ASPECTE EPIDEMIOLOGICE, IMUNOFENOTIPICE ȘI MOLECULARE ÎN ADENOCARCINOMUL COLORECTAL LA PACIENȚII CU DIABET ZAHARAT TIP 2 [301711]

UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE „CAROL DAVILA” BUCURESTI.  FACULTATEA DE MEDICINĂ.

[anonimizat] 2

Conducător științific: Doctorand: [anonimizat]. Dr. [anonimizat]-Cristian

București

2016

CUPRINS

Lista abrevieri.

PARTEA GENERALA.Stadiul actual al cunoasterii.

CAPITOLUL 1. CANCERUL-CADRUL ETIOPATOGENIC

1.1.Caracteristicile generale ale tumorilor maligne.Teoriile carcinogenezei.

1.2.Clasificarea tumorilor.

1.3.Stadializarea TNM.

1.4.Grandingul histologic.

1.5.Caracteristicile histologice ale tumorii.

1.6.Ciclul celular.Descriere.Mecanisme de reglare.Interrelatia cu metabolismul glucidic.

CAPITOLUL2. PARTICULARITATILE METABOLISMULUI CELULEI TUMORALE MALIGNE.FENOMENUL WARBURG.

2.1.Metabolismul energetic.Principalele cai metabolice.

2.2. Metabolismul ca potential factor in originea cancerului.

2.3.Metabolismul glucozei.Rolul glucozei in carcinogeneza.Efectul sau fenomenul Warburg

2.4. Rolul glutaminei in carcinogeneza

CAPITOLUL 3. FAMILIA PROTEINELOR BCL2 SI P53.DESCRIERE.ROLURI IN ONCOGENEZA SI DIABETOGENEZA

3.1.Apoptoza.Definitie.Tipuri.

3.2.Familia proteinelor Bcl-2.Istoric.Descriere.Roluri.Reglare

3.3.Rolul familiei proteinelor Bcl2 in DZ

3.4.Proteina supresoare tumorala p53.Istoric. Descriere.Roluri.Reglare

3.5. Relatia Bcl-2/p53

CAPITOLUL 4. DIABETUL ZAHARAT. DEFINITIE.DIAGNOSTIC.CLASIFICARE

4.1.Definita diabetului zaharat

4.2.Diagnosticul DZ.Criteriile actuale de dg ale tulburarilor de glicoreglare la adult cuprind.Modifcarile spectrului glicemic la adult.

4.3.Clasificarea DZ

4.4.Fiziopatologia DZ tip2. Evolutia naturala a DZ tip. Istoria naturala a DZ tip2. Evolutia rezistentei la insulina.

4.5.Complicatiile DZ

CAPITOLUL 5.[anonimizat]

5.1[anonimizat]. Fiziologia secretiei de insulina

5.2Receptorii axei IGF

CAPITOLUL 6. [anonimizat]

6.1.Istoricul relatiei DZ neoplazie

6.2.[anonimizat]. Factori de risc

6.3.Tratamentul cu Metformin

6.4.Dimensiunea economica a cancerului si DZ

CAPITOLUL 7. [anonimizat]-DZ: O ASOCIERE REALA?

7.1.Clasificarea histologica a tumorilor colorectale:

7.2.Diagnosticul cancerului colorectal

7.3. Epidemiologie CRC si DZ

7.4.[anonimizat]-cancer colorectal

PARTEA SPECIALA.Contributia personala.

Obiectivul si scopul tezei de doctorat.

CAPITOLUL 8. PREVALENTA DIVERSELOR TIPURI DE CANCER LA PACIENTII DIABETICI INTERNATI IN IDNBM N.C. PAULESCU

8.1.Premise.Obiective.Scop.

8.2.Materiale si metode.

8.3.Rezultate

8.4.Discutii

8.5.Concluzii

CAPITOLUL 9.PREVALENTA DIABETULUI ZAHARAT LA PACIENTII CU DIVERSE TIPURI DE CANCER NOU DIAGNOSTICATE IN SPITALUL CLINIC DE URGENTA BUCURESTI

9.1.Premise.Obiective.Scop.

9.2.Materiale si metode.

9.3.Rezultate

9.4.Discutii

9.5.Concluzii

CAPITOLUL 10.[anonimizat]2 SI P53 IN ADENOCARCINOMUL COLORECTAL LA PACIENTII CU DZ TIP2 [anonimizat]

10.1.Premise.Obiective.Scop.

10.2.Materiale si metode.

10.3.Rezultate

10.4.Discutii

10.5.Concluzii

CAPITOLUL 11. EVALUAREA PARTICULARITATILOR METABOLSIMULUI GLUCOZEI IN ADENOCARCINOMUL COLORECTAL LA PACIENTII CU DZ TIP 2 [anonimizat]-CT.

11.1.Premise.Obiective.Scop.

11.2.Materiale si metode.

11.3.Rezultate

11.4.Discutii

11.5.Concluzii

CAPITOLUL 12.PARTICULARITATILE ULTRASTRUCTURALE ALE ADENOCARCINOMULUI COLORECTAL IN DIABETUL ZAHARAT TIP 2 VS NON-DZ TIP2.

12.1.Premise.Obiective.Scop.

12.2.Materiale si metode.

12.3.Rezultate

12.4.Discutii

12.5.Concluzii

CONCLUZII

VALORIFICAREA REZULTATELOR

REFERINTE BIBLIOGRAFICE

ANEXE

PARTEA GENERALĂ:

STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII

CAPITOLUL 1

CANCERUL-CADRUL ETIOPATOGENIC

I.1. Caracteristicile generale ale tumorilor maligne.Teoriile carcinogenezei

Carcinogeneza implică o serie de mutații in punctele cheie in genom, constand în achiziționarea de trasaturi cunoscute sub numele de semne distinctive ale cancerului , elaborate de Hanahan și Weinberg. Pentru a simplifica complexitatea mecanismelor fiziopatologice specifice neoplaziilor maligne aceste semne distinctive sunt grupate intr-o sinteza de 8 proprietati biologice ce se pot clasifica in [1,2] :

1.abilitatea de a sustine proliferarea cronica excesiva;

2.sustragerea de la actiunea factorilor supresori de crestere;

3.rezistența la apoptoza,

4.dobandirea imortalitatii prin multiplicare expresiei telomerazei,

5.angiogeneza susținută,

6.invazia si metastazarea,

7.reprogramarea metabolismului energetic in sensul dereglarii metabolismului celular

8.sustragerea de la actiunea mecanismelor imune defensive[22,23] .

Pentru toate aceste semne distinctive au fost elaborate diverse molecule ce se afla in diverse faze ale trialurilor clinice iar unele au fost deja aprobate pentru uzul clinic in tratamentul anumitor forme de cancer. Astfel au fost create diverse molecule cum ar fi [3-18]:

-inhibitorii telomerazei cu rol in inhibarea imortalitatii;

-activare imuna cu ajutorul anticorpilor monoclonali anti-CTLA4 mAb;

-inhibarea angiogenezei prin blocarea semnalizarii VEGF;

-blocarea invaziei si metastazarii prin molecule inhibitorii ale cai c-MET/HGF (receptorul tirozikinazic c-MET si factorul de crestere hepatocitar);

-stimularea apoptozei prin crearea de molecule proapoptotice BH-3 mimetice

-normalizarea metabolismului energetic celular prin molecule ce inhiba metabolismul aerob celular (fenomenul Warburg);

-inhibarea proliferarii prin molecule ce inhiba receptorii factori de crestere epidermali (EGFR);

-inhibitorii ciclin-kinazelor dependente pentru sensibilizarea la actiunea factorilor supresori de crestere;

-limitarea instabilitatii genomice cu ajutorul agentilor inhibitori ai  poli ADP ribozo polimerazei (PARP) sau inhibarea inflamatiei cu ajutorul agentilor antiinflamatori specifici [3-18].

Exista mai multe teorii asupra naturii biologice a cancerului. Carcinogeneza trebuie privita ca un proces evolutiv, in care selectia naturala favorizeaza anumite celule care sunt capabile să supraviețuiască în medii ostile concomitent cu dezvoltarea de noi circuite metabolice si noi cai de agresiune si rezistenta[19]. Cancerul a fost descris prima oara ca un sistem evolutiv de catre Nowell în articolul său din 1976, postuland ca "variabilitatea genetică dobândită în cadrul clonei originale permite selectia secvențială de sublinii mai agresive"[19,20]. Cancerul trebuie privit astfel dintr-o perspectiva evolutiva la nivel celular, tisular si de organism. Competitia reprezinta o trasatura esentiala evolutionista si se aplica cu succes si in cazul procesului de transformare neoplazica maligna, tradusa prin avantajul celulei neoplazice in raport cu celula normala [19,21].

Dezvoltarea cancerului necesita adesea modificari genetice si epigenetice desfasurate pe perioade lungi de timp,procese sustinute si de diversitatea multiplelor linii tumorale din cancer.

Riscul de cancer creste odata cu varsta (omul fiind predispus la a dezvolta diverse forme de cancer odata cu inaintarea in varsta) , majoritatea formelor de cancer fiind diagnosticate la varstnici. Carcinogenii produc mutatii la nivelul genomului ce sunt corectate prin mecanisme specifice.

Intr-un studiu recent Duesberg  si colab, considera cancerul ca o forma de speciatie iar agentii carcinogeni mediaza carcinogeneza prin procesul de aneuploidie (modificari ale numarului de cromozomi) cu destabilizarea cariotipului. Ulterior doar un numar scazut de celule aneuploide vor obtine o autonomie reproductiva, prima caracteristica comuna a celulelor canceroase dar si a speciilor. Aceasta teorie explica cateva din semnele distinctive ale cancerului descrise de Heinberg [22].

O alta teorie asupra carcinogenezei este teoria evolutionista non-darwiniana ce are in centru fenomenul de deriva sau fluctuatie genetica, un proces fundamental non-adaptativ si nu unul de selectie naturala[19,23]. Aceasta teorie implica procese ce se desfasoara in aval de fluxul genetic informational, modificarile epigenetice predominand in comparatie cu cele genetice[19].

Un concept progresist al naturii biologice celulare a cancerului este teoria celulelor stem canceroase [24,25](CSC). Aceasta teorie implica existenta unui subset de populatii de celulele tumorale maligne cu proprietati caracteristice celulelor stem care sunt responsabile de cresterea tumorala, rezistenta la tratament si recurenta cancerului[45,46]. Organismul uman detine 3 tipuri de celule stem: germinale (spermatozoidul, ovulul); embrionare si adulte. Ca si comportament bologic exista similitudini remarcabile intre celula stem si celula tumorala maligna redate in Tabelul 1.1[26].

Tabel 1.1. Similitudini in comportamentul biologic al celulor maligne vs celule stem

Conform acestei ipoteze distrugerea nediscriminativa a tuturor celulelor canceroase nu ar fi atat de efectiva comparativ cu distrugerea anumitor subseturi de celule implicate in cresterea tumorala pe termen lung-cum ar fi CSC spre exemplu. Studiile experimentale au demonstrat existenta CSC in diverse organe si tesuturi: colon, san, plaman, prostata, creier, ficat, pancreas si ficat [24,25]. Aceasta teorie relativ nou a captat atentia cercetatorilor prin deschiderea unor noi cai terapeutice inovative care sa imbunatateasca prognosticul si evolutia tratamentului oncologic [24,25].

Un aspect important al neoplaziilor ce se adauga ca un argument suplimentar in favoarea heterogenitatii, este reprezentata de variabilitatea clonala. Ca si clonalitate celulele tumorale pot avea origine variata,existand trei tipuri de variante de expresie, functie de numarul de celule implicate in dezvoltarea neoplaziei: a.policlonala- in care fiecare tumora consta in linii celulare initiate derivate din multiple celule mama; b.monoclonala- tumora are o singura celula mama initiata, iar tumorile multiple din acelasi organ au ca origine diseminarea directa a celulelor din tumora;c.policlonala-fiecare celula initiata genereaza multiple tumori plecand de la o singura celula mama (monoclonala)[27]. (fig. 1.1)

Figura 1.1 Selectia clonala a celulelor maligne.

Exista o serie de afectiuni ereditare ce se asociaza cu neoplasmele. Aceste sunt fie afectiuni mostenite dominante si includ: mutatia genei RB1 (retinoblastomul), mutatia WT1 (tumora Wilms), mutatia BRCA1 si BRCA2 (cancerul de san), mutatia TP53 si CHEK2 (sindromul Li-Fraumeni), mutatia PTEN (sindromul Cowden),mutatia APC, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 (polipoza adenomatoasa familiala, cancerul colorectal non-polipozic familial),mutatia CDK2NA ce codeaza p16INK4A, p14ARF (melanomul malign) [28], mutatia in gena MEN1, (neoplazia endocrina multipla tip 1-MEN1 sau sindromul Wermer), mutatia gena RET (MEN2) , mutatia in gena VHL (sindromul Von Hippel-Lindau) sau afectiuni mostenite recesive ce includ: mutatia genei BLM si RecQ (sindromul Bloom), mutatia NER (excizie reparare nucleotid), mutatia ATM (ataxie telangiectazie), mutatia STK11(sindromul Peutz-Jeghers). [29,30].

O caracteristica importanta a cancerului este instabilitatea genetica ce este aproape patognomonica pentru aceasta maladie. In cancerele ereditare instabilitatea genetica rezulta din mutatiile in genele repratoare ADN si exista inca din stadiul de leziuni premaligne ghidand cresterea tumorii prin cresterea ratei de mutatii spontane (teoria mutatorului) [31]. Pentru cancerele non-ereditare (sporadice) instabilitatea genetica si mutatiile TP53, ATM (ataxie telangiectazie), kinaza inhibitorului ciclin-dependenta 2A (CDKN2A ce codifica p16INK4A si p14ARF), este atribuita mutatiilor ADN induse de oncogene[31].

Epigenetica poate fi privita ca o punte de legatura intre genotip si fenotip si exprima modificarile stabile, potential reversibile, mostenite in activitatea si expresia genelor fara a modifica insa secventa ADN [45]. Mecanismele epigenetice sunt esentiale pentru dezvoltarea si mentinerea unui patern specific tesut-expresie genica specifica [Sharma S, Kelly TK, Jones PA. Epigenetics in cancer. Carcinogenesis. 2010;31(1):27-36. doi:10.1093/carcin/bgp220.]. Modificarile epigenetice alaturi de cele genetice pot induce carcinogeneza si pot favoriza dezvoltarea fenotipului malign [33].

Tumorile maligne prezinta o specificitate de origine si aparitie functie de varsta. In functie de grupele de varsta tumorile pot fi impartite astfel fie in tumori embrionare (de ex:tumora Wilms, retinoblastomul, neuroblastomul etc.), fie cu o predominanta de aparitie la grupa de varsta tanara (leucemiile, tumorile de testicul etc.) fie tumori asociate cu varsta, incidenta lor crescand odata cu procesul de senesecenta (prostata, colon, vezica urinara, san, colon)[27]. Cresterea frecventei cancerelor odata cu varsta poate fi partial explicata prin mecanisme complexe moleculare si fiziologice cum ar fi durata mai lunga de expunere la carcinogeni, afectarea sistemului imun, modificarile hormonale, scaderea capacitatii de reparare ADN cu cresterea frecventei mutatiilor, scurtarea telomerelor si modificari ale activatii telomerazei ce conduce la modificari structurale cromozomiale in timpul mitozei[27]. Acest aspect este unul esential datorita frecventei cresute a cancerului si diabetului zaharat in populatia varstnica.

Transformarea neoplazica cuprinde o serie de stadii evolutive intermediare, cu o durata variabila (uneori si 20 de ani). Pe parcursul acestei evolutii subclinice a carcinogenezei, celulele prezinta modificari atat de numar (hiperplazie), cat si modificari ale functiei (metaplazie) si structurii (displazie/anaplazie) cu etape si secvente succesive (fig. 1.2) [27]. Aceste proces multistadial au fost evidentiate in modelele experimentale murinice.

Figura 1.2.Carcinogeneza. Model de stadializare si evolutie- sinteza si schematizare.

Caracterul de malignitate implica doua trasaturi esentiale: diferitele grade de anomalii structurale celulare si invazia tesuturilor/organelor vecine.Cancerele pot apare din orice tip de tesut si multe din tumorile benigne nu devin niciodata maligne [27].

I.2.Clasificarea tumorilor.

Raportat la comportamentul biologic tumorile pot fi clasificate in 3 mari grupuri : a.benigne ce nu disemineaza la distanta, pastrand relativ caracteristicile tesuturilor de origine; b.in situ caracteristice tumorilor epiteliale, nu depasesc membrana bazala si tesutul inconjurator dar prezinta caracteristici maligne; c. tumorile maligne cu capacitate de metastazare [27]. Fenotipul malign implica doua trasaturi esentiale: diferitele grade de anomalii structurale celulare si invazia tesuturilor/organelor vecine. Cancerele pot apare din orice tip de tesut dar multe din tumorile benigne nu devin niciodata maligne [27].

Functie de originea embriologica, statusul de diferentiere si comportamentul biologic subtipurile de tumorile maligne se clasifica conform fig.1.3. Functie de originea embriologica celulele pot fi divizate in 4 mari grupuri: celule mezenchimale (ce alcatuiesc tesutul conjunctiv, osos, cartilaginos, muscular si limfovascular), epitelial, hemato-limfoid si nervos, grupate in tesuturi si organe cu un patern specific[27]. Fiecarui subtip embriologic celular ii corespunde un subtip de cancer specific cu un comportament biologic diferit [34]

Figura I.3. Clasificarea tumorilor. Adaptat dupa Weinber 2014 [34].

I.3. Stadializarea TNM

Stadializarea poate fi definita ca aprecierea gradului de extensie loco-regionala a tumorii .Cancerul este o boala extrem de heterogena iar stadializarea sa este o etapa esentiala in managementul bolilor neoplazice, atat in planificarea terapeutica cat si in prognostic si evaluarea rezultatelor terapeutice Exista mai multe tipuri de metode utilizate in scopul stadializarii: metoda clinica ce foloseste elemente clinice (examinarea fizica), paraclinica (markerii tumorali) , imagistica ce presupune diferite tehnici [explorarea cu raze X insotite sau nu de substante de contrast, ,ecografia, computer tomografia (CT), computer tomografia cu emisie de pozitroni ( PET scan), rezonanța magnetică nucleară ( RMN), si mai nou o tehnica imagistica bazata pe rezonanta magnetica ce detecteaza nivele crescute de glucoza denumita „glucose chemical exchange saturation transfer” sau glucoCEST], respectiv utilizarea datelor din raportul chirurgical si buletinul histopatologic. Stadializarea cuprinde 4 tipuri diferite de clasificari :a.stadializarea clinica- bazata pe datele clinice, imagistice si materialele bioptice; b.stadializarea patologica sau postchirurgicala- este cea mai complexa si cuprinde atat datele din stadializarea clinica cat si cele din raportul chirurgical si din buletinul histopatologic; c.stadializarea post-terapie sau post-terapie neo-adjuvanta- evalueaza gradul de extensie tumorala post radio sau chimioterapie, anterior interventiei chirurgicale; d.restadializarea- se utilizeaza pentru stadializarea recurentei tumorii maligne post-tratament chirurgical sau chimi/radio/terapie [35-37].

Sistemul TNM (tabelul I.2, figura I.4) este un sistem de clasificare universal acceptat, larg utilizat ce se poate folosi pentru marea majoritate a cancerelor. El implica 3 parametri majori :T (tumora) ce evalueaza gradul de extensie al tumorii primare, N ( ganglion) – evalueaza prezența sau absenta extensiei la ganglionii limfatici regionali , M (metastaza) – evalueaza prezența sau absenta metastazelor la distanță de tumora primară și ganglionii regionali. Fiecarui parametru ii corespunde forma abreviata reprezentat de prima litera T, N sau M si adnotat in general cu o cifra de la 1 la 4 ce corespunde stadiului respectiv astfel [34-36] a.pentru T: Tx – tumora primară nu poate fi evaluată; T0 – nu există dovada tumorii primare; Tis – carcinom in situ; T1, T2, T3, T4 – creșterea și invazia tumorii primare; b.pentru N: Nx – ganglionii regionali nu pot fi evaluați;N0 – nu există metastaze ganglionare regionale;

N1, N2, N3 – invadarea ganglionilor regionali în diferite grade;de precizat ca orice afectare al altor ganglioni altii decat cei regionali se considera metastaza limfatica ganglionara la distanta;c. pentru M: Mx – metastazele nu pot fi evaluate; M0 – nu există metastaze;

M1 – metastaze la distanță; de precizat ca, categoria M1 poate fi adnotata cu acronimele organului/tesutului la distanta in care metastazeaza Ex M1 HEP; M1 PUL; M1 OTH [34-36].. Pentru anumite localizari specifice se poate utilizeaza o subclasificare a categoriei: T1a, T1b , N1a, N1b,N1c, M1a, M1b etc. [35-37].

Desi TNM este o clasificarea universala a cancerelor, totusi pentru anumite localizari ale cacnerului exista si alte clasificari cum ar fi: Ann Arbor pentru limfomul Hodgkin, Dukes- pentru cancerul colorectal, Clark pentru melanoamele maligne, Federația Internațională de Ginecologie și Obstetrică (FIGO) pentru cancerele genitale feminine[34-36]. Fiecarui parametru ii corespunde un parametru notat cu litera T, N sau M si adnotat in general cu o cifra de la 1 la 4.

Figura I.4.Model de stadializarea T, N si M a tumorilor epiteliale maligne la nivelul organelor tubului digestiv. Este evidentiata stuctura generala a peretelui unui organ cavitar cu evidentierea tunicii corespunzatoare. Tis corespunde tumorii situate intraepitelial. Stadiul T1 corespunde invaziei tumorii dincolo de lamina propria pana la inclusiv nivelul muscularei mucoasei. Prezenta tumorii la nivelul muscularei mucoasei corespunde stadiului T2. Invazia tesutului adiacent organ-specific dincolo de musculara mucoasei corespunde stadiului T3. Diseminarea la distanta a celulelor tumorale reprezinta stadiul T4.N0 corespunde ganglionilor neivadati de celulele tumorale. Functie de numarul de ganglioni invadati N1, N2 si N3 corespund invaziei celulelor tumorale maligne la nivelul ganglionilor regionali. Invazia organelor adiacente sau diseminarea la distanta a celulelor tumorale reprezinta stadiul T4 si corespunde stadiului M.

Rezumativ neoplaziile maligne pot fi clasificate si stadializate la modul general conform tabelului I.2.

Tabel I.2.Clasificarea generala si stadializarea cancerului [36]

I.4.Gradingul histologic.

Diferentierea reprezinta procesul prin care o celula nediferentiata (celula stem) il parcurge pentru a se diferentia catre un anumit tip de celula. Exista celule inalt diferentiate ce prezinta o capacitate diferita de diviziune, cum este neuronul care cel mai probabil si-a pierdut capacitatea de a se divide. Celulele epiteliului intestinului subtire, sangvine si imune prezinta o rata de diviziune rapida, iar cele embrionare au capacitatea de a se diferentia in aproape orice tip de celula. Rata de diviziune nu se coreleaza in mod obligatoriu cu riscul de cancer (tumorile intestinului subtire fiind rare, desi celulele epiteliale au o rata de diviziune rapida). Dimensiunile unei celule sau ale unui organ sunt reglate prin mecanisme inhibitorii si stimulatorii ale hormonilor si factorilor de crestere specifici [27].

Statusul de diferentiere (histologic) al tumorilor este denumit grading si este abreviat cu initiala G. Gradingul este adnotat in general cu o cifra de la 1 la 4 functie de tipul de celula, astfel G1 corespunde unui grad usor diferentiat, G2 unui grad moderat diferentiat, G3 unui grad slab diferentiat iar G4 gradului nediferentiat iar Gx unui grad de diferentiere neprecizat. Gradingul, evaluaza comportamentul biologic al unei celule si reprezinta gradul de anormalitate al celulelor maligne comparativ cu celulele tesutului/organului de origine, fiind un element ce masoara practic gradul de diferentiere [38]. Un G crescut si un stadiu TNM crescut reprezinta elemente de prognostic rezervat, valoarea celor doi parametrii fiind direct proportionala cu gradul prognosticului.

I.5. Caracteristicile histologice ale tumorii

Din punct de vedere histologic tumora poate fi caracterizata print-o serie de indicatori morfologici si de prognostic (invazivitate): invazia limfovasculara (IVL), invazia perineurala (IPN) ,raspunsul inflamator intratumoral (RII), raspunsul inflamator peritumoral (RII).

Invazia limfovasculara (IVL) ce se caracterizeaza prin prezenta de emboli vasculari tumorali la nivelul capilarelor sanguine si limfatice. Prezenta IVL la nivel tumoral reprezinta un factor independent de prognostic nefavorabil in diverse tumori si poate constitui o cale independenta de metastazare [ 39-54].

Invazia perineurala (IPN) sau extinderea carcinomatoasa neurtoropica poate fi definita ca procesul de invazie neoplazica a filetelor nervoase (nervilor) si este implicata in diseminarea metastatica, pentru anumite forme de cancer fiind unica cale de metastazare. Invazia perineurala reprezinta trăsătura patologică importantă a multor boli neoplazice maligne, inclusiv cele ale regiunii colorectale, pancreasului, a prostatei , a regiunii capului si gatului, tractului biliar și stomacului. Pentru majoritatea cancerelor, IPN reprezinta un marker de prognostic nefavorabil [ ] si poate fi observată în absența invaziei limfatice sau vasculare. Pentru informatii detaliate poate fi accesat articolul de tip review lui Liebig si colab., ce analizeaza detaliat patogenia din punct de vedere molecular a IPN [55-58].

Raspunsul inflamator peritumoral (RIP),este un indicator morfologic de prognostic ce cuantifica tipul si numarul de celule care antureaza structurile tumorale. Functie de intensitatea infiltratului inflamator aceasta poate fi redusa, moderata sau crescuta. In functie de tipul de celula implicata in infiltratul inflamator peritumoral, RIP poate fi clasificat ca si mixt ( in care predomina infiltratul cu granulocite de tip PMN neutrofile) sau cronic- de tip boala Crohn (in care predomina infiltratul de tip limfoplasmocitar). Tumorile ce prezinta un RIP de tip cronic prezinta in general o evolutie mai nefavorabila fiind mai agresive[ 59] Relatia dintre inflamatie si cancer este foarte complexă si a fost observata pentru prima oara de catre Vicrhow in 1863. Se considera ca inflamatia cronica influenteaza toate fazele de carcinogenezei , de la aparitia mutației până la modificari in micromediul tumoral. Exista o cooperare intre celulele inflamatorii si celulele tumorale facilitand dezvoltarea micromediului tumoral cu diseminarea metastatica a tumorii. Aceste fenomene implica modificari in imunitate pin procese de inhibare a raspunsului imun la nivel tumoral [60].

Raspunsul inflamator intratumoral (RII) este un marker de inflamatie cronica care cuantifica numarul de celule inflamatorii ce invadeaza celulele tumorale. Un subtip de RII este reprezentat de raspunsul limfocitar intratumoral (RLI) ce cuantifica numarul de limfocite ce invadeaza celulele tumorale. Un RLI crescut este asociat cu un prognostic favorabil in diverse tipuri solide de cancer inclusiv cu un raspuns mai bun la tratamentul chimioterapic[61-64].

I.6.Ciclul celular. Descriere. Mecanisme de reglare. Interrelatia cu metabolismul glucidic.

Pentru a se reproduce, celula se divide si formeaza doua „celule fiice”, in etape succesive cu o secventa bine determinata, acestea alcatuind ciclul celular [65] (figura 1.5).

Figura 1.5 Ciclul celular.Etape durata si control. Genele supresoare(p53, pRB) activeaza punctele de control ale ciclului celular iar oncogenele (RasMyc) inhiba punctele de control ale ciclului celular. Prezenta nutrientilor sau factorilor de crestere stimuleaza faza G1 prin intermediul cailor de semnalizare specifice (MAPK/mTORC1/2) .Ciclul celular este controlat de o serie de proteine cheie ce controleaza punctele cheie.

Ciclul celular (CC) se desfasoara la o magnitudine impresionanta (se estimeaza ca in fiecare secunda in organismul uman se divid aproximativ 25 milioane de celule [19]), si are o durata variabila, functie de specie si tipul de celula, in medie aproximativ 16h. Include 4 faze distincte in secventa G1-S-G2-M-G1 cu 3 puncte cheie de control la nivelul G1/S,G2/M, M/G1 si detine un mecanism exact de reglare atat extrinsec de la semnale extracelulare, cat si intrinsec prin semnalele receptionate de la nivel intracelular [19]. Majoritatea celulelor la varsta adulta nu se afla intr-o stare de diviziune fiind intr-o perioada inactiva G0 (neuronii) , dar se pot activa sub actiunea unor factori de crestere cu actiunea mitogena, si reintra in ciclul celular printr-un punct de restrictie G1 [19]. In timpul fazei G1, celula creste si prin punctul de control G1/S se asigura ca nu exista mutatii ADN si se pregătește pentru reproducerea informației genetice; in faza S , celula sintetizeaza si replica ADN, iar in faza G2 continua sa creasca fiind pregatita pentru etapa finala de diviziune de mitoza M, cand, materialul genetic al „celulei mama” (cromozomii) in urma unor etape succesive (profaza, metafaza, anafaza, telofaza),este distribuit in mod egal la cele doua „celule fiice” [65,66].

Suplimentar acestor cai, ciclul celular mai poate interfera intr-o maniera reciproca cu anumiti factor sau anumite enzime din caile metabolice in special cele din calea glicolitica, asa cum este redat in tabelul I.3.

Tabelul I.3. Interrelatia ciclului celular cu metabolismul glucidic [67].

Controlul divziunii ciclului celular este esential, el dictand fie momentul in care o celula intra in faza S si sintetizeaza ADN pentru proliferare, fie oprirea ciclului si intrarea in starea de repaus G0, fie corectarea mutatiilor de la nivelul ADN-ului sau initerea procesului de apoptoza.

Ciclul celular este reglat de o serie de cai ce contin atat oncogene cat si supresori tumorali si sunt frecvent dereglate in cancerele umane (figura 1.5 ) [68,69].

La nivel molecular, ciclul celular este guvernat de fluctuatii spatiale si temporale ale activitatii unor complexe proteice ce contin subunitati reglatorii esentiale denumite cicline ce se leaga de subunitatea catalitica corespodenta denumita ciclin-dependent-kinaza (CDK) [68,69]. Activitatea acestor complexe este reglata de o retea de evenimente ce includ, inductia si degradarea subunitatii ciclinei [68,69], gradul de distribuția spațială in diferitele compartimente celulare [68,69], activarea fosforilarii inhibtorii a subunitatii CDK[68,69] si de interactiunea complexului CDK/ciclina cu inhibitorii CDK [68,69].

CAPITOLUL 2

PARTICULARITATILE METABOLISMULUI CELULEI TUMORALE MALIGNE.

4.1.Metabolismul energetic.Principalele cai metabolice.

Metabolismul este trasatura indispensabila a vietii si reprezinta un sistem deschis ce include totalitatea proceselor fizico-biochimice dintr-o celula (unitatea morfofunctionala a materiei vii) ce asigura schimburile permanente de energie, substanta si informatie cu mediul inconjurator, mentinand o stare de echilbru denumita stare dinamica stationara (homeostazie) [70].Metabolismul intermediar se refera la procesele biochimice in care sunt implicate moleculele cu masa moleculara mica.

Procesele de catabolism si anabolism sunt interdependente si in echilibru, fiind cuplate printr-un intermediar comun universal ce contine in molecula sa o legatura macroergica(>7kcal/mol). Principalul intermediar este molecula de ATP ce contine in structura sa 2 legaturi de tip macroergic (avand ca simbol „~ ”), asigurand astfel transferul de energie de la reactiile exergonice la reactiile endergonice (reactiile de sinteza)[70-72]. La nivel celular mai exista si alti compusi macroergici (fosfoenolpiruvat, carbamoil fosfat, acid 1,3bifosfogliceric, creatinfosfat, acetil-CoA,UDP-glucoza, CDP-colina) dar care nu sunt insa universali fiind utilizati in anumite procese metabolice specifice. ATP-ul poate fi folosit intr-o serie de reactii si procese in organism: reactii de biosinteza, procesul de contractie musculara, de transmisie nervoasa sau de transport activ la unor molecule. Exista trei surse de legaturi de tip macroergic utilizate in procesele metabolice: a.fosforilarea oxidativa de lant respirator -prin care se obtine cea mai mare cantitate de legaturi de tip macroergic, proces ce se desfasoara la nivelul lantului respirator din mitocondrie in prezenta oxigenului molecular (O2), b.glicoliza- in care prin oxidarea gliceraldehid 3-fosfat la 1,3 bifosfoglicerat si transformarea fosfoenolpiruvatului in piruvat cu formarea in final de lactat se obtin 2 legaturi de tip macroergic cu pondere mica in aerobioza dar care in condtii de anaerobioza devine un mecanism esential de producere a energiei;c.ciclul Krebs in care se formeaza o legatura de tip macroergic prin decarboxilarea oxidativa a acidului α-cetogluratic [70-72,73]. Fosforilarea oxidativa este reprezentata de reactia endergonica de fosforilare a ADP si formarea de ATP (ADP+Pi=ATP+H20) folosind energia provenita din oxidarea biologica a moleculelor organice complexe, functie de modul de cuplare ea fiind incadrata in fosforilare oxidativa de substrat-din glicoliza si ciclul Krebs (proces cu pondere mica) sau fosforilarea oxidativa de lant respirator (respiratie celulara).

2.Metabolismul ca potential factor in originea cancerului.

Daca este sa se ia in calculul ecuatiei neoplazice, metabolismul ca si posibil element de risc, la ora actuala exista doua modele ale originii cancerelor: A.mutatiile genetice asociate tumorilor pot cauza modificari metabolice cu alterarea metabolismului celular ce va induce modificari epigenetice si in retele de semnalizare ce vor initia procesul de carcinogeneza. B. Dereglarea metabolismului (cauzat de mutatia unei gene din metabolism sau datorata factorilor de mediu) poate induce modificari epigenetice si la nivelul retelelor de semnalizare ce vor initia procesul de carcinogeneza (figura 2.1)[74] Exista doua gene de o importanta majora ce sunt implicate in modelul metabolic cu potential oncogen. Aceste gene cheie tumorale, reprezentate de gena supresoare tumorala p53 si oncogena myc sunt reglatorii esentiali ai metabolismului, iar dereglarea lor este frecvent identificata in majoritatea formelor de cancer solide.

Figura 2.1.Rolul potential al metabolismului in cancer.Adaptat dupa Wu 2013 [74].

Metabolismul glucozei. Descriere.

Calea glicolizei cuprinde un set de reactii biochimice succesive. Glicoliza reprezinta calea universala de metabolizare a glucozei, cu rol esential in producerea de energie si intermediari pentru biosinteza si este constituita dintr-o serie de reactii biochimice desfasurate in citosolul celulei catalizate de o serie de trei enzime ce produc reactii ireversibile: hexokinaza, fosfofructokinaza (FFK) (principalul reglator al ratei glicolizei) si piruvat kinaza. Expresia FFK este inhibata de ATP, citrat, scaderea ph, hormonii hiperglicemianti (glucagon, adrenalina, cortizol) starea preprandiala si activata de insulina, ADP, AMP si respectiv statusul postprandial [70].

Glicoliza se poate desfasura in prezenta sau in lipsa oxigenului (aeroba respectiv anaeroba). Oxidarea anaeroba a glucozei este posibila prin regenerarea NAD+ oxidat (necesar in reactia catalizata de gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza) prin reducerea piruvatului la lactat.

Oxidarea completa a glucozei cuprinde 4 etape: 1.oxidarea glucozei la acid piruvic (calea Embden Meyerhof-specifica metabolismului glucidic); functie de prezenta sau absenta oxigenului piruvatul poate avea mai multe cai: in prezenta oxigenului el este covertit la Acetil-CoA care intra in ciclul Krebs;in absenta oxigenului piruvatul este convertit in lactat de catre LDH care poate fi reconvertit in piruvat in prezenta oxigenului; daca lipsa oxigenului persista lactatul este reconvertit la glucoza in hepatocit via ciclul Cori .2.oxidarea piruvatului la acetil CoA (prin decarboxilare oxidativa) in mitocondrie prin intermediul complexului piruvat dehidrogenaza; 3.oxidarea acetil-CoA in ciclul Krebs cu obtinerea de NADH, FADH2, GTP si CO2. 4.oxidarea hidrogenului de pe substraturi prin procesul de fosforilare oxidativa de lant respirator cu producere de ATP si secundar H20 [1] vezi figura (3). Oxidarea a 1 mol de glucoza produce:a. in conditii aerobe prin oxidare partiala 2ATP +2NADH +2 piruvat; b. In condtiii anaerobe 2ATP+ 2 lactat;c.prin oxidare completa: C6H12O6+ 6O2—38ATP*+6CO2+6H20 cu ΔG0 (energia libera de reactie standard)=-686 kcal/mol (*cu tansportorul malat/aspartat pentru oxidare NADH) [70,75].

Majoritatea celulelor oxideaza glucoza in conditii aerobe, dar glicoliza anaeroba reprezinta unicul mecanism in eritrocite (lipsite de mitocondrii) , preponderent in celula maligna, tesutul embrionar dar si in celulele cu o oxigenare mai redusa (cum ar fi cele din retina, cornee, piele) si temporar in muschiul scheletic in efort intens si prelungit[70,75]. Comparativ cu glicoliza aeroba, glicoliza anaeroba este inhibata de prezenta oxigenului (principiul Pasteur) principiu insa care nu este valabil pentru tesutul tumoral malign care oxideaza glucoza pe calea anaeroba indiferent de prezenta sau nu a oxigenului [70,75].

Odata ajunsa in celula,pentru a fi retinuta in celula si a fi activata glucoza este fosforilata la glucoza-6-fosfat (G6P) de catre hexokinaza cu consum de ATP (figura). G6PD poate realiza: fie conversie la glicogen (depozit energetic) sau fructoza, galactoza, fie calea pentozofosfatilor, fie sa participe la sinteza de glicoproteine si mucopolizaharide, fie sa fie convertit la Acetil-CoA si ulterior metabolizat in ciclul Krebs si in lantul respirator sau sa participe la sinteza de acizi grasi via Acetil-CoA (depozit energetic)[70,75].

Glicoliza anaeroba (2 molecule ATP) este considerata un mecanism primitiv de obtinerea a energiei datorita randamentului foarte scazut comparativ cu glicoliza aeroba ( 36 molecule de ATP prin transportorul glicerol-3-fosfat si 38 molecule ATP prin transportorul malat-aspartat).

3. Metabolismul glucozei in carcinogeneza. Efectul sau fenomenul Warburg

Efectul sau fenomenul Warburg [76-86] se defineste ca trasatura metabolica esentiala a celulei tumorale maligne in care celula maligna catabolizeaza in mod preferential glucoza pe calea anaeroba cu producerea de lactat chiar si in prezenta oxigenului proces denumit glicoliza aeroba. Prezenta fenomenului de glicoliza aeroba in celula tumorala reprezinta un marker de agresivitate[76-86].

Chiar daca randamentul glicolizei este unul scazut (2ATP), productia de energie celulara este mai mare prin procesul de glicoliza comparativ cu procesul de fosforilare oxidativa , deoarece glicoliza are o rata mai accelerata de producere ATP [ 14c, ]. O parte mai mica din energia celulara continua sa fie obtinuta din procesul de fosforilarea oxidativa. Mare parte din cantitatea de energie obtinuta de celula neoplazica prin procesul de glicoliza este utilizata in procesele de biosinteza a precursorilor necesari macromoleculelor (lipide, proteine, acizi nucleici), si pentru acumulare de biomasa si proliferare. Contributia de ATP din glicoliza este un proces dependent de tipul de celula sau tesut si de mediul celular (factori de crestere, nutrienti) sau momentul ciclului celular si este capabila de o crestere exponentiala functie de necesitatile celulei [86] .

Se considera ca alterarea metabolismului glucozei la nivel tumoral are loc in prezenta unui defect mitocondrial. Celulele neoplazice prefera sa metabolizeze glucoza preferential pe cale anaeroba in dauna glicolizei aerobe pe calea fosforilarii oxidative chiar si in prezenta oxigenului.

Celulele tumorale pentru a se adapta procesului de proliferare necontrolata trebuie sa adopte o serie de modificari biochimice [77,78,83,86]:

a. Facilitarea accesului la nivel celular prin captarea crescuta a nutrientilor prin cresterea expresiei receptorilor GLUT (rata crescuta de preluare a glucozei are ca scop cresterea aportului energetic si sinteza a diversi produsi, aminoacizii pentru sinteza proteica, acizii nucleici pentru sinteza ADN si ARNsi lipidele ce intra in compozitia membranelor celulelor)

b.glicoliza anaeroba produce acid lactic creand un mediu acid, valoarea ph-ului din micromediul tumoral fiind direct proportionala cu gradul de nocivitate (un ph scazut al micromediului tumoral fiind nociv celulelor normale nu insa si celor tumorale). Rata crescuta de metabolizare a glucozei in celula neoplazica este evidentiata si prin scanarea tomografica cu emisie de pozitroni (ce utilizeaza ca trasor radioactiv FDG18), o tehnica larg utilizata pentru a detecta prezenta tumorilor solide.

c. productia unei cantitati mai mici de specii reactive de oxigen in procesul de glicoliza , ce creeaza o stabilitate mai mare materialului genetic tumoral si implicit o rezistenta crescuta la apoptoza.

d. cresterea ratei de generare ATP din glicoliza comparativ cu generarea ATP din procesul de fosforilare oxidativa ( studii recente arata ca 95% din cantitatea de ATP este necesara pentru mentinerea homeostaziei celulare doar 5% din cantitatea de ATP fiind utilizata pentru procesul de proliferare celulara).

Figura 2.2.Model de evolutie in vivo a glicolizei aerobe in procesul carcinogenic.Adaptat dupa Gatenby si colab 2007[87,88]. A. Modificarile initiale la nivelul oncogenelor, supresorilor tumorali creeaza conditiile unei proliferari aberante in exces in lumen la distanta de membrana bazala. Atat timp cat celulele sunt separate prin intermediul membranei bazale intacte de aportul sanguin de nutrienti, proliferarea excesiva este limitata de hipoxie. Scaderea concentratiei de oxigen va conduce catre conversia din metabolismul glicolitic aerob catre cel anaerob.Glicoliza va creste concentratia extracelulara de lactat ce determina toxicitate celulara cu apoptoza si necroza. O parte din celule vor rezista in acest micromediu toxic inducand aparitia un fenotip rezistent la toxicitatea indusa de acest mediu acid. Ulterior, aceasta populatie va prolifera rapid ca urmare a favorizarii acestui mediu acid in dauna a celorlalte populatii celulare vulnerabile in acest mediu dar si prin favorizarea invaziei celulare. In final aceasta populatie rezistenta va penetra membrana bazala si se va transforma intr-un cancer invaziv si agresiv.

B.Concentratia de glucoza , oxigen si ioni de hidrogen in carcinomul in situ. bazat pe modele matematice de reactie-difuzie; axa x este reprrezentata de distanta de la membrana bazala in diametre celulare cu un diametru tipic de 25 μm iar axa y este reprezentata de concentratiile normalizate ale oxigenului, glucozei axa y din stanga si ionilor de hidrogeni axa y din dreapta.Concentratia de oxigen reprezentata printr-o linie rosie scade proportional cu distanta de la membrana bazala, pentru ca la o distanta de 5-10 straturi celulare de la membrana bazala sa apara hipoxia severa. In mod contrar concentratia de glucoza marcata cu linia verde scade foarte putin cu distanta. Concentratia ionilor de hidrogen marcata cu o linie albastra prezinta o crestere exponentiala cu distanta. Ca si concluzie putem spune ca hipoxia si acidoza sunt prezente in tumorile de peste 250 μm diametru, iar concentratia de glucoza in micromediu tumoral ramane aproape constanta indiferent de distanta.

Exista o relatie de directa proportionalitate intre concentratia de substrat si distanta fata vasul de sange [87,88] (figura 2.2).

In tumorile epiteliale hiperproliferarea celulara are loc in spatii extrem de limitate. In mod normal la nivelul epiteliului celulele prezinta fenomenul de inhibitie de contact, iar o celula ce pierde contactul cu membrana bazala va intra in apoptoza, termen denumit anoikis[89]. Mutatia la nivelul supresorilor tumorali ce controleaza aceste fenomene va conduce la o hiperproliferare celulara catre exterior datorita membranei bazale[89].Odata cu proliferarea in exces celulele se indeparteaza de membrana bazala si implicit apare o scadere a concentratiei de oxigen dar cu o mica scaderea a glucozei.Concomitent exista o scadere si a disponibilitatii de factori de crestere datorita scaderii aportului sangvin compensata probabil prin secretie autocrina si/sau prin cresterea numarului de receptori ai factorilor de crestere si/sau stimularea diverselor cai de semnalizare oncogene[89]. Un fenomen adaptativ cu o importanta esentiala in carcinogeneza consta in scaderea substratului disponibil ce are ca si consecinta cresterea captarii glucozei si conversia ei pe calea glicolizei aerobe la glicoliza anaeroba[87-90]. Persistenta glicolizei anaerobe chiar si in prezenta oxigenului definesc fenomenul Warburg.Aceasta trasatura este demonstrata si prin tehnica FDG-PET-CT ce descrie o crestere a captarii glucozei in aproape toate tumorile maligne primare sau metastatice. FDG-PET a demonstrat o crestere marcata a captarii glucozei si implicit a glicolizei in cancerele invazivie comparativ cu cancerele neivazive sau tumorile benigne. Astfel creearea unui micromediu acid ( si astfel conversia glicolizei cu producerea de lactat) este astfel critica pentru tranzitia de la cancerul neinvaziv la cel invaziv[87,91]

Fenotipul rezistent la mediul acid toxic prezinta cateva trasaturi adaptative specifice: cresterea captarii glucozei prin crestere expresiei GLUT (GLUT1) si transportorul de Na+/H+ (NHE1) stimularea HIF si anhidrazei carbonice 9, ceea ce indica modificari transcriptionale initiate de hipoxie. Pentru mentinerea concentrtaiei de ATP hipoxia creste intensitatea glicolizei, iar acidoza creste expresia Na/H pentru scaderea aciditatii[89-94].

In lumina acestor date cu evidentierea unui rol esential al metabolismului glucozei si al concentratiei de substrat in carcinogeneza, se ofera o viziune complexa asupra riscului de cancer in DZ [89].

Celula maligna adopta aceasta strategie pentru a preveni moartea celulei pentru a satisface cerintele crescute de energie si produsi intermediari de metabolism necesari procesului de proliferare celulara. Ea isi creste aportul de glucoza prin cresterea expresiei receptorilor GLUT, controlati de diversi factori de transcriptie p53, myc, HIF.

Legat de originea cancerelor Warburg a realizat o serie de observatii publicate in lucrarea „On the origin of cancer cells” publicata in 1956 in prestigioasa revista Science. Paragraful in care Warburg sustine transformarea neoplazica a celulelor ce au leziuni ireversibile la nivelul respiratiei celulare [84,95]:

„Lezarea ireversibila a respiratiei este urmata ca o faza secundara de dezvoltare a cancerului caracterizata de o indelungata lupta pentru existenta a celulelor lezate pentru a-si mentine structura, proces in care o parte din celule vor pieri din cauza lipsei de energie, iar o alta parte vor reusi sa inlocuiasca pierderea ireversibila a energiei respiratorii prin procesul de energie fermentativa. Datorita inferioritatii morfologice a energiei fermentative, celulele inalt diferentiate sunt convertite in urma acestui proces in celule nediferentiate care cresc haotic-celulele canceroase………Pe de alta parte am gasit ca cel mai intens proces de fermentatie a celulelor se desfasoara in cele mai timpurii stadii ale dezvoltarii embrionare. In aceste conditii este clar ca –de cand ontogenia este repetitia filogeniei- fermentatia celulara este mostenirea stramosilor nediferentiati ce au trait in trecut pe consum energetic fermentativ”[84,95]

Suplimentar fenomenului Warburg in cancer exista alte fenomene modificate: efectul Pasteur si efectul Crabtree. Efectul Pasteur este caracteristic celulelor normale si se caracterizeaza prin inhibitia glicolizei anaerobe in prezenta oxigenului insa acest efect este inhibat in celula tumorala. Efectul Crabtree [84] consta in inhibitia fosforilarii oxidative (respiratiei celulare) indusa de glucoza, prin scaderea aportului de oxigen in prezenta glucozei comparativ cu celula normala in care procesul de fosforilare este crescut . Efectul Crabtree se explica prin mai multe mecanisme: a. prin cresterea disponibilitatii glucozei ce va creea o competitie intre glicoliza si fosforilarea oxidativa pentru compusii ADP +Pi in defavoarea fosforilarii oxidative [84,96] b.cresterea productiei de acid lactic cu scaderea ph-ului citosolic proces ce va inhiba enzimele fosforilarii oxidative [84,97] c.cresterea nivelelor de Ca mitocondrial ce va inhiba activitatea ATP-sintetazei (prin asocierea F1F0)[84,98]; d. Cresterea nivelului ROS prin accelerarea glicolizei ce va altera structurile mebranare mitocondriale si va inhiba activitatea enzimelor lantului respirator [84,99] (figura 2.3).

Figura 2.3. Prezentarea comparativa a fenomenului Warburg, Crabtree si Pasteur [84,99].

Capitolul 3

PROTEINELE BCL2 SI P53. DESCRIERE. ROLURI IN ONCOGENEZA SI DIABETOGENEZA

3.1 Fenomenul de apoptoza.

Majoritatea cancerelor apar prin acumularea de mutatii genice care conduc la o dereglare a proliferarii si homeostaziei celulare, rezultand proliferarea celulara necontrolata. Organismul uman detine mecanisme de control a proliferarii celulare care impedica cresterea celulelor mutante prin inducerea apoptozei acestora. Calea majora apoptotica este calea mitocondriala si este controlata de proteinele din familia Bcl-2 (B cell lymphoma 2).

Homeostazia in organismele multicelulare este mentinuta prin balanta dintre proliferarea si moartea celulara. Moartea celulara programata (apoptoza) este o caracteristica a tuturor organismelor multicelulare diferentiate si se bazeaza pe activarea unui program intern de "sinucidere" putand fi declansata de o varietate de stimuli extrinseci sau intrinseci [100,101]. Apoptoza trebuie diferentiata de necroza celulara, necroza celulara fiind produsa de o injurie celulara acuta cu distrugerea integritatii membranei celulare si inducerea unui raspuns inflamator cu liza celulara iar apoptoza consta intr-un fenomen de autodigestie celulara controlata, fara inducerea unui raspuns inflamator[101] .

Studiile genetice si biochimice efectuate pe diverse organisme inclusiv mamifere, D.melanogaster, C. Elegans au evidentiat rolul esential al familiei proteinelor Bcl-2 in reglarea si controlul apoptozei [102].

Dereglarea complexelor mecanisme apoptotice conduce la o serie de afectiuni, astfel: inhibarea apoptozei are implicatii in oncogeneza, iar apoptoza in exces este implicata in distrugerea celulelor din HIV/SIDA, in aparitia bolilor neurodegenerative si a diabetului zaharat [103].

Efectele glucotoxice și lipotoxice cresc stressul oxidativ și produc apoptoza celulei beta prin intermediul complexei familii a proteinelor Bcl-2 [104].

Acumularea de mutatii genetice si epigenetice la nivelul celulei neoplazice, confera celulelor tumorale proprietati prin care se sustrag procesului de apoptoza si prolifereaza necontrolat. Procesul de apoptoza este controlat prin doua cai de semnalizare importante interconectate. Prima cale implica familia proteinelor Bcl2, respectiv proteina Bcl-2 cu rol antiapoptotic, iar a doua cale este reprezentata de proteina supresoare tumorala p53, cu rol proapoptotic. Fenotipul malign se caracterizeaza prin dereglarea acestor cai de semnalizare cu favorizarea procesului de apoptoza, respectiv fie prin pierderea functiei genei supresoare tumorale p53 fie prin amplificarea functiei Bcl-2. Eficacitatea agentilor chimioterapeutici este grevata de integritatea mecanismelor apoptotice. Orice fenomen, factor sau mecanism ce favorizeaza inhibarea apoptozei, suplimentar stimularii celulelor neoplazice interfera cu actiunea multor agenti chimioterapeutici [105]. Mortalitatea prin cancer in DZ si obezitate este crescuta, un mecanism potential fiind si modificarea apoptozei in sensul inhibarii acesteia.

Apoptoza are ca si efectori caspazele. Functie de modul de activare al caspazelor apoptoza poate fi intrinseca prin activarea caspazei 9 actiune dependenta de prezenta citocromului c si de actiunea proteinelor din familia Bcl2 ce activeaza MOMP si extrinseca prin activarea caspazelor 8 si 10 actiune mediata prin receptorii mortii Fas, TRAIL, TNF [49]. O serie de factori fizici, chimici si biologici pot declansa apoptoza pe una din cele doua cai majore, ambele cai activand in final calea caspazelor:

– calea extrinseca sau calea receptorului morții (death receptor mediated pathway) este activata de stimuli extracelulari prin legarea unor liganzi specifici din superfamilia factorului de necroză tumorala (TNF) (ex: FasL), de receptorii mortii de la suprafata celulei (ex:TNFR, Fas). Legarea liganzilor determina modificari conformationale la nivelul domeniului intracelular al receptorului, ceea ce determina recrutarea unor proteine apoptotice, care formează un complex proteic numit DISC (death-inducing signaling complex) cu activarea caspazei 8, functie de nivelul activitatii caspazei 8 semnalul putand activa fie direct calea de semnalizare a caspazelor sau poate implica si activarea caii mitocondriale [105,106].

-calea intrinseca sau calea mitocondriala sau calea Bcl-2 este activata de stimuli intracelulari (deprivare de factori de creștere, expunere la radiatii sau substante chimice, hiperglicemia etc.) si se afla sub controlul complexei familii de proteine Bcl-2 ce determina în final permeabilizarea membranei mitocondriale cu eliberarea citocromului c din mitocondrie in citosol [dupa eliberare citocromul c interacționează cu proteina APAF-1 (apoptotic protease-activating factor-1) și recruteaza pro-caspaza 9, formand astfel un complex multiproteic numit apoptozom] si activarea cascadei caspazelor 9,3,6,7 [105-108].

Este demonstrata ca pierderea expresiei p53 si aparitia p53 mutant insotit de hiperexpresia Bcl2 se asociaza cu rezistenta crescuta la tratamentul antitumoral, atat chimioterapic cat si radioterapic sau hormonoterapic intr-o varietate de tumori [110-120] in contrast cu mentinerea expresiei WT p53 ce s-a asociat cu un raspuns bun la tratament [39].Explicatia deriva din leziunile celulare importante produse de agentii citotoxici si de radiatiile utilizate in tratamentul cancerului ce activeaza calea intrinseca a apoptozei prin intermediul proteinei p53, dar mutatiile proteinei p53 (prezente in mai mult de 50% din tumori) blocheaza aceasta activare producand rezistenta la tratament. O cale apoptotica independenta de p53 este TRAIL [Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)] ce mediaza apoptoza prin intermediul receptorilor mortii DR4 and KILLER/DR5[109]. Tumorile rezistente la apoptoza pot avea o hiperexpresie a caii  Fas/CD95 si a proteinei Bcl2, lipsa expresiei Fas/CD95 si Bcl2 fiind asociata cu un raspuns mai bun la tratament [121].

3.2.Proteina antiapoptotica Bcl2

Identificarea in 1985 a Bcl-2 (B cell leukemia/lymphoma2) codificat de gena BCL-2, prototipul familiei proteinelor Bcl-2, ca rezultat al translocatiei cromozomiale t(14;18)(q32;q31) in limfomul folicular cu celule B si evidentierea rolului de inhibare a apoptozei a produs un imens interes in studiul acestor proteine si o crestere exponentiala a numarului de publicatii pe tema apoptozei[122]. Familia Bcl-2 are in prezent un numar de 17 membrii si consta intr-o serie de proteine cu roluri antiapoptotice dar si proapoptotice si impart secvente comune omoloage cunoscute si ca Bcl- 2 Homology (regiunile BH1 – BH4) [123].

Interacțiunea dintre membrii familiei Bcl-2 și balanța factorilor proapoptotici și antiapoptotici și interacțiunea specifica dintre ei, va determina soarta celulei prin reglarea activarii/inhibitiei MOMP care este considerat „point of no return” în apoptoza și odată produsa celula este practic condamnata la autodistrugere [124]. Proteina Bcl-2 de 25kDa este codata de gena BCL2, exercita efecte antiapototice iar proteina omoloaga Bax are efecte proapoptotice prin competitie, homodimerii Bax-Bax actionand ca inductori iar heterodimerii Bcl2-Bax ca inhibitori inhibtori ai procesului de apoptoza celulara sau de moarte celulara programata (programmed cell death”)[125] ( pathway of cellular suicide machinery).

Proteinele Bcl-2 clasic au rol antiapoptotic, dar soarta celulei va fi determinata de interacțiunea dintre membrii familiei Bcl-2 și balanța factorilor proapoptotici și antiapoptotici și interacțiunea specifica dintre ei [124].

Familia Bcl-2 consta dintr-o serie de proteine cu roluri antiapoptotice dar și proapoptotice ce împart secvente comune omoloage (domenii), cunoscute și ca Bcl-2 Homology (de la grupare amino pana la gruparea carboxi terminala a Bcl-2: regiunile BH-1-BH4) si sunt impartite in trei grupuri functionale [127] :

-proteinele cu rol antiapoptotic :Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-w, A1/Bfl-1, Bcl-B/Bcl2L10 ce cuprind toate cele patru secvente comune omoloage BH-1-BH-4;

-proteinele BH3: Bid, Bim, Puma, Noxa, Bad, Bmf, Hrk, Bik cu secvente comune cu ceilalati membrii ai familiei doar la nivelul domeniului BH-3, activarea lor fiind declansata ca raspuns la stresul celular iar reglarea lor se face la nivel transcriptional -Noxa, Puma si post-translational -Bid, Bmf [127-129]

-proteinele cu rol proapoptotic: Bax, Bak, Bok/Mtd ce contin toate cele patru domenii BH1-BH4.

Structura tridimensionala a membrilor familiei Bcl-2 consta in doua lanturi centrale α-elicoidale hidrofobe inconjurate de 6-7 lanturi α-elicoidale amfipatice de dimensiuni variabile, iar la suprafata proteinelor antiapoptotice se gaseste o zona hidrofoba decliva ("groove") ce reprezinta situsul de legare al peptidelor care mimeaza regiunile BH3 ale proteinelor pro-apoptotice (Bak si Bad) [130]

Pentru clarificarea mecanismelor moleculare de actiune si reglare a apoptozei intermediata de complexa familie a proteinelor Bcl-2 au fost propuse mai multe modele:

-modelul de activare directa ("direct activation") avand ca si caracteristica necesitatea cuplarii proteinelor BH3 de regiunea omoloaga a proteinelor proapoptotice Bcl-2 (Bax and Bak) pentru activarea directa a apoptozei, clasificand proteinele BH3 functie de afinitatea lor de fixare, ca proteine cu afinitate crescuta respectiv scazuta [131,132].

-modelul de inlocuire (“displacement”): proteinele BH-3 nu se fixeaza direct de Bax si Bak, ele fiind active constitutiv, trebuind inhibate de proteinele antiapoptotice Bcl-2 pentru preventia apoptozei [131,133]

-modelul incorporat ("embedded together"): membrana mitocondriala reprezinta "locus of action" pentru cele mai multe proteine Bcl-2 deoarece MOMP (mitochondrial outer membrane permeabilization) nu se produce pana ce proteinele Bax si Bak nu realizeaza modificarile conoformationale corespunzatoare in membrana, din interactiunea cu membrana mitocondriala rezultand modificari distincte conformationale ale proteinelor familiei Bcl-2 prin care isi regleaza afinitatea locala pentru liganzii specifici [131,134]

-modelul unificat("unified"): proteinele antiapoptotice fie blocheaza activatorul BH3 (mod1), fie blocheaza Bak, Bax (modul2) [131,135].

3.3 Rolul proteinelor Bcl2 in diabetogeneza

Apoptoza indusa de mediul diabetic la nivelul celulei β pancreatice creste stressul oxidativ la acest nivel (in special peroxidul de hidrogen) activand calea intrinseca sau extrinseca a apoptozei si crescand raportul Bax/Bcl2[136]. Hiperglicemia cronica reduce expresia a glucokinazei (hexokinazei 4) ce catalizeaza prima etapa a metabolismului glucozei( reactia de fosforilare a glucozei in glucoza6-fosfat) etapa cheie reglatoare a secretiei de insulina din celula β. Mutatia la nivelul genei glucokinazei se asociaza cu DZ MODY boala caracterizata prin: debut precoce (<25 de ani), independenta de insulinoterapie (>5 ani)), transmitere autozomal dominanta, asocierea mai putin frecventa cu obezitatea comparativ cu DZ tip2. Expunerea celulei β la mediul hiperglicemic cronic altereaza fiziologia normala a celulelor insulinosecretorii determinand fenomenul de glucotoxicitate ce consta intr-o disfunctie progresiva a celulei β cu moartea β celulara. Glucokinaza are rol important in apoptoza prin interactiunea cu complexul VDAC mitocondrial blocand astfel accesul Bax la nivelul complexului VDAC si implicit creste raportul Bax/Bcl2, ceea ce va bloca eliberarea citocromului c, aceste procese explicand fenomenul de glucotoxicitate[137].

Atat factorii genetici ereditari cat si cei de mediu contribuie la disfunctia celulei β in diabetul zaharat, iar apoptoza celulei β-pancreatice umane poate fi declansata de o serie de stimuli [glucoza, acizii grasi liberi-AGL, IAPP (polipeptidul amiloidic insular pancreatic), citokinele pro-inflamatorii, produsii avansati de glicozilare (AGE)] ce pot actiona pe mai multe cai: calea extrinseca calea intrinseca caile stresului reticulului endoplasmic [138-140].

Activarea cascadei de semnalizare induce apoptoza celulei β prin mai multe mecanisme ce includ stresul reticulului endoplasmic (stresul RE), modularea familei proteinelor Bcl-2, permeabilizarea mitocondriala si activarea caspazelor [141].

O caracteristica comuna a mortii celulare dupa expunerea celulei β la fenomenul de gluco-lipotoxicitate sau la citokinele proinflamatorii este translocarea Bax in mitocondrie, eliberarea citocromului c si activarea cascadei caspazelor: 9,3,7 conturand calea intrinseca (mitocondriala) a apoptozei [142,143,144]. Studiile in vivo si in vitro pe modele umane sau animale au demonstrat rolul stresului RE in apoptoza celulei β-pancreatice din DZ tip1 si DZ tip 2 [144-146]

Stresul RE este definit ca si acumularea de proteine nepliate (neprelucrate sau unfolded protein response UPR). Celula β pancreatica este in special vulnerabila la stresul RE datorita cererii enorme de prelucrare a insulinei ca raspuns la stimulii fiziologici cum este glucoza. Stresul RE favorizeaza apoptoza specifica, familia proteinelor Bcl-2 avand un rol esential in soarta celulei. Stresul RE din celula β-pancreatica activeaza IRE1α care recruteaza molecula TRAF2 (TNF receptor-associated factor 2-TRAF2) si fosforileaza JNK ce activeaza c-Jun si proteina DP5 (din familia Bcl-2) ce au rol in reglarea homeostaziei RE [141,147]. Apoptoza indusa de stresul RE poate fi oprita prin supraexpresia Bcl-2 sau reducerea DP5, Bax sau Bak[141,148]. Traficul Ca in citosol poate declansa semnale apoptotice atat in celula β cat si in alte tipuri de celule iar permeabilitatea RE la Ca poate fi modificata de proteinele Bcl- 2 [141,149,150].

S-a constat ca in celula β pancreatica la pacientii cu DZ tip2 se produc cantitati mai mari de specii reactive de oxigen (SRO) comparativ cu pacientii non-diabetici , iar sursa majora de producere a SRO este mitocondriala [151-153].

3.4.Proteina supresoare tumorala p53. Descriere.Roluri.

Proteina supresoare tumorala p53 (descoperita de Lionel Crawford, David P. Lane in 1979) denumita si „paznicul genomului” pentru rolul ei de inducere a apoptozei in celulele cu erori de multiplicare ale ADN-ului, este codificata de gena tumorala supresoare-TP53. Proteinele mutante p53 au fost descoperite in liniile celulare murine, iar translocatiile Bcl-2 in limfomul folicular uman. ) Proteina p53 a fost descoperita initial ca o proteina (ulterior fiind descrisa si gena TP53) cuplata la nivelul antigenului T in celulele infectate cu virusul simian 40 (SV40) , infectia cu acest virus producand tumori la soarece [154-158]. Desi initial s-a crezut ca gena TP53 are functie oncogena datorita expresiei crescute in diverse tumori, ulterior in 1989 s-a demonstrat ca gena p53 cu exprimare crescuta in diverse tumori este de fapt o varianta mutata a genei TP53 ce codeaza proteina normala p53 [83-84].

Proteina p53 este codata de gena TP53 ce este localizata la nivelul bratului scurt (p) al cromozomului 17 in pozitia 13.1, mai exact la nivelul de la perechilor de baze 7,668,401 pana la 7,687,549 (17p13.1:7,668,401-7,687,549) [84] , fiind alcatuita din 20.000 de perechi de baze azotate. Gena TP53 codifica proteina p53 ce cuprinde 393 aminoacizi (AA), cu o greutate moleculara de 53 kDa ce este impartita in trei domenii [159,160].

-regiunea amino terminala -NH2 (AA 1-100);

-regiunea centrala "core" (AA 100-300) ce contine zonele de legatura cu ADN-ul si reprezinta zona unde se gasesc majoritatea mutatiilor;

-regiunea carboxi-terminala -COOH (AA 320-260);

Expresia proteinei p53 poate fi crescuta ca raspuns la diversi factori de stres celulari (cum ar fi ADN-ul denaturat, hipoxia sau expresia aberanta a oncogenelor), pentru a creste controlul asupra diverselor procese celulare (de reparare ADN, de control a punctelor cheie ale ciclului celular,de control a procesului de senescenta celulara, control a apoptozei) [162].

Ca si consecinta, inactivarea p53 conduce la o serie de anomalii in controlul punctelor cheie ale ciclului celular, la instabilitate genomica si la cresterea supravietuirii celulare pana la "nemurire celulara", in acest mod fiind permisa proliferarea celulelor mutante [162].

Atat inactivarea cat si activarea cronica in exces a proteinei p53 reprezinta un element nociv si se asociaza cu diverse afectiuni. Activarea in exces a p53 a fost asociata cu o varietate de afectiuni degenerative cum ar fi artrita, scleroza multipla, neuropatia), exacerbarea leziunilor ischemice [164]. Studiile pe modele animale (soareci) evidentiaza ca stimularea acuta a p53 creste incidenta efectelor adverse ale tratamentului citostatic, in timp ce stimularea cronica a p53 este implicata in procesul de imbatranire [162,163,164] . Aceste observatii implica ca activitatea proteinei p53 trebuie atent controlata, inhibarea sau stimularea in exces putand conduce la diverse afectiuni [164] (figura3.1).

Figura 3.1.Rolurile proteinei p53.

Functiile biologice ale p53 se exercita prin intermediul reglarii transcriptionale ale genelor tinta el mentinand echilibrul intre membrii familiei Bcl2 (proapoptotici-Bax, Noxa, Puma sau antiapoptotici-Bcl2, Birc5) controlul expresiei receptorilor mortii (“death receptors”), aceste fenomene regland activitatea caspazelor. In acest fel proteina p53 poate fi perceputa ca un centru reglator complex (crucial decision-maker molecule) ce controleaza procesele de repaus al ciclului celular, apoptoza (functie proapoptotica) , senescenta, reparare ADN si de metabolism [165 ] . Implicarea in apoptoza a p53 este un proces extrem de important deoarece el previne proliferarea celulelor ce poarta potentiale mutatii si alterari ADN si previne astfel aparitia tumorilor(in figura). Aparitia unor mutatii activeaza gena p53 cu stabilizarea proteinei p53 ce induce intrarea celulei in repaus prin transactivarea p21CIP1/Waf1 ce va conduce la inhibarea ciclin-dependent-kinazelor (CDK) si intrarea in repaus a celulei in ambele puncte de tranzitie G1/2 si G2/M ale ciclului celular [166]. Intrarea in repaus a celulei permite proteinei p53 sa corecteze mutatiile ADN [166]. Daca repararea ADN nu se poate face in mod corect, p53 initiaza procesul de apoptoza celulara [166].

Concentratia intracelulara a proteinei p53 este crescuta prin mai multe mecanisme: 1.cresterea transcriptiei p53; 2. cresterea acumularii intra-nucleare a formei active a p53; 3.cresterea exportului extra-nuclear de Mdm2 (Mourine Double Minute 2); 4.modificari post-translationale ale p53 si ale reglatorilor sai; 5.cresterea nivelului citosolic a p53 6.fenomenul de "down regulation" al Mdm2-Mdmx (Mourine Double Minute x ) [167-178].

Proteina p53 stimuleaza apoptoza prin mai multe mecanisme ce implica: Bcl-2 (B-cell Lymphoma 2), BAD (Bcl-2 associated death protein), BAX (Bcl-2 associated X-protein), PUMA (p53-upregulated modulator of apoptosis) si TIGAR (TP-53 induced glycolysis and apoptosis regulator proteins) [167-178].

Proteina p53 influenteaza in mod dual (inhibare sau stimulare) autofagia prin intermediul unor reglatori: mTOR (mammalian target of rapamycin) AMPK (activated protein kinase), TSC2 (tuberous sclerosis protein)[173] .

P53 este capabil sa influenteze fenomenul de apoptoza sau autofagie prin intermediul unor proteine ce favorizeaza autofagia cum ar fi AMPK, DAPK-1 (death associated protein kinase 1), si DRAM (damage-regulated autphagy modulator) [179].

3.5. Relatia p53-Bcl2

Gena supresoare tumorala TP53 si gena Bcl-2 sunt printre primele gene identificate ca fiind asociate cu neoplaziile.

Desi, avand aceasta caracteristica comuna (asocierea cu cancerul), initial s-a crezut ca intre cele doua gene nu exista o legatura, p53 fiind considerata a fi implicata in activarea punctelor cheie de control ale ciclului celular si intalnita in tumorile solide iar Bcl-2 in a inhiba apoptoza si intalnita in tumorile hematopoietice [180]

Studiile recente au aratat o stransa conexiune genetica si biochimica intre aceste doua proteine cu un rol fundamental in biologia cancerului.

Conexiunea p53-Bcl2 implica mai multe mecanisme:

-inducerea directa a transcriptiei Bax de catre p53 ce poate contracara efectele antiapoptotice Bcl-2 (Miyashita T and Reed JC ,1995) [celulele cu deficit de expresie a Bax avand rezistenta la stimuli cunoscuti ca si promoteri ai apoptozei p53 dependente [180,181].

– actiunea p53 prin reglarea transcriptionala directa a subfamiliei Bcl-2 de proteine proapoptotice cu domeniul "BH3" ce includ: Puma, Noxa si posibil Bid (aceste proteine actionand prin cresterea expresiei Bax ce induce activarea proteinelor proapoptotice Bcl-2 cu secvente comune "BH1-BH4 [180,182].

-legarea proteinelor p53 citoplasmatice de familia Bcl-2 a proteinelor proapoptotice conduce la permeabilizarea mitocondriei si apoptoza (p53 actionand ca o proteina Bcl2 de tip "BH3").

Domeniul ADN de legare al p53 este necesar pentru interactiunea directa p53-Bcl2, iar p53 mutante tumorale ce prezinta modificari ale domeniilor ADN de legare a p53 pot avea dereglate si legarea de proteinele Bcl-2 [180,183].

CAPITOLUL 4

Notiuni si actualitati in Diabetul Zaharat.

2.1.Defintia Diabetului Zaharat

DZ este o afectiune complexa, heterogena, avand o componenta ereditara si de mediu, cu debut insidios si o perioada preclinica lunga ce se caracterizeaza prin alterari ale metabolismului ( glucidic, lipidic, proteic) si un deficit de secretie si/sau o actiune ineficienta a insulinei la nivelul tesuturilor tinta, tradusa prin modificari clinico-paraclinice, cat si prin modificari structurale si functionale la nivelul diverselor tesuturi.

2.2.Diagnosticul tulburarilor de glicoreglare la adult

Diagnosticul DZ se realizeaza fie pe baza glicemiei a jeun, fie HbA1c fie a valorilor glicemiei la 0, si 2h post TTGO (tabelul ).Se impun cateva observatii legate de criteriile de diagnostic ale DZ.TTGO se realizeaza conform protocolului OMS utilizand 75 g glucoza anhidra dizolvata in apa. De mentionat ca in cazul diagnosticul prin HbA1c trebuie utilizata o metoda certificata NGSP si standardizata conform protocolului DCCT. Glicemia a jeun se defineste ca absenta aportului caloric pentru cel putin 8h. In absenta unui rezultat inechivoc rezultatele se confirma prin repetarea testului. Se utilizeaza aceleasi teste pentru screening si pentru diagnosticul DZ [184]

Tabel 2.1.Criteriile de diagnostic a tulburarilor de glicoreglare.[184].

2.3.Clasificarea DZ

Functie de etiologie DZ se clasifica in urmatoarele 4 categorii majore[185]:

1.DZ tip 1 ce se caracterizeaza prin deficit absolut de insulina datorita distrugerii celulelor β prin mecanisme autoimune sau idiopatice.

2.DZ tip2 ce se caracterizeaza printr-un deficit relativ de insulina, progresiv pe fondul prezentei rezistentei la insulina.

3.DZ gestational ce este definit prin prezenta DZ in timpul trimestrului II sau III de sarcina (de mentionat ca modificarile glicemice prag pentru diagnosticul DZ gestational sunt diferite de cele ale DZ diagnosticat la adult astfel: glicemia a jeun ≥ 92 mg/dl, *≥180mg/dl la 1h sau *≥153 mg/dl la 2h); *post TTGO cu 75g glucoza anhidra, cu minim 8h post alimentar.

4.DZ de cauza specifica, datorita unui anumit agent etiologic: defecte genetice ale functiei β celulare (MODY1-6, ADN mitocondrial, etc), defecte ale actiunii insulinei (Leprechaunismul,sindrom Rabson-Mendenhall,insulinorezistenta tip A etc), anumite afectiuni ale pancreasului exocrin (neoplazii,pancreatite,traumatisme, fibroza chistica etc ), asociat endocrinopatiilor (sindrom Cushing, Hipertiroidism, Acromegalie, Feocromocitom, Somatostainom etc) , indus medicamentos sau chimic (Glucocorticoizi, hormoni tiroidieni, diazoxid,vacor, pentamidina etc.) , forme atipice de DZ mediat imun (sindromul barbatului rigid, anticorpii antireceptori insulinici etc), infectii (rubeola congenitala, citomegalovirus etc ) si alte sindroame genetice asociate uneori cu DZ (Down, Klinefleter, Turner, Wolfram, Prader-Willi, Laurence-Moon-Biedl, ataxia Friedreich etc).

2.4.Fiziopatologia si evolutia naturala a DZ tip2.

Istoria naturala a DZ tip2 este marcata de o etapa clinica indelungata, initiata cu mult anterior diagnosticului clinic al DZ. Se observa ca inca din stadiul de TNG exista o crestere a rezistentei la insulina(ce are ca efect o crestere compensatorie a secretiei de insulina) insa cu o scaderea a functiei celulelor β. Pe masura ce toleranta la glucoza se altereaza si evolueaza spre stadiul de TAG (GPP si GAJ) insulinorezistenta se amplifica (desi apar anomalii in secretia de insulina , aceasta poate compensa inca ritmul de crestere al insulinorezistentei) . In momentul debutului DZ aproximativ jumatate din masa de celule β sunt distruse, iar insulinorezistenta atinge un punct maximal (insotita de cresterea secretiei de insulina compensatorie maximala) pana ce se va stabiliza intr-o faza de platou . Tot in aceasta perioada se remarca si scaderea sensibilitatii la insulina a hepatocitului cu stimularea productiei hepatice de glucoza, cu o crestere progresiva pana intr-o faza de platou in care se va mentine ulterior. Din acest moment secretia de insulina va scade progresiv, initial se va mai mentine inca la un nivel adecvat (faza de platou), ulterior insa in perioadele tardive ale evolutiei, aceasta va necesita compensare prin administrare exogena de insulina, DZ devenind insulinonecesitant [186].

De remarcat ca pe intreg stadiul de evolutie al anomaliilor asociate DZ, efectul incretinic scade progresiv suprapunandu-se practic cu scaderea functiei secretorii β celulare, ce are ca si efect o mai slaba stimulare a secretiei de insulina. In DZ tip 2 cresterea secretiei de insulina este relativa (pseudohiperinsulinism, astfel insulinemia este insuficient crescuta raportat la valoarea glicemiei, comparativ cu secretia unei persoane cu TNG pentru aceeasi valoare a glicemiei)[186-187].

Figura 4.1.Etiopatogenia si istoria naturala a DZ tip2.

Pe langa cresterea glicemiei, DZ tip2 se caracterizeaza prin : scaderea captarii de glucoza la nivel muscular datorita insulinorezistentei musculare; stimularea productiei hepatice de glucoza datorita cresterii rezistentei la insulina a hepatocitului; cresterea AGL datorita rezistentei la insulina a adipoctului; distrugere β celulara progresiva; hiperglucagonemie si cresterea sensibilitatii hepatice la glucoza, alterarea efectului incretinic, disfunctie la nivelul neurotransmitatorilor cu inhibarea supresiei apetitului si favorizarea castigului ponderal; rezistenta la insulina; hiperglicemie [187]

Contributia insulinorezistentei si a deficitului de secretie insulinica in fiziopatologia DZ tip 2 este inca un subiect larg dezbatut in literatura de specialitate. Insulinorezistenta (IR) precede deficitul de secretie insulinic (Reaven1988), insa rezistenta la insulina singura nu poate explica hiperglicemia din diabetul zaharat. IR este o caracteristica heterogena fiind intalnita atat la persoanele sanatoase (aproximativ 25%), cat si in obezitate, dar si la pacientii nediabetici cu hipertensiune arteriala sau modificari ale spectrului lipidic. La persoanele nediabetice care asociaza IR exista o secretia compensatorie de insulina din celulele β pancreatice, ce mentin glicemia in limite normale [188].

2.5.Complicatiile diabetului zaharat

DZ favorizeaza aparitia multiplelor complicatii la nivelul intregului organism cu o predominanta crescuta la nivelul sistemului vascular (micro sau macro-vascular).

Pe aceasta lista putem include insa si o complicatie redutabila a DZ- oncopatia diabetica datorita, riscului crescut al diabeticilor pentru aparitia anumitor tipuri de cancer.

Studiul lui Liao WC et al. publicat in 2015 in British Medical Journal a evidentiat ca exista o puternica corelatie lineara de tip doza-raspuns intre cresterea glicemiei bazale si cresterea incidentei cancerului de pancreas, de-a lungul intregului spectru glicemic atat din domeniul prediabetului cat si a diabetului zaharat (DZ)[1]. Astfel, fiecare crestere a glicemiei bazale de 0.56mmol/l (10.08mg/dl) s-a asociat cu o crestere de 14% a incidentei cancerului de pancreas [189].

CAPITOLUL 5

AXA INSULINA IGF

5.1.Descrierea axei insulina-IGF. Fiziologia secretiei de insulina.

Axa insulina-IGF este alcatuita din insulina si receptorul specific insulinic cu cele 2 izoforme (IR-A si IR-B) si familia mai complexa IGF ce cuprinde cei 2 liganzi IGF1 si IGF2, cei 2 receptori membranari IGF-1R, IGF-2R ce mediaza actiunea liganzilor IGF1 si IGF2, si cele 6 proteine de legatura cu afinitate inalta (IGFBP 1-6) ce moduleaza actiunea IGF prin reglarea biodisponibilitatii lor. Axa insulina-IGF regleaza metabolismul glucozei si exercita efecte proliferative celulare[190-193]

Numeroase studii epidemiologice au corelat nivelul plasmatic crescut sau expresia tumorala a reprezentantilor axei insulina/IGF (insulina, peptid C ,IGF1 , IGF-2, IGF1R,IR, IR-A, HR-A, IR-A:IR-B) in diverse forme de cancer [193-218].

Insulina (descoperita in 1921 de N Paulescu) este sintetizata si secretata de celula β de la nivelul insulelor Langerhans din pancreas printr-un proces complex. Insulele Langerhans (aproximativ 800.000-1.200.000) constituie pancreasul endocrin ce reprezinta numai 1-2% din masa totala a pancreasului[219]. Insulele Langerhans sunt constituite in mare parte din celule β (aproximativ 70%) iar restul este constituit din celule α secretoare de glucagon (hiperglicemiante), celulele secretoare de somatostatina, si celulele PP ce secreta polipeptidul pancreatic. In mod fiziologic insulina este unicul hormon hipoglicemiant din organism.

Insulina (C257H383O65S6Zn) este o proteina mica cu o greutate moleculara de 5744 Daltoni si prezinta o structura primara (2 lanturi A si B unite prin doua punti disulfidice), secundara (structura helicoidala cu 2 regiuni in lantul A si 1 regiune in lantul B) si o structura tertiara (formarea dimerilor si hexamerilor)[220].

Insulina este sintetizata in ribozomii celulei β sub forma unei molecule de 110 AA, preproinsulina (codificata de gena de la nivelul CR11). Preproinsulina este alcatuita din 110 AA si contine 3 fragmente distincte: peptidul semnal de 24 AA, peptidul C de 31 AA si insulina de 51 AA si 4 AA de legatura (pozitiile 31,32,64,65)[219,220].

Secretia fiziologica de insulina (bazala si stimulata) este discontinua, avand un caracter oscilatoriu si pulsatil, in DZ caracterul oscilatoriu si faza precoce a rasunsului insulinosecretor fiind afectate. In 24h se secreta aproximativ 45-50U insulina corespunzand unui numar de aproximativ 1012 VS . Procesul de secretie este unul extreme de complex si este controlat de factori multiplii: glucoza-cel mai important secretagog de insulina fiziologic (inchide canalele de KATP cu influxul de Ca in celula), AA ( leucina, lizina, arginina), AGL, anumite medicamente (SU, salicilati, glucocorticoizii, diuretice ce elimina K, β blocante etc) si factori neurohormonali complecsi [219,220]

Receptorul de insulina si IGF1R alaturi de receptorul “orfan” IRRR (insulin receptor related receptor) apartin membrilor familiei de receptori tirozinkinazici (RTK), sunt produsi de gene diferite si actioneaza prin intermediul IRS (familia substratului receptorului de insulina) avand o structura tetramerica compusa din 2 subunitati α-extracelulare (locul de legare al liganzilor) a si 2 subunitati β (cu activitate tirozin-kinazica, locul de activare IRS) transmembranare unite prin punti disulfidice. Receptorul IGF1R si IR prezinta secvente comune in proportie de aproximativ 45-65% [ 193] .

Spre deosebire de IGF1R, receptorul de insulina prezinta 2 izoforme functie de prezenta exonului 11, pentru izoforma IR-B el codand o secventa de 12 AA la nivelului C terminal al lantului α al RI. IR-B se gaseste in principal in tesuturile tinta ale insulinei (in tesutul adipos, la nivel hepatic si muscular). Izoforma tip A (IR-A) se gaseste in tesuturile non-clasice de actiune a insulinei: cerebral, limfocitar, splina, tesustul embrionar si tesutul tumoral malign. IGF1R se gaseste ubiquitar dar si in tesutul neoplazic.IGF2 se poate lega de IGF2R, ce nu detine activitate enzimatica si participa la inactivarea IGF2 [192-194].

Celulele ce coexprima la suprafata lor IR si IGF1R pot forma receptori hibrizi ( dimeri –holoreceptorii sunt rezultati din asamblarea a cate unei jumatati de receptor reprezentat de un monomer diferit – de la IR-A/B si/sau IGF1R ). Celulele tumorale au o expresie crescuta a IGF1R, IR-A si a receptorilor hibrizi de tip IGF1-R/IR-A [figura 5.1, tabelul 5.1].

Figura 5.1 Familia receptorilor IR/IGF1R. Adaptat dupa : Pollak M [221]

Tabel 5.1 Expresia familiei insulina/ IGF in cancer. Adaptat dupa Belfiore [222]

Hiperglicemia postprandiala determina depolarizarea celulei β si secretia de insulina prin urmatoare succesiune de evenimente: glucoza aflata in exces postprandial este captata prin difuzie pasiva prin GLUT 2 la nivelul celulei β unde este fosforilata de catre glucokinaza (hexokinaza specifica a celulei β) la G6P devenind metabolic activa si ramanand captiva intracellular. Ulterior pe calea glicolizei aerobe (36/38 ATP) va produce o cresterea nivelului de ATP si implicit cresterea raportului ATP/ADP de la nivelul celulei β. Cresterea acestui raport va produce inhibitia canalului de KATP (kalium inword rectified) (ce mentine polaritatea celului β prin eflux de ioni K) prin legarea ATP la subunitatea KIR6.2 (diferit de legarea SU ce se leaga de SUR1 si actioneaza asemanator glucozei) fenomen ce va initia influxul de Ca, depolarizand membranei celulei β si secretia de insulina [220].

Insulina isi exercita efectele metabolice prin intermediul IR-B astfel: activeaza glicoliza si inhiba gluconeogeneza (hepatica si renala), favorizeaza depozitarea excesului de glucoza sub forma de glicogen (glicogenogeneza hepatica si musculara) inhiband glicogenoliza; la nivelul metabolismului lipidic: inhiba lipogenoliza (β-oxidarea acizilor grasi, inihiba sinteza si creste eliminarea corpilor cetonici la nivel hepatic) si activeaza lipogeneza (atat hepatic prin cresterea sintezei de AG dar si adipocitar prin cresterea expresiei LPL adipocitare); proteic: are efect anabolizant prin cresterea sintezei de AA [220].

Defectul fiziopatologic central in DZ tip2, sindromul metabolic (SM) si obezitate este dereglarea axei insulina-factorul de crestere insulinic de tip1 (IGF1) ce are la baza rezistenta la insulina. Hiperinsulinemia isi exercita efectele fie direct , fie prin scaderea activitatii Insulin-like growth factor-binding protein 1 si 2 (IGFBP1, IGFBP2) ce conduce la cresterea biodisponibilitatii IGF1 liber [223,224]. Insulina si IGF1 actioneaza prin intermediul familiei de receptori de tip tirozin-kinazici , prin receptorul de insulina (RI) respectiv receptorul IGF1 (IGF-1R). Legarea liganzilor la nivelul lantului alfa al receptorilor produce o modificare conformationala la nivelul lantului beta ce va creste activitatea kinazica a lantului β, fenomene ce vor declansa o cascada celulara de semnalizare extrem de complexa (doar in primele etape ale cascadei de semnalizare legare liganzilor putand genera peste 1000 de posibile interactiuni intre proteinele din caile de semnalizare datorat numarului mare de gene si izoforme specifice ale proteinelor) mediate de fosforilarea familiei receptorilor de insulina de substrat la nivelul rezidului tirozinic, aceste reziduuri devenind zone de andocare pentru diverse molecule din cascada de semnalizare[193]. Aceasta familie prezinta 11 membrii, 6 de tip IRS (IRS1-6 ce au distributie si functie specifica), Gab-1, p62dok, Cbl si izoformele Shc[5]. [190-223]. Insulina poate exercita efecte metabolice prin intermediul caii PI3K/AKT sau efecte mitogenice pe calea MAPKs (Ras/Raf/MEK/ERK), cele doua cai de semnalizare fiind intereconectate, ca apoi cele doua cai sa convearga pe o calea comuna mTOR/P70S6K [190-223].

Rezistenta la insulina presupune a asocia un defect in portiunea proximala a caii de semnalizare cu alterare a mecanismului de activare a PI3K/AKT cauzat de cresterea AGL si a citokinelor proinflamatorii ce vor afecta fosforilarea la nivelul serinei si treoninei a lantului β al IR si/sau fosforilarea IRS1 la nivelul rezidului serinei. Inactivarea selectiva a caii PI3K/AKT se asociaza cu cresterea semnalizarii pe calea MAPK, cu alterarea homeostaziei glucozei la nivelul tesuturilor tinta consecutiv cu cresterea stimularii proliferarii celulare in celelalte tesuturi [223-225].

Receptorul de insulina are doua izoforme, IR-A ce predomina in tesutul fetal si celula canceroasa si IR-B ce predomina in tesuturile tinta ale actiunii insulinei[5,6]. In tesuturile in care coexista, IR-A/B si IGF1-R avand structura omoloaga pot forma receptori hibrizi (IR-A/IGF1R formeaza HR-A si IR-B/IGF1-R formeaza HR-B, cu aceeasi eficienta) si pot lega atat insulina cat si IGF1 si IGF2 dar cu afinitate diferita. Receptorii hibrizi se formeaza prin heterodimerizarea hemireceptorilor RI-A/B respectiv IGF1-R si pot apare in diverse cancere [7,8,9]. Pe suprafata celulei canceroase exista o hipexpresie a IR-A si IGF1-R principala tinta a IGF1 fiind IGF1 R iar a IGF2 fiind IR-A si nu IGF1R, la pacientii hiperinsulinemici, insulina stimuland ambele izoforme ale IR-A si IR- B, dar in prezenta unui exces de IGF2, insulina stimuleaza predominant IR-B. Functie de expresia subtipului de receptor si de valabilitatea IGF1 si IGF2 local tumoral existand mai multe posibilitati de legare astfel: Daca IGF1 R si IR-A sunt concomitent supraexpuse si IGF1 si IGF2 sunt prezente in concentratii echimolare , IGF1 se va lega de receptorii cu afinitatea cea mai mare respectiv IGF1-R si HR-A, iar IGF2 de IR-A deoarece legarea sa de IGF1R este inlocuita de legarea IGF1 [1]; daca concentratia IGF2 este crescuta se poate ca si IGF2 sa poata transmita partial prin IGF1R si HR-A pe langa cuplarea la IR-A[1]; daca IGF1 este predominant exista posibilitatea ca sa actioneze si pe IR-A dar cu afinitatea joasa [1]. HR-A leaga preferential IGF1 si IGF2 si insulina in ordinea IGF1>IGF2>insulina iar HR-B leaga predominant IGF-1>IGF2 nu si insulina , dar HR-A leaga cu afinitate mai crescuta IGF1-R decat HR-B [7,10] (tabelul 5.2) [223,227,228].

Tabel 5.2.Afinitatea liganzilor pentru receptorii IR/IGF1R. Adaptat dupa [ 223 ].

La nivelul tumorilor maligne pe langa hiperexpresia receptorilor (IR expresie crescuta dar IR-A este preponderant, IGF1-R, HR-A, receptori atipici IR, IGF1R) exista si fenomenul de cross-reactivitate intre diversele sisteme de semnalizare intracelulare: intre IR si IGF1R, intre IGF/insulina si oncogene (Her2, mtP53, C-myc, Erk1/2, HB virus X ), supresori tumorali (wtp53, PTEN, WT1, BRCA1), hormone steroidici (androgeni, estrogeni) si alti receptori tirozin kinazici( EGFR/Her2), toate acestea creand sisteme de interrelationare extreme de complexe la nivelul familiei insulinei/IGF in cancer[193].

Axa insulina/IGF este interconectata cu diverse sisteme moleculare:oncogene (Erk1,2;c-myc, mtP53), hormoni steoridici (androgeni, estrogeni) , supresori tumorali (WT p53,PTEN) si alti receptori tirozin-kinazici (EGFR,Her2, ER) ceea ce explica complexitate efectelor negative ale insulinorezistentei. Hormonii steroidici(androgeni si estrogeni) activeaza tirozin kinaza Src printr-un mecanism non-genotropic cu activarea kinazei reglatoare a semnalului extracellular (Erk1/2) si a PI3K. La nivel nuclear Erk1/2 va creste expresia genelor IGF-IR. Activarea IR sau IGF1R directa prin legarea liganzilor specifici sau interactiunea cu EGFR/Her2. La nivel nuclear efectorii (supresorii tumorali, oncogenele, estrogenii, PI3K/MAPK) vor interactiona cu componentele sistemului IGF/insulina fie prin stimulare fie prin inhibare a transcriptiei genelor sistemului IGF/insulina [193,223,228].

Hiperinsulinismul (Rezistenta la insulina) favorizeaza reactiile incrucisate(cross-talk) intre caile insulinei si caile IGF. Pacientii cu cancer ce asociaza hiperinsulinemie vor avea o alterare a semnalizarii fiziologice mediata de receptorii sistemului insulina/IGF ce vor activa in principal substratul caii mitogenice ce controleaza procesele de proliferare, apoptoza si migrare celulara., in defavoarea cailor metabolice (glicolizei). GH controleaza sinteza IGF1 si IGFBP3, iar insulina creste IGF1 atat direct cat si indirect prin reglarea GH si scaderea IGFBP1,2 (ce inhiba actiunea IGF1), hiperinsuliemia cronica asociindu-se cu nivele crescute de IGF1 liber si nivele scazute de IGFBP 1 si IGFBP2 Hiperexpresia IR-A favorizeaza semnalizarea mediata de IGF2, cu activitate mai mitogena comparativ cu insulina activand calea p70S6K si ERK [229].

Expresia crescuta a IR-A in tesutul embrionar si ulterior conversia acestora in IR-B sunt asociate cu procesul de diferentiere celulara.Expresia crescuta in cancer a IR-A si cresterea raportului IR-A si IR-B, respective IR-A:IGF1R se asociaza cu procesul de dediferentiere.Toate aceste date coroborate sugereaza ca expresia crescuta tisulara a IR-A favorizeaza procesul de dediferentiere iar expresia crescuta tisulara a IR-B favorizeaza procesul de diferentiere[ 229-231].

Exista numeroase molecule in studiu sau ca si potentiale terapii, ce actioneaza pe multiple cai patogenice: inhibitori IGF1-R/IR, anticorpi anti IGF1 si IGF2 , inhibitori specifici ale diverselor molecule din calea de semnalizare IR-A/IGF-2, modulatori ai IR-A, inhibitori ARN-IR-A insa cu rezultate modeste pana in acest moment [194]. O explicatie ar fi ca receptorii de tip tirozin-kinazic (in special IGF1-R si mai putin IR) pot interactiona cu diverse sisteme supresoare tumorale (wild type PTEN ce scade expresia IGF1-R) [194,232] dar si cu diverse oncogene (c-myc, Src) , hormoni steroidici (ER,estrogeni) sau alti receptori tirozi-kinazici (EGFR)[233-235] , ceea ce poate explica rezistenta la unele tratamente anticancer . O alta explicatie ar putea fi cresterea activitatii in calea mediata de IR (calea IRS1/Grb2/Erk/Akt [237] si cresterea expresiei IR-A [223,238] si/sau IGF2 , astfel celulele tumorale pot schimba calea IGF1/IGF1R (prin blocarea IGF1R) cu IGF2/IR-A pentru a mentine o activitate crescuta proliferativa de migrare si metastazare, astfel cancerele cu un raport crescut IR-A:IGF1R au o rezistenta crescuta la tratamentele anticancer [223].

CAPITOLUL 6

INTERRELATIA DIABET ZAHARAT-CANCER

4.1.Istoricul relatiei diabet zaharat- cancer

Diabetul zaharat si cancerul sunt doua boli cronice heterogene, avand o magnitudine epidemiologica crescuta cu o incidenta, prevalenta si morbiditate in crestere ce antreneaza costuri socio-economice ridicate (antrenand si o dimensiune socio-economica) Primele teorii ce au evidentiat o asociere intre diabetul zaharat, obezitate si cresterea riscului de aparitie a cancerului si a mortalitatii prin cancer au fost enuntate inca de la inceputul secolului trecut. Evidentele epidemiologice au corelat riscul crescut de cancer cu hiperglicemia inca din 1885, dar asocierea diabet zaharat-cancer a fost observata prima oara la inceputul secolului XX, mai exact in anul 1910 de catre Maynard [239,241]. Maynard a emis ipoteza asocierii DZ-cancer pe baza cresterii prevalentei a celor 2 afectiuni odata cu inaintarea in varsta [239,240]. El enunta: „Cancerul si diabetul-ambele boli au in mare masura aceeasi distributie pe grupe de varsta…Etiologia ambelor boli este obscura. Ambele fiind boli ale varstei inaintate…Daca exista un factor comun cauzativ in cresterea lor-trebuie descoperita o corelatie intre aceste boli ”[239,242]

Desi incidenta ambelor afectiuni creste odata cu varsta, studiile ulterioare au demonstrat o relatie independenta de varsta, intre prezenta diabetului zaharat si cresterea riscului de cancer.Studiile de pionierat efectuate pe modele animale de catre Morechi in 1909, Rous 1914 si Tannenbaum in 1940 au demonstrat ca restrictia calorica inhiba carcinogeneza [239]. Aceasta teorie este confirmata si de studii recente ce au evidentiat un risc crescut pentru anumite forme cancer la pacientii obezi. Concomitent studiile au evidentiat un risc crescut de cancer si la pacientii diabetici independent de IMC, denotand si alte mecanisme biologice potentiale [239].

In 1959 Joslin et al.declarau „Studiile de asociere intre diabet si cancer au fost efectuate pe o perioadă de ani , dar dovada unei asocieri pozitive rămâne neconcludenta”[243]

Intr-o analiza in 1971 Kesler a asociat prezenta DZ cu 2 tipuri de cancer si anume: pancreas, endometru si cu legaturi probabile cu cancerul de san, tiroidian, prostata, si cancerele hematologice[240]

Aceste date neconcludente se datoreaza atat prezentei factorilor de confuzie din diverse studii (obezitate, fumat, terapii hormonale), dar si datorate designului studiilor realizate pana in 1990. In ultimii 25 ani insa o serie de studii prospective de cohorta (Cancer Prevention Study II (CPS II),the Physicians’ Health Study and the Women’s Health Initiative(WHI) in the USA, the European Prospective Study into Cancer) ce au eliminat factorii de confuzie au evidentiat o incidenta crescuta a cancerului, dar si o mortalitate crescuta prin cancer la pacientii diabetici [241].

Chiar daca pentru DZ tip2 (90% din DZ) relatia cu cancerul este una solida pentru DZ tip1 evidentele sunt slabe si neconcludente.

Desi mecanismele de proliferare neoplazica si carcinogeneza sunt multifactoriale evidentele epidemiologice actuale in crestere sugereaza ca anomaliile metabolismului glucozei pot reprezenta un factor independent de risc pentru anumite tipuri de cancer atat ca incidenta cat si ca prognostic [242].

Relativ recent intr-un consens al ADA si a Societatii Americane de Cancer din 2010, s-a enuntat ca DZ tip2 se asociaza cu un risc crescut pentru anumite forme de cancer (colorectal, san, endometrial, ficat, pancreatic, si vezica urinara), insa fara o evidenta clara pentru alte tipuri cum ar fi leucemie, renal,esofagian[243]

Comparativ cu pacientii ce non-diabetici, pacientii diabetici prezinta un risc crescut de cancer dar si o mortalitate crescuta prin cancer

2.Interrelatia diabet zaharat-cancer

La nivel mondial exista o „explozie” a bolilor metabolice si a cancerului.Prevalenta comparativa a principalelor afectiuni din perioada 2012-2013 este redata in figura de mai jos.

Figura 6.1.Prevalenta mondiala a principalelor afectiuni onco-metabolice.

O multime de studii din literatura asociaza prezenta DZ cu cresterea riscului de neoplazie.O evaluare extina a acestei relatii pentru diverse tipuri de cancer este redata in rubrica anexe [244-325].

Bolile cronice reprezinta principala cauza de mortalitate la nivel mondial totalizand aproximativ 60% din totalul deceselor (figura 6.2).

Figura 6.2.Principalele cauze de mortalitate la nivel mondial.Adaptata dupa [384]

În literatura de specialitate se citeaza o multitudine de posibile mecanisme implicate in cresterea riscului de cancer la pacientul diabetic toate avand ca element central rezistenta la insulina. Numeroase studii epidemiologice au demonstrat ca DZ, obezitatea si sindromul metabolic se asociaza cu risc crescut pentru diverse forme de cancer –factorul comun al acestor afectiuni fiind hiperinsulinismul compensator, consecinta cresterii rezistentei la insulina dar la care se asociaza si inflamatia cronica subclinica.

Hiperglicemia reprezinta trasatura patognomonica atat a DZ1 cat si a DZ2. Hiperglicemia influenteaza atat prin mod direct cat si indirect dar si prin modularea epigenetica a diverselor aspecte ale carcinogenezei cum ar fi proliferarea, apoptoza si metastazarea. Mecanismele indirecte sunt cresterea insulinemiei si cresterea biodisponibilitatii IGF1 liber, dar si a nivelului de citokine proinflamatorii, iar cele directe si epigenetice includ stimularea prelungita a diverselor cai de semnalizare interconectate ce controleaza comportamentul biologic al celulelor tumorale cum ar fi: procesul de proliferare, migratie si invazie, dar si de recurenta. Majoritatea studiilor s-au axat asupra factorilor mitogenici (insulina si IGF1), si a factorilor inflamatori si mai putin asupra modului in care hiperglicemia influenteaza aceste cai de semnalizare. Astfel acest nou domeniu al efectelor hiperglicemiei si a memoriei hiperglicemice asociate, este inca relativ neexplorat, iar elucidarea acestor mecanisme ar putea contura conexiunile moleculare dintre DZ si cancer si ar putea decela (releva) noi solutii terapeutice[326]. Hiperglicemia contribuie la formarea fenotipului malign al celulei neoplazice prin mai multe mecanisme (vezi tabel).Hiperglicemia stimuleaza proliferarea si rezistenta la apoptoza , invazia vasculara si metastazarea, invazia perineurala si rezistenta la chimioterapie.

Tabel 6.2. Impactul hiperglicemiei asupra comportamentului biologic al celulei neoplazice (tumorale). Adaptat dupa [326,327]

In DZ, AGE se formeaza in exces concomitent cu cresterea stresului oxidativ. Exista o interelatie intre sistemul AGE-RAGE si stresul oxidativ. Cuplarea AGE la RAGE stimuleaza generarea de ROS si creste stresul oxidativ, iar stresul oxidativ la randul sau stimuleaza formarea AGE concomitent cu cresterea RAGE [327].

Cancerul reprezinta a doua cauza de mortalitate in lume, dupa bolile cardiovasculare. Prevalenta cancerului si a bolilor cardiovasculare se afla intr-o continua crestere la nivel mondial iar incidenta diabetului zaharat, a obezitatii si a sindromului metabolic a crescut exponential in ultimii 25 de ani.

Pacientii diabetici prezinta un risc moderat de a dezvolta diverse forme de cancer (cancerul colorectal, de san, uterin si de pancreas) dar prezinta un risc mai crescut de a dezvolta boli cardiovasculare (DZ tip 2 fiind considerat echivalent de boala cardiovasculara). Pe langa acest risc de a dezvolta aceste doua afectiuni cu potential fatal, pacientii diabetici prezinta si un risc crescut de mortalitate atat prin cancer, cat mai ales prin boli cardiovasculare (diabeticii avand acelasi risc de moarte prin boli coronariene [infarctul de miocard, angina pectorala si modificarile ischemice ECG] ca si pacientii non-diabetici ce au suferit un infarct miocardic, atat in cazul femeilor cat si in cazul barbatilor) [328].

Diverse studii observationale au cuantificat gradul de risc comparativ de aparitie sau de deces prin cancer, respectiv boli cardiovasculare, prezenta DZ fiind asociata cu o crestere moderata (RR=1.25) a riscului de aparitie al cancerului comparativ cu bolile cardiovasculare cu un risc mult mai crescut (RR=2.32) [329].

Acest risc echivalent se explica atat prin prezenta anomaliilor specifice DZ, cat mai ales asocierea sa cu multiple comorbiditati intricate cum sunt obezitatea si sindromul metabolic ce pot induce si/sau accelera procesul de carcinogeneza si ateroscleroza. Modificarile clinice si paraclinice associate includ: hipertensiunea arteriala, dislipidemia (cresterea colesterolului total, a trigliceridelor, a LDL colesterolului, a non HDL colesterol, a apolipoproteinei B, a particulelor mici si dense LDL si prin scaderea HDL cholesterol si a apoliproteinei A1), hiperinsulinismul cu cresterea biodisponibilitatii IGF1, hiperglicemia, sindromul inflamator (ce se asociaza la randul sau cu un status protrombotic crescut, disfunctie endoteliala si cresterea markerilor infamatori) , tulburarile hormonale (hipersecretie de leptina si scaderii de adiponectina; cresterea nivelului de estrogen si scaderea de testosteron) [328,330].

Acesti factori de risc ce se potenteaza reciproc in grade variabile vor forma un fond comun, ce va produce modificari la nivel clinic, hormonal si molecular. Toate aceste fenomene explica interelatia complexa si varietatea diverselor forme clinice ale acestor sindroame. Exista o relatie de interdependenta intre diabetul zaharat, sindromul metabolic si obezitate avand ca element fundamental rezistenta la insulina si sindromul inflamator sublinic, ce constituie elementul fiziopatologic central al multor afectiuni.

Diabetul zaharat poate fi considerat ca o afectiune “deghizata” datorita caracterului insidios descrisa intr-un limbaj plastic de K Masur in cartea intitulata “Diabetes and cancer.Epidemiological evidence and Molecular links” ca si “lupul in haine de oaie” [331] datorita faptului ca in momentul diagnosticului DZ, o parte din pacienti pot avea deja o boala cronica constituita la nivel clinic sau subclinic , cum sunt bolile cardiovasculare sau anumite forme de cancer. Diagnosticul tardiv al DZ datorita caracterului insidios face ca intreaga pleiada de factori de risc si comorbiditati asociate sa poata actiona la nivel molecular, subclinic o perioada variabila de timp pana la diagnostic, in care sa favorizeze aparitia diverselor complicatii. Diagnosticarea ulterioara a DZ, functie de gradul de control glicemic ulterior diagnosticului va favoriza suplimentar atat afectiunile cronice deja preexistente diagnosticului cat si aparitia lor in cazul in care ele nu exista deja. Astfel, mediul diabetic va initia si/sau accelera procesele fiziopatologice subiacente specifice afectiunilor cronice (cancerului si BCV), cu cresterea incidentei si mortalitatii acestor doua afectiuni intr-o masura variabila functie de terenul genetic si de gradul de control glicemic ulterior [331].

Prezenta diabetului zaharat si a comorbiditilor asociate creste riscul de aparitie a evenimentelor cardiovasculare si de progresie a bolilor cardiovasculare deja diagnosticate, predispunand si la o alta afectiune letala, boala neoplazica. Datorita acestor efecte cu risc de morbiditate si mortalitate ridicat, diabetul zaharat trebuie tratat cu maxima atentie si importanta, printr-o abordare multifactoriala cu tratarea tuturor factorilor de risc asociati. Tratamentul adecvat hipoglicemiant (ADO, insulina sau derivati injectabili) bazat pe individualizarea schemei terapeutice, pe langa clasica preventie a bolilor cardiovasculare trebuie sa tina cont in alegerea schemei terapeutice optime si de posibila preventie a aparitiei cancerului. Astfel trebuie analizate mecanismele moleculare de actiune ale antidiabeticelor , datorita riscului crescut de cancer pentru anumite subseturi de pacienti diabetici. Controlul metabolic slab al DZ si prezenta cronica a hiperglicemiei va favoriza aparitia atat a complicatiilor specifice DZ cat si a anumitor forme de cancer si printr-un mecanism ce implica sistemul imun [329].

Relatia DZ-cancer este una extrem de complexa :exista factori de risc generali ce actioneaza pe cai metabolice, hormonale si moleculare variabile favorizand riscul de aparitie al tumorilor maligne in general (figura 6.3) , si specifici raportati la comorbiditatile ce afecteaza majoritatea pacientilor diabetici. Comparativ cu cei generali, factorii de risc specifici vor actiona atat independent cat si in mod aditiv , crescand posibilitatea aparitiei, pentru anumite forme de cancer (vezi tabel parte speciala cap 1.discutii). (in cancerul colorectal datorita prezentei neuropatiei diabetice,cancerului hepatic- steatozei hepatice dar si infectiei cronice cu virus C ce favorizeaza atata aparitia DZ cat si a cancerului hepatic, cancerul de prostata-scaderea nivelului de TST).

Dislipidemia

Prevalenta anomaliilor lipidice in DZ tip2 este foarte crescuta.Fenotipul LDL intens aterogen caracterizat prin crestere LDLc, CT, TG si scadere HDL este caracteristic DZ tip2. O serie de studii au evidentiat relatia cancer-modificari ale spectrului lipidic.Atfel in general un nivel crescut de colesterol total dar scazut de HDL s-a dovedit a avea un efect protector, iar LDL s-a dovedit a fi un factor de risc [332-340].

Figura 6.3. Factorii de risc generali specifici DZ tip2 si mecanismele potentiale implicate in carcinogeneza. Adaptat dupa [3,6] In figura sunt redate principalele cai metabolice interrelationate si mecanismele potentiale implicate in procesul de carcinogeneza ( atat in initiere cat si in progresie) la pacientii diabetici.[ 243,329]

AG de tip saturat au actiune proinflamatorie in diverse tesuturi stimuland insulinorezistenta ( macrofage, adipocite, hepatocite, miocite) prin eliberarea de citokine prin intermediul cailor IKKβ/NFκB and JNK1/AP1, Tlr4 si/sauTlr2.In mod contrar AG cu lant lung polinesaturati de tipul DHA sau EPA exercita efecte anti-inflamatorii prin intermediul familiei de receptori PPAR(PPARα or NR1C1, PPARβ/δ or NR1C2, and PPARy or NR1C3) [341,342].

Diverse enzime (ciclooxigenazele (COX), lipoxigenazele (LO), epoxigenazele/enzimele citocromului (CYP)/P450s si lipaza)  utilizeaza AG pentru producerea de liganzi PPAR. Cuplarea acestor liganzi PPAR la receptorul specific PPAR (proces mediat de familia de proteine cytoplasmic fatty acid binding proteins (FABPs)) va induce raspunsuri reglatorii in mecanismele homeostatice energetice celulare, procesul inflamator si in apoptoza, proliferarea si diferentierea celulelor tumorale. Pentru controlul acestor fenomene extrem de complexe familia PPAR interactioneaza cu diverse cai de semnalizare, cum ar fi calea COX2, NF-κB, MAPKs sau PTEN[341-342].

Hiperglicemia.Prediabet

Riscul de cancer in DZ creste direct proportional cu valoarea glicemiei. Studiul lui Liao WC et al. publicat in 2015 in British Medical Journal a evidentiat ca exista o puternica corelatie lineara de tip doza-raspuns intre cresterea glicemiei bazale si marirea incidentei cancerului de pancreas, de-a lungul intregului spectru glicemic atat din domeniul prediabetului ,cat si a diabetului zaharat (DZ)[1]. Astfel, fiecare crestere a glicemiei bazale de 0.56mmol/l (10.08mg/dl) s-a asociat cu o marire de 14% a incidentei cancerului de pancreas [343].

Cresterea stresului oxidativ (SO) joaca un rol important in patologia umana. Un nivel normal al SO exercita efecte fiziologice fiind implicat in reglarea diverselor cai de semnalizare ale celulei, dar cand este in exces poate produce modificari ale macromoleculelor (lipide, proteine, ADN). O cantitate importanta de ROS este produsa la nivel mitocondrial (aproximativ 2% din cantitatea de O2 din procesul de fosforilare oxidativa devine superoxid) avand ca sursa majora lantul transportor de electroni (complexul I si III). Speciile reactive de oxigen isi exercita efectele prin actiune directa sau prin actiunea factorilor clastogenici cu durata lunga de viata si sunt implicati intr-o serie de afectiuni : carcinogeneza, accelerarea imbatranririi si alte procese degenerative. Initial in anumite forme de cancer (prostata) s-a descoperit o crestere a activitatii respiratorii ce va induce o marire considerabila a productiei de ROS cu cresterea mutatiilor ADN si compromiterea functiei respiratorii ce poate favoriza initierea si promotia procesului de carcinogeneza [344-345].

SRO cuprind peroxid de hidrogen (H 20 2) ,superoxid ( O2-), hidroxil inalt reactiv (OH-) produsi in mitocodondrie sau de NADPH oxidaze si au proprietati mutagenice.

Superoxid-dismutaza catalaza

O2- H2O2- H20 +O

Cresterea ROS poate induce inactivarea PKM2 (si derivarea glicolizei pe calea pentozofosfatilor pentru generarea de NADPH si reducerea glutationului intr-un atntioxidant potent), stabilizarea HIF1 cu inactivarea HIF1 ce va activa gena PDK1, 6FFK2/F2,6bifosfataza4 (PFKFB4) care vor converge glicoliza pe calea PPP, cu cresterea nivelului NADPH si titrarea ROS; hipoxia induce activarea glicolizei prin activarea PFKFB3 ce are actiunea antagonica cu PFKFB4 [344-345].

Excesul energetic (caloric) se asociaza cu un risc crescut pentru cancer, iar restrictia prin reducerea stresului oxidativ mitocondrial. cu un risc scazut.

Citokinele proinflamatorii

Inflamatia poate fi definita ca un raspuns fiziologic de restabilire a homeostaziei la actiunea diversilor factori. In mod contrar, o stare de inflamatie cronica sau un raspuns inflamator excesiv au efecte patologice, stimuland aparitia bolilor cardio-vasculare dar si carcinogeneza.

Excesul ponderal, supraponderea cat mai ales obezitatea se asociaza cu un status inflamator cronic subclinic.

Mecanismul de aparitie al procesului inflamator in obezitate implica in mod esential prezenta celulelor imune (de tipul -macrofagelor, neutrofilelor, limfocitelor T- CD4+ [cu subtipurile de limfocite distincte T-helper-Th1, Th2 , Th17 si limfocitele T reglatorii] si CD8+, limfocitele B, celulele natural killer -NK), dar si o crestere a nivelului de acizilor grasi liberi de la nivel local. Stimulul initial este atat procesul de chemoatractie al celulelor imune (de tipul -macrofagelor, neutrofilelor, limfocitelor T- CD4+ [cu subtipurile de limfocite distincte T-helper-Th1, Th2 , Th17 si limfocitele T reglatorii] si CD8+, limfocitele B, celulele natural killer -NK) dar si de crestere a concentratiei acizilor grasi liberi de la nivel local [346].

Mecanismele prin care inflamatia cronica poate favoriza sau induce carcinogeneza includ cresterea rezistentei la apoptoza, favorizarea instabilitatii genomice, alterarea structurii ADN, modificari epigenetice cu alterarea expresiei genetice si cresterea proliferarii celulare[ ]

Desi initial descris in afectiuni microbiene,studii recente indica implicarea inflamazomului in afectiuni non-microbiene asociate cu inflamatia cronica cum ar fi obezitatea si alte afectiuni cronice asociate, respectiv DZ tip2, guta, ateroscleroza,boala Alzheimer, artrita reumatoida, boala metabolica hepatica si cancer. Inflamazomul se defineste ca o familie de complexe proteice ce capteaza diverse semnale microbiene sau endogene pentru a induce un raspuns imun,stimuland inflamatia si apoptoza. In obezitate si DZ tip2, inflamazomul de tip NLRP3 este activat si creste productia de IL1-β, procese mediate de anomaliile metabolice prezente in aceste doua afectiuni: hiperglicemia, dislipidemia cu cresterea nivelului de AGL,prezenta cristalelor de acid uric si colesterol, si cresterea nivelului de β-amiloid. Cele mai importante citokine proinflamatorii asociate obezitatii sunt: factorul de necroza tumorala -α (TNFα), interleukina-6 (IL-6), IL-1β, si interferonul IFNgama [347]..

Un studiu recent al lui Schmidt si colab 2015, a evidentiat diferentele de expresie intre citokinele pro si anti inflamatorii in obezitatea generala si obezitatea viscerala, cea generala asociindu-se cu un nivel crescut de IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-y si TNF-α, iar cea viscerala cu IL-5, IL-10, IL-12, IL-13 and IFN-y-levels. Pacientii cu cu obezitate generala si sedentari au prezentat un nivel crescut de IL-4, IL-10 si IL-13. Numeroase studii au demonstrat rolul benefic al exercitiului fizic regulat in obezitate si DZ tip 2, fenomen ce poate fi explicat si prin reducerea nivelului citokinelor proinflamatorii [348].

Leptina si adiponectina

Pana in prezent s-au descris mai mult de 50 proteine secretate de celula adipocitara (denumite generic adipokine) avand functii celulare complexe, regland homeostazia energetica celulara, metabolismul, imunitatea si inflamatia [349] In pofida acestui numar mare de substante secretate de adipocit doar 2 au fost intens studiate: leptina si adiponectina si rolul lor in cancer. Un nivel crescut de leptina si scazut de adiponectina se asociaza cu un risc crescut pentru anumite tipuri de cancer si pot predispune sau favoriza aparitia sau evolutia unor forme variabile de neoplazie in multiple studii : tiroidian, san, endometrial, colorectal,pancreatic,melanom, limfom non-Hodgkin [ 350-369].

DZ nu trebuie vazut ca o entitate singulara ci ca un grup de anomalii metabolice caracterizat de o serie de potentiali factori de confuzie (obezitatea, sindromul metabolic, diverse profile de tratament anti-diabetic si posibile complicatii cronice si comorbiditati) ce pot influenta intr-un grad variabil riscul privind DZ si cancerul [370].

Aceste doua afectiuni cu impact inalt impart factorii de risc comuni ce isi influenteaza reciproc evolutia ulterioara [370].

Relatia DZ-cancer pancreatic este una bidirectionala, riscul de cancer pancreatic fiind extrem de crescut la pacientii nou diagnosticati.

Tratamentul oncologic (chimio sau radioterapic) este toxic la nivel celular si poate induce aparitia tulburarilor de glicoreglare DZ .

Figura 6.4. Interrelatia DZ-cancer.

Majoritatea bolilor cardiovasculare si o parte a cancerelor pot fi prevenite prin controlul factorilor modificabili de risc. Recomandarile universale de preventie a cancerului cum ar fi cele ale stilului de viata(ce includ o dieta sanatoasa, practicarea a30min de exercitiu fizic aerob/zi, controlul greutatii, intreruperea si/sau limitarea consumului de alcool si interuperea fumatului) sunt elemente extrem de importante atat in preventia DZ si implicit a anumitor forme de cancer asociate DZ cat si din conduita obligatorie necesara obtinerii unui bun control metabolic al DZ alaturi de tratamentul hipoglicemiant. Aditional pacientii diabetici necesita o monitorizare atenta a tratamentului hipoglicemiant (utilizarea tratamentului cu Metformin si evitarea administrarii insulinei in exces) in acelasi timp sa previna sau sa trateze complicatiile cronice deja existente dar si o cresterea a frecventei de screening pentru anumitor forme de cancer frecvent asociate DZ (functie de profilul specific de risc al fiecarui pacient in parte) vezi figura 2 [329].

Datorita pandemiei de DZ chiar si o mica crestere in incidenta a cancerelor in populatia diabetica reprezinta o problema majora de sanatate publica cu consecinte majore . Acest potential risc devine astfel o provocare in a identifica mecanismele asociative ale celor doua boli. Diagnosticarea lor cat mai precoce va avea ca efect implicit scaderea mortalitatii si a costurilor socio-economice legate de aceste afectiuni [329].

Un obstacol major in eludarea relatiei DZ-cancer o reprezinta atat heterogenitatea celor doua afectiuni cat si lipsa unor mecanisme fiziopatologice care sa le explice cu argumente solide etiopatogenia. DZ este o afectiune complexa cronica cu debut insidios, acompaniata de multiple complicatii si comorbiditati.Cancerul are o natura polimorfa, acelasi tip histologic de tumora avand posibilitatii diferite de evolutie si raspuns la tratament functie de modificarile genetice, biochimice si moleculare prezente specifice in acea tumora. Desi cele doua afectiuni sunt extreme de complexe si heterogene, ele au si o caracteristica comuna- caracterul insidios, caracterizat printr-o perioada lunga de evolutie subclinica pana la diagnostic [329].

Datorita cresterii incidentei si prevalentei cancerului in populatia diabetica putem considera neoplazia ca si o complicatie a DZ si si o putem intitula „oncopatia diabetica”[242].

DZ, comorbiditatile si riscul de cancer

Riscul crescut de aparitie si de deces prin cancer este influentat atat de durata lunga de evolutie a DZ cat si de gradul de control glicemic existand o relatie de directa proportionalitate intre acestea. Suplimentar exista o relatie si in raport cu riscul de complicatii cronice specifice DZ, cum sunt cele micro si macrovasculare. Pacientul diabetic dezechilibrat este un pacient fragil datorita atat scaderii imunitatii cat si datorita afectarii organelor majore (ficat, cord, rinichi) cu scaderea functiei lor in grade variabile. Pe parcursul tratamentului oncologic (chimio- si radioterapiei), datorita anomaliilor asociate, pacientul diabetic prezinta o frecventa crescuta a reactiilor adverse la tratamentul oncologic, impunand scaderea atat din punct de vedere calitativ cat si cantitativ a tratamentului (doza/durata de expunere/tip de agent terapeutic) [329]. Aceasta cresterea a frecventei reactiilor adverse si necesitatea modificarii schemei de tratament explica partial, mortalitatea crescuta prin cancer la pacientii diabetici[329].

Figura 6.4. Factori cuantificabili in relatia cancer-DZ ce pot influenta riscul/prognosticul de cancer la pacientii cu DZ.Adaptat dupa [371].

DZ, comorbiditatile si riscul de cancer

Riscul crescut de aparitie si de deces prin cancer este influentat atat de durata lunga de evolutie a DZ cat si de gradul de control glicemic existand o relatie de directa proportionalitate intre acestea. Suplimentar exista o relatie si in raport cu riscul de complicatii cronice specifice DZ, cum sunt cele micro si macrovasculare. Pacientul diabetic dezechilibrat este un pacient fragil datorita atat scaderii imunitatii cat si datorita afectarii organelor majore (ficat, cord, rinichi) cu scaderea functiei lor in grade variabile. Pe parcursul tratamentului oncologic (chimio- si radioterapiei), datorita anomaliilor asociate, pacientul diabetic prezinta o frecventa crescuta a reactiilor adverse la tratamentul oncologic, impunand scaderea atat din punct de vedere calitativ cat si cantitativ a tratamentului (doza/durata de expunere/tip de agent terapeutic) [329]. Aceasta cresterea a frecventei reactiilor adverse si necesitatea modificarii schemei de tratament explica partial, mortalitatea crescuta prin cancer la pacientii diabetici[329].

Figura 6.5. Principalele mijloace de scadere a riscului de cancer/DZ/BCV si de mortalitate prin cancer si BCV la pacientii diabetici.Adaptat dupa [243,329]

Trasaturile comune cancer-DZ

Cancerul si DZ prezinta anumite trasaturi comune cum ar fi debutul asimptomatic/insidios, etiologia multifactoriala, factori de risc comuni: obezitatea, sindromul metabolic, varsta, stilul de viata), dar si tratamentul cu Metformin un antidiabetic larg utilizat cu potential antineoplazic.

Figura 6.5. Trasaturile comune ale DZ si cancerului (desen original)

Tratamentul cu Metformin

Tratamentul cu Metformin este cel mai utilizat tratament ADO in DZ. Metforminul ((N0,N0-dimetilbiguanida) este un medicament ieftin,relativ sigur si efectiv pentru tratamentul DZ, prediabetului si obezitatii iar utilizarea sa ca si agent tumoral ar avea efecte clinice si economice favorabile[16]. O serie de meta-analize au evidentiat un risc scazut de cancer la pacientii cu DZ tip2 tratati cu Metformin [372]

Trialurile clinice efectuate pe diverse tipuri de cancer atat in preventia cat si in tratamentul cancerului au evidentiat un posibil rol benefic al Metorminului ca agent antineoplazic [372-376]. Sunt necesare studii ulteriorare de confirmare. Recent o serie de studii clinice in desfasurare ( NCT01340300; NCT01310231; NCT01650506; NCT02153450; NCT02285855; NCT02122185; NCT02115464; NCT02420652; NCT01205672 etc analizeaza comparativ rolul Metforminului cu diversi agenti chimioterapici ca pe un potential agent antitumoral independent de rolul hipoglicemiant in diverse forme de cancer (cancer colorectal, san, pancreatic, endometrial, ovar, plaman).

Sunt propuse mai multe mecanisme care sa explice rolul antitumoral in vivo and in vitro al metforminului: 1.activarea caii LKB1/AMPK 2.inducerea repausului si/sau apoptozei celulare; 3.inhibitia sintezei proteice;4. reducerea insulinemiei 5. inhibitia raspunsului al proteinelor nepliate (UPR) 6.activarea sistemului imun ; 7. distrugerea celulelor stem-canceroase[375-376].

O serie de studii au evidentiat rolul benefic al activitatii fizice in preventia diverselor forme de cancer [20-25], in mod special pentru cancerul colorectal si de san. Activitatea fizica inhiba toate etapele carcinogenezei (initierea si progresia) prin mai multe mecanisme complexe cum ar fi : scaderea in greutate, reglarea nivelului de hormoni sexuali, inhibarea axei-insulina IGF1 si a altor factori de crestere, stimularea mecanismelor de corectie a ADN, inhibarea sintezei de prostaglandine si a inflamatiei, scaderea generarii de SRO si reducerea stresului oxidativ, activarea sistemului imun [383].

DZ per se nu este o afectiune letala, dar prin complicatiile sale in primul rand de ordin cardiovascular poate deveni o complicatie letala cu mortalitate crescuta. Cancerul se refera la o diviziunea celulara haotica cu inhibarea apoptozei si capacitatea acestora de diseminare la distanta in diverse tesuturi si organe.

Dimensiunea economica a cancerului si DZ

In privinta dimensiunii economice in 2010 la nivel global, cancerul si DZ prezentau costuri relativ apropiate (300miliarde $ cancerul si 500 miliarde $ DZ).Impreuna cele doua afectiuni cronice totalizeaza costuri de aproximativ 790 miliarde de $ fiind aproximativ egale cu cele ale BCV de 863 miliarde de $. In viitor aceasta tendinta de crestere va continua iar in 2030 se preconizeaza ca la nivel global, cheltuielile legate de bolile neoplazice se vor dubla iar costurile legate de DZ si cancer vor depasi pe cele ale BCV. (vezi figura).Aceasta tendinta de crestere a costurilor se poate explica prin cresterea numerica a populatiei in viitor dar si prin deplasarea curbei de varsta spre dreapta, procentul de persoane varstnice estimandu-se a se dubla in urmatoarele 2 decenii, ceea ce va implica si cresterea prevalentei bolilor cronice ce sunt asociate cu varsta mai inaintata. Produsul intern brut total la nivel mondial in 2010 a fost conform Bancii Mondiale de 63,048 miliarde de $ [28], iar cheltuielile legate de bolile cronice au reprezentat aproximativ 6250miliarde de $[385], reprezentand aproximativ 9 % din valoarea PIB-ului mondial. Daca este sa luam insa in calcul si povara economica datorate vietii pierdute prematur din cauza tuturor bolilor cronice aceasta se ridica la nivel global la aproximativ 22.800 miliarde$ in 2010 si se estimeaza a se dubla aproape in 2030 la aproximativ 43.300 miliarde $ (vezi figura), povara cea mai crescuta fiind in tarile dezvoltate cu nivel crescut de trai.Scaderea acestor costuri se poate face prin metode simple de preventie a bolilor cronice ce constau in limitarea efectelor urbanizarii: consumului de alcool, tutun, adoptarea unui stil de viata sanatos (odihna corespunzatore, activitate fizica regulata>30min/zi, dieta sanatoasa cu mese regulate) [384]

Figura 6.6. Principalele costuri ale bolillor cronice la nivel mondial 2010 vs 2030.Adaptat dupa [384].

Tendinta demografica a populatiei este sa creasca ca si numar si sa imbatraneasca, in 2050 estimandu-se cu peste 2 miliarde de persoane in plus, iar populatia varstnica se estimeaza a se dubla pana in 2050 cu cresterea implicita a prevalentei bolilor cronice ce afecteaza preponderent acest grup de varsta ( vezi figura)[27].

Figura 6.7.Tendinta demografica a populatiei si tendinta de imbatranire. Adaptat dupa [384]

CAPITOLUL 7

Cancerul colorectal si DZ

7.1.Clasificarea histologica a tumorilor colorectale.

Exista mai multe clasificari ale tumorilor colorectale: in functie de caracterul tumorii (benign sau malign), in functie de localizare in regiunea anatomica specifica (colon ascendent,unghiul hepatic al colonului, transvers,unghiul splenic al colonului , descendent, sigmoid si rect), functie de originea embriologica (epiteliale si non-epiteliale), in functie de origine (primare si secundare) (figura 7.1).

Figura 6.1 Clasificarea histologica a tumorilor benigne si maligne colorectale conform OMS [386].

Adenocarcinomul colorectal este cea mai frecventa forma de cancer colorectal reprezentand aproximativ 95% din totalul tipurilor histologice de cancer colorectal [386].

7.2.Diagnosticul cancerului colorectal

Diagnosticul de cancer colorectal este realizat adesea in trei moduri: pe baza simptomatologiei (adesea prezenta in stadiile avansate ale tumorii), descoperit intamplator pe baza screeningului de rutina, in urgenta ca rezultat al unei complicatii acute (ocluzie intestinala, peritonita sau mai rar sangerare gastrointestinala acuta). Exista si situatii atipice de prezentare cum ar fi sepis datorat Streptococcus bovis si Clostridium septicum, formarea fistulei maligne, febra de cauza neprecizata sau adenocarcinom cu punct de plecare necunoscut. In functie de stadiul si localizarea tumorii, simptomatologia este polimorfa. Simptomatologia specifica include: modificari ale tranzitului intestinal atat ca aspect al scaunului cat si ca frecventa, cu alternanta sau predominanta diareei/constipatiei, hematochezia si durerile abdominale. Aceste simptome specifice sunt insotite cvasiconstant si de simptome nespecifice precum: anemia, scaderea ponderala, greata, febra, astenia si fatigabilitatea. Uneori cancerul colorectal este descoperit in stadiul tardiv de metastaza (cel mai frecvent ficat, plaman si peritoneu) asociind si alte semne specifice functie de locul metastazarii. Daca exista suspiciunea de cancer colorectal, pentru a certifica prezenta neoplaziei se va testa suplimentar prin metode endoscopice cum este recto-colonoscopia sau capsula endoscopica, imagistice (cum ar fi: CT,RMN, ecografia abdominala standard sau ecografia transrectala, PET-CT, scintigrafia sau clisma baritata) sau paraclinice (prin dozarea markerilor tumorali CEA sau CA19-9 sau identificarea de sangerari oculte prin testul pentru identificarea sangerarii oculte in materiile fecale). Diagnosticul de certitudine si clasificarea sa se va face pe baza examenului histologic.Ulterior, cancerul colorectal se stadializeaza TNM si functie de stadiu si de localizare se va initia selectiv protocolul terapeutic tratamentul chirurgical si radio- sau chimioterapeutic [386-387].

7.Aspecte epidemiologice si etiopatogenice comparative ale CRC si DZ

O serie de studii si metaanalize asociaza CCR cu DZ tip2 cu un exces de risc de 14-84% , insa cu rezultate inconsistente in raport cu DZ tip1. Cancerul colorectal se asociaza si cu obezitatea, respectiv cu cresterea IMC, CA, si raportului talie sold [388-389]. Pacientii ce prezinta nivele scazute de IGF2 si IGFBP3, sau nivele crescute de IGF1, IGFBP2, insulinemie bazala [ ]sau cresterea nivelului glicemiei si insulinemiei la 2h post ingestie 75g glucoza la testul TTGO prezinta un risc potential mai crescut pentru dezvolta neoplazii maligne colorectale. Tratamentul cronic cu agenti insulinosecretori, de tipul sulfonilureicelor sau insulinei pot creste riscul de CCR in anumite studii.

Asocierea epidemiologica slaba a DZ1 cu cancerul si in mod special cu CRC in contrast cu asocierea puternica a DZ 2 cu anumite tipuri de cancer induce ipoteza actiunii altor factori/cai de semnalizare potential oncogene in carcinogeneza in DZ2, limitand rolul hiperglicemiei per se in oncogeneza. O analiza comparativa a diverselor aspecte epidemiologice este redata in tabelul 7.1 [390-402].

Pentru o mai bună înțelegere a mecanismelor asociative ale relației DZ-CCR, am clasificat factorii de risc pentru CCR in: asociați cu DZ [390,403-410], neasociați cu DZ si factori de risc comuni [390,411-422] atȃt pentru CCR cȃt și pentru DZ [390,423-442](figura 7.2)

Figura.7.2.Clasificarea factorilor de risc pentru CCR in raport cu DZ tip 2. Adaptat dupa [ ] cu acordul Revistei de Medicina Interna.

PARTEA SPECIALĂ

CONTRIBUȚIA PERSONALĂ

SCOPUL ȘI OBIECTIVELE TEZEI DE DOCTORAT

Scopul tezei a fost de identifica potentiale diferente epidemiologice, morfotipice, imunofenotipice , imagistice moleculare si ultrastructurale atribuibile diabetului zaharat in cancerul colorectal.In teza am urmarit sa efectuez o analiza complexa (comprehensiva) in care sa evidentiez potentialele diferente ale adenocarcinoamelor colorectale asociate DZ tip2 din punct de vedere epidemiologic, morfotipic, imunofenotipic, imagistic molecular si ultrastructural.

Obiectivele tezei au fost:

sa efectueze o analiza epidemiologica bi-unghiulara a diabetului zaharat si a cancerului (respectiv o analiza epidemiologica a relatiei diabet zaharat-cancer prin evaluarea prevalentei cancerului colorectal in populatia diabetica, comparativ cu a altor forme de neoplazii maligne; dar si o analiza epidemiologica a relatiei cancer-diabet zaharat prin evaluarea prevalentei diabetului zaharat in populatia cu cancer colorectal comparativ cu a altor tipuri de neoplazii maligne).

sa efectueze atat o evaluare din punct de vedere clinic (asocierea cu diversi parametrii clinici, tipul de DZ,durata de evolutie a diabetului zaharat, cu diversele complicatii ale DZ, tipul de tratament) a cancerului colorectal comparativ cu a altor tipuri de neoplazii maligne in diabetul zaharat de tip 2, cat si sa identific potentiale diferente din punct de vedere clinic (localizarea tumorii, stadializarea, prezenta comorbiditatilor, tipul de operatie, evolutia postoperatorie) intre cancerul colorectal la pacientii diabetici, ce asociaza DZ tip2 si pacientii non-diabetici.

sa identifice potentiale diferente din punct de vedere paraclinic (imagistic molecular, histopatologic conventional si histopatologic imunohistochimic si ultrastructural) intre cancerul colorectal la pacientii diabetici, ce asociaza DZ tip2 si pacientii non-diabetici.

CAPITOLUL 8

STUDIUL 1: . PREVALENTA DIVERSELOR TIPURI DE CANCER LA PACIENTII DIABETICI INTERNATI IN IDNBM N.C. PAULESCU

1.Introducere.Premise.Scop si obiective.

Cancerul si DZ sunt doua afectiuni complexe, ambele cu asocieri puternice epidemiologice multifactoriale. Datorita prevalentei in crestere a celor doua afectiuni, grevate de o mortalitate si o morbiditate crescute si de costuri socio-economice ridicate, din perspectiva potentialei asocieri a celor doua boli cronice, putem considera cancerul (pentru cel putin anumite tipuri) ca si boala metabolica.

Desi cele doua boli prin potentialul lor nefast (cresterea morbiditatii si a mortalitatii) au atras atentia cercetatorilor si au fost intens dezbatute in literatura de specialitate, nu s-a reusit ca pana la aceasta data sa se evidentieze o legatura cauzala clara, de tip cauza-efect.

Diabetul zaharat si cancerul sunt doua boli cronice heterogene, cu o prevalenta si o mortalitate in crestere la toate varstele, ambele sexe si pe toate continentele, fiind influentate atat de factorii genetici cat si de cei de mediu.

Prevalenta la 5 ani a cancerului la toate tipurile și pentru ambele sexe în 2012 a fost de 32.5 milioane persoane, pe primele patru locuri situandu-se în ordine descrescatoare: cancerul de san cu 6.3milioane cazuri, de prostata 3.9 milioane de cazuri, colorectal 3.5 milioane de cazuri, plămân 1.9 milioane de cazuri [391,293]. In 2012 la nivel mondial incidenta cancerului a fost de 14.1 milioane de cazuri, iar mortalitatea de 8.2 milioane persoane [391,392].

Dovezile epidemiologice sugerează ca exista o crestere moderata a riscului de cancer la pacientii diabetici si la subiectii cu toleranta alterata la glucoza, la nivelul situsurilor digestive (pancreas,ficat, colon,tract biliar) si la nivelul sanului, endometrului insa cu efect protector pentru cancerul de prostata) , prevalenta cancerului la pacientii diabetici fiind astfel mai mare decat in populatia generala. Riscul este maxim (de aproximativ de 2 ori mai crescut) pentru cancerul de ficat , pancreas , endometru si mai scazut (de 1.2-1.5 ori mai mic) pentru cancerul colorectal , san , vezica urinara [391] ; cu efect neutru pentru cancerul de plaman si cu o corelatie inversa pentru cancerul de prostata [391].

Pacientii cu cancer ce au DZ preexistent au un risc crescut de mortalitate de toate cauzele comparativ cu cei nediabetici (38), toate studiile evidentiind o scadere a supravietuirii la pacientii diabetici cu cancer nou diagnosticat, comparativ cu pacientii non-diabetici cu cancer nou diagnosticat [391].

Terapia hipoglicemianta a fost asociata cu cresterea riscului pentru anumite forme de cancer. Cea mai utilizata terapie hipoglicemianta-Metforminul este asociat cu scaderea riscului de cancer in numeroase studii epidemiologice [391]. Metforminul scade riscul de cancer prin mai multe mecanisme: fie indirect in tesuturile periferice (ficat si muschi) prin scaderea concentratiei de insulina , fie direct printr-un mecanism ce implica LKB1/AMPK si phosphoinositide 3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycin signaling (P3IK/Akt/mTOR) [393].Sulfonilureicele (SU) cresc riscul de cancer semnificativ comparativ cu Metforminul, iar dintre SU cel mai pronuntat efect oncogen il are glibenclamidul , gliclazidul avand efect protectiv (prin efectele antioxidante probabil) [394].

Tratamentul cu insulina, tiazolidindione, inhibitori cotransportori de Na/Glucoza (SGLT2) si tratamentul cu incretine (analogii GLP1 si inhibitorii de DPP-4) nu a evidentiat cresterea riscului de cancer sau cresterea mortalitatii si sunt considerate sigure in dozele terapeutice (85). Doua mentinuni se pot face: tratamentul cu Pioglitazona in doze mari si pe durata indelungata >24luni cu >28.000 mg doza cumulativa s-a asociat cu cresterea riscului de cancer de vezica urinara si exista temerea ca administrarea de insulina exogena in doze crescute poate creste riscul de cancer(85).

Scopul studiului a fost să evalueze (dpdv epidemiologic) prevalenta, aspectele clinice si paraclinice particulare ale cancerului colorectal la pacienții diabetici internați in perioada 01.01.2011-15.09.2014 in Institutul Național de Diabet Nutriție si Boli Metabolice „Prof N.C.Paulescu” comparativ cu a altor tipuri de cancer (vezi figura)

Figura I. Scopul principal al studiului

Obiectivele studiului au fost efectueze o analiza epidemiologica (frecventa, date demografice), clinica (IMC, tipul de DZ dar si tipul de tratament antidiabetic sau prezenta complicatiilor specifice), si paraclinica (HbA1c, fracțiunea HDL colesterol, trigliceride) a diversele forme de neoplazii maligne in populatia diabetica internata.

Materiale si metode:

A.Selectia pacientilor

Studiul este unul observational, descriptiv, si a analizat retrospectiv un numar de 24.104 internari ce corespund unui numar de 13.960 pacienti unici internati, respectiv a 520 internari cu diagnostic de cancer (tumora maligna) si diabet zaharat (vezi figura) . Pentru identificarea pacientilor am utilizat programul informatic ProMedic din cadrul IDNBM N.C.Paulescu fiind selectati practic toti pacientii internati in perioada 01.01.2011-15.09.2014. Dupa excluderea internarilor multiple, celor ramasi in lot le-am aplicat criteriile de includere in studiu : prezenta diagnosticului de diabet zaharat si prezenta concomitenta a diagnosticului de cancer, respectiv varsta de >18 ani. Criteriile de excludere au fost: varsta <18ani, respectiv lipsa diagnosticului de DZ sau/si cancer. In urma analizei (prin excluderea internarilor multiple, a biletelor de internare cu date incomplete sau lipsei diagnosticului de cancer/DZ din biletul de externare ) au fost inclusi in lotul de studiu,in final un numar de 298 de pacienți cu DZ si diverse forme de cancer. S-a efectuat analiza datelor din biletele de externare corespunzatoare pacientilor din lotul de studiu. Astfel s-a urmarit si analizat urmatorii parametrii :

-datele demografice (sexul, varsta, mediul de provenienta-urban sau rural),

-datele antropometrice (inaltimea, greutatea),

-datele privitoare la diabet (tipul si durata de evolutie;

-tipul de tratament: dieta, antidiabetice orale sau insulina;

-complicatiile specifice DZ: retinopatia diabetica, neuropatia diabetica, boala cronica de rinichi, dar si a bolii coronariene ischemice),

-investigațiile biologice ( HbA1c, fracțiunea HDL colesterol, trigliceridele), datele referitoare la patologia maligna asociata (tipul-locatia tumorii si durata de evolutie). S-a calculat indicele de masă corporală (IMC) pentru stabilirea statusului nutrițional.

Figura I.1 Schema de recrutare a pacientilor in studiu

B.Analiza statistica.

Pentru prelucrarea statistica a datelor s-a creat o baza de date Excel (Microsoft Office 2013)in care au fost introduse toate variabilele cu memorarea datelor sub forma de tabele. Prelucrarea statistica a datelor a fost efectuata utilizand aplicatiile Microsoft Excel 2013 si SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) ver 19.00. Variabilele cantitative au fost analizate prin intermediul functiilor ANOVA (Analysis of variance) si T-test, iar variabilele calitative prin intermediul functiei chi-patrat. S-a considerat o valoare semnificativa statistica a lui p < 0.05.

Lotul de pacienti a fost stratificat in functie de : varsta, sex, mediul de provenienta, tipul de diabet, tipul de cancer, valoarea :HbA1c, trigliceridelor , HDL colesterol, inaltimii (m), greutatii (kg), IMC kg/m2); prezenta sau absenta: retiopatiei diabetice (RD) ,neuropatiei diabetice (ND), bolii renale cronice (BRC) ,bolii coronariene ischemice (BCI) , tratamentului cu insulina, cu ADO, sau doar pe dieta.

Rezultate

Caracteristicile generale ale lotului

Distributia lotului pe sexe

In urma excluderii pacientilor ce nu au indeplinit criteriie de includere si/sau criteriile de excludere, in final au fost analizate datele a unui numar de 298 de pacienti. Lotul a cuprins un numar de 164 de femei si 134 de barbati (SD=11.27) (figura I.2.A).

Figura I.2.Distributia pacientilor din lot functie de sex (A) si functie de mediul de provenienta (B).

Distributia lotului functie de mediul de provenienta

Majoritatea pacientilor inclusi in lotul de studiu provin din mediul urban (83% n=246) confom figurii I.2.B

Distributia lotului pe grupele de varsta

Varsta minima in lotul de studiu a fost de 33 de ani iar cea maxima de 90 ani, media de varsta a pacientilor inclusi in lotul fiind de 67.09 ani. Reparitita pacientilor pe grupe de varsta este redata in figura I.3

Figura I.3.Distributia pacientilor functie de grupele de varsta in lotul de studiu.

Distributia lotului functie de tipul de diabet

Cel mai frecvent tip de diabet a fost T2D (n=274;91.94%),urmat de T1D (n=17;5.7%) (figura I.4).A existat un caz de diabet tip LADA (0.34%) si un caz de de diabet tip MODY (0.34%) si 5 cazuri de DZ secundar conform figurii I.4.

Figura I.4.Repartitia numerica a pacientilor din lotul de studiu functie de tipul de DZ .

Distributia lotului functie de grupa de varsta si tipul de diabet

Privitor la modul repartitie al pacientilor functie de grupa de varsta si tipul de DZ se observa in figura I.5 prevalenta aproape exlcusiva a DZ tip2 la grupa de varsta >75 ani, si absenta sa in grupa de varsta tanara 33-39 ani, in care se regasesc exclusiv pacienti cu DZ tip1 sau DZ secundar.

Figura I.5. Distributia pacientilor functie de grupa de varsta si tipul de DZ.

Distributia lotului functie de IMC

Privitor la modul de distributie al IMC in lotul de studiu se observa in figura I.6.A, ca au predominat pacientii supraponderali (IMC=25-30 Kg/m2) si obezi (IMC>30 Kg/m2), valoarea medie a IMC fiind de 28.66 Kg/m2 (SD=8.83).Raportat pe sexe, femeile au prezentat mai frecvent exces ponderal comparativ cu bărbatii (figura I.6.B)

Figura I.6 Distributia valorilor IMC in lotul de studiu (A) sau repartizat pe sexe (B).

Analiza diverselor tipuri de cancer in lotul de studiu, functie de:

Prevalenta diverselor forme de cancer in populatia diabetica studiata

Prevalenta generala a tuturor tipurilor de cancer in populatia de pacienti diabetici internati a fost de 2.13%.

In urma analizei statistice , cea mai frecventa forma de cancer in populatia diabetica a fost cancerul de san (63 cazuri respective 21.1%), urmata de cancerul colorectal (45 cazuri respectiv 15.1%), cancerul pancreatic (37 cazuri respectiv 12.41%) si cancerul pulmonar (31 cazuri respectiv 10.4%). O analiza completa a prevalentei (%) si a frecventei fiecarui tip de cancer in populatia diabetica este redata in figura I.7.

Prevalenta functie de sex a diverselor tipuri de cancer in populatia diabetica studiata

Privitor la distributia pe sexe a diverselor tipuri de cancer se observa in figura I.8 predominanta sexului masculin in mod special in cancerul colorectal (66.7%) si pancreatic (64.8%) , prevalenta barbatilor fiind aproximativ dubla in aceste tipuri de cancer. In mod contrar femeilor predomina in cancerul de vezica urinara, laringe, cutanat si osos (figura I.8).

Figura I.7.Prevalenta (%) si frecventa (numerica) a diverselor tipuri de cancer in populatia diabetica din lotul de studiu. Distributia numerica si procentuala a principalelor tipuri de cancer in populatia diabetica studiata.

Figura I.8 Distributia numerica si procentuala functie de sex a principalelor tipuri de cancer in populatia diabetica studiata.

Prevalenta functie de mediu de provenienta a diverselor tipuri de cancer in populatia diabetica studiata

Raportat la mediul de provenienta se observa in figura I.9 ca indiferent de tipul de cancer, predomina pacientii cu provenienta urbana.

Figura I.9. Distributia numerica si procentuala functie de mediul de provenienta a principalelor tipuri de cancer in populatia diabetica studiata.

Prevalenta functie de grupele de varsta ale diverselor tipuri de cancer in populatia diabetica studiata

Se observa in figuile I.10,I.11 ca dintre toate tipurile de cancer, cancerul colorectal a inclus predominant pacienti varstnici ( 75 % din cazurile de cancer colorectal >65 ani), prezentand varsta medie cea mai inaintata (72.6 ani figura I.12) comparativ cu celelalte tipuri de cancer. Grupa de varsta tanara (>65ani) a fost predominata in cancerul de laringe (86% din cazuri <65 ani) si in cancerul endometrial (80% din cazuri <65 ani) (figura I.10).

Figura I.10. Distributia numerica si procentuala functie de varsta prag 65 ani, a principalelor tipuri de cancer in populatia diabetic studiata.

Figura I.11. Distributia numerica pe grupe de varsta, a principalelor tipuri de cancer in populatia diabetica studiata, cu evidentierea distributiei cancerului colorectal.

Figura I.12. Distributia varstelor medii in principalelor tipuri de cancer din populatia diabetica.

Prevalenta functie de tipul de diabet ale diverselor tipuri de cancer din populatia diabetica studiata

Functie de subtipul de DZ, DZ secundar (5cazuri) s-a asociat aproape in exclusivitate cu cancerul pancreatic 4 cazuri si 1 caz cu cancerul de cai biliare; unicul caz de DZ de tip MODY s-a asociat cu cancerul pancreatic, iar unicul caz de DZ tip LADA cu cancerul de colon (figura I.13). In figura I.14 se observa ca diabetul zaharat de tip 1 s-a asociat cel mai frecvent cu leucemia (1/2 cazuri respective 50% din cazuri) si cancerul cerebral (2/8 respectiv 25% din cazuri), iar DZ tip 2 a avut o predominanta majora in lotul studiat, prezentand o asociere exclusiva cu anumite subtipuri de cancer.

Figura I.13. Distributia numerica a diverselor tipuri de cancer in populatia diabetic studiata,functie de prezenta diveselor forme de DZ. Frecventa cancerului colorectal comparativ cu alte tipuri de cancer in populatia diabetica, functie de tipul de DZ.

Figura I.14 Distributia numerica si procentuala functie de prezenta de DZ tip1 sau DZ tip2, a principalelor tipuri de cancer in populatia diabetic studiata. Prevalenta cancerului colorectal comparativ cu alte tipuri de cancer in populatia diabetica, functie de tipul de DZ

Principalele caracteristici clinice si biochimice ale pacientilor diabetici cu diverse tipuri cancer din lotul studiat.

Analiza distributiei valorilor medii ale IMC in randul subtipurilor de cancer, redata in figura I.15A, a identificat o asociere intre valoarea crescuta a IMC (≥25kg/m2) si cancerul colorectal si cancerele genitale feminine (cancerul de ovar,de san, endometrial si de col uterin), fara o asociere insa cu cancerul pulmonar renal, rinofaringian, vezica urinara, retroperitoneal sau adrenal (ce s-au asociat cu un IMC normal sau scazut -IMC<25kg/m2).

Stratificarea pacientilor pe tipuri de cancer nu a evidentiat vreo semnificatie statistica raportata la nivelul HbA1c (Figura I.15.B) sau al trigliceridelor (figura I.15.C), insa scaderea nivelului HDLc s-a asociat cu prezenta cancerului hepatic si de ovar (p=0,01) (Figura I.15.D) Se observa in figura I.15.B ca pacientii cu cancerul colorectal au asociat un DZ dezechilibrat (HbA1c=9,1%),o valoare normala a trigliceridelor (123 mg/dl; Figura I.15.C) si un nivel usor scazut de HDLc (42 mg/dl; Figura I.15.D).

Figura I.15 Principalele caracteristici clinice si biochimice ale pacientilor diabetici cu cancer din lotul studiat. Valorile principalilor parametrii studiati: A.IMC; B.HbA1c; C.Trigliceride;D. HDL colesterol.

Prevalenta diverselor complicatii in subtipurile de cancer asociate diabetului

Privitor la posibila asociere intre complicatiile specifice diabetului si prezenta cancerului, stratificarea pacientilor pe subtipuri de cancer nu a evidentiat vreo semnificatie statistica intre prezenta retinopatiei diabetice, neuropatiei diabetice, bolii renale cronice sau bolii coronariene ischemice si prezenta vreunui subtip de cancer (figura I.16).

Figura I.16.Prevalenta diverselor complicatii in subtipurile de cancer asociate diabetului.

Tratamentul antidiabetic in subtipurile de cancer asociate diabetului

Distributia tipurilor de tratament antidiabetic pe principalele subtipuri de cancer este redatain figura I.17.

Figura I.17.Tipul de tratament antidiabetic in diversele forme de cancer.

Discutii

Prevalenta generala a cancerului in populatia diabetica din lotul de studiu a fost de 2.13% (figura I.22).

Figura I.22 Prevalenta comparativa a cancerului in diversele populatii.

Conform Globocan, prevalenta la 5 ani, respectiv a numarului total de cazuri de cancer existente la nivel mondial in 2012 era de 32.455.179 cazuri de cancer (exclus cancerul cutanat non-melanomic) iar numarul total de locuitori era de aproximativ 7,054,446,000 [392]. Prevalenta numarului total de cazuri de cancer raportat la numarul total de locuitori de la nivel mondial in 2012 era de 0.46%.

In Romania prevalenta la 5 ani a tuturor tipurilor de cancer (exclus cancerul cutanat non-melanomic) conform Globocan, respectiv a numarului total de cazuri de cancer existente in 2012 era de 178.416 cazuri la o populatie totala de 21.387.000[392 ]. Prevalenta numarului total de cazuri de cancer raportat la numarul total de locuitori din Romania in 2012 era astfel de 0.83%, aproximativ dubla in comparatie cu prevalenta mondiala de doar 0.46%.

Comparand prevalenta cancerului in populatia generala din Romania si de la nivel mondial cu prevalenta din studiul nostru se remarca o diferenta de 2.5 ori mai crescuta in raport cu prevalenta generala a cancerelor din Romania si de 4.6 ori cu cea de la nivel mondial. Aceasta diferenta se explica atat prin riscul crescut al pacientilor diabetici de a dezvolta cu preponderenta anumite forme de cancer, cat si prin elemente ce tin de designul studiului. Astfel, pacientii selectati in studiul actual au fost din cadrul spitalizarii continue nu si din centrele ambulatorii, adresabilitatea la spitalizarea continua fiind in special a pacientilor cu DZ dezechilibrati ( aflati frecvent pe tratament insulinic) datorita asocierii neoplaziei, ceea ce teoretic conduce la o crestere a frecventei consultatiilor si la o adresabilitate crescuta.Exista si o serie de limite ale studiului care pot explica aceste diferente.

Raportat la frecventa diverselor tipuri de cancer in populatia generala din Romania si de la nivel mondial, in tabelul I.1 sunt figurate prevalentele principalelor tipuri de cancer in ordine descrescatoare.

Tabel I.1. Prevalenta la 5 ani a principalelor tipuri de cancer in Romania si la nivel mondial in ordinea frecventei (exprimata in % din totalul cazurilor de cancer, exclusiv cancerul cutanat non-melanomic). LNH=Limfom Non-Hodgkin;NF=rinofaringian Adaptat dupa Globocan.IARC [392].

Prevalența comparativă a diverselor tipuri de cancer din lotul de studiu cu prevalenta cancerului in populația din România și de la nivel mondial

Figura I.23. Prevalența comparativă a subtipurilor de cancer din lotul de studiu cu prevalenta cancerului in populația României și cu populatia de la nivel planetar.Adaptat dupa [392 ].

Cancerul pancreatic a avut o prevalenta mult mai crescut in populatia diabetica comparativ cu prevalenta in populatia generala, fenomen explicabil prin elemente ce tin de relatia anatomica de vecinatate directa, intre tumora si localizarea pancreatica a celulelor β , practice orice tumora aparuta la nivelul pancreasului putand induce modificari ale spectrului glicemic.

In cresterea riscului de cancer la pacientii diabetici, sunt implicati atat factori nespecifici (hiperglicemia, hiperinsulinemia, inflamatia cronica subclinica) cat si factori specifici ce se asociaza cu un anumit tip de cancer cum este figurat in tabel I.2.

Tabel I.2.Mecanisme specifice asociate DZ cu un potential risc carcinogen (sau protectoare). Adaptat [ 262,395-397]

In studiul actual cea mai frecventa forma de cancer asociata cu diabetul zaharat a fost cancerul de san asociindu-se aproape in totalitate cu DZ tip 2. Peste 90% din diabetici sunt DZ tip 2 [391,398], iar DZ tip 2 se asociaza cu obezitatea. In obezitate tesutul adipos secreta in exces pe langa citokine inflamatorii si leptina cu scaderea insa a secretiei de adiponectina [391,399]. Leptina actioneaza prin activarea proteinkinazei mitogen activate (MAPK) exercitand efecte proliferative tumorale [391] si creste expresia si activitatea aromatazei (ce creste conversia androgenilor in estrogeni) si activeaza receptorul estrogenic ERα [391]. Hiperinsulinismul asociat obezitatii se insoteste de o secretie excesiva ovariana de androgeni (la femeile premenopauza) si de o sinteza hepatica scazuta a hormonului de legare a globulinei (SHBG), conducand la o crestere a biodisponibilitatii estrogenilor si testosteronului la femei, iar la barbati numai a estrogenilor [391]. Toate aceste modificari hormonale explica prevalenta crescuta in DZ a cancerului de san la, a cancerului de endometru dar si efectul protector al DZ pe cancerul de prostata [391]. In studiul actual cresterea IMC s-a asociat cu cancerul de san si cu cancerul endometrial

Cancerul colorectal a fost a doua forma de neoplazie asociata cu diabetul in studiul nostru. Corelatia cu diabetul zaharat implica nivele crescute de IGF1, hiperinsulinemia si hiperglicemia, cresterea IMC dar se sugereaza si implicarea neuropatiei diabetice vegetative prin incetinirea tranzitului intestinal si cresterea timpului de contact a diverselor toxine cu mucoasa colonului [391,400].

Cancerul de pancreas al 3-lea ca frecventa in studiul nostru, a fost asociat cu diabetul zaharat independent de sex, varsta, etnie, consum alcool sau statusul de fumator, IMC [391] avand ca si factori de risc potentiali in DZ, hperglicemia si hiperinsulinemia.

Mecanismele fiziopatologice ce pot explica legatura dintre cele doua boli cronice sunt complexe, cresterea prevalentei riscului de cancer in populatia diabetica fiind asociata mai multor conditii.

Hiperglicemia predispune la un dezechilibru intre productia si ultilizarea speciilor reactive de oxigen (SRO) si implicit creste stresului oxidativ celular si conduce la instabilitate genomica si mutatii ADN ce au fost asociate cu diverse forme de cancer (39,40). De asemenea hiperglicemia poate exercita un efect favorabil de crestere tumorala prin actiune directa (celula tumorala avand ca principala sursa de energie glucoza si glutamina), iar prin stimularea formarii de produsi de avansati de glicozilare (AGE) poate creste riscul aparitiei anumitor forme de cancer [391].

Inflamatia cronica subclinica persistenta, prezenta in DZ, prin cresterea nivelelor de citokine inflamatorii: IL6, TNFα,PAI 1 ce sunt secretate de tesutul adipos si activarea anumitor cai de transmisie intracelulare specifice, tirozin kinaza Janus (calea JAK/STAT)(42,43) si activarea factorului nuclear κB (NF-κB)(42,44), creste riscul de transformare si progresie maligna [391].

Defectul fiziopatologic central in DZ tip 2, sindromul metabolic (SM) si obezitate este dereglarea axei insulina-factorul de crestere insulinic de tip1 (IGF1) ce are la baza rezistenta la insulina, fiind asociat direct si indirect cu riscul de cancer. Hiperinsulinemia isi exercita efectele fie direct , fie prin scaderea activitatii Insulin-like growth factor-binding protein 1 si 2 (IGFBP1, IGFBP2) ce conduce la cresterea biodisponibilitatii IGF1 liber [223,391]. Insulina si IGF1 actioneaza prin intermediul familiei de receptori de tip tirozin-kinazici , receptorul de insulina (RI), respectiv receptorul IGF1 (IGF-1R), ce declanseaza o cascada celulara de semnalizare extrem de complexa mediata de o familie de proteine-receptorul insulinic de substrat (IRS) [223,391]. Insulina poate exercita efecte metabolice prin intermediul caii PI3K/AKT sau efecte mitogenice pe calea MAPKs (Ras/Raf/MEK/ERK), cele doua cai de semnalizare fiind intereconectate, ca apoi cele doua cai sa convearga pe o calea comuna mTOR/P70S6K [223,391].

In studiul actual pacientii ce nu au primit tratament cu Metformin au asociat mai frecvente diverse forme de neoplazie, Metforminul fiind corelat cu scaderea riscului de cancer in numeroase studii epidemiologice [391,401]. Metforminul scade riscul de cancer prin mai multe mecanisme: fie indirect in tesuturile periferice (ficat si muschi) prin scaderea concentratiei de insulina , fie direct printr-un mecanism ce implica LKB1/AMPK si phosphoinositide 3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycin signaling (P3IK/Akt/mTOR) [391].

Numeroase studii epidemiologice (de cohorta, caz control sau transversale) cat si meta-analize au evidentiat riscul de cancer in DZ si obezitate. O analiza si o lista completa a riscului de cancer in DZ si obezitate, redata pe subtipuri de cancer, ce include rezultatele a peste 60 metaanalize a se regaseste in tabelele de mai jos [ 244-325 ]

O observatie interesanta este ca, majoritatea studiilor privitoare la riscul de cancer in diabet sunt efectuate pe populatii non-asiatice. Studiul prospectiv a lui Wang et al 2015 efectuat pe o populatie asiatica, a identificat urmatoarele riscuri de neoplazie maligna : riscul general 1.19 (95% CI1.17–1.22) la barbati 1.15 (95% CI1.12–1.19) si la femei 1.25 (95% CI1.21–1.30); ficat 1.32 (95% CI1.23–1.41); colon 1.40 (95% CI1.27–1.55) ;rect 1.26 (95% CI1.14–1.40) ; pancreas 3.14 (95% CI2.89–3.42) ; prostata 1.78 (95% CI1.55–2.03) ; rinichi 1.64 (95% CI1.37–1.97) ;endometru 1.68 (95% CI1.38–2.06) [402].

Intru-un studiu extrem de amplu, unul din cele mai ample studii publicate ce trateaza asocierea diabet-neoplazie, a fost realizat de Tsilidis 2015 si colegii in prestigioasa revista British Medical Journal [403]. Studiul ce a constat intr-o evaluare de metaanalize, a avut ca obiectiv sa evalueze validitatea relatiei DZ-cancer, din punct de vedere al asocierii respectiv al riscului de deces prin cancer in populatia diabetica. Studiul a inclus 27 de meta-analize eligibile comparative si a evidentiat ca numai o mica parte din cancere au un suport si o baza solida si au o asociere indubitabila cu DZ si anume: cancerul colorectal, cancerul de san, cancerul endometrial si colangiocarcinomul intrahepatic. Pentru celelalte tipuri de neoplazie nu exista date suficient de puternice desi in studiile respective a existat semnificatie statistica. Principalul motiv pentru aceste concluzii negative sunt datorate criteriilor stricte de definire a validitatii studiilor.

Studiul actual are si o serie de limite importante , legate de metodologie, de design al studiului si de analiza preliminara a datelor. Pacientii au fost urmariti pe perioada unei singure internari, retrospectiv, fara a putea fi urmariti pe o perioada de timp anume (folow-up) si fara a se putea face o corelatie clara intre prezenta DZ si potentiala crestere a incidentei diferitelor tipuri de cancer.Studiul a inclus doar pacienti spitalizati, adresabilitatea pacientilor ce asociaza diabet si cancer fiind mai crescuta in mediul spitalicesc decat in ambulator, datorita patologiei complexe induse de asocierea celor doua afectiuni. Tratamentului oncologic (chimio sau radioterapic) risca sa induca atat un dezechilibru glicemic mai pronuntat, comparativ cu diabeticii ce nu asociaza cancer, cat si accentuarea altor comorbidiati asociate diabetului in momentul diagnosticului neoplaziei. O alta limita a studiului este data de lipsa certificarii diagnosticului de cancer si a tipului histologic, prin absenta datelor de diagnostic anatomopatologic din biletele de externare. Lipsa unei acurateti a datelor din lotul de studiu, prin absenta anumitor informatii sau prezenta de informatii incomplete in biletele de externare cum ar fi datele anamnestice (privind factorii de confuzie ai asocierii cancer-diabet, gradul de activitate fizica, fumatul, ereditatea,consumul de alcool), clinice sau paraclinice. O alta limita a studiului a fost numarul scazut de pacienti inclusi in lot si absenta unui lot de studiu comparativ non-diabetic standardizat functie de varsta, mediu de provenienta si sex pentru a cuantifica mai exact potentiala asociere a riscului de cancer in DZ. Modul de selectie al pacientilor inclusi in lotul final de studiu pe baza criteriilor de recrutare prezinta si el o limita. Datele preluate (in urma definirii termenilor de cautare din programul ProMedic) au fost incluse initial intr-o baza de date Microsoft Excel 2013, pe baza careia s-a efectuat analiza manuala utilizand functiile de cautare, filtrare, selectie si sortare, existand riscul de rezultate fals pozitive sau negative datorita criteriilor utilizate, in mod special datorita definirii termenilor utilizati in functia de filtrare a tipurilor/subtipurilor de cancer.

Concluzii

Prevalenta generala a diverselor forme de neoplazie maligna in populatia diabetica a fost de 2.13%, mai crescuta comparativ cu prevalenta din populatia generala, diferenta explicabila prin elemente ce tin de heterogenitate a populatiilor si/sau de designul studiului.

Comparativ cu celelate forme de neoplazie maligna din populatia diabetica, putem concluziona ca pacientii diabetici cu cancer colorectal au prezentat:

1 o prevalenta crescuta (15.10%) , fiind a doua forma de neoplazie prezenta in studiul actual, dupa cancerul de san (21%), dar anterior de cancerul de pancreas (12.42%, prevalenta usor mai crescuta comparativ cu cea din populatia generala a Romaniei si de la nivel mondial. S-a observat o prevalenta mult mai crescuta in populatia diabetica, comparativ cu prevalenta din populatia generala a cancerului pancreatic, explicabil prin elemente de localizare anatomica.

2.o predominanta a sexul masculin (66.7%), valori comparabile cu cele din literatura

3.varsta cea mai inaintata, cu o varsta medie (72.6ani), date comparabile cu cele din literatura

4.o asociere puternica cu DZ tip 2 (95.6%) si obezitate (IMC mediu de 33.3kg/m2), aproximativ 2/3 din pacientii diabetici si cu cancer colorectal in antecedente prezentand suprapondere sau obezitate (63.3%).

5. un control metabolic slab (HbA1c=9.1%), HbA1c comparabila cu cea din cancerul pancreatic, pulmonar sau prostata.

Cancerul colorectal comparativ cu alte forme de neoplazie la diabetici, nu s-a asociat cu o anume complicatie a DZ, sau cu vreun anume tip de tratament antidiabetic.

In populatia generala a lotului de studiu pacientii ce nu au primit Metformin au avut o prevalenta mai crescuta a neoplaziilor maligne, semnficativa statistic (p=0.028).

Chiar daca studiul actual a avut numeroase limite, el a putut evidentia pe o perioada relativ scurta de timp prevalenta diverselor forme de cancer intr-o populatie de pacienti diabetici internati si a identificat anumite caracteristici ale cancerului colorectal comparativ cu a altor forme de neoplazie maligna la pacientii diabetici.

Sunt necesare studii ulterioare prospective pe termen lung, pe loturi mari de pacienți care sa investigheze parametrii suplimentari, de tip clinic (AHC de cancer si DZ, consum de tutun, alcool,inaltimea, greutatea, circumferinta taliei, circumferinta soldului, duratei de evolutie a DZ, tipul de tratament, complicatiile specifice si nespecifice DZ) si paraclinic de tip metabolic (evaluarea rezistentei la insulina prin dozarea insulinemiei, glicemiei si calculul HOMA, evolutia temporala a spectrului glicemic evaluata prin efectuarea HbA1c la 3 luni, dozarea IGF1 si a IGFBP, dozarea citokinelor proinflamatorii, dozarea leptinei, adiponectinei) sau de tip tumoral (evolutia markerilor tumorali CEA, sau CA19-9, utilizarea de metode de screening imagistic sau endoscopic pentru certificarea si stadializarea precoce a unor potentiale neoplazii maligne asociate mediului diabetic sau evaluarea IGF1R sau IR-A sau IR-B in tesutul tumoral), cat mai ales analiza gradului de asociere si interferentei acestor parametrii, pentru a putea evalua mai exact prevalența, incidenta si mecanismele biologice subiacente, ale relatiei DZ-cancer.

CAPITOLUL 9

STUDIUL2: PREVALENȚA DIABETULUI ZAHARAT LA PACIENȚII CU DIVERSE TIPURI DE CANCER NOU DIAGNOSTICATE ÎN SPITALUL CLINIC DE URGENȚĂ BUCUREȘTI

INTRODUCERE.Premise.Scop.Obiective

Cancerul și diabetul zaharat (diabetul zaharat-DZ tip 2) sunt două boli complexe, heterogene, caracterizate prin:

-caracter insidos,

-în etiologia lor sunt implicați atât factori genetici cât și factori de mediu,

-au o relație fiziopatologică complexă ambivalentă,

-epidemiologic au o incidență în creștere,

-sunt grevate de o morbiditate și o mortalitate crescută.

Numeroase studii au evidențiat o creștere moderată a riscului de neoplazie la pacienții cu DZ tip 2 în special în sfera genitală feminină și organele anexe (sân, ovar, uter, col uterin), dar și în sfera digestivă (ficat, pancreas, colon, rect).

Scopul studiului a fost să evalueze prevalența diabetului zaharat (DZ) la pacienții cu cancer colorectal nou diagnosticat comparativ cu al altor tipuri de neoplazie malignă, la pacienții internați în Spitalul Clinic de Urgență București în perioada 01.01.2012-01.03.2015.

Figura Scopul principal al studiului

Obiectivele studiului au fost sa efectueze o analiză comparativă atât generală cât și în funcție de datele demografice (vârstă și sex) a prevalenței DZ în populația cu cancer colorectal nou-diagnosticat în raport cu a altor tipuri de neoplazie nou-diagnosticate.

MATERIALE METODE

Materiale și metode: Studiul este unul retrospectiv și a folosit programul informatic medical Hipocrate existent în spital, pentru a selecta toți pacienții externați cu diagnosticul principal de tumoră malignă primar conform Clasificării Internaționale a Maladiilor Ediția a10-a (ICD-10-CM) din biletele de externare astfel: cancerul esofag (C15), cancerul de stomac (C16) cancerul de intestin subțire (C17),cancerul de colon (C18), cancerul recto-sigmoidian (C19), cancerul de rect (C20), cancerul anal (C21), cancerul hepatic (C22), cancerul de vezică biliară (C23), cancerul de pancreas (C25), cancerul de piele-melanom și non-melanom (C43, C44), cancer de sân (C50), cancer de ovar (C56), cancer uterin (C53-C55), cancer ovar (C56).

Ulterior cazurile identficate în studiul actual au fost centralizate într-un tabel ce a inclus trei coloane: prima coloană corespunzatoare sexului (feminin sau masculin), a doua coloană corespunzând vârstei și o a treia coloana corespunzatoare diagnosticelor primare și secundare (tuturor diagnosticelor de externare ale pacientului).

Am identificat un număr total de 4396 pacienți conform criteriilor de căutare, din care am selectat un număr de 3817 pacienți cu diagnostic de tumoră malignă primară. Ulterior din cele 3817 cazuri am selectat doar pacienții unici internați, respectiv 3263. După excluderea cazurior în care datele erau incomplete în final lotul de studiu a cuprins un număr de 3012 pacienți unici internați cu diagnostic de tumoră malignă primară ce prezentau date complete (vezi figura) .

Figura II.1 Criteriile de selecție ale pacienților incluși în studiu.

Pentru analiza datelor în urma criteriilor de căutare s-a identificat o baza de date, ce a fost exportată în Microsoft Excel 2013. Ulterior informațiile au fost analizate și stratificate funcție de criteriile de excludere și includere în studiu într-un tabel dispus pe coloane grupat funcție de datele demografice (vârstă și sex) diagnosticul primar de cancer și diagnosticele secundare.

S-au considerat „tumori primare nou diagnosticate” toate tumorile identificate pe baza criteriilor de căutare ce corespundeau primei poziții în rubrica de diagnostice.

Criteriile de includere ale studiului au inclus pacienți majori cu vârsta >18 ani, atât bărbati cât și femei, ce au prezentat tumora malignă primară nou diagnosticată. Prezența oricărui tip de DZ (T1D, T2D, DZ secundar) în grupa de diagnostice secundare a fost considerată diagnostic de DZ.

Criteriile de excludere din studiu au cuprins, pacienții minori cu vârsta<18 ani și cazurile identificate ca și primare (la căutare utilizând criteriile ICD-10) fără corespondent însa de tumora primara în rubrica de diagnostice .

Rezultate:

În total studiul a inclus un număr de 3048 pacienți cu diverse forme de cancer primare, din care 374 (12.7%) de pacienți diabetici și 2674 de pacienți non-diabetici (87.3%).

Vârsta medie a pacienților incluși în studiu a fost de aproximativ 66 ani, în lotul diabetic fiind mai crescută cu aproximativ 3 ani (69.4 ani) comparativ cu lotul non-diabetic (66.1 ani) (figura II.2A).

Figura II.2.Distribuția vârstei medii și a grupelor de vârstă în cele doua loturi ale studiului.

Limitele de vârstă în lotul diabetic au au fost 20 respectiv 97 ani, iar în lotul non-diabetic între 20 și 99 ani. Distribuția pe grupe de vârstă a cazurilor a fost asemănatoare, fiind redată în figura II2.B.

Distribuția pe sexe a indicat o predominanță usoară a sexului masculin în ambele loturi, cu o diferență ușor mai mare pentru lotul diabetic (figura II.3A).

Figura II.3 Distribuția procentuală și numerică pe sexe (A) , și pe vârstă și pe sexe (B) , a celor doua loturi studiate.

Femeile au predominat în lotul diabetic și au prezentat o vârstă mai înaintată comparativ cu bărbații (78.3vs67.9%/62.1 vs 59.1%) cum este descrisă în figura II.3.

Analiza detaliată, numerică și procentuală a frecvenței fiecărui tip de cancer în cele doua loturi ale studiului este redată în tabelul II.1.

Tabel nr II.1Distribuția subtipurilor de cancer (numerică și procentuală) în cele două loturi studiate.

Deși prevalența cea mai crescută a DZ s-a inregistrat în cazul pacienților cu cancer de pancreas, cancerul colorectal a prezentat cea mai crescută frecvență comparativ cu celelalte forme de cancer în populația studiată atât în lotul diabetic (n=155; 40.6%) cât și non-diabetic (n=1152; 43.8%) din totalul cazurilor incluse în studiu.

Aproximativ un sfert din pacienții ce prezintă cancer de pancreas asociază și DZ, fiind forma de cancer cu frecvența cea mai crescută în DZ (figura II.4).

Figura II.4. Prevalența DZ în diversele subtipuri de cancer.

Repartiția pe sexe a prinicipalelor forme de neoplazie în cele doua loturi indică o predominanță a sexului masculin, cu excepția cancerului de sân, care este asociat aproape exclusiv cu sexul feminin (figura II.5).

Figura II.5.Distribuția numerică și procentuală, pe sexe a celor mai frecvente forme de neoplazie malignă în lotul diabetic/non-diabetic.

Privitor la analiza pe subgrup a cancerului colorectal putem spune că în studiul actual, pacienții cu cancer de colon s-au asociat cel mai frecvent cu DZ (13%) (figura 13E) și au prezentat la diagnostic vârsta cea mai înaintată atât în grupul diabetic cât și non-diabetic (figura 13C,D). Bărbații au fost mai frecvenți în toate cele 3 subtipuri de cancer colorectal (vezi figura), atât la diabetici cât și la non diabetici cu frecvența cea mai crescută în cancerul de joncțiune rectosigmoidiană (C19) în lotul diabetic (figura 13A) și în cancerul de colon (C18) în lotul non-diabetic (figura13B).

Analiza funcție de grupa de vârstă, a evidențiat o predominanță a sexului feminin în grupa de vârstă >65 ani iar sexului masculin în grupa de vârstă sub <65 ani atât în grupul diabetic cât și non-diabetic cu cancer colorectal (figura II.6C). Pacienții diabetici cu cancer colorectal au prezentat o vârstă mai înaintată comparativ cu non-diabeticii ( figura II.6C).

Figura II.6.Analiza cancerului colorectal. Distribuția pe subtipuri de cancer funcție de sex în lotul diabetic (A) sau nondiabetic (B).Distribuția funcție de sex și grupe de vârstă (C). Distribuția pe subtipuri de cancer funcție de vârsta medie în cele doua loturi (D).Prevalența DZ în subtipurile de cancer colorectal (E).

Discuții:

În total studiul a inclus un număr de 3048 pacienți cu diverse forme de cancer, din care 374 de pacienți diabetici și 2674 de pacienți non-diabetici, prevalența medie a DZ în populația studiată fiind de 12.27% ușor crescută față de prevalența DZ în populația adultă din Romȃnia (20-79 ani) de 11.6% conform studiului PREDATORR [404]. Spectrul de vârstă utilizat în studiul PREDATORR (20-79 ani) este superpozabil spectrului de vârstă din studiul nostru (20-99 ani). Prevalența DZ din studiul nostru, superioară prevalenței DZ din studiul PREDATORR, în funcție de subtipul de cancer a fost următoarea (in ordine descrescătoare): 22.4 % pentru cancerul de pancreas, 22.2% pentru cancerul de vezica biliară, 17.3 % pentru cancerul de sân, 12.5% pentru cancerul gastric, 11.9 % cancerul colorectal (figura II.8A,B).

Cancerul colorectal a prezentat o frecvență mai crescută în lotul studiat , comparativ cu incidența din Romania sau de la nivel global (figura II.7, tabel II.2). Acest fenomen este explicat prin profilul specific de adresabilitate al secțiilor de chirurgie din cadrul spitalului.

Figura II.7.Incidența comparativă a diverselor tipuri de cancer în populația din lotul de studiu și populația din Romania și de la nivel global.

Mediul diabetic este un mediu favorabil carcinogenezei (prin asocierea si potențarea diverșilor factori de risc: hiperglicemie, rezistența la insulină, creșterea stresului oxidativ, modificări hormonale,inflamație cronică), iar diagnosticul și tratamentul precoce al DZ se asociază atât cu scăderea incidenței anumitor forme de cancer cât și cu a mortalității prin cancer la pacienții diabetici.

Există o interrelație între prezenăa cancerului și a DZ în mod particular pentru cancerul de pancreas. Relația cancer-pancreatic DZ este una bidirecțională. Prevalența DZ în cancerul pancreatic în studiul lui Chari et al 2008. este foarte crescută fiind de aproximativ 40% iar DZ este adesea este nou diagnosticat [405-406].

Într-un studiu prospectiv efectuat pe 2122 de pacienți diabetici de către Chari și colab, au fost diagnosticați cu cancer de pancreas în primii 3 ani de evoluție ai DZ, un număr de 18 pacienți, respectiv aproximativ 0.85% din cazurile de pacienți diabetici .Se poate astfel enunța că aproximativ 1% din pacienții diabetici cu vârsta ≥50 ani, vor fi diagnosticați cu cancer de pancreas în primii 3 ani de la diagnosticului DZ. În acest mod cancerul pancreatic poate fi privit ca o afecțiune cu un puternic status diabetogen fiind asociat cu factori de risc convenționali ai DZ și având capacitate crescută de a induce hiperglicemie (prin modificări directe anatomice cât și indirecte prin intermediul citokinelor proinflamatorii), apariția DZ fiind astfel un posibil semn premonitoriu al cancerului pancreatic la un anumit subset de pacienți [405,407,408].

Cea mai frecventă forma de cancer în studiul actual a fost cancerul colorectal. Comparativ, la nivel mondial cancerul colorectal este a treia formă de cancer ca și incidență dupa cancerul pulmonar și de san, asa cum este figurat în tabelul II.2

Figura II.8.A.Prevalența comparativă a DZ în subtipurile de cancer ce prezintă o prevalență superioară valorii din studiul Predatorr;B.Prevalența studiului Predatorr în Romania. Adaptat dupa Mota M si colab [433].

Figura II.9.Studiu Predatorr. A.Prevalența tulburărilor de glicoreglare.B. Prevalența DZ (%) pe grupe de vârstă. C Figuri PREDATORR Adaptat după Mota M si colab [404].

După cum se poate observa în datele din studiul PREDATORR există un procent de pacienți ce prezintă modificări glicemice din spectrul diabetic ce nu sunt diagnosticați, valoarea acestui procent fiind direct proportională cu vârsta pacienților (figura II.9A,B), astfel cel putin teoretic dacă este să luam în calcul aceasta observație, prevalența generală a pacienților cu DZ este mai crescută cu cel putin 2.4% (fără să luam în considerare și potențialul evolutiv inductiv diabetogen al neoplaziei maligne, ce ar crește acest procent).

Bărbații au predominat în populația diabetică, pentru toate tipurile de neoplazie dar și în rândul pacienților cu neoplazie malignă colorectală (figura II.3A), ceea ce corespunde asocierii DZ cu sexul masculin în populația generală confrom stduiului PREDATORR (figura II.9C).

Datele din literatura de specialitate se coroborează cu datele obtțnute în studiul actual , asociind mediul diabetic cu un risc oncogen crescut pentru mai multe subtipuri de cancer cum ar fi cancerele din sfera digestivă sau cele din sfera genitală feminină [ 391] .

În studiul actual în mod suprinzător cancerul hepatic a avut o asociere slabă cu DZ comparativ cu datele din literatura de specialitate ce corelează puternic prezenta DZ cu riscul de cancer hepatic [250,251,299,300].

Analiza a subtipurilor de cancer colorectal, a indicat o asociere mai slabă a cancerului rectal cu DZ în studiul actual comparativ cu cancerul de colon (cu o diferență procentuală de 4%) sau de joncțiune rectosigmoidiană (3%). Această prevalență scazută a diverselor parți anatomice ale colonului și rectului, poate fi explicată prin câteva diferențe notabile: natura embriologică (provin din diferite segmente ale tubului digestiv primitiv), histologică (conține celule diferite atât ca proporție cât și ca funcție), anatomice (vascularizație din arterele mezenterice inferioare comparativ cu cele superioare pentru porțiunea proximală a colonului, inervație prin nervii sacrați comparativ cu nervul vag pentru porțiunea proximală a colonului), funcționale (depozit de fecale pentru rect, comparativ cu celelalte porțiuni ale colonului utilizate pentru transportul apei și nutrienților), diferențe în acțiunea factorilor de risc dar și diferențe privind mecanismele moleculare implicate în carcinogeneza ( cancerul rectal asociază atât stabilitate microsatelitară și instabilitate cromozomială comparativ cu cancerul de colon ce asociază instabilitate microsatelitară, însă și o implicare crescută a căilor TP53 și β cateninelor)[409]. Aceste particularități creează la nivel colorectal trei zone teoretic distincte: 1.regiunea proximală a colon (ce include Cecul,CA, CT până la flexura splenică a colonului) 2.regiunea distala colon (CD, sigmoid) și 3.regiunea rectală [409].

Vârsta mai inaintată a pacienților din lotul de diabetici poate fi explicată prin creșterea duratei de acțiune a factorilor de risc diabetici oncogeni. Asocierea între cancerul colorectal și diabet necesită o evoluție mai îndelungată a DZ pentru a crește riscul apariției complicațiilor (neuropatia diabetică vegetativă digestivă) dar și pentru a crește durata de expunere la acțiunea factorilor diabetogeni generali de risc ( hiperinsulinismul cronic, inflamația cronică subclinică, hiperglicemia etc).

În studiul actual sexul masculin s-a asociat mai frecvent cu cancerul colorectal dar și cu alte tipuri în mod special cancerul gastric și pancreas, evidente ce sunt în context cu datele din literatura de specialitate [244-249, 252-256, 259 ].

În studiul lui Lonneke et al 2007 [410], efectuat pe o populație olandeză de 42,921 de pacienți nou diagnosticați cu cancer în perioada 1998-2002 înscriși în Registrul de Cancer din Eindhoven, prevalența DZ în aceasta populație a fost de 9%. Funcție de subtipul de cancer cea mai crescută prevalență a fost în cancerul de pancreas(19%), uter (14%) și cancer renal (8%), iar pentru cancerul de sân, colon și ovar, prezența DZ s-a asociat mai frecvent cu un stadiu tumoral mai avansat. Comparativ cu intervalul de referință privind prevalența DZ în populația generală, prevalența DZ în rândul pacienților cu cancer a fost mai crescută în grupul de populație tânără (35-64 ani) astfel (5.2% vs. 3.4% la bărbați și 3.9% vs. 2.7% la femei) pentru toate tipurile de cancer [410]. Grupul vârstnic (>65 ani) a asociat o prevalență crescută doar în cancerul pancreatic și endometrial [410]. Această diferență de prevalență pe grupe de vârstă se explică prin creșterea frecvenței prevalente a DZ în populația vârstnică (figura II.10), dar concomitent poate sugera și evidenția rolul potențial al cancerului în inducerea DZ.

Creșterea prevalenței DZ la nivel mondial are multplii factori etiologici, cei mai importanți fiind creșterea prevalenței obezității cât și fenomenul de îmbătrânire al populației (senescentă) (figura II.10).

Figura II.10. Prevalența (%) pacienților cu DZ funcție de vârstă la nivel mondial în anul 2013. Adaptat după IDF Diabetes Atlas ed 6 [411]

Se remarcă o heterogenitate (de peste 2 ori) în privința prevalenței DZ în diversele zone ale lumii (figura II.11), cu o prevalență maximă în zona Caraibelor și Americii de Nord și cu o prevalență minimă în Africa.

Figura II.11.Prevalența comparativă a DZ in diversele zone ale lumii [IDF Diabetes Atlas 6 ed].

Studiul nostru are și o serie de limite majore legate fie de metodologia de diagnostic a cancerului și/sau DZ, fie de designul studiului (retrospectiv) sau de analiza a datelor.

1. Diagnosticul de DZ este preluat ca atare din rubrica de diagnostice fără a cunoaște dacă diagnosticul de DZ prezent în această rubrică este certificate printr-o metodă standardizată, astfel anumite cazuri de diabet putănd fi omise sau încadrate incorect. Prevalența diabetului zaharat în diversele forme de cancer este teoretic mai mare, deoarece caracterul insidios al celor două boli maschează debutul DZ. Astfel o parte din pacienții ce nu se cunoșteau anterior cu DZ este posibil să prezinte modificări variabile ale spectrului glicemic de la prediabet la DZ, posibil potențate (accentuate) și de prezența neoplaziei fără însă a putea fi diagnosticate și încadrate corect datorită lipsei unei metode de screening standardizate (cum ar fi efectuarea la internare a HbA1c). Analiza de rutină a unor valori glicemice bazale în contextul modificărilor determinate fie de prezența neoplaziei fie a investigațiilor suplimentare și/sau eventual terapiei de suport nu reprezintă o metoda eficientă și sigură de evaluare a spectrului glicemic. O altă explicație posibilă este menționarea în rubrica de diagnostice din studiu, doar a cazurilor de DZ deja cunoscute și aflate pe diverse scheme de tratament antidiabetic existente (cu o perioadă variabilă de timp) anterior momentului de diagnostic al cancerului cu omiterea cazurilor de DZ nou apărute sau/și a modificărilor glicemice inconsistente dar suficiente pentru a diagnostica DZ..

2.Biletele de externare sunt efectuate pe secțiile de chirurgie și nu conțin informații detaliate și complete legate de dezechilibrul glicemic cronic (tipul de diabet zaharat, durata de evoluție , gradul de control glicemic, schema terapeutică ce include tipul de tratament și doza) ce ar putea corela anumiți parametrii cu apariția cancerului.

3.Diagnosticul primar de cancer nu este certificat histologic, ci este preluat direct din rubrica cazurilor identificate pe baza criteriilor de cșutare (utilizând terminologia ICD-10) ca și prim diagnostic.

4.O alta limită majora a studiului actual este heterogenitatea numerică a pacienților cu diverse tipuri de cancer, unele forme de neoplazie cuprinzând un număr extreme de redus de cazuri (de ordinul cifrelor) pentru a putea trage o concluzie în raport cu o potențiala relație de asociere cu DZ.

5.Analiza datelor prezintă și ea o limita, efectuându-se cu ajutorul Microsoft Excel. Ea a avut la baza analiza manuală utilizând funcțiile de căutare, filtrare, selecție și sortare, existând riscul de rezultate fals pozitive sau negative datorită criteriilor utilizate, în mod special datorită definirii termenilor utilizați în funcția de filtrarea tipurilor/subtipurilor de cancer.

Concluzii:

Prevalența crescută a DZ în cancerul pancreatic, în cel de vezica biliara, în cancerul de san, în cel de colon și în cel gastric se corelează cu datele deja existente în literatura de specialitate, majoritatea studiilor evidențiind un risc crescut de asociere a DZ cu diverse forme de cancer, localizate la nivelul situsurilor de mai sus. În mod particular pentru aceste forme de cancer există o potențială relație asociativă DZ-cancer. Asocierea acestor tipuri de cancer cu DZ are la bază datele din studiul PREDATORR, studiu ce a identificat o prevalență de 11.6 % a DZ în populația adultă (20-79 ani) din România, ușor inferioară prevalenței medii a DZ de 12.68% din studiul nostru. Este nevoie de studii prospective,care să includă loturi mari de pacienți, standardizate pentru diagnosticul DZ, care să depisteze DZ în stadii cât mai incipiente (chiar din stadiul de prediabet) și monitorizarea pacienților cu DZ deja existent în momentul diagnosticului de cancer pentru evaluarea mai exactă a gradului de corelare cu potențială creștere a incidenței diverselor tipuri de cancer la pacienții diabetici.

Deși studiul actual prezintă numeroase limite și dezavantaje de diverse ordine, el reușește să evidențieze un trend asociativ între cancer și DZ în mod special pentru anumite tipuri de cancer (cum sunt: cancerul pancreatic,în cancerul de vezica biliara, în cancerul de san, cancerul endometrial, cancerul de colorectal și pentru cancerul gastric), date ce se corelează cu datele existente în literatura de specialitate.

Chiar dacă prevalența cea mai crescută a DZ s-a inregistrat în cazul pacieților cu cancer de pancreas, cancerul colorectal a reprezentat cea mai frecventă formă în populația studiată atât în lotul diabetic (40.6%) cât și non-diabetic (43.8%) din totalul cazurilor incluse în studiu. Analiza funcție de subtipul de cancer colorectal a inidcat un trend asociativ între prezența DZ și localizarea anatomică a tumorii, asoicerea cea mai crescută a DZ fiind pentru neoplaziile de colon (13%), urmate de neoplaziile regiunii rectosigmoidiene (12%) și o asociere slabă cu cancerul de rect (9.3%). Pacienții ce au prezentat cancer colorectal au avut vârsta mai înaintată comparativ cu non-diabetici pentru toate cele 3 subtipuri, cu o diferență de aproximativ 3 ani. Sexul masculin a fost predominant în toate cele trei subtipuri de cancer colorectal atât în grupul diabetic cât și non-diabetic, nu însă și în grupul de pacienți vârstnici (>65ani) unde a predominat sexul feminin.

Prevalența reală a DZ la pacienții cu cancer din studiul nostru ar putea fi mult mai mare datorită cazurilor de DZ nediagnosticate.

Deși datele din literatura de specialitate asociază DZ cu un risc usor-moderat pentru cancerul colorectal (C18-C20), în studiul nostru asocierea este una relativ modestă pentru neoplazia de colon și cancerul regiunii recto-sigmoidiene, iar pentru cancerul rectal aceasta este una slabă și chiar negativă (mai scazută comparativa cu prevalența DZ în populația generală adultă a Romaniei conform studiului PREDATORR). Această asociere modestă a prevalenței DZ în populația neoplazică din studiul nostru, poate fi cel putin la nivel teoretic, mai crescută datorită existenței cazurilor potențiale de DZ non-diagnosticate.

Datorită complexității relației diabet-cancer și prezenței factorilor de confuzie, putem afirma, că pentru o mai buna cuantificare epidemiologica a relației asociative DZ-cancer și cancer colorectal în mod special sunt necesare studii cu design prospectiv, desfășurate pe intervale îndelungate de timp (datorită caracterului insidios, etiologiei obscure și potențialei interferențe a mecanismelor fiziopatologice a celor doua afecțiuni) care să includă loturi mari de pacienți, standardizate pentru diagnosticul DZ, ce pot depista modificările precoce ale spectrului glicemic, în stadii incipiente (chiar din stadiul de prediabet), dar și monitorizarea pacienților cu DZ deja existent prin metode de screening pentru diagnosticarea precoce a neoplaziei cu evaluarea exacta a prevalenței DZ și corelarea cu potențiala creștere a incidenței diverselor tipuri de cancer la pacienții diabetici.

CAPITOLUL 10

STUDIUL 3.Studiul histologic si IHC al proteinelor Bcl2 si p53 in ADK colorectale la pacientii diabetici versus non-diabetici

INTRODUCERE

Cancerul si DZ sunt 2 afectiuni cronice complexe, frecvente, avand o incidenta si o prevalenta in crestere. Studiile au evidentiat ca persoanele cu DZ tip2 prezinta un risc semnificativ mai mare pentru anumite forme de cancer, cele mai reprezentative fiind: colorectal, pancreas, hepatic, san, uterin [391].

Pacientii diabetici prezinta o incidenta si o mortalitate crescuta a cancerului colorectal, cu un risc suplimentar de a dezvolta cancer CCR de aproximativ 30% comparativ cu non-diabeticii, acest risc fiind crescut direct proportional cu durata de evolutie a DZ [255,303]. Cuantificarea cu exactitate a gradului de risc este extrem de dificila din cauza numerosilor factori de confuzie comuni (dieta neadecvata, sedentarismul, prezenta obezitatii sau a sindromului metabolic, varsta inaintata etc). Desi cifrele nu indica un risc major, totusi prevalenta crescuta a celor doua maladii (prevalenta globala a DZ in 2013 fiind de aproximativ 387 milioane de persoane [411], iar CCR cu o incidenta globala in 2012 de 1.3 milioane de cazuri , si o prevalenta globala in 2012 de 3.5 milioane de persoane, fiind al 3-lea tip de cancer ca frecventa la ambele sexe, dupa cancerul pulmonar si de san) fac ca aceasta potentiala asocierere sa reprezinte o importanta cauza de morbiditate si mortalitate in lume[3]. Cancerul colorectal se asociaza cu DZ, datorita factorilor de risc generali din DZ (hiperglicemia, hiperinsulinemia, cresterea biodisponibilitatii IGF1 liber, procesului inflamator cronic subclinic marcat prin cresterea concentratiei citokinelor proinflamatorii), iar in mod particular datorita unor comorbiditati si factori de risc specifici DZ : alterarea microbiotei intestinale, aparitiei neuropatiei autonome digestive cu cresterea frecventei constipatiei, alterarea homeostaziei acizilor biliari. Totusi nici unul din aceste mecanisme, nu poate explica in totalitate mecanismele moleculare ale asocierii DZ-CRC [390].

Majoritatea cancerelor apar prin acumularea de mutatii genice care conduc la o dereglare a proliferarii si homeostaziei celulare, rezultand proliferarea celulara necontrolata. Organismul uman detinand mecanisme de control a proliferarii celulare care impiedica cresterea celulelor mutante prin inducerea apoptozei acestora. Apoptoza prezinta doua cai : extrinseca si intrinseca, calea majora apoptotica fiind calea intrinseca(mitocondriala) ce este controlata de proteinele din familia Bcl-2 (B cell lymphoma 2). In procesul de apoptoza intervine si proteina supresoare p53, codata de gena TP53, avand rol de inducere a apoptozei in celulele ce contin mutatii ale ADN. Suplimentar controlului procesului apoptotic, familia proteinelor Bcl-2 dar si proteina supresoare p53 detin doua functii extrem de complexe, avand rol in controlul ciclului celular dar si in metabolismul energetic. Prin aceste roluri plurivalente, cele doua proteine pot constitui o potentiala veriga asociativa intre boala neoplazica si bolile metabolice in general, iar in mod particular intre cancer si diabet zaharat.

Familia proteinelor Bcl2 a fost descoperita cu mai bine de 30 de ani in urma, prin translocatia t(14;18) in limfomul folicular ce determina hiperexpresie Bcl2 si cresterea proliferarii foliculare[123].Familia Bcl-2 consta intr-o serie de proteine (ce impart secvente comune omoloage cunoscute ca Bcl- 2 homology (BH) domains cu roluri antiapoptotice dar si proapoptotice). Proteina Bcl2 apartine grupului antiapoptotic „BH1-BH4” al familiei proteinelor Bcl2, din care mai fac parte si (Bcl-XL, Mcl1 etc) prevenind apoptoza prin inhibarea proteinelor proapoptotice „BH1-BH3” (Bax si Bak)[39]. Celalat grup proapoptotic „BH3” al proteinelor Bcl2 are functie duala in inducerea apoptozei: poate activa direct proteinele proapoptotice BH1-BH3 prin intermediul Bim si Bid sau poate inhiba proteinele proapoptotice BH1-BH4 si indirect favoriza in acest mod proteinele proaptotice Bax si Bak[412]. Aceasta interactiune complexa si interdependenta intre membrii acestei familii de proteine, influentata si de factori metabolici va decide soarta celulei prin modificarea balantei intre proteinele proapoptotice si antiapoptotice. In mod normal la nivelul membranei mitocondriale externe ( OMM) este localizata numai proteina antiapoptotica Bcl2 si proaptoptotica Bak, in timp ce mare parte din proteinele proapoptotice sunt libere in citoplasma fiind translocate ulterior la nivelul OMM in urma unui semnal apoptotic[39]. Nivelul si localizarea intracelulara a acestor proteine este reglata prin modificari transcriptionale sau posttranslationale [412].

Studii foarte recente au evidentiat ca proteinele Bcl-2 au o functie extrem de complexa si pot interactiona si cu proteine non-Bcl2. In acest mod familia proteinelor Bcl-2 are caracter plurivalent fiind implicata suplimentar dar si independent de procesul de apoptoza, intr-o serie de procese homeostatice, cum ar fi, controlul punctelor cheie ale ciclului celular, in mecanismul de corectie al ADN, in metabolismul energetic (atat metabolismul glucidic cat si in metabolismul energetic mitocondrial), in morfologia mitocondriala si homeostazia calciului [40].

Forma normala a proteinei p53 sauproteina WTp53 („wild type” ) este o proteina complexa cu rol de factor de transcriptie, avand o distributie nucleara iar tisular o expresie ubiquitara. Proteina WTp53 este activata de anumiti agenti stresori ce regleaza o multime de functii celulare complexe prin controlul expresiei unor gene, cum ar fi: apoptoza, autofagia, senescenta, corectia ADN, sistemul redox, metabolismul glucidic, metabolismul glutaminei, metabolismul lipidic dar si procesul de fosforilare oxidativa[175] (figura III.001). Prin coordonarea acestor procese p53 mentine homeostazia metabolica celulara si integritatea genomica prevenind aparitia tumorilor prin reglarea disponbilitatii celulare de nutrienti in raport cu supravietuirea celulara, putand fiind considerat ca un centru de comanda celular[175].Blocarea acestei cai de semnalizare prin multiple mecanisme favorizeaza proliferarea tumorala si rezistenta la tratament [162].

Figura III.001. Functia si mecanismele de reglare ale proteinei supresoare tumorale p53 .Adaptat dupa [161,413].

Proteina p53 este un supresor critic tumoral, mutatia sau pierderea p53 este prezenta in medie in aproximativ 50% din cancere, cu o expresie diferita in functie de tipul de tumora. Sindromul Li Fraumeni este o afectiune autozomal dominanta ce se caracterizeaza prin prezenta alelei mutante a p53 si asocierea cu diverse forme de cancer:leucemiile, tumorile cerebrale, sarcomul, carcinomul adrenocortical, si cancerul de san. Pe modelele murinice cu absenta completa a p53 incidenta cancerului a fost de 100% [161].

Tehnica IHC poate fi utilizata ca o metoda de detectie indirecta a mutatiei genei p53 ,fiind folosita uzual ca metoda de screening tumoral pentru detectia prezentei acestei mutatii[414,415]. In conditii normale metoda IHC nu poate detecta proteina WTp53 datorita instabilitatii sale, avand o durata de viata foarte scurta (5-30min)[416] si o expresie nucleara extrem de redusa[34]. Forma mutanta a p53 insa, se va acumula la nivel nuclear (prin inhibarea metabolizarii de catre Mdm2) si va atinge un prag de detectie IHC datorita expresiei aberante crescute si a duratei de viata mai lungi [415]. Putem afirma atsfel, ca pattern-ul (modelul) de coloratie IHC a p53 poate fi considerat un marker surogat pentru mutatia p53 in cancer [443].

Proteina supresoare tumorala p53 poate inhiba activitatea proteinei Bcl2 in mai multe moduri: fie prin interactiune directa cu Bcl2 si blocarea actiunii antiapoptotice a Bcl2 actionand ca o proteina de tip BH3 din familia Bcl2, sau prin intermediul factorilor de transcriptie PUMA, NOXA [180-183]. Actiunea proaapoptotica a p53 este mediata de activarea tintelor proapoptotice a p53 ce vor dezechilibra balanta in favoarea proteinelor proapoptotice si vor inhiba prin diverse mecanisme actiunea proteinelor antiapoptotice [180 ](vezi figura)

Figura III.00. Interrelatia Bcl2/p53.Adaptat [180]

Studiile [417-420] au evidentiat o asociere intre p53 si Bcl-2 in adenocarcinomul colorectal (ACR), expresia pozitiva a p53 fiind asociata in general cu un prognostic nefavorabil.

Importanta stiintifica a studiului deriva din faptul ca este primul studiu pe subiecti umani care investigheaza in paralel factori implicati atat in patogeneza DZ (o serie de studii indicand ca hiperglicemia modifica expresia familiei proteinelor Bcl2 si expresia p53 in celula β)[141,421,422]] cat si in patologia maligna [417-420]. Pana in prezent acesti markeri nu au mai fost studiati impreuna , ci separat pentru fiecare patologie in parte, fie in DZ fie in diverse tipuri de cancer. Pornind de la faptul ca ACR este mai frecvent intalnit la pacientii diabetici comparativ cu populatia generala, ne propunem ca pe baza acestui studiu sa investigam un potential mecanism de asociere patogenica, intre cancer (ACR) si DZ prin cuantificarea expresiei IHC a celor 2 proteine. Ipoteza studiului implica existenta mediului diabetic cu modificarile fiziopatologice aferente, ce conduc la o semnalizare excesiva in anumite cai, ce vor interfera cu activitatea complexa a p53 dar si indirect cu activitatea proteinei Bcl2, fie prin intermediul p53, fie prin modificarea raportului intre proteinele pro-apoptotice si antiapoptotice ale familiei Bcl2.

Scopul studiului a fost sa determine si sa compare prin metoda imunohistochimica (IHC) atat a patternului, gradului de expresie si coexpresie a proteinei proapoptotice Bcl2 si a proteinei supresoare tumorale p53 ,cat si sa compare parametrii clinico-morfopatologici la pacientii cu adenocarcinom (ADK) colorectal asociat sau nu DZ tip2.

Obiectivul central al studiului a fost sa evalueze comparativ ADK colorectal la pacientii diabetici versus non-diabetici raportat la aspectele aspectele imunofenotipice ale tumorii (prin evaluarea IHC a gradului de expresie si coexpresie a proteinelor Bcl2 si p53) cat si a aspectelor histologice morfotipice [obtinute prin colorarea standard hematoxilin-eosina (HE) a pieselor tumorale si studiate ulterior prin microscopie optica cu evaluarea invaziei limovasculare (IVL), invaziei perineurale (IPN), raspunsului limfocitar intratumoral (RLI), raspunsului inflamator peritumoral (RIP) si evaluarea gradului de diferentiere histologica a tumorii (G)].

Un obiectiv secundar a fost sa evalueze aspectele clinice particulare (modul de prezentare, tipul de interventie chirurgicala, evolutia postoperatorie [evaluata prin numarul de zile de spitalizare, numarul de zile de ileus, frecventa complicatiilor si tipul cel mai frecvent de complicatie post-operatorie], prezenta comorbiditatilor asociate [obezitate, diabet, dislipidemie, BCI], tipul de tratament antidiabetic, localizarea si dimensiunile tumorii primare, aspectul macroscopic al tumorii, evaluarea extensiei tumorale (T), a extensiei ganglionare (N) , a metastazelor (M) si stadializarea).

Tot un obiectiv secundar al studiului actual a fost sa investigheze expresia parametrilor clinici (T, N, M, stadializare), morfotipici (IVL, IPN, RLI, RIP, grading histologic) si imunofenotipici (expresia proteinelor p53, Bcl2, coexpresiei Bcl2/p53 si clasei imunohistochimice) in diverse circumstante:in functie de sex, tipul de tratament hipoglicemiant, de obezitate, dar si prin analiza fiecarui parametru in raport cu ceilalti in lotul general , iar pentru parametrii clinico-morfotipici (T ,N, M, stadializare, IVL,IPN, RLI, RIP, grading histologic) suplimentar si in functie de clasa IHC si de expresia p53.

Materiale si metode

Selectia lotului:

Au fost selectate initial in total un numar de 108 cazuri, dar in final au fost incluse si analizate in lotul un numar de 99 pacienti respectiv 52 de adenocarcinoame colorectale provenite de la pacientii diabetici, 43 de adenocarcinoame colorectale de la pacienti nondiabetici, si 4 mostre de mucoasa colonica nonlezionala, conform criteriilor de includere in studiu, astfel: pacienti diagnosticati cu ACR primare, varsta >18 ani, femei si barbati, fara antecedente heredo-colaterale de cancer colorectal, fara tratament oncologic anterior diagnosticului de cancer, pacienti diagnosticati cu DZ tip 2 anterior diagnosticului de cancer (pentru lotul cu ACR si DZ).

Cazurile au fost selectate din baza de date a Laboratorului de Anatomie Patologica din cadrul Spitalului Clinic de Urgenta al Municipiului Bucuresti dupa obtinerea acordului din partea Comisiei de Etica. Cazurile au fost selectate utilizand programul informatic medical Hipocrate, fiind selectate in mod aleator (in ordinea aparitiei corespunzator criteriilor de includere conform clasificarii International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems 10th Revision -ICD10) pacientii cu diagnosticul principal de tumora maligna primara de colon (C18), tumora maligna primara recto-sigmoidiana (C19) si tumora maligna primara rectala (C20) din perioada 01.01.2011-30.06.2015. Datele au fost extrase din biletele de externare si buletinele antomopatologice. Este de mentionat in mod special diagnosticul de DZ tip 2 si obezitate ce a fost preluat ca atare din rubrica de diagnostice a biletului de externare. In mod particular nu au existat date explicite privitoare la tipul de tratament hipoglicemiant, acesta fiind dedus in mod indirect astfel: precizarea in grupa de diagnostice a termenului „insulino” a fost incadrat ca DZ tip 2 insulinonecesitant, iar precizarea termenului de „dieta” ca DZ tip 2 cu dieta. Cazurile ramase au fost incadrate ca DZ tip2 in tratament ADO. Ulterior, pentru fiecare caz au fost extrase din arhiva Laboratorului cate un bloc de parafina si lama aferenta colorata hematoxilina eosina (HE).

Materialul tisular inclus in blocurile de parafina a fost obtinut in urma esantionarii macroscopice a specimenelor excizionale chirurgicale, ulterior imersate in recipiente cu fixator standard (solutie formaldehida 10%, tamponata), histoprocesate in sistem automat si incluse la parafina.

Analiza imunohistochimica

Blocurile si lamele aferente au fost expediate catre Departamentul de Histopatologie din cadrul Laboratorului Central de Referinta Synevo in vederea reevaluarii si testarii imunohistochimice in sistem anonimizat, fara date de identificare a pacientilor, date clinice si paraclinice. La momentul receptiei in Laborator, fiecarui caz i-a fost alocat un numar unic de identificare. Blocurile de parafina au fost sectionate la microtom cu obtinerea a cate unei sectiuni histologice cu grosime de 2 μm per caz, care au fost imediat etalate pe baie de apa pentru eliminarea cutelor din panglica de parafina; ulterior, fiecare sectiune a fost recuperata de pe baia de apa pe cate o lama incarcata electrostatic; lamele au fost deshidratate la termostat la 58° C.

Testarea imunohistochimica a fost realizata in sistem automat, utilizand platforma BenchMark XT Ventana. Lamele deshidratate au fost etichetate cu ajutorul sistemului special prevazut, fiecare dintre lame avand inscriptionat un cod de bare aferent protocolului de lucru, numarul cazului si numarul blocului (din laboratorul de provenienta). Anticorpii utilizati au fost solutii IVD (in vitro diagnostic) prediluate, utilizate pentru diagnosticul curent prin metoda automatizata. Lamele au fost pozitionate in aparat, scanate si, dupa verificarea validitatii anticorpilor si a solutiilor de lucru, a fost initiata testarea propriu-zisa cu protocolul dual Bcl-2-p53, utilizand clonele IVD 124 (Denumire anticorp: CONFIRM anti-bcl-2 Mouse Monoclonal Primary Antibody/ Clona: 124/ Producator: Ventana) si respectiv clona Bp53-11 (Denumire anticorp: Anti-p53 (Bp53-11) Primary Antibody/Clona: Bp53-11/ Producator: Ventana) ale producatorului Ventana, parcurgand urmatoarele etape: deparafinare; demascare antigenica; incubare anticorp anti-Bcl-2 (16 minute la 37° C ); denaturare; incubare anticorp anti-p53 (16 minute la 37 ° C); contracolorare. Metoda de vizualizarea a reactiilor imunochimice a utilizat cromogenul conventional de tip DAB (3,3′-diaminobenzidina). Pentru informatii detaliate privitoare la modul de utilizare a celor doi anticorpi se poate consulta protocolul detaliat de utilizare in rubrica Anexe. Postprocesare automata, lamele au fost degresate, deshidratate si montate cu obtinerea de preparate permanente in vederea examinarii microscopice.

Etapa de microscopie optica a reprezentat momentul central al evaluarii histopatologice a sectiunilor tisulare, si a fost realizata independent de catre doi medici anatomopatologi in conformitate cu standardele profesionale actuale. Sectiunile tisulare au fost initial reevaluate in coloratie standard hematoxilina-eosina, cu notarea urmatoarelor date: tip histopatologic, subtip histopatologic, invazivitate, prezenta elementelor de neoplazie intraepiteliala marginala, caracterul si volumul infiltratului inflamator peritumoral si intratumoral, factorii morfologici de prognostic (i.e. invazie limfovascula, invazie perineurala). Ulterior au fost examinate lamele cu coloratie imunohistochimica duala; pentru fiecare caz au fost punctate extensia (in procente din totalul celulelor tumorale viabile) si intensitatea (redusa, medie sau inalta) a reactivitatii la anticorpul anti-p53 (reactie nucleara de culoare rosie) si la anticorpul anti-bcl-2 (reactie citoplasmatica de culoare maron).

Evaluarea reactiilor p53 a fost realizata dupa urmatorul algoritm:

scor 0: reactie in ≤ 25% din celulele tumorale, de intensitate redusa si/sau moderata;

scor 1: reactie in 26-70% din celulele tumorale, de intensitate redusa si/sau moderata;

scor 2: reactie in >70% din celulele tumorale, de intensitate inalta si moderata.

Reactiile scorificate cu 2 puncte indica existenta unei proteine p53 anormale ca urmare a unui eveniment epigenetic sau genetic la nivelul genei TP53. Reactiile scorificate cu 1 punct reprezinta cel mai probabil evenimente nonmutationale, fara a se putea exclude posiblitatea de modulare posttranscriptionala a expresiei genei TP53. Reactiile scorificate cu 0 puncte sunt interpretate ca negative (nonmutationale) cu exceptia absentei complete a reactivitatii (i.e. 0% absolut) caz in care se ridica suspiciune unei mutatii TP53 trunchiate cu imunofenotip nul.

Pe baza profilului imunofenotipic cazurile au fost subdivizate in 4 clase imunohistochimice (IHC): clasa 1: Bcl-2 negativ, p53 negativ (scor 0); clasa2: Bcl-2 pozitiv, p53 negativ (scor 0); clasa 3: Bcl-2 negativ, p53 pozitiv (scor 1 si 2); clasa 4:Bcl-2 pozitiv, p53 pozitiv (scor 1 si 2). Impartirea pe clase se face functie de aspectul dominant al expresiei (reactie in majoritatea celulelor) iar pentru cazurile in care au existat si celule cu aspect minoritar ( reactie concomitenta Bcl2/p53 intr-o minoritate a celulelor) s-a notat termenul de “clona 4”. Acest subgrup heterogen de clona 4, se consideraa a prezenta un risc crescut de rezistenta la tratamentul chimioterapic.

Raspunsul limfocitar intratumoral (RLI) a fost clasificat si notat cu cifre arabe (de la 1 la 6) functie de numarul de limfocite pe campul microscopic de obiectiv 40, ce invadeaza celulele tumorale. Un RLI crescut semnifica un prognostic bun (prin activarea sistemului imun si producerea de anticorpi).

Raspunsul inflamator peritumoral (RIP) functie de tipul de celula implicat in infiltratul inflamator polimorf, a fost clasificat ca mixt (prezenta de limfocite si plasmocite intratumoral) sau cronic (prezenta predominanta a granulocitelor polimorfonucleare (PMN) neutrofile). Comparativ functie de tipul de celula, RIP cronic prezinta mai frecvent o evolutie mai nefavorabila, mai agresiva.

Invazia limfovasculara (IVL) a fost notata ca prezenta, in cazul existentei embolilor tumorali la nivelul capilarelor sanguine sau limfatice sau absenta in cazul lipsei embolilor tumorali din capilarele sanguine sau limfatice. Prezenta IVL semnifica un prognostic nefavorabil.

Invazia perineurala (IPN) a fost notata ca prezenta, in cazul extinderii tumorii de-a lungul fibrelor nervoase sau absenta in cazul in care aceasta extindere nu exista. Prezenta IPN este asociata in general unui prognostic nefavorabil.

Analiza statistica

Pentru prelucrarea statistică a datelor, primul pas în efectuarea studiului l-a reprezentat crearea unei baze de date, în care informațiile au fost memorate în tabele cu ajutorul programului Microsoft Excel. Prelucrările statistice au fost efectuate utilizând aplicațiile Excel, SPSS ver 15.00. Datele au fost sintetizate sub forma de procente iar nivelul de semnificatie folosit in testele statistice la fost de p≤0.05.

Pentru analiza acestora s-au aplicat teste de egalitate a proportiilor generale (Pearson Chi-Square, Fisher exact si Likelihood Ratio) dupa care au fost aplicate teste de comparatie multipla (post-hoc).

Lotul de pacienti a fost stratificat in functie de datele demografice (sex, varsta,mediul de provenienta), date clinice (obezitate, disipidemie, boala coronariana ischemica-BCI ,hipertensiune arteriala-HTA, tipul de tratament: ADO, dieta, insulina, locatia tumorii, dimensiunile tumorii, modul de prezentare la internare, numarul de zile postoperatorii, complicatiile postoperatorii, numarul de zile evolutia postoperatorie,numarul de zile de ileus, tipul de interventie chirugicala, aspectul tumorii), datele paraclinice (T, N, M, stadializare, gradul histologic, invazie limfovasculara, invazie perineurala, raspuns limfocitar intratumoral, raspuns inflamator peritumoral, expresie p53, expresie Bcl2, coexpresie Bcl2/p53, clasa IHC). Ulterior s-au comparat diferentele dintre parametrii la pacientii diabetici si nondiabetici iar pentru testele cu rezultate semnificative statistic s-a aplicat corectia Bonferroni.

Rezultate

Analiza parametrilor clinico-morfotipici si expresia proteinelor Bcl2 si p53 in functie de sex.

Lotul de studiu a inclus un numar de 32 de femei (33.7%) si 63 de barbati (66.3%). Analiza comparativa a parametrilor studiati, a evidentiat o asociere a sexului masculin cu o extensie mai avansata a tumorii primare (T), iar a sexului feminin cu o frecventa mai crescuta a extensiei ganglionare (N). Barbatii au prezentat stadii mai avansate ale extensiei tumorii primare (T) (p=0.029), prezentand in exclusivitate stadiul T2 (100%), insa cu absenta stadiului T1 (0%)(figura ). In mod contrar femeile au asociat mai frecvent extensie ganglionara (N) comparativ cu barbatii, cu relevanta statistica (75% vs 46%, p=0.009) (figura). Analiza stadiului tumoral a identificat o asociere a sexului feminin cu stadii avasante tumorale (stadiul III 50% vs 22%, stadiul IV 22%vs 20%, p=0.158) si au asociat un grad histologic scazut (G1- 6% vs 3%, G2 -72% vs 62% , p=0.364) comparativ cu barbatii ce au prezentat un grad histologic crescut (G3-35% vs 22%). Studiul IHC al proteinelor Bcl2 si p53, a identificat o frecventa crescuta a celor doua proteine in monoexpresie in lotul de sex feminin (19% vs 9% p=0.882, 44% vs 40%,p=0.244), coexpresia Bcl2/p53 fiind identica insa in cele doua loturi (9%). Analiza statistica a celorlalti parametri (IVL, IPN, RIP, RLI, clasei IHC) functie de sex, nu a identificat vreo asociere statistica (vezi figura ).

Figura… Evaluarea comparativa a parametrilor clinico-morfotipici si a expresiei proteinelor Bcl2 si p53, functie de sex.

Caracteristicile generale ale celor doua loturi studiate

Lotul de studiu a inclus un numar total de 95 pacienti (32 de femei si 65 barbati), cu varste cuprinse intre 46 si 92 ani (cu varsta medie de 69.88 ani) impartiti in 2 grupuri: 52 de pacienti cu DZ tip 2 ( grupul/lotul diabetic sau DZ tip2 ) si 43 de pacienti fara DZ tip2 (non-DZ sau grupul/lotul non-diabetic). Caracteristicile generale demografice comparative ale celor doua loturi sunt redate in figura III.1 Comparativ cu lotul non-diabetic, grupul diabetic a prezentat o frecventa usor crescuta a sexului feminin (36.5% vs 30.2%), o predominanta a pacientilor varstnici (56.7% vs 43.3%) si o varsta medie mai inaintata, fiind in medie cu aproximativ cu un an mai in varsta (70.2 ani vs 69.5 ani). Nu au existat diferente semnificative in cele doua loturi functie de mediul de provenienta. (tabelul III1.)

Figura III.1 Caracteristicile generale comparative ale celor doua loturi studiate. A.Raportul numeric si procentual intre cele doua loturi; B.Distributia pe sexe; C. Distributia functie de mediul de provenienta; D,E. Distributia pe grupe de varsta.

Caracteristicile clinico-morfopatologice ale celor doua loturi studiate

Evaluarea clinica initiala a parametrilor clinico-evolutivi a evidentiat in randul diabeticilor comparativ cu non-diabeticii un tablou clinic diferit marcat printr-o frecventa crescuta a sangerarilor in scaun, fie sub forma de rectoragii sau de melena. Pacientii diabetici au prezentat o evolutie postoperatorie nefavorabila comparativ cu non-diabeticii, grevata de aparitia complicatiilor si aparitia a cinci decese. In tabelul III.2 sunt descrise comparativ principalele caracteristici ale celor doua loturi.

Tabel III.1. Evaluarea comparativa a parametrilor clinico-evolutivi din celor doua loturi.

*Observatii: Modul de prezentare “sangerare in scaun” include atat notiunea de melena cat si de rectoragie; simptomatologia nespecifica include:tulburarile de tranzit intestinal, durerile abdominale, scaderea ponderala,greata, astenia sau fatigabilitatea.**Dehiscența plăgii reprezinta cea mai frecventa complicatie postoperatorie a pacientilor cu cancer colorectal, in tabel fiind redata sub forma de procent din totalul complicatiilor aparute.*** Obs:Pot coexista aspecte macroscopice diferite in aceeasi tumora.

Raportat la prezenta comorbiditatilor, comparativ cu non-diabetici pacentii diabetici au asociat o frecventa crescuta in special a obezitatii si a bolii ischemice coronariene asa cum este redat in figura III.3.

Figura III.3 Frecventa comorbiditatilor in cele doua loturi studiate (Nr.cazuri).

Toti pacientii inclusi in studiu (n=95) au prezentat adenocarcinomul colorectal ca si tip histologic de neoplazie iar ca subtip histologic 19 pacienti au prezentat ADC mucinos (productie de mucina>50%), respectiv 8 pacienti diabetici (n=8/52) si 11 pacienti non-diabetici (n=11/43).

Evaluarea comparativa completa (numerica si procentuala) a parametrilor clinico-morfopatologici in cele doua loturi din studiu se regaseste in tabelul III.1.

Tabelul III.2. Evaluarea comparativa a parametrilor clinico-morfopatologici in cele doua loturi.

Analiza functie de subtipul de cancer colorectal a identificat o usoara asociere a grupului diabetic cu neoplazia regiunii colonice respectiv regiunea anatomica dreapta (proximala), fara semnificatie statistica insa (p=0.339) (figura III.2).

Pe lotul studiat IVL a fost mai frecventa in lotul diabetic (59.6% vs 48.8%), dar fara semnificatie statistica (p=0.309) (figurile III.4.A, III.5 si III.6).

Invazia perineurala a fost prezenta in mod egal in cele doua grupuri (23.1 vs 23.3%) (figurile III.4.B, III.7, III.8).

Raspunsul inflamator peritumoral (RIP) de tip cronic a fost mai frecvent intalnit in cazurile de diabet (65.4%) comparativ cu non-diabeticii (62.8%), RIP de tip mixt fiind mai frecvent intalnit la non-diabetici (37.2%), comparativ cu diabeticii (34.6%) fara semnificatie statistica insa (p=0.832) (figurile III.4.D, III.9-III.11).

Raspunsul limfocitar intratumoral (RLI) a prezentat valori comparabile in cele doua grupuri. Astfel, RLI redus-moderat (1-2 limfocite pe camp microscopic de obiectiv 40) a fost prezent in 80.8% din cazurile de diabet comparativ cu cu 81.4% din cazurile de non-diabet, iar RLI crescut (≥3 limfocite pe camp de obiectiv 40) de 19.2% din cazurile de diabet comparativ cu cu 18.6% din cazurile de non-diabet (figurile III.4.C,III.10 si III.11).

Raportat la gradul histologic al tumorii, pacientii diabetici au asociat tumori colorectale cu un grad histologic scazut (G1+G2) (78.8% din cazuri ) comparativ cu non-diabeticii (58.1%din cazuri) iar non-diabeticii au asociat asociat tumori colorectale cu un grad histologic crescut (G3 sau tumori slab diferentiate) (41.9%) comparativ cu diabetcii (21.2%), cu semnificatie statistica (p=0.043 Fisher's Exact Test) (Figurile III.5, III.13-III.17).

Din punct de vedere al extensiei tumorale (pT) nivelul pT2 de extensie este mai frecvent intalnit la diabetici (11.5%) comparativ cu non-diabeticii (4.7%) dar extensia pT3 a fost in mod contrar mai frecventa la non-diabetici (72.1%) comparativ cu diabeticii (59.6%), iar extensia pT4 mai frecventa la diabetici (26.9%) comparativ cu non-diabetici (23.3%), insa fara semnificatie statistica (p=0.447) (figurile III.6A, III.14-III17).

Din punct de vedere al extensiei ganglionare (N), aceasta a fost mai frecventa la diabetici (61.5%) comparativ cu non-diabeticii (48.8%), fara relevanta statistica insa (p=0.299) (figura III.6B).

Din punct de vedere al prezentei metastazelor (M), grupul diabetic a prezentat mai frecvent metastaze (28.8%) comparativ cu non-diabeticii (23.3%) insa nesemnificativa statistic (p=0.641) (figurile III.6.C, III.7,10,11,14,15).

Analiza stadiului tumoral a evidentiat ca, pacientiii diabetici asociaza cel mai frecvent stadiul clinic III (40.4% din cazuri) si II (25.0%) din cazuri, iar pacientii non-diabetici asociaza mai frecvent stadiul clinic II (41.9%) si stadiul III (32.6%), fara relevanta statistica insa (p=0.211) (figurile III.6.D, III.-5,6,9,12,13,16,17)

Figura III.2. Clasificarea (numerica si %) celor doua loturi functie de localizarea tumorii in regiunea anatomica colorectala. Notiunea de colon drept include urmatoarele segmente anatomice: cec, colon ascendent, flexura hepatica a colonului ; Notiunea de colon stang include urmatoarele segmente anatomice: flexura splenica a colonului, colon descendent, colon sigmoid, rect; Notiunea de colon proximal include urmatoarele segmente anatomice: cec, colon ascendent, flexura hepatica a colonului, colon transvers; Notiunea de colon distal include urmatoarele segmente anatomice: flexura splenica a colonului, colon descendent, colon sigmoid.

Caracteristicile comparative ale parametrilor morfotipici din cele doua loturi de studiu sunt redate in figura III.4.

Figura III.4. Expresia comparativa a parametrilor morfotipici in cele doua loturi.

Figura III.6. Clasificarea TNM si stadializarea comparativa a adenocarcinoamelor colorectale in cele doua loturi ale studiului.

Figura III.5 Expresia comparativa a gradului histologic de diferentiere (G) in cele doua loturi.

Figura III.5.Adenocarcinom colon, moderat diferentiat, stadiul 2A.Coloratie HE, 100x. Se evidentiaza embolul neoplazic limfovascular la nivelul frontului tumoral profund. Se observa in regiunea inferioara stanga a imaginii tesutul adipos pericolonic sau subseros cu adipocitele de culoare alba; Numeroasele vase de sange notate cu litera V. In nuanta de fond se observa interstitiul cu celulele endoteliale (aplatizate) si limfocitele de nuanta albastra.

Figura IIII.8.Adenocarcinom colon, moderat diferentiat, stadiul 3B. Invazie tumorala perineurala (marcata prin N si culoarea verde). Coloratie HE, 90x. Nervii sunt marcati prin litera N si culoare verde; V=vas de sange; celule tumorale cu dispozitie glandulara zona superioara stanga; Se observa infilitratul inflamator limfocitar difuz.

Figura III.10.Adenocarcinom colon, moderat diferentiat ,metastazat, stadiul IV, cu necroza luminala si infiltrat inflamator cronic peritumoral cu minima extensie limfocitara intratumorala (zona marcat). Coloratie HE,75x. Se observa celulele tumorale cu aspect glandular cribiform (in sita) si celulele adipoase dispuse difuz (culoare alba).

Figura III.16. Adenocarcinom colon, moderat diferentiat, stadiul 3B, cu arii de ulceratie si mucoasa colonica cu displazie; D-DISPLAZIE, U-ulceratie, N=normal.Coloratie HE, 30x. Se observa tranzitia de la o celularitate normala (cu dispozitie glandulara) la displazie pana la neoplazie. Se observa in partea inferioara stanga lumenului colonului si celulele normale dispuse pe un singur strat (cu nucleii polarizati bazal)=N; central se observa zona de displazie (D) in partea dreapta se observa celulele tumorale cu dispozitie glandulara in straturi multiple cu lumen liber (culoare alba).U=hemoragie peritumorala cu zone de ulceratie; Se observa infiltratul inflamator difuz peritumoral.

Caracteristicile imunohistochimice ale celor doua loturi studiate

Tehnica IHC a evidentiat o expresie negativa a p53 si Bcl-2 in toate cele patru cazuri de epitelii non-tumorale maligne. Pozitivitatea expresiei p53 este marcata prin nucleii de culoare rosie iar in cazul Bcl2 prin citoplasma de culoare maron. Controlul pozitiv pentru Bcl2 s-a realizat prin identificarea Bcl2 in limfocitele stromale, prin vizualizarea coloratiei maron a citoplasmei acestora. Tehnica IHC de coloratie a p53 si Bcl2 a evidentiat o intensitate si o extensie variabila a coloratiei. Rezultatele au variat astfel, in cazul pozitivitatii p53 atat in grupul diabetic cat si non-diabetic intre 0 si 99% iar cea a Bcl2 intre 0-85% in grupul non-diabetic si 0-65% in grupul diabetic, iar coexpresia Bcl2/p53 a variat intre 0-90% in grupul diabetic si 0-75% in grupul non-diabetic ( Figurile III.18-III.30).A exista un singur caz in studiu, un pacient diabetic, ce a prezentat expresie pozitiva atat a Bcl2 si a p53 in monoexpresie cat si Bcl2/p53 coexpresie. Am considerat reactivitatea pozitiva a p53 de intensitate moderata sau inalta ca fiind sugestiva pentru mutatia p53.

Figura III.19.Imagine IHC 44x. Adenocarcinom rectal, moderat diferentiat, stadiul 2A. Monoexpresie p53 in frecvente celule tumorale.Se observa celulele tumorale dispuse glandular (zonele de nuante de rosie) inconjurate de stroma (fibrobllasti de nuanta albastra cu zone maron ce reprezinta controlul intern Bcl-2 limfocitar).

Figura III.20. Imagine IHC, 110x. Adenocarcinom colon, moderat diferentiat, metastazat stadiul 4. Reactivitate Bcl-2 (citoplasma de culoare maron) in 80% din celulele tumorale, reactivitate p53 absenta. Se observa celulele tumorale dispuse glandular cu lumen clar (culoarea alba) si reactivitatea Bcl2 80% (citoplasma de culoare maron);in partea dreapta a imaginii se observa interstitul tumoral cu zone de detritus; zonele de albastru cu maron (fibroblasti si limfocite nuante maron controlul intern Bcl2).

Figura III.22.Imagine IHC ,50x. Adenocarcinom rectal, moderat diferentiat stadiul 2 A. Coloratie duala p53-Bcl2: reactivitate extensiva p53 (nuclei de culoare rosie in 95% din celulele tumorale). Bcl2 negativ in celulele tumorale; Se observa mucoasa colonica normala (jumatatea inferioara a imaginii) cu expresia redusa a p53 (control intern). In partea central superioara se observa celulelel tumorale dispuse glandular (zona de nuanta rosie datorat expresiei p53) iar in partea inferioara se observa infiltratul limfocitar ce reprezinta controlul intern pozitiv Bcl-2 in limfocite (limofcitele prezinta expresie Bcl-2 in mod normal marcata cu cercul galben); in partea dreapta imaginii se observa lumenul rectal. Zona normala cu celule caliciforme reprezinta controlul intern negativ p53.

Figura III.23.Imagine IHC, 90x. Adenocarcinom rectal, moderat diferentiat,stadiul 3B.Coloratie duala p53-Bcl2: coexpresie p53 (nuclei de culoare rosie) si Bcl2 [citoplasma de culoare maron]) in 90% din celule tumorale, monoexpresie p53 in 10% din celulele tumorale. Se observa celulele tumorale dispuse glandular (zona de nuanta rosie data de expresia p53 si cu zone maronii date de expresia Bcl-2) ce contin in interior zone de necroza tumorala, inconjurate de stroma peritumorala (nuanta albastru); in partea dreapta a imaginii se observa celulele adipoase.

Rezultatele complete (numerice si procentuale) ale analizei IHC a celor doua proteine sunt redate in tabelul si includ expresia proteinelor Bcl2 si p53 ca monoexpresie si coexpresie (Bcl2/p53) dar si clasa IHC.

Tabel III.3 Expresia proteinelor Bcl2 si p53 in cele doua loturi.

Pacientii diabetici au prezentat o expresie crescuta a p53 (exprimat in > 70% din celule) (46.2%) comparativ cu non-diabeticii (34.9%), dar fara semnificatie statistica (p=0.306) (Tabel III.3.7).

Expresia singulara a Bcl2, ca si monoexpresie, a prezentat o exprimare relativ scazuta in ambele loturi, fiind in general mai scazuta in lotul diabetic comparativ cu lotul de non-diabetic (9.6% vs 16.3%).

Coexpresia Bcl2-p53 a fost mai frecvent intalnita la pacientii diabetici (11.5%) comparativ cu non-diabeticii (7%), in ambele situatii fara semnificatie statistica insa (p= 0. p= 0.099 ) (Tabel III.3).

Figura III.31.Expresia comparativa a proteinelor Bcl2 si p53 in cele doua loturi de studiu.

Pe baza profilului imunofenotipic, in lotul diabetic majoritatea cazurilor au fost distribuite pe clasa 3 (42.3%) si clasa 1 (40.4%), iar pe lotul non-diabetic majoritatea cazurilor au fost distribuite pe clasa 1 (44.2%) si clasa 3 (32.6%). Imunofenotipul Bcl2+/p53- este mult mai frecvent la non-diabetici (16.3%) comparativ cu diabeticii (5.8%), in mod contrar imunofenotipul de clasa 4 singular sau asociat cu imunofenotipul de clasa 3 cu clona 4 a fost mai frecvent la diabetici (11.5%) comparativ cu non-diabetici (7%) , fara semnificatie statistica insa (p=0.447) (Tabel III.3).

Analiza detaliata a loturilor in functie de expresia proteinelor in diversele subgrupuri de pacienti nu a indicat vreo asociere statistica, cu exceptia obezitatii. Expresia p53 a variat in cele doua loturi functie de prezenta sau absenta obezitatii in momentul diagnosticului de adenocarcinom colorectal. Astfel subgrupul de pacienti diabetici-obezi a prezentat o crestere semnificativa statistic a expresiei p53 de clasa 2 (exprimare in >70% din celulele tumorale cu intensitate inalta si moderata) comparativ cu pacientii non-diabetici (80% vs 36.6% p=0.024) sau cu pacientii diabeticii non-obezi (80% vs 40.5%) (Figura III.8)

Tabelul III.4. Impactul obezitatii raportat la expresia p53 in cele doua loturi de studiu.

Figura III.32 Impactul obezitatii raportat la expresia p53 in cele doua loturi de studiu.

Analiza functie de stadiul tumoral a celor doua proteine in monoexpresie sau coexpresie in cele doua grupuri diabetic si non-diabetic a relevat: in stadiul 1 si 2 proteina Bcl2 este crescuta in monoexpresie insa cu o exprimare slaba a p53 in monoexpresie; cand celula prezinta pozitivitate pentru p53 in stadiul 2 , aceasta se exprima in mod special ca si coexpresie Bcl2/p53, iar procentul de celule ce prezinta pozitivitate Bcl2-p53 este crescut >10% si se asociaza cu prezenta Bcl2 in monoexpresie; stadiul 3 s-a asociat cu prezenta crescuta a p53 in monoexpresie sau asociat in coexpresie (Bcl2/p53), cu o exprimare slaba a Bcl2 in monoexpresie; pacientii in stadiul 4 cu metastaze nu prezinta coexpresia Bcl2/p53 insa, asociaza Bcl2 si p53 in monoexpresie (vezi figura ).

Figura III. Analiza stadiului tumoral functie de expresia proteinelor Bcl2 si p53.

Analiza comparativa a parametrilor clinico-morfotipici in lotul diabetic vs. non-diabetic functie de expresia proteinei p53

Evaluarea IHC a proteinei p53 a evidentiat o expresie crescuta a proteinei p53 de clasa 2 (46.2%) comparativ cu non diabeticii (34.9%). Analiza detaliata a parametrilor clinico-morfotipici in functie de expresia acestei proteine in cele doua loturi diabetic si non-diabeticeste redata in figura . Pacientii diabetici si non-diabetici au prezentat valori similare ale extensiei tumorale (T), ganglionare (N) , a prezentei metastazelor (M) a stadiului clinic, IPN si a RIP atat in clasa 0,1 a proteinei p53 (expresie p53<70% din celulele tumorale de intensitate redusa sau moderata) cat si in clasa 2 a proteinei p53 (expresia p53 >70% din celulele tumorale de intensitate moderata sau inalta). Raspunsul limfocitar intratumoral (RLI) redus (1 limfocit pe camp microscopic de obiectiv 40) a fost mai frecvent la diabetici in cazurile ce au prezentat expresia p53 de clasa 2 , fiind prezent in 63% din cazurile de diabet comparativ cu 33% din cazuri la lotul non-diabetic (33%), insa fara semnificatie statistica (p=0.094). Comparativ cu non-diabeticii,pacientii diabetici au prezentat in cadrul expresiei clasei 1 a proteinei p53 (expresia proteina p53 in 26-70% din celulele tumorale de intensitate redusa sau moderata) un grad de diferentiere scazut (G1-33% vs G1-0%) iar in in cadrul clasei 2 a proteinei p53 o asociere mai crescuta cu gradul histologic moderat (G2-52.6% vs 41.7%) fara relevanta statistica p=0.651. Comparativ cu non-diabeticii se remarca o frecventa crescuta a IVL in cazul pacientilor diabetici ce asociaza clasa 2 a proteinei p53 (58% vs 40%, p=0.333).

Figura III.1 Expresia comparativa a parametrilor clinici (T,N,M,stadializare) in lotul diabetic vs non-diabetic functie de expresia (clasa) proteinei p53 .

Figura III. Expresia comparativa a parametrilor morfotipici (IVL,IPN,RLI, RIP,grading histologic) in lotul diabetic vs non-diabetic functie de expresia (clasa) proteinei p53 .

Analiza comparativa a parametrilor clinico-morfotipici, in lotul diabetic vs. non-diabetic functie de clasa imunohistochimica.

Evaluarea comparativa detaliata a parametrilor clinico-morfotipici functie de clasa imunohistochimica (IHC) la diabetici versus non-diabetici este redata in figura .

Comparativ cu non-diabeticii, pacientii diabetici au prezentat o asociere mai frecventa in cadrul imunofenotipului Bcl2+/p53- a extensiei tumorale T1 (33%vs0%) si T4 (33% vs 0%) (p=0.181), in cadrul imunofenotipului Bcl2-/p53+ a extensiei tumorale T2 (14% vs 7%) (p=0.824) iar in cadrul imunofenotipului Bcl2+/p53+ exensiei tumorale T4 (17% vs 0%) insa fara semnificatie statistica (p>0.05). In cadrul imunofenotipurilor Bcl2+/p53- si Bcl2+/p53+ pacientii diabetici au prezentat o frecventa crescuta a metastazelor comparativ cu non diabeticii (67% vs 29% si respectiv 17% vs 0%) insa fara relevanta statistica (p>0.5). Similar, in cadrul imunofenotipurilor Bcl2+/p53 si Bcl2+/p53+, diabetici au prezentat o crestere a extensiei ganglionare (67% vs 29% si respective 67% vs 33%) fara semnificatie statistica (p=0.523). Pacientii diabetici au prezentat mai frecvent un stadiu tumoral mai avansat pentru imunofenotipurile de clasa 2-4. Astfel pentru imunofenotipul Bcl2+/p53- au asociat mai frecvent stadiul IV in 67% din cazuri comparativ cu non-diabetici cu 29% din cazuri (p=0.142),pentru Bcl2-/p53+ au asociat mai frecvent stadiul III in 36% din cazuri comparativ cu 28% in cazul non-diabeticilor (p=0.797) iar pentru Bcl2+/p53+ au asociat mai frecvent stadiul III in 67% din cazuri comparativ cu 33% din cazuri la non-diabetici (p=0.523), fara insa vreo asociere statistica.

Analiza parametrilor morfotipici la diabetici vs non-diabetici a evidentiat o asociere pozitiva a diabeticilor cu prezenta IVL in cazul imunofenotipurilor Bcl2+/p53-( 67% vs 43%), Bcl2-/p53+ (59% vs 43%,p=0.495) si Bcl2+/p53+ (67% vs 33%,p=0.524) , o asociere pozitiva cu IPN in cazul imunofenotipului Bcl2+/p53+ (67% vs 33%, p>0.5), fara relevanta statistica insa. Diabetici au asociat un raspuns limfocitar intratumoral (RLI) crescut (6 limfocite pe camp microscopic de obiectiv 40) (34% din cazuri comparativ cu absenta acestui tip RLI la non-diabetici (p= ), in cadrul imunofenotipului Bcl2+/p53- , un RLI redus (1 limfocit pe camp microscopic de obiectiv 40) in 59% din cazuri comparativ cu non diabeticii ce au prezentat 36% din cazuri (p= ) , in cadrul imunofenotipului Bcl2-/p53+. In cadrul imunofenotipurilor Bcl2+/p53- si Bcl2+/p53+ diabeticii au prezentat mai frecvent un raspuns inflamator peritumoral (RIP) de tip cronic (100% din cazuri comparativ cu 71% din cazuri la non-diabetici in cadrul clasei 2 IHC, p>0.5; 83% respectiv 67% in cadrul clasei IHC4, p=0.226). Diabeticii au asociat in toate clasele imunofenotipice 1-4 un grad histologic scazut (G2) astfel: in cadrul imunofenotipului Bcl2-/p53- in 62% din cazuri comparativ cu 53% din cazuri la non-diabetici (p=0.836) ; pentru Bcl2+/p53- in 67% vs 43% din cazuri (p=0.064); pentru Bcl2-/p53+ in 77% vs 71% (p=0.489) iar pentru imunofenotipul Bcl2+/p53+ in 100% din cazuri comparativ cu 33% din cazuri (p=0.333).

Figura III Expresia comparativa a parametrilor clinici (T,N,M,stadializare) in lotul diabetic vs non-diabetic functie de clasa imunohistochimica (IHC).

Figura III Expresia comparativa a paramterilor morfotipici (IVL, IPN, RLI) in lotul diabetic vs non-diabetic functie de clasa imunohistochimica (IHC).

Figura III Expresia comparativa a parametrilor morfotipici (RIP si grading histologic) in lotul diabetic vs non-diabetic functie de clasa imunohistochimica (IHC).

Evaluarea comparativa a variabilelor clinico-morfotipice si imunohistochimice studiate pe subloturile de diabet, functie de prezenta sau absenta obezitatii: lotul diabetic obez, lotul diabetic non-obez, lotul non-diabetic.

Lotul de studiu a inclus un numar total de 17 pacienti obezi (n=17/95), 2 pacienti fiind non-diabetici (n=2/43) si 15 pacienti obezi asociind si diabet (n=15/52).

Analiza comparativa a variabilelor clinico-morfotipice si imunohistochimice in cele treo loturi este redata in figura . Evaluarea stadiului tumoral a identificat in randul pacientilor diabetici obezi si non-diabetici o frecventa mai crescuta a stadiul II (47% si respectiv 42%) comparativ cu diabeticii non-obezi (16%) ce au asociat mai frecvent stadiul III (46% vs 32% in lotul non-diabetic vs 27% in lotul diabetic obez) si stadiul IV (24% vs 21% in lotul non-diabetic vs 13% in lotul diabetic obez) insa fara relevanta statistica (p=0.521).

Analiza imunohistochimica a proteinelor a identificat imunofenotipul Bcl2-/p53+ ca fiind asociat mai frecvent cu paceintii diabetici obezi (60%) comparativ cu diabetcii non-obezi (35%) si non-diabetici (33%) insa fara semnificatie statistica (p=0.086). Expresia anormala a proteinei supresoare p53 a fost insa mult mai frecvent exprimata in lotul diabetic obez (80% din cazuri) comparativ cu lotul diabetic non-obez (41% din cazuri) sau non-diabetici (37% din cazuri) cu semnificatie statistica (p=0.024). Coexpresia Bcl2/p53 a fost mai frecvent intalnita in lotul diabetic obez (13%) comparativ cu diabeticii non-obezi (8%) sau non-diabetici (5%) dar fara semnificatie statistica (p=0.272).

Pacientii diabetici obezi au asociat un grad histologic scazut (G2-87%), comparativ cu diabeticii non-obezi (68%) si non-diabetcii (56%) dar fara relevanta statistica (p=0.078).

In urma analizei IVL, IPN, RLI, RIP sau expresiei Bcl2 in cele trei loturi, nu s-au identificat diferente semnificative, valorile fiind aproximativ similare (figura).

Figura III. Analiza comparativa a variabilelor clinic-morfotipice (stadializare,IVL,IPN,RLI,RIP,grading histologic) si imunohistochimice (expresia proteinelor p53 si Bcl2,clasa IHC) in subloturile de diabetici obezi, diabetici non-obezi si non-diabetici.

Analiza comparativa a variabilelor clinico-morfotipice si imunohistochimice studiate pe subloturile de studiu, functie de tipul de tratament hipoglicemiant (ADO sau insulina)

Evaluarea tipului (clasei) de tratament antidiabetic a identificat in randul pacientilor diabetici din studiul nostrum, tratamentul cu antidiabetice orale (ADO) ca fiind cea mai frecventa forma de terapie hipoglicemianta (n=42,respectiv 81% din cazuri), urmata de tratamentul cu insulina asociat sau nu ADO (n=8,respectiv 15% din cazuri) si de terapia medicala nutritionala (dieta) (n=2, respectiv 4% din cazuri), asa cum este redat in figura .

Figura

In figura sunt evidentiate rezultatele, comparative, in cele trei loturi :dieta, ADO si insulina.

Investigarea imunohistochimica a proteinelor Bcl2 si p53 a identificat o expresie crescuta a p53 in lotul ce se afla in tratament cu ADO (51%) comparativ cu cei tratati cu insulina (13%) dar fara relevanta statistica (p=0.061) .Expresia Bcl2 a fost mai frecventa in lotul tratat cu insulina, atat ca monoexpresie (25%vs 5%, p=0.115) cat si in coexpresie (25% vs 10%,p=0.242) comparativ cu ADO insa fara sa exista asociere statistica. Pacientii aflati in tratament cu ADO au prezentat o expresie crescuta a imunofenotipului Bcl2-/p53+ (50% vs 0%) comparativ cu pacientii insulinotratati ce au prezentat mai frecvent imunofenotipul Bcl2+/p53- (24% vs 2%) insa fara semnificatie statistica (p=0.086).

Analiza gradingului histologic a evidentiat asocierea pacientilor insulinotratati cu un grad histologic redus, prezentand tumori cu un grad de diferentiere moderat, comparativ cu comparativ cu cei aflati pe terapie orala (G2-87% vs 69%), insa fara relevanta statistica (p=0.661).

Evaluarea parametrilor clinico-morfotipici (stadializare, IVL,IPN,RLI,RIP) nu a identificat diferente semnificative in loturile studiate.

Figura III. Analiza comparativa a variabilelor clinico-morfotipice (stadializare, IVL,IPN,RLI,RIP,grading histologic) si imunohistochimice (expresia proteinelor p53 si Bcl2) in lotul tratat cu ADO vs insulina vs dieta.

Analiza statistica a datelor din studiu

In urma analizei statistice pe lotul studiat s-au identificat diverse asocieri semnificative statistic. O lista completa a tuturor asocierilor efectuate in studiu este redata in tabelul III.4, iar reprezentarea grafica aacestor asocieri poate fi vizualizata in figura . Barbatii au prezentat un grad de extensie tumorala (pentru T2-100% , T3-65%, T4-63%, p=0.029) mai avansat comparativ cu femeile, dar femeile au prezentat afectare ganglionara (N1-75%) mai frecventa decat barbatii (N1-46%, p=0.009). De asemenea prezenta RLI s-a asociat cu grad tumoral bine diferentiat (6 limfocite pe camp de obiectiv 40 in 50% din cazurile G1 comparativ cu 2% in G2 si 3% in G3, p=0.005). Expresia p53 de clasa 2 s-a asociat cu un grad moderat diferentiat (G2 -49%) comparativ cu G1 (0%) sau G3 (31%), p=0.024. Prezenta IVL s-a asociat cu un grad de extensie tumorala avansata (cu o crestere proportionala intre procentul de IVL si valoarea T, p=0.007) si cu afectare ganglionara (N1-81% comparative cu N1 in absenta IVL de 21%, p=0.001), cu un stadiu mai avansat tumoral (cu o crestere proportionala intre procentul de IVL si valoarea stadiului tumoral, p=0.001) si cu prezenta metastazelor ( 84% din IVL prezente in tumorile cu metastaze comparative cu 44% in cele fara metastaze, p=0.001). Prezenta metastazelor s-a asociat si cu un RLI de intensitate scazuta (≤2 limfocite pe camp de obiectiv 40), p=0.004. Raspunsul inflamator peritumoral mixt s-a asociat mai frecvent cu expresia p53 de clasa 2 (55.9%) comparativ cu raspunsul inflamator peritumoral cronic (32.8%), p=0.025.

Lotul diabetic comparativ cu lotul non-diabetic a prezentat mai frecvent tumori cu un grad histologic de diferentiere moderat (G2), (41/52 respectiv 78.8% vs 25/43 respectiv 58.1%), semnificativa statistic (p=0.043). Analiza pe subloturi a indicat o asociere semnificativa statistic (p=0.024) a expresiei pozitive p53 inalt sugestiva pentru mutatie (expresia p53 de intensitate moderata si inalta in peste 70% din celulele tumorale) in subgrupul de pacienti diabetici-obezi (un numar de 12 cazuri din 15, respectiv 80%) comparativ cu non-diabeticii ( 16 cazuri din 43, respectiv 37%).

Figura. Reprezentarea grafica a asocierilor semnificative statistic identificate in studiu.

Tabel III.4. Valoarea calculata a lui p prin analiza asocierii parametrilor din studiu.

Clasa p53 se refera la clasa 0,1,2.Stadializare se refera la stadializarea tumorala ce cuprinde 4 stadii;T=extensia tumorii primare; N=afectarea ganglionara;M=metastaza primaraIPN=invazie perineurala;IVL=invazie limfovasculara;RLI=raspuns limfocitar intratumoral;RIP=raspuns inflamator peritumoral;clasa IHC=clasa imunohistochimica;

DISCUTII

De remarcat este faptul ca acesta este primul studiu efectuat pe adenocarcinomul colorectal la om, care a comparat expresia proteinelor Bcl2 si p53 intr-o boala metabolica, asa cum este diabetul zaharat.

Acest studiu are o particularitate tehnica, respectiv tehnica de detectia IHC duala utilizata pentru identificarea concomitenta a expresiei proteinelor Bcl2 si p53 in aceeasi celula tumorala.

Numeroase studii au evidentiat o variabilitate crescuta in expresia IHC proteinelor Bcl2 si p53 in adenocarcinomul colorectal (tabel III.5). Comparativ cu alte studii, studiul nostru a evidentiat o expresie moderata a p53, dar o expresie mai scazuta a Bcl2 (tabel III.5). Aceasta variabilitate crescuta din diverse studii a p53 si Bcl2 poate fi explicata prin heterogenitatea crescuta a componentei loturilor (fara particularizarea loturilor din punct de vedere a parametrilor clinico-morfopatologici, a etniei, rasei,a prezentei DZ sau obezitatii) dar si a variabilitatii mutatiilor tumorale fie ele genetice sau a modificarilor epigenetice.

Tabel III.5. Frecventa procentuala a p53 si Bcl2 in diverse studii efectuate in cancerul colorectal. Adaptat dupa [423-426].

Pe baza profilurilor imunofenotipice Bcl2-p53, studiile au evidentiat ca in ADK colorectal exista clase imunofenotipice cu o agresivitate diferita. Astfel cel mai scazut prognostic este pentru imunofenotipurile p53+/Bcl2-, iar cel mai bun prognostic pentru p53-/Bcl2+ [ 427-431 ] cu un risc de 6.38 mai crescut de deces intre cele doua imunofenotipuri [427-431]. In acelasi timp exista o corelatie invers proportionala intre prezenta Bcl2 si a p53, evidentitata si in loturile studiate [427]. Practic riscul de deces in ADK colorectal creste progresiv functie de profilul imunofenotipic, de la p53-/Bcl2+ la p53-/Bcl2-, la p53+/Bcl2+ (asociaza chimiorezistenta) pana la riscul cel mai mare respectiv p53+/Bcl2- (asociaza radiorezistenta) [427], asa cum este descris si in figura III.33

Tehnica de coloratie IHC duala Bcl2/p53 prezinta avantajul identificarii corecte a diverselor imunofenotpiuri tumorale comparativ cu testarea individuala a celor doi markeri [427].

In studiul nostru grupul diabetic a prezentat clase imunofenotipice asociate cu prognostic mai rezervat comparativ cu non-diabeticii. Astfel grupul diabetic (figura III.31) comparativ cu grupul non-diabetic a asociat mai frecvent clasa imunofenotipica 3 (42.3% vs 32.6%) si clasa imunofenotipica 4 (11.5% vs 7%) ) si a prezentat o expresie scazuta a Bcl-2 (9.6%vs 16.3%) fara semnificatie statistica insa (p=0.447, respectiv p=0.367).

Figura III.33 Riscul de deces in ADK colorectal functie de profilurile imunofenotipice p53-Bcl2

Expresia p53 pozitiva singulara sau in asociere cu Bcl2 reprezinta un marker de prognostic rezervat [427,431]. In studiul nostru expresia p53+ scor 2 a avut o frecventa crescuta in grupul diabetic comparativ cu grupul non-diabetic (46.2% vs 34.2%,p=0.306). Analiza pacientilor diabetici a identificat o diferenta de expresie semnificativa statistic a proteinei p53, intre subgrupul de pacienti diabetici-obezi si diabetici non-obezi (figura III.32). Astfel subgrupul de pacienti diabetici-obezi a prezentat o expresie mai crescuta a p53+ scor 2 (expresie in >70% din celulele tumorale de intensitate crescuta sau moderata) comparativ cu diabeticii non-obezi (80% vs 40.5%) sau non-diabeticii (80% vs 34.8%, p=0.024). O analiza comparativa a expresiei p53 in lotul diabetic cat si pe subloturile de pacienti diabetici-obezi este reprezentata in figura… Aceste date explica de ce pacientii ce prezinta obezitate anterior diagnosticului de adenocarcinom colorectal prezinta un prognostic mai rezervat comparativ cu cei ce nu prezinta aceste anomalii metabolice, avand atat un risc crescut de mortalitate si de recurenta a cancerului CCR, cat si cresterea a frecventei complicatiilor post-tratament [296,297,432].

Toate aceste modificari in expresia acestor proteine pot explica excesul de risc de mortalitate in cancerul colorectal atribuibil prezentei DZ si sau obezitatii. Pacientii diabetici prezinta un risc crescut de mortalitate pentru anumite tipuri de cancer indiferent de cauza, in tabelul de mai jos fiind redate rezultatele a mai multor metaanalize ce evidentiaza un risc mai crescut.

Acest risc crescut de mortalitate de orice cauza a fost demonstrat de o serie de studii si metaanalize, in tabelul III.6 fiind redat riscul de mortalitate al pacientilor (de toate cauzele si specifica prin cancer) cu diverse tipuri de cancer ce asociaza DZ comparativ cu pacientii ce nu asociaza DZ. Similar prezenta obezitatii se asociaza cu un risc crescut atat de aparitie a neoplaziei cat si de mortalitate (Tabel I.6 si I.7). Exista o relatie lineara intre mortalitatea in cancer (indiferent de tipul de cancer) si nivelul glicemiei, asociere demonstrata si in Studiul DECODE (Diabetes Epidemiology: Collaborative analysis of Diagnostic criteria in Europe) ce a evidentiat o crestere a mortalitatii prin cancer la persoanele ce prezinta tulburari de glicoreglare [390]. Intr-o metaanaliza efectuata de Barone et al, s-a evidentiat un risc crescut de mortalitate pe termen lung, de toate cauzele, in cazul pacientilor diagnosticati cu cancer si diabet pre-existent comparativ cu cei non-diabetici [390 ], cu un risc pentru toate tipurile cancer de [ HR=1.41 (95% CI: 1.28-1.55)], comparativ cu indivzii normoglicemici [390 ]. In acelasi studiu analiza functie de subtipul de cancer a evidentiat pentru pacientii diabetici cu CRC un risc crescut de mortalitate cu un HR=1.32(95% CI, 1.24-1.41) [390 ]. Alte metaanalize au evidentiat in cazul pacientilor cu CRC si DZ pre-existent [390] un risc crescut de mortalitate atat pe termen lung cat si pe termen scurt dar si o frecventa crescuta a complicatiilor terapeutice cum ar fi cele postchimioterapie dar si o recurenta crescuta a CRC.

Tabel III.6.Meta-analize ale unor studii privind riscul de mortalitate (specifica si de toate cauzele) la pacientii cu cancer cu anumite localizari ce asociaza diabet zaharat. Adaptat dupa[268,278,282-284,286-288,289,296-300]

Mentinerea unui control glicemic si metabolic asociat unei balante energetice si a unei diete echilibrate cu respectarea proportiilor macronuterientilor, are un rol esential in patogeneza cancerului de colon [390 ]. Aceasta observatie este demonstrata si in studiul lui Meyerhardt et al ce a evidentiat ca o crestere in aportul total de hidrati de carbon cu o incarcatura glicemica crescuta se asociaza cu o crestere a mortalitatii si o recurenta mai mare a cancerului de colon in stadiul III [390 ]. Mentinerea unui bun controlul metabolic este esentiala atat inainte cat si dupa diagnosticului de CRC, un control metabolic bun fiind asociat cu o scadere a mortalitatii [390 ].

In studiul actual pe perioada internarii post-operator s-au inregistrat 5 decese, aparute in randul pacientilor diabetici cu cancer colorectal comparativ cu nici un deces in randul pacientilor non-diabetici. Acest risc de mortalitate pe termen foarte scurt se explica prin prezenta comorbiditatilor. Comparativ cu non-diabeticii, lotul diabetic a prezentat o prevalenta crescuta a diverselor comorbiditati, in mod special a obezitatii, dislipidemiei si bolii ischemice coronariane, dar si a HTA. Toate aceste comordibidati coexista si se influenteaza reciproc, iar in functie de intensitate si/sau de durata actioneaza intr-un mod exponential in patologia diverselor afectiuni (figura III.34) Aceste comorbiditati pot fi incluse in cadrul sindromului metabolic frecvent asociat DZ si pot explica riscul de deces pe termen scurt si lung de orice cauza in cancer in general, si in cancerul colorectal in mod special.

Figura III.34 Model teoretic de asociere a mecanismelor fiziopatologice in principalele afectiuni ale patologiei umane, cu evidentierea rolului major al bolilor metabolice . A.Interelatia intre diversele componenete ale sindromului metabolic-DZ-obezitate.B.Interelatia complexa dintre bolile metabolice, BCV si cancer.

O alta cauza citata in literatură, de crestere a mortalitatii pacientului diabetic ce asociaza cancer, este scaderea intensitatii tratamentului oncologic datorita potentialului de inducere a dezechilibrului glicemic si metabolic.

In lotul de studiu grupul diabetic a prezentat o evolutie postoperatorie mai putin favorabila tradusa printr-un numar mai crescut de zile de spitalizare si o frecventa crescuta a complicatiilor comparativ cu lotul non-diabetic (tabelul III.2). Aceste diferente pot fi explicate de factorul de risc comun prezent in DZ si cancer, respectiv de obezitate, dar si de prezenta mediului diabetic si a altor cormorbiditati asociate (figura III.34). Mediul diabetic este un mediu cu potential nociv in care multiplele cai si molecule de semnalizare intracelulara/intercelulare, se potenteaza reciproc, favorizand procesul de carcinogeneza, prin stimularea metabolismului energetic, a proliferarii celulare dar si o crestere a frecventei efectelor mutagene.

Expresia crescuta a proteinei p53 in grupul diabetic si in mod particular in subgrupul de pacienti diabetici-obezi explica prognosticul mai rezervat si riscul de recurenta al ADK colorectal la pacientii cu DZ si/sau obezitate, si in mod special in co-asocierea celor doua afectiuni, comparativ cu pacientii non-diabetici si/sau non-obezi.

DZ este o afectiune caracterizata printr-o evolutie naturala lenta, insidioasa, ce prezinta 2 etape:o etapa initiala, preclinica marcata de o scadere progresiva a functiei β celulare si a efectului incretinic, insotita de cresterea rezistentei la insulina in tesuturile tinta (muscular, adipos si hepatic) tradusa prin cresterea concentratiei insulinei (hiperinsulinemia) si o a doua a faza de etapa clinica tradusa prin aparitia hiperglicemiei si a simptomatologiei specifice diabetului (poliurie, polidpsie, polifagie,tulburari de vedere, scadere ponderala etc) insotita de scaderea progresiva a concetratriei de insulina si de cresterea productiei hepatice de glucoza. Practic dupa o perioada variabila de evolutie a DZ (in medie 20 ani) secretia insulina devine minima si apare necesitatea suplimentarii secretiei endogene de insulina cu insulina exogena (DZ insulinonecesitant). In etapa initiala exista un fenomen de pseudohiperinsulinism ( determinat de crestere rezistentei la insulina) ce va media efectele mitogenice ale insulinei nu si pe cele metabolice insa de unde si riscul crescut de aparitie al proceselor neoplazice[103].

Obezitatea si DZ adesea coexista, obezitatea precedand aparitia DZ. In cercetarea efectuata de Abdullah si colab. 2010 ce a inclus 18 studii de cohorta, s-a evidentiat un risc de aparitie a DZ, de 7 ori mai crescut in randul persoanelor obeze (IMC≥30 kg/m2) si de 3 ori mai mare in randul persoanelor supraponderale (IMC25-30 kg/m2) comparativ cu riscul unei persoane normoponderale (IMC =18.5-25 kg/m2) [433].

Exista o relatie lineara asociata a valorii IMC, atat cu gradul de insulinorezistenta cat si cu riscul de aparitie al DZ tip 2 sau a diverselor tipuri de cancer[434-436]. Riscul de aparitie a cancerului colorectal creste proportional atat cu cantitatea de tesut adipos visceral (VAT) masurata prin circumferinta abdominala (WC) si raportul talie sold ( WHR) cat si cu cea de tesut adipos subcutanat, masurata prin IMC [434]. Obezitatea creste riscul de aparitie al DZ in principal prin excesul de acizi grasi liberi (FFA). Excesul de AGL (AG non-esterificati) cresc rezistenta la insulina (IRes), iar ulterior pentru a compensa aceasta crestere intr-o etapa initiala va amplifica secretia de insulina cu aparitia hiperinsulinemiei,ulterior insa la un subset de persoane obeze cu predispozitie la DZ secretia de insulina se va reduce progresiv[434-436]. Obezii diabetici comparativi cu diabeticii non-obezi prezinta o rezistenta mai crescuta la insulina [434-436].Obezitatea si DZ cresc riscul de aparitie a diverse forme de cancer atat in mod independent cat mai ales asociat.Prin functia sa secretorie endocrina si paracrina cu secretie de hormoni (cresterea sintezei de adipokine cu cresterea raportului leptina/adiponectina), citokine (cresterea secretiei de citokine proinflamatorii-IL6, IL1beta, TNF a, MCP1),factori de crestere, (datortate dereglarii axei insulina-IGF prin cresterea rezistentei la insulina cu hiperinsulinemie compensatorie si cresterea biopdisponibilitatii IGF1 liber) si a diverselor molecule de semnalizare (cresterea sintezei factorilor de integritate vasculara VEGF1, PAI1) [437,438]. Tesutul adipos alb exercita efecte complexe atat asupra metabolismului energetic (avand functia de rezervor energetic si de modulator energetic prin reglarea metabolismului glucidic si lipidic si a sensibilitatii la insulina si a respiratiei mitocondriale), sistemului endocrin (scade nivelul globulinei de legare a hormonilor sexuali (SHBG) cat si in procesul de inflamatie sau in angiogeneza [437,438].

Pacientii obezi si diabetici au un risc semnficativ crescut pentru anumite forme de cancer comparativ cu diabetici non-obezi si obezii non-diabetici, datorita agresivitatii factorilor de risc prezenti in grupul diabetic obez.

Mediul diabetic implica coexistenta intr-o concentratie crescuta a numeroase si variabile molecule de semnalizare: hiperinsulinemia si hiperIGF1 liber, prezenta in exces a leptinei si a citokinelor proinflamatorii [including prostaglandin E2, TNF-α,IL-1β IL-2,IL6, IL-8, IL-10, and monocyte chemoattractant protein (MCP)-1] prezenta produsilor avansati de glicozilare (AGE), prezenta hiperglicemiei, a AGL in exces (in special acidul palmitic)[437-439]. Excesul acestor molecule de semnalizare activeaza atat calea centrala Akt/PI3K/mTOR cat si alte cai si diferiti factori de transcriptie cum sunt MAPK si subfamilia c-Jun N-terminal protein kinases (JNK), JAK-STAT (STAT3), NFkB sau modifica statusul sistemului redox celular prin cresterea productiei de specii reactive de oxigen[437-439].Toate aceste fenomene complexe coexista, interactionand contiuu si amplificandu-se progresiv (crosstalk between the signalling patways), iar in final stimuland atat initierea cat si promotia si progresia cancerului [437-439]. Mecanismul fiziopatologic central in DZ tip2 si obezitate este reprezentat de hiperactivarea caii Akt/PI3K/mTOR enhanced mammalian target of rapamycin (mTOR) activity, aceasta calea de semnzalizare fiind una din cele mai dereglate cai din patologia tumorala umana[440]. Proteina mTOR regleaza balanta fina intre disponibiliatea celulara de nutrienti si nivelul factorilor de crestere, integrand semnalele extra si intracelulare pentru ca impreuna cu proteina p53 sa coordoneze procesele celulare esentiale: de crestere, proliferare, senesecenta, autofagie si apoptoza celulara[440]. Astfel calea p53-mTOR intervine in procese majore cum ar fi patologia cancerului, patologia diabetului zaharat dar si in procesul de imbatranire. Proteina p53 controleaza mTOR prin intermediul a 2 proteine sensibile la nivelul de glucoza: AMPK si  tuberous sclerosis (TSC) 1/TSC2 complex[440]. Proteina p53 interactioneaza cu caile de semnalizare IGF1-AKT1-mTOR realizand retele de semnalizare complexe. Aceste retele (circuite integrative modulatoare de transmisie a semnalelor) sunt interconectate prin puncte de conexiune centrale cum sunt (p53-Mdm2;IGF1-AKT1; TSC1-TSC2-mTOR, GSK3-HIF1) si controlate in mod coordonat de proteine functionale (p53, PTEN, TSC2, PI3K, AKT-1,GSK3, HIF1, MDM2,AMPK, and mTOR)[97,100]. Calea p53-IGF1-AKT-PI3K-mTOR este profund influentata de excesul de molecule de semnalizare prezente in DZ si in obezitate, cu o concentratie mai mare la diabeticii obezi si implicit afectarea caii fiind mai pronuntata la acest grup de pacienti [441].Initierea cancerului in DZ si/sau obezitate poate fi produsa atat in mod direct prin actiunea nociva a SRO din semnalizarea aberanta cat si indirect prin mutatia unor proteine implicate in mecanismul de reparare ADN sau chiar deterioarea oxidativa a ADN mitocondrial si nuclear insesi [439,442]. Toate aceste fenomene sunt determinate de semnalizarea excesiva prin caile specifice[55] sau prin transactivarea unor cai nespecifice DZ, cum ar fi familia EGF (EGFR) [439,443].

Calea de semnalizare AKT/PKB (antiapoptotica) regleaza apotpoza prin mai multe mecanisme complexe la mai multe nivele de reglare : fie prin controlul direct al familiei proteinelor Bcl-2, fie prin controlul unor factori transcriptionali implicati in apoptoza, fie prin reglarea metabolismului glucozei [444]. In prezenta unor niveluri mari de insulina (si IGF1) AKT/PKB fosforileaza GSK la nivelul Ser 133 ce regleaza activitatea cai de transcriptie β-catenina-TCF/LEF cu inhibarea apoptozei, ceea ce creaza o legatura foarte interesanta intre metabolism si controlul apoptozei prin intermediul AKT. Un alt mecanism implicat in metabolism este actiunea AKT/PKB asupra preluarii de nutrienti in absenta factorilor de crestere (in special preluarea de glucoza, ceea ce previne inductia activatoare conformationala a Bax si apoptoza) [444];Exista si alte cai de receptoriale ce pot active calea AKT respective: MAPK (via Ras) si citokinele proinflamatorii (calea JAK1-PDK1-AKT)

Mutatia p53 este un eveniment temporal variabil in carcinogeneza, functie de tipul si de locatia mutatiei, dar si de tipul de tumora,favorizand toate etapele carcinogenezei. Functie de momentul mutatiei, p53 influenteaza in mod diferit diversele etape ale carcinogenezei, (initiere, promotie si metastazare) [445]. Mutatia p53 a fost descrisa intr-o multime de tumori cum ar fi tumorile de : san, vezica urinara, carcinomul cu celule scuamoase de cap si gat, cancerul ovarian, tumori cerebrale, hepatice, colorectale, pulmonare, ostosarcoame , carcinomul adrenocortical, rabomiosarcomul [445]. In mod normal sinteza p53 are un nivel bazal iar nivelul de proteine este reglat activ printr-o rata crescuta de degradare (20min supravietuire proteina). In conditii de stres expresia p53 este stabilizata prin blocarea degradarii si prin procesele de activare.P53 este o proteina cu rol de factor de transcriptie activa sub forma de tetramer. Datorita acestei structuri tetramerice, functie de combinatiile posibile intre tetrameri, numai 1/16 tetrameri p53 retin functia deplina a WTp53,restul tetramerilor continand una sau mai multe subunitati mutante[ 446] ceea ce va conduce la o variabilitate mutationala in randul tumorilor.Modularile in activatile p53 induse de o serie de mutatii sau activari in exces datorita (cum este in DZ glicozilare crescuta) ce pot favoriza aparitia de anomalii de semnalizare in diverse alte cai.

Existe numeroase molecule in studiu anti-p53 cu rol de restabilire a functiei normale a p53, ce pot reactiva pe mai multe cai p53 mutant cum ar fi de exemplu: Advexin, Gendicine, SCH-58500, adenovirusul non-replicativ WT-TP53 ONYX-015; adenovirusi speciali ce pot actiona in celule ce prezinta o functie anormala a p53 de tipul PRIMA-1, MIRA-1, CP-31398, STIMA-1; mici molecule ce pot reactiva expresia normala a p53 de tipul HL198C, NU8354,c lorofuzin, RITA, MI-219, BDP 23, inhibitorii interactiunii p53-Mdm2 de tipul GEM240, oligonucelotidele antisens ce inhiba expresia Mdm2 de tipul Tenovin-6 si inhibitorul deacetilarii ce activeaza p53 [159].

Exista doar doua studii in literatura de specialitate, ale aceluiasi grup de autori (Vairaktaris E si colab 2007; 2008), efectuate pe modele murine diabetice, ce indica o asociere intre prezenta mediului diabetic si modificarile expresiei p53 in carcinogeneza orala. Aceeiasi autori nu identifcat insa o asociere pentru familia proteinelor Bcl2 (pentru proteinele de tipul Bax / Bcl2) [447,448]. Pe aceste modele, DZ se asociaza cu o frecventa crescuta a mutatiilor la nivelul genei P53 iar expresia crescuta a proteinei p53 este alterata in toate stadiile carcinogenezei, din stadiile initiale si pana in stadiile avansate [447].

Interesant este ca desi nu exista date in literatura privind expresia Bcl2 in tumori maligne la subiectii umani diabetici, o serie de studii au evidentiat o expresie scazuta a Bcl2 in complicatiile specifice DZ , prezenta Bcl2 fiind asociata cu o scadere a riscului de aparitie al complicatiilor [449,450].

Prognosticul mai rezervat al pacientilor cu ADK colorectal diabetici, poate fi explicat prin procentul mai mare de pozitivitate a p53 in grupul diabeticilor obezi. Proteina p53 regleaza fenotipul Warburg prin controlul proceselor energetice celulare. La nivelul metabolismului celulei tumorale proteina WT p53 blocheaza aparitia fenotipului Warburg ( crescand fenomenul de glicoliza aeroba), prin mentinerea producerii de energie la parametrii optimi dar cu inhibitia caile anabolice de crestere celulara [451]. Forma WT p53 regleaza metabolismul energetic al celulei functie de raportul ATP/ADP din citosol (ATP inhiband iar ADP stimuland activitatea p53) prin reglarea balantei dintre glicoliza [(scade expresia transportorilor de glucoza GLUT 1 si GLUT4, regleaza nivelul de 1,6 bifosfat prin intermediul TIGAR, scade nivelul fosfglicerat mutazei 1 (PGAM1- the enzyme converting 3-phosphoglycerate to 2-phosphoglycerate)], si fosforilarea oxidativa ( favorizeaza OXPHOS, atat prin cresterea expresiei SCO-2 (synthesis of cytochrome c oxidase 2) cat si prin cresterea utilizarii glutaminei prin stimularea transcriptiei glutaminazei 2 –GLS2)[451]. Mutatia p53 se asociaza cu pierderea functiei p53 si stimularea fenotipului Warbug , ceea ce explica prognosticul mai rezervat in adenocarcinomul colorectal al pacientilor diabetici si obezi ce asociaza imunofenotipul p53+ [451].

La om tesutul adipos este de 2 tipuri: alb cu rol de depozit energic si rol in reglarea balantei energetice (functia sa asociindu-se pozitiv cu obezitatea) si bruncu rol in producerea de caldura prin arderea grasimilor (functia sa asociindu-se negativ cu obezitatea). Dezechilibrarea balantei homeostatice in obezitate creste riscul de dezvoltare a anumitor tipuri de neoplazie, rezistenta la insulina si T2D.

Reteaua adipogenica este reglata prin intermediul a 2 factori esentiali : Peroxisome Proliferator-Activated-Receptor-g (PPARg) si CCAAT-Enhancer-Binding-Protein-a (CEBPa) si include factori cu rol in diferentierea atat a tesutului adipos alb si brun[ ( Adipocyte-Fatty-Acid-Binding Protein (AP-2) si Adiponectin (AdipoQ)] cat si numai a tesutului adipos brun [(Uncoupling-Protein-1 (UCP-1), PPARg Coactivator-1a (PGC-1a), Elongation of Very Long chain fatty acids gene 3 (Elovl3) si Cell Death-Inducing DNA Fragmentation Factor-like Effector A (Cidea)] [452].

Proteina p53 se pare ca este implicata in procesele de diferentiere ale tesutului adipos atat in-vivo cat si in-vitro. Astfel ea exercita un efect reglator pozitiv la nivelul tesutului adipos brun, insa are un efect supresor la nivelul tesutului adipos alb, atat pe celule umane cat si pe celule de modele murine. Hipertofierea adipocitelor prin acumularea de lipide la nivel intraadipocitar activeaza p53 ce mentine statusul homeostatic prin represia factorului adipogenic cheie PPARg. Anularea functiei p53 la nivelul tesutului muscular scheletic altereza capacitatea sa de diferentiere in tesut adipos brun si induce o morfologie anormala la soarecii adulti sau embrioni p53-nuli , mecanism mediat prin factorul de transcriptie Positive-Regulatory-Domain-Containing- 16 (PRDM16)[452]. Proteina p53 poate joaca astfel un rol dual functie de programul de diferentiere adipogenica. Aceast tip de de reglare, direct, celular dependent, reflecta o modalitate suplimentara a p53 de a mentine statusul homeostatic atat la nivel celular cat si la nivel unitar, de organism [452]. Desi pana in prezent nu s-au putut identifica legaturile moleculare cat si rolul exact al p53 in relatia obezitate-cancer, se poate spune ca alterarea expresiei si implicit a functiei p53 va conduce la modificari in procesul de diferentiere cu cresterea acumularii de tesut adipos alb. Toate aceste modificari pot fi o potentiala veriga de legatura intre obezitate, alterarea metabolismului si cancer. Suplimentar acestor date, p53 este implicata in protectia obezitatii induse de dieta [452]..

Se poate emite o ipoteza interesanta in urma rezultatelor studiului actual referitoare la prezenta obezitatii ce se asociza cu anomalia expresiei p53 in diabet: putem concluziona ca anumite subseturi de persoane prezinta o anomalie a proteinei supresoare tumorale p53 ce poate predispune la obezitate prin modificarile induse in procesul de diferentiere al tesutului adipos alb cu facilitarea acumularii de tesut adipos, si prin aceasta conducand la aparitia obezitatii. Prezenta obezitatii va induce pentru un anumit subset de persoane ce asociaza o disfunctie a celulei β, modifcari glicemice variabile iar in final aparitia DZ. Ulterior aparitia DZ si coexistenta alaturi de obezitate poate creste riscul de cancer colorectal prin mecanisme moleculare complexe. Totusi putem enunta ca datorita functiilor biologice extrem de complexe ale proteinei p53, fiind implicata in special in procesul de apoptoza, persoanele ce asociaza anomalia p53 pot fi predispuse la anumite tipuri de cancer in general si in special sunt la risc de dezvolta neoplaziile maligne colorectale, in absenta obezitatii sau a DZ.

Foarte interesant este ca pe langa evenimentele mutationale mai frecvente ale p53, in DZ, p53 poate fi inactivat si prin fenomene non-mutationale. Desi in studiul actual expresia p53 a fost crescuta pe lotul general de pacienti diabetici (obezi si non-obezi) comparativ cu non-diabeticii (46.2% vs 34.9%) ea nu a fost semnificativa statistic (p=0.306). Aceasta lipsa de asociere a expresiei anormale a p53 in lotul diabetic poate fi ipotetic justificata prin cresterea frecventei fenomenelor non-mutationale ale proteinei supresoare tumorale p53 din DZ. Aceste fenomene pot explica suplimentar atat riscul crescut de aparitie cat si de mortalitate crescuta a CCR in DZ. Un studiu recent efectuat pe culturi celulare indica un mecanism non-mutational de inhibare a actiunii WTp53 functie de nivelul glicemiei. Astfel exista un nivel de directa proportionalitate intre valoarea glicemiei si activitatea p53. Un nivel crescut de glucoza (mediul hiperglicemic) inhiba activitatea p53, la nivelul situsului specific de activare a apoptozei, iar un nivel scazut de glucoza activeaza p53 si scade activitatea prooncogenica a p53 mutant [453]. Inhibarea activitatii p53 prin fosforilarea la niveul Ser46 (p53Ser46), se realizeaza numai pentru forma WTp53 nu si pentru forma mutanta a p53 (Ser46D p53 mutant) [453]. In acest mod inactivarea p53 va inhiba transcriptia proteinei pro-apoptotice Puma, ce apartine familiei Bcl2. Blocarea functiei p53 fie prin mecanisme mutationale sau non-mutationale, explica rezistenta crescuta la tratament intalnita la neoplaziile aparute in mediul diabetic (hiperglicemic), si poate constitui un mecanism molecular de legatura intre bolile metabolice, diabet si obezitate si carcinogeneza [453].

Inactivarea p53 se asociaza cu rezistenta crescuta la tratamentul antitumoral, atat chimioterapic, cat si radioterapic sau hormonoterapic intr-o varietate de tumori in contrast cu mentinerea functiei p53 ce s-a asociat cu un raspuns bun la tratament [454,455]. Explicatia deriva din leziunile celulare importante produse de agentii citotoxici si de radiatiile utilizate in tratamentul cancerului ce activeaza calea intrinseca a apoptozei prin intermediul proteinei p53, dar si mutatiile proteinei p53 (prezente in mai mult de 50% din tumori) ce blocheaza aceasta activare producand rezistenta la tratament [454,455]. Suplimentar pacientii diabetici si obezi au o rezistenta mai crescuta la tratament datorita frecventei mai crescute a mutatiei p53 dar si a evenimentelor non-mutationale p53. Modularea expresiei p53 din forma mutanta in forma normala -WTp53 prin introducerea unor grupari functionale intermediate de mici molecule (peptide) si activarea structurii WTp53 sau distrugerea celulelor tumorale ce contin p53 mutant pot reprezenta metode eficiente de tratament selective pentru anumite subseturi de tumori[455].

Nu au existat asocieri semnificative statistic intre pacientii diabetici si non diabetici cu ADK colorectal, raportat la parametrii demografici si clinico-morfopatologici, respectiv invazia limfovasculara, cea perineurala, raspunsul limfocitar intratumoral, raspunsul inflamator peritumoral, extensia ganglionara, extensia tumorala, prezenta metastazelor, stadializarea, varsta,sex, mediu de provenienta, localizarea tumorala. Aceste date sunt in concorandanta cu datele catorva studii raportate in literatura, cu exceptia gradului histologic de diferentiere [456-458].

Majoritatea studiilor nu au evidentiat in ADK colorectal o diferenta semnificativa in privinta gradingului [456-458] la diabetici comparativ cu non-diabeticii. Asocierea DZ tip2 cu un grad de diferentiere scazut in studiul nostru implica o posibila ipoteza speculativa a actiunilor antiproliferative a Metforminului. Teoretic mediul diabetic favorizeaza procesul de-dediferentiere celulara. Studiile pe culturi de celule enterocitare (HT-29) au evidentiat asocierea hiperglicemiei cu procesul de dediferentiere celulara, fenomen insotit de activarea glicolizei intr-un grad proportional cu gradul de diferentiere ( cresterii captarii de glucoza, productiei de acid lactic si scaderea cantitatii de glicogen intracelular pana la un nivel echivalent cu statusul celular nediferentiat). In contrast absenta glucozei stimuleaza procesul de diferentiere celulara [459]. Desi in studiul nostru nu detinem date privitoare la tratamentul cu metformin, se cunoaste ca metforminul este cel mai utilizat ADO, fiind prima linie de tratament in DZ tip2, iar acest tratament se mentine in absenta reactiilor adverse sau contrainidcatiilor. Se cunoaste ca agresivitatea unei tumori creste proportional cu gradul de diferentiere al tumorii. O multime de studii recente indica Metforminul, ca pe un potential agent terapeutic antineoplazic unic sau in asociere cu alte chimioterapice[460-462]. Tratamentul cu Metformin la pacientii cu adenocarcinom colorectal cu DZ tip 2 se asociaza invers proportional cu riscul de metastazare si gradul de dediferentiere celulara, procese mediate cel mai probabil prin activarea caii AMPK si inhibarea caii Wnt/β-catenin, dar si prin scaderea semnalizarii in axa insulina/IGF, intreruperea respiratiei mitcondriale, dar si inhibarea caii mTOR (mammalian target of rapamycin) si prin inhibarea invazivitatii induse de citokine [463,464]. Metforminul joaca un rol atat in procesul de dediferentiere cat si de diferentiere celulara[465,466].Metforminul a evidentiat de asemenea o scadere a riscului de evolutie a adenoamelor in adenocarcinoamelor [467-468].

Fiind un studiu restrospectiv, studiul nostru are cateva limite importante: Datele clinice sunt preluate din biletele de externare fara ca DZ sa fie diagnosticat printr-o metoda standardizata. Nu exista date referitoare la gradul de control glicemic anterior diagnosticului de cancer, a duratei tratamentului antidiabetic si nici a dozei sau a tipului de ADO/ sau insulina. Factorii de confuzie in aparitia CRC ai DZ , legati de stilul de viata nu au putut fi separati de alti factori.

CONCLUZII

Importanta stiintifica a studiului deriva din faptul ca este primul pe subiecti umani care investigheaza in paralel factori implicati atat in patogeneza DZ cat si in patologia maligna (expresia proteinelor Bcl-2 si p53). Pana in prezent acesti markeri nu au mai fost studiati impreuna ca tandem, ci separat pentru fiecare patologie in parte, fie in DZ fie in diverse tipuri de cancer.

Studiul actual are o particularitate tehnica importanta, reprezentata de tehnica de detectie IHC duala, utilizata pentru identificarea concomitenta a expresiei proteinelor Bcl2 si p53 in aceeasi celula tumorala.

Evaluarea initiala comparativa a parametrilor clinico-morfotipici si imunofenotipici pe sexe, nu a evidentiat diferente semnificative, cu exceptia extensiei tumorale (T) si a extensiei ganglionare (N). Barbatii au asociat stadii mai avansate ale extensiei tumorii primare (T) prezentand in exclusivitate stadiul T2 (100%), insa cu absenta stadiului T1 (0%), (p=0.029) iar femeile au asociat mai frecvent extensie ganglionara (N) (75% vs 46%, p=0.009) , ambele asocierii avand semnificatie statistica.

Evaluarea in lotul general a parametrilor clinco-morfo-imunofenotipici in raport reciproc a identificat urmatoarele asocieri semnficative statistic:

-asocierea IVL cu un grad de extensie tumorala avansata (cu o crestere proportionala intre procentul de IVL si valoarea T, p=0.007) si cu afectare ganglionara (N1-81% comparativ cu N1 in absenta IVL de 21%, p=0.001), cu un stadiu mai avansat tumoral (cu o crestere proportionala intre procentul de IVL si valoarea stadiului tumoral, p=0.001) si cu prezenta metastazelor ( 84% din IVL prezente in tumorile cu metastaze comparative cu 44% in cele fara metastaze, p=0.001).

-asocierea RLI redus cu prezenta metastazelor (≤2 limfocite pe camp de obiectiv 40), p=0.004.

-asocierea RLI cu un grad tumoral bine diferentiat (6 limfocite pe camp de obiectiv 40 in 50% din cazurile G1 comparativ cu 2% in G2 si 3% in G3, p=0.005)

-asocierea mai frecventa a expresiei p53 de clasa 2 atat cu un RIP mixt comparativ cu RIP cronic (55.9% vs 32.8%, p=0.025) dar si cu un cu un grad tumoral moderat diferentiat (G2 -49%) comparativ cu G1 (0%) sau G3 (31%), p=0.024.

Analiza comparativa a loturilor raportata la parametrii clinico-morfopatologici in adenocarcinoamalele colorectale, a evidentiat ca pacientii diabetici comparativ cu pacientii non-diabetici au asociat mai frecvent dar nesemnificativ statistic:

-o predominanta usoara a femeilor (36.5% vs 30.2%),

-o varsta mai inaintata la internare (70.2 ani vs 69.5 ani);

-o frecventa mai crescuta a tumorilor la nivelul colonului ( 65.4% vs 51.2%);

-un grad de extensie tumorala crescut (T) la nivelul peretelui intestinal (pT4 26.9% vs 23.3%)

-o extensie crescuta a IVL (59.6% vs 48.8%);

-o frecventa crescuta a extensiei limfoganglionare (N) (61.5% vs 48.8%)

-o frecventa crescuta a metastazelor (28.8% vs 23.3%);

-o frecventa crescuta a stadiului III tumoral (40.4% vs 32.6%)

– prezenta mai frecventa a unui RIP de tip cronic (65.4% vs 62.8%);

-o durata mai crescuta a spitalizarii post-operatorii cu o medie de 18.7 zile (vs 10.1 zile);

-o frecventa crescuta a comorbiditatilor (obezitate, dislipidemie, BCI, si HTA);

-o dimensiune mai scazuta a tumorii primare (4.6cm vs 5.6cm);

-un tablou clinic modificat la internare prin aparitia mai frecventa a melenei sau rectoragiilor (29% vs 18%);

-o evolutie postoperatorie nefavorabila sau lent favorabila (37% vs 12%) cu aparitia mai frecventa a complicatiilor postoperatorii (31% vs 14%) si a 5 decese.

Invazia perineurala si RLI au prezentat valori asemanatoare in cele doua grupuri.Grupul diabetic s-a asociat insa cu tumori cu grad histologic de diferentiere scazut (G1+G2), aceasta asociere fiind semnificativa statistic (p=0.043) (tabelul III.1).

Privitor la expresia IHC a proteinelor Bcl2 si p53 pacientii diabetici comparativ cu pacientii non-diabetici au asociat mai frecvent o expresie crescuta anormala a proteinei p53 (46.2% vs 34.9%), o expresie mai scazuta a Bcl2 (9.6% vs 16.3%), si o asociere mai frecventa cu imunofenotipurile de clasa 3 (42.3% vs 32.6%) si clasa 4 (11.5% vs 7%) insa fara relevanta statistica. Analiza expresiei proteinei p53 pe subloturi, a identificat o asociere semificativa statistic cu obezitatea. Pacientii diabetici-obezi prezinta mai frecvent expresia anormala a proteinei p53 comparativ cu non-diabeticii in ADC colorectal.

Evaluarea comparativa in lotul diabetic vs non-diabetic a parametrilor clinico-morfotipici functie de clasa imunohistochimica (IHC) a identificat o asociere mai frecventa a lotului diabetic (insa fara semnificatie statistica p>0.05) cu urmatorele variabile analizate

– in cadrul extensiei tumorale, cu T1 (33%vs0%, p>0.5) si T4 (33% vs 0%, p=0.181) in cadrul imunofenotipului Bcl2+/p53-, cu extensia tumorala T2 (14% vs 7%, p=0.824) in cadrul imunofenotipului Bcl2-/p53+ si cu extensia tumorala T4 (17% vs 0%, p>0.5) in cadrul imunofenotipului Bcl2+/p53+.

– o frecventa mai crescuta a metastazelor (67% vs 29% si respectiv 17% vs 0%) in cadrul imunofenotipurilor Bcl2+/p53- si Bcl2+/p53+

– o crestere a extensiei ganglionare (67% vs 29%) in cadrul imunofenotipurilor Bcl2+/p53- si respectiv 67% vs 33% in cadrul imunofenotipului Bcl2+/p53+

– o frecventa mai crescuta a stadiilor tumorale avansate pentru imunofenotipurile de clasa 2-4, astfel pentru imunofenotipul Bcl2+/p53- au asociat mai frecvent stadiul IV in 67%vs 29% din cazuri, pentru imunofenotipul Bcl2-/p53+ au asociat mai frecvent stadiul III in 36% vs 28% din cazuri, iar pentru imunofenotipul Bcl2+/p53+ au asociat mai frecvent stadiul III in 67% vs 33% ,

– cu prezenta IVL in cazul imunofenotipurilor Bcl2+/p53-( 67% vs 43%), Bcl2-/p53+ (59% vs 43%) si Bcl2+/p53+ (67% vs 33%)

– o asociere pozitiva cu IPN in cazul imunofenotipului Bcl2+/p53+ (67% vs 33%)

-atat cu un raspuns limfocitar intratumoral (RLI) crescut (6 limfocite pe camp microscopic de obiectiv 40) (34%vs 0%) in cadrul imunofenotipului Bcl2+/p53- cat si cu un RLI redus (1 limfocit pe camp microscopic de obiectiv 40) (59% vs 36%), in cadrul imunofenotipului Bcl2-/p53+

-o frecventa crescuta a raspunsului inflamator peritumoral (RIP) de tip cronic (100% vs 71%) in cadrul imunofenotipului Bcl2+/p53- si (83%vs 67%) si in cadrul imunofenotipului Bcl2+/p53+.

-un grad histologic scazut (G2) in toate cele 4 clase imunofenotipice: in cadrul imunofenotipului Bcl2-/p53- in 62% vs 53%, pentru imunofenotipul Bcl2+/p53- in 67% vs 43%, pentru Bcl2-/p53+ in 77% vs 71%, iar pentru imunofenotipul Bcl2+/p53+ in 100% vs 33% .

Analiza detaliata a parametrilor clinico-morfotipici in functie de expresia proteinei supresoare p53 in diabet vs. non-diabet a indicat o asociere mai frecventa a lotului diabetic (fara semnificatie statistica, p>0.05) in cadrul expresiei p53 de clasa 2 (expresia p53 >70% din celulele tumorale de intensitate moderata sau inalta) cu urmatoarele variabile:

– un raspuns limfocitar intratumoral (RLI) redus (1 limfocit pe camp microscopic de obiectiv 40) (63% vs 33%).

– o asociere mai crescuta cu gradul histologic moderat -G2 (52.6% vs 41.7%)

– o frecventa crescuta a IVL (58% vs 40%).

Raportat la extensia tumorala (T), ganglionara (N) , a prezenta metastazelor (M) a stadiului clinic, IPN si a RIP atat in clasa 0,1 (expresie p53<70% din celulele tumorale de intensitate redusa sau moderata) cat si in clasa 2 a proteinei p53, pacientii diabetici au prezentat valori similare.

Evaluare subgrupului de pacienti diabetici functie de obezitate a evidentiat in randul pacientilor diabetici obezi comparativ cu diabeticii non-obezi si non-diabeticii urmatoarele asocieri (insa fara semnificatie statistica, p>0.05):

– o frecventa mai crescuta a stadiul II tumoral in randul pacientilor diabetici obezi (47%) si non-diabetici (42%) comparativ cu diabeticii non-obezi (16%)

-cu imunofenotipul Bcl2-/p53+ (60%) comparativ cu diabetcii non-obezi (35%) si non-diabetici (33%)

-expresia Bcl2/p53 (13%) comparativ cu diabeticii non-obezi (8%) sau non-diabetici (5%)

-un grad histologic scazut (G2-87%), comparativ cu diabeticii non-obezi (68%) si non-diabetcii (56%)

In urma analizei IVL, IPN, RLI, RIP sau expresiei Bcl2 in cele trei loturi, nu s-au identificat diferente semnificative, valorile fiind aproximativ similare.

Pacientii diabetici obezi au insa si o particularitate, expresia anormala a proteinei supresoare p53, ce s-a exprimat mult mai frecvent in ADC colorectale din lotul diabetic obez (80% din cazuri) comparativ cu lotul diabetic non-obez (41% din cazuri) sau non-diabetici (37% din cazuri) cu semnificatie statistica (p=0.024).

Evaluarea variabilelor clinico-morfotipice si imunohistochimice functie de tipul de tratament hipoglicemiant, a identificat in randul pacientilor diabetici tratati cu insulina comparativ cu ADO urmatoarele asocieri:

– o expresie mai frecventa a Bcl2 (25%vs 5%)

– mai frecvent coexpresia Bcl2/p53 (25% vs 10%,p=0.242)

– mai frecvent expresie scazuta a p53 (13% vs 51%)

– mai frecvent imunofenotipul Bcl2+/p53- (24% vs 2%) insa fara semnificatie statistica (p=0.086).

-mai frecvent tumori cu un grad de diferentiere moderat, comparativ cu cu cei aflati pe terapie orala (G2-87% vs 69%).

Rezultatele acestui studiu sugereaza ca pacientii cu DZ tip2 prezinta mai frecvent adenocarcinoame colorectale moderat diferentiate (G2) comparativ cu pacientii non-diabetici ce prezinta un grad de diferentiere redus (G3). Aceasta asociere implica o potentiala ipoteza speculativa a tratamentului antidiabetic cu Metformin.

Studiul actual a evidentiat ca pacientii diabetici prezinta mai frecvent mutatia proteinei p53 in adenocarcinoamele colorectale comparativ cu non-diabeticii, insa fara semnificatie statistica. O particularitate importanta in privinta expresiei p53, este, pentru subgrupul de pacienti diabetici obezi ce prezinta o expresie anormala a p53 mult mai frecvent comparativ cu diabeticii non-obezi sau non-diabeticii, semnificativa statistic (desi prezinta un grad histologic redus).

Putem concluziona in final ca esenta rezultatelor acestui studiu este: pacientii diabetici, mai ales subgrupul de pacienti diabetici-obezi reprezinta un grup de pacienti cu o agresivitate crescuta a adenocarcinomului colorectal comparativ cu non-diabeticii. Expresia aberanta a p53 asociata DZ tip2 si obezitatii , confera acestui grup un prognostic mai rezervat atat in privinta evolutiei, progresiei, recurentei cat si al raspunsului la tratament. Prezenta crescuta a expresiei aberante p53 in lotul diabetic din studiul actual poate fi considerat ca un marker de prognostic negativ in cancerul colorectal si poate explica partial mortalitatea crescuta prin cancerul colorectal atat in DZ tip2 cat si in obezitate, cat mai ales in asocierea DZ tip2 cu obezitatea. Pacientii diabetici-obezi ar reprezenta grupul cel mai indicat pentru tratament molecular tintit anti-p53, avand teoretic un beneficiu crescut comparativ cu celelalte grupuri in urma acestui tratament.

CAPITOLUL 11

Studiul 4. Evaluarea metabolismului glucozei in cancerul colorectal la pacientii diabetici prin metoda FDG-PET-CT

INTRODUCERE.Scop.Obiective.

Tomografía cu emisie de pozitroni (PET)- ofera informații privind activitatea metabolica unui tesut) iar combinată cu computer tomografia (CT-ofera informatii anatomice precise) este una dintre cele mai avansate metode de diagnostic imagistic. Pentru examinarea PET se folosește o moleculă de glucoză marcată radioactiv cu fluor (18F) – 18F-2-fluoro-2-deoxy-D-glucoza – prescurtat FDG, care permite vizualizarea activității metabolice a țesuturilor și relevă modificările funcționale care apar, în multe cazuri, înainte ca modificările anatomice, structurale să se producă. FDG-ul nu este toxic, a fost aprobat pentru anumite proceduri medicale și nu au fost raportate efecte adverse [470-473].

Investigatia PET are ca si prinicpiu de baza o caracteristica particulara a metabolismului tumoral, reprezentata de cresterea metabolismului glucozei prin cresterea captarii intracelulare a glucozei. Datorita cestei particularitati a metabolismului neoplazic, marcarea radioactiva a glucozei permite o vizualizare detaliata si precoce a tumorilor maligne.

Tomografia cu emisie de pozitroni, reprezinta astfel, o metoda imagistica non-invaziva ce permite vizualizarea in vivo a functiei tesuturilor prin intermediul activitatii metabolice. Pentru vizualizarea imaginilor se utilizeaza substante radioizotopice obtinute cu ajutorul ciclotronului.

Exista diversi radiotrasori utilizati in PET ( derivati din radioizotopii ce emit pozitorni 11C, 15O și 13N) ce utilizeaza diverse substrate biologice (dopamina, tirozina, fluorodeoxiuridin etc) dar cel mai folosit radiotrasor este FDG, ce are ca substrat biologic glucoza. Trei factori majori au impus utilizarea sa ca prima alegere: captarea crescuta de glucoza a tesutului tumoral, timpul de injumatatire mai lung (107min comparativ cu ceilalti radioiziotpoi ce au un timp de injjumatire de oridnul minutelor sau secundelor) si obtinerea in cantitati suficiente prin utilizarea de ciclotroane de mici dimensiuni [474].

Investigatia PET este extrem de utila intr-o varietate de neoplazii, ce prezinta o rată metabolică crescuta (de exemplu: limfoamele,melanoamele,cancerul de colon, san ,bronho-pulmonar[4]),comparativ cu țesuturile înconjurătoare [470-474].

Scopul studiului a fost sa evalueze din punct de vedere imagistic metabolismul glucozei in tumorile maligne colorectale, cat si sa reliefeze influenta si potentialele interferente ale mediului hiperglicemic diabetic si a terapiei hipoglicemiante in investigatia FDG-PET-CT.

Obiectivele studiului au constat in evaluarea metabolismului glucozei la nivelul tumorilor primare si/sau a metastazelor in 6 cazuri de adenocarcinom colorectal, un caz cancer de san si un caz de melanom malign. Un alt scop al studiului, a fost atat in a identifica si evidentia potentialul limitant al hiperglicemiei asociate mediului diabetic, cat si a tratamentului antidiabetic reprezentat de insulina sau Metformin in investigatia PET-CT.

Materiale si metode

Studiul a fost unul observational, non-interventional de tip transversal si s-a desfasurat in perioada 01.03.2015-01.10.2015 in Clinica Neolife Medical Center din Bucuresti. Am analizat si am evaluat alaturi de echipa de la Clinica Neolife Bucuresti un numar de 9 pacienti prin metoda PET-CT atsfel: 2 pacienti diabetici cu ADK colorectal, 5 pacienti non-diabetici cu cancer colorectal, un pacient cu cancer de san si un pacient cu melanoma malign. Studiul a inclus si analiza retospectiva a unui set de imagini PET-CT din colectia Clincii Neolife Bucuresti. Investigatia FDG-PET-CT s-a realizat cu ajutorul aparatului Discovery  610 HD PET-CT fabricat de  General Electric, un aparat de de ultima generatie, performant prin acuratete si doza mica de radiatie de expunere. Pacientii au fost supusi protocolului standard de PET-CT ce a inclus urmatoarele etape: Intr-o etapa initiala s-a injectat prin intermediul unui cateter intravenos montat la nivelul antebratului, glucoza marcata radioactiv de tipul FDG urmata de o perioada de repaus fizic de aproximativ 60 minute in pozitie de clinostatism. Doza de FDG administrata a fost dependenta functie de greutatea pacientului si de durata de expunere. Etapa urmatoare a inclus analiza efectiva a distributiei trasorului radioactiv prin intermediul aparatului de PET-CT. In final imaginile obtinute, au fost procesate si stocate digital cu acordul Clinicii Neolife Bucuresti.

Ca si prinicpiu general al metodei , FDG emite pozitroni. Pozitronul are o durata de viata scurta, un traiect scurt iar prin interactiunea cu electronii existenti in tesuturi, cele doua particule se anihileaza (pozitron-electron) cu aparita cvasisimultana a doi fotoni gamma cu o energie de 511 kiloelectroni volt (511keV), ce vor traversa tesuturile, parasind organimsul si vor fi captati si detectati de camera PET [474]. Camera PET este formata dintr-un set de tuburi fotomultiplicatoare dispuse circular in mai multe coroane de blocuri detectoare pentru a permite detectia fotonilor si cristale de scintilatie pentru a permite conversia fotonilor gamma in fotoni din spectrul vizibil [474].Prin acest fenomene fizice se vizualizeaza distributia radiotrasorului in diversele tesuturi [474]. Daca PET vizualizeaza activitatea functionala a tesutului, CT vizualizeaza detalii morfologice structurale, cuplarea celor doua metode prezentand astfel avantaje complementare .

Rezultate

Figura IV.1.Imagini FDG PET-CT. Artefacte in investigatia PET-CT. Se observa A. o activitate metabolica crescuta la nivelul muschilor antebratului, precum si a muschilor scaleni (efort fizic cu 24 ore inainte de investigatie) si, de asemenea, activitate metabolica crescuta fiziologic la nivel cerebral, renal, miocardic, precum si acumularea de trasor radioactiv la nivel vezical, marcata printr-o intensitate crescuta a culorii negre sau imagini de culoare alb intens. O activitate difuza marcata printr-o nuanta de gri inchis, se observa la nivel hepato-splenic datorita captarii fiziologice. B. activitate metabolic crescuta la nivelul musculaturii striate – pacientul s-a alimentat inainte de investigatie si astfel glucoza marcata radioactiv a fost fixata de insulina in muschi. C. pacient diabetic – valori ale glicemiei > 200 mg/dl – fixare crescuta a glucozei marcate radioactiv la nivelul tuturor tesuturilor. D. acumulare fiziologica de FDG la nivelul tesutului grasos din regiunile cervicala, supra- si subclaviculara, axilara, paravertebrala toracala, precum si perirenal si interanse digestive pelvine – “grasime bruna” – pacientul a stat la o temperatura scazuta inaintea investigatiei. Imagini oferite prin amabilitatea Clinicii Neolife Bucuresti.

Figura IV.2.Imagine FDG-PET-CT. Pacienta in varsta de 62 ani, cu DZ2 in tratament. Artefacte la nivelul cadrului colic datorita tratamentului cu Metformin. Activitate metabolica crescuta fiziologic la nivel cerebral, renal, miocardic, precum si acumularea de trasor radioactiv la nivel vezical, marcata printr-o intensitate crescuta a culorii negre sau imagini de culoare alb intens. Activitate moderata la nivel hepatio-splenic marcata printr-o culoare gri inchis. Imagini oferite prin amabilitatea Clinicii Neolife Bucuresti.

Figura IV.3. Imagine FDG PET-CT. Pacient in varsta de 62 ani, sex masculin diagnosticat si operat in martie 2015 de ADC recto-sigmoidian, cu colostoma. Initial in ianuarie 2015 a urmat tratament oncologic prin chimioterapie si radioterapie. Se observa in imagini metastazele hepatice (iunie 2015), marcate printr-o culoare neagra de intensitate crescuta sau imagini de culoare alb intens. Activitate crescuta fiziologic la nivel cerebral, renal, miocardic, precum si acumularea de trasor radioactiv la nivel vezical, si la locul de injectare al trasorului radioactive, fiind marcate printr-o culoare neagra de intensitate crescuta sau imagini de culoare alb intens. Activitate metabolica moderata la nivel hepato-splenic marcata printr-o culoare gri inchis. Imagini oferite prin amabilitatea Clinicii Neolife Bucuresti.

Figura IV.4. Imagine FDG PET-CT. Pacienta in varsta de 57 ani cu ADC rectal operat (11.2012), chimiotratat (06.2013), radiotratat (09.2012). Se observa doua formatiuni tumorale pulmonare metabolic active (aprilie 2015) marcate printr-o culoare neagra de intensitate crescuta sau imagini de culoare alb intens. Activitatea crescuta fiziologic la nivel cerebral, renal, miocardic, precum si acumularea de trasor radioactiv la nivel vezical, sunt marcate printr-o culoare neagra de intensitate crescuta sau imagini de culoare alb intens. Activitatea metabolica moderata la nivel hepato-splenic este marcata printr-o culoare gri inchis. Imagini oferite prin amabilitatea Clinicii Neolife Bucuresti.

Figura IV.5. Imagine FDG PET-CT. Pacient in varsta de 59 ani, cu ADC de colon operat in august 2014 (metastazectomie seg IV hepatic, rezecție segmentară colon sigmoid), chimiotratat martie 2015. Se observa metastazele hepatice metabolic active (aprilie 2015), marcate printr-o culoare neagra de intensitate crescuta sau imagini de culoare alb intens. Activitatea crescuta fiziologic la nivel cerebral, renal, miocardic, precum si acumularea de trasor radioactiv la nivel vezical, este marcata printr-o culoare neagra de intensitate crescuta sau imagini de culoare alb intens. Activitatea metabolica moderata la nivel hepato-splenic este marcata printr-o culoare gri inchis. Imagini oferite prin amabilitatea Clinicii Neolife Bucuresti.

Figura IV.6. Imagine FDG-PET-CT. Pacienta in varsta de 39 ani, cu ADC de colon ascendent operat (hemicolectomie dreapta 2009) si chimiotratat. In anul 2012 histerectomie totală, anexectomie bilaterală pentru tumoră Krukenberg. Se observa multiple formatiuni tumorale metabolic active, metastatice, generalizate: hepatice, gastrice, osoase (noiembrie 2013) marcate printr-o culoare neagra de intensitate crescuta sau imagini de culoare alb intens. Se vizualizeaza activitatea crescuta fiziologic la nivel cerebral, renal, miocardic, precum si acumularea de trasor radioactiv la nivel vezical, marcata printr-o culoare neagra de intensitate crescuta sau imagini de culoare alb intens. Imagini oferite prin amabilitatea Clinicii Neolife Bucuresti.

Figura IV.7. Imagine FDG-PET-CT. Pacienta in varsta de 50 ani, cu ADC de colon transvers operat si chimiotratat (colectomie segmentara martie 2013). Se observa formatiuni tumorale metabolic active la nivel hepatic si splenic (aprilie 2015) colorate in negru sau imagini de culoare alb intens. Se vizualizeaza activitatea crescuta fiziologic la nivel cerebral, renal, miocardic, precum si acumularea de trasor radioactiv la nivel vezical, marcata printr-o culoare neagra de intensitate crescuta sau imagini de culoare alb intens. Imagini oferite prin amabilitatea Clinicii Neolife Bucuresti.

Figura IV.8. Imagine FDG PET-CT. Pacienta in varsta de 72 ani, cu ADK de colon transvers operat (colectomie sgementara sigomidiana iunie 2014) si chimiotratat (decembrie 2014). Se vizualizeaza o formatiune tumorala metabolic activa hepatica (aprilie 2015) colorata in negru sau imagini de culoare alb intens. Se vizualizeaza activitatea crescuta fiziologic la nivel cerebral, renal, miocardic, precum si acumularea de trasor radioactiv la nivel vezical, marcata printr-o culoare neagra de intensitate crescuta sau imagini de culoare alb intens. Imagini oferite prin amabilitatea Clinicii Neolife Bucuresti.

Figura IV.9. Imagini FDG-PET-CT. Pacienta in varsta de 58 ani, cu ADC de san drept, stadiu avansat, neoperat, metastazat. Se observa tumora primara si metastazele pulmonare si osoase (aprilie 2015) colorate in negru sau imagini de culoare alb intens. Se vizualizeaza activitatea metabolica crescuta fiziologic la nivel cerebral, renal, miocardic, precum si acumularea de trasor radioactiv la nivel vezical, marcata printr-o culoare neagra de intensitate crescuta sau imagini de culoare alb intens. Activitatea metabolica moderata la nivel hepato-splenic este marcata printr-o culoare gri inchis. Imagini oferite prin amabilitatea Clinicii Neolife Bucuresti.

Figura IV.10. Imagini FDG PET-CT. Pacient in varsta de 56 ani, de sex masculin cu melanom malign metastazat (august 2015). Se observa multiplele metastaze osoase in special la nivel vertebral marcate printr-o culoare negru inchis sau imagini de culoare alb intens. Se vizualizeaza activitatea crescuta fiziologic la nivel cerebral, renal, miocardic, precum si acumularea de trasor radioactiv la nivel vezical, marcata printr-o culoare neagra de intensitate crescuta sau imagini de culoare alb intensa. Imagini oferite prin amabilitatea Clinicii Neolife Bucuresti.

Discutii

In toate cazurile din studiu s-a evidentiat captarea crescuta a glucozei in tesuturile active metabolic: creier, cord, anse digestive (datorita miscarilor peristaltice)(figura IV.1-12) De asemenea,tumorile maligne primare si metastazele au fost detectate prin imagistica FDG PET-CT relevand rata metabolica crescuta a neoplaziilor comparativ cu tesuturile adiacente (figura IV1.-12). Au existat si numeroase limite in cazul pacientilor non-complianti la regulile anterioare efectuarii PET-CT. In cazul pacientilor cu DZ tip2 a fost evidentiata si o activitate metabolica crescuta la nivelul cadrului colic (figura IV.2), datorata tratamentului cu antidiabetice orale (Metformin) dar si artefactele in cazul pacientului diabetic cu glicemie crescuta >200mg/dl sau tratamentului cu insulina. (figura IV.1.C)

Imagistica 18F – FDG ( FDG ) PET reprezinta un instrument de diagnosticare neinvaziv care oferă imagini tomografice ce pot fi utilizate pentru obținerea de parametrii cantitativi referitori la activitatea metabolică ațesuturile țintă [474] . 18F este un radioizotop de fluor ( produs de ciclotron) care emite pozitroni și are un timp de înjumătățire scurt ( 109.7min ) , permitand etichetarea numeroaselor tesuturi captante ale acestuia. Putem considera astfel 18F drept un veritabil marcator molecular ce poate eticheta în câteva ore ( de obicei < 3 ore) diversele tesuturi captante [470-474]. FDG este un analog de glucoza ce poate fi captat de celule prin intermediul GLUT iar ulterior intracelular este fosforilat de catre hexokinaze formand un compus inactiv metabolic ce se acumuleaza. Aceasta acumulare este dependenta de intensitatea activitatii metabolice a tesutului respectiv.

Neoplasmele au o rată metabolică crescută a glucozei. Celula maligna metabolizează principala sursa de energie- glucoza la acid lactic pe calea glicolizei, chiar si in prezenta oxigenului (fenomenul Warburg), comutând astfel procesul de formare ATP din fosforilarea oxidativa (proces in care se formează 36 de molecule ATP) in glicoliza aeroba (proces in care se formează doar 2 molecule ATP). Celula neoplazica se caracterizează prin mai multe particularitati: creșterea captării intracelulare a glucozei; creșterea activității enzimelor din calea glicolitica-via acid lactic: hexokinaza1,4(HK 1-4), lactat dehidrogenaza-A (LDH-A) ce conduc la o rata crescuta a glicolizei cu creșterea producției de acid lactic dar cu scăderea activității enzmei piruvat dehidrogenaza-kinaza1 (PDK1-cu rol in transformarea ireversibila a piruvatului in Acetil-CoA pentru procesul de fosforilare oxidativa-via Ciclul Krebs); supraexpresia receptorilor de glucoza (GLUT) in special GLUT-1 si GLUT-3 [95,475-477].

Celulele captează FDG care este fosforilat intracelular la FDG-6 fosfat, compus ce nu mai poate fi metabolizat pe calea glicolitica in continuare si care se acumulează la nivel celular si este evidențiat imagistic datorita izotopului radioactiv Fluor 18 [4].(vezi figura IV.11) [471].

Fig IV.11Principiul metodei FDG[Adpatata dupa Use of PET/CT scanning in cancer patients: technical and practical considerationLANDIS K. GRIFFETH, MD, PHDBUMC PROCEEDINGS 2005;18:321–330]

Indicatiile actuale ale PET-CT in patologia oncologica includ: 1.diferentierea intre caracterul malign si benign; 2. Evidentierea tumorii primare in boala metastatica se descopera ca si prima manifesare sau prezenta sindromului paraneoplazic;3 Stadiliazare cancerului; 4.Monitorizare efectelor tratamentului oncologic;5.Detectarea recurentei tumorale in prezenta unor markeri tumorali crescuti.6. Selectia zonei tumorale pentru biposie cu rol essential pentru diagnostic [470-474].

Pacientilor le este interzis sa se alimenteze cu minim 4 ore (ideal 8h) înaintea examinării (orice fel de lichid sau aliment cu exceptia apei), iar cu o zi inainte este indicat ca pacientii sa se alimenteze cu mese sarace in hidrati de carbon si sa nu consume alcool, pentru a nu altera sensibilitatea examinării datorită unui nivel ridicat al glicemiei. Este necesara o hidratare adecvata, aproximativ 1 litru de apa cu 2h inainte de examinare atat pentru scaderea concentratiei FDG in urina si scaderea frecventei artefactelor cat si din motive ce tin de radioactivitatea FDG. Medicatia de fond se poate administra mai putin aceea ce are in compozitie glucoza sau derivati ai acesteia. Administrare iv de solutii ce contin glucoza se intrerup cu minim 4 h inainte de investigatie.Se evita exercitiile fizice cu minim 6 h ideal cu 24h inainte de procedura (vezi figura IV.1A )[470].

Dupa administrarea iv a FDG pacientul trebuie sa ramana,in repaus fizic pentru 30-60min, intr-o incaperea incalzita pentru a minimaliza acumularea FDG in tesutul adipos brun, fara sa efectueaze miscari pentru a reduce captarea glucozei in muschi (figura IV.1.D).Ulterior pacientul este intins pe masa de PET-CT pentru o durata de aproximativ 20-45min pentru analiza efectiva a distributiei trasorului radioactiv FDG. O investigatie PET-CT dureaza in medie 2-3h din care scanarea dureaza efectiv 30-40min.Produsul 18F-fluoro-2-deoxyglucose (FDG) are la baza radionuclidul Fluorina-18 (18F) si se injecteaza intravenos intr-o doza dependenta de tipul de aparat PET-CT, greutatea pacientului si durata de expunere in conformitatea cu Farmacopeea europeana [470,474].

In cazul pacientilor diabetici cu indicatie de PET-CT se impun cateva reguli privitoare la echilibru metabolic si la farmacocinetica tratamentului antidiabetic. Anterior administrarii FDG se va testa glicemia (preferabil printr-o metoda validata, fie cu ajutorul glucometrului). O glicemie <70mg/dl sau >200mg/dl va amana efectuarea PET-CT (vezi figura) datorita potentialelor artefacte induse de prezenta hiperglicemiei (vezi figura IV.1C). Glicemia a jeun ideala fiind sub <120mg/dl [470].

Privitor la tratamentul hipoglicemiant insulinic anterior efectuarii PET-CT se impun cateva precizari. Administrarea de insulina nu este indicata la mai putin de 4h anterior de efectuarea PET-CT datorita captarii musculare crescute a FDG (vezi figura ). Calea de administrarea trebuie sa fie de preferat subcutanata. Raportat la tipul insulinei se prefera cele cu actiune ultrarapida (analogilor de insulina cu actiune scurta) cu o durata de actiune de 4h [470]. Nu se indica insulinele cu durata de actiune de peste 4h cum sunt insulinele umane rapide (Actrapid, Insuman Rapid, Humulin R) insulinele NPH sau premixate, sau insulinele cu actiune lunga (analogii bazali de insulina de tipul glargine sau detemir). La pacientii cu DZ1 se impune respectarea intervalului farmacocinetic al insulinelor respective pentru evitarea artefactelor [470].

Privitor la medicatia orala antidiabetica, aceasta se poate adiministra anterior PET-CT pentru controlul glicemiei cu exceptia Metforminului. Pentru evitarea artefactelor administrarea acestuia se opreste inaintea efectuarii PET-CT cat si pentru o perioada de 48h dupa efecturea investigatiei (vezi figura ). Metforminul sau dimetilbiguanida, este cel mai utilizat medicament hipoglicemiant creste absortia la nivelul colonului de FDG prin mai multe mecanisme moleculare teoretice ce pot explica aparitia acestor artefacte. Studiile efectuate pe modele animale au evidentiat cresterea transferului de glucoza din compartimentul vascular in compartimentul celular al mucoasei intestinale si cresterea productiei de lactat. Cresterea transferului de glucoza are la baza cresterea expresiei GLUT2 de la nivelul suprafetei apicale a coloncitelor prin activarea AMPK, crescand in acest mod utilizarea glucozei de cate colon [478-480]. Alte mecanisme implicate includ: activitatea musculaturii netede de la nivel intestinal, mucoasa active metabolic, cresterea captarii de glucoza de catre microbii colonici. Cresterea absortiei la nivelul colonului drept comparativ cu cel stang are drept cauza, dispunerea limfocitelor avide de glucoza mai abundenta la nivelul colonului drept [478-480] Exista si alte cauze de absortie crescuta: afectiunile inflamatorii (eneterocolite, diverticulite), polipii colonici hiperplastici si hemoroizii anorectali [478,490]. Observatia din studiul nostru este sustinuta si de numeroase studii din literatura de specialitate [478-480].

Desi imagistica PET nu este utilizata de rutina [ pentru diagnosticarea cancerului de colorectal (datorita specificitatii limitate dimensiunea tumorii de >10mm ) , ea devine foarte utilă insa în identificarea unei leziuni primare în colon, la un pacient cu carcinom metastazat, cu punct de plecare necunoscut [481].

Rolul major al FDG PET-CT în cancerul colorectal este în restadializare, identificând extensia metastatică a bolii preoperator fiind mai sensibil comparativ cu examinarea CT sau RMN [482,483].

De asemenea, in cazul pacientilor cu cresterea markerilor tumorali (CEA) si imagistica conventionala negativa sau echivoca, FDG-PET-CT prezinta o sensbilitatea si specificitate crescuta de peste 90% si respectiv 80% , putand considera FDG-PET-CT ca o metoda imagistica de electie in conditiile cresterii CEA [484-486]..

PET-CT este util in dectarea metastazelor iar pacientii cu cancer colorectal prezinta si metastaze pulmonare ce pot fi detectate cu o acuratete mare prin aceasta tehnica, insa cu limite de detectie de <9 mm [487]

Raport la riscul de iradiere, pacientii ce efectueaza PET-CT sunt expusi la o cantitate moderat-crescuta de radiatii.Comparativ diferitele doze medii de radiatii pentru un adult de greutate si inaltime medie sunt redate in tabelul de mai jos conform Consumer Reports Magasine 2015 [488]:

*Radonul ( cu simbolul chimic Rn-222) „este elementul cu numărul de ordine 86 din tabelul periodic făcând parte din grupa a VIII-a, deci este un gaz inert care o dată format prin dezintegrarea elementelor grele din crusta terestră difuzează în gazele din sol sau din apă și apoi este transportat în atmosferă”[ ] El prezinta 3 izotopi naturali principali cu puncte de injumatatire diferite: „Rn-222 (radonul) își are originea în seria U-238 și are un timp de înjumătățire de 3,82 zile; Rn-220 (thoronul) se produce în seria de dezintegrare a Th-232 având timpul de înjumătățire de 55,6 secunde, iar Rn-219 (actinonul) aparține seriei radioactive a actiniului (U-235)” avand efecte neglijabile datorita concentratiei naturale scazute de numari 0.73% si un timp de injumtatire foarte scurt de numai 4 secunde[489]

Tabel .Adaptat dupa [490].

Concluzii

Imagistica prin metoda FDG PET-CT are la baza o particularitate esentiala a celulei neoplazice tradusa prin cresterea metabolismului glucozei la nivel tumoral. Aceasta investigatie este utila in diagnosticarea precoce a tumorilor maligne, stadializarea, restadializarea dar si in evaluarea raspunsului la tratamentul oncologic.

In ADC colorectal investigatia PET-CT este deosebit de utila in mod special in procesul de restadializare dar si in identificarea tumorilor primare asociate cu cresterea CEA sau asociate prezentei metastazelor. Metoda prezinta insa si anumite limite legate de conditiile de efectuare (statusul postprandial al pacientului, efectuarea oricarui tip de efort fizic sau expunerea la o temperatura scazuta anterior efectuarii investigatiei) putand genera rezultate fals negative prin fixarea FDG la nivelul musculaturii striate, sau eventualele inflamatii asociate datorita metabolismului local crescut putand conduce la rezultate fals pozitive.Fanti S, Franchi R, Batista G, Monetti N, Canini R. PET and PET-CT. State of the art and future prospects. Radiol Med 2005;110:1-15

Prezenta DZ impune o serie de limite in efectuarea investigatiei PET, limite ce sunt legate atat de valoarea glicemiei cat si de elemente ce tin de farmacocinetica terapiei antidiabetice (Metformin sau insulina). Un DZ echilibrat (glicemie 70-200 mg/dl, ideal 70-120mg/dl) nu influenteaza diagnosticul de ADC colorectal in imagistica PET-CT. Prezenta unui DZ dezechilibrat insa, cu o valoare a glicemiei de >200mg/dl, poate induce o fixare difuza a glucozei la nivelul tuturor tesuturilor si poate interefera astfel cu fenomenul de fixare a glucozei de la nivel tumoral. O particularitate restrictiva importanta, a pacientului diabetic cu ADC colorectal ce urmeaza a efectua FDG-PET-CT, ar fi tratamentul cu Metformin, care daca nu este intrerupt la timp poate creea artefacte la nivelul cadrului colic. Tratamentul cu insulina care nu respecta intervalul farmacocinetic de actiune specific va interfera si va produce artefacte difuze in mod special in tesuturile tinta ale actiunii insulinelor. Toate aceste particularitiati pot limita specificitatea si sensibilitatea FDG-PET-CT in DZ, prin interferenta cu principiul metodei FDG . In acest mod se poate reduce posibilitatea vizualizarii tumorii primare in stadii incipiente dar si a metastazelor asociate sau nu tumorii primare. Astfel, investigatia PET-CT necesita o pregatire si o rigoare crescuta din partea pacientilor diabetici, atat din punct de vedere al controlului glicemic (printr-un control glicemic adecvat) cat si al tratamentului cu insulina (administrarea de insuline cu durata de actiune ultrascurta de tipul analogilor cu durata scurta de actiune: glulizina, lispro si aspart) si al administrarii Metforminului (in sensul opririi administrarii cu 48h anterior efectuarii FDG-PET-CT dar si 48h post investigatie)

Deși utilizarea imagisticii PET-CT mărește costurile terapiei oncologice, aceasta investigatie oferă avantaje semnificative în tratamentul ADC colorectal prin rolul multinivelar in managementul acestei forme de neoplazie si include: selecția pacientilor pentru intervenția chirurgicală, decizia inițierii terapiei (CH, RT), localizarea recurențelor la pacienții ADC colorectal cu o creștere inexplicabilă a CEA dar si prin evaluarea si monitorizarea răspunsului post-tratament oncologic. Bibliografie:

Concluzii finale-variante

a.Concluzii (pe studii)

1.In cadrul studiului „ PREVALENTA DIVERSELOR TIPURI DE CANCER LA PACIENTII DIABETICI INTERNATI IN IDNBM N.C. PAULESCU

comparativ cu celelalte tipuri de cancer studiate, pacientii diabetici cu cancer colorectal au prezentat:

-o prevalenta crescuta (15.10%), fiind a doua forma de neoplazie prezenta in studiul nostru, dupa cancerul de san (21%) dar anterior de cancerul de pancreas (12.42%), prevalenta usor mai crescuta comparativ cu cea din populatia generala a Romaniei (13.5%).

– comparativ cu alte tipuri de cancer din populatia diabetica studiata, cancerul colorectal a prezentat o predominanta a sexului masculin (66.7% din cazuri) si a asociat varsta cea mai inaintata (72.6 ani).

– o asociere puternica cu DZ, in 95.6% din cazuri fiind asociat cu DZ tip2 cu control slab (HbA1c=9.1%)

– o asociere importanta cu excesul ponderal, pacientii diabetici ce asociaza cancer colorectal in antecedente prezentand suprapondere sau obezitate in 63.3% din cazuri, avand un IMC mediu de 33.3kg/m2.

-comparativ cu alte forme de neoplazie maligna la diabetici, CCR nu s-a asociat cu o anumita complicatie a DZ sau cu vreun anumit tip de tratament ADO.

In cadrul studiului “PREVALENTA DIABETULUI ZAHARAT LA PACIENTII CU DIVERSE TIPURI DE CANCER NOU DIAGNOSTICATE IN SPITALUL CLINIC DE URGENTA BUCURESTI”

pacientii cu cancer colorectal nou diagnosticat au asociat (prezentat):

-o prevalenta moderat crescuta a DZ, prevalenta DZ pentru anumite tipuri de cancer fiind in urmatoarea ordine: cancerul pancreatic (22.4%) >cancerul de vezica biliara (22.2%) >cancerul endometrial 17.7% >cancerul de san (17.3%) > cancerul gastric (12.5% > cancerul colorectal (11.9%)>cancerul anal(9.8%)> cancerul cutanat>(9.1%)>cancerul hepatic (7.6%)>cancerul de ovar (5.3%)> cancerul col uterin(4.8%)>cancerul de esofag>(1.8%).

-analiza in functie de subtipul de cancer colorectal a evidentiat existenta unei relatii asociative intre prezenta DZ si localizarea anatomica a tumorii , cu un trend descendent de la proximal la distal astfel, asocierea cea mai crescuta a DZ fiind pentru neoplaziile de colon (13%)>neoplaziile rectosigmoidiene(12%)>cancerul de rect (9.3%).

-pacientii ce au asociat CCR si DZ au prezentat varsta medie cea mai inaintata, cu o varsta medie similara in toate cele trei subtipuri de CCR (aproximativ 69 ani) dar cu o diferenta medie de varsta de 3 ani comparativ cu non-diabeticii ( aproximativ 66 ani).

-sexul masculin a predominat in toate cele 3 subtipuri de cancer colorectal [(in cancerul de colon in 56.1% din cazuri comparativ cu 43.9% din cazuri asociate sexului feminin) , in cel rectosigmoidian (58.8% vs 41.2%) si in cel rectal (55.2% vs 44.8%) ], atat in grupul diabetic cat si in cel non-diabetic insa cu o predominanta a sexului feminin in grupul de varsta >65 ani in ambele loturi diabetic (76.8% vs 70.7%) si non diabetic (63.1% vs 61.5%).

“STUDIUL CLINIC, MORFOTIPIC SI IMUNOFENOTIPIC AL PROTEINELOR BCL2 SI P53 IN ADENOCARCINOAMELE COLORECTALE LA PACIENTII CU DZ TIP2 VS NON-DIABETICI” este primul studiu pe subiecti umani care investigheaza expresia imunohistochimica a proteinelor Bcl2 si p53 in cancerul colorectal, avand si o particularitate tehnica, respective detectia IHC duala a expresiei proteinelor Bcl2 si p53. In cadrul studiului, evaluarea comparativa a lotului diabetic vs non diabetic, a condus in cazul pacientilor diabetici la urmatoarele rezultate:

– o frecventa mai crescuta a tumorilor la nivelul colonului ( 65.4% vs 51.2%);

– un grad de extensie tumorala crescut (T) la nivelul peretelui intestinal (pT4 26.9% vs 23.3%)

-o extensie crescuta a IVL (59.6% vs 48.8%);

– o frecventa crescuta a metastazelor (28.8% vs 23.3%);

-o frecventa crescuta a stadiului III tumoral (40.4% vs 32.6%)

– prezenta mai frecventa a unui RIP de tip cronic (65.4% vs 62.8%);

– o frecventa crescuta a extensiei limfoganglionare (N) (61.5% vs 48.8%)

– o durata mai crescuta a spitalizarii post-operatorii cu o medie de 18.7 zile (vs 10.1 zile);

– o frecventa crescuta a comorbiditatilor (obezitate, dislipidemie, BCI, si HTA);

– un tablou clinic modificat la internare prin aparitia mai frecventa a melenei sau rectoragiilor (29% vs 18%);

– o evolutie postoperatorie nefavorabila sau lent favorabila (37% vs 12%) cu aparitia mai frecventa a complicatiilor postoperatorii (31% vs 14%) si a 5 decese.

– expresia crescuta a proteinei p53 de clasa 2 (46.2% vs 34.9%)

– o expresie mai scazuta a Bcl2 (9.6% vs 16.3%)

– o frecventa mai crescuta a coexpresiei Bcl2/p53 (11.5%vs 7%)

– si o asociere mai frecventa cu imunofenotipul de clasa 3 (42.3% vs 32.6%).

– prezinta mai frecvent adenocarcinoame colorectale cu grad scazut de diferentiere (G1+G2) (78.8% vs 58.8%) (p=0.043).

-valori asemanatoare ale invaziei perineurale si ale raspunsului limfocitar intratumoral cu lotul non-diabetic.

Analiza de subgrup in lotul diabetic, a parametrilor clinic-morfo-imunofenotipici, functie de prezenta sau absenta obezitatii nu a identificat diferente semnificative intre lotul diabetic obez, diabetic non-obez si non-diabetic cu exceptia expresiei proteinei p53 de clasa 2 mult mai frecventa in lotul diabetic obez. Proteina p53 de clasa 2 a prezentat o expresie mult crescuta in lotul de pacienti diabetici-obezi (80%), comparativ cu diabeticii non-obezi (41%) sau non-diabeticii (37%) cu semnificatie statistica (p=0.024).

Analiza de subgrup in lotul diabetic, functie de tipul de tratament hipoglicemiant a parametrilor clinico-morfo-imunofenotipici nu a evidentiat asocieri semnificative statistic intre lotul tratat cu insulina sau cu ADO.

Evaluarea comparativa a parametrilor clinico-morfotipici in functie de clasa IHC si expresia p53 in diabet vs non-diabet nu a evidentiat asocieri relevante statistice.

Analiza pe sexe a parametrilor clinic-morfo-imunofenotipici nu a identificat asocieri semnficative statistic cu exceptia extensiei tumorale si extensiei ganglionare. Barbatii au asociat stadii mai avansate ale extensiei tumorii primare (T) prezentand in exclusivitate stadiul T2 (100%), insa cu absenta stadiului T1 (0%), (p=0.029) iar femeile au asociat mai frecvent extensie ganglionara (N1) (75% vs 46%, p=0.009), ambele asocieri avand semnificatie statistica.

In cadrul studiului “EVALUAREA PARTICULARITATILOR METABOLSIMULUI GLUCOZEI IN ADENOCARCINOMUL COLORECTAL LA PACIENTII CU DZ TIP 2 VS NON-DIABETICI PRIN METODA FDG-PET-CT” a condus la urmatoarele concluzii:

– in toate cazurile analizate s-a vizualizat absortia crescuta a glucozei in mod fiziologic in organele active metabolic (creier, rinichi, cord) dar si particular in mod pathologic in procesele neoplazice ce se caracterizeaza prin prin cresterea metabolismului (captarii) glucozei la nivel tumoral.

– investigatia este deosebit de utila in diagnosticarea precoce a tumorilor maligne, stadializarea, restadializarea dar si in evaluarea raspunsului la tratamentul oncologic iar in mod special in CRC este deosebit de utila in procesul de restadializare al CRC prin identficare cu usurinta a metastazelor si stadializarea corecta post-tratament oncologic.

– metoda prezinta insa si anumite limite legate de conditiile de efectuare (statusul postprandial al pacientului, efectuarea oricarui tip de efort fizic sau expunerea la o temperatura scazuta anterior efectuarii investigatiei) putand genera rezultate fals negative prin fixarea FDG la nivelul musculaturii striate.

-prezenta DZ impune o serie de limite in efectuarea investigatiei PET, limite ce sunt legate atat de valoarea glicemiei, o valoare a glicemiei de >200mg/dl, poate induce o fixare difuza a glucozei la nivelul tuturor tesuturilor si poate interfera astfel cu fenomenul de fixare a glucozei de la nivel tumoral, cat si de elemente ce tin de farmacocinetica terapiei antidiabetice (Metformin sau insulina) tratamentul cu Metformin, care daca nu este intrerupt la timp poate creea artefacte la nivelul cadrului colic.

– tratamentul cu insulina care nu respecta intervalul farmacocinetic de actiune specific va interfera si va produce artefacte difuze in mod special in tesuturile tinta ale actiunii insulinelor.

– DZ echilibrat (glicemie 70-200 mg/dl, ideal 70-120mg/dl), cu respectarea restrictiilor impuse de terapia hipoglicemianta, nu influenteaza acuratetea diagnosticului de ADC colorectal in imagistica PET-CT.

b.CONCLUZII (REZUMAT)

Cancerul colorectal este a doua cea mai frecventa forma de neoplazie maligna in populatia diabetica studiata, avand o prevalenta de 15.10%, dupa cancerul de san (21%) dar anterior cancerului de pancreas(12.42%) (cancerul de san>cancerul colorectal>cancerul pancreatic), avand prevalente fiind comparabile cu cele din populatia generala pentru cancerul de san (18.7%)si pentru cancerul colorectal (13.5%) nu insa si pentru cancerul de pancreas (0.9%).

Comparativ cu pacientii non-diabetici, pacientii diabetici cu CRC prezinta o varsta mai inaintata (69ani vs 66 ani), se asociaza frecvent cu DZ tip2 (95.6%) cu control slab (HbA1c=9.1%) dar si cu exces ponderal (IMC mediu =33.3kg/m2) in 63.3% din cazuri, si afecteaza mai frecvent regiunea colonului (13%) comparativ cu regiunea rectosigmoidiana (12%) sau rectala (9.3%).

Cancerul colorectal prezinta o prevalenta a DZ asemanatoare cu cea din populatia generala a Romaniei (11.9% vs 11.6%) (conform studiului Predatorr), prevalenta DZ pentru anumite tipuri de cancer fiind in urmatoarea ordine: cancerul pancreatic (22.4%) >cancerul de vezica biliara (22.2%) >cancerul endometrial 17.7% >cancerul de san (17.3%) > cancerul gastric (12.5% > cancerul colorectal (11.9%)>cancerul anal(9.8%)> cancerul cutanat>(9.1%)>cancerul hepatic (7.6%)>cancerul de ovar (5.3%)> cancerul col uterin(4.8%)>cancerul de esofag>(1.8%).

Analiza imunohistochimica duala a proteinelor Bcl2 si p53 a evidentiat in randul pacientilor ce prezinta DZ tip2 si obezitate in momentul diagnosticului adenocarcinomului colorectal, o expresie crescuta, anormala a proteinei supresoare tumorale p53 (in >70% din celulele tumorale de intensitate inalta si moderata) in 80% din cazuri, comparativ cu pacientii diabeticii ce nu prezinta obezitate, ce exprima proteina p53 in 41% din cazuri sau cu pacientii ce nu prezinta diabet sau obezitate, grup ce exprima proteina in doar 37% din cazuri, aceasta asociere fiind semnificativa statistic (p=0.024). Pacientii diabetici asociaza mai frecvent si imunofenotipul de clasa 3 (Bcl2-/p53+) in 43.3% din cazuri comparative cu 32.6% din cazuri la non-diabetici, prezenta Bcl2/p53 in coexpresie in 11.5% din cazuri comparative 7% din cazuri si o expresie mai scazuta a Bcl2 (9.6% vs 16.3%).

Pacientii cu DZ tip 2 prezinta mai frecvent adenocarcinoame colorectale cu grad scazut de diferentiere (de grad 1-G1 si grad 2-G2) in 78.8% din cazuri comparativ cu 58.8% din cazuri la pacientii ce nu asociaza diabet, aceasta asociere fiind semnificativa statistic (p=0.043).trat cu Metformin…

In cadrul investigatiei de imagistica nucleara PET-CT, prezenta DZ tip2 la pacientii cu ADC colorectal nu influenteaza acuratetea diagnosticului, cu conditia ca DZ sa fie echilibrat, cu un control glicemic adecvat cu o (glicemie 70-200 mg/dl, ideal 70-120mg/dl), si cu respectarea restrictiilor impuse de farmacocinetica terapiei hipoglicemiante (intreruperea Metforminului cu 48h inaintea investigatiei datorat potentialului de a creea artefacte la nivelul cadrului colic si respectarea intervalului farmacocinetic de actiune specific al insulinelor pentru a nu interfera produce artefacte difuze in mod special in tesuturile tinta ale actiunii insulinelor)

c.Concluzii (functie de obiective)

DIN PUNCT DE VEDERE EPIDEMIOLOGIC (studiul 1 si 2)

Cancerul colorectal este a doua cea mai frecventa forma de neoplazie maligna in populatia diabetica studiata, avand o prevalenta de 15.10%, dupa cancerul de san (21%) dar anterior cancerului de pancreas(12.42%) (cancerul de san>cancerul colorectal>cancerul pancreatic), ambele prevalente fiind comparabile cu cele din populatia generala pentru cancerul de san (18.7%)si pentru cancerul colorectal (13.5%) nu insa si pentru cancerul de pancreas (0.9%).

Cancerul colorectal prezinta o prevalenta a DZ asemanatoare cu prevalenta DZ in populatia generala a Romaniei (11.9% vs 11.6%) (conform studiului Predatorr), prevalenta DZ pentru anumite tipuri de cancer fiind in urmatoarea ordine: cancerul pancreatic (22.4%) >cancerul de vezica biliara (22.2%) >cancerul endometrial 17.7% >cancerul de san (17.3%) > cancerul gastric (12.5% > cancerul colorectal (11.9%)>cancerul anal(9.8%)> cancerul cutanat>(9.1%)>cancerul hepatic (7.6%)>cancerul de ovar (5.3%)> cancerul col uterin(4.8%)>cancerul de esofag>(1.8%).

Pacientii cu adenocarcinom colorectal ce asociaza DZ tip2 comparativ cu cei ce nu asociaza DZ tip2, prezinta:

DIN PUNCT DE VEDERE CLINIC (studiul 3):

o frecventa mai crescuta a tumorilor la nivelul colonului ( 65.4% vs 51.2%);

un grad de extensie tumorala crescut (T) la nivelul peretelui intestinal (pT4 26.9% vs 23.3%)

o frecventa crescuta a extensiei limfoganglionare (N) (61.5% vs 48.8%)

o frecventa crescuta a metastazelor (28.8% vs 23.3%);

o frecventa crescuta a stadiului III tumoral (40.4% vs 32.6%)

o durata mai crescuta a spitalizarii post-operatorii cu o medie de 18.7 zile (vs 10.1 zile);

o frecventa crescuta a comorbiditatilor (obezitate, dislipidemie, BCI, si HTA);

un tablou clinic modificat la internare prin aparitia mai frecventa a melenei sau rectoragiilor (29% vs 18%);

o evolutie postoperatorie nefavorabila sau lent favorabila (37% vs 12%) cu aparitia mai frecventa a complicatiilor postoperatorii (31% vs 14%) si a 5 decese.

analiza lotului diabetic functie de tipul de tratament (insulina sau ADO) sau de prezenta obezitatii nu a evidentiat diferente semnificative intre cele doua loturi raportat la parametrii clinici (T,N.M, stadializare).

DIN PUNCT DE VEDERE MORFOTIPIC (studiul 3)

prezinta mai frecvent adenocarcinoame colorectale cu grad scazut de diferentiere (de grad 1-G1 si grad 2-G2) in 78.8% din cazuri comparativ cu 58.8% din cazuri la pacientii ce nu asociaza diabet, aceasta asociere fiind semnificativa statistic (p=0.043).

o extensie crescuta a IVL (59.6% vs 48.8%);

prezenta mai frecventa a unui RIP de tip cronic (65.4% vs 62.8%);

valori asemanatoare ale invaziei perineurale si ale raspunsului limfocitar intratumoral cu lotul non-diabetic.

analiza lotului diabetic functie de tipul de tratament (insulina sau ADO) sau de prezenta obezitatii nu a evidentiat diferente semnificative intre cele doua loturi raportat la parametrii morfotipici (IVL,IPN,RLI,RIP,grading histologic).

DIN PUNCT DE VEDERE IMUNOFENOTIPIC

Analiza imunohistochimica duala a proteinelor Bcl2 si p53 a evidentiat in randul pacientilor ce prezinta DZ tip2 si obezitate in momentul diagnosticului adenocarcinomului colorectal, o expresie crescuta, anormala a proteinei supresoare tumorale p53 (in >70% din celulele tumorale de intensitate inalta si moderata) in 80% din cazuri, comparativ cu pacientii diabeticii ce nu prezinta obezitate, ce exprima proteina p53 in 41% din cazuri sau cu pacientii ce nu prezinta diabet sau obezitate, grup ce exprima proteina in doar 37% din cazuri, aceasta asociere fiind semnificativa statistic (p=0.024).

o expresie mai scazuta a Bcl2 (9.6% vs 16.3%)

o frecventa mai crescuta a coexpresiei Bcl2/p53 (11.5%vs 7%)

o asociere mai frecventa cu imunofenotipul de clasa 3 Bcl2-/p53 + (42.3% vs 32.6%)

evaluarea comparativa a parametrilor clinico-morfotipici in functie de clasa IHC si expresia p53 in diabet vs non-diabet nu a evidentiat asocieri relevante statistice.

analiza lotului diabetic functie de tipul de tratament (insulina sau ADO) sau de prezenta obezitatii nu a evidentiat diferente semnificative intre cele doua loturi raportat la parametrii imunofenotipici (expresie p53,Bcl2,coexpresie Bcl2/p53, clasa imunofenotipica).

DIN PUNCT DE VEDERE IMAGISTIC MOLECULAR (studiul4)

in toate cazurile analizate, s-a vizualizat absortia crescuta a glucozei in mod fiziologic in organele active metabolic (creier, rinichi, cord) dar si particular in mod patologic in procesele neoplazice ce se caracterizeaza prin prin cresterea metabolismului (captarii) glucozei la nivel tumoral.

investigatia este deosebit de utila in diagnosticarea precoce a tumorilor maligne, stadializarea, restadializarea dar si in evaluarea raspunsului la tratamentul oncologic iar in mod special in adenocarcinomul colorectal este deosebit de utila in procesul de restadializare al CRC prin identificarea cu usurinta a metastazelor si stadializarea corecta post-tratament oncologic.

prezenta unui DZ dezechilibrat impune o serie de limite in efectuarea investigatiei PET, limite ce sunt legate atat de valoarea glicemiei (o valoare a glicemiei de >200mg/dl, putand induce o fixare difuza a glucozei la nivelul tuturor tesuturilor si poate interefera astfel cu fenomenul de fixare a glucozei de la nivel tumoral), cat si de elemente ce tin de farmacocinetica terapiei antidiabetice (Metformin sau insulina), cum este exemplul tratamentului cu Metformin, care daca nu este intrerupt la timp poate creea artefacte la nivelul cadrului colic sau tratamentul cu insulina care daca nu respecta intervalul farmacocinetic de actiune specific, va interfera si va produce artefacte difuze in mod special in tesuturile tinta ale actiunii insulinelor.

BIBLIOGRAFIE TEZA

1.Hanahan D, Weinberg RA.Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011 Mar 4;144(5):646-74. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.013.

2.Hanahan D, Weinberg RA.Hallmarks of cancer:Cell. 2000 Jan 7;100(1):57-70.

3.Organ, Shawna Leslie, Ming-Sound Tsao. "An overview of the c-MET signaling pathway." Therapeutic advances in medical oncology 3.1 suppl (2011): S7-S19.

4.Davar D, Beumer JH, Hamieh L, Tawbi H. Role of PARP inhibitors in cancer biology and therapyCurr Med Chem. 2012;19(23):3907-21.

5.Luca Livraghi , Judy E. Garber PARP inhibitors in the management of breast cancer: current data and future prospectsBMC Medicine2015.13:188DOI: 10.1186/s12916-015-0425-1

6.Iannone R, Miele L, Maiolino P, Pinto A, Morello SAdenosine limits the therapeutic effectiveness of anti-CTLA4 mAb in a mouse melanoma model. Am J Cancer Res. 2014 Mar 1;4(2):172-81. eCollection 2014.

7.Joseph F. Grosso and Maria N. Jure-Kunkel.CTLA-4 blockade in tumor models: an overview of preclinical and translational research.Cancer Immunity .2013. Vol. 13, p. 5

8.Billard C. BH3 mimetics: status of the field and new developments.Mol Cancer Ther. 2013 Sep;12(9):1691-700. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-13-0058. Epub 2013 Aug 23.

9. Sitohy B, Nagy JA, Dvorak HF. Anti-VEGF/VEGFR therapy for cancer: reassessing the target. Cancer Res. 2012 Apr 15;72(8):1909-14. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-3406.

10. Dienstmann R, Salazar R, Tabernero J. Overcoming Resistance to Anti-EGFR Therapy in Colorectal Cancer. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2015:e149-56. doi: 10.14694/EdBook_AM.2015.35.e149.

11.Burchett KM, Yan Y, Ouellette MM (2014) Telomerase Inhibitor Imetelstat (GRN163L) Limits the Lifespan of Human Pancreatic Cancer Cells. PLoS ONE 9(1): e85155. doi:10.1371/journal.pone.0085155

12.Woo YM, Shin Y, Lee EJ, et al. Inhibition of Aerobic Glycolysis Represses Akt/mTOR/HIF-1? Axis and Restores Tamoxifen Sensitivity in Antiestrogen-Resistant Breast Cancer Cells. Tan M, ed. PLoS ONE. 2015;10(7):e0132285. doi:10.1371/journal.pone.0132285.

13.Carlotta Granchi, Daniele Fancelli, Filippo Minutolo An update on therapeutic opportunities offered by cancer glycolytic metabolism. Bioorganic & Medicinal Chemistry LettersVolume 24, Issue 21, 1 November 2014, Pages 4915–4925

14. Uzma Asghar, Agnieszka K. Witkiewicz, Nicholas C. Turner & Erik S. Knudsen.The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery14,130–146(2015)doi:10.1038/nrd4504

15. Akin S, Babacan T, Sarici F, Altundag K.A novel targeted therapy in breast cancer: cyclin dependent kinase inhibitors. J BUON. 2014 Jan-Mar;19(1):42-6.

16.C S D Roxburgh and D C McMillan.Cancer and systemic inflammation: treat the tumour and treat the host. British Journal of Cancer (2014) 110, 1409–1412. doi:10.1038/bjc.2014.90 www.bjcancer.com Published online 18 February 2014

17. Rayburn ER, Ezell SJ, Zhang R. Anti-Inflammatory Agents for Cancer Therapy.Molecular and cellular pharmacology. 2009;1(1):29-43. doi:10.4255/mcpharmacol.09.05.

18. Xintaropoulou C, Ward C, Wise A, Marston H, Turnbull A, Langdon SP

A comparative analysis of inhibitors of the glycolysis pathway in breast and ovarian cancer cell line models. Oncotarget. 2015 Sep 22;6(28):25677-95. doi: 10.18632/oncotarget.4499.

19. 1.Ionescu-Tîrgoviste Constantin, Matei Ioan Valentin, Ivanus Bogdan, Falcan Ana Maria. Contributions of evolutionary biology to the understanding of cancer proc. rom. acad., series b, 2012, 14(3), p. 183–190]

20. Nowell PC. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 1976, 194(4260): 23-8.

21. .Kirill S. Korolev, Joao B. Xavier, Jeff Gore Turning ecology and evolution against cancer. Nature Reviews Cancer 14, 371–380(2014)doi:10.1038/nrc3712

22. Duesberg P, Mandrioli D, McCormack A, Nicholson JM.Is carcinogenesis a form of speciation? Cell Cycle. 2011, 10(13): 2100-14.

23. Aranda-Anzaldo A. Cancer development and progression: a non-adaptive process driven by genetic drift. Acta Biotheor. 2001;49(2):89-108

24.Michael L. O’Connor, , Dongxi Xiang, Sarah Shigdar, Joanna Macdonald Yong Li, Tao Wang ,et al Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward Cancer Letters Volume 344, Issue 2, 28 March 2014, Pages 180–187

25.Rahman M, Deleyrolle L, Vedam-Mai V, Azari H, Abd-El-Barr M, Reynolds BA. The cancer stem cell hypothesis: failures and pitfalls. Neurosurgery. 2011 Feb;68(2):531-45; discussion 545. doi: 10.1227/NEU.0b013e3181ff9eb5.

26. Shi-Ming TuCancer: a “stem-cell” disease? Cancer Cell Int. 2013; 13: 40

27. Margaret A Knowles, Peter J Selby Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer. Oxfor University Press. Chpater 1.What is cancer? L M.Franks.M.Knowles.2005:1-24.

28. . K Laud, C Marian, M F Avril, M Barrois, A Chompret, A M Goldstein, M A Tucker, P A Clark, G Peters, V Chaudru, F Demenais, A Spatz, M W Smith, G M Lenoir, and B Bressac-de Paillerets, French Hereditary Melanoma Study Group Comprehensive analysis of CDKN2A (p16INK4A/p14ARF) and CDKN2B genes in 53 melanoma index cases considered to be at heightened risk of melanoma. J Med Genet. 2006 Jan; 43(1): 39–47.

29. Cancer Care Ontario. Cancer Risk Factors in Ontario: Evidence Summary. Toronto, Canada, 2013. Accesat la https://www.cancercare.on.ca/ in 23.11.2015.

30. U.S. Department of Health and Human Services. National Institutes of Health National Cancer Institute.National Cancer Institute.2013. Genetic Testing for Hereditary Cancer Syndromes.2013 Accesat la http://www.cancer.gov/about-cancer/causes-prevention/genetics/genetic-testing-fact-sheet in 25.11.2015

31. Simona Negrini, Vassilis G.Gorgouli, Thanos D. Halazoneti, Genomic instability an evolving hallmark of cancer. Nature Reviews. Molecular cell biology volume 11, 2010: 220-228.

32. Aaron D. Goldberg, David Allis, and Emily Bernstein Epigenetics: A Landscape Takes Shape. Cell 128, February 23, 2007 : 635-638

33. Sharma S, Kelly TK, Jones PA. Epigenetics in cancer. Carcinogenesis. 2010;31(1):27-36. doi:10.1093/carcin/bgp220

34. Robert A. Weinberg .The Biology of cancer.Second Edition.Chapter 2:The nature of cancer. Page 49. Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC.New York and London.USA,2014.

35.American Cancer Society 2015 Cancer staging. Accesat la http://www.cancer.org/treatment/understandingyourdiagnosis/staging in 12.10.2015

36. U.S. Department of Health and Human Services. National Institutes of Health National Cancer Institute.National Cancer Institute.2015. Cancer stanging. Accesat la http://www.cancer.gov/about-cancer/diagnosis-staging/staging/staging-fact-sheet in 12.10.2015

37.American Joint Comittee on Cancer.2015. What is Cancer Staging? Accesat la https://cancerstaging.org/references-tools/Pages/What-is-Cancer-Staging.aspx in 12.10.2015

38. U.S. Department of Health and Human Services. National Institutes of Health National Cancer Institute.National Cancer Institute. Tumor Grade. 2015http://www.cancer.gov/about-cancer/diagnosis-staging/prognosis/tumor-grade-fact-sheet

39. Young Ju Song, Sun Hyoung Shin, Jin Seong Cho, Min Ho Park et al The Role of Lymphovascular Invasion as a Prognostic Factor in Patients with Lymph Node-Positive Operable Invasive Breast Cancer. J Breast Cancer. 2011 Sep; 14(3): 198–203.

40. Sebastian F. Schoppmann, MD,† Guenther Bayer, MD,† Klaus Aumayr et al Prognostic Value of Lymphangiogenesis and Lymphovascular Invasion in Invasive Breast CancerAnn Surg. 2004 Aug; 240(2): 306–312.

41. Kim H, Kim M, Kwak C, Kim HH, Ku JH (2014) Prognostic Significance of Lymphovascular Invasion in Radical Cystectomy on Patients with Bladder Cancer: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS ONE 9(2): e89259.

42.Lim SB1, Yu CS, Jang SJ, Kim TW, Kim JH, Kim JCPrognostic significance of lymphovascular invasion in sporadic colorectal cancer. Dis Colon Rectum. 2010 Apr;53(4):377-84. doi: 10.1007/DCR.0b013e3181cf8ae5.

43.Akagi Y, Adachi Y, Ohchi T, Kinugasa T, Shirouzu K. Prognostic impact of lymphatic invasion of colorectal cancer: a single-center analysis of 1,616 patients over 24 yearsAnticancer Res. 2013 Jul;33(7):2965-70.

44. Shih-Ching Chang, Chun-Chi Lin, Huann-Sheng Wang, Shung-Haur YangLymphovascular invasion determines the outcome of stage I colorectal cancer patientsFormosan Journal of Surgery (2012) 45, 141e145

45. K Mitsuzuka, S Narita, T Koie, Y Kaiho, N Tsuchiya, T Yoneyama, N Kakoi, S Kawamura, T Tochigi, C Ohyama, T Habuchi and Y AraiLymphovascular invasion is significantly associated with biochemical relapse after radical prostatectomy even in patients with pT2N0 negative resection marginProstate Cancer and Prostatic Diseases 18, 25-30 (March 2015)

46. Cheng L1, Jones TD, Lin H, Eble JN, Zeng G, Carr MD, Koch MO. Lymphovascular invasion is an independent prognostic factor in prostatic adenocarcinoma. J Urol. 2005 Dec;174(6):2181-5.

47. Dilek Ertoy Baydar1,*, Barbaros Baseskioglu2 , Haluk Ozen2 , and Pinar Ozdemir GeyikPrognostic Significance of Lymphovascular Invasion in Clinically Localized Prostate Cancer after Radical ProstatectomyTheScientificWorldJOURNAL (2008) 8, 303–312

48. Puljiz M1, Puljiz Ž, Danolić D, Alvir I, Tomica D, Mamić I, Vučemilo T, Perić Balja M, Zorica R. Prognostic value of lymphovascular space invasion in endometrial cancer. Med Glas (Zenica). 2013 Aug;10(2):288-92.

49. Weinberg LE1, Kunos CA, Zanotti KM. Lymphovascular space invasion (LVSI) is an isolated poor prognostic factor for recurrence and survival among women with intermediate- to high-risk early-stage endometrioid endometrial cancer. Int J Gynecol Cancer. 2013 Oct;23(8):1438-45. doi: 10.1097/IGC.0b013e3182a16c93.

50. John W C Chen,1 Mayank Bhandari,1 David S Astill,2 Thomas G Wilson,1 Lilian Kow,1 Mark Brooke-Smith,1 James Toouli,1 and Robert T A Padbury1

51. Mollberg NM, Bennette C, Howell E, Backhus L, Devine B, Ferguson MK. Lymphovascular invasion as a prognostic indicator in stage I non-small cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis. Annals of Thoracic Surgery 2014; 97(3): 965-971

52. Huang Y, Huang H, Pan XW, Xu DF1, Cui XG2, Chen J, Hong Y, Gao Y, Yin L, Ye JQ, Li L. [Epub ahead of print]The prognostic value of lymphovascular invasion in radical prostatectomy: a systematic review and meta-analysis. Asian J Androl. 2015 Oct 13. doi: 10.4103/1008-682X.156636.

53. Predicting patient survival after pancreaticoduodenectomy for malignancy: histopathological criteria based on perineural infiltration and lymphovascular invasionHPB (Oxford). 2010 Mar; 12(2): 101–108.

54. Sha N, Xie L, Chen T, Xing C, Liu X, Zhang Y, Shen Z, Xu H, Wu Z, Hu H, Wu C Impact of lymphovascular invasion on recurrence and progression rates in patients with pT1 urothelial carcinoma of bladder after transurethral resection OncoTargetsand Therapy 2015:8:3401-3406

55.Catherine Liebig ; Gustavo Ayala, ; Jonathan A. Wilks ; David H. Berger ; and Daniel Albo. Perineural Invasion in Cancer. Cancer 2009;115:3379–91

56.Beard CJ, Chen MH, Cote K, et al. Perineural invasion is associated with increased relapse after external beam radiotherapy for men with low-risk prostate cancer and may be a marker for occult, high-grade cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2004;58:19-24.

57.Hirai I, Kimura W, Ozawa K, Kudo S, Suto K, Kuzu H, Fuse A. .Perineural invasion in pancreatic cancer. Pancreas. 2002 Jan;24(1):15-25

58. Ozaki H1, Hiraoka T, Mizumoto R, Matsuno S, Matsumoto Y, Nakayama T, Tsunoda T, Suzuki T, Monden M, Saitoh Y, Yamauchi H, Ogata Y. The prognostic significance of lymph node metastasis and intrapancreatic perineural invasion in pancreatic cancer after curative resection. Surg Today. 1999;29(1):16-22.

59.Perez RO1, Habr-Gama A, dos Santos RM, Proscurshim I, Campos FG, Rawet V, Kiss D, Cecconello I. Peritumoral inflammatory infiltrate is not a prognostic factor in distal rectal cancer following neoadjuvant chemoradiation therapyJ Gastrointest Surg. 2007 Nov;11(11):1534-40

60. Stelian Stefăniță Mogoantă, Corina Lungu, Cătălin Ilie si colab Peritumoral inflammatory reaction in colon cancer. Histological and immunohistochemical study. Rom J Morphol Embryol 2014, 55(4):1429–1435

61. Matthieu Camus,Marie Tosolini, Bernhard Mlecnik, Coordination of Intratumoral Immune Reaction and Human Colorectal Cancer Recurrence. Cancer Res 2009;69(6):2685–93]

62.Denkert C1, Loibl S, Noske A, Roller M, Müller BM, Komor M, Budczies J, Darb-Esfahani S, Kronenwett R, Hanusch C, von Törne C, Weichert W, Engels K,Solbach Tumor-associated lymphocytes as an independent predictor of response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. J Clin Oncol. 2010 Jan 1;28(1):105-13.

63.Tumor-infiltrating lymphocytes in breast cancer. : Yasmin Issa-Nummer, Sibylle Loibl, Gunter von Minckwitz & Carsten Denkert (2014) Tumor-infiltrating lymphocytes in breast cancer, OncoImmunology, 3:3, e27926, DOI: 10.4161/onci.27926

64.Menegaz RA1, Michelin MA, Etchebehere RM, Fernandes PC, Murta EF. Peri- and intratumoral T and B lymphocytic infiltration in breast cancer. Eur J Gynaecol Oncol. 2008;29(4):321-6.

65. George F. Weber. Molecular mechanism of Cancer: Chapter 5 The cell cycle. 2007 Springer .Page 104-120.

66. Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates; 2000. The Eukaryotic Cell Cycle. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9876/

67. Marisa R. Buchakjian & Sally Kornbluth. The engine driving the ship: metabolic steering of cell proliferation and death.Marisa R. Buchakjian & Sally Kornbluth.Nature Reviews Molecular Cell Biology 11, 715-727 (October 2010)

68. Funk, Jens Oliver. "Cell cycle checkpoint genes and cancer." eLS (2006).Accesat la [http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1038/npg.els.0006046/pdf] in 12.01.2016.

69.Kastan, Michael B., and Jiri Bartek. "Cell-cycle checkpoints and cancer."Nature 432.7015 (2004): 316-323.

70.Viorel Serban.Tratat roman de boli metabolice.Metabolismul intermediar si energetic al glucidelor, lipidelor si proteinelor 21-61 editura Burmar, 2011 Timisoara

71. Robert K. Murray, MD, PhD Daryl K. Granner, MD Peter A. Mayes, PhD, DSc Victor W. Rodwell. Harper’s Illustrated Biochemistry a LANGE medical book twenty-sixth edition. Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Publishing Division;2003 Section I1.. Bioenergetics & The Metabolism Of Carbohydrates; Peter A. Mayes, Kathleen M. Botham, Bioenergetics:The Role of ATP (80-91)

72. Robert Horton,Laurence A. Moran, K. Gray Scrimgeour,Marc D. Perry, J. David Rawn,Principles of Biochemistry Fourth Edition Pearson Prentice Hall;Pearson Education, Inc.Upper Saddle River, New Jersey 07458; 10 Introduction to Metabolism296-326: 305.

73. Miriam D. Rosenthal ,Robert H. Glew Medical Biochemistry.

Human Metabolism in Health and Disease. A JOHN WILEY & SONS, INC., PUBLICATION 2009.USA. INTRODUCTION TO METABOLISM 1:11; page 7

74. Wu W, Zhao S. Metabolic changes in cancer: beyond the Warburg effect. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2013 Jan;45(1):18-26. doi: 10.1093/abbs/gms104.

75.Harper’s Illustrated Biochemistry a LANGE medical book twenty-sixth edition Robert K. Murray, MD, PhD Daryl K. Granner, MD Peter A. Mayes, PhD, DSc Victor W. Rodwell, PhD Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Publishing Division;2003 Section I1. Bioenergetics & The Metabolism Of Carbohydrates& Lipids : Peter A. Mayes, PhD, DSc, & David A. Bender, 17 Glycolysis & the Oxidation of Pyruvate 136-144

76. Diaz-Ruiz R, Rigoulet M, Devin A. The Warburg and Crabtree effects: On the origin of cancer cell energy metabolism and of yeast glucose repression. Biochim Biophys Acta – Bioenerg. 2011;1807(6):568-576. doi:10.1016/j.bbabio.2010.08.010.

77.Koppenol WH, Bounds PL, Dang C V. Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 2011;11(5):325-337. doi:10.1038/nrc3038.

78. Upadhyay M, Samal J, Kandpal M, Singh OV, Vivekanandan P. The Warburg effect: Insights from the past decade. Pharmacol Ther. 2013;137(3):318-330. doi:10.1016/j.pharmthera.2012.11.003.

79. Goodwin ML, Gladden LB, Nijsten MWN, Jones KB. Lactate and Cancer: Revisiting the Warburg Effect in an Era of Lactate Shuttling. Front Nutr. 2015;1(January):2014-2016. doi:10.3389/fnut.2014.00027.

80. Hsu PP, Sabatini DM. Cancer Cell Metabolism: Warburg and Beyond. Cell. 2008;134(5):703-707. doi:10.1016/j.cell.2008.08.021.

81. Lu J, Tan M, Cai Q. The Warburg effect in tumor progression: Mitochondrial oxidative metabolism as an anti-metastasis mechanism. Cancer Lett. 2014;356(2):156-164. doi:10.1016/j.canlet.2014.04.001.

82. Otto Warburg,Franz Wind, and Erwin NegeleinJ „The metabolism of tumors in the body ”Gen Physiol 1927 8:519-530. Published March 7, 1927, doi:10.1085/jgp.8.6.519 Accesat la

http://jgp.rupress.org/content/8/6/519.full.pdf+html

83. Chi V. Dang Cancer's Molecular Sweet Tooth and the Warburg EffectCancer Res 2006; 66: (18). September 15, 2006

84. Gabriel D. Dakubo . Mitochondrial Genetics and Cancer. The Warburg Phenomenon and Other Metabolic Alterations of Cancer Cells 39-66.2010

85. Andrei G. Vlassenko, Jonathan McConathy, Lars E. Couture, Yi Su, Parinaz Massoumzadeh. Aerobic Glycolysis as a Marker of Tumor Aggressiveness: Preliminary Data in High Grade Human Brain Tumors. Disease Markers Volume 2015 (2015), Article ID 874904, 11 pages

http://dx.doi.org/10.1155/2015/874904

86. Sophia Y. Lunt1 and Matthew G. Vander Heiden Aerobic Glycolysis: Meeting the Metabolic Requirements of Cell Proliferation Annual Review of Cell and Developmental Biology Vol. 27: 441-464 (Volume publication date November 2011)

87. R A Gatenby, K Smallbone, P K Maini, F Rose, J Averill, R B Nagle, L Worrall and R J Gillies.Cellular adaptations to hypoxia and acidosis during somatic evolution of breast cancer. British Journal of Cancer (2007) 97, 646–653. doi:10.1038/sj.bjc.6603922 www.bjcancer.com

88.Gatenby RA1, Gillies RJ.Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nat Rev Cancer. 2004 Nov;4(11):891-9.Gatenby RA1, Gillies RJ.

89. Masur, K. Thévenod F. Zänker K.S (Witten) (eds): Diabetes and Cancer. Epidemiological Evidence and Molecular Links Front Diabetes. Basel, Karger, 2008, vol 19, pp 59-70 (DOI:10.1159/000152024) Role of Glucose Metabolism in Carcinogenesis and Cancer Progression.Gatenby R.

90. Gatenby RA, Gawlinski ET.The glycolytic phenotype in carcinogenesis and tumor invasion: insights through mathematical models. Cancer Res. 2003 Jul 15;63(14):3847-54.Gatenby RA1, Gawlinski ET.

91. Carvalho KC, Cunha IW, Rocha RM, et al. GLUT1 expression in malignant tumors and its use as an immunodiagnostic marker. Clinics. 2011;66(6):965-972. doi:10.1590/S1807-59322011000600008.

92.Swietach P, Vaughan-Jones RD, Harris AL, Hulikova A. The chemistry, physiology and pathology of pH in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 2014;369(1638):20130099. doi:10.1098/rstb.2013.0099.

93. Stephan J. Reshkin1, Rosa A. Cardone1 and Salvador Harguindey. Na+ -H+ Exchanger, pH Regulation and Cancer Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery, 2013, 8, 000-000

94. Alvaro Marín-Hernández, Juan Carlos Gallardo-Pérez, Sara Rodríguez-Enríquez, Rusely ncalada, Rafael Moreno-Sánchez, , Emma Saavedra, Modeling cancer glycolysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – BioenergeticsVolume 1807, Issue 6, June 2011, Pages 755–767 Bioenergetics of Cancer

95. On the Origin of Cancer Cells Author(s): Otto Warburg Source: Science, New Series, Vol. 123, No. 3191, (Feb. 24, 1956), pp. 309-314

96. Sussman I, Erecinska M, and Wilson DF (1980). Regulation of cellular energy metabolism: the Crabtree effect. Biochim Biophys Acta 591, 209–223

97. Heinz A, Sachs G, and Schafer JA (1981). Evidence for activation of an active electrogenic proton pump in Ehrlich ascites tumor cells during glycolysis. J Membr Biol 61, 143–153.

98. Wojtczak L (1996). The Crabtree effect: a new look at the old problem. Acta Biochim Pol 43, 361–368.

99. Yang X, Borg LA, and Eriksson UJ (1997). Altered metabolism and superoxide generation in neural tissue of rat embryos exposed to high glucose. Am J Physiol 272, E173–180

100..Raff MC Social controls on cell survival and cell death. Nature. 1992 Apr 2;356(6368):397-400

101.Craig B. Thompson .Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science. 1995 Mar 10;267(5203):1456-62.

102. N.M. Droin, D.R. Green Role of Bcl-2 family members in immunity and disease Biochimica et Biophysica Acta 1644 (2004) 179–188

103. S.C. Lee, S. Pervaiz, Apoptosis in the pathophysiology of diabetes mellitus The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 39 (2007) 497–504

104. McKenzie MD1, Jamieson E, Jansen ES, Scott CL, Huang DC, Bouillet P, Allison J, Kay TW, Strasser A, Thomas HE. Glucose induces pancreatic islet cell apoptosis that requires the BH3-only proteins Bim and Puma and multi-BH domain protein Bax. Diabetes. 2010 Mar;59(3):644-52. doi: 10.2337/db09-1151. Epub 2009 Dec 3

105. Radulescu D., Potentialul cardiotoxic al citostaticelor.Cluj Napoca.Editura Risoprint. 2013.pagina 21-24.

106. Scaffidi, C., Fulda, S., Srinivasan, A., et al. (1998). Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways. EMBO J., 16, 1675–1687.

107.Thomas, H.E.; McKenzie, M.D.; Angstetra, E.; Campbell, P.D.; Kay, T.W. Beta cell apoptosis in diabetes. Apoptosis 2009, 14, 1389–1404.

108. Hotchkiss, R.S.; Strasser, A.; McDunn, J.E.; Swanson, P.E. Cell death. New Engl. J. Med. 2009, 361, 1570–1583.

109. S Wang.The promise of cancer therapeutics targeting the TNF-related apoptosis-inducing ligand and TRAIL receptor pathway Oncogene (2008) 27, 6207–6215; doi:10.1038/onc.2008.298

110. Mariana Varna,1,2 Guilhem Bousquet,1,2 Louis-François Plassa,4 Philippe Bertheau,1,2,3 and Anne Janin1,2,3TP53 Status and Response to Treatment in Breast Cancers Journal of Biomedicine and BiotechnologyVolume 2011 (2011), Article ID 284584, 9 pages http://dx.doi.org/10.1155/2011/284584

111. : Pan D, Marcato P, Ahn D-G, Gujar S, Pan L-Z, et al. (2013) Activation of p53 by Chemotherapeutic Agents Enhances Reovirus Oncolysis. PLoS ONE 8(1): e54006. doi:10.1371/journal.pone.0054006

112.. Eric Wattel, Claude Preudhomme, Bernard Hecquet, Michael Vanrumbeke, Bruno Quesnel, Isabelle Dervite, Pierre Morel, and Pierre Fenaux p53 Mutations Are Associated With Resistance to Chemotherapy and Short Survival in Hematologic Malignancies Blood, Vol 84, No 9 (November l), 1994: pp 3148-3157

113. Zhen Wang and Yi Sun Targeting p53 for Novel Anticancer Therapy Transl Oncol. 2010 Feb; 3(1): 1–12. Published online 2010 Feb.

114. Lowe SW, Bodis S, McClatchey A, Remington L, Ruley HE, Fisher DE, Housman DE, Jacks T. p53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo. Science. 1994;266(5186):807–810. [PubMed]

115. Lowe SW, Ruley HE, Jacks T, Housman DE. p53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents. Cell. 1993;74(6):957–967. [PubMed]

116. Herod JJ, Eliopoulos AG, Warwick J, Niedobitek G, Young LS, Kerr DJ. The prognostic significance of Bcl-2 and p53 expression in ovarian carcinoma. Cancer Res. 1996;56(9):2178–2184. [PubMed]

117. Shelling AN. Role of p53 in drug resistance in ovarian cance . Lancet . 1997; 349(9054) :744–745 .[PubMed]

118. Borresen AL, Andersen TI, Eyfjord JE, Cornelis RS, Thorlacius S, Borg A, Johansson U, Theillet C, Scherneck S, Hartman S, et al. TP53 mutations and breast cancer prognosis: particularly poor survival rates for cases with mutations in the zinc-binding domains. Genes Chromosomes Cancer. 1995;14(1):71–75.[PubMed]

119. Preudhomme C, Fenaux P. The clinical significance of mutations of the P53 tumour suppressor gene in haematological malignancies. Br J Haematol. 1997;98(3):502–511. [PubMed]

120. Hamada M, Fujiwara T, Hizuta A, Gochi A, Naomoto Y, Takakura N, Takahashi K, Roth JA, Tanaka N, Orita K. The p53 gene is a potent determinant of chemosensitivity and radiosensitivity in gastric and colorectal cancers. J Cancer Res Clin Oncol. 1996;122(6):360–365. [PubMed]

121. R Maruyama, K Yamana, T Itoi, N Hara, V Bilim, T Nishiyama, K Takahashi and Y Tomita.Absence of Bcl-2 and Fas/CD95/APO-1 predicts the response to immunotherapy in metastatic renal cell carcinoma British Journal of Cancer (2006) 95, 1244–1249. doi:10.1038/sj.bjc.6603359 www.bjcancer.com Published online 10 October 2006

122. Tsujimoto Y, Cossman J, Jaffe E, Croce CM. Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma. Science. 1985 Jun 21;228(4706):1440-3.

123. Levine B,Sinha S, Kroemer G. Bcl-2family members: Dual regulators of apoptosis and autophagy,Autophagy,4(5),600-606 (2008)

124. Leber B, Lin J, Andrews DW, Embedded together: the life and death consequences of interaction of the Bcl-2 family with membranes ,Apoptosis 12: 897–911(2007).

125. Basu A, Haldar S. The relationship between BcI2, Bax and p53: consequences for cell cycle progression and cell death.

Mol Hum Reprod. 1998 Dec;4(12):1099-109.

126. Surya Bhan, Rahul Mitra, A. K. Arya, H. P. Pandey, and K. Tripathi A Study on Evaluation of Apoptosis and Expression of Bcl-2-Related Marker in Wound Healing of Streptozotocin-Induced Diabetic Rats ISRN DermatologyVolume 2013 (2013), Article ID 739054, 6 pages http://dx.doi.org/10.1155/2013/739054

127.Grant Dewson ,Ruth M Kluck Bcl-2 family-regulated apoptosis in health and disease Cell Health and Cytoskeleton 2010:2

128. Villunger A, Michalak EM, Coultas L, et al. p53- and drug-induced apoptotic responses mediated by BH3-only proteins Puma and Noxa. Science. 2003;302:1036–1038.

129.Puthalakath H, Villunger A, O’Reilly LA, et al. Bmf: A pro-apoptotic BH3-only protein regulated by interaction with the myosin V actin motor complex, activated by anoikis. Science. 2001;293:1829–1832.

130.Andrew M. Petros, Edward T. Olejniczak, Stephen W. Fesik Structural biology of the Bcl-2 family of proteins Biochimica et Biophysica Acta 1644 (2004) 83–94

131. Aisha Shamas-Din, Justin Kale, Brian Leber and David W. Andrews. Mechanisms of Action of Bcl-2 Family Proteins Cold Spring Harb Perspect Biol 2013;5:a008714.

132. Letai A, Bassik MC, Walensky LD, Sorcinelli MD, Weiler S, Korsmeyer SJ. 2002. Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics. Cancer Cell 2: 183–192

133. Chen L,Willis SN,Wei A, Smith BJ, Fletcher JI, Hinds MG, Colman PM, Day CL, Adams JM, Huang DC. 2005. Differential targeting of prosurvival Bcl-2 proteins by their BH3-only ligands allows complementary apoptotic function.Mol Cell 17: 393–403.

134. Leber B, Lin J, Andrews DW. 2010. Still embedded together binding to membranes regulates Bcl-2 protein interactions. Oncogene 29: 5221–5230.

135. Llambi F, Moldoveanu T, Tait SW, Bouchier-Hayes L, Temirov J, McCormick LL, Dillon CP, Green DR. 2011. A unified model of mammalian BCL-2 protein family interactions at the mitochondria. Mol Cell 44: 517–531.

136 .Ilir Mehmeti, Sigurd Lenzen, Stephan Lortz Modulation of Bcl-2-related protein expression in pancreatic beta cells by pro-inflammatory cytokines and its dependence on the antioxidative defense status Molecular and Cellular Endocrinology 332 (2011) 88–96

137. Kim, Won-Ho, et al. "Exposure to chronic high glucose induces ß-Cell apoptosis through decreased interaction of glucokinase with mitochondria downregulation of glucokinase in pancreatic ß-Cells." Diabetes 54.9 (2005): 2602-2611.

138. Lupi R, Del Prato S. Beta-cell apoptosis in type 2 diabetes: quantitative and functional consequences. Diabetes Metab. 2008 Feb;34 Suppl 2:S56-64

139. Wajant H. The Fas signaling pathway: more than a paradigm Science 2002 ; 296 : 1635-1636

140. Gibson G.E., Huang H.M. Mitochondrial enzymes and endoplasmic reticulum calcium stores as targets of oxidative stress in neurodegenerative diseases J Bioenerg Biomembr 2004 ; 36 : 335-340

141. Esteban N. Gurzov,Decio L. EizirikBcl-2 proteins in diabetes: mitochondrial pathways of ß-cell death and dysfunction. Trends in Cell Biology 21 no7/ 424-431.2011

142. Grunnet, L.G. et al. (2009) Proinflammatory cytokines activate the intrinsic apoptotic pathway in b-cells. Diabetes 58, 1807–1815

143. Cunha, D.A. et al. (2009) Glucagon-like peptide-1 agonists protect pancreatic b-cells from lipotoxic endoplasmic reticulum stress through upregulation of BiP and JunB. Diabetes 58, 2851–2862

144. Wali JA Masters SL, Thomas HE. Linking metabolic abnormalities to apoptotic pathways in Beta cells in type 2 diabetes Cells. 2013 Apr 26;2(2):266-83. doi: 10.3390/cells2020266.

145. Cunha, D.A.; Hekerman, P.; Ladriere, L.; Bazarra-Castro, A.; Ortis, F.; Wakeham, M.C.; Moore, F.; Rasschaert, J.; Cardozo, A.K.; Bellomo, E.; et al. Initiation and execution of lipotoxic ER stress in pancreatic beta-cells. J. Cell Sci. 2008, 121, 2308–2318.

146. Oyadomari, S.; Koizumi, A.; Takeda, K.; Gotoh, T.; Akira, S.; Araki, E.; Mori, M. Targeted disruption of the Chop gene delays endoplasmic reticulum stress-mediated diabetes. J. Clin. Invest. 2002, 109, 525–532.

147. Gurzov, E.N. et al. (2009) Signaling by IL-1b+IFN-g and ER stress converge on DP5/Hrk activation: a novel mechanism for pancreatic ß-cells apoptosis. Cell Death Differ. 16, 1539-1550.

148. Zhang, D. and Armstrong, J.S. (2007) Bax and the mitochondrial permeability transition cooperate in the release of cytochrome c during endoplasmic reticulum-stress-induced apoptosis. Cell Death Differ. 14, 703–71

149. Lim, J.H. et al. (2009) Coupling mitochondrial dysfunction to endoplasmic reticulum stress response: a molecular mechanism leading to hepatic insulin resistance. Cell Signal. 21, 169–177

150. Szegezdi, E. et al. (2009) Bcl-2 family on guard at the ER. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C941–953

151. Ma,ZA, Zhengshan Z , Turk J "Mitochondrial dysfunction and ß-cell failure in type 2 diabetes mellitus." Experimental diabetes research 2012 (2011).

152. R. P. Robertson, J. Harmon, P. O. T. Tran, and V. Poitout,“Beta-cell glucose toxicity, lipotoxicity, and chronic oxidative stress in type 2 diabetes,” Diabetes, vol. 53, supplement 1, pp.S119–S124, 2004.

153. P. Jezek and L. Hlavata, “Mitochondria in homeostasis of reactive oxygen species in cell, tissues, and organism,” The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, vol. 37,

no. 12, pp. 2478–2503, 2005

154. Linzer DI, Levine AJ (1979) Characterization of a 54K dalton cellular SV40 tumor antigen present in SV40-transformed cells and uninfected embryonal carcinoma cells. Cell 17: 43–52

155. Lane DP, Crawford LV (1979) T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells. Nature 278: 261–263

156. Tsujimoto, Y. et al. Clustering of breakpoints on chromosome 11 in human B-cell neoplasms with the t(11;14) chromosome translocation. Nature 315, 340-343.1985

157. Bakhshi A., Jensen,J.P., Goldman,P., Wright,J.J., McBride,O.W., Epstein,A.L. and Korsmeyer,S.J. (1985) Cloning the chromosomal breakpoint of t(14;18) human lymphomas: clustering around JH on chromosome 14 and near a transcriptional unit on 18. Cell, 41, 899–906.

158. Cleary M.L. and Sklar,J. (1985) Nucleotide sequence of a t(14;18) chromosomal breakpoint in follicular lymphoma and demonstration of a breakpoint-cluster region near a transcriptionally active locus on chromosome 18. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82, 7439–7443.

159. Bert Vogelstein,Carol Prives. The rise of p53.Nature Publishing Group.Nature Reviews Cancer 2009.

160. Genetics Home Reference gene summary on the TP53 gene. U.S. National Library of Medicine (2015) Accesed on http://ghr.nlm.nih.gov/gene/TP53 in 20.10.2015

161. Brady CA, Attardi LD. p53 at a glance. J Cell Sci. 2010 Aug 1;123(Pt 15):2527-32. doi: 10.1242/jcs.064501.

162. Jordan S Fridman and Scott W Lowe Control of apoptosis by p53 Oncogene (2003) 22, 9030–9040

163. Tyner SD1, Venkatachalam S, Choi J, Jones S, Ghebranious N, Igelmann p53 mutant mice that display early ageing-associated phenotypes. Nature. 2002 Jan 3;415(6867):45-53.

164. Komarova EA, Gudkov AV. Chemoprotection from p53-dependent apoptosis: potential clinical applications of the p53 inhibitors. Biochem Pharmacol. 2001 Sep 15;62(6):657-67. Review

165. Vladimir O. Pustylnyak, Pavel D. Lisachev,Mark B. Shtark. Expression of p53 Target Genes in the Early Phase of Long-Term Potentiation in the Rat Hippocampal CA1 Area NeuralPlasticityVolume 2015 (2015), Article ID 242158, 12 pageshttp://dx.doi.org/10.1155/2015/242158

166. Narayana Kilarkaje, PhD1?Maie M. Al-Bader, Diabetes-Induced Oxidative DNA Damage Alters p53-p21CIP1/Waf1 Signaling in the Rat Testis Reprod Sci. 2015 Jan;22(1):102-12 Reproductive Sciences May 14, 20141933719114533729

167. Hu W, Feng Z, Levine AJ. The Regulation of Multiple p53 Stress Responses is Mediated through MDM2. Genes & Cancer. 2012;3(3-4):199-208. doi:10.1177/1947601912454734.

168.Xinjiang Wang, Xuejun JiangMdm2 and MdmX partner to regulate p53. FEBS Letters. Volume 586, Issue 10, 21 May 2012, Pages 1390

169.Anju Thomas1, Theresa Giesler1,2 and Eileen White.p53 mediates Bcl-2 phosphorylation and apoptosis via activation of the Cdc42/JNK1 pathway.Oncogene. 2 November 2000, Volume 19, Number 46, Pages 5259-5269

170. Peng Jiang, Wenjing Du1 and Mian Wu1 p53 and Bad: remote strangers become close friends Cell Research (2007) 17: 283–285 doi: 10.1038/cr.2007.19; 2007

171. Galluzzi L, Morselli E, Kepp O, Maiuri MC, Kroemer G. Defective autophagy control by the p53 rheostat in cancer. Cell Cycle 2010; 9: 250-255 [PMID: 20023384

172. A Basu,S Haldar The relationship between BcI2, Bax and p53: consequences for cell cycle progression and cell death. Mol. Hum. Reprod. (1998) 4 (12):1099-1109.

173.Sui X, Jin L, Huang X, Geng S, He C, Hu X. p53 signaling and autophagy in cancer: a revolutionary strategy could be developed for cancer treatment. Autophagy 2011; 7: 565-571 [PMID: 21099252]

174.Maiuri MC, Galluzzi L, Morselli E, Kepp O, Malik SA, Kroemer G. Autophagy regulation by p53. Curr Opin Cell Biol 2010; 22: 181-185 [PMID: 20044243]

175. Douglas R. Green, Jerry E. Chipuk. p53 and Metabolism: Inside the TIGAR. Cell, Volume 126, Issue 1, 14 July 2006, Pages 30-3.

176. Karim Bensaad, Atsushi Tsuruta, Mary A. Selak M. Nieves Calvo Vidal, Katsunori Nakano TIGAR, a p53-Inducible Regulator of Glycolysis and Apoptosis.

177.Yee KS, Wilkinson S, James J, Ryan KM, Vousden KH. PUMA- and Bax-induced autophagy contributes to apoptosis.Cell Death Differ 2009; 16: 1135-1145 [PMID: 19300452]

178. Katsunori Nakano, Karen H Vousden. PUMA, a Novel Proapoptotic Gene, Is Induced by p53. Molecular Cell.Volume 7, 2001, Pages 683–694

179.Lorin, Séverine, et al. "Evidence for the interplay between JNK and p53-DRAM signaling pathways in the regulation of autophagy." Autophagy 6.1 (2010): 153-154.

180. M T Hemann and S W Lowe The p53–Bcl-2 connection. Cell Death and Differentiation (2006) 13, 1256–1259.

181. Opferman JT1, Korsmeyer SJ. Apoptosis in the development and maintenance of the immune system. Nat Immunol. 2003 May;4(5):410-5.

182. Ute M Moll1 , Sonja Wolff , Daniel Speidel and Wolfgang Deppert. Transcription-independent pro-apoptotic functions of p53 Curr. Opin. Cell Biol. 17: 631–636.

183. York Tomita , Natasha Marchenko , Susan Erster , Alice Nemajerova WT p53, but Not Tumor-derived Mutants, Bind to Bcl2 via the DNA Binding Domain and Induce Mitochondrial Permeabilization. J. Biol. Chem. 281: 8600–8606

184. American Diabetes Association. Classification and diagnosis of diabetes. Sec. 2. In Standards of Medical Care in Diabetesd2016. Diabetes Care 2016;39(Suppl. 1): S13–S22

185. American Diabetes Association. Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus.Diabetes Care. 2010;33(Suppl 1):S62-S69. doi:10.2337/dc10-S062.

186. Viorel Serban. Tratat Roman de Boli Metabolice. Volumul1.Etiopatogenia si istoria naturala a diabetului zaharat, Viorel Serban, Adrian Vlad, Alexandra Sima.143-148.Editura Brumar 2010.

187. RalphA.DeFronzo, Ele Ferrannini, Paul Zimmet, and K. George M. M. Alberti International Textbook of Diabetes Mellitus, Fourth Edition.371. Pathogenesis of type 2 diabetes mellitus.2015.

188. Reaven GM Banting lecture 1988. Role of insulin resistance in human disease. Diabetes. 1988 Dec;37(12):1595-607.

189. Liao, Wei-Chih, et al. "Blood glucose concentration and risk of pancreatic cancer: systematic review and dose-response meta-analysis." Bmj 349 (2015): g7371.

190. George I Fantus. Insulin Resistance and cancer.Epidemiology, Cellular and Molecular Mechanisms and Clinical Implications. Springer.New York.USA.2011: 10.The role of IGF Axis in Human Malignancy: Evidence from epidemiological Studies and Tissue Analysis 213-242.

191. Derek LeRoith. Insulin-like Growth Factors and Cancer. From Basic Biology to Therapeutics.Humana Press.New York.USA.2012: Epidemiology of IGF1 and Cancer 1-24

192. George I Fantus. Insulin Resistance and cancer.Epidemiology, Cellular and Molecular Mechanisms and Clinical Implications. Springer.New York.USA.2011:2 Insulin/IGF-1 Signaling Nodes and their Role in Carcinogenesis Cullen M. Taniguchi and C. Ronald Kahn 53-77

193. George I Fantus. Insulin Resistance and cancer.Epidemiology, Cellular and Molecular Mechanisms and Clinical Implications. Springer.New York.USA.2011: IGF-I and Insulin Receptor Families in Cancer Antonino Belfiore, Ira D. Goldfine, and Roberta Malaguarnera 243-269

194.George I Fantus. Insulin Resistance and cancer.Epidemiology, Cellular and Molecular Mechanisms and Clinical Implications. Springer.New York.USA.2011 ;The Role of the IGF Axis in Human Malignancy: Evidence from Epidemiological Studies and Tissue Analysis Julia V. Burnier, Shun Li, and Pnina Brodt 213-242

195. Jenab M, Riboli E, Cleveland RJ et al (2007) Serum C-peptide, IGFBP-1 and IGFBP-2 and risk of colon and rectal cancers in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition. Int J Cancer 121:368–376

196. Manousos O, Souglakos J, Bosetti C et al (1999) IGF-I and IGF-II in relation to colorectal cancer. Int J Cancer 83:15–17

197.Hunt KJ, Toniolo P, Akhmedkhanov A et al (2002) Insulin-like growth factor II and colorectal cancer risk in women. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 11:901–905

198. Frasca F, Pandini G, Scalia P et al (1999) Insulin receptor isoform A, a newly recognized, high affinity insulin-like growth factor II receptor in fetal and cancer cells. Mol Cell Biol 19:3278–3288

199. Sciacca L, Mineo R, Pandini G et al (2002) In IGF-I receptor-deficient leiomyosarcoma cells autocrine IGF-II induces cell invasion and protection from apoptosis via the insulin receptor isoform A. Oncogene 21:8240–8250

200. Peyrat JP, Bonneterre J, Beuscart R et al (1988) Insulin-like growth factor 1 receptors in human breast cancer and their relation to estradiol and progesterone receptors. Cancer Res 48:6429–6433

201. Cullen KJ, Yee D, Sly WS et al (1990) Insulin-like growth factor receptor expression and function in human breast cancer. Cancer Res 50:48–53

202. Papa V, Gliozzo B, Clark GM et al (1993) Insulin-like growth factor-I receptors are overexpressed and predict a low risk in human breast cancer. Cancer Res 53:3736–3740

203. Koda M, Sulkowski S, Garofalo C et al (2003) Expression of the insulin-like growth factor-I receptor in primary breast cancer and lymph node metastases: correlations with estrogen receptors alpha and beta. Horm Metab Res 35:794–801

204. Vella V, Pandini G, Sciacca L et al (2002) A novel autocrine loop involving IGF-II and the insulin receptor isoform-A stimulates growth of thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab 87:245–254

205. Sciacca L, Costantino A, Pandini G et al (1999) Insulin receptor activation by IGF-II in breast cancers: evidence for a new autocrine/paracrine mechanism. Oncogene 18:2471–2479

206. Kalli KR, Falowo OI, Bale LK et al (2002) Functional insulin receptors on human epithelial ovarian carcinoma cells: implications for IGF-II mitogenic signaling. Endocrinology 143:3259–3267

207. Ouban A, Muraca P, Yeatman T et al (2003) Expression and distribution of insulin-like growth factor-1 receptor in human carcinomas. Hum Pathol 34:803–808

208. Guo YS, Narayan S, Yallampalli C et al (1992) Characterization of insulin like growth factor I receptors in human colon cancer. Gastroenterology 102:1101–1108

209. Huff KK, Kaufman D, Gabbay KH et al (1986) Secretion of an insulin-like growth factor-Irelated protein by human breast cancer cells. Cancer Res 46:4613–4619

210. Yee D, Paik S, Lebovic GS et al (1989) Analysis of insulin-like growth factor I gene expression in malignancy: evidence for a paracrine role in human breast cancer. Mol Endocrinol 3:509–517

211. Maiorano E, Ciampolillo A, Viale G et al (2000) Insulin-like growth factor 1 expression in thyroid tumors. Appl Immunohistochem Mol Morphol 8:110–119

212. Michell NP, Langman MJ, Eggo MC (1997) Insulin-like growth factors and their binding proteins in human colonocytes: preferential degradation of insulin-like growth factor binding protein 2 in colonic cancers. Br J Cancer 76:60–66

213. Pietrzkowski Z, Mulholland G, Gomella L et al (1993) Inhibition of growth of prostatic cancer cell lines by peptide analogues of insulin-like growth factor 1. Cancer Res 53:1102–1106

214. Paik S (1992) Expression of IGF-I and IGF-II mRNA in breast tissue. Breast Cancer ResTreat 22:31–38

215. Singh P, Dai B, Yallampalli C et al (1994) Expression of IGF-II and IGF-binding proteins by colon cancer cells in relation to growth response to IGFs. Am J Physiol 267:G608–G617

216. Jehle PM, Fussgaenger RD, Blum WF et al (1999) Differential autocrine regulation of intestine epithelial cell proliferation and differentiation by insulin-like growth factor (IGF) system components. Horm Metab Res 31:97–102

217. Li SL, Goko H, Xu ZD et al (1998) Expression of insulin-like growth factor (IGF)-II in human prostate, breast, bladder, and paraganglioma tumors. Cell Tissue Res 291:469–479

218. Avnet S, Sciacca L, Salerno M et al (2009) Insulin receptor isoform A and insulin-like growth factor II as additional treatment targets in human osteosarcoma. Cancer Res 69:2443–2452

219.C.Ionescu-Tirgoviste, R Lichiardopol , Cristian Guja.Diabetul Zaharat: manual pentru studenti, medici de familie si rezidenti: Etiopatogenia diabetului zaharat pag 20-23 Editura Ilex Bucuresti 2007

220.Viorel Serban. Tratat Roman de Boli Metabolice. Volumul 1.Timisoara. Brumar 2010.Insulina Structura si biosinteza 95-113.

221. Pollak M.The insulin receptor/insulin-like growth factor receptor family as a therapeutic target in oncology. Clin Cancer Res. 2012 Jan 1;18(1):40-50. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-11-0998.

222. Belfiore A, Pandini G, Vella V, Squatrito S, Vigneri R. Insulin/IGF-I hybrid receptors play a major role in IGF-I signaling in thyroid cancer. Biochimie. 1999; 81: 403–7.

223.Antonino Belfiore and Roberta Malaguarnera Insulin receptor and cancer Endocrine-Related Cancer (2011) 18 R125–R147

224. Frystyk J 2004 Free insulin-like growth factors – measurements and relationships to growth hormone secretion and glucose homeostasis. Growth Hormone & IGF Research 14 337–375. (doi:10.1016/j.ghir.2004.06.001)

225. Cusi K, Maezono K, Osman A, Pendergrass M, Patti ME, Pratipanawatr T, DeFronzo RA, Kahn CR & Mandarino LJ 2000 Insulin resistance differentially affects the PI 3-kinase- and MAP kinase-mediated signaling in human muscle. Journal of Clinical Investigation 105 311–320. (doi:10.1172/JCI7535)

226. Jiang ZY, Lin YW, Clemont A, Feener EP, Hein KD, Igarashi M, Yamauchi T, White MF & King GL 1999 Characterization of selective resistance to insulin signaling in the vasculature of obese Zucker (fa/fa) rats. Journal of Clinical Investigation 104 447–457. (doi:10. 1172/JCI5971)

227. Tiange WANG Guang NING and Zachary Bloomgarden Diabetes and cancer relationships Journal of Diabetes 5 (2013) 378–390

228. Pandini G, Frasca F, Mineo R, Sciacca L, Vigneri R, Belfiore A. Insulin/insulin-like growth factor I hybrid receptors have different biological characteristics depending on the insulin receptor isoform involved. J Biol Chem. 2002; 277: 39684–95

229. Derek LeRoith. Insulin-like Growth Factors and Cancer. From Basic Biology to Therapeutics.Humana Press.New York.USA.2012 Overlaps Between the Insulin and IGF-I Receptor and Cancer Antonino Belfiore and Roberta Malaguarnera 263-274

230. Sciacca L, Prisco M, Wu A, et al (2003) Signaling differences from the A and B isoforms of the insulin receptor (IR) in 32D cells in the presence or absence of IR substrate-1. Endocrinology 144:2650–2658

231. Entingh AJ, Taniguchi CM, Kahn CR (2003) Bi-directional regulation of brown fat adipogenesis by the insulin receptor. J Biol Chem 278:33377–33383

232. Vella V, Pandini G, Sciacca L et al (2002) A novel autocrine loop involving IGF-II and the insulin receptor isoform-A stimulates growth of thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab 87:245–254

233.SCIACZhao H, Dupont J, Yakar S et al (2004) PTEN inhibits cell proliferation and induces apoptosis by downregulating cell surface IGF-IR expression in prostate cancer cells. Oncogene 23:786–794

234 Werner H, Le Roith D (2000) New concepts in regulation and function of the insulin-like growth factors: implications for understanding normal growth and neoplasia. Cell Mol Life Sci57:932–942

235. Klotz DM, Hewitt SC, Ciana P et al. Requirement of estrogen receptor-alpha in insulin-like growth factor-1 (IGF-1)-induced uterine responses and in vivo evidence for IGF-1/estrogen receptor cross-talk. J Biol Chem. 2002; 277: 8531–7.

236. Ahmad T, Farnie G, Bundred NJ et al (2004) The mitogenic action of insulin-like growth factor I in normal human mammary epithelial cells requires the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase. J Biol Chem 279:1713–1719

237.Mur C, Valverde AM, Kahn CR & Benito M 2002 Increased insulin sensitivity in IGF-I receptor – deficient brown adipocytes. Diabetes 51 743–754. (doi:10.2337/diabetes. 51.3.743)

238. Zhang H, Pelzer AM, Kiang DT & Yee D 2007 Downregulation of type I insulin-like growth factor receptor increases sensitivity of breast cancer cells to insulin. Cancer Research 67 391–397. (doi:10.1158/0008-5472. CAN-06-1712)

239.Maynard GD. A statistical study in cancer death-rates. Biometrika. 1910;7:276–304;.Accesat la [http://biomet.oxfordjournals.org] in data de 17.10.2015.

240.L. Poretsky (ed.), Principles of Diabetes Mellitus, Springer Science+Business Media, LLC 2010 Emily Jane Gallagher, Ruslan Novosyadlyy, Shoshana Yakar, and Derek LeRoith The Increased Risk of Cancer in Obesity and Type 2 Diabetes:Potential Mechanisms 579-599.

241. Ralph A. DeFronzo, Ele Ferrannini, Paul Zimmet, and K. George M. M. Alberti. International Textbook of Diabetes Mellitus, Fourth Edition 2015 JohnWiley & Sons, Ltd. Published 2015 by JohnWiley & Sons, Ltd. Emily Jane Gallagher1, Ruslan Novosyadlyy2 and Derek LeRoith1 CHAPTER 21 Type 2 diabetes and cancer 306-315

242. M. Balasubramanyam. Diabetic oncopathy – One more yet another deadly diabetic

complication! Indian J Med Res. 140(1): 15-18; 2014

243. Edward Giovannucci, David M. Harlan, Michael C. Archer, Diabetes and Cancer

A consensus report. Diabetes Care. 2010 Jul; 33(7): 1674–1685.doi: 10.2337/dc10-0666

244. Bosetti C, Rosato V, Li D, Silverman D, Petersen GM, Bracci PM, Neale RE, Muscat J, Anderson K, Gallinger S, Olson SH, Miller AB, Bueno-de-Mesquita HB, Scelo G, Janout V, Holcatova I, Lagiou P, Serraino D CL. Diabetes, antidiabetic medications and pancreatic cancer risk: an analysis from the international pancreatic cancer case-control consortium. Ann Oncol, 2014. PMID: 25057164

245.Ben Q, Xu M, Ning X, Liu J, Hong S, Huang W, Zhang H, Li Z. Diabetes mellitus and risk of pancreatic cancer: A meta-analysis of cohort studies.Eur J Cancer 47:1928-37, 2011. PMID: 21458985

246.Elena JW, Steplowski E, Yu K, Hartge P, Tobias GS, Brotzman MJ, Chanock SJ, Stolzenberg-Solomon RZ, Arslan AA, Bueno-de-Mesquita HB, Helzlsouer K, Jacobs EJ, LaCroix A, Petersen G, Zheng W, Albanes D, Allen NE, Amundadottir. Diabetes and risk of pancreatic cancer: a pooled analysis from the pancreatic cancer cohort consortium. Cancer Causes Control 24:13-25, 2013. PMID: 23112111

247.Everhart J, Wright D. Diabetes mellitus as a risk factor for pancreatic cancer. A meta-analysis. JAMA 273:1605-9, 1995. PMID: 7745774

248.Huxley R, Ansary-Moghaddam A, Berrington de Gonzalez A, Barzi F, Woodward M. Type-II diabetes and pancreatic cancer: a meta-analysis of 36 studies. Br J Cancer 92:2076-83, 2005. PMID: 15886696

249.Li, Donghui. Mao, Yixiang. (2015). Diabetes as a Risk Factor of Pancreatic Cancer.

Pancreapedia: Exocrine Pancreas Knowledge Base, DOI: 10.3998/panc.2015.2

250. Gao S, Yang WS, Gao J, Wang J, Xiang YB. [A meta-analysis of cohort studies on the association between diabetes and the risk of primary liver cancer] Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. 2010 Aug;44(8):711-6.

251.Wang C, Wang X, Gong G, Ben Q, Qiu W, Chen Y et al.: Increased risk of hepatocellular carcinoma in patients with diabetes mellitus: a systematic review and meta-analysis of cohort studies. Int J Cancer 2012, 130: 1639-1648.

252.Song S, Wang B, Zhang X, Hao L, Hu X, Li Z, et al. (2015) Long-Term Diabetes Mellitus Is Associated with an Increased Risk of Pancreatic Cancer: A Meta-Analysis. PLoS ONE 10(7): e0134321. doi:10.1371/journal.pone.0134321

253.Guraya SY. Association of type 2 diabetes mellitus and the risk of colorectal cancer: A meta-analysis and systematic review.World J Gastroenterol., 2015. 221(19): 6026-603

254.Luo W, Cao Y, Liao C, Gao F.Diabetes mellitus and the incidence and mortality of colorectal cancer: a meta-analysis of 24 cohort studies. Colorectal Dis. 2012 Nov;14(11):1307-12. doi: 10.1111/j.1463-1318.2012.02875.x.

255.Deng L, Gui Z, Zhao L, Wang J, Shen L. Diabetes mellitus and the incidence of colorectal cancer: an updated systematic review and meta-analysis.Dig Dis Sci. 2012 Jun;57(6):1576-85. doi: 10.1007/s10620-012-2055-1. Epub 2012 Feb 17.

256.Kentaro Shikata, Toshiharu Ninomiya, Yutaka Kiyohara1Diabetes mellitus and cancer risk: Review of the epidemiological evidenceIssueCancer ScienceVolume 104, Issue 1,9–14, 2013

257.Habib SL, Rojna M. Diabetes and risk of cancer. ISRN Oncology 2013:583786, 2013.

258.Jiao Jian Tong, Huang Tao, Ouyang Tao Hui, And Chen Jian;Exp Ther Med. 2012 Nov; 4(5): 877–882.Published online 2012 Sep 6. doi: 10.3892/etm.2012.698

259.Ge Z, Ben Q, Qian J, Wang Y, Li Y. Diabetes mellitus and risk of gastric cancer: a systematic review and meta-analysis of observational studiesEur J Gastroenterol Hepatol. 2011 Nov;23(12):1127-35. doi: 10.1097/MEG.0b013e32834b8d73.

260.Ren HB, Yu T, Liu C, Li YQ. Diabetes mellitus and increased risk of biliary tract cancer: systematic review and meta-analysis.Cancer Causes Control. 2011 Jun;22(6):837-47. doi: 10.1007/s10552-011-9754-3. Epub 2011 Mar 19.

261.Huang W, Ren H, Ben Q, Cai Q, Zhu W, Li Z. Risk of esophageal cancer in diabetes mellitus: a meta-analysis of observational studies.Cancer Causes Control. 2012 Feb;23(2):263-72. doi: 10.1007/s10552-011-9874-9. Epub 2011 Nov 18.

262. Shouji ShimoyamaDiabetes mellitus carries a risk of gastric cancer: A meta-analysis. World J Gastroenterol. 2013; 19(40): 6902–6910.Published online 2013 Oct 28. doi: 10.3748/wjg.v19.i40.6902

263.Yoon JM, Son KY, Eom CS, Durrance D, Park SM. Pre-existing diabetes mellitus increases the risk of gastric cancer: A meta-analysisWorld J Gastroenterol. 2013 Feb 14; 19(6): 936–945.Published online 2013 Feb 14. doi: 10.3748/wjg.v19.i6.936

264.Junshan Li, Tianjie Han,Linlin Xu, and Xiaotian Luan.Diabetes mellitus and the risk of cholangiocarcinoma: an updated meta-analysisPrz Gastroenterol. 2015; 10(2): 108–117.

265.Jing W, Jin G, Zhou X, Zhou Y, Zhang Y, Shao C, Liu R, Hu X. Diabetes mellitus and increased risk of cholangiocarcinoma: a meta-analysis.Eur J Cancer Prev. 2012 Jan;21(1):24-31. doi: 10.1097/CEJ.0b013e3283481d89.

266.Krämer HU, Schöttker B, Raum E, Brenner H.Eur J Cancer. 2012 Jun;48(9):1269-82. doi: 10.1016/j.ejca.2011.07.010. Epub 2011 Aug 31.Type 2 diabetes mellitus and colorectal cancer: meta-analysis on sex-specific differences.

267.Leoncini E, Carioli G, La Vecchia C, Boccia S, Rindi G. Risk factors for neuroendocrine neoplasms: a systematic review and meta-analysis.Ann Oncol. Annals of Oncology 00: 1–13, 2015 doi:10.1093/annonc/mdv5052015

268. Shichong Liao, Jinxin Li1 ,Wen Wei , Lijun Wang , Yimin Zhang , Juanjuan L , Changhua Wang , Shenrong Sun1Association between Diabetes Mellitus and Breast Cancer Risk: a Meta-analysis of the LiteratureAsian Pacific J Cancer Prev, 12, 1061-1065; Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, Vol 12, 2011

269. Larsson SC, Mantzoros CS, Wolk A.Diabetes mellitus and risk of breast cancer: a meta-analysisInt J Cancer. 2007 Aug 15;121(4):856-62.

270.Friberg E, Orsini N, Mantzoros CS, Wolk A. Diabetes mellitus and risk of endometrial cancer: a meta-analysis.Diabetologia. 2007 Jul;50(7):1365-74. Epub 2007 3.

271.Larsson SC, Orsini N, Brismar K, Wolk A. Diabetes mellitus and risk of bladder cancer: a meta-analysis.Diabetologia. 2006 Dec;49(12):2819-23. Epub 2006 Oct 5.

272.Zhu Z, Wang X, Shen Z, Lu Y, Zhong S, Xu C. Risk of bladder cancer in patients with diabetes mellitus: an updated meta-analysis of 36 observational studies.BMC Cancer. 2013 Jun 26;13:310. doi: 10.1186/1471-2407-13-310.

273. Fang H, Yao B, Yan Y, Xu H, Liu Y, Tang H, Zhou J, Cao L, Wang W, Zhang J, Zhao L, Chen X, Zhang F, Zhao Y.Diabetes Technol Ther. 2013 Nov;15(11):914-22. doi: 10.1089/dia.2013.0131.Diabetes mellitus increases the risk of bladder cancer: an updated meta-analysis of observational studies.

274.Yang XQ, Xu C, Sun Y, Han RFDiabetes mellitus increases the risk of bladder cancer: an updated meta-analysis.Asian Pac J Cancer Prev. 2013;14(4):2583-9.

275.Lee JY, Jeon I, Kim JW, Song YS, Yoon JM, Park SM. Diabetes mellitus and ovarian cancer risk: a systematic review and meta-analysis of observational studies.Int J Gynecol Cancer. 2013 Mar;23(3):402-12. doi: 10.1097/IGC.0b013e31828189b2.

276.Lee JY, Jeon I, Lee JM, Yoon JM, Park SMDiabetes mellitus as an independent risk factor for lung cancer: a meta-analysis of observational studies.Eur J Cancer. 2013 Jul;49(10):2411-23. doi: 10.1016/j.ejca.2013.02.025. Epub 2013 Apr 3.

277.Zhang F, Yang Y, Skrip L, Hu D, Wang Y, Wong C, Qiu J, Lei H.Diabetes mellitus and risk of prostate cancer: an updated meta-analysis based on 12 case-control and 25 cohort studies.Acta Diabetol. 2012 Dec;49 Suppl 1:S235-46. doi: 10.1007/s00592-012-0439-5. Epub 2012 Nov 4.

278.Tian T1, Zhang LQ, Ma XH, Zhou JN, Shen J. Diabetes mellitus and incidence and mortality of gastric cancer: a meta-analysis.Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2012 Apr;120(4):217-23. doi: 10.1055/s-0031-1297969. Epub 2011 Dec 20.

279.Kasper JS1, Giovannucci E. A meta-analysis of diabetes mellitus and the risk of prostate cancer.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006 Nov;15(11):2056-62.

280.Bonovas S, Filioussi K, Tsantes A. Diabetes mellitus and risk of prostate cancer: a meta-analysis.Diabetologia. 2004 Jun;47(6):1071-8. Epub 2004 May 26.

281 Prue J Hardefeldt, Senarath Edirimanne and Guy D EslickDiabetes increases the risk of breast cancer: a meta-analysis Endocrine-Related Cancer (2012) 19 793–803

282. P Boyle, M Boniol, A Koechlin, C Robertson, F Valentini, K Coppens, L-L Fairley, M Boniol, T Zheng, Y Zhang, M Pasterk, M Smans, M P Curado, P Mullie, S Gandini, M Bota1, G B Bolli, J Rosenstock and P Autier1Diabetes and breast cancer risk: a meta-analysisBritish Journal of Cancer (2012) 107, 1608–1617. doi:10.1038/bjc.2012.414www.bjcancer.comPublished online 20 September 2012

283. Kimberly S. Peairs, Bethany B. Barone, Claire F. Snyder, Hsin-Chieh Yeh, Kelly B. Stein, Rachel L. Derr, Frederick L. Brancati, and Antonio C. Wolff Diabetes Mellitus and Breast Cancer Outcomes: A Systematic Review and Meta-Analysis J Clin Oncol 29:40-46. © 2010 by American Society of Clinical Oncology

284.Zhou Y., Zhang X., Gu C., Xia J. Diabetes mellitus is associated with breast cancer: systematic review, meta-analysis, and in silico reproduction Panminerva Medica 2015 September;57(3):101-8; 2015

285. Zhi-Hua Zhang; Pu-Yu Su ;Jia-Hu Hao; Ye-Huan SunThe Role of Preexisting Diabetes Mellitus on Incidence and Mortality of Endometrial Cancer A Meta-Analysis of Prospective Cohort Studies INTERNATIONAL JOURNAL OF GYNECOLOGICAL CANCER 23(2) . 2013

286.Bao C1, Yang X, Xu W, Luo H, Xu Z, Su C, Qi X. Diabetes mellitus and incidence and mortality of kidney cancer: a meta-analysis.J Diabetes Complications. 2013 Jul-Aug;27(4):357-64. doi: 10.1016/j.jdiacomp.2013.01.004. Epub 2013 Feb 20.(abstract)

287.J Diabetes Complications. 2010 Sep-Oct;24(5):345-53. doi: 10.1016/j.jdiacomp.2010.06.004. Epub 2010 Jul 24. Substantially increased risk of cancer in patients with diabetes mellitus: a systematic review and meta-analysis of epidemiologic evidence in Japan.Noto H, Osame K, Sasazuki T, Noda M.

288. Chen, Luyao ; Li, Hongzhao ; Gu, Liangyou ; Ma, Xin MD; Li, Xintao ; Gao, Yu ; Zhang, Yu ; Shen, Donglai MD; Fan, Yang ; Wang, Baojun ; Bao, 291.Xu ; Zhang, Xu MDThe Impact of Diabetes Mellitus on Renal Cell Carcinoma Prognosis: A Meta-Analysis of Cohort Studies Medicine:July 2015 – Volume 94 – Issue 26 – p e1055 doi: 10.1097/MD.0000000000001055

289. Hongzhou Cai, Zicheng Xu, Ting Xu,Bin Yu ,Qing Zou.Diabetes mellitus is associated with elevated risk of mortality amongst patients with prostate cancer: a meta-analysis of 11 cohort studiesDiabetes/Metabolism Research and Reviews;Volume 31, Issue 4, pages 336–343, May 2015

290.Hua Xu, Hao-wen Jiang,Guan-xiong Ding, Hu Zhang, Li-min Zhang, Shan-hua Mao, Qiang DinDiabetes mellitus and prostate cancer risk of different grade or stage: A systematic review and meta-analysisDiabetes Research and Clinical PracticeVolume 99, Issue 3, 2013, Pages 241–249

291.Jorge J. Castillo, Nikhil Mull2 John L. Reagan, Saed Nemr, and Joanna Mitri Increased incidence of non-Hodgkin lymphoma, leukemia, and myeloma in patients with diabetes mellitus type 2: a meta-analysis of observational studies Blood. 2012 May 24; 119(21): 4845–4850.Prepublished online 2012 Apr 10. doi: 10.1182/blood-2011-06-362830

292. Chao C1, Page JHType 2 diabetes mellitus and risk of non-Hodgkin lymphoma: a systematic review and meta-analysis. . Am J Epidemiol. 2008 Sep 1;168(5):471-80. doi: 10.1093/aje/kwn160. Epub 2008 Jul 8.

293.Joanna Mitri, MD,1 Jorge Castillo, MD,2 and Anastassios G. Pittas, Diabetes and Risk of Non-Hodgkin's Lymphoma A meta-analysis of observational studies. Diabetes Care. 2008 Dec; 31(12): 2391–2397.doi: 10.2337/dc08-1034

294.Yeo Y, Ma SH, Hwang Y, Horn-Ross PL, Hsing A, Lee KE, Park YJ, Park DJ, Yoo KY1, Park SK7. Diabetes mellitus and risk of thyroid cancer: a meta-analysis.PLoS One. 2014 Jun 13;9(6):e98135. doi: 10.1371/journal.pone.0098135. eCollection 2014.

295.Li QI,Xiaoling QI, Hongyan XIONG,2 Qin LIU,4 Jinxin LI,5 Yao ZHANG,2 Xiangyu MA,2 Na WU,2 Qingyun LIU, Liangui FENG1, Type 2 Diabetes Mellitus and Risk of Malignant Melanoma: A Systematic Review and Meta-Analysis of Cohort StudiesIran J Public Health. 2014 Jul; 43(7): 857–866.

296.Mills KT, Bellows CF, Hoffman AE, Kelly TN, Gagliardi G.Diabetes mellitus and colorectal cancer prognosis: a meta-analysis.Dis Colon Rectum. 2013 Nov;56(11):1304-19. doi: 10.1097/DCR.0b013e3182a479f9.

297.Kelly B. Stein, Claire F. Snyder, Bethany B. Barone, Hsin-Chieh Yeh, Kimberly S. Peairs, Rachel L. Derr, Antonio C. Wolff, and Frederick L. Brancati Colorectal Cancer Outcomes, Recurrence, and Complications in Persons With and Without Diabetes Mellitus: A Systematic Review and Meta-AnalysisDig Dis Sci. Author manuscript; available in PMC 2011 May 12.Published in final edited form as:Dig Dis Sci. 2010 Jul; 55(7): 1839–1851.doi: 10.1007/s10620-009-0944-8

298.Bethany B. Barone,Hsin-Chieh Yeh, , Claire F. Snyder, Kimberly S. Peairs, , Kelly B. Stein,,Rachel L. Derr, , Antonio C. Wolff, , and Frederick L. Brancati,Long-term All-Cause Mortality in Cancer Patients With Preexisting Diabetes MellitusA Systematic Review and Meta-analysis; JAMA. Author manuscript; available in PMC 2011 May 12.Published in final edited form as:

JAMA. 2008 Dec 17; 300(23): 2754–2764.;doi: 10.1001/jama.2008.824

299.Wang P, Kang D, Cao W, Wang Y, Liu Z.Diabetes mellitus and risk of hepatocellular carcinoma: a systematic review and meta-analysis.Diabetes Metab Res Rev. 2012 Feb;28(2):109-22. doi: 10.1002/dmrr.1291.

300. Yang WS, Va P, Bray F, Gao S, Gao J, Li HL, Xiang YB. The role of pre-existing diabetes mellitus on hepatocellular carcinoma occurrence and prognosis: a meta-analysis of prospective cohort studies. PLoS One. 2011;6(12):e27326. doi: 10.1371/journal.pone.0027326. Epub 2011 Dec 21.

301. Zhe Dai, Yan-Cheng Xu, and Li NiuObesity and colorectal cancer risk: A meta-analysis of cohort studies. World J Gastroenterol. 2007 Aug 21; 13(31): 4199–4206.; PMCID: PMC4250618

302. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2007 Dec;16(12):2533-47.Obesity and risk of colorectal cancer: a meta-analysis of 31 studies with 70,000 events.Moghaddam AA1, Woodward M, Huxley R.

303. Am J Clin Nutr. 2007 Sep;86(3):556-65.Obesity and colon and rectal cancer risk: a meta-analysis of prospective studies.Larsson SC, Wolk A.

304. Ma Y, Yang Y, Wang F, Zhang P, Shi C, Zou Y, et al. (2013) Obesity and Risk of Colorectal Cancer: A Systematic Review of Prospective Studies. PLoS ONE 8(1): e53916. doi:10.1371/journal.pone.0053916

305. Zg Zhao, Xg Guo, Cx Ba, W Wang, Yy Yang, J Wang And Hy Cao Overweight, Obesity and Thyroid Cancer Risk: a Meta-analysis of Cohort Studies The Journal of International Medical Research 2012; 40: 2041 – 2050

306. Xiaoping Xia1 , Wei Chen , Jiaoyuan Li , Xueqin Chen , Rui Rui , & Peng Yuan Body Mass Index and Risk of Breast Cancer: A Nonlinear Dose-Response Meta-Analysis of Prospective Studies; Scientific Reports 4, Article number: 7480 (2014)

307.D. S. M. Chan, A. R. Vieira, D. Aune, E. V. Bandera, D. C. Greenwood4, A. McTiernan5, D. Navarro Rosenblatt1, I. Thune6,7, R. Vieira8 & T. Norat1 Body mass index and survival in women with breast cancer—systematic literature review and meta-analysis of 82 follow-up studies Annals of Oncology 00: 1–14, 2014 doi:10.1093/annonc/mdu042

308.Lee J, Meyerhardt JA, Giovannucci E, Jeon JY (2015) Association between Body Mass Index and Prognosis of Colorectal Cancer: A Meta-Analysis of Prospective Cohort Studies. PLoS ONE 10(3): e0120706. doi:10.1371/journal.pone.0120706

309. Xiaoyi Zhang, Guiqin Zhou, Bo Sun,Guohua Zhao, Dezhong Liu, Jiage Sun, Chuanhai Liu, Hui Guo.Impact of obesity upon prostate cancer-associated mortality: A meta-analysis of 17 cohort studiesOncol Lett. 2015 Mar; 9(3): 1307–1312.Published online 2014 Dec 31. doi: 10.3892/ol.2014.2841

310. M. Dobbins, K. Decorby, and B. C. K. Choi.The Association between Obesity and Cancer Risk: A Meta-Analysis of Observational Studies from 1985 to 2011ISRN Preventive Medicine;Volume 2013 (2013), Article ID 680536, 16 pages

311. Berrington de Gonzalez A, Sweetland S, Spencer E. Br J Cancer. A meta-analysis of obesity and the risk of pancreatic cancer. Br J Cancer. 2003 Aug 4;89(3):519-23.

312. Kaustav Majumder, Arjun Gupta, Nivedita Arora, Preet Paul Singh Siddharth SinghPremorbid Obesity and Mortality in Patients With Pancreatic Cancer: A Systematic Review and Meta-analysis.Clinical Gastroenterology and Hepatology.Available online 14 October 2015.cited in http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1542356515013415

313. S C Larsson, A Wolk Overweight, obesity and risk of liver cancer: a meta-analysis of cohort studies Br J Cancer. 2007 Oct 8; 97(7): 1005–1008.

314. Jpn J Clin Oncol. 2012 Mar;42(3):212-21. doi: 10.1093/jjco/hyr198. Epub 2012 Jan 12.

Obesity and liver cancer risk: an evaluation based on a systematic review of epidemiologic evidence among the Japanese population.Tanaka K1, Tsuji I, Tamakoshi A, Matsuo K, Ito H, Wakai K, Nagata C, Mizoue T, Sasazuki S, Inoue M, Tsugane S; Research Group for the Development and Evaluation of Cancer Prevention Strategies in Japan.

315. Eur J Cancer. 2009 Nov;45(16):2867-73. doi: 10.1016/j.ejca.2009.04.019. Epub 2009 May 6.Overweight, obesity and gastric cancer risk: results from a meta-analysis of cohort studies.Yang P1, k Y, Chen B, Wan HW, Jia GQ, Bai HL, Wu XT.

316. Br J Cancer. 2007 May 7;96(9):1457-61. Epub 2007 Mar 20.Obesity and the risk of gallbladder cancer: a meta-analysis.Larsson SC1, Wolk A.

317.Int J Cancer. 2008 Mar 15;122(6):1418-21.Overweight and obesity and incidence of leukemia: a meta-analysis of cohort studies.Larsson SC1, Wolk A.

318. Int J Cancer. 2007 Oct 1;121(7):1564-70.Obesity and risk of non-Hodgkin's lymphoma: a meta-analysis.Larsson SC1, Wolk A.

319. Leuk Res. 2012 Jul;36(7):868-75. doi: 10.1016/j.leukres.2011.12.020. Epub 2012 Jan 29.

Obesity but not overweight increases the incidence and mortality of leukemia in adults: a meta-analysis of prospective cohort studies.Castillo JJ1, Reagan JL, Ingham RR, Furman M, Dalia S, Merhi B, Nemr S, Zarrabi A, Mitri J.

320. Diabetes Res Clin Pract. 2010 Sep;89(3):309-19. doi: 10.1016/j.diabres.2010.04.012. Epub 2010 May 20.The magnitude of association between overweight and obesity and the risk of diabetes: a meta-analysis of prospective cohort studies.Abdullah A1, Peeters A, de Courten M, Stoelwinder J.

321.Wallin A, Larsson SC.Eur J Cancer. 2011 Jul;47(11):1606-15. doi: 10.1016/j.ejca.2011.01.020. Epub 2011 Feb 25.Body mass index and risk of multiple myeloma: a meta-analysis of prospective studies.

322. F. Turati I. Tramacere C. La Vecchia& E. Negri.A meta-analysis of body mass index and esophageal and gastric cardia adenocarcinoma.Annals of Oncology 00: 1–9, 2012 doi:10.1093/annonc/mds244

323. Int J Biol Markers. 2014 Mar 24;29(1):e21-9. doi: 10.5301/jbm.5000047.Overweight, obesity and endometrial cancer risk: results from a systematic review and meta-analysis.Zhang Y, Liu H, Yang S, Zhang J, Qian L, Chen X.

324. Int J Cancer. 2013 Mar 1;132(5):1162-9. doi: 10.1002/ijc.27719. Epub 2012 Jul 30.Obesity and incidence of lung cancer: a meta-analysis.Yang Y, Dong J, Sun K, Zhao L, Zhao F, Wang L, Jiao Y.

325. Esposito K, Chiodini P, Colao A, Lenzi A, Giugliano D. Metabolic syndrome and risk of cancer: a systematic review and meta-analysis. Diabetes Care. 2012 Nov;35(11):2402-11. doi: 10.2337/dc12-0336.

326.Tae Young Ryu , Jiyoung Park , Philipp E. Scherer. Hyperglycemia as a Risk Factor for Cancer Progression Diabetes Metab J 2014;38:330-336;12,13

327. Abe R, Yamagishi S. AGE-RAGE system and carcinogenesis. Curr Pharm Des. 2008;14(10):940-5.

328. Juutilainen et al, Type 2 Diabetes as a “Coronary Heart Disease Equivalent”An 18-year prospective population-based study in Finnish subjects Diabetes Care 2005 : 28 ,12 2901-2907

329. L. Sciacca, R. Vigneri, A. Tumminia. Clinical and molecular mechanisms favoring cancer initiation and progression in diabetic patients. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases (2013) 23, 808-815

330. Lavie, Carl J., Richard V. Milani, and Hector O. Ventura. "Obesity and cardiovascular disease: risk factor, paradox, and impact of weight loss."Journal of the American College of Cardiology 53.21 (2009): 1925-1932.

331. K Masur, F Thevenod, KS Zanker.Diabetes and cancer.Epidemiological evidence and Molecular links. Preface 2008

332. Ahn, Jiyoung, et al. "Prediagnostic total and high-density lipoprotein cholesterol and risk of cancer." Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention 18.11 (2009): 2814-2821.

333. 2. Zhao W1, Guan J2, Horswell R3, Li W4, Wang Y3, Wu X5, Hu G6. HDL cholesterol and cancer risk among patients with type 2 diabetes. Diabetes Care. 2014 Dec;37(12):3196-203. doi: 10.2337/dc14-0523. Epub 2014 Sep 11.

334. Kitahara CM1, Berrington de González A, Freedman ND, Huxley R, Mok Y, Jee SH, Samet JM. J Clin Oncol. Total cholesterol and cancer risk in a large prospective study in Korea 2011 Apr 20;29(12):1592-8. doi: 10.1200/JCO.2010.31.5200. Epub 2011 Mar 21.

335. Strohmaier S1, Edlinger M, Manjer J, Stocks T, Bjørge T, Borena W, Häggström C, Engeland A, Nagel G, Almquist M, Selmer R, Tretli S, Concin H, Hallmans G, Jonsson H, Stattin P, Ulmer H. Total serum cholesterol and cancer incidence in the Metabolic syndrome and Cancer Project (Me-Can). PLoS One. 2013;8(1):e54242. doi: 10.1371/journal.pone.0054242. Epub 2013 Jan 23.

336. Iso H, Ikeda A, Inoue M, Sato S, Tsugane S; JPHC Study Group Serum cholesterol levels in relation to the incidence of cancer: the JPHC study cohorts. . Int J Cancer. 2009 Dec 1;125(11):2679-86. doi: 10.1002/ijc.24668.

337. Melvin JC1, Holmberg L, Rohrmann S, Loda M, Van Hemelrijck M. Serum lipid profiles and cancer risk in the context of obesity: four meta-analyses. J Cancer Epidemiol. 2013;2013:823849. doi: 10.1155/2013/823849. Epub 2013 Jan 20.

338. Benn M1, Tybjærg-Hansen A, Stender S, Frikke-Schmidt R, Nordestgaard BG. Low-density lipoprotein cholesterol and the risk of cancer: a mendelian randomization study. J Natl Cancer Inst. 2011 Mar 16;103(6):508-19. doi: 10.1093/jnci/djr008. Epub 2011 Feb 1

339. Liu YuPeng, Zhang YuXue, Li PengFei, Cheng Cheng, Zhao YaShuang, Li DaPeng, Du Chen, Cholesterol Levels in Blood and the Risk of Prostate Cancer: A Meta-analysis of 14 Prospective Studies Cancer Epidemiol Biomarkers Prev; 24(7); 1086–93. ©2015 AACR.

340. Touvier M1, Fassier P1, His M1, Norat T2, Chan DS2, Blacher J1, Hercberg S1, Galan P1, Druesne-Pecollo N1, Latino-Martel P1.Cholesterol and breast cancer risk: a systematic review and meta-analysis of prospective studies. Br J Nutr. 2015 Aug 14;114(3):347-57. doi: 10.1017/S000711451500183X. Epub 2015 Jul 15.

341.Christopher K. Glass, M.D. and Jerrold M. Olefsky, M.D. INFLAMMATION AND LIPID SIGNALING IN THE ETIOLOGY OF INSULIN RESISTANCE. Cell Metab. 2012 May 2; 15(5): 635–645.

342. Liliane Michalik and Walter Wahli PPARs Mediate Lipid Signaling in Inflammation and Cancer. PPAR Research Volume 2008 (2008), Article ID 134059, 15.

343. Stattin P, Björ O, Ferrari P, Lukanova A, Lenner P, Lindahl B, Hallmans G, Kaaks R. Prospective study of hyperglycemia and cancer risk. Diabetes Care. 2007 Mar;30(3):561-7.

344. Chi V. Dang Links between metabolism and cancer Genes & Dev. 2012. 26: 877-890

345. Keshav K. Singh l Leslie C. Costello. Mitochondria and Cancer. Springer 2009: Mitochondria and Cancer 1-23

346. A J Dannenberg, NA Berger Obesity, Inflammation and Cancer.Energy Balance and Cancer 7.Springer Science.New York.2013.Obesity, Inflammation and Insulin Resistance.LG Ellies,A Johnson, J.Olefsky 1-25

347. A J Dannenberg, NA Berger Obesity, Inflammation and Cancer.Energy Balance and Cancer 7.Springer Science+ Bussines Media New York.2013. Inflamasomes and Obesity.Tdeng, jCUi, CJLyon 25-61

348.Schmidt, Frank M., et al. "Inflammatory cytokines in general and central obesity and modulating effects of physical activity." PloS one 10.3 (2015): e0121971.

349. M.G. Kolonin (ed.), Adipose Tissue and Cancer, DOI 10.1007/978-1-4614-7660-3_5, 71 © Springer Science+Business Media New York 2013Adipokines: Soluble Factors from Adipose Tissue Implicated in Cancer Gilberto Paz-Filho , Ameet Kumar

350.Uddin S1, Hussain AR, Siraj AK, Khan OS, Bavi PP, Al-Kuraya KS. Role of leptin and its receptors in the pathogenesis of thyroid cancer. Int J Clin Exp Pathol. 2011;4(7):637-43. Epub 2011 Oct 3.

351.Newman G1, Gonzalez-Perez RR. Leptin-cytokine crosstalk in breast cancer.

Mol Cell Endocrinol. 2014 Jan 25;382(1):570-82. doi: 10.1016/j.mce.2013.03.025. Epub 2013 Apr 4.

352. Gonzalez-Perez RR1, Lanier V, Newman G. Leptin's Pro-Angiogenic Signature in Breast Cancer. Cancers (Basel). 2013 Sep 6;5(3):1140-62. doi: 10.3390/cancers5031140.

353. Guo S1, Gonzalez-Perez RR. Notch, IL-1 and leptin crosstalk outcome (NILCO) is critical for leptin-induced proliferation, migration and VEGF/VEGFR-2 expression in breast cancer. PLoS One. 2011;6(6):e21467. doi: 10.1371/journal.pone.0021467. Epub 2011 Jun 23.

354. Yu Ma,1 Zhiwei Liu,2 Yan Zhang,1 and Bingjian Lu 3Serum leptin, adiponectin and endometrial cancer risk in Chinese womenJ Gynecol Oncol. 2013 Oct; 24(4): 336–341

355. Lili Liu, Lijun Wang Jindan Zheng, Gang TangLeptin promotes human endometrial carcinoma cell proliferation by enhancing aromatase (P450arom) expression and estradiol formation (EJOG) European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology , Volume 170 , Issue 1 , 198 – 201

356. Stolzenberg-Solomon RZ, Newton CC, Silverman DT, Pollak M, Nogueira LM, Weinstein SJ, Albanes D, Männistö S, Jacobs EJ. Circulating Leptin and Risk of Pancreatic Cancer: A Pooled Analysis From 3 Cohorts. Am J Epidemiol. 2015 Aug 1;182(3):187-97. doi: 10.1093/aje/kwv041. Epub 2015 Jun 17.

357. Fan Y1, Gan Y1, Shen Y1,2, Cai X1, Song Y1, Zhao F1, Yao M1, Gu J1, Tu H1Leptin signaling enhances cell invasion and promotes the metastasis of human pancreatic cancer via increasing MMP-13 production. Oncotarget. 2015 Jun 30;6(18):16120-34.

358. Mendonsa AM1, Chalfant MC1, Gorden LD2, VanSaun MN3. Modulation of the leptin receptor mediates tumor growth and migration of pancreatic cancer cells. PLoS One. 2015 Apr 28;10(4):e0126686. doi: 10.1371/journal.pone.0126686. eCollection 2015.

359. Howard JM1, Cathcart MC, Healy L, Beddy P, Muldoon C, Pidgeon GP, Reynolds JV. Leptin and adiponectin receptor expression in oesophageal cancer. Br J Surg. 2014 May;101(6):643-52. doi: 10.1002/bjs.9469. Epub 2014 Mar 24.

360. Duan X1, Tang P1, Zhang H1, Yu Z2. [Expression of leptin and adiponectin in esophageal squamous cell carcinoma and their clinical significanceZhonghua Zhong Liu Za Zhi. 2014 Nov;36(11):839-43.

361. Ioannis Tourkantonis, Maria Kiagia, Evangelia Peponi, Sophia Tsagouli, Konstantinos N. SyrigosThe Role of Leptin in Cancer PathogenesisJournal of Cancer Therapy, 2013, 4, 640-650

362. Duggan C1, Onstad L, Hardikar S, Blount PL, Reid BJ, Vaughan TL. Association between markers of obesity and progression from Barrett's esophagus to esophageal adenocarcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 2013 Aug;11(8):934-43. doi: 10.1016/j.cgh.2013.02.017. Epub 2013 Mar 1.

363. Singh SK1, Grifson JJ, Mavuduru RS, Agarwal MM, Mandal AK, Jha V. Serum leptin: a marker of prostate cancer irrespective of obesity. Cancer Biomark. 2010;7(1):11-5. doi: 10.3233/CBM-2010-0136.

364. Elizabeth L. Brandon, Jian-Wei Gu,* Lauren Cantwell, Zhi He, Gray Wallace, and John E. HallObesity promotes melanoma tumor growth: Role of leptinCancer Biol Ther. Author manuscript; available in PMC 2009 Dec 21.

365. Julie A. Ellerhorst,1 A. Hafeez Diwan,2 Shyam M. Dang,1 Deon G. Uffort,1 Marilyn K. Johnson,1 Carolyn P. Cooke,1 andElizabeth A. Grimm1Promotion of Melanoma Growth by the Metabolic Hormone LeptinOncol Rep. Author manuscript; available in PMC 2011 Aug 18.

366. Fatemehsadat Amjadi,1 Shaghaygh Haghjooy Javanmard, 1 Hamid Zarkesh-Esfahani,2 Majid Khazaei,3 and Manijeh Narimani1Leptin promotes melanoma tumor growth in mice related to increasing circulating endothelial progenitor cells numbers and plasma NO productionJ Exp Clin Cancer Res. 2011; 30(1): 21.

367. Skibola CF1, Holly EA, Forrest MS, Hubbard A, Bracci PM, Skibola DR, Hegedus C, Smith MT. Body mass index, leptin and leptin receptor polymorphisms, and non-hodgkin lymphoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004 May;13(5):779-86.

368. Lin HY1, Shi H, Li CY, Chen QC, Huang TB, Liu PC, Lou LM. LEP and LEPR polymorphisms in non-Hodgkin lymphoma risk: a systematic review and pooled analysis. J BUON. 2015 Jan-Feb;20(1):261-8.

369. Vaghef N., Abroun S., Kaviani Saeid, Ali Moghadam K., Rostami Sh., Sadeghi Bhareh, Saki N.A.D.,Khamisipour Gh.R. The Role Of Leptin In Pathophysiology Of Myeloma Cells. Cell Journal (Yakhteh) Fall 2010 , Volume 12 , Number 3 (47); Page(s) 319 To 328.

370. Valerio Gristina, Maria Grazia Cupri, Martina Torchio, Diabetes and cancer: A critical appraisal of the pathogenetic and therapeutic links (Review) Biomedical Reports 3: 131-136, 2015

371. Mihaela Aldea , Lucian Crăciun, Tiberiu Popescu Iuliana Nenu , Carmen Crivii Confounding Factors Of The Diabetes – Metformin – Cancer Relationship Rom J Diabetes Nutr Metab Dis.21(3):239-246;2014.doi: 10.2478/rjdnmd-2014-0029

372. Diana Hatoum1 and Eileen M. McGowanRecent Advances in the Use of Metformin: Can Treating Diabetes Prevent Breast Cancer? BioMed Research International Volume 2015 (2015), Article ID 548436, 13 pages

373.. Diana Hatoum, Eileen M. McGowanRecent Advances in the Use of Metformin: Can Treating Diabetes Prevent Breast Cancer? BioMed Research International Volume 2015 (2015), Article ID 548436, 13 pages

http://dx.doi.org/10.1155/2015/548436

374. U.S. National Institutes of Health 2015. ClinicalTrials.gov;Accesat la https://clinicaltrials.gov/ct2in 15.12.2015.

375. Taxiarchis V. Kourelis, Robert D. Siegel.Metformin and cancer: new applications for an old drug Med Oncol. 2012 Jun;29(2):1314-27. doi: 10.1007/s12032-011-9846-7. Epub 2011 Feb 8.

376. Bin Bao,Asfar S. Azmi,Shadan Ali ,Feras Zaiem,Fazlul H. Sarkar.Metformin may function as anti-cancer agent via targeting cancer stem cells: the potential biological significance of tumorassociated miRNAs in breast and pancreatic cancers.Ann Transl Med 2014;2(6):59

377. Wu Y, Zhang D, Kang S. Physical activity and risk of breast cancer: a meta-analysis of prospective studies. Breast Cancer Res Treat. 2013 Feb;137(3):869-82. doi: 10.1007/s10549-012-2396-7. Epub 2012

378. Lahart IM, Metsios GS, Nevill AM, Carmichael AR. Physical activity, risk of death and recurrence in breast cancer survivors: A systematic review and meta-analysis of epidemiological studies. Acta Oncol. 2015 May;54(5):635-54. doi: 10.3109/0284186X.2014.998275. Epub 2015 Mar 9.

379. Sun JY, Shi L, Gao XD, Xu SF. Physical activity and risk of lung cancer: a meta-analysis of prospective cohort studies. Asian Pac J Cancer Prev. 2012;13(7):3143-7.

380. Wolin KY1, Yan Y, Colditz GA, Lee IM. Physical activity and colon cancer prevention: a meta-analysis. Br J Cancer. 2009 Feb 24;100(4):611-6. doi: 10.1038/sj.bjc.6604917. Epub 2009 Feb 10.

381. Schmid D, Behrens G, Keimling M, Jochem C, Ricci C, Leitzmann M. A systematic review and meta-analysis of physical activity and endometrial cancer risk. Eur J Epidemiol. 2015 May;30(5):397-412. doi: 10.1007/s10654-015-0017-6. Epub 2015 Mar 24.

382. Farris MS, Mosli MH2, McFadden AA, Friedenreich CM, Brenner DR The Association between Leisure Time Physical Activity and Pancreatic Cancer Risk in Adults: A Systematic Review and Meta-analysis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2015 Oct;24(10):1462-73. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-15-0301. Epub 2015 Jul 14.

383. McTierman. Physical Activity, Dietary Calorie Restriction, and Cancer. Volume 3 of the series Energy Balance and Cancer pp 143-163. Andrew Rundle.Mechanisms Underlying the Effects of Physical Activity on Cancer.2011

384. Bloom, D.E., Cafiero, E.T., Jané-Llopis, E., Abrahams-Gessel, S., Bloom, L.R., Fathima, S., Feigl, A.B., Gaziano, T., Mowafi, M., Pandya, A., Prettner, K., Rosenberg, L., Seligman, B., Stein, A.Z., & Weinstein, C. (2011). The Global Economic Burden of Noncommunicable Diseases. Geneva: World Economic Forum.

385. World Development Indicators database, World Bank,2011.Accesat la https://siteresources.worldbank.org/ in 16.12.2015.

386. World Health Organization Classification of Tumours. International Agency for Research on Cancer (IARC). Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System. Stanley R. Hamilton Lauri A. Aaltonen.2000. ; Hamilton S.R., Aaltonen L.A. (Eds.): World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System. IARC Press: Lyon 2000. Chapter 6. Tumours of the colon and rectum;104.

387. 1.Finlay A Macrae, Johanna Bendell, Clinical presentation, diagnosis, and staging of colorectal cancer.Wolters Kluwer.2015. Accesat in 19.12.2015 la [http://www.uptodate.com/]

388.European Association for the Study of Diabetes (EASD).Type 1 diabetes and cancer. Diapedia, 2014. [http://www.diapedia.org/associated-disorders/type-1-diabetes-and-cancer#fn:2]

389.Shu X, Ji J, Li X, Sundquist J, Sundquist K, Hemminki K. Cancer risk among patients hospitalized for Type 1 diabetes mellitus: a population-based cohort study in SwedenDiabet Med., 2010. 227(7):791-7.

390. Popescu-Vâlceanu HC, Radulian G, Bratu M si colab . Colorectal cancer and diabetes – a real link? Medicina Interna:12 (5):31-45, 2015.

391. Popescu-Vâlceanu H C, Radulian G, Bratu M si colab. Romanian Journal of Diabetes Nutrition and Metabolic Diseases: 22(2):115-123, 2015.

392. World Health Organization.International Agency for Research on Cancer (IARC). Globocan 2012. Estimated cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2012. Lyon, France. [Cited in 22.01.2015] Available from: http://globocan.iarc.fr/ Pages/fact_sheets_cancer.aspx and http://globocan.iarc.fr/ Pages/fact_sheets_population.aspx

393. Andrea DeCensi.Matteo Puntoni, Pamela Goodwin, Massimiliano Cazzaniga, Alessandra Gennari,Bernardo Bonanni, and Sara Gandini Metformin and Cancer Risk in Diabetic Patients: A Systematic Review and Meta-analysis, Cancer Prev Res; 3(11) November 2010 (1451-1461)

394. Yehuda Handelsman, Derek LeRoith, Zachary T. Bloomgarden, Samuel Dagogo-Jack et al., AACE/ACE Consensus Statement Diabetes And Cancer— An Aace/Ace Consensus Statement Diabetes and Cancer, Endocr Pract. 2013;19(No. 4) 675-692

395. Roberts DL1, Dive C, Renehan AG. Biological Mechanisms Linking Obesity and Cancer Risk: New Perspectives Annu Rev Med. 2010;61:301-16. doi: 10.1146/annurev.med.080708.082713.

-21 de ref

396.Alba-Loureiro TC, Munhoz CD, Martins JO, Cerchiaro GA, Scavone C, Curi R, Sannomiya P. et al Neutrophil function and metabolism in individuals with diabetes mellitus. Braz J Med Biol Res. 2007 Aug;40(8):1037-44.

397. Aneire E. Khan, Valentina Gallo, Jakob Linseisen et al Diabetes And The Risk Of Non-Hodgkin’s Lymphoma And Multiple Myeloma In The European Prospective Investigation Into Cancer And Nutrition Haematologica June 2008 93: 842-850; Doi:10.3324/haematol.12297

398. World Health Organization. Type 2 diabetes. . Fact sheet N°312. 2015 [Cited in 18.01.2015] Available from: http://www.who.int/mediacentre/ factsheets/fs311/en/

399. Khandekar MJ, Cohen P, Spiegelman BM. Molecular mechanisms of cancer development in obesity. Nat Rev Cancer 11: 886–895, 2011.

400.Sanket Joshi, Menghan Liu, and Nigel Turner, “Diabetes and Its Link with Cancer: Providing the Fuel and Spark to Launch an Aggressive Growth Regime,” BioMed Research International, vol. 2015, Article ID 390863, 11 pages, 2015.

401. Noto H, Goto A, Tsujimoto T, Noda M. Cancer risk in diabetic patients treated with metformin: a systematic review and meta-analysis. PLoS ONE 7: e33411, 2012.

402. Meng Wang, Ru-Ying Hu, Hai-Bin Wu et al Cancer risk among patients with type 2 diabetes mellitus: a population-based prospective study in China. Sci Rep: 5: 11503, 2015.

403. Tsilidis Konstantinos K, Kasimis John C, Lopez David S, Ntzani Evangelia E, Ioannidis John P A. Type 2 diabetes and cancer: umbrella review of meta-analyses of observational studies BMJ: 350 :g7607, 2015.

404. Mota M, Popa SG, Mota E si colab Prevalence of diabetes mellitus and prediabetes in the adult Romanian population: PREDATORR study. J Diabetes. 2015 Apr 7. doi: 10.1111/1753-0407.12297

405. Popescu-Valceanu HC, Radulian G , Dragut R si colab. Pancreatic cancer: epidemiology and risk factors Proc. Rom. Acad., Series B: 17(2):117–124, 2015.

406. Suresh T. C, Cynthia L. Leibson, Kari G. Rabe, Lawrence J. Timmons, Jeanine Ransom, Mariza de Andrade, Gloria M. Petersen, Pancreatic Cancer-associated Diabetes Mellitus: Prevalence and Temporal Association with Diagnosis of Cancer Gastroenterology 134, 95–101,2008.

407. Suresh T. C , C L. Leibson, K G. Rabe, J Ransom, M de Andrade,G M. Petersen. Probability of pancreatic cancer following diabetes: A Population-Based Study Gastroenterology 129, August 504–511,2005.

408. Pannala R, Leirness JB, Bamlet WR, Basu A, Petersen GM, Chari ST. Prevalence and clinical profile of pancreatic cancer-associated diabetes mellitus. Gastroenterology. 134(4):981-7, 2008.

409.Li F, Lai M .Colorectal cancer, one entity or three. J Zhejiang Univ Sci B: 10(3):219-229, 2009.

410. Lonneke V. van de Poll-Franse, Saskia Houterman , Maryska L.G. Janssen-Heijnen , Marcus W. Dercksen , Jan Willem W. Coebergh and Harm R. Haak. Less aggressive treatment and worse overall survival in cancer patients with diabetes: A large population based analysis.Int. J. Cancer: 120, 1986–1992, 2007.

411. International Diabetes Federation. The global burden. IDF Diabetes Atlas, 6th edn., 2013, Brussels, Belgium. Accesat in 07.11.2015 la [ttps://www.idf.org/sites/default/files/EN_6E_Atlas_Full_0.pdf]

412. Jennefer Lindsay, Mauro Degli Esposti, Andrew P. Gilmore. Bcl-2 proteins and mitochondria—Specificity in membrane targeting for death Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell ResearchVol 1813, 4, April 2011, Pages 532–539 .

413. Jayne Loughery, David Meek Switching on p53: an essential role for protein phosphorylation? Biodiscovery8.1 (2013)

414. Anna Yemelyanova1, Russell Vang1,2, Malti Kshirsagar1,5, Dan Lu1, Morgan A Marks4, Ie Ming Shih1,2,3 and Robert J Kurman1,2,3 Immunohistochemical staining patterns of p53 can serve as a surrogate marker for TP53 mutations in ovarian carcinoma: an immunohistochemical and nucleotide sequencing analysis Modern Pathology (2011) 24, 1248–1253

415.Anupma Nayak, Angela Mercy Ralte, Mehar Chand Sharma, Varinder Paul Singh, Ashok Kumar Mahapatra, Veer Singh Mehta, Chitra Sarkar p53 protein alterations in adult astrocytic tumors and oligodendrogliomas Neurology India, Vol. 52, No. 2, April-June, 2004, pp. 228-232

416. Ute M. Moll,Oleksi Petrenko, The MDM2-p53 Interaction Molecular Cancer Research Vol. 1, 1001–1008, December 2003

417. Anna Yemelyanova1, Russell Vang1,2, Malti Kshirsagar1,5, Dan Lu1, Morgan A Marks4, Ie Ming Shih1,2,3 and Robert J Kurman1,2,3 Immunohistochemical staining patterns of p53 can serve as a surrogate marker for TP53 mutations in ovarian carcinoma: an immunohistochemical and nucleotide sequencing analysis Modern Pathology (2011) 24, 1248–1253

418. Flamini et al Prognostic significance of cytoplasmatic p53 overexpression in colorectal cancer. An immunohistochemical Analysis Europ. J. Cancer, 32 A:802-806 (1996)

419.Flohil et al, Expression of bcl-2 protein in hyperplastic polyps, adenomas,and carcinomas of the colon, J Pathol., 178:393-397 (1996)

420.Zhao et al, Prognostic significance of bcl-2 and p53 expression in colorectal carcinoma . J Zhejiang Univ SCIENCE B 6(12):1163-1169 (2005)

421. Hoshino A, Ariyoshi M, Okawa Y, Kaimoto S, Uchihashi M, Fukai K, Iwai-Kanai E, Ikeda K, Ueyama T, Ogata T, Matoba S. Inhibition of p53 preserves Parkin-mediated mitophagy and pancreatic β-cell function in diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Feb 25;111(8):3116-21. doi: 10.1073/pnas.1318951111. Epub 2014 Feb 10.

422. Bernat Soria, Benoit R Gauthier Dual Trade of Bcl-2 and Bcl-xL in Islet Physiology Diabetes January 2013 vol. 62 no. 1 18-21

423. Intisar Salim Pity , Sardar Hassan Arif , Djwar Ali Hadji . Angiogenesis, p53 and Bcl2 in Colorectal Carcinoma International Journal of Advancements in Research & Technology, Volume 2, Issue 3, March 2013 ISSN 2278-7763

424.Hunaldo Lima de Menezes; Mário Jorge Jucá; Edmundo Guilherme de A. Gomes; Benício L. Bulhões B. P. Nunes; Analysis of the immunohistochemical expressions of p53, bcl-2 and Ki-67 in colorectal adenocarcinoma and their correlations with the prognostic factors Arq. Gastroenterol. vol.47 no.2 São Paulo Apr./June 2010

425.J. Watson, A. J. Merritt, L. S. Jones, J. N. Askew, E. Anderson, A. Becciolini, M. Balzi, C. S. Potten, and J. A. Hickman Evidence of reciprocity of bcl-2 and p53 expression in human colorectal adenomas and carcinomas. Br J Cancer. 1996 Apr; 73(8): 889–895.

426.A.C. Goussial, E. loachiml, N.J. Agnantisl, M. Maheral and E.V. Bcl-2 expression in colorectal tumours. Correlation with p53, mdm-2, Rb proteins and proliferation indices. Histol Histopathol (2000) 15: 667-672.

427. Manne U, Myers RB, Moron C, Poczatek RB, Dillard S, Weiss H, Brown D, Srivastava S, Grizzle WE. Prognostic significance of Bcl-2 expression and p53 nuclear accumulation in colorectal adenocarcinoma. Int J Cancer. 1997 Jun 20;74(3):346-58.

428. Bosari, S., Viale, G., Bossi, P., Maggioni, M., Coggi, G., Murray, J.J. And Lee, A.K.C., Cytoplasmic accumulation of p53 protein: an independent prognostic indicator in colorectal adenocarcinomas. J. nat. Cancer Inst., 86, 681–687 (1994).

429. Zeng, Z.H., Sarkis, A.S., Zhang, Z.-F., Klimstra, D.S., Chamytonowicz, E., Guillem, J.G., Cordon-Cardo, C. And Cohen, A.M., p53 nuclear overexpression: an independent predictor of survival in lymph node– positive colorectal cancer patients. J. clin. Oncol., 12, 2043–2050 (1994)

430. BARETTON, G.B., DIEBOLD, J., CHRISTOFORIS, G., VOGT, M., MULLER, C., DOPFER, K., SCHNEIDERBANGER, K., SCHMIDT, M. and LOHRS, U., Apoptosis and immunohistochemical bcl-2 expression in colorectal adenomas and carcinomas. Cancer, 77, 255–264 (1996).

431. Dan-ping Zhao, Xiao-wen Ding, Jia-ping Peng, Yi-xiong Zheng, and Su-zhan Zhang†Prognostic significance of bcl-2 and p53 expression in colorectal carcinoma J Zhejiang Univ Sci B. 2005 Dec; 6(12): 1163–1169.

432. Erin M. Siegel, PhD, MPH, Cornelia M. Ulrich, PhD, Elizabeth M. Poole, PhD, Rebecca S. Holmes, MD, MPH, Paul B. Jacobsen, PhD, and David Shibata, MD The Effects of Obesity and Obesity-Related Conditions on Colorectal Cancer Prognosis ;Cancer Control January 2010, Vol. 17, No. 1; 52-57;2010

433.Abdullah, Asnawi, et al. "The magnitude of association between overweight and obesity and the risk of diabetes: a meta-analysis of prospective cohort studies." Diabetes research and clinical practice 89.3 (2010): 309-319.

434.Krishnan Bhaskaran, Ian Douglas, Harriet Forbes, Isabel dos-Santos-Silva, David A Leon, Liam Smeeth Body-mass index and risk of 22 specifi c cancers: a population-based cohort study of 5·24 million UK adults Lancet 2014; 384: 755–65

435. .Daniel A. Garcı´a-Este´ vez, David Arau´ jo-Vilar, A´ ngeles Saavedra-Gonza´lez, Gloria Fiestras-Janeiro, and Jose´ Cabezas-Cerrato Analysis of the Relationship Between Body Mass Index, Insulin Resistance, and Beta-Cell Function: A Cross-Sectional Study Using the Minimal Model METABOLISM 53(11):1462-6 · NOVEMBER 2004

436. Michael L Ganz, Neil Wintfeld, Qian Li, Veronica Alas, Jakob Langer and Mette Hammer2* The association of body mass index with the risk of type 2 diabetes: a case–control study nested in an electronic health records system in the United States Diabetology & Metabolic Syndrome 2014, 6:50  doi:10.1186/1758-5996-6-50

437.Kolonin MG Adipose Tissue and Cancer. Chapter 1: Nikki A Ford, J DiGiovanni, SD Hursting Metabolic perturbations associated with adipose tissue dysfunction and obesity related cancer. Editura Springer. New York 2013, pagina 1-15.

438. . Ivana Vucenik, Joseph P Stains Obesity and cancer risk: evidence, mechanisms, and recommendations Ann N Y Acad Sci. 2012 Oct; 1271(1): 37–43.

439. Shao Chin Lee, Juliana CN Chan2 Evidence for DNA Damage as a Biological Link Between Diabetes and Cancer Chinese Medical Journal 2015;vol 128, issue 11:page 1543-1548

440. Zhaohui Feng, Haiyan Zhang, Arnold J. Levine, Shengkan Jin. The coordinate regulation of the p53 and mTOR pathways in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 7; 102(23): 8204–8209.

441. Arnold J. Levine Zhaohui Feng, Tak W. Mak, Han You, and Shengkan Jin2,4;Coordination and communication between the p53 and IGF-1–AKT–TOR signal transduction pathways Genes & Development 20:267–275, 2006.

442. Narayana Kilarkaje, Maie M. Al-Bader, Diabetes-Induced Oxidative DNA Damage Alters p53-p21CIP1/Waf1 Signaling in the Rat Testis Reprod Sci. 2015 Jan;22(1):102-12.

443. Wanxing Duan,1 Xin Shen,2 Jianjun Lei,1 Qinhong Xu,1 Yongtian Yu,1 Rong Li,1 Erxi Wu,3 and Qingyong Ma1 Hyperglycemia, a Neglected Factor during Cancer Progression Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International Volume 2014, Article ID 461917, 10 pages

444.Gang Song a, Gaoliang Ouyang a, Shideng Bao The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival J. Cell. Mol. Med. Vol 9, No 1, 2005 pp. 59-71

445.Noa Rivlin, Ran Brosh, Moshe Oren, and Varda Rotter Mutations in the p53 Tumor Suppressor Gene Important Milestones at the Various Steps of Tumorigenesis Genes Cancer. 2011 Apr; 2(4): 466–474.

446. Wan Mui Chan, Wai Yi Siu, Anita Lau, and Randy Y. C. Poon How Many Mutant p53 Molecules Are Needed To Inactivate a Tetramer?Molecular And Cellular Biology, Apr. 2004, p. 3536–3551

447.Eleftherios Vairaktaris1, Giorgos Kalokerinos1,Lambros Goutzanis, Sofia Spyridonidou, Stavros Vassiliou1,Spyridoula Derka, Emeka Nkenke4, Christos Yapijakis, Antonis Vylliotis, Andreas Lazaris And Efstratios Patsouris. Diabetes Alters Expression of p53 and c-myc in Different Stages of Oral Oncogenesis ANTICANCER RESEARCH 27: 1465-1474 (2007)

448.Vairaktaris E, Kalokerinos G, Goutzanis L, Yapijakis C, Derka S, Vassiliou S, Spyridonidou S, Vylliotis A, Nkenke E, Lazaris A, Patsouris E.Diabetes enhances cell proliferation but not Bax/Bcl-2-mediated apoptosis during oral oncogenesis Int J Oral Maxillofac Surg. 2008 Jan;37(1):60-5. Epub 2007 Sep 6.

449. Dong-Sub Jung, Sun Ha Lee, Seung-Jae Kwak , Jin Ji Li,, Do Hee Kim, Bo-Young Nam , Hye Young Kang , Tae Ik Chang , Jung Tak Park , Seung Hyeok Han , Tae-Hyun Yoo, Shin-Wook Kang Apoptosis occurs differentially according to glomerular size in diabetic kidney disease Nephrol Dial Transplant (2012) 27: 259–266 .

450. Timothy S. Kern,Yunpeng Du, Casey M. Miller, Denise A. Hatala, Leonard A. Levin Overexpression of Bcl-2 in Vascular Endothelium Inhibits the Microvascular Lesions of Diabetic Retinopathy The American Journal of Pathology, Vol. 176, No. 5, May 2010.

451. Pearl Lee, Karen H Vousdenand, Eric C Cheung TIGAR, TIGAR, burning bright Lee et al. Cancer & Metabolism 2014, 2:1

452. Molchadsky A, Ezra O, Amendola PG, Krantz D, Kogan-Sakin I, Buganim Y, Rivlin N, si colab. p53 is required for brown adipogenic differentiation and has a protective role against diet-induced obesity. Cell Death Differ. 2013 May;20(5):774-83. doi: 10.1038/cdd.2013.9. Epub 2013 Feb 15.

453. Alessia Garufi, Gabriella D’Orazi. High glucose dephosphorylates serine 46 and inhibits p53 apoptotic activity. Garufi and D’Orazi Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 2014, 33:79

454. Pan D, Marcato P, Ahn D-G, Gujar S, Pan L-Z, et al. (2013) Activation of p53 by Chemotherapeutic Agents Enhances Reovirus Oncolysis. PLoS ONE 8(1): e54006. doi:10.1371/journal.pone.0054006

455. Zhen Wang, Yi Sun. Targeting p53 for Novel Anticancer Therapy Transl Oncol. 2010 Feb; 3(1): 1–12.

456. Ching-Wen Huang, Li-Chu Sun, Ying-Ling Shih, Hsiang-Lin Tsai Chao-Wen Chen, Yung-Sung Yeh, Cheng-Jen Ma, Che-Jen Huang and Jaw-Yuan The impact on clinical outcome of high prevalence of diabetes mellitus in Taiwanese patients with colorectal cancer; Huang et al. World Journal of Surgical Oncology 2012, 10:76

457. Chen Chuang-Qi, Fang Le-Kun, Cai Shi-Rong, Ma Jin-Ping, Yang Guang-Xin, Yang Wan, Zhan Wen-Hua And He Yu-Long Effects of diabetes mellitus on prognosis of the patients with colorectal cancer undergoing resection: a cohort study with 945 patients Chin Med J 2010;123(21):3084-3088

458.Jeffrey A. Meyerhardt, Paul J. Catalano, Daniel G. Haller, Robert J. Mayer, John S. Macdonald, Al B. Benson III, and Charles S. Fuchs Impact of Diabetes Mellitus on Outcomes in Patients With Colon Cancer J Clin Oncol 21:433-440, 2003.

459. Zweibaum A, Pinto M, Chevalier G, Dussaulx E, Triadou N, Lacroix B, Haffen K, Brun JL, Rousset M. Enterocytic differentiation of a subpopulation of the human colon tumor cell line HT-29 selected for growth in sugar-free medium and its inhibition by glucose. J Cell Physiol. 1985 Jan;122(1):21-9.

460. M Pollak Investigating Metformin for Cancer Prevention and Treatment: The End of the Beginning Michael Cancer Discov; 2(9); 778–90, AACR.

461. Aljada A, Mousa SA. Metformin and neoplasia: implications and indications. Pharmacol Ther. 2012 Jan;133(1):108-15. doi: 10.1016/j.pharmthera.2011.09.004. Epub 2011 Sep 6.

462. Petrushev B, Tomuleasa C, Soritau O, Aldea M, Pop T, Susman S, Kacso G, Berindan I, Irimie A, Cristea V. Metformin plus PIAF combination chemotherapy for hepatocellular carcinomaExp Oncol. 2012;34(1):17-24.

463.Yanfei Zhang,Meiping Guan, Zongji Zheng, Qian Zhang, Fang Gao, and Yaoming Xue Effects of Metformin on CD133+ Colorectal Cancer Cells in Diabetic Patients PLoS One. 2013; 8(11): e81264.

464. Amlan Das, Archana De, Gargi Maity, Snigdha Banerjee, Sushanta Banerjee.The anti-diabetic drug metformin perturbs proliferation and cellular differentiation of pancreatic cancer cells: a key mechanism of its anticancer activity (784.6) The FASEB Journalvol. 28 no. 1 Supplement784.6;2014

465. Jang WG, Kim EJ, Bae IH, Lee KN, Kim YD, Kim DK, Kim SH, Lee CH, Franceschi RT, Choi HS, Koh JT.Metformin induces osteoblast differentiation via orphan nuclear receptor SHP-mediated transactivation of Runx2. Bone. 2011 Apr 1;48(4):885-93. doi: 10.1016/j.bone.2010.12.003. Epub 2010 Dec 13.

466. Ying Gao, Jing Xue, Xiaoyu Li,Yongqian Jia, Jing Hu.Metformin regulates osteoblast and adipocyte differentiation of rat mesenchymal stem cells Journal of Pharmacy and Pharmacology Volume 60, Issue 12, pages 1695–1700, December 2008.

467. Youn Hee Cho, Bong Min Ko, Shin Hee Kim, Yu Sik Myung, Jong Hyo Choi, Jae Pil Han, Su Jin Hong, Seong Ran Jeon1 , Hyun Gun Kim1 , Jin Oh Kim1 , Moon Sung Lee; Does Metformin Affect The Incidence of Colonic Polyps and Adenomas in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus? Intest Res 2014;12(2):139-145

468. Kim Yh, Noh R, Cho Sy, Park Sj, Jeon Sm, Shin Hd, Kim Sb, Shin Je Inhibitory Effect Of Metformin Therapy On The Incidence Of Colorectal Advanced Adenomas In Patients With Diabetes. Intest Res. 2015 Apr;13(2):145-52. Doi: 10.5217/Ir.2015.13.2.145. Epub 2015 Apr 27.

469. Zhang ZJ, Zheng ZJ, Kan H, Song Y, Cui W, Zhao G, Kip KE.Reduced risk of colorectal cancer with metformin therapy in patients with type 2 diabetes: a meta-analysis. Diabetes Care. 2011 Oct;34(10):2323-8. doi: 10.2337/dc11-0512.

470. Ronald Boellaard & Roberto Delgado-Bolton & Wim J. G. Oyen. FDG PET/CT: EANM procedure guidelines for tumour imaging: version 2.0. Eur J Nucl Med Mol Imaging (2015) 42:328–354

471. Landis K. Griffeth Use Of Pet/Ct scanning in cancer patients: technical and practical consideration.Bumc Proceedings 2005;18:321–330

472.Djulbegovic B, Soares HP, et al. Recommendations on the use of F-18-FDG PET in oncology. J Nucl Med. 2008;49(3): 480–508.

473.Agrawal A, Rangarajan V. Appropriateness criteria of FDG PET/CT in oncology.The Indian Journal of Radiology & Imaging. 2015;25(2):88-101. doi:10.4103/0971-3026.155823

474.V. Rusu, Cipriana Ștefănescu PET și PET-CT: Principiu fizic și aplicații medicale.Jurnalul de Chirurgie, Iasi, 2007, Vol. 3, Nr. 2;92-101

475.Otto Warburg,Franz Wind, and Erwin NegeleinJ „The metabolism of tumors in the body”Gen Physiol 1927 8:519-530. Published March 7, 1927, doi:10.1085/jgp.8.6.519

476.Masur, K. (Witten) (eds): Diabetes and Cancer. Front Diabetes. Basel, Karger, 2008, vol 19, pp 134-144 (DOI:10.1159/000152030)

477.Dakubo, Gabriel D :Mithocondrial genetics and cancer.The Warburg Phenomenon and Other Metabolic Alterations of Cancer Cell, vol XV, Springer, 2010, pp:39-66.

478.Sabire Yılmaz, Meftune Özhan, Sait Sager,1Duygu Yörük Atik, Metin Halac,Kerim Sönmezoğlu Metformin-Induced Intense Bowel Uptake Observed on Restaging FDG PET/CT Study in a Patient with Gastric LymphomaMol Imaging Radionucl Ther. 2011 Dec; 20(3): 114–116.

479.Arash Eftekhari, David Manders, Tina Alden, Withholding metformin prior to 18F-FDG positron emission tomography (PET) oncology studies J Nucl Med May 2013 vol. 54no. supplement 2 550 (abstract)

480. Metformin may be associated with false-negative cancer detection in the gastrointestinal tract on PET/CT.Steenkamp DW1, McDonnell ME2, Meibom S3. Endocr Pract. 2014 Oct;20(10): 1079-83.

481.Gutman F, Alberini JL, Wartski M, et al. Incidental colonic focal lesions detected by FDG PET/CT. AJR Am J Roentgenol. 2005 Aug;185(2):495-500; Yasuda S, Hirofumi F, Nakahara T, et al. 18F-FDG PET in detection of colonic adenomas. J Nucl Med 2001;42:989–992

482. Reid B AdamsThomas A. Aloia , Evelyne Loyer et al.Selection for hepatic resection of colorectal liver metastases:expert consensus statement. HPB 2013 Feb;15(2):91-103

483.Denecke T, .Rau B, Hoffmann KT, et al. Comparison of CT, MRI and FDG-PET in response predication of patients .with locally advanced rectal cancer after multimodal preoperative therapy. Eur Radiol 2005;15:1658–1666]

484.Gade M, Kubik M, Fisker RV, Thorlacius-Ussing O, Petersen LJ. Diagnostic value of 18F-FDG PET/CT as first choice in the detection of recurrent colorectal cancer due to rising CEA. Cancer Imaging. 2015;15(1):11.

485.Yu-YU Lu, Jin-Hua Chen,, Chun-Ru Chien et al, Use of FDG PET-CT to detect recurrent colorectal cancer in patients with elevated CEA: a systematic review and meta-analysis, Int J Colorectal Dis (2013);28:1039-47.,

486 .Lu YY, Chen JH, Chien CR, Chen WT, Tsai SC, Lin WY, Kao CH.Use of FDG PET-CT to detect recurrent colorectal cancer in patients with elevated CEA: a systematic review and meta-analysis, Int J Colorectal Dis (2013);28:1039-47

487. Bamba Y, Itabashi M, Kameoka S. Value of PET/CT imaging for diagnosing pulmonary metastasis of colorectal cancer.Hepatogastroenterology. 2011 Nov-Dec;58(112):1972-4.

488.Consumers Union of United States Inc.USA New York.2015. The surprising dangers of CT scans and X-rays.Accesat in 03.12.2015 la [http://www.consumerreports.org/cro/magazine/2015/01/the-surprising-dangers-of-ct-sans-and-x-rays/index.htm]

489.Cosma, C., & Jurcut, T. (1996). Radonul si mediul inconjurator. Ed. Dacia capitolul 4 pag 72 Radonul

490. World Nuclear Association, registered in England.Wales.2015.Nuclear Radiation and Health Effects. Accesat in 04.12.2015 la [http://www.world-nuclear.org/information-library/safety-and-security/radiation-and-health/nuclear-radiation-and-health-effects.aspx].