Biodiversitatea Microflorei Lactice Prezenta In Unele Produse Alimentare Si Tehnici de Determinare a Acesteia

REZUMAT

Bacteriile lactice sunt un grup de microorganisme înrudite care sunt extrem de importante în produsele alimentare și în industria băuturilor. În general, fiind considerate sigure pentru consumul uman (în cazul probioticelor, chiar benefice pentru sănătatea umană), bacteriile lactice au fost folosite de secole și continuă să fie utilizate în întreaga lume la scară industrială, în procesele de fermentație alimentară, inclusiv iaurt, brânzeturi, carne și legume fermentate.

Bacteriile lactice sunt, de asemenea, folosite în producerea de siloz și alte furaje pentru animalele agricole. Clinic, ele pot îmbunătăți starea de sănătate digestivă la animalelor tinere, și au, de asemenea, aplicabilitate în medicina umană.

În prezenta lucrare s-a descris biodiversitatea bacteriilor lactice în diferite produse alimentare din diferite zone geografice și tehnici de determinare a prezenței lor în aceste produse.

Descrierea compoziției microflorei prezente în produsele alimentare, în special produsele lactate, se bazează pe abordarea culturii independente, care promite oportunități unice de apreciere a diversității speciilor procariote prin analiza ribozomală a genelor ARN-ului din populațiile mixte.

Cuvinte cheie: bacterii lactice, biodiversitate, microfloră, produse lactate, genomică

The lactic acid bacteria (LAB) are a group of related micro-organisms that are enormously important in the food and beverage industries. Generally regarded as safe for human consumption (and, in the case of probiotics, positively beneficial to human health), the LAB have been used for centuries, and continue to be used worldwide on an industrial scale, in food fermentation processes, including yoghurt, cheeses, fermented meats and vegetables. They are also important to the brewing and winemaking industries.

The LAB are also used in producing silage and other agricultural animal feeds. Clinically, they can improve the digestive health of young animals, and also have human medical applications.

In this study has been described lactic bacteria biodiversity in different food products from various geographic areas and techniques for determining their presence in these products.

Microflora composition description present in food products, especially dairy, is based on independent cultural approach, which promise unique opportunities to discover the diversity of prokaryotic species through ribosomal RNA genes analysis from mixed populations.

Key words: lactic acid bacterial, biodiversity, microflora, milk products, genomics

CUPRINS

INTRODUCERE

Alimentele fermentate reprezintă aproape o treime din dieta obijnuită a oamenilor din toate regiunile globului (Campbell-Platt). Cele mai mari cantități de produse fermentate se obțin în Europa, America de Nord și sudul Africii. Există o mare diversitate în ceea ce privește tipul produselor fermentate consumate în diferite regiuni: în America de Sud și Orientul Mijlociu se consumă în special băuturi si produse lactate fermentate; în India cele mai căutate produse fermentate se obțin din cereale și legume (exemple: dosa, idli, adai, vada și papadum); în Asia sunt foarte populare produse pe bază de pește și legume care sunt foarte bogate în proteine, precum și produsele pe bază de cereale obținute prin fermentare în amestec cu legume (exemple: miso preparat din orez sau orz și soia; sosul de soia preparat din grâu și boabe de soia). În afară produselor tradiționale, specifice diferitelor zone, există o serie de produse fermentate, precum vinul, berea, brânzeturile sosul de soia , miso, etc care sunt consumate și apreciate în toată lumea.

Explozia demografică a atras după sine, în mod inevitabil, creșterea necesarului de ingrediente alimentare, precum și necesitatea diversificării produselor, găsirii unor metode sigure de conservare și a unor practici culinare inovative. Astfel, pe lângă produsele fermentate și băuturile alcoolice cunoscute în întreaga lume, care se obțineau în mod natural prin fermentație spontană cu ajutorul microorganismelor indigene, s-au dezvoltat foarte mult tehnologiile bazate pe folosirea culturilor starter (fermentație controlată).

La ora actuală cele mai consumate produse fermentate sunt produsele lactate, băuturile și produsele pe bază de cereale. Pe langă acestea se înregistreaza și consumul anual important de produse fermentate pe bază de carne, pește, legume și în general leguminoase.

Produsele fermentate sunt considerate a fi sigure pentru consum, datorită caracterului lor acid (alimente cu pH scăzut obținute prin fermentație lactică; exemple: iaurt, gundrunk, kimchi), alcalin (alimente cu pH ridicat, precum kinema, dawadava și pidan) sau alcoolic ( bere, vin sake sau pulque) care a permis clasificarea lor ca produse 3A sau A3.

CAPITOLUL I

1. ISTORIA BACTERIILOR LACTICE ÎN ALIMENTELE FERMENTATE

1.1. Considerații generale asupra bacteriilor lactice

Bacterile lactice au fost utilizate din cele mai vechi timpuri pentru obținerea de alimente fermentate din lapte, carne și produse vegetale. Fermentația lactică se utilizează în mod convențional pentru procesarea și conservarea unei mari cantități de hrană. Aceste produse alimentare au un pH scăzut ca rezultat al formării acidului lactic și altor acizi organici care limitează dezvoltarea organismelor de alterare și patogene. În plus, fermentația lactică contribuie la îmbunătațirea texturii produselor, asigură formarea unor compuși de aromă și permite îmbunătățirea valorii nutritive a produsului final.

Conform noilor concepte moderne privind extindere producerii pe scară largă a alimentelor funcționale, numeroși oameni de știință, pediatri, fiziologi și nutriționiști consideră diferitele produse vegetale fermentate ca fiind produse din aceasta categorie, ce beneficiază de activitatea biochimică complexă a culturilor de microorganisme, între care speciile dominante sunt bacteriile lactice. Numeroase studii au demonstrat că prin consumul de produse fermentate derivate din cereale se pot obține beneficii majore pentru sănătate. Acestea sunt induse atât de celulele microbiene, care ingerate și menținute viabile induc modificări și influențe pozitive în mediul intestinal, cât și de metaboliți formați prin activitatea lor fermentativă în cursul procesării materiilor prime.

Incidența bacteriilor lactice în produsele alimentare derivă din prezența lor în mod natural în microbiota specifică unor materii prime de origine vegetală (cereale, fructe, legume) sau animală (lapte, carne), de unde ajung în produsele alimentare, sau prin utilizarea lor deliberată, în calitate de ingrediente alimentare, sub formă de culturi starter artizanale sau comerciale. În ambele cazuri, prin controlul și dirijarea activității metabolice a bacteriilor lactice, se obțin efecte benefice cu implicații în tehnologia produselor fermentate, pentru diversificarea, îmbunatațirea calității și conservarea acestora, precum și pentru asigurarea rolului lor de alimente funcționale.

Pe de altă parte, bacteriile lactice sunt în mod natural colonizate în microbiota tractului gastrointestinal și gineco-urinar al omului și animalelor. În aceste habitate, bacteriile lactice sunt considerate componente esențiale ale microbiotei indigene, jucând un rol important în inducerea stării de sănătate, cu efecte probiotice, funcționale, imunomodulatoare, și creșterea rezistenței față de acțiunea negativă a patogenilor.

Bacteriile lactice reprezintă un grup heterogen de microorganisme cu proprietăți metabolice comune, dintre care se evidențiază în principal capacitatea de a produce acid lactic ca produs principal al fermentatiei lactice a glucidelor simple.

Grație flexibilității metabolismului lor, bacteriile lactice pot metaboliza glucidele simple prin fermentație homolactică, când acidul lactic este unicul produs final al fermentației lactice, sau prin fermentație heterolactică, când pe lângă acid lactic se formează și acid acetic, alcool etilic, dioxid de carbon și acid formic (Kleerebezem și Hugenholtz, 2003).

Prin potențialul lor enzimatic, bacteriile lactice contribuie totodată la definirea caracteristicilor senzoriale, nutritive și reologice ale produselor alimentare fermentate, și, în plus, au importante contribuții pentru îmbunatățirea inocuității, stabilității microbiologice și în asigurarea siguranței alimentare.

Grație beneficilor tehnologice și pentru creșterea calității vieții și a sănătății populației, induse de utilizarea bacteriilor lactice, studiile privind taxonomia, fiziologia și genetica acestor microorganisme au căpătat o amploare deosebită în ultimii 25 de ani (Gasson și de Vos, 2004).

Bacteriile lactice fac parte din microbiota specifică materiilor utilizate în panificație, iar în timpul procesării diversitatea calitativă și cantitativă a speciilor este influiențată de:

Caracteristicile calitative și cantitative a microbiotei materiilor prime;

Capacitatea bacteriilor de adaptare la relațiile de competiție sau de simbioză între specii;

Condițiile de procesare și modul în care acestea influențează viabilitatea și activitatea fiziologică a bacteriilor lactice.

La nivel global, în secolul trecut, multe microorganisme au fost izolate și
caracterizate din alimente fermentate în mod tradițional. Bacteriile lactice au primit o atenție considerabilă de la industriile farmaceutice și cele alimentare datorită potențialului biotehnologic. Bacteriile lactice au un rol esențial în industria de prelucrare a laptelui, din cauza nivelurilor ridicate de consum uman din mai multe alimente fermentate importante, în principal de brânză și lactate fermentate. Cel mai important bacterii lacice aparțin genurilor Lactococcus mostra non, Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus și Streptococcus care au fost utilizate în mod tradițional în industria alimentară. Numeroase pete de aceste genuri au fost izolate și identificate în produse lactate, produse de boabe, carne și produse din pește, bere, vin, fructe și sucuri de fructe, legume murate, varză murată, siloz, maiele etc. din diferite regiuni, inclusiv Europa, Asia, Africa și America Latină.

1.2. Istoria bacteriilor lactice

Fermentarea este un proces în care modificările chimice sunt aduse în substrat organic prin acțiunea enzimelor produse de microorganisme (Prescott și Dunn 1957; Psoni și colab. 2003). Deși este extrem de dificil pentru a localiza precis începuturile de constientizare a omului prezența și rolul microorganismelor în alimente, dovezile disponibile indică faptul că această cunoaștere a precedat înființarea bacteriologiei și microbiologiei ca domenii ale științei. Exploatarea fermentării în societatea umană are o istorie lungă. Prima dovadă de bere fabricată manual a fost depistată în 7000 Î.Hr în Babilonul Antic (Pederson 1971). La aproximativ 3000 Î.Hr, Sumerienii sunt considerați ca primi mari crescători de animale și lăptari, dar sunt și printre primii care au facut unt. (Tamime 2002). Laptele untul și branza au fost deasemenea utilizate de egipteni înca din anul 300 D.Hr. În China, koumiss are o istorie lungă de utilizare ca băutură populară printre persoanele normade tradiționale. Mai devreme de înregistrări, koumiss apărea în timpul dinastiei Han (202 BC-202 AD) și a atins răspândită popularitate în timpul dinastiei Yuan (1271 AD-1368 AD).

Kircher (1659) a demonstrat prima dată apariția bacteriilor în lapte și acest lucru a fost confirmat de Bondeau (1846) două secole mai târziu. Leeuwenhoek (1680) a fost primul care a observat celulele de drojdie în lapte, dar Pasteur (1857) a fost primul om de știință care arăta că acrirea laptelui a fost cauzată de creșterea microorganismelor din acesta. Pana în secolul secolul XX, termenul de bacterie lactică a fost folosit la organisme pentru acrirea laptelui. Semnificativ, primele culturi pure de bacterii a fost Bacteria Lactis (ceea ce noi numim azi Lc lactis) Lister (1873), Metchnikoff și col. (1907) au izolat-o și denumit-o Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus.

1.3. Produse lactate fermentate

Laptele este unul dintre cele mai importante componente ale regimului alimentar uman din copilarie pâna la bătrânețe (Elmagli și El-Zubeir 2006) și poate fi fermentat de bacteriile lactice și drojdie, pentru a produce alte produse care variază în funcție de gustul lor, constituenți și forme. Este posibil ca originea produselor lactate sa fi fost Orientul Mijlociu și Balcani (Tamime 2002). Astăzi, diverse tipuri de produse lactate fermentate au fost dezvoltate în toate părțile lumii inclusiv Orientul Mijlociu, Africa de Sud, Asia și Europa de Vest. Existau aproximativ 400 nume generice aplicate produselor tradiționale și celor industrializate variind numai de tipul de lapte fermentat (Kurmann și colab. 1992). În ultimii ani, cu avansarea studiilor pe produse lactate, mai multe și mai multe specii de bacterii lactice au fost izolate și caracterizate de produsele fermentate natural anterior necunoscute, în zonele rurale de la distanță. Cele mai importante varietăți de produse lactate din întreaga lume, și de bacterii lactice în cadrul lor sunt, în prezentate în continuare, după cum urmează:

Amasi -este un bine cunoscut acritor pentru laptele de vacă de băut, de obicei de oamenii Zulu din Africa de Sud. Este produs în oale de lut care sunt utilizate în mod repetat pentru a asigura fermentarea spontană a laptelui crud, acesta fermentează natural la o temperatura de 5ºC (Keller și Iordania 1990; Gadaga și colab. 2001). Pregătirea amasi tradițională este similară în alte țări unde laptele crud este turnat în borcane sau vase de piatră. Acesta este apoi fermentat pentru mai multe zile. Amasi este acum disponibilă în centrele comerciale din Africa de Sud. Au fost identificate șapte specii de bacterii lactice izolate în Amasi de către diferiți cercetători (W. Liu și colab. 2014). Studiile lui  Feresu și Muzondo  (1990), au aratat că bacteriile lactice predominante izolate în amasi au fost identificate ca: Lb. helveticus, lb. plantarum, lb. delbrueckii subsp. lactis, lb. paracasei subsp. paracasei și lb. paracasei subsp. pseudoplantarum (Feresu și Muzondo 1990 ).

Biruni este un produs similar cu branză realizat din secolul al XX-lea limitată la zona Munților Nuba din Sudan, deși recent a fost răspândit în mai multe zone locuite de păstori care l-au numit laban-gadim (lapte vechi). Este similar cu misael care este de asemenea produs în Sudan. Biruni are probabil una dintre cele mai lungi perioade de fermentare poate fi depozitat timp de cel puțin 1 an și cel mult zece ani (Salih și colab. 2011). Informațiile despre acest produs sunt rare pentru că vine din regiunea Munțiilor Nuba care este în apropierea unui orasel sfâșiat de razboaie (Abdelgadira și colab. 1998).

Brânza dulce, telemeaua și urda sunt denumirile comune pentru produsele lactate românești (Zamfir și colab. 2006). Făcute din lapte de vacă, capră sau bivoliță, este lăsat peste noapte să fermenteze într-un loc cald (de exemplu, lângă cuptor în casă sau în fermă). În unele cazuri lapte este prima dată fiert pentru câteva minute. A doua zi, stratul superior este colectat ca smântână și restul este utilizat ca laptele fermentat (lapte acru) sau pentru producția de brânză. Pentru aceasta din urmă, laptele acru este încălzit și se adaugă cheag. Alternativ, cheagul poate fi adăugat în lapte înainte de fermentare. Zerul este îndepărtat din laptele acru și brânza este colectată într-o cârpă specială, apoi apăsat și scurs. Aceasta asa numită brânză dulce poate fi consumată imediat. Alternativ, o brânză sărată numită telemea poate fi fabricată. Aceasta poate fi păstrată timp de mai multe luni într-un amestec de apă, zer și sare. De asemenea, o brânză moale din zer, numit urdă, poate fi preparată prin încălzirea zerului la 80-90ºC, apoi urmează colectarea particulelor plutitoare și uscarea acestora. Compoziția de laborator în aceste produse a fost descrisă de Zamfir (2006) și sunt incluse 15 specii. Cea mai frecventă dintre bacterii lactice găsite în România în laptele crud și produsele lactate fermentate (smântâna, brânză etc.), a fost Lc. Lactis.

Chhurpi este o brânză de casă din lapte de vacă sau iac fermentată, produs în statul Indian Sikkim și Nepal. Are o textură ca de cauciuc cu un gust ușor acru. Acest produs lactat fermentat tradițional este mai puțin cunoscut, deoarece este limitat doar la gospodăriile individuale. În timpul producției, laptele este fiert 15 minute până când un strat alb este format care este strecurat apoi printr-o cârpă, iar zerul este eliminat. Așa este produs un chhurpi moale, care este mâncat cu curry sau ca o supă (Dewan
și Tamang 2007). Când chhurpi este păstrată într-un vas închis pentru aproximativ 15 zile sau mai mult, produsul este numit somar fermentat care este puternic aromat. Este moale, dar amară, este consumată ca supă alaturi de orez fiert sau mei în Sikkim și Nepal. Au fost izolate și identificate 128 de bacterii lactice: Lb. bifermentans, Lb. paracasei subsp. pseudoplantarum, Lb. Chefir, Lb. hilgardii, Lb. alimentarius, Lb. paracasei subsp. paracasei, Lb. plantarum, Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris și E. faecium din acele produse lactate colectate din locuri diferite din India, Nepal și Bhutan.

Ventilatorul lactat (Dairy fan) -este de asemenea numit "rusan" sau "ruxian" în limba chineză din cauza formei sale unice de ventilator. Este un produs similar cu brânză făcut din lapte de vacă și consumată de oamenii Bai o minoritate etnică din provincia Yunnan și în sud-vestul Chinei. Compoziția chimică și cantitatea resurselor proprii și valoarea nutrițională au fost evaluate de către Liu (2011). Ventilatorul este produs prin adaugarea unui suc acidulat în lapte și apoi încalzit. Liu (2009) a izolat 91 de tulpini de bacterii lactice de la 20 de probe de ventilator. Acestora le-ar putea fi atribuite 12 specii sau subspecii pe baza caracteristicilor sale fiziologice și biochimice, si analiza secvenței de gena ARNr 16S. Lactobacillus helveticus și lb. fermentum erau speciile predominante în ventilator.

Dahi -este un nume local din Nepal pentru un preparat din lapte de vacă produs în gospodăriile locale pentru consumul direct sau pentru prelucrarea ulterioară în alte prduse lactate. Pentru prepararea acestui dahi prima dată este fiert laptele proaspăt de vacă într-un vas. După fierbere este lăsat la răcit la temperatura camerei și o cantitate mică dintr-un dahi deja făcut se adaugă peste el și apoi se lasa 1-2 zile pe timp de vară, și 2-4 zile pe timp de iarnă, într-o cameră cu temperatura normală, până fermentează. Dahi tradițional este consumat cu orez fiert sau orez bătut, de către oamenii din Nepal.

Gariss este un pordus lactat unic din familii tradiționle Sudaneze din lapte de cămilă făcut într-un prces semi-continuu de fermentare. Cuvântul Gariss înseamnă "prinzând" sau "ciupind", indicând un grad ridicat acrire. Fermentarea se face în două pungi de piele tăbăcită de capră încorporate în ceva verde sau iarbă umedă efectuata pe spatele cămilei. În acest mod, laptele este supus la tremur continuu rezultat prin mișcarea cămilei. Ori de câte ori o parte a produsului este retrasă pentru consum, alt lapte proaspăt de camilă este adăugat până la volumul inițial. Acest proces de producție descris de Salih (2011) este similar cu procedura utilizată pentru producerea de koumiss tradițional de către nomazii Mngoli din China. Bacteriile lactice din compoziția Gariss include mai mult de 10 specii izolate din produse lactate. Specia cea mai dominantă din genul Lactobacillus, dintre care: grupul Lb paracasei. Lb. grupul, Lb. fermentum, Lb. plantarum și Lb. raffinolactis. Speciile dominante de coci sunt: Lc. lactis, Enterococcus spp. și Leuconostoc spp. (Sulieman și colab. 2006; Abdel Moneim 2006; Hassan și colab. 2008; Ashmaig și colab. 2009).

Gibna (brânză) produsă din diferit lapte crud (inclusiv lapte de bivoliță și vacă) din Sudan, a început în secolul al optsprezecelea, pornite de la familii de greci care au migrat în Sudan. Producerea Gibnei este o metoda de conservare importantă pentru surplusul de lapte din zonele rurale. Principalele tipuri de brânză sunt Gibna Bayda și Gibna Mudaffara (El-Sheikh 1997; Hamid și El-Owni 2007) și variază în funcție de compoziție, consistență, culoare, gust, aromă, tipul de ambalaj și activității microbiene în timpul coacerii (Salih 2011). Gibna bayda este unică deoarece conține concentrații ridicate de sare care sunt adăugate în lapte înainte de procesare pentru a preveni deteriorarea rapidă înainte de coacere (Taormian 2010). Procesul de producție a fost revizuit de Salih (2011). Bacteriile lactice și alte bacterii naturale prezente în laptele crud execută procesul de fermentare și astfel nu este nevoie de altceva (Abdel și colab. 1998; El-Owniand Hanmid 2008). Lb. delbrueckii subsp. thermofilus, lb. casei și S. mutans era cea mai comună microfloră din aceste produse (Ahmed 1997).

Gouda este o brânză gălbuie numită după orașul Gouda din Olanda și este una din principalele soiuri de brânză de tip olandez produsă în întreaga lume (Walstra și colab. 1993). Este un semi-brânzet fabricat din lapte de vacă, deși laptele de oaie și capră poate fi de asemenea utilizat (Van den Berg 2000). Maturarea acestui tip de brânză are loc 1-20 luni timp în care trece de la moale la tare și poate fi consumată în orice etapă de maturitate în funcție de caracteristicile produsului cerut, preferințele consumatorilor și factori economici (Walstra și colab. 1993). Au fost zece specii de bacterii lactice izolate și identificate în acest produs (W, Liu și colab. 2014).

Chefirul este un alcool care conține lapte din țările caucaziene precum Rusia Armenia, etc., fermentat cu drojdie și bacterii lactice. Culoarea acestui produs este alb sau gălbui și textura este destul de groasă, dar nu lipicioasă, cu o consistență elastică (Tamime 2006). Conform standardelor poloneze compoziția microscopică trebuie să fie de 80% Lactobacillus spp., 12% drojdie și 8 % Lactococcus spp.. Compoziția de bacterii lactice raportată include peste 30 de specii sau subsp. și 24 de specii de drojdie (Tamime 2006). Pseudomonas spp. și E. coli au fost de asemenea detectate în chefir de DGGE (Chen și colab. 2008).

Koumiss este produs din lapte de iapă care a fost în mod natural fermentat cu bacterii lactice și drojdie și este făcută la sud de Rusia, Mongolia și nord-vestul regiunilor din China. Au fost înregistrate 62 de specii sau subspecii de laborator koumiss. Bacteriile lactice izolate, raportate includ patru specii de Enterococcus, 45 specii sau subspecii de Lactobacillus, patru specii de Lactococcus, patru specii de Leuconostoc, două specii de Streptococcus și trei specii de Weissella (Burentegusi 2002; Uchida și colab. 2007; Watanabe și colab. 2008).

Kule naoto este un produs tradițional din lapte fermentat produs de membrii unui trib Maasai din Kenya. Este spontan fermentat din lapte crud de vacă. Laptele este tratat în prealabil prin adăugare de sânge proaspat de vacă, înainte de inițierea procesului de fermentare (Mathara și colab. 2004, 2008). Șapte specii de bacterii lactice au fost izolate din produsele fermentate. Alte studii ulterioare au arătat că compoziția de bacterii lactice din Kule naoto era 55% din genul Lactobacillus, 14% din Lactococcus, 25% din Enterococcus și 6% din Leuconostoc. Lactobacillus plantarum era predominant și a constituit 60% din speciile Lactobacillus prezente (Mathara și colab. 2004).

Kurut este un produs tradițional din laptele de iac fermentat natural, este unul din produsele alimentare a oamenilor din Tibet și a regiuni autonome din China. De asemenea este consumat de oameni din Qinghai, Gansu și Sichuan, provincii din China. Au fost izolate 19 specii de bacterii lactice, speciile predominante au fost S. thermophilus, Lb. helveticus, Lb. fermentarum și S. thermophilus în provincia Sichuan, Provincia Gansu, Tibet, Regiunii Autonome și respectiv Provincia Qinghai din China, (Sun și colab. 2010; Bao și colab. 2010, 2011; Liu și colab. 2009).

Misael este un produs din lapte de vacă fermentat atât în statul Darfur din vestul Sudanului dar și în Egipt. Deși de cele mai multe ori este asociat cu Sudan, a fost introdus și în Egipt (Abdelgadira și colab. 1998). Metoda de pregătire a misael la Darfur este mai similară cu cea din Egipt. Misael este produs prin fierberea laptelui apoi răcire și inoculând cu o cantitate mică de la un lot precedent. După acrire, semințe de chimen negru (Nigella sativa) și schinduf (Trigonella foenum graenum) sunt adăugate. Uneori, câtiva păstăi verzi sau ardei roșu sunt de asemenea adăugați. Produsul este fermentat pentru încă două sau mai multe zile înainte de consum (Dirar 1993).

Prăjitură cu lapte este o brânză fermentată tradițional din lapte de capră și este consumată de minoritățile din provincia Yunnan din China. Valoarea nutritivă a laptelui de capră este foarte mare și include vitamine și o diversitate de oligoelemente (Chen și colab. 2009). Bacteriile lactice (de la 8.32 x 1010 CFU/g la 10.16 x 1010 CUF/g) și drojdia (de la 1,06 x 1010 CUF/g la 6.15 x 1010 CUF/g) erau microorganisme predominante în prăjitura cu lapte (Bao și colab. 2011). În total, 76 tulpini de bacterii lactice au fost izolate din 13 probe de prajitură cu lapte și atribuite la 9 specii. Lactococcus lactis subsp. lactis și Lc. garvieae au fost cele mai abundente specii de bacterii lactice în prajitura cu lapte din Yunnan.

Nunu este un fel de iaurt pregătit și consumat de Fulani, oameni din Ghana. Nunu este prelucrat din lapte de vacă proaspăt în cauciuc sau găleti prin fermentarea spontană. Metoda de producție a acestui prdus fost descrisă în literatura de specialitate de Akabanda și colab. (2010). Bacteriile lactice predominante, includ diferite specii de Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus și Streptococcus.

Philu este o cremă de lapte produs din lapte de vacă sau iac și este de obicei gătită și consumată ca o delicatețe cu orez fiert în Bhutan și statul Indian Sikkim. În timpul pregătirii philu-lui, lapte proaspăt este colectat în vasele de lemn sau de bambus cilindrice și încet se învârtea în jurul peretiilor vaselor pentru 5-10 min. În acest timp, o masă cremoasă începe să se lipească de pereții vaselor. Restul de lichid este turnat oprit și lichidul rămas se scurge. Acest proces este repetat zilnic pentru 6 – 7 zile până când un strat gros, alb cremos este format pe interiorul pereților vaselor. Este depozitată apoi la loc uscat pentru consum. Philu produs din lapte de vacă este de culoare albă cu o textură de unt și puțin insipidă la gust, în timp ce philu produse din lapte de iac este mai alb, cremos cu o semi-textura solida. Philu este un produs din lactate tradiționale vândute în piețele locale din Sikkim și Bhutan.

Qula este un tip de brânză din lapte de iac cu un aspect granulat, tare și galben, din Tibet și China. Procesul de a face brânză Qula prin metodele tradiționale din Tibet a fost descrisă de Duan si colab. (2008). Bacterile lacice, au fost cel mai important grup de microorganisme în Qula, fiind reprezentate de 15 specii sau subspecii identificate in laborator, Lb. helveticus a fost predominant.

Rob, cunoscuta și ca mantie, este produs în gospodăriile rurale din Sudan prin fermentarea laptelui de vacă, oaie sau capră. Surplusul de lapte este colectat într-un recipient, inoculat cu o monstra din rob, din ziua precedentă și lasat să fermenteze peste noapte. Procesul de fermentare începe de obicei seara, când animalele se întorc de la pășuni și rezultatul acru este produs dimineața când animalele pleacă la pășuni. Proaspăt produs, rob are un gust plăcut cu un pH de aproximativ 4,5. Literatura timpurie de Sahaf (1981) și El Mardi (1988) a arătat că S. thermophilus, lb. thermofilus, lb. helveticus, lb. fermentum și Lc. lactis au fost cele mai comune specii de bacterii lactice în rob. (Hamza și colab. 2009) au identificat și Lb. delbreuckii subsp. thermofilus, Lb. rhamnosus, Lb. plantarum, Lb. casei și Lb. pentosus utilizând API 50CHL și A. viridians, E. faecium, E. Gallinarum, Lc lactis lactis sub sp., Leuconostoc sp., S. acidominimus și S. bovis utilizând API 20 STREP. Rezultatele au fost confirmate prin Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD).

CAPITOLUL II

2. BIODIVERSITATEA BACTERIILOR LACTICE

2.1. Taxonomia, morfologia și fiziologia bacteriilor lactice

Caracterizate ca fiind bacterii facultativ anaerobe, Gram pozitive, nesporulate, catalazo-negative și acido-tolerante, lipsite de mobilitate, cu celule de formă cilindrică (bastonas) sau sferică (coccus), cu excepția câtorva specii, majoritatea bacteriilor lactice au fost certificate ca fiind microorganisme din categoria GRAS (Generally Recognized as Safe).

Grupul bacteriilor lactice include specii aparținand, în principal, genurilor consactrate, Lactobaciullus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Oenococcus, Enterococcus și Leuconostoc, însă o serie de noi genuri sunt citate în literatură ca aparținând acestui grup.

Taxonomia bacteriilor lactice este permanent revizuită. În mod tradițional, clasificarea taxonomică a bacteriilor lactice se realizează în funcție de caracterele morfologice (culturale sau microscopice) și proprietăți fiziologice, precum: spectrul și modalitatea de fermentare a glucidelor simple, capacitatea de a se dezvolta la anumite temperaturi, tipul de acid lactic produs, capacitatea de a crește în medii cu NaCl, toleranța la aciditate sau compoziția peretelui celular.

În funcție de partucularitățile biochimice și fiziologice, au fost stabilite 3 grupuri taxonomice, și anume:

Grupul A – bacterii lactice strict homofermentative – care au capacitatea de a fermenta hexozele pe calea Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) cu producerea de acid lactic (85%). Au capacitatea de a fermenta deasemenea fructoza, dar nu transformă nici gluconatul, nici pentozele.

Grupul B – bacterii lactice facultativ heterofermentative – care fermentează complet hexozele, cu formare de acid lactic pe calea EMP. Transforma pentozele în acid lactic și acid acetic, grație prezenței unei fosfoketolaze indusă.

Grupul C – bacterii lactice strict heterofermentative – care fermentează hexozele cu formare de acid lactic, acid acetic, etanol și dioxid de carbon și transformă pentozele în acid lactic și acid acetic, în ambele cazuri fiind implicată enzima fosfoketolaza.

În funcție de unele particularități filogenetice și structura peretelui celular (aranjarea murinei), la cele trei grupuri s-au afiliat înca trei subgrupuri, și anume:

Grupul a – grupul Lb. delbrueckii

Grupul b – grupul Lb. casei/Pediococcus ssp.

Grupul c – grupul Leuconostoc ssp.

În realitate, bacteriile lactice prezintă o diversitate metabolică și genetică deosebită, ceea ce face imposibilă separarea în grupuri clar delimitate.

2.2. Bacteriile lactice din lapte și produsele lactate

Denumite și “bacterii folositoare”, ele asigură fermentația lactică în urma căreia lactoza trece în acid lactic. În paralel cu formarea de acid lactic, crește aciditatea laptelui, ceea ce conduce la cuagularea cazeine, deci, la “prinderea” laptelui.

Bacteriile lactice aparțin Familiei LACTOBACTERIACEAE, care are 2 subfamilii:

STREPTOCOCCACEAE, cu 2 genuri:

genul STREPTOCOCCUS. Speciile S. lactis și S. cremoris generează aciditatea spontană și naturală a laptelui, până la nivelul de 120-150˚T. Aceste specii se dezvoltă în intervalul termic 10 – 40˚, cu maxim de activitate la 30 – 35˚C. Specia S. thermophylus este prezentă în iaurt și se dezvoltă începând de la +20˚, dar temperatura optimă este de 40 – 50˚C. Dacă laptele conține speciile S. fecalis și S. liquefaciens, brânzeturile obținute vor avea gustul de “amar”.

genul LEUCONOSTOC, include 2 specii fregvent întâlnite (L. citrovorum și L. paracitrovorum), care asigură aroma caracteristică untului și smâtânii, deoarece concură la formarea de diacetil.

LACTOBACILLEAE, include tot 2 genuri:

genul LACTOBACILLUS, cu 3 subgenuri:

subgenul Thermobacterium – cu bacterii ce se dezvoltă bine la temperaturi de 37 – 60˚C. Speciile T. lactis și T. helveticus se găsesc în brânzeturile Svaiter și Gruyère, specia Lactobacillus bulgaricus intră în microflora iaurtului, iar Lactibacillus acidophyllus este prezentă în laptele acidofil;

subgenul Streptobacterium, include bacterii care se dezvoltă optim la temperaturi de 28 – 32˚C. Cea mai raspandită specie este S. casei întalnită în brânzeturile tari (svaiter); are efect lactozo-fermentativ și acțiune proteolitică, proprietăți foarte importante în fermentația unor sortimente de brânzeturi tari;

subgenul Betabacterium, are ca reprezentant specia Lacobacillus fermenti, întalnită în cheag și în brânzeturile nematurate, dar și în cele maturate;

genul PROPIONIBACTERIUM. Cuprinde bacterii care intervin în maturarea brânzeturilor; ele transformă acidul lactic, hidrații de carbon și alcoolii polivalenți, în acid propionic, acid acetic și bioxid de carbon. Speciile P. shermanii și P. freudenreichii intervin în maturarea șvaițerului. P. rubrum formează în brânzeturi colonii roșii nedorite.

2.3. Incidența bacteriilor lactice în microbiota aluaturilor acide

Importanța deosebită a cerealelor în dietă, precum și beneficiile deosebite pentru sănătate, prin aportul de glucide, proteine vitamine (E și vitamine din grupul B), fibre alimentere fier și săruri minerale, a condus la extinderea gamei de produse de panificație derivate în special din materii prime de bază, grâu, porumb, orez sau orz. Extinderea pe scară largă a producției în industia de panificație, corelată cu cerințele pieței și cu nevoia de diversificare permanentă a gamei de produse, cu proprietăți senzoriale, nutritive și funcționale, a condus la extinderea materiilor prime utilizate (sorg, mei, manioc etc.).

Diversitatea calitativă și cantitativă a microbiotei va depinde însă foarte mult de microbita materiilor prime, de condițiile de procesare și de conducerea proceselor fermentative în sensul stimulării competiției între specii și a proceselor metabolice utile in vitro și in vivo.

Condițiile fizico-chimice create de conținutul de apă liberă, pH, temperatură, concentrația de NaCl și a altor substanțe chimice dizolvate (zahar, aditivi și indrediente etc.) influențează selecția speciilor și funcționalitatea metabolică în aluat.

Bacteriile lactice cele mai frecvent întâlnite în microbiota produselor de panificație aparțin genurilor: Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Leuconostoc și Weissella. Dintre acestea, cele mai frecvent întalnite sunt specii ale genului Lactobacillus (cca. 100 de specii).

Specia Lactobacillus alimentarius, (sinonim cu Lactobacillus paralimentarius) a fost identificată în aluaturi produse în Japonia. Lactobacillus brevis și Lactobacillus plantarum sunt asociate cu Lactobacillus fermentum în microbiota aluaturilor produse în Rusia. Specia Lactobacillus fermentum este dominantă în aluaturi produse în Suedia și Germania. Specia Lactobacillus acidophilus apare fecvent în aluaturi produse în Italia.

Studii recente au evidențiat, în microbiota aluaturilor acide noi specii de lactobacilli și pediococi care au fost asociate unor grupuri de specii cunoscute, și anume:

Lactobacillus acidifarinae, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus spicheri și Lactobacillus zymae, ca membri ai grupului Lactobacillus buchneri;

Lactobacillus mindensis și Lactobacillus nantensis, calsificați în grupul Lactobacillus alimentarius;

Lactobacillus rossiae, specie aparținând grupului Lactobacillus reuteri;

Pediococcus argentinicus, ca o specie nouă a genului Pediococcus.

În procesele fermentative care au loc în aluat, bacteriile lactice heterofermentative joacă un rol major comaparativ cu alte produse fermantate lactic. Astfel, specia Lb. sanfanciscensis (sinonim Lb. Bervis var. lindneri și Lb. sanfrancisco) este considerată cea mai dominantă în aluaturi acide obținute din faină de grâu sau secară. Speciile Lb. brevis și Lb. plantarum sunt deasemenea frecvente în ambele tipuri de aluaturi.

2.4. Perspective moderne de utilizare a bacteriilor lactice în panificație

Cercetăriile moderne privind diversificarea gamei de alimente funcționale derivate din cereale explorează capacitatea substraturilor de a conține compuși cu rol prebiotic (componete chimice nedigestibile, cum sunt fibrele alimentare), colerat cu rolul prebiotic al bacteriilor lactice starter (Salovaara, 2004).

În acest sens, o atenție deosebită se acordă compoziției chimice a fainurilor, proprietățiilor biotehnologice și funcționare ale culturilor starter și, în special, stabilității metabolice și menținerii viabilității culturilor starter probiotice în timpul procesării și păstrării.

Se consideră ca unii constituenți ai făinurilor cum sunt fibrele sau amidonul, au un rol deosebit în protecția culturiilor starter prin încapsularea naturală a celulelor și protecția acestora față de factorii denaturanți.

În optimizarea condiților biotehnologice și selecția culturilor starter, trebuie sa se aibe în vedere condițile de acțiune, atat in vitro, cât și in vivo, și, în special, stimularea activității metabolice, a functionalității în relații simbiotice cu alte culturi utile și menținerea viabilității in vivo (Axelsson, 2004).

Preocuparea actuală pentru obținerea de produse de panificație funcționale, prin utilizarea de culturi starter probiotice de bacterii lactice, reprezintă direcții moderne de cercetare în acest domeniu.

CAPITOLUL III

3. DIVERSITATEA GENETICĂ A BACTERILOR LACTICE

3.1. Biodiversitatea bacteriilor lactice identificate prin abordări Culturi-Dependent

În ultimii 20 de ani, bacteriile lactice au fost deseori izolate și identificate în produse lactate fermentate în mod tradițional. Aceste produse lactate fermentate includ: busa (Turkestan), cieddu (Italia), dadhi (India), chefir (Balcani), kumiss (Stepă) Kurut, (regiuni din hymalaya), laban zabadi (Egipt), mazun (Armenia), taette (N. Europei), skyr (Islanda), masl (Iran), crowdies (Scotia), kuban și iaurt (Miyazaki și Matsuzaki 2008). Studii ale diferitelor tipuri de lapte crud utilizat (inclusiv de vacă, de capră, oaie, camilă, bivolita, și iac) arată o mare diversitate a bacteriei laptelui la nivel de gen și specie. De exemplu, 12 specii diferite de bacterii lactice au fost izolate și identificate în timpul fabricării și depozitarii brânzei Anevato, grăsime tartinabilă greacă, brânză din lapte de capră sau de oaie: trei specii au fost din genul Lactococcus (Lc. lactis, Lc. garviae, Lc. raffinolactis), trei specii au fost din genul Leuconostoc (Leuc. mesenteroides, inclusiv subspecii mesenteroides și dextranicum, Ln. paramesenteroides și Leuc. lactis) și șase specii au fost din genul Lactobacillus (Lb. plantarum, Lb. coryneformis, Lb. paracasei, Lb. brevis, Lb. viridens bifermentans și Lb viridens).

3.1.1. Bacteriile lactice în Koumiss

Koumiss (cunoscută și ca și koumiss, kumiss, kumys, kumyz, kimiz sau coomys) este o băutură foarte populară consumată în țarile din regiuni din Kazahstan, Azerbaidjan, Turcia (kumye), în China și Mongolia (Tooner 1994). În secolului al șaptelea, koumiss a devenit o băutură zilnică a Mongoliei, de triburi unde, astăzi, produsul este cunoscut ca airag, arrag, irag, chige sau chigo (în limba Mongoliei) (Zhang și Zhang 2012). Koumiss tradițională este produsă din lapte de iapă și în Mongolia este de asemenea produsă din lapte de cămilă. În Europa și America de Nord, un produs similar cu koumiss este produs din lapte de vacă (Mann 1989; Di Cagno și colab. 2004). Microflora izolată din koumiss nu a fost bine definită, dar constă în principal în bacterii lactice și drojdie. Într-adevăr, Saccharomyces unisporus a fost identificat ca principalul patogenic în koumiss tradițional din Kazahstan (Park și colab. 2006). Uneori, bacteriile lacetice au fost de asemenea găsite (Zhang și Zhang 2012; Park și colab. 2006). În ultimii ani, numeroase studii au fost publicate clarificând diversitatea bacterilor lactice izolate și cultivate în culturi pure din koumiss tradițional în China și Mongolia.

3.1.2. Bacteriile lactice în laptele de cămilă fermentat tradițional și în produsele anexe

Cămilele (Camelidae) în principal locuiesc în deșert și semi-regiunile deșertice, cu populații majore distribuite în cadrul Sudanului și alte țări africane, țările Arabe, India, Mongolia și regiunea de vest a Chinei (Jiri și colab. 2009). Din laptele crud de cămilă se produc: lactate proaspete, lapte nepasteurizat, lapte sau laptele fermentat spontan (cum ar fi suusac) este de asemenea o componentă importanta a unei diete zilnice de proteine, se produc în Africa de Est și țări precum Kenya și Somalia (Farah și colab. 2007). În Sudan, laptele proaspat, laptele nepasteurizat de cămilă, și lapte de cămilă fermentat (gariss) sunt larg consumate de comunitățile pastorale care trăiesc în zone aride și semiaride din regiunile țării (Ashmaig și colab. 2009). Lapte de cămilă fermentat este de asemenea popular în China (shubat în limba Hazakh) și Mongolia (hogormag în limba Mongoliei) (Shuangquan și Miyamoto 2004). Primele rapoarte au indicat că componența bacterială din microflora laptelui de cămilă fermentat, a fost dominat de bacteriile lactice, speciile aparținând mai multor genuri diferite. În ultimii ani, în scopul de a îmbunătăți fermentarea spontană și de a dezvolta adecvat producția de mâncare, multe specii de bacterii lactice au fost izolate și identificate de la laptele de camilă, prin diferite instituții de cercetare în diferite țări și regiuni.

3.1.3. Bacteriile lactice din laptele de vacă fermentat tradițional și a produselor acestuia

Istoric, produsele lactate fermentate au apărut în triburile nomade pentru a conserva substanțele nutritive valoroase din lapte crud proaspăt. Cu avansarea civilizației umane și schimbări în stilul de viață, rolul acestor alimente ca unica sursă de nutriție pentru popor nomad a încetat. Cu toate acestea, procesul de fabricare a acestor produse lactate fermentate tradiționale a continuat să fie dezvoltat și transmis din generație în generație în populațiile etnice minoritare din China.

În zilele noastre, multe produse lactate fermentate sunt consumate de minorități etnice din Mongolia, Xinjiang, Tibet și alte provincii din China. Cu toate acestea, după cum vacile sunt, în present, principalele animale domestice din China, laptele de vacă este materia primă importantă pentru a produce o varietate de produse lactate, inclusiv: iaurt, Eedsen Su Aarchi și wurum. Laboratorul cheie de Inginerie si Biotehnologii lactate, Ministerul Educației din China au fost mult timp implicați în izolarea și identificarea bacterilor lactice din produse fermentate tradițional din lapte de vacă. Din 2001 până în prezent, o mare varietate au fost izolate și identificate într-o selecție de diferite zone etnice minoritare de China, Mongolia și Tibet (http://www.bio149.cn/html/labcc.html).

3.1.4. Bacteriile lactice din Kurut și alte produse fermentate din laptele de iac

Iacul este una dintre cele mai vechi specii de bovină din China și distribuite în principal în platoul Qing-tibetană, la o altitudine medie de 4.000 de metri. China are aproximativ 13 milioane de iaci, fiind cel mai mare numar de iaci din lume (Zhang și colab. 2008). China are atât cel mai mare număr de efective iac cât și cea mai mare producție de lapte de iac din lume (Zhu și Zhang 2005). Multe feluri de produse lactate, inclusiv kurut, qula, unt și brânză sunt preparate din lapte de iac și consumate de oamenii tibetani din regiunile platoului Qing-tibetan din China. Kurut este una dintre cele mai importante produse fermentate și se prepara folosind metode de producție tradiționale, raportate de Chen și colab. (2009). Marea altitudine și clima specială a platoului tibetan reprezintă o distinctie ecologica, cu o largă biodiversitate. O asemenea diversitate de specii, inclusiv o diversitate de bacterii lactice, rezultă într-o microfloră foarte specifică asociat laptelui de iac și produselor sale (Li și colab. 2002; Luo și colab. 2005). Aceste diferențe de biodiversitate de bacterii sunt foarte importante în formarea caracteristicilor tipice ale produselor lactate fermentate tradiționale în diferite regiuni. Mai multe studii au raportat compoziția speciilor și a biodiversității bacteriilor lactice în produsele lactate de iac din diferite regiuni din China, inclusive regiune Tibet (Zhang și colab 2008; Airidengcaicike și colab. 2010; Duan și colab. 2008) și provincii din Qihai (Sun și colab. 2010), Gansun (Bao și colab. 2012a) și Sichuan (Bao si colab. 2012b). O predominanță de Lc. helveticus a fost înregistrată în produse de qula și zer din provinciile Gansu și Sichuan. De asemenea, s-au mai înregistrat în kurut din provincia Gansu. Cu toate acestea, speciile predominante din kurut în Sichuan, Qinghai și Tibet au fost Lb. helveticus, S. thermophilus și Lb. fermentum. Alte specii din genurile Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc au fost izolate într-o frecvență redusă. Numărul de specii identificate variază de la unu până la peste 20 în funcție de produs. Modelul de distribuție generală a arătat că predominanța speciilor și biodiversitatea bacteriilor lactice din produse lactate de iac din cele patru regiuni geografice îndepărtate variază substanțial.

3.2. Genomica bacteriilor lactice

Fig. 3.1. Arborele de aderare de secvențe partiale de ADN 16S învecinate arată relațile filogenetice dintre bacteriile lactice de cultură și cele sălbatice (Elaine și colab. 2002).

Datorită importanței lor practice în biotehnologie, agricultură, industrie alimentară și, mai recent, în medicină, bacteriile lactice au fost intens studiate în ultima decadă. Cum era în care traim este era genomicii, eforturile cercetatorilor s-au îndreptat catre secvențierea genoamelor câtorva specii și tulpini de bacterii lactice deținute de cele mai reprezentative colecții de culturi.

În 2001 un colectiv de geneticieni de la INRA și Genoscope – Franța, condus de Alexander Bolotin și Alexei Sorokin, publică primul genom al unei bacteri lactice complet secvențializat, și anume, cel de la Lactococcus lactis subsp. lactis tulpina IL1403.

Până în prezent au fost secvențiate, sau sunt în curs, înca 28 genoame de bacterii lactice sau de bacterii cu proprietăți probiotice asemănătoare acestora. În cadrul programului Genoame Microbiene, 11 genoame sunt secvențiate de Joint Genome Institute (JGI) și Lactic Acid Bacteria Genome Consortium (LABGC) în care sunt implicate, în parteneriate, colective din 7 universități din SUA. Restul de 18 genoame sunt rezultatul cooperării unor institute de cercetare și universități, atât din SUA, cât și din Europa.

Secvențierea genoamelor bacteriilor lactice este strâns colerată cu studierea habitatului lor (lapte, carne, plante, tract intestinal) a rolului lor (probiotic vs fermentativ), cu elucidarea unor importante căi metabolice: biosintetice sau fermentative, astfel încat, toate aceste cercetări conduc către o cunoaștere profundă, holistica acestui grup de bacterii, dar și către o accelerare a comercializari și a exploatări acestora în diverse domenii.

Bacterile lactice sunt bacterii Gram-pozitive care, datorită geoamelor lor relativ mici (2-4 Mb) precum și procentului redus de GC (34-50%), au manifestat o considerabilă adaptare genetică în cursul evoluției, ocupând nișe ecologice foarte diverse. Analizele de genomică comparativă au arătat că genele esențiale, implicate în metabolismul central (gene, house keeping), ca și genele din vecinătatea originii de replicare oriC, sunt bine conservate în evoluție. Astfel, se poate afirma că funcții precum: producerea de acid lactic, activitatea proteolitica, toleranța la stres sau la pH scăzut, producerea de compuși antimicrobieni, transportul trans membranar, sunt funcții comune ce conferă specificitate bacteriilor lactice.

Întelegerea căilor naturale de transfer genetic pe orizontală (transformarea, conjugarea și transducția), mai ales în biotopurile în care bacteriile lactice coexistă, poate explica evoluția, adaptarea bacteriilor lactice precum și potențialele aplicații a acestora în biotehnologie. Secvențele de inserție (IS), bacteriofagii, elementele genetice mobile, plasmidele conjugative sustin căile principale de transfer genetic pe orizontală și demonstrează perfecta adaptabilitate la diferite habitate, precum și proprietățiile unice și benefice pe care le posedă bacteriile lactice.

3.2.1. Biodiversitatea bacteriilor lactice determintată de abordarea culturii independente

Înainte de 1990, expunearea la soare și creșterea microorganismelor în cultură pură a fost singura metodă de identificare și caracterizare. Din această cauză, studiul timpuriu al compoziției specilor și analiza biodiversității au fost realizate în principal bazandu-se pe metodele culturii-dependente. Oricum, este cunoscut faptul că mai puțin de 1% din microorganisme pot fi cultivate în laborator (Ward și colab.1990; Engelen și colab. 1998). Mai mult, pasul spre creșterea în vitro poate conduce spre subestimarea analizei în biodiversitate deoarece creșterea lentă a specilor prezente în număr scăzut nu pot concura cu creșterea rapidă sau a specilor mai răspandite (Hugenholtz și colab. 1998).

Urgența abordării cultivarii-independente a depașit aceste probleme și promite oportunități unice să descopere diversitatea speciilor procariote necultivate înainte, prin analiza ribozomală a genelor ARN-uli ale populației mixte de microorganisme din eșantionul de mediu (Hugenholz și colab.1998). Aceasta este mult mai reprezentativă pentru spctrul real al microorganisemelor și a genelor lor care sunt active într-un habitat la alegere. La o evaluare globală a compoziției microbiene a produselor lactate și a altor hrane fermentate, studii făcute pe compoziția microbiană de bacterii lactice au fost clarificate folosind abordarea culturii-independente.

3.2.2. Diversitatea microbiala în fermentarea tradițională produselor lactate determinată de analiza secvenței matagenomială

Abordarile culturii-independente au fost folosite tot mai mult pentru a determina compoziția complexă a comunităților microbiene. Aceste proceduri au pornit caracterizarea simultană a întregului ecosistem și a identificării multor specii din aceste surse (Quigley și colab. 2011). Acolo este o mare cantitate de informație cu privire la genomii microorganismelor care nu pot fi cultivate în moduri convenționale, tehnicile metagenomiale fiind una din cheile tehnologice folosite acum pentru a accesa și a investiga acest potențial. Aceste tehnici au fost detectate la toate culturile de specii comune, precum și unele microorganisme nedetectate înainte. În acesti ani pyrosecvențierea a fost des folosită pentru a studia diversitatea și dinamica populației bacteriene dintr-un chefir irlandez și produsele sale fermentate corespunzator (Dobson și colab. 2011) și alte produse fermentate (Humblot și Guyot 2009; Roh și colab 2010; Jung și colab. 2011). Biodiversitatea bacteriilor lactice în fermentarea tradițională a produselor lactate (incluzând laptele fermentat de vacă, koumiss și kurut) în China, Mongolia și Rusia sunt de asemenea investigate acum folosindu-se tehnologia pyrosecvențierii în Laboratorul Cheie al Biotehnologiei și Ingineria Lactatelor, Ministerul Educației din China (Inner Mongolia Agricultural University) pentru a complementa extinderile anterioare ale studilor pe cultura-independentă (Bao și colab. 2012a,b). Până când aceste date nu sunt publicate, un rezumat va fi prevăzut în secțiunile următoare.

3.2.3. Diversitatea microbiană în fermentarea tradițională a laptelui de vacă

Probe de lapte fermentat de vacă au fost colectate din regiunea Xinjiang Ugyur, China (n=10 din regiunea Zhaosu și 12 din regiunea Tekesi) și au fost supuse studiului diversității microbiale folosindu-se 454 pyrosecvențe. Aceasta a rezultat într-un total de 245.423 secvențe ARN 16S de înalta calitate cu fiecare mostra producând o medie de 13.062 secvențe (raza = 7913-16476, SD=3096). După alinierea PyNAST-ului și analiza identității 100% a grupului secvențial, 11.790 secvențe reprezentative au fost obținute. RDP combinat cu metoda exploziei omologică secvențială a grupului alineat au fost folosite pentru identificarea secvențelor la nivel de încrengatură și gen. Secvențele au fost distribuite între 7 încrengaturi (Fig. 3.2), din care 4 fiind încrengatura bacterială Firmicutes, Protobacteria, Bacteroides și Actionobacteria care împreună formează 99% din secvențe. Alte 2 ale încrengaturi au fost de asemenea bacterii, TM7 și Verrucomicrobia, dar au fost reprezentate de doar 0,01 si 0,007% din totalul secvențelor respective.

Fig. 3.2. Proporția secvențelor ARNr 16S din probe de lapte de vaca fermentat tradițional atribuită increngaturii microorganismelor (Liu și colab 2014).

Fig. 3.3. Proporția secvențelor ARNr 16S din probe de lapte de bovine fermentat tradițional atribuite unor genuri de microorganisme (Liu și colab. 2014).

Toate aceste secvențe au fost de asemenea identificate la nivelul de gen (Fig.3.3). Acolo au fost 11 genuri reprezentate în acele mostre (la un nivel de cel puțin 0.03% din secvențe/mostră), din care 20 au fost bacterii lactice și, din toate, Lactobacillus a fost considerat ca cel mai abundent. În 5 dintre probe 99% din secvențe pot fi atribuite bacteriei Lactobacillus. Urmatorul cel mai abundent gen a fost Streptococcus care, a fost maxim într-o probă reprezentând 55% din secvențe. Cea mai mare proporție de secvențe atribuite Lactococcus-ului a fost de 26,85% și de 24,77% în 2 probe anume.

Fig. 3.4. Conținutul relativ bacterian (ARNr 16S proporție de secvență) în koumiss tradițional bazat pe nivelul genurilor (Liu și colab. 2014).

3.2.4. Diversitatea microbiană în Kumiss tradițional

Diversitatea microbiană în koumiss tradițional a fost de asemenea studiată prin utilizarea tehnologiei pyrosecvențierii (un proces care se face într-un recipient care funcționează la temperaturi foarte ridicate). De exemplu, șase probe de koumiss (trei probe din Xinjiang din China, trei probe din Rusia) colectate din Xinjiang Uygur regiune autonoma și regiunea Kalmuckia din Russia. Toate secvențele au fost identificate la nivelul genelor în Fig. 3.4, care reprezintă relativ conținutul de bacterii la nivelul genelor (este mai mare de 0.3%) în aceste probe. Erau 9 gene prezentate în aceste probe, dar Lactobacillus a fost considerată ca fiind cea mai abundentă bacterie. Conținutul său a ajuns la mai mult de 98%, mai ales în cele patru probe. Urmat de Streptococcus, conținutul maxim de aceste bacterii a ajuns la 81% pe o probă. Mai mult, conținutul cel mai mare a fost Lactococcus 14.83% în una dintre probe. Celelalte genuri prezentate în aceste probe au fost mai puțin de 10%. Toate secvențele au fost identificate la 11 încrengaturi, Firmicuters este microflora predominanta în majoritatea probelor (Fig 3.5).

Fig.3.5. Proporția secvențelor ARNr 16S din probe de kurut atribuite încrengaturii de microorganisme (Liu și colab. 2014).

3.2.5. Diversitatea microbiană în Kurut tradițional

Mostre de kurut (lapte de iac fermentat în mod tradițional) au fost colectate din Tibet, China (n = 8 probe din județul Geda, și 8 din județul Ningzhong) și supuse analizei în studiile diversității microbiene folosind 454 pyrosecvente. Probele pentru secvențe au fost alocate pentru diferite regiuni din două județe. Aceasta a dus la 112.173 de scvențe ARNr 16S de înaltă calitate, cu fiecare probă care produce o medie de 13.062 de secvențe (interval=6274-7765, SD = 482). Urmărind alinierile PyNAST și identitatea secvențelor de analiza, au fost obținute 6530 de secvențe reprezentative. RDP combinat cu metoda BLAST de aliniere în grup a secventelor omoloage, au fost apoi utilizate pentru identificarea secvențelor la nivel de încrengătura si gene. Secvențele au fost distribuite între 11 încrengaturi (Fig. 3.6) din care patru au fost încrengaturi bacteriene: Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroides și Actinobacteria care împreună reprezentau 99% din secvențe. Restul de șapte încrengaturi au fost de asemenea bacterii (Acidobacteria, Chloroflexi, Tenericutes, TM7, Deinococcus-Thermus, Spirochaetes și SR1) fiecare contabilizând între 0,013 și 0,015% din secvențe.

Fig.3.6. Proporția secvențelor ARNr 16S din probe de kurut atribuite unor genuri de microorganisme (Liu și colab. 2014).

Secvențele au fost de asemenea identificate la nivelul genelor (Fig. 3.7). Erau 13 gene identificate în aceste probe (fiecare la un nivel de cel putin 0,01% din secvențele prezente), printre care au fost și bacterii lactice, Lactobacillus a fost considerat cel mai abundent, reprezentând 99 % sau mai multe secvențe pe un anumit număr de probe. A doua acea mai abundentă a fost genul Streptococcus, (33.89% din secvențe) în proba B4. În proba A4 Lactococcus a atins cele mai ridicate nivele (80.20% din secvențe).

3.2.6. Diversitatea microbiană în produse lactate tradiționale din diferite locuri

Diversitatea comunității bacteriene în produsele lactate fermentate din Mongolia, Provincia Gansu, China; Provincia Sichuan, China și Regiune Autonoma Inner Mongolia, au fost de asemenea examinate folosind o abordare metagenomicî (o alternanță de genuri sexuate și asexute) 454 pyrosecvențe (Fig. 3.7).

Fig. 3.7. Abundența relativă (procente de secvențe) de bacterii în fermentația naturală a produselor lactate din diferite regiuni (Liu și colab. 2014).

Secvențele au fost distribuite printre patru încrengături de bacterii, și anume: Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes și Actinobacteria. Din cele patru încrengături de bacterii, Firmicutes este dominat în toate probele. Cea de a doua ce mai dominantă încrengătură de bacterie a fost Proteobacteria, reprezentând în medie 17% (±9%) de secvențe. Bacteroidetes (0.53 % ± 0,59 %), Actinobacteria (0.11 % ± 0,05 %) și bacterii neclasificate (0.11 % ± 0,07%) au fost la un nivel scăzut în toate probele. La nivelul genelor, un total de 95 de gene de bacterii au fost identificate de la cele patru încrengaturi, din care cel mai abundent a fost Lactobacillus. La o analiză mai profunda 14 gene au fost comune în toate probele de produse lactate fermentate natural din cele patru locații de prelevare diferite (Mongolia, Provincia Gansu, Provincia Sichuan și regiunea Autonomă Inner Mongolia). În plus, față de Lactobacillus (67.22, 52.51, 49.91 și 43.70% pentru fiecare regiune ) au mai fost identificate sepciile de bacterii lactice: Streptococcus (12,07, 33.55, 29.51 și 0,71%), Lactococcus (3.66, 0.17, 2.26 și 21.86%), Leuconostoc (1,92, 0,02, 1,60 și 0,16%). Simultan, au fost identificate: Acinetobacter (1,13, 0,75, 3,09 și 1.31%), Enhydrobacter (0,15, 0,16, 0,42 și 0,37%), Cloacibacterium (0,15, 0,09, 0,18 și 1,09%), Acetobacter (0.10, 12,09, 3,57 și 20.06%), Macrococcus (0,05, 0,17, 1,52 și 0,02%), Chryseobacterium (0,05, 0,03, 0,02 și 0,12%), Delftia (0,03, 0,01, 0,03 și 0,12%), Escherichia (0,02, 0,05, 0,06 și 0,04%), Rhizobium (0,02, 0,01, 0,16 și 0,09%) și Roseomonas (0,02, 0,01, 0,03 și 0,06%).

3.3. Diversitatea bacteriilor lactice în produsele lactate fermentate în mod tradițional determinată prin alte tehnici moleculare, în special denaturarea gradientă gel de electroforeză

Pe lângă analiza secvenței metagenomiale, există și alte tehnici moleculare care permit culturii independente identificarea și monitorizarea microbiană diversificată. Majoritatea acestor tehnici se bazează pe amplificarea și detectarea acizilor nucleici predominanți prezenți într-o probă prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) (Yang și colab. 2001). Comparativ cu metodele convenționale aceste metode moleculare sunt, în general mai rapide, mai specifice, mai sensibile și mai precise, permițând un studiu precis a populațiilor microbiene și diversitatea lor în ecosistemele date. Acestea au fost utile pentru a monitoriza schimbările în comunitățile microbiene.

Studiile de cultură independente sunt bazate pe tehnici de amprentare moleculare, cum ar fi: denaturarea gradientă în gel de electroforeză (DGGE) (Ercolini și colab. 2004;. Lafarge și colab, 2004), electroforeză gradient de temperatură temporală (TTGE) (Lafarge și colab. 2004; Ogier și colab. 2002), conformație de polimorfism printr-un singur fir (SSCP) (Duthoit și colab. 2003) au fost utilizate pentru a caracteriza diversitatea bacterienă în laptele crud și în alte produse lactate și produse alimentare fermentate. Aceste metode de cultură independentă poate nu numai caracteriza complet bacteriile lactice primare din lapte, cum ar fi: Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Weissella și Pediococcus, dar poate detecta, de asemenea, spectrul larg al altor microorganisme care apar mai puțin frecvent sau nu pot fi detectate prin metode de cultură dependentă.

BIBLIOGRAFIE

Abdel Moneim ES, Abdalla AI, Ahmed AF. Chemical and microbiological quality of Garris Sudanese fermented camel’s milk product. Food Sci Technol. 2006;42:321–328

Abdel Gadira WS, Ahmeda TK, Dirar HA. The traditional fermented milk products of the Sudan. Int J Food Microbiol. 1998;44:1–13

Ahmed AM. The common microorganisms in the Sudanese white soft cheese. Sud J Vet Sci Anim Husb. 1997;36:109–12.

Ahmed IAM, Morishima I, Babiker EE, Mori N. Characterisation of partially purified milk clotting enzyme from Solanum dubium Fresen seeds. Food Chem. 2009;116:395–400

Airidengcaicike, Chen X, Du XH, Wang WH, Zhang JC, Sun ZH, Liu WJ, Li L, Sun TS, Zhang HP. 2010. Isolation and identification of cultivable lactic acid bacteria in traditional fermented milk of Tibet in China. Int J Dairy Technol; 63(3):437–44

Akabanda F, Owusu-Kwarteng J, Glover LKR, Tano-Debrah K. Microbiological characteristics of Ghanaian traditional fermented milk product. Nunu. Nat Sci. 2010;8(9):178–87

Ashmaig AA, Hasan, El-Gaali E. Identification of lactic acid bacteria isolated from traditional Sudanese fermenred camel’s milk (Gariss). Afr J Microbiol Res. 2009;3:451–457

Axelsson A., 2004 Lactic Acid Bacteria: Clasification and Physiology, Ed. Marcel Dekker, New York.

Banu C., 2000 Biotehnologii in industria alimentara, Editura Tehnica, București.

Banu I, 2010, Aplicatii in panificatie, Editura University Press, Galati.

Bao QH, Chen X, Liu HX, Zhang WY, Liu WJ, Yu J, Wang F, Zhang HP.,2011 Isolation and identification of cultivable lactic acid bacteria from traditional goat milk cake in Yunnan province of China. Afr J Microbiol Res;5(29):5284–91

Bao QH, Yu J, Liu WJ, Qing MJ, Wang WH, Xia Chen Wang F, Li MH, Wang HM Lv Q, Zhang HP., 2012a, Predominant lactic acid bacteria in traditional fermented yak milk products in the Sichuan Province of China. Dairy Sci Technol;92:309–319

Bao QH, Liu WJ, Yu J, Wang WH, Qing MJ, Chen X, Wang F, Zhang JC, Zhang WY, Qiao JM, Sun TS, Zhang HP.,2012b, Isolation and identifi cation of cultivable lactic acid bacteria in traditional yak milk products of Gansu Province in China. J Gen Appl Microbiol;58:95–105

Burentegusi MT, Nakamura S. Identification of lactic acid bacteria isolated from fermented mare‘s milk ’’chigee’’ in Inner Mongolia. China Anim Sci Technol. 2002;73:441–8

Chen H, Wang SY, Chen MJ. Microbiological study of lactic acid bacteria in kefir grains by culture-dependent and culture-independent methods. Food Microbiol. 2008;(25)3:492–501.

Chen YF, Sun TS, Wang JC, Airden CK, Bai M, Zhang HP. Comparison of nutrition and microbiological compositions between two types of fermented milk from Tibet in China. Int J Food Sci Nutr. 2009;60(S7):243–50

Di Cagno R, Tamborrino A, Gallo G, Leone C, de Angelis M, Faccia M, Amirante P, Gobbetti M. Uses of mares’ milk in manufacture of fermented milks. Int Dairy J. 2004;14:767–75

Dirar HA. The indigenous fermented foods of the sudan. A study in African food and Nutrition, CAB International, Cambridge, UK. 1993

Dobson A, O’sullivan O, Cotter PD, Ross P, Hill C. 2011, High-throughput sequence-based analysis of the bacterial composition of kefir and an associated kefir grain. FEMS Microbiol Lett;320:56–62.

Duan Y, Tan Z, Wang Y, Li Z, Li Z, Qin G, Huo Y, Cai Y. 2008. Identification and characterization of lactic acid bacteria isolated from Tibetan Qula cheese. J Gen Appl Microbiol; 54:51–60

Duthoit F, Godon JJ, Montel M., 2003, Bacterial community dynamics during production of registered designation of origin Salers cheese as evaluated by 16S rRNA gene single-strand conformation polymorphism analysis. Appl Environ Microbiol.;69:3840–8

Elaine E., Maaike C., Erwin G., Antoon D.L., and Willem M. 2002; The Intestinal LABs; Kluwer Academic Publishers; 343

EI-Sheikh NAA. Production of Mudaffara cheese from cows and goats milk. M.Sc. Thesis, University of Khartoum, Sudan. 1997

El-Owni AOO, Hamid OIA. Effect of storage period on weight loss, chemical composition, microbiological and sensory characteristics of Sudanese white cheese (Gibna Bayda). Pak J Nutr. 2008;7:75–80

Elmagli AAO, El-Zubeir IEM. Study on the compositional quality of pasteurized milk in Khartoum state (Sudan). Int J Dairy Sci. 2006;1:12–20

Engelen B, Meinken K, von Wintzingerode F, Heuer H, Malkomes HP, Backhaus H. 1998; Monitoring impact of a pesticide treatment on bacterial soil communities by metabolic and genetic engerprinting in addition to conventional testing procedures. Appl Environ Microbiol; 64:2814–21

Ercolini D, Mauriello G, Blaiotta G, Moschetti G, Coppola S.,2004 PCR-DGGE fingerprints of microbial succession during a manufacture of traditional water buffalo mozzarella cheese. J Appl Microbiol. ;96:263–70

Farah Z, Mollet M, Younan M, Dahir R. Camel dairy in Somalia: limiting factors and development potential. Livest Sci. 2007;110:187–91.

Feresu SB, Muzondo MI. Identification of some lactic acid bacteria from two Zimbabwean fermented milk products. World J Microbiol Biotechnol. 1990;6:178–86.

Gadaga TH, Mutukumira AN, Narvhus JA. Growth characteristics of Candida kefir and two strains of Lactococcus lactis subsp. lactis isolated from Zimbabwean naturally fermented milk. Int J Food Microbiol. 2001;70(1–2):11–9.

Gasson, M.J., de Vos W.M., 2004, Genetics and Biotehnology of lactic Acid Bacteria, Splinger Berlin, Germany

Hamid IA, AO El Owni. Microbiological properties and sensory characteristics of white cheese (Gibna bayda) collected in Zalengei area West Darfur. Res J Anim Vet Sci 2007;2:61–5.

Hassan AR, El–Zubeir MEI, Babiker AS. Chemical and microbial measurements of fermented camel milk Garris from transhumant and nomadic herds in Sudan. J Basic Appl Sci. 2008;2:166–171.

Hamza AA, El Gaali IE, Mahdi AA. Use of the RAPD-PCR fingerprinting and API system for clustering lactic acid bacteria isolated from traditional Sudanese sour milk (Roab). Afr J Biotechnol. 2009;8:3399–404

Hugenholtz P, Pitulle C, Hershberger KL, Pace NR. 1998; Novel division level bacterial diversity in a Yellowstone hot spring. J Bacteriol. 1998;180:366–76

Humblot C, Guyot JP.,2009, Pyrosequencing of tagged 16S rRNA gene amplicons for rapid deciphering of the microbiomes of fermented foods such as pearl millet slurries. Appl Environ Microbiol;75:4354–61

Ionescu A., 2002, Biotehnologia aditivilor alimentari, Editura Academica, Galați

Jiri MT, Cui P, Ding F, Geng J, Gao H, Zhang H, Yu J, Hu S, Meng H. Monophyletic origin of domestic bactrian camel (Camelus bactrianus) and its evolutionary relationship with the extant wild camel (Camelus bactrianus ferus). Anim Genet. 2009;40:377–82.

Jung JY, Lee SH, Kim JM, Park MS, Bae JW, Hahn Y, Madsen EL, Jeon CO. 2011. Metagenomic analysis of kimchi, a traditional Korean fermented food. Appl Environ Microbiol;77:2264–74

Keller JJ, Jordan I. Fermented milks for the South African market. Afric J Dairy Sci. 1990;22:47–9

Kleerebezem M, Hugenholtz J. Metabolic pathway engineering in lactic acid bacteria. Curr Opin Biotechnol. 2003;14:232–7.

Kurmann JA, Rasic JLJ, Kroger M. Encyclopedia of fermented. Fresh milk products. New York: Van Nostrand Reinhold; 1992

Lafarge V, Ogier JC, Girard V, Maladen V, Leveau JY, Gruss A, Delacroix-Buchet A.,2004, Raw cow milk bacterial population shifts attributable to refrigeration. Appl Environ Microbiol. 2004;70:5644–5650

Li W, Shang H, Li J, Xu Z, Qin L. The content of Microorganism of yak’s milk of Tianjin regions. Chin J Anim Quaran. 2002;19:36

Liu WJ, Sun ZH, Zhang JC, Gao W, Wang WH, Wu L, Sun TS, Chen W, Liu XM, Zhang HP. Analysis of microbial composition in acid whey for dairy fan making in Yunnan by conventional method and 16S rRNA sequencing. Curr Microbiol. 2009;59:199–205.

Luo Z, Li SYY, Han B. Research on the microflora and physicochemical index of the kurut in Tibet. China Brewing (in Chinese). 2005;10:40–1.

Mann EJ. Kefi r and koumiss. Dairy Ind Int. 1989;54(9):9–10.

Mathara JM, Schillinger U, Kutima PM, Mbugua SK, Holzapfel WH. Isolation, identification and characterisation of the dominant microorganisms ofkule naoto: the Maasai traditional fermented milk in Kenya. Int J Food Microbiol. 2004;94:269–78.

Mathara JM, Schillinger U, Guigas C, Franz C, Kutima PM, Mbugua SK, Shin HK, Holzapfel WH. Functional characteristics of Lactobacillus spp. from traditional Maasai fermented milk products in Kenya. Int J Food Microbiol. 2008;126(1–2):57–64

Miyazaki K, Matsuzaki T. Health Properties of Milk Fermented with Lactobacillus casei strain Shirota (LcS). In: Farnworth ER, editor. Handbook of fermented functional foods. 2nd ed. New York: CRC Press, Taylor & Francis Group; 2008. p. 165–208.

Ogier JC, Son O, Gruss A, Tailliez P, Delacroix-Buchet A. Identification of the bacterial microflora in dairy products by temporal temperature gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol. 2002;68:3691–701

Park W, Zhang H, Zhang B, Zhang L. 2006. Mare milk. In: Park YW, George FW, editors. Handbook of milk of non-bovine mammals. 1st ed. Haenlein: Blackwell Publishing; P. 275–296

Park JM, Shin JH, Lee DW, Song JC, Suh HJ, Chang UJ, Kim JM. 2010. Food Sci Biotechnol;19(2):541–6

Pederson CS. Microbiology of food fermentations. Westport: AVI; 1971.

Prescott SC, Dunn CG. (1957) Industrial microbiology. New York: McGraw-Hill; 1957.

Psoni L, Tzanetakis N, Litopoulou-Tzanetaki E. Microbiological characteristics of Batzos, a traditional Greek chees from raw goat’s milk. Food Microbiol. 2003;20:575–82

Quigley L, O’Sullivan O, Beresford TP, PaulRoss R, Fitzgerald GF, Cotter PD. 2011; Molecular approaches to analysing the microbial composition of raw milk and raw milk cheese. Int J Food Microbiol;15081–5094

Roh SW, Kim KH, Nam YD, Chang HW, Park EJ, Bae JW. 2010; Investigation of archaeal and bacterial diversity in fermented seafood using barcoded pyrosequencing. Int J Syst Evol Microbiol;4:1–16

Salih AMM, El Sanousi SM, El Zubeir EM. A review on the Sudansese traditional dairy products and technology. Int J Dairy Sci. 2011;6(4):227–45.

Shuangquan B, Miyamoto T. Microflora in traditional fermented camel’s milk from Inner Mongolia. China Milchwissenschaft. 2004;59:649–652

Sulieman AM, Ilayan AA, El faki AE. Chemical and microbiological quality of Garris, Sudanese fermented camel’s milk product. Int J food Sci Technol. 2006;41(3):321–328

Sun ZH, Liu WJ, Gao W, Yang M, Zhang JC, Wu L, Wang JG, Menghe BG, Sun TS, Zhang HP. 2010. Identification and characterization of the dominant lactic acid bacteria from kurut: the naturally fermented yak milk in Qinghai, China. J Gen Appl Microbiol; 56:1–10

Tamime AY. Fermented milks: a historical food with modern applications-a review. Eur J Clin Nutr. 2002;56(Suppl)4:1–15.

Tamime AY. Production of Kefir, Koumiss and Other related Products. In: Tamime AY, editor. Fermented Milk Blackwell Science Ltd, Oxford, UK, 2006;174–216.

Taormina PJ. Implications of salt and sodium reduction on microbial food safety. Crit Rev Food Sci Nutr. 2010;50:209–27.

Tooner JS. 1994; Koumiss in Mongol culture: past and present. Milk and milk products from Medieval to Modern Times In: P Lysaght ,editor. Canongate Press, Edinburgh; p. 130–39.

Uchida K, Hirata M, Motoshima H, Urashima T, Arai I. 2007; Microbiota of‘airag’, ‘tarag’ and other kinds of fermented dairy products from nomad in Mongolia. Anim Sci J.;78(6):650–8

Usturoi M. G, 2007, Tehnologia laptelui si a produselor derivate, Editura Alfa, Iasi.

Van den Berg G. Semi-hard cheeses. In: Tamime, A.Y., Law, B.A; editors, 2000; Mechanisation and Automation in Dairy Technology. Academic Press, Sheffield. 2000

Vuyst LD, Schrijvers V, Paramithiotis S, Hoste B, Vancanneyt M, Swings J, Kalantzopoulos G, Tsakalidou E, Messens W. 2002; The biodiversity of lactic acid bacteria in Greek traditional wheat sourdoughs is reflected in both composition and metabolite formation. Appl Environ Microbiol.;68(12):6059–69

Walstra P, Moomen, geurts TJ.1993 Dutch-type varieties, in Cheese: chemistry. Physic and Microbiology, Vol. 2, In: P.F. Fox, editor, Chapman & Hall, London; p. 39–82

Ward DM, Weller R, Bateson MM. 1990; 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community. Nature. 1990;345:63–5

Watanabe K, Fujimoto J, Sasamoto M. 2008 Diversity of lactic acid bacteria and yeasts in Airag and Tarag, traditional fermented milk products of Mongolia. World J Microbiol Biotechnol;24:1313–25

Wenjun Liu, Huili Pang, Heping Zhang and Yimin Cai, 2014, Biodiversity of Lactic Acid Bacteria, Springer Science+Business Media Dordrecht

Yang CH, Crowley DE, Borneman J, Keen NT.,2001, Microbial phyllosphere populations are more complex than previously realized. Proc Natl Acad Sci USA.;98:3889–94.

Zamfir M, Vancanneyt M, Makras L, Vaningelgem F, efebvre KL, Pot B, Swings J, De Vuyst L. 2006; Biodiversity of lactic acid bacteria in Romanian dairy products. Syst Appl Microbiol;29:487–495

Zhang HP, Xu J, Wang JG, Menghebilige, Sun TS, Li HP, Guo MR.2008. A survey on chemical and microbiological composition of Kurut, naturally fermented yak milk from Qinghai in China. Food Control;19:578–586

Zhang JC, Liu WJ, Sun ZH, Bao QH, Wang F, Yu J, Chen W, Zhang HP. 2011. Diversity of lactic acid bacteria and yeasts in traditional sourdoughs collected from western region in Inner Mongolia of China. Food Control;22:767–74

Zhang WY, Zhang HP. 2012. Fermentation and koumiss. In: Hui YH, editor. Handbook of animalbased fermented foods and beverages. 2nd ed. Boca Raton: CRC Press; p. 165–172

Zhu G, Zhang Y. 2005; Current conditions and developing approaches of yak production in China. Chin J Anim Sci (in Chinese);41(1):61–3.

*** http://www.bio149.cn/html/labcc.html.