Bacili Gram Negativi (1) [302404]
[anonimizat], procariotele, [anonimizat] a fi însăși originea vieții. [anonimizat], [anonimizat] o cunoaștem astăzi.
Aroganța de a considera că putem îmblânzi natura și dorința intrinsecă de a accelera atingerea spontană a [anonimizat] a [anonimizat], [anonimizat] a umanității.
[anonimizat], [anonimizat], deoarece doar o [anonimizat], continuitate pe această planetă și îndeplinirea obiectivelor evolutive scontate.
Microbiologia, [anonimizat] o unealtă indispensabilă erei moderne. [anonimizat], a tuturor aspectelor legate de microorganisme și relevarea implicațiilor asociate.
[anonimizat]. [anonimizat] a acestora grăbește procesul. [anonimizat], alături de utilizarea rațională a medicamentelor, evaluarea pragmatică a statusului actual și a perspectivelor de viitor. Doar un efort colectiv poate schimba cursul evenimentelor. [anonimizat]-negativi sunt din ce mai mult asociați cu o durată crescută a spitalizării și cu o incidență mai mare a mortalității de cauză nozocomială.
[anonimizat]-[anonimizat], cât și efectele benefice. [anonimizat] o constantă actualitate și importanță.
PARTEA GENERALĂ
Capitolul I. [anonimizat], [anonimizat], o vastă subcategorie a microorganisme procariote. Având, [anonimizat], [anonimizat]. Bacteriile au fost printre primele forme de viață apărute și sunt prezente în majoritatea habitatelor naturale. Există aproximativ 5×1030 [anonimizat] o biomasă care o depășește pe cea a tuturor plantelor și animalelor. [anonimizat], [anonimizat] a [anonimizat], trăiesc în relații simbiotice sau parazitare cu plantele și animale [Pepper et al., 2009].
Unii autori consideră că microbiomul uman cuprinde aproximativ 39 [anonimizat] 30 de miliarde de celule umane. Preponderent situate la nivelul florei intestinale și pe piele, majoritatea bacteriilor din organism sunt considerate inofensive de sistemul imunitar, având multiple roluri benefice. Cu toate acestea, mai multe specii de bacterii sunt patogene și cauzează boli infecțioase, cum ar fi holera, sifilisul, antrax, tuberculoză, lepră și ciuma bubonică. În țările dezvoltate, se utilizează antibiotice atât pentru tratarea infecțiilor bacteriene, cât și în agricultură, ceea ce face ca rezistența la antibiotice să devină o problemă tot mai mare. În industrie, bacteriile sunt importante în tratarea apelor reziduale, în gestionarea scurgerilor de petrol, în producția de lactate prin fermentație, în recuperarea metalelor în sectorul minier și în biotehnologie, în fabricarea antibioticelor și altor substanțe chimice [Chaplin et al., 2917].
În anul 1987, Carl Woese a împărțit Eubacteria în 11 diviziuni pe baza secvențelor ARN ribozomale 16S (SSU). Cercetătorul a argumentat faptul că bacteriile, archaea și eucariotele sunt linii separate de descendență care s-au diferențiat timpuriu dintr-o singură colonie ancestrală. Cu toate acestea, unii biologi susțin că Archaea și Eukaryota au apărut dintr-un grup de bacterii. În orice caz, relațiile dintre viruși și archaea au început cu aproximativ două miliarde de ani în urmă, susținând coevoluția printre membrii acestor grupuri. De asemenea, a devenit clar că bacteriile metanogene sunt radical diferite, fiind în mod eronat considerate relicve ale unor bacterii vechi. Așadar, Archaea (Archaebacteria), Bacteria (Eubacteria) și Eukaryota (Urkaryota) sunt liniile formalizate, eucariote făcând referire la componenta nucleocitoplasmatică a celulei. În această accepțiune, deoarece Archaea și Bacteria sunt la fel de legate între ele precum sunt de eucariote, singurul sens din prezent al termenului de procariot înseamnă non – eucariot, limitându-i valoarea. Recent, James Lake a prezentat un aranjament binar al regnului, în structura Parkaryotae-eucariote și eocite-Karyotae, sugerând subdiviziunea în cinci încrengături distincte: Eukaryota, Eocyta, Methanobacteria, Halobacteria și Eubacteria bazată pe structura ribozomală. De asemenea, el a arătat că bacteriile gram – negative au apărut dintr-o simbioză între două bacterii gram pozitive [Land et al., 2015].
Procariotele împărtășesc multe trăsături comune, cum ar fi lipsa membranei nucleare, unicelularitatea, diviziunea prin fisiune binară (diviziunea în jumătate, în care replicarea ADN și segregarea au loc simultan) și, în general, au dimensiuni mici. Criteriile de identificare și de clasificare se bazează pe filogenie (deoarece toate bacteriile provin dintr-un strămoș comun și de atunci sunt supuse unui constant proces de diversificare, posedă niveluri diferite de înrudire evolutivă), metabolism (în funcție de procesul evolutiv specific, căile metabolice pot fi diferite), mediu (influențează mult trăsăturile), morfologie (există multe diferențe structurale între bacterii, cum ar fi forma celulei, colorația la proba gram (numărul de bistraturi lipidice), structura membranei celulare, ș.a.m.d.), sau patogenitate [Cabeen și Jacobs – Wagner, 2005].
Microorganisme procariote, bacteriile au o arhitectură celulară simplă. Acestea se subdivid în trei mari clase: arhebacterii, eubacterii și cianobacterii. Sunt invizibile cu ochiul liber, dimensiunile lor fiind cuprinse între 0,2 μm și 1 m, cu o grosime de 1 μm. Arhebacteriile trăiesc în medii lipsite de oxigen (anaerobe) și includ, spre exemplu, bacteriile metanogene, halofile și pe cele regăsite în apele termale. Acestea formează un alt regn distinct, Archaea, fiind diferite față de bacterii. Eubacteriile, adică bacteriile propriu – zise, trăiesc în toate mediile de viață: apă, aer, sol, ori pe / în alte viețuitoare [Ordeanu, 2018].
I.1 Morfologia bacteriană
În general, morfologia bacteriilor este o trăsătură invariabilă a speciei ce permite recunoașterea bacteriilor în cadrul cercetărilor de laborator. Configurația se relevă cel mai bine la bacteriile tinere active în medii favorabile, provenite din multiplicare recentă. Odată cu îmbătrânirea celulelor, aspectul bacteriilor se poate modifica. Formele de involuție sunt degenerări morfologice bacteriene. Acesta este și unul dintre criteriile de clasificare, prin examinare directă la microscopul optic, în funcție de morfologie și de dispunere [Ordeanu, 2018].
În funcție de forma celulei, se disting coci, bacili, cocobacili, spirale și molicute. În timp ce cocii au forma aproximativ sferică, bacilii se disting prin forma alungită, cilindrică, asemănătoare unui bastonaș. Extremitățile corpului bacilar alungit pot fi rotunjite (Enterobacteriaceae), tăiate drept (Bacillus anthracis), măciucate (Corynebacterium diphtheriae), ascuțite (Lysinibacillus fusiformis) sau corpul neregulat, granular (Mycobacterium tuberculosis). Există, de asemenea, o morfologie intermediară între coci și bacili, cocobacilii. Vibrionii sunt forme morfologice sub formă de virgulă. Bacteriile mobile, lungi, filamentoase cu spire mari se numesc spirili. Bacteriile bacterii subțiri, flexuoase și foarte mobile prin prezența fibrelor contractile se numesc spirochete. Formele morfologice diferite ale bacteriilor parazite ce nu prezintă un perete bacterian sunt grupate în moliculite [Ordeanu, 2018].
Gruparea bacteriilor apare ca o consecință a diviziunii celulare și se realizează în funcție de planurile de diviziune. Întrucât așezarea este caracteristică speciei, acest aspect facilitează procesul de diagnosticare. Doar unele specii de bacili prezintă o aranjare caracteristică, printre care Klebsiella pneumoniae ce formează diplobacili prin așezarea cap la cap a elementelor, Bacillus anthracis se dispune în lanțuri formând streptobacili, Corynebacterium diphtheriae care se dispune sub forma literelor chinezești sau a literor mari de tipar, X, Y, Z, Mycobacterium tuberculosis ce se așează caracteristic sub forma a două elemente unite prin una dintre extremități sau Corynebacterium pseudodiphtheriticum care se dispune în palisade.
I.2 Structura internă a bacteriei
Asemenea oricărei celule, bacteriile dezvăluie o compoziție chimică complexă, și anume apă în proporție de 70-85%, proteine cu componență specifică, acizi aminați, lipide, zaharuri, săruri minerale, enzime și pigmenți. Explorarea organizării interne a bacteriilor a putut fi studiată recent, prin microscopia electronică sau cu contrast de fază, prin citogenetica bacteriană și prin metode de biochimie celulară. Structura celulei bacteriene este asemănătoare cu cea eucariotă a organismelor superioare, prezentând, în esență, nucleu diferențiat, citoplasmă și perete celular. Cu toate acestea, celula bacteriană are o structură mai simplă, procariotă. Protoplastul este forma celulei bacteriene alcătuite doar din nucleu, citoplasmă și membrană citoplasmatică viabil doar în medii hipertonice bogate în substanțe nutritive de origine animală. De obicei, însă, protoplastul este înconjurat la exterior de un strat mai rezistent, peretele bacterian [Ordeanu, 2018].
Peretele bacterian, plasat în afara membranei citoplasmatice, înconjoară protoplastul, fiind alcătuit dintr-un strat relativ rigid de 10-15 pm de complex mucopeptidic, cu componență specifică bacteriilor, care conține: acetil – glucozamină, acid acetil – muramic, lizină, adenină și acid diaminopimelic. Aceasta reprezintă structura de bază a peretelui bacterian și se regăsește în proporție de 80% în bacteriile gram pozitive și doar de 20% la bacteriile gram-negative. În alcătuirea peretelui intră, în continuare, structurile speciale (la bacteriile gram pozitive sunt constituite în mare parte de acizii teichoici, iar la bacteriile gram-negative de lipopolizaharide identice cu endotoxinele). Secțiunea peretelui bacterian apare prin examinare la microscopul electronic sub formă tristratificată la bacteriile gram-negative și dublu stratificată la bacteriile gram pozitive. De asemenea, se observă prezența a numeroase subunități macromoleculare sferice egale, dispuse simetric pe suprafață [Ordeanu, 2018].
Peretele bacterian prezintă o serie de funcții importante:
a. Menținerea constantă a formei bacteriei și protejare împotriva factorilor nocivi externi (spre exemplu, de variațiile de presiune osmotică);
b. Structura diferită a permis diferențierea a două mari categorii de bacterii pe baza colorației Gram: gram pozitive și gram-negative;
c. Porozitatea peretelui permite pătrunderea nutrienților solubili cu dimensiunea potrivită până la nivelul membranei citoplasmatice – rol de transport pasiv în nutriție;
d. La nivelul suprafeței se pot afla receptori speciali pentru fixarea unor fagi sau a unor substanțe (medicamente, toxici, metaboliți, etc.);
e. Rol activ în diviziunea celulară, despărțind cele două celule fiice;
f. Reprezintă sediul unor antigene importante, precum endotoxina bacteriilor gram-negative, antigenul O (în zona profundă a peretelui) și antigene specifice de virulență.
În momentul în care în mediu există o deficiență a elementelor esențiale necesare sintezei peretelui, când intervin la acest nivel factori precum lizozimul (enzima litică activă asupra peretelui bacterian) sau în prezența unor substanțe, sinteza este incompletă sau nu mai are loc. Bacteriile cu perete deficitar (forme L) apar în anumite condiții experimentale sau in vivo în timpul tratamentului medicamentos sub formă de protoplaști (elemente complet lipsite de perete) sau sferoplaști (cu rest de perete). Peretele deficitar este gram-negativ și duce la polimorfism și la sensibilitate ridicată la variațiile de presiune osmotică (micoplasme și unele bacterii). Protoplaștii nu se multiplică, nu revin la forma inițială și la final lizează [Ordeanu, 2018].
Membrana citoplasmatică este constituentul lipoproteic structural cu rol de separare a citoplasmei de peretele celular și prezintă o organizare tristratificată. Delimitează la exterior protoplastul, apărând ca o condensare a citoplasmei. Acționând ca barieră osmotică, reglează schimburile nutritive pasive pentru apă și anumiți ioni liposolubili, și activ selective cu ajutorul permeazelor. La acest nivel se regăsesc și numeroase enzime respiratorii. De asemenea, membrana citoplasmatică intervine și în diviziunea celulară fiind implicată, alături de perete, la formarea septului transversal [Ordeanu, 2018].
Citoplasma bacteriană reprezintă un sistem coloidal complex în care apa, proteinele, glucidele, lipidele și substanțele minerale se regăsesc sub formă vâscoasă, de gel. La acest nivel au loc cele mai importante procese metabolice vitale și de multiplicare. Prin examinare la microscopul electronic s-a evidențiat prezența a numeroase granulații sferice, ribozomii. Sediul sintezei proteinelor bacteriene specifice, aceștia reprezintă depozite de ARN dispuse pe o rețea reticulară fină (reticul) fixate de membrana citoplasmatică. La nivelul citoplasmei se regăsesc:
a. Mezozomi, numiți și corpi membranoși sau condrioizi, reprezintă corpusculi tubulari sau lamelari care fac legătura cu nucleul, prelungiri de membrană citoplasmatică. La acest nivel se regăsesc enzimele respiratorii și unele enzime cu rol în nutriție. Se pare că au, de asemenea, un rol activ în diviziunea celulară, alături de nucleu;
b. Incluziunile sunt particule granulare dense cu rol de depozite de rezervă, formate din glicogen, amidon, sulf, polimetafosfat. Granulațiile de volutină (polimetafosfat) se colorează metacromatic și sunt extrem de numeroase la anumite specii;
c. Vacuolele sunt formațiuni de 0,3-0,5 μm situate la nivelul citoplasmei, care conțin apă și permit dizolvarea substanțelor nutritive.
Nucleolul este o formațiune intracelulară ce nu prezintă membrană (nucleol, la celula procariotă) constituită din filamente foarte fine, dispuse sub formă de scul înfășurat și supraînfășurat-filamentul cromozomial unic repliat pentru a ocupa un spațiu foarte redus, care desfășurat are formă elicoidală. La nivelul cromozomului se regăsesc genele determinante ale eredității. În alcătuirea nucleului intră două lanțuri polinucleotidice, mononucleotidele din componența acestuia conținând două baze purinice: adenina și guanina și două baze pirimidinice: timina și citozina. Difracția ADN cristalizat cu raze X a arătat înfășurarea elicoidală a celor două lanțuri în jurul unui ax central. Lanțurile sunt unite prin punți de hidrogen ce apar obligatoriu stereotipic între adenină și timină, guanină și citozină de pe cele două lanțuri diferite. Baza azotată (purinică sau pirimidinică) se leagă întotdeauna de zaharul din ADN, dezoxiriboza, care la rândul său este legat de acidul fosforic. Deoarece la nivelul nucleului se regăsesc în gene toate atributele speciei ce urmează a fi transmise ereditar descendenților, rolul său devine esențial în procesele de multiplicare ce au loc în mod uzual prin diviziune directă (sciziparitate). Diviziunea nucleului începe prin clivajul longitudinal al cromozomului cu resintetizarea concomitentă a lanțului complementar. La finalul clivajului apar doi nuclei identici, având aceeași structură și conținând aceeași informație genetică. În cazul anumitor specii bacteriene se pot întâlni și alte elemente morfologice, accesorii, ce pot lipsi în cadrul speciei fără a afecta viabilitatea celulei.
Situată în afara peretelui bacterian, capsula apare doar la anumite specii bacteriene, prezentând dimensiuni variabile în funcție de specie și de condițiile de mediu (de la microcapsulă până la clar distinctă, caz în care se poate evidenția prin metode imunologice sau tehnici speciale de colorare sau se poate prezenta sub forma unei mase capsulare abundente în care plutesc bacteriile). Este un produs poliozidic de secreție. Prin abundența de mucopolizaharide, coloniile capătă un aspect ”mucos”. Rolul capsulei este de protecție împotriva condițiilor nefavorabile ale mediului extern și de acțiunea fagocitelor. La acest nivel se regăsesc, în cazul unor specii bacteriene, antigene importante (VIa la salmonele sau polipeptidic la bacilul antraxului), de unde și virulența crescută. În caz de absență a capsulei la aceste bacterii, virulența scade considerabil (cazul tulpinililor vaccinale) [Ordeanu, 2018].
Cilii (flageli) sunt apanajul speciilor mobile (organ de locomoție), fiind frecvent întâlniți la bacili. Sunt constituiți din proteina flagelină (antigen flagelar). Cilii prezintă cel puțin două (de obicei trei sau cinci ) filamente răsucite elicoidal, formând un filament axial unic, înconjurat de o teacă. Aceștia sunt inserați pe o granulație bazală citoplasmatică, după care traversează peretele bacterian. În funcție de așezarea față de bacterie, se deosebesc:
Cili peritrichi (număr mare care înconjoară bacteria;
Cili lofotrichi (smoc de cili la unul sau ambele capete);
Cili amfitrichi (cât un cil la ambele capete);
Cili monotrichi (un cil la un capăt).
Fibrii (pilii) reprezintă apendice mai scurte și mai drepte în comparație cu cilii, prezente în număr mare la anumite specii bacteriene, adesea la bacili gram-negativi. Au o constituență proteică și rol în adeziunea pe suporturi solide, cu un posibil rol în hemaglutinare. Contribuie și la stabilitatea și aderența biofilmului microbian [Ordeanu, 2018].
Sporul este o structură intracelulară prezentă doar la anumite specii bacteriene (Bacillus, Clostridium, etc.). Se consideră în prezent că sporogeneza este o etapă fiziologică normală în evoluția bacteriilor sporulate, în cazul indivizilor maturi, odată cu îmbătrânirea sau odată cu modificarea anumitor condiții de mediu. Sporul eliberat de forma vegetativă poate rezista în mediu extern foarte mult timp întrucât prezintă un conținut scăzut de apă, iar bacteria se află în repaus metabolic complet. Reintrodus în condiții favorabile, sporul reproduce bacteria inițială cu toate caracterele speciei, nemodificate. În scopul perpetuării speciei, sporul reprezintă formă de rezistență a bacteriei în natură. Astfel, se disting:
a. Spori centrali care nu deformează corpul bacterian (genul Bacillus);
b. Spori centrali sau subterminali care prin dimensiuni deformează corpul (genul Clostridium);
c. Spori situați terminal care modifică morfologia bacteriei (genul Plectridium).
Glixocalixul este un fel de ”ciment” format din mucoproteine, care leagă bacteriile de substratul pe care se află și / sau între ele. Favorizează formarea de biofilme, monostraturi de microorganisme, care căptușesc unele suprafețe pentru a dobândi o mai mare rezistență în mediul ambiant, față de factori fizici, chimici sau biologici [Ordeanu, 2018].
I.3 Fiziologia bacteriană
Conceptul de fiziologie bacteriană reprezintă cumulul de procese biologice dintr-o populație microbiană, incluzând toate procesele metabolice complexe de nutriție și respirație până la creșterea, multiplicarea și moartea bacteriilor. Fiziologia bacteriană este diferită de cea a organismelor superioare, prin varietatea și intensitatea excepțională a proceselor metabolice. Prin urmare, bacteriile prezintă abilitatea de se dezvolta, crește și multiplica extrem de repede în decursul a 12-24 de ore dacă sunt plasate în condiții favorabile. Multiplicarea poate fi uneori atât de intensă, încât substratul pe care acționează bacteriile este puternic modificat.
Metabolismul bacterian cuprinde totalitatea reacțiilor biochimice dintre celulă și substrat pentru asigurarea funcțiilor biologice vitale. În funcție de substratul nutritiv, bacteriile prezintă un grad ridicat de adaptabilitate și o mare variație a tipurilor metabolice. Acestea pot să difere între specii sau chiar în cadrul aceleiași specii [Ordeanu, 2018].
Există două mari tipuri de reacții catalizate enzimatic în metabolismul bacterian, acestea neffind distincte, ci interdependente:
Reacții prin care celula își furnizează energia necesară tuturor produselor biochimice vitale (metabolism energetic);
Reacții de sinteză, prin care baza substanțelor nutritive din mediu se sintetizează materia vie proprie, specifică celulei bacteriene (metabolism de sinteză) [Ordeanu, 2018].
Metabolismul energetic (respirația bacteriană)
În raport cu sursa de energie utilizată, bacteriile se împart în foto și chemosintetizante. Bacteriile fotosintetizante (fototrope) utilizează energia solară. Fotosinteza la bacterii se deosebește fundamental de acela al clorofilei de la algele unicelulare. Bacteriile fotosintetizante autotrofe cuprind grupa sulfo-bacteriilor purpurii și verzi, care utilizând energia furnizată de lumina solară cu ajutorul pigmenților fotosintetizanți, își realizează sintezele pornind de la dioxid de carbon și surse anorganice (de exemplu hidrogen molecular și compuși minerali de sulf). Aceste bacterii trăiesc libere în natură, în apele stătătoare sau termale sulfuroase, mai ales în anaerobioză, sub planctonul de alge acvatice. Bacteriile fotosintetizante heterotrofe sunt bacterii saprofite, purpurii nesulfuroase, în general anaerobe care utilizează ca sursă de energie lumina solară, iar pentru sinteză au nevoie și de structuri organice (de exemplu alcoolii și acizii grași). [Ordeanu, 2018].
Bacteriile chemosintetizante cuprind majoritatea bacteriilor care utilizează ca sursă de energie procesele oxidative, pe seama substanțelor chimice prezente în substratul nutritiv. Bacteriile autotrofe își obțin energia prin oxidarea unei substanțe anorganice: amoniac, dioxid de azot, hidrogen sulfurat, fier, sulf, hidrogen. Aceste bacterii prezintă o specializare deosebită asupra substratului din care își eliberează energia necesară și pe care îl oxidează; de aceea au primit denumirea de fero-bacterii, hidrogen-bacterii, sulfo-bacterii, etc. Bacteriile heterotrofe folosesc drept surse de energie oxidarea aerobă sau anaerobă a unor substanțe organice care de multe ori reprezintă totodată și sursa lor de carbon. Cel mai adesea utilizează glucidele, acizii grași, alcoolii care sunt degradați prin oxidare la dioxid de carbon și apă. [Ordeanu, 2018].
Bacteriile paratrofe, fiind parazite obligatorii intracelulare, energia necesară reacțiilor biochimice de sinteză este furnizată în totalitate de către organismul gazdă.
Orice proces chimic aerob sau anaerob prin care energia este pusă în libertate de către celula bacteriană pentru a fi folosită la sinteza materialului celular poartă numele de metabolism energetic sau în sens mai larg, de respirație bacteriană. Respirația se referă deci la toate reacțiile producătoare de energie care au loc în celulă și datorită cărora celula trăiește. De obicei aceste reacții sunt de oxidare cuplate întotdeauna cu reacții de reducere și constituie potențialul de oxido-reducere celular. Tipul cel mai frecvent de respirație la bacterii este respirația aerobă (asemănătoare cu cea a organismelor superioare) în care substanța organică este oxidată în organism până la dioxid de carbon și apă cu ajutorul hidrogenului atmosferic. Prin oxidare se înțelege transportul unui atom de hidrogen de la un donator la un acceptor. Când acest ultim acceptor este oxigenul liber, au loc procese de oxigenare, iar bacteriile care pot trăi în prezența oxigenului atmosferic se numesc aerobe [Ordeanu, 2018].
Ulterior s-a constatat că bacteriile pot avea și respirație de tip anaerob, în care microorganismele nu au nevoie de oxigenul atmosferic pentru activitatea lor vitală. Aceste bacterii, numite anaerobe, își procură energia necesară din procesele de fermentație care au loc în substratul nutritiv prin dehidrogenare în absența oxigenului atmosferic. Ultimul receptor de hidrogen în acest caz poate fi orice substanță anorganică, cu excepția oxigenului. Deoarece prin oxidarea biologică se eliberează în final o cantitate mare de energie, respirația bacteriană este asigurată prin două mecanisme: eliberarea energiei sub formă fracționată și depozitarea energiei în scopul unei utilizări ulterioare.
Eliberarea fracționată a energiei (respirația propriu-zisă) se realizează prin intermediul unor succesiuni de reacții de oxido-reducere catalizate de enzime respiratorii care alcătuiesc așa numita catenă de respirație celulară. Aceasta acționează prin enzime numite dehidraze care includ trei categorii principale de enzime: piridinice, flavinice și sistemul citocromilor. Procesele redox funcționează de cele mai multe ori, prin două sisteme enzimatice complete: sistemul citocrom-oxidazic și sistemul flavoproteinic. În orice caz, există un lanț întreg de reacții chimice, catalizate enzimatic, fiecare treaptă a procesului respirator fiind asigurată de procese enzime diferite, specializate. Faptul că energia se eliberează treptat, ea poate fi utilizată în mod continuu în procesele de degradare și sinteză a materialului celular. Energia se înmagazinează într-un compus organic de fosfor, reprezentat de acidul adenozintrifosforic (ATP cu o legătură puternică, macroergică) care poate elibera, la nevoie, această energie cu ușurință în interiorul celulei bacteriene. În funcție de modul cum folosesc oxigenul molecular, microorganismele pot fi grupate în patru tipuri respiratorii:
a. Strict aerobe, care folosesc oxigenul molecular ca acceptor de hidrogen, în sistemul citocromic, deci ele au nevoie în mod obligatoriu de oxigen pentru a trăi;
b. Strict anaerobe, microorganisme care își procură energia necesară activității lor vitale din procesele de fermentație, în absența oxigenului liber. Dacă oxigenul ar fi prezent în mediu, el având rol de ultim acceptor de hidrogen, s-ar produce apa oxigenată, substanță toxică pentru bacterii. Această substanță la bacteriile aerobe este neutralizată de catalază, enzimă care lipsește la bacteriile anaerobe. De aici explicația anaerobiozei și necesitatea eliminării oxigenului din mediile utilizate pentru cultivarea bacteriilor anaerobe;
c. Facultativ anaerobe, se dezvoltă în mod obișnuit în prezența oxigenului pe care îl utilizează, dar se pot dezvolta și în absența lui. Aici se încadrează majoritatea bacteriilor, în special enterobacteriile, bacteriile lactice, levurile;
d. Microaerofile. Aceste microorganisme au nevoie de o cantitate de oxigen mai mică decât cea din aerul atmosferic, deoarece unele din enzimele lor sunt sensibile la condițiile de oxidare puternică.
Metabolismul de sinteză (nutriția bacteriană)
Metabolismul de sinteză (nutriția bacteriană) cuprinde totalitatea reacțiilor biochimice prin care celula bacteriană își furnizează materialele plastice necesare pe care le transformă în substanțe specifice proprii. În condiții favorabile metabolismul este activ, însă există osibilități de adaptare la mediile mai puțin favorabile. Funcțiile biologice normale se pot realiza doar în cazul prezenței în mediu a substanțelor chimice necesare, incluzând surse de carbon, surse de azot, compuși organici pe care bacteria nu îi poate sintetiza și deci trebuie să îi găsească în mediu; ioni anorganici esențiali: carbon, oxigen, azot, hidrogen, fosfor, sulf; numeroase bacterii mai necesită și potasiu, mangan, fier, zinc, cupru, etc. [Ordeanu, 2018].
Se știe că în natură bacteriile se comportă foarte variat, de la cel mai complet saptofitism până la parazitismul cel mai strict, deci apar necesitățile metabolice diferite. Din punct de vedere al nutrienților, bacterii sunt autotrofe (necesită substanțe simple, anorganice) și heterotrofe (necesită substanțe mult mai complexe) [Ordeanu, 2018].
Bacteriile autotrofe își pot sintetiza constituenții celulari din surse anorganice simple de carbon și azot ca dioxidul de carbon, dioxidul de azot, amoniac și nitrați. Astfel, unele specii utilizează dioxidul de carbon ca sursă unică de carbon, iar amoniacul ca unica sursă de azot și apă. Pentru sinteză ele își procură energia necesară fie din lumina solară (bacterii sulfo-purpurice), fie prin oxidarea unor compuși anorganici folosind oxigenul. Denumirea de autotrofe subliniază abilitatea de a se dezvolta în natură cu totul independent de materia organică.
Bacteriile heterotrofe necesită pentru metabolismul lor de sinteză compuși organici care în majoritatea cazurilor le furnizează atât energia necesară, cât și sursa de carbon. Bacteriile heterotrofe prezintă numeroase tipuri metabolice, având exigențe nutritive diferite în raport cu mediul de viață (saptofit sau parazit). Cu cât bacteria este mai adaptată la viața de parazitism, în care caz are la dispoziție toate elementele pentru propriul său metabolism în organismul gazdei, cu atât necesitățile nutritive vor fi mai mari in vitro. Fiind mai puțin dotată enzimatic, eadevine astfel incapabilă să își sintetizeze singură metaboliții săi esențiali. Dacă se dorește cultivarea în condiții de laborator a acestora, este necesară suplimentarea mediului de cultură cu substanțe nutritive. Numeroase specii heterotrofe au exigențe metabolice și mai mari. Nevoia de factori de creștere a unor microorganisme este atât de specifică, încât multiplicarea este direct proporțională cu prezența acelui factor în mediu. Cele mai importante tipuri metabolice ale acestor bacterii sunt [Ordeanu, 2018]:
a. Carbon organic și azot molecular atmosferic (bacterii fixatoare de azot răspândite în sol și apă, specii aerobe (Azotobacter) sau anaerobe (Clostridium pasteurianum) și alte specii fixe care trăiesc în simbioză cu plantele leguminoase (Rhisobium));
b. Carbon din surse organice și azot din surse anorganice (carbon din substanțe polizaharidice, acizi organici, alcooli, lactați, iar azotul din amoniac sau săruri de amoniu);
c. Carbon și azot din sursă organică; aici se încadrează unele specii saprofite.
Mecanismul nutriției. În condiții favorabile, bacteria utilizează substanțele nutritive din substrat după ce le transformă cu ajutorul unor enzime exogene (elaborate și eliminate în afara celulei) denumite desmolaze, până la produși care pot pătrunde prin perete și membrana citoplasmatică în interiorul celulei bacteriene. La acest nivel, în citoplasma bacteriană au loc o serie de reacții chimice catalizate de enzime specializate, pentru a desăvârși desfacerea substanțelor nutritive până la elemente sau compuși simpli în vederea realizării sintezei. Această sinteză se realizează treptat, în compuși din ce în ce mai complecși, până se ajunge la compoziția specifică celulei bacteriene. Procesele au loc în mod activ, când substratul nutritiv este intens modificat prin reacții biochimice complexe. Modul în care microorganismele pot degrada în natură sau în produsele contaminate substanțele chimice complexe, de natură diversă: proteine, glucide și grăsimi [Ordeanu, 2018].
Degradarea substanțelor proteice din mediu. Proteinele reprezintă surse importante de azot și carbon. Ele pot fi degradate intens de Aspergillus, Penicillium, Rhisopus, numeroase bacterii aerobe Bacillus, Pseudomonas, anaerobe facultative Proteus, Serratia, precum și bacterii sporulate strict anaerobe din genul Clostridium. Microorganismele degradează substanțele proteice prin procese complexe de oxidare și decarboxilare în două faze: proteoliza și putrefacția. Proteoliza, în care acționează enzimele bacteriene speciale, proteinaze și peptidaze, în limite largi de pH (1,5-10,5) și prin care proteinele sunt scindate până la aminoacizi; de exemplu gelatina și caseina sunt rapid degradate, lichefiate de bacteriile proteolitice. Urmează apoi procesul anaerob de putrefacție în care aminoacizii sunt asimilați ca atare sau degradați în continuare. Dezaminarea acizilor aminați catalizată de decarboxilaze are ca rezultat eliberarea de amoniac, care este apoi utilizat de bacterie ca sursă de azot. Prin decarboxilarea anaerobă a aminoacizilor determinată de bacterii se eliberează gruparea COOH, se formează dioxid de carbon și amina corespunzătoare. Enzimele bacteriilor proteolitice (ribonucleaze, dezoxiribonucleaze) acționează specific asupra acizilor nucleici prin depolimerizare, determinând o degradare ireversibilă [Ordeanu, 2018].
Degradarea glucidelor. Aceste substanțe reprezintă o sursă importantă de energie pentru microorganisme și furnizează în același timp carbon, necesar pentru nutriția lor. Cea mai mare cantitate a rezervei de carbon este reprezentată de oligo- , dar mai ales de polizaharide, care într-un prim stadiu sunt transformate sub acțiunea microorganismelor în monozaharide. Degradarea lor se datorează unor enzime numite diastaze (amilaze, maltaze) care acționează prin procese de oxidare și descompun, de exemplu, hexozele până la dioxid de carbon și apă sau acționează prin hidroliză și reducere. Fermentațiile bacteriene se caracterizează printr-o puternică consumare a glucidelor cu transformarea incompletă a acestora în stadii succesive. În timpul fermentațiilor bacteriene, dirijate enzimatic, se degajă o cantitate mare de energie. Glucoza, de exemplu, poate fi descompusă până la acid piruvic, care reprezintă o substanță importantă în metabolismul bacterian. Acidul piruvic este decarboxilat aerob sau anaerob prin fermentație alcoolică sau lactică. Glucoza mai poate fi fermentată prin hidroliză și fosforilare cu beta-galactozidoze și invertaze [Ordeanu, 2018].
Polizaharide. amidonul este degradat cu ajutorul enzimei amilază în maltoză și apoi, în continuare, în glucoză. Numeroase microorganisme pot acționa asupra celulozei. Siu (1951) a stabilit o listă de peste 150 de microorganisme celulotice, aparținând unor grupuri foarte diverse de Eubacterii (Bacillus, Bacterium, Cellulomonas, Clostridium, Pseudomonas, Vibrio), bacterii din grupul Myxobacterii, Actinomicete și mucegaiuri. Anumiți patogeni pot hidroliza acidul hialuronic, favorizând propagarea infecției.
Lipidele sunt degradate cu ajutorul lipazelor extracelulare, care prin hidroliză scindează fosfolipidele, sterolii în glicerol și acizii grași (în special palmitic și stearic) [Ordeanu, 2018].
Capitolul II. Bacili gram-negativi de interes medico-farmaceutic
II.1 Bacilii gram-negativi ai familiei Enterobacteriaceae
Cel mai adesea, patologiile infecțioase umane sunt corelate cu prezența bacililor gram-negativi. Acest aspect se manifestă nu doar asupra numărului total de cazuri identificate, dar și în ceea ce privește numărul de specii și cuantumul testelor de sensibilizare (antibiograme). Enterobacteriaceele sunt localizate intestinal și pătrund digestiv. Speciile patogene numără genurile Salmonella și Shigella. De asemenea, anumite specii saprofite din componența florei intestinale pot deveni patogene în anumite condiții, precum genurile Escherichia, Klebsiella și Proteus. Unele grupuri intermediare: Arizona, Citobacter, Hafnia, Serratia sunt în general nepatogene, determinând în mod excepțional infecții la om. Heterogenitatea enterobacteriaceelor se datorează în primul rând habitatului complex, reprezentat de mediul intestinal. La acest nivel, se regăsesc numeroase specii și numeroase genuri care se interinfluențează și intercondiționează, ceea ce implică o variabilitate mare a caracteristicilor biochimice, antigenice și a structurilor și mijloacelor de apariție a patogenității. De asemenea, acesta este argumentul și din spatele diferitelor incercări de clasificare pentru încadrarea acestor bacterii într-un grup sau în altul.
Criteriile de clasificare sunt de obicei cele chimice și de structură antigenică. Clasificarea lui Ewing și Edwards (1960) acceptată în prezent împarte familia în diviziuni principale sau triburi și apoi în grupuri sau genuri. Fiecare gen cuprinde mai multe serotipuri care la rândul lor prezintă mai multe tipuri fagice și tipuri fermentative (biotipuri). Complexitatea caracterelor biochimice sau antigenice impune efectuarea testelor diferențiale.
Caractere generale. Enterobacteriaceele se întâlnesc sub formă de bacili sau de cocobacili gram-negativi nesporulați și de cele mai multe ori necapsulați, cu o lungime cuprinsă între 1 și 3 μm, având o grosime cuprinsă între 0,4 și 0,6 μm. În ceea ce privește forma, aceștia prezintă capete rotunjite. În cadrul genului există diferențe de mobilitate, unii baciili putând fi mobili și alții imobili. Bacteriile din genul Enterobacteriaceae reduc nitrații la nitriți, cultivă pe medii simple și au abilitatea de a fermenta glucoza sau alte zaharuri cu sau fără producere de gaz [Ordeanu, 2018].
Tabelul I Clasificarea Enterobacteriaceelor (adaptare după Ewing și Edwards)
Sursa: Ordeanu V., Microbiologie farmaceutică. Note de curs, Editura Universității Titu Maiorescu, Editura Hamangiu, București, 2018
Enterobacteriaceae au o structură antigenică complexă constituită din: antigenele somatice O, antigene de suprafață sau de înveliș K și antigene flagelare H, prezente numai la specii mobile. Recent s-a descris la nivelul fimbrilor la unele Enterobacteriaceae un singur antigen fimbrial prezent în formațiunile numite fimbri sau pili cu rol în aderare pe suporturi solide (hematii, medii de cultură sticlă) și care uneori pot determina reacții serologice încrucișate în cursul diagnosticului de laborator. Rezistența la antibiotice se poate transmite prin mecanisme genetice. Acestea sunt reprezentate de către transducția cu bacteriofag sau conjugare. În același timp, la nivel subcelular se regăsește factorul plasmidic de rezistență R care transferă prin conjugare rezistența la antibiotice de la o tulpină saprofită sau patogenă la o tulpină sensibilă patogenă prin schimb de ADN citoplasmatic fără intervenția nucleului. Procesul are loc frecvent, de unde și multirezistența la antibiotice; se impune deci efectuarea imediată a examenelor de laborator pe produse patologice proaspete și efectuarea antibiogramei [Ordeanu, 2018].
Genul Escherichia
Escherichia coli, descoperit de către Theodor Escherich în anul 1895, este un constituent obișnuit al florei normale a intestinului la om și animale unde apare după primele ore de la naștere [Ordeanu, 2018]. Genul Escherichia grupează cinci specii: Escherichia coli (cu biovarurile normal și inactiv), Escherichia blattae, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii și Escherichia vulneris. În intestinul omului, Escherichia coli reprezintă flora dominantă a intestinului gros având un rol important în menținerea unei fiziologii normale a acestuia și în sinteza unor proteine din grupul B și K. Eliminat în mediul extern cu materiile fecale contaminează apa, solul, alimentele etc. și în prezent, tulpinile de Escherichia coli reprezintă indicatorul de poluare fecală a mediului [Toma Săcărea, 2006]. De obicei saprofit, el poate deveni în anumite condiții patogen. Unele infecții prezintă tendință recidivă și de cronicizare, fiind greu de tratat [Ordeanu, 2018].
Escherichia coli este o bacterie rezistentă în mediul extern care însă poate fi distrusă cu ușurință de către antisepticele și dezinfectantele uzuale. Cu toate acestea, prezintă o capacitate deosebită de adaptare la modificările de mediu cum ar fi prezența unor minerale, modificări de pH, temperatură, osmolaritate. Poate sesiza prezența sau absența unor substanțe chimice sau gaze în mediul său de viață și, cu ajutorul cililor, se poate apropia sau îndepărta de acestea. Poate de asemenea să devină imobil și să producă fimbrii de adeziune care să-i permită aderarea de substratul specific. Ca răspuns la modificările de temperatură sau osmolaritate își modifică dimensiunea porilor prin modificări ale porinelor constituente ale membranei externe, variind-o pentru acumularea moleculele mari de nutrienți sau pentru a elimina substanțele inhibitoare. Are abilitatea de sintetizare de enzime care hidrolizează antibioticele betalactamice sau rezistența poate apărea prin mutații la nivelul porinelor [Toma Săcărea, 2006].
Caracterele morfotinctoriale. Bacil gram-negativ, Escherichia coli poate prezenta și forme filamentoase. De asemenea, există variații și în ceea ce privește prezența capsulei, a cililor peritrichi și a mobilității [Toma Săcărea, 2006].
Caracterele de cultură descriu Escherichia coli ca fiind un germen nepretențions, bine adaptat mediului său de viață. Acesta crește pe medii simple în care glucoza poate fi singurul constituent organic. Este aerob, facultativ anaerob, care poate avea deopotrivă metabolism fermentativ sau respirator. Formează colonii de tip „S” la cultivarea în medii solide și formează un inel aderent pe peretele tubului în mediile lichide pe care le tulbură uniform [Toma Săcărea, 2006]. Formează indol în apă peptonată și nu crește pe mediu cu citrat [Ordeanu, 2018].
Caractere biochimice și de metabolism. Fermentează glucoză și carbohidrați, producând acid și gaz, iar la descompunerea lactozei eliberează acid. De asemenea, tulpinile de Escherichia coli au abilitatea de descompunere a proteinelor, când formează indol, iar reacția roșu metil este pozitivă. Majoritatea tulpinilor sunt oxidază negative și sunt capabile să reducă nitriții în nitrați. Nu produc urează și nu descompun proteinele cu formare de hidrogen sulfurat. Tulpinile de Escherichia coli care posedă plasmidul „col” eliberează colicine, substanțe toxice pentru alte tulpini bacteriene [Toma Săcărea, 2006].
Structura antigenică a tulpinilor de Escherichia coli cuprinde:
1. Antigenul O (somatic) care prezintă specificitate de grup. Acesta corespunde poliozidelor fixate pe lipopolizaharidele peretelui bacterian [Toma Săcărea, 2006]. Antigenul O prezintă stabilitate termină, la acizi și la alcool. Prin reacții de aglutinare au fost identificate 180 de serogrupe antigenice O și multe dintre acestea au reacții încrucișate cu antigenele unor tulpini de Klebsiella, Salmonella, Providencia sau Vibrio, și unele comune cu Shigella;
2. Antigenul H sau antigenul flagelar este prezent doar la tulpinile ciliate și este alcătuit dintr-o proteină specifică numită flagelină. Are specificitate de tip, este termolabil și este inactivat de alcool. Prin reacții de aglutinare au fost evidențiate 56 de serotipuri H;
3. Antigenul K sau antigenul capsular este de natură polizaharidică, are specificitate de tip. Acesta a fost identificat la tulpinile uropatogene de Escherichia coli și la tulpini implicate în cazuri de meningită neonatală (antigen K1). Determină O-inaglutinabilitatea tulpinilor. Se cunosc 103 antigene K;
4. Antigenul B, cu diferitele sale variante, este un antigen de suprafață;
5. Antigenele de aderență (adezine, pili, fimbri), de natură proteică.
Caractere de patogenitate. Pe baza antigenelor O, H și K au fost identificate peste 700 de serotipuri de Escherichia coli. Serotipia este utilă în identificarea acelor tulpini implicate în procese patologice umane. În cadrul speciei se disting numeroase variante care exprimă caractere de patogenitate, variante numite patovaruri, patotipuri. Escherichia coli este patogenă prin virulență și/sau toxigenitate și, în funcție de determinanții de patogenitate prezenți, tulpinile de Escherichia coli pot cauza diferite afecțiuni [Toma Săcărea, 2006]. Unele tulpini O111B4, O119B14, etc. cu o anumită structură antigenică (prezența acțiunii B în antigenul K de înveliș) sunt foarte patogene pentru copilul mic în special în primii trei ani de viață determinând otite, mastoidite, meningite, septicemii. O acțiune deosebit de gravă care afectează copilul mic în primele luni sau în primul an de viață este sindromul toxico-septic-epidemic sau diareea malignă a noilor născuți, infecție cu caracter epidemic care poate apărea în secțiile de maternitate sau pediatrie. Tulpinile de Escherichia coli implicate în cazuri de meningită neonatală sunt patogene prin antigenul capsular K1, siderofori și endotoxină. Tulpinile uropatogene de Escherichia coli prezintă ca factori de patogenitate fimbrii P sau PAP, fimbrii tip 1, sideroforii, hemolizine alfa și beta și atigenul K [Toma Săcărea, 2006].
Patogenie. Enterobacteriile din Genul Escherichia sunt, în marea majoritate, saprofite sau condiționat patogene. Cu toate acestea patotipurile (fenotipuri patogene) umane determină infecții intestinale și extraintestinale. Enterocolitele infecțioase sunt produse de tulpinile:
ETEC (enterotoxigenic Escherichia coli);
EPEC (enteropathogenic Escherichia coli);
EHEC (enterohaemorrhagic Escherichia coli);
EIEC (enteroinvasive Escherichia coli);
EAGGEC (enteroaggregative Escherichia coli).
Tulpinile ETEC afectează toate categoriile de vârstă și reprezintă etiologia majoră a diareei copiilor și a turiștilor în țările cu sanitație deficitară, numită și „diareea turiștilor”, transmiterea realizându-se prin alimentele și apa contaminate. Odată pătrunsă pe cale orală, ETEC colonizează intestinul subțire și elaborează o serie de enterotoxine care determină creșterea secreției de apă și electroliți în lumenul intestinal (toxina TL) și inhibarea absorbției de lichid intestinal (toxina TS). După o incubație de 24-72 de ore se instalează simptomele: diaree apoasă fără febră, colici abdominale, grețuri, vărsături. Tulpinile ETEC aparțin serogrupelor O 6, 8, 15, 20, 25, 63, 78, 80, 85, 115, 128, 139 [Toma Săcărea, 2006].
Tulpinile EPEC induc o diaree apoasă asemănătoare cu cea din infecțiile cu ETEC afectând cu precădere copiii. EPEC sintetizează toxină shiga-like enterotoxică și citotoxică și nu au abilitatea de a sintetiza enterotoxine TL sau TS. Prin adezinele Bfp se leagă de epiteliul intestinal la nivelul colonului determinând distrugerea microvilozităților cu răspuns inflamator, fără semne de invazie. Ca urmare se instalează malabsorbția, diareea apoasă persistentă, febră și vărsături. Tulpinile EPEC aparțin serogrupelor O 26, 55, 86, 111, 119, 125, 126, 127, 128, 142 [Toma Săcărea, 2006].
Tulpinile EAGGEC au capacitatea de a adera agregativ de celulele mucoasei intestinale cauzând diaree fără fenomene invazive sau inflamatorii. Patogenitatea tulpinilor EAGGEC apare prin intermediul fimbrilor de adeziune, a enterotoxinei agregative codificată plasmidic și a hemolizinei asemănătoare tulpinilor uropatogene. Tulpinile de Escherichia coli enteroagregative sunt asociate cu diareea apoasă, persistentă instalată la copiii mici [Toma Săcărea, 2006].
Tulpinile EIEC din serogrupele O 28, 112, 124, 136, 143, 144, 147, 152 aderă la celulele epiteliale ale colonului cu ajutorul unor adezine non fimbriale și patogenitatea acestora apare ca urmare a invazivității, deoarece penetrează și se multiplică în interiorul enterocitului pe care îl distrug. Nu produc enterotoxină. Sunt apropiate din punct de vedere biochimic și antigenic de Shigella. Afectează adulții și copiii, simptomele fiind colicile abdominale, febra și scaunele diareice mucosanguinolente asemănătoare dizenteriei [Toma Săcărea, 2006].
Tulpinile EHEC, reprezentate în principal de serotipul O157H7, O26 și O111 sunt agenții etiologici pentru sindromul hemolitic și uremic. Acestea aderă la nivelul celulelor epiteliale ale colonului prin intermediul intiminei. Sunt moderat invazive și patogenitatea se datorează producerii unei toxine shiga-like numită și verotoxină a cărei sinteză este stimulată de deficiența de fier. Toxina este responsabilă de răspunsul inflamator local intens produs și de anemia hemolitică, trombocitopenia și insuficiența renală acută determinate prin lezarea endoteliului capilarelor. Scaunele diareice cu puțin lichid, mult sânge și mucus conținând polimorfonucleare sunt însoțite de febră, grețuri, vărsături și colici abdominale [Toma Săcărea, 2006].
Infecțiile extraintestinale cuprind infecțiile urinare, intraabdominale, bacteriemii, șoc endotoxic, meningita neonatală și infecțiile nosocomiale. În infecțiile urinare tulpinile uropatogene de Escherichia coli (UPEC) sunt responsabile de 90% din infecțiile tractului urinar. Sunt afectate cu precădere femeile tinere, active sexual. Tulpinile uropatogene aparțin serotipurilor O 1,2,4,6,7,16,18,75 și serotipurilor K 1,2,3,12,13 care posedă adezine ce permit aderarea de epiteliul urinar. Tulpinile de Escherichia coli regăsite în infecțiile intraabdominale prezintă sisteme de captare a fierului, proprietăți antifagocitare și acțiune citotoxică împotriva polinuclearelor. Simptomatologia include supurații peritoneale, biliare, genitale. Bacteriemiile sunt cauzate de tulpini cu siderofori, citotoxine, capsulă și lipopolizaharide. Șocul endotoxic apare după distrugerea a numeroase celule de Escherichia coli, când se eliberează subit o cantitate mare de endotoxină (eliberarea amplă de IL-1 și TNF). Simptomatologia include febră, hemoragii și colaps circulator. Meningita neonatală este produsă de tulpinile care sintetizează antigenul capsular K1, ajunse în torentul sanguin de la nivelul nazofaringelui sau din intestin. Infecțiile nosocomiale apar datorită răspândirii infecției de către personal sau prin instrumentar [Toma Săcărea, 2006].
Diagnosticul de laborator este bacteriologic, prin izolarea și cultivarea pe mediu Drigalschi, urmată de identificări biochimice și serologice: aglutinări cu ser polivalent și seruri monovalente [Ordeanu, 2018]. În ser, lichid cefalo-rahidian sau urină poate fi identificat antigenul K1 prin reacții de latexaglutinare realizându-se un diagnostic rapid mai ales la nou născut sau sugar. Pot apărea reacții încrucișate cu antigenul de grup B al meningococului. Se pot evidenția adezinele prin capacitatea de aglutinare a hematiilor. Metodele ELISA se utilizează la identificarea proteinei antigen marker de virulență de pe membrana exterioară a celulelor EIEC și la detectarea antigenelor specifice de grup, de tip și a exotoxinelor [Toma Săcărea, 2006]. În cazul urinei se pot face uroculturi cantitative. La adult se poate efectua și un diagnostic serologic indirect, determinând anticorpii din ser față de tulpina proprie izolată, în special în cazurile cronice (titru semnificativ 1:500) [Ordeanu, 2018].
Genul Salmonella
Genul Salmonella aparține familiei Enterobacteriaceae și cuprinde aproximativ 1500 de specii, dintre care fac parte bacilul tific și bacilii paratifici A, B și C, agenții etiologici ai febrei tifoide și a febrelor paratifoide, celelalte specii determinând toxiinfecții alimentare [Ordeanu, 2018]. Principalul habitat al salmonelelor este tractul intestinal al oamenilor și al animalelor. Toate serovarurile de Salmonella enterica subspecia enterica sunt parazite pentru om și mamifere, în timp ce celelalte subspecii se întâlnesc preponderent la păsări și animale cu sânge rece [Toma Săcărea, 2006]. Salmonelele se elimină prin dejecte, contaminează apa și alimentele care apoi infectează organisme noi prin mecanism fecal-oral [Ordeanu, 2018]. În mediul înconjurător ele doar supraviețuiesc, multiplicarea lor nefiind semnificativă. Majoritatea serovarurilor nu au specificitate de gazdă cu excepția serovarurilor typhi și paratyphi cu specificitate pentru om, serovarul abortus ovis pentru ovine, serovarul typhisuis pentru porci, serovarul gallinarum și serovarul pullorum pentru păsări [Toma Săcărea, 2006].
Rezistența în mediul extern a salmonelelor este mare. Supraviețuiesc 6 luni în sol, 3 luni în gheață, 7 zile în apă potabilă și 25 de zile în materii fecale [Ordeanu, 2018]. În solul pășunilor pot supraviețui până la 200 de zile și în alimente supraviețuiesc între 10 și 180 de zile [Toma Săcărea, 2006]. Sunt distruse în 15-20 minute la 60oC și de antisepticele uzuale [Ordeanu, 2018] și în 5 minute la 100°C. Cu toate acestea, din ce în ce mai frecvent se identifică tulpini implicate în infecțiile nozocomiale cu plurirezistență la antibiotice [Toma Săcărea, 2006].
Caractere morfotinctoriale. sunt bacili gram-negativi, necapsulați, nesporulați. În afară de Salmonella gallinarum și Salmonella pullorum care sunt imobile, prezintă flageli peritrichi. Nu fermentează lactoza, nu produc indol, majoritatea produc hidrogen sulfurat și cu excepția bacilului tific, toți folosesc citratul ca sursă de carbon [Ordeanu, 2018].
Caractere de cultură. Cultivă pe medii simple și cresc pe majoritatea mediilor de cultură, fiind aerobe, facultativ anaerobe [Ordeanu, 2018]. Formează colonii ”S” lactozo-negative pe mediile selective. Producerea de hidrogen sulfurat, evidențiată prin apariția unei pete de culoare neagră în centrul coloniilor, face ca acestea să se numească colonii „în ochi de pisică”. Formează colonii de tip ”R” negre, opace, cu margini neregulate și cu luciu metalic la cultivarea pe mediul Wilson-Blair. Pentru salmonele, mediile de îmbogățire sunt bulionul Müller-Kauffmann și cele cu selenit azid de sodiu. În astfel de condiții, dezvoltarea este extrem de rapidă, în 24 de ore sau mai puțin (la 40°C), când mediul Müller-Kauffmann se decolorează și cel cu selenit devine cărămiziu. Tulbură bulionul și formează colonii translucide de tip ”S” pe geloză [Toma Săcărea, 2006].
Caractere biochimice și de metabolism. Sunt bacterii lactozo-negative; prin fermentarea glucozei duc la formarea de acid și gaz. Salmonella typhi este singura specie care produce doar acid, fără gaz. Fermentează manitolul, maltoza și sorbitolul cu eliberare de acid și gaz. În mediile care conțin adonitol, sucroză, salicină și lactoză nu se formează acid. Speciile de Salmonella nu formează indol și urează, decarboxilează lizina și ornitina, descompun proteinele cu eliberare de hidrogen sulfurat și folosesc citratul ca unică sursă de carbon. Reacția roșu-metil este pozitivă și testul Voges-Proskauer negativ. Nu cresc pe mediul cu cianuri de potasiu, nu hidrolizează gelatina și nu dezaminează fenilalanina și triptofanul [Toma Săcărea, 2006].
Structura antigenică. Înrudite din punct de vedere al structurii antigenice, se pot defini peste 2300 de serotipuri. Salmonella prezintă trei tipuri importante de antigene, antigenul somatic, cel de suprafață și antigenul flagelar, cu aplicații în diagnostic și identificare [Toma Săcărea, 2006]. Așadar, salmonelele posedă un antigen somatic O situat în profunzimea peretelui bacterian care se identifică cu endotoxina, de natură glucido-lipido-polipeptidică, antigen H cu structură proteică și antigen Vi prezent numai în anumite specii în care caz conferă bacteriilor o virulență deosebită. Se identifică prin reacții serologice [Ordeanu, 2018].
Antigenul somatic O este format din fracțiuni antigenice. Prin cross-absorbție s-au individualizat 67 de structuri antigenice diferite, utilizate la identificarea serologică. Antigenele O etichetate cu același număr sunt înrudite, deși nu sunt întotdeauna identice. Pot fi tipuri distincte O (exemplu O:35), sau antigene O parțiale (care prezintă un număr de antigene parțiale, exemplu O:4,5,12). Formele cu o secvență incompletă de unități repetitive a polizaharidului-O formează colonii de tip ”R” și se numesc rough, fiind de cele mai multe ori avirulente sau slab. Tulpinile cu secvența completă de unități polizaharidice O formează colonii de tip ”S”, smooth, și sunt deosebit de virulente. De asemenea, antigenul O prezintă specificitate de grup, ceea ce duce la încadrarea salmonelelor în serogrupe notate cu litere majuscule, fiecare grupă conținând multe serovaruri. Antigenele de suprafață ale unor serovaruri de Salmonella sunt frecvent observate și la alte genuri ale bacteriilor enterice (Escherichia coli și Klebsiella). Antigenele de suprafață ale salmonelelor pot masca antigenul O, determinând inaglutinabilitate O în reacțiile serologice [Toma Săcărea, 2006].
Antigenul Vi este un antigen specific de suprafață întâlnit doar la trei serovaruri Salmonella: typhi, paratyphi C și Dublin. Este asociat virulenței și invazivității determinând leucopenie, scăderea nivelului complementului seric și capacitatea de multiplicare intrafagocitară. Reprezintă și substratul de fixare al bacteriofagilor [Toma Săcărea, 2006].
Antigenele flagelare H sunt proteine labile termic situate la nivelul cililor. Se cunosc peste 50 de antigene H care pot de asemenea să fie subtipate ca antigene parțiale. Fenomenul de variație de fază se întâlnește la multe tipuri Salmonella, ele putând să-și schimbe tipul de specificitate al flagelilor cu un altul. Antigenele H se pot prezenta sub una sau sub ambele forme: faza 1 și/sau faza 2. Salmonella enterica serovar enteritidis, typhi prezintă flageli cu antigen H monofazic. Majoritatea produc antigen H difazic. Astfel serovarul typhimurium poate produce flageli cu antigenul i sau antigenul 1,2. Unele serovaruri pot avea chiar și antigen H trifazic. Prin transducție unele tulpini au pierdut antigenul H, devenind imobile. Antigenul H este notat cu o singură cifră, o literă mică a alfabetului sau cu litera „z” urmată de un sufix. LPS (lipopolizaharidul) bacteriilor din genul Salmonella, ca și la alți bacili gram-negativi, este conținut de învelișul celular, eliberat odată cu liza bacteriei și care acționează ca endotoxină. Complexul macromolecular endotoxinic este alcătuit din [Toma Săcărea, 2006]:
a. Porțiunea polizaharidică externă O, responsabilă de specificitatea O și de determinarea virulenței microorganismului;
b. Porțiune mijlocie R, antigen comun tuturor enterobacteriilor;
c. Porțiunea internă lipidică, lipidul A.
Endotoxina se regăsește în patogeneza febrei, activarea complementului seric și a sistemelor de coagulare, activează kininele, scăde contractilitatea miocardului și alterează funcțiile limfocitelor. Endotoxina circulantă poate fi responsabilă, în parte, pentru manifestările șocului septic din infecțiile sistemice [Toma Săcărea, 2006].
Patogenitate. Zoonozele sunt boli ale animalelor și omului (zooantroponoze), provocând toxiinfecții alimentare. Factorii esențiali sunt prezența antigenului O și Vi și de toxicitatea endotoxinei (antigenul somatic O). Endotoxina în sine nu prezintă o toxicitate deosebită, rolul său fiind preponderent sensibilizant. Aemenea antigenului somatic O, aceasta prezintă o structură glucido-lipido-polipeptidică [Ordeanu, 2018]:
a. Componenta proteică conferă antigenitatea complexului și deci determină în organism formare de anticorpi;
b. Polizaharidul imprimă specificitatea endotoxinei;
c. Lipidul are rol sensibilizant [Ordeanu, 2018].
Infecțiile Salmonella la om variază în funcție de serovar, de tulpină, de cantitatea de germeni ingerați, de natura alimentelor contaminate și de statusul imunitar al gazdei. Unele serovaruri sunt foarte patogene și în cadrul aceluiași serovar pot exista diferențe de patogenitate. După infecția cu Salmonella serovar typhi și Salmonella serovar paratyphi apar în circulație anticorpi circulanți anti-O, anti-H, anti-Vi asigurând imunitate pe viață. Cu toate acestea, după gastroenteritele cu Salmonella, imunitatea dobândită lipsește de obicei deoarece timpul este insuficient pentru apariția unui răspuns imun, boala evoluând foarte rapid. Anticorpi secretori sau ai mucoasei tip IGA protejează intestinul împotriva salmonelelor [Toma Săcărea, 2006].
Gastroenteritele sunt determinate de ingerarea serovarurilor Salmonella. Aciditatea gastrică face parte din mecanismul de apărare a organismului față de aceste bacterii fiind responsabilă de distrugerea majorității germenilor ingerați. Contaminarea poate să mai aibă loc și de la persoană la persoană pe cale fecal-orală. Incubația durează de la câteva ore până la o zi, microorganismele multiplicându-se în epiteliul intestinal, provoacă un sindrom inflamator intestinal cu diaree mucopurulentă și sangvinolentă. În general este o boală benignă. În mod normal nu apare septicemia, aceasta survenind excepțional ca o complicație la persoanele imunocompromise. Sunt posibile localizări extraintestinale. În convalescență persoanele care au fost infectate cu serovaruri nontifoidice de Salmonella prezintă contagiozitate trei luni. Mecanismele de patogenitate sunt:
a. Atașarea și supraviețuirea intracelulară datorate antigenelor de suprafață;
b. Invazivitatea: salmonelele penetrează mucusul, aderă și invadează enterocitele ileonului și ajung astfel și în țesutul subepitelial; microorganismele Sunt internalizate în vacuole endocitice în care se multiplică;
c. Limitarea infecției la nivelul tractului gastro-intestinal de către polimorfonucleare; totuși microorganismele se pot răspândi pe cale hematogenă și către alte locuri din organism;
d. Răspunsul inflamator mediază eliberarea de prostaglandine, Stimulând ampc și activând secreția de fluid în lumenul intestinal ceea ce determină apariția scaunelor diareice;
e. Distrucția epitelială apare spre finalul bolii;
f. Efectul exotoxinelor LT, ST nu s-a identificat încă, pe când citotoxina este implicată în invazia și distrucția celulară [Toma Săcărea, 2006].
Agenții etiologici ai febrelor enterice sunt serovarurile typhi și paratyphi. Calea de pătrundere este digestivă, transmiterea fiind realizată de la persoană la persoană. După ingerarea germenilor urmează o perioadă de incubație de 1-3 săptămâni timp în care microorganismele traversează mucoasa intestinală și invadează plăcile Peyer. De aici germenii trec în circulația limfatică apoi în cea sangvină determinând etapa septicemică a bolii. Tabloul de septicemie se caracterizează prin febră crescută și stare generală alterată. Mortalitatea este crescută în aceste cazuri. Dacă se administrează o doză mare de antibiotic poate avea loc eliberarea unei cantități mari de endotoxină (distrugerea unui număr mare de bacterii-șoc endotoxic). După vindecare individul poate rămâne purtător, bacteriile regăsindu-se în bilă (un an). În infecțiile cu serovaruri Salmonella apar septicemii. Dintre infecțiile focale mai frecvente sunt artrita reactivă aseptică postenteritică și sindromul Reiter care au fost raportate după aproximativ trei săptămâni de la debutul enteritelor cu Salmonella spp. Patogenitatea în salmonelozele majore se datorează:
a. Antigenelor de suprafață care joacă rol în atașarea și supraviețuirea intracelulară: antigenul Vi și variantele smooth și rough ale serovarurilor typhi și paratyphi;
b. Invazivității, microorganismele trec prin enterocitele ileocecale și infectează sistemul limfatic regional, iar apoi pe cale sangvină infectând și alte părți ale sistemului reticulo-endotelial;
c. Fagocitării microorganismelor de către macrofage și monocite; în interiorul acestora salmonelele supraviețuiesc, sintetizează peste 40 de proteine ca răspuns la fagocitare, se multiplică și sunt transportate către ficat, splină și măduvă osoasă unde continuă replicarea;
d. Reintrării în curentul sangun, în timpul celei de a doua săptămâni, cauzând bacteriemia și infectând tractul biliar și alte organe; endotoxemia determină creșterea și menținerea febrei;
e. Colonizării vezicii biliare (săptămânile 2-3 de boală) și reinfectării tractului intestinal; apar simptome diareice și posibile necroze ale plăcilor Peyer;
f. Endotoxina poate fi responsabilă de febra sau leziunile enterice întâlnite în febra tifoidă [Toma Săcărea, 2006].
Febra tifoidă. Este produsă de Salmonella typhi care pătrunde în organism odată cu ingerarea apei sau a alimentelor contaminate. Odată ajuns la nivelul intestinului subțire, se fixează și se multiplică în plăcile lui Peyer (ganglioni limfatici mezenterici) în macrofage, după care bacilii sunt puși în mișcare prin sistemul limfatic, în splină, ficat și măduvă osoasă. Ulterior macrofagele distruse eliberează bacteriile în torentul circular, determinând faza de bacteriemie a bolii. Din punct de vedere clinic, după o incubație de 10-12 zile, debutul este insidios, cu stare generală alterată. În perioada de stare, apare febră de 38-39oC evoluează în platou, cu mici oscilații, apare hipotensiune, somnolență, delir (stare tifică), scaune diareice mai rar constipație și erupție discretă cutanată, lenticulară în special pe torace și abdomen. Se obține o bună imunitate atât umorală, cât și celulară deoarece salmonelele sunt facultativ intercelulare. În febra tifoidă vindecarea clinică nu se însoțește întotdeauna cu sterilizarea bacteriologică, microbii putând persista la nivelul vezicii biliare și a intestinului subțire, de unde microbii sunt eliminați în mediul extern un timp îndelungat (uneori ani de zile) în mod continuu sau intermitent iar foștii bolnavi sunt purtători [Ordeanu, 2018].
Febrele paratifoide sunt asemănătoare cu febra tifoidă însă mai puțin severe și cu recăderi multiple, datorită unei imunizări mai slabe a organismului. Aspecte clinice de febre paratifoide pot fi date și de alte salmonele după cum și bacilii paratifici pot determina toxiinfecții alimentare. Toxiinfecțiile alimentare apar în mediul familial sau în colectivități, la persoanele care au consumat același aliment contaminat. Cel mai adesea sunt declanșate de Salmonella typhimunium (Aertrycke) în aproximativ 50% din cazuri îmbolnăviri, Salmonella enteritidis (Gartner), paratificiful A, B, C, ș.a.m.d. Boala apare după o incubație scurtă de 5-24 de ore de la consumul de carne, ouă (în special rațe) sau orice produse alimentare contaminate de purtători care manipulează alimente; în general își păstrează aspectul și gustul nemodificat. Tabloul clinic este determinat de simptome digestive: grețuri, vârsături, dureri abdominale, diaree și febră de 38-39oC [Ordeanu, 2018].
Diagnosticul de laborator bacteriologic se face cât mai rapid posibil pentru a izola și a confirma diagnosticul de specie, urmând ca precizarea tipului să se facă ulterior [Ordeanu, 2018]. În salmoneloze coprocultura este pozitivă din primele ore ale infecției. După utilizarea mediile selective, diferențiale și de îmbogățire pentru Salmonella, se realizează reacții de aglutinare cu seruri specifice mono și polivalente în vederea stabilirii diagnosticului cert [Toma Săcărea, 2006]. Diagnosticul de laborator include:
a. Diagnostic bacteriologic direct, prin care se urmărește izolarea bacilului tific din sânge prin hemocultură, bilă, materii fecale, urină pe un mediu de îmbogățire și pe minim două medii speciale (mediul Leifson selectiv și mediul Drigalschi diferențial). Subsecvent, se realizează teste serologice, morfotinctoriale și de cultivare pentru identificare;
b. Diagnostic serologic sau indirect care constă în punerea în evidență în a 10-12 zi de boală a anticorpilor anti O și H din serul bolnavului prin reacția serică calitativă, care a înlocuit vechea reacție Widal. Examenul serologic va fi efectuat de două ori, la internarea bolnavului și după 7-10 zile pentru a urmări curba în ascensiune a anticorpilor serici. Se consideră pozitivă o reacție cu titru peste 1/200 pentru antigenul O la persoanele nevaccinate și peste 1/500 la cele vaccinate. În cazul în care se efectuează seroreacția pentru pacienți ce au fost vaccinați cu trei luni înainte, aceasta nu are valoare diagnostică [Ordeanu, 2018].
Genul Shigella
Genul Shigella, numit astfel după microbiologul japonez Shiga care a descoperit aceste bacterii în anul 1898, reunește speciile Shigella dysenteriae (Grup A), Shigella flexneri (Grup B), Shigella boydii (Grup C) și Shigella sonnei (Grup D). Germenii din grupul Shigella sunt bacterii strict adaptate omului, întotdeauna patogene provoacă dizenterie, boală infecțioasă acută sporadic endemică sau epidemică [Ordeanu, 2018]. Sunt întâlnite în intestinul și materiile fecale ale bolnavilor, convalescenților precum și la purtătorii aparent sănătoși [Toma Săcărea, 2006].
Speciile din genul Shigella rezistă în praf uscat 10 zile, 9 zile în ape la 7-10°C, pe lenjerie două săptămâni, în alimente 1-2 săptămâni, în gheață 2 luni. Sunt inactivate în 10 minute la 50-60°C. Sunt germeni sensibili la antagonismul microbian și la bacteriofagi specifici. În materiile fecale bacilii sunt distruși în câteva ore datorită concurenței microbiene [Ordeanu, 2018].
Caractere morfotinctoriale. Imobili, necapsulați și nesporulați [Ordeanu, 2018].
Caractere de cultură. Sunt bacterii aerobe, facultativ anaerobe care se dezvoltă bine la 37°C pe medii simple, slab și moderat selective și diferențiale (Istrati-Meitert, ADCL). Formează colonii „S”, lactozo-negative, transparente [Toma Săcărea, 2006].
Caractere biochimice și de metabolism. Imobili, oxidazo-negativi, reduce nitrații, nu descompun lactoza, fermentează glucoza, nu formează hidrogen sulfurat, nu metabolizează urea. Nu produc indol, excepția fiind Shigella flexneri care este indol-pozitiv. Cele două mari subgrupe biochimice sunt grupul manito-pozitiv (grupele B,C,D) și grupul manito-negativ (grupul A, Shigella dysenteriae) [Toma Săcărea, 2006].
Structura antigenică. Antigenul somatic O stă la baza împărțirii în patru grupe antigenice și la subdiviziunea acestora în serotipuri: grupul A (Shigella dysenteriae cu 12 serotipuri), grupul B (Shigella flexneri cu 6+2 serotipuri), grupul C (Shigella boydii cu 18 serotipuri) și grupul D (Shigella sonnei cu un serotip care prezintă două faze antigenice, S și R). Unele tulpini posedă capsulă (antigenul K). Acest antigen nu este utilizat în tipizarea serologică a genului Shigella, dar pot interfera cu determinarea antigenului somatic O. Alte antigene ale tulpinilor Shigella sunt exotoxina termolabilă exprimată de Shigella dysenteriae serotip 1, Shet 1 și shet 2, Invasion Plasmid Antigens (Ipa) și proteina Intercellular Spread (Ics) [Săcărea, 2006].
Patogenitate. Virulența constă exclusiv în multiplicarea ei în epiteliul colonului gazdei umane, provocând prodrom diareic enterotoxic și/sau citotoxic, inflamația colonului mediată de citokine și necroză epiteliară Factorii de virulență sunt codificați plasmidic și au funcții identice la toate speciile. Shigella prezintă o singură endotoxină, provocând dizenterii fără fenomene toxice și nervoase, excepția fiind reprezentată de Shigella dysenteriae. Shigeloza este o boală diareică acută care apare ca urmare a infecției pe cale orală cu Shigela spp. Microorganismul ingerat este depozitat în spațiul subepitelial unde este fagocitat de macrofage. Fagozomii macrofagelor sunt apoi degradați și shigelele intracelulare induc eliberarea de IL-1 care determină un aflux al leucocitelor polimorfonucleare. În urma apoptozei macrofagelor infectate bacteriile vor fi eliberate spre suprafața bazolaterală a enterocitelor adiacente. Shigelele intracelulare se atașează de actina complexului joncțional enterocitic, se multiplică și se răspândesc în enterocitele învecinate prin inducerea polimerizării actinei. Astfel, filamentele de actină propulsează bacteria din citoplasmă în celula epitelială adiacentă, evitând efectiv imunitatea umorală mediată prin anticorpi. În final apare necroza epiteliului. În cazul infecției cu Shigella dysenteriae 1 apar și efectele exotoxinei (toxina Shiga), acestea fiind de trei tipuri: neurotoxic, citotoxic și enterotoxic [Toma Săcărea, 2006].
a. Efectul enterotoxic constă în aderarea toxinei shiga de receptorii intestinului subțire și blocarea absorbției electroliților, glucozei și aminoacizilor din lumenul intestinal.
b. Efectul citotoxic constă în inhibarea sintezei proteinelor, cauză a morții celulare, leziunilor microvasculare a intestinului și a hemoragiei locale. Astfel se explică apariția abceselor parietale în ileonul terminal, apoi a necrozei, ulcerației și hemoragiei.
c. Efectul neurotoxic are ca semne febra și crampele abdominale.
Shigella dysenteriae este singurul din grup care elaborează o exotoxină neurotropă, cauzând la om o boală gravă cu fenomene digestive și nervoase [Toma Săcărea, 2006]. Microorganismele pătrund pe cale digestivă și se localizează la nivelul de mucoasă a intestinului gros și doar în cazuri excepționale trec în sânge. Aflate la acest nivel, prezintă o acțiune iritantă prin intermediul endotoxinei. Boala începe brusc, după o incubație de 2-8 zile cu fenomene de intoxicație nervoasă în cazul bacilului Shiga, dureri abdominale, tenesme și scaune foarte numeroase (40-100/zi) cu mucus, puroi și sânge (scaun dizenteriform). Bolnavul prezintă semne de deshidratare masivă. Ceilalți bacili dizenterici determină forme clinice mai ușoare cu 4-6 scaune /zi prezentând același aspect caracteristic dar boala evoluează fără fenomene nervoase și deshidratare. Uneori se confundă enteritele sau cu enterocolitele [Ordeanu, 2018].
Diagnosticul de laborator bacteriologic se efectuează din fecale, de preferință, (recoltate cu sonda Nelaton). Transportul produsului patologic se face în mediul Cary-Blair iar însămânțarea este recomandat să se efectueze cât mai curând după recoltare [Ordeanu, 2018]. Prima izolare se face pe medii slab sau moderat selective și diferențiale (Istrati-Meitert, ADCL) care se incubează la 37°C, 18-24 de ore. Formează colonii transparente lactozo negative. Confirmarea se realizează prin teste de aglutinare cu seruri specifice de grup și de tip. Diagnosticul diferențial se realizează prin abilitatea shigelei de a decarboxila lizina. Metodele rapide de identificare sunt reacțiile de hibridizare și PCR [Toma Săcărea, 2006].
Genul Klebsiella
Genul Klebsiella cuprinde Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromatis, Klebsiella terrigena, Klebsiella ornithinolytica și Klebsiella planticola, fiind regăsite la nivel gastrointestinal, respiratoriu și pe tegumente [Toma Săcărea, 2006]. Klebsiella pneumoniae (pneumobacilul, bacilul Friedlander) este saprofit al căilor respiratorii superioare, intestin, tegumente, de unde în anumite condiții poate deveni patogen. Klebsiella pneumoniae determină la om pneumonii, bronhopneumonii, pleurezii, otite, sinuzite, peritonite, septicemii, infecții urinare, etc. În unele cazuri determină infecții intraspitalicești. Sunt condiționat patogene [Ordeanu, 2018].
Klebsiella sunt distruse la 55°C în 30 minute sub acțiunea căldurii umede. La temperatura camerei și la întuneric pot supraviețui câteva luni. Cu toate că sunt sensibile la cefalosporinele de generația a III-a, floxacine, colimicină și gentamicină, unele tulpini pot prezenta o creștere a rezistenței la antiseptice și dezinfectante [Toma Săcărea, 2006].
Caractere morfotinctoriale. Scurți, imobili, nesporulați, nu prezintă cili, prezintă capete rotunjite, adesea regășiți în diplo. În produsele patologice apar sub formă de cocobacili înconjurați de capsulă [Toma Săcărea, 2006].
Caractere de cultură. Cultivă pe medii simple, nefiind pretențioși. Formează colonii mucoase, lactozo-pozitive [Ordeanu, 2018]. Aerobi, facultativ anaerobi. Deși temperatura optimă de creștere este de 37°C, pot crește și la temperatura camerei. Formează colonii tip „M” pe geloză simplă. Se observă deseori apariția de variante ale tipului de colonie: tipul „S” și tipul „R” (colonii plate și uscate). Pe mediile slab selective își păstrează aspectul mucoid al coloniilor, iar mediile moderat selective induc formarea de colonii cu caracter mucoid mai puțin pregnant.
Caractere biochimice. Fermentează lactoza, zaharoza și glucoza cu eliberare de acid și gaz. Nu produc indol, cu excepția Klebsiella oxytoca. Produc urează, acetil metil carbinol, citratul este unica sursă de carbon și nu descompun proteinele cu eliberare de hidrogen sulfurat.
Structura antigenică. În genul Klebsiella sunt descrise 3 feluri de antigene: antigenul somatic O (întâlnit la formele smooth), antigenul somatic R (întâlnit la formele rough) și antigenul capsular K. Nu prezintă antigen flagelar H. În schema antigenică de diagnostic se disting 5 grupe de antigene O și 77 de fracțiuni antigenice K. Unele tulpini prezintă o enterotoxină termostabilă [Toma Săcărea, 2006].
Patogenitate. Tulpinile genului Klebsiella sunt patogene prin virulența legată de prezența capsulei de natură polizaharidică (formată din D-glucoză, fucoză și acid uronic) și a fimbrilor. Speciile Klebsiella pneumoniae și Klebsiella oxytoca sunt responsabile de majoritatea infecțiilor umane. Numărul infecțiilor cauzate de Klebsiella pneumoniae este mai mare decât cel al infecțiilor cauzate de Klebsiella oxytoca. Pneumonia este în cea mai mare parte cauzată de Klebsiella pneumoniae, este cea mai frecventă formă clinică a infecției cu Klebsiella atât în afara cât și în cadrul unităților de îngrijire a sănătății. Tusea este productivă cu o cantitate consistentă de spută gelatinoasă cu urme de sânge. Complicațiile apar deseori, fiind reprezentate de abcese și distrucție tisulară a plămânilor. Klebsiella pneumoniae și Klebsiella oxytoca determină cel mai adesea infecții, cel mai adesea la prematuri. [Toma Săcărea, 2006].
Infecțiile tractului urinar cu speciile de Klebsiella sunt, din punct de vedere clinic, identice celor cauzate de agenții patogeni specifici acestei localizări. În spitalele sau sanatoriile în care îngrijirea medicală este de lungă durată, Klebsiella spp. este ocazional izolată din plăgi și abcese, fără să declanșeze simptome bolnavilor. [Toma Săcărea, 2006].
Klebsiella ozaenae produce ozena, atrofia mucoasei nazale, cu descărcare mucopurulentă ce formează cruste. Simptomele frecvente sunt congestia nazală și un miros urât al cavității nazale. Este o afecțiune mai frecvent întâlnită la bătrâni [Toma Săcărea, 2006].
Diagnosticul de laborator se pune pe baza morfologiei specifice și prin teste biochimice. La identificarea coloniilor mucoase se iau în considerare și rezultatele examenelor biochimice. Identificarea definitivă se realizează prin tiparea serologică cu reacții de aglutinare, coaglutinare sau latexaglutinare.
Genul Proteus
Genul Proteus a familiei Enterobacteriaceae se diferențiază pe baza proprietăților biochimice diferite în patru subgrupe: Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus morgani și Proteus rettgeri [Ordeanu, 2018]. Germenii din genul Proteus sunt ubicuitar răspândiți în natură, putându-se întâlni în sol, ape reziduale, ape de suprafață, în materiile organice în putrefacție, în tractul intestinal uman, în alimente și în produse patologice [Toma Săcărea, 2006]. În anumite condiții devin patogeni. Uneori determină infecții urinare sau pot fi asociați în supurațiile putride și gangrenoase pulmonare [Ordeanu, 2018].
Poate rezista o perioadă mai îndelungată în unele soluții antiseptice, de detergenți, precum și în soluții perfuzabile, în cele care conțin glucoză putându-se multiplica la temperatura camerei, fapt ce explică difuzibilitatea bacteriilor în mediul spitalicesc. Rezistența la antibiotice este foarte mare [Toma Săcărea, 2006].
Caractere morfotinctoriale. Sunt bacili gram-negativi mobili, cu cili peritrichi sau lofotrichi. Invadează extrem de rapid mediile de cultură solide. Sunt polimorfi, având forme variate, de la bastonașe scurte de 1-3 µm lungime, până la forme lungi filamentoase. Nu prezintă capsulă și nici spori [Toma Săcărea, 2006].
Caractere de cultură. Nu sunt germeni pretențioși. Pe geloză simplă și pe geloză-sânge invadează mediul. Din locul inoculării, valuri succesive de cultură migrează concentric până la marginea mediului sau până la întâlnirea cu vălul migrator al altei colonii. Dacă coloniile migratoare aparțin aceleiași tulpini, valurile se intrică, formând o pânză continuă. Dacă ele aparțin unor tulpini diferite, chiar din aceeași specie de Proteus, migrările se opresc la o distanță de 1-2 mm, între ele trasându-se o linie de demarcație (fenomen Dienes), important marker epidemic. Produc urează. Pe mediile selective care conțin săruri biliare, morfină, etc. formează colonii ”S”, netede, rotunde, transparente, lactozo negative, „în ochi de pisică” [Toma Săcărea, 2006]. Unele tulpini fermentează zaharoza și produc indol în apa peptonată [Ordeanu, 2018].
Caractere biochimice. Aerobi, facultativ anaerobi, fermentează glucoza. Nefermentarea lactozei este un indicator al patogenității. Proteus vulgaris este singurul care produce indol și care nu fermentează maltoza. Producerea de hidrogen sulfurat este obligatorie în cadrul acestui gen. Proteus vulgaris este singura care nu produce ornitindecarboxilază. Iau parte la procesele de putrefacție prin folosirea oxigenului din mediu favorizând dezvoltarea bacteriilor anaerobe și prin sinteza de enzime proteolitice care descompun proteinele. Acest aspect se evidențiază prin lichefierea mediului Löffler. [Ordeanu, 2018].
Structură antigenică. Proteus spp. pot prezenta antigen somatic O, antigen flagelar H, pili și enterotoxine. Antigenul somatic O prezintă specificitate de grup, fiind comun la Proeus vulgaris și Proteus mirabilis. Se cunosc 55 antigene somatice O. Antigenul flagelar H, cu specificitate de tip, prezintă 31 de fracțiuni antigenice. Anumite tulpini de Proteus vulgaris (OX19, OX2, OXK) produc antigene folosite în testele de aglutinare Weil-Felix pentru decelarea anticorpilor serici produși împotriva tifosului exantematic. Proteus spp. nu prezintă antigen capsular (K) [Toma Săcărea, 2006].
Patogenitate. Ca germeni condiționat patogeni, Proteus spp. cauzează diferite infecții ale tractului digestiv, toxiinfecții alimentare și enterite la sugari și la copii mici. Infecțiile tractului respirator inferior, pneumoniile, sunt de cele mai multe ori nosocomiale. Septicemiile apar mai ales la bătrâni. Ele pot fi însoțite sau urmate de peritonite, meningite etc. Meningita neonatală este o afecțiune foarte gravă a nou născuților, iar dacă tulpinile aparțin Proteus mirabilis, poate fi însoțită de abces cerebral. Pot suprainfecta plăgile chirurgicale sau pe cele arse putând duce la apariția abceselor. Infecțiile tractului urinar inferior sunt reprezentate de cistite. Capacitatea Proteus spp. de a descompune ureea joacă un rol foarte important în inducerea litiazei urinare.
Diagnosticul de laborator se bazează pe izolarea și identificarea bacteriei din diferite produse patologice, germen ușor de recunoscut prin caracterul său particular de a invada mediile de cultură solide; variantele imobile însă se pot confunda cu alte specii lactozo negative patogene: salmonele, shigele. Un alt test pentru a confirma rolul său patogen este prezența anticorpilor la bolnav (în special în infecțiile cronice) față de propria tulpină izolată la litru de cel puțin 1/500 [Ordeanu, 2018]. Diagnosticul se face prin tipare serologică a celor 55 factori antigenici O și 31 H; lizotipiei; rezistotipiei, studiindu-se diferitele grade și spectre de sensibilitate ale Proteus spp. [Toma Săcărea, 2006].
II.2 Bacili gram-negativi nonenterobacterii
Familia Pseudomonadaceae. Genul Pseudomonas
Genul Pseudomonas din familia Pseudomonadaceae cuprinde germeni nepretențioși și strict aerobi. Bacilii din genul Pseudomonas produc pigment de diferite culori: albastru-verde, galben-verde fluorescent, roșu sau brun. Pseudomonas aeruginosa elaborează un pigment verde-albastru (piocianina), iar specia saprofită Pseudomonas fluorescens un pigment verde-galben (fluoresceina) de care trebuie diferențiat în cadrul diagnosticului [Ordeanu, 2018]. Sunt extrtem de rezistenți la antibiotice, dezinfectante și antiseptice.
Descoperită de către Gessard în anul 1882 în puroiul albastru al unor plăgi infectate, Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas pyocyanea sau bacilul piocianic) este specia tip a familiei Pseudomonadaceae, genul Pseudomonas. Bacterie potențial patogenă, contaminează frecvent plăgile larg deschise, în special după arsuri, cu puroi albastru și miros caracteristic, aromatic (tei sau salcâm). Foarte răspândit în mediul extern, este prezent și pe tegumentele, cavitățile și la nivel intestinal [Ordeanu, 2018]. Este rezistent la variațiile mediului exterior. Supraviețuiește mai multe luni și se multiplică în apă la temperatura mediului ambiant. Sintetizează piocine și aeruginocine care acționează bacteriostatic asupra altor tulpini. Chiar dacă prezintă rezistență la antiseptice și dezinfectante, este sensibil la pH acid și la sărurile de argint. Este foarte rezistent la antibiotice și este frecvent izolat din mediul de spital de pe diferite suprafețe, de pe instrumentar sau poate contamina medicamentele [Toma Săcărea, 2006].
Rezistența naturală a Pseudomonas aeruginosa față de antibiotice este datorată impermeabilității membranei externe și producerii unei beta-lactamaze inductibile. Rezistența dobândită apare prin două mecanisme care uneori sunt sinergice:
a. Structura lipopolizaharidului membranar este eterogenă, numărul și dimensiunile porinelor membranei externe variază și condiționează permeabilitatea pentru antibiotice.
b. Posedă numeroase plasmide transferabile prin conjugare sau prin transducție și mare parte a tulpinilor sunt lizogene. Se explică astfel numeroasele variații genetice ale tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa, în special în ceea ce privește polirezistența față de substanțele antibacteriene. Este sensibil la acțiunea unor bacteriofagi [Toma Săcărea, 2006].
Caractere morfotinctoriale. Nesporulat, prezintă un cil polar, se regăsește izolat, în perechi sau lanțuri scurte [Toma Săcărea, 2006].
Caractere de cultură. Este un germen nepretențios oxidazo pozitiv care nu fermentează glucoza și care poate crește și în apă distilată, chiar și în strictă aerobioză. Temperatura la care se poate dezvolta variază în limite largi pentru tulpinile patogene: 5-42°C. După 24 ore de incubare dezvoltă colonii „S”, transparente. Atât colonia cât și mediul sunt pigmentate în verde albăstrui, colonia având reflexe metalice. Cultura emană un miros aromat de tei, salcâm (trimetilamină) sau iasomie. În momentul cultivării geloză-sânge, apare o zonă de beta hemoliză în jurul coloniei. În continuare, identificarea are în vedere mediile potrivite producției de pigment: King A (piocianină) și King B (pioverdină). În medii lichide Pseudomonas aeruginosa formează o peliculă fină la suprafață și sub aceasta se regăsește un strat de pigment [Toma Săcărea, 2006].
Caractere biochimice. Pseudomonas aeruginosa nu atacă fermentativ zaharurile dar poate descompune oxidativ glucoza determinând acidifierea mediului. Este oxidazo-pozitiv, descompune gelatina, nu produce indol, hidrogen sulfurat sau urează. Deși sintetizează o serie de enzime (nitrat reductază sau arginin dehidrogenază), este deficitar în sintezarea de lizin decarboxilază, ornitin decarboxilază și ortonitrofenil galactoză. Acești germeni pot folosi drept sursă unică de carbon glucoză, acid lactic, acetic, manitol, arginină, citrat, ș.a.m.d. Pigmentul produs conține pioverdină hidrosolubilă fluorescentă galben verzuie și piocianina verde albăstruie solubilă. 10% din tulpini nu produc pigment, iar 1% produc un pigment roșu sau negru [Toma Săcărea, 2006].
Structură antigenică. Pseudomonas aeruginosa posedă un antigen somatic O termostabil de natură lipopolizaharidică, localizat în peretele bacterian. Acest antigen are 20 de variante, pentru 16 dintre ele existând seruri imune specifice (O:1-O:16). Aceste seruri pot fi livrate și sub forma de seruri polivalente, fiecare grupând 4 antiseruri, notate cu majuscule A, C, E, F. Serotipurile O:6 și O:11 sunt cel mai frecvent întâlnite, iar serotipul O:12 este extrem de rezistent la antibiotice. Antigenul flagelar H este de natură proteică. Factorul de adeziune slime este o substanță mucoidă, în general extrasă din coloniile mucoase ale tulpinilor implicate în infecții ale tractului respirator la pacienții cu fibroză chistică [Toma Săcărea, 2006].
Patogenitate. Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa sunt patogene prin virulență și toxigeneză. Deși este puțin virulent pentru organismul sănătos, devine agresiv pentru cei imunodeprimați. Virulența este asigurată de capsula cu rol de adezină împiedică pătrunderea antibioticelor în celula bacteriană și are rol antifagocitar; pilii asigură adeziunea de substratul specific; lipopolizaharidul din peretele bacterian are rol de endotoxină și de siderofori. Tulpinile patogene sintetizează multipli compuși toxici difuzibili:
a. Citotoxina de natură proteică ce alterează leucocitele;
b. Hemolizinele, glicolipidele și fosfolipaza C care acționează sinergic;
c. Proteaze, elastaze și colagenaze care lezează țesuturile;
d. Exotoxina A de natură proteică, sintetizată în cantități variabile în funcție de tulpină, are o structură și un mod de acțiune similar toxinei difterice, dar nu poate fi transformată în anatoxină. Inhibă sinteza proteică, lezează țesuturile și are acțiune de imunodeprimare;
e. Exotoxina S, mai puțin toxică, este prezentă la tulpinile cu afinitate pentru țesutul pulmonar. Inhibă sinteza proteică și produce imunosupresie [Toma Săcărea, 2006].
În funcție de poarta de intrare cauzează:
a. Infecții cutanate, consecință a băilor în ape poluate: foliculită, piodermită, otită externă, etc.;
b. Infecții cutanate apărute în mediul spitalicesc: infecții ale plăgilor chirurgicale, traumatice, ulceroase, a escarelor sau a arsurilor;
c. Infecții iatrogene datorate îngrijirilor medicale sau a manevrelor instrumentare: otită medie sau externă, meningită, endocardită după chirurgie cardiacă, osteoartrită după injecții intraarticulare, infecții urinare după aplicarea sondelor, etc;
d. Bronhopneumopatii mai frecvente la pacienții cu altă boală de bază (neoplasm, mucoviscidioză, leucemie, diabet zaharat etc);
e. Infecții digestive, enterite acute după tratamente antibiotice orale de lungă durată sau după consum de apă contaminată;
f. Infecții oculare secundare intervențiilor chirurgicale sau instilării de colire contaminate, utilizării soluției de curățare a lentilelor de contact contaminate [Toma Săcărea, 2006].
Etapele instalării procesului infecțios sunt colonizarea, invazia, diseminarea și difuzia toxinelor în organismul uman. Colonizarea celulelor epiteliale ale tegumentului și ale mucoaselor se realizează prin intermediul adezinelor, fimbrilor sau prin producerea de slime, susținute de acțiunea citotoxinei și a factorului leucopeniant care asigură protecția față de fagocitoză. Invazia este asigurată de acțiunile unor factori ca proteaza, elastaza, hemolizina, exotoxina A care alterează țesutul, distrug complementul, imunoglobulinele și fibronectina. Fosfolipaza C are afinitate pentru țesutul pulmonar unde distruge surfactantul. În faza de diseminare intervin exotoxina A și endotoxina de natură lipopolizaharidică cauzând uneori șocul septic cu evoluție deosebit de gravă. În mod normal, apărarea față de colonizarea Pseudomonas aeruginosa se realizează de către sistemul imunitar nespecific prin fagocitoză și complementul seric. Mijloacele de apărare nespecifică pot fi depășite în urma ingestiei, inoculării unei cantități mari de germen sau a unei tulpini foarte virulente. În aceste cazuri infecția se instalează și se generalizează înainte ca organismul să dezvolte un răspuns imun specific [Toma Săcărea, 2006].
Diagnostic de laborator. Se utilizează medii simple pentru izolare. Pentru identificare este suficient cumulul reprezentat de aspectul coloniilor, prezența de pigment, mirosul caracteristic, oxidaza pozitivă și beta hemoliza. Identificarea se realizează prin intermediul auxonogramei în care se evaluează capacitatea de asimilare a substanțelor menționate anterior utilizate drept substrat. În cazul unor infecții nosocomiale cu Pseudomonas aeruginosa se impune identificarea elementelor fenotipice caracteristice tulpinii izolate [Toma Săcărea, 2006]:
a. Serotipie. Reacții de aglutinare (serotipurile O) cu seruri imune specifice. Această metodă nu poate fi utilizată pentru tulpinile de tip R, mucoase, non aglutinabile sau poliaglutinabile;
b. Lizotipie. Pseudomonas aeruginosa este sensibil la acțiunea unor bacteriofagi;
c. Producerea de bacteriocine se testează cu o tulpină de referință cu sensibilitate cunoscută sau prin efectul piocinei elaborate de o tulpină cunoscută asupra tulpinii necunoscute izolate;
d. Biotipie. Caracterele care permit identificarea biotipurilor în cadrul speciei sunt pigmentul, hidroliza gelatinei, asimilarea argininei, testul ortonitrofenil galactozei (ONPG);
e. Antibiotipie [Toma Săcărea, 2006].
Diagnosticul se realizează exclusiv bacteriologic prin izolarea și identificarea microbului din produse patologice. Prezența pigmentului facilitează diagnosticarea, însă trebuie avut în vedere faptul că unele tulpini nu produc pigment. Pentru diferențiere se utilizează specia saprofită Pseudomonas fluorescens [Ordeanu, 2018].
II.3 Bacili gram-negativi anaerobi
Genul Bacteroides cuprinde mai multe specii, printre care Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides distanosis, Bacteroides vulgatus, Bacteroides ovatus și Bacteroides uniformis. Se regăsesc la nivel intestinal. Sunt bacili mari gram-negativi, polimorfi, colorați bipolar și neciliați. Cultivă în strictă anaerobioză, la 37°C, pe medii cu sânge. Coloniile sunt netede, lucioase, mari. Nu provoacă hemoliză. Creșterea este inhibată pe medii cu dezoxicolat dar este stimulată de bilă. Bacteroides fragilis descompune sărurile biliare pe geloză-sânge cu bilă, ducând la apariția unui precipitat cafeniu în jurul coloniei. Hidrolizează esculina. Descompune fermentativ carbohidrații cu eliberare de acid și gaz, metaboliții finali fiind acidul acetic și acidul succinic. Deși produc beta lactamază, sunt sensibili la metronidazol și clindamicină. Sunt implicate în majoritatea infecțiilor cu germeni anaerobi cauzând afecțiuni pleuro-pulmonare, peritoneale, ginecologice, septicemice. Patogenitatea Bacteroides fragilis rezidă în: ”lipopolizaharidul cu specificitate de tip care are activitate endotoxică slabă, capsula polizaharidică ce are rol antifagocitar și prin enzimele eliberate extracelular: proteinaze, colagenaze, fibrinolizină, fosfataze, hialuronidaze etc.” [Toma Săcărea, 2006].
Genul Porphyromonas cuprinde Porphyromonas asaccharolytica, Porphyromonas catoniae și Porphyromonas endodontalis. Porphyromonas asaccharolytica este comensal al vaginului și al colonului. Porphyromonas catoniae și Porphyromonas endodontalis sunt specii anaerobe componente ale microbiotei din crevasele gingivale și intesinale. Sunt bacili și cocobacili Gram-negativi, neciliați, nesporulați. Este dificilă cultivarea lor, fiind nevoie de o anaerobioză strictă. Coloniile produc un pigment brun sau negru care se dezvoltă în jurul sau sub colonie în 6-10 zile. După incubare la 37°C timp de 5-7 zile apar colonii de diferite dimensiuni, rotunde, cu margini bine delimitate, lucioase și umede. Descompun fermentativ aminoacizii aspartic și glutamic la metaboliții finali acidul n – butiric, acidul acetic și acidul propionic. Sunt sensibili la amoxicilină, macrolide, clindamicină, fluorochinolone și metronidazol. Porphyromonas asaccharolytica este implicată în infecții mixte legate de tractul intestinal inferior, infecții gangrenoase sau ulcere ale piciorului diabetic. Porphyromonas catoniae intervine în boala parodontală iar Porphyromonas endodontalis are rol în formarea plăcii dentare subgingivale și determină abcese periapicale severe distructive. [Toma Săcărea, 2006].
Genul Prevotella cuprinde bacterii componente ale microbiotei bucale, fiind bacili Gram-negativi polimorfi neciliați și nesporulați. Prevotella melaninogenica se găsește în crevasele gingivale și în vagin. Prevotella intermedia și Prevotella nigrescens fac parte din microbiota colonului și a cavității bucale a omului și animalelor. În strictă anaerobioză, după incubare la 37°C timp de 48 de ore, apar colonii de diferite dimensiuni, rotunde, cu margini bine delimitate, lucioase și umede. Unele specii produc un pigment brun sau negru care poate colora colonia și care se poate dezvolta în jurul sau sub colonie. Hemoliza variază cu specia. Creșterea este favorizată de hemină și menadionă și inhibată de o concentrație de 6,5% NaCl, de bilă și de săruri biliare. Sunt implicate în infecții pleuro-pulmonare, gingivale, în sfera ORL sau pelvi-peritoneale. Prevotella melaninogenica este implicată în infecții endogene cu punct de plecare crevasele gingivale și vaginul. Prevotella nigrescen și Prevotella intermedia provoacă parodontopatii marginale cronice. Descompun fermentativ carbohidrații cu formare de acid acetic și acid succinic. Sunt sensibili la benzilpenicilină, amoxicilină, macrolide și metronidazol. Unele tulpini secretă beta lactamază [Toma Săcărea, 2006].
Genul Fusobacterium cuprinde specii strict anaerobe printre care Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium naviforme, Fusobacterium mortiferum și Fusobacterium varium. Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium alocis și Fusobacterium necrophorum au ca habitat cavitatea bucală a omului, iar Fusobacterium naviforme și Fusobacterium gonidioformans sunt componente ale microbiotei vaginale. Alte specii de Fusobacterium fac parte din flora tractului intestinal. Sunt bacili gram-negativi polimorfi (forme filamentoase, fusiforme sau cocobacilare) fără cili și nesporulați. Cultivă în strictă anaerobioză la 37°C după o incubare timp de 48 de ore, când apare o cultură ce emană un intens miros putrid. Fusobacterium necrophorum formează colonii mari, neregulate, opace, alb – cenușii și provoacă beta hemoliză. Restul speciilor formează colonii mici, rotunde, cu margini regulate, cenușii, slab beta hemolitice. Descompun fermentativ carbohidrații, aminoacizii sau alte peptide eliberând la final acid n-butiric. Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium periodonticum și Fusobacterium alocis participă la formarea plăcii dentare; Fusobacterium nucleatum este implicat în parodontite acute și cronice, abcese cerebrale, abcese hepatice și în infecții ale țesuturilor moi faciale. Fusobacterium necrophorum este implicat în infecții ale țesuturilor moi periorale și genitale. Deși produc betalactamaze, sunt sensibili la clindamicină, carbapeneme și metronidazol [Toma Săcărea, 2006].
Capitolul III. Tratamentul bolilor cauzate de bacilii gram-negativi
III.1 Medicamente antiinfecțioase
Antibioticele sunt compuși produși în mod natural de anumite microorganisme și aceste substanțe au acțiune antimicrobiană, iar chimioterapicele sunt compuși cu acțiune selectiv inhibitorie, de origine semisintetică sau sintetică. Clasificarea antibioticelor și chimioterapicelor antimicrobiene se realizează în funcție de structura chimică [Cristea et al., 2017, pg. 955 – 966].
Antibiotice
Antibiotice betalactamice
Monobactami
Dibactami
Penami (peniciline)
Peniciline naturale
Peniciline antistafilococice
Aminopeniciline
Carboxipeniciline
Ureidopeniciline
Amidinopeniciline
Penemi
Carbapenemi
Cefeme (cefalosporine)
Carbacefeme
Tribactami
Antibiotice aminoglicozide: streptomicina, kanamicina, gentamicina, spectinomicina, neomicina, tobramicina, amikacina, netilmicina
Antibiotice macrolide: eritromicina, oleandomicina, spiramicina, roxitromicina, diritromicina, claritromicina, fluritromicina, azitromicina; sinergistine
Antibiotice lincomocine (lincosamide): lincomicina, clindamicina
Antibiotice glicopeptidice: vancomicina, teicoplanina, daptomicina
Antibiotice cu spectru larg: tetracicline, amfenicoli
Grupul rifampicinei
Antibiotice polipeptidice: polimixine și bacitracina
Chimioterapice antimibrobiene
Chinolone și fluorochinolone
Sulfamide antibacteriene
Diaminopirimidine: trimetoprim
Derivați de nitrofuran
Derivați de chinolină
Derivați de imidazol
Derivați de formaldehidă
Alte structuri: acid mandelic, dapsona, mesalazina, linezolid, spectinomicină, fosfomicină, acid fusidic [Cristea et al., 2017].
Spectrul antimicrobian al unui compus include microorganismele ce răspund la mecanismul său de acțiune. Din punct de vedere al spectrului antimicrobian, antibioticele și chimioterapicele antimirobiene pot fi clasificate în:
Spectru îngust de tip benzilpenicilină, peniciline antistafilococice și anti Pseudomonas, macrolidele și lincosamide (coci gram pozitivi și negativi și pe bacili gram pozitivi);
Spectru îngust de tip streptomicină, gentamicină, amikacină, polimixine (coci gram pozitivi și negativi, bacili gram-negativi);
Spectru larg de tip tetraciclină, cloramfenicol, aminopeniciline, cefalosporine (coci și bacili gram pozitivi și negativi, spirochete, micoplasme, rikettsii și clamidii) [Cristea et al., 2017].
Spectrul antimicrobian inițial al antibioticelor și al chimioterapicelor s-a îngustat în timp prin dezvoltarea rezistenței diferitelor bacterii. Astfel, în prezent 80% dintre tulpinile de stafilococ auriu sunt rezistente la benzilpenicilină, majoritatea tulpinilor de bacili Gram-negativi și unele tulpini de bacil tuberculos sunt rezistente la streptomicină [Cristea, 2017].
Mecanismul de acțiune poate fi de tip bactericid sau bacteriostatic.
Acțiunea bactericidă constă în intoxicarea ireversibilă a germenilor microbieni la concentrații minime inhibitorii (sau mai mari) de către chimioterapice. Acțiunea bactericidă poate fi absolută (afectează germenii atât în stare de repaus, cât și în faza de multiplicare ca, spre exemplu, polimixinele) sau degenerativă (afectează germenii numai în faza de multiplicare ca, spre exemplu, penicilinele, cefalosporinele, aminoglicozidele) [Cristea et al., 2017].
Acțiunea bacteriostatică constă în inhibarea multiplicării germenilor. Germenii pot fi omorâți in vivo ca urmare a intervenției mecanismelor de apărare ale organismului. Au mecanism de acțiune bacteriostatic sulfamidele, tetraciclinele, cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele [Cristea et al., 2017].
Se întâlnește, în cazul aminoglicozidelor și al fluorochinolonelor, efectul numit postantibiotic antimicrobian, ceea ce înseamnă că efectul se menține și la concentrațiile minime subinhibitorii. Mecanismul rezidă în împiedicarea sintezei proteinelor bacteriene. În acest context, administrarea poate fi realizată la intervale de timp mai mari [Cristea et al., 2017].
Mecanismele de acțiune la nivelul celulei bacteriene sunt:
Acțiune asupra peretelui celular (inhibarea sintezei peptidoglicanului care intră în constituția peretelui bacterian): betalactame, vancomicină;
Acțiune asupra membranei citoplasmatice (modifică bariera osmotică a membranei bacteriilor gram-negative, care pierd constituenții citoplasmatici și mor): polimixinele;
Inhibarea sintezei proteice ribozomale prin legarea de subunitățile 30S (tetracicline), 50S (cloramfenicol, macrolide, lincosamide) sau interferența dintre subunitățile 30S și 50S (aminoglicozide);
Acțiune la nivelul aparatului nuclear prin:
Blocarea ARN polimerazei ADN-dependentă și inhibarea sintezei de ARNm, urmată de scăderea sintezei proteinelor ribozomale: rifampicina;
Blocarea ADN girazei bacteriene, enzimă care supraspiralizează ADN, blocând astfel diviziunea celulară: acidul nalidixic și fluorochinolonele;
Acțiune competitivă cu metaboliții omologi: cotrimoxazol;
Efect toxic asupra ADN: metronidazol [Cristea et al., 2017].
Tabelul II Sensibilitatea bacililor gram-negativi la antibiotice și chimioterapice antimicrobiene, adaptare după Cristea et al., 2017
Sursa: Cristea, A., 2017, București, Tratat de farmacologie, Ediția I, Editura Didactică și Medicală
Tabelul II Sensibilitatea bacililor gram-negativi la antibiotice și chimioterapice antimicrobiene, adaptare după Cristea et al., 2017 (continuare)
Sursa: Cristea, A., 2017, București, Tratat de farmacologie, Ediția I, Editura Didactică și Medicală
Tabelul II Sensibilitatea bacililor gram-negativi la antibiotice și chimioterapice antimicrobiene, adaptare după Cristea et al., 2017 (continuare)
Sursa: Cristea, A., 2017, București, Tratat de farmacologie, Ediția I, Editura Didactică și Medicală
III.2 Sensibilitatea și rezistența la antibiotice
Rezistența microbiană reprezintă capacitatea microorganismelor patogene de a se menține în stare activă și de a se multiplica în prezența antibioticelor și/sau a chimioterapicelor. Apare în mod natural (determinată genetic, reprezintă capacitatea microorganismelor de a se multiplica și dezvolta în prezența unei anumite substanțe antimicrobiene) sau poate fi dobândită (de natură genetică și negenetică). Caracterul rezistenței poate fi încrucișat între grupe chimice diferite de antibiotice și chimioterapice [Cristea et al., 2017].
Prin mecanism de dobândire genetică, rezistența implică selectarea în mod natural a germenilor rezistenți, prin transfer cromozomial sau extracromozomial, prin mediere plasmidică (cel mai frecvent) [Cristea et al., 2017]. Rezistența prin transfer cromozomial implică:
a. Mutațiile cromozomiale survin spontan sau sunt induse de agenți mutageni;
b. Mutațiile în genomul bacterian apar prin schimbarea unui singur nucleotid din molecula de ADN sau prin transpoziția unor secvențe mai mari de nucleotide;
c. Se poate instala brusc (independent de concentrația agentului antimicrobian) sau lent, prin mutații succesive (fenomen dependent de concentrația agentului antimicrobian). [Cristea et al., 2017].
Transferul extracromozomial implică transmiterea informațiilor cu ajutorul plasmidelor, molecule circulante de ADN bacterian autonom ce se regăsesc în spațiul extracromozomial citoplasmatic. Transmiterea plasmidelor de la o bacterie la alta se face prin conjugare (fenomen frecvent pentru bacilii gram-negativi de tipul Escherichia coli, Serratia, Klebsiella pneunomoniae sau Pseudomonas), prin traducerea prin intermediul bacteriofagilor (S. aureus și unii colibacili) sau prin transformare, când materialul plasmidic este preluat direct de alt microorganism în urma distrugerii unei bacterii. Medierea plasmidică vizează antibioticele betalactamice (peniciline, cefalosporine), macrolide de tip eritromicină și lincosamide, aminoglicozide, antibiotice cu spectru larg, sulfamide și trimetoprim. Mecanismul nongenetic se referă la existența unei stări metabolice inactive sau la renunțarea la structura țintă (modificarea în formă L, protoplaști sau lipsa peretelui celular) [Cristea et al., 2017]. Mecanismele biochimice ale rezistenței naturale și dobândite sunt:
Sintetizarea enzimelor ce inactivează compușii antimicrobieni, de tip betalactamaze:
Exoenzime (coci gram-pozitivi, negativi, bacili gram-pozitivi care inactivează penicilinele naturale, aminopenicilinele, carboxipenicilinele, ureidopenicilinele și cefalosporinele (I));
Endoenzime (bacili gram-negativi clasa I (piocianic, Enterobacter, Serratia), clasele II, III, IV și V (majoritatea celor aerobi) și clasa VI (Bacteroides fragilis);
Scăderea permeabilității bacteriei pentru antibiotic la nivelul peretelui bacterian sau a membranei citoplasmatice;
Producerea de enzime modificate (polimeraze, transpeptidaze, carboxipeptidaze), care limitează sau anulează acțiunea antibacteriană a antibioticului exercitată la nivelul enzimei țintă;
Alterarea țintei extracelulare (prin modificarea proteinelor ribozomale);
Creșterea sintezei de APAB, care anulează efectul de inhibare competitivă a sulfamidelor [Cristea et al., 2017].
Specific, în tratamentul febrei tifoide se utilizează cloramfenicol (100 mg/kg) timp de 12 zile, aplicat în primele 10 zile de boală pentru a reduce complicațiile și pentru a preveni recăderile. Cloramfenicolul este activ asupra bacilului tific deoarece pătrunde în interiorul macrofagelor în care se regăsește adesea situat. Prin același mecanism acționează și rifampicinele. Deoarece s-au semnalat tulpini de bacil tific rezistente la antibiotice, pentru orientarea tratamentului este necesară în prezent antibiograma. Se utilizează compuși ce realizează concentrații biliare ridicate. În prezent, nu se mai utilizează cloramfenicolul, ci sulfametoxazolul [Ordeanu, 2018].
În primul rând, terapia enteritelor include prevenirea deshidratării și refacerea echilibrului electrolitic, controlul durerii, al grețurilor și vărsăturilor. Deoarece se dorește evitarea prelungirii fazei de purtător, antibioterapia se realizează doar în baza antibiogramei. Cu toate acestea, în formele severe se inițiază antibioterapia sau în cazul pacienților imunocompromiși. Unele tulpini prezintă plurirezistență la antibiotice. În febrele enterice spitalizarea și administrarea intravenoasă de antibiotice trebuie să se realizeze cât mai repede posibil. Rezistența la antibiotice poate surveni și la serovarurile typhi și paratyphi. În cazul în care serovarul typhi rezidă biliar, aceasta va fi îndepărtată chirurgical și pacientului i se va administra ampicilină. Această cale de tratare a purtătorilor prezintă o eficacitate de 85% [Toma Săcărea, 2006].
În shigeloză, boală autolimitantă, tratamentul antibiotic al dizenteriei devine necesar în cazurile severe de boală, la pacienții vârstnici și la copii. Tratamentul antibiotic se face conform antibiogramei, reducându-se durata bolii de la 5-7 zile până la aproximativ 3 zile și perioada excreției de Shigella în covalescență. [Toma Săcărea, 2006].
În ceea ce privește speciile de Klebsiella, aproape toți membrii acestui gen sunt rezistenți la antibiotice betalactamice: penicilină, ampicilină, amoxicilină. Sunt frecvent sensibile la acțiunea cefalosporinelor, ceea ce le recomandă ca tratament de primă intenție. Cu toate acestea, în ultimii ani s-au izolat tulpini de Klebsiella pneumoniae rezistente la cefalosporine, rezistență datorată prezenței β-lactamazelor cu spectru larg, notate prescurtat SKBLS. Tulpinile de Klebsiella pneumoniae care produc SKBLS sunt notate SKBL-KP. Aceste enzime au capacitatea de a inactiva cefalosporinele prin clivarea inelului βlactamic al medicamentului. Genetic, producerea acestor enzime este codificată plasmidic [Toma Săcărea, 2006].
Așadar, în orice situație de infecție se recurge la efectuarea diagnosticului de laborator și a antibiogramei. În special în contextul actual, antibioterapia empirică este cel mai puțin recomandată, excepția fiind reprezentată de cazurile specifice în care viața pacientului este în pericol.
III.3 Epidemiologie și profilaxie
Profilaxia infecțiilor cu Escherichia coli presupune respectarea igienei colective, personale, alimentare. Fiind un comensal al intestinului și potențial patogen, acesta poate contamina medicamentele prin intermediul mâinilor murdare [Ordeanu, 2018]. Poarta de intrare (tract digestiv, respirator, urinar, genital) determină tipul de infecție [Toma Săcărea, 2006].
Cele mai importante rezervoare de transmitere a salmonelozelor, zoonoze, sunt animalele domestice și sălbatice. Datorită abilității de supraviețuire în produse de origine animală, toxiinfecțiile alimentare reprezintă cele mai frecvente salmoneloze [Toma Săcărea, 2006]. În România majoritatea salmonelelor care determină gastroenterite sunt serovarurile typhimurium și enteritidis. În ultimul timp datorită importului de alimente și a tranzitului mare de persoane străine se izolează la noi în țară specii nemaîntâlnite în trecut: Salmonella panama, Salmonella mision, Salmonella infantis, Salmonella derby, etc. [Ordeanu, 2018].
Febra tifoidă este o boală răspândită pe tot globul, mai ales în regiunile temperate unde apar cazuri sporadice în timpul anului și ibucniri epidemice în lunile iunie – septembrie. Izvorul de infecție este reprezentat de omul bolnav și purtător. Se transmite prin contact direct cu pacientul sau indirect prin consum de apă și alimente (legume, fructe, moluște, etc.) infectate. Mecanismul de infecție este fecal-oral. Pentru a preveni răspândirea infecției se utilizează următoarele metode: profilaxia nespecifică (măsuri de igienă și de screening progilactic) și profilaxia specifică (vaccinarea tifoidică la persoane cu vârsta între 5 și 55 de ani). Vaccinul tifoidic (T) este o suspensie de bacil tific (un miliard/ml) inactivată prin căldură și fenol. În raport cu vârsta se administrează 0,25 ml între 5 și 12 ani și 0,5 ml între 12 și 55 de ani, câte două doze la interval de 30 de zile pe cale subcutanată. Revaccinarea se face în doze unice anuale, în raport cu vârsta, timp de trei ani consecutiv. Urmează apoi cinci ani pauză după care se face din nou vaccinarea completă. În unele regiuni endemice ale țării se aplică în prezent vaccinul TAB sub formă de drajeuri, câte două drajeuri pe zi, pe nemâncate, timp de trei zile, deci în total șase drajeuri. Acest vaccin nu este însoțit de reacții secundare [Ordeanu, 2018].
În febrele tifoide și salmoneloze, se ridică un semnal de alarmă cu privire la chestiunile epidemiologice de tipul purtătorilor asimptomatici. O altă chestiune de o deosebită importanță este legată de utilizarea pe scară largă și nejudicioasă a antibioticelor la animale și oameni. Astfel, rezistența la antibiotice este una dintre cele mai mari probleme de sănătate publică. Coroborată cu numărul și varietatea rezervoarelor de salmonele, prospectele de viitor devin sumbre [Toma Săcărea, 2006].
Pentru Shigella, profilaxia este mai ales nespecifică: izolarea bolnavilor și dezinfecția dejectelor, ingerarea fructelor și legumelor spălate, igiena individuală riguroasă, în special a mâinilor, iar convalescenții vor fi eliberați din spital numai după trei coproculturi negative. Profilaxia specifică se realizează prin vaccinul Shiga, preparat de către Istrati în anul 1942, constituit din exotoxină, endotoxină și corpi microbieni care este bine tolerat în injecții intramusculare. Istrati și Meitert (1961) au preparat un vaccin dintr-o variantă de bacil dizenteric flexner 2a, cu patogenitate mult accentuată. Vaccinul conține o suspensie de bacterii vii, se administrează pe cale orală și este bine tolerat [Ordeanu, 2018].
Infecțiile provocate de Klebsiella spp. sunt mult mai frecvent nosocomiale, agenții patogeni fiind considerați oportuniști. Cel mai adesea în instituțiile de îngrijire medicală infecțiile se transmit prin intermediul personalului medical. Controlul apariției infecțiilor nosocomiale este foarte dificil. Grupurile intraspitalicești de control a infecțiilor agresive pot ajuta foarte mult la scăderea infecțiilor nosocomiale prin identificarea și controlul factorilor predispozanți și, mai mult, prin educarea și instruirea personalului din spital. Cele mai importante măsuri profilactice rămân cele de igienă generală. Imunizarea activă sau pasivă nu se practică. Totuși, seruri hiperimune sau vaccinuri pentru Klebsiella spp. au un impact major asupra infecțiilor nosocomiale [Toma Săcărea, 2006].
Fiind germeni foarte răspândiți în natură, infecțiile cu Proteus spp. depind de statusul imunologic al gazdei, virulența tulpinilor, de controlul infecțiilor nosocomiale și al alimentelor.
Mediile umede reprezintă pentru Pseudomonas aeruginosa atât sursă, cât și suport material de transmitere. Este o bacterie periculoasă în mediul spitalicesc pentru că aici există o mare aglomerare de persoane susceptibile la infecție și, în același timp, se selectează în mod natural tulpini virulente și foarte rezistente față de antibiotice. Calea de transmitere o reprezintă mâna, instrumentele sau dispozitivele medicale contaminate: sonde, catetere, canule, masca de oxigen etc. Se impune o activitate susținută de prevenire a infecțiilor nosocomiale cu Pseudomonas aeruginosa prin măsuri de igienă generală și individuală, prin aplicarea corectă a măsurilor de dezinfecție, antisepsie și asepsie. Profilaxia specifică este indicată pacienților de la terapie intensivă sau din secțiile de arși și se realizează cu vaccinul monovalent la pacienții cu afecțiuni respiratorii și vaccin polivalent sau ser imun polivalent la cei cu arsuri extinse. Rezistența sa mare ridică serioase probleme terapeutice favorizând și răspândirea bacteriei. Tratamentul infecțiilor cauzate de Pseudomonas aeruginosa se face obligatoriu sub controlul antibiogramei și întotdeauna cu o asociere de antibiotice [Toma Săcărea, 2006].
În cazul Vibrio cholerae, rezervorul de infecție principal îl reprezintă omul bolnav, purtătorul convalescent și purtătorul sănătos. O altă sursă de infecție o reprezintă rezervorul extrauman, vibrionii supraviețuind în organismul sau cochilia unor viețuitoare marine cum ar fi unele specii de crustacee, moluște și pești. Transmiterea infecției se face în principal prin consum de apă contaminată, alimente marine insuficient tratate termic și fecal-oral. Muștele pot interveni în transmitere. Biotipul El Tor este foarte contagios. Receptivitatea bolii este generală. Holera se cunoaște încă din anul 1817 când a apărut în India, Pakistan și Birmania, apoi s-a extins pe tot globul fiind descrisă prima pandemie. De atunci au fost descrise în total 7 pandemii. În prezent holera a rămas endemică în India și o parte din țările din Asia și Africa (Afghanistan, India, Cambodgia, Malaezia, Nepal, Sri Lanka) și apare sporadic în America de Nord, Australia și unele țări europene [Toma Săcărea, 2006]. Măsurile de profilaxie sunt riguroase, în special în circumstanțe epidemiologice (carantină, profilactic tetraciclină 5-6 zile, vaccinarea cu vaccin holeric inactivat prin căldură, caracterul bacteriologic riguros al tuturor persoanelor cu simptomatologie specifică, protecția și supravegherea surselor de apă potabilă, etc.) [Ordeanu, 2018]. Cea mai importantă măsură terapeutică o reprezintă compensarea rapidă a pierderilor hidroelectrolitice prin rehidratare intravenoasă, urmată de rehidratare orală. Medicația antimicrobiană se administrează în cure scurte, iar antibioticul se alege în funcție de rezistența la antibiotice a tulpinilor circulante în focarul endemic. Măsurile specifice sunt reprezentate de vaccinare. În acest domeniu România are prima contribuție în pandemia din 1913, când s-a practicat pentru prima dată vaccinarea pe scară largă, care a dus la stingerea rapidă a epidemiei. Primele vaccinuri cu administrare parenterală au avut o eficiență mai redusă. În prezent se încearcă dezvoltarea vaccinurilor cu administrare orală, utilizând mai multe metode: vaccinuri corpusculare inactivate, vaccinuri vii obținute prin inginerie genetică. Vaccinurile corpusculare inactivare cu administrare orală conferă o imunitate de 6 luni și se pot administra în zonele endemice. Vaccinurile vii cu administrare orală, obținute prin inginerie genetică par a fi o promisiune în creșterea eficienței vaccinării holerice [Toma Săcărea, 2006].
Capitolul IV. Importanța pentru farmacist a bacililor gram-negativi
IV.1. Patologie
Unii bacili gram-negativi pot să cauzeze îmbolnăviri la om și animale, prin mecanisme de patogenitate. În mod normal, mecanismele de apărare ale unui individ sănătos pot înlătura majoritatea microorganismelor patogene în scurt timp de la pătrunderea în organism. În cadrul speciei, gradul de patogenitate al unei tulpini se regăsește descris de conceptul de virulență. Spre deosebire de patogenitate, care reprezintă atributul speciei, virulența este o caracteristică a tulpinii. Același microorganism poate prezenta atât tulpini toxigene virulente, cât și tulpini netoxigene și, deci, nepatogene. Chiar și între tulpinile toxigene există o diferență în ceea ce privește cantitatea de toxină secretată. În funcție de capacitatea de invazie a organismului, se pot distinge:
a. Microorganisme toxigene: multiplicarea are loc discret, la poarta de intrare iar toxina produsă este apoi vehiculată în întregul organism prin sânge;
b. Microorganisme invazive: penetrarea mai adâncă a țesuturilor este dependentă de atașarea acestora și, odată pătrunse, se vor multiplica și vor secreta diverși factori de patogenitate;
c. Microorganisme sensibilizante: subsecvent infecției apare sensibilizarea organismului, răspunsul survenind prin reacții imunopatologice ce îi sunt nocive.
Contextul evoluționar a dus la apariția bacteriilor cu proprietăți invazive, toxigene și sensibilizante (ca, spre exemplu, Streptococcus pyogenes). Rezervorul de infecție este reprezentat, de cele mai multe ori, de către însuși pacientul afectat sau care a devenit purtător, ducând la propagarea infecției. Căile de eliminare în mediu sunt reprezentate, în mare parte, de fluidele biologice. Individul bolnav reprezintă cel mai important rezervor de infecție, putând fi mai contagios în perioada de incubație. Deși pentru numeroase boli infecțioase vindecarea clinică este însoțită de sterilizarea bacteriologică, în cazul anumitor patogeni eliminarea rămâne chiar și după aceea, foștii bolnavi constituind “purtătorii de germeni” (purtătorii precoci sau preinfecțioși și purtătorii foștilor bolnavi). Eliminarea poate avea loc permanent sau intermitent. Purtătorii ocazionali sunt indivizi sănătoși care sunt imuni, însă care au avut contact cu bolnavul.
Căile de transmitere ale infecției reprezintă, practic, traseul unui patogen de la sursă până la un individ receptiv pentru a produce o nouă contaminare, fie prin contact direct, fie prin intermediul unor obiecte sau elemente ale mediului extern, alimente sau chiar medicamente. De asemenea, nerespectarea regulilor de igienă personală are o contribuție negativă extrem de pregnantă, aceasta fiind o cale extrem de rapidă de transmitere a bacteriilor patogene, în special pentru infecțiile cu poartă de intrare digestivă.
În continuare, una dintre chestiunile cele mai importante este reprezentată de către populația receptivă. Acest număr esențial în context epidemiologic are la bază susceptibilitatea de a deveni un mediu optim de dezvoltare pentru agentul infecțios. Infecțiile nosocomiale sunt dobândite în cursul spitalizării sau al unui tratament medicamentos. Din punct de vedere al impactului, acestea sunt unele dintre cele mai dificile și mai problematice infecții, îndeosebi în contextul modern actual de plurirezistență bacteriană. Abordarea terapeutică vizează, în acest context, efectuarea unei antibiograme în vederea identificării tratamentului eficient.
Organismele sunt în permanență expuse contactului cu nenumărate microorganisme și, în momentul în care un agent patogen pătrunde, apare un conflict între mecanismele de agresiune și posibilitățile de apărare. Altfel spus, infecția poate fi definită ca fiind cumulul proceselor biologice ce au loc în organismul gazdei subsecvent pătrunderii și multiplicării unor agenți infecțioși. Determinanții acestui proces includ:
a. Obligativitatea patogenității microorganismului;
b. Necesitatea existenței unei cantități suficiente de microorganisme, astfel încât să apară procesul infecțios;
c. Carea de pătrundere a patogenului să fie propice dezvoltării speciei respective;
d. Calea de transport până la țesutul sau la organul în care se va fixa să fie ușor accesibilă.
Patogenitatea reprezintă abilitatea provoca boala la o anumită specie gazdă. Virulența reprezintă abilitatea microorganismelor de a pătrunde, adaptare, înmulțire și invadare a organismului. Determinanții acestui proces includ capsula (spre exemplu, virulența pneumococului este legată în mod exclusiv de încapsularea sa. De asemenea, și streptococul betahemolitic de tip A prezintă în structura peretelui bacterian proteina M, responsabilă de virulență); agresinele (enzime eliminate în afara corpului bacterian); hialuronidaza și colagenaza; hemolizine, leucocidine, lecitinaze (cu rol de liză a diferitelor celule); fibrinolizine sau factori antifagocitari. Un rol important în virulență îl joacă vârsta bacteriilor (cele tinere, sub 100 de generații, fiind mai virulente). În același timp, mobilitatea deosebită a unor microorganisme este extrem de importantă, putând facilita invadarea țesuturilor, chiar și a barierelor intacte. Manifestarea virulenței poate fi dependentă și de anumiți factori mult mai complecși, ca în cazul speciilor potențial patogene, care sunt de regulă inofensive pentru gazdă, în anumite condiții.
Toxinogeneza reprezintă manifestarea patogenității prin secretarea anumitor compuși, endo sau exotoxine. Exotoxinele sunt acei compui eliberați de celula vie în mediul exterior, fiind, în general, active în cantități foarte mici, acțiunea lor fiind extrem de specifică. O serie de microorganisme pot secreta în același timp exotoxine și alți factori de patogenitate (ca, spre exemplu, streptococii beta hemolitici de grup A sau stafilococii enterotoxici). Endotoxinele reprezintă compuși în strânsă legătură cu constituenții celulari, eliberați la moartea și autoliza bacteriană. În general situați în profunzimea peretelui bacterian, sunt mai puțin antigenice decât exotoxinele. În timp ce exotoxinele sunt termolabile, endotoxinele sunt termorezistente. Factorii de sensibilizare asociați acțiunii bacteriene includ fenomenele de sensibilizare alergică, prin formarea complexelor specifice antigen-anticorp.
Răspunsul imun la pătrunderea în țesuturi a antigenelor duc la apariția unor mecanisme imunologice complexe, umorale și celulare. Mecanismele de apărare sau rezistența antiinfecțioasă cuprind totalul proceselor de adaptabilitate fie transmise ereditar, fie dobândite, care au rolul de a împiedica pătrunderea și dezvoltarea agenților patogeni.
Imunitatea nespecifică (înnăscută) este dependentă de specie și reprezintă, practic, rezistența înnăscută a acesteia. Răspunsul imun este extrem de rapid și maximal, nespecific și acest subsistem nu dispune de memorie imunologică. Imunitatea nespecifică este prezentă în cazul tuturor formelor de viață. Reacțiile acestui proces de apărare sunt de fiecare dată identice. Printre factorii care influențează apărarea nespecifică se numără integritatea barierelor fizice (mecanice, ca spre exemplu, pielea și mucoasele); mecanisme specifice (cili vibratili, peristaltismul intestinal, lizozimul, ș.a.m.d.); flora comensală normală și factorii specifici mediului (pH, tărie ionică, ș.a.m.d.); factorii umorali care acționează independent de anticorpi și factorii celulari.
Imunitatea specifică (dobândită) apare individual, pe tot parcursul vieții, în funcție de patogenii întâlniți. Răspunsul imun este specific, existând un interval între expunere și răspuns maximal, subsistemul deținând memorie imunologică. Imunitatea specifică se întâlnește la organismele superioare (cu mandibulă). Antigenul este entitatea improprie gazdei care stimulează organismul cu producerea unui răspuns imun, cu structură chimică specifică care este în mod obligatoriu prezentată celulelor specifice, care are prezintă o anumită durată de remanență în organism. Anticorpul, gamaglobulină modificată, apare ca răspuns la pătrunderea antigenului în organism. Anticorpul are abilitatea de a reacțona în mod specific cu un anumit antigen. Un rol extrem de important este jucat de anumite celule ”imunocompetente”, care, sub influența antigenului, suferă anumite modificări. Acestea sunt formate din organele limfoide embrionare, care migrează în a doua perioadă de embriogeneză în organele limfocite primare sau centrale, unde vor deveni limfocite. Pătrunderea unui antigen nou în organism declanșează o mobilizare a celulelor polimorfonucleare neutrofile și apoi a macrofagelor. Înglobarea antigenului de către macrofage duce la migrarea acestora spre cel mai apropiat organ limfoid în care se regăsesc nenumărate limfocite T și B, formând centri germinativi. La nivelul macrofagului, antigenele sunt scindate și transformate sub acțiunea enzimelor lizozomale până la nivelul fragmentelor specifice care conțin informația antigenică. Aceasta este transmisă prin ARNm către limfocitele din jur. În ceea ce privește elaborarea anticorpilor, răspunsul organismului este fie de tip primar, dacă se discută despre prima expunere, fie de tip secundar, în cazul expunerilor repetate. Rezistența specifică poate fi obținută fie în mod activ prin participarea directă a sistemului imunocompetent, fie pasiv, prin vaccinare sau transmisie transplacentară. În general, imunitatea dobândită durează toată viața, implicând sistemul imunoformator, și instalându-se într-un interval cuprins între una și trei săptămâni.
La rândul lor, microorganismele prezintă o serie de factori de protecție față de mecanismele de apărare ale organismului uman, printre care se numără mecanisme antifagocitare (care se opun, practic, înglobării bacteriilor, de tipul capsulei, al glicocalixului și al proteinei M), mecanisme de rezistență la acțiunea enzimelor lizozomale, mecanisme de protecție față de efecte bactericide ale altor compuși (spre exemplu, structurile de suprafață precum capsula sau lipopolizaharidul din peretele bacterian), mecanisme de protecție față de reacțiile imune sau acești factori pot să rezide în însăși variabilitatea structurii. Mecanismele și modalitățile de interacționare a patogenilor cu gazda umană sunt apanajul sistemelor de apărare înăscute sau dobândite. Perpetuarea într-o populație implică în același timp un anumit grad de virulență și de adaptabilitate, de flexibilitate în modularea virulenței.
Bacilii patogeni Salmonella, Shigella și Vibrio provoacă boli infecțioase extrem de contagioase distincte care sunt diagnosticate, tratate și supravegheate epidemiologic. Starea endemică este rezultatul diagnosticării și tratării incorecte și insuficiente a unor forme ușoare. O altă chestiune de o importanță crucială este reprezentată de patogenitatea potențială a bacililor Escherichia, Klebsiella, Proteus și Pseudomonas. Explicația rezidă în faptul că nu sunt exigente din punct de vedere nutritiv și, de asemenea, sunt prezente atât în mediul extern, cât și inern la nivel de tegumente și mucoase. Se observă că în mediul intraspitalicesc ca urmare a procedurilor de igienă și a antibioterapiilor apar tulpini cu patogenitate marcantă selectate în mod natural. Contaminarea medicamentelor poate duce la noi infecții iatrogene, severe. Astfel,
a. Bacilul coli care prin ”mâini murdare” poate contamina obiecte din spital și transmite astfel infecții uneori cu caracter epidemic; [Ordeanu, 2018].
b. Klebsiella pneumoniae poate contamina diferite medicamente folosite pentru aerosoli sau soluții dezinfectante utilizate pentru bronhodilatatoare, bronhoscoape, sonde endotraheale, determinând infecții respiratorii grave soldate uneori cu exitus; [Ordeanu, 2018].
c. Bacilul piocianic care prezintă un spectru de sensibilitate natural mai restrâns la antibiotice, poate contamina unele preparate cu antibiotice față de care el este rezistent (unguent, colire), contaminând și supraviețuind în soluții de penicilină, acid boric, fluoresceină, anestezice, diferite colire, soluție de clorură de benzalconiu, etc. [Ordeanu, 2018].
IV.2. Biotehnologii farmaceutice
Cu o importanță deosebită în biotehnologiile farmaceutice, cunoașterea aprofundată a particularităților microorganismelor este esențială în orice demers de cercetare, permițând dezvoltarea aplicațiilor în agricultură, industrie alimentară, industria chimică, pielărie, în protecția mediului și, nu în ultimul rând, în domeniul medical și farmaceutic. Locul fruntaș deținut de acestea rezidă atât în posibilitățile de dezvoltare oferite, cât și în posibilele efecte secundare asociate contaminării cu microorganisme.
În general, microorganismele de interes în aceste procese biotehnologice provin din surse naturale și, după selecție, acestea sunt supuse unor procese modificatoare. Produsele obținute prin aceste mijloace includ o gamă largă de compuși cu o importanță crucială, printre care antibiotice (în mare parte sintetizate din genul Streptomyces; spre exemplu, sintetizată din Penicillium chrysogenum și descoperită de Fleming în anul 1929, se obține penicilina; metabolitul secundar obținută în condiții strict controlate, streptomicina este obținută din tulpini de Streptomyces griseus); aminoacizi (ca, spre exemplu, lizina sau acidul glutamic); acizi organici (precum acid citric, acetic, lactic, fumaric, ș.a.m.d.); enzime (ca, spre exemplu, proteaze, amilaze și glucoamilaze); bioinsecticide microbiene (cu acțiune asupra unor insecte sau nematode); biopolimeri (utilizați pe scară largă pentru proprietățile de gelificare); polizaharide microbiene (folosite ca stabilizatori, pentru dispersarea particulelor, ca agenți formatori de filme, surfactanți, șa.m.d.).
Una dintre cele mai spectaculoase descoperiri din domeniul microbiologiei este că microorganismele pot realiza o serie de reacții chimice care nu pot fi realizate de chimia organică. Spre exemplu, unul dintre procesele de o importanță colosală este bioconversia steroizilor. Un alt rol extrem de important al microorganismelor este îndepărtarea poluanților din mediu (bioremediere) sau utilitatea în biodegradarea produselor agroalimentare ce generează pagube materiale semnificative (în care numite alimente procesate minimal pot produce infecții sau efecte nedorite, susceptibilitatea fiind proprie oricărui produs, caz în care apar în primul rând modificări organoleptice. În general, aceste situații sunt asociate nerespectării măsurilor igienodietetice).
În general, pregnanța rezervorului de infecție uman este justificată deopotrivă prin numărul mare de purtători sănătoși și de frecvența crescută a infecțiilor, prin intermediul plurirezistenței și a adaptabilității bacteriene în diferite condiții de mediu. Aceasta este o chestiune deosebit de stringentă, în special în ceea ce privește unitățile sanitare și posibilitățile de contaminare a medicamentelor. Din acest motiv, încăperile în care sunt preparate medicamentele se impun a fi menținute extrem de curate, iar produsele (în special cele obligatoriu sterile) se prepară în mod aseptic.
Putând fi considerat un domeniu relativ nou, biotehnologia are în vedere utilizarea diferitelor microorganisme sau a anumitor compuși specifici acestora pentru producerea de substanțe de interes medico-farmaceutic. De o deosebită importanță sunt producerea vaccinurilor și a medicamentelor. În prezent, majoritatea produselor medicamentoase produse și comercializate la nivel mondial cuprind, într-o anumită proporție, procese biotehnologice.
Vaccinurile reprezintă unul dintre cele mai importante produse derivate prin biotehnologii, permițând obținerea unei stări de rezistență specifică dobândită în mod artificial, imunizând activ pacienții. În general, vaccinurile preparate în vaccinologia clasică folosesc fie un fragment antigenic propriu corpului bacterian, fie diferiți compuși produși de microorganismele de interes. Vaccinuri corpusculare inactive sunt preparate din suspensii bacteriene omorâte (prin căldură, raze ultraviolete sau cu ajutorul unor substanțe precum fenoli, formol, ș.a.m.d.). Vaccinurile obținute din extracte microbiene sunt preparate fie din lizate, fie din anumite extracte solubile rezultate din dezintegrarea bacteriei cu ultrasunete sau prin diferite procedee chimice, prin concentrarea și purificarea ulterioară a componentelor de interes. De asemenea, vaccinurile pot fi preparate și din diferite toxine microbiene (anatoxine). În funcție de numărul antigenelor din compoziție, vaccinurile pot fi monovalente (în compoziția lor intrând o singură specie sau mai multe tulpini ale acesteia) sau polivalente (numite și asociate, conțin mai multe specii de interes, fiind deosebit de avantajoase întrucât implică un număr mult mai mic de inoculări în populație. Prepararea vaccinurilor are la bază tulpini cu virulența mult atenuantă (din tulpini vii și atenuate sau din tulpini vii, nepatogene). Selectarea tulpinilor are la bază o analiză extensivă și compehensibilă cu privire la proprietăți și la structura antigenică, în general pentru cele mai frecvente tulpini. O altă abordare implică autovaccinul, formulat pe baza patogenului izolat de la persoana bolnavă. Printre vaccinurile reprezentative de o importanță covârșitoare se numără vaccinul meningococic și autovaccinul streptococic dezvoltat de către Institutul Cantacuzino, așa cum se arată în Tabelul III.
Tabelul III Bacili gram-negativi utilizați în industrie
Sursa: Ordeanu V., Microbiologie farmaceutică. Note de curs, Editura Universității Titu Maiorescu, Editura Hamangiu, București, 2018
Compuși antimicrobieni produși de anumite microorganisme vii, antibioticele sunt utilizate profilactic sau în scop terapeutic în gestionarea patologiilor infecțioase (totuși, din peste 4000 de compuși de interes, doar în jur de 50 pot fi utilizați pe scară largă). Se impune ca produsul de elecție să prezinte o toxicitate redusă în același timp în care eficacitatea este ridicată și producția facilă. Antibioticele reprezintă o categorie grupă importantă de compuși medicamentoși ce prezintă toxicitate selectivă, prezența lor în concentrații mici având abilitatea de a inhiba anumite procese metabolice intracelulare sau de a provoca liza corpului bacterian, fără a fi nocive pentru celulele gazdă. Din acest motiv, există un mare interes față de utilizarea și utilitatea lor împotriva maladiilor infecțioase.
Asocierea dintre noile și vechile tehnologii proprii industriei farmaceutice prezintă un potențial crucial de valorificare a utilizării microorganismelor. Importanța pentru farmacist a microorganismelor rezidă în însăși abilitatea lor de contaminare și de dezvoltare în numeroase medii. Se poate afirma că, practic, este imposibilă existența unui mediu în care bacteriile să nu se dezvolte. În prezent, monografiile din Farmacopee de analiză în controlul microbiologic al medicamentelor, substanțelor farmaceutice, al mediului de lucru și al operatorilor cuprind metodologii moderne fizico – chimice (cromatografie de lichide sub presiune, spectrofotometrie de absorbție atomică), farmacotehnic (de dizolvare) și microbiologic (controlul eficacității conservanților antimicrobieni).
IV.3. Contaminarea microbiană
Toate monografiile cuprinse în Farmacopee impun controlul încărcăturii microbiene, indiferent de formulare (substanțe farmaceutice ca atare, produse de origine vegetală sau preparate nesterile, ș.a.m.d.). Stabilitatea fizico-chimică, microbiologică, biofarmaceutică se asigură prin diferite mijloace. De asemenea, prin recipiente închise etanș, se înțelege că acestea trebuie să protejeze conținutul de mediul extern, prin evitarea contaminării cu produse solide, lichide, vapori, gaze sau microorganisme.
În primul rând, prelevarea probelor pentru analiză pentru determinările calitative și cantitative prevăzute în Farmacopee trebuie să prezinte, sub toate aspectele, caracteristicile produsului din lotul și seria respectivă. Lotul reprezintă cantitatea de materie primă presupusă a fi unitară din care se obțin una sau mai multe serii de produse. Seria reprezintă totalitatea unităților de produs care au fost obținute în condiții identice într-un singur ciclu de operații. Condițiile de prelevare sunt stabilite conform normelor în vigoare. Numărul de unități dintr-o serie, necesar analizei, se stabilește în funcție de prevederile monografiei respective, corelate cu prevederile generale ale monografiei respectivei forme farmaceutice și cu prevederile monografiilor pentru metodele generale de analiză implicate.
Controlul organoleptic se realizează în scopul verificării aspectului, culorii, mirosului și gustului unei substanțe. Evaluarea aspectului implică controlul formei (cea cristalină se observă cu ochiul liber, forma microcristalină se apreciază cu ajutorul unui microscop care mărește de 200 de ori, iar în cazul formei amorfe la microscop nu se observă cristale). În cazul substanțelor lichide, se controlează dacă sunt limpezi (în raport cu apa), transparente, opace sau tulburi (în raport cu etaloanele de transparență, opacitate). La produsele moi se controlează dacă acestea sunt omogene sau nu. În ceea ce privește culoarea, substanțele solide trebuie privite fără prelucrare prealabilă pe o suprafață mată, albă, la lumina zilei. Pentru substanțele lichide se folosește ca etalon de comparație apa, iar eventualele colorații se compară cu etaloanele de culoare. Controlul mirosului se realizează, atât pentru substanțele solide, cât și pentru cele lichide, imediat după deschiderea recipientului. Conceptul de ”miros caracteristic” înseamnă că mirosul perceput nu poate fi confundat, fiind specific produsului respectiv. Controlul gustului se realizează prin prelevarea unei cantități mici de substanță netoxică și aducerea acesteia pe limbă (pe hârtie de filtru, în cazul lichidelor netoxice).
Sterilizarea este procesul de distrugere sau de îndepărtare a microorganismelor vii în formă vegetativă sau sporulată. Metoda se alege în funcție de proprietățile fizico-chimice ale produselor, pentru evitarea eventualelor modificări în calitatea acestora. Eficacitatea metodei de sterilizare depinde de natura produselor, de gradul și natura unei eventuale contaminări microbiene și de condițiile în care a fost preparat produsul. Sterilizarea cu vapori de apă sub presiune și sterilizarea prin căldură uscată sunt metodele cele mai sigure și trebuiesc folosite ori de câte ori natura produsului o permite. Prepararea pe cale aseptică se folosește în cazul produselor care nu pot fi sterilizate în recipientul final. Echipamentul de lucru al personalului, substanțele, solvenții, ustensilele, recipientele trebuie sterilizate în prealabil. Toate operațiunile se efectuează în condiții aseptice.
Verificarea eficacității sterilizării se efectuează cu ajutorul unor indicatori biologici. Prin valoarea D a indicatorilor se înțelege valoarea unui parametru de sterilizare (durata sau doza absorbită) necesară pentru a obține o reducere de 90% a numărului inițial de microorganisme viabile.
1. Sterilizarea cu vapori de apă sub presiune: se folosește ori de câte ori este posibil pentru preparatele apoase, pentru pansamentele chirurgicale și produse analoage ale acestora. Se efectuează în autoclave încălzite electric sau cu gaz, în care aerul a fost înlocuit cu vapori de apă sub presiune. Sterilizarea se efectuează, de obicei, la 121oC cel puțin 15 minute sau la 115oC cel puțin 30 de minute. Materialele poroase, precum pansamentele chirurgicale și produsele analoage, se sterilizează în recipiente care asigură penetrația vaporilor de apă. Pansamentele chirurgicale se sterilizează, de obicei, la 134-138oC timp de 5 minute. Anumite articole din sticlă, porțelan sau metal se sterilizează la 121-124oC timp de 20 de minute. Ca indicator biologic se pot folosi sporii de Bacillus stearothermophilus.
2. Sterilizarea prin căldura uscată: se folosește pentru produsele rezistente la căldură și pentru produsele neapoase, care nu pot fi sterilizate cu vapori de apă sub presiune: produse uleioase, pulberi, material de laborator din sticlă sau porțelan, instrumentar metalic fără suduri cu cositor. Sterilizarea prin căldură uscată se realizează, de obicei, la 160oC pentru cel puțin 3 ore, la 170oC cel puțin o oră sau la 180oC cel puțin 30 de minute.
3. Sterilizarea prin filtrare: se folosește în cazul soluțiilor termolabile. În vederea îndepărtării microorganismelor, filtrarea se efectuează prin filtre bacteriologice sterile sau prin membrane filtrante sterile, respectând precauțiile impuse de acest mod de lucru. Produsul filtrat se introduce, în condiții aseptice, în recipientele în prealabil sterilizate, care apoi se închid etanș.
4. Sterilizarea cu gaz: se folosește pentru produsele care nu rezistă la temperaturile ridicate necesare sterilizării sau cu vapori de apă sub presiune sau sterilizării prin căldură uscată și care sunt compatibile cu gazul sterilizant (de obicei, oxidul de etilen care, datorită faptului că este inflamabil, adesea se regăsește asociat cu un gaz inert precum dioxidul de carbon).
Controlul sterilității se poate efectua folosind fie metoda filtrării prin membrane, fie metoda însămânțării directe în mediul de cultură. Metoda filtrării prin membrane permite separarea microorganismelor contaminate de inhibatorii creșterii lor și se folosește în special pentru lichidele și pulberile care prezintă activitate microbiană. Metoda este adecvată și preferabilă în cazul produselor uleioase, a unguentelor și cremelor care pot fi aduse în soluție cu diluanți sterili lipsiți de activitate antimicrbiană cât și în cazul lichidelor și a pulberilor lipsite de activitate antimicrobiană. Însămânțarea directă în mediul de cultură se realizează prin transferarea cantității din proba de analizat direct în mediul de cultură (masă sau volum), astfel încât raportul probă luată în lucru – mediu de cultură să fie de aproximativ 1:10 pentru lichide și 1:100 pentru solide, dacă nu se prevede altfel. Dacă proba de analizat are activitate antimicrobiană, aceasta se înlătură prin neutralizare cu o substanță sterilă corespunzătoare sau prin diluare. Mediile de cultură însămânțate se incubează timp de 14 zile (dacă nu se prevede altfel) la 30-35oC pentru bacterii și la 20-25oC pentru fungi. Examinarea mediilor de cultură se efectuează zilnic pe toată perioada de incubare. Mediile care conțin preparate uleioase trebuie agitate ușor în fiecare zi. Controlul contaminării microbiene urmărește determinarea numărului total de microorganisme aerobe sau lipsa unor microorganisme patogene sau condiționat-patogene, eventual prezente în produsele farmaceutice, de la materii prime până la forme farmaceutice finite.
Microorganismele cele mai importante pentru contaminarea substanțelor farmaceutice, suprafețelor, personalului și a medicamentelor vizează bacteriile extrem de răspândite în mediile ambiante, unele fiind și foarte rezistente la factorii de mediu. Prin contaminarea medicamentelor, ele pot fi administrate involuntar pacientului, care va căpăta în plus și o boală infecțioasă care îi va agrava situația, mai ales dacă este vorba despre un medicament injectabil, perfuzabil, un colir oftalmic, un medicament pentru plăgi sau care se înghite. Pe de altă parte, prezența unui microorganism viu în medicament poate să îl altereze, anulându-i calitățile terapeutice. Chiar și un microorganism omorât, care nu mai poate să provoace o infecție, poate să cauzeze reacții alergice, febră, toxinoză, etc. Oricum, prezența unui microorganism patogen în substanțele farmaceutice, pe ustensile și pe suprafețele de lucru, la operatori, în ambalaje sau în medicamente constituie și un indicator de contaminare microbiană, putând să coexiste și alți microbi nedoriți. În cazul în care medicamentul sau produsul însuși este un microorganism viu cu efect terapeutic se impune verificarea viabilității sale și puritatea culturii, pentru a nu fi contaminată cu microbi patogeni.
Pseudomonas aeruginosa este o bacterie condiționat patogenă, bacil gram-negativ (colorat în roșu), non enterobacterie, în formă de bastonaș, cu lungimea de 3-5 μm și diametru de 1 μm, nesporulat, așezat individual. Se găsește în mediul ambiant pe suprafețe, plante, etc. Este rezistent la factorii de mediu, la dezinfectante și antibiotice, fiind cea mai rezistentă bacterie nesporulată. Produce îmbolnăviri prin multiplicare în organism și mai puțin prin toxine, de exemplu plăgi purulente (cu puroi verde), infecții ORL, ale organelor interne și uneori toxiinfecții alimentare. Este o bacterie recomandată pentru testări microbiologice și farmacologice. La 100 ml mediu nr. 10 se adaugă 10 ml din diluția 1 la 10 a probei luate în lucru (sau cantitatea corespunzătoare la 1 g sau 1 ml probă de analizat) și se omogenizează. Se incubează la 35-37oC timp de 24 de ore, după care se efectuează treceri pe mediul nr. 11 și pe mediul nr. 12, turnate în plăci. Se incubează la 35-37oC timp de 24-48 de ore. Dacă pe mediul nr. 11 apar colonii de culoare verde și pe mediul nr. 12 colonii mici, de culoare verde-albăstruie, foarte aderente pe mediu, se efectuează treceri pe mediul nr. 13 și pe mediul nr. 14, turnate în plăci. Apariția pe mediul nr. 13 a unor colonii galben-verzui, iar pe mediul nr. 14 a unor colonii albastre, poate constitui indiciul prezenței microorganismului. Prezența sa se confirmă prin efectuarea testului oxidazei, în care o porțiune dintr-o colonie suspectă se trece în striuri cu ajutorul unei anse din platină, de pe mediul nr. 13 sau mediul nr. 14, pe o fâșie impregnată cu diclorhidrat de N,N’-dimetil-4-fenilendiamină. Apariția unei colorații roșu purpurii arată prezența microorganismului Pseudomonas aeruginosa, care se poate confirma și biochimic.
Escherichia coli este o bacterie nepatogenă, bacil gram-negativ (se colorează în roșu), din familia enterobacteriilor, are formă de bastonaș, cu lungimea de 3-5 μm și diametrul de 1 μm, nesporulat, așezat individual. Se găsește în mod normal în intestinul animalelor (inclusiv om) de unde contaminează mediul ambiant: sol, apă, obiecte. Este rezistent la multe antibiotice. Produce îmbolnăviri (condiționat patogen) prin multiplicare în organism dacă se află în alt loc decât la nivel intestinal: plăci purulente, tegumente și mucoase, infecții urinare, ORL, etc. Rareori există și tulpini patogene care pot să dea infecții digestive, la care există și toxine (toxiinfecții alimentare). Prezența microorganismului în apă, alimente, substanțe farmaceutice, etc. este considerată ca un indicator de poluare cu enterobacterii, deoarece este cel mai numeros reprezentant al familiei. Dacă se identifică E. coli, cu mare probabilitate vor exista și alte enterobacterii condiționat patogene sau patogene, care deși pot fi prezente sunt mai greu de pus în evidență. Este o bacterie recomandată pentru testări microbiologice și farmacologice. La 100 ml mediu nr. 3 se adaugă 10 ml din diluția 1 la 10 a probei luate în lucru (sau cantitatea corespunzătoare la 1 g sau 1 ml probă de analizat) și se omogenizează. Se incubează la 37oC timp de 24-48 de ore, după care se efectuează treceri pe mediul nr. 15 turnat în plăci. Se incubează la 43-45oC timp de 18-24 de ore. Apariția pe mediul nr. 15 a unor colonii roșii, în general nemucoase, de bacterii gram-negative sub formă de bastonașe înconjurate uneori de o zonă de precipitare roșiatică, poate constitui indiciul prezenței microorganismului. Se confirmă prezența sa prin formarea de indol și prin alte teste biochimice.
Salmonella spp. este un grup de bacterii patogene, bacili gram-negativi (colorați în roșu), enterobacterie în formă de bastonaș, cu lungimea de 3-5 μm și diametrul de 1 μm, nesporulat, așezat individual. Se poate găsi în intestinul unor animale (oameni bolnavi sau purtători aparent sănătoși, mamifere, păsări, reptile, pești, etc.) de unde poluează apa, solul și diferite obiecte. Rozătoarele bolnave pot să contamineze produsele din depozite (alimente, substanțe farmaceutice). Produce îmbolnăviri prin multiplicare în organism și prin toxine: febră tifoidă și paratifoidă, salmoneloze, toxiinfecții alimentare. Este puțin rezistentă în mediul ambiant (dar se conservă bine în gheață), la dezinfectante și antibiotice, dar poate căpăta antibiorezistență. La 100 ml mediu nr. 9 se adaugă 10 ml din diluția 1 la 10 a probei luată în lucru (sau cantitatea corespunzătoare la 1 g sau 1 ml probă de analizat) și se omogenizează. Se incubează la 37oC timp de 24-48 de ore după care se efectuează treceri pe mediul nr. 12 turnat în plăci. Se incubează la 37oC timp de 24-48 de ore. Apariția pe mediul nr. 12 a unor colonii de culoare verde-albăstruie sau neagră înconjurate de un halou deschis la culoare poate constitui indiciul prezenței. Se confirmă prezența prin teste biochimice și serologice. O porțiune de colonie suspectă se trece în mediul nr. 16 prin înțepare pe partea dreaptă și în striuri pe partea înclinată. Dacă după incubare la 37oC timp de 24 de ore partea înclinată este alcalină (roșie) și partea dreaptă este acidă (galbenă) cu sau fără înnegrirea concomitentă a părții drepte (prin producerea de sulfură de hidrogen) se procedează și la confirmarea prin teste serologice.
Controlul eficacității conservanților antimicrobieni este un aspect deosebit de important. Conform F.R.X., conservanții antimicrobieni sunt compuși care se adaugă unor preparate farmaceutice sterile în scopul evitării unei eventuale contaminări microbiene a acestora pe perioada folosirii sau unor preparate farmaceutice nesterile în scopul reducerii încărcăturii microbiene a acestora. Adăugarea conservanților antimicrobieni nu exclude obligativitatea respectării regulilor de bună fabricație. Microorganismele-test folosite pentru controlul eficacității conservanților antimicrobieni, prevăzute în F.R.X., sunt cel mai frecvent întâlnite în timpul procesului de fabricație, pe perioada conservării și a folosirii produselor, prezentând un risc crescut pentru contaminarea preparatelor farmaceutice; în unele cazuri pot fi folosite și alte microorganisme test. Pentru a evalua eficacitatea conservanților antimicrobieni folosiți, perioada de testare este de cel puțin 28 de zile; după caz, se pot efectua testări repetate. Controlul eficacității conservanților antimicrobieni se efectuează în condiții care permit evitarea unei contaminări accidentale a preparatului farmaceutic analizat și fără a efectua microorganismele-test inoculate. Pentru contaminările experimentale se folosesc următoarele microorganismele: Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Candida albicans (ATCC 10231), Aspergillus niger (ATCC 16404).
Activitatea antimicrobiană, microbiologică, a antibioticelor se realizează, conform F.R.X., prin metoda difuzimetrică, în care se compară zonele de inhibiție ale creșterii unui microorganism test, produse de concentrații cunoscute dintr-un antibiotic-standard, cu zonele de inhibiție produse de concentrații presupuse egale ale antibioticului de analizat. Activitatea microbiologică a antibioticelor se exprimă în unități internaționale sau în micrograme per mililitru de antibiotic de analizat. Soluțiile standard stoc și de lucru se prepară prin dizolvarea unei mase cunoscute de antibiotic-standard (în prealabil uscat, dacă este necesar), în 100 ml solvent. Microorganismele test utilizate se folosesc fie în formă vegetativă, fie în formă sporulată. În cazul microorganismelor test în formă sporulată se utilizează o suspensie-stoc de spori care se prepară după o anumită tehnică (după păstrarea în plăci Petri cu mediul nr. V, se realizează treceri succesive pe o durată de trei zile). La determinarea activității microbiologice a antibioticelor se folosesc suspensii de microorganisme-test de anumite concentrații, obținute prin diluție din suspensiile de concentrația 109 microorganisme test pe mililitru, atât pentru forma vegetativă, cât și pentru forma sporulată. Activitatea microbiologică a antibioticelor se mai poate determina și prin metoda turbidimetrică.
Tabelul IV Medii de cultură folosite pentru întreținerea tulpinilor de microorganisme-test, pentru obținerea suspensiei-stoc de spori și pentru treceri zilnice, conform FR X
Sursa: Farmacopeea Română, Ediția a X-a
Tabelul V Medii de cultură folosite pentru determinarea activității microbiologice a antibioticelor, conform FR X
Sursa: Farmacopeea Română, Ediția a X-a
Tabelul VI Soluții tampon sterile, conform FR X
Sursa: Farmacopeea Română, Ediția a X-a
Impurități pirogene sunt controlate, conform F.R.X., se bazează pe urmărirea temperaturii rectale a iepurilor, după administrarea intravenoasă a soluției de analizat, pentru decelarea prezenței unor eventuale impurități cu efect hipertermizant. Administrarea se efectuează intravenos în vena marginală a urechii. Viteza de injectare trebuie să fie de cel mult 5 ml/min. Pentru volume ce depășesc 5 ml/kg masă corporală, soluțiile administrate trebuie să aibă temperatura cuprinsă între 20 și 38oC.
Impuritățile toxice se determină pe șoareci albi, sănătoși, cu masă corporală de 18-22 g. Proba de lucru se dizolvă în apă sterilă sau în solventul specificat în monografie, în concentrația prevăzută în monografia respectivă. Dacă nu se prevede altfel, se administrează intravenos, la cinci șoareci câte 0,5 ml soluție-probă într-un interval de 5-10 s, cu un debit constant, iar animalele se țin sub observație timp de 24 de ore. Proba este corespunzătoare dacă nici un animal nu prezintă fenomene toxice (convulsii, pareze) imediat după injectare și dacă toate animalele supraviețuiesc până la sfârșitul perioadei de observație. În caz contrar, determinarea se repetă o dată sau de mai multe ori pe zi, pe loturi de cel puțin cinci animale nefolosite.
În acest context, se poate argumenta cu ușurință obligativitatea controlului microbiologic riguros și a preparării aseptice a oricărui medicament, indiferent de calea de administrare.
PARTEA EXPERIMENTALĂ
Capitolul V. Studiu practic
V.1 Obiectivele cercetării
Obiectivul principal al prezentului studiu este rezultatul direct al contextului global marcat de evoluția extrem de rapidă a microorganismelor și, în speță, a cocilor de interes medico-farmaceutic. Din acest motiv, se relevă una dintre chestiunile cele mai stringente și importante de considerat, maniera în care modificările de la nivelul structurii interne impactează morfologia și fiziologia acestor patogeni.
În acest sens, obiectivul concret de cercetare este reprezentat de aprecierea caracterelor morfologice și de cultură pentru unii dintre cei mai notorii, mai vătămători și mai alarmanți germeni ai prezentului, Escherichia coli și Pseudomonas aeruginosa. Având în vedere că primul pas în emiterea oricărui diagnostic este reprezentat de aprecierea atributelor caracteristice patogenului, cunoașterea caracteristicilor morfotinctoriale ale bacteriilor de interes este esențială.
Justificarea alegerii efectuate rezidă în însăși extinderea și impactul colosal al acestei specii, în special în contextul actual înfricoșător al plurirezistenței bacteriene și al limitării, din ce în ce mai severe, al alternativelor terapeutice disponibile. De asemenea, progresul cercetărilor nu poate ține pasul cu evoluția rapidă și, în acest sens, devine un imperativ dezvoltarea de noi tehnici, metode și procedee cu ajutorul tehnologiilor moderne în era digitală.
Studiu a implicat introducerea microorganismului în diverse medii de cultură, atât lichide, cât și solide, și evaluarea comportamentului acestuia și predilecțiile pe care le prezintă. În vederea emiterii concluziilor pertinente cu privire la exprimarea afinității microorganismului pentru compușii definitorii ai mediilor de cultură și asupra specificităților morfologice observate, probele prelucrate sub formă de frotiuri au fost evaluate și la microscop. Această determinare permite, pe de o parte, confirmarea precisă a aspectului general, al formei celulare, a dispunerii cocilor și a lor dimensiunii aproximative și, în același timp, relevă viabilitatea celulelor în concordanță cu ipotezele de studiu. Studiul a fost întreprins în luna mai a anului 2019 și a avut în vedere aprecierea caracterelor morfotinctoriale ale bacililor, iar cercetarea efectuată și-a propus evaluarea modului în care anumite specii de microorganisme de mare interes în aria medico-farmaceutică răspund în diferite condiții de mediu.
V.2 Material și metodă
Studiul s-a desfășurat la catedra de microbiologie din cadrul Universității Titu Maiorescu din București, în perioada mai-iunie a anului 2019 [Figura 9], [Figura 10], [Figura 11], [Figura 12], [Figura 13]. Prezenta cercetare a implicat cultivarea unei tulpini de Escherichia coli și a unei tulpini de Pseudomonas aeruginosa în diferite medii de cultură, compararea rezultatelor obținute fiind realizată în raport cu un blanc. Însămânțarea s-a realizat cu ajutorul anselor cu vârf, în mediile cultură deja preparate în industrie (de către firma producătoare Sanimed), de tip solid (în plăci Petri cu diametrul de 10 cm), lichid sau semisolid. După însămânțarea mediilor de cultură, acestea au fost ținute la incubatoarele Memmert sau Heraeus timp de 24 de ore la o temperatură de 37oC. Evaluarea microscopică s-a realizat cu ajutorul microscopului optic model IOR M24M. Conform Farmacopeei Române, Ediția a X-a, există o serie de 17 medii de cultură a căror tehnică de preparare este indicată pentru 1000 g. Dintre acestea, s-au folosit în efectuarea studiului: mediul geloză-sânge, Chapman și mediul Chapman lichid. Incubarea a avut în vedere menținerea unui grad de umiditate de 70-80%. Însămânțarea s-a realizat cu ajutorul anselor, prin puncție în cazul mediilor lichide și cu ajutorul tehnicii de însămânțare prin epuizare.
V.3. Rezultate și discuții
V.3.1. Cultivarea pe medii lichide
V.3.1.1. Escherichia coli
Escherichia coli, flora dominantă a intestinului gros cu rol de menținere a unei fiziologii normale și în sinteza unor proteine din grupul B și K, este o bacterie rezistentă în mediul extern. Deși poate fi extrem de ușor distrus de către antisepticele și dezinfectantele uzuale, prezintă o capacitate deosebită de adaptare la modificările de mediu (modificări de pH, temperatură sau osmolaritate). Poate sesiza prezența sau absența unor substanțe chimice sau gaze în mediul său de viață și, cu ajutorul cililor, se poate apropia sau îndepărta de acestea. Poate de asemenea să devină imobil și să producă fimbrii de adeziune care să-i permită aderarea de substratul specific. Ca răspuns la modificările de temperatură sau osmolaritate își modifică dimensiunea porilor prin modificări ale porinelor constituente ale membranei externe, variind-o pentru acumularea moleculele mari de nutrienți sau pentru a elimina substanțele inhibitoare.
Escherichia coli este un bacil gram-negativ ce poate prezenta și forme filamentoase sau variații și în ceea ce privește prezența capsulei, a cililor peritrichi și a mobilității. Este un germen nepretențions, care crește și pe medii simple în care glucoza poate fi singurul constituent organic. Este aerob, facultativ anaerob, care poate avea deopotrivă metabolism fermentativ sau respirator. Formează colonii de tip „S” la cultivarea în medii solide și formează un inel aderent pe peretele tubului în mediile lichide pe care le tulbură uniform. Formează indol în apă peptonată și nu crește pe mediu cu citrat. Fermentează glucoză și carbohidrați, producând acid și gaz, iar la descompunerea lactozei eliberează acid. Majoritatea tulpinilor sunt oxidazo-negative și sunt capabile să reducă nitriții în nitrați. Nu produc urează și nu descompun proteinele cu formare de hidrogen sulfurat.
Mediile lichide de cultură folosite pentru a evidenția morfologia și caracterele de cultură ale bacteriei gram-negative Escherichia coli au fost mediul Chapman lichid, mediul apă peptonată, bulionul simplu, bulionul cu selenit acid de sodiu, TSB și mediul semisolid Cary Blair [Tabelul VII].
Tabelul VII Rezultatele cultivării comparate de Escherichia coli, incubat 24 de ore la 37oC în diferite medii lichide
Notă: mediile lichide contin și: M1-seleniu (toxic bacterian), M2-clorură de sodiu hiperosmolar, M3-extract de soia, M4-extract de carne, M5-peptone de carne, M6-este mediu semisolid pentru conservare și transport, cu glicerină (inhibitor)
Legendă: – = 0, +/- = 1, + = 2, ++ = 3
Mediile de cultură lichide utilizate și rezultatele obținute
Metodă de preparare: Componentele, cu excepția lactozei, se dizolvă în apă. Se ajustează pH-ul la 7,50,1 și se filtrează. Se adaugă lactoza, se repartizează câte 10 ml în eprubete și se sterilizează 115oC timp de 30 de minute.
Utilizare: în general, acest mediu este utilizat pentru diferențierea cocilor gram pozitivi de cei gram-negativi, existând o protecție a celor gram pozitivi pentru componentele acestui mediu și, în consecință, aceștia sunt cei care se dezvoltă cel mai bine în aceste condiții.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în mediul Chapman lichid arată un viraj de culoare al mediului.
Așa cum se poate observa în Figura 22, Escherichia coli s-a dezvoltat bine în condițiile mediului Chapman lichid.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în mediul de cultură apă peptonată arată că acesta tulbură mediul.
Așa cum se poate observa în Figura 23, mediul de cultură apă peptonată reprezintă un mediu prielnic dezvoltării microorganismului Escherichia coli.
Utilizare: mediul bulion simplu reprezintă unul dintre mediile de bază, pe baza acestuia preparându-se și alte medii de cultură lichide de o importanță semnificativă, printre care bulionul Mueller Hinton, bulionul sânge, bulionul selenit, tioglicolat, cu infuzie de cord-creier, ș.a.m.d. Mediul bulion simplu se utilizează pentru cultivarea germenilor nepretențioși.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în bulionul simplu a produs o tulburare semnificativă a mediului de cultură, coloniile dezvoltându-se foarte bine.
Așa cum se arată în Figura 24, mediul bulion simplu este extrem de favorabil dezvoltării microorganismului.
Utilizare: acest mediu se folosește preponderent pentru identificarea bacililor gram-negativi, când se formează o tulburare semnificativă a mediului și un viraj de culoare la roz (roz-cărămiziu) întrucât are loc reducerea selenitului acid de sodiu la seleniu metalic în prezența lactozei, în special ca urmare a prezenței salmonelelor.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în mediul bulion cu selenit acid de sodiu a arătat atât o tulburare masivă a mediului, cât și un virament extrem de pertinent de culoare, de la incolor la roșu – portocaliu. Bacteria s-a dezvoltat extrem de bine în aceste condiții.
Așa cum arată Figura 25, se remarcă prezența bacilului gram-negativ Escherichia coli.
Utilizare: mediul TSB a fost inițial dezvoltat pentru cultivarea unor microorganisme foarte pretențioase fără adaos de ser, sânge sau orice alt agent de îmbogățire. Ca mediu de cultură cu scop general, acesta susține creșterea majorității organismelor atât aerobe, cât și facultativ aerobe, chiar dacă cerințele lor sunt ridicate. Datorită nivelului ridicat al conținutului de nutrienți. Proprietățile superioare de creștere a bulionului TSB îl fac deosebit de potrivit și pentru testarea sensibilității la antibiotice. De asemenea, prezintă rezultate bune în detectarea cocilor gram-pozitivi și poate fi utilizat, de asemenea, pentru testele de catalază și coagulază. Mediul nu este potrivit pentru întreținerea tulpinilor de interes deoarece fermentarea carbohidraților poate pune în pericol viabilitatea organismelor.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în mediul TSB a dus la tulburarea semnificativă a mediului, ceea ce înseamnă că acest mediu este favorabil dezvoltării bacteriei.
Așa cum arată Figura 26, Escherichia coli s-a dezvoltat foarte bine în acest mediu.
Utilizare: mediul semisolid Cary Blair se utilizează, în general, pentru transportul agenților patogeni enterici, inclusiv Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae și Escherichia coli.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în mediul de cultură Cay Blair arată că acesta nu este favorabil dezvoltării bacilului.
Așa cum se prezintă în Figura 27, Escherichia coli nu se dezvoltă în acest mediu, mediul Cary Blair fiind utilizat pentru transportul microorganismelor.
V.3.1.2. Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa elaborează un pigment verde-albastru (piocianina), fiind un bacil extrem de rezistent la variațiile în condițiile de mediu. Chiar este extrem de rezistent la antiseptice, dezinfectante și variațiile condițiilor de mediu, este sensibil la pH acid și la sărurile de argint. Nesporulat, prezintă un cil polar, se regăsește izolat, în perechi sau lanțuri scurte, fiind un germen nepretențios oxidazo-pozitiv care nu fermentează glucoza și care poate crește și în apă distilată, chiar și în strictă aerobioză. Temperatura la care se poate dezvolta variază în limite largi pentru tulpinile patogene: 5-42°C. După 24 ore de incubare dezvoltă colonii „S”, transparente. Atât colonia cât și mediul sunt pigmentate în verde albăstrui, colonia având reflexe metalice. Cultura emană un miros aromat de tei, salcâm (trimetilamină) sau iasomie. În medii lichide Pseudomonas aeruginosa formează o peliculă fină la suprafață și sub aceasta se regăsește un strat de pigment. Pseudomonas aeruginosa nu atacă fermentativ zaharurile, dar poate descompune oxidativ glucoza determinând acidifierea mediului. Este oxidazo-pozitiv, descompune gelatina, nu produce indol, hidrogen sulfurat sau urează. Acești germeni pot folosi drept sursă unică de carbon glucoză, acid lactic, acetic, manitol, arginină, citrat, ș.a.m.d. Pigmentul produs conține pioverdină hidrosolubilă fluorescentă galben verzuie și piocianina verde albăstruie solubilă.
Mediile lichide de cultură folosite pentru a evidenția morfologia și caracterele de cultură ale bacteriei gram-negative Pseudomonas aeruginosa au fost mediul Chapman lichid, mediul apă peptonată, bulionul simplu, bulionul cu selenit acid de sodiu, TSB și mediul semisolid Cary Blair [Tabelul VIII].
Tabelul VIII Rezultatele cultivării comparate de Pseudomonas aeruginosa, incubat 24 de ore la 37oC în diferite medii lichide
Notă: mediile lichide conțin și: M1-seleniu (toxic bacterian), M2-clorură de sodiu hiperosmolar, M3-extract de soia, M4-extract de carne, M5-peptone de carne, M6-este mediu semisolid pt conservare și transport, cu glicerină (inhibitor)
Legendă: – = 0, +/- = 1, + = 2, ++ = 3
Mediile de cultură lichide utilizate și rezultatele obținute
Metodă de preparare: componentele, cu excepția lactozei, se dizolvă în apă. Se ajustează pH-ul la 7,50,1 și se filtrează. Se adaugă lactoza, se repartizează câte 10 ml în eprubete și se sterilizează 115oC timp de 30 de minute.
Utilizare: în general, acest mediu este utilizat pentru diferențierea cocilor gram pozitivi de cei gram-negativi, existând o protecție a celor gram pozitivi pentru componentele acestui mediu și, în consecință, aceștia sunt cei care se dezvoltă cel mai bine în aceste condiții.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură Chapman lichid nu a arătat că acest mediu de cultură i-ar fi favorabil bacteriei.
Așa cum arată Figura 28, Pseudomonas aeruginosa nu se dezvoltă în acest mediu.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură apă peptonată arată o tulburare evidentă a mediului, semnificativă în raport cu proba martor (blanc).
Așa cum se arată în Figura 29, Pseudomonas aeruginosa s-a dezvoltat extrem de bine în mediul de cultură apă peptonată.
Utilizare: mediul bulion simplu reprezintă unul dintre mediile de bază, pe baza acestuia preparându-se și alte medii de cultură lichide de o importanță semnificativă, printre care bulionul Mueller Hinton, bulionul sânge, bulionul selenit, tioglicolat, cu infuzie de cord-creier, ș.a.m.d. Mediul bulion simplu se utilizează pentru cultivarea germenilor nepretențioși.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură bulion simplu a avut ca rezultat tulburarea semnificativă a mediului, în raport cu proba martor (blanc).
Așa cum arată Figura 30, Pseudomonas aeruginosa se dezvoltă extrem de bine în acest mediu.
Utilizare: acest mediu se folosește preponderent pentru identificarea bacililor gram-negativi, când se formează o tulburare semnificativă a mediului și un viraj de culoare la roz (roz-cărămiziu) întrucât are loc reducerea selenitului acid de sodiu la seleniu metalic în prezența lactozei, în special ca urmare a prezenței salmonelelor.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură bulion simplu nu a avut ca rezultat tulburarea mediului, în raport cu proba martor (blanc), arătând că mediul nu îi este prielnic, iar microorganismul nu s-a dezvoltat.
Așa cum este prezentat în Figura 31, Pseudomonas aeruginosa se dezvoltă extrem de bine în acest mediu, mediul prezentând o tulburare semnificativă și colorația specifică.
Utilizare: mediul TSB a fost inițial dezvoltat pentru cultivarea unor microorganisme foarte pretențioase fără adaos de ser, sânge sau orice alt agent de îmbogățire. Ca mediu de cultură cu scop general, acesta susține creșterea majorității organismelor atât aerobe, cât și facultativ aerobe, chiar dacă cerințele lor sunt ridicate. Datorită nivelului ridicat al conținutului de nutrienți. Proprietățile superioare de creștere a bulionului TSB îl fac deosebit de potrivit și pentru testarea sensibilității la antibiotice. De asemenea, prezintă rezultate bune în detectarea cocilor gram-pozitivi și poate fi utilizat, de asemenea, pentru testele de catalază și coagulază. Mediul nu este potrivit pentru întreținerea tulpinilor de interes deoarece fermentarea carbohidraților poate pune în pericol viabilitatea organismelor.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură TSB a avut ca rezultat tulburarea semnificativă a mediului, în raport cu proba martor (blanc).
Așa cum se arată în Figura 32, Pseudomonas aeruginosa se dezvoltă extrem de bine în mediul TSB.
Utilizare: mediul semisolid Cary Blair se utilizează, în general, pentru transportul agenților patogeni enterici, inclusiv Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae și Escherichia coli.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură Cary Blair nu a arătat că acesta îi este prielnic dezvoltării microorganismului.
Așa cum arată Figura 33, plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură Cay Blair arată că acesta nu este favorabil dezvoltării bacilului.
V.3.2. Cultivarea pe medii solide
V.3.2.1. Escherichia coli
Escherichia coli, flora dominantă a intestinului gros cu rol de menținere a unei fiziologii normale și în sinteza unor proteine din grupul B și K, este o bacterie rezistentă în mediul extern. Deși poate fi extrem de ușor distrus de către antisepticele și dezinfectantele uzuale, prezintă o capacitate deosebită de adaptare la modificările de mediu (modificări de pH, temperatură sau osmolaritate). Poate sesiza prezența sau absența unor substanțe chimice sau gaze în mediul său de viață și, cu ajutorul cililor, se poate apropia sau îndepărta de acestea. Poate de asemenea să devină imobil și să producă fimbrii de adeziune care să-i permită aderarea de substratul specific. Ca răspuns la modificările de temperatură sau osmolaritate își modifică dimensiunea porilor prin modificări ale porinelor constituente ale membranei externe, variind-o pentru acumularea moleculele mari de nutrienți sau pentru a elimina substanțele inhibitoare.
Escherichia coli este un bacil gram-negativ ce poate prezenta și forme filamentoase sau variații și în ceea ce privește prezența capsulei, a cililor peritrichi și a mobilității. Este un germen nepretențions, care crește și pe medii simple în care glucoza poate fi singurul constituent organic. Este aerob, facultativ anaerob, care poate avea deopotrivă metabolism fermentativ sau respirator. Formează colonii de tip „S” la cultivarea în medii solide și formează un inel aderent pe peretele tubului în mediile lichide pe care le tulbură uniform. Formează indol în apă peptonată și nu crește pe mediu cu citrat. Fermentează glucoză și carbohidrați, producând acid și gaz, iar la descompunerea lactozei eliberează acid. Majoritatea tulpinilor sunt oxidazo-negative și sunt capabile să reducă nitriții în nitrați. Nu produc urează și nu descompun proteinele cu formare de hidrogen sulfurat.
Mediile solide de cultură folosite pentru a evidenția morfologia și caracterele de cultură ale bacteriei gram-negative Escherichia coli au fost mediul agar triptozat, mediul TSA (ecu extract de soia), geloză-sânge, Mueller-Hinton (lapte) uscat, mediul Chapman (hipersalin), mediul Mac Conkey (bilă), mediul Levine (bilă), mediul Istrati-Meitert (bilă), mediul AABTL (lactoză), mediul ADCL (lactoză), mediul Chapman TTC, mediul SS (seleniu), mediul BSA (alcalin) și mediul diferențial Yersinia [Tabelul IX].
Tabelul IX Rezultatele cultivării comparate de Escherichia coli, incubat 24 de ore la 37oC în diferite medii solide
Notă: mediile solide sunt: M1=agar triptozat, M2=TSA (soia), M3=geloză-sânge, M4=Mueller-Hinton (lapte) uscat, M5=Chapman (hipersalin), M6=Mac Conkey (bila), M7=Levine (bilă), M8=Istrati-Meitert (bilă), M9=AABTL (lactoză), M10=ADCL (lactoză), M11=Chapman TTC, M12=SS (seleniu), M13=TCBS (alcalin), M14=BSA (alcalin), M15=Yersinia
Legendă: – = 0, +/- = 1, + = 2, ++ = 3
Mediile de cultură solide utilizate și rezultatele obținute
Metodă de preparare: bacto-peptona, clorura de sodiu și agarul sub formă de pulbere se dispersează într-un volum din maceratul de carne, se adaugă apoi restul de macerat și se încălzește la fierbere până la dizolvare completă. În cazul folosirii extractului de carne, bacto-peptona, clorura de sodiu, agarul sub formă de pulbere și extractul de carne se dispersează într-un volum de apă, se adaugă apoi restul de apă și se încălzește la fierbere până la dizolvare completă. pH soluției se ajustează astfel încât după sterilizare să fie 7,40,1. Se filtrează, se repartizează în flacoane și se sterilizează la 121oC timp de 15 minute. După prepararea agarului simplu, în vederea preparării mediului geloză-sânge, 900 ml din acesta se topește, se răcește la 50oC și se adaugă, în condiții aseptice, 100 ml sânge defibrinat uman, de iepure sau de berbec. Ingredientele se amestecă și se repartizează în plăci Petri sterile. Mediul are culoarea roșie, roșu închis, sângeriu.
Utilizare: mediul geloză-sânge este utilizat pentru cultivarea bacteriilor pretențioase.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în mediul geloză-sânge a avut drept rezultat dezvoltarea rapidă și semnificativă a bacilului.
Așa cum arată Figura 38, Escherichia coli se dezvoltă în mediul geloză-sânge, fără existența unei zone de hemoliză.
Mediul de cultură BSA implică suplimentarea mediului agar simplu prin adăugarea unui procent de 4% albumină serică bovină.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în mediul de cultură BSA nu a arătat că acest mediu îi este favorabil.
Așa cum arată Figura 39, mediul BSA nu este favorabil dezvoltării microorganismului Escherichia coli.
Utilizare: mediul de cultură agar triptozat se folosește pentru izolarea, cultivarea și diferențierea morfologică și biochimică a numeroși patogeni, printre care a streptococilor, pneumococilor, meningococilor, îmbogățirea, izolarea, cultivarea și diferențierea primară a Brucella, Listeria și alte microorganisme patogenice ș.a.m.d. În studiul de față, mediul de cultură agar triptozat a fost utilizat drept mediu diferențial și preferat de dezvoltare.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în agar triptozat arată că acest mediu de cultură este favorabil creșterii și dezvoltării microorganismului.
Așa cum arată Figura 40, mediul de cultură agar triptozat este favorabil dezvoltării microorganismului Escherichia coli.
Utilizare: mediul de cultură TSA se folosește pe scară largă pentru menținerea sau cultivarea secundară a tulpinilor de referință, de exemplu Enterobacteriaceae și stafilococi.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în mediul de cultură TSA a arătat că acest mediu este favorabil dezvoltării bacteriei.
Așa cum arată Figura 41, Escherichia coli nu s-a dezvoltat extrem de bine în acest mediu.
Metodă de preparare: Componentele, cu excepția D-manitolului și a roșului de fenol se dizolvă în apă încălzită la aproximativ 50oC. Se ajustează pH la 7,50,1 și se filtrează. Se adaugă D-manitolul și roșul de fenol, se repartizează în flacoane și se sterilizează la 110oC timp de 20 de minute.
Utilizare: pentru izolarea selectivă și cultivarea stafilococilor. Microorganismele care utilizează manitolul transformă mediul în galben. Agarul cu manitol și clorură de sodiu conține deopotrivă peptone și extract de carne, ce acționează drept sursă de azot, vitamine, minerale și aminoacizi esențiali creșterii și dezvoltării microorganismelor. Concentrația de clorură de sodiu de 7,5% acționează drept inhibitor parțial sau total pentru alte microorganisme în afară de stafilococi. De asemenea, clorura de sodiu oferă nutrienții necesari pentru procesele de transport și osmoză. Manitolul este carbohidratul a cărui fermentație duce la formarea unui mediu acid detectat cu indicatorul roșu de fenol, ajutând la diferențierea speciilor.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în mediul de cultură Chapman solid arată că acesta nu îi este favorabil dezvoltării microorganismului.
Utilizare: în prezentul studiu, mediul de cultură Mueller Hilton a fost utilizat pentru a demonstra rolul esențial al apei în creșterea și dezvoltarea microorganismelor. Acesta este folosit pentru evaluarea susceptibilității față de antibiotice. Mediul Mueller Hinton conține extract de carne de vită, hidrolizat acid de cazeină, amidon și agar. Extractul de carne de vită și acidul hidrolizat de cazeină furnizează azot, vitamine, carbon, aminoacizi, sulf și alți nutrienți esențiali. Amidonul este adăugat pentru a absorbi metaboliții toxici produși. Hidroliza amidonului produce dextroză, care servește ca sursă de energie. Agarul este agentul de solidificare.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în mediul de cultură Mueller Hilton arată că acesta este extrem de favorabil dezvoltării microorganismului.
Utilizare: mediul de cultură MacConkey este folosit pentru izolarea, cultivarea și diferențierea coliformilor și a patogenilor enterali. Enterobacteriile patogene nu fermentează lactoza, producând colonii transparente. Acesta este un mediu selectiv pentru enterobacterii (deoarece sărurile biliare din mediu inhibă flora gram-pozitivă), dar și diferențial, prin fermentarea lactozei din mediu, ce permite identificarea și diferențierea altor specii. Prin digerarea enzimatică a gelatinei, a cazeinei și a țesutului animal, bacteria își procură azot, vitamine, minerale și aminoacizi esențiali pentru creștere. Lactoza este glucidul fermentabil care furnizează carbon și energie, iar sărurile biliare și cristal violetul au rolul de a inhiba creșterea bacteriilor gram pozitive. Clorura de sodiu furnizează electroliții esențiali pentru transport și echilibru osmotic. Indicatorul roșu neutru are o culoare roșie la pH sub 6,8, aspect deosebit de util în cazul microorganismelor ce fermentează lactoza este fermentată, deoarece pH mediului scade, schimbând culoarea roșului neutru spre roz. Agarul este agentul de solidificare. Microorganismele care fermentează lactoza formează colonii de culoare roz până la cărămizii, cu sau fără o zonă de bilă precipitată, în timp ce microorganismele care nu fermentează lactoza formează colonii incolore sau limpezi.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în mediul de cultură MacConkey arată în mod evident faptul că acest mediu este deopotrivă prielnic și specific dezvoltării enterobacteriaceelor, bacteria dezvoltându-se extrem de bine.
Așa cum se prezintă în Figura 42, mediul MacConkey este extrem de favorabil dezvoltării microorganismului.
Utilizare: cunoscut și sub numele de geloză lactozată, mediul Istrati Meitert este utilizat pentru izolarea, cultivarea și diferențierea coliformilor și a patogenilor enterali. Enterobacteriile patogene nu fermentează lactoza, producând colonii transparente. Utilizarea acestui mediu permite diferențierea bacteriilor în două mari categorii, gram-negative și gram-pozitive prin abilitatea de fermentare a lactozei. Plasarea bacteriilor lactozo pozitive în acest mediu de cultură are ca rezultat îngălbenirea mediului, spre deosebire de bacteriile gram-negative, ale căror colonii împrumută culoarea verde a mediului.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în acest mediu de cultură a arătat că îi este favorabil dezvoltării, așa cum se arată în Figura 45.
Utilizare: mediul de cultură Levine este deopotrivă selectiv și diferențial, recomandat pentru izolarea și identificarea unor enterobacteriacee și a speciei Pseudomonas aeruginosa.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli arată că acesta este favorabil dezvoltării microorganismului.
Utilizare: agarul albastru de bromtimol-lactoză eeste un mediu diferențial (fără inhibitori) recomandat pentru izolarea, cultivarea și identificarea germenilor coliformi, în special a enterobacteriilor. Hidrolizatul enzimatic de cazeină și extractul de drojdie din mediu sunt surse de carbon, azot, vitamine și minerale. Albastrul de bromtimol este indicator al lipolizei.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în acest mediu de cultură arată într-un mod cert interdependența dintre componentele mediului și necesitățile nutriționale și de mediu ale bacteriei, care s-a dezvoltat extrem de bine în aceste condiții.
Așa cum se arată în Figura 44, mediul AABTL este extrem de favorabil dezvoltării microorganismului Escherichia coli.
Utilizare: acest mediu a fost formulat pentru identificarea coliformilor, în mod deosebit în apa potabilă.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în acest mediu de cultură arată că microorganismul se dezvoltă bine în aceste condiții.
Utilizare: acest mediu este deopotrivă selectiv și diferențial pentru izolarea patogenilor enterali, în special Salmonella și o parte din speciile Shigella, diferențierea realizându-se pe baza fenilalaninei care permite diferențierea speciilor Salmonella spp. de Proteus spp.
Rezultatele studiului: plasarea Escherichia coli în acest mediu de cultură arată că nu îi este prielnic dezvoltării microorganismului [Figura 45].
V.3.2.2. Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa elaborează un pigment verde-albastru (piocianina), fiind un bacil extrem de rezistent la variațiile în condițiile de mediu. Chiar este extrem de rezistent la antiseptice, dezinfectante și variațiile condițiilor de mediu, este sensibil la pH acid și la sărurile de argint. Nesporulat, prezintă un cil polar, se regăsește izolat, în perechi sau lanțuri scurte, fiind un germen nepretențios oxidazo-pozitiv care nu fermentează glucoza și care poate crește și în apă distilată, chiar și în strictă aerobioză. Temperatura la care se poate dezvolta variază în limite largi pentru tulpinile patogene: 5-42°C. După 24 ore de incubare dezvoltă colonii „S”, transparente. Atât colonia cât și mediul sunt pigmentate în verde albăstrui, colonia având reflexe metalice. Cultura emană un miros aromat de tei, salcâm (trimetilamină) sau iasomie. În medii lichide Pseudomonas aeruginosa formează o peliculă fină la suprafață și sub aceasta se regăsește un strat de pigment. Pseudomonas aeruginosa nu atacă fermentativ zaharurile, dar poate descompune oxidativ glucoza determinând acidifierea mediului. Este oxidazo-pozitiv, descompune gelatina, nu produce indol, hidrogen sulfurat sau urează. Acești germeni pot folosi drept sursă unică de carbon glucoză, acid lactic, acetic, manitol, arginină, citrat, ș.a.m.d. Pigmentul produs conține pioverdină hidrosolubilă fluorescentă galben verzuie și piocianina verde albăstruie solubilă.
Mediile solide de cultură folosite pentru a evidenția morfologia și caracterele de cultură ale bacteriei gram-negative Pseudoonas aeruginosa au fost mediul agar triptozat, mediul TSA (ecu extract de soia), geloză-sânge, Mueller-Hinton (lapte) uscat, mediul Chapman (hipersalin), mediul Mac Conkey (bilă), mediul Levine (bilă), mediul Istrati-Meitert (bilă), mediul AABTL (lactoză), mediul ADCL (lactoză), mediul Chapman TTC, mediul SS (seleniu), mediul BSA (alcalin) și mediul diferențial Yersinia [Tabelul X].
Tabelul X Rezultatele cultivării comparate de Pseudomonas aeruginosa, incubat 24 de ore la 37oC în diferite medii solide
Notă: mediile solide sunt: M1=agar triptozat, M2=TSA (soia), M3=geloză-sânge, M4=Mueller-Hinton (lapte) uscat, M5=Chapman (hipersalin), M6=MacConkey (bilă), M7=Levine (bilă), M8=Istrati-Meitert (bilă), M9=AABTL (lactoză), M10=ADCL (lactoză), M11=Chapman TTC, M12=SS (seleniu), M13=TCBS (alcalin), M14=BSA (alcalin), M15=Yersinia
Legendă: – = 0, +/- = 1, + = 2, ++ = 3
Mediile de cultură solide utilizate și rezultatele obținute
Metodă de preparare: bacto-peptona, clorura de sodiu și agarul sub formă de pulbere se dispersează într-un volum din maceratul de carne, se adaugă apoi restul de macerat și se încălzește la fierbere până la dizolvare completă. În cazul folosirii extractului de carne, bacto-peptona, clorura de sodiu, agarul sub formă de pulbere și extractul de carne se dispersează într-un volum de apă, se adaugă apoi restul de apă și se încălzește la fierbere până la dizolvare completă. pH soluției se ajustează astfel încât după sterilizare să fie 7,40,1. Se filtrează, se repartizează în flacoane și se sterilizează la 121oC timp de 15 minute. După prepararea agarului simplu, în vederea preparării mediului geloză-sânge, 900 ml din acesta se topește, se răcește la 50oC și se adaugă, în condiții aseptice, 100 ml sânge defibrinat uman, de iepure sau de berbec. Ingredientele se amestecă și se repartizează în plăci Petri sterile. Mediul are culoarea roșie, roșu închis, sângeriu.
Utilizare: mediul geloză-sânge este utilizat pentru cultivarea bacteriilor pretențioase.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în acest mediu de cultură arată o dezvoltare extraordinară a microorganismului.
Așa cum arată Figura 47, geloza-sânge este un mediu extrem de favorabil dezvoltării Pseudomonas aeruginosa.
Utilizare: în prezentul studiu, mediul de cultură Mueller Hilton a fost utilizat pentru a demonstra rolul esențial al apei în creșterea și dezvoltarea microorganismelor. Acesta este folosit pentru evaluarea susceptibilității față de antibiotice. Mediul Mueller Hinton conține extract de carne de vită, hidrolizat acid de cazeină, amidon și agar. Extractul de carne de vită și acidul hidrolizat de cazeină furnizează azot, vitamine, carbon, aminoacizi, sulf și alți nutrienți esențiali. Amidonul este adăugat pentru a absorbi metaboliții toxici produși. Hidroliza amidonului produce dextroză, care servește ca sursă de energie. Agarul este agentul de solidificare.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură Mueller Hilton arată că acesta poate detecta tulpinile înalt rezistente la anumiți compuși. Din acest motiv, acest mediu de cultură este unul dintre cele mai importante.
Mediul de cultură BSA implică suplimentarea mediului agar simplu prin adăugarea unui procent de 4% albumină serică bovină.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură BSA a arătat că acest mediu nu este favorabil dezvoltării microorganismului.
Așa cum se prezintă în Figura 48, Pseudomonas aeruginosa nu s-a dezvoltat în mediul de cultură BSA.
Utilizare: mediul de cultură agar triptozat se folosește pentru izolarea, cultivarea și diferențierea morfologică și biochimică a numeroși patogeni, printre care a streptococilor, pneumococilor, meningococilor, îmbogățirea, izolarea, cultivarea și diferențierea primară a Brucella, Listeria și alte microorganisme patogenice ș.a.m.d. În studiul de față, mediul de cultură agar triptozat a fost utilizat drept mediu diferențial și preferat de dezvoltare.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură agar triptozat a evidențiat caracterele sale biochimice și de cultură specifice, microorganismul formând colonii caracteristice.
Așa cum prezintă Figura 49, agarul triptozat reprezintă un mediu optim pentru cultivarea Pseudomonas aeruginosa.
Utilizare: mediul de cultură TSA se folosește pe scară largă pentru menținerea sau cultivarea secundară a tulpinilor de referință, de exemplu Enterobacteriaceae și stafilococi.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură TSA a dus la dezvoltarea propice a microorganismului. Dezvoltarea culturilor a avut loc la o temperatură de 37oC, cu aerare, ducând la formarea coloniilor caracteristice.
Figura 50 arată că mediul TSA reprezintă o alegere optimă pentru cultivarea Pseudomonas aeruginosa, bacilul crescând foarte bine în aceste condiții.
Metodă de preparare: Componentele, cu excepția D-manitolului și a roșului de fenol se dizolvă în apă încălzită la aproximativ 50oC. Se ajustează pH la 7,50,1 și se filtrează. Se adaugă D-manitolul și roșul de fenol, se repartizează în flacoane și se sterilizează la 110oC timp de 20 de minute.
Utilizare: pentru izolarea selectivă și cultivarea stafilococilor. Microorganismele care utilizează manitolul transformă mediul în galben. Agarul cu manitol și clorură de sodiu conține deopotrivă peptone și extract de carne, ce acționează drept sursă de azot, vitamine, minerale și aminoacizi esențiali creșterii și dezvoltării microorganismelor. Concentrația de clorură de sodiu acționează drept inhibitor parțial sau total pentru alte microorganisme în afară de stafilococi. De asemenea, clorura de sodiu oferă nutrienții necesari pentru procesele de transport și osmoză. Manitolul este carbohidratul a cărui fermentație duce la formarea unui mediu acid detectat cu indicatorul roșu de fenol, ajutând la diferențierea speciilor.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură Chapman solid arată că acesta nu este favorabil dezvoltării microorganismului, așa cum arată Figura 51.
Utilizare: mediul de cultură MacConkey este folosit pentru izolarea, cultivarea și diferențierea coliformilor și a patogenilor enterali. Enterobacteriile patogene nu fermentează lactoza, producând colonii transparente. Acesta este un mediu selectiv pentru enterobacterii (deoarece sărurile biliare din mediu inhibă flora gram pozitivă), dar și diferențial, prin fermentarea lactozei din mediu, ce permite identificarea și diferențierea altor specii. Prin digerarea enzimatică a gelatinei, a cazeinei și a țesutului animal, bacteria își procură azot, vitamine, minerale și aminoacizi esențiali pentru creștere. Lactoza este glucidul fermentabil care furnizează carbon și energie, iar sărurile biliare și cristal violetul au rolul de a inhiba creșterea bacteriilor gram pozitive. Clorura de sodiu furnizează electroliții esențiali pentru transport și echilibru osmotic. Indicatorul roșu neutru are o culoare roșie la pH sub 6,8, aspect deosebit de util în cazul microorganismelor ce fermentează lactoza este fermentată, deoarece pH mediului scade, schimbând culoarea roșului neutru spre roz. Agarul este agentul de solidificare. Microorganismele care fermentează lactoza formează colonii de culoare roz până la cărămizii, cu sau fără o zonă de bilă precipitată, în timp ce microorganismele care nu fermentează lactoza formează colonii incolore sau limpezi.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în acest mediu de cultură arată o dezvoltare semnificativă a microorganismului.
Așa cum arată Figura 52, mediul MacConckey reprezintă o alegere potrivită pentru cultivarea Pseudomonas aeruginosa, microorganismul dezvoltându-se extrem de bine în aceste condiții.
Utilizare: mediul de cultură Levine este deopotrivă selectiv și diferențial, recomandat pentru izolarea și identificarea unor enterobacteriacee și a speciei Pseudomonas aeruginosa.
Rezultatele studiului: Plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură Levine a arătat că acesta este un mediu selectiv de creștere pentru această bacterie, microorganismul dezvoltându-se foarte bine.
Utilizare: cunoscut și sub numele de geloză lactozată, mediul Istrati Meitert este utilizat pentru izolarea, cultivarea și diferențierea coliformilor și a patogenilor enterali. Enterobacteriile patogene nu fermentează lactoza, producând colonii transparente. Utilizarea acestui mediu permite diferențierea bacteriilor în două mari categorii, gram-negative și gram pozitive prin abilitatea de fermentare a lactozei. Plasarea bacteriilor lactozo pozitive în acest mediu de cultură are ca rezultat îngălbenirea mediului, spre deosebire de bacteriile gram-negative, ale căror colonii împrumută culoarea verde a mediului.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în mediul de cultură Istrati Meitert arată că microorganismul se dezvoltă extrem de bine în aceste condiții, formând colonii caracteristice.
Așa cum prezintă Figura 53, mediul Istrati Meitert reprezintă un mediu prielnic pentru dezvoltarea microorganismului Pseudomonas aeruginosa.
Utilizare: agarul albastru de bromtimol-lactoză este un mediu diferențial (fără inhibitori) recomandat pentru izolarea, cultivarea și identificarea germenilor coliformi, în special a enterobacteriilor. Hidrolizatul enzimatic de cazeină și extractul de drojdie din mediu sunt surse de carbon, azot, vitamine și minerale. Albastrul de bromtimol este indicator al lipolizei.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în acest mediu a dus la dezvoltarea fulminantă a microorganismului, arătând că aceste condiții sunt prielnice creșterii bacteriei.
Așa cum prezintă Figura 54, mediul AABTL reprezintă un mediu prielnic pentru dezvoltarea microorganismului Pseudomonas aeruginosa.
Utilizare: acest mediu a fost formulat pentru identificarea coliformilor, în mod deosebit în apa potabilă.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în acest mediu de cultură arată că aceste condiții sunt favorabile dezvoltării acestui microorganism.
Utilizare: acest mediu este deopotrivă selectiv și diferențial pentru izolarea patogenilor enterali, în special Salmonella și o parte din speciile Shigella, diferențierea realizându-se pe baza fenilalaninei care permite diferențierea speciilor Salmonella spp. de Proteus spp.
Rezultatele studiului: plasarea Pseudomonas aeruginosa în acest mediu arată o dezvoltare pregnantă a bacteriei.
Așa cum arată Figura 55, mediul SS este favorabil dezvoltării bacililor gram-negativi și, în speță, microorganismului Pseudomonas aeruginosa.
Așa cum arată Figura 56, Pseudomonas aeruginosa s-a dezvoltat extrem de bine în mediul selectiv Yersinia.
V.3.3. Examinare microscopică
Etapa de examinare la microscopul optic IOR M24M a probelor anterior pregătite pentru evaluarea caracterelor morfologice și de cultură a implicat realizarea de frotiuri pentru evaluarea caracterelor tinctoriale. În primă fază, se transferă bacteriile de interes din mediul de cultură pe lama de sticlă. Aceasta se pregătește prin trasarea unei zone de delimitare în care centrul unei lame curate pentru a marca punctul central al frotiului. Cu ajutorul unei pipete curate sau a unei anse sterile de inoculare, se aduce o picătură de apă în locul marcat (dacă mediul utilizat este bulion, atunci nu este necesară picătura de apă distilată). Secundar, se prelevează prin raclare o cantitate mică de probă din mediul de cultură și se amestecă bine cu picătura de apă.
În continuare, are loc uscarea completă în aer a frotiului și se fixează cu ajutorul unor treceri succesive deasupra arzătorului Bunsen. Prin această procedură, compușii specifici utilizați în colorația gram se vor fixa mai bine. Realizarea colorației gram se face prin plasarea frotiului pe un suport de colorare și acoperirea sa succesivă pentru câte un minut cu cristal violet, albastru de metil și safranin O (Hucker counterstain). Frotiurile sunt spălate în jet de apă și apoi sunt plasate pe hârtie absorbantă pentru eliminarea excesului de colorant.
Frotiurile astfel obținute se examinează la microscopul optic, puterea de mărire fiind crescută progresiv. Diferențierea bacteriilor gram-negative se bazează pe faptul nu rețin colorația primară, pierzând pata de cristal violet deoarece stratul lor de peptidoglican este foarte subțire, preluând doar colorantul safranin. Astfel, bacteriile gram-negative apar roșiatice sau roz atunci când sunt privite sub microscop [Figura 62].
V.4. Comentarii
…
Concluzii
Bibliografie
Baron S, editor. Medical Microbiology. 4th edition. Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7627/.
Bertrand, Jean – Claude; Caumette, Pierre; Lebaron, Philippe; Matheron, Robert; Normand, Pierre; Sime – Ngando, Telesphore, Environmental Microbiology: Fundamentals and applications, Editura Springer, New York, 2011.
Cabeen, Matthew & Jacobs-Wagner, Christine. (2005). Bacterial cell shape. Nature reviews. Microbiology. 3. 601-10. 10.1038/nrmicro1205.
Cristea, Aurelia, 2017, București, Tratat de farmacologie, Ediția I, Editura Didactică și Medicală.
Elizabeth Thursby; Nathalie Juge, Introduction to the human gut microbiota, în Biochem J. 2017 Jun 1; 474(11): 1823–1836., doi: 10.1042/BCJ20160510.
Finegold SM. Anaerobic Gram-Negative Bacilli. In: Baron S, editor. Medical Microbiology. 4th edition. Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996. Chapter 20. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8438/.
Framer III, J.J. & Boatwright, K.D. & Michael Janda, J. (2007). Enterobacteriaceae: Introduction and Identification.
Gedikli, Serap & Tabak, Özge & Tomsuk, Ozlem & Çabuk, Ahmet. (2008). Effect of Microwaves on Some Gram-negative and Gram Positive Bacteria. Journal of Applied Biological Sciences. 2. 67-71.
https://journals.lww.com/ccmjournal/fulltext/2003/04000/impact_of_antibiotic_resistant_gram_negative.7.aspx
Ian L. Pepper, Scot E. Dowd, Chapter 5 – Aeromicrobiology, Editor(s): Raina M. Maier, Ian L. Pepper, Charles P. Gerba, Environmental Microbiology (Second Edition), Academic Press, 2009, Pages 83-102, ISBN 9780123705198, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-370519-8.00005-5.
Joseph J, Sharma S, Dave VP. Filamentous gram-negative bacteria masquerading as actinomycetes in infectious endophthalmitis: a review of three cases. J Ophthalmic Inflamm Infect. 2018;8(1):15. Published 2018 Oct 11. doi:10.1186/s12348-018-0157-4.
Joshi, Dinesh & Bhandari, Shiva & Upreti, Anup & Banjara, Megha & Bm, Regmi & Pn, Prasad. (2015). Empirical use of antibiotics in Emergency Department of Tribhuvan University Teaching Hospital and Treatment Success Rate in Discharged Patients. Journal of the Institute of Medicine.
Land M, Hauser L, Jun SR, Nookaew I, Leuze MR, Ahn TH, Karpinets T, Lund O, Kora G, Wassenaar T, Poudel S, Ussery DW, Insights from 20 years of bacterial genome sequencing, în Funct Integr Genomics. 2015 Mar;15(2):141-61. doi: 10.1007/s10142-015-0433-4. Epub 2015 Feb 27. Review. PMID: 25722247.
Manganelli R, Gennaro ML. Protecting from Envelope Stress: Variations on the Phage-Shock-Protein Theme. Trends Microbiol. 2016;25(3):205-216.
Masschelein, Joleen & Jenner, Matthew & L. Challis, Gregory. (2017). Antibiotics from Gram-negative bacteria: A comprehensive overview and selected biosynthetic highlights. Natural Product Reports. 34. 10.1039/C7NP00010C.
McBride ME, Duncan WC, Knox JM. The environment and the microbial ecology of human skin. Appl Environ Microbiol. 1977;33(3):603-8.
Mehrad B, Clark NM, Zhanel GG, Lynch JP. Antimicrobial resistance in hospital-acquired gram-negative bacterial infections. Chest. 2015;147(5):1413-1421.
Monografia Bacillus în Enciclopaedia Britannica, 2019, https://www.britannica.com/science/bacillus-bacteria, accesat la 25.02.2019.
Mukherjee S, Kearns DB. The structure and regulation of flagella in Bacillus subtilis. Annu Rev Genet. 2014;48:319-40.
Munoz-Price, L. Silvia. (2015). Controlling multidrug-resistant Gram-negative bacilli in your hospital: A transformational journey. Journal of Hospital Infection. 89. 10.1016/j.jhin.2015.02.006.
O'hara CM. Manual and automated instrumentation for identification of Enterobacteriaceae and other aerobic gram-negative bacilli. Clin Microbiol Rev. 2005;18(1):147-62.
Ordeanu, Viorel, Microbiologie farmaceutică. Note de curs, Editura Universității TituMaiorescu, Editura Hamangiu, București, 2018.
Panawala, Lakna. (2017). Difference Between Gram Positive and Gram-negative Bacteria.
Paweł Sacha; Alina Ostas; Jadwiga Jaworowska; Piotr Wieczorek; Dominika Ojdana; Jerzy Ratajczak; Elzbieta Tryniszewska, The KPC type beta-lactamases: new enzymes that confer resistance to carbapenems in Gram-negative bacilli, în Folia Histochemica et Cytobiologica, Vol. 47, Nr. 4, 2009, pg. 537 – 543, 10.2478/v10042-009-0079-y.
Pop-Vicas A, Opal SM. The clinical impact of multidrug-resistant gram-negative bacilli in the management of septic shock. Virulence. 2013;5(1):206-12.
Raina M. Maier, Chapter 7 – Extreme Environments, Editor(s): Raina M. Maier, Ian L. Pepper, Charles P. Gerba, Environmental Microbiology (Second Edition), Academic Press, 2009, Pages 123-134, ISBN 9780123705198, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-370519-8.00007-9.
Raina M. Maier, Ian L. Pepper, Chapter 4 – Earth Environments, Editor(s): Raina M. Maier, Ian L. Pepper, Charles P. Gerba, Environmental Microbiology (Second Edition), Academic Press, 2009, Pages 57-82, ISBN 9780123705198, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-370519-8.00004-3.
Richet, H. , Seasonality in Gram-negative and healthcare-associated infections, în Clinical Microbiology and Infection , Volume 18 , Issue 10 , 934 – 940.
Souli, M and Galani, I and Giamarellou, H, Emergence of extensively drug-resistant and pandrug-resistant Gram-negative bacilli in Europe, în Eurosurveillance, 13, 19045 (2008), https://doi.org/10.2807/ese.13.47.19045-en
Stephen Jay Gould, "Planet of the Bacteria," Washington Post Horizon, 1996, 119 (344): H1.
Todd R. Sandrin, Scot E. Dowd, David C. Herman, Raina M. Maier, Chapter 6 – Aquatic Environments, Editor(s): Raina M. Maier, Ian L. Pepper, Charles P. Gerba, Environmental Microbiology (Second Edition), Academic Press, 2009, Pages 103-122, ISBN 9780123705198, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-370519-8.00006-7.
Toma Săcărea, Felicia, Bacteriologie medicală, Editura University Press, Târgu Mureș, 2006.
Vandamme P, Pot B, Gillis M, de Vos P, Kersters K, Swings J., Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics, în Microbiol Rev. 1996 Jun;60(2):407-38. Review. PMID: 8801440.
Vellai T, Takács K, Vida G., A new aspect to the origin and evolution of eukaryotes, în J Mol Evol. 1998, May;46(5):499-507, PMID: 9545461.
Anexe
Lista figurilor și a tabelelor din lucrarea Implicațiile bacililor gram-negativi în medicină și farmacie
Lista figurilor din lucrarea Implicațiile bacililor gram-negativi în medicină și farmacie
Figura nr. 1: Salmonella typhi (Enterobacteriaceae)
Figura nr. 2: Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonadaceae)
Figura nr. 3: Dispunerea Klebsiella pneumoniae sub formă de diplobacili
Figura nr. 4: Mycobacterium tuberculosis
Figura nr. 5: Dispunerea Bacillus anthracis sub formă de streptobacili
Figura nr. 6: Dispunerea Corynebacterium diphtheriae sub formă de litere
Figura nr. 7: Escherichia coli (Enterobacteriaceae)
Figura nr. 8: Dispunerea Corynebacterium pseudodiphtheriticum în palisade
Figura nr. 9: Incubatorul Hereus utilizat în realizarea determinărilor
Figura nr. 10: Mediile lichide utilizate, înainte de însămânțare
Figura nr. 11: Mediile lichide utilizate, după însămânțare
Figura nr. 12: Escherichia coli în Chapman lichid
Figura nr. 13: Escherichia coli în apă peptonată
Figura nr. 14: Escherichia coli în bulion simplu
Figura nr. 15: Escherichia coli în bulion cu selenit acid de sodiu
Figura nr. 16: Escherichia coli în TSB
Figura nr. 17: Escherichia coli în mediul Cary Blair
Figura nr. 18: Pseudomonas aeruginosa în Chapman lichid
Figura nr. 19: Pseudomonas aeruginosa în apă peptonată
Figura nr. 20: Pseudomonas aeruginosa în bulion simplu
Figura nr. 21: Pseudomonas aeruginosa în bulion cu selenit acid de sodiu
Figura nr. 22: Pseudomonas aeruginosa în TSB
Figura nr. 23: Pseudomonas aeruginosa în mediul Cary Blair
Figura nr. 24: Mediile de cultură solide utilizate, după însămânțare
Figura nr. 25: Escherichia coli în geloză-sânge
Figura nr. 26: Escherichia coli în mediul BSA
Figura nr. 27: Escherichia coli în agar triptozat
Figura nr. 28: Escherichia coli în mediul TSA
Figura nr. 29: Escherichia coli în Chapman solid
Figura nr. 30: Escherichia coli în mediul MacConkey
Figura nr. 31: Escherichia coli în Istrati Meitert
Figura nr. 32: Escherichia coli în AABTL
Figura nr. 33: Escherichia coli în mediul SS
Figura nr. 34: Escherichia coli în agarul selectiv Yersinia
Figura nr. 35: Pseudomonas aeruginosa în geloză-sânge
Figura nr. 36: Pseudomonas aeruginosa în mediul BSA
Figura nr. 37: Pseudomonas aeruginosa în agar triptozat
Figura nr. 38: Pseudomonas aeruginosa în mediul TSA
Figura nr. 39: Pseudomonas aeruginosa în Chapman solid
Figura nr. 40: Pseudomonas aeruginosa în mediul MacConkey
Figura nr. 41: Pseudomonas aeruginosa în Istrati Meitert
Figura nr. 42: Pseudomonas aeruginosa în AABTL
Figura nr. 43: Pseudomonas aeruginosa în mediul SS
Figura nr. 44: Pseudomonas aeruginosa în agarul selectiv Yersinia
Figura nr. 45: Materiale utilizate în realizarea determinărilor microscopice
Figura nr. 46: Etapa inițială de preparare a frotiurilor
Lista tabelelor din lucrarea Implicațiile bacililor gram-negativi în medicină și farmacie.
Tabelul nr. 1: Clasificarea Enterobacteriaceae
Tabelul nr. 2: Sensibilitatea bacililor gram-negativi la antibiotice și chimioterapice antimicrobiene
Tabelul nr. 3: Bacili gram-negativi utilizați în industrie
Tabelul nr. 4: Medii de cultură folosite pentru întreținerea tulpinilor de microorganisme – test, pentru obținerea suspensiei – stoc de spori și pentru treceri zilnice
Tabelul nr. 5: Medii de cultură folosite pentru determinarea activității microbiologice a antibioticelor
Tabelul nr. 6: Soluții tampon sterile
Tabelul nr. 7: Cultivare comparată de Escherichia coli, incubat 24 de ore la 37oC în diferite medii lichide
Tabelul nr. 8: Cultivare comparată de Pseudomonas aeruginosa, incubat 24 de ore la 37oC în diferite medii lichide
Tabelul nr. 9: Cultivare comparată de Escherichia coli, incubat 24 de ore la 37oC în diferite medii solide
Tabelul nr. 10: Cultivare comparată de Pseudomonas aeruginosa, incubat 24 de ore la 37oC în diferite medii solide
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Bacili Gram Negativi (1) [302404] (ID: 302404)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.