilita plierea corectă a altor proteine. Astfel, chaperonele stabilizează lanțurile polipeptidice deja formate în timpul transportului lor spre organite celulare.

Ele stabilizează lanțurile polipeptidice în formare, a căror translație se desfășoară încă la nivelul ribozomilor. Legarea chaperonelor menține porțiunea aminoterminală a lanțului polipeptidic într-o conformație nepliată, până când restul lanțului polipeptidic este sintetizat, iar proteina se poate plia corect. Totodată chaperonele mențin proteinele nepliate, pentru a media transportul lor prin canale transmembranare specifice.

Termenul de chaperonă a fost utilizat pentru prima dată pentru o proteină, nucleoplasmina care se leagă la histone și mediază asamblarea acestora în nucleozomi, fără ca nucleoplasmina să fie încorportă în structura nucleozomului final. Dar chaperonele au, pe lângă un rol de catalizator mediator al plierii proteinelor, deoarece ele asistă procesul de autoasamblare al lanțurilor polipeptidice.

Una dintre cele mai cunoscute molecule însoțitor este HSP (heat shock protein), prezentă în toate celulele. Sinteza multor proteine HSP este inițiată ca răspuns la un șoc termic, probabil pentru a preveni împachetarea greșită, sau pentru a repara proteinele împachetate greșit.

Astfel de proteine pe lângă implicarea în translocare și împachetare mai îndeplinesc și alte funcții în transportul proteinelor prin membrane.

Membri familiei Hsp 60 (numiți chaperonine) facilitează plierea proteinelor în conformațiile lor native. O chaperonină are 16 subunități, aranjate sub forma a două inele. Lanțurile polipeptidice sunt protejate de citozol prin legarea în interiorul cavității centrale a cilindrului chaperoninei. În acest mediu izolat are loc plierea corectă a lanțurilor polipeptidice, proces care este însoțit de hidroliza ATP. Energia furnizată de hidroliza ATP este folosită pentru desfășurarea proceselor de eliberare și reatașare a regiunilor nepliate ale lanțului polipeptidic la chaperonină, permițând plierea gradată a ppolipeptidului în conformația corectă.

Enzimele implicate în împachetarea corectă a lanțurilor polipeptidice catalizează ruperea și refacerea unor legături specifice.

Astfel, protein disulfid izomeraza catalizează ruperea și refacerea legăturilor disulfurice între resturile de cisteină, permițând plierea corectă (Fig. 3.21).

Legăturile disulfurice sunt specifice proteinelor de secreție și pentru unele proteine membranare. Formarea legăturilor disulfurice în citozol nu este posibilă datorită agenților reducători care mențin resturile de cisteină în forma lor redusă. Legăturile S-S se formează în reticulul endoplasmatic deoarece aici se menține un mediu oxidant.

Fig. 3.21 Acțiunea protein disulfid-izomerazei (PDI) în procesul de rearanjare a legăturilor disulfurice

Peptil prolil izomeraza este cea de-a doua enzimă implicată în plierea proteinelor. Ea catalizează izomerizarea legăturilor peptidice care implică resturi de prolină. Peptidil prolil izomeraza catalizează izomerizarea între configurațiile cis și trans ale legăturilor peptidice prolil, care ar putea constitui o etapă limitativă în plierea proteinelor.

3.3.3. REGLAREA FUNCȚIILOR PROTEINELOR

Enzimele catalizează aproape toate reacțiile biologice. Reglarea activității enzimatice se realizează parțial la nivelul expresiei genice, care determină cantitatea oricărei enzime sintetizată în celulă. Dar există și sisteme de reglare a funcțiilor proteinelor deja sintetizate, după cum urmează :

REGLAREA PRIN MOLECULE MICI

Enzimele pot să-și modifice conformația prin legarea unor molecule mici, cum ar fi aminoacizii sau nucleotidele și în acest fel activitatea lor enzimatică va fi alterată. De exemplu, produșii finali ai multor căi biosintetice inhibă enzimele care catalizează primul pas al sintezei lor și astfel se asigură o cantitate adecvată de produs și se împiedică sinteza acestuia în cantități excesive

Acest tip de inhibare poartă numele de reglare alosterică, în care molecula reglatoare se leagă necovalent la un situs de pe enzimă, care este diferit de situsul catalitic.

Un alt tip de mecanism de control a activităților celulare intracelulare este legarea GTP. De cele mai multe ori forma legată de GTP a proteinelor reprezintă forma lor activă, în schimb forma legată de GDP reprezintă conformația inactivă. În celule are loc un schimb permanent între GTP și GDP atașate la proteine, în funcție de necesitățile de moment ale celulei.

REGLAREA PRIN MODIFICĂRI COVALENTE

Unele enzime sunt reglate prin clivarea proteolitică a precursorilor inactivi. Proteoliza este un proces ireversibil, constituind un mod covalent de reglare a activității enzimatice.

Un alt exemplu de modificare covalentă a proteinelor este fosforilarea. Fosforilarea este un proces rapid de activare sau inhibare a activității unor proteine celulare ca răspuns la stimuli externi.

Fosforilarea proteică este catalizată de protein kinază, care transferă grupările fosfat de la ATP la grupările hidroxil ale catenelor laterale ale serinei, treoninei sau tirozinei.

Fosforilarea proteică este reversibilă datorită proteinfosfatazelor care catalizează hidroliza resturilor de aminoacizi fosforilați.

La fel ca protein kinazele, majoritatea protein fosfatazelor sunt specifice, fie pentru serină și treonină, fie pentru tirozină, deși unele recunosc toți cei trei aminoacizi. Prin acțiune combinată, protein kinazele și protein fosfatazele mediază fosforilarea reversibilă a multor proteine celulare.

După fosforilare, gruparea polară dar neutră din punct de vedere electric (OH) este înlocuită cu o grupare fosfat ( – PO32-), încărcată negativ. Acest schimb va conduce la modificarea structurii tridimensionale a proteinei substrat. Astfel de modificări afectează în primul rând activitatea proteinei dar pot influența și stabilitatea ei sau localizarea subcelulară.

Deci, fosforilarea/defosforilarea reprezintă un mecanism de reglare, în care proteina substrat poate fi în forma activă sau inactivă în funcție de fosforilare.

Protein kinazele și fosfatazele sunt componente importante ale căilor de semnalizare care controlează diviziunea celulară, creșterea, formarea citoscheletului și metabolismul. Ele funcționează ca amplificatori ai semnalelor și modifică răspunsul celular la semnalele externe.

3.3.3.3. INTERACȚIUNILE PROTEINĂ – PROTEINĂ

Subunitățile componente ale unor proteine sunt lanțuri polipeptidice identice. Alte proteine conțin două sau mai multe polipeptide distincte.

Interacțiunile dintre lanțurile polipeptidice sunt importante în reglarea activității proteice. Astfel, la multe enzime alosterice legarea unei molecule reglatoare alterează conformația proteică, prin modificarea interacțiunilor dintre subunități.

3. 4. PROCESELE DE PRELUCRARE POST-TRANSLAȚIONALE

Aproape toate proteinele unei celule eucariote sunt codificate de ADN nuclear și sintetizate de ribozomii citozolici, care pot să fie atașați la membrana RE sau nu. Totuși, proteinele codificate de ADN cloroplastic și mitocondrial (aproximativ 100) sunt sintetizate de ribozomi în interiorul acestor organite și încorporate direct în compartimentul organitului respectiv.

Proteinele sintetizate în citoplasmă trebuie să se deplaseze spre o destinație specifică, care este indicată de un domeniu de localizare specific. Domeniile de localizare sunt de obicei peptide scurte, dar pot fi și oligozaharide ca în cazul hidrolazelor lizozomale din celulele mamiferelor. Domeniile de localizare sunt de obicei localizate la capătul aminoterminal al proteinei, alteori pot să fie localizate la capătul carboxil, sau chiar în mijlocul lanțului polipeptidic.

Domeniul de localizare este esențial pentru transportul proteinei, dar de obicei nu face parte din forma activă a proteinei. De aceea, după atingerea destinației aceste domenii sunt clivate de proteaze specifice dând naștere proteinei active, mature.

În cazul proteinelor care rămân în citozol (ex. actina, tubulina) nu sunt prezente domenii de localizare dar există domenii informaționale care permit monomerilor să dea naștere unei structuri organizate.

Pentru a pătrunde într-un anumit compartiment celular este necesar ca proteinele să traverseze membrana acestuia. Majoritatea proteinelor posedă suprafețe hidrofilice și de aceea ele nu pot să traverseze direct miezul hidrofob al biomembranelor. Această traversare are loc prin intermediul unor proteine transmembranare care funcționează ca proteine transportoare sau proteine canal prin care proteina trebuie să treacă într-o configurație neîmpachetată. Pentru a se menține în formă neîmpachetată lanțul polipeptidic se asociază cu proteine însoțitoare, (chaperone). Acestea stabilizează structura lanțului polipeptidic neîmpachetat, ușurând astfel traversarea membranei. Alte tipuri de chaperone se leagă de lanțul polipeptidic după ce acesta a traversat membrana, asigurând împachetarea corectă. (Fig. 3.22).

Fig. 3.22 Stabilizarea lanțului polipeptidic, cu proteine chaperone specifice,

în vederea traversării membranei

Calea urmată de fiecare lanț polipeptidic este determinată deci de domeniile de localizare, care permit sortarea proteinelor în mai multe etape. Primul eveniment de sortare a proteinelor le separă în două grupuri.

Proteinele din prima categorie sunt sintetizate pe ribozomii liberi din citoplasmă și pot să rămână în acest compartiment sau să fie dirijate spre alte compartimente în funcție de secvențele semnal specifice – plastide, mitocondrii, peroxizomi și nuclei (Fig. 3.23. A).

Proteinele din cel de-al doilea grup sunt orientate spre RE datorită prezenței unei secvențe semnal specifice, localizate la capătul amino terminal. Translația acestei molecule semnal face ca ribozomul să se atașeze la RE în timpul sintezei proteice. RE la care s-au atașat ribozomii este denumit RE rugos. Proteinele astfel sintetizate sunt proteinele care urmează calea secretorie, adică sunt eliminate din celulă sau sunt orientate spre diferite compartimente cum ar fi: perete celular, plasmalemă, vacuole și tonoplast (Fig. 3.23, B).

Fig. 3.23 Sortarea proteinelor în funcție de destinație

3.4.1. CALEA TRANSPORTULUI POST-TRANSLAȚIONAL

Calea transportului post-translațional este urmată de proteinele sintetizate pe ribozomii liberi, care nu se atașează la membrana reticulului endoplasmatic (RE). Aceștia sunt denumiți ribozomi liberi, deși uneori ei sunt asociați cu citoscheletul. Cu ajutorul acestor ribozomi sunt sintetizate atât proteine solubile cât și proteine membranare, care vor fi orientate spre nucleu, mitocondrii, cloroplaste sau peroxizomi.

3.4.1.1. PROTEINELE LOCALIZATE ÎN CITOPLASMĂ

În cazul sintezei unor astfel de proteine în lanțul polipetidic nu sunt prezente domenii de localizare. Proteinele sunt sintetizate pe ribozomii liberi aflați în citoplasmă, iar după finalizarea sintezei sunt împachetate astfel încât să-și îndeplinească funcția specifică. De exemplu, monomerii actinici sunt sintetizați pe ribozomii liberi aflați în citozol, iar după sinteză se asamblează dând naștere filamentelor de actină.

3.4.1.2. PROTEINELE LOCALIZATE ÎN PLASTIDE

Deși plastidele conțin propriul lor ADN și ribozomi, majoritatea proteinelor sunt codificate de ADN nuclear și importat din citoplasmă. Conținutul plastidelor este separat de citoplasmă prin două membrane distincte – membrana internă și cea externă. În plus cloroplastele au un sistem de membrane intern–membranele tilacoide. Cele trei membrane definesc trei compartimente apoase: spațiul intermembranar, stroma și lumenul tilacoid. Fiecare compartiment apos și fiecare membrană conțin proteine specifice, unice. Localizarea proteinelor într-un anumit compartiment necesită prezența a două domenii de localizare: primul, care orientează proteina spre cloroplaste și cel de-al doilea care asigură localizarea precisă în compartimente.

Proteinele sintetizate pe ribozomii liberi, care sunt apoi orientate spre cloroplaste posedă un domeniu de localizare cloroplastică, denumit peptidă de tranzit. Această peptidă de tranzit este localizată la capătul amino al proteinei și este alcătuită din 40-50 de aminoacizi, având rol atât în orientare cât și în procesul de translocare prin învelișul cloroplastului. După translocarea prin învelisul cloroplastului peptida de tranzit este eliminată de către o peptidază.

Peptidele de tranzit sunt necesare și suficiente pentru importul în cloroplaste. Proteinele care nu au o peptidă de tranzit nu pot fi importate iar dacă o peptidă tranzit este adăugată la capătul amino al unei proteine străine cloroplastului aceasta va fi importată.

Mecanismul după care are loc translocarea proteinelor prin învelișul cloroplastic

Importul proteinelor în cloroplaste are loc prin intermediul unor canale transmembranare care apar la locul de contact dintre cele două membrane. Astfel precursorii proteici străbat ambele membrane, pătrunzând în stroma mitocondrială. Până în prezent nu se cunoaște sigur dacă peptida de tranzit interacționează inițial cu receptori proteici sau cu lipide din membrana externă. Este posibil ca ambele interacțiuni să apară. Proteinele destinate să ajungă în membrana externă a cloroplastului nu intră prin canalul de transport ci pătrund în membrană direct din citozol.

Înainte de a traversa canalul transmembranar precursorii proteici se asociază cu chaperone, care împiedică împachetarea și ușurează pătrunderea prin canalul transmembranar.

După pătrunderea proteinei în stromă peptida de tranzit este eliminată de către o peptidază.

O dată aflat în interiorul cloroplastului polipeptidul are câteva posibilități (Fig. 3.24):

Fig. 3.24 Mecanismul de import al proteinelor în cloroplaste

Dacă proteina rămâne în stromă o chaperonă complexă, de dimensiuni mari (alcătuită dintr-o subunitate mare HSP 60 și o subunitate mică HSP 10 kDa) va ajuta la împachetare într-un proces dependent de ATP (Fig. 3.24, calea 1).

Dacă proteina va fi localizată în membrana cloroplastică internă ea va fi orientată spre această membrană de către o secvență semnal specifică, care devine activă după eliminarea peptidazei de tranzit (nu se evidențiază în figură).

Dacă proteinele fac parte din alcătuirea membranei tilacoide, după eliminarea peptidei de tranzit se activează o secvență semnal de care se leagă o particulă de recunoașterea semnalului (SRP). Complexul alcătuit din proteină și secvența de recunoaștere a semnalului este orientat spre membrana tilacoidă. Procesul necesită GTP (Fig. 3.24 Calea 2, particula SRP nu este evidențiată).

In cazul proteinelor care funcționează în lumenul tilacoid, după eliminarea peptidai semnal se activează un domeniu de localizare lumenală și totodată proteina se asociază cu chaperone specifice, care împiedică împachetarea. În această formă proteina este orientată spre tilacoizi. În membrana tilacoidă există canale transmembranare care permit transferul proteinelor care posedă semnal de localizare lumenală (Fig. 3.24, calea 3).

Importul în cloroplaste poate fi studiat prin reconstituirea procesului într-o cultură de celule sau cu ajutorul plantelor modificate genetic.

Procesul necesită chaperone pe ambele fețe ale învelișului cloroplastic și un grup de proteine denumite aparat de import proteic Acest aparat străbate ambele membrane la locul în care ele vin în contact. Ambele etape necesită energie provenită din hidroliza ATP.

În prima etapă chaperonele citozolice mențin proteinele într-o formă nepliată. Peptida de tranzit de pe aceste proteine interacționează cu lipidele membranei externe sau cu proteinele din aparatul de import, care formează canalul transmembranar prin care are loc importul. În timpul anilor 90 cercetătorii au identificat câteva proteine care fac parte din aparatul de import și au obținut ADNc care le codifică. Aceste componente au fost denumite Toc (translocon of the outer envelope membrane of the chloroplast). Două dintre aceste proteine Toc 34 și Toc 159 sunt proteine dependente de GTP strâns ancorate în membrana externă, cu domeniul care leagă GTP orientat spre citozol. O a treia proteină, Toc 75, care este de asemenea adânc împlântată în membrana externă, are o secvență care nu prezintă omologie cu nici o proteină cu funcție cunoscută identificată până în prezent. A patra proteină, HSP 70 IAP ( import intermediate – associated protein) un omolog al proteinei HSP 70 prezintă caracteristicile biochimice ale unei proteine membranare integrale. Interacțiunea precisă a acestor proteine și implicarea lor în procesul de transport nu este încă bine înțeleasă. Numai o componentă a sistemului de translocare din membrana internă a fost identificată până acum.

3.4.1.3. PROTEINELE LOCALIZATE ÎN MITOCONDRII

Mitocondriile sunt prezente în aproape toate celulele eucariote. La fel ca și cloroplastele, posedă o membrană internă și o membrană externă, care delimitează două compartimente și anume spațiul intermembranar și matrixul mitocondrial.

Fiecare membrană și fiecare compartiment posedă un set unic de proteine, similar cu celelalte organite. Enzimele care alcătuiesc lanțul de transport al electronilor se găsesc în membrana internă, pe când majoritatea enzimelor care alcătuiesc ciclul acidului citric se găsesc în matrixul mitocondrial.

Mitocondriile posedă propriul ADN, ARN și sistem enzimatic de sinteză proteică. Cu toate acestea majoritatea proteinelor mitocondriale trebuie să fie importate din citozol, deoarece sunt codificate de ADN nuclear și sintetizate în citozol.

Transportul mitocondrial a fost studiat cu precădere la drojdii, dar se consideră că mecanismul de transport la plante este similar.

Majoritatea proteinelor mitocondriale sunt sintetizate sub forma unor precursori, având la capătul amino-terminal un domeniu de localizare – presecvență, care facilitează translocarea proteinelor prin ambele membrane mitocondriale. Aceste presecvențe sunt asemănătoare cu peptidele de tranzit ale proteinelor cloroplastice.

Presecvențele au structuri de helixuri cu caracter amfipatic, deoarece posedă aminoacizi hidrofobi pe una dintre fețe și resturi de aminoacizi încărcați pozitiv pe cea de-a doua latură. După ce o proteină pătrunde în matrixul mitocondrial presecvența este clivată de o peptidază, exact ca în cazul cloroplastelor.

Proteinele sunt transportate în mitocondrii neîmpachetate, fiind menținute în această formă cu ajutorul chaperonelor citozolice. Procesul de translocare a proteinelor este mediat de un aparat de import, care străbate ambele membrane la punctul de contact dintre acestea. După ce proteina a pătruns în matrix, aceasta este împachetată cu ajutorul altor chaperone.

Din nou ca la cloroplaste transportul unor proteine în membrana mitocondrială internă și în spațiul intermembranar necesită existența a două semnale. Astfel de proteine posedă o secvență de aminoacizi hidrofobici imediat după presecvență. Atunci când presecvența este eliminată de către o peptidază din matrix, secvența hidrofobică nou expusă funcționează ca un domeniu de localizare pentru a orienta proteina din matrix spre membrana internă. Proteinele destinate a face parte din membrana internă rămân fixate în aceasta, pe când proteinele care funcționează în spațiul intermembranar sunt translocate în spațiul intermembranar unde este eliminat domeniul de localizare, formându-se proteina activă.

3.4.1.4. PROTEINELE LOCALIZATE ÎN PEROXIZOMI

Peroxizomii sunt organite specializate care participă la mai multe căi metabolice fiind prezente în toate celulele eucariote. Celulele vegetale conțin cel puțin trei tipuri de peroxizomi.

Plantele tinere și frunzele senescente conțin glioxizomi, care au rol în mobilizarea trigliceridelor stocate.

Cea de-a doua categorie de peroxizomi, prezenți în frunze joacă un rol important în reacția de respirație care însoțește fixarea dioxidului de carbon în plantele C3.

A treia categorie, întâlnită la unele plante leguminoase tropicale care exportă ureide, conțin enzime unice, implicate în metabolismul azotului.

Spre deosebire de cloroplaste și mitocondrii, peroxizomii sunt mărginiți de o membrană simplă și ei nu conțin ADN sau ribozomi. În consecință toate proteinele peroxizomilor sunt sintetizate de către ribozomii liberi din citoplasmă și importate în peroxizomi.

Cel puțin două domenii de localizare PTS1 și PTS 2 sunt implicate în importul proteinelor în matrixul mitocondrial. Secvența semnal PTS1 este foarte scurtă (tripeptidă) și spre deosebire de alte domenii de localizare se găsește la capătul carboxiterminal al lanțului polipeptidic și nu este îndepărtată după translocarea în peroxizomi.

Secvența semnal PTS2 se află la capătul aminoterminal al lanțului polipeptidic, este îndepărtată după translocarea proteinei în matrixul peroxizomului și marchează proteinele prezente în matrix.

Importul proteinelor în peroxizomi nu necesită numai un domeniu de localizare dar necesită de asemenea și energie furnizată de hidroliza ATP-ului.

Deși transportul unor proteine care conțin secvențele PTS1 necesită factori citozolici, cum ar fi membri ai familiei Hsp 70 nu se cunoaște încă dacă pentru transportul unor proteine în peroxizomi sunt necesare chaperonele.

3.4.1.5. PROTEINELE LOCALIZATE ÎN NUCLEU

În funcție de dimensiunile lor, moleculele pot traversa complexul porului nuclear prin două mecanisme.

Moleculele mici (sub 40 KDa) difuzează activ prin cele opt canale deschise, cu diametru de 9 nm, care sunt delimitate de ansamblul spițe-inele din structura porului nuclear.

Macromoleculele (proteine, ADN) trec prin canalul central printr-un proces activ, în care proteinele specifice și ARN sunt recunoscute și transportate selectiv într-o singură direcție (Fig. 3.25).

Fig. 3.25 Tipurile de transport ale proteinelor și ARN,

prin complexul porului nuclear

Proteinele transportate în nucleu, dintre care pot fi menționate histonele, ADN polimerazele, factorii de transcripție sunt dirijate spre nucleu prin secvențe de aminoacizi specifice, denumite semnale de localizare nucleară (NLS).

Până în prezent au fost identificate două semnale majore pentru importul proteinelor în nucleu: tipul SV 40 și tipul bipartit.

Prima secvență de acest tip a fost identificată la virusul SV40, având următoarea structură : PKKKRKV. Acest tip de semnal este caracterizat de câteva resturi bazice consecutive și în multe cazuri mai conține și un rest prolinic.

Tipul bipartit are următoarea secvență de localizare nucleară (NLS): KRPAATKKAGQAKKKK. Aceasta se caracterizează printr-un model alcătuit din două resturi bazice, 10 resturi distanțatoare și o altă regiune bazică, constituită din 3-5 resturi bazice.

3.4.2 CALEA TRANSPORTULUI CO-TRANSLAȚIONAL

Calea transportului co-translațional este urmată de proteinele care sunt orientate în final spre peretele celular, plasmalemă, vacuole și tonoplast, sau sunt eliminate din celulă.

Proteinele care urmează această cale sunt orientate spre reticulul endoplasmatic (RE) încă din timpul sintezei proteice, împreună cu ribozomii. După ce procesul de sinteză s-a finalizat, proteinele sunt modificate, asamblate, sortate și orientate spre destinațiile specifice.

RE care ia astfel naștere poartă numele de reticul endoplasmatic rugos. Acesta este abundent în celulele specializate în secreția proteinelor (de exemplu celulele cerealelor aleurone) sau în stocarea proteinelor vacuolare (de exemplu celulele parenchimatice ale semințelor).

Proteinele care urmează calea secretorie pot fi împărțite la rândul lor în două categorii:

Proteinele care sunt orientate spre vacuole sau spre exteriorul celulelor (perete celular și proteine de secreție) traversează membrana reticului endoplasmatic, regăsindu-se în forma lor finală în interiorul acestuia;

Proteinele integrale, care vor intra în alcătuirea plasmalemei, tonoplastului, complexului Golgii sau membranei nucleare rămân încastrate în membrana reticulului endoplasmatic (RE).

3.4.2.1. MECANISMUL DE TRANSPORT CO-TRANSLAȚIONAL AL PROTEINELOR DE SECREȚIE

În cazul proteinelor care urmează calea transportului co-translațional lanțul polipeptidic nou sintetizat posedă la capătul aminoterminal un domeniu de localizare care poartă numele de peptidă semnal, cu o lungime de 16-30 de aminoacizi, care orientează lanțul polipeptidic în formare spre membrana RE.

O peptidă semnal tipică constă din unul sau mai mulți aminoacizi încărcați pozitiv, urmați de o regiune alcătuită din 6-12 aminoacizi hidrofobici. Aminoacizii încărcați pozitiv permit interacțiunea acestei secvențe cu partea polară a membranei RE, iar aminoacizii hidrofobi preîntâmpină respingerea lanțului polipeptidic de către miezul hidrofob al membranei.

Peptidele semnal sunt similare în cazul diferitelor proteine atât în celulele vegetale cât și în cele animale și drojdii. Prin tehnologia ADN recombinat s-a dovedit că prezența acestei secvențe semnal la orice tip de proteină va conduce la orientarea ribozomului pe care are loc acea sinteză spre membrana RE.

Înainte de a se lega la RE, peptida semnal este recunoscută de o particulă de recunoaștere a semnalului (SRP) care este un complex ribonucleoproteic. Această particulă conține o moleculă mică de ARN, cu o lungime de 300 de nucleotide care leagă 6 proteine diferite, fiecare având o funcție specifică. Particula de recunoaștere a semnalului (SRP) este prezentă de obicei în citozol unde așteaptă apariția unei peptide semnal la capătul unui lanț polipeptidic care tocmai este sintetizat. Procesul de recunoaștere între peptida semnal și particula de recunoaștere a semnalului are loc atunci când polipeptidul nou sintetizat are o lungime de aproximativ 70 aminoacizi cu aproximativ 40 de aminoacizi ieșiți din ribozom. Legarea particulei de recunoaștere a semnalului (SRP) la lanțul polipeptidic în formare blochează sinteza și evită împachetarea greșită a polipeptidului deja sintetizat.

Translocarea lanțului polipeptidic prin membrana reticulului endoplasmatic (RE)

Translocarea proteinelor în lumenul RE implică particula de recunoaștere a semnalului, receptorul acestei particule și o proteină canal (complex de translocare) din membrana RE.

După ce particula de recunoaștere a semnalului (SRP) s-a legat la peptida semnal care iese din ribozom întregul ansamblu intră în contact cu receptorul SRP și se atașează la membrana RE.

Receptorul este o proteină integrală transmembranară compusă din două polipeptide dependente de GTP. O dată ce tot complexul s-a atașat la membrana RE particula de recunoaștere a semnalului disociază de pe peptida semnal, utilizând energia furnizată de hidroliza GTP-ului.

După ce SRP este eliberată în citozol, ribozomul și lanțul polipeptidic în formare se atașează la complexul de translocare care este o proteină canal transmembranară, alcătuită din trei proteine transmembranare. În continuare translația și translocarea în lumenul RE au loc simultan. În timp ce lanțul polipeptidic înaintează prin canalul transmembranar peptida semnal este clivată de către o peptidază, un complex enzimatic care se află în lumenul RE. Ca rezultat, peptida semnal nu este prezentă în proteinele vacuolare sau proteinele de secreție.

După eliminarea peptidei semnal lanțul polipeptidic pătrunde în lumenul RE, până la finalizarea sintezei, când întregul lanț polipeptidic se regăsește în lumenul RE. În timp ce are loc translația și translocația de lantul polipeptidic care crește în lumenul RE se leagă chaperoane specifice care împiedică împachetarea greșită pe parcursul sintezei (Fig. 3.26).

Fig. 3.26 Mecanismul de translocare a lanțului polipeptidic prin membrana reticulului endoplasmatic

Particula de recunoaștere a semnalului (SRP) se atașează la peptida semnal;

Întregul complex format se depasează la nivelul complexului de translocare, SRP fiind recunoscută de un receptor specific;

Lanțul polipetidic în formare străbate canalul complexului de translocare;

Peptidaza semnal clivează peptida semnal, lanțul polipeptidic ănaintând în lumenul RE;

Lanțul polipeptidic, după finalizarea sintezei se regăsește în lumenul RE.

3.4.2.2. MECANISMUL DE TRANSPORT CO-TRANSLAȚIONAL AL PROTEINELOR MEMBRANARE INTEGRALE

În această categorie se încadrează proteinele membranare integrale ale RE, complexului Golgi, tonoplastului și plasmalemei. Mecanismul urmat depinde de numărul segmentelor transmembranare ale proteinei și de orientarea acesteia.

În funcție de numărul și tipul domeniilor transmembranare posedate de către fiecare lanț polipeptidic, proteinele de membrană se împart în trei categorii.

Tipul I de proteine de membrană

În această categorie se încadrează proteinele care au un singur domeniu transmembranar, iar regiunea care rămâne localizată în citozol se află la capătul carboxi.

Peptida semnal, localizată la capătul amino, care pătrunde în lumenul RE, este clivată imediat după ce proteina începe să traverseze membrana RE. Apoi translocarea este oprită înainte de finalizarea translației, în momentul apariției unei secvențe de stopare a transferului (secvență hidrofobică) (Fig. 3.27).

Dimensiunile domeniului polipeptideic care rămâne în citozol depinde de localizarea domeniului transmembranar în interiorul proteinei.

Fig. 3.27 Mecanismul de stopare a transferului în cazul proteinelor de membrană

Tipul II de proteine de membrană

În această categorie se încadrează proteinele care au un singur domeniu transmembranar, iar domeniul care rămâne localizat în citozol se află poziționat la capătul amino al lanțului polipeptidic.

Aceste proteine nu posedă o peptidă semnal care să fie eliminată după pătrunderea în lumenul RE. Se pare că domeniul transmembranar de natură hidrofobică acționează ca o secvență semnal și direcționează integrarea proteinei în membrana RE lăsând o mare porțiune a regiunii aminoterminale în citozol. Segmentul carboxi – terminal al proteinei se găsește în lumenul RE.

În această categorie se încadrează proteinele membranare ale Complexului Golgi.

Tipul III de proteine de membrană

În această categorie se încadrează proteinele care posedă mai multe domenii transmembranare. În structura acestor lanțuri polipeptidice alternează regiuni hidrofobe, care alcătuiesc domeniile transmembranare cu regiuni hidrofile care alcătuiesc buclele de legătură. Acestea din urmă sunt poziționate fie în citozol, fie în lumenul RE (Fig. 3.28).

În cazul acestor proteine primul domeniu transmembranar acționează ca o peptidă semnal iar cel de-al doilea funcționează ca o secvență de ancorare. Al treilea domeniu acționează din nou ca o peptidă semnal, al patrulea ca o secvență de ancorare, etc. Deși atât SRP cât și receptorii pentru SRP sunt necesari pentru integrarea primului domeniu transmembranar ele nu sunt necesare pentru următoarele domenii transmembranare.

Fig. 3.28. Dispunerea celor trei tipuri de proteine de membrană

în reticulul endoplasmatic (a- tip I, b-tip II, c-tip III)

O dată ce aceste proteine sunt inserate în membrana RE ele pot să fie reținute acolo (rezidente RE) sau să fie îndreptate spre alte destinații. Până în prezent nu există cunoștințe despre domeniile care orientează proteinele spre alte destinații sau le mențin în calea de transport.

3.4.3. PRELUCRAREA PROTEINELOR ÎN LUMENUL RETICULULUI ENDOPLASMATIC

Modificările care au loc în lumenul reticulului endolasmatic permit proteinelor să se împacheteze corect și să fie orientate spre compartimentul celular în care își vor îndeplinifuncția.

Lumenul reticulului endoplasmatic conține un număr de enzime și chaperone care asigură împachetarea corectă și care au posibilitatea să degradeze polipeptidele sintetizate greșit. Astfel există certitudinea că numai proteinele corect împachetate și asamblate sunt transportate pe calea secretorie spre destinația lor finală.

Proteinele care se regăsesc în lumenul RE (proteinele orientate spre vacuole, perete celular și proteine de secreție) pot să sufere următoarele modificări:

Adoptarea conformației spațiale corecte a proteinelor care are loc fie cu ajutorul proteinelor însoțitoare (chaperoane) fie prin formarea legăturilor disulfidice între grupările SH ale resturilor cisteinice sau oligomerizarea și atașarea unor glicani N-linkați;

Glicozilarea proteinelor.

Fiecare proteină suferă o parte dintre aceste modificări, dar pot să apară și altele, după ce proteina părăsește RE. Proteinele care nu sunt corect împachetate sau asamblate pot să fie reținute în RE unde ele pot să fie distruse de proteaze.

3.4.3.1. ADOPTAREA CONFORMAȚIEI SPAȚIALE CORECTE A PROTEINELOR

Procesul este mediat de o chaperonă BiP – Binding protein (70 kDa) (care funcționează în lumenul RE și a fost descoperită în celulele animale care secretă imunoglobulină G) și alte proteine de acest tip care se află în lumenul RE.

BiP se leagă la proteina în formare sau la lanțul polipeptidic parțial împachetat, în special la acele segmente bogate în aminoacizi hidrofobici care nu sunt expuse în mod normal la suprafața unei proteine împachetate corect. Prin legarea ei, proteina BiP previne interacțiunile nespecifice ale acestor segmente, prevenind în final împachetarea incorectă. Este o enzimă dependentă de ATP (energia este furnizată de hidroliza ATP).

Multe proteine de secreție, proteine vacuolare sau proteine membranare sunt stabilizate prin legături disulfidice formate atunci când grupările SH de la cisteine sunt oxidate cu agenți de oxidare potriviți.

Totuși, lanțurile polipeptidice conțin adesea mai mult de două cisteine, și de aceea punțile disulfidice care se formează nu sunt întotdeauna cele corecte. Ruperea și reformarea legăturilor disulfidice astfel încât să se realizeze împachetarea corectă sunt catalizate de o enzimă denumită protein-disulfid-izomeraza (PDI), o enzimă prezentă în lumenul reticulului endoplasmatic.

Multe proteine nu sunt alcătuite dintr-un singur lanț polipeptidic ci sunt oligomeri cu două, trei, patru sau mai multe subunități care iau naștere în lumenul RE.

De exemplu proteinele de rezervă (vicilin și faseolin) acumulate în vacuolele de stocare sunt trimeri cu dimensiuni de 45 kDa, formați în lumenul RE. Dacă nu are loc formarea trimerilor subunitățile sunt degradate de către proteaze.

Deci mecanismele de control ale calității acționează pentru a reține proteinele în RE în timpul împachetării și asamblării și să degradeze polipeptidele defective structural care nu se pot matura corespunzător.

O parte din proteinele greșit împachetate sunt degradate chiar în lumenul RE, altele sunt translocate în citozol unde sunt degradate în proteazomi. Nu se cunoaște încă mecanismul care sortează aceste proteine și care determină locul de desfășurare a degradării.

3.4.3.2. GLICOZILAREA PROTEINELOR ÎN RETICULUL ENDOPLASMATIC

Adiția covalentă a zaharidelor la proteine este una dintre funcțiile majore ale RE. Majoritatea proteinelor din lumenul RE sunt glicozilate înainte de a fi transportate la complexul Golgi.

Reacțiile de glicozilare sunt importante pentru că produc markeri, care asigură transportul proteinelor prin diferite compartimente celulare, iar radicalii oligozaharidici asigură sortarea proteinelor și direcționarea lor corectă către alte organite celulare.

Glicozilarea N-linkată are caracteristici comune pentru toate proteinele, implicând participarea a aproximativ 50 de enzime, din trei compartimente subcelulare. Glicozilarea impune parcurgerea a patru etape importante și anume:

Sinteza lipidei purtătoare dolicol pirofosfat (dolicol -PP)

Asamblarea intermediarului oligozaharid – lipidă dolicol-PP-oligozaharid

Transferul oligozaharidului de la dolicol la enzima țintă (Fig. 3.29).

Enzima glicozil transferaza transferă gruparea oligozaharidică ancorată pe dolicol pirofosfat la un rest de asparagină prezent în protina țintă. Această reacție are loc pe fața lumenală a membranei reticulului endoplasmatic și necesită prezența secvenței de recunoaștere Asn-X-Ser/Thr. Un rest de asparagină, care nu este urmat de serină sau treonină, fiind separate de orice alt aminoacid nu va fi recunoscut de transferază.

Modificarea oligozaharidelor în lumenul reticulului endoplasmatic și în complexul Golgi

Deci, oligozaharidul precursor este legat la membrana RE prin intermediul unei molecule lipidice speciale denumite dolicol pirofosfat. Oligozaharidul este sintetizat pe acest lipid, treaptă cu treaptă după care este transferat in bloc pe asparagina unei molecule proteice.

Fig. 3.29 Mecanismul reacției de glicozilare a proteinelor în reticulul endoplasmatic

După ce prima etapă a glicozilării proteinelor a fost realizată în RE, glicoproteinele rezultate sunt împachetate în vezicule și sunt transportate prin intermediul acestora la nivelul aparatului Golgi, unde procesul este continuat și în cele din urmă finalizat.

În final, proteinele care au fost eliberate în lumenul RE, prelucrate și asamblate corect pot să se deplaseze spre alte destinații, în funcție de domeniul lor de localizare. Dacă nu au un alt domeniu de localizare ele sunt secretate în afara celulei.

Există totuși unele proteine cum ar fi BiP și protein disulfid-izomeraza care rămân în RE. Ele sunt reținute în acest compartiment prin două mecanisme și anume: datorită afinității pe care o au una față de cealaltă se leagă între ele și totodată au posibilitatea de a lega ionii de Ca2+ care se găsesc în concentratie mare in RE (datorită unor domenii cu afinitate ridicată față de Ca2+) dând astfel naștere la o rețea care nu permite eliminarea lor prin vezicule.

3.4.4. TRANSPORTUL ȘI PRELUCRAREA PROTEINELOR ÎN COMPLEXUL GOLGI

În complexul Golgi, organitul membranar cu rol în prelucrarea finală a proteinelor sunt supuse modificărilor proteinele de secreție, proteinele lizozomale și cele membranare.

3.4.4.1. PRELUCRAREA ÎN COMPLEXUL GOLGI A PROTEINELOR DE SECREȚIE

În sacii complexului Golgi are loc concentrarea produșilor de secreție sintetizați în reticulul endoplasmatic și totodată prelucrarea biochimică a acestora, care constă în glicozilarea terminală, scindarea lanțurilor polipeptidice precum și alte modificări cum ar fi sulfatarea urmată de sortare și livrare spre diferite destinații.

GLICOZILAREA

În reticulul endoplasmatic proteinele sunt glicozilate de către un singur tip de oligozaharid, în special manoza. În complexul Golgi, proteinele sunt supuse unor modificări mai complexe, formându-se două clase de oligozaharide: complexul oligozaharidic, format din N-acetilglucozamină, acid N-acetil-neuroaminic, galactoză și oligozaharide formate numai din molecule de manoză.

În realizarea glicozilării sunt implicate glicoziltransferazele și glicozidazele care sunt proteine integrale cu zona activă orientată spre interiorul sacilor membranoși. Cele mai importante enzime de acest tip sunt glicozil-transferazele și anume sial-transferaza, galactozil-transferaza și manozidazele, care îndepărtează manoza pentru adăugarea N-acetilglucozaminei.

O categorie specială de proteine, care sunt glicozilate în aparatul Golgi este reprezentată de proteogicani, la care lanțul glucidic rezultă printr-o polimerizare extensivă. Dintre proteoglicanii secretați o parte intră în componența matrix-ului extracelular, iar restul rămîn ancorate în membrana plasmatică

B. CLIVAJUL PROTEOLITIC SPECIFIC

Numeroși hormoni peptidici, enzime, sunt sintetizați în formă inactivă, sub formă de precursori. Produsul activ apare numai după proteoliza moleculei precursor, proces care începe în reticulul Golgi trans.

Se pune întrebarea de ce în unele cazuri sunt sintetizați precursori ai proteinelor. Uneori, proteinele sunt foarte mici și sinteza lor pe ribozomi nu ar fi eficientă, iar împachetarea în vezicule de secreție ar eșua. Alte proteine, cum ar fi hormonii sunt sintetizate sub această formă în reticulul endoplasmatic pentru a nu acționa asupra celulei în care sunt sintetizați. Sunt apoi modificate în complexul Golgi, după care, în forma lor activă sunt exportate sb forma unor vezicule spre celulele țintă.

C. SORTAREA PRODUȘILOR DE SECREȚIE

În compartimentele complexului Golgi are loc separarea proteinelor de secreție de enzimele lizozomale și de alte tipuri de proteine, după care sunt ambalate în membrane compatibile pentru a fuziona cu plasmalema și exportate în exteriorul celulei. Acestea pot să urmeze două căi:

Calea secretorie reglată este o cale urmată de proteinele care necesită un stimul sau un mecanism de declanșare pentru a fi secretat. Unii stimuli reglează sinteza proteinei și de asemenea eliminarea ei din celulă.

Calea secretorie constitutivă permite secretarea proteinelor care sunt necesare în afara celulei, cum ar fi matrix-ul extracelular. Ele nu necesită stimuli, deși procesul poate fi stimulat de către factorii de creștere.

3.4.4.2. PRELUCRAREA ÎN COMPLEXUL GOLGI A PROTEINELOR LIZOZOMALE

În compartimentele complexului Golgi are loc prima dată segregarea enzimelor lizozomale de ceilați produși de secreție. Enzimele lizozomale au grupări gluidice terminale – manoza-6-fosfat care funcționează ca marker. Acest compus este recunoscut de un receptor specific din membrana reticulului endoplasmatic și a complexului Golgi, determinând separarea enzimelor lizozomale în zona trans, de unde se desprind vezicule, care formează apoi liozomii primari.

3.4.4.3. PRELUCRAREA ÎN COMPLEXUL GOLGI PROTEINELOR MEMBRANARE

Proteinele integrale de membrană, sintetizate în reticulul endoplasmatic rugos sosesc pe calea veziculelor la complexul Golgi unde sunt maturate și eliberate sub forma unor vezicule care furnizează membranelor atât proteine cât și lipide.

Totodată complexul Golgi este implicat în reciclarea membranelor, ca un proces de reutilizare a componentelor plasmalemei. Pe parcursul procesului de exocitoză plasmalema își mărește permanent suprafața, datorită veziculelor cu care fuzionează. Pentru a contracara acest fenomen, din plasmalemă se desprind vezicule care se întorc la complexul Golgi unde are loc reciclarea componentelor membranare. Deci, la complexul Golgi sosesc vezicule care pot să conțină și proteine de membrană, enzime, receptori ce pot fi modificate, separate și refolosite.

Modificările suferite de diferitele tipuri de proteine au loc în compartimente specifice ale complexului Golgi, fiind precedate de procesele desfășurate în nucleu sau reticulul endoplasmatic (Fig. 3.30).

Fig. 3.30 Reacțiile la care sunt supuse proteinele sau lipidele în reticulul

endoplasmatic și complexul Golgi

Compartimentul cis al complexului Golgi primește moleculele de la reticulul endoplasmatic și apoi le transmite compartimentului median, având o participare redusă la procesul de modificare a proteinelor. Se îndepărtează parțial manoza și se fosforilează oligoglucidele conținute de proteinele lizozomale.

Compartimentul median are ca funcție primară glicozilarea, prin adăugarea N-acetilglucozaminei la moleculele proteice și lipidice.

În compartimentul trans și reticulul Golgi trans se adaugă acid sialic la oligozaharide. El reprezintă sediul sortării finale și a exportării moleculelor cu destinații bine orientate.

Transportul moleculelor prin complexul Golgi este direcțional, cisternele complexului fiind asociate cu un număr mare de vezicule de dimensiuni reduse. Aceste vezicule transportă proteinele și lipidele de la reticulul endoplasmatic, care intră prin compartimentul cis în aparatul Golgi și avansează în toate compartimentele până sunt eliminate prin rețeaua Golgi trans. Aceste vezicule sunt acoperite de o proteină de învelire („coating protein”) care se consideră că ar juca un rol de semnal în direcționarea transportului. Ele reglează tipul de molecule care sunt împachetate într-un anumit tip de vezicule, controlează procesul de asamblare a veziculelor indicând atât membrana țintă cât și sistemul care permite veziculelor să fuzioneze cu ținta.

3.4.5. DEGRADAREA PROTEINELOR

Nivelurile proteinelor în celule sunt determinate nu numai de ratele de sinteză, dar și de ratele de degradare. Proteinele care nu mai sunt utile la un moment dat în celulă sau proteinele sintetizate greșit trebuie să fie eliminate din celule. Dacă nu sunt îndepărtate, aceste proteine otrăvesc celula, prin formarea unor agregate cu dimensiuni mari, insolubile. Alte proteine sunt degradate ca răspuns la semnale specifice, furnizând un alt mecanism pentru reglarea activității enzimatice.

Proteinele anormale apar în celule ca rezultat al mutațiilor, erorilor apărute în sinteza sau împachetarea proteinelor, denaturării spontane, bolilor, stresului sau degradării oxidative.

Degradarea proteinelor are ca scop atât reglarea activității proteice prin eliminarea moleculelor care nu mai sunt utile în celulă cât și reciclarea aminoacizilor.

Degradarea proteinelor în celule are loc prin câteva căi proteolitice, specifice fiecărui compartiment celular.

Astfel, sisteme distincte sunt prezente în vacuole, citozol, nucleu, cloroplaste mitocondrii și lizozomi. Mecanismul după care are loc proteoliza reflectă originea evolutivă a organitului respectiv (mecanismul proteolitic observat în cloroplaste și mitocondrii este mai apropiat de sistemele bacteriene decât de cele localizate în citozol).

3.4.5.1 DEGRADAREA PROTEOLITICĂ CITOZOLICĂ

În fiecare celulă, numărul și diversitatea proteinelor este extrem de mare, astfel că este necesară existența unor mecanisme precise atât pentru acțiunea proteazelor cât și pentru marcarea proteinelor care urmează să fie degradate. Fără o astfel de reglare enzimele proteolitice ar degrada proteinele celulare fără discriminare.

Proteinele care nu mai sunt utile în celulă sau cele care au fost sintetizate sau împachetate greșit, posedă sisteme de recunoaștere specifică :

Proteinele citozolice destinate a avea o viață scurtă sunt marcate la capătul aminoterminal prin apariția unor secvențe scurte de aminoacizi, care par să funcționeze ca semnal proteolitic.

În alte cazuri căile proteolitice sunt activate de condițiile de mediu – temperatura ridicată, expunerea la metale grele sau infecția cu patogeni.

Alteori, proteinele aberante sau împachetate incorect implică probabil o creștere semnificativă a numărului de reziduuri hidrofobice prezente pe suprafața proteinei. De obicei, secvențele hidrofobe sunt îngropate în interiorul proteinei, pentru a preveni interacțiunea lor cu mediul apos.

Atunci când o proteină a fost sintetizată sau împachetată incorect, lanțurile hidrofobe sunt expuse spre exterior. Aceste zone hidrofobe furnizează situsuri de legare pentru proteinele care reglează activitatea diverselor enzime proteolitice.

Calea cea mai importantă a degradării proteolitice selective în celulele eucariote utilizează ubiquitina ca marker pentru proteinele citozolice, care devin ținte pentru o proteoliză rapidă.

Ubiquitina este un polipeptid mic, alcătuit din 76 de aminoacizi, înalt conservați în archebacterii și eucariote. Ea se atașează la gruparea amino laterală a unui rest de lisină și în acest fel marchează proteina respectivă.

Apoi ubiquitine adiționale sunt adăugate pentru a forma un lanț poliubiquitinic. Asemenea proteine poliubiquitinice sunt recunoscute și degradate de un complex proteazic de dimensiuni mari, numit proteazom (M=1,5 MDa). Ubiquitina este eliberată în procesul degradării proteice, astfel încât ea poate fi utilizată într-un alt ciclu.

Se cunoaște că procesul de proteoliză în celulele eucariote necesită energie furnizată prin hidroliza ATP. Deoarece hidroliza legăturilor peptidice este favorizată din punct de vedere energetic, se consideră că ATP este necesar pentru reglarea activității proteolitice și anume are rol în recunoașterea și marcarea proteinelor care urmează să fie degradate.

Mecanismele de acțiune a proteazelor sunt complexe, iar sistemele de reglare dificil de caracterizat.

Procesul de degradare a proteinelor se desfășoară în mai multe etape, după cum urmează (Fig. 3.31).

Fig. 3.31 Procesul de marcare a proteinelor cu ubiquitine în vederea degradării

În prima etapă ubiquitina este activată prin atașarea la enzima E1- Gruparea carboxil terminală a ubiquitinei se leagă covalent la o grupare SH a enzimei E1 (1).

Ubiquitina este transferată la un reziduu cisteinic al enzimei E2 (2).

Proteina țintă, care poartă semnalul de degradare este recunoscută de enzima E3, cu care se leagă într-un complex necovalent (3).

Sistemul E3-proteină țintă se leagă la enzima E2, formând un complex (4)

Ubiquitina este transferată de la E2 la proteina țintă prin intermediul unei grupări NH2 de pe un rest de lisină al proteinei țintă (5)

Transferul ubiquitinei este repetat astfel încât se formează un lanț poliubiquitinic. Fiecare grupare carboxil de la capătul C al fiecărei ubiquitine, atașată suplimentar este legată la un reziduu lizinic al ubiquitinei precedente.În general, o serie de 4 ubiquitine trebuie să fie atașate la proteina țintă înainte ca aceasta să se deplaseze spre proteasom (6)

Enzimele E2 și E3 se disociază (7)

Complexul proteină-lanț poliubiquitinic este transportat la un proteasom pentru degradare. Ubiquitina este eliminată de pe proteina țintă, astfel că poate fi reutilizată (8).

Proteasomul este o structură proteică complexă (26 S) alcătuit din trei subunități: un miez (20 S) cu care sunt asociate două subunități reglatoare (19S) (Fig. 3.32).

Miezul este alcătuit din 4 inele suprapuse, fiecare inel conținând șapte subunități. Inelele formează la interior un canal, care conține situsurile active pentru proteoliză. Amplasarea centrilor catalitici în canal protejează proteinele nemarcate împotriva degradării. Subunitățile reglatoare funcționează ca o cale de intrare în proteasom, dirijând pătrunderea proteinei marcate în canal.

Proteinele marcate cu ubiquitină, pătrund în canalul proteazomului, unde sunt amplasați centri catalitici, fiind degradate. După finalizarea procesului de degradare, proteazomul se disociază, iar aminoacizii și ubiquitinele sunt eliberate în citoplasmă.

Ubiquitinele se întorc în alte procese de marcare, iar aminoacizii vor sta la baza sintezei altor lanțuri polipeptidice.

Fig. 3.32 Structura și modul de funcționare a proteazomului

3.4.5.2. DEGRADAREA PROTEOLITICĂ ÎN LIZOZOMI

Lizozomii intervin în metabolismul celular prin digestia proteinelor extracelulare preluate prin endocitoză, precum și datorită înlocuirii permanente a organitelor citoplasmatice și a proteinelor citozolice.

Astfel, în lizozomi pot fi degradate moleculele pătrunse în celulă din exterior – heterofagie, sau molecule sau chiar organite citoplasmatice care nu mai sunt utile în celule – autofagia.

Moleculele sau componentele care urmează a fi degradate sunt înconjurate de membrane provenite de la reticulul endoplasmatic pentru a forma vezicule. Aceste vezicule fuzionează cu lizozomii, iar enzimele lizozomale digeră conținutul veziculelor. În interiorul lizozomilor sunt prezente aproximativ 50 de enzime, care sunt active numai la pH-ul acid din acest compartiment.

În unele situații speciale, când celula este lipsită de hrană, lizozomii preiau și degradează în mod selectiv anumite proteine citozolice. Sunt degradate în special proteine care conțin secvența Lys-Glu-Arg-Gln, care se pare că le orientează către lizozomi. În procesul de degradare este implicată și chaperona Hsp 70, care menține lanțurile polipeptidice nepliate în timpul transportului lor prin membrana lizozomală.

Pe această cale sunt degradate proteine de care celula se poate lipsi și astfel se furnizează aminoacizi și energie, care permit derularea proceselor metabolice fundamentale.

3.4.5.3. DEGRADAREA PROTEOLITICĂ ÎN VACUOLE

Vacuolele sunt bogate în enzime hidrolitice și îndeplinesc mai multe funcții în celule. Una dintre funcțiile de bază constă în degradarea proteinelor, funcție similară cu cea a lizozomilor din celulele animale. Unii cercetători sugerează că în timpul lipsei nutrienților plantele transportă o serie de proteine citozolice în vacuole, unde sunt degradate pentru a genera aminoacizii necesari sintezei altor proteine.

3.4.5.4. DEGRADAREA PROTEOLITICĂ ÎN ALTE ORGANITE CELULARE

Proteoliza este prezentă în cloroplaste, deoarece acestea conțin aproximativ 50% din proteinele prezente în aparatul foliar. Una dintre proteazele identificate în cloroplaste prezintă omologie cu o enzimă de același tip, izolată din E. coli. Activitatea acestei enzime este importantă pentru prevenirea acumulării proteinelor anormale în timpul senescenței țesuturilor foliare.

Alte organite din celulele vegetale, inclusiv mitocondriile, peroxizomii și reticulul endoplasmatic posedă de asemenea sisteme pentru degradarea proteinelor. Aceste sisteme proteolitice nu au fost caracterizate până în prezent.

CAPITOLUL IV

TEHNICI DE BAZĂ ÎN ANALIZA ACIZILOR NUCLEICI ȘI A PROTEINELOR

Moleculele care sunt supuse analizei în investigațiile specifice biologiei moleculare, genomicii sau proteomicii sunt moleculele ADN, ARN sau proteine.

Moleculele ADN sunt extrase și purificate prin procedee specifice, după care pot fi supuse direct investigațiilor, datorită stabilității lor. Genomul este același în toate celulele unui organism, în orice fază de dezvoltare ontogenetică, în orice condiții de mediu și de aceea ADN poate fi extras din orice tip de celule sau țesuturi.

Astfel se pot obține informații cu privire la structura genomului, pot fi identificate și caracterizate gene, pot fi stabilite amprente genetice sau se poate stabili gradul de înrudire, diversitatea sau filiația intra sau interspecifică.

În cazul în care se urmărește investigarea moleculelor ARN o problemă importantă o prezintă instabilitatea acestora. De aceea, de cele mai multe ori se obțin molecule ADN complementar, care sunt copii fidele ale ARNm, dar care prezintă o stabilitate mai ridicată, ceea ce permite aplicarea tuturor metodelor de investigație specifice ADN. Populațiile de ARN din celule sunt specifice tipului de organ, etapei de dezvoltare și condițiilor de mediu și de aceea este necesară alegerea în prealabil a materialului de analizat în funcție de obiectivele urmărite.

Analizele care au ca obiect ARN permit evaluarea expresiei genelor și anume pot fi identificate genele care se exprimă la un anumit moment, poate fi analizată comparativ supra sau sub-expresia unor gene sau efectul unor factori externi asupra expresiei genelor.

Structura, proprietățile fizice și chimice specifice ale acizilor nucleici și ale proteinelor au permis de-a lungul anilor, o dată cu progresul biologiei moleculare și a echipamentelor specifice, dezvoltarea unor tehnici de analiză moderne, care au stat apoi la baza tehnicilor de investigație complexe.

4.1. DENATURARE/RENATURARE/HIBRIDIZARE

Denaturarea sau disocierea (“DNA melting”) este un proces în care o moleculă de acid dezoxiribonucleic (ADN) se separă în două lanțuri monocatenare prin desfacerea legăturilor de hidrogen formate între bazele azotate complementare. Ambii termeni menționați sunt utilizați cu referire la același proces, care are loc în general atunci când amestecul este încălzit (94-95ºC); denaturarea poate însă să se refere și la separarea catenelor ADN sub acțiunea unor agenți chimici cum ar fi ureea, sau prin supunerea la un mediu alcalin (pH>11).

Pentru copii multiple de ADN temperatura de disociere (“melting temperature”) – Tm este definită ca temperatura la care jumătate dintre catenele ADN sunt sub formă bicatenară și jumătate sunt monocatenare. Temperatura de disociere depinde atât de lungimea moleculei cât și de secvența nucleotidelor în fragmentul analizat.

Monitorizarea proceselor de denaturare este posibilă prin măsurarea absorbanței, ținând cont că moleculele de ADN au absorbția maximă în domeniul UV, la o lungime de undă de 260 nm. Atunci când moleculele de ADN se denaturează absorbanța va crește până la finalizarea procesului, când în amestec se găsesc numai molecule monocatenare, după care va rămâne constantă. Acest fenomen poartă numele de efect hipocromic, iar absorbanța ADN monocatenar este cu 50% mai mare decât a celui bicatenar.

Reacția de denaturare/disociere poate avea loc atunci când este compensată energia de legătură, stabilită între bazele azotate complementare. Se cunoaște că legăturile stabilite între citozină și guanină (3 legături de hidrogen) sunt mai puternice decât cele dintre adenină și timină (2 legături de hidrogen), prin urmare regiunile bogate în A/T pot fi mai ușor denaturate.

Au fost dezvoltate metode analitice care permit evaluarea proporției de citozină și guanină din genom, denumită conținut CG, care poate fi estimată prin măsurarea temperaturii la care ADN genomic se disociază. Temperaturi mai ridicate sunt asociate cu un conținut mai ridicat în CG (Fig. 4.1).

Regiunile care alcătuiesc promotorii genelor sunt alcătuite de secvențe de genul „TATATA”, care se denaturează mai ușor, furnizând fragmente ADN monocatenare, care permit începerea transcrierii.

Fig. 4.1. Variația procentului de molecule denaturate în funcție de temperatură, pentru polinucleotide alcătuite exclusiv din C/G, respectiv A/T, comparativ cu un fragment natural de ADN

Procesul de denaturare este reversibil, astfel că molecula bicatenară poate fi refăcută. Dacă fragmentele monocatenare care refac dublul helix au la origine aceiași moleculă ADN, procesul poartă numele de renaturare. Dacă fragmentele de ADN monocatenare au origini diferite (ex. secvență țintă, sondă moleculară) procesul poartă numele de hibridizare.

Prin scăderea temperaturii sau a pH este favorizată refacerea legăturilor de hidrogen între bazele complementare de pe cele două lanțuri unice de ADN, ARN sau ARN și ADN. Reacțiile de renaturare se produc de regulă la temperaturi care corespund unei diferențe de 20 – 30ºC față de temperatură de disociere (Tm) a acidului nucleic bicatenar; dacă temperatura însă scade brusc, catenele rămân separate.

Un factor important în procesul de hibridizare este stringența, sau intensitatea reacției. Dacă două catene unice de acid nucleic sunt formate pe toată lungimea din baze complementare, iar condițiile de reacție sunt favorabile, stringența (intensitatea) reacției de combinare este foarte puternică. Dacă pe cele două catene de acid nucleic există doar zone parțiale cu baze complementare, stringența este mai scăzută. Această situație apare în special atunci când cele două catene provin de la două organisme diferite.

Procesele de denaturare asociate cu renaturarea sau hibridizarea își găsesc o gamă largă de aplicații în dezvoltarea tehnicilor complexe de investigație în biologia moleculară.

APLICAȚII GENERALE

Evaluarea timpului de renaturare poate fi utilizată pentru a estima compoziția în baze azotate și totodată prezența unor fracții repetitive în secvența analizată. Această metodă a fost aplicată în anii ”60 pentru a evidenția diferențele apărute în compoziția bazelor azotate a moleculelor de ADN, provenite de la diferite organisme și totodată pentru a demonstra că ADN eucariot conține un procent mare de secvențe repetitive.

La scară de genom, metoda a fost folosită pentru a estima distanța genetică dintre două specii, proces care poartă numele de hibridizare ADN- ADN. Dacă se analizează regiuni izolate din genom, se pot utiliza geluri cu gradient de denaturare sau în gradient de temperatură pentru a detecta prezența unor mici nepotriviri. Totuși, în prezent, pentru ca informațiile cu privire la succesiunea bazelor azotate să fie mai precise se preferă utilizarea tehnicii de secvențializare.

Procesul de denaturare ADN este de asemenea utilizat în tehnicile de biologie moleculară, în special în cadrul PCR (Polymerisation Chain Reaction). Cunoașterea temperaturii de disociere (Tm) are o importanță deosebită în stabilirea temperaturii de legare a primerilor la catena matriță, ceea ce conduce la reacții de amplificare eficiente.

Procesele de renaturare/hibridizare au stat la baza dezvoltării tehnicilor Southern și microarray, în care atât ADN fixat pe suport cât și sonda moleculară sunt denaturate, iar reacția de hibridizare se desfășoară în condiții prestabilite, pe baza complementarității bazelor.

În prezent se poate aplica metoda de “hibridizare in situ” controlabilă cu ajutorul tehnicilor de fluorescență. În acest caz sonde moleculare marcate se leagă la secvențe complementare de ADN care se găsesc în cromozomii prometafazici etalați pe o lamă microscopică și denaturați în prealabil.

4.2. SECȚIONAREA MOLECULELOR ADN CU ENDO-NUCLEAZELE DE RESTRICȚIE

Enzimele de restricție sau endonucleazele de restricție sunt endonucleaze de origine bacteriană. În mod natural ele clivează moleculele de ADN străin (de exemplu ADN viral pătruns în celula bacteriană respectivă), fără a cliva însă ADN bacterian propriu, deoarece acesta poartă un semn de recunoaștere, reprezentat de niște situsuri specifice, metilate. Metilarea reprezintă un mecanism de apărare al celulei bacteriene față de propriile nucleaze.

Nomenclatura enzimelor de restricție a fost stabilită de către Nathans și Smith (1973) astfel: Prima literă indică genul bacterian de proveniență, literele 2, 3 indică specia; alte litere indică tulpina bacteriană de proveniență a enzimei; numerele indică ordinea de descoperire.

Luând ca exemplu enzima de restricție denumită EcoR I, putem spune că litera E provine de la gen – Escherichia, grupul de litere co provine de la specie, coli, litera R de la tulpina RY13. Cifra romană I arată că EcoR I a fost prima enzimă izolată din această tulpină.

După izolarea primei enzime de restricție – Hind III, în anul 1970 și descoperirea și caracterizarea ulterioară a numeroase alte enzime de restricție, în 1978 a fost decernat premiul Nobel pentru Fiziologie și Medicină lui Daniel Nathans, Werner Arber și Hamilton Smith. Descoperirea lor a condus la dezvoltarea tehnologiei ADN recombinant care a permis, de exemplu producerea pe scară largă a insulinei umane utilizînd bacteria E. coli. De atunci au fost studiate în detaliu mai mult de 3000 de enzime de restricție dintre care mai mult de 600 sunt disponibile comercial și sunt utilizate în procesele de manipulare a ADN în laborator.

4.2.1. CLASE GENERALE DE ENZIME-ENDONUCLEAZE DE RESTRICȚIE

Până în prezent au fost caracterizate trei sisteme de restricție-metilare (R-M), dintre care cea mai mare răspândire o are sistemul II (95%).

ENZIME DE RESTRICȚIE – tipul I

Enzimele de restricție de tipul I au fost identificate prima dată și sunt caracteristice pentru două tulpini K 12 și B din E. coli. Aceste enzime secționează la nivelul unui situs amplasat la o anumită distanță (cel puțin 1000 bp) de situsul de recunoaștere. Situsul de recunoaștere este asimetric, compus din două porțiuni, una alcătuită din 3-4 nucleotide și cea de-a doua din 4-5 nucleotide, separate de o sevență de separare („spacer”), cu o lungime 6-8 nucleotide.

Din punct de vedere structural, enzimele de restricție de tipul I sunt alcătuite din trei subunități denumite HsdR, HsdM și HsdS. Subunitatea HsdR este implicată în procesul de secționare, HsdM este necesară pentru metilare (ex. adăugarea de grupări metilice la ADN gazdă, ceea ce reprezintă o activitate metil-transferazică); subunitatea HsdS are un rol în stabilirea specificității situsului de recunoaștere, ca o completare la activitatea metiltransferazei.

Activitatea acestor enzime este asigurată de câțiva cofactori enzimatici și anume S-Adenosyl methionina (AdoMet), adenozin-trifosfatul (ATP) și ionii de magneziu (Mg2+).

ENZIME DE RESTRICȚIE – tipul II

Enzimele de restricție de tipul II, cele mai comune și mai utilizate tipuri de enzime, sunt compuse dintr-o singură subunitate, iar situsurile de recunoaștere sunt de obicei nedivizate și palindromice, cu o lungime de 4-8 nucleotide. Aceste enzime recunosc și secționează secvențe specifice din molecula ADN bicatenar și nu necesită ATP sau S-Adenosyl methionina (AdoMet) pentru funcționare, dar Mg2+ acționează ca și cofactor.

In anii 1990 și la începutul anilor 2000 au fost descoperite noi tipuri de enzime din aceiași familie, care nu urmează criteriile clasice ale acestei clase de enzime.

Astfel, enzimele care nu respectă întru-totul caracteristicile specifice acestei clase au fost catalogate în subgrupe, definite prin adăugarea unei litere la sfârșit.

Tipul II B de enzime de restricție (Bcg I și Bpl I) sunt multimeri, alcătuiți din mai mult de o subunitate. Acestea secționează molecula ADN de o parte și de alta a situsului de recunoaștere și necesită prezența ambilor cofactori AdoMet și Mg2+.

Tipul II E (Nae I) secționează molecula ADN în urma interacțiunii cu două copii ale secvenței de restricție. Un situs de recunoaștere acționează ca țintă pentru secționare, în timp ce cel de-al doilea acționează ca activator alosteric mărind eficiența de secționare a enzimei.

Similar cu tipul II E, tipul II F (Ngo M IV) interacționează cu două copii ale situsului de restricție, dar secționează ambele secvențe în același timp.

Tipul II G (Eco 57I) are o singură subunitate la fel ca tipul II clasic de enzime de restricție , dar necesită cofactor AdoMet pentru a fi activ.

Tipul II M, cum ar fi Dpn I, este capabil să recunoască și să secționeze ADN metilat.

Tipul II S (Fok I), având o structură dimerică, secționează ADN la o distanță definită de situsul de recunoaștere care este asimetric și non-palindromic.

Similar, tipul II T (Bpu 10I și Bsl I) este compus din două subunități diferite. Unele recunosc secvențe palindromice în timp ce altele au situsuri de restricție palindromice.

ENZIME DE RESTRICȚIE – tipul III

Enzimele de restricție de tipul III (Eco P15) recunosc două secvențe separate, non-palindromice care sunt orientate invers, secționând la 20-30 perechi de baze după situsul de recunoaștere. Aceste enzime conțin mai mult de o subunitate și necesită AdoMet și ATP ca și cofactori, datorită rolului lor în metilare și restricție.

4.2.2. ASPECTE GENERALE PRIVIND ENZIMELE DE RESTRICȚIE CU UTILIZARE COMUNĂ ÎN TEHNICILE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ

Enzimele cele mai utilizate sunt enzimele de tip II, care recunosc o secvență specifică din molecula ADN dublu catenar, se atașează la nivelul acelei secvențe, producând secționarea.

Aceste secvențe, denumite situsuri de recunoaștere sunt alcătuite dintr-un număr redus 4, 6 sau 8 perechi de nucleotide ce formează două secvențe palindromice situate în jurul unui punct de simetrie. Cele mai uzuale sunt enzimele care au situsuri de recunoaștere alcătuite din 6 bp.

Enzimele al căror situs de recunoaștere este alcătuit dintr-un număr redus de perechi de baze secționează moleculele de ADN mai des, deoarece probabilitatea de a întâlni acele secvențe în genom este mai mare. Cu cât lungimea unui situs de recunoaștere este mai mare, cu atât se va regăsi în mai puține poziții în genom.

Unele enzime de restricție taie simultan ambele catene în același punct, rezultând fragmente cu capete netede, în timp ce altele taie catenele după o schemă defazată, rezultând fragmente ADN cu capete coezive monocatenare (Fig. 4.2). Dacă fragmentele monocatenare se află situate la capetele 3’, extremitățile poartă numele de „capete coezive 3’”, iar dacă rămân fixate în zona 5’ sunt denumite „capete coezive 5’”.

Aceste aspecte referitoare la extremitățile fragmentelor formate în urma secționării cu o enzimă de restricție au o importanță deosebită în procesele de formare a moleculelor de ADN recombinat, deoarece pot fi legate numai fragmente care au capete netede, iar cele cu capete coezive trebuie să fi fost secționate cu aceiași enzimă de restricție, pentru a avea extremități monocatenare complementare.

Fig. 4.2. Mecanismul de acțiune al enzimelor de restricție

Săgețile reprezintă legăturile fosfodiesterice care vor fi desfăcute de către enzimele de restricție

În continuare sunt prezentate trei tipuri de enzime de restricție care generează capete diferite.

În urma acțiunii enzimelor de restricție ambele catene ale moleculei ADN sunt secționate. De fiecare dată enzima secționează o legatură fosfodiesterică generând grupări -OH la capetele 3’ și fosfat la capetele 5’ formate în urma reacției.

Fiecare enzimă de restricție prezintă o activitate optimă în anumite condiții de temperatură, care coincid cu temperatura mediului de viață al tulpinii bacteriene din care a fost extrasă.

În general enzimele de restricție izolate din surse diferite recunosc secvențe de nucleotide diferite. Există însă enzime care au situsuri identice, deși nu au fost izolate din aceiași tulpină bacteriană, prin urmare au și denumiri diferite. Atsfel de enzime poartă numele de izoschizomeri. De exemplu enzimele Cla I și Bsu I, au același situs de recunoaștere: ATCGAT.

În plus, există unele enzime care recunosc o secvență de patru nucleotide, iar această secvență se află în interiorul unei secvențe de 6 nucleotide, care reprezintă situsul de recunoaștere al altei enzime. De exemplu Mbo I și Bam H I. Situsurile de recunoaștere pentru aceste enzime sunt următoarele.

Mbo I 5’ ↓ G A T C 3’ Bam H I 5’ G ↓ G A T C C 3’

3’ C T A G ↑ 5’ 3’ C C T A G↑G 5’

APLICAȚII GENERALE

Enzimele de restricție sunt foarte mult utilizate în tehnicile de genetică moleculară. Ele stau la baza tehnologiei ADN recombinat și de asemenea sunt folosite în alcătuirea hărților de restricție și evidențierea polimorfismului cu ajutorul markerilor RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) sau CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic DNA).

4.3. SINTEZA ADN, CU AJUTORUL ADN POLIMERAZELOR

ADN polimerazele sunt reprezentate de un grup de enzime care asigură sinteza unei noi catene de ADN, utilizând o altă catenă ca matriță.

În cadrul procesului de replicare a ADN, in vivo, la un moment dat are loc desfacerea legăturilor de hidrogen dintre cele două lanțuri polinucleotidice, care devin astfel independente și servesc fiecare ca matriță pentru formarea unui lanț polinucleotidic complementar. În acest proces este implicat un sistem enzimatic complex, în care ADN polimeraza ocupă un loc central.

Astfel, pentru sinteza ADN, atât in vivo cât și in vitro, trebuie să existe o catenă de ADN care să funcționeze ca matriță, un fragment (primer) care să pună la dispoziție o grupare OH la un capăt 3’ și cei patru nucleozid trifosfați (dATP, dTTP, dCTP și dGTP), care să furnizeze moleculele din care va fi sintetizată noua catenă.

ADN polimeraza catalizează adiția unităților mononucleotidice la capătul 3’- hidroxil liber al catenei ADN primer, direcția procesului de sinteză a ADN fiind întotdeauna 5’→3’. Reacția are loc printr-un atac nucleofil, în care gruparea 3’-hidroxil din restul nucleotidic terminal al catenei de ADN în creștere, reacționează cu atomul fosfat aflat în poziția 1 a nucleozid-5’-trifosfatului următor, determinând formarea legăturii fosfo-diesterice și eliminarea de pirofosfat (Fig. 4.3).

În biologia moleculară, caracteristica ADN polimerazelor de a sintetiza noi catene de ADN a fost exploatată foarte mult, permițând dezvoltarea unei game largi de investigații.

Astfel, descoperirea ADN polimerazelor stabile termic a permis introducerea la scară largă a proceselor PCR – amplificarea prin reacția în lanț a polimerazei, revoluționând astfel biologia moleculară.

Fig. 4.3 Mecanismul alungirii catenei prin acțiunea ADN polimerazei

4.3.1. METODA AMPLIFICĂRII PRIN REACȚIA ÎN LANȚ A POLIMERAZEI

Amplificarea prin reacția în lanț a polimerazei este o metodă analitică de investigare a acizilor nucleici, care constă din amplificarea enzimatică in vitro a unui fragment ADN, cu secvență necunoscută, poziționat între două regiuni cu secvențe cunoscute. Astfel este posibilă amplificarea unei singure copii ADN în milioane de copii în numai câteva ore.

Metoda este cunoscută în limba franceză sub numele de”méthode d‘amplification électivé în vitro de séquences d‘acides nucléiques” – metoda amplificării selective in vitro a secvențelor de acizi nucleici, iar în limba engleză sub numele de “Polymerase Chain Reaction” – reacția în lanț a polimerazei – abreviată prin acronimul PCR. Această abreviere este acreditată în literatura de specialitate de circulație internațională, implicit în literatura de limba franceză.

Această nouă metodă a fost inițiată în perioada 1980-1983 de către Kerry Mullis (Mullis, 1990), care a primit premiul Nobel pentru Chimie în anul 1993. Metoda, percepută ca o revoluție metodologică în biologia moleculară se remarcă prin faptul că face posibilă obținerea unui număr impresionant de copii ale unor secvențe specifice din ADN care pot fi gene, fragmente de gene sau alte secvențe ADN.

Pentru a fi posibilă desfășurarea unei reacții de amplificare sunt necesare două oligonucleotide cu secvențe specifice, denumite uzual “amorse” (fr. amorces) sau “primeri” (engl. primers), complementare cu secvențele care flanchează fragmentul ADN de amplificat. Aceste oligonucleotide furnizează grupările libere OH, la capetele 3’, necesare ADN polimerazei pentru a începe sinteza. Dezvoltarea acestei tehnici a cunoscut o amploare deosebită după ce a fost izolată o ADN polimerază termostabilă, care să rămână activă pe parcursul tuturor etapelor de încălziri și răciri repetate.

4.3.1.1. COMPONENTELE UNEI REACȚII DE AMPLIFICARE – CARACTERISTICI ȘI MOD DE UTILIZARE

Componentele (reactivii) necesari desfășurării unei reacții de amplificare sunt ADN matriță, primerii, ADN polimeraza, cei patru nucleozid-trifosfați și o soluție tampon, care asigură condițiile optime de reacție (pH, tărie ionică, MgCl2). Fiecare dintre aceste componente trebuie să îndeplinească o serie de caracteristici pentru ca, după derularea programului de amplificare să rezulte un număr suficient de fragmente, care să permită vizualizarea în gel de agaroză.

ADN MATRIȚĂ („Template”)

Referitor la moleculele ADN de amplificat trebuie să se țină cont de mai multe aspecte referitoare în special la calitatea acestora și mai puțin la cantitate, deoarece pe parcursul desfășurării reacției sunt parcurse cicluri în care amplificarea este exponențială.

De obicei pot fi amplificate fragmente cu lungimi mai mici de 10 kb, dar randamente foarte bune se obțin atunci când fragmentele sunt mai mici de 3kb.

Nu sunt necesare cantități mari de ADN, deoarece are loc o amplificare a fragmentelor țintă, iar cantitățile mari de ADN favorizează obținerea de produși PCR nespecifici. Calitatea ADN este însă importantă, deoarece prezența unor urme din anumiți compuși folosiți în procedurile de extracție (fenol, EDTA, proteinază K) pot să inhibe activitatea Taq polimerazei.

Totodată fragmentele ADN trebuie să fie intacte pe o lungime mai mare decât cea care urmează a fi amplificată, în caz contrar amplificarea nefiind posibilă. Acest aspect apare mai ales atunci când sursă din care se realizează extracția este reprezentată de ADN fosil, urme biologice etc.

PRIMERI

Primerii sunt fragmente monocatenare de ADN (oligonucleotide)

cu o lungime de 15-30 nucleotide. Cu cât lungimea primerilor crește, cu atât crește și specificitatea legării lor.

Aceste secvențe flanchează fragmentul țintă de interes din ADN matriță, fiecare primer legându-se la capătul 3’al unei catene. Legarea primerilor este antiparalelă, aceștia furnizând grupări OH la capetele 3’, care permit alungirea ulterioară a catenelor ADN (Fig. 4.4).

Procesul de legare a primerilor este hotărâtor în desfășurarea unei reacții de amplificare și de aceea este supus unor procese de optimizare. De aceea trebuie să fie acordată o atenție deosebită atât secvenței stabilite pentru fiecare primer, cât și stabilirii unei temperaturi optime de legare.

Fig. 4.4. Modul de atașare și de stabilire a secvenței primerilor

Secvența primerilor

La stabilirea secvenței primerilor trebuie să fie respectate o serie de condiții, pentru ca reacțiile de amplificare să se desfășoare în condiții optime.

Conținutul în nucleotide GC (numărul de baze C și G, ca un procent din numărul total de baze) trebuie să se încadreze în intervalul 40-60%.

Prezența bazelor G și C printre ultimele baze de la capătul 3' favorizează legarea specifică, datorită legăturilor puternice dintre bazele complementare C și G. Dar un număr mai mare de trei G sau C trebuie să fie evitat între ultimele cinci baze de la capătul 3'.

Structura secundară a primer-ului are o importanță deosebită; se poate stabili atât intra cât și intermolecular și poate afecta afecta eficiența reacției. Structurile care trebuiesc evitate sunt prezentate în continuare:

Formarea structurilor „ac de păr” („hairpin”) datorită interacțiunilor intramoleculare trebuie să fie evitate.

Formarea unui dimer prin interacțiunea intermoleculară dintre doi primeri, de același sens;

Formarea unor dimeri prin interacțiunea celor doi primeri – sens și antisens, datorită complementarității bazelor.

În secvența primerilor trebuie să fie evitată prezența unor di-nucleotide care se repetă consecutiv de mai multe ori (ex. ATATATAT) deoarece conduc la atașări eronate la ADN matriță.

Trebuie să fie de asemenea evitată o secvență de forma AGCGGGGGATGGGG, în care o bază se repetă de cinci ori. Numărul maxim de repetiții acceptat este de 4 nucleotide.

Temperatura de legare a primerilor

Un aspect foarte important în procesele PCR este temperatura de atașare a primerilor la secvențele complementare, secvențele țintă („target”) de pe catena matriță, deoarece este un parametru critic în procesul de amplificare.

Temperatura de disociere – Tm („melting temperature”) a unui primer cu o lungime mai mică de 25 de nucleotide se poate estima cu ajutorul relației:

Tm =4(G+C) + 2(A+T),

Unde G, C, A și T reprezintă numărul nucleotidelor respective în structura primerului.

Dacă primerul are o lungime mai mare de 25 de nucleotide, temperatura de disociere trebuie să fie calculată cu ajutorul soft-urilor speciale (Ex: Primer Premier, PrimerPlex), în care sunt evaluate interacțiunile dintre bazele adiacente, influența concentrației sărurilor etc.

Temperatura de disociere a celor doi primeri trebuie să nu difere prin mai mult de 5ºC, deci conținutul în bazele GC și lungimea lor trebuie să fie apropiate.

Temperatura optimă de legare a primerilor se stabilește la o valoare cu 5ºC mai redusă comparativ cu media temperaturilor de disociere (Tm) ale celor doi primeri.

ADN POLIMERAZĂ

În general, în reacțiile de amplificare se utilizează Taq polimeraza, care este o polimerază termostabilă, denumită după numele bacteriei termofile Thermus aquaticus din care a fost izolată inițial de către Thomas D. Brock în 1965.

Thermus aquaticus este o bacterie care trăiește în izvoare termale prin urmare posedă o polimerază stabilă la temperaturi ridicate. Această enzimă este capabilă să reziste la condițiile de denaturare a ADN (temperatură ridicată) necesare în timpul desfășurării reacției PCR. Astfel, a fost posibilă înlocuirea ADN polimerazei din E. coli, care era utilizată inițial în reacțiile PCR.

Taq polimeraza are o activitate optimă în intervalul de temperatură 75-80ºC, cu un timp de înjumătățire de 9 minute la temperatura de 97,5ºC și poate replica 1000 de baze perchi în mai puțin de 10 secunde la 72°C.

Un dezavantaj al Taq polimerazei este fidelitatea relativ redusă în procesul de replicare deoarece îi lipsește activitatea 3' – 5' exonucleazică (are o rată a erorii cuprinsă între 1 și 9000 de nucleotide). De aceea au fost izolate și alte ADN polimeraze termostabile și din alte bacterii termofile, cum ar fi Pfu ADN polimeraza, care posedă activitate exonucleazică. Aceste enzime pot fi utilizate în locul sau împreună cu Taq polimeraza, pentru o fidelitate mai înaltă a amplificării.

Taq polimeraza conduce la sinteza unor produși care au o grupare deoxi-adeninfosfat (A) la capetele 3’. Prezența acestei grupări poate fi exploatată în procesul de clonare directă a produșilor PCR în vederea secvențializării.

DEZOXI-NUCLEOZIDTRIFOSFAȚI (dNTP)

Prezența dezoxi-ribonucleozid trifosfaților (dNTP) în amestecul de amplificare furnizează moleculele de bază pentru sinteza noilor catene ADN. Este foarte important ca toți cei patru nucleozid trifosfați (dATP, dTTP, dCTP și dGTP) să fie prezenți în concentrații egale, bine stabilite, pentru ca reacția de amplificare să se desfășoare în condiții optime.

CLORURA DE MAGNEZIU (MgCl2)

MgCl2 are rolul de a forma complecși solubili cu dNTP, proces esențial pentru încorporarea acestora în noua catenă ADN și totodată stimulează activitatea polimerazei. O cantitate redusă de ioni de Mg2+ conduce la cantități mici de produși PCR. O concentrație ridicată favorizează însă formarea produșilor nespecifici. Cantități reduse de Mg2+ sunt recomandate atunci când este importantă fidelitatea sintezei ADN. Dacă probele ADN conțin EDTA sau alte substanțe care pot să lege ionii Mg2+, concentrația acestora în amestecul de reacție trebuie să fie crescută corespunzător.

4.3.1.2. MECANISMUL DE AMPLIFICARE PRIN REACȚIA PCR

Reacția PCR are la bază mecanismul de replicare a ADN in vivo. ADN dublu catenar este denaturat, copiat și renaturat. Această tehnică presupune desfășurarea mai multor cicluri alcătuite fiecare din 3 etape. În plus, la începutul reacției are loc o etapă de denaturare inițială, iar la sfârșit o reacție de extensie finală (Fig. 4.5).

Etapa de denaturare inițială

Denaturarea completă a ADN matriță la începutul reacției PCR are loc la temperatura de 94-95ºC, având ca scop desfacerea moleculelor bicatenare de ADN inițial și formarea moleculelor monocatenare. Timpul de denaturare este cu atât mai mare cu cât conținutul de guanin-nucleozid fosfat (G) și citozin-nucleozid fosfat (C) este mai mare.

B. Ciclu de amplificare, alcătuit din trei etape:

B.1. Etapa de denaturare

Fiecare ciclu de amplificare demarează cu o etapă de denaturare, care conduce la desfacerea moleculelor dublu catenare, atât a celor inițiale, cât și a celor formate pe parcursul derulării procesului. Timpul de denaturare depinde din nou de conținutul de guanin-nucleozid fosfat (G) și citozin-nucleozid fosfat (C).

B.2. Etapa de legare a primerilor (“annealing”) – atașarea celor două oligonucleotide utilizate ca primeri la secvențele complementare din ADN matriță.

B.3. Extensia, sinteza ADN, proces care are loc prin adăugarea de nucleotide la capetele 3’ ale primerilor, cu ajutorul ADN polimerazei, în prezența ionilor de Mg2+.

De obicei etapa de extensie are loc la temperatura de 70-75ºC, rata de sinteză la această temperatură, în prezenta Taq polimerazei fiind ridicată. Timpul recomandat pentru extensie este de 1 minut, pentru sinteza unor fragmente cu lungime mai mare de 2 kb. Dacă se sintetizează fragmente mai mari, timpul de extensie este de obicei mărit cu 1 minut pentru fiecare 1000 bp.

Fig. 4.5. Etapele care alcătuiesc un proces de amplificare amplificare prin reacția în lanț a polimerazei – PCR

1 – etapa de denaturare

2- etapa de legare a primerilor

3- etapa de sinteză ADN, în prezența ADN polimerazei (P)

4- ciclurile repetate, care conduc la amplificarea ADN

Numărul de cicluri

Numărul de cicluri PCR depinde de cantitatea de ADN matriță de la care se pornește și de cantitatea de produși de amplificare așteptată. Pentru mai puțin de 10 copii inițiale ale ADN matriță ar trebui să fie derulate 40 de cicluri. Dacă inițial cantitatea de ADN matriță este mai mare, sunt suficiente 25-35 de cicluri.

C. Etapa de extensie, sinteză ADN finală

După ultimul ciclu, este necesară menținerea amestecului la 72ºC, timp de 5-15 minute pentru a completa toate golurile din produșii de amplificare obținuți. De asemenea, de-a lungul acestei etape activitatea de transferază terminală a Taq polimerazei permite adăugarea de nucleotide A la capetele 3’ale produșilor PCR. Astfel, dacă fragmentele PCR urmează să fie clonate în vectori T/A această etapă poate să fie prelungită la 30 minute.

Cele trei etape: denaturarea, legarea primerilor și extensia alcătuiesc un singur ciclu al amplificării. După fiecare ciclu, fragmentul de ADN nou sintetizat va servi ca matriță într-un nou ciclu de amplificare. Produsul major al acestor reacții exponențiale este un segment ADN dublu catenar, ale cărui extremități sunt date de capetele 5’ ale primerilor și a cărui lungime este determinată de distanța dintre primeri.

După primul ciclu de amplificare produșii sintetizați au lungimi diferite, care depășesc distanța dintre situsurile de legare ale celor doi primeri. După al doilea ciclu aceste molecule generează fragmente ADN cu lungime bine definită, care se vor acumula exponențial de-a lungul ciclurilor de reacție și vor forma produșii de reacție predominați (Fig.4.6). După amplificare numărul de copii al fragmentului de interes este dat de relația:

2n x, unde n este numărul de cicluri și x numărul inițial de copii

Fiecare dintre componentele unei reacții de amplificare este hotărâtoare în desfășurarea unei reacții de amplificare eficientă.

ADN polimerazele stabile termic au o largă utilizare în tehnicile de biologie moleculară, dar au fost identificate și alte enzime, cu utilizări în alte domenii, cum ar fi completarea unor fragmente ADN parțial monocatenare (formate în urma secționării cu enzime de restricție) sau în marcarea unor fragmente ADN.

APLICAȚII GENERALE

Pe baza principiilor tehnicii PCR s-au dezvoltat o serie de metode de investigație, cum ar fi PCR cu punct final ”End-point PCR”, PCR în timp real („Real-time PCR”), PCR asociat cu revers-transcripția (”Reverse transcription polymerase chian reaction”, cu largi aplicații în domeniul evidențierii prezenței sau absenței unei gene, sau secvențe ADN, amplificarea unui fragment ADN, generarea unor markeri moleculari, detectarea și cuantificarea unei secvențe ADN și studiul expresiei genelor.

4.3.2. SINTEZA ADN ÎN SCOPUL COMPLETĂRII UNOR EXTREMITĂȚI MONOCATENARE

In cadrul proceselor de secționare cu enzime de restricție există posibilitatea formării unor capete coezive, compuse din fragmente scurte monocatenare. Completarea acestor secvențe poate să aibă loc printr-o reacție de sinteză, catalizată de o ADN polimerază.

În acest scop se utilizează fragmentul Klenow al ADN polimerazei I, care reprezintă un fragment mare (75 kDa) al acestei enzime, care și-a păstrat activitatea 5'-3' polimerazică și 3'-5' exonucleazică, dar și-a pierdut activitatea exonucleazică 5'-3'. De aceea, această enzimă se utilizează atunci când este necesară evitarea degradării moleculelor ADN nou sintetizate.

Mecanismul de reacție este similar cu al celorlate polimeraze, prin urmare necesită o grupare – OH liberă, la un capăt 3’.

În cazul fragmentelor monocatenare formate în urma secționării cu enzime de restricție, gruparea de inițiere a reacției este furnizată chiar de capetele 3’, care mărginesc secvențele monocatenare. ADN polimeraza adaugă la acestea nucleozid-trifosfați, ținând cont de complementaritatea bazelor, astfel încât are loc formarea unor capete netede.

APLICAȚII GENERALE

Metoda de completare a secvențelor monocatenare de ADN se aplică în cazul în care se dorește formarea unor molecule de ADN recombinat, pornind de la fragmente ADN care au fost secționate cu enzime de restricție generatoare de capete coezive, diferite. În această situație este necesară completarea capetelor monocatenare, permițând astfel ADN ligazei să refacă legăturile fosfodiesterice între fragmente cu capete netede.

4.3.3. SINTEZA ADN ÎN PROCESE DE MARCARE A SONDELOR MOLECULARE

În cadrul proceselor de marcare radioactivă sau enzimatică a fragmentelor de ADN utilizate ca sonde moleculare se folosesc drept matrițe catene unice de ADN, rezultate dintr-o denaturare prealabilă a unei catene, iar enzima implicată este ADN polimeraza I, fragment Klenow.

Reacțiile de sinteză a noilor catene de acid nucleic pornesc de la primeri cu o lungime de 6 nucleotide, cu secvență întâmplătoare, care găsesc secvențe complementare în mai multe puncte în fragmentul care urmează a fi copiat. Acestea furnizează grupările OH, la capetele 3’, necesare ADN polimerazei pentru a începe sinteza. În catena nou formată vor fi înglobați nucleozid-trifosfații, în funcție de complementaritatea bazelor, dintre care numai unul a fost marcat în prealabil (radioactiv sau chimic) (Fig. 4.7).

APLICAȚII GENERALE

Marcarea radioactivă sau enzimatică a unor fragmente ADN, se realizează în scopul utilizării ulterioare a acestora ca sonde moleculare. Este astfel posibilă identificarea prezenței unor fragmente ADN într-un amestec, care poate să fie fixat fie pe o membrană – transfer Southern, fie într-un preparat microscopic – hibridizare in situ.

Fig. 4.7. Etapele reacției de marcare chimică sau enzimatică

a. Moleculele ADN dublu catenare care urmează să fie marcate sunt mai întâi denaturate;

b. Hexanucleotide cu secvențe de baze total întâmplătoare se vor lega la lanțurile monocatenare pe baza complementarității bazelor; Aceste nucleotide au rol de primeri pentru sinteza noii catene de ADN; Se adaugă ADN polimeraza Klenow, si cei patru nucleozid trifosfați, dintre care numai unul a fost marcat în prealabil (dATP, DTTP,

dGTP și dCTP*)

c. Enzima leagă nucleotidele la capătul 3’ al primerului (hexanucleotid), respectând complementaritatea bazelor.

Lanțul ADN originar servește drept matriță pentru sinteza fragmentelor ADN marcate. Reacția are loc sub acțiunea ADN polimerazei Klenow; întotdeauna noile nucleotide se adaugă la capătul 3’, alungirea lanțului realizându-se în direcția 5’→3’.

4.4. LEGAREA MOLECULELOR ADN, CU AJUTORUL ADN LIGAZELOR

In vivo, ADN ligazele sunt enzime implicate în legarea fragmentelor de ADN, având rol în refacerea punților fosfodiesterice între grupările OH de la capetele 3’ și grupările fosfat de la capete 5’, intervenind în unirea fragmentelor Okazaki și totodată acționează în procesele reparatorii în urma acțiunii radiațiilor UV.

In vitro, modul lor de acțiune este similar, fiind necesar ca fragmentele de ADN care urmează să fie legate să aibă capete compatibile – netede sau coezive complementare (generate prin secționarea cu aceiași enzimă de restricție) (Fig. 4.8).

Fig. 4.8. Mecanismul de acțiune al ADN ligazelor

Conform mecanismului de acțiune al ADN polimerazei, gruparea OH de la capătul 3’ al unui fragment se leagă covalent la atomul de fosfor de la capătul 5’ al celui de-al doilea fragment, catalizând formarea unei legături fosfodiesterice, cu ajutorul energiei furnizate de hidroliza ATP.

În cazul în care fragmentele care urmează să fie legate au fost secționate cu enzime de restricție care au generat capete netede este necesar ca secvențele monocatenare să fie complementare. Astfel, în prima etapă se formează legăturile de hidrogen între bazele azotate complementare, după care intervine acțiunea ADN ligazei, care leagă ambele catene, formând o moleculă bicatenară de ADN (Fig. 4.9).

Fig. 4.9. Reacția de refacere a legăturilor fosfodiesterice între capete coezive generate în urma secționării cu enzime de restricție

APLICAȚII GENERALE

Ligazele au o largă utilizare în tehnologia ADN recombinat, deoarece catalizează formarea moleculelor hibride, alcătuite din vectorii de clonare și fragmentele de ADN care urmează a fi multiplicate. Ligazele utilizate în acest scop sunt cele de natură bacteriană, izolate din tulpini de E. coli, infectate sau neinfectate cu bacteriofagul T4.

4.5. SINTEZA ADN COMPLEMENTAR

Investigațiile din domeniul studiului expresiei genelor se orientează spre analiza populațiilor de ARNm, care reprezintă 1 – 2% din totalul de ARN celular și sunt constituite din câteva mii de tipuri diferite, corespunzătoare proteinelor prezente în acel moment în celulă.

Datorită cantității foarte reduse, extracția și purificarea ARNm nu este posibilă și de aceea se lucrează cu ARN total. Apoi, moleculele ARNm pot fi separate pe baza pe structurii lor specifice și anume resturile adenilate (100-250) prezente la extremitatea 3’ – secvența poly A.

Capetele poly(A) nu sunt codificate de ADN, dar sunt adăugate post translațional, înainte ca ARNm să fie exportat din nucleu în citoplasmă. Un complex enzimatic, care include o endonuclează și o polimerază poly(A), recunoaște o secvență semnal (5’ – AAUAAA’) din apropierea capătului 3’ al produsului de transcripție, secționează pre-ARNm în aval de acest semnal și adaugă 100-250 de resturi adenilate la capăzul 3’. Capetele poly(A) facilitează exportul ARNm din nucleu, stabilizează ARNm împotriva degradării exonucleazice și par să fie implicate în inițierea translației.

Pentru separarea ARNm dintr-un amestec de ARN total se utilizează oligonucleotide dT (poly T), care sunt fixate pe un suport solid. Acest suport este amplasat fie ca umplutură în coloane sau se fixează pe particule magnetice.

În primul caz amestecul de ARN total se trece pe coloane, ARNm se leagă de oligonucleotidele dT, datorită complementarității bazelor iar celelalte tipuri de molecule ARN sunt eliminate. Recuperarea ARNm are loc printr-o simplă eluare cu solvenți specifici.

În cel de-al doilea caz soluția ARN total este pusă în contact cu particulele magnetice atașate la oligonucleotidele dT, pe care se fixează ARNm. Are loc apoi separarea într-un câmp magnetic, după care moleculele de acid nucleic se recuperează cu solvenți specifici.

În cazul aplicării unor tehnici mai avansate nu este necesară separarea ARNm, ci se analizează direct ARN total.

În continuare are loc sinteza moleculelor de ADN complementar (ADNc), care reprezintă numai informația pură formată din secvențele de exoni care alcătuiesc anumite gene. Fragmentele de ADNc se sintetizează artificial în laborator, pe o moleculă de ARNm, drept copie complementară, în prezența enzimei reverstranscriptaza.

Reverstranscriptaza denumită și ADN polimeraza dependentă de ADN este o polimeraza care transcrie o moleculă monocatenară de ARN într-o moleculă monocatenară de ADN. Această enzimă a fost descoperită de doi cercetători care au lucrat independent, Howard Temin și David Baltimore în 1970, care au primit premiul Nobel pentru Fiziologie și Medicină în anul 1975. În mod natural reverstranscriptaza se găsește în virusurile ARN (ribovirusuri), iar descoperirea ei a adus un argument împotriva așa numitei dogme a geneticii conform căreia informația genetică este transferată întotdeauna în direcția ADN →ARN→proteine.

Pentru ca revers-transcriptaza să fie activă este necesară prezența unei secvențe scurte dublu catenare la capătul 3’, care acționează ca un primer pentru polimerază.

Acest punct de pornire poate fi furnizat de către o nucleotidă dT, de dimensiuni scăzute, care se leagă la capătul poly(A) al moleculei de ARNm funcționează ca un primer.

Apoi, revers-transcriptaza adaugă deoxi-nucleotide la capătul 3’ al primerului, în direcția specifică 5’→3’, ținând cont de complementaritatea bazelor.

Produsul de reacție este o moleculă hibridă ADNc –ARNm, alcătuită deci din ARN matriță și o moleculă complementară de ADN monocatenar.

La capătul 5’ al moleculei ARNm, reverstranscriptaza poate cauza o răsucire a noii catene ADN prin utilizarea ultimelor baze ale acesteia ca matriță pentru sinteza unui alt lanț complementar, cu o lungime de 12-20 bp. Acest fragment formează o buclă, care furnizează, un primer (o grupare –OH la un capăt 3') de la care începe sinteza ADN polimerazei.

Apoi, molecula ARNm este degradată prin tratare cu substanțe alcaline sau prin fierbere (procese care conduc la degradarea exclusivă a ARN), iar molecula ADNc monocatenară care va reprezenta matrița de copiat pentru ADN polimerază.

Bucla formată la capătul 3' al moleculei ADNc monocatenară furnizează un primer natural pentru următoarea etapă în care este utilizată ADN polimeraza I, fragment Klenow, pentru a transforma molecula monocatenară într-una bicatenară. În această reacție polimeraza utilizează molecula monocatenară de ADNc pentru a sintetiza o secvență identică cu ARNm original.

Produsul obținut este un dublu helix, cu o buclă la unul dintre capete. Pentru a se genera o moleculă bicatenară de ADN bucla este degradată de către nucleaza S1, care secționează în special fragmente de ADN monocatenar (Fig. 4.10).

Fig. 4.10. Sinteza moleculei bicatenare de ADNc

Fig. 4.10. Sinteza moleculei ADNc, cu ajutorul unui primer oligo dT și a reverstranscriptazei

Metodele de sinteză a ADN complementar se bazează pe capacitatea enzimei revers transcriptaza de a transcrie ARN mesager într-o moleculă de ADN complementar monocatenară, într-o reacție denumită de sinteză a primei catene. Totuși, datorită faptului că revers transcriptaza nu poate transcrie întreaga moleculă de ARNm, capătul 5’ tinde să rămână nereprezentat în populația de ADNc.

Această sinteză incompletă apare mai ales atunci când moleculele ARNm au o lungime mare sau sunt împachetate datorită structurilor secundare care se formează. Prin urmare se formează molecule ADNc incomplete deoarece acțiunea revers-transcriptazei încetează înainte de realizarea completă a transcripției. Pentru a corecta aceste dezavantaje pot fi aplicate tehnici mai avansate de sinteză, care sunt prezentate în capitolul 5.1.3.

APLICAȚII GENERALE

Moleculele de ADNc sunt sintetizate ori de câte ori se dorește efectuarea unor investigații la nivel de ARN. Astfel, este posibilă obținerea unor biblioteci ADNc, care să fie utilizate în procesele de cartare genetică, fizică sau în scopul identificării genelor. Totodată ADNc permite evaluarea cantitativă sau calitativă a expresiei genelor prin tehnici de amplificare PCR sau microarray.

4.6. IDENTIFICAREA PROTEINELOR SPECIFICE CU AJUTORUL ANTICORPILOR

Analizele moleculare se efectuează în general la nivelul acizilor nucleici, ceea ce conferă informații cu privire la structura genomului sau la transcripția genelor. De miâulte ori prezintă interes și obținerea de informații cu privire la procesele translaționale, respectiv post-translaționale.

În cazul din urmă, dacă se dorește identificarea anumitor proteine este necesară utilizarea anticorpilor specifici, care formează cupluri cu proteina de interes.

Anticorpii sunt proteine, având ca unitate de bază un monomer constituit din patru structuri polipeptidice, organizate în regiuni simetrice. Structura tridimensională este conferită de legăturile disulfidice. Două dintre structuri sunt lanțuri grele H („heavy”), cu greutate moleculară mare și două sunt lanțuri ușoare L („light”), asocierea între ele realizându-se în ordinea L-H-H-L. La rândul lor aceste lanțuri se subdivid în regiunea V (variabilă) de la capătul NH2 terminal și C (constantă) din zona C-terminală, repartizându-se astfel: pe lanțul H-VH, CH 1, CH2 și CH3, iar pe lanțul L-VL și CL (Fig. 4.11.) În structura anticorpilor se diferențiază două regiuni, Fab și Fc, care prezintă diferențieri din punct de vedere funcțional.

Fig. 4.11 Structura anticorpilor utilizați pentru identificarea proteinelor

În structura anticorpilor se diferențiază două regiuni, Fab și Fc, care prezintă diferențieri din punct de vedere funcțional.

Fragmentul Fab („fragment antigen binding”), situat în regiunea aminoterminală a lanțurilor grele și ușoare are rol în legarea proteinei. Fragmentul Fc, situat la extremitatea distală, la capătul carboxi, interacționează cu receptorii specifici, fiind implicat în fixarea pe celule.

În funcție de modul lor de producere, anticorpii pot fi împărțiți în două categorii: policlonali sau monoclonali.

Anticorpii policlonali sunt produși în animale de talie medie, în urma injectării cu proteină de interes. În urma imunizării, în organismul animal se sintetizează anticorpi specifici care sunt apoi purificați din sânge.

Anticorpii policlonali. au o sensibilitate ridicată dar o specificitate de recunoaștere mai redusă, comparativ cu anticorpii monoclonali.

Anticorpii monoclonali sunt sintetizați în culturi de celule hibride, obținute prin fuzionarea in vitro a unor celule producătoare de anticorpi (splenocite sau limfocite obținute de la animale imunizate cu o anumită antigenă) cu celule neoplazice obținute din mieloame sau limfoame. Sunt astfel exploatate caracteristicile ambelor tipuri de celule – capacitatea de diviziune nelimitată, preluată de la celulele tumorale și proprietatea de a produce anticorpi, preluată de la splenocite (Fig. 4.12).

Fig. 4.12. Procedura de obținere a anticorpilor monoclonali în celule hibride, obținute prin fuzionarea unor celule producătoare de anticorpi cu celule tumorale

Anticorpii monoclonali au unele avantaje deoarece ei exprimă o afinitate și specificitate uniformă față de un singur determinant antigenic sau epitop și pot fi produși în cantități mari, in vitro, în culturile de celule.

După sinteză, ambele tipuri de anticorpi necesită etape suplimentare de purificare, după care pot să fie utilizați pentru identificarea unor proteine specifice.

APLICAȚII GENERALE

Anticorpii permit identificarea oricărei proteine prin testări imunologice cum sunt: Western Blotting și ELISA (“Enzyme Linked Immunosorbent Assay”). În funcție de tipul proteinei țintă este posibilă detectarea unei afecțiuni induse enzimatic, prezența unor patogeni sau a unor organisme modificate genetic.

4.7. ANALIZA MOLECULELOR DE ACIZI NUCLEICI/PROTEINE PRIN ELECTROFOREZĂ

Electroforeza este o metodă analitică de separare a particulelor încărcate electric sub acțiunea unui câmp electric uniform aplicat din exterior.

În funcție de mediul în care se efectuează separarea, metodele electroforetice se împart în două clase: electroforeza în mediu liber – proces care se bazează pe electromigrarea liberă a speciilor ionice într-o soluție tampon corespunzătoare și electroforeza în mediu stabilizant – proces care presupune utilizarea unor medii suport care pot fi inerte: hârtie de filtru, acetat de celuloză, silicagel, alumină sau dimpotrivă pot participa activ în separare, interacționând cu particulele care migrează: geluri de amidon, agaroză, poliacrilamidă.

4.7.1. ELECTROFOREZA ÎN GEL DE AGAROZĂ

Separarea acizilor nucleici se realizează de obicei prin electroforeză în gel de agaroză care este cea mai avantajoasă metodă de analiză atât pentru ADN cât și pentru ARN.

Agaroza este un polizaharid inert, care conduce la formarea unui gel cu pori de anumite dimensiuni, în funcție de concentrație. Sub acțiunea câmpului electric acizii nucleici care sunt macromolecule încărcate parțial negativ (datorită reziduurilor fosfat) migrează spre anod (+).

Rata de migrare a moleculelor de acizi nucleici liniari, într-un câmp electric este invers proporțională cu lungimea moleculelor, astfel că pot fi separate fragmente de dimensiuni diferite, iar lungimile lor pot fi apreciate prin compararea cu un marker ADN/ARN, pentru care se cunosc dimensiunile fragmentelor.

Benzile de acizi nucleici prezente în gelul de agaroză se vizualizează direct, prin colorare cu o substanță fluorescentă, bromura de etidiu și iluminare UV. Această metodă de vizualizare este foarte sensibilă, permițând detectarea unor benzi de ADN care conțin până la 2 ng de ADN.

Bromura de etidiu, abreviată în general ca BrEt este un colorant fluorescent pentru acizi nucleici, cu o moleculă plană (Fig.4.13). Aceasta se intercalează între bazele azotate ale unei molecule de acid nucleic, formând complecși care absorb radiația în domeniul UV și o retransmit în vizibil. Astfel este posibilă vizualizarea fragmentelor de acizi nucleici, în urma expunerii la o lumină UV. Bromura de etidiu are o acțiune mutagenă, cancerigenă sau teratogenă în funcție de organism și de condițiile externe.

Fig. 4.13 Structura bromurii de etidiu (a) și modul de intercalare în molecula ADN (b)

Rata de migrare electroforetică a ADN depinde de mai mulți parametri importanți și anume:

Dimensiunea fragmentelor de ADN

Fragmentele de ADN migrează cu viteze care sunt invers proporționale cu logaritmul greutății lor.

Concentrația gelului

Cantitatea de agaroză prezentă în gel determină dimensiunile porilor care se formează, influențând rata de migrare a fragmentelor de acizi nucleici. De aceea concentrația gelului trebuie să fie aleasă cu grijă, pentru a permite separarea optimă a fragmentelor analizate.

Fragmentele mari de acizi nucleici (5-60 kb) pot fi separate în geluri cu concentrație redusă 0,3 – 0,5 %, iar fragmentele mici (0,1-3,0 kb) pot fi analizate în geluri cu concentrație mare 2%. O concentrație medie, de 0,8% poate să conducă la o separare bună a fragmentelor din domeniul 0,5-10 kb. Concentrația gelului de agaroză se alege deci în funcție de intervalul în care se încadrează fragmentele analizate.

Conformația ADN

Formele circulare sau liniare de acizi nucleici cu aceiași greutate moleculară migrează diferit, nefiind posibilă compararea lor.

Tensiunea la care are loc migrarea

La tensiuni scăzute viteza de migrare a fragmentelor liniare este proporțională cu tensiunea. Dacă se utilizează tensiuni prea ridicate rata de separare scade. Pentru a obține o rezoluție maximă, migrarea trebuie să se producă la o tensiune de 3-10V/h/cm.

Temperatura

Temperatura nu afectează mobilitatea electroforetică, dacă se menține în intervalul 4-30°C. În general electroforeza în geluri de agaroză are loc la temperatura camerei. Dacă se utilizează geluri cu concentrații mai mici de 0,5% este necesară menținerea gelului la temperaturi scăzute, deoarece la temperaturi mai ridicate acesta se poate lichefia.

4.7.2. ELECTROFOREZA ÎN GEL DE POLIACRILAMIDĂ

În cazul electroforezei în gel de poliacrilamidă pot fi analizate fragmente de acizi nucleici cu dimensiuni mici (<1kb), sau fracții proteice în formă denaturată.

Față de alte medii suport, gelul de poliacrilamidă are următoarele avantaje practice: putere mare de rezoluție, reproductibilitate; posibilitatea controlului dimensiunilor porilor pe un domeniu larg; inerția, stabilitatea chimică la variații mari de pH, temperatură și forță ionică, transparență perfectă, rezistență și flexibilitate.

Obținerea gelurilor de poliacrilamidă se realizează printr-o reacție de polimerizare ireversibilă a doi monomeri: acrilamidă și bisacrilamidă, având ca inițiator persulfatul de amoniu (NH4) S2O8 și catalizator tetra metilen-diamina (TEMED). Bisacrilamida funcționează ca agent de reticulare.

Mărimea efectivă a porilor în gelurile de poliacrilamidă depinde de concentrația totală a monomerilor (acrilamidă si bisacrilamidă) (T%) și de gradul de reticulare (C%), care reprezintă raportul dintre cantitatea de agent de reticulare (bisacrilamidă) și cantitatea totală de monomeri (acrilamidă si bisacrilamidă).

Concentrația gelurilor de poliacrilamidă, respectiv gradul de reticulare se stabilesc în funcție de dimensiunile particulelor care urmează să fie separate.

Fracțiunea reprezentată de proteinele de analizat este extrasă și analizată apoi prin electroforeză în gel de poliacrilamidă. Benzile, care reprezintă fracțiile proteice sunt fixate și developate din gel cu soluții de coloranți speciali.

După extragere în soluții de extracție specifice, proteinele analizate, sunt denaturate în prezența dodecilsulfatului de sodiu (SDS). Acesta este un detergent anionic care distruge aproape toate legăturile necovalente. Se mai poate adaugă mercaptoetanol pentru distrugerea punților de sulf.

SDS-ul mai are proprietatea de a se lega în raport constant (1,4g SDS/1g proteină) la toate proteinele. Se formează astfel complexe SDS-proteină denaturată, încărcate negativ. Sarcinile intrinseci ale polipeptidelor sunt nesemnificative comparativ cu sarcinile electrice negative rezultate după legarea SDS-ului, fiind astfel posibilă separarea strict în funcție de dimensiunile polipeptidelor.

Desfășurarea electroforezei se urmărește vizual, datorită introducerii în probele analizate a unei soluții colorant de migrare.

După terminarea migrării, fracțiile proteice separate în gel se vizualizează în prezența colorantului Comassie Brillant Blue sau a azotatului de argint. Colorarea cu azotat de argint este mai laborioasă, dar permite vizualizarea unor cantități foarte mici de proteină – 0,02 μg, comparativ cu colorantul menționat – 0,1μg.

APLICAȚII GENERALE

Analizele prin electroforeză a acizilor nucleici și a proteinelor au o gamă foarte largă de utilizare, deoarece permit vizualizarea fragmentelor ADN formate în urma secționării cu enzime de restricție, a amplificării PCR, a produșilor pentru secvențializare, a evaluării moleculelor de ADN recombinat. Totodată această tehnică stă la baza dezvoltării tehnicilor Southern, Northern și Western, care sunt prezentate în capitolul 5.2

CAPITOLUL V

PROCEDEE COMPLEXE DE ANALIZĂ ȘI EVALUARE A MOLECULELOR DE ACIZI NUCLEICI ȘI PROTEINE

5.1. METODE DE INVESTIGAȚIE BAZATE PE PCR (Polymerisation Chain Reaction)

O dată cu dezvoltarea tehnicilor de investigație în biologia moleculară, tehnica PCR a suferit o serie de modificări, care permit lărgirea posibilităților de utilizare. În continuare vor fi prezentate cele mai importante variante ale amplificării PCR.

5.1.1. METODA AMPLIFICĂRII PRIN REACȚIA ÎN LANȚ A POLIMERAZEI – PCR cu punct final

În literatura de specialitate acronimul PCR este utilizat pentru tehnica PCR tradițional, care mai este denumită ca PCR cu punct final, deoarece rezultatul poate fi evidențiat numai la sfârșitul reacției de amplificare. În literatura de limba engleză metodă este cunoscută sub denumirea de” End-point PCR”.

În acest caz amplificarea fragmentului specific de ADN dublu catenar, denumit și fragment țintă se desfășoară după principiile metodologice descrise în capitolul 4.3.1.

Pentru a verifica dacă în urma amplificării au fost sintetizate fragmentele așteptate, produșii PCR sunt separați prin electroforeză în gel de agaroză. Dimensiunile fragmentelor sunt determinate prin compararea cu un marker molecular de greutate (în limba engleză „molecular weight marker”).

Se poate aprecia astfel dacă secvența țintă este prezentă în proba analizată și totodată dacă are dimensiunea așteptată. Din acest considerent metoda amplificării prin PCR cu punct final este indicată pentru “detectarea” secvențelor dintr-un eșantion biologic, fiind deci o metodă calitativă.

Accesibilitatea metodei de amplificare prin PCR cunoaște și limite, condiționate de lungimea fragmentului amplificabil, deci a ADN inițial. Astfel amplificarea fragmentelor de 100-1000 nucleobaze este relativ facilă. Se estimează că limita superioară a lungimii fragmentelor amplificabile este de 3 kb, pentru că, la valori mai mari scade randamentul amplificării. Totodată este posibilă evidențierea prezenței unei anumite secvențe de ADN, fără a oferi informații privitoare la numărul de copii sau cantitatea de ADN existentă în proba de analizat.

5.1.1.1. PCR MULTIPLEX

PCR multiplex se încadrează în categoria PCR cu punct final, deoarece analiza produșilor de amplificare se realizează la sfârșitul reacției, dar se diferențiază prin posibilitatea de desfășurare a mai multor reacții de amplificare în același timp.

În amestecul de amplificare se introduc mai multe seturi de primeri, fiecare specific pentru o anumită secvență. Teoretic, reacțiile de amplificare ar trebui să aibă loc în același timp, fiecare set de primeri amplificând o anumită secvență ADN. Practic, în astfel de reacții de amplificare va exista întotdeauna un risc ridicat al obținerii unor rezultate eronate deoarece:

Fiecare set de primeri necesită condiții de reacție diferite (de exemplu regim de temperaturi diferit sau o concentrație diferită a reactanților);

Combinarea diferitelor seturi de primeri poate să crească riscul amplificării altor fragmente decât secvențele țintă;

Atunci când mai multe fragmente țintă sunt amplificate într-o reacție PCR, ele concurează pentru reactanți. În această competiție, un fragment care este prezent într-un număr mai mare de copii la început va predomina asupra altor fragmente care sunt prezente în număr mai redus.

Chiar dacă tehnica PCR multiplex prezintă și o serie de dezavantaje este totuși utilizată pentru un screening general al probelor de analizat, după care probele posibil pozitive sunt reanalizate cu un singur set de primeri.

5.1.1.2. PCR CANTITATIV COMPETITIV

Tehnica PCR cantitativ competitiv este asemănătoare cu PCR clasic, dar în acest caz are loc amplificarea simultană a două tipuri de ADN, care conțin secvențe asemănătoare, amplificabile cu același set de primeri. Primul tip de ADN este extras din proba de analizat, iar cel de-al doilea este un standard intern denumit competitor. La fel ca la PCR calitativ, produșii de amplificare sunt analizați la sfârșitul reacției.

PCR competitiv furnizează posibilități foarte bune pentru o detectare simplă și sigură a anumitor secvențe în probele de analizat și totodată o determinare semi- cantitativă a acestora.

În acest caz, în reacția de amplificare se introduce ADN extras din proba de analizat care este purtătorul potențial al unei secvențe țintă și un ADN competitor, sau standard intern, care poartă o secvență țintă puțin modificată, dar care poate fi amplificată cu același set de primeri. În cazul competitorului secvența țintă a fost fie scurtată, prin deleție, fie mărită prin inserție. Aceste modificări nu afectează însă situsurile de legare ale primerilor.

Ca standarde interne sau competitori sunt utilizate produse care conțin secvența țintă cu o concentrație cunoscută.

Deci, ADN standard intern cu concentrație cunoscută este adăugat în amestecul de reacție și amplificat împreună cu ADN țintă al probei cu concentrație necunoscută. La sfârșitul reacției de amplificare produșii obținuți se analizează prin electroforeză în gel de agaroză și sunt vizualizați prin iluminare UV în prezența bromurii de etidiu. Produșii au o intensitate a fluorescenței care este proporțională cu cantitatea de ADN amplificat și ei apar în gelul de agaroză ca două benzi distincte, cu intensități diferite (Fig. 5.1).

Dacă se realizează o singură reacție de amplificare se poate preciza numai dacă concentrația probei necunoscute este mai mare, sau mai mică comparativ cu standardul intern.

În scopul obținerii unor rezultate mai complexe, se realizează mai multe amestecuri de amplificare în care pentru standardul intern se realizează diluții seriale, iar proba cu concentrație necunoscută se menține constantă. Produșii de reacție se analizează prin electroforeză în gel de agaroză și se compară intensitatea benzilor rezultate din fiecare amestec de amplificare. Apoi, se identifică amestecul pentru care intensitatea celor două benzi este identică, considerându-se că în acest caz concentrația probei necunoscute este identică cu cea a standardului intern. Dacă pentru nici unul dintre amestecurile de reacție nu se vizualizează fragmente cu aceiași intensitate, atunci se pot efectua alte diluții ale probei standard, în așa fel încât să fie posibilă în final evaluarea concentrației probei necunoscute.

O variantă mai complexă a PCR cantitativ competitiv este PCR cantitativ dublu competitiv, care are la bază același principiu, aplicat de două ori: o dată pentru o genă specifică speciei și standardului ei intern și a doua oară unei gene specifice și standardului intern corespunzător. Rezultatele obținute din ambele amplificări PCR permit calcularea conținutului de inițial al secvenței de interes, comparativ cu genă specifică speciei..

Atât PCR cantitativ competitiv, cât și sistemul dublu competitiv prezintă un avantaj major deoarece nu necesită nici un echipament în plus, comparativ cu PCR cantitativ. Metodele mai sus menționate sunt totuși considerate a fi semi cantitative, deoarece ele necesită un standard cu care să fie comparate. Compararea se realizează vizual, din această cauză fiind posibilă apariția unor erori. Rezultatul poate fi de formă mai mare, egal sau mai mic comparativ cu proba standard.

Fig. 5.1. Desfășurarea unui proces PCR semi-cantitativ competitiv

5.1.1.3. AMPLIFICAREA PRIN REACȚIA ÎN LANȚ A POLIMERAZEI – PCR CU TEMPERATURĂ VARIABILĂ DE LEGARE A PRIMERILOR

În cazul utilizării tehnicii PCR, uneori rezultatele așteptate nu sunt corespunzătoare, deoarece legarea primerilor la catena matriță are loc cu o eficiență scăzută. În această situație se consideră că temperatura de legare a primerilor, stabilită teoretic nu asigură condițiile optime de desfășurare a reacției. De aceea este necesară optimizarea procesului prin urmarea unui program cu gradient de temperatură, sau „PCR Touchdown”.

Programele cu gradient de temperatură presupun folosirea condițiilor similare de amplificare și anume același amestec de reacție, aceeași matriță ADN, aceiași primeri; reacțiile se desfășoară în același timp în aparatul thermalcycler, dar temperatura de legare a primerilor diferă pe coloane. Astfel se poate stabili temperatura optimă a acestui pas de care depinde în mare măsură reușita unei reacții de amplificare.

Programele PCR Touchdown se utilizează mai ales atunci când se urmează tehnica PCR Multiplex și anume se dorește amplificarea unui ADN matriță în același timp cu mai mulți primeri.

Programul de tip Touchdown presupune folosirea unei variații a temperaturii de legare a primerilor, în cadrul aceleiași reacții de amplificare. Diferențele față de programele cu gradient de temperatură constau în faptul că nu se mai urmărește stabilirea unei temperaturi optime de legare ci se dorește ca amplificarea să se producă în cadrul aceluiași program pentru un număr cât mai mare de perechi de primeri, în condiții optime.

Un astfel de program este compus din aceeași pași ai reacției de amplificare, dar temperatura fiecărui ciclu de legare a primerilor diferă. Într-o etapă de amplificare temperatura crește cu o rată de 2°C la fiecare două cicluri, pornind de la premisa că perechile de primeri folosite vor atinge optimul de legare la una dintre temperaturile folosite.

Aceste programe se folosesc cu succes, deoarece pentru anumiți primeri este necesară o temperatură optimă de legare doar la debutul amplificării, după care procesul decurge normal chiar dacă temperatura de legare scade.

De menționat că primerii folosiți în acest program de amplificare trebuie să fie specifici, preciși și robuști, pentru a preîntâmpina apariția posibilă a produșilor de amplificare nespecifici.

5.1.2. PCR ÎN TIMP REAL

În biologia moleculară tehnica PCR în timp real, denumită și PCR cantitativ în timp real (Q-PCR/qPCR) este o tehnică de laborator care permite amplificarea și cuantificarea simultană a unei secvențe țintă de ADN.

În literatura de specialitate de limbă engleză metoda este cunoscută sub denumirea de „real-time polymerase chain reaction” – reacția în lanț a polimerazei urmărită în timp real sau „quantitative real time polymerase chain reaction” – reacția în lanț a polimerazei, cantitativă, urmărită în timp real, notată abreviat prin acronimul (Q-PCR/qPCR).

Această tehnică urmează principiul PCR, caracteristic fiind faptul că ADN amplificat este cuantificat în timp real, pe măsură ce se acumulează în reacție, după fiecare ciclu de amplificare. Astfel este posibilă determinarea numărului absolut al copiilor unei secvențe ADN specifice sau poate avea loc o cuantificare relativă, atunci când se raportează la o genă de referință.

Tehnica PCR în timp real a devenit disponibilă în anul 1996, o dată cu introducerea pe piața a primului echipament care a permis urmărirea desfășurării reacției de amplificare în timp. De atunci și până în prezent a rămas cea mai precisă și sensibilă tehnică aplicată pentru detectarea și cuantificarea acizilor nucleici.

PCR în timp real este un sistem bazat pe o monitorizare continuă a produșilor PCR, care se realizează prin măsurarea semnalului fluorescent al unei probe interne de-a lungul reacției. O problemă în procesul de monitorizare a desfășurării procesului a fost găsirea unei metode care să permită detecția produșilor PCR pe măsură ce ei se formează. În acest scop se aplică în prezent două strategii importante: una utilizează un colorant fluorescent care are capacitatea de a se lega numai la moleculele de ADN bicatenare iar cea de-a doua se bazează pe prezența unor sonde oligonucleotidice, alcătuite din ADNmc, care se leagă în interiorul fragmentului ADN care urmează să fie amplificat și devin fluorescente după ce reacția a avut loc.

5.1.2.1. CUANTIFICAREA ACIZILOR NUCLEICI CU AJUTORUL COLORANȚILOR SPECIFICI

Cea mai simplă și economică modalitate pentru detectarea și cuantificarea produșilor PCR este utilizarea SYBR Green, o substanță fluoroforă care are proprietatea de a se cupla cu moleculele ADN bicatenar (ADNbc), mărindu-și astfel fluorescența de peste 1000 de ori.

SYBR green este un colorant fluorescent sintetic, introdus la începutul anilor 1990, care se leagă la fragmentele ADN dublu catenar cu o specificitate foarte mare. Este utilizat pe scară foarte largă în cercetările de biologie moleculară pentru a cuantifica și vizualiza ADN dublu catenar.

Este un colorant cianinic asimetric, stabil într-un interval larg de temperatură, ceea ce înseamnă că poate fi utilizat pentru a monitoriza reacțiile biochimice (Fig. 5.2.). Complexele ADN-colorant absorb lumina în spectrul albastru (λmax = 488 nm) și emit lumină verde (λmax = 522 nm).

Fig. 5.2. Structura colorantului SYBR Green

Pe măsură ce cantitatea de ADNdc crește, ca rezultat al amplificării secvențelor specifice, crește și cantitatea de SYBR Green fixat la ADN și deci gradul de fluorescență al amestecului de reacție. Energia emisă de fluorofor în urma excitării în UV este înregistrată la sfârșitul fiecărui ciclu de amplificare, fiind proporțională cu cantitatea inițială a secvențelor ADN țintă.

Dezavantajul utilizării colorantului SYBR green este legarea lui la orice moleculă de ADN dublu catenar din reacție, inclusiv dimerii alcătuiți de primeri și alți produși de reacție nespecifici, ceea ce conduce la o supraestimare a concentrației secvențelor țintă.

SYBR Green este totuși cea mai economică alegere pentru detectarea produșilor PCR în timp real, deoarece este ieftin, ușor de utilizat și sensibil. El poate fi utilizat în orice reacție de amplificare, fără a fi necesară pregătirea unor sonde pentru fiecare secvență țintă particulară care urmează să fie analizată. Pentru că legarea este nespecifică procesul de detecție necesită o optimizare considerabilă și sunt necesare alte metode ulterioare pentru validarea rezultatelor.

5.1.2.2. CUANTIFICAREA ACIZILOR NUCLEICI CU AJUTORUL SONDELOR MOLECULARE SPECIFICE

De-a lungul timpului au fost dezvoltate mai multe sisteme de marcare, denumite sonde moleculare, care se leagă la fragmentul țintă, dar devin fluorescente numai după ce reacția de amplificare a avut loc. În continuare sunt prezentate cele mai uzuale tipuri de sonde moleculare, cu utilizare în tehnica Real-Time PCR.

SONDE MOLECULARE TaqMan

Sondele moleculare TaqMan sunt fragmente scurte de ADN, marcate cu un colorant raportor fluorescent (R) și un colorant absorbant pentru fluorescența (Q), fiind denumite și sonde interne. Atunci când cei doi coloranți se află în apropiere, legați la același fragment ADN nu este emis semnal fluorescent.

Secvența sondelor este astfel stabilită încât să se lege exact în regiunea care urmează să fie amplificată. Deci, pentru fiecare secvență țintă trebuie să fie utilizată o „probă TaqMan” specifică.

În cadrul fiecărui ciclu de amplificare ADN este prima dată denaturat și separat în două molecule monocatenare. A doua etapă este legarea primerilor și în același timp și a probei interne. Primerii se leagă la capetele fragmentului care urmează a fi amplificat, iar proba se leagă în mijlocul acestuia. În ultima etapă ADN polimeraza sintetizează noile catene de ADN, pornind de la primeri. Deoarece polimeraza aleasă are o activitate exonucleazică 5’ – 3’ foarte pronunțată, atunci când ajunge în dreptul probei o secționează în nucleotidele componente. În această situație colorantul raportor fluorescent și cel absorbant nu mai sunt apropiați, astfel ca semnalul fluorescent poate fi detectat. Semnalul fluorescent este înregistrat la sfârșitul fiecărui ciclu de amplificare, fiind proporțional cu cantitatea inițială a secvențelor DNA țintă (Fig. 5.3).

Monitorizarea în timp real a desfășurării reacției de amplificare prin măsurarea fluorescenței conduce la trasarea unor curbe de amplificare alcătuite dintr-o fază exponențială, una liniară și una de platou. Se investighează în paralel probe standard, cu concentrații cunoscute și totodată probele de analizat.

Se stabilește o valoare de prag „Threshold” în zona de amplificare exponențială, după care se stabilește valoarea CT („threshold cycle”), care reprezintă numărul de cicluri necesare unei probe pentru a ajunge la valoarea de prag. Cu cât cantitatea inițială de ADN a fost mai mare, cu atât valoarea CT va fi mai mică. Valorile CT pentru probele standard vor sta la baza trasării unei drepte de etalonare. Raportarea valorilor CT ale probelor de analizat la dreapta de etalonare permite stabilirea concentrației inițiale de secvență țintă în probă ADN analizată.

Analizele Real-Time PCR cu sonde moleculare TaqMan sunt utilizate în studiile de expresie a genelor, identificarea virusurilor și a bacteriilor, discriminarea alelelor, cuantificarea ADN și genotiparea polimorfismului unei singure nucleotide.

Fig. 5.3. Desfășurarea procesului Real-Time PCR cu sonde moleculare TaqMan

Fig. 5.4. Stabilirea pragului de amplificare, determinarea valorilor CT și trasarea dreptei de etalonate

SONDE “molecular beacons”

Sondele “molecular beacons” sunt oligonucleotide monocatenare, cu o structură de “ac de păr”. În prezența unei secvențe țintă ele se desfac, se leagă și devin fluorescente. Sondele menționate sunt compuse din patru subunități (Fig. 5.5).

Fig. 5.5. Structura unei sonde „Molecular beacons”

Aceste sonde pot să identifice prezența unui acid nucleic specific dintr-o soluție omogenă. În prezența unei secvențe complementare regiunile liniare (“stem”), se separă, rezultând o sondă care hibridizează cu secvența țintă.

Pe parcursul procesului de amplificare sonda moleculară intervine activ, după cum urmează: în timpul unei etape de denaturare sonda are o conformație alungită și emite fluorescență; pe măsură ce temperatura scade, pentru a permite legarea primerilor, regiunile liniare se asociază rapid, astfel că semnalul fluorescent nu mai este emis; dacă însă sondele se leagă la secvența țintă, fluorescența este emisă din nou; la creșterea temperaturii, pentru a facilita sinteza ADN, sondele disociază de secvențele țintă, ne- interferând cu polimerizarea; câte o nouă reacție de hibridizare are loc în timpul fiecărei etape de legare a primerilor, din fiecare ciclu, iar intensitatea fluorescenței este corelată cu acumularea de produși de amplificare (Fig. 5.6).

Fig. 5.6. Desfășurarea procesului Real-Time PCR cu sonde „Molecular beacons”

Deci, fluorescența este monitorizată și înregistrată în cursul fiecărei etape de legare a primerilor, când sonda se atașează la secvența țintă complementară.

Pe baza informațiilor cu privire la semnalul fluorescent înregistrat este posibilă cuantificarea numărului inițial de copii ale secvenței ADN de interes.

Utilizarea sondelor “molecular beacons” permite dezvoltarea unui număr mare de aplicații cum ar fi: identificarea polimorfismului la nivel de nucleotide; detecția acizilor nucleici în timp real; cuantificare prin tehnica Real-Time PCR; identificarea și discriminarea alelică; tehnici de diagnostic clinic.

Avantajele utilizării sondelor „Molecular beacons”

Structura specifică a acestor sonde permite evidențierea nepotrivirii unei singure perechi de baze, deoarece moleculele legate greșit sunt mai puțin stabile din punct de vedere termodinamic, comparativ cu moleculele hibride formate între sondele liniare și secvențele țintă parțial complementare.

Mai mult, spre deosebire de sondele liniare, în cazul sondelor „molecular beacons” transferul de energie se realizează direct, de la colorantul raportor la cel absorbant. Astfel se pot utiliza ca raportori un număr mare de posibili fluorofori, cu un colorant absorbant comun.

Acest avantaj are o importanță deosebită atunci când se dorește identificarea concomitentă a mai multor secvențe țintă (experiment multiplex), situație în care pot fi utilizate mai multe sonde, cu diferiți fluorofori ca raportori.

Sonde – primeri Scorpions

Primerii Scorpions sunt molecule bifuncționale în care un primer este linkat covalent cu o sondă moleculară, astfel că sunt alcătuiți dintr-o structură similară sondelor „Molecular beacons” și o oligonucleotidă. Moleculele conțin deci atât un colorant raportor, cât și unul absorbant.

În timpul reacției PCR, primerul hibridizează cu secvența țintă și are loc extensia, datorită acțiunii ADN polimerazei. Primerii Scorpion pot fi utilizați pentru a examina și identifică puncte de mutație utilizând probe multiple. Fiecare sondă poate fi marcată cu un fluorofor diferit pentru a emite la lungimi de undă diferite.

Primerii Scorpion au legat la capătul 5' o sondă moleculară. Sonda este alcătuită dintr-o regiune liniară cu un fluorofor la un capăt și un absorbant la celălalt capăt.

Funcționarea Scorpion

În cazul primerilor Scorpion. Sonda trebuie să fie legată fizic la primer, ceea ce înseamnă că reacția care conduce la generarea de semnal este una uni moleculară. Aceasta este în contrast cu coliziunea bimoleculară necesară pentru alte tipuri de sonde, cum ar fi TaqMan sau molecular Beacons.

După ce a avut loc un ciclu complet. Secvența țintă nou sintetizată se va atașa la aceiași catena ca și sonda. Urmând cel de-al doilea ciclu de denaturare și legare, sonda și ținta hibridizează. Denaturarea buclei necesită mai puțină energie decât noul ADNbc produs. În consecință, secvența hairpin hibridizează cu o parte a produșii nou formați în PCR. Aceasta conduce la separarea fluoroforului de absorbant și cauzează emiși

Aplicații – analiza SNP, Real-time PCR, discriminare alelica, testări de genotipare într-un singur tub

Fig. 5.7. Desfășurarea procesului Real-Time PCR cu sonde-primeri Scorpions

5.1.3. PCR ASOCIAT CU REVERS-TRANSCRIPȚIA

(RT-PCR)

În ultima vreme, în biologia moleculară se acordă o atenție tot mai mare studiului expresiei genelor, deoarece o serie de procese metabolice din celulele vii sunt controlate pe această cale.

Astfel s-au dezvoltat tehnici de investigare asupra ARN, cum ar fi tehnica PCR asociată cu revers-transcripția. În literatura de limba engleză metoda este cunoscută sub denumirea de ”Reverse transcription polymerase chian reaction”, notată abreviat cu RT-PCR.

În cazul în care revers transcripția este asociată unei reacții PCR în timp real, tehnica poartă numele de tehnica PCR asociată cu reverstranscripția urmărită în timp real. În literatura de limba engleză metoda este cunoscută sub denumirea de ”Real-time reverse-transcription polymerase chian reaction”, notată abreviat cu qRT-PCR, RRT-PCR, sau RT-rt PCR.

În general, acronimul RT-PCR semnifică PCR asociat cu revers transcripția și nu PCR în timp real, dar unii autori nu au aderat la această convenție.

Tehnica RT-PCR presupune două etape și anume revers-transcripția (RT), proces în care ARN este copiat într-o moleculă de ADN complementar (ADNc), cu ajutorul revers-transcriptazei și a primerilor, după care are loc o amplificare PCR, care urmează toate etapele descrise anterior. Etapa de sinteză a ADNc este foarte importantă deoarece în cadrul PCR pot fi amplificate numai molecule ADN.

Procesul RT-PCR a fost dezvoltat după ce au fost caracterizate revers- transcriptazele sau ADN-polimerazele dependente de ARN de către H.M. Temin și D. Baltimore, la virusurile tumorale, descoperire pentru care au primit Premiul Nobel pentru Medicină în anul 1975. Revers-transcriptazele sintetizează ADN în direcția 5’-3’, la fel ca ADN polimerazele ADN-dependente și ARN-polimerazele, utilizând dezoxi-ribonucleozid-5’-trifosfați (dNTP) ca precursori și necesitând atât prezența matriței pe care o vor copia, cât și o catenă primer (amorsă) care să furnizeze capetele 3’-hidroxil libere.

Astfel, în cazul procesului de revers-transcripție este necesară prezența unei matrițe, care este constituită din moleculele de ARN și de un primer care să furnizeze punctul de pornire al sintezei ADN.

În stabilirea mecanismelor după care se desfășoară revers- transcripția, o importanță deosebită o reprezintă structura moleculelor ARNm. Se cunoaște că moleculele ARNm suferă o serie de modificări post translaționale prin atașarea la capătul 3’a unui fragment poly (A), conținând 100-250 de resturi adenozin-monofosfat (AMP), denumit extremitatea poly A („poly-A-3’ tail”). Această structură specifică a moleculelor ARNm stă la baza dezvoltării sistemelor de primeri (amorse) care să inițieze sinteza ADNc.

În prezent se cunosc trei tipuri de primeri:

o oligonucleotidă alcătuită din resturi poly-T, denumită primer oligo-dT, care se poate lega la toate moleculele de ARNm în același timp, pe baza complementarității poly-A – poly –T (Fig. 5.8 A)

un primer cu o secvență specifică, care va conduce la o copiere selectivă a unei singure molecule ARNm (Fig. 5.8 B)

un primer cu o secvență întâmplătoare, care se poate lega la orice moleculă ARNm, în orice poziție. Se produc astfel fragmente ADNc mai scurte, deoarece primerul nu se va lega exclusiv la capătul 3’ al moleculei de ARNm (Fig. 5.8 C).

Utilizarea primerului cu secvență întâmplătoare mărește probabilitatea ca extremitatea 5’ a moleculei de ARNm să fie convertită în ADNc, deoarece de obicei revers-transcriptaza nu atinge capetele 3’ ale moleculelor de ARNm cu o lungime mare.

Fig. 5.8. Tipurile de primeri și acțiunea lor în procesul de sinteza a ADNc (A) primer oligo-dT, (B) primer cu secvența specifică; (C) primer cu secvență întâmplătoare

ADNc sintetizat cu ajutorul revers-transcriptazei poate fi supus apoi amplificării prin PCR cu punct final, dacă se dorește o evaluare calitativă sau semicantitativă. În acest caz produșii de amplificare sunt analizați prin electroforeză în gel de agaroză, iar benzile obținute pot fi analizate comparativ. Revers-transcripția poate avea loc în același tub cu amplificarea PCR, procesul numindu-se RT-PCR într-o singură etapă (“one-step RT-PCR”) sau cele două reacții pot avea loc succesiv.

Dar, PCR cu punct final este o tehnică cu o sensibilitate mai redusă, cu un risc mai mare de contaminare a probelor datorită proceselor de manipulare care au loc după amplificare. De aceea se utilizează pe scară tot mai largă tehnica PCR asociată cu revers-transcripția urmărită în timp real. În acest caz în reacția de amplificare se introduce ADNc, urmându-se apoi toate etapele descrise în cadrul tehnicii PCR în timp real.

Astfel ADN amplificat este cuantificat în timp real, pe măsură ce se acumulează în reacție, fiind posibilă evaluarea cantității inițiale de ARN specific, care a fost prezentă în proba de analizat.

5.1.4. APLICAȚII ALE AMPLIFICĂRII PRIN REACȚIA ÎN LANȚ A POLIMERAZEI (PCR)

5.1.4.1. APLICAȚII ALE PCR CU PUNCT FINAL”End-point PCR”

EVIDENȚIEREA PREZENȚEI SAU ABSENȚEI UNEI GENE SAU SECVENȚE ADN

Datorită posibilității de evidențiere a unei secvențe ADN prin amplificare, urmată de analiză prin electroforeză în gel de agaroză sau poliacrilamidă, tehnica PCR poate fi utilizată pentru evidențierea prezenței sau absenței unei gene/secvențe ADN într-o probă analizată. În funcție de tipul genei identificate se pot desprinde o serie de aplicații practice ale tehnicii PCR.

Aplicații în medicină

detectarea infecțiilor bacteriene sau virale, dacă secvența a cărei prezență a fost identificată este constituită din ADN viral sau bacterian;

detectarea unor boli, dacă acestea sunt condiționate de apariția unor mutații ale unor gene cunoscute;

posibilitatea pronosticului unor boli congenitale, în cazul în care acestea au un determinism genetic;

stabilirea sexului la produsul de concepție, chiar din stadiul embrionar, investigație posibilă datorită markerilor specifici amplasați pe cromosomul Y.

Aplicații în agricultură și industria alimentară

identificarea prezenței OMG (organisme modificate genetic) în produsele agricole și alimentare, investigație posibilă deoarece genele transferate la plante sunt cunoscute;

identificarea infecțiilor bacteriene sau virale în produse agricole, dacă secvența identificată este constituită din ADN viral sau bacterian;

AMPLIFICAREA UNOR FRAGMENTE ADN

Datorită posibilității amplificării unei secvențe, prin tehnica PCR pot fi obținute cantități mari de ADN care să fie apoi utilizate în diferite scopuri:

generarea de sonde moleculare care, în urma marcării radioactive sau chimice sunt utilizate în procese de hibridizare în tehnicile Southern sau Northern;

producerea unor fragmente ADN care să poată fi secvențializate prin tehnica Sanger, pornind de la secvența unuia dintre primerii utilizați la amplificare;

producerea unor cantități suficiente dintr-un fragment ADN, astfel încât să fie posibilă obținerea unei molecule ADN recombinant.

GENERAREA UNOR MARKERI ADN

Tehnica PCR poate sta la baza generării unui număr mare de markeri moleculari cum ar fi: EST – etichetarea secvențelor exprimate („Expressed Sequence Tag”), RAPD – amplificarea întâmplătoare a ADN polimorfic („Random Amplified Polymorphic DNA”), AFLP – polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate („Amplified Fragment Length Polymorphism”), SSR – secvențe simple repetate („Simple Sequence Repeats”), CAPS – polimorfismul fragmentelor amplificate și secționate („Cleaved Amplified Polymorphic Sequence”), SCAR- Regiuni amplificate secventializate („Sequence characterized amplified region”).

Markerii moleculari, care evidențiază polimorfismul la nivel de ADN cu ajutorul tehnicii PCR pot să-și găsească o paletă foarte largă de aplicații: cartarea genomului, în cadrul căreia se stabilește poziția fiecărui marker molecular pe harta genetică, pe baza frecvenței de recombinare; selecția asistată de markeri, care poate avea loc dacă anterior au fost identificați markeri moleculari linkați cu caractere fenotipice de interes; evaluarea diversității genetice intra sau inter specifice; analiza distanțelor genetice, prin stabilirea gradului de înrudire; verificarea și perfecționarea clasificărilor taxonomice; analiza filogenetică; investigații criminalistice și teste de paternitate, posibile în cazul organismului uman, care a fost secvențializat în totalitate.

5.1.4.2. APLICAȚII ALE TEHNICII PCR ÎN TIMP REAL („Real-time PCR”)

PCR în timp real sau PCR cantitativ permite estimarea cantității unei secvențe date, prezente într-o probă. În funcție de tipul secvenței identificate și cuantificate se desprind aplicațiile acestei tehnici:

Detectarea și cuantificarea ADN viral în diferite probe biologice; tehnica este precisă, cu o sensibilitate foarte ridicată, permițând detecția virusului imediat după infecție;

Detecția și cuantificarea unor gene, provenite de la organisme modificate genetic;

În cazul în care PCR este combinat cu procesul de revers-transcripție este posibilă determinarea cantitativă a abundenței unor molecule de ARNm, ca măsură a expresiei genelor. Pot fi astfel evidențiate modificările induse la nivelul expresiei genelor de către factorii de mediu, apariția unor boli etc. Identificarea genelor a căror expresie este modificată în anumite condiții reprezintă un pas important în descifrarea mecanismelor de apărare care se declanșează în organismele vii pentru contracararea efectului factorilor de stres.

5.1.4.3. APLICAȚII ALE TEHNICII PCR ASOCIAT CU REVERS-TRANSCRIPȚIA ( ”Reverse transcription polymerase chian reaction”)

Având în vedere că în cadrul reacției PCR asociat cu revers-transcripția (RT-PCR) se analizează ARN, aplicațiile tehnicii sunt specifice acestui tip de acid nucleic:

Studiul genomului retrovirusurilor cum ar fi virusul gripal sau virusul HIV;

Clonarea genelor eucariote în organisme procariote în scopul producerii proteinelor; ADNc generat în urma reacțiilor RT-PCR reprezintă exact secvența de acid nucleic care se regăsește în secvența proteinei sintetizate;

Determinarea semi-cantitativă a abundenței diferitelor molecule de ARNm într-o celulă sau un țesut, ca o măsură a expresiei genelor.

5.2. TEHNICILE DE TRANSFER ȘI ANALIZĂ A ACIZILOR NUCLEICI/PROTEINELOR

Tehnica SOUTHERN BLOTTING a fost imaginată în 1975 de către Southern, în scopul identificării unor fragmente specifice de ADN cu ajutorul sondelor moleculare marcate. Tehnica se bazează pe proprietatea ADN de a se denatura și de a renatura alături de orice fragment ADN care posedă secvențe complementare.

Prin analogie, au fost imaginate tehnicile NORTHERN BLOTTING, care presupune analiza ARN și WESTERN BLOTTING, care presupune analiza proteinelor.

Tehnicile menționate se desfășoară după aceleași principii, dar prezintă și particularități datorate tipului de molecule analizate.

5.2.1. TEHNICA SOUTHERN BLOTTING

Tehnica Southern presupune parcurgerea mai multor etape și anume: separarea fragmentelor de ADN, transferul fragmentelor de ADN, în formă denaturată pe membrane solide, hibridizarea cu sonde moleculare marcate și identificarea prezenței secvențelor țintă.

5.2.1.1. SEPARAREA FRAGMENTELOR ADN

Într-o primă etapă are loc izolarea și purificarea ADN, cu metode specifice speciei sau țesutului din care se realizează extracția. Apoi, ADN este secționat cu enzime de restricție, care taie molecula de ADN la nivelul unor secvențe specifice (capitolul 4.2).

Apoi, fragmentele secționate sunt separate în funcție de greutatea lor moleculară prin electroforeză în gel de agaroză, sau poliacrilamidă (capitolul 4.7).

Fragmentele de ADN nu pot fi analizate direct în gelurile în care au fost separate și de aceea sunt transferate pe suporturi solide, care permit evaluarea ulterioară.

5.2.1.2. TRANSFERUL FRAGMENTELOR ADN DIN GEL, PE MEMBRANE SOLIDE

Fragmentele ADN sunt transferate pe membrane de nitroceluloză sau nylon pe care pot fi păstrate timp nelimitat. Aceste membrane au o încărcare pozitivă, pentru a asigura o afinitate bună pentru acizii nucleici, care posedă grupări negative. Poziția fragmentelor de ADN pe membrane este identică cu cea din gel, ceea ce permite identificarea lor după hibridizarea cu sonde moleculare.

MECANISMUL PROCESULUI DE TRANSFER

Pentru a realiza transferul efectiv al fragmentelor ADN din gel pe membrană se realizează ansambluri alcătuite dintr-o structură tip „sandwich”. Astfel, gelul se va așeza pe un suport poros, care este imersat într-o soluție implicată atât în procesul de transfer, cât și în denaturare. Peste gel se va așeza membrana, care va fi acoperită la rândul ei cu un strat de hârtii absorbante. Este necesar ca tot acest ansamblu, menținut cu ajutorul unei greutăți, să fie aranjat pe verticală.

Datorită hârtiilor absorbante soluția de denaturare/transfer va fi antrenată din vasul în care se află, spre partea superioară a ansamblului. Astfel soluția va trece prin gel, va denatura fragmentele de ADN și le va antrena în sus, unde vor întâlni membrana. Soluția de transfer va fi absorbită spre partea superioară, dar fragmentele de ADN vor rămâne imobilizate pe membrană.

După terminarea transferului, fragmentele denaturate sunt fixate pe suport prin tratament termic sau prin iradiere UV.

5.2.1.3. HIBRIDIZAREA MEMBRANELOR CU SONDE MOLECULARE MARCATE ȘI IDENTIFICAREA FRAGMENTELOR ȚINTĂ

Hibridizarea este o tehnică de recombinare a acizilor nucleici, care vizează alcătuirea unei molecule de acid nucleic dublu catenar din două lanțuri unice, separate, pe baza complementarității perechilor de baze. Împerecherea de baze complementare se poate realiza între ADN-ADN, ADN-ARN sau ARN-ARN.

Prin această tehnică este posibilă identificarea unei secvențe de acid nucleic monocatenar (secvența țintă), cu ajutorul unei sonde moleculare marcate. Sonda moleculară reprezintă un fragment de acid nucleic (ADN sau ARN), cu secvență cunoscută, care este marcat radioactiv sau chimic și denaturat în prealabil.

Dacă sonda și secvența țintă sunt total sau parțial complementare din punctul de vedere al secvențelor de baze nucleotidice, se formează o moleculă hibrid de acid nucleic în care se identifică secvențele nucleotidice pe secvența țintă, în raport cu bazele (complementare) de pe secvența nucleotidică cunoscută a sondei moleculare.

Atât ADN țintă cât și sonda moleculară marcată sunt supuse unui proces de denaturare, după care are loc procesul de hibridizare, în condiții de temperatură și concentrație a sărurilor bine precizate.

După ce procesul de hibridizare a avut loc, sonda moleculară în exces se elimină, pentru a evita identificarea unor probe fals pozitive. Apoi membrana este supusă unui proces de developare și analiză, specific sistemului de marcare utilizat.

Acele fragmente ADN la care s-a atașat sonda moleculară sunt vizualizate sub forma unor spoturi întunecate, colorate sau fluorescente, în funcție de metoda de marcare aplicată.

În figura următoare (5.9) sunt prezentate etapele parcurse pentru identificarea prezenței unor secvențe prin tehnica Southern Blotting.

Fig. 5.9. Etapele care alcătuiesc un experiment de identificare a fragmentelor ADN prin tehnica Southern blotting

O etapă metodologică necesară, după ce fragmentele ADN denaturate au fost fixate pe membrane este marcarea sondelor moleculare.

MARCAREA SONDELOR MOLECULARE

Sondele moleculare reprezintă fragmente de ADN, cu secvențe cunoscute, care trebuie să fie marcate radioactiv sau chimic, înainte de utilizare. Inițial se obțin dezoxi-ribonucleozid trifosfați marcați, care se înglobează apoi în fragmente de acizi nucleici, copii ale secvenței sondei moleculare.

MARCAREA RADIOACTIVĂ

Marcarea radioactivă se realizează cu radioizotopi 3H, 35S, 125I, 32P, introduși într-un anumit dezoxi-ribonucleozid trifosfat, care prin dezintegrare emit raze β. Astfel, după cuplarea sondei moleculare cu secvența țintă, izotopul radioactiv va emite radiații care pot fi evidențiate prin auto-radiografiere (impresionarea unei plăci Roentgen sau a unui clișeu autoradiografic care se developează ulterior), sau pot fi preluate direct, prin intermediul unor echipamente speciale.

La alegerea izotopilor trebuie ținut cont de timpul de înjumătățire, timp necesar pentru ca substanța radioactivă să se descompună în proporție de 50%: 3H- 12,35 ani, 35S- 87,4 zile, 125I- 60 zile, 32P- 14,3 zile.

În cazul în care izotopul ales este 32P, înregistrarea semnalului radioactiv și transmiterea la un sistem computerizat se realizează cu ajutorului unui echipament denumit Phosphoimager.

Una dintre cele mai utilizate metode pentru marcarea radioactivă este „Random Priming Oligolabelling”.

În acest caz se folosesc ca matrițe catene unice de ADN, rezultate dintr-o denaturare prealabilă a unei catene de ADN. Se folosește enzima Klenow polimeraza, care reprezintă un fragment de ADN-polimerază căruia îi lipsește activitatea 5’-3’exonucleazică.

Reacțiile de sinteză a noilor catene de acid nucleic pornesc de la primeri cu o lungime de 6 nucleotide, cu secvență întâmplătoare, care găsesc secvențe complementare în mai multe puncte în fragmentul care urmează a fi copiat. Acestea furnizează grupările OH, la capetele 3’, necesare ADN polimerazei pentru a începe sinteza.

În catena nou formată vor fi înglobați nucleozid trifosfații, în funcție de complementaritatea bazelor, dintre care numai unul a fost marcat în prealabil radioactiv (Capitolul 4.3.3).

Fragmentele ADN astfel pregătite sunt utilizate apoi ca sonde marcate în diferite variante ale reacțiilor de hibridizare.

În ultima vreme există tendința ca substanțele radioactive să fie abandonate din cauza efectului lor nociv asupra experimentatorului și înlocuite cu marcarea enzimatică.

MARCAREA CHIMICĂ

În procesele de marcare chimică se utilizează cel mai adesea oligomarcarea, principiul fiind similar cu cel al marcării radioactive, cu deosebirea că nucleozid-trifosfatul marcat radioactiv este înlocuit cu un nucleozid-trifosfat marcat chimic. Marcarea chimică se realizează cel mai frecvent cu biotină sau digoxigenină.

Biotina se leagă printr-o structură de atașare, denumită spacer de uracilul dintr-un nucleozid-trifosfat. Acest braț de legare va ușura și legarea ulterioară a biotinei la sistemele de identificare.

Bio-UTP: Biotina-spacer-uracil-riboză-trifosfat

În mod normal, uracilul se înglobează numai în ARN, dar nu și în ADN. Pentru a fi totuși posibilă și marcarea ADN, sunt create structuri artificiale uracil-dezoxiriboză, care vor putea ulterior să facă parte dintr-o catenă ADN.

Bio-dUTP: Biotina-spacer-uracil-dezoxiriboză-trifosfat

Atât Bio-UTP cât și Bio-dUTP sunt derivate biotinate ale dezoxi-uridin-trifosfatului, respectiv ribo-uridin-trifosfatului și vor fi înglobate în ADN (în locul dezoxi-timidin-trifosfatului), respectiv în ARN.

Prezența biotinei poate fi detectată apoi prin legarea la compuși cu afinitate ridicată – avidina și streptavidina sau anticorpi specifici, marcați în prealabil cu substanțe care pot fi identificate ulterior.

Digoxigenina este un steroid izolat din Digitalis pupurea și Digitalis lanata. Deoarece florile și frunzele acestor plante sunt singurele surse naturale de digoxigenină (DIG), anticorpii anti-DIG nu se vor lega la alți compuși.

Digoxigenina se va lega în poziția 5 a unei uridine prin intermediul unei structuri de atașare – spacer, alcătuită din 11 atomi de carbon (Fig. 5.10).

Nucleotidele marcate cu DIG pot fi încorporate în probe de acizi nucleici de către ADN polimerază și totodată de către ARN polimerază și terminal transferază prin procese de: oligomarcare întâmplătoare (“random primed labelling”), translație prin tăiere (“nick translation”), PCR, marcarea terminală a lanțurilor ADN (“3’–end labelling/tailing”) sau transcripție in vitro.

Fragmentele hibridizate cu DIG pot fi detectate cu ajutorul anticorpilor cu afinitate ridicată – anticorpi anti -DIG care sunt conjugați cu fosfataza alcalină, peroxidaza, fluoresceina, rodamina sau particule coloidale de aur.

Figura 5.10 Digoxigenin-UTP /dUTP/ddUTP

Digoxigenin-UTP: R1=OH, R2=OH

Digoxigenin-dUTP: R1=OH, R2=H

Digoxigenin-ddUTP: R1=H, R2=H

Sensibilitatea procesului de detecție depinde de metoda utilizată pentru vizualizarea anticorpului anti-DIG conjugat. Dacă acesta este marcat cu fosfataza alcalină poate fi vizualizat:

– Colorimetric, în prezența substratului NBT – (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride) și BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyphosphate p-Toluidine); acești reactivi reacționează cu fosfataza alcalină, formând un precipitat albastru-violet sau

– Fluorescent, în prezența HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2-phenylanilide phosphate).

Un alt sistem de marcare chimică utilizează nucleotidele marcate cu fluoresceină (fluorescein-dUTP/UTP/ddUTP), care pot fi încorporate enzimatic într-o secvență de acid nucleic (Fig. 5.11).

Deoarece fluoresceina reprezintă un sistem de marcare direct, nu sunt necesare proceduri de vizualizare imunocitochimică, semnalul de fond fiind mai redus. Totuși această metodă prezintă un dezavantaj comparativ cu metodele indirecte și anume sensibilitatea mai redusă.

Nucleotidele marcate cu fluoresceină pot fi detectate și cu anticorpi anti-fluoresceină conjugați enzimatic, procesul având în acest caz o sensibilitate similară cu cea a metodelor indirecte.

Figura 5.11 Fluorescein-dUTP

5.2.1.4 APLICAȚII ALE TEHNICII SOUTHERN BLOTTING

Tehnica Southern permite localizarea în mod particular a unor fragmente ADN, dintr-un amestec complex, astfel că pot fi identificate gene sau fragmente anonime de ADN.

Pe baza acestei tehnici s-au dezvoltat markerii RFLP („Restriction Fragment Length Polymorphism”) care asigură investigații directe sau indirecte și datorită preciziei și versatilității au devenit un instrument indispensabil în domeniile identificării genelor și cartare, în diagnostic, criminalistică, filogenie și evoluționism.

Este posibilă de asemenea determinarea greutății moleculare a fragmentelor de restricție, detectarea prezenței unei secvențe ADN într-o probă, determinarea numărului de copii al unei secvențe ADN, evaluarea amprentei genetice a unui individ etc.

5.2.2. TEHNICA NORTHERN BLOTTING

Tehnica Northern Blotting a fost dezvoltată în anul 1977, de către James Alwine, David Kemp și George Stark, iar denumirea a fost dată prin analogie cu tehnica Southern, dezvoltată de un cercetător cu același nume.

În cazul aplicării acestei tehnici, care permite evaluarea nivelului de expresie a genelor în timpul diferențierii, morfogenezei sau în anumite condiții de mediu, sunt urmate aceleași etape ca la transferul Southern, cu câteva particularități date de caracteristicile moleculei ARN.

Astfel, fragmentele ARN sunt extrase, moleculele de ARNm sunt separate pe baza structurii lor specifice (capete poly(A)), după care sunt analizate prin electroforeză în gel de agaroză sau poliacrilamidă.

Nu este necesară secționarea cu enzime de restricție deoarece fragmentele analizate au dimensiuni reduse, corespunzătoare regiunilor codificatoare ale fiecărei gene.

Moleculele ARNm sunt oligonucleotide monocatenare care pot adopta diverse structuri secundare, care le măresc volumul. Pentru a preîntâmpina astfel de situații, gelul de electroforeză trebuie să asigure condiții denaturante.

Fragmentele ARN sunt apoi transferate pe membrane solide, fără a mai fi necesară denaturarea și fixate prin tratament termic sau cu radiații UV.

Etapele de hibridizare, marcare a sondelor moleculare și analiză a rezultatelor obținute se desfășoară după aceleași reguli ca cele de la transferul Southern.

APLICAȚII ALE TEHNICII NORTHERN BLOTTING

Tehnica Northern Blotting permite evaluarea expresiei unei anumite gene, în diferite țesuturi, organe, stadii de dezvoltare, în diferite condiții de stres, la atacul patogenilor sau în cursul unui tratament.

Tehnica poate fi de asemenea utilizată pentru a determina supra/sub expresia anumitor gene. Dacă expresia unei gene este accentuată („up-regulate”) se observă un semnal mai intens pe membrana hibridizată, în dreptul genei respective. Apoi, fragmentul ADN poate fi secvențializat, pentru a determina dacă reprezintă o genă cunoscută sau nu, prin comparare cu bazele de date existente în prezent.

Dacă se utilizează o singură sondă moleculară este posibilă determinarea aproximativă a dimensiunii produsului de transcripție maturat (ARNm), ceea ce furnizează informații cu privire la reglarea post-transcripțională a genei – modificări care au avut loc după transcripție.

5.2.3. TEHNICA WESTERN BLOTTING

Tehnica Western Blotting a fost dezvoltată de către George Stark, iar denumirea a fost introdusă de către W. Neal Burnette, în 1981, prin analogie cu tehnicile Southern și Northern.

În acest caz este posibilă detectarea unor proteine specifice într-un extract; proteinele, în formă nativă sau denaturată se separă prin electroforeză în funcție de lungimea lanțului polipeptidic, dacă se utilizează condiții denaturante sau de structura lor tridimensională, în condiții non-denaturante.

5.2.3.1. SEPARAREA PROTEINELOR

Proteinele extrase și purificate se separă prin electroforeză, în funcție de punctul izoelectric (pI), de greutatea moleculară, sarcina electrică sau de o combinație a acestor factori. Natura procesului de separare depinde de tratamentul la care au fost supuse probele de analizat sau de natura gelului.

Cele mai utilizate procedee utilizează geluri în care s-a adăugat SDS (dodecil-sulfat de sodiu), denumite și SDS-PAGE („SDS polyacrylamide gel electrophoresis”). În aceste condiții proteinele sunt menținute într-o formă denaturată, în care punțile disulfidice [S-S] sunt desfăcute.

SDS, adăugat atât în geluri cât și în probe asigură, pe lângă condițiile denaturante o încărcare uniform negativă a proteinelor, ceea ce permite în final separarea numai în funcție de greutatea lor moleculară.

5.2.3.2. TRANSFERUL PROTEINELOR DIN GEL, PE MEMBRANE SOLIDE

Pentru ca proteinele să poată fi accesibile detecției cu anticorpi, este necesar transferul lor pe membrane solide de nitroceluloză sau poliviniliden difluorură (PVDF), suporturi care au o afinitate uniformă pentru toate tipurile de proteine.

Transferul proteinelor din gel pe membrană poate fi realizat printr-o procedură de lucru similară cu cea descrisă anterior (Southern Blotting), prin capilaritate sau poate avea loc sub acțiunea unui câmp electric – electroblotting.

În acest fel fracțiile proteice analizate sunt transferate pe membrane în aceleași poziții în care se află în gel. Deoarece membranele utilizate au o mare afinitate pentru toate proteinele, inclusiv anticorpii este necesară blocarea acesteia imediat după transfer. Astfel, membrana se tratează cu o soluție diluată de proteine (albumină serică bovină – BSA sau lapte praf degresat), care se vor atașa uniform la membrană, în afară de pozițiile în care s-a legat proteina țintă. Acest tratament mărește precizia și claritatea rezultatelor și elimină rezultatele fals pozitive.

5.2.3.3. TRATAREA MEMBRANELOR CU ANTICORPI MARCAȚI ȘI IDENTIFICAREA PROTEINELOR ȚINTĂ

În continuare membrana pe care au fost transferate toate fracțiile proteice se pune în contact cu o soluție de anticorp, care se va lega specific la proteina țintă. Pentru a fi posibilă vizualizarea poziției în care s-a legat anticorpul este necesar ca acesta să fie marcat. Pot fi aplicate două strategii și anume: reacția într-o singură etapă sau în două etape.

Reacția într-o singură etapă necesită un singur anticorp marcat, care se va lega la proteina țintă și este vizualizat printr-un procedeu specific sistemului de marcare.

Reacția în două etape necesită doi anticorpi, dintre care numai unul este marcat. Primul anticorp se leagă la proteina țintă, atașată la membrană, după care este recunoscut de cel de-al doilea anticorp care a fost în prealabil marcat.

Reacția în două etape, deși necesită doi anticorpi este totuși mai ieftină comparativ cu cea într-o singură etapă deoarece cel de-al doilea anticorp marcat poate fi utilizat pentru un număr mare de reacții de identificare. Astfel, primul anticorp recunoaște foarte specific și se atașează la proteina țintă; cel de-al doilea anticorp marcat recunoaște o anumită regiune din primul anticorp, la care se atașează. Regiunea recunoscută de cel de-al doilea anticorp poate fi specifică speciei în care a fost produs anticorpul, deci specificitatea este foarte redusă. De exemplu, se poate utiliza același anticorp marcat pentru orice anticorp primar care a fost produs în cobai "antimouse".

Vizualizarea este specifică procedeului de marcare utilizat care poate fi colorimetric, chemiluminiscent, radioactiv sau fluorescent.

Un exemplu de marcare a anticorpilor este legarea fosfatazei alcaline. Prezența acestei enzime este evidențiată cu ajutorul p-nitro-fenil fosfatului, care este un substrat cromogen.

În urma interacțiunii dintre p-nitro-fenil-fosfat și fosfataza alcalină se formează p-nitrofenol, un produs solubil, de culoare galben intens care permite identificarea probelor pozitive. Dacă reacțiile se desfășoară în mediu lichid este posibilă determinarea cantitativă a proteinei la care s-a legat anticorpul marcat prin determinări spectofotometrice la lungimea de undă de 405 nm.

Fig. 5.12 Prezentarea schematică a tehnicii Western Blotting

A – Separarea prin SDS PAGE a amestecului proteic extras din proba de analizat;

B – Membrana de nitroceluloză, pe care sunt transferate, în aceleași poziții ca în gel, proteinele separate în funcție de dimensiuni;

C – Membrana de nitroceluloză după tratamentul cu anticorp marcat și substrat cromogen – apar semnale pozitive, sub forma unor benzi colorate, numai pentru probele care conțin proteina țintă.

5.2.3.4. APLICAȚII ALE TEHNICII WESTERN BLOTTING

Tehnica Western Bloting își găsește utilizări multiple în medicină, fiind produse kituri pentru confirmarea unor maladii, cum ar fi HIV, encefalită bovină spongiformă sau hepatită B.

De asemenea tehnica menționată poate conduce la identificarea prezenței oricărei proteine într-un preparat, cu condiția ca aceasta să fi fost izolată și purificată în prealabil, pentru a fi posibilă producerea anticorpilor specifici. Este posibilă și determinarea aproximativă a greutății moleculare, ceea ce furnizează informații cu privire la eventualele modificări postranslaționale ale proteinei.

5.2.4. HIBRIDIZAREA  IN  SITU

            Hibridizarea in situ este o metodă citogenetică directă de localizare a unui fragment specific de ADN pe cromozom.

Se utilizează sonde moleculare (fragmente ADN identificate și clonate în prealabil), care se leagă numai la acele regiuni cromozomale în care găsesc un grad înalt de similaritate a secvențelor.

Astfel, o secvență de ADN clonat (sondă moleculară) se hibridizează pe cromozomii prometafazici etalați pe o lamă microscopică, după ce au fost denaturați în prealabil (pentru ca moleculele ADN să devină monocatenare).

Sonda moleculară, marcată radioactiv (cu izotopi de tritiu), sau chimic, cu biotină sau digoxigenină (Dig), se va lega pe o regiune cromozomală complementară.

Dacă marcarea sondei moleculare a fost radioactivă, molecula hibridă poate fi localizată prin acoperirea preparatului cu o emulsie sensibilă la razele X. Poziția granulelor "radioactive" pe o anumită bandă cromozomică reflectă localizarea genei.

Dacă sondele sunt marcate cu biotină, moleculele hibride pot fi identificate cu molecule fluorescente, avidina și streptavidina. Dacă pentru marcare s-a utilizat digoxigenină (Dig), detecția se realizează cu anticorpi anti-DIG conjugați enzimatic. În cazul marcării chimice vizualizarea/

poziționarea semnalului fluorescent pe un anumit cromozom se realizează cu un microscop cu fluorescență, astfel că tehnica poartă numele FISH („Fluorescence in Situ Hibridization”) (Fig. 5.13).

Nivelul de rezoluție al localizării corespunde unei regiuni de 1-2 milioane bp din cromozomul metafazic. Rezoluția crește la 50-500 kb pentru fibrele de cromatină interfazică și la câteva kb pentru fibrele de cromatină alungite/întinse artificial (“fiber-FISH”).

APLICAȚII ALE TEHNICII FISH („Fluorescence în Situ Hibridization”)

Tehnica FISH are a o gamă largă de aplicații în biologia moleculară și în medicină, în investigațiile de diagnostic și mutații cromozomale, studii ale structurii și funcțiilor celulare și în experimentele de cartare.

În cercetările clinice tehnica FISH poate fi utilizată pentru diagnoza prenatală a aberațiilor cromozomale moștenite, diagnoza postnatală a bolilor genetice moștenite, a bolilor infecțioase, virale sau bacteriene, diagnoza citogenetică a tumorilor și detecția expresiei aberante a genelor.

În cercetările de laborator, tehnica FISH poate fi utilizată pentru cartarea genomului, studii de evoluție, analiza organizării și dinamicii nucleare, replicare, sortarea cromozomilor.

Recent, această tehnică a fost tot mai mult utilizată pentru stabilirea ordinii și poziției markerilor moleculari în regiunile cromozomale de interes – cartarea citogenetică.

Fig. 5.13. Identificarea prezenței pe cromozom a unei secvente specifice de ADN, prin tehnica FISH („Fluorescence in Situ Hibridization”)

5.2.5. TEHNICA MICROARRAY

Tehnica microarray este o tehnică modernă, care îmbină descoperiri atât din domeniul biologiei moleculare cât și al automaticii și informaticii, care permite identificarea prezenței anumitor gene, evaluarea expresiei genelor sau identificarea polimorfismului unei singure nucleotide (SNP).

Principiul unui experiment microarray, spre deosebire de analizele clasice Northern-blotting este următorul: ARNm dintr-o anumită linie celulară sau țesut este utilizat pentru a genera sonde marcate, denumite uneori “țintă” care sunt hibridizate în paralel cu un număr mare de secvențe ADN, imobilizate pe o suprafață solidă într-o distribuție ordonată.

Prin această metodă pot fi detectate și cuantificate simultan zeci de mii de specii de produși de transcripție. Pentru derularea unui astfel de experiment este necesară prezență unor suporturi, pe care se fixează sondele moleculare și a moleculelor ADN țintă, care au fost marcate în prealabil.

5.2.5.1. SONDELE MOLECULARE UTILIZATE ÎN MICROARRAY

În timp, suporturile pe care sunt imobilizate fragmentele au evoluat, pornind de la o membrană și ajungând în prezent la cip-uri.

Macrodispozitive ADN (DNA macroarray)

Macrodispozitivele ADN – membrane de hibridizare – sunt predecesoarele micro-dispozitivelor ADN și a chip-urilor ADN. În acest caz sonde provenite din biblioteci ADNc sunt stocate cu o densitate de câteva zeci/cm2 pe suporturi speciale (membrane de nylon), cu dimensiuni de 8×12 cm, pe care sunt fixate cu ajutorul iradierii UV. Secvențele țintă sunt molecule ADNc, marcate radioactiv cu 32P. Detecția produșilor de hibridizare se realizează prin autoradiografiere.

Microdispozitive ADN de sticlă (DNA microarray)

Microdispozitivele sunt constituite din lamele de sticlă, cu dimensiuni de 1,8 x 1,8 cm, pe care sunt fixate câteva mii de sonde, constituite din molecule ADNc sau clone EST (secvențe exprimate), care au fost secvențializate în prealabil. Secvențele țintă sunt molecule ADNc, marcate cu coloranți fluorescenți. Detecția produșilor de hibridizare are loc prin scanare cu un laser confocal.

Chip ADN („DNA chips”)

În ultimii ani tehnologia ADN microarray a avansat rapid, datorită posibilității de producere automatizată a unor chip-uri obținute din materiale speciale, care permit robotizarea. Chip-urile sunt lamele de sticlă sau silicon, acoperite cu expoxi-silan, amino-silan sau poliacrilamidă, care asigură legătura între suport și fragmentele ADN fixate.

Se pot diferenția două tipuri de investigații, în funcție de moleculele fixate pe suport: ADN complementar sau oligonucleotide. Materialul fixat pe suport poate fi asimilat cu termenul “sondă” care se utilizează în tehnica Northern blotting.

În cazul microarray ADNc sondele sunt reprezentate de produși obținuți în urma reacțiilor PCR generate de biblioteci ADNc sau colecții de clone, utilizând fie primeri specifici vectorului fie unor gene și sunt fixate pe suportul solid sub forma unor spoturi, în locații bine stabilite. Spoturile au dimensiuni de 100-300 µm și sunt așezate la o distanță egală unele de altele. Cu ajutorul acestei tehnici suportul (chip-ul) cuprinde mai mult de 30.000 de molecule ADNc.

În cazul microarray oligonucleotide, fragmente cu lungimi de 20-25 nucleotide se sintetizează și se fixează simultan pe suport. Acestea pot reprezenta 10.000 de gene diferite, cu câte 40-50 oligonucleotide/genă. Avantajul acestei metode constă în faptul că oferă o gamă foarte variată de molecule, fără a fi necesară manipularea ADNc. De asemenea, aceste sonde pot fi gândite astfel încât ele să reprezinte părți unice ale unui produs de transcripție, făcând posibilă detecția unor gene înrudite.

Deoarece oligonucleotidele scurte pot să conducă la hibridizări nespecifice și sensibilitate redusă, mai recent au fost dezvoltate tehnici care presupun fixarea pe suport a unor oligonucleotide mai lungi (50 –100 nucleotide), dar costul unor astfel de dispozitive este ridicat.

În prezent, produsele comerciale care se utilizează în aproape toate laboratoarele provin de la Compania Affymetrix, cu dimensiuni de 1,28 cm2 și au fixate un număr mai mare de 500.000 de sonde.

5.2.5.2. SECVENȚE ȚINTĂ UTILIZATE ÎN MICROARRY

În cazul în care se dorește investigarea genomului experimentele au ca obiect de studiu ADN, care poate fi utilizat ca atare.

Dacă studiile se îndreaptă spre evaluarea expresiei genelor, atunci este necesară sinteza ADNc, care reprezintă copia populației ARNm, prezentă la un moment dat în celule (capitolul 4.5).

Moleculele fluorescente cele mai utilizate pentru marcare sunt membri ai familiei cianinelor Cy3 și Cy5. După hibridizare semnalele sunt detectate utilizând un scanner fluorescent. Utilizarea a două substanțe fluorofore permite determinarea semnalelor de hibridizare de la două procese distincte, într-un singur experiment. O dată ce au fost obținute intensitățile fluorescenței, cea mai mare parte a muncii implică analiza datelor pentru a extrage informații interpretabile din punct de vedere biologic.

Scanerele actuale utilizează diferite tipuri de lasere care emit de obicei la 532 și 635 nm și filtre în domeniile (550-600 nm și 655-695 nm), pentru a elimina contaminarea de fond („background”).

Posibilitatea distingerii între două probe marcate cu coloranți diferiți permite analiza comparativă a două probe distincte.

5.2.5.3. ETAPELE UNEI TEHNICI DE INVESTIGARE MICROARRAY

Dacă secvențele țintă au fost marcate și chip-urile care au legate sondele moleculare de interes sunt disponibile, derularea unui experiment microarray presupune parcurgerea mai multor etape și anume:

Hibridizarea, care constă în introducerea secvențelor țintă marcate într-o cameră de hibridizare, în care se află cip-ul care are fixate sondele de interes, procesul având loc în condiții precizate de temperatură.

Spălarea secvențelor țintă în exces, pentru a evita obținerea unor rezultate false.

Scanarea cip-ului și identificarea spot-urilor la care s-au legat secvențele țintă marcate.

Achiziția imaginilor și analiza datelor obținute (Fig. 5.14).

Secvențele țintă, reprezentate de ADN sau ADNc sunt marcate fluorescent, pentru ca identificarea produșilor de hibridizare să fie posibilă.

Fig. 5.14 Etapele parcurse în cadrul unui experiment microarray

În figura de mai sus este prezentat un studiu de evaluare comparativă a genelor provenite din două probe diferite A și B.

ARN total a fost extras din ambele probe, s-a separat ARNm, după care a avut loc sinteza moleculelor ADNc. În fiecare probă va exista un set diferit de molecule ADNc, corespunzătoare genelor transcrise în celule, la momentul la care s-a efectuat extracția ARN.

Cele două seturi de molecule ADNc sunt marcate cu doi coloranți fluorescenți diferiți (A – verde și B – roșu), după care are loc hibridizarea.

Analiza datelor obținute va evidenția pe chip spoturi de culori diferite: roșu, pentru genele transcrise numai în proba B, verde pentru cele din proba A și galben pentru genele exprimate în ambele probe. Această analiză se poate realiza numai cu ajutorul unor soft-uri speciale, care convertesc informația preluată de pe chip (o suprafață de 1,28 cm2 care cuprinde câteva zeci sau sute de mii de spoturi) într-o imagine vizibilă cu ochiul liber. O astfel de imagine cuprinde un număr uriaș de informații, astfel ca poate fi analizată numai computerizat.

Rezultatul final permite analiza comparativă a datelor obținute, atât la nivel calitativ – care gene sunt exprimate și care nu, în anumite condiții, dar și la nivel semicantitativ – care gene prezintă supraexpresie sau subexpresie, deci care sunt activate respectiv represate în anumite condiții, în anumite țesuturi, organe etc.

5.2.5.4. APLICAȚII ALE TEHNICII MICROARRAY

Tehnica microarray are în prezent o gamă largă de aplicații, atât pentru analiza ADN cât și ARN.

Profilul expresiei genelor

În cadrul experimentelor care urmăresc profilul expresiei genelor este posibilă monitorizarea simultană a mii de gene pentru a determina efectul unui anumit tratament, al unei boli sau a unui stadiu de dezvoltare asupra procesului de transcripție. De exemplu este posibilă identificarea acelor gene a căror expresie este modificată ca răspuns la acțiunea patogenilor sau a altor organisme, prin compararea probelor extrase din țesuturi infectate și neinfectate.

Identificarea genelor (GeneID)

Atunci când se analizează probe ADN este posibilă detectarea prezenței unor gene în alimente și furaje, provenite din organisme modificate genetic (OMG), din micoplasme în culturile de celule sau de la anumiți patogeni care produc boli.

Detecția polimorfismului unei nucleotide (SNP)

Tehnica microarray permite identificarea polimorfismului unei singure nucleotide între alele, intra sau inter-populațional. Cele mai importante aplicații permit genotiparea, analizele criminalistice, determinarea predispoziției la o anumită boală, evaluarea mutațiilor, evaluarea heterozigoției sau analiza linkage-ului genetic.

Hibridizarea genomică comparativă

Dacă se analizează comparativ două probe ADN, provenite din organisme diferite sau țesuturi diferite ale aceluiași organism este posibilă identificarea genelor comune sau diferite, printr-o hibridizare genomică comparativă.

Imunoprecipitarea cromatinei

Secvențele ADN legate la o anumită proteină pot fi izolate prin imunoprecipitarea acelei proteine; aceste fragmente pot fi apoi hibridizate pe un chip, care permite determinarea situsului de legare al unei proteine în genom.

5.3. PROCESUL DE CLONARE A FRAGMENTELOR DE ADN

Prin clonare se înțelege producerea unor copii identice ale unei gene sau ale oricărui alt fragment de ADN. Metoda a fost aplicată pentru prima dată la începutul anilor ’70 și se bazează pe tehnologia ADN recombinat și anume legarea in vitro a două molecule de ADN, aparținând unor surse diferite (fragmentul ADN de interes și vectorul de clonare) și introducerea lor în celule vii, în care se vor replica.

La baza dezvoltării acestei metode a stat izolarea unor tulpini bacteriene E. coli, care nu au posibilitatea de a secționa moleculele de ADN străin. De asemenea, descoperirea enzimelor de restricție a contribuit mult la dezvoltarea domeniului.

Etapele unui proces de clonare sunt:

Pregătirea inserției – a fragmentului sau fragmentelor care urmează să fie clonate;

Pregătirea vectorului de clonare;

Formarea moleculelor ADN recombinat, în prezența ADN ligazei;

Introducerea moleculei de ADN recombinat în celule bacteriene gazdă.

Selecția bacteriilor eficient transformate.

Vectori de clonare

De-a lungul timpului au fost utilizate diferite tipuri de vectori, care permit clonarea unor fragmente cu lungimi diferite: plasmide (~10kb), bacteriofagi (9-23 kb), cosmide (~40 kb), BAC – Cromosomul Artificial Bacterian (~100-300 kb), YAC- Cromosomul Artificial de Drojdie (~ 500 kb până la 3 Mb). În funcție de scopul urmărit se alege un anumit tip de vectori, care asigură multiplicarea fragmentelor ADN inserate.

Din punct de vedere practic este avantajoasă utilizarea unor vectori care acceptă ca inserții fragmente mari de ADN, pentru că în acest fel probabilitatea ca gena, respectiv secvența de ADN de interes să fie prezentă într-o singură clonă este mai mare.

5.3.1. CLONAREA ÎN PLASMIDE

5.3.1.1 CARACTERISTICILE PLASMIDELOR CA VECTORI DE CLONARE

Plasmidele reprezintă clasa celor mai utilizați vectori de clonare. Acestea sunt molecule de ADN circular închise, cu dimensiuni cuprinse între 1 și 200 kb, prezente în mod natural în celulele bacteriene. Cele mai multe plasmide conțin gene de rezistență la diferite antibiotice, conferind această rezistență și celulelor bacteriene care le poartă.

Unele plasmide au replicarea cuplată cu cea a cromozomului bacterian, astfel încât în fiecare celulă bacteriană este prezentă una, sau cel mult câteva copii ale plasmidei. Alte tipuri însă au o replicare independentă, astfel încât în fiecare celulă bacteriană pot exista 10-200 de copii ale aceleiași plasmide.

Caracteristice naturale ale plasmidelor au fost exploatate în cadrul tehnologiei ADN recombinat, realizându-se plasmide artificiale, care pot să fie utilizate ca vectori de clonare.

Pentru a putea fi utilizată ca vector de clonare o plasmidă trebuie să îndeplinească următoarele condiții:

să fie relativ mică;

să posede o origine a replicării;

să posede una sau două gene marker, care să permită selecția bacteriilor eficient transformate;

să posede un singur loc de recunoaștere pentru una sau mai multe enzime de restricție într-o zonă care nu este importantă pentru replicare, care să fie utilizat ca situs de clonare; este preferabil ca situsul de clonare să fie amplasat în interiorul unei gene de selecție, astfel încât introducerea fragmentului de ADN străin să dezactiveze gena.

Genele marker pot să fie gene care conferă rezistență la anumite antibiotice sau care dau o reacție de culoare.

VECTORUL DE CLONARE pUC 19

O plasmidă reprezentativă pentru vectorii de clonare utilizați pentru clonarea unor fragmente mici de ADN (<10 kb) este pUC 19.

Vectorul pUC19 posedă o genă care-i conferă rezistență la ampicilină și o regiune a operonului lac, care reprezintă factori de selecție (Fig. 5.15). Totodată posedă o secvență care funcționează ca origine a replicării (rep), având rolul de a menține plasmida în celulele bacteriene. Acest vector are o replicare independentă de cea a cromozomului bacterian, ceea ce conduce la acumularea unor cantități mari de ADN plasmidial în celulele bacteriene.

În interiorul operonului lac a fost introdusă o oligonucleotidă (54bp), care conține 13 secvențe de recunoaștere unice pentru mai multe enzime de restricție, care pot să fie utilizate ca situsuri de clonare (MCS – Multiple Cloning Sites) (Fig. 5.16). Sunt de asemenea cunoscuți doi primeri M13 sens și M13 antisens, care pot fi utilizați în procesele de determinare a secvenței inserției prin metoda Sanger.

Fig. 5.15. Harta genetică a vectorului de clonare pUC 19

5' GTT GTAAAACGACGGCCAGT GAATTC GAGCTCGGTACCCGG GGATCC TCTAGA

GTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATG GTCATAGCTGTTTCCTG 3'

Fig. 5.16 Secvența multiplă de clonare a vectorului pUC 19

Fragmentul operonului lac din E. coli este alcătuit din gena structurală lacZ, responsabilă de sinteza -galactozidazei, gena lacI, responsabilă pentru sinteza represorului proteic și un segment denumit secvență multiplă de clonare (MCS). Aceasta conține secvențe de recunoaștere pentru un număr mare de endonucleaze de restricție, care pot funcționa ca situsuri de clonare.

Atunci când celulele bacteriene care poartă vectorul nemodificat sunt dezvoltate pe mediu care conține izopropil-tiogalactozidază (un inductor al operonului lac), represorul codificat de gena lac I este dezactivat, nu se mai poate lega la operator, astfel că fragmentul genei lac Z este transcris. Proteină rezultată se combină cu o proteină codificată de ADN-ul cromozomal, pentru a alcătui o formă hibridă activă a -galactozidazei. Dacă în mediu este prezent substratul cromogen 5-brom-4-clor-3-indolil--galactozidaza (X-gal), acesta este hidrolizat de către -galactozidaza hibridă, rezultând un produs albastru. Astfel, coloniile bacteriene care conțin vectorul nemodificat au culoare albastră.

Secvența multiplă de clonare este introdusă în interiorul fragmentului operonului lac, dar nu împiedică producerea -galactozidazei, datorită dimensiunilor mici pe care le are. Dacă într-unul dintre situsurile de clonare este introdusă însă o inserție de dimensiuni mai mari, operonul este dezactivat, iar enzima nu se mai produce. Coloniile bacteriene care conțin vectorul modificat au culoare albă.

Segmentul operonului lac, alături de gena care conferă rezistență la ampicilină reprezintă markeri de selecție importanți pentru identificarea celulelor bacteriene eficient transformate.

VECTORUL BAC – Cromosomul Artificial Bacterian

(Bacterial Artificial Chromosom)

Sistemul de clonare BAC se bazează pe factorul de fertilitate F prezent în E.coli. Plasmida F este o moleculă circulară de ADN, mult mai mică decât cromosomul bacterian, având o dimensiune de aproximativ 100kb. Atunci când este utilizată ca vector de clonare sunt eliminate porțiuni de ADN, care nu sunt esențiale pentru funcționare.

În anul 1992 a fost obținut vectorul de clonare pBAC 108L, iar în prezent este utilizat vectorul pBelo BAC II (Fig. 5.17) care are la bază plasmida F, în care a fost introdusă o oligonucleotidă sintetică. Vectorul astfel rezultat are dimensiuni de 7,5 kb și posedă proprietăți specifice plasmidei F și totodată caracteristici provenite de la fragmentul nou introdus.

De la plasmida F a fost preluată gena care îi conferă rezistență la cloramfenicol, genele ori S și rep E, care mediază replicarea unidirecțională și genele par A și par B, care mențin numărul de copii la una sau cel mult două într-o celulă bacteriană.

Oligonucleotida sintetică conține fragmentul operonului lac din E. coli și un segment denumit secvență multiplă de clonare (MCS). Aceasta conține secvențe de recunoaștere pentru un număr mare de endonucleaze de restricție, care pot funcționa ca situsuri de clonare.

Segmentul operonului lac, alături de gena care conferă rezistență la cloramfenicol reprezintă markeri de selecție importanți, utilizați la alcătuirea și caracterizarea bibliotecii de ADN.

Clonele obținute cu ajutorul vectorului BAC au o serie de caracteristici:

au o mare stabilitate în timp;

se mențin într-un număr foarte redus de copii în celulele bacteriene în care au fost introduse, scăzând astfel foarte mult posibilitatea apariției recombinărilor între inserții;

ADN-ul plasmidial poate fi izolat cu ușurință;

Dacă sunt clonate fragmente de dimensiuni mari, în cazul în care numărul de plasmide/celulă bacteriană ar fi ridicat există pericolul aparițiilor unor recombinări necontrolate. Astfel, ADN plasmidial care ar fi recuperat după clonare ar purta inserții cu secvențe diferite.

Pentru a preîntâmpina acest neajuns, atunci când se dorește clonarea unor fragmente de dimensiuni mare se utilizează întotdeauna vectori care se mențin într-o singură copie în fiecare celulă bacteriană.

VECTORI DE EXPRESIE

Vectorii de expresie sunt vectori de clonare care conțin secvențe suplimentare reprezentate de: un promotor inductibil, regiunea care codifică o secvență specifică pentru legarea ARNm pe cromosom și o secvență terminală. La sfârșitul regiunii care codifică secvența de legare pe cromozom este introdusă o secvență de recunoaștere pentru o anumită enzimă de restricție, care se utilizează ca situs de clonare (Fig. 5.17).

Utilizarea vectorilor de expresie are ca scop producerea unei proteine de interes de către o bacterie.

Fig. 5.17. Secvențele suplimentare prezente într-un vector de expresie – promotor și secvențe UTR – transcrise dar netraduse, cu rol în legarea ARNm la ribozom

Orice secvență care începe cu codonul start (AUG) poate fi plasată în poziția marcată de săgeată și va fi transcrisă în celulele bacteriene.

După obținerea moleculei de ADN recombinat, în care a fost inserat fragmentul ADN de interes, aceasta este introdusă în celule bacteriene cărora le-a fost indusă competența. În celulele transformate va fi sintetizată proteină care corespunde exact cu regiunea de codificare inserată.

Dacă este clonată secvența unei gene provenite de la un organism eucariot, pot să apară probleme deoarece bacteriile nu posedă tot mecanismul necesar eliminării intronilor și legării exonilor între ei. Din această cauză este indicat să fie clonată (introdusă într-un vector de exprimare) o moleculă de ADN complementar.

O altă tehnică este aceea de a insera secvența de codificare puțin după începutul unei secvențe care codifică o proteină bacteriană; în acest fel, după translație se produce o proteină hibridă și anume: regiunea N-terminală este constituită dintr-o porțiune de proteină bacteriană a cărei secvența a fost întreruptă, iar restul proteinei corespunde secvenței de codificare străine.

Această secvență N-terminală bacteriană este de obicei scurtă, rolul ei fiind acela de a proteja proteina hibridă împotriva unei eventuale degradări produse de bacterie sau poate constitui secvența semnal care să asigure secreția proteinei hibride în mediu.

VECTORI SPECIFICI PENTRU PRODUȘII DE AMPLIFICARE (PCR)

În capitolul 4.1.1.1 a fost prezentată proprietatea de transferază terminală a Taq polimerazei, aceea de adăugare a unei o grupări dezoxi-adeninfosfat (A) la capetele 3’.

Prezența acestei grupări poate fi exploatată în procesul de clonare denumit „TA”, în care se utilizează un vector de clonare cu o grupare dezoxi-timinfosfat (T) neîmperecheată, la capătul 3', care complementează dezoxi-adeninfosfatul (A) neîmperecheat al produsului PCR.

Un astfel de sistem de clonare este TOPO TA, un vector liniarizat, care permite inserarea directă a produșilor de PCR amplificați cu ajutorul Taq polimerazei, fără a fi necesare proceduri post PCR. Sistemul enzimatic utilizat pentru formarea legăturilor fosfodiesterice este topoizomeraza I.

Un alt sistem de clonare pentru produși PCR, care permite secvențializarea directă este sistemul pGEM.

Acest vector liniar permite clonarea unor produși PCR de dimensiuni mai mici de 1 kb și conține promotorii T7 și SP6 care flanchează regiunea de clonare multiplă. De asemenea are o genă de rezistență la ampicilină și o regiune a operonului lac, care ajută la selecția transformanților. Conține situsuri unice de recunoaștere pentru 16 enzime de restricție și de asemenea cei doi primeri M13 sens și M13 antisens, care pot fi utilizați în procesele de determinare a secvenței inserției prin metoda Sanger (Fig. 5.19).

Fig. 5.19 Harta vectorului pGEM (A) și secvența multiplă de clonare

Catena superioară corespunde moleculei ARN sintetizată de catre

ARN polimeraza T7

Catena inferioarăcorespunde moleculei ARN sintetizată de către

ARN polimeraza SP6

Vectorul prezentat permite deci clonarea produșilor PCR prin sistemul T/A, deoarece posedă situsul de inserție corespunzător; poate funcționa ca un un vector de expresie, deoarece are în structura sa doi promotori și totodată poate fi utilizat în secvențializare pentru că posedă cei doi primeri specifici M13, sens și antisens.

5.3.1.2 ETAPELE PROCESULUI DE CLONARE ÎN PLASMIDE

Clonarea în plasmide presupune parcurgerea etapelor specifice pentru orice proces de clonare, care presupune formarea moleculelor de ADN recombinat, introducerea acestora în celule bacteriene pregătite în prealabil și selecția clonelor care conțin fragmentele de interes.

A. FORMAREA MOLECULELOR DE ADN RECOMBINAT

În principiu, clonarea în plasmide este foarte facilă. Într-o primă etapă vectorul este secționat cu o enzimă de restricție și legat în vitro cu un alt fragment de ADN. În reacția de recombinare poate să fie introdus unul sau mai multe fragmente ADN pentru care se dorește multiplicarea.

Legarea se realizează în prezența ADN ligazei, care are capacitatea de a reface legături fosfodiesterice între o grupare OH aflată la un capăt 3’ și o grupare fosfat aflată la un capăt 5’ al unui fragment ADN. Pentru a fi posibilă desfășurarea unor astfel de reacții este necesar ca ambele tipuri de ADN, atât vectorul cât și fragmentele de interes să aibă capete compatibile.

Fragmentele ADN au capete compatibile fie dacă au rezultat în urma secționării cu aceiași enzimă de restricție (în cazul în care enzimele utilizate generează capete coezive) fie au fost secționate cu enzime diferite, care generează capete netede.

În cazul în care fragmentele care urmează să fie legate nu au capete compatibile, este posibilă sinteza acestora cu ajutorul ADN polimerazelor specifice (capitolul 4.3.2).

Pentru a mări specificitatea reacțiilor, de obicei se realizează secționări cu enzime de restricție care generează capete coezive, atât pentru vector cât și pentru fragmentul/fragmentele de clonat. Astfel, reacția de ligare are loc cu ușurință, generându-se molecule ADN recombinat – alcătuite din vectorul de clonare, care a inclus un fragment de ADN străin (Fig. 5.20).

Fig. 5.20 Formarea moleculelor ADN recombinat

Atât vectorul, cât și moleculele ADN au fost secționate cu aceiași enzimă de restricție (EcoR I), care a generat capete coezive complementare, fiind astfel posibilă apropierea fragmentelor, formarea legăturilor de hidrogen între bazele complementare și apoi refacerea legăturilor fosfodiesterice în prezența ADN ligazei.

Una dintre problemele majore care apare în cazul clonării în plasmide este recircularizarea acestora fără a include fragmentul ADN străin. Acest proces poate fi limitat prin ajustarea concentrațiilor de ADN străin și vector, în timpul reacției de ligare sau prin tratarea vectorului secționat cu fosfatază.

În timpul legării celor două molecule, ADN ligaza catalizează formarea unei legături fosfodiesterice între două nucleotide adiacente numai dacă una dintre nucleotide posedă o grupare fosfat la capătul 5’ iar cealaltă o grupare OH la un capăt 3’.

Recircularizarea plasmidei poate fi împiedicată dacă gruparea 5’ fosfat este îndepărtată de la ambele capete ale ADN plasmidial liniarizat, utilizând fosfataza alcalină bacteriană.

Ca rezultat, nici una dintre catenele duplexului nu mai poate forma o legătură fosfodiesterică. Totuși, segmentul de ADN străin, care posedă o grupare fosfat la capătul 5’ poate fi legat eficient cu plasmida defosforilată, rezultând o moleculă circulară (Fig. 5.21).

Moleculele de ADN recombinat formate în urma reacției de ligare sunt introduse apoi în celule bacteriene în vederea multiplicării, proces care poartă numele de transformare.

În procesele de transformare se utilizează tulpini bacteriene selecționate, care nu au capacitatea de a distruge ADN străin pătruns în celule. Totodată din aceste celule au fost îndepărtate toate plasmidele naturale, astfel încât, în urma transformării să se regăsească numai moleculă de ADN recombinat nou introdusă.

Celulelor bacteriene care vor fi utilizate în reacția de transformare trebuie să li se fi indus în prealabil competența, adică învelișul lor celular să fie permeabilizat, astfel încât să permită pătrunderea ADN străin.

B. INTRODUCEREA MOLECULEI DE ADN RECOMBINANT ÎN CELULE BACTERIENE GAZDĂ

Moleculele de ADN recombinat se introduc într-o celulă gazdă, care devine tranzitoriu acceptoare de ADN străin. Se pot utiliza în acest scop bacteriile (E. coli), drojdiile (Saccharomices cerevisiae) sau culturile de celule (linii celulare CHO – Chinese hamster ovary), care îndeplinesc condițiile necesare: să aibă o rată de multiplicare ridicată, să prezinte susceptibilitate pentru vector și să prezinte un balast proteic minim.

Cel mai des sunt utilizate tulpini speciale E. coli naturale (E. Coli DH 10B sau E.coli HB 104) care au o rată de multiplicare ridicată.

Cu cât celula gazdă este mai prolifică, cu atât se obțin cantități mai mari de ADN recombinat, conducând la sinteza de copii ADN identice fragmentului genic înserat. Pornind de la o singură moleculă se poate ajunge la 1012copii de ADN recombinat.

PREPARAREA CELULELOR COMPETENTE E. coli

Susceptibilitatea celulelor bacteriene față de vector, sau competența se induce artificial prin metode specifice procedurii utilizate la transformare. Dacă celulele competente vor fi transformate prin metoda șocului termic, este necesară permeabilizarea lor, prin crearea unor pori în membrană, cu ajutorul CaCl2. În cazul în care, pentru transformare se va utiliza electroporarea nu este necesară o permeabilizare prealabilă, ci numai o îndepărtare a urmelor de săruri provenite de la mediul de cultură, în scopul evitării formării unor arcuri electrice.

În condiții ideale, diviziunea bacteriei E. coli se produce exponențial, rata de creștere depinzând de mediul de cultură, de genotipul bacteriei, de temperatură și de gradul de aerare.

Dacă densitatea culturii crește, rata diviziunii descrește. În momentul în care cultura bacteriană atinge o anumită concentrație – valoarea de saturație, diviziunea este oprită, dar bacteriile sunt încă viabile.

Rata de multiplicare este urmărită prin măsurarea periodică a densității optice la o lungime de undă de 600 nm. Relația dintre densitatea optică și numărul de celule variază de la o tulpină la alta și este recomandabil să se alcătuiască curbe de calibrare care să reflecte această relație.

Pentru a obține celule competente care dau o rată mare de transformare este necesar ca în cultura bacteriană numărul de celule să fie de 5×107 celule/ml. Din curba de calibrare se poate determina densitatea optică corespunzătoare acestui număr de celule, pentru fiecare tulpină bacteriană în parte.

În mod practic densitatea optică se măsoară din timp în timp, iar dezvoltarea se oprește atunci când aceasta a atins valoarea corespunzătoare numărului de 5×107 celule/ml, pentru tulpina bacteriană cu care se lucrează.

După ce celulele bacteriene au fost pregătite, are loc introducerea moleculelor de ADN recombinat în acestea, proces care poartă numele de transformare.

În cazul în care vectorul de clonare a fost o plasmidă, sau plasmida specială BAC, transformarea poate avea loc prin șoc termic sau prin electroporare. În urma procesului de transformare moleculele de ADN recombinat ajunse în celulele bacteriene au o replicare corelată, respectiv independentă față de cea replicarea bacteriană.

Cultura bacteriană rezultată în urma transformării se cultivă pe mediu de cultură solid suplimentat cu factorii de selecție potriviți.

Fiecare celulă eficient transformată va generă un ansamblu de celule care poartă numele de clonă. Deci, fiecare colonie care se dezvoltă pe mediul de cultură solid este o clonă, în care toate celulele poartă același tip de ADN recombinat (Fig. 5.22).

Fig. 5.22. Transformarea celulelor bacteriene și selecția bacteriilor eficient transformate

C. SELECȚIA CLONELOR OBȚINUTE

Cultivarea pe medii suplimentate cu factori de selecție permite numai dezvoltarea celulelor care au fost eficient transformate (care conțin vectorul de clonare purtător al genelor de selecție).

În continuare este necesară identificarea acelor clone care conțin moleculele de ADN recombinat și cele care conțin vectorul recircularizat. Această selecție se realizează de obicei pe baza testării rezistenței la anumite antibiotice sau prin apariția unor reacții de culoare. De cele mai multe ori se realizează pe baza reacției de culoare, în prezența substratului X-gal (5-brom-4-clor-3-indolil--galactozidaza). Astfel, vor fi analizate în continuare numai acele clone care au generat colonii de culoare albă. Clonele care au generat colonii albastre conțin vectorul recircularizat, neavând importanță din punctul de vedere al procesului de clonare.

Apoi este necesară selectarea acelor clone care conțin ADN recombinat purtător al unei secvențe ADN de interes. În acest scop pot fi aplicate mai multe metode.

5.3.1.3 TESTAREA CLONELOR EFICIENT TRANSFORMATE

Pentru a fi posibilă testarea cu ajutorul sondelor moleculare este necesară obținerea unor suporturi solide (membrane de nylon sau nitroceluloză) care să aibă fixate pe ele ADN plasmidial corespunzător tuturor clonelor care urmează a fi testate, sub formă denaturată (Fig. 5.23).

Testarea imunologică

Testarea imunologică poate fi aplicată atunci când sunt folosiți la clonare vectori de exprimare.

În acest caz biblioteca ADN conține clone care au ca inserții molecule de ADN complementar. Având în vedere că s-au utilizat vectori de expresie, în cultura bacteriană trebuie să fie prezentă proteina codificată de gena care a fost clonată.

Procesul de testare este asemănător cu cel care utilizează sonde moleculare și presupune parcurgerea mai multor etape (Fig. 5.24).

În primul rând cultura de clone este acoperită cu o membrană de nylon, pe care rămân fixate coloniile bacteriene.

Prin metode specifice are loc o extracție și o fixare a proteinelor din celulele bacteriene direct pe membrană (inclusiv proteina de interes).

Apoi, membrana este incubată cu un anticorp specific, care se va lega selectiv la proteina de interes. După spălarea anticorpului care nu s-a legat la proteina țintă, membrana este incubată cu cel de-al doilea anticorp, care prezintă afinitate pentru primul anticorp folosit și a fost marcat în prealabil.

În urma examinării membranei se poate evidenția exact poziția coloniei bacteriene care a sintetizat proteina de interes, deci cea care posedă ca inserție a vectorului de clonare gena căutată.

Fig. 5.23 Identificarea clonelor care posedă ca inserție fragmente ADN complementare cu sondele moleculare

5.3.2. CLONAREA ÎN BACTERIOFAGI

Posibilitatea urmării ciclului lizogenic al bacteriofagilor a fost exploatată pentru utilizarea acestora în tehnologia ADN recombinat.

Astfel au fost obținuți mutanți ai bacteriofagului λ care posedă toate proprietățile pentru a putea fi folosiți ca vectori de clonare. Utilizarea bacteriofagului λ în procesul de clonare implică următoarele etape:

ADN vectorului este secționat cu o enzimă de restricție potrivită;

Capetele vectorului sunt legate cu fragmentele de ADN străin (este necesar ca fragmentele care urmează să fie legate să posede capete compatibile);

ADN recombinat este împachetat în vitro într-o particulă de bacteriofag viabilă care poate infecta celulele bacteriene.

Dezavantajul utilizării ADN fagic ca vector de clonare este că în acest caz pot fi introduse fragmente foarte mici de ADN. Introducerea unor fragmente mai mari împiedică împachetarea ADN în „capul” bacteriofagului.

Din acest motiv se practică o altă metodă și anume eliminarea unei părți de ADN din genomul bacteriofagului astfel încât să nu fie perturbată posibilitatea de împachetare și infectare. În urma acestor modificări, capetele coezive (cos) ale ADN fagic trebuie să rămână nealterate, deoarece sunt implicate în împachetarea noilor particule virale. Apoi, genomul modificat al bacteriofagului este secționat cu o enzimă de restricție.

În paralel ADN care urmează a fi clonat este secționat cu aceiași enzimă de restricție, după care sunt separate fragmentele care au o lungime de aproximativ 20 kb.

Fragmentele rezultate în urma secționării cu aceiași enzimă de restricție a vectorului și a fragmentelor cu lungimea de 20 kb din ADN de clonat sunt puse în contact, în prezența ADN ligazei.

În continuare pot fi urmate două căi (Fig. 5.25):

Unirea fragmentelor inițiale ale genomului bacteriofagului, conducând la formarea unei catene de ADN cu o lungime egală cu 72% din lungimea genomului normal (nemodificat); această lungime este prea mică pentru a permite împachetarea într-o particulă de bacteriofag.

Pot fi împachetate numai fragmente cu o lungime cuprinsă între 75 și 105% dintr-un genom normal.

Introducerea unei inserții potrivite (10-25 kb) între cele două capete ale ADN al bacteriofagului, care conduce la formarea unei molecule cu o lungime potrivită, care poate fi împachetată.

Aproape toate particulele λ formate în acest fel vor conține ca inserție fragmentul de ADN străin.

Fig. 5.25 Etapele procesului de obținere a ADN recombinat, în cazul clonării în bacteriogfagi

După ce a fost manipulată molecula ADN recombinat, aceasta este împachetată în vitro într-o particulă fagică, care are posibilitatea de a infecta celulele bacteriene.

Se cunoaște că acțiunea de infectare are loc după următorul mecanism: fagul se prinde cu cele șase fibre proteice codale și cu placa terminală de suprafața celulei bacteriene, după care cilindrul cozii se contractă și partea sa interioară pătrunde întocmai ca un ac de seringă, ADN fagic fiind injectat în celula gazdă.

După pătrunderea în celula gazdă este urmat ciclul lizogenic, adică ADN provenit de la bacteriofag este inserat în cromozomul bacterian, fiind menținut în populația celulelor bacteriene o dată cu replicarea ADN bacterian.

Avantajul clonării cu ajutorul bacteriofagilor este că introducerea moleculei de ADN recombinat în celule se realizează mai ușor decât în cazul plasmidelor, nefiind necesară inducerea competenței pentru celulele gazdă.

Dezavantajele acestui procedeu sunt reprezentate de lungimea relativ redusă a fragmentelor care pot fi clonate (25 kb) și de faptul că fragmentul de ADN străin se regăsește ca parte a cromozomului bacterian. De aceea, atunci când se dorește analizarea fragmentelor clonate este necesară izolarea ADN cromozomal bacterian și apoi separarea fragmentelor provenite din genomul bacterian de cele care au fost introduse în mod artificial.

5.3.3. CLONAREA ÎN COSMIDE

Cosmidele reprezintă un alt tip de vectori de clonare, care sunt hibrizi între plasmide și bacteriofagi, permițând clonarea unor fragmente cu lungimi de până la 40 kb. Au fost construite pentru prima dată în anul 1978.

Cosmidele sunt structuri artificiale care conțin:

O genă care le conferă rezistență la un antibiotic și o origine a replicării, preluate de la plasmide;

Unul sau mai multe locuri de recunoaștere pentru enzime de restricție;

Capetele coezive ale bacteriofagului λ (capetele cos), care permit împachetarea moleculei ADN hibride într-o particulă fagică.

Caracteristica esențială a acestui vector este că produce infecția ca un bacteriofag, adică direct, fără a necesita procese de pregătire prealabilă a celulelor bacteriene și se menține apoi în celulele bacteriene ca o plasmidă.

5.3.4. UTILIZAREA TEHNOLOGIEI ADN RECOMBINAT ÎN PRODUCEREA INSULINEI

În perioada 1963-1965, trei grupe de cercetători (americani, germani și chinezi) au reușit sinteza artificială a insulinei prin intermediul a 170 de reacții chimice, lucru ce făcea imposibilă producerea insulinei pe cale industrială.

Noile tehnologii industriale de obținere a insulinei umane au fost posibile odată cu identificarea genei insulinei (anul 1980) și crearea moleculelor recombinate de ADN, utilizând o plasmida ca vector de clonare. Insulina este o proteină mică, cu masa de 5734 daltoni și cuprinde 51 resturi aminioacidice. Este alcătuită din două lanțuri, un lanț A (cu 21 resturi aminoacidice) și unul B (cu 30 resturi aminoacidice) legate prin două punți disulfurice (A7-B7 și A20-B19); o a treia legătură disulfurică leagă restul Cys-A6 cu Cys-A11.

În procesul de clonare, segmente de gene corespunzătoare lanțurilor mature de insulină A și B sunt introduse în plasmide diferite, care prezintă rezistență la un antibiotic și gena structural β-gal ca markeri.

Plasmidele sunt transferate separat în E. coli. În cultura de bacteriană, în prezența antibioticului de selecție se dezvoltă numai acele celule bacteriene care au fost eficient transformate. Inducția expresiei β-gal (prin adăugarea de β-galactoză) determină exprimarea genelor pentru insulină, care sunt transcrise și traduse în celulele bacteriene. Lanțurile insulinice sunt extrase din celulele bacteriene după care sunt puse în contact, formându-se insulina activă biologic (Fig. 5.26).

Datorită utilizării tehnologiei ADN recombinant, se obțin aproximativ 200 grame de insulină de pe 1 m3 de mediu de cultură, adică tot atât cât se poate extrage din aproape 1600 kg de pancreas de bou sau porc.

Insulina umană este singura proteină animală produsă în bacterii pentru care structura este absolut identică cu cea a moleculei naturale.

Inițial au apărut unele probleme cauzate de contaminarea produșilor finali cu celule bacteriene, care prezentau un risc de îmbolnăvire pentru pacienți, problemă care a fost rezolvată prin introducerea unor procedee avansate de purificare. În prezent insulina este produsă în drojdii, care secretă o moleculă cu o structură tridimensională perfectă, care nu mai necesită operațiuni costisitoare de purificare avansată.

Probele clinice efectuate cu insulina umană, produsă prin tehnici de inginerie genică, au demonstrat că ea nu are efecte secundare și că poate fi comercializată, adică folosită la tratarea bolnavilor de diabet (din 1982 în SUA și din 1983 în Marea Britanie).

5.26. Procesul de producere a insulinei prin tehnologia ADN recombinant

5.4. ALCĂTUIREA BIBLIOTECILOR ADN

Bibliotecile ADN sunt colecții de clone care au ca inserții fragmente ADN genomic sau complementar, care pot fi menținute în condiții specile și care pot fi multiplicate în funcție de necesități.

5.4.1. BIBLIOTECILE ADN GENOMIC

Bibliotecile de ADN genomic conțin câteva zeci de mii de clone, fiecare dintre acestea având ca inserție un fragment din ADN genomic. Având în vedere că procesul de clonare are loc la întâmplare este posibil ca unele fragmente să fie prezente în mai multe clone, iar altele să nu fie reprezentate, dar în general inserțiile clonelor sunt diferite. Pentru a fi siguri că a fost acoperit tot genomul, deci probabilitatea de a exista fragmente nereprezentate să fie foarte mică este necesar ca suma inserțiilor tuturor clonelor să fie de aproximativ 7 ori mai mare decât dimensiunea genomului

5.4.1.1. OBȚINEREA BIBLIOTECILOR GENOMICE

Bibliotecile genomice se obțin prin procedee clasice de clonare, cu unele caracteristici specifice. Este necesară existența unei surse de ADN genomic pentru specia de interes și un vector de clonare care să-i confere următoarele caracteristici:

clonele care o alcătuiesc să fie stabile, pentru a putea fi utilizate un timp îndelungat;

să aibă dimensiunile inserțiilor suficient de mari, astfel încât un număr cât mai mic de clone să acopere fragmente cât mai mari din genom;

ADN-ul plasmidial să poată fi izolat și purificat cu ușurință, pentru a simplifica procesele de analiză a clonelor;

Există mai multe sisteme de clonare care îndeplinesc aceste condiții, și anume cromozomul artificial de drojdie – YAC și cromozomul artificial bacterian – BAC. Acesta din urmă este cel mai mult utilizat pentru producerea de biblioteci genomice.

În alcătuirea bibliotecii genomice se parcurg mai multe etape și anume (Fig. 5.27):

Izolarea nucleilor intacți;

Extracția ADN genomic din nuclei prin liza învelișului nuclear.

Este necesară aplicarea unei proceduri speciale de extracție a ADN pentru că în cazul metodelor uzuale de extracție și purificare a ADN genomic, din cauza secționărilor mecanice care apar în timpul diferitelor etape de lucru se obțin fragmente ADN cu dimensiuni relativ reduse (100 -200 kb).

Secționarea parțială a ADN genomic cu o endonucleaza de restricție.

Este necesară secționarea parțială a ADN genomic, pentru ca fragmentele care se vor regăsi ca inserții în clonele bibliotecii de genomice să se suprapună pe anumite porțiuni. Astfel, va fi posibilă alcătuirea hărților fizice prin identificarea clonelor cu inserții suprapuse.

Separarea prin electroforeză în câmp electric pulsatoriu (PFGE – pulsed field gel electroforesis) și izolarea porțiunii de gel care conține fragmentele de ADN cu dimensiuni cuprinse între 200 și 500kb;

Sunt selectate fragmentele cu lungimi mari (200-500 kb), deoarece în cazul introducerii în reacția de ligare a unui amestec cu fragmente de diferite dimensiuni, includerea fragmentelor mici în moleculele de ADN recombinat este favorizată din punct de vedere energetic.

În cazul construirii bibliotecilor genomice se dorește obținerea unor clone cu inserții mari, care să asigure acoperirea întregului genom.

Secționarea vectorului de clonare cu aceiași enzimă de restricție, care trebuie să posede un situs de recunoaștere unic, plasat în secvența multiplă de clonare (MCS);

Obținerea ADN-ului recombinat prin punerea în contact a vectorului de clonare și a fragmentelor de ADN genomic, ambele secționate cu aceiași endonuclează de restricție, în prezența ADN ligazei. Între cele două tipuri de fragmente se formează legături fosfodiesterice, datorită existenței capetelor coezive.

Electroporarea, adică introducerea moleculelor de ADN recombinat în celule bacteriene electrocompetente, cărora li s-a indus în prealabil competența;

Selecția coloniilor bacteriene eficient transformate pe baza rezistenței la antibioticul specific;

Selecția coloniilor bacteriene care conțin ADN recombinat, pe baza reacției de culoare.

Având în vedere că noțiunea de clonă definește ansamblul de celule care provin de la o celulă unică, se consideră că fiecare colonie albă reprezintă o clonă BAC, constituită din celule bacteriene E. coli, care posedă același tip de ADN recombinat.

În general se selectează un număr de 30-40.000 de clone, care sunt transferate pe plăci speciale, distribuite pe rânduri și coloane și alcătuiesc biblioteca genomică.

Fig. 5.27 Etapele principale de alcătuire a unei biblioteci genomice

5.4.1.2 TRANSFERUL CLONELOR BAC CARE ALCĂTUIESC BIBLIOTECA GENOMICĂ PE SUPORTURI SOLIDE

Pentru ca biblioteca genomică să poată fi analizată în continuare este necesar ca toate clonele care o alcătuiesc să fie transferate pe suporturi solide – membrane de nylon. Acestea sunt transferate cu ajutorul unor roboți speciali, pentru a asigura o distribuție foarte ordonată.

De exemplu, în cazul unei biblioteci ADN, pe o membrană cu dimensiunile de 8×12 cm sunt transferate 1536 de clone, aranjate în 384 de careuri (3x3mm), dispuse în 24 coloane și 16 rânduri. Fiecare clonă se aplică în două spoturi dispuse simetric în cadrul careului, conform schemei de mai jos (Fig.5.28). Astfel, în fiecare careu sunt prezente patru clone BAC diferite.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

A

B

C

D

E

G

H

I

J

K

L

M

N

O

P

Fig. 5.28 Distribuția clonelor BAC pe membrana cu numărul (1-4), din biblioteca genomică

Literele (A,B,C..P) reprezintă simbolul liniei iar cifrele (1,2,…. 24) simbolul coloanei de pe placa de pe care provin clonele BAC. In careul corespunzător poziției C 12 a fost prezentată distribuția celor 4 clone BAC care îl alcătuiesc. Prima cifră din codul fiecărei clone BAC reprezintă numărul plăcii de pe care aceasta provine ( în acest caz 1, 2, 3 sau 4).

5.4.1.3 CARACTERIZAREA BIBLIOTECII GENOMICE

O bibliotecă genomică conține deci 30- 40.000 de clone BAC, cu o dimensiune medie a inserțiilor de aproximativ 100 – 150 kb.

Dimensiunile însumate ale inserțiilor clonelor trebuie să depășească de 5-7 ori genomul speciei, pentru a fi siguri că fiecare fragment de ADN genomic este prezent în cel puțin o clonă.

Deoarece ADN genomic a fost secționat parțial, cel mai probabil este ca fragmentele de ADN care alcătuiesc inserțiile clonelor BAC să se suprapună în anumite porțiuni. Având în vedere că procesul de clonare este statistic, există posibilitatea ca unele fragmente de ADN să nu fie regăsite ca inserții ale clonelor BAC iar altele să fie prezente în mai multe clone.

În cazul în care se alcătuiesc biblioteci genomice ale plantelor superioare, trebuie să se țină cont de faptul că acestea dețin o cantitate mare de ADN repetitiv, care nu se exprimă dar care produc o cantitate mare de fragmente de restricție.

Pentru a depăși acest inconvenient se utilizează enzime de restricție sensibile la metilare, deoarece regiunile transcrise sunt mult mai puțin metilate decât regiunile cu secvențe repetitive.

O enzimă precum Pst I va genera fragmente foarte mari în regiunile repetate metilate, fragmente care nu pot fi clonate și/sau amplificate și fragmente de mărimi medii în regiunile care conțin gene sau secvențe moderat repetate.

5.4.2. BIBLIOTECILE ADN complementar (ADNc)

O bibliotecă ADN complementar reprezintă o colecție de clone, care

au ca inserții moleculele de ADN complementar (ADNc) corespunzătoare populației de ARNm existentă la un moment dat în celule.

O astfel de bibliotecă cuprinde numai informația pură, formată numai din secvențe de exoni. Spre deosebire de bibliotecă de ADN genomic, care rezultă din clonarea fragmentelor de ADN originare direct din genom, fragmentele ADNc se sintetizează artificial în laborator, pe o moleculă de ARN mesager matur, ca o copie complementară (capitolul 4.5).

În timp ce clonele de ADN genomic sunt identice pentru toate celulele aceluiași organism, clonele ADNc sunt specifice țesutului, stadiului de dezvoltare, condițiilor de mediu etc. Prin urmare, atunci când se alcătuiește o bibliotecă ADNc, trebuie să se țină seama de aspectele menționate, iar alegerea materialului să se realizeze în funcție de scopul urmărit.

De exemplu, dacă se dorește evaluarea expresiei genelor în condiții de stres, este necesară alcătuirea a două biblioteci ADNc. Una va proveni din ARNm al lotului control, iar cea de-a doua de la un lot supus factorilor de stres.

5.4.2.1. OBȚINEREA BIBLIOTECILOR ADNc

Pentru obținerea bibliotecilor ADNc, prima etapă este extracția ARN, separarea ARNm, după care are clonarea, urmând toate etapele specifice acestui proces, cu câteva particularități datorate structurii moleculelor de ADNc.

Ca vectori de clonare se aleg în general plasmidele sau vectorii de expresie. Având în vedere că fragmentele clonate sunt gene, secvențe codante de ADN, este posibilă alegerea unor vectori de expresie atunci când scopul nu este numai multiplicarea ADN, ci și producerea de proteine.

În procesul de clonare nu mai este necesară secționarea moleculelor de ADN, deoarece populația de ADNc este alcătuită din fragmente cu dimensiuni mici. Dar, pentru a mări eficiența procesului de formare a moleculelor de ADN recombinat, ADNc este prelucrat suplimentar, după cum urmează:

Metilarea moleculelor de ADNc, pentru a le proteja împotriva secționării cu enzime de restricție;

La capetele moleculelor ADNc se leagă fragmente de ADN denumite adaptoare cu situs de restricție („Restriction site linker”) care sunt oligonucleotide care conțin în secvența lor un situs de recunoaștere al unei enzime;

Fragmentele ADNc modificate, sunt secționate cu enzima de restricție al cărui situs se află în adaptori;

Vectorul de clonare este secționat cu aceiași enzimă de restricție;

Obținerea moleculelor ADN recombinat prin punerea în contact a vectorului de clonare și a fragmentelor de ADN genomic, ambele secționate cu aceiași endonuclează de restricție, în prezența ADN ligazei. Între cele două tipuri de fragmente se formează legături fosfodiesterice, datorită existenței capetelor coezive.

Transformarea, adică introducerea moleculelor de ADN recombinat în celule bacteriene, cărora li s-a indus în prealabil competența;

Selecția coloniilor bacteriene eficient transformate pe baza rezistenței la antibioticul specific;

Selecția coloniilor bacteriene care conțin ADN recombinat, pe baza reacției de culoare.

Dintre coloniile bacteriene, care reprezintă fiecare o clonă este selectat un număr de 106-107, care sunt transferate pe membrane solide, după un procedeu similar cu cel aplicat în cazul bibliotecii ADN genomic.

Fig. 5.29 Etapele procesului de clonare a moleculelor de ADNc

5.4.2.2. CARACTERIZAREA BIBLIOTECII ADNc

O bibliotecă ADNc trebuie să conțină deci 106-107 de clone ADNc, cu o dimensiune a inserțiilor care depinde de lungimea produsului de transcripție.

Este necesar un număr atât de mare de clone pentru ca probabilitatea ca anumiți produși de transcripție să nu fie prezenți.

Având în vedere că procesul de clonare este statistic, fragmentele ADNc care corespund unor gene cu o transcripție abundentă se vor găsi într-un număr foarte mare de clone, iar cele care provin de la gene cu transcripție ocazională vor fi extrem de rare, sau chiar vor lipsi.

5.5. SECVENȚIALIZAREA FRAGMENTELOR ADN

Metodele pentru determinarea secvenței nucleotidice a unor fragmente de ADN au fost dezvoltate independent de Walter Gilbert – o tehnică de degradare chimică și Fred Sanger – o tehnică de sinteză enzimatică, care în 1980 au primit premiul NOBEL.

Metoda Gilbert se bazează pe modificarea ADN, urmată de secționarea la nivelul bazelor specifice. Metoda necesită marcare radioactivă și o purificare avansată a fragmentelor care urmează să fie secvențializate, și de aceea a fost abandonată, fiind înlocuită de metoda Sanger.

Pentru ca o reacție de secvențializare să aibă loc, este necesară utilizarea unui primer specific, prin urmare este necesară cunoașterea secvenței care mărginește fragmentul țintă de analizat. De aceea, în prezent fragmentele de secvențializat sunt clonate în vectori specifici, cu secvențe cunoscute (care au fost prezentați în capitolul 5.3.1). În acest caz secvențele care flanchează orice fragment clonat sunt cunoscute, pentru ele fiind disponibili primeri care pot fi utilizați în orice reacție de secvențializare. Pentru fiecare vector de clonare, care poate fi utilizat la secvențializare, există pe piață primeri specifici care pot fi utilizați în acest proces.

5.5.1. METODA DE SECVENȚIALIZARE SANGER

Metoda Sanger se bazează pe utilizarea unei molecule, dideoxinucleozid trifosfat (ddNTPs), un compus care, spre deosebire de deoxiriboză nu are o grupare OH în poziția 3’. Această moleculă are proprietatea de a bloca sinteza ADN, deoarece îi lipsește gruparea necesară pentru formarea unei legături fosfodiester între două nucleotide.

Pentru a se desfășura o reacție de secvențializare sunt necesare următoarele componente: o moleculă de ADN matriță, monocatenară; un primer, ADN polimerază, nucleotide marcate radioactiv sau fluorescent și nucleotidele modificate (dideoxi), care au proprietatea de a bloca sinteza ADN.

Având în vedere că procesul de secvențializare se bazează pe o reacție de sinteză a ADN, el începe întotdeauna la capătul 5’ al fragmentului de analizat.

Proba de ADN se împarte în patru reacții, fiecare conținând toate cele patru deoxinucleotide marcate (dATP, dGTP, dCTP și dTTP) și ADN polimeraza (Fig. 5.30). În fiecare reacție se adaugă una dintre cele patru dideoxinucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP, sau ddTTP).

Fig. 5.30 Desfășurarea reacției de secvențilaizare, cu nucleotide marcate

De exemplu, dacă fragmentul de analizat are secvența de mai jos, în reacția ce va stabili localizarea C se va adauga ddGTP; atunci când dideoxiribonucleotidul respectiv este încorporat în catena în curs de formare, sinteza se oprește. Când polimeraza întâlnește următorul nucleotid C fenomenul se repetă și rezultă astfel fragmente de 3, 6, 9 și 13 nucleotide.

Reacții similare pentru nucleotidele cu A, T și C vor furniza serii corespunzătoare de fragmente.

Catenele nou sintetizate, marcate datorită includerii dideoxi-nucleotidelor marcate, sunt denaturate termic și separate în funcție de dimensiuni (cu o rezoluție de o nucleotidă) prin electroforeză într-un gel denaturant de poliacrilamidă. Amestecurile de reacție migrează în același gel, în godeuri individuale (linia A, T, C, sau G).

Benzile ADN sunt vizualizate apoi prin autoradiografiere sau prin iluminare UV, astfel că ansamblul celor patru reacții poate fi citit pe o “scară” pozițională direcționată de la fragmentele cele mai mici la cele mai mari; astfel se poate determina secvența de nucleotide a fragmentului analizat.

O altă variantă a acestei metode se desfășoară similar cu cea prezentată anterior, diferențiindu-se prin tipul de marcare (Fig. 5.31).

Fig.5.31 Desfășurarea reacției de secvențilaizare, cu primeri marcați

În acest caz, cele patru tipuri de amestecuri de reacție sunt marcate datorită marcării anterioare a primerilor.

Cea mai utilizată metodă în prezent este cea în care dideoxi-nucleozid-trifosfații sunt marcați cu coloranți fluorescenți diferiți, denumită și metoda cu colorant terminal “Dye-terminator sequencing”

Astfel, amplificarea are loc într-o singură reacție, iar produșii de amplificare sunt analizați prin electroforeză capilară. La ieșirea din gel fragmentele ADN sunt scanate de către un laser, care înregistrează automat colorantul corespunzător fragmentului respectiv. Separarea fragmentelor ADN se realizează în funcție de dimensiuni, astfel încât este posibilă trasarea unei diagrame care precizează ordinea bazelor azotate în fragmentul matriță (Fig. 5.32).

Fig. 5.32. Etapele procesului de secvențializare prin metoda

“Dye-terminator sequencing”

La interpretarea rezultatelor trebuie să se țină seama de faptul că în prima parte a secvenței 15-40 de nucleotide corectitudinea procesului de secvențializare este mai redusă, la fel ca și după ce a fost parcursă o lungime a fragmentului de 700-900 nucleotide. Prin urmare, secvențializarea unui fragment mai mare 700-800 nucleotide nu va furniza rezultate reale. Dacă se dorește analizarea unor fragmente cu o lungime mai mare este posibilă secvențializarea din două direcții (pornind de la cele două situsuri de inserție ale fragmentului ADN în vectorul de clonare). Se vor obține două secvențe cu orientare opusă, care vor fi comparate și apoi suprapuse, pentru a determina secvența reală a fragmentului analizat (Fig. 5.33.).

De asemenea este posibil ca prima parte a secvenței determinate să provină din vectorul de clonare (care flanchează fragmentul de analizat), fapt care trebuie să fie luat în considerare atunci când se interpretează rezultatele obținute.

Fig. 5.33 Secvențializarea unui fragment ADN, pornind din două direcții de sinteză

Determinarea secvenței are loc în direcția 5’-3’, pentru fiecare catenă ADN

Metoda de sinteză enzimatică descrisă de Sânger este din ce în ce mai mult folosită fiind perfecționată continuu. Folosind ca vectori, pentru secvența de determinat, plasmide de generația III-a se pot secvențializa molecule de ADN bicatenar. Marcajul radioactiv a fost înlocuit cu marcajul prin fluorocromi specifici fiecărui nucleotid. Informatizarea a deschis drumul automatizării și sunt deja folosite secvențializatoare automate.

Instrumentele automatizate pot să secvențializeze până la 384 de probe ADN în același timp, într-o singură migrare, fiind posibile 24 de migrări pe zi. Secvențializatoarele sunt dotate cu sistem de electroforeză capilară pentru separarea fragmentelor ADN în funcție de dimensiuni iar detecția, înregistrarea fluorescenței și a rezultatelor are loc sub forma unor cromatograme (5.34). Reacțiile de amplificare, purificare și resuspendare în soluție tampon, care se desfășoară înainte de secventializare sunt automatizate. Există soft-uri care pot să elimine automat urmele de ADN de calitate redusă. Precizia unor astfel de algoritmi este mai redusă comparativ cu examinarea vizuală de către un operator, dar suficientă pentru a permite automatizarea procesării unei game foarte mari de date.

Fig. 5.34. Cromatogramă, care reprezintă rezultatul final al unui proces de secvențializare automatizată

5.5.2. APLICAȚII ALE PROCESULUI DE SECVENȚIALIZARE

Metodele aplicate în prezent permit determinarea directă, într-o singură reacție, a secvențelor pentru fragmente de DNA relativ scurte (maxim 1000 de nucleotide). De aceea secventializarea diferitelor genomuri, cu dimensiuni cuprinse între 104 și 1011 nucleotide (genomul uman este alcătuit din 3,3 x 109 nucleotide) necesită parcurgerea unor etape de clonare, urmate apoi de secvențializare.

În unele cazuri în care genomul are dimensiuni reduse (virusuri, bacterii) sau dacă organismul investigat prezintă importanță deosebită (om) secventializarea genomului a fost realizată în totalitate. În cazul altor tipuri de organisme a fost realizată secventializarea unor regiuni cromozomale de interes. Toate secvențele determinate până în prezent se găsesc în baze de date, cum ar fi „EMBL Nucleotide Sequence Database” sau „BLAST -Basic Local Alignment Search Tool”, cu caracter public. Informațiile existente în aceste baze de date pot sta la baza cercetărilor ulterioare cu privire la identificarea și caracterizarea genelor.

5.5.2.1. DETERMINAREA UNOR SECVENȚE ADN

De cele mai multe ori fragmentele pentru care se dorește identificarea secvenței fac parte din regiunile codante ale genelor și de aceea atenția s-a îndreptat spre investigarea ARNm, respectiv a ADNc. Pentru a extinde mai mult cercetările atenția s-a îndreptat spre bibliotecile ADNc, ale căror clone sunt sunt reprezentante ale tuturor moleculelor ARNm prezente la un moment dat în țesutul analizat. La rândul lor, moleculele ARNm au suferit procesele de prelucrare specifice (structura moleculei ARNm, după prelucrare a fost prezentată în fig. 3.11).

Secvențializarea integrală a inserțiilor acestor clone nu este posibilă, deoarece lungimea lor medie este mai mare comparativ cu posibilitatea de secvențializare (700-900 nucleotide).

Prin urmare se determină secvențele ambelor extremități 5’ și 3’, denumite EST – etichete ale secvențelor exprimate („Expressed Squence Tags”, care furnizează informații cu privire la secvența moleculei ARNm, 5’ EST reprezintă secvența unei părți a transcriptului, care de obicei codifică o proteină (exoni). Aceste regiuni sunt conservate între specii și nu se modifică prea mult în cadrul unei familii de gene.

Secvența 3’ EST provine într-o mai mare măsură din secvența 3’ UTR (secvență transcrisă dar netradusă) și de aceea conține într-o proporție mai mare secvențe necodante. Această situație se datorează lungimii mai mări a secvenței 3’ UTR comparativ cu 5’ UTR.

Toate secvențele EST determinate până în prezent (mai mult de 60 de milioane) se găsesc în baza de date “GenBank” – dbEST”, EST -NCBI site – (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/).

Acest tip de secvențe a fost dezvoltat inițial pentru identificarea produșilor de transcripție ai unor gene, dar pe parcurs utilizarea lor s-a extins în domeniul identificării genelor, pentru obținerea unor date privind expresia și reglarea genelor, determinarea secvențelor și pentru dezvoltarea unor sisteme de markeri moleculari cum ar fi: RFLP– polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție („Restriction fragment length polymorphism”), SSR – secvențe simple repetate (microsateliți) („Simple sequence repeats”), SNP polimorfismul unei singure nucleotide („Single nucleotide polymorphism”), CAPS – polimorfismul fragmentelor amplificate și secționate („Cleaved amplified polymorphic sequence”).

De asemenea secvențele EST pot fi utilizate în scopul design-ului unor sonde ADN cu utilizare în analizele microarray, pentru evaluarea expresiei genelor.

Sondele moleculare dezvoltate pe baza EST vor recunoaște secvențe unice în genom, ceea ce constituie un avantaj major în procesele de alcătuire a unor hărți genetice cu densitate mare și a hărților fizice.

O altă posibilitate de investigare este secvențializarea moleculelor dintr-o bibliotecă DNAc în scopul evidențierii secvențelor genelor transcrise la un moment dat în celule.

Procesul de secvențializare poate sta la baza identificării mutațiilor punctiforme, denumite în literatura de limba engleză SNP (single nucleotide polymorphism) – polimorfismul unei singure nucleotide, care pot să însoțească apariția unei boli. Evidențierea acestor mutații prin secvențializare permite diagnosticarea precisă și precoce a bolii.

Alteori procesele de secvențializare au ca obiect de analiză fragmente ADN, care provin din regiuni cromosomale diferite.

Astfel, dacă se identifică regiuni cromosomale de interes, în care se află aplasate gene, cu ajutorul bibliotecilor genomice este posibilă cartarea fizică, urmată de secvențializare. Modalitatea de alcătuire a hărților fizice este descrisă în capitolul…

Au fost secventializate +++genomuri

MARKERII SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Metoda evaluării SNP se bazează pe identificarea diferențelor apărute în secvențele genomurilor la nivelul unei singure nucleotide.

În literatura de specialitate de limba engleză metoda este cunoscută sub denumirea de” Single Nucleotide Polymorphism” – Polimorfismul unei Singure Nucleotide, notat abreviat prin acronimul SNP.

Dezvoltarea acestui tip de markeri a fost posibilă datorită perfecționării unor tehnici moderne de analiză cum ar fi secvențializarea, microarray, Real-Time PCR și totodată extinderii bazelor de date informatizate referitoare la secvențele ADN studiate până în prezent.

Diferențele care apar la nivelul unei singure nucleotide sunt generate de mutații punctiforme, care pot avea sau nu efect asupra fenotipului. Markerii SNP sunt prezenți de obicei în număr mai mare în regiunile necodante ale genomului, deoarece modificarea unei singure nucleotide în interiorul regiunilor codante poate să genereze un codon care să nu fie sinonim cu cel inițial, conducând astfel la modificarea unui aminoacid din lanțul polipeptidic codificat. În cazul în care modificarea conduce la generarea unui codon sinonim secvențele aminoacizilor nu vor fi alterate. Modificările sinonime pot însă să modifice procesul de excizie și sudare a ARN (ARN splicing), conducând la modificări fenotipice.

Markerii SNP se gasesc în număr mare în genom, dar peste tot in abundența și distribuția lor depinde de specie. De exemplu porumbul are un marker SNP la fiecare 60-120 bp, în timp ce genomul uman are un marker la fiecare 1000 bp.

SNP este un marker genotipic codominant, care permite diferențierea homozigoților de heterozigoți.

PRINCIPII METODOLOGICE

În ultima perioadă tehnologia determinării secvențelor s-a dezvoltat tot mai mult, astfel că în bazele de date există un număr tot mai mare de secvențe EST-secvențe țintă exprimate, ceea ce a condus la lărgirea posibilităților de analiză directă a variațiilor apărute la nivelul secvențelor ADN.

Tehnicile de genotipare a polimorfismului unei singure nucleotide SNP se bazează pe unul sau două dintre următoarele mecanisme moleculare: hibridizarea specifică a alelelor, extensia primerilor, ligarea oligonucleotidelor și secționarea invazivă. Metode foarte specializate de genotipare, cum ar fi chip-uri ADN, Real-time PCR specific alelelor fac SNP o tehnică atractivă în domeniul markerilor moleculari. Aceasta poate fi automatizată și se poate aplica pentru o categorie mare de scopuri cum ar fi: identificarea rapidă a cultivarelor și alcătuirea unor hărți genetice cu o densitate foarte mare de markeri.

În figurile prezentate în continuare sunt evidențiate tehnicile care permit identificarea markerilor SNP, în care este studiată o singură alelă- A, care a suferit o modificare A/G. Alela G poate fi detectată în acelașăi mod, într-o reacție paralelă.

Hibridizarea specifică a alelelor sau hibridizarea cu o oligonucleotidă specifică alelei ASO („hybridization with allele-specific oligonucleotides”).

În acest caz se utilizează două sonde moleculare scurte, având o nucleotidă complementară cu varianta alelică a SNP în poziția centrală.

Sondele sunt hibridizate la secvența țintă care conține SNP, în condiții în care numai fragmentele formate pe baza unei complementarități de 100% sunt stabile, iar hibrizii care conțin nepotriviri sunt instabili. Prezența hibrizilor stabili este evidențiată prin metode specifice, caracteristice sistemului de marcare al sondei moleculare.

O îmbunătățire a acestei tehnici este utilizarea unor chip-uri ADN pe care sondele moleculare sunt sintetizate direct. Pot fi astfel identificate SNP prin tehnica microarray, urmărind oligonucleotidele la care s-au atașat probele țintă de ADN.

Extensia primerului specific alelei („allele-specific primer extension”)

Această metodă presupune utilizarea a doi primeri care se leagă la secvența lor țintă adiacentă SNP, iar la capătul 3’au nucleotide complementare cu variantă alelică. În prezența Taq polimerazei numai primerii cu o potrivire perfectă la capătul lor 3’ vor genera produși de amplificare.

În urma analizei prin electroforeză în gel de agaroză se va evidenția un fragment amplificat numai în cazul în care în probă este prezentă varianta alelică nemodificată.

Minisecvențializarea extensiei unui primer („minisequencing single nucleotide primer extension”)

În cazul aplicării acestei metode se utilizează un singur primer, a cărui secvență țintă este adiacentă unei secvențe SNP. În prezența unei polimeraze primerul este extins cu o singură nucleotidă, complementară cu cea aflată la situsul SNP. Apoi secvența amplificată este secvențializată, iar identificarea nucleotidei după care a fost extins primerul definește genotipul.

Ligarea unor sonde specifice alelelor („Allele specific ligation probes”)

Această metodă presupune utilizarea unor perechi de sonde oligonucleotidice care se leagă la secvențele complementare adiacente. La joncțiunea dintre aceste sonde este prezentă o nucleotidă specifică alelei, la capătul 3' respectiv 5'. Atunci când potrivirea sondelor moleculate la secvențele lor țintă este de 100% ele vor fi legate de către ADN ligază, iar o nepotrivire de o nucleotidă inhibă această reacție.

Secționarea invazivă („invasive cleavage”)

În cadrul acestei metode se utilizează o pereche de sonde, dar secvența 5' a SNP nu este legată la secvența țintă. În plus se utilizează o oligonucleotidă invazivă care este complementară cu secvența 5' a SNP. Atunci când o oligonucleotidă se atașează perfect la secvența țintă, ea este înlocuită la nivelul situsului SNP de către oligonucleotida invazivă, formând o structură recunoscută și secționată de către o endonuclează specifică, care elimină regiunea 5' a sondei.

Secționarea unui situs de restricție („restriction site cleavage”)

În cazul aplicării acestei metode pentru secționarea moleculei ADN țintă sunt utilizate endonucleaze de restricție cu situs de recunoaștere specific alelelor. Această tehnică este aplicabilă atunci când SNP alterează secvența de recunoaștere a unei enzime.

Moleculele țintă cu situsuri nealterate rămân nesecționate, iar celelelte conduc la formarea a două fragmente ADN.

Discriminarea alelelor cu ajutorul tehnicii Real-Time PCR

O metodă care câștigă o tot mai largă aplicabilitate în domeniul evidențierii SNP este real-Time PCR.

Dacă se utilizează sonde moleculare marcate fluorescent TaqMan (capitolul…) acestea trebuie să aibă secvențe complementare cu regiunea din ADN țintă în care a apărut mutația (SNP). Sondele se vor lega la această secvență dacă potrivirea este perfectă; dacă nu procesul de atașare nu va avea loc.

Desfășurarea reacției de amplificare, în cazul variantelor care au legat sonda moleculară va conduce la o creștere a fluorescenței, deoarece polimeraza aleasă are o activitate exonucleazică 5’ – 3’ foarte pronunțată, iar atunci când ajunge în dreptul sondei o secționează în nucleotidele componente, separâd colorantul raportor fluorescent și cel absorbant.

Atunci câd sonda moleculară nu se leagă la fragmentul țintă din cauza SNP, nu va apărea semnal fluorescent.

Aplicarea acestei tehnici de investigare permite evidențierea a două situații – detectarea fluorescenței, legată de prezența alelei sălbatice și absența acesteia, determinată de alela mutantă (SNP).

CAPITOLUL VII

APLICAȚII GENERALE ALE SISTEMELOR COMPLEXE DE ANALIZĂ ȘI EVALUARE MOLECULARĂ

Dezvoltarea continuă a sistemelor de investigare la nivel molecular a permis extinderea domeniului de aplicații, astfel că în prezent se pot obține informații complete cu privire la organizarea genomului, secvența acestuia, expresia genelor și chiar manipularea materialului genetic. Este posibilă identificarea căilor metabolice implicate în diferitele procese, cu importanță atât teoretică, în cunoașterea legilor care guvernează procesele desfășurate într-un organism viu cât și practică, în îmbunătățirea

7.1. CARTAREA GENOMULUI

Încă de la începutul secolului al -XX-lea au fost efectuate primele experimente de cartare, care au permis stabilirea dispunerii schematice a cromozomilor și au condus la alcătuirea cariotipului diferitelor specii.

La sfârșitul anilor 1960 au fost alcătuite hărțile citogenetice, ca diagrame în cadrul cărora cromozomii au fost identificați pe baza modelului de bandare, sau de colorarea diferențiată, în funcție de gradul de condensare al cromatinei. A fost astfel posibilă identificarea modificărilor apărute la nivel cromozomal, modificări care pot genera diferite maladii.

Mai târziu, o dată cu dezvoltarea tehnicilor de analiză moleculară s-au dezvoltat hărți cromozomale mai complexe și anume hărțile genetice, sau hărțile de linkage, care se bazează pe stabilirea poziției relative a unor markeri de-a lungul cromozomilor și hărțile fizice, care permit evaluarea distanțelor genice în unități de măsură absolute – kb (perechi de nucleotide) și totodată conduc la posibilitatea de secvențializare a fragmentelor de ADN de interes.

În prezent, toate informațiile obținute la nivel molecular sunt corelate cu hărțile citogenetice, furnizându-se astfel informații referitoare la poziționarea unor fragmente ADN cu secvențe bine stabilite pe cromozomi.

7.1.1. CARTAREA GENETICĂ. ALCĂTUIREA HĂRȚILOR DE LINKAGE

Hărțile genetice sau hărțile de linkage au fost considerate mult timp reprezentări grafice ale cromozomilor și a genelor care alcătuiesc diferite grupe de linkage, gene plasate pe cromozomi la distanțe relative exprimate în procente de recombinare.

În prezent, hărțile genetice sunt alcătuite pe baza markerilor moleculari. Un marker molecular reprezintă orice caracteristică moleculară moștenită, diferită între indivizi, care se poate detecta ușor și a cărei segregare în descendență poate fi urmărită.

Astfel, pe o hartă genetică markerii moleculari (gene sau fragmente anonime de ADN) sunt dispuși într-o ordine liniară de-a lungul cromozomilor, în anumite poziții, distanța dintre loci fiind relativă, exprimată ca procent de recombinare (1 cM = 1% recombinări între loci). Pentru a fi posibilă urmărirea segregării lor, markerii trebuie să fie polimorfici în populația de cartare.

Alcătuirea unei hărți genetice de linkage presupune parcurgerea mai multor etape bine definite și anume: alegerea formelor parentale, identificarea markerilor moleculari care evidențiază polimorfismul între acestea, stabilirea frecvențelor de recombinare și analiza statistică a datelor.

Cel mai important pas în analizele de segregare este selecția celor mai potrivite linii parentale, care trebuie să fie destul de diferite din punct de vedere genetic încât să manifeste suficient polimorfism, dar în același timp nu trebuie să fie foarte îndepărtate pentru că ar putea cauza sterilitatea descendenților. De obicei se aleg forme parentale care aparțin aceleiași specii și se diferențiază la nivel fenotipic printr-un caracter de interes.

Formele parentale sunt încrucișate pentru a dezvolta o populație de cartare, care va fi analizată din punctul de vedere al polimorfismului manifestat la nivelul markerilor moleculari. În cartarea moleculară se utilizează în general descendențele F2, obținute prin autopolenizare, backcross sau linii recombinate.

Pentru a putea fi utilizată eficient în cartarea genetică, o populație trebuie să fie alcătuită din câteva sute de indivizi, proveniți de la formele parentale selectate. Mărimea populațiilor determină rezoluția finală a hărții – un număr mai mic de 50 de indivizi nu permite o evaluare corectă a rezultatelor, iar dacă se dorește o rezoluție înaltă (o densitate mare a markerilor moleculari) sunt necesare populații de 1000 sau mai mulți indivizi.

În cazul cartării genetice pot fi utilizate toate categoriile de markeri moleculari, cu mențiunea că markerii codominanți conduc la o interpretare mai precisă a rezultatelor obținute.

Este posibilă utilizarea cu succes a unor markeri moleculari care au fost cartați la speciile model sau la speciile înrudite, datorită fenomenului de colinearitate a acestora. S-a dovedit că markerii moleculari au o poziție similară și sunt aranjați în aceiași ordine pe cromozomii speciilor înrudite, fenomen care poartă numele de sintenie. În cazul în care nu sunt disponible informații referitoare la cartarea genetică a speciei studiate pot fi utilizate ca sonde moleculare inserții ale clonelor genomice sau ADNc, cu condiția ca acestea să nu conțină secvențe repetitive.

Markerii moleculari care au permis evidențierea polimorfismului între formele parentale, în procesul inițial de screening sunt utilizați în continuare în procesul de cartare, urmărindu-se segregarea lor în descendență.

Prin urmare, toți indivizii care alcătuiesc populația de cartare vor fi analizați cu fiecare marker selectat, stabilindu-se frecvența de recombinare pentru fiecare pereche de loci (markeri moleculari).

Frecvențele de recombinare și erorile standard pentru fiecare pereche de markeri sunt estimate folosind metoda maximei probabilități, iar unitățile hărții sunt determinate folosind o funcție de cartare. Un scor LOD este calculat ca log (în baza 10) al unui raport între șansele ipotezei ca un linkage să existe și cele ca acesta să nu apară. Construcția hărților de linkage este facilitată prin folosirea unor programe (softuri) cum ar fi MAPMAKER [http://www.mapmanager.org/qtsoftware.html].

Numărul markerilor dintr-o hartă genetică poate depăși 1000, dar ei nu sunt distribuiți uniform pe cromozomi, fiind grupați în unele regiuni și absenți în altele. De exemplu regiunile aflate în apropierea centromerilor indică o recombinare foarte slabă ceea ce este reflectat prin aglomerarea markerilor în această zonă, pe harta genetică.

În general, cu cât doi markeri sunt mai apropiați cu atât este mai puțin probabil ca un eveniment de recombinare (crossover în timpul meiozei) să separe alelele și cu atât mai mult este probabil să fie moștenite împreună. Dacă doi loci sunt foarte îndepărtați pot să apară două sau mai multe recombinări astfel că un număr de recombinări cu soț refac combinațiile originale ale alelelor și sunt cuantificate ca 0 crossingover. Un număr impar de recombinări crează o combinație alelică recombinată și se consideră a fi un eveniment crossover. Un proces de recombinare de 50% corespunde la o segregare independentă, fiind posibilă măsurarea directă numai a unor distanțe mai mici de 50 de unități de cartare.

Deci, distanța dintre punctele unei hărți genetice este o reflecție a frecvenței de recombinare dintre cele două puncte. Această unitate este măsurată în centimorgani (cM), după geneticianul Thomas Hunt Morgan (Fig. 7.1). Doi markeri se află poziționați la o distanță de 1 cM dacă sunt separați cu o frecvență de recombinare de 1%. Această distanță genică nu poate fi tradusă în distanță fizică și anume de cantitatea totală de ADN care separă markerii, deoarece relația dintre distanța genică și cea fizică variază între specii, dar și între diferitele locații din genom ale unei singure specii.

Până în prezent au fost alcătuite hărțile genetice la majoritatea speciilor importante, acestea ajutând la înțelegerea structurii, funcționalității și evoluției unui genom. Studiile recente au arătat că hărțile genetice ale multor specii înrudite (de exemplu cerealele) sunt similare în ceea ce privește conținutul și locația genelor. De aceea, în prezent se încercă identificarea modalității în care informațiile cuprinse într-o hartă genetică a unei specii pot fi aplicate unei alte specii înrudite. Pentru aceasta au fost elaborate anumite sisteme model pentru care fost elaborate hărți genetice, aplicate ulterior la rude mai complexe din punct de vedere genetic, care pot fi specii de cultură importante.

7.1.2. IDENTIFICAREA MARKERILOR MOLECULARI LINKAȚI CU UN CARACTER DE INTERES

Poziția pe cromozom a genelor care determină caractere utile poate fi stabilită prin analize ale linkage-ului cu ajutorul markerilor, într-o hartă genetică a unei specii.

Analiza oricăror markeri polimorfici și a oricărui caracter segregant poate fi utilă pentru identificarea markerilor linkați. Odată ce un marker segregant este identificat, pot fi folosite diferite metode de analiză, pentru a asocia markerul cu un caracter important. Există totuși și posibilitatea de a găsi un marker linkat care nu a fost cartat, prin evidențierea directă a polimorfismului.

În general, atunci când se urmărește identificarea markerilor moleculari amplasați în imediata vecinătate a unei gene de interes poate fi aplicată metoda liniilor izogene sau analiza segregării în amestec – BSA („Bulked Segregant Analysis”).

Obținerea materialului de lucru în cazul aplicării metodei liniilor izogene necesită un timp îndelungat și de aceea de cele mai multe ori se utilizează tehnica BSA.

Aplicarea analizei segregării în amestec (BSA) presupune existența unei populații care segregă pentru gena de interes, având ca părinte un organism mutant. În acest caz, dacă este posibilă identificarea unor markeri moleculari la nivelul cărora se determină polimorfism între fenotipul mutant și cel sălbatic se poate afirma că acei markeri sunt apropiați de gena de interes și segregă împreună cu aceasta.

PRINCIPII METODOLOGICE

Analiza segregării în amestec – BSA („Bulk Segregant Analysis”) presupune deci identificarea polimorfismului dintre două probe ADN, izolate din majoritatea indivizilor populației segregante. O primă probă conține ADN de la indivizi care exprimă un anumit caracter (forma sălbatică a genei), iar a doua conține ADN de la indivizi care au suferit o mutație, caracterul de interes nefiind prezent. Polimorfismul ADN dintre cele două probe diferite este corelat cu genele care condiționează apariția caracterului urmărit, fiind posibilă cartarea mutațiilor.

Această tehnică oferă un avantaj important în identificarea markerilor asociați cu un caracter fără a fi nevoie de alcătuirea unei hărți genetice complete. Totuși, necesită markeri care pot fi testați ușor, cum ar fi markerii PCR sau AFLP, care evidențiază un număr cât mai mare de benzi polimorfice în urma unei singure etape de analiză.

Metoda permite utilizarea unei game largi de structuri populaționale și poate fi adesea aplicată unui material produs în cadrul unui program de ameliorare.

Un dezavantaj al acestei metode îl reprezintă imposibilitatea de determinare a distanței genice dintre marker și caracter. De aceea, ca o confirmare suplimentară a asocierii marker-caracter se analizează toți indivizii care au alcătuit cele două amestecuri și se determină proporția de linii care conduc la amprenta ADN așteptată.

Identificarea markerilor linkați cu caractere de interes poate fi exploatată cu succes în analize genetice mai complexe cum ar fi identificarea și clonarea genei (capitolul) care condiționează apariția acelui fenotip, sau stabilirea unei metodologii de selecție asistată de markeri (MAS) (capitolul).

CARTAREA FIZICĂ

În general cartarea fizică are ca obiect regiuni cromozomale de interes în care au fost poziționate gene, cartarea fizică constituindu-se ca o etapă în procesul de identificare a genelor prin clonare pozițională.

Regiunile cromozomale de interes sunt delimitate cu ajutorul markerilor moleculari, amplasați în prealabil pe harta genetică.

Deci, pentru a fi posibilă alcătuirea unei hărți fizice pentru o regiune cromozomală este necesară existența unei hărți genetice pentru specia luată în studiu și totodată cunoașterea poziției genei într-o regiune delimitată de markeri moleculari.

Cu ajutorul markerilor moleculari și având la dispoziție o bibliotecă genomică a speciei luate în studiu este posibilă desfășurarea procesului de cartare fizică, care presupune mai multe etape și anume:

Identificarea clonelor ale căror inserții provin din regiunea cromozomală care urmează a fi cartată;

Identificarea clonelor suprapuse, prin metoda “mersului pe cromozom” (chromosome walking), cu ajutorul clonelor ale căror inserții provin din regiunea cromozomală de interes.

7.1.3.1. IDENTIFICAREA CLONELOR ALE CĂROR INSERȚII PROVIN DIN REGIUNEA CROMOSOMALĂ CARE URMEAZĂ A FI CARTATĂ

Markerii moleculari care delimitează regiunea cromozomală de interes sunt utilizați ca sonde moleculare marcate (radioactiv sau enzimatic) în procesul de analiză a bibliotecii genomice, pentru a identifica clonele BAC care au secvențe complementare în inserție (Fig. 7.2).

Fig. 7.2. Identificarea clonelor BAC ale căror inserții provin din regiunea cromosomală de interes

a – harta genetică a regiunii cromozomale; M1-M5 reprezintă markerii moleculari care delimitează această regiune;

b – inserțiile clonelor din biblioteca genomică care provin din regiunea cromozomală de interes și conțin secvențe complementare markerilor moleculari M1-M5; C1-C5 reprezintă denumirile clonelor BAC determinate ca pozitive pentru fiecare marker molecular.

7.1.3.2. IDENTIFICAREA CLONELOR CU INSERȚII SUPRAPUSE

Clonele genomice ale căror inserții provin din regiunea cromozomală de interes pot fi utilizate ca jaloane în procesul de determinare a clonelor suprapuse, prin metoda “mersului pe cromozom” („chromosome walking”).

Pentru a putea fi aplicată metoda “mersului pe cromozom” este necesar ca extremitățile inserțiilor clonelor genomice determinate inițial ca pozitive să fie identificate și apoi izolate. Apoi, aceste fragmente sunt utilizate pe rând ca sonde moleculare în procese de hibridizare a membranelor pe care se află transferată întreaga bibliotecă genomică. Astfel pot fi identificate clonele ale căror inserții sunt suprapuse cu inserțiile clonelor inițiale (Fig. 7.3).

Fiecare ciclu de izolare a extremităților inserțiilor și apoi de determinare a clonelor cu inserții suprapuse reprezintă o etapă în "mersul pe cromozom".

Procesul continuă până când este identificat un număr mare de clone ale căror inserții sunt suprapuse și acoperă toată regiunea cromozomală de interes.

Fig. 7.3. Alcătuirea hărții fizice a unei regiuni cromosomale prin metoda

"mersului pe cromozom"

(1) analiza bibliotecii genomice cu markerul M1 ca sondă moleculară și identificarea clonei pozitive C1;

(2) identificarea și izolarea capetelor inserțiilor clonei C1; utilizarea capetelor inserției clonei C1 ca sonde moleculare pentru analiza bibliotecii genomice și identificarea clonelor pozitive C2 și C3;

(3) identificarea și izolarea capetelor inserțiilor clonelor C2 și C3;

Utilizarea fragmentelor de ADN care reprezintă capetele inserțiilor clonelor ca sonde moleculare în analiza bibliotecii genomice și identificarea clonelor pozitive C4 și C5;

7.1.3.3. IZOLAREA EXTREMITĂȚILOR INSERȚIEI CLONEI GENOMICE

În scopul izolării extremităților inserției unei clone genomice se utilizează de obicei tehnica PCR invers.

În acest caz ADN plasmidic este secționat cu o endonuclează de restricție care are o singură secvență de recunoaștere în interiorul vectorului și anume în fragmentul lac (Fig. 7.4).

Fig. 7.4. Identificarea extremităților unei clone genomice, alcătuite în vectorul de clonare BAC („Bacterial Artificial Chromosome”), prin metoda PCR-invers („Inverse-PCR”)

După secționare se formează mai multe fragmente, dintre care numai două sunt hibride (1 și 2), fiind alcătuite dintr-o porțiune provenită din vectorul de clonare și una din extremitatea inserției clonei genomice. Celelalte fragmente (3, 4, 5 și 6) provin din mijlocul inserției și nu prezintă interes în cadrul acestui proces.

Pentru a fi posibilă identificarea și izolarea extremității drepte a inserției, fragmentele formate în urma secționării sunt supuse unui proces de recircularizare, în prezența ADN ligazei. Amestecul rezultat este introdus în celule bacteriene E. coli, a căror competență a fost indusă în prealabil, iar selecția are loc pe un mediu suplimentat cu factorul de selecție. Vor avea rezistență la factorul de selecție numai celulele bacteriene care poartă plasmida provenită din recircularizarea fragmentului 2. În alcătuirea acestei plasmide este prezentă porțiunea din vectorul de clonare, purtătoare a genei de selecție și extremitatea dreaptă a inserției clonei genomice. Fragmentul de ADN reprezentat de extremitatea inserției poate fi amplificat printr-un proces PCR, cu ajutorul primerilor P3 și P4 ale căror secvențe sunt cunoscute.

Dacă amestecul rezultat în urma procesului de recircularizare este supus unei amplificări PCR, cu ajutorul primerilor P1 și P2, are loc multiplicarea fragmentului ADN care constituie extremitatea stângă a inserției clonei BAC. Procesul poartă numele de PCR invers (IPCR).

Cu ajutorul acestei metode pot să fie identificate și amplificate fragmentele care reprezintă extremitățile inserției unei clone genomice.

Este o metodă precisă, care însă necesită patru primeri cu secvențe diferite, a căror achiziționare este costisitoare, secvențele celor patru primeri fiind specifice vectorului de clonare.

Astfel, este posibilă alcătuirea hărții fizice pentru o anumită regiune cromosomală, compusă dintr-o înșiruire de clone cu inserții suprapuse. Având în vedere că dimensiunile fragmentelor care constituie inserțiile clonelor genomice sun cunoscute se poate spune că, în cazul cartării fizice, distanțele relative dintre doi markeri moleculari (cM) sunt transformate în unități de măsură absolute – bp (perechi de nucleotide). Relația de corespondență „cM-bp” nu este universal valabilă, ci este specifică fiecărei regiuni cromozomale în parte. Inserțiile clonelor de interes pot fi secvențializate.

CARTAREA CITOGENETICĂ

Generarea unei hărți citogenetice necesită informații provenite atât din cartările genetice cât și din cele citologice. Hărțile genetice prezintă ordinea liniară a markerilor și procentul de recombinare între markerii linkați și nu conțin informații despre distanțele fizice sau cele citologice, nici despre numărul de perechi de baze dintre markeri.

Hărțile citogenetice încorporează datele oferite de hărțile genetice și caracteristicile citologice ale cromozomilor, cum sunt centromerii, telomerii și mai recent, semnalele obținute prin hibridizarea fluorescentă în situ -FISH (“fluorescent în situ hybridization”).

Astfel, integrarea hărților citogenetice și genetice poate fi realizată prin hibridizarea secvențelor cartate genetic direct pe cromozomi și vizualizarea acestora prin tehnici de microscopie.

Hărțile citogenetice sunt alcătuite prin determinarea microscopică a poziției unor structuri vizibile marcate, pe cromozomii fixați. Se aseamănă cu hărțile fizice, cu deosebirea că nu permit identificări ale secvențelor ADN.

Hărțile citogenetice se bazează pe cromozomi meiotici sau mitotici și nu conțin date de recombinare și nici despre numărul perechilor de baze dintre structurile citologice. Poziția unui marker marcat este exprimată de obicei ca procent din lungimea totală a unui braț cromozomal. Lungimea absolută a cromozomului suferă modificări dramatice pe parcursul ciclului celular și numărul de perechi de baze cuprins în unitatea de lungime depinde de gradul de condensare a cromatinei.

De obicei, hărțile citogenetice sunt reprezentate, prin așezarea hărții genetice lângă reprezentarea grafică a cromozomului și indicarea punctelor de intersectare ale acestora. Astfel de hărți oferă informații despre poziția genetică și citologică a unui marker, nefiind însă posibilă obținerea unor date referitoare la secvența ADN (Fig. 7.5).

Până în prezent hărțile citogenetice sunt limitate ca număr datorită numărului redus de caractere citologice vizibile prin marcarea cromozomilor. Acestea se limitează de obicei la centromeri, heterocromatina din jurul lor (heterocromatina centrică), regiunile de organizare nucleolară sau regiuni de eucromatină și regiuni de heterocromatină noncentrică cum sunt cromomerii.

Hărțile genetice, fizice și citogenetice furnizează informații cu privire la organizarea și funcționarea genomului, constituind un punct de plecare în procesele de identificare, izolare și studiu al genelor.

7.2. IDENTIFICAREA ȘI IZOLAREA GENELOR

Strategiile aplicate pentru izolarea genelor exploatează una sau mai multe dintre cele patru caracteristici care le definesc: au o anumită structură primară, ocupă un anumit loc în genom, codifică o moleculă de ARNm cu un mod de expresie particular și cele mai multe îndeplinesc o funcție specifică.

Unele tehnici facilitează izolarea genelor de la orice specie, în timp ce altele se pot aplica numai la una sau câteva specii. Există gene care se exprimă în toate celulele unui organism, care sunt relativ ușor de identificat și izolat. Sunt însă și gene care se exprimă diferențiat în timp și spațiu, respectiv numai o scurtă perioadă de timp în cursul dezvoltării sau numai într-un anumit tip de celule (de ex. Numai în celulele meristematice).

În ultimii ani, strategiile de identificare și izolare a genelor s-au dezvoltat ca urmare a automatizării proceselor de secvențializare, miniaturizării membranelor utilizate în hibridizare, etc. În plus, strategiilor de identificare directă a unei singure gene li s-au alăturat strategii care permit analiza transcriptomului adică a ARNm exprimat în proba analizată.

Dacă se dorește identificarea prezenței unei gene, care a fost caracterizată și cel puțin parțial secvențializată, metodologia de investigare se îndreaptă spre tehnici simple, care au la bază reacția PCR sau transferul Southern. Dacă se cunosc secvențele primerilor specifici, respectiv secvența unei sonde moleculare, acestea pot fi utilizate pentru evidențierea prezenței unei gene într-o probă, genă care poate să indice prezența unui patogen, a unei maladii etc.

În cazul în care scopul cercetărilor este identificarea, izolarea și caracterizarea unor gene necunoscute, strategiile de investigare sunt corelate cu informațiile existente cu privire la acea genă.

În funcție de scopul urmărit, procedurile pot lua în studiu fie ADN genomic, fie ARNm. În cadrul procedurilor pe bază de ADN genomic se diferențiază mutageneza de inserție, aplicată atunci când se cunoaște caracterul de interes, dar nu există nici o altă informație cu privire la gena care îl induce. O altă metodă, clonarea pozițională poate fi aplicată dacă se cunoaște fenotipul produs de mutația unei gene, dar sunt necesare informații prealabile cu privire la harta genetică, poziționarea aproximativă a a genei pe cromozom și în plus, este necesară existența unei biblioteci genomice.

Metodele care investighează moleculele ARNm se bazează în general pe procesul de hibridizare, diferențiindu-se două categorii – hibridizarea prin diferență, în cadrul căreia se compară direct populațiile de ARNm existente în două probe de analizat, sau microarray, metodă prin care fiecare populație de ARNm hibridizează cu un set complex de sonde moleculare, după care rezultatele obținute sunt comparate computerizat.

O altă categorie de metode de investigare se bazează pe secvențializare și anume: secvențializarea etichetelor pentru secvențele exprimate-EST („Expressed Sequence Tags”), metodă care utilizează informațiile provenite de la produșii de transcripție, pentru identificarea și secvențializarea unor fragmente ADN și analiza în serie a expresiei genelor-SAGE („Serial Analysis of Gene Expression”), care permite identificarea unui set de gene specifice unei probe de analizat, prin compararea profilelor ARNm obținute de la o variantă martor și una experiment.

7.2.1. MUTAGENEZA DE INSERȚIE

7.2.1.1. CONSIDERAȚII GENERALE

Utilizarea mutagenezei de inserție pune la dispoziție o cale mai rapidă de a identifica și clona gene prin inducerea de mutații.

În acest caz, spre deosebire de mutageneza clasică, este posibilă producerea unei game foarte largi de mutații, care sunt etichetate, astfel că genele corespunzătoare pot fi identificate cu ușurință.

Mutațiile sunt produse cu ajutorul unor elemente ADN, capabile să se insereze la întâmplare într-un cromozom, cum ar fi transpozonii sau ADN-T din Agrobacterium tumefaciens. Inserția unui astfel de element poate induce o mutație, care conduce la pierderea funcției unei gene și implicit la o modificare fenotipică.

ADN-T este un segment specific al plasmidei Ți (prezentă în Agrobacterium tumefaciens), modificată artificial, care poate conține gene marker de selecție și/sau gene de interes, care se află sau nu sub controlul unor promotori. Acesta este transferat de la bacterie în celula gazdă a plantei și inserat în genomul nuclear în timpul procesului de transformare (mecanismul detailat al procesului de transformare genetică la plante este prezentat în capitolul 7.3).

Utilizarea ADN-T ca un mutagen de inserție prezintă nenumărate avantaje în comparație cu transpozonii deoarece inserția ADN-T nu își mai schimbă poziția după ce a fost transferată, se găsește într-un număr redus de copii, iar modificările la nivel de ADN sunt stabile din punct de vedere fizic și chimic de-a lungul mai multor generații. În plus, ADN-T se inserează la întâmplare și nu afectează numai expresia genei în care s-a inserat, dar acționează și ca un marker pentru identificarea mutației.

De aceea, metodă care utilizează mutageneza prin intermediul ADN-T câștigă tot mai mult teren, fiind posibilă aplicarea unor strategii diferite, în funcție de scopul urmărit.

7.2.1.2. OBIECTIVE URMĂRITE ÎN MUTAGENEZA DE INSERȚIE

IDENTIFICAREA UNEI GENE

Obținerea unor mutanți cu fenotip modificat, datorat expresiei alterate a unei gene funcționale, în care s-a inserat fragmentul ADN-T face posibilă identificarea acesteia. ADN-T conține în general o genă marker de selecție, care permite identificarea plantelor modificate și secvențe ADN de etichetare care pot fi utilizate cu succes în procesul de identificare a genei mutante.

IDENTIFICAREA UNOR ELEMENTE DE REGLARE A GENELOR

Identificarea unor elemente ale secvențelor de reglare ale genei se realizează diferit în funcție de elementul de reglare de interes.

În cazul în care se urmărește identificarea unor promotori, tehnica poartă numele de „promotor trapping”. Se utilizează fragmente ADN-T cu o genă raportor care permite identificarea fără echivoc a plantelor modificate.

În acest scop se utilizează gena GUS (uidA), care codifică β-glucuronidaza sau gena GFP („Green Fluorescent Protein Gene”) care dă o reacție de fluorescență atunci când plantele sunt expuse la lumina ultravioletă (~ 395 nm) sau lumină albastră (~490 nm) (capitolul…).

Dacă sunt identificate plante transformate, pe baza prezenței produșilor de transcripție ai genei raportor, se consideră că gena s-a inserat în apropierea unui promotor nativ, care a inițiat transcripția. Regiunea cromozomală în care a avut inserția ADN străin poate fi izolată, iar promotorul investigat, clonat și utilizat în alte procese de transformare genetică.

În cazul în care se urmărește identificarea unor elemente activatoare („enhancer trapping”) secvențele ADN-T conțin gene raportor puse sub controlul unor promotori. În cazul identificării unor plante transformate în care expresia genei raportor este mai accentuată comparativ cu alte plante de același tip, se consideră că inserarea fragmentului ADN străin a avut loc în apropierea unui activator („enhancer”) nativ. Analiza regiunii cromozomale în care s-a inserat ADN-T permite studierea și clonarea activatorului identificat.

Dacă se urmărește inducerea supraexpresiei unei gene native, fragmentul ADN-T inserat poartă elemente puternic activatoare. Dacă inserția a avut loc în apropierea unei gene, expresia ei este accentuată, ceea ce permite identificarea mutantului respectiv. Studiile referitoare la segmentul cromozomal în care a avut loc inserția ADN străin permit identificarea genei respective.

Cele mai avansate studii în acest domeniu au fost efectuate la Arabidopsis thaliana, care este planta model în studiile de genetică, datorită dimensiunilor foarte reduse și simplității genomului. În plus, în anul 2000 a fost finalizată secvențializarea genomului acestei specii, ceea ce a oferit posibilități multiple pentru accelerarea cercetărilor în domeniul științelor vegetale. Având la dispoziție o secvență completă, a fost posibilă orientarea cercetărilor ulterioare spre spre genomica funcțională.

Având în vedere că în cazul acestei specii intronii au dimensiuni reduse, iar materialul intergenic este de asemenea puțin abundent, inserția unei secvențe ADN-T, cu o lungime de 5-25 kb produce în general o alterare a funcției unei gene. Dacă se produce o populație suficient de numeroasă de linii transformate, probabilitatea de a identifica o plantă transgenică care să poarte inserția ADN-T în interiorul unei gene de interes este foarte mare. Până în prezent au fost create câteva sute de mii de linii de inserție care sunt disponibile la Centrul de Resurse Biologice Arabidopsis („Arabidopsis Biological Resource Center – ABRC”).

7.2.1.3. STRATEGII DE IDENTIFICARE A FRAGMENTULUI ADN-T INSERAT ÎN GENOMUL VEGETAL

Următoarea etapă, după ce plantele mutante au fost selectate în funcție de fenotip, este identificarea genei în care a avut loc inserția. Fragmentul ADN-T funcționează ca o etichetă, flancată de ambele părți de fragmente ale genei de interes. Pentru investigarea regiunii cromozomale din apropierea ADN-T pot fi aplicate mai multe strategii și anume: strategia de recuperare a plasmidei („plasmid rescue”), tehnica PCR invers și tehnica „TAIL PCR”.

Strategia de recuperare a plasmidei („plasmid rescue”) implică secționarea cu o enzimă potrivită a ADN genomic al plantei mutante. De preferat ca enzima să nu posede situsuri de recunoaștere în secvența fragmentului ADN-T.

Moleculele formate în urma secționării sunt supuse unui proces de ligare, în prezența ADN ligazei („self-ligation”), iar moleculele formate sunt introduse în celule bacteriene E. coli (proces de clonare). Se formează un număr foarte mare de fragmente circular închise, dar în populația bacteriană se poate menține numai acel fragment care posedă o secvență specifică, denumită originea replicării care se află în segmentul ADN-T. După clonare din cultura bacteriană obținută se extrage ADN plasmidial, care conține este analizat în continuare (Fig. 7.6). De interes este secvențializarea fragmentelor care mărginesc fragmentul ADN-T pentru că ele fac parte din gena a cărei mutație a indus apariția fenotipului de interes.

Pentru secventializare se utilizează primeri specifici vectorului de clonare, iar secvențele obținute sunt comparate cu cele prezente în bazele de date pentru a determina posibile similitudini.

Cea de-a doua strategie presupune utilizarea tehnicii PCR invers, care presupune secționarea ADN genomic extras de la fenotipul mutant cu o enzimă de restricție care are un singur situs de recunoaștere în fragmentul ADN-T și situsuri cu distribuție aleatoare în genom. În urma secționării se obține un număr mare de fragmente ADN, care sunt supuse procesului de ligare, în urma căruia se formează molecule circular închise. Două dintre aceste molecule conțin părți din fragmentul ADN-T, dar numai una conține secvența denumită origine a replicării. Moleculele circulare sunt clonate, adică sunt introduse în celule bacteriene pentru multiplicare. În populația bacteriană se va menține numai acea moleculă care posedă secvența ori.

ADN plasmidial se recuperează din clona obținută și se analizează în continuare, ținând cont că reprezintă numai unul dintre fragmentele care flanchează situsul de inserție al ADN-T (Fig.7.7).

Strategia „Tail PCR” implică trei etape consecutive de PCR, realizate cu un set de primeri specifici SP1, SP2 și SP3 și un primer de dimensiuni mici, cu secvență arbitrară.

Secvențele primerilor specifici sunt astfel alese încât pozițiile lor să fie consecutive (SP1, SD2, SP3), cu aceiași orientare 5’-3’, spre unul dintre fragmentele care flanchează ADN-T. Aceștia permit desfășurarea unei proceduri de amplificare tip „Nested PCR”.

Primerul cu secvență arbitrară degenerată, notat AD va găsi aleator secvențe complementare în moleculele de ADN genomic.

Prima reacție de amplificare se desfășoară în prezența primerilor SP1 și AD. Primul primer are o poziție complementară bine stabilită, dar primerul arbitrar se va lega la întâmplare. Dacă distanță de legare dintre cei doi primeri nu este prea mare, se va amplifica un fragment ADN, care cuprinde parțial fragmentul ADN-T și în plus, secvența flancatoare de ADN genomic.

Următoarele reacții, în prezența primerilor SP2 și AD, respectiv SP3 și AD vor restrânge porțiunea amplificată, reducând foarte mult segmentul provenit din ADN-T.

Fragmentul amplificat în final este clonat și supus reacției de secvențializare. Astfel, se obține secvența unei gene, implicată în inducerea unui fenotip cunoscut, care poate fi caracterizată în continuare (Fig. 7.8).

7.2.2. CLONAREA POZIȚIONALĂ

7.2.2.1. CONSIDERAȚII GENERALE

Clonarea pozițională sau clonarea pe bază de hartă („map-based cloning”) permite identificarea oricărei gene pentru care se cunoaște fenotipul indus, cu condiția ca acest caracter să fie monogenic și să se datoreze unei mutații.

Această tehnică poate fi aplicată numai atunci când există cercetări anterioare care să pună la dispoziție o hartă genetică moleculară cât mai completă pentru specia luată în studiu și o bibliotecă genomică ale cărei clone posedă ca inserții fragmente mari de ADN provenite de la aceiași specie.

7.2.2.2. STATEGII APLICATE ÎN PROCESUL DE CLONARE POZIȚIONALĂ

Prima etapă a clonării pe bază de cartare este identificarea unui marker molecular, poziționat în apropierea genei de interes (o distanță de câțiva cM). Pentru screening-ul inițial poate să fie utilizată o populație cu dimensiuni mai reduse (60-150 indivizi).

Următorul pas este de a satura regiunea din jurul markerului molecular original cu alți markeri, într-o populație mult mai extinsă (300-600 indivizi). Se încearcă astfel identificarea unor markeri care segregă împreună cu caracterul de interes, caz în care numărul de recombinări între marker și gena care condiționează apariția caracterului de interes este foarte redus.

Apoi markerul care segregă împreună cu gena este utilizat pentru screening-ul unei biblioteci (BAC sau YAC) pentru a identifica clona/clonele pozitive. O astfel de clonă conține în inserție o secvență complementară cu cea a markerului molecular.

Ținând cont de modalitatea de alcătuire a unei biblioteci genomice (capitolul…) putem spune ca inserția acestei clone este de fapt un fragment ADN care provine din regiunea cromosomală în care a fost cartat markerul molecular. Această clonă poate fi utilizată ca un jalon în procesul ulterior de determinare a clonelor suprapuse, prin metoda “mersului pe cromozom” („chromosome walking”) (Fig. 7.9).

După derularea primei etape a „mersului pe cromozom” fragmentele care reprezintă extremitățile inserției clonei BAC sunt utilizate la rândul lor ca markeri moleculari pentru screening-ul populației de cartare. Este de preferat ca populația utilizată în această etapă să aibă dimensiuni foarte mari (1000-3000 de indivizi).

Fig. 7.9 Desfășurarea procesului de mers de-a lungul cromosomului („chromosome walking”) prin identificarea clonelor cu inserții suprapuse, provenite din regiunea cromozomală de interes

Scopul acestui screening este de a identifica un set de markeri care co-segregă întotdeauna cu gena de interes, fără a fi posibilă nici o recombinare. Cu cât dimensiunile populației analizate în această etapă sunt mai mari, cu atât crește probabilitatea de a găsi markeri amplasați foarte aproape de gena de interes.

Dacă, ori de câte ori este exprimată o alelă a genei, markerul asociat este de asemenea prezent, deci nu apare nici o recombinare între genă și marker se utilizează termenul de co-segregare.

În cazul în care se găsesc recombinări între fragmentele provenite din extremitățile inserției clonei și genă, se trece la următoarea etapă a mersului pe cromozom.

De această dată fragmentele analizate anterior (care provin din inserția clonei) sunt utilizate pe rând ca sonde moleculare în procese de hibridizare a membranelor pe care se află transferată întreaga bibliotecă genomică. Astfel pot fi identificate clonele BAC ale căror inserții sunt suprapuse cu inserțiile clonei inițiale.

Procesul de screening al populației și de identificare a clonelor suprapuse continuă până când se identifică markeri care co-segregă cu gena întotdeauna, în final fiind identificată o clonă care cuprinde în inserția proprie chiar gena de interes.

Acest fragment este introdus într-un vector de clonare specific și este transferat în genomul unei plante mutante pentru caracterul de interes, prin transformare genetică. Dacă plantele modificate genetic au dobândit caracterul de interes, înseamnă că gena căutată este prezentă în fragmentul introdus în genomul plantei. Tehnica poartă numele de complementare a mutației, reprezentând o confirmare a ipotezei că gena de interes se găsește în fragmentul ADN identificat.

Apoi fragmentul care conține gena de interes se secvențializează, direct sau în urma subclonării, în vederea identificării unei regiuni centrale a unei gene – ORF („open reading frame”), secvență care foarte probabil codifică o proteină.

Există posibilitatea de a identifica numai o regiune centrală – ORF, ceea ce reprezintă o situație favorabilă, dar de cele mai multe ori se găsesc mai multe astfel de structuri. În cea de-a doua situație este necesară producerea altor plante modificate genetic, prin transformare cu fiecare regiune în parte.

Se identifică în final regiunea centrală care complementează mutația și apoi se realizează studii moleculare și biochimice asupra noii gene clonate. Secvența ei se compară cu secvențele existente în bazele de date, se identifică astfel proteina codificată și rolul posibil pe care poate să-l îndeplinească în celule și calea metabolică în care poate fi implicată.

În continuare va fi prezentată, pentru exemplificare, procedura de identificare a locusului HY1, care codifică o hem-oxigenază prin clonare pozițională și izolarea genei candidate (Fig. 7.10).

Harta genetică a cromozomului 2, după cum reise din bazele de date Arabidopsis thaliana definește poziția genetică a genei HY1, ca fiind linkată cu markerul ER. Asamblarea hărții fizice prin identificarea clonelor BAC suprapuse, pornind de markerul ER a permis identificarea a două gene posibil candidate pentru HY1 (AtHO 1 și 2), pe baza omologiei cu o secvență cunoscută.

Structura genei AtHO1a fost dedusă prin compararea secvenței cu cea a ADNc cu lungime întreagă. În figură de mai jos – structura genei HY1, dreptunghiurile albe și negre reprezintă regiunile codante, respectiv cele care nu sunt traduse. Liniile indică intronii și regiunile netranscrise. Au fost identificate trei mutații (hy1) în regiunile codante, iar secvențele ADN care le cuprind sunt indicate și aliniate cu tipul sălbatic (HY1). Nucleotidele subliniate evidențiază diferențele de secvență între mutanți și tipul sălbatic, iar cu majuscule sunt reprezentate nucleotidele din exoni, iar cu litere mici intronii.

Au fost astfel prezentate etapele care trebuiesc parcurse pentru identificarea și caracterizarea unei gene.

.

Fig. 7.10. Etapele procesului de identificare a unei gene prin clonarea pozițională

7.2.3 METODE DE IDENTIFICARE A GENELOR

PE BAZA REACȚIILOR DE HIBRIDIZARE

7.2.3.1. CONSIDERAȚII GENERALE

Aplicarea metodelor bazate pe hibridizare este avantajoasă deoarece nu necesită existența unor informații anterioare cu privire la secvența de nucleotide și se pot realiza cu cantității mici de ARNm.

În acest sunt identificate gene pornind de la produșii lor de transcripție (ARNm) și nu de la modificări apărute în moleculă de ADN.

7.2.3.2. STRATEGII APLICATE ÎN PROCESUL DE IDENTIFICARE A GENELOR CU AJUTORUL METODELOR BAZATE PE HIBRIDIZARE

HIBRIDIZAREA PRIN DIFERENȚĂ („subtractive hybridization”)

Hibridizarea prin diferență este o tehnică extrem de utilă care permite compararea a două populații de ARNm și obținerea clonelor pentru genele care sunt exprimate diferențiat doar într-una dintre cele două populații. Deși există mai multe metode diferite, principiul care stă la baza diferențierii este același.

În primul rând cele două populații de ARNm sunt convertite în ADNc; populația ADNc care conține produși de transcripție specifici (cu expresie diferențiată) poartă numele de „experiment” (tester) iar populația ADNc de referință se numește „control” (driver).

ADNc experiment și control se denaturează și se pun în contact, astfel încât toate fragmentele complementare dau naștere unor molecule hibride, bicatenare. În acest fel se leagă moleculele ADNc care provin de la gene exprimate atât la varianta „control” cât și la cea „experiment”. Aceste molecule sunt eliminate, iar moleculele ADNc nehibridizate, care rămân, vor reprezenta genele exprimate exprimate în varianta experiment, dar sunt absente la control (Fig. 7.11).

Cu toate că metodele tradiționale de hibridizare prin diferență au avut unele rezultate, ele necesită hibridizări repetate și nu permit identificarea unor produși de transcripție rari. În prezent a fost dezvoltată o metodă bazată pe amplificarea selectivă a secvențelor exprimate diferențiat, metodă care a reușit să depășească limitele tehnice ale metodelor de diferențiere tradiționale.

Tehnica hibridizării prin diferență este eficientă și reproductibilă, necesită cantități mici de ARNm, iar separarea fizică a moleculelor monocatenare și dublu catenare nu mai trebuie realizată. În final, are loc amplificarea moleculelor țintă, care provin de la genele care au o exprimare diferențiată.

După amplificare fragmentele sunt clonate și secvențializate, find posibilă astfel compararea cu informațiile existente în bazele de date și extinderea cercetărilor în scopul determinării funcției și căii metabolice în care este implicată gena identificată.

Fig. 7.11 Schema procesului de hibridizare prin diferență

(după Franțescu, 2005 )

.

MICROARRAY

Tehnica microarray s-a dezvoltat foarte mult în ultimii ani în special în domeniul studiului expresiei genelor.

O altă direcție de mare interes a fost însă și identificarea unor gene care sunt exprimate diferențiat în timp și spațiu într-un organism. Prin această tehnică este posibilă monitorizarea simultană a mii de gene pentru a determina efectul unui anumit tratament, al unei boli sau al unui stadiu de dezvoltare asupra procesului de transcripție.

În acest caz, două probe ARNm, provenite din surse diferite, denumite martor și experiment sunt copiate în moleculele corespunzătoare de ARNm, marcate diferit și utilizate într-un proces de hibridizare a unui chip microarray (Fig. 7.12). Pe suport sunt fixate în mod ordonat un număr foarte mare de fragmente oligonucleotidice, cu secvențe cunoscute (capitolul 5.2.5.3.).

Analiza finală a rezultatelor permite identificarea acelor oligo-nucleotide care apar în proba experiment și nu sunt prezente la proba martor. Având în vedere că secvența oligonucleotidelor este cunoscută, acestea pot fi utilizate apoi ca sonde moleculare pentru identificarea clonei ADNc complementare. Inserția clonei este secvențializată, după care este posibilă identificarea și caracterizarea genei corespunzătoare.

Fig. 7.12. Identificarea genelor care se exprimă diferențiat într-o probă test comparativ cu proba martor

În alte situații este posibilă detectarea variației numărului de copii pentru anumite secvențe, cu un nivel de rezoluție mare, prin hibridizarea genomică comparativă de tip array – array CGH („Array comparative genomic hybridization”).

În cazul aplicării acestei metode se analizează ADN extras de la o probă test și una de referință, care se marchează diferențiat cu fluorofori diferiți. Pe suport (chip) se fixează câteva mii de sonde moleculare derivate de la cele mai cunoscute gene sau regiuni non-codante din genom. Hibridizarea dintre cele două elemente menționate permite evaluarea raportului dintre fluorescența probei test și a celei de referință, care conduce la determinarea modificărilor în numărul de copii pentru o locație particulară din genom.

Utilizând această metodă pot fi detectate modificări ale numărului de copii la un nivel de rezoluție de 5-10 kb. În prezent s-au dezvoltat metode cu o rezoluție chiar mai mare, care pot să detecteze variații structurale la un nivel de rezoluție de 200bp. Este astfel posibilă identificarea unor modificări cromozomale recurente cum ar fi microdelețiile și duplicațiile în anumite condiții (de boală, de mediu) datorită aberațiilor cromozomale apărute.

Tehnica menționată poate fi utilizată și pentru cariotiparea virtuală, care poate să înlocuiască cu succes cariotiparea citogenetică, datorită nivelului de rezoluție mult mai ridicat.

În acest scop se utilizează suporturi pe care sunt fixate câteva milioane de sonde moleculare, provenite dintr-o regiune de interes din genom. Probele țintă sunt probe ADN secționate, marcate și apoi hibridizate la suport. Intensitățile semnalelor de hibridizare pentru fiecare probă sunt analizate cu ajutorul unui soft special, care generează un raport test/martor pentru fiecare sondă de pe suport.

Cunoscând poziția fiecărei sonde pe suport și totodată poziția în genom, soft-ul aliniază sondele în ordinea cromozomală și reconstruiește genomul virtual. Se alcătuiește astfel un cariotip virtual, care are o rezoluție foarte ridicată comparativ cu citogenetica convențională.

În prezent există un tip de test array, utilizabil pentru cariotipare umană care conține 1,8 milioane de markeri polimorfici și non-polimorfici cu o rezoluție de 10-20 kb (aproximativ dimensiunile unei gene). Aceasta rezoluție este de aproximativ 1000 de ori mai mare comparativ cu cea furnizată de citogenetica convențională.

Aplicabilitatea metodologiilor prezentate mai sus se îndreaptă în special spre investigațiile medicale deoarece este necesară pregătirea unor suporturi (chip-uri) speciale, cu un număr foarte mare de sonde moleculare care sunt specifice fiecărui genom, având deci costuri ridicate. Este posibilă astfel identificarea unui număr mare de maladii produse de mutații cromo-somale.

Metoda microarray poate fi aplicată și pentru identificarea genelor (GeneID) prezente într-o anumită probă.

În acest caz se fixează pe suport (chip) toate genele care pot fi prezente în organismele modificate genetic, sau toate genele care produc toxine, în funcție de scopul urmărit. Suportul se hibridizează cu probă ADN extrasă din materialul de analizat, fiind astfel posibilă identificarea tuturor genelor care sunt prezente atât în probă de analizat cât și pe suport.

Astfel poate fi detectată prezența unor gene în alimente și furaje, provenite din organisme modificate genetic (OMG), din micoplasme în culturile de celule sau de la anumiți patogeni care produc boli etc.

7.2.4. METODE DE IDENTIFICARE A GENELOR PE BAZA REACȚIILOR DE SECVENȚIALIZARE

Aceste tehnici pot depăși limitele impuse de metodele bazate pe hibridizare dar ele nu pot atinge eficiența analizelor în paralel. Prezentăm în continuare cele mai cele mai cunoscute metode bazate pe secvențializare.

7.2.4.1. SECVENȚIALIZAREA FRAGMENTELOR – EST („Expressed Sequence Tags”)

În prezent, în baza de date „GenBank – dbEST” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/) sunt stocate un număr foarte mare (aproximativ 64 milioane) de secvențe de tip EST („Expressed Sequence Tags”) care au fost izolate, clonate și secvențializate, provenind de la un număr mare de specii, dar în special de la organismele considerate model pentru studiile de genetică (capitolul 5.5.2.1). Această baze de date este actualizată continuu, accesul fiind public.

Având în vedere că secvențele EST reprezintă copii ale regiunilor codante din genom, ele sunt deosebit de utile în procesul de identificare a genelor atât intra cât și interspecific De asemenea secvențele EST prezintă o serie de avantaje practice cum ar fi faptul că pot fi generate rapid și ieftin (printr-un singur experiment de secvențializare).

Dacă se dorește identificarea unei gene, la o anumită specie, poate fi utilizată secvența EST corespunzătoare, existentă în baza de date menționată. În plus este necesară o bibliotecă genomică a speciei luate în studiu, alcătuită cel mai adesea în vectorul de clonare BAC („Bacterial Artificial Chromosome”)

Având în vedere că o bibliotecă genomică este alcătuită dintr-un număr foarte mare de clone (câteva zeci de mii), analiza acesteia este complexă, fiind posibile două strategii de investigare: hibridizarea sau amplificarea.

Dacă se urmează strategia de hibridizare, secvența EST va furniza o sondă moleculară. ADN plasmidial al clonelor care alcătuiesc biblioteca genomică sunt transferate pe membrane solide (capitolul…), care sunt apoi hibridizate cu sonda moleculară EST marcată. Este astfel posibilă identificarea unei clone genomice pozitive care să fie analizată în continuare.

Dacă se alege strategia de amplificare, secvența EST stă la baza design-ului primerilor. ADN plasmidial corespunzător clonelor care alcătuiesc biblioteca genomică va reprezenta matrița unor reacții PCR succesive, în care sunt realizate amestecuri ADN după algoritmi matematici. În final, va fi posibilă identificarea unei clone care dă amplificare pozitivă.

Clonele genomice, identificate ca pozitive prin una dintre cele două strategii menționate mai sus conțin în inserția lor o secvență corespondentă a markerului EST. Se consideră că investigațiile cu privire la inserția clonei pot să aducă informații suplimentare privind gena analizată.

De cele mai multe ori această inserție se secvențializează direct sau în urma unor procese de subclonare (pentru a reduce dimensiunile fragmentelor de secvențializat).

Secvențele obținute sunt analizate, comparate (aliniate) cu secvențele existente în bazele de date pentru a identifica similitudinile cu secvențele prezente în bazele de date existente.

De exemplu, prin analiza secvențelor EST au fost identificați la Arabidopsis thaliana noi membri ai unei familii de proteine care formează canale pentru K+ sau ai unei familii de transportori ai NO3-. Dintre etichetele pentru secvențele exprimate de la Arabidopsis numai o treime corespund unor gene care codifică proteine cunoscute, celelalte reprezentând gene care codifică proteine fără corespondenți cunoscuți și secvențializați la alte organisme.

Secvențele EST pentru care nu există corespondenți în bazele de date sunt gene exprimate care nu au fost încă identificate, care pot fi secvențializate și introduse în aceste baze, în scopul dezvoltării acestora.

7.2.4.2. ANALIZA ÎN SERIE A EXPRESIEI GENELOR – SAGE („Serial Analysis of Gene Expression”)

Analiza în serie a expresiei genelor este o alternativă la metoda secvențializării etichetelor pentru secvențele exprimate, fiind o tehnică experimentală care permite o evaluare directă și cantitativă a expresiei genelor.

Metoda SAGE se bazează pe izolarea unei secvențe unice (10 -14 bp) din fiecare moleculă ARNm individual, considerată a fi o „etichetă” specifică. Această secvență trebuie să conțină suficientă informație pentru a permite identificarea precisă, unică a produsului de transcripție.

Etichetele specifice, provenite de la un număr mare de molecule ARNm sunt legate împreună, rezultând o moleculă ADN serială, care este clonată și apoi secvențializată.

Se determină apoi de câte ori apare o anumită secvență etichetă în molecula serială, valoare corelată cu nivelul de expresie a genei corespunzătoare (Fig. 7.13).

Fig. 7.13. Etapele tehnicii SAGE – analiza în serie a expresiei genelor

(„Serial Analysis of Gene Expression”)

Orice fenomen biologic, cu posibile implicații asupra nivelului de expresie a genelor poate fi evaluat cu ajutorul tehnicii SAGE. Aceasta constă într-o procedură complexă, care nu oferă numai informații generale cu privire la expresia genelor într-un anumit tip de celule sau țesuturi, în anumite condiții, dar permite și identificarea unui set de gene specifice pentru anumite condiții celulare, prin compararea profilelor obținute de la o variantă martor și una experiment..

Tehnica SAGE permite identificarea genelor exprimate în anumite condiții și cuantificarea relativă a expresiei genelor. Necesită cantități mici de material de pornire (pot fi realizate studii chiar pe o singură celulă), furnizează date despre produșii de transcripție a mii de gene, fără a necesita cunoștințe anterioare cu privire la secvențe și exploatează toate avantajele conferite de tehnicile de secvențializare. În plus este o tehnică ușor de abordat ieftină și rapidă, comparativ cu alte tipuri de investigații.

7.3. STUDIUL EXPRESIEI GENELOR

Cunoscând etapele parcurse în procesul de sinteză al unei proteine se consideră că evaluarea expresiei genelor se poate realiza fie prin cuantificarea proteinei sintetizate, fie a produșilor de transcripție. Având în vedere că proteinele suferă o serie de modificări translaționale, cea mai bună metodă rămâne cuantificarea moleculelor ARNm (Fig. 7.14).

Unele proceduri permit evidențierea calitativă a genelor exprimate în anumite situații, dar există și metode cantitative, care permit cuantificarea produșilor de transcripție prin comparație cu o genă de referință. Astfel, tehnica microarray permite evaluarea semicantitativă, simultană a expresiei pentru un număr foarte mare de gene, pe când tehnicile care au la bază reacția PCR permit evaluarea semicantitativă sau cantitativă a unei singure gene. A fost utilizată în trecut și tehnică Northern, dar aceasta și-a pierdut din importanță o dată cu dezvoltarea tehnicilor moderne de biologie moleculară.

7.3.1. UTILIZAREA TEHNICII MICROARRAY ÎN EVALUAREA EXPRESIEI GENELOR

7.3.2. UTILIZAREA TEHNICII RT-PCR ÎN EVALUAREA EXPRESIEI GENELOR

Tehnica PCR asociată cu revers-transcripția, RT-PCR, este o metodologie de lucru care permite analiza moleculelor ARNm, prezente într-o anumită probă de analizat.

Cele două reacții, de revers-transcripție și de amplificare pot avea loc simultan, în același tub sau succesiv, în două reacții diferite.

Oricare ar fi metoda aplicată într-o primă etapă are loc sinteza moleculelor ADNc, care sunt amplificate apoi cu primeri specifici genei de analizat. Întotdeauna se analizează în paralel o genă de referință (“housekeeping gene”), cu o expresie constantă, care nu depinde de natura țesutului sau condițiile de mediu. Podușii de amplificare pot fi cuantificați la sfârșit sau pe parcursul desfășurării reacției, adică în timp real.

7.3.2.1. RT-PCR CU PUNCT FINAL

Etapele de desfășurare a reacției PCR asociată cu revers-transcripția a fost prezentată detaliat în capitolul 5.1.3. După ce reacția de amplificare a avut loc produșii se analizează prin electroforeză în gel de agaroză. Prezența unei benzi (datorată produsului de amplificare) indică formarea produsului de transcripție, deci expresia genei de interes. Intensitatea benzilor obținute poate fi evaluată semicantitativ, în cazul în care cantitatea de ARN utilizat în toate reacțiile de amplificare a fost aceiași (Fig. 7.15).

Fig. 7.15 Analiza prin electroforeză în gel de agaroză a produșilor rezultați în urma reactiei RT-PCR

1 – gena de referință

2-4 – gene de interes

Analiza vizuală permite o evaluare relativă, care subliniază că în cazurile 2 și 3 se înregistrează o supraexpresie a genelor, iar în cazul 4 o subexpresie, datorită intensității mai accentuate, respectiv mai scăzute a benzilor, comparativ cu gena de referință.

Imaginile gelurilor obținute pot fi analizate în vederea stabilirii nivelului de expresie a genelor și cu ajutorul unui soft de tip ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/idex.html), care permite cuantificarea intensității benzilor vizibile în geluri (cunoscute în literatura de specialitate drept teste de densitometrie) și transformarea acestora în valori numerice care permit estimarea precisă a nivelului de expresie prin comparație cu gena de referință.

Aplicarea metodei descrise mai sus prezintă o serie de avantaje cum ar fi precizia, fiind ideală pentru determinarea prezenței sau absenței unui transcript. Comparativ cu RT-PCR în timp real, care permite o cuantificare foarte precisă a produșilor de transcripție, tehnica de analiză cu punct final este mai ieftină, dar permite numai o evaluare semicantitativă.

7.3.2.2. RT-PCR ÎN TIMP REAL

Amplificarea exponențială via RT-PCR este o tehnică cu o acuratețe ridicată și poate fi folosită atât în diagnosticarea bolilor genetice dar și în determinarea abundenței unei molecule ARN dintr-o celulă sau țesut ca o măsură a expresiei genelor.

Dintre toate tehnicile de evaluare a expresiei genelor în țesuturi și celulule, tehnica RT-PCR s-a dovedit a fi cea mai precisă și mai versatilă. Această tehnică poate fi folosită pentru a determina prezența sau absența unui transcript, pentru a estima nivelul de expresie și pentru a clona produși ADNc, fară a mai fi ncesară construirea și screeningul unei biblioteci de gene.

7.4. MANIPULAREA GENETICĂ LA PLANTE

7.4.1. CONSIDERAȚII GENERALE

Modificarea genetică la plante câștigă o tot mai mare importanță în dezvoltarea științelor vegetale, pe măsură ce tehnicile de biologie moleculară se dezvoltă, permițând identificarea, clonarea și chiar secvențializarea unui număr tot mai mare de gene.

Scopul final al procedurilor de modificare genetică se diferențiază în funcție de natura genei introduse în genom. Pot fi realizate experimente de modificare genetică care să conducă la identificarea și investigarea altor gene de interes, sau pot fi obținute plante care au dobândit noi caractere, care le conferă însușiri agronomice importante. În plus, procesul de transfer al genelor poate avea loc intra sau interspecific, gena nou introdusă provenind de la aceiași specie sau specii diferite.

Indiferent de scopul urmărit, procedura de modificare genetică presupune parcurgerea acelorași etape (Fig.7.16).

Fig. 7.16. Etapele parcurse pentru obținerea unei plante modificate genetic

Etapele de clonare a genelor în vectori de expresie, transformarea genetică și caracterizarea plantelor modificate genetic sunt proceduri de rutină, care s-au perfecționat de-a lungul timpului, chiar dacă la început dimensiunea mare a genomului vegetal și prezența peretelui celular de natură celulozică au fost piedici care trebuiau să fie depășite. Alte caracteristici însă, cum ar fi posibilitatea de cultivare in vitro pe medii sintetice și totipotența celulelor vegetale au fost argumente în favoarea transferului de gene și mai ales a regenerării plantelor după transformare.

Procedeele de manipulare genetică, care presupun modificarea structurii genetice a plantei prin transferul și integrarea stabilă a unor gene manipulate in vitro, pot fi clasificate în funcție de scopul urmărit sau de proveniența genei care este introdusă în genomul vegetal.

Dacă se dorește identificarea unor gene sau a unor secvențe de reglare – promotori („promotor trapping”) sau elemente activatoare („enhancer trapping”) se utilizează mutageneza de inserție, care presupune transferul în genomul plantei a unor regiuni de dimensiuni reduse (ADN-T și o genă marker raportor) care au rolul de a induce modificări în organizarea acestuia.

Dacă scopul urmărit este de a investiga funcționalitatea unor gene nou identificate se aplică tehnica de complementare a mutației. Gena de studiat, împreună cu regiuni reglatoare potrivite sunt introduse prin transformare genetică în genomul unei plante mutante pentru caracterul de interes. Dacă în urma transformării plantele dobândesc caracterul studiat, înseamnă că gena nou identificată este funcțional activă.

În multe situații scopul manipulării genetice este transferul unor caractere valoroase din punct de vedere agronomic, alimentar sau economic. Această direcție de cercetare a fost posibilă datorită dezvoltării tehnicilor de genetică moleculară și extinderea lor în domeniul vegetal, permițând identificarea unui număr tot mai mare de gene de interes, cu produși implicați în căi metabolice determinante pentru apariția anumitor caractere.

În cazul în care genele transferate provin de la specii diferite (de cele mai multe ori de la bacterii) procesul poartă numele de TRANSGENEZĂ. O variantă alternativă la transgeneză o constituie CISGENEZA, un proces în cadrul căruia genele transferate provin de la forme ce aparțin aceleiași specii, de multe ori populații locale sau rude sălbatice. Cisgeneza este astfel un proces care preia atât avantajele hibridării intraspecifice și anume transferul unor gene de interes de la indivizi ai aceleiași specii, cât și cele ale transgenezei și anume transferul selectiv al unui singur fragment ADN.

Etapele parcurse în obținerea unei plante modificate genetic, fie prin transgeneză, fie prin cisgeneză sunt aceleași: identificarea genei care să confere caracterul de interes, stabilirea metodei optime de transformare genetică, introducerea genei de interes în genomul plantei urmată de regenerarea plantelor modificate genetic.

7.4.2. STRATEGII APLICATE ÎN VEDEREA MANIPULĂRII GENETICE LA PLANTE

În studiile aplicative privind “modificarea genetică la plante”, dependent de speciile de plante care fac obiectul cercetărilor, se aplică în principal următoarele metode:

Transformarea mediată de Agrobacterium;

Metoda biolistică sau bombardamentul cu microproiectile;

Transformarea protoplaștilor.

7.4.2.1 TRANSFORMAREA MEDIATĂ DE Agrobacterium

Genul Agrobacterium include bacterii care trăiesc în sol și infectează plantele la nivelul unor leziuni. Aceste bacterii sunt capabile să transfere în țesutul lezat un fragment de ADN propriu, ADN-T, de pe plasmida Ti (Tumor inducing), în cazul speciei Agrobacterium tumefaciens sau Ri în cazul Agrobacterium rhizogenes, care se integrează în genomul plantei. Ca urmare, bacteria Agrobacterium tumefaciens induce formarea de tumori la nivelul coletului („crown gall disease”) iar Agrobacterium rhizogenes formarea de rădăcini firoase („hairy roots”). O extindere mai mare o are transformarea mediată de Agrobacterium tumefaciens și de aceea în continuare va fi descris acest sistem de transformare.

Agrobacterium – promotorul ingineriei genetice naturale

Plasmida Ti (“Tumor inducing”) este prezentă în celulele bacteriene Agrobacterium tumefaciens și conține majoritatea genelor necesare pentru formarea tumorilor. Plantele rănite sintetizează compuși fenolici care stimulează genele de virulență (genele vir). Genele de virulență codifică un set de proteine responsabile pentru excizarea, transferul și integrarea ADN-T în genomul vegetal. Genele din regiunea T-ADN sunt responsabile pentru procesul de formare a tumorilor, unele dintre ele direcționând producerea hormonilor de creștere care cauzează proliferarea celulelor transformate. Regiunea ADN-T este flancată la ambele capete de două segmente cu lungimea de 25bp, denumite extremitățile T-ADN. Extremitatea stângă nu este esențială pentru transfer, dar cea dreaptă este indispensabilă.

Formarea tumorilor, proces biologic foarte complex este un adevărat caz de inginerie genetică naturală, care a fost exploatat în vederea dezvoltării tehnicilor de modificare genetică la plante.

Elemente genice naturale, exploatate în manipularea genetică

Proprietatea Agrobacterium tumefaciens de a transfera o parte din propriul ADN în genomul plantei a fost exploatată în dezvoltarea tehnicilor de manipulare genetică.

Cercetările efectuate au demonstrat că există cel puțin trei elemente, preluate de la Agrobacterium, necesare pentru transferul genelor la plante.

Primul este reprezentat de extremitățile de 25 bp lungime (LB și RB), care delimitează ADN-T din plasmida Ti, indispensabile procesului de transfer. Având în vedere că între cele două extremități nu există gene necesare transferului această regiune poate fi îndepărtată, ceea ce conduce la “dezarmarea” ADN-T. Plasmidele astfel modificate sunt în continuare capabile de transformarea celulei vegetale dar nu vor mai produce tumori, prin urmare plantele regenerate vor fi “normale” din punct de vedere fenotipic (Fig. 7.17).

Fig. 7.17 Modificarea regiunii ADN-T în vederea obținerii unor

Vectori de transformare genetică la plante

Al doilea element necesar pentru transferul de ADN-T este constituit dintr-un număr de gene codificate de cromozomul bacteriei Agrobacterium tumefaciens. Unele dintre aceste gene cum ar fi chvA, chvB sau pscA sunt esențiale pentru producția de exopolizaharide, ele fiind implicate în atașarea bacteriei la celula vegetală și formarea microfibrelor celulozice. Locusul ros aflat tot pe cromozom influențează eficiența expresiei regiunii vir.

Este evident că o combinație a plasmidei Ti cu unele sușe bacteriene pot influența considerabil virulența lor.

Al treilea element necesar pentru transferul de ADN-T este reprezentat de genele pentru virulență, care sunt activate de moleculele fenolice ale plantelor rănite. Regiunea vir, amplasată pe plasmida Ti, în afara regiunii ADN-T conține cel puțin 22 de gene organizate în 7 operoane (virA-virG). O parte dintre genele vir alcătuiesc un sistem de reglare al celorlalte gene care sunt implicate în transfer.

STRUCTURA CONSTRUCȚIEI UTILIZATE ÎN TRANSFERUL DE GENE

În construcțiile utilizate în transferul de gene elementele prezentate sunt organizate pe două plasmide – o plasmidă dezarmată care conține extremitățile LB și RB, între care pot fi amplasate gene de interes și o plasmidă Ti helper, care conține genele pentru virulență, care alcătuiesc un vector binar (Fig. 7.18). În plus acest sistem este introdus în tulpini specializate de Agrobacterium tumefaciens, pe al cărui cromozom sunt aplasate genele implicate în interacțiunea plantă-bacterie.

Ținând cont de toate aceste aspecte au fost dezvoltate construcții speciale care să conțină toate elementele necesare pentru transfer și în plus să permită inserarea genelor de interes.

În regiunea dintre cele două extremități LB și RB ale plasmidei dezarmate sunt introduse fragmentele care urmează a fi transferate, alcătuite din regiuni centrale ale genelor (ORF), care codifică proteine specifice, însoțite de sistemele de reglare, reprezentate în special din promotori, secvențe terminale (UTR) sau activatori, în funcție de scopul urmărit.

Fig. 7.18 Structura unui vector binar utilizat în transformarea genetică la plante

În general genele străine, introduse în regiunea T-DNA, între cele două extremități sunt:

Genele de interes, care urmează a fi studiate sau gene care conferă, prin intermediul proteinei codificate caractere importante economic (toleranță la erbicide, rezistența la salinitate, rezistența la dăunători și/sau agenți patogeni etc);

Genele marker selectabile, care codifică în general proteine cu proprietatea de a inactiva substanțe chimice incluse în mediul de cultură, permițând selecția celulelor care au fost eficient transformate. Cele mai folosite codifică enzime ce conferă celulelor rezistență la antibiotice și erbicide. Aceste gene permit selectarea celulelor eficient transformate încă din primele etape ale procesului de transformare.

Dacă scopul manipulării genetice este mutageneza de inserție sau studiul unor noi gene identificate, prezența genelor marker selectabile nu prezintă importanță.

Atunci când se dorește obținerea unor produse comerciale se încearcă restrângerea cât mai mult posibil a fragmentului inserat în genomul vegetal și în special eliminarea genelor marker, ceea se ar mări gradul de acceptare a acestor plante de către consumatori. În acest scop pot fi urmate mai multe strategii cum ar fi recombinarea situs specifică, recombinarea omoloagă intracromosomală, transpoziția sau co-transformarea, care sunt însă laborioase și costisitoare. În prezent, o dată cu dezvoltarea tehnicilor de investigare a ADN, se încearcă eliminarea în totalitate a genelor marker selectabile. În acest caz, după ce procesul de transformare a avut loc se selectează un număr foarte mare de regeneranți, care se testează prin amplificare PCR specifică în scopul evidențierii fragmentelor inserate și selectarea plantelor eficient transformate.

Genele raportor sau genele marker identificabile codifică proteine care determină formarea unui produs vizibil, ce permite identificarea celulelor transformate.

Genele raportor sunt prezente în construcțiile de transformare în special atunci când se urmărește mutageneza de inserție sau studiul unor gene. În cazul mutagenezei de inserție construcția utilizată la transformare conține fragmentul ADN-T, cu o singură genă raportor care trebuie să permită selecția rapidă și facilă a plantelor eficient transformate. În acest caz cea mai des utilizată în prezent este gena GFP („Green Fluorescent Protein Gene”).

Proteina verde fluorescentă (GFP), un compus care emite lumină verde atunci când este expusă la radiații ultraviolete (~ 395 nm) sau lumină albastră (~490 nm), nu necesită nici un fel de substrat pentru detecție.

Gena gfp care codifică această proteină are o expresie stabilă în plantele superioare, nu depinde de specie, iar dacă este pusă sub controlul unui promotor constitutiv poate fi detectată în orice organ.

Această genă furnizează un marker transgenic universal, nedistructiv, care permite testarea unui număr foarte mare de plante în același timp, permițând evidențierea vizuală a plantelor transformate în urma iluminării UV sau cu lumină albastră.

O altă genă raportor este gena uid A (gus A), care codifică enzima β-glucuronidaza. Această enzimă dă o reacție de culoare în prezența substratului cromogen 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucuronid (X-gluc), iar activitatea ei specifică poate fi măsurată în prezența substratului fluorogenic 4-metil umbeliferil glucuronid (MUG). Un dezavantaj al acestui sistem de marcare este necesitatea prelevării unei probe de țesut din plantele de analizat, ceea ce îi conferă un caracter distructiv.

Fiecare gena este pusă sub controlul unui promotor care poate fi: constitutiv, inductibil sau specific țesutului.

Promotorii constitutivi sunt utilizați atunci când expresia genelor nou introduse în genomul vegetal este necesară în toate țesuturile plantelor; cel mai utilizat promotor constitutiv, în cazul transformării plantelor dicotiledonate provine de la virusul mozaicului conopidei și aparține genei care determină sinteza unei molecule ARN 35S (promotor 35S);

În cazul promotorilor inductibili expresia genelor nou introduse este indusă de acțiunea unor compuși specifici, cum ar fi hormonii, factorii de stres biotic sau abiotic sau de semnale din mediu.

Promotorii specifici unui țesut asigură expresia genelor nou introduse numai în anumite țesuturi, deci are loc manifestarea localizată a caracterului conferit prin modificarea genetică.

În cazul în care se realizează mutageneza de inserție în scopul identificării unor gene, se utilizează în general promotorii constitutivi. Dacă în schimb se dorește identificarea unor elemente din regiunile de reglare a genelor pot fi utilizați promotori inductibili sau specifici unui țesut, în funcție de scopul urmărit.

În produsele comerciale alegerea tipului de promotor se realizează în funcție de scopul urmărit, aceștia fiind fie constitutivi fie specifici țesutului în care proteina codificată de transgenă își îndeplinește funcția.

MECANISMUL PROCESULUI DE TRANSFER DE GENE LA PLANTE

Procesul de transfer și integrare a fragmentului de ADN-T în genomul celulei vegetale presupune parcurgerea mai multor etape:

Recunoașterea de către Agrobacterium a semnalului emis de celula vegetală rănită

Procesul de transformare începe cu rănirea plantei. Ca răspuns la rănire, celulele plantelor dicotiledonate produc o varietate de compuși fenolici (acetosyringona sau α-hidroxiacetosyringona) și zaharuri. În mod normal aceste substanțe fac parte din mecanismul de apărare al plantei, fiind implicate în sinteza fitoalexinelor și a ligninei. Aceste molecule sunt difuzate dinspre locul rănirii și se comportă asemeni unui semnal care atrage orice agrobacterie din sol.

Atașarea bacteriei la celulele vegetale

Atașarea bacteriei Agrobacterium la celulele vegetale presupune inițial asocierea prin intermediul unor polizaharide (produsul locusului attR). Apoi bacteria colonizează locul rănirii formând microfibre celulozice care o fixează la celulele vegetale. În procesul de atașare a celulelor bacteriene de celulele vegetale sunt implicate mai multe gene cromozomale (genele chv). Genele chvA și chvB sunt implicate în producerea și secreția β-1-2-glucan, iar gena pscA este implicată în secreția succinoglicanului.

Activarea genelor din regiunea vir

Moleculele semnal ca acetosyringona, prezente în concentrații mari activează un receptor membranar Vir A (produsul codificat de gena vir A) care activează un factor de transcripție, Vir G. Proteina Vir G activată interacționează cu elementele activatoare și promotorii operonilor vir A, vir B, vir C, vir D, vir E și vir G, conducând la accentuarea nivelului de expresie. Genele vir A și vir G au o expresie constitutivă, iar celelalte gene vir o expresie indusă de interacțiunea cu Agrobacterium.

Produșii acestor gene vir sunt implicați în prelucrarea ADN-T din plasmida Ți și în transferul ADN-T în celula vegetală.

Producerea catenei T

Extremitățile dreaptă și stângă sunt recunoscute de produsul complexului VirD1/VirD2 iar VirD2 produce o secționare la nivelul catenei inferioare de ADN. După secționare proteina Vir D2 se atașează covalent la capătul 5’ a monocatenei ADN-T detașate, în proces fiind implicată și proteina Vir C1. Catena detașată este înlocuită prin sinteză.

Transferul fragmentului de ADN-T în celula vegetală

Complexul care se formrază, ADN-T/Vir D2/Vir E2 este exportat din celula bacteriană prin intermediul unui pil-T compus din proteine codificate de operonul virB (proteinele Vir B1-11 intră în structura unui por membranar al celulei vegetal și în aparatul de translocare).

Proteina VirE2 protejează catena de acțiunea nucleazelor, facilitează integrarea în nucleu și conferă conformația corectă complexului pentru trecerea prin porii nucleari.

Proteina VirE2 conține un semnal de localizare nuclear (SLN), amplasat la capătul C-terminal care orientează molecula ADN spre nucleu, unde factori ai celulei gazdă facilitează integrarea în nucleu, posibil mediat de sistemul de reparare a ADN. Dacă nu există similarități între genomul vegetal și fragmentul ADN-T, integrarea are loc la întâmplare în genomul nuclear (Fig 7.19 și Fig 7.20).

Fig. 7.19 Transferul genelor mediat de Agrobacterium tumefaciens

Fig. 7.20 Mecanismul genetic al procesului de transformare genetică mediată de Agrobacterium tumefaciens

În urma procesului de transfer al genelor fragmentul ADN cuprins între cele două extremități ale fragmentului ADN-T (LB și RB) este transferat în genomul plantei, într-o poziție întâmplătoare, de obicei într-un număr redus de loci (numărul de copii ale transgenei este de obicei redus),inserarea având loc în unul dintre cromozomii omologi.

7.4.2.2. TRANSFORMAREA GENETICĂ PRIN METODA BIOLISTICĂ

Metoda biolistică este o metoda de transformare, cu o aplicabilitate largă, atât pentru plante mono cât și dicotiledonate, utilizată pentru prima dată în anul 1987 pentru transformarea cerealelor (grâu și porumb).

Metoda constă în precipitarea ADN pe microparticule (1µm diametru) din tungsten sau aur coloidal, care sunt introduse apoi în celulele vegetale. Accelerarea particulelor se realizează cu dispozitive speciale, denumite „gene gun”, cu ajutorul heliului sub presiune. Particulele penetrează peretele celular și de obicei pătrund în stratul superficial al țesutului, alcătuit din 1-2 celule.

Încercările de optimizare ale sistemului s-au axat pe trei aspecte ale acestui proces: tipul de microparticule și prepararea lor, accelerarea microparticulelor și alegerea țesutului țintă. S-a constatat că este necesar să existe un echilibru între numărul și mărimea particulelor accelerate asupra unui țesut țintă, vătămarea țesuturilor și cantitatea de ADN aflată pe particule. O cantitate prea mică de ADN poate conduce la o frecvență mică de transformare, iar o cantitate mare de ADN duce la număr mare de copii și re-aranjamente ale construcției genetice.

Recent, s-a obținut o eficiență mai mare de transformare la o concentrație scăzută de ADN, în cazul în care microparticulele sunt alcătuite din aminosiloxani.

Țesuturile vegetale utilizate în bombardamentul cu microparticule pot fi: explante cărora li se induce embriogeneza după transformare sau culturi embriogenetice care sunt transformate, după care sunt supuse unor procese de proliferare, urmate de regenerare. Pentru a proteja țesutul vegetal de vătămare în timpul procedurii de bombardare se recurge la tratamente ce induc o plasmoliză ușoară sau cultură pe medii înalt osmotice.

Datorită avantajelor sale metoda biolistică a devenit metoda favorită în numeroase laboratoare, permițând transformarea cu succes a unor plante pentru care alte metode nu au dat rezultate cum ar fi: soia, porumbul, ovăzul, orezul, sorgul, trestia de zahăr, grâul, plante forestiere etc, dar numărul mare de copii pentru genele inserate și posibilele re-aranjamente constituie probleme care trebuie să fie menționate.

7.4.2.3. TRANSFORMAREA GENETICĂ PRIN METODA PROTOPLAȘTILOR

Protoplaștii, celulele vegetale lipsite de perete celular, constituie un sistem experimental optim pentru manipulări genetice, putând fi făcuți să înglobeze material genetic exogen.

Pentru transferul DNA, de obicei plasmidial, în protoplaștii izolați se pot utiliza diferite metode, și anume:

Tratamente chimice cu agenți permeabilizanți (mai ales polietilenglicol – PEG); PEG și alți agenți chimici pot permeabiliza membrana plasmatică permițând intrarea moleculelor DNA în citoplasmă.

Electroporarea, care implică permeabilizarea reversibilă a membranei plasmatice în prezența unor impulsuri electrice având amplitudine crescută și durată foarte scurtă; porii formați în membrană permit intrarea DNA străin în citoplasmă;

Sonicarea, care presupune permeabilizarea membranei protoplastelor în prezența ultrasunetelor; (Zhang și colab., 1991).

Microinjectarea, proces care constă în introducerea cu ajutorul unei micropipete a ADN direct în protoplasti;

Manipularea protoplaștilor vegetali este foarte dificilă datorită problemelor asociate cu regenerarea de plante fertile, iar ADN utilizat în transformare este susceptibil la degradare și rearanjamente. În ciuda acestor limitări, posibilitatea de izolare a protoplaștilor la un număr mare de specii prezintă un avantaj. În cazul în care sunt transformați cloroplaști, metoda protoplaștilor înlocuiește cu succes metoda biolistică.

7.4.2.3. REGENERAREA PLANTELOR MODIFICATE GENETIC ȘI CARACTERIZAREA LOR MOLECULARĂ

Indiferent de metoda utilizată pentru modificarea genetică, celulele posibil transformate sunt multiplicate, timp în care are loc și selecția cu factorii de selecție corespunzători genelor marker utilizate.

În etapa următoare, din celulele transformate sunt regenerate plante, care sunt supuse unor teste moleculare complexe. Fiecare plantă regenerată este un eveniment de transformare unic, care se analizează separat; gena se inserează în genom la întâmplare, astfel că nu vor exista două plante identice.

În cazul în care s-a utilizat o genă raportor, plantele eficient transformate pot fi identificate cu ajutorul testelor specifice (tratarea cu un substrat cromogen în cazul genei uid A sau iluminarea UV, în cazul genei gfp).

Având în vedere că genele utilizate la transformare au fost caracterizate și secvențializate în prealabil, testele moleculare sunt orientate spre analiza acizilor nucleici și a proteinelor specifice acestora.

Astfel, inserarea transgenei în genom se identifică prin testul PCR, în care are loc amplificarea ADN genomic cu primeri specifici genei studiate. Prezența produșilor de amplificare dovedește prezența genei de interes în genomul studiat.

Numărul de copii al genei nou introduse se determină cu ajutorul tehnicii Southern, în care ADN genomic al plantelor transformate este secționat cu enzime de restricție, denaturat și fixat pe membrane solide, iar sonda moleculară este constituită din secvența genei de interes Apariția unor semnale pozitive corespunzătoare mai multor fragmente genomice indică prezența unui număr mare de copii ale transgenei. Sunt selectate de obicei plante care au o singură copie, deoarece modificările produse în genomul celulei vegetale sunt minime. O metoda mai recentă, dar mai costisitoare este Real-Time PCR, care permite determinarea numărului de copii al transgenei prin comparație cu o genă de referință, prezentă într-o singură copie.

Funcționalitatea genei nou introdusă poate fi determinată prin detectarea moleculei ARNm corespunzătoare, dar de cele mai multe ori este identificată prezența proteinei codificate de transgenă prin metodele ELISA („Enzyme-linked immunosorbent assay”) sau Western Blotting. Metoda ELISA permite detecția prezenței proteinei și în același timp cuantificarea acesteia ca o evaluare a expresiei genei de interes. Metoda Western permite, pe lângă identificarea prezenței proteinei și o evaluare aproximativă a dimensiunilor acesteia. Mai recent a fost introdusă metoda RT-PCR (revers-transcriptase PCR) pentru evaluarea expresiei transgenei prin investigarea ADNc, corespunzător moleculei ARNm sintetizată în timpul transcrierii.

O investigare importantă este și secvențializarea, atât a genei nou introduse, cât și a secvențelor din genomul vegetal care flanchează această genă. Determinarea secvenței genei are o importanță deosebită pentru a dovedi că, pe parcursul tuturor etapelor parcurse pentru modificarea genetică, aceasta nu a suferit transformări. Secvențele regiunilor care mărginesc gena de interes pot evidenția structura și funcția locusului de inserție. În cazul în care în aceste secvențe sunt regăsite regiuni ale unor gene vegetale, evenimentul de transformare respectiv își pierde utilitatea practică.

Testele de laborator permit selecția plantelor transformate după care au loc testele în condiții de mediu controlate și testele de câmp. În funcție de tipul genei inserate, o mare importanță o are testul biologic, care certifică nu numai transferul eficient al unei gene funcționale, dar și manifestarea caracterului dorit (rezistență la atacul insectelor, rezistență la acțiunea erbicidelor, toleranță la secetă, etc.).

Tot în această etapă se determină și modul de segregare și transmiterea transgenei în descendență. Regeneranții primari sunt hemizigoți pentru gena de interes (au o singură alelă, pe unul dintre cromozomii omologi). În cazul plantelor cu înmulțire sexuată în descendență vor fi selecționate liniile homozigote, care vor trece în etapa următoare, de evaluare a însușirilor agronomice prin testarea în câmp.

7.4.3. IDENTIFICAREA PLANTELOR MODIFICATE GENETIC

Dezvoltarea metodelor de identificare a plantelor modificate genetic se realizează în prezent de către compania producătoare, o dată cu efectuarea testelor moleculare.

În funcție de nivelul de specificitate dorit pot fi identificate una sau mai multe fragmente din genomul plantei transformate. Au fost alese pentru testare tehnicile PCR, datorită preciziei, acurateții rezultatelor și ușurinței de utilizare.

Astfel, orice testare începe cu verificarea specificității de specie, care demonstrează că ADN analizat este amplificabil și aparține speciei luate în studiu (Fig. 7.21).

Fig. 7.21 Identificarea plantelor modificate genetic la diferite niveluri de specificitate

Următorul nivel este screening-ul primar, care permite identificarea prezenței unui promotor, sau secvență terminală care sunt însă specifice unui număr foarte mare de plante modificate genetic (PMG). De aceea, în urma unui astfel de test se poate afirma numai dacă o probă conține sau nu PMG, fără nici o altă informație particulară.

Pentru o specificitate mai ridicată este posibilă identificarea prezenței genelor transferate – specificitate de genă. În acest fel poate fi identificată compania căreia îi aparține produsul, dar nu cu certitudine, deoarece în unele situații există mai multe companii care utilizează aceleași gene pentru transformare. Apoi, specificitatea de construcție evidențiază prezența unei regiuni de joncțiune dintre diferite elemente ale inserției transgenice (de exemplu joncțiunea genă-promotor).

Nivelul cel mai înalt de detecție este dat de specificitatea de eveniment de transformare, în care fragmentul amplificat se află la joncțiunea dintre fragmentul transferat și molecula ADN vegetal. Acest fragment este unic, specific fiecărui eveniment de transformare și permite identificarea unui anumit produs MG.

7.4.4. APLICAȚII ALE MANIPULĂRII GENETICE LA PLANTE

In anul 1996 au fost cultivate primele soiuri de plante modificate genetic in scopul comercializarii. Zece ani mai tarziu suprafata cultivata in intreaga lume a fost de 102 milioane de hectare, datorita avantajelor prezentate de aceste culturi.

In prima generatie de plante modificate genetic introduse în cultura și comercializare sunt incluse plantele rezistente la erbicide, la dăunatori și boli. Dobândirea acestor caractere a reprezentat un avantaj în primul rând pentru cultivatori ceea ce a favorizat scepticismul privind siguranța alimentară.

De aceea au fost dezvoltate sisteme de transformare din ce în ce mai performante, în cadrul cărora au fost eliminate genele marker. Aceste gene confera în general rezistența la antibiotice și eliminarea lor din construcțiile utilizate la transformarea genetică a reprezentat un pas înainte în realizarea unor produse mai sigure.

Mai târziu au fost obținute plante modificate genetic cu toleranța la factorii de stres abiotic, ceea ce a permis cultivarea unor soiuri potrivite cu condițiile climatice și de sol din diferite regiuni ale globului.

Cele mai noi realizari ale ingineriei genetice le reprezintă obținerea acelor soiuri care aduc un plus de valoare produselor agricole din punctul de vedere al consumatorilor cum ar fi ameliorarea valorii nutritive, a însușirilor de calitate sau a însușirilor tehnologice.

In continuare vor fi prezentate succint principalele categorii de plante modificate genetic a căror producere a fost posibilă datorită dezvoltării tehnicilor de biochimie și genetică moleculară, care au permis elucidarea căilor de biosinteza ale unor produși, identificarea enzimelor implicate în aceste procese și totodată identificarea genelor care le codifică.

Plante modificate genetic rezistente la erbicide pot fi obținute prin transferul unei gene mutante care codifică enzime insensibile la erbicidul respectiv sau a unei gene care codifică o enzimă ce degradează erbicidul. Plantele astfel obținute sunt tolerante față de erbicide totale, biodegradabile, fără efect negativ asupra mediului și netoxice pentru om și animale. Aplicarea unui singur erbicid total presupune mai putina muncă, cheltuieli mai reduse și totodată beneficii asupra mediului înconjurător prin reducerea poluării solului și a apei.

Rezistența la insecte s-a obținut prin transferul unei gene pentru o endotoxină izolată de la bacteria Bacillus thuringiensis, așa numita toxină Bt. A fost astfel produs porumb rezistent la atacul sfredelitorului european al tulpinilor si la viemele radacinilor (Diabrotica) și cartof rezistent la atacul gândacului din Colorado. In celulele plantelor se sintetizează o proteină insecticid care este toxică pentru dăunatorii menționați, dar nu are efect toxic sau alergen asupra mamiferelor. Pe lângă sporurile semnificative de producție obținute în cazul cultivării acestor plante trebuie menționat și efectul pozitiv asupra mediului, datorită eliminării tratamentelor cu insecticide (Badea, 2001).

Obținerea plantelor modificate genetic rezistente la boli a fost posibilă o dată cu progresele considerabile în înțelegerea succesiunii proceselor moleculare care constituie elementele componente ale sistemelor de aparare ale plantelor. In cazul rezistenței la patogenii de natura fungică sunt transferate gene care codifică proteine corelate cu patogeneza sau gene de rezistență. Rezistența la virusuri a fost obținută prin transferul unor gene pentru proteine capsidale virale, care induc rezistența la un spectru mai larg de virusuri, sau pot avea loc procese de silentiere ARN.

De o importanța deosebită sunt plantele modificate genetic pentru toleranța la stresul abiotic. In condițiile actuale, în care conditiile de mediu se degradează tot mai mult un interes maxim îl prezintă plantele tolerante la seceta, la temperaturi înalte sau scăzute, la stres salin, sau toleranța la prezența aluminiului și a metalelor grele. De exemplu, în plante se pot sintetiza osmoprotectori – prolina, glicin betaina, sau proteine care pot inactiva metalele grele. Obținerea unor plante cu o toleranta mare la prezenta metalelor, care au în același timp și o capacitate mare de acumulare a acestora deschide noi căi spre un domeniu de maxim interes în zilele noastre și anume fitoremedierea.

Plantele modificate genetic din generația a doua au avut ca scop ameliorarea valorii nutritive a produselor agricole. Au fost produse plante de rapiță, soia și porumb având uleiuri de calitate superioară pentru consumul uman sau uleiuri noi pentru uz industrial, prin modificarea compozitiei acizilor grași. De asemenea există posibilitatea sintezei unor proteine îmbunătățite sau proteine noi. Un obiectiv al manipulării genetice l-a reprezentat și ameliorarea conținutului de micronutrienți cum ar fi vitaminele A, E, C sau fierul. Exemplul cel mai concludent îl reprezintă orezul auriu “golden rice”, produs în anul 2000 și îmbunătațit în 2005, care sintetizează beta-caroten, un precursor al vitaminei A. Se consideră că un consum de 75 g de orez auriu pe zi ar putea să rezolve gravele probleme ale copiilor din zone defavorizate de pe glob, în care deficiența de vitamina A face numeroase victime.

De interes pentru cercetători a fost și îmbunătațirea unor însușiri de calitate, cum ar fi întârzierea procesului de coacere și extinderea perioadei de păstrare, modificarea fermitătii fructelor sau a procesului de maturare prin controlul nuvelului etilenei, ameliorarea calitătilor gustative, prevenirea brunificării enzimatice sau modificarea culorii florilor.

In ultimii ani interesul în domeniul manipulărilor genetice s-a orientat spre producerea proteinelor recombinate în plante. Pot fi astfel produse în plante proteine cu utilizări industriale sau proteine farmaceutice – vaccinuri, anticorpi și alte proteine terapeutice. Sinteza unor molecule terapeutice sau vaccinuri în plante prezintă o serie de avantaje și anume modul de producere este ușor și rapid, pot fi păstrate la temperatura mediului ambiant și totodată sunt eliminate riscurile contaminărilor virale sau bacteriene asociate vaccinurilor produse în tesuturi animale sau umane (Badea, 2005).

7.5 SECVENȚIALIZAREA GENOMULUI

Moleculele de ADN au fost secvențializate pentru prima dată în anul 1977. Primul organism viu al cărui genom a fost secvențializat complet a fost virusul Haemophilus influenzae, în 1995. În 1996 a fost secvențializat primul genom eucariot – Saccharomyces cerevisiae, iar în 1998 a fost secvențializat genomul unui eucariot multicelular Caenorhabditis elegans.

Astfel, până în prezent au fost secvențializate în totalitate genomurile a peste 350 de organisme procariote și 73 eucariote, dintre care 21 protiste, 4 alge, 15 fungi, 4 insecte, 5 nematozi, 9 plante superioare, 9 mamifere și 6 alte animale.

(http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_sequenced_bacterial_genomes)

(http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_sequenced_eukaryotic_genomes)

7.5.1. SECVENȚILIZAREA GENOMULUI LA PLANTE

În cazul plantelor superioare au fost secvețializate genomurile organismelor model, care pot furniza informații valoroase pentru cercetările care au ca obiect alte specii cu genom mai complex. În plus au făcut obiectul studiilor de secvențializare speciile de mare interes pentru hrana populației, cum ar fi orezul (Tabel 7.1 ).

Completarea secvenței genomului la Arabidopsis thaliana (AGI, 2000) a reprezentat un pas important în cercetarea din domeniul biologiei vegetale. Astfel, s-a furnizat prima descriere detaliată a secvenței unei plante superioare și s-au evidențiat unele procese noi implicate în creșterea și dezvoltarea plantelor. Disponibilitatea secvenței genomului la Arabidopsis a permis lărgirea și accelerarea unor cercetări ulterioare în genetica vegetală.

În anul 2002 a fost secvențializat genomul pentru două subspecii de orez, pentru că această specie este recunoscută ca având un genom de dimensiuni reduse și în plus constituie hrana principală pentru un procent foarte mare din populația lumii.

Genomul Ostreococcus tauri a fost secvențializat în 2006, deoarece este un organism eucariot simplu, iar genomul Physcomitrella patens a fost de interes deoarece reprezintă un organism cu importață în studiile de evoluție a plantelor. Populus trichocarpa este un arbore model, cu utilizări comerciale importante, care a fost studiat comparativ cu Arabidopsis. Rapița este una dintre speciile importante pentru producția de ulei în întreaga lume, iar porumbul și vița de vie au de asemenea o importanță comercială.

Tabel 7.1. Dimensiunea genomului și numărul de gene la speciile vegetale al căror genom a fost secvențializat ( 2009)

7.5.2. SECVENȚILIZAREA GENOMULUI LA UMAN

Cel mai ambițios proiect de secvențializare a genomului uman a fost inițiat în 1990 în SUA, în cadrul Institutul Național de Sănătate și Departamentul de Energie, având denumirea de Proiectul de cartare a genomului uman ( „The Human Genome Project –HGP”) și s-a finalizat în anul 2003.

Scopul propus al acestui proiect a fost de a secvențializa genomul uman până în anul 2005. Prin colaborarea cu alte programe naționale de cercetare din Canada, China, Franța, Germany, Japonia si Anglia si cu ajutorul unor companii comerciale (Celera), succesul proiectului a depășit așteptările.

Sub auspiciile proiectului HGP la mijlocul anilor 90 a fost dezvoltată o hartă genetică și una fizică a genomului uman. Aceste realizări au permis orientarea eforturilor spre identificarea genelor care produc numeroase maladii prin clonarea pozițională.

Până în 1996 genomul drojdiei și al bacteriilor a fost secvențializat, astfel că atenția s-a îndreptat spre incercarea de secvențializarea celor 3,2 x 109 baze din genomul uman.

Strategia aplicată a fost secționarea genomului uman în fragmente de 100 – 200 kb care au fost apoi clonate în vectori BAC (Bacterial Artificial Chromosome). Cele 20 000 de clone BAC au fost ordonate și cartate înainte ca ele să fie secționate în fragmente mici de 2 kb, pentru realizarea subclonelor, care au fost secvențializate.

Analiza secvențelor subclonelor a permis stabilirea înlănțuirii acestora în clona BAC de origine. Apoi, secvențele clonelor BAC au fost ordonate, astfel încât să se stabilească poziția lor inițială pe cromozomi. Toate aceste procese de ordonare au permis asamblarea secvenței întregului genom, care a fost publicată în revista Nature, în 2001, în aceiași săptămână în care o companie privată – Celera, a publicat secvența ei proprie în revista Science.

Ultima estimare a numărului de gene codante din genomul uman, pe baza cercetărilor finalizate în anul 2006, este în jur de 25.000 gene, similar cu multe alte organisme mai simple. De aceea s-a considerat că, complexitatea genomului uman se datorează proceselor de reglare a genelor și de producere a unui set elaborat de produși proteici și nu complexității genomului.

Succesul acestei secvențializări marchează un progres major în biologia umană, care aduce un beneficiu enorm în termenii înțelegerii sensibilității oamenilor la boli și dezvoltarea unor noi tratamente genetice.

În prezent, având la dispoziție o hartă completă a genomului pentru un număr mare de specii, scopul cercetărilor din întreaga lume este genomica funcțională și stabilirea funcțiilor pentru noile secvențe ADN determinate.

Atunci când este identificată o nouă secvență, aceasta este comparată cu bazele de date existente, pentru a obține informații cu privire la posibila implicare într-o anumită cale metabolică. Tehnicile foarte sofisticate de investigare, cum ar fi microarray, secvențializare, completate cu instrumentele bioinformaticii permit identificarea unui număr mare de secvențe ADN, dar stabilirea cu certitudine a funcției unei gene nou identificate este încă o provocare pentru cercetărea actuale.

7.6. AMPRENTAREA UMANĂ, ANALIZE CRIMINALISTICE

În realizarea unui profil ADN individual se folosesc o serie de tehnici care să permită determinarea similitudinilor dintre probe.

Prima metodă folosită în acest sens a fost tehnica RFLP, care ajută la identificarea polimorfismului cu ajutorul enzimelor de restricție și permite vizualizarea mai multor loci în același timp. Acestă tehnică este laborioasă, necesită cantități mari de ADN nedegradat și nu permite identificarea alelelor individuale.

De aceea, s-au dezvoltat tot mai mult procedurile bazate pe tehnica PCR, care permit obținerea de informații valoroase cu un grad de precizie foarte ridicat, pornind de la cantități reduse de ADN, sau chiar degradate.

Metoda PCR poate fi ușor adaptată pentru a analiza minisateliții hipervariabili – VNTR ("variable number of tandem repeats")(capitolul 2.3.3.2.). De exemplu, în SUA, serviciul FBI a standardizat un set de13 analize VNTR pentru a stabili amprenta ADN și a organizat baza de date CODIS (http://www.fbi.gov/hq/lab/html/codis1.htm) pentru investigații criminalistice.

De asemenea, sunt disponibile seturi de kituri comerciale pentru analize cu markeri care evidențiază polimorfismul unei singure nucleotide SNP (“Single Nucleotide Polymorphism”) (capitolul 6.3.1.). Aceste analize presupun amplificarea PCR a unor regiuni specifice cu variații cunoscute și mai apoi, hibridizarea acestora pe chip-uri microarray.

ANALIZELE SECVENȚELOR MINISATELIT

Metodele cele mai utilizate în prezent sunt cele care se bazează pe investigarea regiunilor minisatelit, înalt polimorfice. În cazul indivizilor care nu sunt înrudiți, numărul acestor repetiții diferă și de aceea pot fi folosite pentru identificare.

Acești loci minisateliți pot fi identificați cu primeri specifici, amplificați cu ajutorul PCR, separați și vizualizați cu ajutorul electoforezei în geluri de agaroză sau în capilare.

Pentru a crește gradul de precizie a testului efectuat, se analizează un număr de 13 regiuni miniosatelit, ceea ce exclude apariția unei erori. De exemplu, probabilitatea ca profilul ADN a doi indivizi, obținut prin această metodă să fie același este de 1 la un trilion.

În cazul în care se efectuează un test de paternitate se analizează comparativ profilul ADN al mamei, al copilului și al potențialilor tați. Dacă testele sunt criminalistice, se analizează în paralel amprentele ADN ale victimei, ale probei prelevate de la locul faptei și ale posibililor suspecți. Se analizează și ADN prelevat de la victimă pentru a fi siguri că ADN din probă nu a fost contaminat cu ADN de la victimă (Fig. 7.22 ).

Fig. 7.22. Profilul ADN, utilizat pentru identificarea indivizilor în cazul efectuării testelor de paternitate și a investigațiilor criminalistice

În imaginea prezentată, amprenta ADN a copilului (C) este moștenită fie de la mamă (M) fie de la F1, demonstrând ca acesta este tatăț. În amprenta copilului nu sunt prezente fragmente provenind de la F2, ceea ce îl exclude ca fiind potențial genitor.

În cazul analizelor criminalistice se evidențiază fără nici un dubiu că amprenta ADN obținută din proba de analizat provine de la suspectul 1.

O altă tehnică folosită pentru a obține un profil ADN este AFLP – Amplified Fragment Length Polymorphism (polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție amplificate) (capitolul 6.2.2.2), care a fost dezvoltată la începutul anilor 1990.. Evidențierea diferențelor dintre alele se bazează pe polimorfismul VNTR, detectat prin amplificări PCR specifice ale ADN. Produșii de amplificare se separă prin electroforeză în gel de poliacrilamidă, ceea ce ar putea conduce la interpretări eronate. De aceea analizele au fost automatizate, mărindu-le gradul de precizie și eliminând subiectivitatea operatorului.

În situațiile în care ADN nuclear este prea degradat pentru a fi folosit în analiza PCR a minisateliților, se recurge le investigarea ADN mitocondrial (ADNmt). Această strategie este posibilă deoarece într-o celulă numărul de copii al ADNmt depășește de câteva ori ADN nuclear. Criminaliștii amplifică și secvențializează două regiuni ale ADNmt, identificând mai apoi diferențele la nivel de nucleotide. Deoarece ADNmt este moștenit pe cale maternă, poate fi folosit ca referință ADN provenit de la rudele materne. O diferență de două sau mai multe nucleotide este considerată o excludere.

Acest tip de analize se folosește în determinarea identității unor persoane dispărute atunci când rudele materne sunt cunoscute. ADNmt poate fi obținut din fire de păr, oase sau dinți.

BAZE DE DATE ADN

În prezent există câteva baze de date ADN uman în toată lumea. Unele dintre ele sunt private, dar majoritatea sunt proprietate guvernamentală. Cea mai mare bază de date ADN este deținută de guvernul SUA și deținea peste cinci milioane de înregistrări ( în anul 2007). O bază de date ADN de dimensiuni aproxiativ similare este deținută și de guvernul Regatului Unit al Marii Britanii. Toate aceste baze de date pot fi utilizate pentru compararea amprentelor ADN obținute din probele prelevate de la locul comiterii unei infracțiuni.

Dovezile pe bază de ADN pot fi falsificate în primul rând prin plasarea la locul infracțiunii de probe false de ADN. Mai mult, procedurile criminalistice care se folosec in prezent nu pot distinge între ADN natural și cel artificial (obținut prin amplificare PCR ).

7.7. APLICAȚII ALE MARKERILOR MOLECULARI ÎN PROGRAMELE DE AMELIORARE

Ameliorarea plantelor este esențială în vederea asigurării necesarului de hrană a populației planetei în contextul creșterii populației și a scăderii suprafețelor de teren agricol.1/3 din suprafețele arabile au fost pierdute în ultimii 40 de ani, și în fiecare zi un plus de ¼ milioane de oameni trebuie hrăniți în plus. Ameliorarea genetică a plantelor este singura opțiune disponibilă care să satisfacă toate cerințele. Ingineria genetică oferă soluții în cazul unor probleme dar câștigul imediat este dat de utilizarea markerilor moleculari în ameliorarea plantelor.

7.7.1. SELECȚIA ASISTATĂ DE MARKERI

Ameliorarea plantelor implică mai multe etape, de încrucișări succesive, urmate de procese de selecție, care necesită mulți ani mai ales în cazul în care se studiază caractere complexe influențate de mediul înconjurător .

Selecția asistată de markeri (SAM) are rolul de a accelera întreg procesul, făcând posibilă o selecție mai eficientă și în final comercializarea mai rapidă a unui soi.

Deci, selecția asistată de markeri oferă posibilitatea creșterii eficienței selecției unor genotipuri la care se urmăresc mai multe caractere de interes. Această tehnică se bazează pe identificarea unor markeri moleculari linkați de anumite gene pentru care se realizează selecția. Odată realizat acest lucru selecția în cadrul programelor de ameliorare poate fi realizată în laborator și nu necesită expresie fenotipică. De exemplu rezistența la boli poate fi evaluată în absența bolii și caracterele unei plante adulte cu privire la rezistența la stres, poate fi evaluată încă din primele stadii de dezvoltare.

Selecția asistată de markeri (MAS) are rolul de a accelera întreg procesul, făcând posibilă o selecție mai eficientă și în final comercializarea mai rapidă a unui soi.

Accelerarea backcrossului

Markerii moleculari pot fi utilizați pentru accelerarea programelor de backross. Amelioratorii urmăresc introducerea unui singur caracter (genă) într-o constelație genetică fără să influențeze alte caracteristici.

In forma sa tradițională, backcrossul asigură transferul unei gene de interes de la părintele donor la cel receptor sau recurent în circa 5-6 generații de backcross. Acest timp este necesar pentru refacerea cât mai completă a genotipului recurent valoros, care va cuprinde și gena dorită de la genomul donor. Markerii moleculari permit însă ca în fiecare generație de backcross să se aleagă indivizii care conțin cel mai mare procent din părintele recurent și totodată gena introgresată. In acest fel, selecția genotipului ideal durează 2-3 generații, în timp ce timpul necesar pentru backcross-ul tradițional este cel puțin dublu.

4.4. METODE MOLECULARE DE PROTEJARE A DREPTURILOR AMELIORATORILOR

Amelioratorii trebuie să aibă posibilitatea să identifice soiurile comerciale, să poată beneficia de pe urma acestor soiuri și să-și recupereze banii investiți în ameliorare.

Recunoașterea drepturilor amelioratorilor necesită în general stabilirea uniformității, stabilității și identității noilor soiuri.

Uniformitatea soiurilor trebuie să fie evidențiată în conformitate cu standardele existente pentru fiecare specie.

Soiurile trebuie să fie stabile pe parcursul a cel puțin două generații. Tehnicile moleculare pot fi utilizate pentru stabilirea acestor proprietăți în vederea obținerii și protejării drepturilor amelioratorilor.

Pentru a evidenția identitatea, puritatea și stabilitatea soiurilor pot fi utilizate toate tipurile de markeri moleculari. Aceștia pot fi considerați asemenea unor caractere sau trăsături adiționale pentru evaluarea diferențelor genetice.

Principalele cerințe în cazul testelor moleculare utilizate în protejarea soiurilor sunt: testul să fie repetabil, să fie obiectiv și ușor de analizat, să furnizeze diferențe semnificative între specii.

Avantajul markerilor moleculari este acela că analiza ADN-ului nu este influențată de mediu înconjurător.

Gama de markeri disponibili diferă în funcție de specie (speciile mai importante și mai intens studiate dispun de un număr mai mare de markeri).

Tehnicile care presupun utilizarea unor markeri arbitrari (RAPD) sunt utile pentru speciile mai puțin studiate deoarece pot fi aplicate fără o cunoaștere prealabilă a secvențelor de nucleotide și în absența hărților genetice sau a studiilor moleculare.

O metodă utilă de identificare a soiurilor în scopul protejării lor din punct de vedere comercial trebuie să se bazeze pe teste care pot fi reproduse în orice laborator. Microsateliții ar putea să satisfacă aceste cerințe dar realizarea lor este extrem de costisitoare pentru majoritatea speciilor, utilizarea lor realizându-se exclusiv la speciile importante.

Identitatea și puritatea soiurilor de cereale

Peste 500 de milioane de tone de grâu, orez, sau porumb sunt produse anual pentru consum direct sau pentru consumul de produse alimentare. Diferențierea soiurilor de cereale în funcție de calitățile de prelucrare are o aplicabilitate deosebită mai ales dacă această diferențiere nu se poate realiza pe baze morfologice. Soiurile de grâu care arată similar pot avea proprietăți foarte diverse în ceea ce privește producerea de alimente finite.

Probleme asemănătoare apar în diferențierea soiurilor de orz (unele sunt recomandate în producerea berii iar celelalte, chiar dacă se aseamănă din punct de vedere morfologic, se utilizează în hrana animalelor).

O simplă reacție PCR cu primeri ce codifică -amilaza a dus la identificarea soiurilor cu caracteristici diferite.

Identificarea soiurilor de viță de vie

Producția de vinuri se bazează pe o gamă largă de soiuri de viță de vie și confirmarea identității acestor soiuri are importanță în realizarea vinurilor de calitate. Există în jur de 5000 de genotipuri de viță de vie pentru care există 24 000 de denumiri. Pentru identificarea acestora s-au utilizat markeri microsateliți.

Identificarea plantelor horticole

Identificarea genotipurilor horticole are o importanță considerabilă. Plantarea unei livezi cu un alt genotip decât cel dorit va avea repercusiuni financiare de durată (greșeala poate fi observată doar după câțiva ani).

Confuzia în ceea ce privește soiurile de măr a fost ușor eliminată prin utilizarea markerilor RAPD.

4.5 ANALIZA FILOGENETICĂ A PLANTELOR CU AJUTORUL TEHNICILOR MOLECULARE

Analiza filogenetică presupune definirea evoluției plantelor. Populațiile de plante din zilele noastre sunt grupate în încercarea de a defini dezvoltarea lor din grupe taxonomice ancestrale.

Clasificarea din punct de vedere sistematic este bazată pe o presupusă relație filogenetică. Înțelegerea relațiilor genetice dintre plante pe baza informațiilor taxonomice poate furniza detalii cu privire la potențialul resurselor genetice ce pot fi utilizate ulterior în încrucișare sau pentru izolarea de gene utile. Datele care definesc distanțele genetice dintre grupurile taxonomice sunt deseori prezente sub forma unui complex de asemănări și deosebiri. Aceste date stau la baza generării arborilor filogenetici și la stabilirea căilor de evoluție a plantelor superioare.

Analizele filogenetice pot fi efectuate pornind de la toate tipurile de ADN din celulă.

Analiza ADN-ului mitocondrial

Genomurile vegetale mitocondriale sunt mari și variate ca mărime comparativ cu cele animale (între 100 și 2 500 de kb). Datorită prezenței în copii multiple, genomul mitocondrial este o sursă abundentă de ADN, utilă pentru determinarea relațiilor filogenetice.

Astfel, analiza RFLP a genomului cloroplastic, mitocondrial și nuclear la două specii de orez sugerează că genomul mitocondrial și nuclear au o evoluție similară în timp ce variabilitatea cloroplastului a fost la jumătate comparativ cu primele două.

Primele studii au utilizat RFLP pentru a investiga variația genelor mitocondriale. Mai recent pentru compararea genelor mitocondriale a fost utilizată secvențializarea directă a genelor amplificate cu ajutorul PCR-ului.

Variațiile la nivelul ratei de evoluție a diferitelor gene mitocondriale facilitează analiza filogenetică pentru orice nivel particular. De exemplu, genele ribozomale din mitocondrii pot fi utilizate în analize filogenetice. Astfel, originea geografică a speciilor sălbatice înrudite cu arborele de cauciuc cultivat a fost indicată de analiza RFLP a ADN-ului mitocondrial. Analize similare a ADN-ului cloroplastic arată un polimorfism scăzut.

Analiza genelor cloroplastice

Cloroplastele au un genom propriu, prezent în copii multiple (120-220kb), care la rândul lui poate fi utilizat pentru estimarea diferențelor genetice.

Analiza genomului cloroplastic permite evaluarea diferitelor grupe taxonomice datorită ratei mai mici de evoluție a cloroplastului. Subunitatea mare a ribuloz 1,5 bifosfat carboxilaza și subunitățile  și  ale ATP- azei au fost utilizate intens pentru estimarea relației genetice.

Genele ribozomale din cloroplaste sunt similare celor procariote și sunt foarte utile de asemenea în analizele filogenetice. Genomurile cloroplastelor fiind înalt conservate fac mai ușoară compararea prin omologie. Analiza RFLP a ADN-ului cloroplastic este utilă în diferențierea speciilor în interiorul genului.

Analiza genelor nucleare

Genomurile nucleare la plante sunt mult mai mari (108-1011 pb) comparativ cu cele ale organitelor celulare și furnizează o gamă variată de gene pentru analize. Genomurile plantelor variază în mărime de până la 1500 de ori. Analiza genomurilor nucleare poate implica compararea locilor specifici, aranjarea locilor de-a lungul cromozomului și distanța dinte cei doi loci. Analiza genelor nucleare la plante furnizează o gamă largă de opțiuni pentru investigarea diferențelor genetice incluzând analiza diferențelor de secvență la nivelul unor loci specifici sau analiza diferențelor în aranjarea genomului.

Multigenele cum ar fi cele care codifică ARN ribozomal sunt foarte utile în analizele filogenetice datorită prezenței secvențelor înalt conservate și a numărului mare de copii (detecție mai bună, permite o detectare precisă a acestor loci în diferite grupe taxonomice).

Cele mai studiate secvențe ale genelor ribosomale sunt spațiile interne transcrise. Deoarece pot să apară mai multe secvențe de acest tip la o specie, este foarte important ca la toate speciile analizate să se analizeze același tip de secvență. Aceste investigații se bazează pe tehnica PCR.

Analiza filogenetică utilizând RAPD

RAPD permite obținerea unui număr mare de rezultate foarte ușor. Se presupune că au origine nucleară dar nu întotdeauna este așa. Variația detectată sugerează că această metodă este utilă în analiza speciilor sau a varietăților, cel mult la nivel subgenic. Markerii RAPD au fost utilizați pentru analiza populațiilor de arbori de cacao.

4.6. UTILIZAREA TEHNICILOR MOLECULARE ÎN MANAGEMENTUL FLOREI SPONTANE

Markerii moleculari pot fi utili în managementul populațiilor de plante reprezentate din specii pe cale de dispariție sau nedorite.

Conservarea speciilor pe cale de dispariție

Înțelegerea variației genetice a speciilor pe cale de dispariție poate fi un instrument important în managementul supraviețuirii și diversității genetice. Relațiile dintre populațiile izolate geografic poate indica mărimea izolării genetice și strategiile de conservare a variațiilor în populațiile de plante din flora spontană. Introducerea, într-un anumit areal de noi indivizi, de către om, poate fi administrată în așa fel încât să protejeze identitatea genetică a locului. Uneori o populație izolată geografic poate fi unică și justifică măsurile de conservare, în timp ce în alte cazuri analizele moleculare pot să sugereze că populația nu este suficient diferențiată pentru a necesita o protecție specială. Ocazional speciile considerate rare pot fi identificate cu ajutorul markerilor ca fiind hibrizi între două specii comune.

Clasificarea speciilor pe cale de dispariție în patru categorii poate fi realizată prin analize cu markeri moleculari astfel: specii dispărute, pe cale de dispariție, vulnerabile, rare.

Speciile considerate rare indică o variație genetică scăzută. Fragmentarea populațiilor din flora spontană poate duce la pierderea diversității genetice datorită reducerii fluxului de gene între populațiile rămase și a creșterii driftului genetic. Scăderea diversității genetice va lăsa populația mai puțin echipată în fața presiunii genetice exercitată de schimbările de mediu și conduce în final la extincție.

Tehnicile moleculare pot fi utilizate pentru a monitoriza aceste procese prin evaluarea pierderii alelelor rare și a nivelului de heterozigoție în populație. Analizele moleculare furnizează un instrument important în caracterizarea biodiversității.

Identificarea regiunilor bogate în genotipuri endemice prezintă un important pas spre conservarea habitatelor și un management corect care să reducă extincția speciilor.

Analiza moleculară a speciilor reduse din punct de vedere numeric poate fi un instrument esențial în asigurarea supraviețuirii lor. În cazuri extreme, în care din populația respectivă nu mai există decât un individ, analiza filogenetică a relației cu alte specii este singura posibilitate de analiză. Aceasta indică unicitatea și valoarea conservării acelei specii. Dacă există mai mult de un individ este posibilă analiza structurii genetice a populației. Aceasta va indica dacă indivizii sunt clone sau există o variație genetică. Dacă toți indivizi sunt identici din punct de vedere genetic, opțiunile sunt asemănătoare cu cele în care în care există un singur individ. Dacă există o variație genetică cât de mică analizele moleculare vor indica strategiile prin care variația moleculară poate fi conservată.

Controlul buruienilor

Buruienile sunt plante nedorite care frecvent își au originea în exteriorul mediului în care au devenit o problemă. Originea geografică a speciilor de buruieni poate fi stabilită prin metode moleculare pentru a compara populația de buruieni cu alte posibile populații sursă. Această abordare poate fi utilă în atragerea agenților de control biologici (insecte și alți patogeni) pentru anumite genotipuri de buruieni. Variația genetică în populația de buruieni poate fi utilizată pentru a stabili frecvența sau numărul de indivizi noi sau de genotipuri.

4.7. IDENTIFICAREA PATOGENILOR LA PLANTE

Performanțele scăzute ale unor soiuri se datorează unor factori multipli: condiții de mediu nefavorabile, nutriție necorespunzătoare, boli sau dăunători. Simptomele bolilor cauzate de virusuri, bacterii, ciuperci sau nematozi pot fi confundate cu cele rezultate în urma condițiilor nefavorabile de mediu. Cu ajutorul metodelor moleculare se pot identifica aceste tipuri de variații cât și tipul de patogen.

Există o gamă largă de metode moleculare ce pot fi utilizate pentru identificarea patogenilor. Tehnici precum analiza genelor ce codifică ARN ribozomal, analiza ADN plasmidial, RAPD, electroforeza în câmp electric pulsatoriu, urmată de secționarea cu endonucleaze de restricție, pot fi utilizate pentru identificarea microorganismelor.

Analizele moleculare efectuate asupra unei plante atacate de patogeni trebuie să facă distincție la nivel molecular între plantă și patogen. Exemple: sonde marcate ; metode pe bază de PCR; RAPD; analiza genelor ribozomale; analiza PCR a virusurilor la plante.

4.8. ALTE APLICAȚII

Compoziția alimentelor

Analiza compoziției alimentelor are o aplicabilitate comercială deoarece permite verificarea ingredientelor ce apar pe etichetă.

Contaminarea alimentelor cu specii toxice sau care conțin substanțe antinutriționale sau care cauzează alergii este o informație necesară pentru consumatori. Analizele moleculare au capacitatea de a detecta prezența unor specii nedorite în cantități infime.

Detectarea indivizilor care au suferit variații somaclonale în timpul micropropagării

Metodele moleculare pot fi folosite pentru analiza plantelor multiplicate in vitro pentru a elimina indivizii cu probleme. Cultura in vitro în cazul unor citrice determină frecvent apariția unor indivizi fără valoare comercială.