Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale [600308]

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
1
UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCURE ȘTI

TEZĂ DE DOCTORAT

BIOANALIZA POLIFENOLILOR DIN EXTRACTELE UNOR
PLANTE MEDICINALE TRADI ȚIONALE

POLYPHENOLS BIOANALYSIS OF MEDICINAL HERBS
EXTRACTS

Doctorand: [anonimizat]. Chim. ALINA -OANA MATEI (DĂNILĂ)

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
2
Conduc ător științific: Prof. Dr. Ing. GABRIEL LUCIAN RADU

Octombrie
-2015 –

UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCURE ȘTI
ȘCOALA DOCTORALĂ „CHIMIE APLICATĂ ȘI ȘTIINȚA MATERIALELOR”
DEPARTAMENTUL DE CHIMIE ANALITICĂ ȘI INGINERIA MEDIULUI

TEZĂ DE DOCTORAT

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante
medicinale tradi ționale

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
3

Polyphenols bioanalysis of medicinal herbs extracts

Doctorand: [anonimizat]. Chim. ALINA -OANA MATEI (DĂNILĂ)
Conduc ător științific: Prof. Dr. Ing. GABRIEL LUCIAN RADU

Bucure ști
-2015 –

Universitatea Politehnica din Bucure ști
Facultatea de Chimie Aplicată și Știința Materialelor
Departamentul de Chimie Analitică și Ingineria Mediului

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
4

TEZĂ DE DOCTORAT

BIOANALIZA POLIFENOLILOR DIN EXTRACTELE UNOR
PLANTE MEDICINALE TRADI ȚIONALE

Conduc ător științific:
Prof. Dr. Ing. GABRIEL LUCIAN RADU

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
5
Doctorand: [anonimizat]. Chim. ALINA -OANA MATEI (DĂNILĂ )

Bucure ști
-2015 –

CUPRINS
INTRODUCERE
I.PARTEA TEORETIC Ă
I.1. CARACTERIZAREA GENERALĂ A PLANTELOR MEDICINALE 1
I.1.1. Calendula officinalis (Gălbenele) 1
I.1.2.Origini și răspândire 1
I.1.3. Caracterizarea plantei 2
I.1.4. Compoziția biochimică 2
I.1.5. Proprietăți terapeutice 6
I.1.6. Forme de utilizare 9
I.2.1. Hypericum perforatum (Sunătoarea) 10
I.2.2.Origini și răspândire 10
I.2.3. Caracterizarea plantei 11
I.2.4. Compozi ția biochimică 11
I.2.5. Proprietăți terapeutice 13
I.2.6. Forme de utilizare 14
I.3.1. Galium verum (Sânzienele) 14

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
6
I.3.2. Origini și răspândire 15
I.3.3. Caracterizarea plantei 15
I.3.4. Compoziția biochimică 16
I.3.5. Proprietăți terapeutice 16
I.3.6. Forme de utilizare 18
I.4.1. Origanum vulgare (Șovârful) 18
I.4.2.Origine și răspândire 19
I.4.3. Descrierea plantei 19
I.4.4. Compozi ția biochimică 20
I.4.5. Proprietăți terapeutice 22
I.4.6. Forme de utilizare 25
I.2.TEHNICI ANALITICE UTILIZATE PENTRU CARACTERIZAREA
EXTRACTELOR VEGETALE 25
I.2.1. Metode de extrac ție a compu șilor din extractele vegetale 25
I.2.2. Ob ținerea extractelor vegetale apoase 25
I.2.3. Ob ținerea extractelor vegetale alcoolice 26
I.2.4. Ob ținerea uleiurilor vegetale 27
I.3. Меtοdе dе analiză a сοmрușіlοr dіn еxtraсtеlе vеgеtalе de Calendula officinalis ,
Hypericum perforatum , Galium verum și Origanum vulgare 28
І.3.1. Меtοdе sресtrοmеtrісе 28
I.3.1.1. Spectrometria UV -Vis 28
I.3.1.2. Spectrometria de mas ă 33
I.3.2. Metode cromatografice 34
I.3.2.1. Cromatografia în strat subțire 34

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
7
I.3.2.2. Cromatografia de lichide de înaltă performan ță (HPLC) 36
I.3.2.3. Cromatografia în fază gazoas ă 43
I.3.3. Metode electroforetice 46
I.3.3.1. Electroforeza capilară 46
I.4. Concluzii 50
II. PARTEA EXPERIMENTALĂ 52
II.1.CARACTERIZAREA PRIMAR Ă A EXTRACTELOR APOASE ȘI HIDROALCOOLICE (30%, 50% ȘI
70%) ALE PLANTELOR: CALENDULA OFFICINALIS, HYPERICUM PERFORATUM, GALIUM VERUM
ȘI ORIGANUM VULGARE IN CEEA CE PRIVE ȘTE CONȚINUTUL IN POLIFENOLI ȘI ACTIVITATEA
ANTIOXIDANT Ă 52
II.1.1. Introducere 52
II.1.2. Reactivii utilizați 53
II.1.3. Obținerea extractelor vegetale prin extracție în mediu apos și hidroalcoolic (30%,
50% și 70%) 53
II.1.4. Determinarea conținutului total de polifenoli 54
II.1.5. Capacitatea de scavenger a radicalului ABTS 54
II.1.6. Capacitatea de scavenger a radicalului DPPH 55
II.1.7. Analiza cantitativ ă a polifenolilor din probe reale prin cromatografia de înaltă
performan ță în fază invers ă cu detec ție cu șir de diode (RP -HPLC -DAD) 55
II.1.3. Rezultate și discuții 56
II.1.3.1. Conținutul total de polifenoli 56
II.1.3.2. Capacitatea antioxidantă 57
II.1.3.3. Validarea par țială a metodei cromatografice 58
II.1.3.4. Analiza cantitativ ă a polifenolilor din probe reale utiliz ând RP -HPLC 66
II.1.4. Concluzii 69

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
8
II.2. DEZVOLTAREA ȘI VALIDAREA UNEI METODE ANALITICE SENSIBILE PENTRU
CARACTERIZAREA AVANSAT Ă A CONȚINUTULUI IN POLIFENOLI ȘI STUDIUL STABILIT ĂȚII
PROBELOR REALE ȘI A UNOR PREPARATE COMERCIALE DIN PLANTELE STUDIATE 70
II 2.1. Introducere 70
II.2.2. Materiale și metode 70
II.2.2.1. Prepararea extractelor vegetale 71
II.2.2.2. Determinarea conținutului de polifenoli totali 71
II.2.2.3. Determinarea con ținutului de flavonoide totale 72
II.2.2.4. Identificarea și separarea polifenolilor prin LC -MS 72
II.2.3. Rezultate și discuții 73
II.2.3.1. Conținutul de polifenoli și flavonoide totale 73
II.2.3.2. Validarea metodei LC -MS 74
II.2.3.3. Analiza LC -MS a probelor reale 82
II.2.3.4. Evaluarea stabilității în timp a conținutului de compuși biologic activi prezenți în
extractele etanolice ob ținute în laborator și în extractele comerciale 86
II.2.4. Concluzii 90
II.3 ANALIZA CALITATIV Ă ȘI CANTITATIV Ă COMPARATIV Ă A POLIFENOLILOR DIN EXTRACTELE
DE: CALENDULA OFFICINALIS , HYPERICUM PERFORATUM , GALIUM VERUM ȘI ORIGANUM
VULGARE PRIN ELECTROFOREZA CAPILAR Ă ZONAL Ă 91
II.3.1. Introducere 91
II.3.2. Materiale si metode 91
II.3.2.1. Prepararea extractelor vegetale 92
II.3.2.2. Separarea electroforetic ă a polifenolilor 92
II.3.3. Rezultate și discu ții 93
II.3.3.1. Dezvoltarea metodei de electroforeză capilară zonală (CZE) 93

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
9
II.3.3.2. Validarea metodei de electroforeză capilară zonală (CZE) 93
II.3.3.3. Analiza electroforetic ă a probelor reale 99
II.3.4. Concluzii 105
II.4.EXTRACȚIA ȘI CUANTIFICAREA UNOR TANINURI DIN DIFERITE TIPURI DE EXTRACTE ALE
PLANTELOR STUDIATE FOLOSIND MALDI -TOF ȘI CROMATOGRAFIE ELECTROCINETIC Ă
MICELAR Ă (MEKC) 106
II.4.1. Introducere 106
II.4.2. Materiale și metode 107
II.4.2.1. Prepararea extractelor vegetale 108
II.4.2.2. Analiza taninurilor prin MALDI -TOF 108
II.4.2.3. Separarea taninurilor prin MEKC 109
II.4.3. Rezultate și discuții 109
II.4.3.1. Caracterizarea extractelor vegetale prin MALDI -TOF 109
II.4.3.2. Dezvoltarea și validarea metodei MEKC 115
II.4.3.3. Analiza probelor reale prin MEKC 120
II.4.4. Concluzii 123
III. CONCLUZII GENERALE 124
IV. BIBLIOGRAFIE

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
10

INTRODUCERE

Plantele medicinale sunt specii vegetale naturale cu propriet ăți terapeutice remarcabile.
Încă din antichitate plantele medicinale au fost utilizate în fitoterapie. Efectul terapeutic se datorează
prezen ței în compozi ția acestora a unor combina ții naturale considerate ca principii active.
Inițial, au fost cunoscute un num ăr de 14 plante medicinale folosite cu succes pentru
tratarea diferitelor boli de vechile triburi geto -dacice. P ână acum în Rom ânia au fost identificate
aproximativ 300 plante medicinale fiind utilizate frecvent în industria farmaceutic ă și alimentar ă.
Pentru o utilizare c ât mai co rectă a acestor plante medicinale este absolut necesar ă studierea
intensiv ă a fiec ărei specii în parte. Dintre cele mai importante plante medicinale cultivate la noi în
țară atenția noastră s -a îndreptat spre : Calendula officinalis (Gălbenele), Hypericum p erforatum
(Sun ătoarea), Galium verum (Sânziene) și Origanum vulgare (Șovârful). G ălbenelele sunt plante
medicinale utilizate în scop terapeutic datorit ă acțiunilor sale imporante și anume: antibacterian ă,
antifungic ă, antitumoral ă, cicatrizant ă, hepatoprotectoare, imunostimulatoare, antiinflamatorie,
antiviral ă și anti -HIV. Datorit ă principiilor sale active sun ătoarea are ac țiune antiinflamato are,
astringent ă, cicatrizant ă, antidiareic ă, vasodilatatoare, hipotensiv ă, antibacterian ă. Sânzienele sunt
utilizate de sute de ani în medicina tradi țional ă româneasc ă în tratamentul bolilor tiroidiene, bolilor
de ficat și rinichi, în tratarea reumatismului dar și a nervozit ății. Șovârful se recomand ă a fi utilizat în
tratamentul bron șitelor, traheitelor, gastritei, tusei convulsive, astmului bron șic, tusei convulsive,
datorit ă acțiunii expectorant e și antispastic e, antiseptic ă și astri ngent ă asupra organismului.
Cercet ările științifice și studiile farmacologice asupra acestor plante medicinale au permis ob ținerea
de noi informa ții despre clasele de compu și naturali prezen ți în aceste plante dintre acestea fiind
studia ți cel mai intens p olifenolii (acizii fenolici și flavonoidele).
Scopul principal al tezei de doctorat a fost caracterizarea analitică a extractelor obținute
din speciile Calendula officinalis , Hypericum perforatum , Galium verum și Origanum vulgare din
punct de vedere al conținutului în substanțe active, în special compuși polifenolici cu ajutorul
metodelor analitice specifice.
Pentru îndeplinirea acestui scop au fost dezvoltate patru metode analitice noi: două metode
cromatografice (HPLC), una de el ectroforeză capilară zonală (CZE) și una de cromatografie
electrocinetică micelară (MEKC) pentru identificarea principiilor active din extractele apoase,

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
11
hidroalcoolice (30%, 50% și 70%) și acetonice ale speciilor vegetale luate în studiu. Toate metodele
dezvoltate au fost validate par țial. Prin cromatografia de înaltă performan ță în fază invers ă au fost
identifica ți și cuantifica ți zece compu și polifenolici: acid clorogenic, acid cafeic, acid ferulic, acid
cumaric, rutin, acid rozmarinic, luteolin, querce tol, apigenin și kaempferol. Totodată, extractele
apoase și hidroalcoolice (30%, 50% și 70%) au fost caracterizate din punct de vedere al conținutului
total de polifenoli și flavonoide și al capacității antioxidante.
A fost dezvoltată o metodă LC -MS ori ginală cu ajutorul căreia au fost analizate comparativ
extractele hidroalcoolice (30%, 50% și 70%) preparate în laborator ale celor patru plante și extractele
acelorași plante existente pe piața rom ânească (extract etanolic obținut din Calendula officinali s,
extract etanolic obținut din Hypericum perforatum și extract etanolic obținut din Origanum vulgare ).
De asemenea, s -a avut în vedere compararea datelor cantitative obținute pentru extractele etanolice
(preparate în laborator și extractele comerciale) ale plantelor C. officinalis , H. perforatum , G. verum și
O. vulgare păstrate la temperatura camerei timp de 24 săptămâni cu datele cantitative obținute
pentru acelea și extracte etanolice, depozitate la temperatura de 40 C.
Metoda de electroforeză capilară zonală originală a permis identificarea și cuantificarea a 16
compu și polifenolici (rutin, naringenin, izoquercitrin, acid cinamic, acid clorogenic, acid sinapic, acid
siringic, acid ferulic, kaempferol, luteolin, acid cumaric, quer cetol, acid rozmarinic, acid salvianolic A,
acid cafeic și acid galic) din extractele apoase și hidroalcoolice (30%, 50% și 70%) ale plantelor C.
officinalis , H. perforatum , G. verum și O. vulgare .
Au fost analizate comparativ pentru prima dată extractele apoase, hidroalcoolice (30%, 50% și
70%) și acetonice ale speciilor vegetale studiate în vederea separării și cuantificării taninurilor
(catechina / epicatehina, epigalocatechina, galat de epigalocatechină și galat de epicatechină). Analiza
compozi ției în taninuri a extractelor de Calendula officinalis , Hypericum perforatum , Galium verum și
Origanum vulgare a fost realizată pentru prima dată utiliz ând ionizarea prin desorbție cu laser asistată
de matrice, cu detector timp de zbor (MALDI -TOF) și cromatograf ia electrocinetică micelară (MEKC).
Prin tehnica MALDI -TOF s -a realizat o evaluare calitativă a extractelor și s -a eviden țiat prezen ța
catechinelor, a zaharurilor dar și prezen ța altor componente (fisetinidin, isoramnetin, etc.). Metoda
MEKC par țial valida tă a permis analiza cantitativă a extractelor vegetale și a condus la selectarea celui
mai bun mediu de extrac ție a taninurilor prezente în aceste plante.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
12
I.1. CARACTERIZAREA GENERALĂ A PLANTELOR MEDICINALE

I.1.1.Calendula officinalis (Gălbenele)

Calendula officinalis (L) face parte din regnul Plantae , subregnul Tracheobionta ,
divizia Magnoliophyta , clasa Magnoliopsida , subclasa Asteridae , ordinul Astera les, familia
Asteraceae , subfamilia Calenduleae , genul Calendula [1].
Denumirile populare sub care este cunoscută această plantă în România sunt :
salomie, flori osenești calce, rujuliță, călinică, filimică, ochi galben, sosioară, cuconițe, craițe,
himilica, vâsdoage, rujinele, boance, nacotele, caldarușă , galbenare, fetișcă, roșioara [2-5].
Cea mai populară și frecvent utilizată denumire este cea de gălbenele.
Denumiri le internaționale ale acestei plante sunt : African Marigold [1], Engli sh
Marigold, Holigol d, Mary Bud [6], Calendula, English Garden Marigold, Pot Marigold [7] .

I.1.2 .Origini și răspândire
Calendula officinalis este originară din sudul Europei, zona mediteraneană și unele
părți ale Asiei [8] în prezent fiind cultivată pes te tot în lume deoarec e este una din cele mai
rezistente plante la temperaturi scăzute [9]. Ipoteza precum că gălbenelele au apărut pentru
prima dată în zonele mediteraneene, răspândindu -se apoi în toată Europa și Orientul Mijlociu
este susținută de mai mulți cercet ători, precizându -se astfel o origine mai exactă: din estul
Macaroneziei, regiunea mediterană, până în Iran [10].

Fig. I.1. Calendula officinalis [11]

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
13
I.1.3 . Caracterizarea plantei
Calendula officinalis este o plantă anuală uneori bienală. Prezintă o rădăcina p ivotantă
adâncă, de aproximativ 20 cm , tulpină erectă cu ramificații multiple. Frunzele sunt întregi,
alterne, glabre sau pubescente. Frunzele inferioare sunt spatulat -lanceolate iar cele
superioare sunt tomentoase. Poate ajunge pâna la înălțimea de 30 -50 cm [1]. Inflorescențele
sunt sub formă de capitule terminale formate din flori ligulate și flori centrale tubuloase de
culoare portocalie sau galben ă. Planta înflorește din mai până în septembrie iar fructele sunt
achene. Planta are un miros balsamic puter nic [12].

I.1.4. Compozi ția biochimic ă
Studiile efectuate pe această specie au arătat prezența mai multor clase de compuși
chimici dintre cele mai importante fiind: carotenoizi i, terpenoide le, flavonoide, aminoacizi i și
uleiuri le volatile , chinone le și cumarine le [1].

a) Carotenoizii
Identificarea ca rotenoizilor a fost realizată în extractele metanolice a diferitelor p ărți ale
plantei Calendula officinalis (Tabelul I.1.) . Raportul cant itativ al carotenoizilor totali
exprimat în mg g-1 produs uscat , a fost de 7,71% în petale, 1,61% în polen, 0,85% în frunze și
0,18% în tulpini [13,14] .

Tabelul I.1. Carotenoizii identificați în plantele de Calendula officinalis [13]
Carotenoizii identificați în petale și polen Carotenoizii identificați în frunze și tulpini
9 Z-neoxanthină neoxantină
violaxantină 9Z-neoxantină
luteoxantină violaxantină
auroxantină luteoxantină
9 Z-violaxantină 9Z-violaxantină
flavoxantină 13Z-violaxantină
mutatoxantină anteraxantină
9 Z-antroxantină mutatoxantin epimerul 1
luteină mutatoxantin epimerul 2
9 / 9-A-luteină luteină
13 / 13 -Zlutein 9 / 9-2-luteină
criptoxantină criptoxantină

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
14
licopen caroten
caroten

b) Terpenoidele , au fost identificate în principal în extractul eter ic (eter de petrol ) al
florilor de Calendula officina lis (Tabelul I.2.) .

Tabelul I.2. Principalele terpenoide identificate în specia Calendula officinalis
Denumire compus Sursa
bibliografică
sitosteroli [15]
stigmasteroli
diesteri -dioli [16]
3 monoesteri -taraxasterol [17,18]
taraxasterol
lupeol
eritrodiol [19]
ursodiol [20]
faradiol -3-O-palmitat [21]
faradiol -3-O-miristat
faradiol -3-O-laurat
arnidiol -3-O- palmitat [22,23]
arnidiol -3-O-miristat
arnidiol -3-O-laurat
calenduladiol -3-O-palmitat
calenduladiol -3-O-miristat
saponine acide oleanolice: calendulozide AH [24-27]
oleanane glicozid triterpene: calendulaglicozid O [23]
calendula glicozid ester A6 -On-metil
calendula glicozid A6'
calendula glicozid B
calendula glicozid B es ter 6-On-butil
calendula glicozid C
calendula glicozid C ester 6 -On-metil ester
calendula glicozid C 6 -O-n-butil

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
15
calendula glicozid ester F6 -On-butil
calendulozide G6 – on- metil ester
glucozide ale acidului oleanolic (găsit e în principal în rădăcinile
mature) I, II, III, VI, VII [28,29]
Glucuro nide (găsit e în principal în flori și părțile verzi ale
plantei ) [30]

c) Flavonoidele au fost identificate în principal în extract ele etano lice al florilor de
Calendula officinalis (Tabelul I.3.) .

Tabelul I.3 . Principalele flavonoide identificate în specia Calendula officinalis
Denumire compus Sursa bi bliografică
quercetină
[31]
izoramnetină
izoquercetină
[32] izoramnetin -3-O-D-glicozidă
narcisină
calendoflazide
calendoflavozide
[23,33] calendoflavobiozide
rutin
neohesperidozidă
izoramnet in-3-O-neohesperidozidă
izoramnetin -3-O-2G-ramnozil rutinozidă
izoramnetin -3-O-rutinozidă
quercetin -3-O-glucozid
quercetin -3-O-rutinozid
acid cafeic
[33]
acid clorogenic

d) Uleiurile volatile – s-a observat că uleiurile volatile diferă cantitativ în funcție de
fenofaza plantei . Astfel, în faza de înflorire deplină întâlnim o cantitate maximă de ulei volatil
(0,97 %) iar în faza de buton floral conținutul este minim (0,13%). Uleiul esențial este bogat în
cadinenă, cadinol, (+)-T-muurolol , limon en, 1,8-cineol și p-cimen [34]. Principalele

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
16
monoterpene și sesquiterpene identificate în extractele de Calendula officinalis sunt: tuienă ,
pinenă, sabin enă, limonene, 1,8 -cineol, p -cimen, 3 -carenă, nonanal, terpenă -4-ol, oplopenonă,
trans-ocimen -terpenenă , 3 -cilohexenă -1-ol, felandrenă, humulenă , germacrenă D,
aloaromadendrenă, salienă, calarenă, ilangenă, terpeneol , geraniol, carvacrol, acetat de bornil,
acetat sabinil, cubebenă, copaenă, bourbonenă, gurjunenă, aromadendrenă, cadinenă, cadină
1,4-dienă, nerolidol, palustron, endobourbonenă, cadinol, cariofilenă, murolenă, muurolol.

e) Aminoacizii
În extractul etanolic a florilor de Calendula officinalis au fost identificați un număr
de 15 aminoacizi în formă liberă: alanină, arginină, acidul aspartic , aspargină, valină,
histidină, acidul glutamic, leucină, lizină, prolină, serină, tirozină, treonină, metionină și
fenilalanină. Raportul cantitativ al amin oacizilor totali exprimat în mg g-1 produs uscat a fost
de 4,5% în flori, 5% în frunze și 3,5% în t ulpini [35].

f) Carbohidrații
În extractul hidroalcoolic al inflorescențelor de gălbenele cultivate în Europa au fost
identificate de Varlijen J., (1989) [36] și Wagner H . și colab oratorii (1985) [37] următoarele
fracții polizaharidice : fracția polizaharidic ă I, fracția polizaharid ică II și fracția polizaharid ică
III împreună cu monozaharide.

g) Lipidele
Pentru identificarea lipidelor au fost analizate extractele eter ice (eter de petrol ) din
semințe, frunze și flori de Calendula officin alis. În semințe au fost identificate 15,7% lipide
neutre, 0,6% fosfolipide și 0,9% glicolipide [38, 16 ]. De asemenea, uleiul din semințele de
gălbenele conține un acid gras oxigenat (acidul 9-hidroxi-10, 12-octadecadienoic ) [39] iar în
flori au fost ident ificați următorii acizi grași: lauric, miristic, palmitic, stearic, oleic, linoleic și
acidul linolenic.

h) Cumarinele – au fost identificate în extractul etanolic al florilor de Calendula
officinali . Principalele cumarine sunt reprezentate d e: scopoletina, umbeliferona și esculetina
[40].
i) Chinonele detectate în gălbenele au fost: plastochinone, filochinone și ubichinone
[41].

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
17
j) Alte componente
Alți compuși chimici identificați în extractele de Calendula officinalis au fost:
loliolidă, calendulin și n-parafină [42-44].
I.1.5. Proprietăți terapeutice
Numeroasele studii farmacologice au raportat p roprietățile terapeutice ale speciei
Calendul a officinalis printre care amintim : acțiunea antibacterian ă și antifungică,
antitumorală, cicatrizant ă, antioxidant ă, hepatoprotectoare, imunostimulatoare,
antiinflamatorie, antiedemoas ă, antiviral ă și anti-HIV.

 Acțiunea antibacterian ă și antifungică
Studiul descris de Iauk L. și colaboratorii (2003 ) [45] a constat în caracterizare a unui
extract mentanolic și a un decoct (10%) din flori de gălbenele urmărindu -se acțiunea acestora
împotriva bacteriilor paradontale anaerobe și aerobe facultative. Speciile testate au fost
Porphyromonos gingivalis , Prevotella spp ., Furobacterium nuclea tum, Caphocytophaga
gingivalis , Veilonella parvula , Eikenellacorrodens , Peptostreptococcus și Actinomyces
odontolyticus . Rezultatele obținute au arătat că extractele de Calendula officinalis au avut o
activitate mai scăzută de inhibare ( 2048 mg L-1) împotr iva tututror speciilor testate cu
excepția speciei Prevotella spp . De asemenea, uleiul esențial din flori le de Calendula
officinalis s-a dovedit a fi un bun antifungic fiind testat pe diferite sușe fungice precum
Candida albicans , Candida dubliniensis , Candida parapsilosis , Candida glabrata , Candida
tropicalis , Candida guilliermondii , Candida krusei și Rhodotorella spp ., utilizându -se o
concentrație de 15 μL / disc de cultură [46]. Potențialul antimicrobian a extractelor alcoolice
de Calendula officinalis au fost testate pe fungi și bacterii. Eficacitate cea mai mare a fost
rapor tată pentru extractele metanolice comparativ cu cele etanolice [47]. Extractele de
Calendula officinalis sunt utilizate și ca tratament homeopat în medicina dentară . Utilizarea
lor z ilnică sub formă de apă de gură scade apari ția cariilor și previne procesele inflamatorii
cum ar fi gingivita, mucozită, parodontita și peri -implantitis [48].

 Acțiunea anti tumoral ă
Acțiunea anti tumorală a speciei Calendula officinalis a fost testată la șoareci in vitro
pe linii celulare tumorale demonstrându -se activitatea antitumorală a extractul ului metano lic
din flori de gălbenele [23]. Izolarea compușilor și testarea individuală acestora a arătat
prezența următorilor compuși cu activitate anticanceroa să:

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
18
 calendulozida F6' -O-n-butil ester ce prezintă acțiune activă împotriva: leucemiei, la
o concentrație de 23,1 μmoli; a cancerului de colon, la o concentrație de 0,77 μmoli; a
cancerului de piele, la o concentrație de 0,77-0,99 μmoli; a cancerului renal, la o
concentrație de 17,2 μmoli; a cancerului de sân, la o concentrație > 50 μmoli;
 calendulozida G6' -O-metil ester care este activă împotri va tuturor liniilor celulare de
cancer men ționate mai sus; în plus, prezintă acțiune și împotriva cancerului ovaria n, la
o concentrație de 20,1 μmoli [23].
De asemenea, a u fost semnalate acțiuni citotoxice și pentru extractele din frunze,
flori sau plantă întreagă. Acțiune a antitumorală a extractelor de gălbenele a fost dovedită prin
testarea fracțiunil or saponifi cate pe șoareci in vivo [49]. Medina E.J. și colab oratorii (2006 )
[50] au studiat modul în care e xtractele apoase d in flori de gălbenele au arătat in vitro o
puternică inhibare a proliferării celulelor tumorale ale șoarecilor prin blocarea ciclului celular .

 Acțiune cicatrizantă
Pentru a se demonstra ac țiunea cicatriz antă a extractelor de gălbenele s-a studiat
influența acestora asupra migrației fibroblastelor și a proliferării lor în zona leziunilor care au
fost analizate. Astfel, chiar la concentrații sc ăzute de 10 pg mL-1 numărul de celule a crescut
cu 64,35% în cazul extractului în hexan și cu 70,53% în cazul extractelor etanolice de
gălbenele [51]. Extractul etano lic din flori de gălbenele a fost testat și împortiva arsurilo r
termice induse experimenta l la șobolani. Prin utilizarea unor doze diferite de extract (20, 100,
și 200 mg kg-1 greutate corporală) s-a constatat că cea mai eficace doză este cea de 200 mg
kg-1 corp. Acesta a dus la amel iorarea semnificativă a rănilor prin creșterea conținutului d e
hidroxiprolină în colagen și a hexozaminei. Nivelul proteinelor în faza acută a scăzut în mo d
semnificativ constatându -se în paralel o scădere a peroxidării lipidelor datorită acțiunii
antioxidante a extractelor respective [52].

 Acțiune antioxidant ă
Popovic M. și colaboratorii (2009) [53] confirmă capacitatea antioxidantă a
extractulu i metanolic (de concentrație 70 %) al speciei Calendula officinalis prin testarea
influenței acestuia în peroxidarea indusă a lipidelor lipozomale. Studiul descris de Fran kic T.
și colaboratorii (2008 ) [54] a constat în caracterizarea extractelor cu propilen glicol din petale
și flori de g ălbenele. Analizele indic ă faptul că extractul din petale a prezentat capacitate
antioxidant ă mai mare co mparativ cu extractul din flori . Datorită capacității antioxidante

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
19
ridicate, extractele de gălbenele ar putea avea utilizare terapeutică în combaterea
complicațiilor diabetice cronice ș i pentru încetinirea procesului de îmbătrânire [55].

 Acțiune hepatoprotectoare
Pentru a se demonstra activitatea hepatoprotectoare, extractele hidroalcoolice a le
florilor de Calendula officinalis au fost testate pe șoareci , în doză de 10 mL kg-1 corp. Acest ea
au determinat o reducere cu 28,5 % a citolizei hepatice în paralel cu reducer ea nivelurilor
enzimelor glutam at-oxalat -transaminaza și glutam at-piruvat -transam inaza . Testele
enzimologice au arătat de asemenea , o reducere a nivelurilor lacta t dehidrogenazei , succinat
dehidrogenazei , citocrom oxidazei și adenozin trifosfatazei [56]. Testel e in vitro au arătat că
decoctul din flori de Calendula officinalis recoltate din Canada administrat la o concentrație
de 2000 μg mL-1 a prezentat activitate împotriva a cinci tipuri de cancer uman la ficat cu un
efect inhibitor de 25 -26% [57].

 Acțiune im unostimulatoare
Fracțiile polizaharidice din extractele etanolice ale speciei Calendula officinalis au
prezentat activități imunostimulatoare. Testate in vitro fracția polizaharidic ă III la o
concentrație de 10-5 – 10-6 mg mL-1 a condus la cea mai mare fagocitoză (54 -100%) în timp ce
fracția polizaharidic ă I și II au condus la fagocitoză în procent de 40-57% respectiv 20-30%
[36, 37].

 Acțiu ne antiinflamatorie și antiedemoasă
Acțiunea a ntiinflamatorie și antiedemoasă se pare c ă este legată de prezen ța
terpenoidelor constituent e, în special a celor glicozidice din extractele de g ălbenele conform
studiilor realizate de Ukiya M. și colaboratorii ( 2006 ) [23]. Un rol foarte important îl au
esterii faradiol 3 -miristic, faradiol 3 -palmitic și 4-taraxasterol găsiți în extractele de gălbenele ,
conform studiiilor descrise de Della R.L. și colaboratorii (1990; 1994) [58, 59]. Aceștia
prezintă capacitate a de reducere a edemelor de până la 50% la o doză de 240 μg/cm2.
Activitățile antiedemoase ale compu șilor ( esterul faradiol 3 -miristic, faradiol 3 -palmitic și c-
taraxasterol ) au fost testate pe edeme prezente pe urechile de șoareci. În urma analizelor,
studiile au arătat că ambii esteri faradiol prezint ă activitate antiedemoas ă mult mai mare
comparativ cu c-taraxa sterol iar efectul de inhibare a ed emelor a crescut cu până la 65 -66%
[18]

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
20
 Acțiune antivirală
Testele efectuate pe șoareci in vitro au demonstrat acțiune a antivirală a tincturii de
gălbenele asupra virusurilor herpes și a gripei de tip A [60].

 Acțiunea anti -HIV
Acțiunea anti -HIVa fost pusă în evidență in vitro utilizându -se extract e organice și
apoase din flori le uscate de Calendula officinalis . Ambele extracte au fost relativ netoxice
pentru liniile limfocitare uman e Molt -4 dar numai cel or ganic a prezentat activitate anti -HIV.
Astfel, s -a obțin ut inhibarea HIV1 –RT la o concentrație de 100 μg mL-1 iar la concentrați a de
500 μg mL-1 s-a observat sup rimarea acțiunii virusului HIV . Aceste rezultate au sugerat că
extractul organic de flori din Calendula officinalis are proprietă ți anti -HIV de interes
terapeutic [61].

I.1.6. Forme de utilizare
Rezultate remarcabile detaliate în studiul efectuat de Mishra K. și colaboratorii (2012 )
[62] au fost obținute în urma testării unei creme pe bază de ule i esențial din florile de
Calendula officinalis . În urma simul ării intensității radiației solare s-a constata t că această
cremă protectoare prezintă un coeficient de protecție de 14,84± 0,16% fiind recomandată
pentru protejarea pielii împotriva r adiațiilor UV dar și pentru menținerea unei pigmentații
naturale ale pielii . Extractele alcoolice ale petalelor de Calendula officinalis sunt utilizate
datorită activității lor antimicrobiene remarcabile. Potențialul antimicrobian a l extractelor a
fost evaluat pe unui grup de microorganisme izolate de la pacien ți din Spitalul ora șului
Belfast (bacterii și ciuperci ) folosind testul de difuzie în disc. Extractele metanolice au
prezentat o mai bună activitate antibacteriană împotriva majorită ții bacteri ilor testate
compa rativ cu extractele etanolice [63]. Aplicarea zilnică a unui gel de gă lbenele în
concentrație de 2% este recomandat pentru cicatrizarea rănilor [64]. Derivatele farmaceutice
care pot fi ob ținute folosind această plantă sunt: infuzia (1 linguriță de plant ă la un sfert de
litru de apă); tinctura (câteva grame de flori într -un litru de alcool, se lasă 14 zile la soare sau
la căldură (200 C)); crema cu extract de gălbenele (poate fi utilizat ă în combaterea obstrucției
limfatice ) [65]; suc proaspăt (frunzel e, tulpinile și florile se trec printr -un storcător electric de
uz casnic ) [66]; băi de șezut; spălaturi.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
21
I.2.1 . Hypericum perforatum (Sunătoarea )
Hypericum perforatum (L) face parte din regnul Plantae , subregnul Tracheobionta ,
divizia Magnoliophyta , clasa Magnoliopsida , ordin Theales , familia Hypericaceae , genul
Hypericum .
Denumiri le populare ale plantei sunt : pojar, pojarnică, sunaică, zburătoare, șerlai,
barba -lupului, buruiană -de-năduf, floare -de-năduf, floare -galbenă,crucea -voinicului, iarba –
crucii, iar ba-spaimei iarba -lui-sf.-Ioan, iarba -sângelui, iarba -spurcății, osul -iepurelui, sovârf –
galben [67], pojarniță, fălcățea, harnică, drobișor, închegătoare [68]. Cea mai frecvent
utilizată denumire populară este cea de sunătoare.
Denumiri le internaționale utilizate sunt : St. John’s Wort, perforate St John’s wort,
common St . John’s wort, klamath weed, hypericum, goat weed [69], Hypericum, hardhay
(Engl), Hyperici herba (Lat), Johanniskraut, Sonnenwendkraut, Hartheu (Ger), herb de
millepertuis (Fr), iperico (I tal), prikbladet perikon (Dan) [70 ], hypericum millepertuis [71].

I.2.2 .Origini și răspândire
Sunătoarea este originar ă din Europa, Asia de Vest și Africa de Nord. Este o plantă
care se adaptează foarte u șor fiind prezentă în numeroase păduri, pășunile săra ce, zone
neglijate, în culturi , pe marginile drumurilor și în zonele l imitrofe culturilor [72]. Planta poate
fi întâlnită și în zonele reci, montane și poate fi cultivată ca plantă medicinală [73]. În prezent
planta poate fi întâlnită în zonele temperate ale lumii (America de Nord, America Centrală,
America de Sud, Australia , Noua Zeelanda, Africa de Sud, India, Japonia, Insulele M ascarene
și Papua Noua Guinee ) [74].

Fig. I.2. Hypericum perforatum [75]

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
22
I.2.3. Caracterizarea plantei
Sunătoarea este o plantă perenă, care prezintă două etape de creștere. În primul an
formează o rozetă de frunze iar în primăvara și vara următoare dezvoltă una sau mai multe
tulpini de 30 -120 cm înălț ime [76]. Tulpina este lemnoasă și prezintă numeroase ramificații.
Frunzele sunt oval-eliptice, opuse câte două cu puncte negre spre margine. Flori le au
diametrul de 2 cm, dispuse în corimb în vârful tulpinii și a ramurilor. Ca liciul și corola sunt
pentamere cu sepale lanceolate și petale galbe n aurii, cu puncte negre iar f ructul este o
capsulă ovală [77 ].

I.2.4 . Compozi ția biochimic ă
Extractele de sunătoare sunt bogate în compuși biologic activi inclusiv rutin ,
pectină, colină, sitosterol, hipericină și pseudohipericină (compuși cu un real potențial în
tratamentul SIDA ) [78]. Principalii constituienți bioactivi întâlniți în extractele de sunătoare
sunt hipericina și hiperforina existând pe lâng ă aceștia și alte componente active, ca
flavonoidele și taninurile [79]. În Tabelul I.4 . sunt prezentate principiile active ale acestei
plante raportate în literatura de specialitate.

Tabelul I .4. Principalii compuși biologic activi identificați în specia Hypericum
perforatum
Denumirea Sursa
bibliografică
hipericina
[80,81 ] pseudohipericina
izohipericina
protohipericina
protopseudohipericina
ciclopseudohipericina
flavonoli (kaempferol, quercetin)
[80, 82 -85] flavone simple (luteolin)
glicozide
catechine
rutin
[86, 87 ] hiperozid
izoquercitin

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
23
ulei eteric [80]
rezine [80]
tanin [80,88 ]
hiperforină [80,84 ]
adhiperforină [84]
acizii: cafeic, ascorbic, nicotinic, valerianic, izovale rianic,
palmitic, stearic, miristic, clorogenic, cumaric, p-cumaric, ferulic,
p-hidroxibenzoic și acizii vanilici [80, 88 -90]
alți compuși: carotenoizi, colină, saponine, nicotinamidă, β –
sitosterol, pectină, hidrocarburi saturate cu catenă liniară (C16,
C30 ), alcooli (C24, C26, C28) [80,89 -91]

De asemenea, literatura de specialitate menționează următoarele principii active dar și
conținutul lor procentual în planta proaspătă [92-94,79]:
 Naftodiantrone: hipericină 0,09 % și pseudohipericină 0,23 %;
 Floroglucinoli: hiperforină 2 -4,5% și adhiperforină 0,2 -1,8%;
 Flavonoizi: quercitină 2%, hi perozidă 0,7 %, quercitrină 0,5%, izoquercitină 0,3%, rutin
0,3%, ametoflavone 0,01 -0,05% și I3, II8 -biapigenin 0,1 -0,5% ;
 Procianidine 12% ;
 Taninuri 6 -15%;
 Uleiuri esențiale 0,06-1%;
 Aminoacizi 0,01% ;
 Acizi fenolici : acid cafeic 0,1% și acid clorogenic <0,1% ;
 Compuși solubili în apă (acizi organici, peptide, polizaharide) 0,5 %;
Conținutul în hipericină și derivații ei a fost estimat la 0,1 -0,15% în planta proasp ătă de
Hyperic um perforatum în studiul efectuat de Vanhaelen M. și colaboratorii (1983) [81].
Hipericina, pseudohipericina, izohipericina , protohipericina, protopseudohipericina, alături de
ciclopseudohipericină se regăsesc în special în planta proaspătă. Extractele de sunătoare
conțin flavone simple , glicozide, flavonoide compuse [82, 83], flavonoli (kaempferol,
quercetin) dar și catechine (flavonoide asociate cu taninuri condens ate) [84, 85 ]. În sunătoare
conținutul în hiperforină variază între 2 și 4,5% iar în adhiper forină de la 0,9% la 1,9% [84]
iar conținutul în rutin a fost estimat la 1,6%, în hiperozid de 0,9% și izoquercitin de 0,3%
[86]. Literatura de specialitate menționează prezența unor polifenoli cum sunt: acidul cafeic,
acidul c lorogenic, acidul p -cumaric , acidul ferulic , acidul p-hidroxibenzoic și acizii vanilici.
De asemenea, în Hypericum perforatum au fost detecta te cantități mici (0,05 -0,9%) de uleiuri

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
24
volatile în special α și β -pinen, α -terpineol, geraniol și urme de monterpene și sesquiterpene
[89] dar și metil -2-octan (în proporție de peste 30%), n-nonane și n-undecan [90].

I.2.5. Proprietăți terapeutice
Datorită compușilor biologic activi existen ți în sunătoare, aceasta prezintă o serie de
acțiuni benefice:
 Acțiune de ameliorare a bolilor sistemului nervos dar și a alcoolismului
De secole, sun ătoarea este folosit ă pentru tratarea tulburărilor psihice fiind utilizată în
prezent și ca tratament naturist împotriva depresie i [95]. De asemenea, a fost folosită de foarte
mult timp în tratarea : excitabilită ții, nevralgiilor, sc iaticii, nevrozelor, anxietății [96 ] tratarea
insomniilor și alcoolismului [70]. Sunătoarea este recomandată ca fiind un bun antidepresiv,
antinevralgi c, remediu al durerilor prezente în zona spinării (leziuni, nevralgii, sciatică,
reumatism muscular) și împotriva tulburărilor psihice ușoare (excitabilitate, menopauză,
anxietate și nervozitate) [70].

 Acțiune antibacteriană și antivirală
Acțiunea antibacterian ă a sunătoarei este dată de prezen ța hiperforinei care are
proprietăți antib acteriene excelente [97 ]. Sunătoarea a fost testată pe Staphylococcus aureus
[90] precum și pe Streptococcus pyogenes și Corynebacterium diphtheriae [98] obținându-se
rezultate remarcabile. Dar efectul antibactericid este semnalat doar în concentrații ridi cate ale
hiperforinei [99, 100]. Activitatea antivirală este dată de prezența flavonoidelor în extractele
de Hypericum perforatum [101]. Hipericina a fost studiată în ceea ce prive ște activitatea sa și
posibil ul mecanism al acesteia împotriva virusului her pes simplex (HSV -1). Testele au
sugerat că hipericina a fost mult mai eficientă împotr iva HSV -1 ca un agent antiviral decât ca
un agent antiviral intracelular [102, 103 ]. De asemen ea, studiile efectuate au demonstrat faptul
că hipericina prezint ă activitate împotriva HIV și hepatitei C [104]. Studiile mai recente
efectuate de Bone K. și Mills S. (2013 ) [70] au arătat eficacitatea produselor farmaceutice pe
bază de extract de Hypericum perforatum în prevenirea herpes ului, varicelei , febrei glandulară
și a hepatitei virale .

 Activitatea antitumorală
Activitatea antitumoral ă a extractului de Hypericum perforatum a fost demonstrat ă in
vitro prin testarea extractelor pe mai multe tipuri de celule tumorale , la șoareci . Testele au
arătat că prezența hipericinei inhibă direct activitatea fa ctorului de proliferare tumoral ă. Cu

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
25
toate astea , nu se poate concluziona faptul că extractele de Hypericum perforatum sunt
eficient e împotriva celulelor tumorale consitutind astfel subiectul cercet ărilor viitoare [105].

 Acțiune vasodilatatoare și diuretică
Sunătoarea este utilizată frecvent în tratamentul afecțiunilor gastrice fiind întâlnită în
compoziția ceaiurilor gastrice și hepatice. Împortantă este și prezența vitaminei P determinat ă
de glicozidele cveretolului dar și de prezența hiperozidei cu proprietăți vasodilatatoare [77].
Alt studiu referitor la acțiunea vasodilatatoare, diuretic ă și hipotensivă a sun ătoarei este cel
raportat de Bone K. și Mills S. ( 2013 ) [70].

 Acțiune antiinflamatoare, a ntiseptică, cicatrizantă
Planta se utilizează ca antiinflamator al căilor bronșice și genito -urinar e și are acțiune
cicatrizant ă, antiulcero asă, antihemoragic ă, antihemoroidal ă, antinev ralgică [77], astringent ă
și antiseptic ă [96]. Ingerarea plantei sau în unele cazuri contactul cu seva plant ei poate
provoca fotosensibilitate la unele pers oane [106 ].

I.2.6 . Forme de utilizare
Hypericum perforatum are numeroase forme de utilizare:
– macerat ul uleios sau untul de sun ătoare este utilizat în medicina tradi țională ca cicatrizant
[77];
– uleiul din sunătoare este indicat pentru alergii, dureri de cap, eczeme, iritații, bilă leneșă,
tratamentul pietrelor la vezică [77] pentru tratamentul rănilor, vânătăilor, sc iaticii,
reumatismului muscular [70];
– infuzia din flori de sunătoare se fol osește cu succes împotriva gastritei ;
– infuzia din planta întreagă se utilizează în caz de gingivite, abcese dentare, afte și răni
bucale, cataplasme pentru tratarea rănilor și a nevr algiilor [77] uz intern [70];
– pulberea este indicată în cazul tulburăr ilor emoționale puternice [77];
– tinctura este folosită contra depresiilor, stărilor de anxietate și neliniște [77];
– preparatele tonice sunt utilizate împotriva depresiilor, anxietății și pentru tratarea leziunilor
[96];

I.3.1 . Galium verum (Sânzienel e)
Galium verum (L) face parte din regnul Plantae , subregnul Tracheobionta ,
încrengătura Magnoliophyta , clasa Magnoliopsida , ordinul Gentianales , familia Rubiaceae ,
genului Galium [107]

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
26
Denumiri le populare române ști ale plantei : floarea Sf ântului Ion, cornățel,
asprișoară, turiță lipicioasă, beteala reginei [108], floarea -lui-Sântion, sânzâiană albă,
sâmiană , sânzănioară , smântânică , răcuină, beteala -reginei, sânziene -de-grădină, crețușcă,
sălcioară, năvalnicul -ăl-mare; sânziene -de-pădure, năvalnicul -ăl-mare; sânziene -de-pădure,
mama -pădurii [109], drăgaică, sânziene, lipicioasă, închegătoare, smântânică, petela reginei,
sanziană galbenă [110].
Denumiri le internaționale : Yellow Bedstraw, Yellow Spring bedstraw [111], Yellow
Bedstraw, Petty Mugget, Cheese Renning, Cheese Rennet [112], Hedge Bedstraw, Robin -run-
the-Hedge, Maiden's Hair, Strawbed, Cheese Rennet, Cheese Running , Lady's Bedstraw
[113].

I.3.2. Origini și răspândire
În prezent, Galium verum originară din Europa și Asia de Vest este răspândită pe tot
globu l până la altitudini de 1700 m. Este o plantă iubitoare de umiditate și lumină întâlnită
prin păduri , tufărișuri, fânețe, pe marginea de drumuri și în culturi [114].

I.3.3. Caracterizarea plantei
Galium verum este o plantă perenă cu rădăcini adventive și rizomi. Tulpinile sunt
muchiate și netede cu înălțimi cuprinse între 15 până la 120 cm . Frunzele sunt linear ascuțite
de 10 -30 mm, netede, lucioas e, păroas e pe partea inferioară. Florile grupate în panicule
terminale dense sunt puternic parfumate, galbene, mici de 5 -8 mm. Fructele sunt mericarpe
elipsoidale , turtite lateral, de 1,5 -2 mm [115].

Fig. I.5. Galium verum [116]

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
27

I.3.4. Compozi ția bioch imică
Sânzienile ocupă un prim loc în medicina naturistă datorită compoziție i biochimice
foarte variate ( iridoide, flavonoide, taninuri, vitamine și alți compuși activi ). În Tabelul I.5.
sunt prezentați principalii compuși biologic activi identificați în Galium verum.

Tabelul I.5 . Principalii compuși biologic activi identificați în specia Galium verum
Denumirea compusului Sursa
bibliografic ă
acid clorogenic [117-120]
rutin
luteo lin 7-O-glucozidă
flavonoizi
acizi polifenolici
8-O-acetilharpagidă
acid oleanolic
acid cafeic
acid p -cumaric
β-sitosterol
acid iridoidic
uleiuri esențiale [121]
fenoli [117-119]
antrachinone: 1,3-dihidroxi -2-metilantrachinonă,
fizcionă, 2 -hidroxi -1, 3 -dimetoxiantr achinonă, 2,5 –
dihidroxi – 1,3-dimetoxiantr achinonă [122-124]

taninuri [125]
saponine
uleiuri esențiale
ceruri
vitamina C
7-iridoid glicozidă [126]
asperulozidă
acid asperulosidic
monotropene

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
28
acid-diacetil asperulozidic
6-O-epi-acetilscandozidă
dafilozidă și deacetil – dafilozidă
2 glicozid -flavonol
astragalină

Hemcischi L. A. (2010 ) [127] a indic at prezența iridoide lor (0,61-1,33 g% acubozidă ),
flavonoide lor (1,66 -5,84 g% rutin) și a acizi lor polifenol -carboxilici (1,44-2,44 g% acid
clorogenic ) în extractele de Galium ver um recoltate în anul 2008. O analiză calitativă și
cantitativă comparativă a flavonoidelor din păr țile aeriene de Galium verum L. și Galium
molugo L. a fost efectuată de Tămaș M. și colaboratorii (2006 ) [117]. Analiza calitativă a
flavonoidelor efectuate p rin TLC arată diferen țe semnificative între cele două specii,
compusul comun unic fiind rutin . Au fost identificați 5 flavonoizi (acidul cafeic, acidul
clorogenic, rutin, hiperozida și cvercitrozida) și 2 compuși fenil -propanoidici. Conținutul total
de fla vonoide e ste de trei ori mai mare în Galium verum (2,24 %) decât în Galium molugo
(0,72 %). Compozi ția chimică a uleiului esen țial obținut din păr țile aeriene ale speciei Galium
verum din Iran a fost examinat de Mirza M. și colaboratorii (2004 ) [128]. Uleiul izolat prin
hidro distilare conține un număr de 23 de compuși, cei mai reprezentativi fiind β -cariofilan ul
(26%), oxid ul de cariofilan (1 6,2%) și germacren D (11,2 %).

I.3.5. Proprietăți terapeutice
Studiile de specialitate evidenț iază o serie de propriet ăți terapeutice ale extractelor de
sânziene . Utilizat e destul de mult în medicina tradițională, sânzienele sunt folosite și în
prezent în combaterea pietrelor la rinichi, în diverse boli urinare, pentru tratarea epilepsiilor și
a crizelor de isterie dar și ca plantă de leac pentru erup țiile cutanate [129]. Sânzienele prezintă
proprietăți diure tice, antidiareice, sedative și spasmolitice [130] având efecte benefice asupra
nervozității, fobiilor, bolilor cardiovasculare ș i unele afecțiuni ale ficatului [88]. Medicina
tradițională sârbă utilizează produsele pe bază de Galium verum în cazul gutei . Studiile
efectuate de Lakić și colaboratorii (2010) [118] au pus în evidență capacitatea antioxidantă
remarcabilă a extractelor metanolice de sânzâiene cultivate în Se rbia. Testele efectuate in
vitro , folosind metoda Drabkin de către Mitic V. D. și colaboratorii (2014 ) [131] au urmărit
dacă extractele metanolice de Galium verum din Serbia prezintă activitate hemolitic ă.
Totodată, s-a măsurat capacit atea antioxidant ă utilizând radicalii DPPH și ABTS a extractelor
metanolice dar și conținutul de polifenoli și flavonoide totale. Rezultatele obținute au

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
29
demonstrat faptul c ă extractele metanolice prezint ă activitate hemolitic ă slabă dar valorile
capacității antioxidant e (70 și 75 μg mL-1) au indicat faptul că această plantă reprezintă o
sursă naturală de antioxidanți . Proprietățile antioxidante semnificative ale extractelor
metanolice ale speciei Galium verum din estul T urciei comparativ cu extractele apoase au fost
demonstrat e de Mavi A. și colab oratorii (2004 ) [132] care au măsurat capacitatea antioxidantă
prin me toda cu radicalul DPPH și au determinat con ținutul de po lifenoli totali ale extractelor .
Proprietăți le diuretice, depurative și spasmolitice sunt date de prezen ța compuși lor fenolici și
al irioide lor ceea ce face ca planta să fie utilizată frecvent în tratamentul pietrelor la rinichi, în
cazul anemiilor și a hidropiziei [133], în tratamentul psoriaz isului și al reumatismului [134,
135], în tratarea furunculelor și al e punctelor negre. Galium verum a fost folosit în cele mai
multe cazuri ca un decoct în medicina tradi țională. Schmidt M. și colaboratorii (2014) [136 ]
au raportat într-un studiu i nfluența decoct ului asupra celulelor tumorale . Citotoxicitatea se
pare că este influențată de prezența glicoproteinei P iar k eratinocite le mucoaselor au arătat
sensibilitate scăzută împotriva concentra ției ridicate de Galium. În concluzia acestui studiu, se
pare că decoctul de Galium verum poate fi utilizat concomitent cu tratamen tul medicamentos
împotriva cancerului .

I.3.6. Forme de utilizare
Datorită proprietăților sale, sânzienele pot fi utilizat e sub mai multe forme și anume:
– ceaiuri, utilizate în tratamentul bolilor de ficat, rinichi, splină, pentru sistemul limfatic,
reușește eliminarea toxinele din aceste organe;
– infuzie , indicată în tratamentul noduli lor tiroidieni, a hipotiroidiei ;
– suc din planta proaspătă , utilizat în boli de piele;
– crema , folosită în combaterea lombosciaticii [137];
– decoct , indicat în oprir ea hemoragiilor nazale , combaterea afecțiunile glandei tiroide [138];
– unguentul, calmează starea de oboseală a picioarelor;

I.4.1.Origanum vulgare (Șovârful)
Origanum vulgare (L) face parte din regnul Plantae , subregnul Tracheobionta ,
încrengătura Magn oliophyta , clasa Magnoliopsida , ordinul Lamiales , familia Lamiaceae ,
genului Origanum [107].
Denumiri le populare române ști ale plantei : șovârf, solovârf, solonic, broască,
origan, budeană, busuiocul fecioarelor, dost, milot [108], ferăstău , majoran , pălări a-cucului,

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
30
stropan, trifoiște [109], busuioc de pădure, busuiocul feciorilor, măgeran sălbatic, poala sfintei
Marii [110 ].
Denumiri le internaționale : Spanish Thyme [139], Orenga , Greek Oregano ,
Marjolaine bâtarde , Marjolaine sauvage, Marazolette, Kostets, dost, origano commune [111],
Wild mar joram, English marjoram, Grove marjoram, Pot marjoram, Wintersweet [140].

I.4.2.Origine și răspândire
Șovârful este originar din zona muntoasă mediteraneană, din Grecia, Asia Mică și
Italia iar în prezent o putem întâlni în Asia, Europa și Africa de Nord, prefer ând solurile
calcaroase [112]. Planta se poate întâlni pe solurile uscate , în lum inișuri, în păduri, pe
marginea drumurilor dar și în zonele muntoase până la 2000 m altitudine [141].

I.4.3. Descrierea plantei
Origanum vulgare este o plantă perenă cu înălțimi ce poate atinge 90 cm . În pământ
are un rizom lignificat gros de 2 -3cm iar tulpinile de culoare ro șiatică sau verde (sterile și
florifere ) sunt ramificate în partea superioar ă. Frunzele sunt opuse, ovoide, ascu țite sau
prismatice, cu marginea întreagă sau u șor dințate de 10 -40 mm lungime, late de 4 -25 mm, pe
partea inferioară preze ntând peri șori fini. Florile sunt mari de 5 -30 mm ș i sunt adunate în
spice cu buchete globuloase, terminale . Bracteele sunt de 4 -5 mm, ovale sau alungi te de
culoare purpurie sau gri [141].

Fig. I. 6. Origanum vulgare [143]

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
31
I.4.4. Compozi ția biochimic ă
Uleiurile esențiale extrase din Origanum vulgare reprezintă principala clas ă de
compuși aceștia putând fi folosiți ca antioxidanți naturali în produsele alimentare . Studiu l
raportat de Quiroga1 R. P. și colaboratorii (2013 ) [143] au evidențiat compoziția chimică,
conținutul polifenolic , activitatea antioxidant ă și activitatea antilipolitic ă a uleiuri lor esențiale
de oreganum . Principalii compu și găsiți în ulei ul esențial de oreganum au fost c -terpinene
(32,10%), o -terpinene (15,10%), p -cimen (8,00%) și tim ol (8,00%). Origanum vulgare L.
cultivat în regiunile Liguria și Emilia din nordul Italiei a fost analizat pentru con ținutul în ulei
esențial de către D’Antuono și colaboratorii (2000 ) [144 ]. Pe baza compozi ției de ulei ,
probele au fost alocate la trei gru pe principale: primul grup a avut un con ținut ridicat de
carvacrol/ timol; al doilea a fost caracterizat printr -o compozi ție de sesquiterpene și un
conținut ridicat de linalool și al treilea a fost caracterizat prin prezen ța abundentă de
sesquiterpene. În uleiul esențial de ore ganum au fost identifi cați un număr de 64 de compuși
iar conținutul acestora în diferite părți ale plantei a fost în medie de: 3,27 mg g-1 s.u. produs
uscat, în frunze; 20, 81 mg g-1s.u. produs uscat, în flori; 18,74 mg g-1s.u produs uscat, în
amestecul de frunze și flori. Principalii compu și identifica ți în uleiurile esențiale sunt detaliați
în Tabelul I.6 .

sabienă (Z) β -ocimenă β-cariofilienă spatulenol
Fig. I.7. Principalele monoterpene din uleiul
esențial de Origanum vulg are [145]
Fig. I.8 Principalele sesqiterpene din uleiul
esențial de Origanum vulgare [145]

Tabelul 1.6 . Prin cipalii compuși biologici identificați în uleiurile esențiale ale speciei
Origanum vulgare
Denumire compus Sursa
bibliografic ă
γ-terpinene [143]
α-terpinene
p-cimen

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
32
timol
polifenoli
carvacrol [141]
hidrocarburi monoterpene
sesquiterpene
linalool
acid cafeic, acid clorogenic și acid rozmarinic [146]
taninuri
principii amare
luteolol
kaempferol
derivați triterpenici
acid ursolic ș i oleanolic
cis-linalool -oxid [144]
trans -pinen hidrat
1-3-8-p-menthatriene
acetat de mirtenil
β-elemen e
jasmone
gurjunene
cis-β-farnesen
trans -γ-bisabolen
globulol
t-cadinol

Testele efectuate de c ătre De Falco E. și colab oratorii (2013 ) [145 ] au arătat că în
compoziția uleiului volatil de Origanum vulgare sunt prezen ți o multitudine de compu și: 33
sesqiterpene hidrocarbonate ; 16 sesqiterpene oxigenate ; 16 monoterpene hidrocarbonate; 25
monoterpene oxigenate; 16 hidr ocarburi; 5 alți compuși ( 1-octen -3-ol, octan -3-ol, dihidroedulan
II, fitol, acid hexadecanoic) ; 5 compuși carbonilici ( 1-octen -3-onă, criptonă, cis-iasmonă, β –
iononă, hexahidrofarnesil -acetonă); 5 fenoli (eter -metil de timol, eter -metil de carvac rol,
timol, carvacrol, eugenol).

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
33
Tabelul 1.7 . Principalii compuși biologic activi identificați în diferite extracte de
Origanum vulgare
Denumirea Sursa bibliografic ă
polifenoli [145]
monoterpenoide: carvacrol și timol
geraniol [147]
[148]
acetat de geranil
linalo ol
acetat de linalil
β-mircen
β-cariofilenă
β-bisabolenă
β-bourbonenă
germacrenă
α-humulenă
α-muurolenă
γ-muurolenă
γ-cadinenă
alo-9-aromadendrenă
α-cubebenă
α-copenă
α-cadinol
β-oxid cariofilenă
cis/trans -hidrat de sabinen
acizi cetonici

I.4.5 . Proprietăți terapeutice
Investigațiile referitoare privind proprietățile terapeutice ale speciei Origanum vulgare
au eviden țiat prezența unui număr mare de compuși bioactivi dar și importanța medicinală a
acestuia [149]. Principalele proprietăți ale speciei Origanum vulgare sunt:

 Acțiunea antioxidantă
Cercetările efectuate de către Chun S.S. și colaboratorii (2005 ) [150] au demonstrat
capacitatea antioxidantă a extractelor de ore ganum și totodată activitatea antimicrobia nă

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
34
împotriva Helicobacter pylori, bacterie responsabilă de apariția cancerului stomacal .
Analizele obținute au concluzionat faptul c ă inhibarea creșterii acestei bacterii se datoreaz ă
prezenței acizilor fenolici din extractele de Origanum vulgare . De asem enea, uleiul esențial de
oreganum posedă proprietă ți antioxidante iar publicațiile Comisiei Europene recunoa ște
proprietățile antioxidante ale acestui ulei precum și eficacitatea lui în cazul infec țiilor,
tulburărilor căilor respiratorii și urinare [151 ].

 Acțiunea antimicrobiană
În 1998 Adam K. și colab oratorii [152] în urma studiilor efectuate au raportat faptul că
uleiul esențial de ore ganum prezintă acțiune terapeutică împotriva infecție i cu fungi
Trichophyton rubrum . Unele compo nente din uleiul esenț ial de ore ganum cum ar fi
carvacrolul și timolul prezintă proprietăți antifungic e remarcabile [153]. Lucrare a descrisă de
Bașer K. (2008) [154] evidențiază câteva activități (antimicrobiene, antitumorale,
antigenotoxic, analgezic, antispasmodic, antiinfla mator, angiogen, antiparazitare,
antiplachetar, antihepatotoxic și hepatoprotectoare ) ale uleiurilor esențiale ob ținute din specia
Origanum vulgare cultivat în Turcia și încearcă să explice posibil ul mecanism in vivo de
acțiune a carvacrol ului. Carvacrolul este responsabil de acțiunea antimicrobi ană ceea ce face
ca acesta să fie utilizat în prepararea unor medicame nte pe bază de plante.
Pentru evaluarea activit ății antimicrobiene au fost comparate uleiurile esențiale din
specia Origanum vulgare cu cele provenite din specia Origanum majorana . Pentru aceasta , s-
a realizat un studiu pe diferite culturi de Staphylococcus aureus , Acinetobacter spp., Proteus
spp., Enterobacter spp ., Klebsiella spp ., izolate de la pacien ții cu conjunctivită. Rezultatele
obținute a u arătat un efect inhibitor proeminent pe to ate sușele bacteriene analizate la un
interval de 24 ore de expunere confirmând premizele utilizării uleiurilor volatile ca surse
alternative antibioticelor [155]. Literatura de specialitate raporteaz ă faptul că uleiul esențial
de Origanum vulgare are compuși cu propriet ăți antimicrobiene, antioxidant e și prin urmare
poate fi folosit ca un ingredient natural în produsele alimente și/sau conservant în industria
farmaceutic ă [156, 157].

 Acțiunea antidiabetic ă
Studiu l descris de Bejaoui și colaboratorii (2013) [158 ] a urmărit cuantificarea
compușilor biologic activi din Origanum vulgare cultivat în Tunisia. Analiza compozi ției
chimice a uleiului esen țial a fost realizată utilizând GC -MS. Capacită țile an tioxidante ale
uleiului esen țial și al extractului metanolic au fost evaluate folosind metodele DPPH și FRAP.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
35
Activitatea antidiabetică a fost demonstrat ă folosind α -amilază. Uleiul esen țial de ore ganum a
fost bogat în carvacrol (61,20 -74,03 %), p -cime n (5, 89-12,60 %) și γ-terpinen (1,13 -6,88%).
Uleiul esen țial și extractul metanolic testate pentru efectul inhibitor al α-amilazei au arătat o
capacitate puternică de a i nhiba degradarea amilazei din pancreas și glanda salivară.
Cercetările descri se de Koukoulit sa C . și colabor atorii (2006 ) [159 ] au eviden țiat efectul
extractelor apoase și metanolice de Origanum vulgare asupra aldozo reductazei și
lipooxigenazei din soia. Rezultatele au arătat un poten țial promi țător al extractelor de
oreganum pentru a preveni co mplicațiile diabetului pe termen lung și o eficacitate
antiinflamato are prin inhibarea lip ooxigenazei din soia.

 Acțiunea de ameliorare a ulcerului gastric
Literatura de specialitate raportează o evaluare farmacologică a activită ților anti –
inflamatorii și anti-ulcer al carvacrol ului, un constituent majoritar din uleiul esențial de
oreganum în mod ele experimentale de edem indus de diferiți agenți și leziuni gastrice induse
de acid ac etic. La modelele de edem indus de dextran sau histamină, carvacrol ul a fost eficace
la doze de 50 mg kg-1 (46% și respectiv 35%). Rezultate le sugerează intervenția carvacrol ului
în eliberare și/sau si nteza de mediatori inflamatori i, favorizând astfel procesul de vindecare în
cazul ulcere lor gastrice [160 ]. În medicina populară tu rcă există numeroase studii care
precizeaz ă folosirea extractelor de ore ganum la tratarea tulburărilor gastro -intestinale [161 ].

 Acțiunea de stimulare a hipotalamusului
Un st udiu efectuat pe șobolani prin injecție intraperitonială timp de o săptămână cu
extract apos de Origanum vulgare a indicat o creștere a activităților cer ebrale din zona
hipotalamusului dar și o creștere a conținutului în antioxidanți, ceea ce sugerează c ă extractul
apos de Origanum vulgare poate îmbunătăți aptit udinile de î nvățare la șobolani [162].

 Alte acțiuni fitofarmaceutice
Extractele de Origanum vulgare pot fi folosite: împotriva răcelii și tusei , expectorant
[163]; diuretic, antinevralgic, antitusiv [164]; împotriva durerilor de dinți, de cap și a
nevrozelor [165]; carminativ, diaforetic, stimulent, aperiti v tonic [166]; antihelmi ntic și
antiparazitic [161];

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
36
I.4.6 . Forme de utilizare
Infuziile și decoctul acestei plante se folosesc împotriva tulburărilor gastrice și a
ulcerului duodenal [161]. Decoctul macerat la rece este utilizat împotriva tusei datorită
acțiunii sale expectorante și calmant e [164]. Împotriva durerilor de cap și a ne rvozității sunt
preferate uleiurile volatile datorită efectelor antimicrobiene și antiseptice pe care le au
extractele de ore ganum [155].

I.2. T EHNICI ANALITICE UTILIZATE PENTRU CARACTERIZAREA
EXTRACTELOR VEGETALE
I.2.1. Metode de extrac ție a compu șilor din extractele vegetale
Pentru carac terizarea plantelor medicinale: Calendula officinalis , Hypericum
perforatum , Galium verum și Origanum vulgare au fost dezvoltate numeroase metode de
analiză. Alegerea unei metode de analiz ă depinde în primul rând de etapa de preg ătire a
materialului vegetal care presupune precurățirea și precon diționarea probei prin elimin area
impurităților, resturil or de pământ și a plantelor atacate de boli și dăunatori. A doua etap ă
important ă pentru obținerea unui material vegetal de calitate bun ă este procesul de uscare.
Plantele medicinale utilizate sub form ă de ceaiuri sau pentru ob ținerea produselor
farmaceuti ce se usuc ă imediat dup ă recoltare ținându-se cont de temperatura de uscare și se
evită contactul plantelor cu lumina solar ă. Pentru a evita degradarea com pușilor biologic
activi , plantele medicinale (Calendula officinalis , Hypericum perforatum , Galium ver um și
Origanum vulgare ) pot fi păstrate la temperatura camerei protejate de umiditate și de lumina
directă solară în pungi de h ârtie, săculețe de pânză sau cutii de carton [167].
Extracția compușilor din plantele speciilor Calendula officinalis , Hypericum perforatum ,
Galium verum și Origanum vulgare se poate realiza cu: ap ă, alcool (alcool etilic, alcool
metilic), aceton ă, acetat de etil sau amestecuri ale acestora în diferite procente.

I.2.2 . Obținerea extractelor vegetale apoase
Extractele vegetale apoa se se ob țin prin amestecarea părților aeriene vegetale
mărunțite cu apă, sub agitare. Extracția poate fi realizat ă la temperatura camerei [168-171] sau
la temperaturi înalte [172-176, 132 ].
Procedeul de extrac ție descris de Perez -Carreon J.I. și colaborato rii (2002 ) [177]
constă în adăugarea a 15 g de flori uscate de Calendula officinalis peste un litru de apă
deionizată fiartă. Amestecul a fost lăsat în repaus timp de 15 min. și ulterior a fost filtrat
printr -o membrană cu dimensiunea porilor de 0,22 μ m. Rezultatele studiului au arătat că
extractul apos de gălbenele a prezentat o bună activitate antibacteriană împotriva tuturor

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
37
bacteriilor patogene testate (Salmonella , Shigella dysenteriae , Shigella flexneri , Shigella
sonnei și E. coli ).
Extractele apoase pot fi ob ținute pornind de la materialul vegetal m ărunțit de
Hypericum perforatum în 100 mL de NaCI 0,9% (solu ție salină). Preparatul a fost omogenizat
într-un vortex și s-a filtrat prin hârtie de filtru iar 1 mL de preparat a fost considerat a con ține
50 mg de extract de hipericin ă [178].
Scopul studiului descris de Benavides V. și colaboratorii (2010 ) [179] a fost
investigarea efectul ui extractului apos de Origanum vulgare asupra dezvoltării embrionilor de
șoarece . Frunze le de Origanum vulgare au fost usc ate la 60° C într -un cuptor timp de 24 ore .
Extractul apos a fost obținut prin încălzire a a 300 g de ore ganum în 1500 mL de apă distilată
la 60° C timp de 15 minute. Amestecul s -a filtrat și din extract s -a pregătit doze de 0 , 9, 18 și
36 mg mL-1.
Unii cercetători precizeaz ă obținerea extractelor vegetale folosind un amestec de
solvenți format din ap ă și etanol (metanol) în diferite propor ții [180, 181, 132].

I.2.3 . Obținerea extractelor vegetale alcoolice
Metodele utilizate pentru o bținerea extractelor vegetale alcoolice sunt: macerare
(păstrarea amestecului la temp eratura camerei sau la frigider pentru o anumit ă perioadă de
timp); extracția Soxhlet (extractul vegetal se ob ține cu ajutorul Soxhletului prin extracție
repetată); expunerea amestecului la m icrounde, respectiv sonicarea amestecului. Câteva
metode de extrac ție ale speciilor: Calendula officinalis , Hypericum perforatum , Galium
verum și Origanum vulgare sunt prezentate în Tabelul I.8.

Tabelul I.8. Caracteristicile metodelor de extrac ție pentru obținerea extractelor vegetale
Planta Metoda de extrac ție Solvent Sursa bibliografic ă
Calendula officinalis Extracția Soxhlet la
temperatur a camerei,
24 ore Metanol/Etanol [182]
Macerare la
temperatura camerei, 3
zile Etanol, 960C [183]
Macerare la
temperatura de 350C,
24 ore Metanol [184]
Macerare la
temperatura camerei,
48 ore Metanol 80% [185]
Hypericum
perforatum Extracție Soxhlet la
temperatura camerei Etanol 80% [186]

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
38
Macer are la întuneric,
la temperatura camerei,
6 ore Metanol 80% [187]
Macerare la întuneric Metanol, 90% [188]
Expunere la microunde Metanol [189]
Galium verum Extracție repetată la
cald Metanol [119]
Macerare Etanol 95% [190]
Macerare la întuneric ,
la temperatura de 40 C,
7zile Etanol 30%, 50% si
70% [191]
Origanum vulgare Extracție Soxhlet, 20
ore Etanol 70% [192]
Macerare, 72 ore Etanol, 75% [193]
Extracție Soxhlet, la
temperatura de 50 0C,
4-6 ore Etanol [194]

I.2.4 . Obținerea uleiurilor vegetale
Uleiurile vegetale se obțin prin procedeul de distilare cu ab ur (hidrodistilare) folosind
un aparat de tip Clevenger , fiind necesar ă o cantitate mare de material vegetal și un timp de
minim 3 ore pentru a obține câțiva mL de ulei esen țial. Literatura de specialitate precizeaz ă
proprietățile uleiurilor esen țiale vege tale ale speciilor Calendula officinalis , Hypericum
perforatum , Galium verum și Origanum vulgare precum și întrebuințările acestora în
cosmetică, parfumerie, preparate farmaceutice dar și în industria alimentar ă [195-197].
Uleiul esen țial (0,05%) din gălb enele a fost ob ținut utilizând procedura de distilare cu
vapori descris ă de Petrov ic L. și colaboratorii (2007) [198]. Extracția material ului vegetal s-a
realizat la temperatura de 40° C la presiune înaltă (100, 200 și 300 bari ) dar și la temperatura
de 15° C la presiune joasa (60, 90 și 120 bar i). S-a constatat că, creșterea presiunii a dus la o
creștere a randamentului astfel , conținutul de uleiuri volatile obținut din extractele i nvestigate
a fost semnificativ mai mare (1,52 -2,70 ori) și a crescut odată cu creșterea presiunii.
Saroglou V. și colaboratorii (2006) [199] au studiat compoziția de ulei volatil ob ținut
din șase specii de Hypericum cultivate în Serbia. Uleiurile esen țiale au fost ob ținute prin
procedeul de distilare cu vapori timp de 2 ore într -un aparat Clevenger modificat cu un
receptor răcit cu apă pentru a reduce supra -încălzire a procesului de hidrodistilare. Rezultatele
au eviden țiat faptul c ă uleiurile ob ținute conțin cantități mari de hidrocarburi sesquiterpene .
Părțile aeriene uscate ale speciei Galium verum (80 g) au fost colectate din provincia
Teheran în stadiu complet de înflorire în mai 2003 și au fost supuse procesului de
hidrodistilare timp de 3 ore folosind un aparat de tip Clevenger conform studiului descris de

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
39
Mirza M . și colabor atorii (2004) [128 ]. Uleiul a fost uscat pe sulfat de sodiu anhidru și
depozitat într -un flacon sigilat până la analiză.
Studiul compușilor volatili din flori le de Galium verum colectate î n vara anului 2008
în Harkov Oblast ' a fost descris de Il′ina T.V. și colaboratorii (2009) [121]. Probele analitice
au fost ob ținute din materii prime proaspăt colectat e prin distilare cu vapori și ulterior tratarea
distilatului cu hexan. Compozi țiile calitative și cantitative ale frac ției lipofil ice au fost
stabilite pri n analiza GC-MS.

I.3. Меtοdе dе analiză a сοmрușіlοr dіn еxtraсtеlе vеgеtalе de Calendula officinalis ,
Hypericum perforatum , Galium verum și Origanum vulgare
Principalele metode de analiz ă utilizate pentru caracterizarea extractelor vegetale studiate
sunt:
 Metode spectrometric e (spectrometria UV -Vis și spectrometria de mas ă);
 Metoda cromatografic ă (cromatografia în strat subțire, cromatografia de lichide de
înalta perforaman ță și cromatografia în fază gazoasă);
 Metoda electroforetic ă (electroforeza capilar ă și cromatografia electrocinetic ă
micelară);

І.3.1. Меtοdе sресtrο mеtrісе
I.3.1.1. Spectrometria UV -Vis
Sресtrοmеtrіa reprezintă mеtοda рrіn сarе sе măsοară сantіtatеa dе lumіnă a bsοrbіtă
dе ο substanță сhіmісă рrіn înregistrarea іntеnsіtățіі lumіnіі un uі fasсісοl се străbate sοluțіa
dе analіzat. Ρrіnсіріul dе bază еstе сă fіесarе сοmрus absοarbе sau transmіtе lumіna ре un
anumі t іntеrval dе lungіmі dе undă [200].
Una dintre metodele frecvent utilizate pentru caracterizarea extractelor vegetale este
metoda Folin -Ciocâlteu , care are la bază reducerea polifenolilor cu ajutorul
molibdowolframat ului (Na 2WO 4 / Na 2 MoO 4). În urma acestei reac ții (care are loc în mediu
basic) rezultă O 2-, care reacționează cu molibdatul formând ionul (Mo4+) (albastru) a cărui
absorbanță se determină spectrofotometric în intervalul 745 -750 nm. Acidul galic poate fi
utilizat ca standard de referință [201]. Metoda Folin -Ciocâlteu este una foarte simplă și rapidă
dar este necesar ca pH-ul de lucru să fie basic deoarece pH-ul acid poate cauza reacții lente și
nespecifice. Literatura de specialitate indic ă o corelație între rezultat ele obținute prin metoda
Folin -Ciocâlteu și cele obținute prin alte metode care evaluează activitatea antioxidantă (ex.
DPPH, TEAC) [202].

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
40
Conținutul tota l de polifenol i din extractele metanolice de g ălbenele cultivate în
Tunisia a fost determinat utilizând reactivul Folin -Ciocâlteu conform procedeului descris de
Rigane G. și colaboratorii (2013 ) [203]. După 30 de minute de incubare la temperatura
camerei a fost măsurată absorbanța la 765 nm. Polifenolii totali au fost exprima ți ca
echivalent acid ga lic (mg echivalent acid galic g-1 extract). Rezultatele studiilor de
determinare a polifenolilor totali utilizând metoda Folin -Ciocâlteu din extractele de Calend ula
officinalis au fost detaliate de numero și cercetători [204-206].
În lucrarea descris ă de Çelen G. și colaboratorii (2008 ) [207] extractele brute de
Hypericum perforatum cultivate în Muğla au fost ob ținute prin extrac ție cu acetonă: apă și
apă. Extractel e au fost investigate chi mic pentru con ținutul de polifenol i totali prin metoda
Folin -Ciocâlteu. Cantitatea de polifenoli totali din extract ul cu acetonă: apă (7: 3, v/ v, 150, 44
mg GA g-1 material) a fost determinată ca fiind aproape de cinci ori mai mare comparativ cu
cantitatea găsită în extractul apos (33,01 mg GA g-1 material ). Un alt studiu descris de
Morshedloo M.R. și colaboratorii (2012) [208] utilizează reactivul Folin -Ciocâlteu pentru
determinarea de polifenoli to tali din extractele metanolice (80 %) de sunătoare , cultivată în
Iran (50 μg equivalent GA g-1produs uscat ).
Studiul descris de Vlase L. și colaboratorii în 2014 [209] raportează cantitatea de
polifenoli tota li din extractele etanolice (70 %) din patru specii de Galium ( Galium verum ,
Galium mollugo , Galium aparine și Galium odoratum ). Cea mai mare cantitate de polifenoli
totali a fost determinat ă pentru specia Galium mollugo (3,46 ± 0,13 g GAE 100 g-1 s.u.),
urmată de Galium verum (2,6 ± 0,12 g GAE 100 g-1 s.u.), Galium aparine (2,4 ± 0,24 g GAE
100 g-1 s.u.) și Galium odoratum (1,4 ± 0,35 g GAE 100 g-1 s.u.).
Conținutul de polifenol i totali din extractele eterice, acetonice, alcoolice și apoase de
Origanum vulgare din Portugalia a fost determinat conform studiului descris de Albano S.M.
și Miguel M.G. (2011 ) [210]. Valorile ob ținute în acest studiu a variat între 0,74 mg GAE
mL-1(fracția metanolic ă) și 28,92 mg GAE mL-1 (fracția apoasă). Licˇina B.Z. și colaboratorii
(2013 ) [211] raportează un studiu referitor la determinarea de polifenoli tot ali din extractele
apoase, alcoolice, acetonice și eterice de Origanum vulgare cultivat în Serbia. Concentra țiile
de polifenoli totali au fost examinate folosind metoda Folin -Ciocâlteu iar valorile ob ținute au
variat între 84,5 și 235 mg GA g-1 extract.
Pentru d eterminarea con ținutului de flavonoide totale din extractele vegetale se
folosește metoda spectrometric ă UV-Vis care presupune formarea unor compu și în urma
reacției dintre flavonoide și clorura de aluminiu (AlCl 3) în mediu bazic ce pot fi m ăsurați

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
41
spectrometric la 420 nm, după 60 minute de incub are la temperatura camerei [212 ].
Quercetinul și rutinul sunt standarde de referin ță frecvent utilizate pentru aceasta metod ă.
Conținutul de flavonoide totale din extractele metanolice de Calendula officinal is din
Tunisia a fost determinat spectrofotometric conform studiului descris de Rigane G. și
colaboratorii (2013 ) [203] utilizând o metodă bazată pe fo rmarea unui complex de aluminiu .
Conținutu l de flavonoide totale a fost exprimat în mg echivalent quercet in per gram de extract
uscat (mg QE g-1).
Un grup de cercet ători raporteaz ă concentrația de flavonoide totale din frunzele și
florile de Hypericum perforatum supuse radia țiilor UV -B [213]. Astfel, c oncentrația de
flavonoide totale din flori a fost mai mic ă decâ t cea din frunzele de Hypericum perforatum .
Metoda spectrofotometrică cu clorură de aluminiu a fost utilizat ă pentru determinarea
flavonoide lor to tale din extractele etanolice din patru specii de Galium cultivat în România .
Absorban ța a fost măsura tă la 430 nm. Valorile con ținutul ui de flavonoide total e au fost : 6,93
± 0,44g RE 100 g-1 s.u. pentru extractul speciei Galium mollugo ; 5,21 ± 0,24 g RE 100 g-1 s.u.
pentru extractul speciei Galium verum ; 2,81 ± 0,54 RE 100 g-1 s.u. pentru extractul specie i
Galium odoratum și 1,60 ± 0,53 g RE 100 g-1 s.u. pentru extractul speciei Galium aparine
[209].
Câteva plante cultivate în România și utilizate în special în medicina naturistă dar și ca
aditivi alimentari naturali datorită conținutului lor ridicat în antioxidanți au fost investigate de
către Spridon I. și colaboratorii (2011) [214]. Extractele metanolice de Lavandula
angustifolia , Melissa officinalis , Salvia officinalis , Origanum vulgare , Rosmarinus officinalis ,
Thymus vulgaris , Verbascum sp. și Mentha l ongifolia precum și cele de Hypericum
perforatum și Inula helenium au fost analizate din punct de vedere al con ținutul ui de
flavonoide totale . Extractul de Origanum vulgare a avut cel mai mare con ținut de flavonoide
totale (43 mg rutin g-1 extract) compara tiv cu celelalte extracte stud iate. De asemenea, s -a
observat o corelație pozitivă între rezultatele ob ținute pentru activitatea antioxidantă totală și
rezultatele ob ținute pentru con ținutul de flavonoide totale ale extractelor studiate .

 Activitatea de sc avenger a radicalului DPPH (2,2 difenil -1-picrilhidrazil)
Metoda DPPH este o metodă frecvent folo sită pentru investigarea capacit ății
antiox idante în special a extractelor vegetale folosind radical ul liber 2,2 difenil -1-
picrilhidrazil. Rezultatele acestei metode pot fi exprimate în : echivalen ți Trolox (analogul
sintetic al vitaminei E) , IC50 (cantitatea de probă necesară reducerii a 50% din absorban ța
DPPH -ului), acid ascorbic sau oric e alt compus antioxidant deoarece metoda nu e ste una

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
42
standardizată. Toto dată, această metodă este folosită și pentru cuantificarea antioxidanților în
sisteme bilogice complexe [215].
Radicalul DPPH poate fi utilizat ca radical în evaluarea activității antioxidante iar
monitorizarea acestuia poate fi realizată spectrofotometri c sau electrochimic [216, 217 ].
Radicalul DPPH are o culoare violetă și poate fi redus la un compus galben pal în prezența
antioxidanților; scăderea absorbanței DPPH este măsurată la 517 nm. M etoda DPPH este o
metodă simplă, rapidă și determină activitatea antioxidant ă a unor diver și antioxidanți și
extracte vegetale mai puțin a acelor antioxidanți al căror spectru se suprapune cu cel al
radicalului DPPH (ex: carotenoizii) [218].
Prin metoda spetrofotome trică detaliată de Butn ariu M. și Coradini Z.C. (2012) [219]
s-a determinat capacitatea antioxidantă a extractelor (metanolice, etanolice și izopropanolice)
din flori de Calendula officinalis . Rezultatele ob ținute au concluzionat faptul c ă capacitatea
antioxidant ă a fost mai mare în cazul ex tractelor metanoli ce comparativ cu celelalte extracte
studiate ( extract etanolic 96%, extract etanolic 60% și extract izopropanolic 99%).
Studiul descris de Victor B.K. și Hamed W.M.A. (2014 ) [220] a raportat determinarea
capacității antioxidante al e extractelor cu: eter d e petrol, metanol, cloroform, acetat de etil, n –
butanol și apă a speciei Hypericum perforatum . Capacitatea antioxidant ă a fost mai mare în
cazul extractelor metanolice și apoase ( 1,119 % și 1,105 %) în timp ce extractele cu cloroform
și acetat de etil au p rezentat valori mai mici (0,857 % și 0,572 %).
Potențialele antioxidante ale extractelor de Hypericum perforatum din regiunea
Tavush a Armeniei au fost evaluate prin testul DPPH cu monitorizarea simultană a
conținutului de flavonoide totale . S-a demonstrat că extractele etanolice și apoase ale
sunătoarei prezintă capacita te antioxidant ă mare și se coreleaz ă cu conținutul de flavonoide
totale . Valori ridicate ale capacit ății antioxidante a extractelor de sun ătoare au fost precizate
de unii autori în lucrările lor [221].
Au fost evaluate proprietă țile antioxidante ale extractelor metanolice de Galium verum
din două localită ți din Serbia. Activitatea antioxidantă a fost evaluată în patru moduri diferite.
Capacitatea de captare a radicalilor libe ri a fost examin ată prin DPPH precum și prin testul cu
peroxid de hidrogen. S -a determinat con ținutul de polifenoli și flavonoide totale dar și
cantitatea de clorofilă. Rezultatele studiului au indicat prezen ța unei activită ți antioxidante
foarte puternice la ambele probe cu diferen țe destul de mici datorate con ținutului diferit în
polifenoli (2,44 – 4,65 mg și 4,57 -5,16 mg echivalent acid galic g-1 produs uscat) și flavonoide
(6,38 – 10,70 µg și 15,56 – 17,96 µg echivalent quercitin g-1produs uscat) [118].

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
43
În studiul d escris de Zhang X.L. și colaboratorii (2014 ) [222] a fost evalua tă
activitatea antioxidant ă in vitro utilizând radicalii DPPH și FRAP a unor compuși fenolici
izolați din extractul etanolic al întregii plante de Origanum vulgare . Structurile noilor
compuși au fost identificate pe baza analizelor spectroscopice extinse (UV, IR, RMN și
HRESIMS) . Câțiva compuși au prezentat activitate antioxidantă semnificativă comparabilă cu
cea a acid ului ascorbic.
Activitățile antioxidante ale compușilor 4'-O-beta-D-glucopiran ozil-3', 4' –
protocatechuate dihidroxibenzil, 4'-O-beta-D-glucopiranozil -3', 4' -dihidroxibenzil și 4-O-
metilprotocatechuate izolați din frunze uscate de oregano ( Origanum vulgare ) au fost
comparate cu cele ale rutin ului, quercetin ului și acid ului rozmarinic la o concentra ție de 2×10-
5 M. Investigațiile studiului au raportat faptul c ă activitatea antioxidant ă a compușilor 4' -O-
beta-D-glucopiranozil -3' și 4'-dihidroxibenzil protocatechuate a fost aproa pe identică cu cea a
quercetinului și a acidului rozm arinic iar activitatea antioxidant ă a compușilor 4'-O-beta-D-
glucopiranozil -3' și 4'-dihidroxibennzil 4 -O-metilprotocatechuate a fost mai mică decât cea a
quercetinului si a acidul ui rozmarinic [223].

 Activitatea de scavenger a radicalului ABTS (2,2’ -azinobis (acid 3 -etilbenzotiazolin -6-
sulfonic)
Această metodă presupune testarea capacității de inhibiție a compușilor antioxidan ți
asupra radicalului ABTS. Scăderea absorban ței amestecului de reacție ABTS -antioxidan ți se
realizează spectrof otometric, la lungimea d e undă de 734 nm. Metoda poate fi utilizat ă cu
succes pentru determinarea capacității antioxidante a extracte lor vegetale și poate fi exprimat ă
în: Echivalen ți Trolox , procente de inhibi ție sau IC50. Deoarece exprimarea capacității
antioxidante a extractel or vegetale se poate realiza în echivalen ți Trolox această metodă este
cunoscută și sub denumirea de TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant C apacity).
A fost evaluat ă capacitatea anatioxidant ă in vitro și in vivo a extract ului apos de
Calendula officinalis conform studiului descris de Preethi K.C. și colaborat orii (2006) [224 ].
Valorile IC 50 pentru radicalul ABTS și radical ul DPPH au fost 6,5 și respective 100 pg mL-1,
fiind comparat e cu cea a extractului de ghimbir, care este un extract antioxidant standard.
Administrarea orală a extractului specie i Calendula officinalis la șoareci timp de o lună a
crescut semn ificativ activitatea catalazei în timp ce nivelul de glutation peroxidaz ă a scăzut
după administrarea extractului de g ălbenele . Aceste rezultate au indi cat faptul că, Calendula
officinalis prezintă activitate anti oxidantă semnificativă in vitro și in vivo .

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
44
Treisprezece specii de Hypericum cultivate în Bulgaria au fost investigate pentru
determinarea c apacității antioxidant e, a conținutului de taninuri și a conținutului de
flavonoide total e. Extractele metanolice din speciile de Hypericum au fost analizate pentru
activitățile de captare a radicalilor și pentru activitățile antioxidante utilizâ nd DPPH , ABTS ,
FRAP și inhibarea peroxid ării lipidelor cu tiocian at de fer. Hidroxitoluen ul butilat și acid ul
ascorbic au fost fo losiți ca martori pozitivi. Extractele metanolice de Hypericum cerastoides ,
Hypericum perforatum și Hypericum maculatum prezintă activități antioxidante semnificative
fiind considerate surse d e compuși antioxidan ți naturali [225].
Mitic V.D. și colaboratorii (2014) [131] raportează proprietățile antioxidante și cele de
inhibare a colinesterazei ale speciilor de Galium verum și Tragopogon pratensis . Extractele
metanolice ale plantelor cultivate în Serbia au fost evaluate pentru determinarea capacit ății
antioxidante cu radicalii DPPH și ABTS, și pentru conținutul de polifenoli și flavonoide
totale . Rezultatele studiului au ar ătat faptul c ă extractul m etanol ic de Galium verum prezintă
capacitate an tioxidantă semnificativ ă (IC 50 26,98 pg mL-1 pentru DPPH și 125, 14 mg Trolox
g-1 extract uscat pentru ABTS ) comparativ cu extractele metanolice de Tragopogon pratensis
(IC 50 59,25 pg mL-1 pentru DPPH și 6,31 mg Trolox g-1 extract uscat pentru ABTS) .
Investigațiile efectuate pe 27 plante medicinale din Macedonia de către Tusevski O. și
colaboratorii (2014) [226] au demonstrat capacitatea antioxidant ă a extractelor de Origanum
vulgare dar și faptul că există o corela ție liniară pozitivă între capacitatea antioxidantă a
extractelor de Origanum vulgare și conținutul de polifenoli totali. Acest studiu demonstreaz ă
că ace astă plantă medicinal ă constitue o sursă bogată în compuși bioactivi în special pentru
industria alimentară și farmaceutică.

I.3.1.2 . Spectro metria de masă
Spectrometria de mas ă este o tehnică sensibilă cu numeroase aplicaț ii în chimia
analitică utilizată pentru identificarea maselor moleculare și a structurilor chimice a
compușilor. Spectrul de mas ă obținut în urma analizei probelor separ ă moleculele în func ție
de raportul masă/sarcină (m/z). Principalele componente ale spectrometrului de mas ă sunt:
sursa de ionizare, analizorul de mas ă și detector de ioni. Procesul de ionizare a unei probe
supuse analizei în care ionii rezulta ți sunt transfera ți cu ajutorul unui c âmp magne tic sau
electric către analizor are loc în sursa de ionizare. Există mai multe tehnici de ionizare:
 Ionizare prin impact cu electroni (EI)
 Ionizare chimic ă (CI)
 Ionizarea electrospray (ESI)

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
45
 Ionizare prin desorb ție laser asista tă de o matrice (MALDI)
Analizorul are rolul de a separa ionii în funcție de raportul mas ă/sarcină. Cele mai utilizate
analizoare sunt:
 Analizor de tip sector
 Analizor de tip timp de zbor
 Analizor de tip quadrupol
 Analizor de tip trapa ionica
 Analizor de tip orbitrap
Frecvent utilizat în spectrometria de masă este detectorul multiplicator de electroni sau
detectorul Faraday.
MALDI -TOF este o tehnic ă de ionizare bl ândă având tendința de a produce ioni
încărcați cu o singur ă sarcină electrică. Principiul ace atei tehnici const ă în amestecarea probei
cu o cantitate în exces de matrice; în urma aplic ării fascicolului de laser asupra amestecului,
moleculele de matrice se evapor ă iar analitul r ămane liber în fază gazoasă. Ionizarea analitului
se realizeaz ă în urma transferului de protoni de la moleculele de matice la analit. Deoarece
această tehnică permite determinarea simultană a maselor în amestecuri poate fi utilizată cu
success pentru analiza compușilor cu masă molecular ă mare (protein e, peptide, nucleotide,
zaharuri, etc.) dar și pentru analiza compușilor cu masă molecular ă mică (taninuri ,
proantocianidine, etc. ).
Prin tehnica MALDI -TOF s -a realizat pentru prima dat ă caracterizarea extractelor
apoase, hidroalcoolice și acetonice ale speciilor Calendula officin alis, Hypericum perforatum ,
Galium verum și Origanum vulgare și s-a evidențiat prezența catechinelor, a zaharurilor dar și
prezența a ltor componente (fisetinidin, is oramnetin, etc. ) [227 ].

I.3.2. Metode cromatografice
I.3.2.1. Cromatografia în strat sub țire
Cromatografia în strat subțire se bazeaz ă pe reparti ția cu vitez ă diferită a compușilor
dintr -un amestec între o fază mobilă (amestecul eluent , care folose ște solvent sau amestec de
solvenți organici, nepolari ) și o fază staționară (adsorbantul , repreze ntat de silicagel, polimida,
geluri, etc. ). Este o tehnic ă simplă cu o selectivitate bun ă de separare frecvent utilizat ă pentru
separarea amestecurilor complexe cum ar fi: proteine, compu și polifenolici, etc.
Prezența acizilor polifenolici și a flavonoid elor în extractele de gălbenele , sunătoare,
sânziene și șovârf au fost evidențiate prin analiza c romatografică în strat subțire (TLC) și prin
cromatografia în strat subțire de înaltă performanță (HPTLC) ( Tabelul I.3.1. )

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
46

Tabelul I.3.1. Parametri i cromatogr afici corespunz ători metodelor TLC și
HPTLC
Probe Metoda Faza mobil ă Compu și identifica ți Sursa
bibliografic ă
Calendula
officinalis TLC Acetat de etil:acid
formic:acid acetic
glacial(100:11:11:26);
n-hexan:acetat de etil
(8:2) Flavonoide, triterpene
deriv ate [228]
HPTLC Acetat de etil: acid
formic:acid acetic:ap ă
(100:11:11:26);
t-butanol:acid acetic:ap ă
(3:1:1) Rutin, quercetin, acid
clorogenic, acid cafeic,
acid cumaric, acid
vanilic [229]
HPTLC Hexan:acetat de etil:ap ă
[(0:80:20; 66:34:0;
100:0:0)] Acid cafeic, acid
clorogenic, faradiol,
rutin [230]
HPTLC Hexan:acetat de etil: acid
acetic glacial: ap ă Acid clorogenic, acid
cafeic, rutin [231]
HPTLC Acetat de etil:acid
formic:acid acetic glacial:
apa (100:11:11:26) Acid clorogenic,
hiperoside, rut in [232]
HPTLC Hexan: acetat de etil:acid
acetic (20:10:1) Chamazulen, bisabolol [233]
Hypericum
perforatum TLC Toluen:acetat de etil:acid
formic (50:40:10) Hipericin,
pseudohipericin [234]
TLC Butan -2-ol:acid acetic:apa
(14:1:5);
Toluen:acetona:acid
formic (60:60:1) Flavonoide, taninuri
hidrolizabile [235]
TLC Acetat de etil:acid
formic:acid acetic
glacial:apa
(100:11:11:26);
Cloroform:metanol (9:1);
Acetat de etil: acid formic
(50:6);
Tolen:cloroform:acetona
(40:25:35) Hipericin, quercetin,
kaempfe rol, rutin [236]
HPTLC Benzen:toluene:amoniac
(9:1:0,1); cloroform:
acetat de etil:acid formic
(5:4:1); Acetat de
etil:metanol:apa
(10:1,35:1) – [237]
Galium
verum TLC Acid formic:apa:acetat de
etil (10:5:85) Hiperoside, rutin,
quercetin, isoquercetin,
luteolin, apigenin,
hipericin, acid
clorogenic [238]
TLC – Acid rozmarinic, acid
clorogenic, acid cafeic,
acid ferulic, acid o -[119]

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
47
cumaric, acid p -cumaric,
apigenol, luteolin,
apigenol -7-O-glucoside,
luteolin -7-O-glucoside,
cvercetol, rutoside, β –
sitosterol, stigmasterol,
oleanolic acid, ursolic
acid
Origanum
vulgare TLC Acetat de etil:apa:acid
formic:acid acetic
(72:14:7:7) Acid cafeic,
qvercitrozida,
hiperosida, acid
clorogenic, rutozida [239]
TLC Hexan: acetat de etil (8:2)
Hexan: acetat de etil (3:7) – [240]
HPTLC Toluen:acetat de etil
(5:1,5) ; – [241]
HPTLC Toluen:eter de
petrol:acetat de
etil:acetonitrile (5:5:1:0,3) Acid ursolic, acid
oleanolic [242]

I.3.2.2. Cromatografia de lichide de înaltă performan ță (HPLC)
Principiul acestei tehnici dе sерararе are la bază іntеraсțіunеa dіfеrеnțіată a
сοmрonen țіlor unei probe сu cele dοuă fazе numite : faza mοbіlă șі faza stațіοnară [243].
Теhnісa еstе fοartе іmрοrtantă în analіza substanțеlοr bіοlοgісе șі farmaсοlοgісе (aсіzі
οrganісі, hіdrοсarburі arοmatісе рοlісісlісе, рrοtеіnе, zaharіdе, vіtamіnе, dіfеrіtе mеtabοlіțі)
[244] șі poate fі fοlοsіtă atât реntru analіza сalіtatіvă (fiind analіzată сοmрοzіțіa unuі
amestec) cât șі pentru analіza сantіtatіvă (fi ind analіzată сοnсеntrațіa unеі substanțе) .
Cοlοanеle cromatografice sunt tuburі dе οțеl іnοxіdabіl сu un dіamеtru іntеrіοr dе 3 -5 mm și
сu lungіmі dе 10 -35 сm. Cοlοana sе umрlе сu faza stațіοnară care poate fi nерοlară sau
рοlară. Faza mοbіlă рοatе fі: рο lară (faza stațіοnară еstе nерοlară іar рrοсеd еul sе numеștе
"сrοmatοgrafіе în fază іnvеrsă" , RΡ -HΡLC) sau nерοlară (faza stațіοnară este рοlară іar
рrοсеdеul sе numе ștе "сrοmatοgrafіе în fază nοrmală") [245, 246 ]. În сazul cromatografiei de
lichide de în altă performanță în fază inversă faza mοbіlă рοatе fі aрa, aсеtοnіtrіlu l, mеtanοlul,
sοluțііlе tamрοn precum șі amеstесurіlе aсеstοra în рrοрοrțіі dіfеrіtе. În сееa се рrіvеștе faza
fіxă aсеasta рοatе fі сοmрusă dіn granulе dе sіlісagеl cu dimensiuni cupri nse între 3 șі 10 μm .
Fazеlе stațіοnarе рοt fі: hіdrοсarburі рοlarе сu gruре funсțіοnalе ( -CΝ) sau hіdrοс arburі
nерοlarе (C8 -C18) [247]. Cromatografia de lichide de înaltă performanță еstе сеa ma і
unіvеrsală tеhnісă dе analіză, d οmеnііlе salе dе aрlісarе fiind сеlе dе сοntrοl al сalіtățіі,
analіzе іndustrіalе șі alіmеntarе, tеstе tοxісοlοgісе, tеstе сlіnісе, analіza mеdісο -lеgală șі de
mοnіtοrіzarе a mеdіuluі. În рlus, HΡLC еstе una dіntrе сеlе m aі sеnsіbіlе рrοсеdее analіtісе

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
48
fііnd utіlіzată реntru amеstесurі сοmрlеxе dе сοmрușі dar șі pentru caracterizarea extractelor
vegetale [248, 249 ].
În separarile cromatografice se folosesc diferiți detectori cu senzitivitate bună :
absorpție UV -VIS (100 pg -1 ng), fluorescen ță (1-10 pg), spectrometrie de mas ă (100 pg -1
ng), electrochimic (10 pg -1 ng) și indice de refrac ție (100 ng -1 µg). Detectorul utilizat în
separare a compușilor trebuie să îndeplineasc ă o serie de condi ții și anume: sensibilitate,
stabilitate și reproductibilitate bună; stabilitate pe un domeniu larg de temperatură ; răspuns
liniar la diferite concentrații; timp scurt de răspuns; ușurință în utilizare și durată lungă de
viață . Detecția absorbanței moleculare UV -VIS este cea mai frecvent utilizat ă pentru
separarea compu șilor din extractele vegetale.
Un studiu descris de Bili a A.R. și colaboratorii (2001) [250] a avut ca scop analiza
cromatografică (HPLC -DAD) ale unor extracte hidroalcoolice din flori de gălbenele care a
permis separarea agliconilor, mono -, di- și triglicozidelor dar și separarea claselor de
flavonoide inclusiv a flavonelor, flavonolilor, flavanonolilor și flavanoliganilor. Astfel,
această metodă este propusă pentru analiza unor medicamente sau preparate medicamentoase
pe bază de plante în care flavonoide le sunt elementele constitutive act ive.
Prin cromatografia de lichide de înaltă performan ță în fază inversă (RP-HPLC -UV) au
fost analizate calitativ și cantitativ trei flavone: quercitina, kam pferolul și isoramnetinul din
extractele metanolice a șase plante medici nale printre care Calendul a officinalis și Hypericum
perforatum . Metoda dezvoltată a presupus folosirea metanolului 40 -60% ca fază mobilă și o
coloană ODS (125 m mx 4 mm) cu particulele de 5 µm într-un timp relativ scurt (7 min.).
Metoda utilizată a fost simplă, precisă și reproduc tibilă [251].
Raškovic A. și colaboratorii (2014) [252 ] au raportat eficacitatea preparatelor pe bază
de Hypericum perforatum comparativ cu medicamentele antidepresive . Astfel au fost studiate
o serie de extracte etanolice, apoase, infuzii, tablete și capsule pe bază de sunătoare. Analiza
cantitativă cromatografică (HPLC -UV-DAD) a indicat faptul că extractul etanolic are cel mai
ridicat con ținut în naftodiantrone: hipericină (57,77 µg mL-1) și pseudohipericină (155,38 µg
mL-1). Rezultatele ob ținute au eviden țiat eficacitatea preparatelor pe bază de Hypericum
perforatum comparativ cu diazepamul, pentobarbitalul și paracetamolul.
Într-un studiu recent Kamal A. și colabora torii (2012) [253] au dezvoltat o metodă
RP-HPLC simplă și specifică pentru analiza calitat ivă și cantitativă a hipericinei utilizându -se
un sistem cromatografic cu detector UV . Monitorizarea compu șilor s-a realizat la lungimea
de undă de 590 nm. Metoda dezvoltată a fost utilizată pentru determinarea hipericinei din
produsele nat uriste pe bază de sunătoare din Asia.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
49
Crockett S.L. și colaboratorii (2005) [254] au analizat printr -o metodă cromatografic ă
(RP-HPLC -DAD) 74 de extracte metanolice provenite din specia Hypericum perforatum
recoltate din diferite regiuni din Europa precum și din SUA . Scopul studiului a fost de a
separa și cuantifica nouă compu și de mare interes farmacologic: rutin, hiperoside,
isoquercitrin, quercitrin, quercetin, amentoflavone (I3 ", II8 -biapigenin), hipericin ,
pseudohipericin și hiperforin . Rezultatele au indica t faptul că profilele fito chimice ale
constituen ților pot fi folosi te pentru a distinge diferențele existente între Hypericum
perforatum și alte specii de Hypericum dar și pentru identificarea speciilor care pot fi de
interes pentru investiga ții fitochimice ulterio are.
Extractele cu acetat de etil, apoase și metanolice ale speciilor Hypericum
origanifolium și Hypericum montbretii au fos t analizate prin metoda RP -HPLC -DAD iar
rezultatele au fost comparate cu extractele speciei Hypericum perforatum . Studiul a eviden țiat
conținutul ridicat în acid clorogenic și acid cafeic în toate probele analizate. Cele mai ridicate
valori ale con ținutului total în polifenoli au prezentat extractele cu acetat de etil a specie i
Hypericum perforatum [255].
O metoda RP-HPLC -UV dezvoltată de Stefova M . și colaboratorii (2001) [256] a fost
utilizată pentru determinarea flavonolilor (miricetin, quercitin și kampferol ) din 16 extracte
acetonice de plante medicinale printre care și Hypericum perforatum , cultivate în Macedonia.
Studiul a indica t prezența quercitinului într -o concentra ție mai mare în extractul de sun ătoare.
Concentra ția quercetinului în materialul vegetal studiat a variat în tre 0,026 și 0,552 % (m/m).
Au fost i nvestigate cromatografic (RP -HPLC -DAD) câteva extracte metanolice ale
speciilor Hypericum perfo ratum , Hypericum perfoliatum și Hypericum ericoides cultivate în
Tunisia cu scopul de a identifica compușii majoritari și anume flavonoide, naftodiantrone și
floroglucinoli . În urma analizei au fost identifica ți 15 compuși biochimic i printre care : 3 acizi
fenolici (clorogenic, siringic și ferulic), 5 flavonoli (rutin , hiperosida, isoquercitrina,
quercitrina și quercetina), 1 biflavonoid și 4 naftodiantrone (pseudoprotohipericina,
protohipericina, psuedohipericina și hipericina). Spec ia Hypericum ericoides a prezentat
concentra ții mai mari de acizi fenolici și flavonoli în timp ce specia Hypericum perforatum a
avut un conținut mai bogat de naftodiantrone și floroglucinoli, a ceasta din urmă putând fi
considerată o sursă bogată de hiperi cina, hiperforină precum și derivații acestora [257].
Scopul unui studiu realizat de Tuncel N.B. și colaboratorii (2010) [258] pe o serie de
plante medicinale cultivate în Turcia printre care Origanum vulgare și Hypericum perforatum
a presupus utilizarea unei metode cromatografice (RP-HPLC -UV) pentru determinarea
următorilor acizi fenolici: galic, protocatechinic, vanilic, cafeic, clorogenic, siringic, cumaric,

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
50
ferulic, rozmarinic și trans -cinamic. Analizele ob ținute au arătat prezen ța unui con ținut ridicat
în acizi fenolici. Acidul rozmarinic a fost compusul majoritar identificat în extractul de
Origanum vulgare .
Lucrarea elaborat ă de Ghiță L. și colaboratorii (2012) [119] prezintă studiul
comparativ al speciilor Galium verum L. și Galium album Mill. prelev ate din mai multe zone
din nord -estul Moldovei. În urma analizei cromatografice (RP-HPLC -DAD) s-au determinat
următorii compu și: acidul clorogenic, rutin, luteolin -7-O-glucoside și luteolin. Comparativ cu
extractul metanolic de Galium album , extractul meta nolic de Galium verum este mai bogat în
rutin, luteoli n-7-O-glucoside si luteolin și mai sărac în acid clorogenic.
Un grup de cercet ători au evidențіat analiza cromatografic ă (RP-HPLC -DAD) a unor
extracte apoase și etanolice ale speciilor Calendula officin alis, Hypericum perforatum ,
Galium verum și Origanum vulgare , cultivate în Rom ânia. Compu șii polifenolici identificați
au fost: acizi i fenolici (acid ul clorogenic, acidul cafeic, acidul ferulic, acidul cumaric, acid
rozmarinic) și flavonoide le (rutin, lute olin, quercetol , api genin și kaempf erol). Profilele
tuturor compu șilor polifenolici identificațі au fost ob ținute în 50 min. Datele cantitative au
arătat că extractele alcoolice au avut un con ținut mai ridicat în acizi fenolici și flavonoide
comparativ cu extractele apoase [191].
Proestos C. și colaboratorii 2002 [259] au dezvoltat o metod ă cromatografic ă (RP-
HPLC -DAD) cu scopul de a identifica și cuantifica compușii polifenolici din extractele
metanolice a unor plante aromatice de origine greacă printre care și Origanum vulgare .
Analizele cantitative ob ținute au indicat prezen ța unui con ținut ridicat în acid galic de 1,55 –
2,6 mg la 100 g-1 probă uscată. A cidul ferulic a fost prezent în concentra ții între 0,34 și 6,9
mg la 100 g-1 probă uscată iar acidul ca feic a prezentat valori între 1,0 și 13,8 mg la 100 g-1
probă uscată. De asemenea, catechina și epicatechina au fost principalii compu și identifica ți
în extract ele de ore ganum.
Literatura de specialitate precizeaz ă numeroase studii referitoare la analiza compușilor
polifenolici prezen ți în extractele vegetale utilizând cromatografia lichidă de înaltă
performan ță cuplată cu spectromet ria de masă .
Studiu l raportat de Rigane G. și colaboratorii (2013) [203] a avut ca obiectiv
investigarea compu șilor bioactivi și a compozi ției chimice din extractele speciei Calendula
oficinalis cultivată în Tunisia prin cromatografia de lichide de înaltă performan ță cuplată cu
spectromet ria de masă (LC -MS). Prin această tehnică au fost analizate e xtractele metanol ice și
apoase din frunzele și florile de gălbenele , cercetările conducând la identificarea șі
cuantificarea un ui număr de cinci compu și principali : rutina, quercetin -3-O-glucozid a,

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
51
scopoletina -7-O-glucozida, is oramnetin -3-O-glucozida și acidul galic. Acest studiu ar putea
oferi informa ții utile pentru industrie cu scopul de a produce extract e de plante bogate în
compuși bioactivi .
Identificarea șі separarea flavonoidelor, naftodiantronelor șі a hiperforinei din
extractele metanolice de Hypericum perforatum prin metoda LC -MS în 35 de min. a fost
realizată de Ganzera M . și colaboratorii (2001) [260]. Studiul a arătat diferen țe semnificative
din punct de vedere al analizei calitative și cantitative indicând necesitatea utilizării metodelor
de analiză precise p entru asigurarea calită ții suplimentelor alimentare dar și pentru produsele
pe bază de sunătoare.
Un număr de 21 de probe de ulei de sunătoare au fost investigate prin cromatografia
de lichide de înaltă performan ță cuplată cu spectrometria de mas ă cu sco pul de a identifica șі
cuantifica principalele componente active, de c ătre Orhan I.E. și colaboratorii (2002) [261].
Rezultatele ob ținute au arătat prezen ța pseudohipericinei (cu valori cuprinse între 0,135 și
3,280 µg g-1) șі a hiperici nei (cu valorile 0, 277 și 6,634 µg g-1) în toate uleiurile analizate.
Acidul clorogenic a fost det ectat doar într -o singură probă având valoarea de 1,063 µg g-1,
hiperforina fiind identificată în patru probe, cu valori cuprinse între 0,977 șі 2,399 µg g-1;
adhiperforina a fo st detectată în șase probe, valorile înregistrate fiind între 0,005 și 3,165 µg
g-1. Hipericina șі pseudohipericin a au fost frecvente în uleiurile analizate în timp ce
hiperforina, adhiperforina șі acidul clorogeni c au lipsit din aceste probe.
Tehnicile LC/DAD/SPE/ NMR și LC/ UV/ (ESI) MS au fost aplicate de către Tatsis
E.C. șі colaboratorii (2007) [262] pentru separare a și verificarea structurii componentelor
majore cunoscute din extractele metanolice de Hypericum perforatum din Grecia . Prin analiza
LC-MS au fost identifica ți: naftodiantronele (hipericina, pseudohipericina, protohipericina șі
protopseudohipericina), floroglucinolii (hiperforina șі adhiperforina), flavonoidele
(quercitinul, quercitrinul, izoquercitrinul, hiperozida, astilbinul, miqelianinul șі I3, II8 –
biapigenin ) precum șі acizii fenolici ( acidul clorogenic șі acidul 3 -O-coumaroilquinic). În
extractele metanolice de sun ătoare a u fost detectate pentru prima dată 2 floroglucinoli
(hiperfirin și adhiperfirin) care au fost raporta ți anterior ca f iind precursori î n biosinteza
hiperforinei și a adhiperforinei .
Un alt studiu mai amplu șі-a propus să investigheze compozi ția chimică a păr ților
aeriene ale specie i Hypericum perforatum colectate din 3 zone ale Estoniei. Cromatografia de
lichide de înaltă performan ță cuplată cu spectrometria de masă a fost folosită pentru
identificarea acizilor fenolici, hipericinei șі hiperforinei din extractele apoase șі etanolice ale
frunzelor șі florilor de sunătoare . Rezultatele studiului demonstrează o variabilitate destul de

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
52
ridicată în con ținutul di verselor clase de substan țe din Hypericum perforatum cu scopul de a
selec ta materiile prime utilizate pentru produse le farmaceutice [263].
Prin metoda LC -MS descris ă de Kusari S. șі colaboratorii (2009) [264] au fost
identificațі un număr de opt compu șі: hipericina, pseudohipericina, emodina, hiperforina,
hiperozida, rutinul, quercetinul șі quercitrinul din mai multe specii din genul Hypericum
(Hypericum hirsutum L., Hypericum maculatum Crantz , Hypericum montanum L., Hypericum
tetrapterum Fr. colectate di n Slovacia și Hypericum perforatum L. colectate din India ).
Probele au constat în extracte din frunze, tulpini și rădăcini. Rezultatele ob ținute au arătat că
hiperforina șі quercitinul se găsesc în cantită ți mai ridicate în specia Hypericum perforatum
comparativ cu celelalte specii analizate.
Orčic´ D. Z. șі colaboratorii (2011) [265] au dezvoltat o metod ă de fracționare și
identificare a compușilor cu proprietă ți active din extractele metanolice de Hypericum
perforatu m din sudul Serbiei. Metoda LC -MC a permis separare a și identificarea
componentelor majore (6 flavonoide, 4 nafthodiantrone și 4 floroglucino li) din extractele de
sunătoare într-un timp foarte scurt (8 minute). În plus , majoritatea frac țiilor analizate au
prezentat o activitate antioxidantă foarte mare în compara ție cu antioxidan ții sintetici.
Activitatea antioxidantă poate fi atribuită prezenței flavonoide lor și acizi lor fenolici în timp ce
floroglu cinolii și naftodiantronele nu au demonstrat nici o activi tate semnificativă. S -a
evidențiat posibilitatea obținerii prin fracționare a preparate lor de sunătoare cu un raport
semnificativ floroglucinoli -naftodiantrone până la 95 : 5%.
O serie de extracte metanolice de Hypericum perforatum din nordul Greciei au fo st
analizate prin LC -MS de către Kalogeropoulos N. și colaboratorii (2010) [266]. Rezultatele au
indicat prezen ța preponderentă de gl ucozide, quercitin, epicatechina și catechina . De
asemenea, a fost identificat și malvidin cu concentrația de 1,96 ± 0,2 mg g-1. Concluziile
acestui studiu eviden țiază faptul că încapsularea în β -Ciclodextrin ă îmbunătă țește stabilitatea
termică a antioxidan ților nutraceutici prezenți în extract ele de sunătoare, sugerând astfel că,
complexul de incluziune ar putea servi drept u n supliment alimentar bogat în flavonoide sau
un aditiv nou care poate spori capacitatea antioxidantă a alimente lor proaspete sau prelucrate
termic.
După administrarea unor extracte de Hypericum perforatum șobolanilor și oamenilor
voluntari s-a determinat conținutul de hiperforină din pla sma sangvină prin metoda LC-MS.
Datorită faptului că dozele terapeutice administrate la șobolani au fost ma i mici decât în cazul
oamenilor a fost necesară o metodă LC-MS cât mai precisă pentru determinarea hiporfirinei.
După 3 ore de la administrarea unui produs ce con ține 5% hiperforină în doză de 300 mg kg-1

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
53
s-a determinat concentra ția de hiperforină (370 ng mL-1) în plasma sangvină a șoarecilor.
Testarea s -a efectuat și în cazul voluntari lor sănătoși care după 3,5 ore de la administrarea
unor tablete ce con țineau 14,8 mg hiperforină s-a constatat prezen ța unei concentra ții ridicate
de hiperforină în p lasma sangvină (150 ng mL-1) [267].
Un studiu efectuat de Gao S. și colaboratorii (2010) [268] pe 12 produse naturiste pe
bază de Hypericum perforatum au fost analizate în ceea ce prive ște conținutul în polifenoli.
Prin metoda LC -MC au fost identifica ți compușii majoritari: rutina, hiperozida,
isoquercitrinul, quercitrinul, quercetinul și amentoflavona. Rezultatele ob ținute a u
concluzionat faptul că diferitele suplimente pe bază de Hypericum perforatum au un con ținut
foarte variat în polifenoli. În acest context, apare astfel necesitatea standardiz ării acestor
produse pentru utilizarea lor în condi ții de siguran ță și eficacita te.
Cromatografia de lichide de înaltă performan ță cuplată cu spe ctrometria de masă a fost
utilizată de Jager L.S. și colaboratorii (2004) [269] pentru testarea diferite lor ceaiuri și băuturi
disponibile pe pia ță care con țin extract de sunătoare. A fost de terminat con ținutul de
hipericină, pseudohipericină, hiperforină și adhiperforină. Compararea concentra țiilor din 4
ceaiuri de sunătoare au arătat o varia ție a concentra ției de hipericină cuprinsă între 1044 și
1010 ng mL-1. Totodată, în alte băuturi anali zate nu au fost identifica ți compuși de macerare
aceștia fiind probabil descompu și din cauza pH -ului scăzut sau datorită expunerii la lumină.
Datorită faptului că unele medicamente pe bază de Hypericum perforatum determină
scăderi substan țiale ale concentr ațiilor de medicamente , un studiu elaborat de Martin -Facklam
M. și colaboratorii (2004) [270] și-a propus să evalueze gradul de expunere sistemică la
hiperforină și hipericină a pacien ților unui spital. Astfel, au fost comparate conținutul în
medicamente cunoscut ini țial din alte investiga ții cu cel de după administrarea de produse pe
bază de sunătoare. Astfel 150 pacien ți cu vârsta de peste 18 ani au participat la acest
experiment. Hiperforina și hipericina au fost determinate prin tehnica LC-MS analizând
plasma pacien ților. Rezultatele ob ținute au arătat că hipericina și hiperforina pot scădea
concentra țiile medicamentelor administrate pe timpul spitalizării. În concluzie, utilizarea
necontrolată a produselor pe bază de sunătoare concomitent cu medicamenta ția administrată
are influen ță negativă asupra eficacită ții tratamentului medicamentos .
Un grup de cercet ători au dezvoltat o metodă LC-APCI -MS cu scopul de a identifica
și cuantifica 13 compu și (acid clorogenic, acidul cafeic, acidul cumaric, acidul feru lic, (+ )-
catechin, ( -)-epicatechin, rutin, quercet in, isoquercitrin, f isetin, izoramnetin, hesperidin și
crisin ) din extractele hidroalcoolice ale speciilor Calendula officinalis , Hypericum
perforatum , Galium verum și Origanum vulgare precum și din unele e xtracte comerciale ale

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
54
acestor plante medicinale din Rom ânia. Extractele etanolice preaparate în laborator prezintă
concentra ții mai mari de compu și poli fenolici comparativ cu extractele comerciale. Metoda
cromatografică dezvoltată a fost simplă, sensibilă și reproductibilă și poate fi utilizată cu
succes în viitor și pentru analiza unor extracte din alte plante [271 ].
Folosind cromatografia de lichide de înaltă performan ță cuplată cu spectrometria de
masă, Shen D.D. și colaboratorii (2010) [272 ] au identi ficat trei acizi organici (acidul
rozmarinic, acidul oleanolic si acidul ursolic) din extractele plantelor din genul Origanum .
Rezultatele cantitative au arătat faptul că în extractele speciei Origanum vulgare întâlnim
concentra ții ridicate ale acestor ac izi comparativ cu celelalte extracte .
Miron T.L. și colaboratorii (2010) [228] folosește metoda extracției sub presiune
pentru a izola compu șii bioactivi de la trei plante native din România: oregano ( Origanum
vulgare ), tarhon ( Artemisia dracunculus ) și cimbru sălbatic ( Thymus serpyllum ). Au fost
testate extracțiile cu apă, etanol și apa:etanol la temperaturi de extrac ție cuprinse între 50 si
2000 C. Utilizarea metode i LC-MS/MS a permis ide ntificarea a 30 de compuși polifenolici
diferiți incluzând acizi fe nolici, flavone, flavanone și flavonoli care au o influen ță importantă
asupra capacității antioxidante totale ale extractelor.

I.3.2.3. Cromatografia în fază gazoas ă
Cromatografia în fază gazoasă (GC) еstе o tehnică care sе bazеază ре dіstrіbu țіa
compușіlor întrе un gaz șі ο fază stațіοnară fiind utіlіzată реntru sерararеa сοmрοnеntеlοr
dіntr -ο sοluțіе. Numai deriva ții volatil i (сοmрușі сarе au рunс t dе fіеrbеrе maі mіс dе 400°C)
pot fi analizațі рrіn сrοmatοgrafіa în fază gazoasă deoarece aceștia trebuie să fie stabili șі sub
fοrmă de vapori. Cοlοana еstе un сaріlar lung dе aрrοxіmatіv 10 рână la 50 m lungіmе сu un
dіamеtru іntеrіοr dе сâțіva mісrοmеtrі iar faza mοbіlă еstе alсătuіtă dіnt -un gaz іnеrt (Hе, Аr,
H2, Ν 2). Mecanismul constă în injectarea probe i printr -un orificiu de admisie unde este
imediat vaрοrіzată șі transрοrtată dе un сurеnt dе gaz. Astfel, gazul transрοrtă сοmрușіі рrіn
сοlοană șі aсеștіa sunt sерarațі datοrіtă sοlubіlіtățіі lοr dіfеrіtе în faza stațіοnară. Dеtесtοrul
înrеgіstrеază sсhіm barеa dе f ază a сοmрοnеntеlοr dе analіzat sеmnalul fііnd înrеgіstrat ре
сrοmatοgramă οbțіnându -sе astfel datеle сantіtatіvе șі сalіtatі vе ale сοmрușіlor de interes
[273]. Chiar dac ă această tehnică prezintă câteva dezavantaje legate de prelucrarea probelor si
costurile de analiz ă, tehnica a fost utilizat ă frecvent pentru stabilirea compozi ției extractelor
vegetale.
Extracția uleiului esențial (0,05%) din gălbenele s-a realizat la presiune înaltă (100,
200 și 300 bari, temperatura 40 ° C) și la presiune joasa (60, 90 și 120 bar i, temperatura 15°

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
55
C). Compușii majoritari identifica ți folosind GC -MS și GC -FID au fost: cadinol (26,54%), T –
cadinol și T-muurolol (9,80 %), cadinene (2, 99%), acid hexadecanoic (2,95%) și ledane
(2,45%). Î n plus, a fost investigată și cinetica de extrac ție la presiunea de 200 bar i și la
temperatura de 40° C. Extractul total ob ținut după 10 de ore de extrac ție a fost de 6,54% iar
conținutul în ulei esen țial a fost de 0,209% fiind de 4,16 ori mai mare comparativ cu
conținutul obținut prin procedura standard de distilare cu vapori [198].
Uleiurile esențiale au fost extrase prin hidrodistilarea frunze lor proaspete, uscate și
flori proaspete de Calendula officinalis . Analiza uleiurilor prin GC -MS a arătat un total de 30
de compu și din frunze proaspete , 21 de compu și din frunze uscate și 24 de compu și din flori .
Sesquiterpenoidelor au fost compușii majoritari în frunze le proaspete (59,5%) și flori (26 %)
în timp ce monoterpene le s-au găsit în concentra ție mai mare în uleiul din frunze uscate
(70,3%). T -muurolol (40,9 %) a fost compusul predominat în uleiul din frunze proaspete; α-
thujene (19,2%) și δ-cadinene (11,8%) au fost de asemenea prezen ți în cantită ți mari.
Întrucât, 1,8 -cineol (29,4%), γ-terpenene (11,6%), d -cadinene (9,0%), β-pinen (6,9%) și α-
thujene (6,3%) au fost principalele componente în uleiul din frunze uscate , în uleiul din flori
proaspete α-thujene (15,9%), δ-cadinene (13,1%) și δ-cadinene (10,9%) au fost componentele
majore. Rezultatele a cestui studiu descris de Okoh O.O. și colaboratorii (2008) [274] au
întărit faptul că există diferen țe cantitative și calitative a componentelor din uleiuri le esențiale
din planta proaspat ă și uscată.
Analiza fitochimică calitativă și cantitativă a extractelor metanolice din flori de
Calendula off icinalis cultivate în Irak a fost eviden țiată conform studiului descris de Abdul –
Jalill R. (2014) [275]. Studiul a arătat prezen ța zah arurilor , taninuri lor, flavonoide lor,
steroizi lor, terpenoide lor și alcaloizi lor. Extractele metanolice din flori, rădacină, frunze și
stem au f ost analizate prin cromatografia în fază gazoasă cuplată cu spectrometria de masă
(GC-MS). Au fost identifica ți 7, 17, 43 și 22 compuși diferiți din extractele analizate de flori,
rădacină , frunze și respectiv stem. Componentele major e prezent e au fost: 2 -oxa-6-
azatriciclo -(3,7) -decan, 4,8 -diiod -6-(Fenilsulfonil) – (1α, 3β, 4α, 5α, 7β, 8β) – (21.419 %) în
extract ul din flori; octadec -9-enoic (33, 51%) în extract ul din stem; acidul 6-octadecenoic în
extract ul din rădăcină (36,63%) și în extract ul din frunze (27, 47%).
Compoziția de ulei volatil ob ținut din șase specii de Hypericum din Serbia a fost
studiată de Saroglou V. și colaboratorii (2006 ) [199]. Uleiurile esen țiale au fost analizate prin
GC-FID și GC -MS. Identificarea substan țelor a fost făcută prin compararea spectrelor de
masă cu datele din literatura de specialitate. Au fost identificate un număr total de 100 de
compuși diferiți. Principalele componente ale popula țiilor investigate din fiecare taxon au fost

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
56
dezvăluite după cum ur mează: Hypericum alpinum : (-)-β-pinen e, γ-terpinene, ( -)-(E)-
caryophyllene; Hypericum barbatum : α-pinen, β -pinen, (-)-limonen, (-)-(E)-caryophyllene,
(-)-cariofilenă oxid; Hypericum rumeliacum : α-pinen, β-pinen, (-)-limonen; Hypericum
hirsutum : nonan, un decan, (E) -cariofilenă , (-)-cariofilenă oxid; Hypericum maculatum :
spathulenol, globulol; Hypericum perforatum : (-)-α-pinen, (Z) -β-farnesene, germacrene D;
Hidrocarburi le monoterpene au dovedit a fi principalul grup de taxoni apar ținând sec țiunii
Drosocarp ium în timp ce taxoni i din secțiunea Hypericum au fost mai bogate în hidrocarburi
sesquiterpene.
Uleiurile esen țiale obținute prin hidrodistilarea păr ților aeriene ale speciilor
Hypericum perfoliatum L. (Drosocarpium Spach.) și Hypericum tomentosum (Adenos epalum
Spach.) cultivate în Tunisia a u fost analizate prin GC și GC -MS de Hosni K. și colaboratorii
(2008 ) [276 ]. În uleiurile esen țiale ale specie Hypericum perfoliatum au fost identifica ți 32 de
compuși : α-pinen (13,1%), al lo-aromadendrene (11,4%), germ acrene-D (10,6%), n -octan
(7,3%), α-selinene (6,5%) și β-selinene (5,5%), în calitate de constituen ți principali; în uleiul
de Hypericum tomentosum au fost identificate 66 de component e, menton (17,0%), n -octan
(9,9%), β-caryophyllene (5,3%), α -pinen (5,2% ), acid lauric (4,1%) și β-pinen (3,7%) fiind
componentele cele mai abundente. Ambele uleiuri au fost caracterizate cu scopul utiliz ării în
industria alimentară, farmaceutică și parfum erie.
Compoziția chimică a uleiului esen țial obținut din păr țile aeriene ale specie i Galium
verum (Rubiaceae) din Iran a fost examinat prin GC și GC / MS de Mirza M. și colaboratorii
(2004 ) [128 ]. În uleiul esențial de Galium verum au fost identificate 23 de componente.
Componentele majore s-au dovedit a fi: (E) -cariofilenă (26%), oxid cariofilenă (16,2%) și
germacrene D (11,2%). Potrivit raport ărilor din literatura de specialitate specia Galium verum
mai conține pe langă polifenoli, carbohidra ți și aminoacizi.
Il′ina T.V. și colaboratorii ( 2009 ) [121] raportează studiul comp ușilor volatili din
florile de Galium verum colectate î n vara anului 2008 în Harkov Oblast '. În urma analizei GC-
MS au fost identifica ți 36 de compu și. Cis-3-hexen -1-ol (29,77%), scualen (20,82 %), eter ul
monometil dietilenglicol (10,17 %), și alcool ul benzi lic (7,85 %) au dominat frac ția lipofil ică.
Cantitatea totală de compu și volatili din flori le speciei Galium verum a fost de 2,74%,
calculată pe materie primă uscat ă.
Probele de Origanum vulgare provenite din șase zone din China și Pakistan au f ost
analizat e prin GC-FID precum și prin GC-MS. În aceste probe au fost identif icate 11 -16
componente volatile reprezentând 98,5% – 99,9% din componentele volatile ale uleiul ui de
oreganum . Clasa monoterpene lor a fost predominantă în toate uleiurile esen țiale analizat e.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
57
Rezultatele ob ținute au indicat prezen ța unui con ținut ridicat în hidrocarburi sesquiterpene
[277].
Scopul studiu lui descris de Carneiro de Barros J. și colaboratorii (2009) [278] a fost de
a investiga compozi ția chimică a uleiului esențial de Origanum vulgare , efectul inhibitor al
uleiului asupra viabilită ții tulpinei Staphylococcus aureus , izolată din alimente și influența de
inhibiție a uleiului asupra unor atribute fiziologice ale acestei tulpini. Analiza GC -MS a
demonstrate faptul că, carvacrol ul (57,71%) a fost compus ul cel mai r ăspândit în ulei, urmat
de p-cimen (10,91%), γ-terpinene (7,18%), terpinen -4-ol (6,68%) și timol ( 3,83%). În plus,
rezultatele au ar ătat că uleiul esențial de Origanum vulgare la concentra ții 0,03, 0,6 și 0,12 µg
mL-1 a inhibat viabilitatea celulară a tulpinii Staphylococcus aureus . Astfel, uleiul esențial de
Origanum vulgare ar putea fi un antimicrobian cu capacitatea de a inhiba cre șterea și
supraviețuirea bacteriilor patogene în alimente, în special a tulpinii Staphylococc us aureus .

I.3.3. Metode electroforetice
I.3.3.1. Electroforeza capilară
Electroforeza capilar ă este una dintre cele mai modern e tehnici de analiz ă. Principiul
metodei se bazează pe separarea moleculelor încărcate electric în funcție de mobilitatea
acesto ra într-un tampon cu un anumit pH și în funcție de fluxul electroosmotic. Procesul de
separare are loc în capilare de siliciu, umplute cu diferi ți electroli ți, prin aplicarea unei
diferențe de poten țial la extremitatea cap ilarului. Astfel, ionii probei se deplaseaz ă spre
electrodul corespunz ător trecând prin detector ce r ăspunde cu înregistrarea unei
elecroforegram ă.
În funcție de modul în care are loc separarea exist ă mai multe variante de
electroforez ă capilară:
 electroforeza capilar ă zonală -separarea electroforetică a analiților se
realizează pe o capilară foarte îngustă în funcție de sarcina electric ă și a masei
moleculare ;
 focusarea electric ă -principiul metodei se bazează pe mi șcarea unor molecule
cu caracter amfoter într-un anumit gradient de pH s tabil;
 izotacoforez a capilară -separarea componen ților unei probe are loc în funcție
de mobilitatea lor, în zone distincte cuprinse între două soluții de electrolit.
Prima con ținând un ion conduc ător (cu o mobilitate mai mare ca a solvi ților) și
cealaltă un ion terminal (cu o mobilitate mai mică fa ța de a lor) ;

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
58
 cromatografia electrocinetic ă micelară -separarea anali ților se realizeaz ă într-
un tampon prin parti ția diferen țiată a lor între micele . În cazul acestei metode
în electrolitul suport se adaugă un a gent tensioactiv într -o concentrație mai
mare decât concentrația sa micelară;
Electroforeza zonal ă și cromatografia electrocinetic ă micelară au fost utilizate cu
succes și la caracterizarea extractelor vegetale.
Marusk A . și colaboratorii (2010) [279] au evidențiat un studiu comparativ privind
numarul de compu și biologic activi din extractele metanolice ale plantelor medicinale: Bidens
tripartita L., Trigonella foenum graecum L., Silybum marianum L. și Calendula officinalis L.
și formele poliploide create experimental ale acestora . Pentru analiza calitativă și cantitativă a
extractelor s-au folosit metode le CE, HPLC și GC -MS. Din analiza electroforetică și
cromatografic ă a extractelor metanolice se poate concluziona faptul că acestea prezintă
concentra ții diferite de compuși fenolici (acidul clorogenic și rutin). De asemenea, rezultatele
electroforetice au confirmat faptul că formele poliploide conțin mai mulți acizi fenolici
comparativ cu plantele de referință.
O metodă electroforetică zonală (CZE) pentru d eterminarea rutin ului dintr-un extract
etano lic din părțile aeriene ale specie i Hypericum perforatum este descris ă de Dogrukol -Ak
D. și colaboratorii (2001 ) [280]. Analiza a fost realizată utilizând o capilară și un electrolit
format din 10% etanol și 20 mM tampon borat la pH 8,0 . Potențialul aplicat a fost de 28 kV,
injectarea vid de 1 s iar detecția compușilor s-a realizat la 200 nm. Timpul de migrare a fost
de 10,1 ± 0,2 min iar reproductibilitatea de 1,26 %. Mai mult, metoda descrisă este simplă,
rapidă și poate fi aplicat ă și pentru analiza rutinului din preparate le farmaceutice .
Scopul studiului descris de Mazina J. și colaboratorii (2015) [281] a fost de a analiza
compozițiile a 47 de plante medicinale și 4 tipuri de ceai din Estonia utilizând o metodă de
fluorescen ță spectrală, rezultatele fiind verificate prin metodele CE-DAD și HPLC -DAD -MS.
Compușii principali identifica ți au fost: catechin, acidul protocatecuic, acidul clorogenic,
acidul siringic și acidul ferulic. Cercetările au concluzionat faptul că rezultatele ob ținute prin
metoda de fluorescen ță sunt în corelație cu rezultatele ob ținute prin metodele CE -DAD și
HPLC -DAD -MS.
Extractele din florile speciilor Calendula officinalis și Sambucus nigra au fost
analizate prin cromatografia de lichid e de înaltă performan ță în fază inversă și cromatografia
electrocinetică micelară . Separarea compu șilor prin RP-HPLC s-a realizat pe o coloana C8
Aquapore RP 300 , faza mobil ă conținând 2 -propanol și tetrahidrofuran. Pentru metoda
MECC s-a utilizat o capilară cu lungimea de 72 cm iar tampon ul de migrare a fost format din

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
59
sodiu dodecil sulfat și borat de sodiu (pH 8,3) . Rezultatele ob ținute prin aceste tehnici au fost
comparate , tehnica MECC fiind mult mai sensibil ă și mai rapid ă decat tehnica RP-HPLC
[282].
Extractele de Hypericum perforatum au fost analizate de Jensen A. G. și Hansen S. H.
(2002) [283] utilizând un sistem de electro foreză capilară cu flux electro osmotic negativ.
Metoda a fost utilizat ă pentru separarea urm ătorilor compu și: hiperic in, protopseudohip ericin,
pseudohipericin, protohi pericin și hiperforin. Timpul de analiză pentru hi pericin și hiperforin
a fost de maxim 3 min. Tehnica de electro foreză capilară cu flux electro osmotic negativ s-a
dovedit a fi o tehnică foarte rapid ă pentru evalua rea compoz iției hi pericinului și a
hiperforinului din extractele de Hypericum perforatum .
Cinci fl avonoide (hi peroside, isoquercitrin, quercitrin, quercetin și rutin) au fost
separat e și cuantificate din extracte le metanolice ale frunzelor și florilor corespunz ătoare
speciei Hypericum perforatum prin electroforez ă capilară zonal ă (CZE) și izotacoforeza
capilară (ITP) . Electrolitul utilizat pentru metoda CZE fost diferit d e cel folosit pentru metoda
ITP dar ambii electroli ți au avut un conținut de 20 % (v/ v) metanol. Metoda ITP -CZE cu
detecție spectrofotometrică la 254 nm a fost potrivit ă pentru cuantificarea flavonoid elor din
probele naturale reale ; kaempferol a fo st utilizat ca standard intern [284].
Dmitrienko S.G. și colaboratorii (2012) [2 85] au comparat metodele d e determinare
HPLC, cromatografia în strat sub țire, electroforeza capilară și alte metode ele ctrochimice. Au
fost analizate diferite metode de extrac ție, preconcentrare și determinare a quercitinei dar și a
altor flavonoizi din specia Hypericum perforatum . Probele analizate cu un con ținut ridicat în
quercitină au fost constituite din preparate farmaceutice, suplimente alimentare și mostre de
plante. Extractul metanolic de Hypericum perforatum a prezentat cel mai mare con ținut de
quercetin comparativ cu cele lalte plantele studiate.
O metodă bazată pe ele ctroforeză capilară cu detec ție electrochimică (CE -DE) a fost
dezvoltată pentru prima dată de către Tan Z. și colaboratorii (2006) [286 ] pentru separarea și
determinarea următorilor compu și: acid isovanillic, acid vanilic , querceti n, acid rozmarinic,
acid cafeic și acid protocatechuic din extractele speciei Origanum vulgare și din preparatele
sale medicinale . În condi țiile optime, anali ții au fost separa ți în 21 min. folosindu -se un
tampon de migrare format din tampon borat 50 mmol, pH 8,7 . Metoda a fost aplicată cu
succes pentru analiza eșantioanelor reale cu rezultate satisfăcă toare .
Gatea F. și colaboratorii (2014 ) [287] au elaborat și validat o metodă de electroforeză
capilară, simplă, reproductibilă și rapidă prin care s -au separat 20 de compu și polifenolici
(resveratrol, pinostrobin, acacetin, crizol, rutin, naringenin, izoquercitrin, umbeliferonă, acidul

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
60
cinamic, acid clorogenic, galangin, acid sinapic, acidul siringic, acid ferulic, kampfe rol,
luteolin , acidul cumaric, quercetin, acid rozmarinic și acid cafeic) din extractele etanolice ale
speciilor Origanum vulgare și Mentha aquatic a. Tamponul de migrare utilizat a fost format
din 45 mM solu ție tampon tetraborat și 0,9 mM sulfat dodecil de sodiu, la pH = 9,35.
Intervalele de linearitate utilizate pentru cuantificarea compu șilor au fost satisfăcătoare
prezentând coeficien ți de corela ție între 0,997 și 0,999 pentru cei 20 de compu și. Metoda a
prezentat caracteristici performante cu limite de detec ție cuprinse între 0,02 și 1,75 și limi te
de cuantificare între 0,07 -5,77 μg mL-1.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
61
I.4.Concluzii
 Plantele medicinale Calendula officinalis (Gălbenele) , Hypericum perforatum
(Sunătoarea) , Galium verum (Sânziene) și Origanum vulgare (Șovârful) sunt specii
vegetale natural e cu propriet ăți remarcabile;
 Compoziția biochimic ă a specie i Calendula officinalis cuprinde mai multe clase de
compuși chimici dintre cele mai importante fiind: carotenoizi i, terpenoide le,
flavonoide, aminoacizi i și uleiuri le volatile , chinone le și cumarine le;
 Extractele de sună toare sunt bogate în compuși biologic activi : rutin, pectină, colină,
sitosterol, hipericină și pseudohipericină (compuși cu un real potențial în tratamentul
HIV), hipericina și hiperforina, flavonoidel e, taninuri;
 Sânzienile ocupă un loc important în medicina naturistă datorită compoziției
biochimice foarte variate și anume: iridoide, flavonoide, taninuri, vitamine și alți
compuși activi ;
 Principalii compu și găsiți în ulei ul esențial extras din Origanum vulgare au fost :
carvacrolul, c-terpinene, o -terpinene, p -cimen , timol, acizi feno lici, flavonoide,
taninuri, etc;
 Studiile farmacologice au raportat propriet ățile terapeutice ale plantelor: Calendula
officinalis (acțiune antibacterian ă și antifungic ă, an titumorală, cicatrizant ă,
antioxidant ă, hepatoprotectoare, antiinflamatorie, antidemoas ă, antiviral ă și anti-HIV);
Hypericum perforatum (acțiune de ameliorare a bolilor sistemului nervos și a
alcoolismului, antibacterian ă și antivirală, antitumoral ă, vasod ilatatoare și diuretică,
antiinflamatoare, antiseptic ă, cicatrizant ă); Galium verum (acțiuni diuretic e, sedative,
spasmolitice și antioxidant ă); Origanum vulgare (acțiune antioxidant ă,
antimicrobian ă, antidiabetic ă, acțiune de ameli orare a ulcerului gastri c, acțiune de
stimulare a hipotalamusului, alte acțiune fitofarmaceutice);
 Principalii compuși responsabili de acțiunile biologice ale plantelor Calendula
officinalis , Hypericum perforatum , Galium verum și Origanum vulgare sunt
polifenolii , acest lucru fi ind demonstrat de numeroasele raport ări științifice;
 Cele mai utilizate medii de extracție pentru gălbenele, sun ătoare, sânziene și șovârf
sunt: apa, alcoolul etilic, alcoolul metilic dar și amestecuri în diferite propor ții ale
acestora;
 Spectrometri a UV-Vis permite determinarea calitativ ă și cantitativă a principiilor
active precum și proprietățile antioxidante ale extractelor de: Calendula officinalis ,
Hypericum perforatum , Galium verum și Origanum vulgare ;

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
62
 Prin spectrometria de mas ă s-a realizat caracter izarea extractelor apoase,
hidroalcoolice și acetonice ale speciilor Calendula officinalis , Hypericum perforatum ,
Galium verum și Origanum vulgare și s-a evidențiat prezența catechinelor, a
zaharurilor dar și prezența a ltor componente (fisetinidin, is oramn etin, etc.) ;
 Cromatografia în strat sub țire este tehnica analitic ă frecvent utilizat ă pentru
identificarea compu șilor ind ividuali din extractele plantelor Calendula officinalis ,
Hypericum perforatum , Galium verum și Origanum vulgare ;
 Cromatografia de lichide de înalta performan ță în fază inversă (RP-HPLC) reprezintă
una dintre cele mai utilizate tehnici pentru caracterizarea speciilor Calendula
officinalis , Hypericum perforatum , Galium verum și Origanum vulgare ;
 Tehnica RP -HPLC cuplat ă cu detectori de tipul DAD și MS a permis analiza calitativ ă
și cantitativă a extractelor de gălbenele, sun ătoare, sânziene și șovârf;
 Analiza uleiurilor ob ținute din extractele speciilor Calendula officinalis , Hypericum
perforatum , Galium verum și Origanum vulgare s-a realizat prin utilizarea
cromatografiei în fază gazoasă cuplată cu diferiți detectori (GC -MS, GC -MS/MS, GC –
FID);
 Datorită timpului scurt de analiz ă și a costului ex trem de redus comparativ cu metoda
cromatografic ă, electroforeza capilar ă (CE) este utilizat ă cu suc cess în caracterizarea
extrac telor de gălbenele, sun ătoare, sânziene și șovârf;

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
63
II. PARTEA EXPERIMENTALĂ
Scopul principal al tezei de doctorat a fost caracterizarea analitică a extractelor obținute
din speciile Calendula officinalis , Hyperic um perforatum , Galium verum și Origanum vulgare
din punct de vedere al conținutului în substanțe active în special compuși polifenolici . Pentru
îndeplinirea acestui scop au fost propuse o serie de obiective subsidiare :
 Caracterizarea primară a extractelor apoase și hidroalcoolice (30%, 50% și 70%) ale
plantelor: Calendula officinalis , Hypericum perforatum , Galium verum și Origanum
vulgare în ceea ce privește con ținutul de polifenoli și activitatea antioxidantă;
 Dezvoltarea și validarea unei metode analitic e sensibile pentru caracterizarea avansată
a conținutului în polifenoli și studiul stabilită ții probelor reale și a unor preparate
comerciale din plantele studiate;
 Analiza calitativă și cantitativă comparativă a polifenolilor din extractele de: Calendula
officinalis , Hypericum perforatum , Galium verum și Origanum vulgare prin
electroforez ă capilară zonală;
 Extracția și cuantificarea unor taninuri din diferite tipuri de extracte ale plantelor
studiate folosind MALDI -TOF și cromatografia electrocinetică micelară (MEKC) ;

II.1. CARACTERIZAREA PRIMAR Ă A EXTRACTELOR APOASE ȘI
HIDROALCOOLICE (30%, 50% și 70%) ALE PLANTELOR: CALENDULA
OFFICINALIS, HYPERICUM PERFORATUM, GALIUM VERUM SI ORIGANUM
VULGARE ÎN CEEA CE PRIVE ȘTE CON ȚINUTUL ÎN POLIFENOLI ȘI
ACTIVITATEA ANT IOXIDANT Ă

II.1.1. Introducere
În general plantele medicinale sunt caracterizate prin conținutul lor diferit în principii
active. O categorie importantă de compuși biologic activi este repreze ntată de compușii
polifenolici a căror acțiune constă în prevenirea formării radicalilor liberi. Polifenolii sunt
clasificați în două grupe principale: acizi fenolici și flavonoide, regăsindu -se în diferite părți
anatomice ale plantelor (flori, fructe, rădăcini, frunze). Câteva dintre activitățile acestor
compuși sunt: anti-tumorale, anti -inflamatorii, antimicrobiene, antibacteriene, antif ungice și
imunostimulatoare [288, 289 ]. Flora țării noastre este extrem de diversă, ea înglobează
aproximativ 60% din speciile medicinale europene, plante utilizate tradițional în trat amentul
naturist a unor boli. În acest context, caracterizarea principiilor acti ve din aceste plante
medicinale reprezintă o preocupare pentru mulți cercetători.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
64
Multe plante medicinale sunt folosite empiric, fără a fi suficient studiate din punct de vede re
al compoziției chimice, cea care determină activitățile biologice. Printre plantele frecvent
utilizate în medicina noastră populară pentru realele proprietăți terapeutice, fac parte:
Calendula officinalis , Hypericum perforatum , Galium verum și Origanum vulgare , pe care le –
am ales pentru studiu deoarece nu au fost caracterizate exhaustiv din punct de vedere chimic.
Experimentele realizate în ca drul primului subcapitol al păr ții de cercetare au avut
drept scop caracterizarea extractelor obținute din Calend ula officinalis , Hypericum
perforatum , Galium verum și Origanum vulgare. Menționez că s -a lucrat doar pe preparate
comerciale. Activitățile experimentale desfă șurate au inclus:
– Obținerea extractelor vegetale din plante prin extracție în mediu apos și
hidro alcoolic (30%, 50% și 70%);
– Determinarea conținutului total de polifenoli a extractelor;
– Determinarea capacit ății antioxidante a extractelor ob ținute (metoda cu ABTS și
metoda cu DPPH);
– Analiza calitativă și cantitativă a unor compu și individuali din probe reale prin
cromatografia de lichide în fază inversă cu detec ție cu șir de diode (RP -HPLC –
DAD) ;

II.1.2. Reactivii utiliza ți
Etapele experimentale au presupus utilizarea unor reactivi specifici: acetonitril, acidul
acetic, reactivul Folin -Ciocâlteu, meta nol și etanol care au fost achizi ționați de la Sigma –
Aldrich (Germania); acidul clorogenic, acidul cafeic, acidul ferulic, acidul cumaric, acidul
rozmarinic, rutin, luteolin, qu ercetol, apigenin, kaempferol, 2,2 '-azinobis (acid -6-sulfonic 3 –
etilbenzotiazol ină) sare de diamoniu (ABTS), 1,1 -difenil -2-picrylhydrazyl (DPPH), 6 -hidroxi –
2,5,7, acidul 8 -tetrametilcroman -2-carboxilic (Trolox), persulfat de potasiu, ace tat de sodiu,
carbonat de sodiu au fost achizi ționate de la Fluka (Germania). Standardele utilizat e au fost de
puritate ridicat ă (≥ 98%) iar reactivii folosi ți au fost de puritate HPLC. De asemenea, s -a
utilizat apă ultra -pură Mili Q (Millipore).

II.1.3. Obținerea extractelor vegetale prin extracție în mediu apos și hidroalcoolic (30%,
50% și 70%)
Materialul vegetal uscat al fiecărei plante luate în studiu a fost achiziționat d in
magazinele specifice de pe piața rom ânească. 5 mg din fiecare plantă au fost amestecate cu
apă (1:10, m/v) și etanol în diferite concentrații, respectiv 30%, 50% și 70% (1:10, m/v). Timp

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
65
de 7 zile amestecul a fost ținut la întuneric la temperatura de 40 C. Extractele apoase și
hidroalcoolice au fost filtrate prin h ârtie de filtru, alicotate și păstrate la congelator pe durata
experimentelor.

II.1.4. Determinarea c onținutului t otal de polifenoli
Conținutul total de polifenoli din probele apoase și hidroalcoolice s -a determinat
conform metodei descrisă de Waterhouse (2001) [29 0] metodă care presupune utilizarea
reactivului Folin -Ciocâlteu. Peste soluțiile diluate de acid galic sa u soluțiile apose și
hidroalcoolice diluate s -a adaugat 2,5 mL reactiv Folin -Ciocâlteu (1:10) , 2 mL carbonat de
sodiu 7,5% (m/v) și apă distilată p âna la volum final de 5 mL. După o oră de incubare la 50°
C s-a măsurat absorbanța la 765 nm față de o soluți e martor (metanol). Conținutul total de
polifenoli din probele examinate a fost determinat prin utilizarea curbei etalon a acidului galic
pentru domeniul de concentrație 5 -80 µg mL -1și a fost exprimat sub formă de echivalenți de
acid galic (GAE) L-1.

II.1.5. Capacitatea de scavenger a radicalului ABTS
Determinarea capacității antioxidante prin metoda cu radicalul ABTS a fost realizată
conform protocolului descris de Van den Berg R. și colaboratorii (1999) [291 ] și Re R.(1999)
[292] cu unele mici modifică ri. Cationii ABTS se formează în urma reacției dintre soluția stoc
de ABTS (7 mM) cu persulfatul de potasiu (2,45 mM). Amestecul a fost lăsat la temperatura
camerei la î ntuneric timp de 12 -16 ore pentru a favoriza finalizarea procesului de formare a
radicalilor. Diferite concentrații ale probelor (500 µL) au fost adăugate la soluția de lucru
ABTS (2500 µL). Scăderea absorbanței înregistrată la lungimea de undă de 734 nm a fost
măsurată comparativ cu un martor care a con ținut metanol în loc de probă. Capacit atea
antioxidantă a extractelor a fost exprimată în mM Echivalen ți Trolox și a fost calculată
conform următoarei ecuații:

TEAC proba= c trolox x f x (A proba-Aetalon/Atrolox-Aetalon) x 1 / m (1)
unde:
– A etalon reprezintă abs orbanța maximă a soluție -martor;
– A Trolox reprezintă absorbanța maximă a soluției stoc de Trolox;
– A proba reprezintă absorbanța maximă a probei;
– f este factorul de diluție al probei;
– c trolox este concentrația de Trolox, exprimată în mmol L-1;

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
66
– m – greutatea de plantă uscată, exprimată în g.
Toate determin ările spectrometrice au fost realizate cu ajutorul unui spectrofotometru UV/VIS
(Jasco V-530, Japonia). Determinările au fost realizate în triplicat .

II.1.6. Capacitatea de scavenger a radicalulu i DPPH
Metoda descrisă de Eklund P.C. și colaboratorii (2009) [293 ] și Govindarajan R. și
colaboratorii (2003) [294 ] are la bază proprietatea „de stingere” a radicalilor DPPH de către
compușii cu acțiune antioxidantă. Pentru determinarea capacit ății antiox idante s -au utilizat
diferite concentra ții ale probelor (apoase și hidroalcoolice) (100 µL), metanol (1900 µL) și
soluție metanolică de DPPH 80 μmol (1000 µL). După 5 minute de incubare la temperatura
camerei a fost înregistrată scăderea absorbanței la 517 nm față de o soluție etalon constituită
doar din metanol și DPPH. Capacitatea antioxidantă a extractelor a fost exprimată în mM
Echivalen ți Trolox și a fost calculată conform următoarei ecuații:

TEAC proba= c trolox x f x (A proba-Aetalon/ATrolox-Aetalon) x 1 / m (1)
unde:
– A etalon reprezintă absorbanța maximă a soluție -martor;
– A Trolox reprezintă absorbanța maximă a soluției stoc de Trolox;
– A proba reprezintă absorbanța maximă a probei;
– f este factorul de diluție al probei;
– c trolox este concentrația de Trolox, exprimată în mmol L-1;
– m – greutatea de plantă uscată, exprimată în g.

II.1.7. Analiza cantitativ ă a polifenolilor din probe reale prin cromatografia de înaltă
performan ță în fază invers ă cu detec ție cu șir de diode (RP -HPLC -DAD)
Pentru separarea cromatografică a fost utilizat un sistem Shimadzu LC -DAD
(Shimadzu, Japonia) compus din: două pompe (LC -10ADvp), detector cu șir de diode (SPD –
M20A), degazor (DGU -20A5), termostat pentru coloană (CTO -10ASvp) și u n sistem de
control (SCL -10AVP). Separarea compușilor s -a realizat pe o coloană Kromasil 100 -5C18 cu
lungimea de 250 mm și diametru intern de 4,6 mm, dimensiunea particulelor de silica de 5
µm. Faza mobilă utilizată a fost formată din: acetonitril (solvent A) și acid acetic 1% (solvent
B). Debitul fazei mobile a fost de 0,8 mL min-1 iar probele au fost eluate conform următorului
program de gradient: 1% la 55% B în 15 min., 55% B , 15 min. și 55% la 1% B în 10 min.
Temperatura a fost menținută constantă la 25° C iar volumul de injecție a fost de 20 µL.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
67
Coloana a fost echilibrată timp de 15 min. folosind un amestec A:B de 50:50%.
Cromatogramele au fost monitorizate pentru un interval de lungimi d e undă cuprins între 320 –
370 nm la o rată de 0,8 s-1 și o rezolu ție de 4,0 nm. Identificarea compușilor de interes s -a
realizat prin înregistrarea spectrelor UV și în func ție de timpul de reten ție a fiecăruia.
Integrarea automată a datelor s -a realizat cu ajutorul programului LabSolution/LCSolution
(Shimadzu, Japonia).
Soluțiile stoc de standard au fost preparate în metanol la o concentra ție de 1 mg mL-1
și au fost păstrate la întuneric, la temperatura de 40 C. Din solu țiile stoc au fost preparate
zilnic diferite dilu ții în faza mobilă în vederea realizării curbelor de calibrare pentru compu șii
de interes.

II.1.3. Rezultate și discuții
II.1.3.1 1 Conținutul total de polifenoli
Conținutul total de polifenoli al extractelor vegetale analizate sunt prezentate în
Tabelul II.1.1. Din rezultatele ob ținute se poate observa o variație mare a con ținutului de
polifenoli în func ție de mediul de extrac ție utilizat. Cantită țile cele mai mari de polifenoli au
fost determinate în extractele hidroalcoolice. Astfel, în extractele apoase au fost determinate
valori ale polifenolilor tota li cuprinse între 0,90 și 9,89 g echivalen ți de acid galic L-1.
Cantitatea cea mai mare de polifenoli a fost determinată în extractele apoase de O. vulgare
(4,71 g GAE L- 1 cea mai mică valoare fiind înregistrată în extractul apos de G . verum (0,90 g
GAE L- 1).
În ceea ce privește conținutul total de polifenol i al extractelor hidroalcoolice cantitatea
cea mai mare a fost determinată î n extractul etanolic 50 % de O. vulgare (9,89 g GAE L- 1) iar
cea mai mică valoare a fost determin ată în extractul etanolic de 30% al speciei C. officinalis
(1,34 g GAE L -1). Dintre cele 4 familii de plante testate Asteraceae (C. officinalis ), Guttiferae
(H. perforatum ), Rubiaceae (G . verum) și Laminaceae (O. vulgare ), extractul etanolic 50%
obținut din familia Laminaceae a prez entat cel mai mare con ținut în polifenoli (9,89 g GAE
L-1). Totodată, din analiza datele obținute se poate observa că exceptând extractul etanolic
70% de H. perforatum valorile cele mai mari în ceea ce prive ște conținutul de polifenoli totali
au fost ob ținute p entru extractele etanolice 50%. Rezultatele ob ținute sunt similare cu cele
raportate de unii autori pentru extractele pla ntelor medicinale studiate [203, 295 ].

II.1.3.2. Capacitatea antioxidantă

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
68
Testarea capacității antioxidante a extractelor studia te a fost realizată prin două
metode: metoda DPPH și metoda ABTS. Ambele metode au la bază un mecanism de reac ție
de tip transfer electronic singular – SET (”single electron transfer”) adică au loc prin transferul
unui electron de la antioxidant la radical . Rezultatele acestor experimente sunt prezentate în
Tabelul II.1 .1.
Toate extractele testate au prezentat capacitate antioxidantă pentru radicalii testa ți.
Valorile capacită ții antioxidante ale extractelor exprimate în m M Trolox ob ținute prin metod a
DPPH sunt mai mici decât cele ob ținute prin metoda ABTS.
Tabelul II.1.1. Conținutul de polifenoli total i și capacit atea antioxidantă a extractelor
vegetale

GAE L-1- g echivalen ți acid galic L-1

Din rezultatele ob ținute prin metoda ABTS se observă că pentru extractele etanolice
valoarea TEAC cea mai mare (307 ,51 mM) a fost determinată pentru extractul etanolic 50%
de O. vulgare iar valoarea TEAC minimă pentru extractul etanolic de 50% al C. officinalis
(22,83 mM). În cazul extractelor apoase, cea mai mare valoare TEAC s -a determinat pentru
specia O. vulgare (91,62 m M) iar cea mai mică pentru extractul apos al speciei G . verum
(18,89 m M). Prin compararea valorilor TEAC determinat e pentru extractele etanolice 30% se
observă că cea mai mare valoare s -a determinat la specia O. vulgare cu 145 ,19 m M, valoarea
minimă fiind determinată pentru extractul de C. officinalis cu 20 ,03 m M iar pentru extractul Planta Proba TEAC ABTS
(mM) TEAC DPPH
(mM) Polifenoli
totali
(g GAE L-1)
C. officinalis Extr.apos 19,54±0 ,35 0,69±0,31 1,19±0,28
Extr.etanolic30% 20,03±0,32 1,37±0,10 1,34±0,11
Extr.etanolic50% 22,83±0,88 2,13±0,68 1,54±0,05
Extr.etanolic70% 18,47±1,46 1,95±0,20 1,35±0,02
H.perforatum Extr.apos 22,13±0,73 0,43±0,61 0,97±0,15
Extr.etanolic30% 36,85±0, 86 1,77±0,25 1,73±0,47
Extr.etanolic50% 71,14±0,51 4,43±0,15 1,59±0,35
Extr.etanolic70% 65,37±0,56 3,89±0.21 2,53±0,23
G. verum Extr.apos 18,89±0,30 0,79±0,55 0,90±0,13
Extr.etanolic30% 31,73±0,35 4,03±0,31 1,96±0,58
Extr.etanolic50% 37,36±0,40 4,97±0,49 2,78±0,85
Extr.etanolic70% 33,85±0,25 5,88±1,07 2,53±0,33
O. vulgare Extr.apos 91,62±0,72 0,57±0,58 4,71±0,01
Extr.etanolic30% 145,19±0,21 18,11±0,49 7,42±0,11
Extr.etanolic50% 307,51±0,46 20,90±1,33 9,89±0,57
Extr.etanolic70% 268,52±0,25 17,62±0,25 8,85±0,26

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
69
30% de H. perforatum a fost ob ținută valoarea TEAC de 36 ,85 m M. Pentru extractele
hidroalcoolice în etanol 70%, valoarea TEAC cea mai mare s -a înregistrat pentru O. vulgare
cu 268 ,52 mM, valoarea medie fiind determinată pentru H. perforatum 65,37 mM, respectiv
valoarea TEAC cea mai mică pen tru specia C. officinalis cu 18 ,47 mM.
Capacitatea antioxidantă a extractelor măsurată prin metoda DPPH a prezentat valori
diferite comparativ cu cele care au fost măsurate prin metoda ABTS. Valorile capacită ții
antioxidan te determinate prin metoda DPPH exprimate în m M Trolox pentru extractele
obținute cu etanol 50% au fost diferite, cea mai mare fiind determinată pentru specia O.
vulgare (20,90 mM) iar cea mai mică valoare a fost determinată în cazul speciei C. officinalis
cu 2,13 mM. Pentru extracte le apoase, cea mai mare valoare a fost m ăsurată pentru specia G .
verum (0,79 mM) iar cea mai mică a fost determinată pentru specia H. perforatum cu 0,43
mM. Valorile capacită ții antioxidante pen tru extractele etanolice de 30% au variat similar cu
cele obținute pentru extractele în etanol 50%; cea mai mare valoare s -a determinat la specia
O. vulgare cu 18 ,11 mM, valoarea cea ma i mică fiind determinată pentru specia C. officinalis
cu 1 ,37 m M. Pentru extractele ob ținute în etanol 70%, valorile capacită ții antioxid ante
determinate prin m etoda DPPH au scăzut în ordinea: O. vulgare (17,62 mM), G . verum (5,88
Mm) H. perforatum (3,89 mM) respectiv C. officinalis (1,95 mM).
Dintre toate extractele testate cele aparținând spe ciei O. vulgare au prezentat cele mai
mari va lori ale capacit ății antioxidante pentru ambele metode de analiză. Aceste rezultate sunt
în corelație cu valorile concentra țiilor de polifenoli determinate pentru aceste extracte.

II.1.3.3. Validarea par țială a metodei cromatografice
Pentru o mai bună ca racterizare a extractelor apoase și hidroalcoolice ob ținute din
Calendula officinalis , Hypericum perforatum , Galium verum , Origanum vulgare și pentru
identificarea unor compu și ce conferă proprietă ți deosebite ace stor extracte a fost dezvoltată o
metodă cr omatografică pentru separarea și cuantificarea compu șilor polifenolici. Metoda
cromatografică dezvoltată a permis separarea, identificarea și determinarea cantitativă a zece
compuși polifenolici: acidul clorogenic, acidul cafeic, acidul ferulic, acidul cum aric, rutin,
acidul rozmarinic, luteolin, quercetol, apigenin, kaempferol prezen ți în extractele studiate.
Metoda cromatografic ă dezvoltată a fost validat ă parțial prin demonstrarea
selectivității, liniarit ății, determinarea limitelor de detec ție, determin area limitelor de
cuantificare, preciziei și exactității.
Pentru o mai bună separare a compu șilor au fost testate diverse faze mobile și diverse
concentra ții ale componentelor fazei mobile (metanol -apa-acid acetic la pH=2,00; metanol –

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
70
apa-acid acetic la pH=2,50 ; acetonitrile -acid acetic 1%). Au fost testate și diferite valori
pentru viteza de curgere a fazei mobile cuprins e între 0,70 și 1,0 mL min-1. Un alt parametru
testat a fost valoarea temperaturii la care are loc separarea (200C, 250C, 300C).
Condițiile optime selectate pentru separarea compu șilor polifenolici au fost:
– compoziția fazei mobil e:acetonitril (solvent B) – acid acetic 1% (solvent A);
– viteza de curgere a fazei mobile 0,8 mL min-1;
– temperatura coloanei 250 C;
În figurile de mai jos sunt pre zentate câteva cromatograme exemplificative pentru un
amestec de standard e și pentru extractele etanolice de C. officinalis , H. perforatum , G . verum
și O. vulgare .

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min-1000100200300400500600700800900mAU
325nm,4nm (1.00)

Fig.II.1.1 . Cromatogra ma amestecului de standarde: 1- Acid clorog enic; 2 – Acid cafeic; 3 –
Acid ferulic; 4 – Acid cumaric; 5 – Rutin; 6 – Acid rozmarinic; 7 – Luteolin; 8 – Quercet ol; 9 –
Apigenin; 10 – Kaempferol
1 2
3 4 5
6 7
8 9
10

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
71

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min-1000100200300400500600700800mAU
325nm,4nm (1.00)
Fig.II.1.2 . Cromatograma extractului etanolic 70% de C. officinalis (1- Acid
cloro genic; 2 – Acid cafeic; 3 – Acid ferulic; 4 – Acid cumaric; 5 – Rutin; 6 – Acid rozmarinic; 7 –
Luteolin; 8 – Quercetol; 9 – Apigenin; 10 – Kaempferol )

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min-50050100150200250300350mAU
323nm,4nm (1.00)

Fig.I I.1.3 . Cromatograma extractului etanolic 70% de H. perforatum (1- Acid
clorogenic; 2 – Acid cafeic; 3 – Acid ferulic; 4 – Acid cumaric; 5 – Rutin; 6 – Acid rozmarinic; 7 –
Luteolin; 8 – Quercetol; 9 – Apigenin; 10 – Kaempferol )

1
2 3 4
5
6
7 8 9
10
1
2 3
4 5
6
7 8
9 10

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
72

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min-100010020030040050060070080090010001100mAU
254nm,4nm (1.00)
Fig.II.1.4 . Cromatograma extractului etanolic 70% de G . verum (1- Acid
clorogenic; 2 – Acid cafeic; 3 – Acid ferul ic; 4- Acid cumaric; 5 – Rutin; 6 – Acid rozmarinic; 7 –
Luteolin; 8 – Quercetol; 9 – Apigenin; 10 – Kaempferol )

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min025050075010001250mAU
325nm,4nm (1.00)

Fig. II.1.5 . Cromatograma extractului etanolic 70% de O. vulgare (1- Acid
clorogenic; 2 – Acid cafeic; 3 – Acid ferulic; 4 – Acid cumar ic; 5- Rutin; 6 – Acid rozmarinic; 7 –
Luteolin; 8 – Quercetol; 9 – Apigenin; 10 – Kaempferol )

Selectivitatea metodei a fost determinată prin analiza compușilor standard și a
probelor. Picurile compușilor de interes au fost identificați prin compararea timpilo r de
retenție și a spectrelor UV cu cele ale standardelor . Datele prelucrate cu ajutorul softului LC 1 2 3
4
5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6
7 8 9 10

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
73
Workstation software LabSolution/ LCsolution (Shimadzu , Japonia) au demonstrat faptul că
similaritatea spectrelor UV în domeniul 320 -370 nm a fost mai mare de 96 % ceea ce
înseamnă că, compușii analizați au fost de puritate ridicat ă.
Liniaritatea metodei cromatogra fice a fost verificat ă prin analiza de regresie liniar ă a
valorilor ariilor picurilor versus concentra ția standardului. Pentru r ealizarea curbelor de
calibrare soluțiile stoc au fost preparate la concentrație finală de 1 mg mL-1. Curbele de
calibrare au fost construite prin reprezentarea grafică a ariilor picurilor în funcție de
concentrația fiecărui compus analizat. Fiecare curbă de cali brare a fos t construită pentru opt
concentra ții diferite , fiecare concentra ție fiind analizată în triplicat. Intervalul de concentra ție
pentru care s -a testat lini aritatea metodei a fost cuprins între 2,5 -80,00 µg mL-1. Metoda
dezvoltată a prezentat lini aritate pentr u toți compușii în domeniul 2,5 -60,0 µg mL-1.
Dependen ța liniară între aria picului ș i concentrația fiecărui compus a fost demonstrată prin
calcularea coeficientului de determinare (r2). Valorile coeficienților de determinare pentru toți
analiții au fost c uprinse între 0,9985 și 0,9999. În Tabelul II.1.2 . sunt prezentați parametrii
înregistrați pentru metoda cromatografică.
Limita de detecție (LOD) este definită drept concentrația minimă măsurabilă cu un
nivel de încredere specificat a unui element chimic c are produce un semnal egal cu de trei ori
abaterea standard experimenta lă a zgomotului de fond (S/Z=3) . Limitele de detec ție au fost
cuprinse între 0,05 µg mL-1 pentru rutin și 0,25 µg mL-1 pentru acidul rozmarinic. Limita de
cuantificare (LOQ) este defini tă ca cea mai mică cantitate de analit care poate fi cuantificată
reproductibil peste zgomotul de referin ță (S/Z=10). Valorile înregistrate pentru limitele de
cuantificare au fost cuprinse între 0,19 si 0,85 µg mL-1. Valorile ob ținute pentru limitele de
detecție și cele de cuantificare indică faptul că metoda prezintă o bună sensibilitate.

Tabelul II.1.2 . Parametri i de performanț ă ai metodei RP -HPLC
Compus
TR±SD
(min)
Liniaritatate
(µg mL-1) r2 LOD
(µg mL-1) LOQ
(µg mL-1)
Acid clorogenic 17.52±0.10 2.5-60 0.9999 0.22 0.73
Acid cafeic 19.18±0.10 2.5-60 0.9993 0.08 0.26
Acid ferulic 20.11±0.12 2.5-60 0.9999 0.21 0.70
Acid cumaric 21.13±0.02 2.5-60 0.9998 0.06 0.22
Rutin 22.13±0.02 2.5-60 0.9998 0.05 0.19
Acid rozmarinic 23.10±0.07 2.5-60 0.9985 0.25 0.85
Luteolin 27.45±0.07 2.5-60 0.9992 0.10 0.35

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
74
Quercetol 27.71±0.07 2.5-60 0.9990 0.23 0.77
Apigenin 31.87±0.03 2.5-60 0.9992 0.15 0.53
Kaempferol 33.46±0.06 2.5-60 0.9992 0.23 0.79

Precizia exprim ă gradul de concordan ță între o serie de m ăsurări obținute de la mai
multe probe. Stabilirea preciziei metodei elabo rate s -a bazat pe două măsurări și anume cea de
repetabilitate a răspunsului pe durata unei zile (n=6) și cea de reproductibilitate a răspun sului
în timp (determinările s -au realizat pe durata a 3 zile) (3x n=6). Pentru măsurarea preciziei a
fost calculat ă deviația standard relativ ă: RSD (%) = SD/medie x 100%. Valorile repetabilit ății
și reproductibilit ății obținute sunt detaliate în Tabelul I I.1.3 .
Toate valorile ob ținute pentru % RSD au fost mai mici de 3 % ceea ce reflectă o bună
precizie a metodei analitice.

Tabelul. II.1.3. Repetabilitatea ș i reproductibilitatea compușilor identificați
Compus Conc.
teoretic ă
(µg /mL) Conc.
detectat ă
(µg /m L) RDSa
(%, n=6) Conc.
detectat ă
(µg /mL ) RDSb
(%, 3x(n=6)

Acid clorogenic 5 5,85 2,77 5,05 0,62
10 10,14 1,55 10,17 1,16
15 15,05 0,32 15,35 1,25
Acid cafeic 5 5,45 1,79 5,21 2,82
10 10,18 1,08 10,13 0,99
15 15,53 1,56 15,27 1,12
Acid ferulic 5 5,08 0,33 5,06 0,59
10 10,04 0,28 10,14 0,53
15 15,06 0,41 15,29 1,13
Acid cumaric 5 5,04 0,69 5,02 0,48
10 10,44 1,14 10,09 0,66
15 15,03 0,52 15,01 0,49
Rutin 5 5,08 0,76 5,15 1,29
10 10,27 1,01 10,32 1,18
15 15,06 0,24 15,09 0,43
Acid r ozmarinic 5 5,03 0,19 5,05 0,37
10 10,21 1,18 10,18 1,95
15 15,09 0,39 15,27 1,09
Luteolin 5 5,18 1,20 5,11 0,47
10 9,96 1,78 10,18 1,16
15 15,17 0,35 15,26 0,72
Quercetol 5 5,36 1,08 5,22 0,89
10 9,97 0,52 10,19 1,74
15 15,11 0,38 15,20 1,70
Apigenin 5 5,01 0,18 5,17 1,05
10 10,10 1,26 10,13 1,16

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
75
15 15,07 0,08 15,22 1,48
Kaempferol 5 5,03 0,18 5,04 0,50
10 10,02 0,11 10,07 0,51
15 15,32 1,05 15,18 1,26
a-Repetabilitate; b -Reproductibilitate
Exactitatea (a curatețea) unei proceduri a nalitice exprim ă ‘apropierea’ între valoarea care
este acceptat ă ca valoare de referin ță (valoarea adev ărată) și valoarea m ăsurată. Valorile de
regăsire a compu șilor polifenolici de interes s -au determinat utiliz ându-se o prob ă diluată de
C. officinalis la care s -au adaugat concentra ții cunoscute de standarde (2 µg mL-1, 7 µg mL-1
și 12µg mL-1). Regăsirea (%) = (Concentra ția găsită / Concentra ția adăugată)*100. Pentru
fiecare nivel de reg ăsire s -a realizat analiz a în triplicat. Valoarea maxim ă de regăsire a fost
calculată pentru acidul cumaric (104,50%) iar valoarea minim ă a fost calculată pentru
apigenin (97,66%). Valorile de reg ăsire ale compuș ilor sunt prezentate în Tabelul II.1.4 .

Tabel II.1.4. Valorile de reg ăsire pentru compușii polifenolici
Compus Conc.ad ăugat ă
(µg mL-1) Conc.g ăsită
(µg mL-1) Regăsire
(%, n=3)
Acid clorogenic 2 1,98 99,00
7 7,02 100,28
12 11,85 98,75
Acid cafeic 2 2,05 102,5
7 6,87 98,14
12 12,11 100,92
Acid ferulic 2 1,96 98,00
7 6,95 99,28
12 12,04 100,33
Acid cumar ic 2 2,09 104,50
7 6,88 98,28
12 11,79 98,25
Rutin 2 1,96 98,00
7 7,10 101,43
12 11,86 98,83
Acid rozmarinic 2 2,04 102,00
7 7,07 101,00
12 12,08 100,66
Luteolin 2 1,98 99,00
7 6,89 98,42
12 11,75 97,92
Quercetol 2 2,03 101,50
7 6,85 97,85
12 11,92 99,33
Apigenin 2 1,96 98,00
7 6,85 97,85
12 11,72 97,66

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
76
Kaempferol 2 1,98 99,00
7 7,07 101,00
12 12,08 100,67

În tabelul următor ( Tabelul II.1.5) sunt prezentate metode HPLC utilizate pentru
caracterizarea unor e xtracte diferite (bere, vin, extract e de plante) și metoda dezvoltată în
cadrul acestei lucrări. După cum se observă, metoda dezvoltată este performantă și
comparabilă din punct de vedere al sensibilită ții, liniarită ții și a timpului de analiză cu
celelalte metode considerate.

Tabelul II.1.5. Metoda dezvoltată și alte metode utilizate pentru cuantificarea
polifenolilor
Proba Compu și separa ți Timpul de
separare LOD
(mg L-1) Referin țe
Vin Acidul galic, acidul cafeic,
acidul p -cumaric, (+) –
catechin, ( -)-epicatechin,
quercetin 35 min. 0,3-1,3 [296]
Bere (Cehia) Acidul galic, acidul
protocatecuic, catechin,
acidul cafeic, epicatechin,
acidul p -cumaric, acidu l
ferulic, acidul salicilic,
quercetin 35 min. 0,05-0,41 [297]
Extract de
frunze de
Crataegus
pinnatifida
Bge Acidul clorogenic, vitexin -4”-
O-glucoside, vitexin -2”-O-
rhamnoside, vitexin, rutin,
hyperoside, isoquercitrin,
quercetin 55 min. 0,0162 –
0,374 [298]
Extract de
R.
bourboniana
, R.brunonii,
R.
damascena Acidul galic, catechin,
epicatechin, rutin, acidul m –
cumaric, quercitrin, miricetin,
quercetin, apigenin,
kaempherol 16 min. 0,11-0,44 [299]
Extract de
C.
officinalis,
H.
perforatum,
G . verum, O.
vulgare Acidul clorogenic, acidul
cafeic, acidul ferulic, acidul
cumaric, rutin, acidul
rozmarinic, luteolin,
quercetol, apigenin,
kaemp ferol 34 min. 0,058 -0,25 Metoda
prezenta

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
77
II.1.3.4. Analiza cantitativ ă a polifenolilor din probe reale utiliz ând R P-HPLC
Metoda cromatografică dezvoltată a fost utilizat ă pentru determinarea calitativă și
cantitativă a acizilor fenolici (acidul clorogenic, acidul cafeic, acidul ferulic, acidul cumaric și
acidul rozmarinic) și a flavonoide lor (rutin, luteolin, que rcetol, apigenin și kaempferol) din
extractele apoase și etanolice ale plantelor: C. officinalis , H. perforatum , G . verum și O.
vulgare .
Rezultatele obținute au evidențiat faptul că extractele alcoolice au prezentat valori mai
ridicate în ceea ce privește conți nutul în acizi fenolici și flavonoide comparativ cu extractele
apoase ( Tabelul II.1.6 .).
În extractele speciei C. officinalis , acidul clorogenic a fost compusul majoritar
cuantificat, cel mai mare conținut regăsi ndu-se în extractul etanolic 50% (3,23 mg g-1s.u.).
Concentra ția cea mai mare de acid cafeic s -a detectat în extractul etanolic 30% (0,68 mg g-
1s.u.) în timp ce în extractul etanolic 70% s -a identificat un con ținut ridicat de acid ferulic
(0,48 mg g-1s.u.), acid cumaric (1,72 mg g-1s.u.) și acid ro zmarinic (0,05 mg g-1s.u.).
Concentra ții mici de rutin, luteolin, quercetol, apigenin și kaempferol au fost cuantificate doar
în extractele apoase ale speciei analizate. Aceste rezultate sunt similare cu cele raporate de
Olennikov D.N. și Kashchenko N.I. (2013) [300] dar și de Lubsandorzhieva P.N. și
colaboratorii (2014 ) [301] pentru extractele etanolice de C. officinalis , cultivată în Rusia .
În extractele plantei H. perforatum cea mai mare cantitate de acid clorogenic a fost
cuantificat ă în extractul etano lic 50% (2,96 mg g-1s.u.). Cantități importante de acid ferulic,
acid cumaric și acid rozmarinic au fost identificate în extractele etanolice 50%. Concentra ția
cea mai mare de quercetol a fost detectat ă în extractul etanolic 50% (10,03 mg g-1s.u.) în timp
ce în extratul apos quercetolul nu a putut fi identificat. Comparând rezultatele ob ținute cu cele
raportate de alte studii, aceste rezultate sun t mai mari dar similare cu cele raportate de
Wojdyło A . și colaboratorii (2007) [295] pentru extractele de H. pe rforatum cultivată în
Polonia sau Öztürk N. și colaboratorii ( 2009) din Turcia [255 ].
În extractele de G . verum s-au detectat c oncentrații mari de acizi fenolici , de exemplu
acidul clorogenic cu concentra ția de 9,31 mg g-1s.u. (extract etanolic 30%), acidu l cafeic cu
concentra ția de 2,15 mg g-1 s.u. (extract etanolic 30%), acidul ferulic cu concentra ția de 8,54
mg g-1s.u. (extract etanolic 50%), acidul cumaric cu concentra ția de 2,33 mg g-1 s.u. (extract
etanolic 70%) și acidul rozmarinic cu concentra ția de 0,86 mg g-1 s.u. (extract etanolic 70%).
Cantități mari de quercetol, apigenin și kaempferol au fost detectate doar în extractele
etanolice 50%. Rezultate similare au fost raporate de Ghiță G. și colaboratorii ( 2012 ) [119]
pentru extractele de G. verum cultivat în N-E Moldovei, Rom ânia.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
78
Acidul rozmarinic a fost compusul majoritar cuantificat în extractele de O. vulgare ,
concentra ția acestuia a variat între 1,76 mg g-1 s.u. în extractul apos și 8,57 mg g-1s.u. în
extractul etanolic 50%. Aceste rezultate sun t comparabile cu cele raportate de Radušienė și
colaboratorii (2008) [302] concentra ția acidului rozmarinic în extractele de O. vulgare cultivat
în Lituania a variat între 0,53 și 7,42 mg g-1 s.u. Cantități mici de flavonoide (luteolin,
quercetol, apigenin și kaempferol) au fost cuantificate aproape în toate extractele speciei .
Datele cantitative obținute arată că mediul de extrac ție influen țează cantitatea
compușilor identificați în extractele apoase și etanolice, în general extractele etanolice 50%
fiind cele mai bogate în acizi fenolici și flavonoide. Astfel, putem afirma că plantele
medicinale studiate prezintă un conținut ridicat de compuși fenolici constituind astfel surse
bogat e în antioxidanți naturali.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
79

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
80

Tabelul II.1.6. Conținutul în acizi fenoli ci și flavonoide determinat în probele studiate (mg g-1s.u.)
Planta Proba 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
C. officinalis Extr.apos 0,38 0,49 0,31 0,07 0,06 0,013 0,012 0,015 0,013 0.026
Extr.etanolic30% 0,82 0,68 0,27 0,17 0,13 0,038 0,0162 0,058 0,061 0.043
Extr.etanolic50% 3,23 0,34 0,39 0,97 0,82 0,036 0,035 0,054 0,072 0.04
Extr.etanolic70% 2,48 0,36 0,48 1,72 1,32 0,048 0,044 0,069 0,14 0.057
H.perforatum Extr.apos 1,78 0,71 0,0154 0,33 0,29 0,063 0 0 0 0
Extr.etanolic30% 2,21 1,25 0,61 0,66 0,54 0,28 0,085 0,87 0,068 0.12
Extr.etanolic50% 2,96 0,64 3,52 0,67 0,57 0,51 0,14 10,03 0,2 0.38
Extr.etanolic70% 0,470 0,092 3,04 0,42 0,074 0,041 0,02 0,85 0,018 0.036
G. verum Extr.apos 2,77 1,97 1,44 0,88 0,84 0 0,053 0,068 0 0
Extr.etanolic3 0% 9,31 2,15 4,56 1,37 1,18 0,29 0,102 0,405 0,062 0.087
Extr.etanolic50% 1,35 1,23 8,54 1,85 1,74 0,68 0,16 0,52 0,079 0.089
Extr.etanolic70% 1,33 0,592 4,025 2,33 2,25 0,862 0,204 0,471 0,0653 0.245
O. vulgare Extr.apos 0,522 0,410 0,501 1,401 1,327 1,767 0,230 0,056 0,026 0.024
Extr.etanolic30% 0,605 1,314 3,010 1,586 1,605 4,07 0,347 0,035 0,101 0.037
Extr.etanolic50% 3,69 0,842 1,82 2,503 2,362 8,57 0,393 0,238 0,142 0.216
Extr.etanolic70% 0,292 0,881 0,372 1,677 1,596 7,41 0,368 0,425 0,297 0.635

1-Acid clorogenic; 2-Acid cafeic; 3-Acid ferulic; 4-Acid cumaric ; 5-Rutin; 6-Acid rozmarinic; 7-Luteolin; 8-Quercetol; 9-Apigenin; 10-Kaempferol;

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
81

II.1.4. Concluzii
 În aceast studiu au fost analizate extractele apoase ș i etanolic e (30%, 50% și 70%) ale
plantelor C. officinalis , H. perforatum , G . verum și O. vulgare pentru determinarea
conținutului de polifenoli totali și a activit ății antioxidate.
 Capacitatea antioxidant ă a fost testat ă utilizând metodele cu radicalii ABTS și DPPH;
toate extractele vegetale au prezentat c apacitate antioxidantă mare .
 Cele mai mari valori în ceea ce privește conținutul total de polifenoli și activitatea
antioxidantă au fost obținute în general pentru extractele etanolice 50% și pentru
specia O. vulga re (TEAC ABTS 307,51 m M; TEAC DPPH 20,90 mM; 9,89 g GAE L-1).
 Metoda cromatografică validată parțial este liniar ă pe un domeniu de liniaritate
cuprins între 2,50-60 µg mL-1, obținându-se un coeficient de determinare (r2) mai
mare de 0,9985.
 Metoda RP-HPLC prezintă o bună exactitate, folosindu -se pentru demonstrarea ei
metoda adaosurilor. Valoar ile de regăsire a u fost cuprinse între 97,66% (apigenin) și
104,50% (acidul cumaric ), fiind astfel valori acceptabile pentru concentra țiile folosite;
 Metoda cromatogra fică este: precisă, lucru care rezult ă din demonstrarea testelor de
repetabilitate și reproductibilitate . Valorile studiului de repetabilit ate, exprimate în
RSD % au fost cuprinse între 0,11-2,77% și valorile testelor de reproductibilit ate au
variat între 0,37% și 1,95 %; sensibilă, limitele de detec ție au fost cuprinse între 0,05
µg mL-1 pentru rutin și 0,25 µg mL-1 pentru acidul rozmarinic; valorile înregistrate
pentru limitele de cuantificare au variat între 0,19 și 0,85 µg mL-1.
 Analiza cantitativ ă a evidențiat faptul că extractele etanolice (în special extractele
etanolice 50%) au prezentat valori mai ridicate în ceea ce privește conținutul în acizi
fenolici și flavonoi de comparativ cu extractele apoase.
 Această metodă cromatografică facilă poate fi re comandată ca procedură standard
pentru analize uzuale în cazul extractelor de plante medicinale.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
82
II.2. DEZVOLTAREA ȘI V ALIDAREA UNEI METODE ANALITICE SENSIBILE
PENTRU CARACTERIZAREA A V ANSAT Ă A CONȚINUTULUI ÎN POLIFENOLI ȘI
STUDIUL STABILIT ĂȚII PROB ELOR REALE ȘI A UNOR PREPARATE
COMERCIALE DIN PLANTELE STUDIATE

II 2.1. Introducere
Datorită efectelor benefice asupra sănătății plantele medicinale au fost intens studiate
iar responsabili pentru proprietățile și acțiunile lor biologice (antioxidante , antiinflamatoare,
antimicrobie ne și cardioprotectoare) sunt considera ți a fi și compușii polifenolici [303-306].
Pentru cuantificarea polifenolilor din extractele vegetale au fost dezvoltate n umeroase
proceduri analitice (TLC, LC -DAD, LC -FLD, LC -MS, GC și CE). Cromatografia de lichide
de înaltă performan ță cuplată cu diferite sisteme de detecție (UV-Vis, fluorescen ță,
electrochimic, spectrometria de masă) este una dintre cele mai folosite tehnici datorită
selectivității ridicate, reproductibilită ții și simpl ității. O tehnică frecvent utilizată pentru
analiza extractelor naturale este cromatografia de lichide cuplată cu spectrometria de masă
(LC-MS) care presupune confirmarea rapidă și precisă a compușilor chimici și poate fi
utilizată pe scară largă pentru an aliza polifenolilor din plante [308-312].
În această etapă s -a urmărit o analiză mai detaliată a plantelor aflate în studiu, prin
lărgirea gamei de compu și polifenolici studia ți, lărgirea gamei de materie primă studiată (al ți
furniz ori de plante medicinal e, evaluarea unor extracte comerciale) și studiul stabilită ții în
timp a extractelor studiate. Scopul principal în realizarea acestui obiectiv a fost dezvoltarea
unei metode LC-APCI -MS reproductibilă și selectivă pentru a identifica și cuantifica mai
mulți compuși polife nolici din extractele plante lor: C. officinalis , H. perforatum , G . verum și
O. vulgare . Pentru îndeplinirea acest ei etape s-au realizat urm ătoarele activități experimentale :
– Determinarea con ținutului de polifenoli și flavonoide totale;
– Dezvo ltarea și validarea unei metode cromatografice (LC -MS) mai sensibilă și mai
eficientă dec ât metoda DAD pentru separarea și cuantificarea polifenolilor din
extractele etanolice ob ținute în laborator și din extracte etanolice comerciale ;
– Evaluarea stabilităț ii în timp a con ținutului de compu și biologic activi prezenți în
extractele etanolice obținute în laborator și în extractele comerciale;

II.2.2. Materiale și metode
Materialele și reactivii specifici utiliza ți pentru realizarea acestei etape au fost
achiz itionați de la urm ătoarele firme:

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
83
1. Fluka (Germania) – (-)-epicatechin, hesperidin, fisetin și crisin;
2. Sigma -Aldrich (Germania) – acidul clorogenic, (+) -catechin, acidul cafeic,
rutin, acidul cumaric, isoquercitrin, quercetin, is oramnetin și acidul ferulic;
metanol (ULC/MS Biosolve), acetonitril (ULC/MS Biosolve) și acidul formic
de calitate analitică, carbonatul de sodiu, clorura de alumin iu și reactivul Folin –
Ciocâlteu;
De asemen ea, s-a utilizat apă ultra -pură Mili Q (Millipore). Înainte de analiza LC -MS
toate soluțiile au fost filtrate folosind filtre cu dimensiunea porilor de 0,2 µm (Ch romafil,
PTFE, Macherey -Nagel).

II.2.2.1. Prepararea extractelor vegetale
Părțile aeriene al e materialului vegetal uscat aparținând plantelor : C. officinalis , H.
perforatum , G . verum și O. vulgare au fost achiziționate de pe piața românească. 5 mg din
fiecare plantă au fost macerate cu etanol în diferite concentrații, respectiv 30%, 50% și 70%
(1:10, m/v). Amestecul a fost agitat zilnic timp de 7 zile și a fost ținut la î ntuneric, la
temperatura de 40 C. Extractele etanolice au fost filtrate prin hârtie de filtru, alicotate și
păstrate la congelator până la efectuarea analizelor.
Extractele etanolice comerciale ale speciilor C. officinalis, H. perforatum și G . verum
au fost achiziționate din plafar de la producătorii români. Extractele comerciale de C.
officinalis au fost cumpărate de la trei producători diferiți [Dacia Plant, J udețul Brasov, (A1);
Hofigal , București (A2) și Santo Raphael, București (A3)]. Extractele de H. perforatum au
fost furnizate de Dacia Plant [Jude țul Brașov, (B1)] și Hofigal [București, (B2)] iar extractele
de G . verum au fost furnizate de către Dacia Plant [Județul Brașov, (C1)] și Santo R aphael
[București, (C2)]. Pe durata experimentelor t oate extra ctele au fost depozitate la întuneric, la
temperatura de 40 C. Extractele comerciale au fost filtrate printr -un filtru cu dimensiunea
porilor de 0,2 µm și au fost injectate direct în sistemul HPLC.

II.2.2.2 Determinarea c onținutului de polifenoli total i
Determinarea c onținutul ui de polifenoli totali din extractele etanolice (30%, 50% și
70%) s -a realizat conform metodei descrisă de Waterho use A.L. (2001) [290]. Protocolul
presupune adăugarea de reactiv Folin -Ciocâlteu (2,5 mL ), carbonat de sodiu 7,5 % (m/v) (2
mL) și apă distilată peste soluțiile diluate de acid galic sau peste soluțiile etanolice pâna la
volumul final de 5 mL. După 45 min. de incubare a amestecului la temperatura de 500 C a fost
măsurată absorbanța la lungimea de und ă de 765 nm. Conținutul total de polifenoli din

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
84
extractele etanolice a fost estimat prin utilizarea curbei de calibrare a acidului galic:
y=0,0106x -0,0534; R2=0,9993 . Domeniul de concentrație a fost cuprins între 5 și 80 µg mL -1
iar conținutul total de polifenoli a fost exprimat sub formă de echivalenți de acid galic (GAE)
L-1.
II.2.2.3 Determinarea con ținutului de flavonoide totale
Conținutul de flavonoide totale din extractele etanolice s-a determinat conform
metodei descrise de Zhishen J. și colaboratorii (1999) [212] cu mici modificări. Metoda
utilizează clorura de aluminiu care formeaz ă un compl ex de culoare galben -portocaliu datorită
reacției dintre clorura de aluminiu și flavone. Peste probele diluate s -a adaugat 300 µL AlCl 3
2,5% (m/v) și 500 µL acetat de sodiu 10% (m/v). După 60 min. de incubare la temperatura
camerei s-a măsurat absorban ța la 420 nm. Conținutul total de flavonoide din extractele
etanolice a fost estimat prin utilizarea curbei de calibrare pentru standardul rutin : y=0,006x –
0,0075; R2=0,9996 , pentru domeniu l de concentra ție cuprins între 10 si 80 µg mL -1.

II.2.2.4. Identificarea și separarea pol ifenolilor prin LC -MS
Analiza compu șilor individuali din probele reale s-a realizat prin cromatografie de
înaltă performan ță cuplată cu spectrometria de masă cu aju torul unui echipament Shimadzu
(Japonia) format din: două pompe LC20 – ADSP, sistem de control SCL – 10A, detector cu șir
de diode SPD – M20Avp, auto sampler SIL – 20AC și termostat pentru coloana CTO – 20AC.
Sistemul a fost cuplat la un detector de mas ă Shimadzu 2010 EV echipat cu interfața APCI.
Separarea s-a realizat pe o coloană Kromasil C18 (5 µm, 150 mm x 2,1 mm diametru
interior). Faza mobilă a constat din apă cu acid formic, pH = 4 ( solvent A) și acetonitril cu
acid formic , pH = 4 ( solvent B). Probe le au fost eluate conform urm ătorului g radient: 0-20
min. 5%-50% B; 10 min . 50% B; 30 -50 min . 50% – 80% B; 50 -60 min . 80% – 5% B. Viteza
de curgere a fost de 0,2 mL min-1 iar volumul soluției de probă injectată a fost 10 µL. Coloana
a fost echilibarată tim p de 15 min. înaintea fiec ărei analize. Analizele au fost efectuate la
temperatura de 350 C.
Condițiile utilizate pentru spectrometru de masă echipat cu sursa APCI au fost: flux
gaz (N2) de 1,5 L min – 1, tensiune (CDL ) de – 5V; temperatura CDL 250 °C; b loc de căldură
250 ° C, detector de tensiune 1,5 kV, tensiune interfață -5 kV .
Scanarea completă a spectrelor de masă a fost înregistrată în mod ul negativ în
intervalul m/z 50 – 700. Compușii au fost identificați prin compararea timpilor de retenție cu
cele ale standardelor și prin adiție standard. Confirmarea compușilor s -a realizat și cu ajutorul

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
85
spectrelor de masă. Datele au fost achiziționate și interpretate cu ajutorul programului
Solutions LC / MS .

II.2.3. Rezultate și discuții
II.2.3.1. Conținutul de polifenoli și fla vonoide total e
Conținutul de polifenoli și flavonoide totale al extractelor etanolice în cazul celor
patru specii de plante studiate este prezentat în Tabelul II.2.1.
Conținutul de polifenoli totali din extractele etanolice preparate în laborator a variat între 1,73
pentru extract ul etanolic 30% al speciei C. officinalis și 9,83 g GAE L-1 pentru extract ul
etanolic 50% al speciei O. vulgare .
Dintre cele 4 specii testate ( C. officinalis , H. perforatum , G . verum și O. vulgare )
extractul etanolic 50% al speciei O. vulgare a prezentat cel mai mare con ținut în polifenoli
(9,83 g GAE L-1). Datele cantitative arat ă că extractele etanolice 50% au prezentat cele mai
mari valori în ceea ce privește conținutul de polifenoli totali. Astfel, r ezulta tele raportate
anterior sunt în conformitate cu cele raportate în acest capitol dar și cu cele raporate de unii
autori în literatura de specialitate [203 , 295 ].
Concentrația de flavonoid e total e din extractele etanolice preparate în laborator a
variat între 1,07 g L-1 pentru extractul etanolic 30% al speciei C. officinalis și 6,22 g L-1
pentru extractul etanolic 50% al speciei H. perforatum . Dintre toate extractele etanolice
studiate, extractele etanolice 50 % ale plantelor au înregistrat cea mai mare concen trație de
flavonoide. Comparând datele cantitative obținute cu cele rapor tate de alți autori , acestea sunt
similare cu cele raportate de [203, 214, 313 ]
În ceea ce prive ște extractele etanolice comerciale se observă că, concentra ția cea
mare de polife noli și flavonoide totale a fost detectat ă la specia H. perforatum (B1, 10,99 g
GAE L-1; 10,74 g L-1) urmată de speciile G. verum (C1, 4,18 g GAE L-1; 5,19 g L-1) și
respectiv C.officinalis (A3, 3,50 g GAE L-1; 3,22 g L-1).

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
86

Tabelul II.2.1. Conținu tul de polifenoli și flavonoide total e

II.2.3.2. Validarea metodei LC -MS
Metoda cromatografică dezvoltată a permis separarea a: 4 acizi fenolici (acidul
clorogenic, acidul cafeic, ac idul cumaric și acidul ferulic); 2 flavanoli (catechin și
epicatechin); 5 flavonoli (rutin, quercetin, isoquercitrin, fisetin și isor amnetin); o flavanonă
(hesperidina) și o flavona (crisin ). Structura chimică a acestor compu și este prezentată în
Figura II.2.1 . Din cei 13 compuși, 7 sunt diferi ți față de cei analiza ți în capitolul anterior.

1 2 3 Planta Proba Conc entrația de
polifenoli totali
(g GAE L-1) Conc entrația de
flavonoide
totale ( g L-1)
C. officinalis Extr. etanolic 30% 1,73 1,07
Extr. etanolic 50% 1,74 1,24
Extr. etanolic 70% 1,36 1,10
H. perfo ratum Extr. etanolic 30% 3,29 1,35
Extr. etanolic 50% 6,20 6,22
Extr. etanolic 70% 5,15 5,79
G . verum Extr. etanolic 30% 1,85 1,86
Extr. etanolic 50% 3,01 3,59
Extr. etanolic 70% 2,31 3,36
O. vulgare Extr. etanolic 30% 6,48 3,73
Extr. etanolic 50% 9,83 3,98
Extr. etanolic 70% 8,78 2,68
A1 Extr. etanolic 2,36 2,24
A2 Extr. etanolic 2,19 2,05
A3 Extr. etanolic 3,50 3,22
B1 Extr. etanolic 10,99 10,74
B2 Extr. etanolic 5,24 5,32
C1 Extr. etanolic 4,18 5,19
C2 Extr. etanolic 3,26 2,27

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
87

4 5 6

7 8 9

10 11 12

13

Fig.II.2.1 . Structura chimic ă a compușilor identifica ți prin metoda LC -MS: 1- Acid
clorogenic; 2 – (+)-Catechin; 3 – Acid cafeic; 4 – (-)-Epicatechin; 5 – Acid cumaric; 6 – Acid
ferulic; 7 – Rutin; 8 – Isoquercitrin; 9 – Quercetin; 10 – Hesperidin; 11 – Fisetin; 12 – Isoramnetin;
13- Crisin

Pentru o separare mai bună a compușilor au fost testate diferite faze mobile cu diverse
compoziții (apă / acid formic: metanol / acid formic la pH = 2,70; apă / acid formic: metanol /
acid formic, la pH = 3,50; acid formic 0,5% / apă; acid formic / acetonitr il / apă ; acid formic
0,5% / apă: acid formic 0,5% acetonitril la pH = 4,0). S -a constatat că faza mobilă formată din

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
88
acetonitril: apă cu acid formic la pH = 4,0 a fost cea mai potrivită fază pentru separarea
polifenolilor.
În scopul îmbunătățirii ioniză rii analiților sunt utilizați frecvent aditivi pentru faza
mobilă . La diferite concentrații , unii aditivi ( ex. acidul trifluoracetic) pot reduce sensibilitatea
unor metode LC-MS. La alegerea coloanei se acordă o atenție deosebită deoarece proprietățile
fazei staționare poate infl uența concentrația aditivului . Acidul formic poate produce protoni
care facilitează formar ea de sarcini negative în exces prin reducerea numărului de protoni
generați de hidrogen ul gazos. Acesta , în exces, odat ă cu creșterea valo rii pH-ului local poate
conduce la deprotonarea analiților. Adăugarea acidului formic în faz ă mobilă a constituit cea
mai bună modalitate de a îmb unătăți forma picului de analit în scopul acc elerării timpului de
analiză și implicit pentru a îmbunătăți separar ea prin mărirea intensității semnalului MS în
modul negativ de ionizare. Pentru identificarea compușilor s-a utilizat tehnica APCI în modul
negativ.
Condițiile LC -MS au permis detectarea ionului molecular pentru fiecare compus și a
produs fragmentarea în modul negativ . Ionii moleculari neprotonați [M -H]- au fost detectați la
m/z 353,31 pentru acidul clorogenic, 289,20 pentru (+) -catechin, 179,16 pentru a cidul cafeic,
289,27 pentru ( -)-epicatechin, 609,52 pentru rutin, 163,16 pentru acidul cumaric, 463,38
pentru isoquercitrin, 193,18 de acidul ferulic, 609,56 de hesperidin, 285,23 de fisetin, 301, 23
de quercetin, 315,26 de isor amnetin și 253,24 pentru crisin .
Pentru ilustrarea rezultatelor obținute c romatograma LC-MS (TIC) a standardelor
identificate este pr ezentată în Figura II.2.1 și alte exemple de cromatograme ale diferitelor
probe sunt prezentate în Figurile II.2.2 – II.2.5.

5.
0 10.
0 15.
0 20.
0 25.
0 30.
0 35.
0 40.
0 45.
0 50.
0 5000
0 10000
0 15000
0 20000
0 25000
0 30000
0 35000
0 40000
0 45000
0 50000
0 55000
0 60000
0

1 2
3 4 5 6
7
8 9
10 11 12 13

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
89

Fig.II.2.1 . Cromatograma LC-MS (TIC) soluției de standar de: 1- Acid clorogenic; 2 – (+)-
Catechin; 3 – Acid cafeic; 4 – (-)-Epicatechin; 5 – Rutin; 6 – Acid cumaric ; 7- Isoquercitrin; 8 –
Acid ferulic; 9 – Hesperidin; 10 – Fisetin; 11 – Quercetin; 12- Isoramnetin; 13 – Crisin

Fig.II.2.2 . Cromatograma LC-MS a extractului etanolic 70% de O. vulgare (1- Acid
cloroge nic; 2 – (+)- Catechin; 3 – Acid cafeic; 4 – (-)-Epicatechin; 5 – Rutin; 6 – Acid cumaric; 7 –
Isoquercitrin; 8 – Acid ferulic; 9 – Hesperidin; 10 – Fisetin; 11 – Quercetin; 12 – Isoramnetin; 13 –
Crisin )

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12 13

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
90

10 20 30 40 50 min010203040506070mAU
279nm,4nm (1.00)Fig.II. 2.3
. Cromatograma LC-MS a extractului et anolic 30% de C.officinalis (1- Acid clorogenic;
2- (+)- Catechin; 3 – Acid cafeic; 4 – (-)-Epicatechin; 5 – Rutin; 6 – Acid cumaric; 7 –
Isoquercitrin; 8 – Acid ferulic; 9 – Hesperidin; 10 – Fisetin; 11 – Quercetin; 12 – Isoramnetin; 13 –
Crisin )

10 20 30 40 50 min0255075100125150175200mAU
283nm,4nm (1.00)
Fig.II.2
.4. Cromatograma LC-MS a extractului etanolic 50% de H. perforatum (1- Acid
clorogenic; 2 – (+)- Catechin; 3 – Acid cafeic; 4 – (-)-Epicatechin; 5 – Rutin; 6 – Acid cumaric; 7 –
Isoquercitrin; 8 – Acid ferulic; 9 – Hesperidin; 10 – Fisetin; 11 – Quercetin; 12 – Isoramnetin; 13 –
Crisin ) 1 2
3 4 5 6 7 8 9 10 11
12 13
1 2 3
4 5 6 7 8
9 10 11 12 13

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
91

5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 min0255075100125150175200225250275300325350375400425mAU

Fig.II.2.5. Cromatograma LC-MS a extractului etanolic 50% de G . verum (1- Acid
clorogenic; 2 – (+)- Catechin; 3 – Acid cafeic; 4 – (-)- Epicatechin; 5 – Rutin; 6 – Acid cumaric; 7 –
Isoquercitrin; 8 – Acid ferulic; 9 – Hesperidin; 10 – Fisetin; 11 – Quercetin; 12 – Isoramnetin; 13 –
Crisin )

Metoda dezvoltat ă a fost validată în termeni de liniaritate, limite de detecție și
cuantificare, repetabilitate, re productibilitate și exactitate.
Selectivitatea metodei a fost demons trată prin compararea spectrelor UV a compușilor
de interes și prin compararea timpilor d e retenție cu cei ai standardelor . Datele prelucrate cu
ajutorul softului Solutions LC / MS (Shimadzu, Japonia) au demonstrat faptul c ă similaritatea
spectrelor UV în domeniul 320 -370 nm și a spectrelor de mas ă a fost mai mare de 96 % ceea
ce înseamna că, compușii analizați au fost de puritate ridicată.
Liniaritatea a fost investigată prin analize repetate ale soluțiilor standard în int ervalul
de concentrați e cuprins între 2,0 și 80 µg mL-1. Pentru a stabili dacă între aria picului și
concentrația obținută există o dependen ță liniară s-a calculat coeficientul de determinare ( r2).
În urma rezultatelor obținute s-a stabilit că metoda a fost liniară pentru domeniul de
concentrație cuprins între 2,5 și 60,00 µg mL-1 iar valori le coeficienți lor de determinare au
fost mai mari dec ât 0,9971 . În Tabelul II.2.2. sunt prezenta ți parametrii de performan ță a
metodei LC -MS.
Limita de detec ție (LOD) și limita de cuantificare (LOQ) au fost calculate ca fiind
3xS/Z , respectiv 10xS/Z. Valorile limitelor de detec ție au fost cuprinse între 0,05 µg mL-1
pentru ( -)- epicatechin și 0,28 µg mL-1 pentru hesperidin. Valorile limitelor de cuantificare au
fost 0,18 µg mL-1 pentru ( -)- epicatechin și 0,93 µg mL-1 pentru hesperidin. Valorile ob ținute 1 2 3 4 5 6 7
8 9 10
11 12 13

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
92
pentru limitele de detecție și cuant ificare demonstreaz ă faptul că metoda LC -MS dezvoltat ă
prezintă o sensibilitate bună.

Tabelul II.2.2. Parametri i de performanță a i metodei LC -MS
Compus Domeniu de
linearitate
(µg mL-1) Coeficient
determinare
(r2) LOD
( µg mL-1 ) LOQ
( µg mL-1 )
Acid clo rogenic 2,5-50 0,9971 0,12 0,40
(+)-Catechin 2,5-50 0,9994 0,07 0,23
Acid cafeic 2,5-50 0,9993 0,16 0,53
(-)-Epicatechin 2,5-50 0,9977 0,05 0,18
Rutin 2,5-50 0,9985 0,08 0,26
Acid cumaric 2,5-50 0,9980 0,21 0,70
Isoquercitrin 2,5-50 0,9996 0,08 0,28
Acid ferulic 2,5-50 0,9995 0,19 0,63
Hesperidin 2,5-50 0,9994 0,28 0,93
Fisetin 2,5-50 0,9990 0,11 0,36
Quercetin 2,5-50 0,9985 0,08 0,26
Isoramnetin 2,5-50 0,9995 0,25 0,83
Crisin 2,5-50 0,9990 0,20 0,66

Precizia exprim ă gradul de concordan ță între o serie de m ăsurări obținute de la mai
multe probe. Stabilirea preciziei metodei elabo rate s -a bazat pe două măsurări: repetabilitate a
răspunsului pe durata unei zile (n=6) și reproductibilitate a răspunsului î n timp (determi nările
s-au realizat pe durata a 3 zile) (3x n=6). Pentru măsurarea preciziei a fost calculat ă deviația
standard relativ ă: RSD (%) = SD/medie x 100 %. Toate valorile ob ținute pentru % RSD au
fost mai mici de 3 % ceea ce reflectă o bu nă precizie a metodei a nalitice ( Tabelul II. 2.3).

Tabelul II.2.3. Valorile repetabilit ății și a reproductibilit ății
Compus Conc.
teoretic ă
(µg mL-1) Conc.
detectat ă
(µg mL-1) RSDa
(%, n=6) Conc.
detectat ă
(µg mL-1) RSDb
(%, 3x n=6 )
Acid
clorogenic 5 5,01 0,20 5,17 0,79
10 10,24 0,55 10,17 1,13
15 15,03 0,83 15,22 1,11
(+)-Catechin 5 5,52 1,07 5,31 1,70
10 10,10 2,10 10,14 2,82
15 15,35 1,94 15,29 2,13

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
93
Acid cafeic 5 5,07 0,43 5,08 1,93
10 10,06 0,26 10,19 1,57
15 15,07 0,56 15,28 1,24
(-)-
Epicatechin 5 5,018 0,96 5,03 2,19
10 10,54 1,24 10,09 1,50
15 15,03 0,64 15,04 1,04
Rutin 5 5,07 0,83 5,24 1,39
10 10,67 1,17 10,27 1,69
15 15,05 0,33 15,20 0,63
Acid cumaric 5 5,03 0,40 5,08 0,77
10 10,30 1,20 10,12 1,97
15 15,08 0,09 15,48 1,08
Isoquercitrin 5 5,28 0,19 5,17 0,97
10 9,94 1,99 10,16 2,19
15 15,18 0,28 15,30 0,69
Acid ferulic 5 5,57 1,09 5,21 1,27
10 9,99 0,20 10,17 0,75
15 15,10 0,29 15,21 0,70
Hesperidin 5 5,00 0,28 5,18 1,00
10 10,09 1,44 10,17 2,76
15 15,07 0,10 15,12 0,48
Fisetin 5 5,02 0,10 5,12 0,64
10 10,02 0,41 10,11 1,07
15 15,52 1,02 15,26 1,30
Quercetin 5 5,56 0,84 5,45 1,23
10 10,07 0,84 10,22 1,04
15 15,37 1,22 15,51 1,46
Isoramnetin 5 5,07 0,87 5,30 1,08
10 10,01 0,19 10,21 0,74
15 15,18 0,76 15,40 1,27
Crisin 5 5,08 0,59 5,37 1,08
10 10,14 0,61 10,29 0,95
15 15,06 0,51 15,32 1,27
a-Repetabilitate; b -Reproductibilitate;

Exactitatea ( acuratețea) unei proceduri analitice a fost demonstrat ă prin testele de
regăsire. V alorile de reg ăsire a compu șilor polifenolici de interes au fost determinat e prin
utilizarea unei probe diluate de H. perforatum la care s -au adăugat concentra ții cunoscute de
standarde (2 µg mL-1, 7 µg mL-1 și 12 µg mL-1). Regăsirea (%) = ( Concentra ția gă sită /
Concentra ția adăugată )*100. Pentru fiecare nivel de reg ăsire s -a realizat analiz a în triplicat.
Valoarea maxim ă de regăsire a fost calculată pentru isoquercitrin (102 ,40%) iar valoarea
minimă a fost calculată pentru acidul clorogenic (97,20%). Valor ile de regăsire ale compu șilor
sunt prezentate în Tabelul II.2.4 .

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
94
Tabelul II.2.4. Valorile testelor de reg ăsire pentru metoda LC -MS
Compus Conc.adaug.(µg mL-1) Conc.g ăsită (µg mL-1) RSD (%, n=3)
Acid clorogenic 2,50 2,43 97,20
7,50 7,38 98,40
12,50 12,42 99,36
(+)- Catechin 2,50 2,45 98,00
7,50 7,58 101,06
12,50 12,61 100,88
Acid cafeic 2,50 2,55 102,00
7,50 7,62 101,60
12,50 12,38 99,04
(-)- Epicatechin 2,50
2,46 98,40
7,50
7,34 97,86
12,50
12,78 102,24
Rutin 2,50 2,58 103,20
7,50 7,72 102,93
12,50 12,59 100,72
Acid cumaric 2,50 2,56 102,40
7,50 7,53 100,40
12,50 11,98 95,84
Isoquercitrin 2,50 2,55 102,00
7,50 7,68 102,40
12,50 12,32 98,56
Acid ferulic 2,50 2,43 97,20
7,50 7,57 100,93
12,50 12,23 97,84
Hesperid in 2,50 2,57 102,80
7,50 7,67 102,26
12,50 12,73 101,84
Fisetin 2,50 2,53 101,20
7,50 7,66 102,13
12,50 12,80 102,40
Quercetin 2,50 2,56 102,40
7,50 7,45 99,33
12,50 12,16 97,28
Isoramnetin 2,50 2,48 99,20
7,50 7,36 98,13
12,50 12,44 99,52
Crisin 2,50 2,46 98,40
7,50 7,54 100,53
12,50 12,23 97,84

II.2.3.3. Analiza LC-MS a probelor reale
Metoda LC -MS dezvoltat ă a fost utilizat ă pentru identificarea, separarea și
cuantificarea a 13 compu și polifenolici ( acid clorogenic, (+) – catech in, acid cafeic, ( -)-
epicatechin, rutin, acid cumaric, isoquercitrin, acid ferulic, hesperidin, fisetin, isoramnetin și

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
95
crisin ) atât din extractele etanolice ale plantelor: C. officinalis , H. perforatum , G . verum și O.
vulgare preparate în laborator cât și din extracte etanolice comerciale (Tabelul II.2.5. ).
În extractele plantei C. officinalis , compusul majoritar cuantificat a fost ( -)-epicatechin
cu concentra ția de 6,509 mg g-1 s.u. (extractul etanolic 70% ). Cantitatea de acid clorogenic a
variat în tre 0,78 mg g-1 s.u. în extractul etanolic 30% și 3,423 mg g-1 s.u. în extractul etanolic
50%. O cantitate mare de (+)-catechin a fost identificat ă în extractul etanolic 50% ( 4,667 mg
g-1 s.u.). Alți compuși cuantifica ți în extractele etanolice a speciei C. offi cinalis au fost: rutin,
isoquercitrin, hespe ridin, fisetin, quercetin, isor amnetin și crisin. Rezultate similare au fost
raportate de Rigane G. și colaboratorii (2013) [203] pentru extractele speciei C. officinalis ,
cultivată în Tunisia. Extractele etanoli ce 70% de C. officinalis prezintă concentrații mai mari
de compu și polifenolici comparativ cu celelal te extracte etanolice studiate (30% și 50%).
S-a observat că în extractele speciei H. perforatum s-au cuantificat concentra ții
importante de (-)-epicatechi n (8,233 mg g-1 s.u.) și (+) -catechin (8,106 mg g-1 s.u.) în
extractele etanolice 50%, respectiv 70%. Cantit ăți mari de acid clorogenic (2,945 mg g-1 s.u.)
și acid cafeic (1,051 mg g-1 s.u.) s-au regăsit doar în extractul etanolic 50%. Conc entrația cea
mai mare de quercetin (11,42 mg g-1 s.u.) a fost detectat ă în extractul etanolic 50% în timp ce
isoramnetin și crisin au fost cuantifica ți în cantități mici. Aceste concentra ții sunt mai mari dar
similare cu cele raportate de Tusevski O. și colaboratorii (2014) pentru extractele de H.
perforatum cultivată în Macedonia [226 ]. Din rezultatele ob ținute s -a observat c ă extractele
etanolice 50% prezint ă cantități mai mari de compu și fenolici fa ță de extra ctele etanolice
30%, respectiv 7 0%.
Datele cantitative al speciei G .verum au arătat faptul c ă cele mai mari concentrații de (-
)-epicatechin (9, 726 mg g-1 s.u.), (+)-catechin (9.426 mg g-1 s.u.), și acid cumaric (2,73 mg g-1
s.u.) au fost cuantificate în extractul etanolic 70% iar cea mai mare cantitate de acid feru lic
(7,646 mg g-1 s.u.) a fost detectată în extractul etanolic 50%. Alți compuși identificați în
cantități mici în extractele de G .verum au fost: de fisetin (0,060 mg g-1 s.u.), isor amnetin
(0,040 mg g-1 s.u.) și crisin (0,002 mg g-1 s.u.). Rezultate mai m ici au fost raportate de Vlase
L. și colaboratorii (2014) [209] pentru planta G . verum cultivată în Transilvania, Rom ânia.
Extractul etanolic 70% prezintă concentra ții mai mari de acizi fenolici și flavonoide
comparativ cu extractele etanolice studiate (30 % și 50%).
În extratele plantei O. vulgare principalii compuși detectați au fost ( -)-epicatechin
(7,681 mg g-1 s.u.) și (+)- catechin (7,464 mg g-1 s.u.) în extractul etanolic 70%. Cea mai mare
cantitate de acid clorogenic a fost identificat ă în extractul etanolic 50% (3,549 mg g-1 s.u.) iar
cea mai mică în extractul alcoolic 70% (0,107 mg g-1 s.u.). Concentra ții semnificative de rutin

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
96
(3,562 mg g-1 s.u.), izoquercitrin (3,528 mg g-1 s.u.), hesperidin ( 3,173 mg g-1 s.u.) și fisetin
(6,232 mg g-1 s.u.) au fost cuantificate în extractele etanolice 70% al speciei. Au fost
cuantificate cantit ăți mici de quercetin (0,045 mg g-1 s.u.), isor amnetin (0,204 mg g-1 s.u.) și
crisin (0,033 mg g-1 s.u.). Rezultate similare au fost raporatate anterior de Spiridon I. și
colaboratorii (2011) [314] și W’glarz Z. și colaboratorii (2006) pentru planta O. vulgare
cultivată în Romania , respectiv Polonia [31 5]. Datele cantitative au ar ătat că extractele
etanolice 70% prezint ă concentra ții mai mari de acizi fenolici și flavonoide .
Extractele etanolice preparate în labor ator prezintă un conținut mai ridicat în compuși
polifenolici comparativ cu rezultatele ob ținute anterior prin HPLC dar și cu rezultatele unor
studii menționate de unii autori în literatura de specialitate [316-320].
În ceea ce priveș te datele cantitative obținute pentru extractele etanolice comerciale
ale plantelor C. officinalis , H. perforatum și G . verum , au arătat că conținutul compușilor
polifenolici este similar cu cel al extractelo r obținute în laborator . În extractele de C.
officinalis compușii majoritari cuantifica ți au fost: (-)- epicatechin (2,785 mg g-1 s.u., A3),
acidul clorogenic (1,735 mg g-1 s.u., A2) și (+) -catechin (1,705 mg g-1 s.u., A1). Cantități mici
de flavonoide au fost cuantificate în toate e xtractele etanolice comerciale. În extractele
comerciale al plantei H. perforatum principalii compu și detectați au fost : quercetin (10,28 mg
g-1 s.u., B2), (-)-epicatechin (4,105 mg g -1s.u., B2) și isoquercitrin (1,497 mg g-1 s.u., B1).
Există diferențe m ajore între probele comerciale ale speciei G . verum cu privire la conținutul
de acid clorogenic [ 1,462 mg g -1s.u. (C1), 0,396 mg g -1s.u. (C2)], acid ferulic [1,525 mg g –
1s.u. (C1), 0,247 mg g -1s.u. (C2)], (-)-epicatechin [3,948 mg g -1s.u. (C1), 1, 071 mg g -1s.u.
(C2)] , fisetin [3,016 mg g -1s.u. ( C1) , 0,472 mg g -1s.u. (C2)] și hesperidin [0,441 mg g -1s.u.
(C1), 2,646 mg g -1s.u. (C2)].

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
97

Tabelul II.2.5. Conținutul de compu și determinat în extractele analizate (mg g-1 s.u.)
Planta Probe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
C.
officinalis Extr.alc.30% 0,78 0,498 0,322 1,811 0,226 0,113 0,522 0,329 0,395 0,102 0,049 0,086 0,007
Extr.alc.50% 3,423 4,667 0,418 0,576 0,638 1,442 0,135 0,468 1,296 1,986 0,056 0,039 0,004
Extr.alc.70% 1,874 2,798 0,226 6,509 1,287 1,873 0,605 0,652 1,622 1,145 0,061 0,052 0,020
H.
perforatum Extr.alc.30% 1,41 0,616 0,774 0,991 0,399 0,107 0,202 0,774 1,288 0,050 0,774 0,053 0,006
Extr.alc.50% 2,945 8,106 1,051 1,319 0,375 0,678 1,956 2,261 1,895 2,610 11,42 1,246 0,005
Extr.alc.70% 1,116 7,179 0,034 8,233 0,685 0,913 1,363 3,642 2,271 0,836 0,937 0,553 0,051
G.
verum Extr.alc.30% 3,217 1,024 2,967 1,313 1,550 1,339 0,150 4,286 0,836 0,060 0,503 0,040 0,002
Extr.alc.50% 2,056 6,688 1,354 2,291 1,402 1,790 2,135 7,646 1,395 3,983 0,575 0,764 0,037
Extr.alc.70% 1,430 9,426 0,314 9,726 1,464 2,73 2,467 3,616 1,270 0,427 0,402 0,532 0,072
O.
vulgare Extr.alc.30% 0,632 2,776 1,219 1,863 2,029 1,794 0,789 3,607 2,982 0,085 0,045 0,204 0,109
Extr.alc.50% 3,549 4,375 0,822 3,279 2,613 2,645 0,544 1,768 1,124 5,357 0,213 0,751 0,044
Extr.alc.70% 0,107 7,464 0,825 7,681 3,562 1,433 3,528 0,175 3,173 6,232 0,317 0,741 0,033
A1 0,350 1,705 0,187 0,641 0,019 0,046 0,528 0,225 0,078 0,689 0,043 0,020 0,022
A2 1,735 0,628 0,183 2,204 0,016 0,033 0,543 0,367 0,628 2,329 0,05 0,053 0,029
A3 0,228 0,433 0,244 2,785 0,150 0,016 0,478 0,278 0,114 1,885 0,079 0,201 0,142
B1 1,308 1,397 0,094 1,155 0,270 0,405 1,497 0,337 1,394 1,137 0,063 0,192 0,410
B2 1,237 0,539 0,069 4,105 0,084 0,518 0,076 0,069 0,698 0,848 10,28 0,356 0,046
C1 1,462 0,996 0,327 3,948 0,362 0,637 0,405 1,525 0,441 3,016 0,301 0,052 0,038
C2 0,396 0,893 0,217 1,071 0,046 0,146 0,043 0,247 2,646 0,472 0,123 0,357 0,038

1- Acid clorogenic; 2- (+)- Catechin; 3- Acid cafeic; 4-(-)- Epicatechin; 5- Rutin ; 6- Acid cumaric ; 7- Izoquercitrin ; 8- Acid ferulic ; 9- Hesperidin ;
10- Fisetin ; 11- Quercetin ; 12- Isoramnetin; 13- Crisin; A1, A2, A3 – Extract comercial de C. officinalis (Dacia Plant, Hofigal , Santo Raphael );
B1, B2 – Extract comercial de H. perforatum (Dacia Plant, Hofigal ); C1, C2 – Extract comercial de G . verum (Dacia Plant , Santo Raphael );

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
98

II.2.3.4. Evaluarea stabilității în timp a con ținutului de compu și biologic activi prezen ți
în extractele e tanolice obținute în laborator și în extractele comerciale

Activitatea experimentală a avut în vedere compararea datelor cantitative ob ținute
pentru extractele etanolice (preparate în laborator și extractele comerciale) ale plantelor C.
officinalis , H. perforatum , G . verum și O. vulgare păstrate la temperatura camerei timp de 24
săptămâni cu datele cantitative ob ținute pentru acelea și extracte etanolice, depozitate la
temperatura de 40 C. Probele păstrate la temperatura camerei timp de 24 săptămâni au fo st
analizate prin cromatografia de lichide de înaltă performanță cuplată cu spectrometria de
masă. Conținutul de acizi fenolici și flavonoide din extractele etanolice vegetale păstrate la
temperatura camerei timp de 24 săptămâni sunt prezentat e în Tabelul II.3.1 .
În extractele speciei C. officinalis principalii compu și identifica ți au fost (+) -catechin
(2,75 mg g-1 s.u. în extractul alcoolic 50% ) și (-)-epicatechin ( 5,01 mg g-1 s.u. în extractul
alcoolic 70%) dar într-o cantitate mult mai mic ă comparativ cu concentra țiile detectate în
extractele p ăstrate la temperatura de 40 C (4,667 mg g-1 s.u. în extractul alcoolic 50%; 6,509
5,01 mg g-1 s.u. în extractul alcoolic 70%). Datele cantitative obținute pentru extractele
păstrate la temperatura camerei și pentru cele depozitate la temperatura de 40 C au arătat
diferențe majore în ceea ce privește con ținutul în acizi fenolici (acidul clorogenic, acidul
cumaric și acidul ferulic ) în timp ce flavono idele (fisetin, quercetin, isor amnetin și crisin) se
pare că au fost compușii cei mai stabili . Extractele alcoolice 70% a speciei C. officinalis ,
păstrate la temperatura camerei au fost cele mai concentrate extracte comparativ cu extractele
alcoolice 30% și 50%.
S-u cuantificat c oncentrații diferite de acid clorogenic (1,2 5 mg g-1s.u. în extractul
etanolic 50%), (+) -catechin (6,11 m g g-1s.u. în extractul etanolic 50%) și (-)-epicatechin (7,11
mg g-1s.u. în extractul etanolic 70%) în extractele etanolice p ăstrate la temperatura camerei al
speciei H. perforatum , comparativ cu extractele depozitate la temperatura de 40C. Rutin,
hesperidin, isoramnetin și crisin au fost cei mai stabili compuși identifica ți în extractele
păstrate la temperatura camerei. Pe baza analizei LC -MS a probelor depozitate la temperatura
camerei putem afi rma faptul că extractele etanolice 50% con țin cantități mari de acizi fenolici
și flavonoide comparativ cu extractele etanolice 30 și 70%. Rezultate le sunt similare cu cele
obținute în urma analizei LC -MS a probelor p ăstrate la rece.
În extractele etanolic e păstrate la te mperatura camerei a speciei G . verum au fost
detectate concentra ții mai mici de acizi fenol ici: acidul clorogenic (2,02 mg g-1s.u. în extractul

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale
99
etanolic 30%) , acidul cafeic (1,76 mg g-1s.u. în extractul etanolic 30%) , acidul cumaric (1,87
mg g-1s.u. în extractul etanolic 70%) și acidul ferulic (6,86 mg g-1s.u. în extractul etanolic
50%) comparativ cu cantit ățile cuantificate în extractele depozitate la 4o C. Ca și în cazul
extractelor păstrate la rece, compu șii majoritari identific ați în extractele depozitate la
temperatura camerei au fost : (+)- catechin (7,69 mg g-1s.u. în extractul etanolic 70%) și (-)-
epicatechin (7,92 mg g-1s.u. în extractul etanolic 70%) . S- a observat c ă izoramnetinul și crisin
au fost cei mai stabili compuși iar extrac tele etanolice 70% au prezentat concentra ții mai mari
de compu și poliufenolici față de extractele etanolice 30 și 50%.
Diferențe majore de concentra ții din extractele etanolice (30%, 50% și 70%) păstrate
la temperatura camerei a plantei O. vulgare comparat iv cu cele depozitate la rece au fost
cuantificate pentru acid clorogenic (2,44 m g g-1s.u. în extractul etanolic 50%), (+) -catechin
(6,61 m g g-1s.u. în extractul etanolic 70%) și (-)-epicatechin (6,28 m g g-1s.u. în extractul
etanolic 70%) iar flavonoidele (rutin, hesperidin, fisetin, isoramnetin, crisin) au prezentat
diferențe mult mai mici de concentra ții. În extractele 70% s -au cuantificat cantit ăți mai mari
de compuși comparativ cu celelate extract e studiate (extracte etanolice 30 și 50%).
În ceea ce p rivește probele comerciale ale speciei C. officinalis , s-a observat diferențe
de concentra ții pentru acidul clorogenic, (+)-catechin și (-)-epicatechin; fisetinul, quercetinul
și isoramnetinul fiind c ompușii cei mai stabili.
Compușii cei mai stabili cuanti ficați în probele comerciale de H. perforatum
depozitate la temperatura camerei au fost: quercetin [0,04 mg g-1 s.u. (B1), 9,08 mg g-1 s.u.
(B2)] , isoramnetin [0,09 mg g-1 s.u. (B1), 0,16 mg g-1 s.u. (B2)] și crisin [0,01 mg g-1 s.u.
(B1), 0,02 mg g-1 s.u. (B2)] .
În probele comerciale al e speciei G . verum , acidul clorogenic [0,56 mg g-1 s.u. (C1),
0,19 mg g-1 s.u. (C2)], (+) – catechin [0,69 mg g-1 s.u. (C1), 0,74 mg g-1 s.u. (C2)] ( -)-
epicatechin [3,04 mg g-1 s.u. (C1), 0,81 mg g-1 s.u. (C2)] și acid cu maric [0,49 mg g-1 s.u.
(C1), 0,09 mg g-1 s.u. (C2)] au prezentat concentra ții semnificativ mai mici comparativ cu
extractele comerciale p ăstrate la temperatura de 4o C.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

100

Tabelul II.3.1. Conținutul în compuși polifenolici al extractelor etanolice păstrat e la temperatura camerei (mg g-1s.u.)

Planta Probe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
C.
officinalis Extr.alc.30% 0,54 0,12 0,12 1,52 0,09 0,09 0,32 0,20 0,19 0,07 0,02 0,05 0,004
Extr.alc.50% 2,32 2,75 0,28 0,32 0,28 1,25 0,12 0,27 1,06 1,62 0,04 0,02 0,002
Extr.alc.70% 0,72 1,89 0,14 5,01 1,11 1,71 0,47 0,45 1,41 0,98 0,05 0,03 0,01
H.
perforatum Extr.alc.30% 0,51 0,32 0,53 0,77 0,25 0,08 0,18 0,52 1,01 0,02 0,43 0,02 0,003
Extr.alc.50% 1,25 6,11 0,91 1,02 0,18 0,46 1,61 1,87 1,65 2,14 10,82 1,01 0,002
Extr.alc.70% 0,86 6,26 0,01 7,11 0,56 0,88 1,20 3,32 2,02 0,67 0,80 0,32 0,03
G.
verum Extr.alc.30% 2,02 0,90 1,76 0,99 1,37 1,04 0,04 3,78 0,53 0,03 0,32 0,01 0,001
Extr.alc.50% 1,68 4,88 1,02 1,73 1,19 1,50 1,90 6,86 0,87 3,72 0,36 0,52 0,01
Extr.alc.70% 0,97 7,69 0,11 7,92 1,25 1,87 2,08 3,42 1,06 0,26 0,24 0,33 0,05
O.
vulgare Extr.alc.30% 0,21 1,88 0,98 1,16 1,78 1,44 0,52 2,12 1,74 0,05 0,03 0,18 0,02
Extr.alc.50% 2,44 2,75 0,64 1,97 2,04 2,32 0,36 1,32 0,92 5,07 0,11 0,55 0,01
Extr.alc.70% 0,03 6,61 0,71 6,28 3,19 1,20 3,21 0,08 2,78 5,92 0,26 0,61 0,01
A1 0,10 0,80 0,08 0,45 0,006 0,02 0,22 0,16 0,05 0,42 0,02 0,009 0,007
A2 0,84 0,43 0,05 1,56 0,002 0,01 0,34 0,12 0,32 2,12 0,03 0,02 0,009
A3 0,08 0,23 0,14 1,62 0,08 0,009 0,26 0,09 0,08 1,47 0,06 0,12 0,08
B1 0,96 1,10 0,02 0,76 0,13 0,23 1,18 0,15 1,09 1,02 0,04 0,09 0,22
B2 0,76 0,28 0,04 2,99 0,05 0,34 0,04 0,02 0,42 0,65 9,08 0,16 0,02
C1 0,56 0,69 0,12 3,04 0,18 0,49 0,18 1,29 0,16 2,77 0,10 0,03 0,01
C2 0,19 0,74 0,17 0,81 0,02 0,09 0,02 0,14 2,19 0,25 0,08 0,28 0,02

1- Acid clorogenic; 2- (+)- Catechin; 3- Acid cafeic; 4-(-)- Epicatechin; 5- Rutin ; 6- Acid cumaric ; 7- Izoquercitrin ; 8- Acid ferulic ; 9- Hesperidin ;
10- Fisetin ; 11- Quercetin ; 12- Isoramnetin; 13- Crisin; A1, A2, A3 -Extract comercial de C. officinalis (Dacia Plant, Hofigal, Santo Raphael );
B1, B2 – Extract comercial de H. perforatum (Dacia Plant, Hofigal ); C1, C2 – Extract comercial de G . verum (Dacia Plant, Santo Raphael );

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

101
Datele cantitative ob ținute au arătat faptul c ă în extractele p ăstrate la temperatura de 40 C s-au
înregistrat concentrații mai mari de compu și polifenolici comparativ cu extra ctele depozitate la
temperatura camerei (Fig. II.3.1 ). În concluzie, condițiile de depozitare ale extra ctelor
influențează conținutul în principii active ale acestora. Rezultatele obținute sunt importante
pentru diverse firme care au ca scop prelucrarea plantelor cu realizarea unor preparate
fitoterapice, gemoterapice și medicamente homeopatice.

5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 min50000100000150000200000250000300000350000400000450000500000550000600000650000700000750000800000850000uV

Fig. II.3.1. Cromatograma înregistrată pent ru extractul etanolic de 30%: 1-extract etanolic
păstrat la temperatura de 40 C; 2-extract etanolic păstrat la temperatura camerei

1
2 3 4 5 6 7 8 9 10
11
12 13 1
2

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

102
II.2.4.Concluzii

 În acest capitol s -a realizat caracterizarea și compararea extractelor etanolice ale
plantelor C. officinalis , H. perforatum , G . verum și O. vulgare , obținute în
laborator și a extractelor comerciale (C. officinalis , H. perforatum și G . verum ),
din punct de vedere al con ținutului în compuși biologic activi și a compozi ției
unor compuși individuali .
 Conținutul de polifenoli și flavonoide totale pentru toate extractele etanolice au
prezentat valori cuprinse între 1,36 -10,99 g GAE L-1și 1,07-10,74 g L-1.
 În ceea ce privește con ținutul de polifenoli și flavonoide totale, concentra ția cea
mai mare (10,99 g GAE L-1, 6,22 g L-1) a fost întalnită la proba comer cială a
speciei H. perforatum (B1).
 Metoda LC -MS propusă a fost validată în termeni de liniaritate, limite de detecție
(0,05 -0,28 µg mL-1) și cuantific are (0,18 -0,93 µg mL-1), repetabilit ate (0,09 -1,44
% RSD), reproductibilitate (0,48 -2,82 % RSD) și exactitate (95,84 -103,20 %) .
 Datele cantitative au ar ătat faptul c ă extractele etanolice preparate în laborator
prezintă concentrații mai ridicate de compuși polifenolici comparativ cu extractele
etanolice comerciale .
 Analiza LC -MS a extractelor etanolice a demonstrat faptul c ă extractele păstrate
la temperatura de 40 C prezint ă concentrații mai mari de compu și polifenolici
comparativ cu extra ctele depozitate la temperatura camerei .
 Metoda LC-MS a permis cuantificarea unor compuși care conduc la diferen țierea
tipului de extracție.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

103
II.3 ANALIZA CALITATIV Ă ȘI CANTITATIV Ă COMPARATIV Ă A POLIFENOLILOR
DIN EXTRACTELE DE: CALENDULA OFFICINALIS , HYPERICUM PERF ORATUM ,
GALIUM VERUM ȘI ORIGANUM VULGARE PRIN ELECTROFOREZ Ă CAPILAR Ă
ZONAL Ă

II.3.1. Introducere
În ultimii ani s -a dovedit că electroforeza capilară (CE) reprezintă o bună alternativă la
HPLC pentru investigarea diferiților compuși datorită bunei rezolu ții, versatilită ții, simplicită ții,
timpului scurt de analiză și a costurilor scăzute în ceea ce prive ște reactivii și materialele
consumate. La acest moment, cea mai utilizată metodă de detec ție pentru compu șii separați prin
CE este spectrometria UV -Vis dar fără îndoială, utilizarea spectrometriei de masă ca sistem de
detecție va avea un trend ascendant [321-322].
Pentru realizarea unei bune separări prin CE este necesară optimizarea câtorva parametri
cum sunt: tipul, concentra ția și valoarea pH-ului tamponu lui de migrare, tipul și dimensiunea
capilarei, temperatura de separare, puterea câmpului electric aplicat, modul de injec ție, etc.
Contribuția majoră pe care o aduce separarea compu șilor prin CE este timpul scurt de
analiză și costurile foarte reduse com parativ cu HPLC.
În acest capitol s -au urmărit realizarea a două obiective principale:
– Dezvoltarea unei metode electroforetice de separarea a polifenolilor;
– Folosirea metodei dezvoltate și validate par țial pentru c aracterizarea calitativă și
cantitativă a extractelor vegetale ale speciilor: C. officinalis , H. perforatum , G. verum
și O. vulgare .

II.3.2. Materiale si metode
Acidul cafeic, quercetinul, kaem pferolul, rutinul, luteolinul, acidul ferulic, acidul
clorogenic acid, acidul roz marinic, acidul sinapic , acidul p -cumaric, acidul siringic, naringeninul,
acidul cinamic, acidul galic, acidul salvianolic A, izoquercitrinul, tetraboratul de sodiu, dodecil
sulfatul de sodiu (SDS), acidul fosforic 85% au fost achizi ționate de la Sigma (Germania).
Apa ultrapură, soluția 0,1N și 1N de hidroxid de sodium au fost achizi ționate de la
Agilent Technologies (Germania). Solven ții (Merck, Germania) și soluțiile au fost filtrate cu

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

104
ajutorul unor membrane cu o dimensiune a porilor de 0,2
m (Millipore, Bedford, MA, USA) și
au fost degazte înainte de utilizare.
Soluțiile stoc de standarde au fost preparate prin dizolvare în met anol ( 2 mg mL-1) și au
fost depozitate la 4° C pe toată perioada determinărilor. Dilu țiile soluțiilor de standarde au fost
preparate zilnic în e lctroli tul utilizat la migrare.
II.3.2.1. Prepararea extractelor vegetale
Materialul vegetal uscat al plantelor: C. officinalis , H. perforatum , G . verum și O. vulgare
a fost achiziționat de pe piața românească. 5 mg din fiecare plantă au fost supuse extrac ției cu
apă (1:10, m/v) și etanol în diferite concentrații respectiv 30%, 50% și 70% (1:10, m/v).
Amestecul a fost ținut la î ntuneric la temperatura de 40 C și agitat zilnic timp de 7 zile . Extractele
apoase și etanolice au fost filtrate prin h ârtie de filtru, al icotate și păstrate la congelator până la
efectuarea analizelor.

II.3.2.2 . Separarea electroforetic ă a polifenolilor
Separarea polifenolilor din probe reale s-a realizat cu ajutorul unui sistem CE Agilent cu
detector cu șir de diode (DAD). Pentru separar e s-a utilizat o capilară fused -silica (Agilent
Technologies, Germany) cu diametru intern de 50 µm și lungime efectivă de 72 cm. Înainte de
orice determinare capilara a fost spălată succesiv cu NaOH 1N timp de 10 min; NaOH 0,1 N
timp de 10 min; apă ultra p ură 10 min; tampon 20 min. Între separări capilara a fost condi ționată
cu NaOH 0,1M timp de 1 min, H 2O pentru 1 min și electrolit de migrare timp de 2 min. După
trei migrări succesive tamponul de migrare a fost înlocuit.
Injecția probei s -a realizat în mo d hidrodinamic (35 mbar/12 sec) iar temperatura de
separare a fost de 30oC.
Separarea simultană a polifenolilor s -a realizat cu ajutorul unui tampon de migrare format
din tetraborat de sodiu 45 mM con ținând 0,9 mM SDS, pH=9,35 ajustat cu HCl 1 M pornind d e
la o metodă dezvoltată anterior [287]. Voltajul aplicat a fost de 30 kV iar detec ția s-a realizat în
domeniul de lungime de undă 200 -360 nm. Cuantificarea compu șilor s -a realizat prin măsurători
la lungimea de undă 280 nm. Pentru analiza datelor s -a util izat programul ChemStation
(Agilent).

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

105
II.3.3. Rezultate și discu ții
II.3.3.1. Dezvoltarea metodei de electroforeză capilară zonală (CZE)
Literatura de specialitate prezintă mai multe metode de electroforeză capilară pentru
separarea polifenolilor [323-326]. Tampoanele de migrare utilizate pentru separarea polifenolilor
pot fi constituite din diferite săruri (fosfat, borat, borax) și au fost utilizate ca atare sau împreună
cu SDS și/sau solvent organic. Metoda electroforetică dezvoltată, face parte din cate goria
metodelor de electroforeză zonale, cu detec ție directă în UV. Surfactantul anio nic SDS din
tamponul de migrare ajută la îmbunătă țirea separării dar, deoarece concentra ția sa nu atinge
concentra ția critică micelară, metoda nu poate fi inclusă în metod ele de electroforeză
electrocinetică micelară. Metoda se bazează pe utilizarea tamponului alcalin de tetraborat de
sodiu și a fost adaptată pentru pentru separarea a 16 polifenoli. Unii dinte compu șii polifenolici
sunt deja analiza ți prin celelalte metode, dar unii sunt nou introdu și: acidul cinamic, sinapic,
siringic și salvianolic, naringeninul.

II.3.3.2. Validarea metodei de electroforeză capilară zonală (CZE)
Metoda de electroforeză capilară zonală a fost validată din punct de vedere al următorilor
parametri: liniaritate, precizie, exactitate, limită de detec ție, limită de cuantificare.
Identificarea picurilor s -a realizat prin adi ție standard și prin compararea valorilor
timpului de reten ție caracteristic fiecărui compus. După cum se observă în Tabelu l II.3.1 . pentru
toți compușii separați, variația timpului de reten ție a fiecărui compus a fost mică, cele mai mari
variații fiind calculate pentru acidul ferulic (tR= 15,42±0,36 min ), acidul salvianolic A (tR=
22,24±0,33 min) , acidul cafeic (t R=23,99±0,52 min) și acidul galic (t R= 26,24±0,68 min) (Fig.
II.3.1 .).

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

106

Fig. II.3.3. Electroforegrama solutiei de standarde (40 µg mL-1): 1- Rutin, 2 – Naringenin, 3 –
Izoquercitrin, 4 – Acid cinamic, 5 – Acid clorogenic, 6 – Acid sinapic, 7 – Acid siringic, 8- Acid
ferulic, 9 – Kaempferol, 10 – Luteolin, 11 – Acid c umaric, 12 – Quercetol, 13 – Acid rozmarinic, 14 –
Acid salvianolic A, 15 – Acid cafeic, 16 – Acid galic

Liniaritatea metodei pentru domeniile de concentra ții studiate a fost verificată prin
analiza de re gresie liniară a valorilor ariilor picurilor versus concentra ția standardului (y = aX+b,
unde X este concentra ția (µg mL-1), y- area picului, a și b constante ale ecua ției de regresie) .
Curbele de calibrare au fost realizate în triplicat pentru 11 valori d e concentra ție. Domeniile de
liniaritate au fost testate pentru concentra ții cuprinse între 2,5-100 µg mL-1. Domeniile de
liniaritate au fost cuprinse între 2,5-80 µg mL-1. În Tabelul II.3.1 . sunt prezentate ecua țiile de
regresie liniară și coeficien ții de determinare pentru fiecare compus. Pentru domeniile de
concentra ție investigate s -a obținut o bun ă lini aritate iar valorile coeficien ților de determinare r2
au fost mai mari decât 0,994 pentru to ți analiții.
Limita de detecție (LOD) și limita de cuantifi care (LOQ) a compușilor au f ost calculate
ca 3x S/Z respectiv 10xS/Z. Limitele de detec ție au variat între 0,06 µg mL−1 pentru acidul
cinamic respectiv 1,38 µg mL−1 pentru acidul rozmarinic. Limitele de cuantificare au variat între
1 2
3 4
5
6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16
min. mAU

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

107
0,20 µg mL−1 pentru lute olin și 4,56 µg mL−1 pentru acidul rozmarinic. Valorile ob ținute pentru
limitele de detec ție și cuantificare indic ă faptul că metoda prezint ă o bună sensibilitate.

Tabelul II.3. 1. Parametrii de p erforman ță ai metodei CZE
Compus tR
(min) Ecuația curbei de
regresie r2 Domeniu de
liniaritate
(µg mL-1) LOD
(µg mL-1) LOQ
(µg mL-1)
Rutin 11,46±0,16 y = 0,582x + 1, 652 0,998 2,5-80 0,48 1,59
Naringenin 11,77±0,13 y = 0,409x + 1, 072 0,999 2,5-80 1,19 3,92
Izoquercitrin 12,48±0,11 y = 0,735x + 1, 285 0,999 2,5-80 0,37 1,22
Acid cinamic 13,12±0,14 y = 2, 272x + 2,19 0,998 2,5-80 0,06 0,20
Acid clorogenic 13,50±0,10 y = 0,912x + 1, 260 0,999 2,5-60 0,44 1,45
Acid sinapic 13,81±0,10 y = 0,433x + 0, 027 0,997 2,5-80 0,81 2,69
Acid siringic 15,19±0,09 y = 0,795x + 0,575 0,997 2,5-80 0,39 1,29
Acid ferulic 15,42±0,36 y = 1,326x + 1, 467 0,998 2,5-80 0,16 0,53
Kaem pferol 15,69±0,12 y = 3,12x + 0, 666 0,998 2,5-60 0,15 0,50
Luteolin 16,56±0,14 y = 1,325x + 2, 089 0,998 2,5-70 0,13 0,44
Acid c umaric 17,21±0,24 y = 2 ,267x + 1, 647 0,998 2,5-80 0,17 0,56
Quercetol 18,27±0,24 y = 1,744x + 0, 053 0,998 2,5-60 0,62 2,04
Acid roz marinic 20,61±0,20 y = 0,659x + 2, 439 0,998 2,5-80 1,38 4,56
Acid salvianolic A 22,24±0,33 y = 2.5281x + 1.8 0,994 2,5-60 0,22 0,74
Acid cafeic 23,99±0,52 y = 2,151x – 0,082 0,999 2,5-60 0,61 2,01
Acid galic 26,24±0,68 y =0,644x + 0, 415 0,999 2,5-60 0.60 1.97

Precizia metodei CZE a fost demonstrată prin teste de repetabiliate și reproductibilitate.
Repetabilitatea metodei a fost testată prin 5 injecții succesive ale amestecului de standarde în
aceiași zi iar reproductibilitatea prin 5 injec ții succesive ale amestecului de standarde pe

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

108
parcursul mai multor zile ( Tabelul II.3.2. ). Rezultatele sunt prezentate în termeni de devia ție
relativă stand ard (RSD). Valorile RSD pentru repetabilitate nu au depă șit valoarea de 5,09 % iar
pentru reproductibilitate valoarea de 5,07 %.
Table II .3.2. Repetabilitatea și reproductibilitatea metodei CZE
Compus Repetabilitatea
(%, n = 5) Reproductibilitatea
(%, n =3×5)
Ziuaa 1 Ziuab 2 Ziuac 3
Rutin 1,02 2,42 4,34 4,52
Naringenin 2,85 4,66 3,45 2,99
Izoquercitrin 4,95 4,22 4,55 2,81
Acid cinamic 4.57 3,52 3,22 2,35
Acid clorogenic 4,09 4,76 4,80 3,41
Acid sinapic 4,06 4,40 5,07 3,54
Acid siringic 3,96 3,73 3,13 3,92
Acid ferulic 5,09 4,97 5,04 4,08
Kaem pferol 3,12 4,87 2,77 2,45
Luteolin 3,58 4,55 3,82 3,21
Acid c umaric 4,92 4,15 2,13 2,91
Quercetol 5,00 4,80 3,35 4,08
Acid roz marinic 4,32 4,71 3,81 3,97
Acid salvianolic A 5,12 4,38 4,36 4,11
Acid cafeic 4,90 4,30 4,07 4,96
Acid galic 4,59 4,34 5,03 4,58
a concentra ție standarde : 9 µg mL-1; b concentra ție standarde: 35 µg mL-1; c concentra ție
standarde: 55 µg mL-1.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

109
Pentru a se demonstra că metoda CZE dezvoltată este exactă s -a ales ca exact itatea
metodei să fie demonstrată u tilizându -se un extract diluat de Hypericum perforatum (diluat 10x)
la care au fost adăugate concentra ții cunoscute de standarde ( Tabelul III.3.3. ). Procentele de
regăsire pentru probele testate au avut valori cuprinse î ntre 86,66 % și 101,54 %.
Tabelul II.3.3 . Exactitatea metodei CZE (%)
Compus Concentra ție adăugată
12 µg mL-1 24 µg mL-1 36 µg mL-1
Regăsire (%)
Rutin 101,54 ± 3,75 98,45 ± 2,11 96,67,5 ± 1,67
Naringenin 96,71 ± 0,61 95,96 ± 5,63 95,02 ± 4,76
Izoquercitrin 92,54 ± 2,88 96,09 ± 3,61 97,54 ± 3,55
Acid cinamic 99,39 ± 3,37 95,64 ± 3,54 99,77 ± 0,26
Acid clorogenic 96,93 ± 4,27 98,92 ± 1,05 97,4 ± 3,14
Acid sinapic 96,02 ± 4,56 99,49 ± 3,20 98,39 ± 3,16
Acid siringic 96,84 ± 3,29 97 ± 3,47 93,75 ± 1,73
Acid ferulic 90,60 ± 2,99 86,88 ± 1,49 93,32 ± 4,16
Kaem pferol 89,30 ± 3,64 94 ± 4,39 86,66 ± 1,93
Luteolin 94,81±0,96 97,45 ±3,05 93,52 ± 2,31
Acid c umaric 90,74 ± 4,35 91,54 ± 0,56 93,94 ± 2,71
Quercetol 94,27 ± 2,83 97,91 ± 2,83 98,27 ± 3,25
Acid roz marinic 96,71 ± 4,80 96,07 ± 3,90 99,62 ± 5,28
Acid salvianolic A 97,30 ± 3,81 96,33 ± 0,90 93,48 ± 3,33
Acid cafeic 91,22 ± 3,21 92,87 ± 2,88 91,88 ± 4,11
Acid galic 93,58 ± 5,03 94,05 ± 4,33 92,51 ± 3,41
Regăsirea (%) = (cant itate determinată – cantitatea existentă)/ cantitatea adăugată) x 100.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

110
Rezultatele ob ținute recomandă metoda de electroforez ă capilară dezvoltată pentru
separarea și cuantificarea polifenolilor din diferite ex tracte de origine vegetală. După cum se
observă, metoda CZE dezvoltat ă prezintă caracteristici de performan ță superioare comparativ cu
alte metode cromatografice ( Tabelul II.3.4 ).

Tabelul II.3.4. Metoda CZE dezvoltat ă și alte metode cromatografice
Proba Compu și separa ți Timp
(min.) Tehnica LOD
µg mL-1 Referin țe
Extract de
Blumea
Balsamifera Dihidroquercetin –
7,4’-dimetil eter,
blumeatin, quercetin,
5,7,3’,5’ –
tetrahidroxiflavanone,
dihidroquercetin -4’-
metil eter 35 min. HPLC -UV 0,005 –
0,05 [327]
Extract e din
plante
medicinale Acid cafeic, acid p –
cumari c, acid ferulic,
acid neoclorogenic,
quercetin, luteolin,
apigenin, kaempferol,
isoramnetin, miricetin 40 min. HPLC -DAD – [295]
Extract din T.
officinalis, C.
scolimus, S.
marianum, H.
perforatum, C.
majus și L.
clavatum Acid galic, acid
protocatecuic, a cid
clorogenic, acid
cafeic, acid o –
cumaric, acid p-
cumaric, acid trans –
cinamic, acid vanilic,
acid ferulic, acid
sinapic, cinarin, 40 min. HPLC -UV – [328]

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

111
quercetin,
kaempferol, taxifolin,
apigenin glucoside
Extract din P .
campechiana ,
P . sapota și P .
viridis Acid galic,
galocatechin,
catechin, epicatechin,
dihidromirecitin,
catechin -3- O- galate,
mirecitin 40 min. HPLC -MS 0,002 –
0,25 [329]
Extract din
cătină, măceș Trans -resveratrol,
catechin, acid
clorogenic, quercetin,
miricetin, rutin, acid
cafeic, acid galic 22 min. CZE – [330]
Extract din C.
officinalis, H.
perforatum, G .
verum și O.
vulgare Rutin, naringenin,
izoquercitrin, acid
cinamic, acid
clorogenic, acid
sinapic, acid siringic,
acid ferulic,
kaempferol, luteolin,
acid cumaric,
quercetol, ac id
rozmarinic, acid
salvianolic A, acid
cafeic, acid galic 27 min. CZE 0,06-1,38 Metoda
prezent ă

II.3.3.3 . Analiza electroforetic ă a probelor reale
Metoda electroforetic ă dezvoltată a fost utilizat ă pentru analiza extractelor apoase și
hidroalcoolice (3 0%, 50% și 70%) ale plantelor C. officinalis , H. perforatum , G . verum și O.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

112
vulgare. Datele cantitative arată că concentra țiile compușilor polifenolici sunt diferite în toate
tipurile de extracte studiate. (Tabelul II.3.5 , Fig. II.3.2., Fig. II.3.3., Fig. II.3.4., Fig. II.3.5., .).

Fig. II.3.2. Electroforegrama extractului etanolic 70% al speciei C. officinalis

Fig. II.3.3. Electroforegrama extractului etanolic 70% al speciei H. perforatum

1 2
3 4
5 6
7 8 9 10
11 12 13
16 15 14
min. mAU 1 2

1 2
3
4 5
6 8
9 10 11 12
14 15 16
min. mAU

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

113

Fig. II.3.4. Electroforegrama extractului etanolic 70% al speciei G . verum

Fig. II.3.5. Electroforegrama extractului etanolic 70% al speciei O. vulgare

Extractele speciei C. officinalis au prezentat cele mai mici concentra ții de compu și
polif enolici comparativ cu celelalte plante studiate în acest capitol. Acidul clorogenic și acidul
1
2 3
4 5 6 7 8 9 10
11
12
16 15 14 13
min. mAU
1 2
3 4
5 6 7 8 9 10 11
16 15 13 12
min. mAU

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

114
cafeic au fost cuantifica ți în toate extractele speciei iar concentra țiile acestora au variat
semnificativ de la 0,031 mg g-1 s.u. (extract apos) la 0,43 mg g-1 s.u. (extract etanolic 50%) și de
la 0,21 mg g-1 s.u. (extract etanolic 50%) la 0,71 mg g-1 s.u. (extract apos). Acidul rozmarinic și
acidul slavianolic A nu au fost identifica ți în extractele analizate . Cele mai mari cantit ăți de rutin
și naringenin au fos t detectate în extractul etanolic 30% (4,03 mg g-1 s.u.) și în extractul etanolic
70% (6,67 mg g-1 s.u.). Au fost detectate cantit ăți mici de kaempferol, luteolin și quercetol. În
extractele plantei C. officinalis a fost cuantificat pentru prima dat ă naringeninul . Rezultatele sunt
similare cu cele rapor tate de Dănilă și colaboratorii (2011) [191] și Matei și colaboratorii (2015)
[271] pentru extractele acestei speci i, cultivat ă în Romania.
În extractele speciei H. perforatum , acidul sinapic a fost compusu l majoritar în toate
tipurile de extracte, concentra ția acestuia variind de la 1,13 mg g-1 s.u. în extractul apos la 7,08
mg g-1 s.u. în extractul etanolic 30%. Aceste rezultate sunt comparabile cu cele raportate de
Dvorackova E. și colaboratorii (2014) [331] pentru extractele de H. perforatum cultivată în
Cehia . Alți acizi fenolici cuantifica ți au fost : acidul clorogenic (3,53 mg g-1 s.u. în extractul
etanolic 30%), acidul cinamic (1,97 mg g-1 s.u. în extractul etanolic 70%), acid ul rozmarinic
(11,61 mg g-1 s.u. în extractul etanolic 70%) și acid ul cafeic (0,71 mg g-1 s.u. în extractul apos).
Flavonoidele (rutin, naringenin, izoquercitrin, kaempferol, luteolin și quercetol) au fost
cuantificate în cantități mici în toate extractele speciei H. perforatum .
Analiza extractelor plantei G . verum a evidențiat fapul c ă acidul sinapic a fost compusul
majoritar în extractele speciei . Acidul sinapic fost detectat în concentra ții mari î n toate extractele
în special în extract ul etanolic 50% (9,14 mg g-1 s.u.). Acidul clorogenic (1,87 mg g-1 s.u. în
extractul etanolic 50%), acid ul siringic (1,70 mg g-1 s.u. în extractul etanolic 50%), acid ul
cumaric (1,33 mg g-1 s.u. în extractul etanolic 70%) și acid ul cafeic (3,12 mg g-1 s.u. în extractul
etanolic 30%) au fost princip alele componente cuantificate în extractele speciei în timp ce acidul
galic și acidul ferulic a u fost găsiți în cantități mai mici. Cele mai mari concentra ții de rutin și
naringenin au fost cuantificate în extractele etanolice 70%. Conform metodei descr ise, au fost
identificate pentru prima dat ă în extracte le apoase și etanolice (30%, 50% și 70%) ale speciei G.
verum naringeninul, acidul sinapic și acidul siringic .
În ceea ce prive ște extractul etanolic de O. vulgare s-a observat că acest extract prezin tă
un conținut mare de acid rozmarinic în special în extractul etanolic 50% (19,33 mg g-1 s.u.).
Acidul sinapic și acidul siringic au fost cuantifica ți doar în extractul apos (0,18 mg g-1 s.u., 0,19

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

115
mg g-1 s.u.) și în extractul etanolic 70% (0,28 mg g-1 s.u., 0,29 mg g-1 s.u.). Dintre toate
flavonoide identificate doar izoquercitrinul a fost g ăsit în concentra ții mari în special în extra ctul
etanolic 50% (4,48 mg g-1 s.u.). Datele ob ținute sunt comparabile cu alte studii referitoare la
extractele din aceast ă plantă din România [191, 332 ]. Rezultate similare au fost raportate în
Lituania, India și Grecia [302, 333-334].
Deși acidul sinapic, acid ul siringic și naringenin ul sunt fitochimicale comune în dieta
umană, nu a u primit la fel de mult interes din partea comunității științifice precum acizi i
hydroxicin amic i (acidul cafeic sau acidul ferulic ) chiar dac ă au demonstrat o serie de propriet ăți:
antimicrobiene [335-339], anti -inflamator [340], anti-tumorale [341], anti -anxietate [342] (acidul
sinapic); antimicr obiene [343], anti-tumorale [344] și anti -diabetice [345] (acidul siringic); anti-
inflamator, anti -proliferativă și anti -mutagen e (naringenin) [346].
Rezultatele experimentale demonstreaz ă faptul că cantitatea de acizi fenolici și
flavonoide este influen țată de mediul de extrac ție. Astfel, extractele etanolice 70 % ale plantelor
C. officinalis , H. perforatum și O. vulgare , și extractul etanolic 50% al speciei G. verum prezintă
concentra ții importante în acești compuși.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

116
Tabelul II.3.5. Con ținutul în acizi fenolici și flavonoide în extractelor vegetale (mg g-1 s.u.)

1- Rutin ; 2- Naringenin; 3- Izoquercitrin; 4- Acid cinamic; 5- Acid clorogenic; 6- Acid sinapic; 7- Acid siringic; 8- Acid ferulic; 9-
Kaempferol; 10- Luteolin; 11- Acid c umaric; 12- Quercetol; 13- Acid rozmarinic; 14- Acid sa lvianolic A; 15- Acid cafeic; 16- Acid
galic

Planta Extract 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
C. officinalis Apos 2,62 2,05 0,008 0,015 0,031 1,51 0,77 0,04 0,013 0 0,07 0,05 0 0 0,71 0,12
Etanolic30% 4,03 1,10 0 0 0,22 2,38 0,69 0,41 0,09 0 0 0,046 0 0 0,48 0,40
Etanolic 50% 0,31 2,33 0,01 0 0,43 0,96 1,71 0 0,09 0,05 0,1 0,09 0 0 0,21 0,28
Etanolic 70% 1,23 6,67 0,99 0,22 0,17 1,33 0 0,52 0,36 0,06 0,02 0,08 0 0 0,23 0,17
H. perforatum Apos 0,66 0,03 0,19 0,42 1,57 1,13 0 0 0,03 0 0,01 0,28 0 0 0,81 0
Etanolic 30% 0,005 0,2 0,73 0,50 3,53 7,08 0,09 0,01 0,23 0,46 0,32 1,39 0,29 0 0,89 0,52
Etanolic 50% 0,22 0,56 0,12 0,04 0,98 2,16 0,07 0 0,03 0,05 0 0,49 0.0 0 0,07 0
Etanolic 70% 0,18 1,50 0,33 1,97 0,37 5,09 0,27 0,14 0,21 1,28 0,13 0,12 11,61 0 0,15 0,55
G. verum Apos 0,29 0,005 0,28 0 0,49 4,19 0.00 0,47 0,16 0 0,40 0 0 1,35 0,16
Etanolic 30% 0,01 0,1 0,46 0 0,86 0,61 0,29 1,01 0,06 0,03 0,88 0,31 0 0 3,12 0,74
Etanolic 50% 5,16 0,38 0,21 0 1,87 9,14 1,70 0,45 0 0,46 0 0,81 0 0 1,08 0,38
Etanolic 70% 5,47 5,77 0,25 1,68 0,96 2,22 1,40 0,34 0,15 0,41 1,33 0,28 0,20 0 0,37 0,26
O. vulgare Apos 0,03 0 0,01 0,08 0,23 0,18 0,19 0,04 0.00 0,61 0,04 0,35 0,06 0,04 0,13 0,21
Etanolic 30% 0,62 0 3,47 0 0 0 0 0 0,11 0,94 0,35 0 8,82 0 0,92 1,29
Etanolic 50% 0,04 0 4,48 0 0 0 0 0,02 0,03 1,13 0,73 0,20 19,33 0,66 0,54 0
Etanolic 70% 5,06 0,52 3,15 0,002 0,32 0,28 0,29 0,09 0,26 0,90 0,57 0,14 16,29 0,28 0,59 0,82

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

117
II.3.4. Concluzii

 Utilizarea unor medii diferite de extrac ție a permis ob ținerea unor extracte apoase și
etanolice (30%, 50% și 70%) cu un con ținut ridicat în compuși biologic activi.
 Datele cantitative au indicat faptul că extractele apoase con țin concentrații mai mici de
polifenoli comparativ cu extracte etanolice .
 Conținutul în acizi fenolici și flavonoide a variat în extractele vegetale în funcție de
mediul de extrac ție, specia O. vulgare și în general extractele etanolice 70 % fiind cele
mai bogat e în acești compuși.
 Rezultatele ob ținute sunt în conformitate cu datele HPLC anterioare și, în plus, am
demonstrat pentru prima dată prezen ța unor compu și (de exemplu : naringenin în
extractele de C. officinalis , naringenin în extractele de H. perforatum , naringenin, acidul
sinapic și acidul siringic în extractele de G. verum și acid ul sinapic în extractele de O.
vulgare ) în extractele plantelor studiate .
 Metoda C ZE dezvoltată este sensibilă, liniară, repetitivă, reproductibilă și exactă .
 Metoda electrofo retică propusă a fost validată parțial: liniaritate (2,5-80,0 µg mL-1) limite
de detecție (0,06 -1,38 µg mL-1) și cuantificare (0,20 -4,56 µg mL-1), repetabilitate (RSD ≤
5,09%) , reproductibilitate (RSD ≤ 5,07% și exactitate (86,66% -101,54% ).
 Metoda CZE dezv oltată a permis cuantificarea a 16 compuși polifenolici în 27 min din
extracte le vegetale .

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

118

II.4. EXTRACȚIA ȘI CUANTIFICAREA UNOR TANINURI DIN DIFERITE TIPURI DE
EXTRACTE ALE PLANTELOR STUDIATE FOLOSIND MALDI -TOF ȘI
CROMATOGRAFIE ELECTROCINETIC Ă MICELAR Ă (MEKC)

II.4.1. Introducere
Taninurile sunt compuși naturali în general solubili în apă cu masă molecula ră cuprinsă
între 300 și 20000 Da și cu o importanță deosebită în medicina tradițională dar și în industria
prelucrării pieilor d e animale. În funcție de structura chimic ă taninurile se clasific ă astfel :
– gallotaninuri ( unități le galloil sunt cuplate cu unități poliol-, catechin – sau unități
triterpenice);
– ellagitaninuri (două unități de galloi l sunt cuplate C-C);
– taninuri complexe (unitatea de c atechină este legată glicozidic la o unitate gallotannin
sau la o unitate ellagitanin);
– taninuri condensate (formate prin legarea C -4 de o catechină cu C -8 sau C -6 a
următoarei structuri monomerice catechin) [347 ].
Principale le taninuri prezente în plan te și în special în ceaiul verde sunt: catechina,
epicatechina, galat de epicatechină, epigalocatechină și galat de epigalocatechină. Unii
cercetători au demonstrat faptul că aceste taninuri (în special galat de epigalocatechină) pot
inhiba carcinogeneza s au creșterea diferitelor tipuri de cancer stabilite la diverse organe (stomac,
ficat, plămân, gl anda mamară, colon ș i piele) [348, 349 ]. Utilitatea taninurilor este foarte variată
(coagulanți în producția de cauciuc, în producția de cerneluri , coloranți ca tionici , antioxidanti
prezenți în vinuri, sucuri, ceaiuri, etc. ) datorită multiple lor proprietăți ale acestora : antiseptice,
antioxidante, antibacteriene și anticancerigene [350-355]. Valorificarea farmaceutic ă și
terapeutic ă a plantelor medicinale presupu ne cunoa șterea propri etăților principiilor active,
taninurile fiind una dintre principalele clase de compu și utilizați în scop terapeutic.
În ultimii ani, cercetatorii au dezvoltat numeroase metode (HPLC, LC -MS, CZE, MEKC,
MALDI -TOF) pentru a identifica ta ninurile, în special catechine le din produsele alimentare și
ceai verde. Ionizarea prin desorbție cu laser asistată de matrice (MALDI) este o tehnică de
ionizare "bl ândă" care cuplată cu un detector de masă (TOF) reprezintă un instrument important
pentru analiza compuși lor cu mase moleculare mari (proteine, glucide, peptide) dar și pentru

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

119
analiza compuși lor cu mase moleculare mici (100 -500 Da) [356 -358]. Caracterizarea
moleculelor mici este dificilă și mecanismul procesului desorbție / ionizare depinde foar te mu lt
de tipul de matrice utilizat dar și de prepararea eșantioanelor înainte de analiză. Deoarece tehnica
MALDI -TOF permite determinarea simultană a maselor în amestecuri, poate fi utilizată și în
industria produselor alimentare [359 ]. În ultimii ani , o atenție deosebit ă a fost îndreptată către
tehnica electrocineticii micelare care a fost introdusă pentru prima dată în 1984 de către Terabe și
colaboratorii [360] și care permite separarea simultană a speciilor atât neutre cât și încărcate fiind
mult mai sensibilă decât electroforeza capilară zonală. În acest moment această tehnică este
utilizată în special pentru determinarea drogurilor din probele care au un con ținut ridicat în
proteine (probe clinice, biofluide), în separarea unui amestec de substan țe farmaceutice cu
caracteristici structurale și fizico -chimice similare, pentru determinarea impurit ăților, în
separarea unor enantiomeri din amestecuri complexe , etc. și mai puțin pentru separarea și
identificarea compușilor polifenolici din extractele unor plante medicinale.
În acest capitol s -a urmărit realizarea urm ătoarelor activit ăți experimentale:
– Obținerea extractelor apoase, etanolice și acetonice ale speciilor C. officinalis , H.
perforatum , G . verum și O. vulgare cu un con ținut mare în compuși biolog ic activi;
– Dezvoltarea unor metode de separare a taninurilor în scopul caracteriz ării calitative și
cantitative a extractelor apoase, etanolice și acetonice ale plantelor studiate;

II.4.2. Materiale ș i metode
Sodiu tetraborat și sodiu dod ecil sulfat (SDS) , (+)-catechina (C), (-)-epicatechina (EC) și
fosfatul monobazic (KH 2PO 4) au fost achiziționate de la Sigma -Aldrich (Germania). (-)-
epigalocatechina (EGC) , (-)-galat de epigalocatechin ă (EGCG) și (-)-galat de epicatechin ă
(EGC) au fost achiziționate de la Fluka (Germania). Apa ultra pur ă, soluțiile de hidroxid de sodiu
0,1 N și 1 N au fost procurate de la Agilent Technologies (Germania) iar solvenții utilizați de la
Merk (Germania). Acidul formic, matricea și amestecul de calibrare, C104 (bradikinina,
Angio tensina II, Neurotensină, ACTH, Bovine, Insulina B) au fos t achiziționați de la Bio -laser
(Franța).
Soluțiile au fost filtrate cu ajutorul unui filtru cu dimensiunea porilor de 0,2 µm
(Millipore, Bedford, MA, USA) și au fost degazat e înainte a fiecărei anal ize. Soluțiile standard
individuale au fost preparate prin dizolvarea a 1 mg din fiecare compus în 1 mL de metanol.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

120
Soluțiile standard stoc și extractele vegetale au fost depozitate la 4° C pe perioada
experimentelor.
Soluțiile standard de lucru au fost d iluate în BGE și aduse la temperatura camerei înaintea
fiecăre i analize.

II.4.2.1.Prepararea extractelor vegetale
Extractele vegetale s -au preparat folosind părțile aeriene uscate ale plantelor C.
officinalis , H. perforatum , G . verum și O. vulgare obținute din farmacii, după cum urmează :
– extracte apoase la temperatura camerei [1:10 (m / v)];
– infuzie la temperatura de 950 C [1:10 (m / v)];
– extracte etanolice 30%, 50% și 70% [1:10 (m / v)];
– extracte acetonice [acetonă: apă, 80:20 (v / v)], [1:30 (m / v)];
Extractele apoase, etanolice și acetonice au fost păstrate timp de șapte zile la temperatura
de 4° C. Toate extr actele au fost filtrate prin hârtie de filtru Whatman . Înainte de fiecare analiză
extractele au fost filtrate prin filtru Millipore cu dimensiunea porilor de 0,2 µm. Pentru analiza
MALDI -TOF extractele au fost concentrate folosind Concentrator plus Eppendorf și apoi au fost
dizolvate în acetonă (9,6 mg mL-1).

II.4.2.2. Analiza tan inurilor prin MALDI -TOF
Spectrele de masă ale extractelo r (apoase, etanolice și acetonice) au fost înregistrate la
temperatura de 22° C, în conditii de vacuum înalt (10-7 – 10-9 mbarr) utilizând spectrometrul de
masă Axima CFR -Plus Shimadzu -Kratos și au fost prelucrate cu ajutorul programului
Launchpad. Ionizar ea probei s -a produs în urma acțiunii fasciculului laser provenit de la sursa de
azot ce func ționează în pulsuri și emite la 337 nm . Analizele s -au efectuat în următoarele condiții
experimentale: polaritate pozitivă, în care toleranța pentr u masele înregi strate a fost de ± 0,5 Da
și puterea laserului de 118.
Calibrarea instrumentului s -a realizat prin metoda „ calibrare extern ă în vecinatatea
probei” utilizând amestecul standard C104 (pentru domeniul 500 -3500 Da), ce con ține
Bradykinin [1 -5] (572,7 Da); Ang iotensin II (1046 ,2 Da); Neurotensin (1672 ,9 Da); ACTH [18 –
39] (2465 ,7 Da); Bovine Insulin chain B (3495 ,9 Da). Matricea utilizată a fost acidul 2,5 –
dihidroxibenzoic (D HB) de concentrație 10 mg mL-1 în acetonitril / apă ultrapură / acid acetic

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

121
(20 / 80 / 0,1 %). Probele au fost mixate cu matricea în cantități egale și apoi au fost aplicate pe
placa MALDI folosind metoda sandwich, c are constă în spotul area a 0,5 L matrice, care se las ă
la uscat la temperatura camerei, iar dup ă aceea se spotuleaz ă deasupra cristalelor de matrice
formate 0,5 L probă și 0,5 L matrice .

II.4.2.3. Separarea taninurilor prin MEKC
Pentru analiza taninurilor din extractele vegetale s-a utilizat un sistem CE Agilent cu
detector cu șir de diode. Compușii au fost separați utilizând o coloană capilară cu lungime totală
de 72 cm ( lungimea efectivă fi ind de 63,5 cm) cu dimensiunea particulelor de 50 µm. Tamponul
de migrare a fost format din 10 mM KH 2PO 4, tampon tetraborat de sodiu 8,3 mM con ținând 66,7
mM SDS, pH = 7,0 ajustat cu acid clorhidric 1 M. Înaintea fiec ărei determinări capilara a fost
spălată succesiv cu NaOH 1 N timp de 10 min ., NaOH 0,1 N timp de 10 min., apă ultra pură
timp de 10 min. și tampon 20 min . Între migr ări, capilara a fost condi ționată cu NaOH 0,1 N
timp de 1 mi n., apă ultrapură timp de 1 min. și electrolitul de migrare timp de 2 min. După 3
migrări consecutive tamponul de migrare a fost înlocui t. Injecția probei s -a realizat în mod
hidrodinamic în 12 sec. (35 mbar) și sistemul a operat sub tensiune pozitivă de 3 0 kV.
Temperatura de separare a fost de 300 C. Electrocromatogramele au fost înregistrat e la lungimea
de undă de 210 nm iar a chiziția și prelucrarea datelor au fost realizate cu ajutorul programului
ChemStation.

II.4.3. Rezultate și discuții
II.4.3.1. Caracterizarea extractelor vegetale prin MALDI -TOF
Tehnica MALDI -TOF s-a utiliz at pentru identificarea prezenței taninurilor și obține rea
mai mult or informații despre structurile și gradul de polimerizare al constituenților din extractele
apoase, etanolice (3 0 %, 50 % și 70 %) și acetonice ale plantelor C. officinalis , H. perforatum , G .
verum și O. vulgare . Datorită faptului c ă matricea influenteaz ă procesul de ionizare al analitului ,
au fost testate diverse tipuri de matrice de concentrații diferite (5 -10 mg mL-1) și anume : acidul
α-ciano-4-hidroxicinamic (α -CHCA), acidul sinapinic (SA), acidul 2,5 -dihidroxibenzoic cu NaCl
(10 mg mL-1) și acidul 2,5 -dihidroxibenzoic (DHB). În urma rezultatelor obținute s-a dovedit ca
DHB (10 mg mL-1) este matricea optim ă pentru analiza taninu rilor din extractele analizate (Fig.
II.4.1. ).

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

122

A
B
C

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

123

Fig.II.4.1. Spectrul MALDI al speciei C. officinalis în diferite matrici: A – α-CHCA;
B- SA; C – DHB+NaCl; D – DHB

Dintre cele trei tipuri principale de extracte , cele acetonice au prezentat intensit ăți mai
mari pentru semnale de interes (Fig.II. 4.2.).

D
A
B

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

124

C
D
E

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

125

Fig.II.4.2. Spectrul MALDI al speciei H. perforatum : A- extract apos; B – infuzie; C –
extrac t alcoolic 30%; D – extract alcoolic 50%; E – extract alcoolic 70%; F – extract acetonic

În spectr ele de masă al e extractelor vegetale s-a observat prezența componentelor
monomerice și oligomerice de C / EC (290,3 Da), EGC (306,3 Da), EGCG (458,3 Da), ECG
(442,3 Da ), isoramnetin (317,1 Da) galloyl (333,7 Da), di-epicatechina (428,2 Da) și dizaharida
(343,4 Da). De asemenea s -a mai identificat și fisetinidinul, care are aceeași structură ca și a
catechinei dar fără gruparea -OH din poziția C5 a inelului A) și dimmerul acestuia .
Semnalul atribuit C / EC a prezentat intensitate mare în spectrele de masă MALDI ale
extractelor speciei C. officinalis , ceea ce indică un conținut mai mare de C / EC . În plus, s-a mai
observat și prezența unui semnal la 625,4 Da, care a fost atribuit compusului is oramnetin -3-O-
rutinoside .
Extractul apos al speciei H. perforatum a prezentat un semnal de intensitate mare la m/z
623,5 Da, care a fost atribuit moleculei galatului de epicatechină ( 442 Da) la care s -a atașat un
radical de mon ozaharidă (180 Da). Aceasta grupare s -a regăsit și în celelalte extracte apoase ale
celorlalte specii, dar în raport mai mic. Prezența unui conținut ridicat de zaharuri poate reduce
puterea și rezistența legăturilor chimice proporțional cu d oza adaugată [3 61].
În extractele alcoolice ale speciei H. perforatum , dar în special în cel etanolic 50%
(Fig.II.4.3 .), au fost identificate următoarele naftodiantr one [M+H]+: hipericina ( 505,4 Da),
pseudohipericin (521 ,1 Da), protopseudohipericin (523,1 Da); florogluc inoli (hiperforina 537,4
Da) și rutin (610,1 Da).
F

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

126

Fig.II.4.2 . Spectrul de masă al extractului alcoolic (50%) al speciei H. perforatum în
domeniul de masă 400-900 Da

Prezența semnalelor de la m/z 497,9 ; 775,9 ; 1049,9 ; 1324,3 și 1600 Da observate în
spectrele de mas ă MALDI ale speci ei G . verum (Fig. II.4.3. ) indică exitența unor structuri de tip
fisetinidin legate. De asemenea s -au putut identifica și urme de pinoresinol ( 358,5 Da) și acid
ursolic (457,0 Da).

Fig.II.4.3. Spectrul MALDI al extractului al coolic (70%) al speciei G . verum

În spectrele MALDI ale extractelor etanolice ale speciei O. vulgare, în special extractul
etanolic de 70% , s-a observat și un semnal la m/z 716,2 Da corespunzător compusului theaflavin
3-galate (Figura II.4.4 .).

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

127

Fig.II.4.4. Spectrul MALDI al extractului etanolic (70%) de O. vulgare în domeniul
de masă 250-750 Da
În concluzie, extractele speciilor analizate au prezentat compu și comuni (C / EC, EGC,
EGCG, ECG) dar și compuși diferiți, specifici fiec ărei specii (isorhamneti n, galloyl, fisetinidin,
hipericina, pseudohipericin, protopseudohipericin, floroglucinoli, rutin, pinoresinol, acid ursolic,
theaflavin 3 -galate) . Aceste rezultate obținute prin tehnica MALDI -TOF au confirmat unele date
obținute anterior prin metoda LC -APCI-MS [271]. Astfel se poate considera că tehnica MALDI –
TOF este potrivită at ât pentru identificarea și caracterizarea taninurilor din extractele vegeta le cât
și pentru determinarea originii botanice; în plus , tehnica MALDI -TOF prezintă unele avantaje și
anume: metoda este simplă și rapidă (1,5 min) și pentru prepararea probei se folosesc cantită ți
foarte mici de reactivi (c âțiva L).

II.4.3.2. Dezvoltarea și validare a metodei MEKC
Metoda MEKC a fost aplicată pentru analiza cantitativă a taninurilor identificați ulterior
prin tehnica MALDI -TOF. M etoda a pornit de la tehnica descrisă de Bonoli și colaboratorii
(2001 ) cu unele modificări [362 ].
Pentru a obține o rezoluție mai bun ă a compuși lor și pentru a înțelege comportamentul
acestora, trebuie să cunoaștem structura analiților (mărimea și sarcina) dar și efectele soluției de
electrolit (compoziția chimică, pH -ul și vâscozitatea). Valoarea pH -ului tamponului de migrare
trebuie să fie bine controlată deoarece ea poate influența mobilitatea electroforetică și rezoluți a
compușilor. În studiul nostru au fost testa te diferite valori ale pH -ului cuprinse între 2,0 si 9,3,

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

128
valoarea de pH optimă fiind 7,0. Au fost testate diferite concentrații de SDS cuprinse între 0,9 și
200 mM, la pH 7,0, iar concentrația finală optimă a fost stabilită la 66 ,7 mM , deoarece acesta
oferă o separare mai bună a compușilor. Pent ru a evita denaturarea micelară a fost adăugat în
soluția tampon metanol și acetonitril în concentrații cuprinse între 5 și 15%. Prin adăugarea de
modificatori o rganici s -a observat că picurile nu au fost bine separate. De asemenea, parametrii
instrumentali (lungimea coloanei capilare și tensiunea aplicată) joacă un rol important în
procesul de separare. Creșterea lungimii capil arei mărește timpul de separare iar analiții pot fi
mai bine separa ți. Totodată, tensiunea mică poate conduce la o separare mai bună a compușilor.
Au fost testate capilare cu lungimi to tale cuprinse între 50 și 11 2 cm precum și tensiuni diferite
(26, 28 și 30 kV ) aplicate pentru fiecare colo ană capilară. În urm a testelor efectuate s-a observat
că cea mai bună separare a fost obținută utilizând capilara cu lungimea totală de 72 cm și
tensiunea aplicat ă de 30 kV .
Metoda cromatografică electrocinetică micelară propusă a fost validată parțial (liniaritate,
limite de detecție și cuantificare, repetabilitate, re productibilitate și exactitate).
Picurile compușilor analizați au fost identificați prin adi ție standard și prin compararea
timpilor de retenție a acestora cu cele ale standardelor . Datele pr elucrate cu ajutorul programului
ChemStation (Agilent, Germania) au demonstrat faptul c ă, compușii analizați au fost de puritate
ridicată (≤ 96%). Electrocromatogramele au fost înregistrate la 210 nm.
Liniaritatea a fost investigată în int ervalul de conce ntrații 2,0 si 6 0,0 µg mL-1. Domeniul
de liniaritate a fost determinat pentru intervalul 2,0 si 40,0 µg mL-1. Coeficientul de determinare
(r2) pentru toți compușii analizați a fost mai mare decât 0,9986, ceea ce confirmă o bună
proporționalitate între aria picului și concentrația compușilor. Valorile limitelor de detec ție
(calculate ca fiind 3x S/Z ) au variat între 0,0032 µg mL-1 și 0,0153 µg mL-1. Valorile limitelor de
cuantificare (calculate ca fiind 10x S/Z ) au fost între 0,0096 µg mL-1 și 0,0466 µg mL-1. Datele
obținute pentru limitele de detec ție și cele de cuantificare indic ă faptul că metoda prezint ă o bună
sensibilitate. În Tabelul II.4.1 sunt prezentați parametri i de performanț ă a metodei MEKC.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

129
Tabelul II.4.1. Parametrii de performanță ai meto dei MEKC
Compus Coeficient
determinare (r2) Liniaritate
(µg mL-1) LOD
(µg mL-1) LOQ
(µg mL-1)
C 0,9990 2-40 0,0153 0,0466
EGC 0,9995 2-40 0,0075 0,0230
EGCG 0,9986 2-40 0,0032 0,0096
ECG 0,9997 2-40 0,0132 0,0435
EC 0,9994 2-40 0,0051 0,0152

Preciz ia a fost demonstrat ă prin teste de repetabilitate și reproductibilitate . Repetabilitatea
a fost testată prin analiza a șase răspunsuri (n=6) obținute succesiv în aceeasi zi ale amestecului
de standarde de concentrație diferit ă (5 µg mL-1, 10 µg mL-1 și 20 µg mL-1). Reproductibilitatea a
fost testată prin 6 injecții succesive ale amestecului de standarde pe parcursul a trei zile (3xn=6).
Rezultatele experimentale au arătat o bună precizie a metode i. Deviația standard relativă a fost
cuprinsă între 0,03 % (EGC) și 1,10 % (EC) pentru repetabilitate și între 0,16% (ECG) și 1,20%
(EGC) pentru reproductibilitate. Valorile repetabilit ății și reproductibilit ății metodei sunt
prezentate în Tabelul II.4.2.

Tabelul II.4.2. Valorile repetabilit ății și reproductibilit ății medodei MEKC
Compus Conc.
teoretic ă
(µg mL-1) Conc.
detectat ă
(µg mL-1) RSDa
(%, n=6) Conc.
detectat ă
(µg mL-1) RSDb
(%,3x(n=6)
C 5 5,07 0,11 5,05 0,32
10 10,02 0,25 10,05 0,44
20 20,03 0,35 20,00 0,50
EGC 5 4,99 0,03 5,02 0,38
10 10,03 0,17 9,97 1,20
20 20,02 0,25 10,02 0,93
EGCG 5 5,04 0,15 4,99 0,35
10 9,99 0,45 10,07 0,76
20 20,10 0,27 20,00 0,42
ECG 5 5,04 0,10 5,00 0,16
10 10,02 0,92 10,08 0,25
20 20,09 0,84 20,02 0,48
EC 5 5,03 1,10 5,02 0,24

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

130
10 10,08 0,19 10,06 0,73
20 20,06 0,08 19,99 0,26
a-Repetabilitate; b-Reproductibilitate;

Exactitatea metodei analitice a fost demonstra tă prin testele de reg ăsire. Valorile de reg ăsire a
compușilor de interes au fost determinat e prin utilizarea unei probe diluat e de G . verum la care s –
au adăugat concentra ții cunoscute de standarde (4 µg mL-1, 8 µg mL-1și 12 µg mL-1). Regăsirea
(%) = ( Concentrația detectată / Concentrația adăugată)*100. Pentru fiecare nivel de reg ăsire s -a
realizat fiecare analiz ă în triplica t. Rezul tatele au fost cuprinse între 94, 25% pentru EGC și
102,50% pentru EGCG. Valorile de reg ăsire ale compușilor sunt prezentate în Tabelul II .4.3.

Tabelul II.4.3. Valorile testelor de reg ăsire

Rezultatele obținute au fost compar ate cu alte date din literatur a de specialitate iar
metoda descrisă MEKC a arătat o precizie mai bună decât alte metode cromatografice (HPLC,
CZE și MEEK). Câteva metode de analiză a taninurilor din diferit e extracte sunt prezentate în
Tabelul II.4.4 .

Compus Conc. ad ăugat ă
(µg mL-1) Conc. detecta tă
(µg mL-1) Regăsire
(%, n=3)
C 4 3,89 97,25
8 7,90 98,75
12 12,19 101,58
EGC 4 3,96 99,00
8 7,54 94,25
12 11,57 96,42
EGCG 4 4,03 100,75
8 7,65 95,63
12 12,30 102,50
ECG 4 3,78 94,50
8 7,75 96,88
12 11,36 94,66
EC 4 3,91 97,75
8 8,05 100,63
12 12,13 101,08

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

131
Tabelul II.4.4. Metode utilizate pentru analiza cantitativă a taninurilor comparativ cu
metoda dezvol tată
Proba Analiți Timp
(min.) Tehnica LOD
(µg mL-1) Referințe
Extract ceai
verde, oolong,
ceai negru Acidul galic,
teobromin, EGC, C,
cafeina, 8 –
cloroteofilin, EC,
EGCG, GCG, ECG 48 min. HPLC 0,04-1,38 [363]
Extract de ceai
verde, negru,
oolong C, EC, GC,EGC, CG,
ECG, GCG, EGCG,
cafeina 7 min. HPLC 0,11-0,29 [364]
Extract de ceai
verde Cafeina, adenina,
teofilina, EGCG,
EGC, EC, C, acidul
galic, quercetin,
acidul cafeic 20 min. CZE 0,20-0,50 [365]
Extract de ceai
verde chinezesc,
eai verde indian,
ceai verde organic
indian C, EC, EGC, GC,
EGCG, ECG, cafeina,
teofilina 12 min. MEEKC 0,30-6,61 [366]
Extract de ceai
rosu, ceai alb, ceai
verde, ceai negru,
cacao, hamei EGC, C, EGCG, EC,
GCG, ECG, CG,
quercetin, timol 14 min. MEKC 0,618 -1,93 [367]
Extract de ceai
verde, ceai negru,
ceai Pu -erh EGCG, EGC, GCG,
EC 20 min. MEKC 1,00-2,50 [368]

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

132
Extract de C.
officinalis , H.
perforatum , G .
verum , O. vulgare C, EGC, EGCG, ECG,
EC 12 min. MEKC 0,003 –
0,015 Metoda
prezentă

II.4.3.3. Analiza probelor reale prin MEKC
Există câteva rapoarte furnizate de literatura de specialitate privind determinarea
simultană a taninurilor din diverite tipuri de extracte vegetale . Este cunoscut faptul că dintre
toate tipurile de ceai Camellia sinensis este planta cea mai studiată pentru co nținutul său bogat în
catechine [369, 370 ]. Din cunostin țele noastre este prima dat ă când este utilizată metoda de
cromatografie electrocinetic ă micelară pentru separarea și cuantificarea taninurilor din extractele
speciilor C. officinalis , H. perforatum , G . verum și O. vulgare . În general, nu prea s -au studiat
taninurile din alte plante decât ceai urile (verde și negru).
Analiza extractele apoase, etanolice și acetonice ale extractelor vegetale ( C. officinalis , H.
perforatum , G . verum și O. vulgare ) a arătat faptul c ă în funcție de mediul de extracție conținutul
în compuși a variat mult de la o prob ă la alta (Tabelul II.4.5. ).
În Fig.II.4.5 . sunt prezentate electrocromatogramele amestecului de standarde și ale
extractelor vegetale.

020406080100120140
5 7 9 11 13 15
Time (min)mAU
1
2 3 4 5
A B C D E

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

133
Fig.II.4.3. Electrocromatogramele: A-amestec de standarde (1 -C, 2-EGC, 3 – EGCG, 4 –
ECG, 5 -EC); B – C. officinalis (infuzie); C – G . verum (infuzie); D – O. vulgare (extract alcoolic
30%); E – H. perforatum ( extract apos)
Componenta majoră din extractele de C. officinalis este EGCG a c ărei concentra ție a
variat între 132,70 µg g-1 m.u. în infuzie și 370,43 µg g-1 m.u. în extractul etanolic de 30%. Cea
mai mare cantitate de epicatechin ă a fost identificată în extractul etanolic de 50% iar în extractul
etanolic de 70% a fost detectată cea mai mare concentrație de EGC (230,01 µg g-1 m.u.).
Comparativ cu celelalte plante studi ate specia C. officinalis prezintă concentrații scăzute de
catechine.
În ext ractele speciei H perforatum , cea mai mare cantitate de EGCG a fost identificată în
extractul etanolic de 30% (1614,73 µg g-1 m.u.) urmat de extractul etanolic 70% (1388,74 µg g-1
m.u.), extractul apos (1208.49 µg g-1m.u.), extractul acetonic (544,24 µg g-1 m.u.), infuzie
(204,12 µg g-1 m.u.) și extractul etanolic 50% (79,53 µg g-1 m.u.).
Toți ceilalți compuși au prezentat concentrații importante în extractele speciei H. perforatum (de
exemplu, C cu 38, 89 µg g-1 în extractul acetonic; EGC cu 862,80 µg g-1 în infuzie și extractul
etanolic de 70 % (949,51 µg g-1); ECG cu 749,67 µg g-1 în extractul etanolic de 50% și EC cu
850,4 µg g-1 în infuzie).
În extractele plantei G . verum doar catechina a fost găsită în concentrații semnificative în
extractul acetonic (1222,32 µg g-1 m.u.) și EGCG în extractul etanolic de 70% (1529,47 µg g-1
m.u.).
Datele cantitative obținute au arătat că extractele de O. vulgare prezintă un conținut
ridicat de EG CG atât în infuzie c ât și în extractul acetonic și extractul etanolic de 30% (de
exemplu 17947,66 µg g-1 m.u. în extractul acetonic, fiind cea mai mare cantitate detectată).
Ceilalți compuși au fost observați în conc entrații importante în extracte cum ar fi: EC în
extractul etanolic de 50% (2032,31 µg g-1 m.u.); C și EGC în extractul etanolic de 70% (8012,33
și respectiv 2977,29 µg g-1 m.u.) și ECG în extractul acetonic (2489, 55 µg g-1 m.u.).
În urma datelor cantitative obținute putem afirma că mediul de e xtracție are un rol
important în extragerea cât mai f idelă a catechinelor din plantele studiate. Concentrații
importante de catechine au fost obținute în special în extractele etanolice și anume în extractul
etanolic de 50% de C. officinalis , extractul eta nolic de 70% de H. perforatum dar și în extractele
acetonice de O. vulgare și G . verum. În extractele apoase, se poate observa că EGCG se găsește

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

134
într-o cantitate mare în extractele de C. officinalis , H. perforatum și G . verum dar și în infuzia
speciei O. vulgare .
Catechina a fost prezentă în cantități importante în extractele apoase de C. officinalis , H.
perforatum și G . verum iar epicatechina în extractele de H. perforatum (infuzie și extract apos)
precum și în extractul apos de G . verum .
Deși conținutul de catechine identificat în extractele plante lor folosite în medicina
tradițională este mic în comparație cu nivelul de catechine raportat în extrac tele de ceai verde
(168,96 µg mL-1) [371] trebuie remarcat faptul că aceste plante au proprietăți terapeuti ce
remarcabile.

Tabelul II.4.5. Conținutul de catechine din extractele vegetale prin metoda MEKC
(µg g-1 m.u.)
Planta Extract C EGC EGCG ECG EC
C.
officinalis Apos 45,91 35,39 319,95 29,37 27,79
Infuzie 55,44 106,60 132,70 262,66 4,16
Acetonic 39,28 184,67 173,16 23,24 52,82
Etanolic 30% 12,08 93,93 370,43 130,34 22,74
Etanolic 50% 65,36 93,94 299,22 59,42 657,88
Etanolic 70% 30,61 230,01 253,07 543,01 5,98
H.
perforatum Apos 203,06 34,98 1208,49 225,64 295,05
Infuzie 74,28 862,80 204,12 80,32 850,40
Acetonic 387,89 268,48 544,24 38,78 259,03
Etanolic 30% 38,90 53,74 1614,73 222,58 272,78
Etanolic 50% 108,20 782,30 79,53 749,67 62,02
Etanolic 70% 183,45 949,51 1388,74 47,10 5,94
G. verum Apos 519,81 58,41 330,57 20,40 133,44
Infuzie 238,80 42,12 10,93 61,80 0,15
Acetonic 1222,32 191,59 125,07 36,37 49,92
Etanolic 30% 23,76 66,25 64,50 52,36 24,44
Etanolic 50% 9,27 75,24 302,14 662,71 29,47
Etanolic 70% 20,50 34,95 1529,47 184,76 37,64
O. vulgare Apos 3,42 58,27 79,71 5,55 5,51
Infuzie 53,10 99,39 843,60 82,32 35,00
Ecetonic 905,26 238,35 17947,66 2489,55 125,44
Etanolic 30% 531,55 158,17 1536,36 28,84 250,48
Etanolic 50% 129,77 1978,33 833,77 4,88 2032,31
Etanolic 70% 8012,33 2977,29 263,43 636,34 139,17
C-(+)-catechina; EGC -(-)-epigalocatechina ; EGCG – (-)-galat de epigalocatechină ; ECG -(-)-
galat de epicatechină ; EC- (-)-epicatechina;

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

135

II.4.4. Concluzii
 Au fost testate diferite medii de extrac ție pentru ob ținerea unor extracte ale
plantelor C. officinalis , H. p erforatum , G . verum și O. vulgare cu un con ținut
ridicat în taninuri .
 Spectrele de masă înregistrate prin tehnica MALDI -TOF au fost folosite pentru
identificarea componentelor predominante (catechina/ epicatehina,
epigalocatechina, galat de epigalocate chină și galat de epicatechină), a celorl alte
componente (fisetinidin, isor amnetin) precum și a zaharurilor lega te de
componentele predominante .
 Avantajul major al t ehnicii MALDI -TOF este că oferă în timp foarte scurt (1,5
min.) informații calitative și sem i-cantitative .
 Metoda MEKC e ste simplă, rapidă și a dovedit o lin iaritate (2-40 µg mL-1),
precizie (repetabilitatea cuprinsă între 0,03 -1,10% RSD; reproductibilitate cu
valori cuprinse între 0,16 si 1,20 % RSD ) și sensibilitate bună (LOD: 0,0032 –
0,0153 µg mL-1; LOQ: 0,0096 -0,0466 µg mL-1) pentru analiza catechinelor din
diferite tipuri de extracte vegetale .
 Datele cantitative obținute au arătat faptul că extractele etanolice (în special cele
de 70%) prezintă con centrații mai mari de taninuri; extractul etanol ic 70% al
speciei Origanum vulgare are cel mai mare conținut în taninuri .
 Din informațiile noastre este pentru prima dată când catechinele găsite în
extractele plantelor medicinale C. officinalis , H. perforatum , G . verum și O.
vulgare au fost analizate folosind tehnicile MALDI -TOF și MEKC sau orice altă
tehnică .

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

136
III. CONCLUZII GENERALE
Partea de cercetare prezentat ă în această lucrare a constat în caracterizarea analitică a unor
extracte (apoase, etanolice și acetonice) ale plantelor Calendula offici nalis , Hypericum
perforatum , Galium verum și Origanum vulgare din punct de vedere al conținutului în substanțe
active , în special compuși polifenolici , prin dezvoltare a unor metode analitice performante.

Concluziile părții originale ale tezei au fost:

 Au fost caracterizate extractele apoase ș i etanolice (30%, 50% și 70%) ale plantelor C.
officinalis , H. perforatum , G . verum și O. vulgare pentru determinarea conținutului în
compuși polifenolici .
 S-a demonstrat c apacitatea antioxidantă a extractele vegetal e utilizând metodele cu
radicalii ABTS și DPPH .
 A fost dezvoltată o metodă nouă RP-HPLC -DAD pentru separarea și cuantificarea
polifenolilor din extractele vegetale.
 S-a demonstrat ca metoda cromatografică validată parțial prezintă sensibilitate bună (0,05
µg mL-1 și 0,25 µg mL-1), este repetitivă (RSD %, 0,11-2,77%), reproductibilă (RSD % a
variat între 0,37% și 1,95 %) și exactă (valorile de regăsire a u fost cuprinse între 97,66%
și 104,50% ).
 Prin a naliza RP-HPLC s-a evidențiat faptul că extractele etano lice (în special extractele
etanolice 50%) au prezentat valori mai ridicate în ceea ce privește conținutul în acizi
fenolici și flavonoide comparativ cu extractele apoase.
 Au fost analizate comparativ pentru prima dată extractele etanolice ale plantelor C.
officinalis , H. perforatum , G . verum și O. vulgare , obținute în laborator și extractele
comerciale ( C. officinalis , H. perforatum și G . verum ).
 A fost dezvoltat ă și validată o m etodă nouă LC-MS pentru cuantificarea polifenolilor din
extractele vegetale.
 Metoda LC -MS este sensibil ă (cu limite de detecție cuprinse între 0,05 și 0,28 µg mL-1 și
limite de cuantificare cuprinse între 0,18 și 0,93 µg mL-1), repetitiv ă (0,09 -1,44 % RSD),
reproductibil ă (0,48 -2,82 % RSD) și exact ă (95,84 -103,20 %).

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

137
 S-a evidențiat faptul că extractele etanolice preparate în laborator prezintă concentrații
mai ridicate de compuși polifenolici comparativ cu extractele comerciale.
 Prin a naliza LC -MS a extractelor etanolice s-a demonstrat faptul că extractele păstrate la
temperatura de 40 C prezintă concentrații mai mari de compuși polifenolici comparativ cu
extractele dep ozitate la temperatura camerei.
 Au fost utilizate diferite medii de extracție care a permis ob ținerea unor extracte apoase
și etanolice (30%, 50% și 70%) cu un con ținut ridicat în compu și biologic activi.
 A fost dezvoltat ă o metodă electroforetică nouă (CZE) pentru cuantificarea polifenolilor;
metoda CZE este sensibil ă (LOD, 0,06-1,38 µg mL-1), repetitiv ă (RSD ≤ 5,09%),
reproductibil ă (RSD ≤ 5,07% ) și exactă (86,66% -101,54%).
 S-a demonstrat pentru prima dată prezen ța unor compu și (de exemplu: naringenin în
extractele de C. officinalis , naringenin în extractele de H. perforatum , naringenin, acidul
sinapic și acidul siringic în extractele de G . verum și acidul sinapic în e xtractele de O.
vulgare) în extractele plantelor studiate.
 Au fost testate diferite medii de extracție pentru obținerea unor extracte ale plantelor C.
officinalis , H. perforatum , G . verum și O. vulgare cu un conținut ridicat în taninuri.
 Au fost înregistrate pentru prima dată spectrele de masă (MALDI -TOF) pentru
identificarea componentelor predominante și a celorlalte componente din extractele
vegetale studiate.
 A fost dezvoltat ă și validată parțial o metodă nouă MEKC pentru separarea și
cuantificarea cate chinelor din diferite tipuri de extracte vegetale .
 S-a demonstrat c ă metoda MEKC este simplă, rapidă și a dovedit o liniaritate (2 -40 µg
mL-1), precizie (repetabilitatea cuprinsă între 0,03 -1,10% RSD; reproductibilitate cu
valori cuprinse între 0,16 si 1,2 0% RSD) și sensibilitate bună (LOD: 0,0032 -0,0153 µg
mL-1; LOQ: 0,0096 -0,0466 µg mL-1) .
 Analiza MEKC a demonstrat faptul că extractele etanolice (în special cele de 70%)
prezintă concentrații mai mari de taninuri; extractul etanolic 70% al speciei Origan um
vulgare are cel mai mare conținut în taninuri.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

138
Articole publicate în reviste cotate ISI:
 Alina O. D ănilă, F. Gatea, G.L. Radu , Polyphenol composition and antioxidant activity
of selected medicinal herbs, Chemistry of Natural Compounds, vol.47, no.1 , pp. 22 -26,
2011, doi: 0009 -3130/11/4701 -0022, IF: 0,5 09
 Alina O. Matei , Florentina Gatea, G.L. Radu , Analysis of phenolic compounds in some
medicinal herbs by LC -MS, Journal of Chromatographic Science, vol. 53, pp. 1147 -1154 ,
doi:10.1093/chromsci/bmu177 , 2015, IF : 1,3 63
 Florentina Gatea, Eugenia D.Teodor, Alina O. Matei , Georgiana I. Badea, Gabriel L.
Radu, Cappilary electrophoresis method for 20 polyphenols separation in propolis and
plant extracts, Food Analytical Methods, vol. 8, no.5, pp. 1197 -1206,
doi:10.1007/s12161 -014-0006 -5, 2014, IF : 1,956
 Florentina Gatea, Eugenia D. Teodor, Gabriela Paun, Alina O. Matei , Gabriel L. Radu,
Cappilary electrophoresis method validation for organic acids assessment in probiotics,
Food Analytical Methods , doi:10.1 007/s12161 -014-0018 -1, vol. 8, no. 5, pp. 1335 -1340,
2014, IF : 1,956
 Florentina Gatea, Alina O. Matei , Eugenia D. Teodor, Gabriel L. Radu, Accurate
quantitation of 17 polyphenols from propolis extracts by reversed -phase liquid
chromatography with diode a rray detection, Revue Roumaine de Chimie, vol. 59, no.9,
pp. 797 -805, 2014, IF : 0,311
 Florentina Gatea, Alina O. Matei , Eugenia D. Teodor , Gabriel L., Radu Antioxidant
properties and polyphenols composition of some Roumanian propolis samples, Revue
Roumaine de Chimie, vol. 60, no. 1, pp. 65 -74, IF: 0,311
 Alina O. Matei , Florentina Gatea, Eugenia D. Teodor, Gabriel L. Radu, Tannins an alysis
from different medicinal plants extracts using MALDI -TOF and MEKC , Chemical
Papers (manuscript submitted), IF: 1,46 8
 Alina O. Matei , Florentina Gatea, Eugenia D. Teodor, Gabriel L. Radu, Polyphenols
analysis from different medicnal plants extracts using capillary electrophoresis, Revista
de Chimie (manuscript submitted), IF: 0,810

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

139
Articol indexat BDI
 Alina O. Matei , Florentina Gatea, Andreia Alecu, G.L.Radu, Total polyphenolic content
and antioxidant activity from anthocyanin extracts, U.P.B. Sci. Bull., Series B, vol. 77,
no. 2, ISSN 1454 – 2331 , 2015
Comunic ări științifice
 Alina O. D ănilă, Florentina Gatea, Gabrie l L. Radu , Bioactive constituents and
antioxidant activity of some medicinal herbs extracts, 7th Joint Meeting of AFERP, ASP,
GA, PSE & SIF, Athens, 2008.
 Florentina Gatea, G abriela Paun , Alina O. Dănilă, Maria Ichim , Characterization of
Echinaceea fracti ons obtained by an ultrafiltration preoces, 7th Joint Meeting of AFERP,
ASP,GA, PSE & SIF, Athens, 2008.
 Cristina Mateescu, Florentina Gatea, Alina O. Dănilă, Gabriel L.Radu, Antioxidant
activity constituents of ethanolic propolis extracts from Romanian market, 41th
Apimondia Congress, Montpellier, 2009.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

140
IV. BIBLIOGRAFIE
1. Muley B.P., Khadabadi S.S., Banarase N.B., Phytochemical constituents and
pharmacological activities of Calendula officinalis Linn (Asteraceae): A review, Tropical
Journa l of Pharmaceutical Research, 8 (5), pp: 455 -465, 2009
2. Păun E., Mihalea A., Dumitrescu A.,Tratat de plante medicinale și aromatice cultivate,
Editura Academiei București, 1988
3. Pârvu C ., Enciclopedia plantelor – mica enciclopedie, Editura Tehnică, București , 2000
4. Muntean L.S ., Tratat de plante medicinale cultivate și spontane. Editura Risoprint Cluj –
Napoca, 2007
5. Mohan G., Mică enciclopedie de plante medicinale și fitoterapie, Editura Corint, 2000
6. http://academic.ev ergreen.edu
7. European Scientific Cooperative on Phytotherapy (ESCOP). Monographs on the
medicinal uses of plant drugs, 1997
8. Fischer F., History of Calendula , http://www.gardenguides.com
9. Gilman E.F., Howe T., Calendula officinalis , Pot Marigold, Institute o f Food and
Agricultural Sciences, University of Florida, Gainesville, 2011.
10. Mohammad S.M., Kashani H.H., Pot marigold ( Calendula officinalis ) medicinal usage
and cultivation. Scientific Research and Essays vol. 7, pp. 1468 -1472, 2012
11. http://www.aliphia.ro
12. Constantinescu G., Hațeganu – Buruiană E., Să ne cunoaștem plantele medicinale,
proprietățile lor terapeutice și modul de folosire, Editura Medicală București, 1986
13. Bako E., Deli J., Toth G., HPLC study on the caroteno id composition of Calendula
products. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, vol. 52, pp. 241 -250, 2002
14. Goodwin T.W., Studies in carotenogenesis: the carotenoids of the flower petals of
Calendula officinalis , Biochemical Journal, vol. 58, pp. 90 -94, 1954
15. Adler G., Kasprzyk Z., Free sterols, steryl esters, glycosides, acelyted glycosides and
watersoluble complexes in Calendula officinalis , Phytochemistry, vol. 14, pp. 627 -631,
1975
16. Wilkomirski B., Kasprzyk Z., Free and ester -bound triterpene alcoho ls and sterols in
calendula flowers, Phytochemistry, vol. 18, pp. 253 -255, 1979

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

141
17. Wilkomirski B., Pentacyclic triterpene triols from Calendula officinalis flowers,
Phytochemistry, vol. 24, pp. 3066 -3067, 1985
18. Zittwel -Eglseer K., Sosa S., Jurenitsch J., Schub ert- Zsilavecz M., Loggia R.D., Tubaro
A., Bertoldi M., Franz C., Antioedematous activities of the main triterpenoid esters of
marigold ( Calendula officinalis L .), Journal Ethnopharmacology, vol. 57, pp. 139 -144,
1997
19. Wojciechowski Z., Bochenska -Hryniewicz M., Kurcharezak B., Kasprzyk Z., Sterol and
triterpene alcohol esters from Calendula officinalis , Phytochemistry, vol. 11, pp. 1165 –
1168, 1972
20. Sliwowski J., Dziewanowska K., Kasprzyk E., Ursadiol: a new triterpene diol from
Calendula officinalis flowers, Khim Prom Soedin Journal, vol 12, pp. 157 -160, 1973
21. Eitterl -Eglseer K., Reznicek G., Jurenitsch J., Novak J., Zitterl W., Franz C.,
Morphogenetic variability of faradiol monoesters in marigold Calendula officinalis L ,
Phytochemical Analysis, vo. 12, pp. 19 9-201, 2001
22. Neukiron H., D’Ambrosio M., Dovia J., Guerriero A., Simultaneous quantitative
determination of eight triterpenoid monoesters from flowers of 10 varieties of Calendula
officinalis L . and characterisation of a new triterpenoid monoester, Phytoche mical
Analysis, vol. 15, pp. 30 -35, 2004
23. Ukiya M., Akihisa T., Yasukava K., Tokuda H., Suzuki T., Kimura Y.,
Antiinflammatory, anti -tumor – promoting and cytotoxic activities of constituents of
Marigold ( Calendula officinalis ) flowers, Journal of Natural Pr oducts, vol. 69, pp. 1692 –
1696, 2006
24. Vecherko L.P., Zinkevich E.P., Libizov N.I., Ban’kooskii A.I., Calenduloside A from
Calendula officinalis , Khim Prom Soedin Journal, vol. 5, pp. 58 -59, 1969
25. Vecherko L.P., Kabanov U.S., Zinkevich E.P., Kogan L.M., The structure of
calenduloside B from the roots of Calendula officinalis , Khim Prom Soedin Journal, vol.
4, pp. 533, 1971
26. Vecherko L.P., Sviridov A.F., Zinkevich E., Kogan L.M., Structures of calenduloside g
and h from the roots of Calendula officinalis , Khi m Prom Soedin Journal, vol. 4, pp.
532-534, 1974

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

142
27. Vecherko L.P., Sviridov A.F., Zinkevich E.P., Kogan L.M., The structure of
calenduloside C and D from the roots of Calendula officinalis , Khim Prom Soedin, vol. 3,
pp. 66 -73, 1975
28. Ruszkowski D., Szakiel A., Janiszowska W., Metabolism of [3 -3H] oleanolic acid in
Calendula officinalis L . roots, APP, vol. 25, pp. 311 -317, 2003
29. Wojciechowski Z., Jelonkiewicz -Konador A., Tomaszewski M., Jankowski J., Kasprzyk
Z., The structure of glucosides of oleanolic acid isol ated from the roots of Calendula
officinalis flowers, Phytochemistry, vol. 10, pp. 1121 -24, 1971
30. Vidal -Ollivier E., Balansard G., Revised structures of triterpenoid saponins from the
flowers of Calendula officinalis, Journal of Natural Products, vol. 52, n o. 5, pp. 1156 –
1159, 1989
31. Kurkin V.A., Sharova O.V., Flavonoids from Calendula officinalis flowers, Khim Prom
Soedin Journal, vol. 2, pp. 179 -180, 2007
32. Vidal -Ollivier E., Flavonol glycosides from Calendula officinalis flowers, Planta Medica,
vol. 55, pp. 73-73, 1989
33. Agatonovic –Kustrin S., Loescher M. C., Qualitative and quantitative high performance
thin layer chromatography analysis of Calendula officinalis using high resolution plate
imaging and artificial neural network data modeling, Analytica Chimic a Acta, vol. 798,
pp. 103–108, 2013
34. Okoh O.O., Sadimenko A.A., Afolayan A.J., The effects of age on the yield and
composition of the essential oils of Calendula officinalis , Journal of Applied Sciences,
vol. 7, no. 23, pp. 3806 -3810, 2007
35. Abajova R.L., As lanov S.M., Mamedova M.E., Amino acids of Calendula officinalis ,
Chemistry of Natural Compounds, vol. 30, no. 15, pp. 641 -641, 1994
36. Varlijen J., Structural analysis of rhamnoarabinogalactans and arabinogalactans with
immunostimulating activity from Calendu la officinalis , Phytochemistry, vol. 28, pp.
2379 -2383, 1989
37. Wagner H., Proksch A., Riess -Maurer I., Vollmar A., Odenthal S., Stuppner H., Jurcic
K., Le Turdu M., Fang J., Immunstimulierend wirkende p olysaccharide (Heteroglykane)
aus höheren Pflanzen, Arzn eimittel -Forschung, vol 7, pp. 1069 –1075, 1985

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

143
38. Vlchenko N.T., Glushenkova A.I., Mukhamedova K.S., Lipids of Calendula officinalis ,
Chemistry of Natural Compounds, vol. 34, no. 3, pp. 272 -274, 1998
39. Badami R.C., Morris L. J., The oxygenated fatty acid of cal endula seeds oil, The Journal
of the American Oil Chemist’s Society, vol. 42, pp. 1119 -1121, 1965
40. Kerkach A.I., Komissarenko N.F., Chernobai V.T., Coumarines of the inflorescences of
Calendula officinalis and Helichrysum arenarium , Khim Prom Soedin Journal , vol. 6, pp.
777, 1986
41. Janiszowska W., Michalski W., Kasprzyk Z., Polyprenyl quinones and tocopherol in
Calendula officinalis, Phytochemistry, vol. 15, pp. 125 -127, 1976
42. Willuhn G., Westhaus R.G., Loliolide (Calendin) from Calendula officinalis , Planta
Medica, vol. 53, pp. 304 -304, 1987
43. Fleisonner A.M., Plant extracts: To accelerate healing and reduce inflammation,
Cosmetics Toiletries, vol. 45, pp. 100 -113, 1985
44. Komoe H., Hayashi N., Paraffins of the petals of Calendula officinalis , Phytochemistry,
vol. 1 0, pp. 1944 -1944, 1971
45. Iauk L., Lo -Bue A.M., Milazzo I., Rapisarda A., Blandino G., Antibacterial activity of
medicinal plant extracts against periodontopathic bacteria, Phytotherapy Research, vol.
17, pp. 599 -604, 2003
46. Gazim Z.C., Rezende C.M., Fraga S.R. , Svidzinski T.E., Cortez D.G., Antifungal activity
of the essential oil from Calendula officinalis L . (Asteraceae ) growing in Brazil,
Brazilian Journal of Microbiology, vol. 39, pp. 61 -63, 2008
47. Ayub M. A.,Rao J. R., Antimicrobial activity of Calendula off icinalis petal extracts
against fungi, as well as Gram -negative and Gram -positive clinical pathogens,
Complementary Therapies in Clinical Practice , vol. 18, no 3, pp. 173 –176, 2012
48. Mercedea Palacios de Diego, Las tinturas madre homeopáticas de Calendula officinalis y
Echinacea angustifolia como antiséptico oral, Revista Médica de Homeopatía , vol. 6, no.
3, pp. 112 –126, 2013
49. Boucard -Maitre Y., Algernon O., Raynaurd J., Genotoxic and antitumoral activity of
Calendula officinalis extracts, Pharmazie, vol. 43, pp. 220 -221, 1988

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

144
50. Medina E.J., Lora A.G., Paco L., Algarra I., Collado A., Garrido F., A new extract of the
plant Calend ula officinalis produces a dual in vitro effect: cytotoxic antitumor activity
and lymphocyte activation, BMC Cancer, vol. 6, pp. 119 -132l, 2006
51. Fronza M., Heinzmann B., Hamburger M., Laufer S., Merfort I., Determination of the
wound healing effect of Calen dula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts,
Journal of Ethnopharmacology vol. 126, no. 3, pp. 463 –467, 2009
52. Chandran P.K., Kutton R., Effect of Calendula officinalis flower extract on acute phase
proteins, antioxidant defense mechanism and granuloma formation during thermal burns,
Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition, vol. 43, pp. 58 -64, 2008
53. Popovic M., Kaurinovic B., Mimica -Dukic N., Vojinovic -Miloradov M., Cupic V.,
Combined effects of plant extracts and xenobiotics on liposoma l lipid peroxidation, Part
1, Journal of Pharmacy Research, no. 5, pp. 465, 2009
54. Frankic T., Salobir K., Salobir J., The comparison of in vivo antigenotoxic antioxidative
capacity of two propylene glycol extracts of Calendula officinalis (Marigold) and vit amin
E in young growing pigs, Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, vol. 41,
pp. 1 -7, 2008
55. Ahmad H., Khan I., Waihid A., Antiglycation and antioxidation properties of juglans
regia and Calendula officinalis : possible role in reducing diabetic complications and
slowing down ageing, Journal of Traditional Chinese Medicine , vol. 32, no. 3 , pp. 411–
414, 2012
56. Rasu M.A., Tamas M., Puica C., Roman I., Sabadas M., The hepatoprotective action of
ten herbal extracts in CCl4 intoxicated liver, Phytotherapy Research, vol. 19, pp. 744 –
749, 2005
57. Lin L.T., Chiang L., Lin C.C., In vitro antihepatoma activity of fifteen nat ural medicines
from Canada, Phytotherapy Research, vol. 16, pp. 440 -444, 2002
58. Della L.R., Topical anti -inflammatory activity of Calendula officinalis extracts, Planta
Medica, vol. 56, pp. 658 -658, 1990
59. Della L.R., Tubaro A., Sosa S., Becker H., Saar S., Is aac O., The role of triterpenoids in
topical anti -inflammatory activity of Calendula officinalis flowers, Planta Medica, vol.
60, pp. 516 – 520, 1994

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

145
60. Bogdanova N.S., Nikolaeva I.S., Shcherbakova L.I., Tolstova T.I., Moskalenko N.I.,
Pershin G.N., Study of antiviral properties of Calendula officinalis , Farmakol Toksikol
(Moscow), vol. 33, pp. 349, 1970
61. Kalvatene Z., Walder R., Gabzaro D., Anti -HIV activity of extracts from Calendula
officinalis flowers, Biomedicine& Pharmacotherapy, vol. 51, pp. 176 -180, 199 7
62. Mishra A., Mishra K., Chattopadhyay A., Assessment of In Vitro Sun Protection Factor of
Calendula Officinalis L. (Asteraceae) Essential Oil Formulation, Journal of Young
Pharmacists , vol. 4, no. 1, pp. 17 –21, 2012
63. Muhammad A.A., Rao J.R., Antimicrobial activity of Calendula officinalis petal extracts
against fungi, as well as Gram -negative and Gram -positive clinical pathogens.
Complementary Therapies in Clinical Practice . vol. 18, no. 3, pp. 173 –176, 2012
64. Leach M.J., Calendula officinalis and wound healing: A systematic review, Wounds, vol.
20, no. 8, pp. 1 – 7, 2008
65. Casley -Smith J.R., The effects of ‘Unguentum lyphaticum’ on acute experimental
lymphedema and other high -protein edema, Lymphology, vol. 16, pp. 150 -156, 1983
66. Treben M., Sănătate din farmacia Domnului, Editura Hungalibri , pp. 28 -30
67. http://dexro.ro/sinonime /sunătoare
68. Crăciun F., Alexan M., Alexan C., Ghidul plantelor medicinale uzuale , Editura științifică,
București, pag. 116, 1992
69. Csurhes S., Zhou Y, Plant Risk Assessment. Cotton -tails: Froelichia floridana and F.
gracilis . Queensland Government Department of Primary Industries and Fisheries
70. Bone K., Mills S., Principles and Practice of Phytotherapy: Modern Herbal Medicine,
Hardcover, pp. 254 -252, 2013
71. Barnes J., Anderson L.A., Phillipson J.D., St. John’s wort ( Hypericum perforatum L .): a
review of its chemi stry, pharmacology and clinical properties, Journal of Pharmacy and
Pharmacology, vol. 53, pp. 583 -600, 2001
72. Parsons W.T., Cuthbertson E.G., Noxious weeds of Australia, Melbourne, Indata Press.,
pp. 692, 1992
73. Crompton C.W., Hall I.V ., Jensen K.I.N., Hild erbrand P.D., The biology of Canadian
weeds, Hypericum perforatum L. , Canadian Journal of Plant Science, vol. 68, pp. 149 –
162, 1988

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

146
74. GISD Global Invasive Species Database (GISD), Hypericum perforatum (herb) 2007,
www.invasivespecies.net/database/species/eco logy.asp
75. http://www.botanikus.de
76. Briese D., Campbell M., Faithfull I., Best practice management guide for environmental
weeds, Weeds CRC, 2000
77. Davidoiu M., Botanica și fitofarmacie, Curs, Editura Printeuro, 2008
78. Foste r S., Duke J.A.A., Field Guide to Medicinal Plants, Eastern and Central N. America,
Houghton Mifflin Co., 1990
79. Nahrstedt A., Butterweck V., Biologically active and other chemical constituents of the
herb of Hypericum perforatum L., Pharmacopsychiatry vol. 30 (Suppl), pp. 129 -134,
1997
80. Nedesan V., Fitoterapie, Editura Viață și sănătate București, 1998
81. Vanhaelen M., Vanhaelen -Fastre R., Quantitative determination of biologically active
constituents in medicinal plant crude extracts by thin -layer chromatograph y-
densitometry, Journal of Chromatogr aphy, vol. 281, pp. 263 -271, 1983
82. Berghofer R., Holzl J., Bifavonoids in Hypericum perforatum ; Part 1. Isolation of 13,II8 –
biapigenin, Planta Medica , vol. 53, pp. 216 -217, 1987
83. Berghofer R., Holzl J., Isolation of I3, I I8-biapigenin (amentofavone) from Hypericum
perforatum , Planta Medica , vol. 55, pp. 91, 1989
84. Ollivier B., Balansard G., Maillard C., Vical E., Separation et identification des acides
phenols par chromatographie liquide haute performance et spectroscopie ul tra-violette.
Application a' la parietaire ( Parietaria officinalis L.) et au millepertuis ( Hypericum
perforatum L.). Journal de Pharm acie de Belgique ., vol. 40, pp. 173 -177, 1985
85. Hoelzl J., Ostrowski E., St John's wort ( Hypericum perforatum L.), HPLC analy sis of the
main components and their variability in a population, Deutsch Apoth Ztg, vol. 127, pp.
1227 -1230 , 1987
86. Dorossiev I., Determination of favonoids in Hypericum perforatum , Pharmazie, vol. 40,
pp. 585 -586, 1985
87. Newall C.A., Anderson L.A., Phillipso n J.D., Herbal Medicines . A Guide for Health -care
Professionals . 1st edn, London: Pharmaceutical Press,1996

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

147
88. Bisset N.G., Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals, Wichtl M. editor, German edition.
Stuttgart: Medpharm, 1994
89. Mathis C., Ourisson G., Etude chimio -taxonomique du genre Hypericum -II. Identifcation
de constituants de diverses huiles essentielles d' Hypericum , Phytochemistry vol. 3,
pp.115 -131, 1964
90. Brondz I., Greybrok T., Aasen A.J., n-Alkanes of Hypericum perforatum : A revision,
Phytochemistry, vol. 22 , pp. 295 -296, 1983
91. Bombardelli E., Morazzoni P., Hypericum perforatum , Fitoterapia, vol. 66, pp. 43 -68,
1995
92. European Scientific Cooperative on Phytotherapy (ESCOP). Monographs on the
medicinal uses of plant drugs, 1997
93. Psysicians´ desk reference for herb al medicine, 1st edition, Medical Economics,
Montvale, 1998
94. Cracchiolo C., Pharmacology of St. Jon´s wort: botanical and chemical aspects, The
Scientific Reviw of Alternative Medicine, vol. 2, pp. 29 -35, 1998
95. Fegert J.M., Kölch M., Zito J.M., Glaeske G., A ntidepressant use in children and
adolescents in Germany, Journal of Child Adolescent Psychopharmacology, vol. 16,
pp.197–206, 2006
96. Newall C.A., Anderson L.A., Phillipson J.D., Herbal Medicines , A Guide for Health -care
Professionals , 1st edn. London: Pharm aceutical Press, 1996
97. Wright C.W., Gott M., Grayson B., Smith A.G., Sunter A., Neill J.C., Hanna M.,
Correlation of hyperforin content of Hypericum perforatum (St John’s wort) extracts with
their effects on alcohol drinking in C57Bl/6J mice: A preliminary study, Journal of
Psychopharmacology vol. 17, pp. 403 -408, 2003
98. Schempp C.M., Dittmar H.C., Hummler D., Simon -Haarhaus B., Schulte -Mönting J.,
Schöpf E., Simon J.C., Magnesium ions inhibit the antigen -presenting function of human
epidermal langerhans cell s In vivo and In vitro . Involvement of ATPase, HLA -DR, B7
Molecules and Cytokines, Journal of Investigative Dermatology, vol.115, pp. 680 -686,
2000

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

148
99. Fiebich B., Heinrich M., Langosch J.M., Kammerer N., Lieb K., Antibacterial activity of
hyperforin from St John's wort., Lancet, vol. 354, pp. 777, 1999
100. Verjiew M., A watershed on the Rhine: Changing approaches to International
environmental cooperation, Geo Journal, vol.47, no.3, pp.453 -461, 1999
101. Mishenkova E.L., Derbentseva N.A., Garagulya A.D., Litvin L.N., Antiviral properties
of St John's wort and preparations produced from it, Tr S'ezda Mikrobiol Ukraine , pp.
222-322, 1975
102. Wood S., Huffman J., Weber N., Andersen D., North J., Murray B., Sidwell R., Hughes
B., Antiviral activity of naturally occurring anthr aquinones and anthraquinone
derivatives, Planta Medica , vol. 56, pp. 651 -652, 1990
103. Weber N.D., Murray B.K., North J.A., Wood S.G., The antiviral agent hypericin has in
vitro activity against HSV -1 through non -specific association with viral and cellular
membranes, Antiviral Chemistry &Chemotherapy vol. 5, pp. 83 -90, 1994
104. Anon, Hypericin HIV trial in Thailand, Scrip Pharmaceutical Journal, vol. 2019, pp. 25,
1995
105. Agostinis P., Vandenbogaerde A., Donella -Deana A., Pinna L.A., Lee K.T., Goris J.,
Merlevede W., Vandenheede J.R., De Witte P.,. Photosensitized inhibition of growth
factor -regulated protein kinases by hypericin, Biochemical Pharmacology, vol. 26, no.
49, pp. 1615 –1622, 1995
106. Plants For A Future, Plants For A Future Database, www.pfaf.org/database , 2004
107. http://www.eplante.ro/plante -a-z
108. www.farmaciaverde.wordpress.com
109. http://www.webdex.ro/
110. http://www.terapii -alternative.com
111. www.ubio.org
112. http://www.botanical.com
113. www.wildflowershop.co.uk
114. www.blog.bota nicatalog.com
115. ZhengyiW., Raven H. P., Deyuan H., Flora of C hina. vol. 19, 2011
116. http//: www.gallery.nen.gov.uk

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

149
117. Tămaș M., Stana D., Timis S., Comparative phytochemical research of Galium verum
and G. mollugo L., Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj -Napoca, vol. 34, pp. 18–
20, 2006
118. Lakić N., Mimica -Dukić N., Isak J., Božin B., Antioxidant properties of Galium verum
L. (Rubiaceae ) extracts, Central European Journal of Biology, vol. 5, pp. 331–337, 2010
119. Ghiță G., Necula R., Trifan A., Gille E., Zamfirache M.M., Stanescu U., Investigation
regarding the phytochemical study of some samples of Galium verum L. and Galium
album Mill., Analele Stiintifice ale Universitatii “Al. I. Cuza”, Iasi, Biologie vegetal ă,
vol.58, no.1, pp.45 -50, 2012
120. Petar S.M., Stanojević P.L., Rajković M.K., Slavica M.M., Vesna. N.D., Ljubiša
N.B.,Veljković B.V., Antioxidant activity of Galium L. extracts obtained by different
recovery techniques, Journal of Chemistry Industrial, vol. 67 no 1, pp. 89–94, 2013
121. Il′ina T., Kovaleva A., Goryachaya O., Essen tial oil from Galium verum flowers,
Chemistry of Natural Compound, vol. 45, pp. 587–588, 2009
122. Banthorpe D., White J., Novel anthraquinones from undifferentiated cell cultures of
Galium verum , Phytochemistry, vol. 38, pp. 107–111, 1995
123. Zhao C.C., Shao J.H., Xian L., Jing X.,Wang J.H., A new anthraquinone from Galium
verum L ., Natural Product Research: Formerly Natural Product, vol. 20, no. 11, pp. 981 –
984, 2006
124. Rafaëll L., Héron S., Nowik W., Tchapla A., Optimisation of ESI -MS detection for the
HPLC of ant hraquinone dyes, Dyes Pigments, vol. 77, pp. 191 -203, 2008
125. Tucakov J., Healing by plants, Rad, Belgrade, 2006
126. Demirezer Ö., Gürbüz F., Güvenalp Z., Ströch K., Zeek A. , Iridoids, flavonoids and
monoterpene g lycosides from Galium verum subsp. verum , Turkish Journal of Chemistry,
vol. 30, pp. 525 -534, 2006
127. Hemcischi L.A., Contribuții la studiul unor specii indigene de Galium și Ajuga, Teză de
doctorat, Universitatea de Medicină și Farmacie ”Gr. T. Popa” Iași, 2010
128. Mirza M., Najafpour N.M., DiniM., Essential oil of Galium verum L . from Iran,
Reasearch Institute of Forests and Rangelands, Tehran, Iran, vol. 3, no. 2, pp. 88 -88,
2004
129. www.botanical.com

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

150
130. Milić P., Bekrić D., Milić S., Rajković K., A study of the extraction kinetics of the
minerals from the white lady's bedstraw by using an artificial neural network , Journal of
Chemistry Industrial , vol. 65, pp. 313 -321, 2011
131. Mitic V.D., Stankov -Jovanovic V.P., Ilic M.D., Vasiljevic P.J., Zabar A.L., Stojanovic
G.S., The antioxidant, hemolytic and cholinesterase inhibition properties of Galium
verum L. and Tragopogon pratensis subsp. Pratensis , Bulgarian Chemical
Communications, vol. 46, no. 2, pp. 269 -276, 2014
132. Mavi A., Terzi Z., Zgen U., Yildi rim A., Coskun M., Antioxidant properties of some
medicinal p lants: Prangos ferulacea (Apiaceae), Sedum sempervivoides (Crassulaceae),
Malva neglecta (Malvaceae), Cruciata taurica (Rubiaceae), Rosa pimpinellifolia
(Rosaceae), Galium verum subsp. verum (Rubiaceae), Urtica dioica (Urticaceae), Review
Biological and Pharmaceutical Bulletin, vol. 5, no. 27, pp. 702 —705, 2004
133. www. health -from -nature.net
134. Chevallier A., The Encyc lopedia of Medical Plants, DK – New -York, pp. 112, 1996
135. Wichtl M., Bisset N.G., Herbal drugs and p hytopharmaceuticals, Medical and
pharmaceutical Science Publication, Stuttgart, pp. 225 -227, 1994
136. Schmidt M., Polednik C., Roller J., Hagen R., Galium verum aqueous extract strongly
inhibits the motility of head and neck cancer cell lines and protects mucosal keratinocytes
against toxic DNA damage, Spandidod Publications, Oncology Reports, pp. 1296 -1302,
2014
137. Popa V., Ștefan S., Dumitrache R., Vindecare prin gân dire, Tipografia Everest pp. 55,
62, 2001
138. www.sanatatea.ro
139. http://health -from -nature.net
140. www.rhs.org.uk
141. Muñoz Centeno L. M., Plantas medic inales españolas: Origanum vulgare L.
(Lamiaceae) (orégano), Acta Botanica Malacitana, no.27, pp. 270 -280
142. http://www.phytoimages.siu.edu
143. Quiroga R.P., Grosso R.N., Lante A., Lomolino G., Zygadlo J.A., Nepote V., Chemical
composition, antioxidant activity and anti -lipase activity of Origanum vulgare and Lippia

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

151
turbinata essential oils, International Journal of Food Science & Technology, vol. 48, no.
3, pp. 642 -649, 2013
144. D'Antuono L.F., Galletti C.G., Bocchini P., Variability of Essential Oil Content and
Composition of Origanum vulgare L. Populations from a North Mediterranean Area
(Liguria Region, Northern Italy), Annals of Botany, vol. 86, pp. 471 -478, 2000
145. De Falco E., Mancini E., Roscigno G., Mignola E., Taglial atela -Scafati, Senatore F.,
Chemical composition and biological activity of essential oils of Origanum vulgare L.
subsp. vulgare L. under different growth conditions, Molecules, vol. 18, no.2, pp. 14948 –
14960, 2013
146. Longo R., Le Monografie Tedesche, Versione italiana. Tomo III. Studio Edizioni,
Milano, 1995
147. Skoula M., Harborne J.B., Taxonomy and chemistry, In: Kintzios SE (Ed.) Oregano:
The genera Origanum and l ippia, Medicinal and Aromatic Plants, Industrial Profiles 25,
Taylor & Francis/CRC Press, USA, pp. 67-108, 2002
148. Arcila Lozano C.C., Loarca Pina G., Lecona Uribe S., Gonzalez E.M., Oregano:
properties, composition and biological activity, Archives Latinoamerican Nutrition, vol.
54, no. 1, pp. 100 -111, 2004
149. Chishti S., Kaloo A.Z., Sultan P., Medicinal imp ortance of genus Origanum : A review.
Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, vol. 5 no. 10, pp. 170 -177, 2013
150. Chun S.S., Vattem D.A., Lin Y.T., Shetty K., Phenolic antioxidants from clonal oregano
(Origanum vulgare ) with antimicrobial avtivity against Helicobacter pylori , Process
Biochememistry , vol. 40, pp. 809 -816, 2005
151. Poggi P., Lipidi di bellezza, Erboristeria, Domani 9, pp. 72 -82, 2000
152. Adam K., Sivropoulou A., Kokkini S., Lanaras T., Arsenakis M., Antifungal activities
of Origanum vulgare subsp. hirtum, Mentha spicata , Lavandula angustifolia , and Salvia
fruticosa essential oils against Human Pathogenic Fungi, Journal of Agricultural and Food
Chemistry, vol. 46, pp. 1739 –1745, 1998
153. Curtis O. F., Shetty K., Growth medium effects of vitrification, total phenolics,
chlorophyll, and water content of in vitro propagated oregano clones, Acta Horticulturae
vol. 426, pp. 489 –497, 1996

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

152
154. Bașer K., Biological and pharmacological activities of carvacrol and carvacrol bearing
essential oils, Current Pharmaceutical De sign, vol. 14, pp. 3106–3119, 2008
155. Toscano Mendes de Oliveira J.L., Melo Diniz Margareth de Fátima, Lima Edeltrudes de
Oliveira, Leite de Souza Evandro, TrajanoVinícius Nogueira, Cavalcante Santos B.H.,
Effectiveness of Origanum vulgare L. and Origanum ma jorana L, Essential oils in
Inhibiting the Growth of Bacterial Strains Isolated from the Patients with Conjunctivitis,
Brazilian archives of biology and technology, vol. 52, no.1, pp. 45 -50, 2009
156. Biondi D., Cianci P., Geraci C., Ruberto G., Piattelli M., A ntimicrobial activity and
chemical composition of essential oils from Sicilian aromatic plants, Flavour and
Fragrance Journal, vol. 8, pp. 331 –337, 1993
157. Sahin F., Güllüce M., Daferera D., Sökmen A., Sökmen M., Polissiou M., Agar G.,
Özer H., Biological ac tivities of the essential oils and methanol extract of Origanum
vulgare ssp. vulgare in the Eastern Anatolia region of Turkey, Food Control, vol. 15, pp.
549–557, 2004
158. Bejaoiu A., Boulila A. Boussaid M., Chemical composition and biological activities of
essential oils and solvent extracts of Origanum vulgare subs. glandulosum Desf. from
Tunisia, Journal of Medicinal Plants Research, vol.7, no. 32, pp. 2429 -2435, 2013
159. Koukoulitsa C., Zika C., Hadjipavlou –Litina D., Demopoulos V. J., Skaltsa H.,
Inhibitory eff ect of polar oregano extracts on aldose reductase and soybean lipoxygenase
in vitro, Phytotherapy Ressearch, vol. 20, pp. 605 –606, 2006
160. Silva F.V., Guimaraes A.G., Silva E.R., Sousa -Neto B.P., Machado F.D., Quintans –
Júnior L.J., Arcanjo D.D., Oliveira F.A. , Oliveira R.C., Anti -inflammatory and anti -ulcer
activities of carvacrol, a monoterpene present in the essential oil of oregano, Journal of
Medicinal Food , vol. 15, no. 11, pp. 984 -991, 2012
161. Bașer K.H.C., The Turkish Origanum species. Oregano, the Genera Origanum and
Lippia , Ed., Kintzios SE, London and New York, Taylor and Francis, pp. 109 -126, 2002
162. Sheibani Vahid, Afarinesh Mohammadreza, Hajializadeh Zahra, Abbasnejad Mehdi,
Haghpanah Tahereh, Arabnezhad Razieh and Sepehri Gholamreza, Evaluation of
Origa num vulgare L. ssp. viridis leaves extract effect on discrimination learning and LTP
induction in the CA1 region of the rat h ippocampus, Iranian Journal of Basic Medical
Sciences, vol. 14, no. 1, pp. 177 -184, 2011

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

153
163. Dundar E., Olgun E.G., Isiksoya S., Kukcu oglu M., B aser K., Bal C., The effects of
intra-rectal and intra -peritoneal a pplication of Origanum onites L . essential oil on 2 , 4, 6 –
trinitrobenzene sulfonic acid induced colitis in the r at, Experimental and Toxicologic
Pathology, vol. 59, pp. 399 -408, 2008
164. Afsharypuor S., Sajjadi S.E., Manesh M.E., Volatile constituents of Origanum
vulgare ssp. viride (syn.: O.heracleoticum ) from Iran, Planta Medica vol. 63, pp. 179 -180,
1997
165. Force M., Sparks W.S., Ronzio R.A., Inhibition of enteric parasites by emulsif ied oil of
Oregano in vivo , Phytotherapy Research, vol. 14, no. 3, pp. 213 -214, 2000
166. Hummer K.A., Caraon C.F., Rilet T.V., Antimicrobial activity of essential oils and
other plant extract, Journal of Applied Microbiology, vol. 86, pp. 985 –990, 1999
167. Roman G he. V., Duda M.M., Imbrea F., Matei Ghe., Timar A.V., Pamantul -Casa
noastra -Conditionarea si pastrarea produselor agricole, Editura Universitara, ISBN: 978 –
606-591-488-9, 2012
168. Jiménez -Medina E., Garcia -Lora A., Paco L., Algarra I., Collado A., Garrido F., A new
extract of the plant Calendula officinalis produces a dual in vitro effect: cytotoxic anti –
tumor activity and lymphocyte activation, BMC Cancer vol. 6, no.119, doi:10.1186/1471 –
2407 -6-119, 2006
169. Sharma P., Sharma A., Agarwal M., Joshi S. C., Contracep tive Potential of Calendula
officinalis Aqueous Extract in Male Rats
170. Sonalika K., Meera A., Priyanka S., Influence aqueous extract of Calendula officinalis
(flower) on the reproductive function of adult male rats, Asian Journal of Science and
Technology ,v ol. 4, no., 12, pp. 020 -023, 2012
171. Namvaran A., Reihani B., Khayatnury M. H., Golabi M., Effect of Hypericum
perforatum on formalin induced pain and inflammation in mice, I ranian Journal of
Veterinary Medicine, vol. 2, no.10, 2008
172. Pandey A., Chandel E., In vitro evaluation of antibacterial activity of Calendula
officinalis , against MDR, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, vol.
3, no. 11, pp. 879-898, 2014

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

154
173. Muller R.S., Breitkrentz J., Groning R., Interactions between aqueous Hypericum
perforatum extracts and drugs: in vitro studies, Phytoterapy Research, vol. 18, pp. 1019 –
1023, 2004
174. Sheibani V., Hajializadeh Z., Afarinesh M., Evaluation of Origanum vulgare L. ssp.
Viridis leaves extract effect on discrimination learning and LTP induction in the CA1
region of the rat hippocampus, Iran Journal Basic Medical Sciences, vol. 14, pp. 161-169,
2010
175. Mohamed N.A., Nassier O.A., The antihyperglycaemic effect of the aq ueous extract of
Origanum vulgare leaves in Streptozotocin -induced diabetic rats, Jordan Journal of
Biological Sciences, vol.6, no.1, pp. 31 -38, 2013
176. Wahab Shihab Z.A., Study the effects of drenching aqueous extract of Origanum
vulgare on some hematologica l characteristics of mature male domestic rabbits, Basrah
Journal of Veterinary Research, vol. 12, no. 2, 2013
177. Perez Carreon J.I., Cruz Jimenez G., Licen Vega J.A., Villa Trevino S., Genotoxic and
anti-genotoxic properties of Calendula officinalis, extract in rat liver cell cultures treated
with diethyl nitrosamine, Toxicology in Vetro, vol. 16, pp. 253 -258, 2002
178. Santos -Filho S.D., Bernardo R.M., Santos K.C.M., Fonseca A.S., Bernardo -Filho M.,
Influence of an aqueous extract of Hypericum perforatum (Hyperic in) on the survival of
Escherichia coli AB1157 and on the electrophoretic mobility of pBSK plasmid DNA,
Revista Brasileira de Farmacognosia, Brazilian Journal of Pharmacognosy, vol. 18, no. 3,
pp. 326 -330, 2008
179. Benavides V., D’Arrigo G., Pino J., Effects o f aqueous extract of Origanum vulgare L.
(Lamiaceae ) on the preimplantational mouse embryos, Revista Peruana de Biologia, vol.
17, no.3, pp. 381 -384, 2010

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

155
180. Hostanska K ., Reichling J ., Bommer S ., Weber M ., Saller R ., Aqueous ethanolic extract
of St. John's wort ( Hypericum perforatum L.) induces growth inhibition and apoptosis in
human malignant cells in vitro, Pharmazie, vo l. 57, no. 5, pp. 323 -31, 2002
181. Subhan F., Khan M., Ibrar M., N. Islam, A. Khan, A.H. Gilani, Antagonism of
antinociceptive effect of hydro -ethanolic extract of Hypericum perforatum Linn. by a
non-selective opioid receptor antagonist, naloxone, Pakistan Jo urnal of Biological
Sciences, vol. 10, no. 5, pp. 792 -796, 2007
182. Dorwal D., Anthelmintic activity of methanolic and ethanolic leaf extract of Calendula
officinalis , International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences,
vol. 3, no. 2, 2012
183. Parente L.M.L., Andrade M.A., Brito L.A.B., Dignani de Moura V.M.B., Miguel M.P.,
Lino -Júnior R.S., Tresvenzol L.F.M., Realino de Paula J., Paulo N.M., Angiogenic
activity of Calendula officinalis flowers L. in rats, Acta Cirúrgica Brasileira, vol. 2 6, no.
1, 2011
184. Efstratiou E., Hussain A.I., Nigam P.S., Moore J.E., Ayub M.A, Rao J.R., Antimicrobial
activity of Calendula officinalis petal extracts against fungi, as well as Gram -negative
and Gram -positive clinical pathogens, Complementary Therapies in Clinical Practice,
vol. 18, pp.173 -176, 2012
185. Nikmehr B., Ghaznavi H., Rahbar A., Sadr S., Mehrzadi S., In vitro anti -leishmanial
activity of methanolic extracts of Calendula officinalis flowers, Datura stramonium
seeds, and Salvia officinalis leaves, Chine se Journal of Natural Medicines, vol. 12, no. 6,
pp. 0423 -0427, 2014
186. Milosevic T., Solujic S., Sukdolak S., In Vitro Study of Ethanolic Extract of Hypericum
perforatum L. on Growth and Sporulation of Some Bacteria and Fungi, Turkish Journal
of Biology, vol . 31, pp. 237 -241, 2007
187. Li Z., Qin C., Li D., Hou Y., Li S., Sun J., Molecularly imprinted polymer for specific
extraction of hypericin from Hypericum perforatum L. herbal extract, Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol. 98, pp. 210 -220, 20 14

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

156
188. Carvalho A.C., Franklin G., Dias A.C.P., Lima C.F., Methanolic extract of Hypericum
perforatum cells elicited with Agrobacterium tumefaciens provides protection against
oxidative stress induced in human HepG2 cells, Industrial Crops and Products , vol. 59,
pp. 177 -183, 2014
189. Abdelhadi M., Meullemiestre A., Gelicus A., Hassani A., Rezzoug S., Intensification of
Hypericum perforatum L. oil isolation by solvent -free microwave extraction, chemical
engineering research and design, vol. 93, pp. 621 -631, 2015
190. Zhao R., Chen Z., Jia G., Li J., Cai Y., Shao X., Protective effects of diosmetin
extracted from Galium verum L. on the thymus of U14 -bearing mice, Canadian Journal
of Physiology and Pharmacology, vol. 89, pp. 665 –673, 2011
191. Danila A.O., Gatea F., Radu G.L. , Polyphenols composition and antioxidant activity of
selected medicinal herbs, Chemistry of Natural Compounds, vol. 47, no.1, pp. 22 -26,
2011
192. Nisha M.C., Subramanian M.S., Prathyusha P., Santhanakrishnan R., Comparative
Studies on Antimicrobial Activity o f Artemisia Sieversiana Ehrhart . Ex. Willd. and
Origanum vulgare L., International Journal of PharmTech Research, vol. 2, no. 2, pp.
1124 -1127, 2010
193. Shokrzadeh M., Ahmadi A., Chabra A., Naghshvar F., Salehi F., Habibi E., Haghi –
Aminjan H., An ethanol extract of Origanum vulgare attenuates
cyclophosphamide -induced pulmonary injury and oxidative lung damage in
mice, Pharmaceutical Biology, vol.52, no.10, pp. 1229 -1236, 2014
194. Kawase K.Y.F., Mothé C.G., Furtado F.A., Coelho G.L.V., Changes in e ssential oil of
Origanum vulgare L. affected by different extraction methods, IJRRAS, vol. 14, no. 2,
2013
195. Gazim Z.C., Rezende C.M., Fraga S.R., Svidzinski T.I.E., Cortez D.A.G., Antifungal
activity of the essential oil from Calendula officinalis L. (Aste raceae) growing in Brazil,
Brazilian Journal of Microbiology, vol. 39, no.1, pp. 61 -63, 2008
196. Zdunić G., Godevac D., Milenković M., Vucićević D ., Savikin K ., Menković N .,
Petrović S ., Evaluation of Hypericum perforatum oil extracts for an antiinflammatory and
gastroprotective activity in rats, Phytotherapy Research ,vol. 23, no.11, pp. 1559 –1564,
2009

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

157
197. Cirak C., Bertoli A., Pistelli L., Seyis F., Essential oil composition and variability of
Hypericum perforatum from wild populations of northern Turkey, Pharmaceutical
Biology, vol. 48, pp :906-914, 2010
198. Petrovic L., Z. Lepovic, Sovilj V., Adamovic D., Tesevic V., An investigation of CO2
extraction of marigold ( Calendula officinalis L.), Journal of the Serbian Chemical
Society, vol. 72, no. 4, pp. 407 -413, 2007
199. Saroglou V. , Marin P.D. , Rancic A. , Veljic M. , Skaltsa H. , Composition and
antimicrobial activity of the essential oil of six Hypericum species from Serbia ,
Biochemical Systematics and Ecology , vol. 35, no. 3, pp. 146 -152, 2007
200. httр://сhеmwіkі.uсdavіs.еdu
201. Magalhaes L., Segundo M., Reis S., Lima J., Methodological aspects about in vitro
evaluation of antioxidant properties, Analytica Chimica Acta, vol. 613, pp. 1 -19, 2008
202. Roginsky V., Lissi E., Review of methods to determine chain -breaking antioxidant
activity in food, Food Chemistry, vol. 92, pp. 235 -254, 2005
203. Rigane G., Ben Younes S., Ghazghazi H., Ben Salem R., Investigation into the
biological activities and chemical composition of Calendula officinalis L. growing in
Tunisia, International Food Research Journal, vol. 20, no.6, pp: 3001 -3007, 2013
204. Raal A., Kirsipuu K., Total flavo noid content in varieties of Calendula officinalis L.
originating from different countries and cultivated in Estonia, Natural Product Research.,
vol. 25, pp. 658 -62, doi: 10.1080/14786419.2010.528417, 2011
205. Sardoei A.S., Shahadadi F., Vakili M. A. Gholamsha hi S., Effects of gibberellic acid
(GA3) on phenolic compounds and antiradical activity of marigold ( Calendula
officinalis ), International Journal of Biosciences , vol. 4, no. 3, pp. 80 -84, 2014
206. Kostic D.A., Velickovic J.M., Mitic S.S., Mitic M.N., Randjel ovic S.S., Arsic B.B.,
Pavlovic A.N., Correlation among phenolic, toxic metals and antioxidant activity of the
extracts of plant species from southeast Serbia, Bulletin of the Chemical Society of
Ethiopia, vol. 27, no. 2, pp. 169 -178, 2013
207. Çelen G., Özkan S., Ayhan F., The phenolic compounds from Hypericum perforatum
and their antimicrobial activities, Hacettepe Journal of Biology and Chemistry, vol. 36,
no.4, pp. 339 -345, 2008

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

158
208. Morshedloo M.R. , Ebadi A., Fatahi Moghaddam M.R., Yazdani D., Essential oil
composition, total phenol compounds and antioxidant activity of Hypericum perforatum
L. extract collected from north of Iran, Journal of Medicinal Plants, vol. 11, no. 8., pp.
218-226, 201 2
209. Vlase L., Mocan A., Hanganu D., Benedec D., Gheldiu A., Crisan G., Comparative
study of polyphenolic content, antioxidant and antimicrobial activity of four Galium
species (Rubiaceae), Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, vol. 9, no. 3, p.
1085 -1094, 2014
210. Albano S.M., Miguel M.G., Biological activities of extracts of plants grown in Portugal,
Industrial Crops and Products, doi:10.1016/j.indcrop.2010.11.012, 2010
211. Licˇina B.Z., Stefanovic´, O.D., Vasic´, S.M., Radojevic´, I.D., Dekic´, M.S., Cˇomic´,
L. R. Biological activities of the extracts from wild growing Origanum vulgare L., Food
Control, vol. 33, pp. 498 -504, 2013
212. Zhishen J., Mengcheng T., Jianming W., The determination of flavonoid contents in
mulberry and their scavenging effects on . Superoxid radicals, Food Chemistry, vol.64,
pp. 555 -559, 1999
213. Germ M., Stibilj V., Kreft S., Gaberšcˇik A., Kreft I., Flavonoid, tannin and hypericin
concentrations in the leaves of St. John’s wort ( Hypericum perforatum L.) are affected by
UV-B radiation levels, Food Chemistry, vol. 122, pp. 471 -474, 2010
214. Spiridon I., Bodirlau R., Teaca C.A., Total phenolic content and antioxidant activity
of plants used in traditional Romanian herbal medicine. Central European Journal of
Biology, vol. 6, no. 3, pp. 388-396, 2011
215. Miliauskas G., Venskutonis P.R., Vanbeek T.A., Screening of radical scavenging
activity of some medicinal and aromatic plant extracts. Food Chemistry, vol. 85, pp. 231 –
237, 2004
216. Milardovic S., Ivekovic D., Grabaric B., Rumenjak V., Grabaric B. – Use of DPPH+ /
DPPH redox couple for biamperometric determination of antioxidant activity,
Electroanalysis, vol. 17, pp. 1847 -1853, 2005
217. Milardovic S., Ivekovic D., Grabaric B., A novel amperometric method for antioxidant
determination using DPPH free radic al, Bioelectrochemistry, vol. 68, pp. 175 -180, 2006

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

159
218. Varvari L., Procedee neconvenționale de detecție electrochimică a unor specii chimice
de interes în biotehnologii și protecția mediului, Teză de doctorat, Cluj -Napoca, 2011
219. Butnariu M., Zepa Coradini C., Evaluation of biologically active compounds from
Calendula officinalis flowers using spectrophotometry, Chemistry Central Journal, vol. 6,
no. 35, 2012
220. Victor B.K., Shaikh Hamed W.M.A., Preliminary phytochemical screening and
evaluation in vitro antioxida nt activity of Iraq species of Hypericum perforatum aerial
part, International Research Journal of Pharmacy, vol. 5, no. 5, 2014
221. Vardapetyan H.R., Tiratsuyan S.G., Hovhannisyan A.A, Martirosyan A.S., Elucidation
of DPPH antiradical and photodynamic activit ies of Hypericum perforatum extracts,
Biological Journal of Armenia, vol. 2, no. 64, 2012
222. Zhang X.L., Guo Y.S., Wang C.H., Li G.Q., Xu J.J., Chung H.Y., Ye W.C., Li Y.L.,
Wang G.C., Phenolic compounds from Origanum vulgare and their antioxidant and
antivir al activities, Food Chemistry, vol. 152, pp. 300 -306, 2014
223. Matsuura H., Chiji H., Asakawa C., Amano M., Yoshihara T., Mizutani J., DPPH
Radical Scavengers from dried leaves of Oregano ( Origanum vulgare ), Bioscience
Biotechnology and Biochemistry, vol. 67, no. 11, pp. 2311 –2316, 2003
224. Preethi K.C., Kuttan R., Antioxidant potential of Calendula officinalis flowers in vitro
and in vivo, Pharmaceutical Biology, vol. 44, no.9, pp. 691 -697, 2006
225. Zheleva -Dimitrova D., Nedialkov P., Kitanov G., Radical scavenging and antio xidant
activities of methanolic extracts from Hypericum species growing in Bulgaria,
Pharmacognozy Magazine, vol. 6, no. 22, pp. 74 –78, 2010
226. Tusevski O., Kostovska A., Iloska A., Trajkovska L., Gadzovska S.S., Phenolic
production and antioxidant properties of some Macedonian medicinal plants, Central
European Journal of Biology, vol. 9, no. 9, pp. 888-900, 2014
227. Matei A.O., Gatea F., Teodor E.D, Radu G.L., Tannins analysis from different
medicinal plants extracts using MALDI -TOF and MEKC, Chemical Paper (man uscript
submitted)
228. Miron T.L., Plaza M., Bahrima G., Ibánez E., Herrero M., Chemical composition of
bioactive pressurized extracts of Romanian aromatic plants, Journal of Chromatography
A, vol. 1218, pp. 4918 -4927, 2011

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

160
229. Ercetin T., Senol F.S., Orhan I. E., Toker G., Comparative assessment of antioxidant
and cholinesterase inhibitory properties of the marigold extracts from Calendula arvensis
L. and Calendula officinalis L., Industrial Crops and Products, vol. 36, pp. 203 -208, 2012
230. Ćetković G.S., Đilas S.M., Čanadanović -Brunet J.M., Tumbas V.T., Thin -layer
chromatography analysis and scavenging activity of Marigold ( Calendula officinalis L.)
extracts, BIBLID, vol. 34, pp. 93 -102, 2003
231. Loescher C.M., Mortona D.W., Razic S., Agatonovic -Kustrin S., High perform ance thin
layer chromatography (HPTLC) and high performance liquid chromatography (HPLC)
for the qualitative and quantitative analysis of Calendula officinalis —Advantages and
limitations, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol. 98, pp.52 -59, 2014
232. Agatonovic -Kustrin S., Loescher C.M., Qualitative and quantitative high performance
thin layer chromatography analysis of Calendula officinalis using high resolution plate
imaging and artificial neural network data modeling, Analytica Chimica Acta, vol. 798,
pp. 103 -108, 2013
233. Agatonovic -Kustrin S., Ortakand D.B., Morton D.W., Yusof A.P., Rapid evaluation and
comparison of natural products and antioxidant activity in calendula, feverfew, and
German chamomile extracts, Journal of Chromatography A, vol. 1385, pp. 103 -110, 2015
234. Mulinnaci N., Bardazzi C., Romani A., Pineli P., Vincieri V.V., Constantini A., HPLC –
DAD and TLC –Densitometry for quantification of hypericin in Hypericum perforatum
L.extracts, Chromatographya, vol. 49, 1999
235. Çelen G., Özkan S., Ayhan F., The phenolic compounds from Hypericum perforatum
and their antimicrobial activities, Hacettepe Journal of Biology and Chemistry, vol. 36,
no. 4, pp. 339 -345, 2008
236. Kitanov G.M. , Hypericin and pseudohypericin in some Hypericum species, Biochemical
Systematics and Ecology, vol. 29, pp. 171, 2001
237. Eloff J.N., Ntloedibe D.T., van Brummelen R., A simplified but effective method for
the quality control of medicinal plants by planar chromatography, Tradititional
Complement Alternative Medicine, vol. 8, pp. 1-12, 2011
238. Nicoletti M., HPTLC fingerprint: a modern approach for the analytical determination of
Botanicals, Revista Brasileira de Farmacognosia Brazilian Journal of Pharmacognosy,
vol. 21, no. 5, pp. 818 -823, 2011

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

161
239. Kulevanova S., Stefova M., Stefkov G., Stafilov T., Identification, isolation and
determination of flavones in Origanum vulgare from Macedonian flora, Journal of Liquid
Chromatography and Related Technologies, vol. 24, no.4, pp. 589 -600, 2001
240. Alves J.N., Arthur V., Potenza M.R., Rossi M.H., Ana lysis chromatography the
Ocimum basilicum , Origanum vulgare , Cymbopogon citratus and Thymus vulgaris after
gamma irradiation, Merit Research Journal of Food Science and Technology, vol. 1, no.2,
pp. 019 -022, 2013
241. Bharti V., Vasudeva N., Oreganum vulgare Li nn. Leaf: An extensive pharmacognostical
and phytochemical quality assessment, Advenced Pharmaceutical Bulletin, vol.3, no. 2,
pp. 277 -281, 2013
242. Nowak R., Wojciak -Kosior M., Sowa I., Sokolowska -Krzaczek A., Pietrzok W.,
Szczodra A., Kocjan R., HPTLC -Densit ometry determination of triterpenic acids in
Origanum vulgare , Rosmarinus officinalis and Syzygium aromaticum , Acta Poloniae
Pharmaceutica -Drug Research, vol. 70, no. 3, pp. 413 -418, 2013
243. General Chemistry, http://antoine.frostburg.edu/chem/senese/chromatography , 2005
244. Kaplan L. A., Pesce A. J., Clinical Chemistry Theory, Analysis, and Correlation, The
C.V. Mosby Company, USA, 1984
245. http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/ch rom1.htm
246. http://www.iupac.org
247. http://www.chromatography -online.org/hplc.php
248. https://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/hplc.html
249. Todi L., Cromatografie de lichide de inalta performanta cuplata cu spectrometrie de
masă (HPLC -ESI Q -ToF MS), Institutul de chimie macr omoleculară Petru Poni Iași 2014
250. Bilia A.R., Salvini D., Mazzi G., Vincieri F.F., Characterization of calendula flower,
milk-thistle fruit, and passion flower tinctures by HPLC -DAD and HPLC -MS, Journal
Chromatographia, vol. 53, no. ¾, pp. 210 -215, 2001
251. Olszewska M., Quantitative HPLC analysis of flavonoids and chlorogenic acid in the
leaves and inflorescences of Prunus serotina Ehrh, Journal Acta Chromatographica, no.
19 pp. 253 -269, 2007
252. Raškovic A., Cvejic J., Stilinovic N., Goločorbin -Kon S., Vukmirovic S., Mimica –
Dukic N., Mikov M., Interaction between different extracts of Hypericum perforatum L.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

162
from Serbia and pentobarbital, diazepam and paracetamol, Journal Molecules, vol. 19,
no. 4 ,pp. 3869 -3882,2014
253. Kamal A., Ahmad F.J., Ahmad S., Saleem K., A val idated HPLC method for the
quantification of hypericin in Hypericum perforatum , Asian Journal of Chemistry, vol.
24, no. 10, pp. 4689 -4692, 2012
254. Crockett S.L., Schaneberg B., Khan I.A., Phytochemical profiling of new and old world
Hypericum (St. John's Wor t) species, Journal Phytochemical Analysis, vol. 16, no. 6, pp.
479-485,2005
255. Öztürk N., Tunc el M., Potog lu-Erkara I ., Phenolic compounds and antioxidant activities
of some Hypericum species: a comparative study with H. perforatum . Pharmaceutical
Biolog y, vol. 47, no. 2, pp. 120 -127, 2009
256. Stefova M., Kulevanova S., Stafilov T., Assay of flavonols and quantification of
quercetin in medicinal plants by HPLC with UV -diode array detection, Journal of Liquid
Chromatography & Related Technologies, vol. 24, no. 15, pp. 2283 -2292, 2001
257. Hosni K., Msâda K., Târit M.B., Hammami M., Marzouk B., Bioactive components of
three Hypericum species from Tunisia: a comparative study, Industrial Crops and
Products vol. 31, no. 1, pp. 158 -163, 2010
258. Tuncel N.B., Yılmaz N., Det ermination of phenolic acid composition of some herbs
from Kaz Mountains, Turkey by high performance liquid chromatography, Akademik
Gida vol. 8, no. 3, pp. 18 -23, 2010
259. Proestos C., Nenadis N., Tsimidou M., Gerothanassis I.P., Troganis A., Boskou D.,
Antioxidant activities and phenolic composition of extracts from Greek oregano, Greek
sage, and summer savory, Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 50, no. 19,
pp. 5294 -5299, 2002
260. Ganzera M., Zhao J., Khan I. A., Hypericum perforatum – chemical pro filing and
quantitative results of St. John's Wort products by an improved high -performance liquid
chromatography method, Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 91 no. 3 pp. 623 -630,
2002
261. Orhan I.E., Kartal M., Gülpi nar A.R., Cos P., Matheeussen A., Mae s L., Tasdemir D.,
Assessment of antimicrobial and antiprotozoal activity of the olive oil macerate samples

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

163
of Hypericum perforatum and their LC -DAD -MS analyses, Food Chemistry, vol. 138 no.
2/3 pp. 870 -875, 2013
262. Tatsis E.C., Boeren S., Exarchou V., Trogan is A.N.,Vervoort J., Gerothanassis I.P.,
Identification of the major constituents of Hypericum perforatum by LC/SPE/NMR
and/or LC/MS, Phytochemistry, vol. 68, no. 3, pp. 383 -393, 2007
263. Helmja K., Vaher M., Püssa T., Orav A., Viitak A., Levandi T., Kaljurand M., Variation
in the composition of the essential oils, phenolic compounds and mineral elements of
Hypericum perforatum L. growing in Estonia, Natural Product Research, vol. 25 no. 5/6
pp. 496 -510, 2011
264. Kusari S., Zühlke S., Borsch T., Spiteller M., Posit ive correlations between hypericin
and putative precursors detected in the quantitative secondary metabolite spectrum of
Hypericum, Phytochemistry, vol. 70, no. 10 pp. 1222 -1232, 2009
265. Orčic D.Z., Mimica -Dukic N.M., Franciškovic M.M., Petrovic S.S., Jovin E .,
Antioxidant activity relationship of phenolic compounds in Hypericum perforatum L .
Chemistry Central Journal, vol. 5 no. 34, 2011
266. Kalogeropoulos N., Yannakopoulou K., Gioxari A., Chiou A., Makris D.P., Polyphenol
characterization and encapsulation in β -cyclodextrin of a flavonoid -rich Hypericum
perforatum (St John's wort) extract, LWT – Food Science and Technology, vol. 43, no. 6,
pp. 882 -889, 2010
267. Biber A., Fischer H., Römer A., Chatterjee S.S., Oral bioavailability of hyperforin from
hypericum extrac ts in rats and human volunteers, Pharmacopsychiatry, vol. 31, sup 1, pp.
36-43, 1998
268. Gao S., Jiang W., Yin T.J., Hu M., Highly variable contents of phenolics in St. John's
wort products affect their transport in the human intestinal Caco -2 cell model:
pharmaceutical and biopharmaceutical rationale for product standardization, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, vol. 58, no. 11, pp. 6650 -6659, 2010
269. Jager L.S., Perfetti G.A., Diachenko G.W., Liquid chromatographic determination of St.
John's wort com ponents in functional foods, Journal of AOAC International, vol. 87, no.
5, pp. 1042 -1048, 2004

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

164
270. Martin -Facklam M., Rieger K., Riedel K.D., Burhenne J., Walter -Sack I., Haefeli W.E.,
Undeclared exposure to St. John's Wort in hospitalized patients, British J ournal of
Clinical Pharmacology, vol. 58, no. 4, pp. 437 -441, 2004
271. Matei A.O., Gatea F., Radu G.L., Analysis of phenolic compounds in some medicinal
herbs by LC -MS, Journal of Chromatographic Science, pp: 1 -8, 2014
272. Shen D.D., Pan M., Wu Q.L., Park C.H., Ju liani H.R., Ho C.T., Simon J.E., LC -MS
method for the simultaneous quantitation of the anti -inflammatory constituents in
oregano (Origanum species), Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 58, no. 12,
pp. 7119 -7125, 2010
273. https://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/hplc.html
274. Okoh O.O., Sadimenko A.P., Asekun O.T., Afolayan A.J., The effects of drying on the
chemical components of essential oils of Calendula officinalis L., African Journal of
Biotechn ology, vol. 7, no. 10, pp. 1500 -1502, 2008
275. Abdul Jalill R.D.H., GC -MS Analysis of Calendula officinalis and cytotoxic effects of
its flower crude extract on human epidermoid larynx carcinoma (Hep -2), World Journal
of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, v ol. 3, no. 4, pp. 237 -275, 2014
276. Hosni K., Msaada K., Ben -Taarit M., Ouchikh O., Kallel M., Marzouk B., Essential oil
composition of Hypericum perfoliatum L. and Hypericum tomentosum L. growing wild in
Tunisia, Industrial Crops and Products, vol. 27, 308 -314, pp. 2008
277. Gong H.Y, Liu W.H,. Lv G.Y, Zhou X., Analysis of essential oils of Origanum vulgare
from six production areas of China and Pakistan, Revista Brasileira de Farmacognosia ,
vol. 24, no 1, pp 25 -32, 2014
278. Carneiro de Barros J., Conceiça˜o M.L., Neto N.J. G., Vieira da Costa A. C., Siqueira
J.P., Bası´lio Junior J.I.D., Leite de Souza E., Interference of Origanum vulgare L.
essential oil on the growth and some physiological characteristics of Staphylococcus
aureus strains isolated from foods, LWT – Food Science and Technology , vol. 42, pp.
1139 -1143, 2009
279. Marusk A., Proscevicius J., Bimbiraite -Surviliene K., Kornisova O. , Ragazinskiene O.,
Ratautaite V., Comparison of phytochemical composition of medicinal plants by means
of chromatographic and related techniques, Procedia Chemistry, vol. 2, pp. 83 -91, 2010

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

165
280. Dogrukol -Ak D., Kirimer N., Tuncel M., Aboul -Enein H.Y., Determin ation of rutin in
Hypericum perforatum extract by capillary electrophoresis, Analytical Letters, vol. 32,
pp. 185 -191, 2001
281. Mazina J., Vaher M., Kuhtinskaja M., Poryvkina L., Kaljurand M., Fluorescence,
electrophoretic and chromatographic fingerprints of h erbal medicines and their
comparative chemometric analysis, Talanta, vol. 139, pp. 233 -246, 2015
282. Pietta P., Bruno A., Mauri P., Rava A., Separation of Flavonol -2-O-glycosides from
Calendula officinalis and Sanbucus -nigra by high -performance liquid and mic ellar
electrokinetic capillary chromatography, Journal of Chromatography, vol. 593, no. 165,
1992
283. Jensen A.G., Hansen S.H., Separation of hypericins and hyperforins in extracts of
Hypericum perforatum L. using non -aqueous capillary electrophoresis with rev ersed
electro -osmotic flow, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol. 27, no. 1 –
2, pp.167 -176, 2002
284. Urbánek M., Blechtová L., Pospı šilová M., Polášek M., On-line coupling of capillary
isotachophoresis and capillary zone electrophoresis for the determination of flavonoids in
methanolic extracts of Hypericum perforatum leaves or flowers, Journal of
Chromatography A, vol. 958, pp.261 -271, 2002
285. Dmitrienko S.G., Kudrinskaya V.A., Apyari V.V., Methods of extraction,
preconcentration, and determinat ion of quercetin, Journal of Analytical Chemistry, v ol.
67, no. 4 , pp 299-311, 2012
286. Tang Z., Zeng Y., Zhou Y., He P., Fang Y., Zang S., Determination of active
ingredients of Origanum vulgar e L. and its medicinal preparations by capillary
electrophoresis with electrochemical detection, Analytical Letters, vol. 39, pp. 2861 –
2875, 2006
287. Gatea F., Teodor E.D., Matei A.O., Badea G.I., Radu G. L., Capillary Electrophoresis
Method for 20 polyphenols separation in propolis and plant extracts, Food Analytical
Methods , DOI 10.1007/s12161 -014-0006 -5, 2014
288. Mulla S.K., Swamy P., Anticancer activity of ethanol and polyphenol extracts of
Portulaca quadrifi da linn on human colon cancer cell lines, International Journal of
Pharma and Bio Sciences, vol. 3, no.3, pp. 488 -498, 2012

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

166
289. Lamoral -Theys D., Pottier L ., Dufrasne F., Nève J ., Dubois J ., Kornienko A ., Kiss R .,
Ingrassia L ., Natural polyphenols that display anticancer properties through inhibition of
kinase activity, Current Medicinal Chemistry, vol.17, no.9, pp. 812 -25, 2010
290. Waterhouse A.L., Determination of total phenolics, Handbook of food analytical
chemistry, Unit I 1.1:Polyphenolics: pp. 464 -465, Wiley, New York, 2001.
291. Berg van den, R., Haenen, G.R.M.M., Berg van den, H., Vijgh vander, W., Bast, A.,
The predictive value of the antioxidant capacity of structurally related flavonoids using
the trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay. Food Chemistry, vol. 70, pp.
391-395, 2000
292. Re R., Pel legrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., Rice -Evans C., Antioxidant
activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay, Free Radical
Biology and Medicine, vol. 26, pp. 1231 -7, 1999
293. Eklund P.C., Langvik.O.K., Warna J.P., Salmi T .O., Willfor S.M., Sjoholm R.E.,
Organic & Biomolecular Chemistry, vol. 7, pp. 2367, 2009
294. Govindarajan R., Rastogi S., Vijayakumar M., Shirwaikar A., Rawat A. K. S.,
Methrotra S., Pushpangadan P., Studies on the antioxidant activities of Desmodium
gangetic um, Biological and Pharmaceutical Bulletin, vol. 26, pp. 1424 -7, 2003
295. Wojdyło A., Oszmian´sk J., Czemerys R., Antioxidant activity and phenolic
compounds in 32 selected herbs, Food Chemistry, vol. 105, pp. 940 –949, 2007
296. Šeruga M., Novak I., Jakobek L., D etermination of polyphenols content and antioxidant
activity of some red wines by differential pulse voltammetry, HPLC and
spectrophotometric methods, Food Chemistry, vol. 124, pp. 1208 -1216, 2011
297. Dvorakova M., Hulin P., Karabin M., Dostalek P., Determinat ion of Polyphenols in
Beer by an Effective Method Based on Solid -Phase Extraction and High Performance
Liquid Chromatography with Diode -Array Detection, Czech Journal Food Science, vol.
25, pp. 182 -188, 2007
298. Ying X., Wang R., Xu J., Zhang W., Li H., Zhang C., Li F., HPLC Determination of
Eight Polyphenols in the Leaves of Crataegus pinnatifida Bge. var. major, Journal of
Chromatographic Science, vol. 47, 2009

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

167
299. Kumar N., Bhandari P., Singh B., Gupta A.P, Kau V.K., Reversed phase -HPLC for
rapid determination of polyphenols in flowers of rose species, Journal of Separation
Science, vol. 31, pp. 262 -267, 2008
300. Olennikov D.N., Kashchenko N.I., New isorhamnetin glycosides and other phenolic
compounds found in Calendula officinalis , Chemistry of Natural Compounds, v ol. 49, pp.
833-840, 2013
301. Lubsandorzhieva P.N., Randalova T.E., Boldanova N.B, Popov D.V., Composition and
essential oil and phenolic compounds of the anti -ulcerogenic herb tea, World Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, vol. 3, pp. 212 -218, 2 014
302. Radušienė J., Ivanauskas L., Janulis V., Jakstas V., Composition and variability of
phenolic compounds in Origanum vulgare from Lithuania, Biologija, vol. 54, no. 1, pp.
45-49, 2008
303. Kemperman A.R., Gross G., Mondot S., Possemiers S., Marzorati M., Wiel e T., Dore J.,
Vaughan E.E., Impact of polyphenols from black tea and red wine/ grape juice on a gut
model microbiome, Food Research International, vol. 53, no. 2, pp. 659 -669, 2013
304. Katalinic V., Mozina S.S., Skroza D., Generalic I., Abramovic H., Milos M. , Ljubenkov
I., Piskernik S., Pezo I., Terpinc P., Boban M., Polyphenolic profile, antioxidant
properties and antimicrobial activity of grape skin extracts of 14 Vitis vinifera varietes
grown in Dalmatia (Croatia), Food Chemistry, vol.119, pp. 715 -723, 201 0
305. Kolodziejczyk K., Sojka M., Abadias M., Vinas I., Guyot S., Baron A., Polyphenols
composition, antioxidant activity and antimicrobial activity of the extracts obtained from
industrial sour cherry pomace, Industrial Crops and Products, vol. 51, pp. 279 -288, 2013
306. Petti S., Scully C., Polyphenols oral health and disease, Journal of Dentistry, vol. 37, pp.
413-423, 2009
307. Vogel H., Gonzalez M., Faini F., Razmilic I., Rodriguez J., Martin J.S., Urbina F.,
Antioxidant properties and TLC characterization of four Chilean Haplopappus species
known as bailahuen, Journal of Ethnopharmacology, vol. 97, no. 1, pp. 97 -100, 2005
308. Ying X., Wang R., Xu J., Zhang W., Li H., Zhang C., Li F., HPLC Determination of
eight polyphenols in the leaves of Crataegus pirenatifida Bge.var.major, Journal of
Chromatographic Science, vol. 47, no. 3, pp. 201 -205, 2009

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

168
309. Goday -Caballero M.P., Acedo -Valenzuela M.I., Galeano -Diaz T., Simple quantification
of phenolic compounds present in the minor fraction of virgin olive oil by LC -DAD –
FLD, Talanta , vol. 101, pp. 479 -487, 2012
310. Rudloff von E., Some aspects of gas -liquid c hromatography of polyphenols, Journal of
Chromatographic Science , vol. 2, no. 3, pp. 89 -92, 1964
311. Zhang Y., Zhao L., Yan -Ping S., Separation and determination of flavonoids in
Ixeridi um gracile by Capillary Electrophoresis, Journal of Chromatography Science, vol.
45, no. 9, pp. 600 -604, 2007
312. Goday -Caballero M.P., Acedo -Valenzuela M.I., Galeano -Diaz T., Simple quantification
of phenolic compounds present in the minor fraction of virgin olive oil by LC -DAD –
FLD, Talanta, vol. 101, pp. 479 –487, 2012
313. Fathi H., Ebrahimzadeh M.A., Antioxidant and free radical scavenging activity of
Hypericum perforatum L. (st. John’s worth), International Journal of Forest, Soil and
Erosion, vol. 3, pp.68 -72, 2013
314. Spiridon I., Colcerub S., Anghela N., Teaca C.A., Bodirlaua R., Armatu A., Antioxidant
capacity and total phenolic contents of oregano ( Origanum vulgare ), lavender
(Lavandula angustifolia ) and lemon balm ( Melissa officinalis ) from Romania, Natural
Product Research, vol. 25, pp. 1657 –1661, 2011
315. W’glarz Z., Osidska E., Geszprych A., Przybyb J., Intraspecific variability of wild
marjoram ( Origanum vulgare L.) naturally occurring in Poland, Revista Brasileira
Plantas Medicinais, vol. 8, pp. 23 -26, 2006
316. Bilia A.R., Bergouzi M.C., Gallori S., Mazzi G., Vincieri F.F., Stability of the
constituents of Calendula , Milk-thistle and Passionflower tinctures by LC -DAD and LC –
MS, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol. 30, pp. 613 -624, 2002
317. Silva B.A. , Malva J.O., Dias A.C.P., St. John’s Wort ( Hypericum perforatum ) extracts
and isolated phenolic compounds are effective antioxidants in several in vitro models of
oxidative stress, Food Chemistry , vol. 110, pp. 611 -619, 2008
318. Sagratini G., Ricciutelli M., Vittori S., Ozturk N., Ozturk Y., Maggi F., Phytochemical
and antioxidant analysis of eight Hypericum taxa from Central Italy, Fitoterapia, vol. 79,
pp. 210 -213, 2008

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

169
319. Smelcerovic A., Zuehlke S., Spiteller M., Raabe N., Ozen T., Phenolic constituents of
17 Hypericum species from Turkey, Biochemical Systematics and Ecology , vol. 36, no.
4, pp. 316 -319, 2008
320. Hurtado -Fernández E., Gomez -Romero M., Carrasco -Pancorbo A., Fernandez -Gutierrez
A., Application and potential of capillary electroseparation methods to determine
antioxidant phenolic compounds from plant food material, Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, vol. 53, pp. 1130 -1160 , 2010
321. Zhao J. , Hu D. -J., Lao K. , Yang Z. -M., Li S. -P., Advance of CE and CEC in
phytochemical analysis (2012 –2013) , Electrophoresis, vol. 35, pp. 205 -224, 2014
322. Petr J., Vitkova K., Ranc V., Znaleziona J., Maier V., Knob R., Sevcik J., Determination
of some phenolic acids in Majorana hortensis by capillary electrophoresis with online
electrokinetic preconcentration, Jo urnal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 56, pp.
3940 -3944, 2008
323. Markham K.R., McGhie T.K., Separation of flavones by capillary electrophoresis: The
influence of pKa on electrophoretic mobility, Phytochemical Analysis, vol. 7, pp. 300 –
304, 1996
324. Fukuj i T.S., Tonin F.G., Tavares M.F.M., Optimization of a method for determination of
phenolic acids in exotic fruits by capillary electrophoresis, Journal of Pharmceutical and
Biomedical Analysis, vol. 51, pp: 430 -438, 2010
325. Franquet -Griell H., Checa A., Núñez O., Saurina J., Hernández -Cassou S., Puignou L.,
Determination of polyphenols in Spanish wines by capillary zone electrophoresis.
Application to wine characterization by using chemometrics, Journal of Agricultural and
Food Chemistry , vol. 60, pp. 8340 -8349, 2012
326. Ballus C. A., Meinhart A. D., Grando de Oliveira R., Godoy H. T., Optimization of
capillary zone electrophoresis separation and on -line preconcentration of 16 phenolic
compou nds from wines produced in South America, Food Research International , vol. 45,
no.1, pp. 136 -144, 2012
327. Nessa F., Ismail Z., Karupiah S., Mohamed N., RP -HPLC method for the quantification
analysis of naturally occurring flavonoids in leaves of Blumea balsamifera DC, Journal of
Chromatographic Science, vol.43, pp. 416 -420, 2005

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

170
328. Pop R.M., Csernatoni F., Ranga F., Fetea F., Socaciu C., HPLC -UV analysis coupled
with chemometry to identify phenolic biomarkers from medicinal plants, used as
ingredients in two foods suppl ement formulas, Bulletin UASVM Food Science and
Technology, vol. 70, no. 2, pp. 99 -107, 2013
329. Ma J., Yang H., Basile M.J., Kennelly E.J., Analysis of polyphenolic antioxidants from
the fruits of three Pouteria species by selected ion monitoring liquid chrom atography
mass spectrometry, Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 52, pp. 5873 -5878,
2004
330. Vaher M., Koel M., Separation of polyphenolic compounds extracted from plant
matrices using capillary electrophoresis, Journal of Chromatography A, vol. 9 90, pp.
225–230, 2003
331. Dvorackova E., Snoblova M., Hrdlicka P., Content of phenolic compounds in herbs
used in the Czech Republic, International Food Research Journal, vol. 21, pp. 1495 -1500,
2014
332. Cioanca O., Mircea C., Iancu C., Gille E., Hancianu M., Int raspecific variability of
Origanum crop varieties depending on growing conditions: secondary metabolites
accumulation, Sgem 2013 Conference Proceedings, doi:
10.5593/Sgem2013/Bf6/S25.015, 2013
333. Hithamani G., Ramalakshmi K., Microwave assisted extraction of phenolics from
Origanum vulgare , International Research Journal of Agricultural Science and soil
Science, vol. 1, pp.7 -12, 2013
334. Grevsen K., Frette X.C., Christensen L.P., Content and composition of volatile terpenes,
flavonoids and phenolic acids in Greek Oregano ( Origanum vulgare L. ssp. hirtum) at
different development stages during cultivation in cool temperate climate, European
Journal of Horticultural Science, vol.74, pp. 193 -203, 2009
335. Nowak H., Kujava R., Zadernowski R., Roczniak B., Kozlowska H., Ant ioxidative and
bactericidal properties of phenolic compounds in rapeseeds, European Journal of Lipid
Science and Technology, vol. 94, pp. 149 -52, 1992
336. Tesaki S., Tanabe S., Ono H., Fukushi E., Kawabata J., Watanabe M.,. 4 -Hydroxy -3-
nitrophenyllactic and si napic acids as antibacterial compounds from mustard seeds,
Bioscience Biotechnology and Biochemistry, vol. 62, pp. 998 -1000, 1998

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

171
337. Barber M.S., McConnell V.S., DeCaux B.S., Antimicrobial intermediates of the general
phenylpropanoid and lignin specific pathw ays, Phytochemistry, vol. 54, pp. 53 -56, 2000.
338. Johnsson L., Dutta P.C., Separation of phytosterol oxidation products by combination of
different polarity gas chromatography capillary columns, Journal of Chromatography A
vol. 1064, pp. 213 -217, 2005
339. Maddox C.E., Laur L.M., Tian L., Antibacterial activity of phenolic compounds against
the phytopathogen Xylella fastidiosa, Current Microbiology, vol. 60, pp. 53 -58, 2010
340. Yun K.J., Koh D.J., Kim S.H., Park S.J., Ryu J.H., Kim D.G., Lee J.Y., Lee K.T., Anti –
inflam matory effects of sinapic acid through the suppression of inducible nitric oxide
synthase, cyclooxygase -2, and proinflammatory cytokines expressions via nuclear factor –
κB inactivation, Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 56, pp. 10265 -72,
2008
341. Hudson E.A., Dinh P.A., Kokubun T., Simmonds M.S.J., Gescher A., Characterization
of potentially chemopreventive phenols in extracts of brown rice that inhibit the growth
of human breast and colon cancer cells, Cancer Epidemiology Biomarkers and
Preventi on, vol. 9, pp. 1163 -1170, 2000
342. Yoon B.H., Jung J.W., Lee J.J., Cho Y.W., Jang C.G., Jin C., Oh T.H., Ryu J.H.,
Anxiolytic -like effects of sinapic acid in mice, Life Science, vol. 81, pp. 234 -240, 2007
343. Chong Z.Z., Shang Y.C, Maiese K, Cardiovascular dise ase and mTOR signaling,
Trends Cardiovascular Medicine, vol. 21, pp. 151 -155, 2011
344. Orabi S.A., Abdelhamidet M.T., Protective role of a -tocopherol on two Vicia faba
cultivars against seawater -induced lipid peroxidation by enhancing capacity of anti –
oxidati ve system, Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences, pp.1 -10, 2014
345. Muthukumaran J., Srinivasan S., Venkatesan R.S., Ramachandran V., Muruganathan
U., Syringic acid, a novel natural phenolic acid, normalizes hyperglycemia with special
reference to glycoprotein components in experimental diabetic rats , Journal of Acute
Disease, pp. 304 -309, 2013
346. Cavia -Saiz M., Busto M.D., Pilar -Izquierdo M.C., Ortega N., Perez -Mateos M., Muniz
P., Antioxidant properties radical scavenging activity and biomolecule protection
capacity of flavonoid naringenin and its glycosides naringin: a comparative study, Journal
of the Science of Food and Agriculture, vol. 90, pp. 1238 -1244, 2010.

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

172
347. Khanbabaee K., Van Ree T., Tannins: classification and definition, Natural Product
Reports, vol. 18, pp. 641 -649, 2001
348. Horie N., Hirabayashi N., Takahashi Y., Miyauchi Y., Taguchi H., Takeishi K.,
Synergistic effect of green tea catechins on cell growth and apoptosis induction in gastric
carcinoma cells, Biological and Pharmaceutical Bul letin, vol. 28, pp. 574 -579, 2005
349. Tabrez S., Priyadarshini M., Urooj M., Shakil S., Ashraf G.M., Khan M.S., Kamal
M.A., Alam Q., Jabir N.R., Abuzenadah A.M., Chaudhary A .G.A., Damanhouri G.A.,
Cancer chemoprevention by polyphenols and their potential appli cation as n anomedicine,
Journal of Environmental Science Health C, vol. 31, pp. 67 -98, 2013
350. Falbe J., Regitz M., Chemie Lexikon , Georg Thieme Verlag Stuttgart/New York, 1995
351. Würdig G., Woller R., Chemie des Weines , Eugen Ulmer GmbH Stuttgart, 1989
352. Mendez O.I.V., Cruz L., Visconte E.B., Pacheco A.V., Dezotti M., Tannin treated water
for use in the emulsion polymerization of SBR, Polimeros Ciencia e Tecnologia, vol. 23,
pp. 326 -330, 2013
353. Mongkholrattanasit R., Krystufek J., Wiener J., Studnickova J., Propert ies of wool and
cotton fabrics dyed with eucalyptus, tannin and f lavonoids, Fibres & Textiles in Eastern
Europe vol. 19, no. 2, pp. 85, 2011
354. Koyunluoglu S., Arslan -Alaton I., Eremektar G., Germirli -Babuna F., Pre -ozonation of
commercial textile tannins: ef fect on biodegradability and toxicity, Journal of
Environment Science and Health A, vol. 41, pp. 1873 -86, 2006
355. Sanchez -Martin J., Gonzalez -Velasco M., Beltran -Heredia J., Gragera -Carvajal J.,
Salguero -Fernandez J., Novel tannin -based adsorbent in removing cationic dye
(Methylene Blue) from aqueous solution kinetics and equilibrium studies, Journal of
Hazardous Materials, vol. 174, pp. 9 -16, 2010
356. Menet M.C., Sang S., Yang C.S., Ho C.T., Rosen R.T., Analysis of theaflavins and
thearubigins from black tea extr act by MALDI -TOF mass spectrometry, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, vol. 52, pp. 2455 -2461, 2004
357. Navarrete P., Pizzi A., Pasch H., Rode K., Delmotte L ., MALDI -TOF and 13C NMR
characterization of maritime pine industrial tannin e xtract, Industri al Crops and Products,
vol. 32, pp. 105 -110, 2010

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

173
358. Olofson T.C., Alstefjord M., Nilson B., Butler E., Vasquez A., Lactobacillus
apinorum sp. nov., Lactobacillus mellifer sp. nov., Lactobacillus mellis sp.
nov., Lactobacillus melliventris sp. nov., Lactobaci llus kimbladii sp. nov., Lactobacillus
helsingborgensis sp. nov. and Lactobacillus kullabergensis sp. nov., isolated from the
honey stomach of the honeybee Apis mellifera, International Journal of Systematic
Evolutionary Microbiology, vol. 64, pp. 3109 -3119 , 2014
359. Reed J.D., Krueger C.G., Vestling M.M., MALDI -TOF mass spectrometry of
oligomeric food polyphenols, Phytochemistry, vol. 66, pp. 2248 -2263, 2005
360. Terabe S., Otsuka K., Ichikawa K., Tsuchiya A., Ando T., Electrokinetic separations
with micellar soluti ons and open -tubular capillaries, Analytical Chemistry, vol. 56, pp.
111-113, 1984.
361. Pizzi A., ed. Wood Adhesives Chemistry and Technology, Marcel Dekker, New York,
pp. 174 -244, 1983
362. Bonoli M., Colabufalo P., Pelillo M., Toschi T.G., Lercker G., Fast determ ination of
catechins and xanthines in tea beverages by micellar electrokinetic chromatography,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 51, no. 5, pp. 1141 -1147, 2003
363. Tan H., Xu W., Zhao A., Zhou L., Lin M., Tan F., Zou Y., Wang Y., Determination of
catechins and purine alkaloids in tea by high performance liquid c hromatography,
Analytical Letters, vol. 45, pp. 2530 -2537, 2012
364. Rahim A.A., Nafrizal S., Saad B., Rapid tea catechins and caffeine determination by
HPLC using microwave -assisted extractio n and silica monolithic column, Food
Chemistry, vol. 147, pp. 262 -268, 2014
365. Arce L., Rios A., Valcarcel M., Determination of anti -carcinogenic polyphenols present
in green tea using capillary electrophoresis coupled to a flow injection system, Journal of
Chromatography A, vol. 827, pp. 113 -20, 1998
366. Pomponio R., Gotti R., Luppi B., Cavrini V., Microemulsion electrokinetic
chromatography for the analysis of green tea catechins: Effect of the cosurfactant on the
separation selectivity, Electrophoresis, vol. 2 4, pp. 1658 -1667, 2003
367. Lopez M.M.C., Vilarino J.M.L., Rodriquez M.V.G., Losada L.F.B., Development,
validation and application of micellar electrokinetic capillary c hromatography method for

Bioanaliza polifenolilor din extractele unor plante medicinale tradi ționale

174
routine analysis of catechins, quercetin and thymol in natural sam ples, Microchemical
Journal, vol. 99, pp. 461 -469, 2011
368. Ye N., Li J., Wang Y., Ma J., Determination of catechins in tea by micellar
electrokinetic chromatography with a grapheme oxide -coated capillary, Instrumentation
Science and Technology, vol. 42, pp. 6 05-617, 2014
369. Sang S., Lambert J.D., Ho C.T., Yang C.S., The chemistry and biotransformation of tea
constituents, Pharmacological Research, vol. 64, pp. 87 -99, 2011
370. Ananingsih V.K., Sharma A., Zhou W., Green tea catechins during food processing and
storage: A review on stability and detection, Food Research International, vol. 50, pp.
469-479, 2013
371. Liu C.M., Chen C.Y., Lin Y.M., Estimation of tea catechin levels using micellar
electrokinetic chromatography: A quantitative approach, Food Chemistry, vol. 150, pp.
145-150, 2014