Biodegradare

Capitolul 2.1 Procesul de Biodegradare

Biodegradarea poate fi definita ca abilitatea microorganismelor de a transforma sau mineraliza anumiti contaminanti organici in substante mai putin toxice care pot fi integrate din nou in ciclurile biogeochimice naturale. Intensitatea cu care se poate desfasura procesul de biodegradare depinde de anumiti factori fizici si chimici cum sunt temperatura, nutrientii, oxigenul, valoarea pH-ului,umiditatea, compozitia, concentratia si biodisponibilitatea contaminantilor, caracteristicile fizico-chimice si istoria mediului contaminat (Margesin, 2001).

Factori care influențează rata de biodegradare a poluanților.

Temperatura

Dintre factorii care influenteaza procesul de biodegradarea temperatura are un rol important deoarece afecteaza direct chimia poluantilor, fiziologia si diversitatea florei microbiene. Deasemenea temperatura poate afecta si solubilitatea hidrocarburilor. Biodegradarea hidrocarburilor poate sa aiba loc la o gama larga de temperaturi, de cele mai multe ori o data cu scaderea temperaturii are loc si o scaderea a ratei de biodegradare (Figura.1).

Figura 1. Ratele de biodegradare ale hidrocarburilor din ecosistemele terestre, acvatice si marine.

(Adaptata dupa Das N.& Chandran P, 2010).

Conform acestei figurii rata de biodegradare cea mai ridicata are loc in ecosistemele terestre la temperaturi cuprinse intre 30-400C, in ecosistemele acvatice la temperaturi cuprinse intre 20-300C, iar in ecosistemele marine la temperaturi cuprinse intre 15-200C.

In cazul biodegradarii petrolului datorita scaderii temperaturilor are loc o crestere a vascozitatii dar si o reducere a votalitatii hidrocarburilor toxice cu masa moleculara mica ceea ce face ca biodegradarea sa se desfasoare cu intarziere. Daca temperaturile depasesc valorile cuprinse intre 30-400C atunci are loc la nivelul membrane bacteriene o crestre a toxicitatii hidrocarburilor. (Das N.& Chandran P, 2010; Leahy J.G. & Colwell R.R, 1990; Coste A.& colab, 2014).

Nutrientii

Deasemenea si nutrientii sunt ingrediente necesare pentru biodegradarea unor hidrocarburilor poluante sa aiba loc cu succes. Fosforul, azotul si unele cazuri fierul pot deveni factori limitativi care pot afecta procesul de biodegradare. De exemplu atunci cand are loc o deversare de petrol in mediile marine, cantitatea de carbon creste in mod semnificatv, in timp ce disponibilitatea fosforului si azototului devine factori limitativi pentru degradarea uleiului.

In mediile terestre cantitatea de nutrienti necesara biodegradarii depinde de consumul de oxigen biochimic. De obicei raportul de masa C:N:P ideal pentru desfasurarea procesului de biodegradare este 120:10:1. Nutrienti ca potasiul, fierul, sodiul, calciu, amoniul, magneziul,clorul sunt si ei necesari dar in cantitati mult mai mici care sa nu depaseasca 100mg/l.

(Das N.& Chandran P, 2010; Leahy J.G. & Colwell R.R, 1990; Coste A.& colab, 2014).

Oxigenul

Prezenta oxigenului este esentiala in desfasurarea procesele oxidative care intervin in timpul biodegradarii hidrocarburilor din mediu. In sol cantitatea de oxigen alocata proceslor de oxidare depinde de rata de consum a microorganismelor, de tipul de sol dar si de prezenta substraturilor utilizabile care pot avea drept consecinta scaderea cantitatii de oxigen.

Valoarea pH-ului

Valoarea pH-ului trebuie sa fie cuprinsa intre 6-8, dar valoare luata in considerare ca fiind optima este cea a pH-ului neutru de 7. Daca valoarea pH-ului solului este depasita atunci se pot inregistra anumite efecte negative ca incapacitatea microorganisnelor de a degrada hidrocarburi. (Leahy J.G. & Colwell R.R. 1990).

Umiditatea

Domeniul optim de dezvoltare al microorganismelor este influențat de umiditate ce este cuprinsă între 25-85%, apă asigură transportul nutrienților și favorizează cataliza enzimatică iar totodată menține presiunea osmotică a celulelor (Doboș.L si colab, 2010).

Biodegradarea compusilor organici depinde si de o serie de factori biologici precum diversitatea si capacitatea metabolica a microorganismelor implicate in procesul biodegradarii .(Genovese, 2008).

Microorganismele implicate in biodegradarea compusilor organici necesita o anumita cantitate de nutrienti si de un acceptor de electoni terminal cu care sa degradeze substratul sau contaminantul. Microorganismele aerobe folosesc oxigenul ca acceptor de electoni in timp ce cele anaerobe utilizeaza in afara de oxigen si alti acceptori de electoni (MeNally D, 2009).

Figura 2. O vedere conceptuala a procesului de degradare microbina

(Adaptat dupa MeNally D, 2009).

Satisfacerea unor conditii este esentiala pentru ca procesul de biodegradarea sa decurga normal. Aceste conditii includ existenta unui organism care sa detine enzimele necesare biodegradarii (existenta acestui organism cu potential catabolic adecvat este necesar dar in acelasi timp nu este suficient pentru ca biodegradarea sa aiba loc), prezenta acelui organism in mediul contaminat (desi majoritatea microorganisme cu capacitati biodegradative sunt prezente aproape in toate mediile de pe suprafata pamantului se poate intampla ca in unele medii aceste microorganisme sa lipsesca), compusul poluant care trebuie sa fie supus biodegradarii trebuie sa fie accesibil organismului cu potential catabolic adecvat ( foarte multi poluanti persista in mediu chiar daca microorganismele implicate in procesul de biodegradare sunt prezente), datorita unui numar mic de populatii de microorganisme care degradeaza compusi sintetici anumite conditii din mediu trebuie sa fie satisafacute astfel incat sa favorizeze proliferarea microorganismelor cu potential activ. (Alexander, 1999).

Biodegradare are la baza 2 procese si anume : cresterea care presupune folosirea poluantiilor organici ca sursa de carbon si energie, in urma acestui process se obtine degradarea completa a poluantilor (mineralizarea) si cometabolismul care se refera la metabolizarea unui comupus

organic in prezenta unui substrat de crestere care este utilizat indeosebi ca sursa primara atat de carbon cat si de energie. (Fritsche W. & Hofrichter M, 2000).

Capitol 2.2 Exemple de procese de biodegradare

Procesul de biodegradare al compusilor organici se poate desfasura atat in conditii aerobe cat si anaerobe.

Biodegradarea aeroba a compusilor organici

De cele mai multe ori procesul de degradare al compusilor organice se realizeaza in conditii aerobe, oxigenul fiind considerat principalul acceptor de electoni din timpul proceselor de degradare microbiana.

Compusii organici care se pot degrada complet si care au o rata ridicata de degradare sunt reprezentati in principal de derivatii ai petrolului dar si de produsele petrochimice.

Bacteriile chemo-organotrofice sunt estentiale in procesul de degradare al compusilor organici deoarece pot utiliza ca sursa de carbon si energie dar si ca donori de electroni o gama larga de compusii naturali si de sinteza.(Tabel 1).

De cele mai multe ori comunitatile microbiene mixte pot avea un potential de biodegradare mult mai mare. De exemplu pentru degradarea unui amestec compex de compusii organicieste necesara informatia genetica a mai multor microorganisme.

Tabel.1 Bacterii predominante din solurile poluate cu hidrocarburi aromatice si alifatice,

hidrocarburi aromatice policiclice si compusi halogenati.

(Adaptat după Fritsche W. & Hofrichter M, 2000).

Levurile au si ele capacitate de a degrada compusi organici. Acestea pot degrada compusi organici ca hidrocarburile alifatice prezente in petrol si produsele petroliere. De exemplu in prezenta anumitor levuri cum sunt Candida lipolytica, Rhodoturula rubra n-alcani cu C10-C24 sunt degradati foarte usor.

Rata de biodegradare a compusilor organici este mai intensa in prezenta oxigenului (conditii aerobe), pentru a se ajunge la cresterea acestei rate sunt necesare indeplinirea unor conditii precum:

Compusii organici trebuie sa fie accesibili microorganismelor care au activitate biodegradativa, degradarea hidrocarburile datorita insolubilitatii lor in apa necesita implicarea unor microorganisme care pot produce biosurfactanti (agenti tensioactivi).

Procesul oxidativ consta in atacul intracelular initial al poluantilor organici, activarea si incorporarea oxigenului este considerat cheia enzimatica a reactiei catalizata de oxidenaze si peroxidaze.

Degradarea periferica a poluantilor organici consta in transformarea pas cu pas in intermediari ai metabolismului central ca de exemplul ciclul acizilor tricarboxilici.

Producerea metabolitilor secundari( piruvat, acetil coenzima A) si incorporarea acestora in biomasa celulara (Fritsche W. & Hofrichter M, 2000).

Figura.2 Incorporarea în biomasă a hidrocarburilor pe calea oxidativă, la microorganisme aerobe. (Adaptat după Fritsche W. & Hofrichter M, 2000)

Biodegradarea anaeroba a compusilor organici

Inca de la sfarsitul anilor 1980 s-a dovedit ca un numar tot mai mare de microorganisme utilizeaza ca substraturi de crestere hidrocarburile saturate si aromatice in conditii stric anoxice. Daca microorganismele aerobe utilizeaza oxigenul ca acceptor de electroni microorganismele anaerobe utilizeaza in respiratia anaeroba ca acceptori de electoni azotul, sulful sau fierul.

Bacteriile anaerobe fata de cele aerobe obtin o cantitate mai mica de energie din conversia substraturilor , si au drept consecinta o cantitatea mica de biomasa produsa.

Din punct de vedere al stabilitatii hidrocarburile alifatice (alcani) sunt stabile in conditii anaerobe. (Widdel.F & Rabus.R, 2001).

Capitolul 2.2 Microorganisme implicate in biodegradarea hidrocarburilor petroliere

Numeroase microorganisme au fost identificate dealungul timpului ca fiind capabile sa utilizeze o gama larga de hidrocarburi petroliere ca sursa primara de carbon si energie.

In procesul de biodegradare microorganismele pot degrada complet sau partial hidrocarburile.

Principalele grupe de microorganisme izolate din medii poluate cu hidrocarburi capabile sa realizeze procesul de biodegradare sunt:

Bacteriile: Bacillus lipolyticum, Achromobacter sp., Actinomyces sp., Micrococcus (ex: Micrococcus paraffinae), Mycobacterium sp., Nocardia sp., Pseudomonas sp. (ex: Pseudomonas aeruginosa), Spirillum sp., Vibrio sp. Etc

Cianobacteriile: Anabaena sp., Coccochloris sp., Oscillatoria sp., Nostoc sp., etc.

Levurile: Candida sp., Saccharomyces sp., Sporobolomyces sp., Rhodospirillum sp.etc. Dintre acestea speciile de Candida sunt cele mai frecvent intalnite in solurile poluate.

Fungii filamentoși: Cladosporium sp., (ex: Cladosporium resinae), Aspergillus sp.,( ex: Aspergillus effusus, Aspergillus versicolor), Penicillium sp., etc.

Alge: Chlamydomonas sp, Chorella sp, Amphora sp, Porphyridium sp.etc

Intr-un studiu realizate de Das si colab s-a putut constata ca dintre toate aceste grupe de microorganisme bacteriile sunt considerate ca fiind principalele microorganisme implicate biodegradarea hidrocarburilor petroliere.

In solurile contaminate cu petrol brut din N-E Indiei au fost gasite specii de Acinetobacter capabile sa utilizeze ca unica sursa de carbon n-alcani cu o lungime a lantului cuprinsa intre 10 si 40 de atomi de carbon (Das si colab, 2010).

Degradarea hidrocarburilor se face diferit in functie de sensibilitatea lor la atacul microbian.

Astfel hidrocarburile susceptbile la degradarea microbiana sunt clasate dupa cum urmeaza: alcani cu catena liniara (hidrocarburile cel mai usor de degradat), alcani cu catena ramificata, aromatici cu greutate moleculara mica, alcani ciclici, aromatici cu greutate moleculara mare. Uni compusii cum sunt hidrocarburile policiclice cu greutate moleculara mare nu pot fi degradate in totalitate (Saadoun si colab., 2002).

De exemplu in timpul procesului de biodegradare a petrolului brut microorganismele pot fi considerate a fii ideale daca indeplinesc o serie de conditii si anume sa poata avea capacitatea de a degrada o gama cat mai larga de compusi petrolieri, rata de reproducere a microorganismelor sa fie rapida, sa fie capabile sa se multiplice si in mediile naturale si nu in ultimul rand sa fie stabile din punct de vedere genetic in asa fel inca sa se poate practica recultivarea si conservarea acestora. (Zarnea, 1994; Abassi si colab, 2008).

Tyagi si colab.(2011) au constatat ca unele microorganisme implicate in procese de biodegradare au afinitate pentru anumiti compusi organici. Unele specii de Pseudomonas, Ralstonia, Rhodoccocus sunt capabile sa degradeze hidrocarburi petroliere si hidrocarburi aromatice ca benzenul, toluenul, etilbenzenul si xilenul, in timp ce degradarea hidrocarburilor poliaromatice cum este naftalina de Pseudomonas, fenantrenul de Pseudomonas si Haemophilus, antracenul de Rhodoccocus, pirenul de Haemophilus si Mycobacterium si benzopirenul cu efecte extrem de cancerigene de Rhodoccocus si Mycobacterium.

Capitolul 3. Comunitatii de microorganisme

Diversitatea si numarul microorganismelor atat din ecosistemele terestre cat si din cele acvatice este foarte mare (bacterii, fungi, alge, actinomicete etc). Dar ca numar si potential de biodegradare bacteriile sunt considerate ca fiind principala grupa de microorganisme implicata in procesul de degradare al compusilor petrolieri. (Leahy J.G. & Colwell R.R. 1990).

Comunitatea de microorganisme poate sa fie definita ca un ansamblu de mai multe specii care coexista in aceelasi mediu si interactioneaza intre ele. Importanata cunosterii conceptului de comunitate de microorganisme este esentiala pentru a putea prezici modul in care evolueaza mediul. (Konopka A., 2009).

Dezvoltarea precum si diversitatea microbiontei din sol depinde de o serie de factori printre care se numara concentratia de oxigen, temperatura, cantitatea de nutrienti, prezenta anumitor poluanti etc. In cazul aparitiei unor dezechilibre ale acestor factori, dinamica microbiotei solului v-a avea de de suferit chiar daca comunitatiile de microorganisme au o capacitatea foarte mare de raspuns la stres. O asemenea situatiie de adaptare la conditiile de stres cum este in cazul substantelor poluante presupune aparitia unor modificari genetice, inducerea sau reducerea sintezei de enzime, prezenta unor plasmide etc. (Ford.T., 1994).

Capitolul 3.1 Tehnici si metode de studiu al comunitatilor de microorganisme

Din punct de vedere al ecologiei caracterizarea comunitatiilor de microorganisme se realizeaza cu ajutorul a doua domenii de studiu si anume:

Studiul diversitatii microorganismelor care presupune identificarea, izolarea si cuantificarea microorganismelor in diferite habitate

Studiul activitatii microbiene care face referire la modul in care activitatile acestora contribuie la observarea diversitatii microbiene.

Diversitatea microorganismelor in mediu poate fii evidentiata cu ajutorul unei game largi de indici cum sunt diversitatea filogenetica, diversitatea speciilor, diversitatea genotipca , diversitatea genelor etc. (Tabel.2) (Xu.J., 2006).

Figura.2 Indici de diversitate microbiana in mediile naturale. (Adaptat dupa Xu.J., 2005).

Daca la inceput estimarea diversitatii si activitatii microorganismelor in mediu se facea pe baza microorganismelor cultivate pe diferite medii nutritive dar si pe analizele experimentale de laborator ex-situ, mai recent s-a constatat ca aceste metode nu evidentiata heterogenitatea microorganismelor din mediu datorita cultivarii doar speciilor cunoscute pana in prezent si ale caror conditii de cultivare le erau cunoscute (Xu.J., 2006).

Datorita existentei unor microorganisme necultivabile s-a dezvoltat o metoda genomica pentru analiza comunitatilor de microorganisme din mediu care poarta denumirea de metagenomica. Metagenomica este o metoda care presupune pe langa clonarea fragmentelor de ADN/ARN izolate din comunitatile de microorganisme si secventierea si analiza acestor fragmente. (Xu.J., 2006., Ferrer.M si colab, 2008).

Principalele metode genomice folosite pentru a putea studia ecologia microorganismelor sunt urmatoarele:

Secventierea ADN (DNA sequencing)

Tehnica PCR (Polymerase chain reaction)

Sistemele de clonare ADN

Reasocierea ADN

Tehnica FISH (Fluorescent in situ hibridizationin)

Tehnica Micro-array

Tehnica RDA (Representational difference analysis)

DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis).

Bazele bioinformatice (Bioinformatics)

Secventierea ADN este cea mai avansata tehnica in genomica si presupune evidentierea succesiunilor de nucleotide din cadrul moleculelor de ADN.

Tehnica PCR (Polymerase chain reaction) permite amplificarea ADN-ului tinta. Aceasta tehnica in combinatie cu alte thenici de electoforeza in gel asa cum este DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) au ajutat la amplificarea si analiza genei nuclare ARN ribosomal contribuind in acest fel la intelegerea si aprecierea importantei pe care o are diversitatea microorganismelor in mediu.

Sistemul de clonare ADN permite separarea si amplificarea secventelor ADN din gene necunoscute care provin din rezervoare genetice heterogene (Xu.J., 2006).