Aspecte Comparative ale Structurii Si Dinamicii Populatiilor de Microorganisme din Diferite Tipuri de Ape

[NUME_REDACTAT]. 2.1 Micrococcus radiodurans Fig. 2.2 Thermococcus gammatolerans Sursă: [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT]. 2.3 mucegaiurile Fig. 2.4 drojdiile

Sursă: [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT]. 2.5 [NUME_REDACTAT]. 2.6 [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT]. 2.7 Aspergillus fumigatus

Sursă: [NUME_REDACTAT]. 2.8: Reprezentarea schematică a procesului de nutritie

Sursă: [NUME_REDACTAT]. 2.9 – Dezvoltarea cianobacteriilor în funcție de reacția mediului (pH) și de temperatură

Fig. 2.9 Salinitatea apelor de suprafață Fig. 2.10 Escherichia coli

Sursă: [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT]. 2.11 [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT] 3.1 Schema bloc a fluxului de tratare a apei din sursa de adâncime
1- captare din puț de adâncime, 2-bloc de aerare, 3-filtre rapide cu nisip, 4-sistemul de dezinfecție (clor gazos, dioxid de clor)

Sursă: [NUME_REDACTAT] 3.2 Schema bloc de tratare convențională a apei din surse de suprafață
1-priza de captare, 2-sistemul de admisie a apei, 3-blocul de injecție a reactivilor de tratare,4-gospodaria de reactivi, 5-tanc de reacție, 6-decantoare, 7-filtre cu cărbune activat,  8-filtre cu nisip, 9-sisteme de tratare specială a apei (osmoza inversă, dedurizare, oxigenare, deferizare), 10- stația de clorare (dozare clor, generare și dozare dioxid de clor), 11-rezervorul de apă potabilă.

Sursă: [NUME_REDACTAT]. 3.3 Determinarea numarului total de germeni

Fig. 3.4 Determinarea bacteriilor coliforme

Tabelul 2.1

Principalele tipuri de metabolism bacterian, în funcție de natura surselor de C, de energie și a donatorului de H

Tabelul 2.2

Longevitatea unor spori și forme vegetative și condițiile în care pot supraviețui

[NUME_REDACTAT], C., Virusologie medicală, [NUME_REDACTAT], București, 1996.

Dobrea, M., Microbiologie generală, practicum, [NUME_REDACTAT], București, 2002.

Răducănescu, H., Bica-Popii, V., Bacteriologie veterinară, [NUME_REDACTAT], București, 1986

Răducănescu, H., Bica-Popii, V., Bacteriologie veterinară aplicată, 1974, [NUME_REDACTAT], București, 1986.

Șerban, M., Biochimie animală, Curs, LITO.IANB București, 1984.

Șerban, M., Biochimie animală, Lucrări practice, LITO.IANB, 1983, București.

Tamaș, V., Biochimie animală, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1975.

http://www.apafiltrata.ro/problemele-apei/bacterii-in-apa

http://ro.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli

UNIVERSITATEA “ VALAHIA “ DIN TÂRGOVIȘTE, DEPARTAMENTUL INGINERIA MEDIULUI, SPECIALIZAREA INGINERIA SI PROTECȚIA MEDIULUI ÎN AGRICULTURĂ

LUCRARE DE LICENȚĂ

Candidat: [NUME_REDACTAT] – [NUME_REDACTAT]: Conf.univ. [NUME_REDACTAT]

2014

"Aspecte comparative ale structurii și dinamicii populațiilor de microorganisme din diferite tipuri de ape"

Capitolul I. Introducere

M

ICROBIOLOGIA (micros-mic, bios-viata, logos-vorbire) este știința care studiază forma, structura (morfologia), genetica, procesele metabolice din organismele microscopice și submicroscopice.

Microbiologia este o știință relativ tânără, care prezintă interes nu numai

științific, ci și practic, pentru diferite domenii ale activității umane: medicina,

agricultura, alimentația, biotehnologia, etc.

Fiind ea insăși o știință ce s-a putut dezvolta ca urmare a dezvoltării tehnice și tehnologice, microbiologia a luat amploare abia în ultimele decenii ale acestui secol. Acumulările teoretice și practice din domeniile fizicii nucleare, ale biologiei celulare si moleculare, ale tehnicilor informaționale, au condus la îmbunătățirea logisticii microbiologiei și, implicit, la dezvoltarea rapidă a microbiologiei ca știintă de mare amplitudine.

În unele ramuri industriale, microbiologia formează totalitatea proceselor tehnologice. Se pot exemplifica astfel industriile fermentative și a antibioticelor, stațiile de epurare a dejectiilor, ș.a., domenii în care cunoașterea fiziologiei și a metabolismului microorganismelor permite dirijarea corectă a proceselor tehnologice în vederea obținerii unor produse utile vieții și activității umane, de calitate superioară și cu randamente ridicate.

Principalele ramuri subordonate ale microbiologiei, cu statut aparte și având preocupări specifice, sunt:

bacteriologia – se ocupă cu studiul bacteriilor;

micologia – se ocupă cu studiul ciupercilor microscopice și macroscopice;

protozoologia – se ocupă cu studiul protozoarelor;

virologia – se ocupă cu studiul virusurilor;

parazitologia – se ocupă cu studiul parazitismului și organismelor parazite;

algologia – se ocupă cu studiul organismelor acvatice simple, numite alge.

La aceste discipline microbiologice trebuie adăugate și domeniile aplicative ale microbiologiei:

imunologia – studiază sistemul mecanismelor de apărare al organismelor, care le protejează față de o eventuală infecție și/sau de orice substanță străină care patrunde în interiorul lor.

microbiologia sănătății publice și epidemiologice – are ca scop monitorizarea și controlul răspândirii bolilor în comunități;

microbiologia alimentelor și a apei – examinează rolul pozitiv sau negativ al microorganismelor în alimente și apă;

microbiologia agricolă – studiază relația dintre microorganisme și recolte, în scopul creșterii producției și calității acestora;

microbiologia petrolului – studiază rolul microorganismelor în geneza zăcămintelor de petrol;

microbiologia mediului – studiază microorganismele prezente în sol, apă și aer, ocupându-se de soluționarea problemelor practice din domeniul sanitar;

biotehnologia – include orice proces prin care oamenii utilizează microorganisme sau procese biologice pentru obținerea unui produs dorit;

microbiologia industrială – utilizează microorganisme pentru a produce cantitați mari de produși utili ca: vitamine, aminoacizi, enzime, medicamente;

ingineria genetică – implică tehnici care în mod deliberat modifică fondul genetic al organismelor pentru a induce obținerea de noi combinații genice. Reprezintă cel mai dinamic domeniu al microbiologiei moderne.

Microbiologia medicală umană și veterinară și a patologiei plantelor-relațiile microorganismelor patogene – organisme gazdă, supraviețuirea și condițiile transmiterii în natură, influența factorilor de mediu, mecanismele moleculare de acțiune împotriva lor și reacția gazdelor față de agresiune.

Desprinderea microbiologiei în ramuri diferite: Microbiologia solului, Microbiologia acvatică, Geomicrobiologie, Microbiologia medicala – fiecare cu tehnici speciale, concepte și terminologii proprii-determină un caracter autonom al acestor domenii interconectate două tipuri de demersuri:

autecologic=relația dintr-un microorganism (individ) și gazda sa (mediul său);

sinecologic= relațiile dintre microorganisme (comunitate biologică) și un anumit mediu:

Microbiologia mediului (Jannasch, 1984) – studiu integrat al relațiilor biologice dintr-un habitat comun și interacțiunile ce apar cu alte organisme și mediul înconjurător.

În prezent microbiologia ecosistemelor naturale (sol, apă, aer) se extinde și asupra zonelor expuse activităților perturbatoare umane (agricultura intensă, poluarea apelor, etc).

Particularități ale domeniului:

biodiversitate imensă

imposibilitatea reproducerii în laborator

caracterul interdisciplinar

tehnici și aparatură

explorarea unor medii extreme

implicarea societății umane

Rolul microorganismelor în funcționarea ecosistemelor are o importanță esențială-3 nivele diferite

Activitate la nivel individual

Activitate la nivel de ecosistem

Activitate la nivel global

Capitolul II. Studii privind structura și dinamica diferitelor populații de microorganisme

2.1 Factorii de mediu și activitatea microorganismelor

Factorii de mediu (ecologici) sunt factori abiotici care influențează dezvoltarea, activitatea fiziologică și înmulțirea microorganismelor.

Cunoașterea relației microorganism – factori de mediu conferă oportunitate în dirijarea activității lor fiziologice → activități dorite/stoparea activității lor.

Fiecare factor de mediu declanșează un răspuns specific reprezentat grafic printr-o valoare optimă, o valoare minimă și una maximă.

Clasificarea factorilor de mediu:

factori fizici: temperatura, umiditatea, radiațiile, presiunea atmosferică

factori chimici: pH, potențialul de oxidoreducere, efectul față de substanțele chimice

Temperatura – microorganismele au exigențe diferite cuprinse între 10 și 105oC.

Tipuri de microorganisme:

psihrofile (criofile, frigofile) – au un conținut ridicat în lipide, capsula de natură poliglucidică (colonii mucilaginoase) mobile, pot prezenta pigmenți, biotopul este constituit din sol, ape reci și aer. Ex. bacterii – (Pseudomonas, Achrobacter, Aerobacter, Alcaligenes )+ fungi – (Candida, Rhodotorula, Cladosporium, Penicillum (fig. 2.6), Geotrichum).

mezofile, sunt numeroase, în sol, apă, sunt macroorganisme homeotrofe, conduc la putrefacție și sunt patogene.

termofile, au un metabolism foarte rapid, modificări structurale la proteine și enzime termostabile, în structura lor sunt prezente complexe termostabile (poliamide) formate din acizi nucleici cu procent ridicat în citozină, timină, Mg, Ca. Biotopul este constituit din izvoare termale, gunoi de grajd, sol (bacteriile Streptomyces thermophille, B. sthearothermophyllus, Cl. nigricans; fungi Candida tropicalis, Aspergillus fumigatus (fig. 2.7)).

Umiditatea- cea din sol are cea mai mare importanță, umiditatea redusă determină dezvoltarea mare a actinomicetelor și fungilor; inhibă dezvoltarea microorganismelor (bacterii foarte sensibile – celulozolitice, nitrificatoare, fixatoare de azot). Seceta mare determină dezvoltarea redusă a microorganismelor, favorizând apariția formelor de rezistență (chiști/spori) ex. actinomicetele – genuri eliminate; ex. Rhizobium, beijerinkia.

Radiațiile – influența lor este corelată cu lungimea de undă.

→radiațiile ionizante, alfa, beta, gamma au fluxuri de electroni rapide, radicali liberi în funcție de doza de iradiere, au efecte letale, mutagene, de adaptare.

→radiațiile gamma au putere mare de penetrare, sunt utilizate în sterilizarea la rece.

Prezența oxigenului micșorează rezistența microorganismelor la iradiere

tratamentele termice micșorează rezistența microorganismelor la iradiere;

bacteriile sunt mai sensibile decât fungii;

bacteriile Gram+ sunt mai rezistente decât cele Gram- speciilea cele mai rezistente: Micrococcus radiodurans (fig. 2.1) și Thermococcus gammatolerans (fig. 2.2).

→ radiațiile X – putere de penetrare mică, sterilizarea aerului.

→ radiațiile UV – lungimea de undă = 136-4000Å, efectul antimicrobian maxim = 254nm întrucât distrug structura bicatenară a ADN – penetrație mică în apă – 1cm – utilizate la sterilizarea apei potabile și a aerului.

→ radiațiile luminoase – lungimea de undă mai mare de 4000Å – efect pozitiv la fototrofe și negativ la chimiotrofe.

→ultrasunetele au efect distructiv la mai mult de 16000Hz prin erupția structurii celulare – sterilizarea lichidelor și obținerea produșilor intracelulari (enzime, toxine, proteine).

Presiunea hidrostatică este relevantă în mediul marin populat cu microorganisme barofile denitrificatoare, prin care nitrații sunt reduși în nitriți în condiții de anaerobioză.

Presiunea osmotică influențează microorganismele în funcție de cantitatea de substanță dizolvată în mediul celular și mediul de cultură.

Tipuri de microorganisme:

normale, cale care adoptă presiuni osmotice reduse

osmofile, adoptă presiuni osmotice ridicate (concentrații mari în glucide, ex. bacteriile 15-40%, mucegaiurile (fig.2.3) și drojdiile 70% (fig.2.4).

halofile, adoptă presiuni osmotice ridicate (concentrații mari de sare, ex. Micrococcus (fig.2.5), Diplococcus, Sarcina, Bacillus; bacterii nitrificatoare, denitrficatoare, protolitice, sulfobacterii în mări și oceane);

osmotolerante, acceptă în general presiuni osmotice ridicate.

Microorganismele au dezvoltare optimă la presiune osmotică intracelulară egală cu presiunea osmotică a mediului. Mucegaiurile au sensibilitate mare, excepție făcând Aspergillus și Penicillum.

Fenomenul de adsorbție este influențat de natura chimică a substanțelor (legături ionice, forțe van der Waals) proprietățile unor celule ale microorganismelor (încărcarea electrică, sinteza de substanțe gumoase).

argilele, au suprafețe absorbante ideale prin rugozitatea particulelor foarte mici și prezența cationilor. De natura cationilor depinde calitatea microorganismelor. Ex. Azotobacter se absoarbe foarte bine în soluri saturate în Fe3+ și Al3+.

Efectele absorbției: modificarea pH-ului, scăderea vitezei de difuzie a ionilor, concentrarea substanțelor nutritive (organice, biologic-active, toxine, antibiotice, vitamine).

2.2 Microflora apei

În ceea ce privește acest mediu vital vieții, sursele de microorganismele sunt prezente aici direct proporțional cu conținutul în substanțe organice și anorganice din apă.

Densitatea și numărul microorganismelor în funcție de proveniența sursei de apă pot fi descrise astfel:

Apă freatică – teoretic pură (sterilă) întrucât microorganismele sunt absente;

Apă de izvor – poate să conțină până la 20 microorganisme/cm3 ca urmare a însămânțării prin contactul direct cu straturile superficiale ale solului și atmosferei;

Apă de râu – în acest tip de apă se află o microfloră permanentă și o alta accidentală provenită din cadavre și dejecții; microorganismele patogene din această apă se reduc numeric prin diluție progresivă în funcție de debitul acestor râuri, de asemenea scad progresiv și din cauza rezistenței diminuate față de acești noi factori de mediu diferiți de cei naturali ai gazdei purtătoare parazitată (temperatură, resurse nutritive, exigențe respiratorii)), concurență cu microorganismele autohtone, consumul de către bacteriofagi și protozoare sau efectul bactericid al ultravioletelor, cu alte cuvinte apele de acest tip oferă condiții vitrege microrganismelor alohtone (străine), precipiatțiile abundente conferind posibilități remarcabile privind creșterea numerică a microorganismelor din apa de râu;

Apa lacurilor – asigură ca urmare a turbidități reduse stratificarea orizontală și verticală a microorganismelor, existând un număr mai mare de micorcelule la malul acesora, în sedimente, la temperaturi ridicate, aceste ape fiind mai cuarte din punct de vedere microbiologic decât cea de râu, reprezentată sute de milioane microorganisme/g;

Apa mărilor și oceanelor – este reprezentată de microorganisme adaptate la presiuni osmotice și hidrostatice ridicate pentru a degrada materia organică, repartiția acestora fiind realizată pe verticală, abundența lor fiind maximă până la adâncimi de 75 cm, reprezentate de bacterii halofile și criofile, [NUME_REDACTAT] reprezentă o excepția în această privință, întrucât densitatea și numărul maxim de microorganisme este întâlnit la adâncimea de 180-200 m adâncime, în zona cu hidrogen sulfurat în concentrații mari, aici fiind prezente bacteriii sulfuroase, sulfatreducătoare sau reducătoare;

Apa de ploaie – în special, în regiunile poluate urbane este o sursă importantă de microorganisme spre deosebire de zonele nelocuite;

Apa fecaloid-menajeră – este o apă cu un conținut foarte mare în microorganisme (1012 microorganisme/cm3) multe din specii fiind enterobacterii de tip coli.

Tipurile de microorganisme din apă sunt reprezentate de bacterii aerobe, facultativ anaerobe și strict anaerobe. Așa de exemplu, sunt prezente microorganismele acvatice cromogene (Sarcina aurantiaca, Sarcina lutea, Chromobacterium violaceum, Pseudomonas fluorescens).

De asemenea, întâlnim microorganisme organotrofe saprofite cu rol proteolitic, amonificator, nitrificator, denitrificator, fixatoare de azot și sulfobacterii.

Bacteriile patogene sunt și ele uneori prezente, fiind surse primare de îmbolnăvire pentru oameni și animale cu germeni din genul Salmonella (S. typhi – febra tifoidă), Shigella (dizenteria), Corynebacterium (difteria), etc.

Eschericia coli este o bacterie cu un rol aparte, de indicator microbiologic al calității apei.

Importanța microorganismelor din apă este reflectată de mai multe aspecte, astfel:

Procesul de autopurificare a apei care constă în degradarea substanțelor organice adsorbite de diferite particule în suspensie sau sedimentate în mâl ajunse acolo prin poluare chimică sunt degradate de microorganisme prin procese de putrefacție și mineralizare în substanțe mai simple. Aceste substanțe servesc la rândul lor de hrană altor microorganisme (biomasă), autopurificarea realizându-se în două faze:

Faza de reducere este prima din faze cronologic vorbind, fază în care sunt active procesele anaerobe;

Faza de oxidare este faza în care sunt activate procesele aerobe, au loc oxidări intense, substratul organic scade cantitativ, în același ritm reducându-se și multiplicarea microbiană realizându-se autopurificare a apei, preces definitivat de acțiunea bacteriofagilor. Acest proces este utilizat cu succes în fluxul tehnologic al stațiilor de epurare.

Productivitatea ecosistemelor acvatice este un important parametru în mediile acvatice, microorganisme fiind o importantă sursă de hrană pentru protozoare și metazoare, consumatori de ordinul I, care constituie la rândul lor hrană pentru alte categorii de cunsumatori.

Procesul de mineralizare constă în transformarea în elemente biogene a unor elemente chimice aflate sub formă de sedimente de fier și zăcăminte de petrol.

Importanță igienică privind potabilitatea apei prin aprecierea calității apei pe baza următorilor indici bacteriologici:

NTG reprezintă numărul total de germeni, fiind o metodă folosită la determinarea bacteriilor mezofile și organotrofe, acestea fiind cuprinse în intervalul 10-10000 microorganisme/cm3;

Numărul bacteriilor coliforme reflectă prezența bacteriilor de origine intestinală, E. coli fiind bacteria cea mai monitorizată dintre acestea datorită rezistenței mari în apă prin două tipuride teste:

IC (indexul colic) care reprezintă numărul probabil de coliformi/l apă, de exemplu apa potabilă are valori între 3-10/l apă;

TC (titrul coli) reprezintă cantitatea cea mai mică de apă în care se admite prezența E.coli, acesta fiind egal cu 300cm3 la o apă cu IC=3.

Poluarea microbiologică a apei.

Procesul de poluarea microbiologică a apei este realizat de două tipuri de poluanți, astfel:

Poluanții primari sunt microorganisme de origine terestră sau aeriană deversate în diferite ape de suprafață, contribuind la impurificarea lor, așa cum se întâmplă cu unele bacterii de tip intestinal, virusuri și drojdii patogene.

Poluanți secundari sunt microorganisme autohtone obișnuite care contribuie la impurificare apelor prin proliferări intense, modificând caracterele organoleptice ale acestora (gust, miros, culoare). Aceste microorganisme sunt reprezentate de:

Bacterii saprofite acvatice – foarte utile pentru că degradează substanțele organice poluante, așa de exemplu, ferobacteriile dezvoltate pe substraturi dure sau macrofite, care pot determina și coroziunea biologică a conductelor; sulfobacteriile din apele sulfuroase capabile să corodeze metalele, lemnul, ceramica, cauciucul, asfaltul; bacteriile mucilaginoase prezente în mâlul organic sub formă de agregate de filamente, capabile să colmateze filtrele și să obtureze conductele.

Fungii sunt microorganisme prezenți în ape cu substanțe organice în cantitate mare, putând afecta și chiar distruge plantele acvatice, branhiile peștilor și chiar fauna bentonică, determinând mirosul și gustul neplăcut al apei, iar pe de altă parte diseminându-se prin sporii care traversează filtrele din rețeaua de apă potabilă.

2.3 Succesiunile ecologice în natură

Fenomenele de succesiune a microorganismelor au fost descrise într-o serie de medii dintre cele mai diferite (sistemul digestiv al mamiferelor nou născute, rumenul rumegătoarelor, izvoare, lacuri, ape reziduale, compost, litiera de foioase și de conifer, sol).

Unele au fost descrise înainte de cristalizarea conceptelor fundamentale ale Ecologiei microorganismelor. Între acestea, un caz tipic este reprezantat de succesiunea inițială de bacteriile și fungi proteolitici, care produc prin activitatea lor metabolică . Acesta este preluat de bacteriile nitrificatoare (nitrit- și nitrat-bacterii), care produc nitrat capabil să inducă înflorirea algelor.

Succesiunile pot fi:

[NUME_REDACTAT]

Succesiunea autotrofă

Succesiunea microorganismelor autotrofe are o importanță ecologică deosebită, deoarece asigură colonizarea mediilor naturale nefertile, lipsite de materie organică. Ea este caracteristică comunitaților-pionier nefertile, care pot coloniza rocile vulcanice nude, recent expuse la suprafața solului.

Inițierea succesiunii condiționată de prezenta energiei solare este realizată de microorganismele fototrofe (cianobacterii și unele alge), cu exigențe nutriționale minime și o mare toleranță la condiții de mediu nefavorabile. Capacitatea unor cianobacterii de a fixa azotul molecular atmosferic este un factor favorizant major. În fazele inițiale ale succesiunilor autotrofe, activitatea fotosintetizanta (P) depășește viteza de respirație (R) a comunității de microorganisme. Raportul fotosinteză/respirație (P/R) este mai mare decât 1, ceea ce face ca în mediile respective să se acumuleze biomasa microbiană. Pe masură ce succesiunea evoluează spre stadiul de comunitate stabilă, raportul P/R se apropie de 1. Un rol important în succesiune revine asocierii simbiotice cianobacterii/fungi sau alge/fungi sub forma lichenilor.

Succesiunea heterotrofă

Are drept caracteristică scăderea în timp a fluxului de energie prin sistem. Dacă aportul de materie organică de la exterior este insuficient, comunitatea de microorganisme își disipează propria energie chimică stocată și succesiunea heterotrofă este, in consecință, temporară: când energia disponibilă în sistem este epuizată comunitatea de microorganisme este expusă dispariției.

Succesiunile heterotrofe temporare sunt caracteristice comunitaților de microorganisme implicate în procese de descompunere. Comunitățile de microorganisme implicate în degradarea unei buturugi dispar în momentul în care este complet descompusă. În cazurile în care comunitatea heterotrofă este aprovizionată continuu cu materie organică de la exterior, succesiunea evoluează spre o comunitate stabilă, respectiv spre stadiul de comunitate-climax. Așa este cazul microbiotei ruminale a rumegătoarelor sau al celei intestinale de la celelalte mamifere, care persistă atât cât timp aportul de hrană este regulat. În momentul în care animalele înceteaza să se hrănească apar perturbări în structura și densitatea microbiotei, care evoluează rapid spre dispariție.

[NUME_REDACTAT] si Bartha (1987), microorganismele-pionier ale unei succesiuni heterotrofe trebuie să dispună de o activitate metabolică ridicată și de viteze mari de creștere pentru a se putea opune invadatorilor secundari.

Succesiunea microorganismelor pe particulele detritee în mediile acvatice

Detritusul vegetal proaspăt prezent sub formă de țesuturi vegetale (rădăcini, tulpini, frunze) marunțite și amestecate cu cantități mici de resturi de altă natură sunt, de regulă, asociate cu comunități complexe de microorganisme.

Pentru a studia evoluția succesiunilor la nivelul lor, Fenchel si Jorgensen (1977) au urmărit, prin microscopie electronică în scanning, apariția diferitelor categorii de microorganisme pe suprafața particulelor detritice sterilizate, submerse în apa de mare sau în apa dulce și inoculate cu o cantitate mică de detritus natural. Bacteriile apar primele, dupa 6-8 ore, ca microorganisme-pionier. Ele se multiplică, atîngând densitatea maximă , după 15-150 de ore, dupa care scad numeric până la o limită de stabilitate, după 200 de ore. După aproximativ 20 de ore apar o serie de zooflagelate mici, care ating densitatea maximă după 200-300 de ore. Tardiv apar și alte grupuri de microorganisme (în special diatomee și rizopode). Final, această succesiune duce la apariția unei comunități de microorganisme foarte asemănătoare celei prezente pe detritusul natural, în care protozoarele acționează ca prădători primari, utilizând ca hrană celulele bacteriene. Este probabil ca temperatura și alți factori de mediu afectează evoluția în timp a succesiunii.

Esențial este faptul că prin această acțiune, pornind de la descompunerea unor polimeri săraci în N, proprii țesuturilor vegetale, se ajunge la înlocuirea lor cu biomasa microbiană (protozoare, bacterii) bogată în N, importantă pentru nitriția nevertebratelor și vertebratelor detritivore.

Colonizarea suprafețelor solide submerse în apele marine a fost studiată și de Roszak și Calwell (1987). Ei au demonstrat că primii colonizatori sunt reprezantați de minibacterii, respectiv de formele adaptate să supraviețuiască la marea varietate de factori fizici și chimici departe de condițiile normale de creștere. Ele ajung la suprafața obiectelor submerse într-o fază de latență, în așa fel încât intrarea în diviziune are loc dupa o fază, uneori prelungită, de lag. Ulterior, sunt înlocuite de bacterii normale, care cresc activ, probabil proprii lor descendenți care declanșează intrarea în acțiune a succesiunii.

Succesiunile consecutive poluarii organice a râurilor

Acestea au fost studiate de Hynes (1960), care a descris modificările fizice, chimice și biologice produse de deversarea unui efluent cu mare încarcătură organică. Aceste efecte se atenuează progresiv, datorită fenomenelor de autoepurare și de diluție, în așa fel încât la o anumită distanță în aval de sistusul de impurificare atât condițiile fizico-chimice, cât și cele biologice revin la normal.

Kendrick și Burges (1962) au studiat succesiunea microfungilor pe suprafața acelor de pin din litiera pădurilor. Este probabil că, în paralel, există și o succesiune a populațiilor bacteriene, care interacționează cu cele fungice și influențează evoluția acestora.

Succesiuni asociate cu formarea solurilor structurate

Numeroase date certe demonstrează implicarea directă a diferite grupuri de microorganisme în formarea solurilor, pornind de la unele medii infertile (roci dezgolite, subsoluri erodate, suprafețe deșertice), cu concentrații scăzute de nutrienți anorganici, în absența aproape completă a substanțelor organice și, adesea, în prezența unor condiții ostile de mediu (absența umidității, condiții extreme de temperatură).

Etapele acestui proces complex și îndelungat sunt descrise după cum urmează:

Microorganismele-pionier sunt reprezentate de cianobacterii și de unele alge tolerante. Ele includ specii de: Gloeocapsa, Gloeocystis, Nostoc (N. ellipsosporum, N. muscorum), Scytonema (în special, S. hafmanii), Palmogloea protuberans, Porphyrosiphon notarisii, P. cinnamomens, Schizothrix calciola, Zygogomium ericetorum). Prezența capacității de fixare a de către unele cianobacterii, precum și a capsulei și a învelișului extern mucilaginos, la majoritatea microorganismelor citate, reprezintă avantaje majore din punct de vedere ecologic.

Multiplicarea lor are drept consecință acumularea de materie organică la care se adaugă particule de praf, formând o peliculă inițială ce este stabilizată, în special, de speciile care produc polizaharide extracelulare.

2.4 Nutriția și creșterea microorganismelor în mediile naturale

Ca orice alte organisme vii, microorganismele au nevoie pentru creștere și multiplicare, ca și pentru manifestarea activității lor biologice de prezența în mediul înconjurător a unor substanțe nutritive, care să conțină elementele chimice necesare pentru analiza constituenților celulari, pentru activitatea enzimelor și sistemelor de transport, și, pe de altă parte, să le furnizeze substanțele necesare pentru producerea de energie biologică utilizabilă. Din cauza heterogenității mediilor naturale sub raport populațional și al nutrienților prezenți, precum și datorită dificultății de a pune la punct tehnici fiabile de identificare și dozare a diferitelor substanțe prezente în jurul celulelor microbiene, cunoștințele referitoare la procesele de nutriție în natură sunt foarte limitate.

Unele elemente biogene sunt necesare în concentrații mari (M). Sunt deci macroelemente. Cele mai imortante sunt: C, O, H, N, S, P, K, Mg, Ca și Fe. Dintre acestea, C, O, H, N, S si P formează 95 % din greutatea celulară uscată a bacteriilor și reprezintă bioelemente majore ale biomasei microorganismelor în general.

Bioelemente minore (micronutrienții și microelementele) sunt necesare în cantități extrem de mici. Ele includ elemente ca: Zn, Mn, Na, Cl, Se, Co, Cu, W, Ni și Mo. Unele (Zn, Mn) sunt necesare pentru toate microorganismele, în timp ce altele (Se, Mo, Co, Cu, W), numai pentru activități speciale.

În funcție de tipul de matabolism al microorganismelor, bioelementele sunt folosite fie ca atare, fie cel mai frecvent, sub formă a diferite combinații. Ele se pot prezenta sub trei forme:

Substanțele anorganice sunt prezente sub formă de:

gaze: , , , CO, , , ;

cationi: , , ;

anioni: fosfat carbonat, bicarbonat, sulfat, nitrit, nitrat, clorat, bromat, fluorat, silicat.

Substanțele organice prezintă o gamă largă de diversitate și de complexitate chimică.Unele sunt ușor accesibile, altele rezistente sau chiar recalcitrante la metabolizarea lor de către microorganisme. Natura lor este frecvent corelată cu dezvoltarea anumitor populații de microorganisme. cu activități metabolice specifice. Unele microorganisme (copitrofe) au nevoie de materie organică în cantitate mai mare în mediu, în timp ce altele (oligotrofe) se dezvoltă numai la concentrații foarte mici. Cele mai multe substanțe organice au valoare de nutrient, însa unele pot exercita efecte inhibitoare sau chiar toxice (alcooli, fenoli, acizi carboxilici, compuși organoclorurați, hidrocarburi, antibiotice)

Factorii de creștere, respectiv substanțele de tipul vitaminelor microbiene (biotina, tiamina, riboflavina, acid folic, acid pantotenic, acid nicotinic, unii aminoacizi) sunt necesari tuturor microorganismelor. Diferențele decurg din faptul că unele sunt capabile sa-i obțină prin activitatea proprie, de biosinteză, în timp ce altele (mutantele auxotrofe) trebuie să-i preia ca atare din habitat sau de la alte organisme (microorganisme, plante, animale).

Macronutrienții sunt utilizați ca precusori sau ca materiale de construcție în sinteza macromoleculelor celulare. Micronutrienții sunt folosiți, adeseori cu un grad mare de selectivitate, nevoile care sunt diferite între specii. De aceea, frecvent, ei influențeaza prezența sau absența microorganismelor într-un habitat.

Tipurile de nutriție a microorganismelor

În raport cu natura sursei de carbon, microorganismele sunt grupate în doua categorii majore:

Autotrofe, care folosesc ca sursă unică sau principală de C celular

Heterotrofe (organotrofe), care folosesc ca sursă de C pentru biosinteze și producere de energie substanțele organice.

Acești termeni sunt folosiți în mod curent, deși practica a demonstrat că marea varietate a modalităților de nutriție proprii microorganismelor nu poate fi exprimată numai în funcție de natura sursei de C. De aceea, au fost adăugate criterii suplimentare ca natura sursei de energie, natura substanțelor folosite ca donatori sau acceptori de H sau electroni.

În funcție de modul de obținere a energiei, microorganismele aparțin, de asemenea, la două categorii distincte:

Fototrofe (fotosintetizante), care folosesc energia radiantă luminoasă

Chemosintetizante, care obțin energia prin reacții chimice.

Ca și în cazul nurtrienților, în orice ecosistem natural, energia poate varia uneori foarte mult, în așa fel încat microorganismele iși ajusteaza automat rata reacțiilor anabolice ( consumatoare de energie), diminuând sinteza diferiților polimeri celulari și realizând sinteza echilibrată constituenților la o rată submaximală sau punând în acțiune mecanisme enzimatice alternative pentru compensarea deficitului. Astfel, la microorganismele aerobe și facultativ anaerobe heterotrofe, limitarea cantității de disponibil este urmată de sinteza de terminal cu mare afinitate pentru și de enzime ce furnizează aceeptori de electroni alternativi. La fototrofe, deficitul de lumină induce derepresia sintezei de pigmenți de antenă.

Reglarea este mai complicată și mai puțin cunoscută în cazul excesului de energie în mediu. El antrenează modularea vitezei de producere pentru a fi în cocncordanță cu necesitățile creșterii sau intrarea în acțiune a unor mecanisme care determină disiparea excesului de energie.

Microorganismele chemoheterotrofe sunt dependente de compuși organici ca sursă de C și energie. Ele pot fi clasificate după natura sursei organice ca:

Saprotrofe – obțin compușii organici din mediul înconjurător;

Simbitrofe – preiau compușii organici direct de la alt organism și trăiesc într-un contact permanent;

Biotrofe – sunt capabile să obțină substanțele organice din celulele vii ale gazdei simbiotice;

Necrotrofe – obțin compușii organici din celulele moarte ale gazdei simbiotice.

În funcție de modul în care obțin substanțele necesare ca sursă de nutrienți și de energie pentru biosinteze, microorganismele chemoheterotrofe formează doua grupe distincte:

Microorganismele osmotrofe (bacterii, microfungi, microalge), care preiau substanțele dizolvate din mediu prin transfer prin membranele celulare “moleculă cu moleculă” sau “ion cu ion”;

Microorganismele fagotrofe, care înglobează substanțe particuate, pe care le digeră înainte de a utiliza produșii de digestie. Microorganismele fagotrofe sunt adaptate mai degrabă să acționeze ca prădători ai osmotrofelor decât concureze cu ele. Osmotrofele concurează între ele pentru nutrienții solubili, iar fagotrofele fac același lucru pentru constituenții particulați.

Clasificarea ecologică a microorganismelor chemoheterotrofe, în funcție de particularitățile de nutriție și de gradul de dependență de alte organisme:

Saprofite obligate libere – reprezentate de microorganisme heterotrofe libere, lipsite de capacitatea de simbioză mutualistă sau parazitară;

Facultativ necrotrofe, grup heterogen, format din microorganisme cu potențial simbiotic, normal libere, cu nutriție saprotrofă, dar care pot adopta o existență parazitară, în cursul căreia prezintă o nutriție necrotrofă;

Necrotrofe obligate. Considerat ca formă extremă a tipului de nutriție precedent, acest tip de nutriție include paraziții specializați, a căror existență liberă este limitată la supraviețuirea în țesutul mort al gazdei infectate;

Obligate biotrofe – reprezintă forma extremă a grupului precedent. Include microorganisme simbiote mutualiste sau parazitare, lipsite de capacitatea de existență liberă în altă formă decât ca spori sau chiști.

Procesul de nutriție (fig. 2.8)

2.5 Factorii care limitează creșterea populațiilor de microorganisme în natură

Mărimea populațiilor de microorganisme rezultate din creștere și multiplicare depinde, pe de o parte, de natura și structura lor genetica și, pe de altă parte, de condițiile de mediu. Pe baza studiilor de laborator și a observațiilor în natură au fost incriminați mai mulți factori ca:

densitatea excesivă;

epuizarea unui nutrient esențial;

producerea de substanțe toxice;

variațiile dincolo de anumite limite ale unor factori de mediu (pH, iluminare, temperatură);

competiția intra- și mai ales interspecifică.

Rolul desnității excesive printr-o multiplicare ce creează aglomerare fizică în mediu, cosiderat inițial ca important prin analogie cu unele situații din ecologia plantelor și animalelor, este considerat în prezent ca minor. Dovada o constituie dezvoltarea bacteriilor în colonii pe medii solidificate, în care densitatea și “îngramadirea” depășesc cu mult densitățile observate în mediile lichide.

În schimb, epuizarea nutrienților sau a altor factori limitanți au în mod cert o importanță deosebita. Experimental, acest rol a fost demonstrat de Freter si Ozawa (1963), care au arătat că dezvoltarea E. coli, cultivată în saci de dializă, este limitată de epuizarea unui nutrient în condiții de anaerobioza sau de oxigen în condiții de aerobioza.

Pe baza acestui gen de observații, limitatea nutrițională este folosită în biotehnologie, în cazul culturilor în chemostat pentru a controla viteza de creștere și densitatea populațiilor de microorganisme.

Rolul factorilor toxici este cunoscut din numeroase exemple. Astfel, în cursul fermentațiilor lactice, bacteriile producătoare înceteaza să se multiplice când concentrația acidului lactic atinge 1,5-1,7 g/l. Multiplicarea lor continuă dacă se ajustează condițiile de pH prin neutralizare sau dacă se utilizează medii cu mare putere-tampon. Un fenomen similar se observa și în cazul vinificației și al fermentației berii în care atingerea unei anumite concentrații limită de alcool determină stoparea creșterii și a multiplicării levurilor.

În sfârșit, un rol esențial în controlul și limitarea densității populațiilor de microorganisme revine diferitelor tipuri de interacțiuni competitive și, în primul rând, celor de prădare și parazitism.

Figura 2.9 evidențiază rolul limitant al acidității mediului și al temperaturilor mai ridicate asupra distribuției cianobacteriilor în mediile acvatice.

2.6 [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT]

În anumite medii acvatice (mări și oceane), presiunea hidrostatică înregistrează mari diferențe de valoare între straturile superficiale și cele profunde sau abisale. În general, se apreciază că, în medie, presiunea hidrostatică crește linear cu adâncimea, cu 1 atm la fiecare 10 m adâncime. La adâncimi foarte mari (cota de adâncime de 10.860 m), presiunea hidrostatică este practic mai mare (Morita, 1976) decât este indicat de regulă de compresiunea de către straturile de apă superioare. Presiunea hidrostatică afectează echilibrul chimic al mediului și are ca urmare scăderea valorilor de pH ale apei marine, datorită modificării solubilității nutrienților, ca, de exemplu, a .

Deși microorganimele rezistă frecvent la presiuni hidrostatice mai ridicate, presiunile foarte mari pot avea pentru unele un efect letal. În funcție de comportarea lor față de diferite presiuni hidrostatice microorganismele pot fi grupate în mai multe categorii:

Microorganismele barofile cresc la presiuni ridicate, uneori depășind 400-500 atm. Unele sunt barofile absolute, în sensul că nu cresc la presiuni mici, ci numai la presiuni ridicate.

Microorganismele barofobe, care nu rezistă la presiuni ridicate.

Microorganismele barotolerante suportă presiuni moderat ridicate. [NUME_REDACTAT] și Wirsen (1984), ele diferă de barofile prin faptul că acestea din urmă cresc mai bine la presiuni mari decât la presiunea normală.

Microorganimele barodure, rezistene la presiuni foarte mari.

Microorganismele euribare, care se dezvoltă la diferențe mari de presiune (1-600 atm).

Microorganismele stenobare, care suportă numai diferențe mici de presiune hidrostatică.

Efectul presiunilor ridicate este relativ puțin studiat. În cazul bacteriei Serretia marcescens, expunerea la presiuni ridicate este urmată de formarea de filamente foarte lungi. Transferarea la presiuni reduse este urmată de divizarea filamentului la celule normale.

Presiunea de 100-500 atm întârzie creșterea și diviziunea la [NUME_REDACTAT]. Faza de lag este, în special, mult prelungită. La presiuni ridicate conținutul biomasei în proteine este același ca la o atmosferă, în timp ce cantitatea de ARN crește, iar ADN scade.

Microorganismele barofile populează în special adâncul mărilor (-1500 m), precum și regiunile abisale. Ele sunt izolate curent de la adâncimi cuprinse între 1707 și 5952 m ([NUME_REDACTAT], Hawaii). Tulpinile izolate din probe de apă colectate de la 4900 m cresc cel mai bine la 200-300 atm, iar cele izolate de la 5100 m, de pe fundul mării, cresc optim la 400-500 atm. Presiunile superioare celei optime sunt asociate cu diminuarea vitezei de creștere. Yaynis și cola (1979) citează cazul spiril marin barofil, care crește de cel puțin 15 ori mai repede la 300-400 de atm decat la 1 atm. Faptul că la adâncimile menționate, temperatura este constantă între 2 și (în experiment ) demonstrează că efectul înregistrat este rezultatul exclusiv al presiunii hidrostatice. În condiții experimantale, unele bacterii izolate din adâncul oceanelor rezistă la 1300 – 1400 atm, ceea ce ar corespunde la o adâncime de 13000 – 14000 m (Pool, 1990).

De menționat că adâncimea maximă evidențiată în natură (expediția Challenger) este de 11034 m. Una din bacteriile izolate în aceste condiții, Pseudomonas bathycetes crește la și la 1000 atm, după o perioadă de lag lungă de 120 de zile. Cultura ajunge în mijlocul fazei logaritmice după 240 zile și în fază staționară după ~1 an. Durata calculată a unei generații este de 33 de zile.

Semnificație ecologică. Presiunea hidrostatică reprezintă un parametru major în mediul marin și oceanic, deoarece toate organismele marine, cu excepția celor care trăiesc la suprafață, sunt expuse la diferite grade de presiune, în funcție de adâncime și de salinitate.

Bacteriile barofile au un rol important în descompunerea plantelor și animalelor moarte, care cad la fundul oceanelor. Ele participă în acest mod la reciclarea materiei organice în natură.

2.7 Salinitatea.[NUME_REDACTAT]

Mediile naturale oferă microorganismelor condiții foarte diferite de salinitate, de la cele cu concentrații foarte mici (apele râurilor și lacurilor) până la cele cu concentrații mari ale lacurilor sărate și mărilor sau chiar la cele ce reprezintă adevărate soluții saturate (fig.2.9).

În sol, salinitatea suferă fluctuații importante în funcție de frecvența și de cantitatea ploilor sau de uscăciune, fiind afectată suplimentar de o serie de factori proprii acestui mediu complex.

Mediul cu salinitatea cea mai constantă este reprezentat de organisme și de celule care beneficiază de mecanisme precise de reglare ionică.

Ca regulă generală, prezența unor concentrații mari de săruri inhibă creșterea celor mai multe microorganisme obișnuite, datorită pierderii apei intracelulare și perturbării echilibrului ionic normal.

În raport cu concentrația sau respectiv de săruri tolerate, microorganismele pot fi grupate în trei categorii: nehalofile sau halofobe, halofile moderate și halofile extreme. Evident clasificarea nu este absolut riguroasă, deoarece există unele microorganisme moderate, care se pot dezvolta la concentrații saline mici, după cum există și microorganisme de apă dulce (halotolerante), care se pot dezvolta în apă de mare.

Microorganismele halofile moderate sunt, în general, bine adaptate la limitele de salinitate ale apei de mare (de regulă, echivalente cu 3,5 % NaCl, la care se adaugă cantități mici de K, Ca, Mg, sulfați, carbonați). Ele cresc slab la salinități inferioare sau superioare acestor limite.

Microorganismele halofile extreme obligate trăiesc în condiții de mediu foarte neobișnuite, la limita granițelor fiziologice pentru viață. Sunt reprezentate de bacteriile din genul Halobacterium si Halococcus, de bacteriile "pătrate" și de alge din genul Dunaliella.

Bacteriile din genul Halobacterium (H. halobium, H. salinarium, H. cutirubum), cel mai mult studiate, sunt halofile extreme. Se dezvoltă la o concentrație minimă de 2,5-3 M NaCl și respectiv la concentrația optimă de 4-5 M NaCl, la care se adaugă 0,1-0,5 M .

Se dezvoltă foarte lent (durata unei generații este de >7 ore), primele colonii colorate în roșu viu până la oranj apărând după câteva zile. Ele conțin pigmenți carotenoizi cu rol protector față de lumină).

Sunt prezente în natură în zonele de mare cu concentrație salină ([NUME_REDACTAT] Lake, bazinele de extracție a sării din mare, în general expuse la soare, deci în condiții în care celulele pigmentate au avantajul de a fi mai bine adaptate, în pește sărat și alte alimente conservate prin sărare etc.), în soluții saline saturate (~36% NaCl).

Halobacterium halobium, recoltat din medii naturale sau cultivat în prezența a 25% NaCl, apare pe microelectrotonografii sub forma unor bastonașe rectangulare subțiri. Nu are un perete celular propriu-zis și nici mureină, ci numai un înveliș foarte subțire și fragil, alcătuit din proteine acide (~75%), lipide (~25%) și cantități infime de glucide aminate (0,5%-1,5%). Sintetizează câteva lipide foarte neobișnuite (analogi de tip di-0-alkil, fosfatidil glicereofosfat), precum și un alcool de tip dihidrofitil.

Dacă soluția salină este diluată treptat, H. halobium ia o formă neregulată și tinde să devină sferică. La concentrații <10% structurile sferice se lizează. Aceste date sugerează că forma bacilară acestei bacterii este în mod specific asociată cu prezența unor concentrații mari de și . Scăderea concentrației lor sau înlocuirea cu , sau cu cationi divalenți sunt urmate de pierderea rigidității și conversia la forme sferice. Microscopia electronică a demonstrat că liza formelor sferice nu este determinată de efecte osmotice, ci este consecința fragilității învelișului celular și dispersării lui în fragmente greu sedimentabile, aproape solubizate, în timp ce membrana celulară rămâne intactă.

Bacteriile din genul Halococcus se dezvoltă la concentrația minimă de 2-2,5 M NaCl și în condiții optime la 3,4-4,5 M NaCl. Au un perete celular gros, compus din polizaharide care conțin resturi dintr-un glucid relativ rar (acidul gulosaminuouronic). Acest perete celular la permite să reziste la șocul osmotic puternic, când sunt plasate în medii diluate.

Cele mai multe date pledează pentru absența peptidoglicanilor (mureina), deoarece aminoacizii și hexozaminele reprezintă numai 7-15% din greutatea uscată a peretelui celular.

Bacteriile "pătrate" au fost izolate inițial de Walsby (1980), din niște bazine cu apă hipersalină ("Sebkha") din [NUME_REDACTAT], unde reprezintă peste 50% din bacteriile asociate cu depozitele de sare. Par să fie ubicvitate în mediile hipersaline, deoarece au fost depistate și în regiunea Eilat (Israel), precum și la [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT] ([NUME_REDACTAT] Mexico), de către Stoeckenius (1981). În aceste regiuni nu pot fi evidențiate decât în mijlocul verii pe crestele de sare când salinitatea este de 210% (total săruri dizolvate). Iarna, când soluția salină este diluată de apă introdusă din mare, pot fi găsite numai pe cristalele de sare de pe marginea bazinelor.

Au formă de pătrate cu latura de 1,5-11 µm și o grosime inegală, mai mică în regiunea centrală (0,1 µm) decât la periferie (0,2-0,5 µm). Sunt acoperite de un perete celular, alcătuit din subunități dispuse în aranjamente regulate de tip hexagonal sau tetragonal. Arhitectura peretelui celular este determinantă pentru forma celulei. Conțin numeroase vacuole cu gaze, dispuse în regiunea periferică a celulelor. Ele apar strălucitoare la microscopul cu contrast de fază și dispar la presiune.

Bacteriile "pătrate" pot apărea izolate sau sub formă de placarde asemănătoare colitelor de timbre poștale, alcătuite din 8-16 celule, la care se văd net planurile de diviziune.

Kessel și Cohen (1982) consideră că avantajul ecologic principal al bacteriilor "pătrate" sau rectangulare derivă din lipsa totală a presiunii de turgor în celulă, care o menține ca un microorganism "turtit" puțin influențat de salinitatea extremă a mediului.

[NUME_REDACTAT] și Walsby (1981), bacteriile "pătrate" fac parte din genul Quadra, aparținând grupului Archaebacteria.

Mecanismele moleculare ale halofiliei extreme.

Halobacteriile extremofile nu prezintă nici una din problemele inerente cultivării altor bacterii într-un mediu hipersalin. Această particularitate este condiționată de o serie de factori:

Cercetările experimentale au evidențiat un fapt cu totul neașteptat: concentrația intracelulară a sărurilor este la fel de mare sau poate chiar mai mare decât în mediu.

Compoziția sărurilor din celulă este deosebită calitativ de cea din mediu: în timp ce mediul de cultură conține de câteva sute de ori mai mult decât în celulă este de câteva ori mai mare decât cea a . Deși halobacteriile au doar nevoi minime de pentru metabolism ele dispun de un mecanism de acumulare a acestuia în celule până la limita de solubilitate a sărurilor de K în apă.

Dezvoltarea optimă a halobacteriilor necesită, în plus, concentrații mari (până la 100 M ), pe lângă complementul de ioni metalici prezenți doar ca urme. O concentrație globală de săruri atât de ridicată în interiorul celulelor implică existența unor ultrastructuri și structuri moleculare capabile să funcționeze numai în soluții saline saturate sau aproape saturate.

Într-adevar, după cum s-a demonstrat, toate structurile investigate au fost găsite stabile și biologic active numai în prezența soluțiilor saline mai concentrate:

În caz de diminuare a concentrației sărurilor, învelișul celular este dezorganizat și fragmentat până la solubilizare în mediu.

Ribosomii sunt stabili și funcționali numai în prezența unei soluții ce conține 4 M KCl și au nevoie pentru stabilizare de o concentrație de 10-100 de ori mai mare decât [NUME_REDACTAT]. În absența acestora subunitățile se disociază.

În timp ce majoritatea proteinelor izolate din bacteriile nehalofile sunt relativ neutre, totalitatea proteinelor membranare și ribosomale provenite de la halofile conțin un număr important de aminoacizi (un excedent mediu de > 10% moli față de cei bazici).

Studiul a peste 30 de enzime izolate de la halofile a arătat marea lor toleranță la soluri. Prezența acestora în concentrație mare ar asigura starea de pliere a lanțului polipeptidic corespunzatoare formei active și menținerea acestei conformații. Cationul din molecula de sare neutralizeaza excesul de încărcătură negativă, înlocuind o funcție îndeplinită la nehalofile de interacțiunile covalente. În cazul diluării soluției saline, forțele repulsive determină deplierea, denaturarea și pierderea activității enzimatice.

2.8 Examinarea directă a bacteriilor în mediile naturale

Contrar așteptarilor, examinarea directă a bacteriilor în diferite medii naturale este foarte dificilă și nesemnificativă: modificările morfologice și fiziologice sunt atât de marcate încât nu pot fi descrise și analizate decât în corelație directă cu condițiile de mediu prevalente în timpul observației. Ele au fost descrise de unii cercetători că aparținând unui “ciclu de viață”, deși, în realitate, sunt guvernate de factori de mediu și lipsite de o bază genetică. De altfel, biologia moleculară a demonstrat că bacteriile sunt într-o stare dinamică, având o mare capacitate de acomodare la modificările parametrilor mediului înconjurător, prin intermediul unei largi varietăți de adaptări genetice și fenotipice ca, de exemplu: modificarea adecvată a sintezei enzimelor pentru a îngloba un nutrient limitant pentru creștere, modularea vitezei de preluare a nutrienților aflați în exces, dirijarea căilor metabolice pentru a evita blocaje specifice datorită lipsei anumitor nutrienți esențiali, coordonarea vitezei sintezelor pentru a menține o creștere adecvată. Aceasta mare capacitate adaptivă explică adesea radical diferite de habitatul lor natural.

Fenomenele au fost reproduse și în condiții de laborator obținându-se celule mici, rotunjite, prin cultivare în medii sărace în nutrienți. Caracteristicile mediilor naturale oligotrofe, aceste celule pitice sunt considerate normale deoarece ele revin la mărimea naturală după ce sunt transferate în medii bogate în nutrienți.

În apariția modificărilor morfologice și fiziologice caracteristice bacteriilor din unele medii naturale cum ar fi mediul oceanic au fost emise două ipoteze:

Morfologia și dimensiunile miniaturale ale bacteriilor marine autohtone ar fi o formă de răspuns la stres sau rezultatul unei strategii de supraviețuire determinată de mai multe diviziuni reductive. Rezultatul lor este mărimea numărului celulelor individuale, fără creșterea biomasei lor. Acest proces duce la apariția unui număr mare de celule miniaturale, care reprezintă forma caracteristică a bacteriilor autohtone în mediile marine;

Celulele mici, rotunjite, din apa de mare ar fi în special forme de tranziție dintr-un mediu bogat (ape uzate, fecaloide sau îmbogățite cu îngrășăminte agricole) la mediul natural oligotrof. Ele sunt expuse unui proces de subnutriție sau chiar în curs de înfometare și, deci, incapabile să desfășoare un metabolism normal.

Gama largă a factorilor de mediu și marea lor variabilitate în mediile naturale la care bacteriile sunt nevoite să se adapteze, exclud existența unui set de condiții normale și, în consecință, o morfologie tipică în aceste medii. De aceea microbiologii utilizează în studiile sistematice și consideră ca tipică morfologia bacteriilor provenite din culturi tinere, în faza de creștere activă, pe medii corespunzatoare și în condiții optime de temperatură, pH etc. Tehnicile de microscopie directă utilizează diferite procedee: mocroscop fotonic cu câmp clar sau întunecat, contrast de fază, cu lumină polarizată sau cu fluorescentă.

Deși utilizate frecvent de unii cercetători, aceste tehnici au o serie de limitări importante:

sunt laborioase;

au un caracter relativ subiectiv, deoarece existența unor particule organice sau anorganice le pot masca prezența sau pot fi confundate cu microorganismele;

sunt relativ insensibile și expuse unor erori.

Tehnica urmăririi directe are, de asemenea, o serie de dezavantaje:

în cazul probelor de sol sau de sedimente, rezultatele depind de gradul de dispersare al agregatelor de microorganisme;

nu deosebește celulele moarte de cele metabolic active.

Examenul microscopic direct poate furniza date importante privind diversitatea microorganismelor într-un microhabitat, modul în care sunt dispuse unele în raport cu celelalte etc. În general, aceste tehnici sunt greu de interpretat datorită, în principal, faptului că în mediile naturale bacteriile sunt adesea foarte mici și greu de deosebit de substanțele intercelulare.

2.9 Grupa bacteriilor de formă alungită dreapta gram negative, aerobe. Familia ENTEROBACTERIACEAE

Cea mai vastă grupare taxonomică dintre bacteriile de interes medical, cuprinde peste 40 de genuri.

Germenii familiei Enterobacteriaceae prezintă următoarele caractere comune:

nișa ecologică este tubul digestiv;

sunt asemănătoare morfologic, predominând formele cocobacilare;

fermentează glucoza,

oxidazo-negativi;

acționează prin virulență și toxine polizaharidice.

[NUME_REDACTAT]

Cuprinde germeni comensali, constituenți obișnuiți ai florei normale intestinale la om și animale, dar care în anumite condiții pot manifesta evidente caractere de patogenitate.

Denumirea de Escherichia provine de la numele lui [NUME_REDACTAT] (1885) cel care a izolat specia tip a genului.

sunt recunoscute mai multe specii, diferențiate pe baza caracterelor biochimice după cum urmează:

E. coli (tip 1 și 2),

E. adercaboxylata,

E. fergusoni,

E. hermanni,

E. vulneris.

(tabel nr.15).

Escherichia coli

Este unul dintre membrii microbiotei normale din tractul intestinal uman și a altor specii animale (fig. 2.10). Multe dintre tulpinile de Escherichia coli nu vătămează omul, în schimb există și tipuri patogene.

Există următoarele tipuri de Escherichia coli patogene :

Escherichia coli enteropatogene pentru copii (EPEC);

produce gastroenterite la copii

Escherichia coli enterotoxine (ETEC);

se localizează în tractul intestinal și provoacă îmbolnăvirea organismului, caracterizată prin crampe abdominale , diaree cu sânge, cu sau fără febră.

Escherichia coli enteroinvazive (EIEC);

produce îmbolnăvire manifestată prin febră, dureri de cap, crampe abdominale ,diaree.

Escherichia coli verotoxicogene (VTEC).Acest grup înglobează și E.coli enterohemoragice (EHEC);

Escherichia coli verotoxicogene provoacă afecțiuni grave la om la o doză infecțioasă redusă, severitatea infecțiilor VTEC variind de la cazuri asiptomatice, în care gazda este doar purtător, la colită hemoragică sau situații mult mai periculoase, precum sindromul urernic hemoragic la copii care conduce la blocaj renal la copii.Bacteriile verotoxicogene se transmit la om prin produse neprocesate de la bovine și ovine contaminate cu fecale la abatorizare sau mulgere.

Escherichia coli enterohemoragic are ca principal rezervor bovinele, potențialele căi de infecție la om fiind:

calea fecală – orală de la animale la oameni, prin contact cu animalele infectate;

contaminarea cu fecale a carcaselor de animale în timpul abatorizării și în principal la eviscerare.

Se dezvoltă viguros în produse cu un conținut redus de NaCl, nu se pot dezvolta în produse cu concentrații mari de NaCl (8,5 %).Poate rezista la temperaturi de refrigerare dar nu este rezistent la tratament termic, inactivarea termică fiind afectată de pH scăzut, activitatea apei.

Escherichia coli enteroagregative (EAEC);

Escherichia coli difuziv aderente (DAEC).

[NUME_REDACTAT] pot fi grupate în funcție de gazda de preferință, și anume :

Salmonele care sunt mai mult sau mai puțin strict adaptate la om, incluzând Salmonella typhi (produce febră tifoidă), Salmonella paratyphi (A, B, C) care produce sindromul paratifoid, cu simptome mai blânde decât în cazul febrei tifoide și [NUME_REDACTAT].

Caracteristicile seropiturilor adaptate strict omului sunt următoarele :

doza redusă pentru a produce boala la om;

durată de incubare mare (10- 12 zile și chiar mai mult)

producere de febră.

Infecția omului are loc prin consum de alimente și apă contaminate cu serotipurile menționate.

Salmonele ale căror serotipuri sunt adaptate la animale, incluzând Salmonella pullorum (la păsări), Salmonella abortus ovis (ovine), Salmonella typhisuis (la porcine), Salmonella dublin (bovine).Se pot produce îmbolnăviri serioase la oameni.

Salmonele care pot afecta atât omul cât și animalele, fără o afinitate puternică față de unele din gazde.Caracteristicile bolii sunt următoarele:

cauzează gastroenterite

infecția este localizată în intestin

perioada de incubație foarte scurtă

boala este de scurtă durată

La om salmoneloza este asociată cu consumul de carne de vită, porc și pasăre și este cauzată de serotipurile grupei a treia.La ingerarea de alimente infectate cu Salmonella, perioada de incubație este de 8 – 72 ore, frecvent 24- 28 ore, și se manifestă prin dureri de cap, crampe abdominale, vomă, diaree, stare generală proastă.Temperatura este de 38- 39ºC. Stagiul acut durează 2 – 5 zile, timp în care Salmonella este depistată în fecale.

Dezvoltarea salmonelelor în carne este condiționată de următorii factori:

temperatura optimă 35…..37º C;

pH optim : 6,5 – 7,5.

Salmonelele sunt distruse la temperaturi > 71º C în centrul termic al cărnii, timp de 10 minute.

[NUME_REDACTAT] găsesc dominant în tubul digestiv, mai ales în intestinul gros (colon) al omului și animalelor este răspândită în diverse medii naturale (apă, sol, alimente)

[NUME_REDACTAT] un bacil sau cocobacil Gram negativ, aerob și facultativ anaerob, polimorf, cu dimensiuni de 2-6/1,1-1,5 μm, nesporulat, necapsulat, mobil datorită unui bogat aparat ciliar dispus peritrih sau uneori imobil.

[NUME_REDACTAT] dezvoltă bine în mediile uzuale la temperatura optimă de 370C. În bulionul nutritiv produce turbiditate intensă, uneori inel la suprafața coloanei de mediu, iar în culturile mai vechi, depozit abundent neaderent. Pe suprafața agarului nutritiv formează colonii cu diametrul de 2-6 mm, opace, nepigmentate, ușor bombate.

Proprietăți biochimice:

germen cu intense proprietăți fermentative

nu utilizează citratul ca unică sursă de carbon

glucoza și alți carbohidrați sunt fermentați cu producere de piruvat,

produc indol și nu produc H2S

unele tulpini de E. coli sunt capabile să producă substanțe cu acțiune antagonică (colicine) active față de alte tulpini de E. coli sau alte enterobacterii.

Sensibilitatea la factorii de mediu

supraviețuiesc în mediul extern (sol, apă,

alimente etc.) săptămâni sau luni de zile

sunt distruși prin expunerea la 60oC în 30 de minute

sunt sensibili la acțiunea antisepeticelor uzuale (fenol, sublimat, cloramină -clorul în concentrație de 0,5-1/1 000 000 este folosit pentru purificarea apei,

sunt sensibili la acțiunea fagilor specifici; unele tulpini sunt lizogene.

Sensibilitatea la antibiotice

sunt sensibili, îndeosebi, față de antibioticele de tip streptomicinic (neomicină, kanamicină, gentamicină, colimicină, polimixina B),

cele cu spectru larg (tetracicină, cloramfenicol)

față de sulfamide (nitofurantoin, furazolidon, olaquindox, carbadox),

chimioterapice urinare (acid nalidixic, cotrimoxazol)

multe tulpini prezintă fenomen de antibiorezistență, care se transmite prin plasmide R

Structura antigenică

se caracterizează printr-o pronunțată variație antigenică

Antigenul ”O”

antigen de suprafață, termostabil, existent la toate formele S ale enterobacteriaceelor

de natură glucido-lipido-polipeptidică,

rezistă la acțiunea alcoolului, formolului și acidului clorhidric

Ag “O” reprezintă polizaharidul “O” specific al lipopolizaharidului peretelui celular

În baza lor tulpinile de E. coli se împart în serogrupe și serotipuri cele mai răspândite serotipuri fiind următoarele:

la viței cu diaree: O15; O21; O17; O5; O78; O26; O115 etc.

la porci cu diaree: O8; O11; O41; O84; O117; O45; O54; O138; O139 etc.

la vaci cu mamită: O39; O88;

la păsări: O1; O2; O3; O5; O8; O73; O78; O11; O22; O47 etc.

Serotipul O157 este implicat în producerea unui sindrom neurologic la om, acest serotip a fost izolat și de animale (porci).

Antigenul “H”.

de natură proteică, termolabil, prezent în flagelii colibacililor mobili;

rezistă la acțiunea formolului și este inhibat de alcool;

este sensibil la acțiunea acidului clorhidric;

au fost descrise 56 de fracțiuni antigene flagelare.

Antigenul K.

antigenele capsulare;

reprezentate prin 3 factori antigenici diferiți notați L, A și B;

sunt de două tipuri: antigene K de natură polizaharidică și antigene K de natură proteică.

Antigenul F.

are origine fimbrială și prezintă rol deosebit în mecanismul patogenetic, intervenind în procesul de aderență a colibacililor la enterocite;

au fost foarte bine studiate F-4, extras din tulpini toxigene provenite de la purcei și F-5, extras din tulpini toxigene de la viței și miei;

ambele antigene se transmit prin plasmide.

Antigenul M.

chimic este acid colanic și este comun și altor enterobacterii;

imprimă caracterul mucos al tulpinilor de E. coli.

Elementele de patogenitate.

Patogenitatea se datorește unor factori de virulență și toxici.

Se clasifică astfel:

tulpini enteropatogene (EPEC);

tulpini enterotoxigene (ETEC);

tulpini enteroinvazive (EIEC);

tulpini enterohemoragice (EHEC).

Factorii de virulență – se includ următorii:

Factorii de aderență (antigenele fimbriale, de tipul F-4 și F-5);

Factorii de colonizare reprezentați de structuri care prezintă asemănări morfologice și biologice cu antigenele F-4 și F-5;

Antigenele de suprafață de tip K- fac ca germenii să fie mai puțin sensibili la fagocitoză și acțiunea litică a complementului, favorizează aderarea celulelor bacteriene la celulele epiteliale.

Factorii de toxicitate – joacă un rol important în mecanismul patogenetic.

Antigenul somatic de tip “O” -protejază colibacilii de macanismele de apărare ale gazdei

Hemolizinele sunt prezente numai la unele tulpini de E. coli îndeosebi la cele izolate de porci cu boala edemelor.

Enterotoxinele -au fost descrise două tipuri de enterotoxine:

Enterotoxina termolabilă (LT)

se aseamănă structural și funcțional cu toxina holerică

perturbă grav activitatea enterocitului, având loc o eliminare masivă de lichid bogat în electroliți în lumenul intestinal, manifestată clinic printr-o diaree apoasă

Enterotoxina termostabilă (ST)

produsă de tulpinile ETEC de origine umană și porcină

perturbă, de asemenea funcția enterocitului, ducând la sporirea secreției de lichid în lumenul intestinal

producerea de enterotoxină este codificată de plasmidul Ent, care se transmite relativ ușor prin procese de recombinare genetică, îndeosebi conjugare

unele tulpini produc colicine “V” care le permită să devină dominante în intestin, fiind favorizată diseminarea sistemică, favorizată și de structurile de înveliș de tipul antigenelor “K”

Importanța E. coli ca indicator sanitar

Numărul colibacililor, cât și a altor enterobacterii lacotozo-pozitive (Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella), pentru care se utilizează termenul de germeni ”coliformi”, din apă și alimente, constituie un important indicator igienico-sanitar. Se urmărește umărul de germeni, pe unitatea de volum care reprezintă un important indicator igienico-sanitar, “Indicele coli” reprezintă criteriul de apreciere a gradului de poluare a apei și alimentelor cu materii fecale. Pentru ca o sursă de apă să fie considerată potabilă, iar un aliment apreciat ca bun pentru consum, trebuie ca numărul de germeni coliformi să se încadreze în anumite standarde.

2.10 [NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT] tip Salmonella choleraesuis este descrisă de Salmon și Smith (1885) pe care o denumesc “bacteria holerei porcine”, crezând în mod eronat că este agentul etiologic al acestei boli. Ligničres în 1900 propune ca acești germeni să fie încadrați în genul Salmonella, în onoarea lui Salmon (fig. 2.11)

[NUME_REDACTAT] funcție de etapa în care au fost izolate și omologate, se întâlnesc la salmonele 3 feluri de denumiri sau notări:

numele speciei receptive, afecțiunea provocată sau combinația între ambele: exemple – S. typhi, S. choleraesuis, S. enteritidis, S. typhimurium, S. abortusovis, S. gallinarum-pullorum etc.;

desemnarea cu numele localității în care au fost izolate: S. nytra, S. helsinki, S. leopoldville, S. montevideo, S. dublin, S. panama etc.;

desemnarea după formula antigenică, luând în considerare anti genul somatic O pentru stabilirea apartenenței de grup și antigenele flagelare H (fază 1 și fază 2) pentru apartenența la tip.

[NUME_REDACTAT] sunt larg răspândite în natură, toate serotipurile cunoscute fiind parazite pentru om și animale.

au fost izolate de la insecte, reptile, păsări, mamifere, om, ca și din diferite elemente ale mediului ambiant (sol, ape de suprafață, alimente, furaje etc.).–prezența salmonelelor este legată de starea de boală sau de portaj;

spre deosebire de E. coli, ele nu sunt prezente la fiecare individ, iar sub raport cantitativ, numărul lor este mai redus.

Morfologia

este un bacil sau cocobacil Gram negativ, cu dimensiuni de 2-3/0,6 μm, nesporulat, necapsulat, mobil cu excepția unui serotip S.gallinarum (pullorum) sau a unor mutante imobile.

[NUME_REDACTAT] bulionul nutritiv produce uniformă destul de evidentă, cu depozit neaderent. Pe suprafața agarului nutritiv formează colonii cu diametrul de 2-4 mm, semitransparente, nepigmentate, ușor bombate.

Caractere biochimice

utilizează citratul ca unică sursă de carbon;

glucoza este fermentată cu producere de gaze;

produc H2S și nu produc indol.

În baza comportamentului biochimic al unui mare număr de serotipuri, Kauffman a definit 4 grupe distincte, pe care le-a denumit subgenuri, numerotate de la I la IV, la care [NUME_REDACTAT] adaugă un al V-lea subgen.

subgenul I grupează salmonelele tipice de la animalele cu sânge cald;

celelalte subgenuri au fost întâlnite la animalele cu sânge rece și în mediul înconjurător.

Sensibilitatea la factorii de mediu.

germeni rezistenți la acțiunea factorilor de mediu;

la 60oC culturile mor în 15-20 de minute, iar la 100oC în 5-7 minute;

în sol 28-280 de zile;

în apă 2-45 de zile;

lapte 2-4 luni;

făină de pește – până la 2 ani;

în pulberea de ouă, 4 ani;

agenții sterilizanți chimici, în concentrații uzuale, au un efect antibacterian satisfăcător.

Dintre antibiotice sunt mai active cloramfenicolul, tetraciclina, ampicilina, gentamicina, kanamicina, cefalosporinele etc.

se recomandă efectuarea antibiogramei;

antibioticele nu acționează asupra salmonelelor localizate intracelular;

sunt atacate de fagi, cu rol tipizarea fagică.

Structura antigenică.

structură antigenică complexă, în baza căreia se împart în mai multe grupe serologice;

pentru medicina veterinară o importanță deosebită o au grupele A, B, C, D și E;

s-au descris până în prezent 51 de grupe, cu peste 2000 de serotipuri.

Antigenele somatice “O”

constituie suportul împărțirii în grupe O, în cadru schemei Kauffman-White;

sunt termostabile, alcoolorezistente și sunt reprezentate de complexul lipidopoliglucidic din membrana externă a peretelui celular.

Antigenele flagelare “H”.

se extrag din flageli;

sunt de natură proteică;

sunt termolabile și alcoolo-sensibile;

se descrie ceea ce se denumește “variația de fază”, întâlnită la marea majoritate a salmonelelor mobile;

nu posedă asemenea antigene S. pullorum-gallinarum.

Antigenele de faza 1 (specifică)

definesc serotipul și ele aglutinează specific numai cu serul omolog;

se notează cu literele mici ale alfabetului latin.

Antigenele de fază 2 (nespecifică)

sunt notate cu cifre arabe și unele litere mici;

ele sunt nespecifice, este comun tuturor serotipurilor;

determină aglutinări încrucișate între serotipuri;

în tipizarea serologică să se folosescă culturi tinere, la care predomină antigenele H de fază 1 (specifică).

Grupele serologice

sunt constituite pe baza structurii antigenelor somatice de tip O;

grupele mai vechi sunt notate cu literele mari ale alfabetului, de la A la Z;

cele mai recente cu cifre arabe;

toate salmonelele dintr-o grupă sunt caracterizate prin unul sau mai multe antigene somatice majore comune, considerate antigene de grup (exemple: grupa A – antigenul 2; grupa B – antigenul 4 etc.).

Serotipurile

se diferențiază între ele pe baza antigenelor H;

antigenele specifice de serotip sunt cele de faza 1;

în cadrul unor serotipuri se disting subdiviziuni bazate pe criterii biochimice (biotip/biovar), al sensibilității la bacteriofagi (fagotip/lizotip), la bacteriocine (bacteriocinotipuri) și la antibiotice.

Antigenele de înveliș (Vi)

se întâlnesc numai la unele salmonele (exemple: S. typhi, S. paratyphi B, S. typhimurium, ș.a), fiind plasate la exteriorul antigenului O;

prezența lor împiedică aglutinarea somatică O (innaglutinabilitate);

denumirea Vi desemenează capacitatea de virulență a salmonelelor respective.

Antigenul M

descris inițial la tulpinile mucoide de S. paratyphi B, însă ulterior a fost identificat și la alte specii: S. typhimurium, S.choleraesuis, S. newport, S. enteritidis, S. anatum etc.

Patogenitatea

acționează prin virulența și endotoxinele;

antigenul O (lipopoliglucidic), cât și antigenul Vi au și funcție toxică;

simptomatologia generală (alterarea stării generale, febra, prostrația, starea de șoc) este determinată de endotoxiemia masivă;

simptomatologia digestivă (anorexia, durerile abdominale, constipația, diareea) se explică prin agresiunea asupra intestinului, ficatului și vezicii biliare;

la femelele gestante (oi, iepe, vaci) salmonelele manifestă un tropism particular pentru uterul gestant, provocând avorturi.

Infecția naturală

Îmbolnăvirile produse de salmonele poartă numele de salmoneloze sau paratifoze, și se întâlnesc la om, animale și păsări.

pot evolua ca boli primare sau ca boli secundare, complicând în deosebi infecțiile virale;

la om salmonelele sunt agenții cei mai frecvenți ai toxiinfecțiilor alimentare;

unele serotipuri sunt monopatogene, producând îmbolnăviri în exclusivitate fie la om (S. paratyphi A., S. typhi și altele) fie la o singură specie de animale (S. abortusovis – la oaie; S. abortusequi – la iapă; S. typhisuis – la porc; S. galinarum-pullorum – la păsări);

alte pot produce infecții la diferite specii de animale (S. typhimurium, S. enteritidis și altele).

Ca entități clinice mai bine cunoscute sunt următoarele:

La om: febra tifoidă și toxiinfecțiile alimentare;

La animale: salmoneloza la viței, porc, animale de blană, avorturile la oi, vaci, iepe;

La păsări: tifoza aviară, puloroza, paratifozele aviare (la porumbei, rațe și găini);

infecțiile salmonelice sunt caracterizate, în general, prin stări febrile, simptome digestive, respiratorii, articulare, avorturi și leziuni de enterită, hepatită necrotică, splenită hiperplastică;

la păsări domină tulburările de ouat, diareea, scăderea procentului de ecloziune, leziunile de ovarită și enterită.

[NUME_REDACTAT] nu produc, în general, o imunitate satisfăcătoare.

în numeroase țări se aplică programe de vaccinare, utilizând vaccinuri inactivate sau vaccinurii din tulpini vii atenuate;

vaccinurile pot fi numai antisalmonelice sau vaccinuri mixte, în amestec cu colibacili și pasteurele;

la noi în țară au întrebuințare mai frecventă vaccinurile inactivate cu acetonă, în prevenirea salmonelozei la viței, purcei, animale de blană, avortul salmonelic la oaie;

se folosește vaccinul viu contra salmonelozei porcului (tulpina Sm/237 de S. choleraesuis) și contra salmonelozei păsărilor (tulpina 9R de S. gallinarum).

Capitolul III. Cunoașterea studiului actual al contaminării cu microorganisme

3.1 Obiective

3.1.1 Medii de cultură

Majoritatea bacteriilor patogene se pot cultiva, în condiții de laborator, pe medii inerte, utilizate în practica bacteriologică curentă. Cultivarea în sisteme vii (ouă embrionate, culturi de celule) se practică pentru bacterii caracterizate prin parazitism intracelular obligatoriu (grupa Rickettsiilor), după cum și pentru evidențierea unor însușiri biologice ale unor specii.

Un mediu de cultură poate fi definit ca un suport nutritiv steril, care permite dezvoltarea și studiul unui microb în afara nișei ecologice naturale. Mediul de cultură este reprezentat de orice amestec de substanțe lichide sau solide, de la cele mai simple, anorganice, până la cele mai complexe din categoria factorilor de creștere, care favorizează dezvoltarea microorganismelor. Complexitatea chimică a mediilor de cultură necesare cultivării diferitelor tipuri de microorganisme este în dependență directă de capacitățile lor de biosinteză.

Pentru a permite dezvoltarea bacteriilor, orice mediu de cultură trebuie să îndeplinească anumite condiții:

să conțină substanțele nutritive necesare metabolismului bacterian,

să aibă o anumită reacție (pH) în limitele căreia se poate dezvolta bacteria,

să corespundă particularităților fiziologice ale bacteriilor, ținând seama mai ales de tipul respirator,

să fie steril.

Clasificarea mediilor de cultură

Criteriile de clasificare sunt următoarele:

După proveniență

Mediile naturale: solide – cartof glicerinat

lichide – mustul de malț, lapte, bilă

Medii artificiale: Simple

solidificate: geloza, gelatina

lichide: bulionul, apa peptonată

Complexe

solidificate: geloză–sânge, bulion–ser, bulion-ascită

Mediile complexe conțin ingrediente cu compoziție chimică nedefinită. Extractele organice (din levuri, din șesuturi vegetale sau animale) suplimentează mediile complexe cu ioni anorganici, aminoacizi, peptide, purine, pirimidine, vitamine esențiale, carbohidrați. Aceste medii constituie suportul de creștere pentru microorganismele cu necesități nutritive complexe.

Medii sintetice sunt acelea care au o compoziție chimic definită (soluții minerale, zaharuri simple, aminoacizi).

După compoziție: medii albuminoase, zaharoase

După scopul utilizării:

Medii uzuale simple, folosite în mod curent în laborator, pentru cultivarea unui număr mare de microorganisme (bulionul, apa peptonată, geloza, gelatina);

Medii speciale, folosite în scopuri bine precizate. Sunt tot medii complexe, dar prin compoziția lor permit creșterea preferențială a anumitor specii dintr-un amestec heterogen de microorganisme dintr-o probă naturală, sau evidențierea anumitor caractere particulare de metabolism ale microorganismului cultivat. Aceste medii conțin:

un indicator ph

un zahăr fermentescibil

antiseptice selective

antibiotice

Medii speciale se subîmpart în:

medii selective

medii de îmbogățire

medii elective

mediile de diagnostic diferențial

medii de menținere.

Medii de diagnostic diferențial

[NUME_REDACTAT] (lactoză turnesolată-agar)

Peptonă 6,9 g

NaCl 5,1 g

Lactoză 15,0 g

Turnesol (soluție 10%) 1,2 ml

Agar 13,0 g

Ingredientele se dizolvă la cald. Se ajustează pH = 7,4 g;

Se autoclavează la , 20 min;

Se filtrează prin hârtie de filtru. Se repartizează în tuburi;

Se sterilizează la , 20 min.

Este mediu de diagnostic diferențial între germenii lactozo-pozitivi și cei lactozo-negativi, dintr-o probă de apă, lapte, carne. Mediul are culoarea violet-deschis. Coloniile de Salmonella lactozo-negative apar colorate în albastru iar cele lactozo-pozitive de E. coli, Shigella, Staphylococus aureus, apar colorate în roșu.

[NUME_REDACTAT]-[NUME_REDACTAT] 100 ml

Lactoză 1,5 g

Bilă de bou (uscată la ) 0,8 g

Citrat de sodiu 0,8 g

0,85 g

Citrat de fier 0,2 g

Soluție apoasă (0,1%) 4,0 ml

Geloza se lichefiază;

Se adaugă celelalte ingrediente și se încălzește la pentru dizolvare. pH se ajustează la 7,3-7,4;

Se sterilizează la , 20 min.

Mediul are culoarea verde. După inoculare și creștere, diferențiază coloniile de Salmonella, care au culoarea albastră-verzuie, de cele de E. coli, care sunt galbene și de cele Proteus, care au culoarea albastră-verde cu centrul mai opac.

[NUME_REDACTAT] (E M B; eozine-methylene-blue)

Se utilizează pentru analiza microbiologică a apei, în scopul detectării germenilor E. coli si Salmonella.

Peptonă 10,0 g

2,0 g

Agar 15,0 g

Apă distilată 1000 ml

Ingredientele se dizolvă prin fierbere;

Se filtrează la cald prin hârtie de filtru sau vată;

După răcire se readuce la volumul inițial (nu se ajustează pH);

Se repartizează în baloane și se sterilizează la , 30 min;

În momentul întrebuințării mediul se lichefiază. La 100 ml mediu se adaugă:

Soluție de lactoză 20% 5,0 ml

Soluție apoasă de eozină galbenă 2% 2,0 ml

Soluție apoasă de albastru de metin 0,5% 1,3 ml

Se omogenizează și se repartizează în plăci Petri.

Coloniile de E. coli (fermentează lactoza) sunt albastru închise cu luciu metalic în lumina reflectată. Coloniile de Salmonella și Shigella (lactozo-negative) sunt transparente până la incolore.

Mediul S I M (testul producerii , indolului și mobilității)

Triptonă 20,0 g

Peptonă din carne 6,1 g

Sulfat feros 0,2 g

Tiosulfat de sodiu 0,2 g

Agar 20,0 g

Apă distilată pH=7,3 1000 ml

Ingredientele se suspendă în apă și se încălzesc pentru dizolvare;

Mediul se repartizează în tuburi, în coloana înaltă de circa 7 cm;

Se sterilizează la , 15 min.

Mediul este diferențial pentru identificarea speciilor de Salmonella și Shigella pe baza producerii de , indol și a tesutului mobilității în același tub. Producerea de este indicată de apariția unei zone negre de-a lungul liniei de inoculare, dupa 18-24 ore de incubare. Mobilitatea este dedusă din creșterea difuză față de linia de inoculare. Producerea indolului se testează cu o fâșie de hârtie de filtru îmbibată în acid oxalic saturat, care se suspendă la dopul de vată, așa încât să nu atingă mediul inoculat. Colorarea portocalie a benzii în timpul incubării denotă producerea indolului.

Mediul cu acetat de plumb

Peptonă 20,0 g

Glucoză 1,0 g

Acetat de plumb 0,2 g

Tiosulfat de sodiu 0,08 g

Agar 15,0 g

Apă distilată pH=6,6 1000 ml

Ingredientele se dizolvă prin încălzire și agitare;

Mediul se repartizează în tuburi;

Se sterilizează prin autoclavare la , 15 min și se răcește în poziție înclinată.

Mediul diferențiază bacteriile intestinale Gram negative în ceea ce privește capacitatea lor de a produce . Porțiunea înclinată a mediului se inoculează prin trasarea unui striu, iar coloana dreaptă prin ințepare. Acetatul de Pb din mediu reacționează cu produs de tulpinile pozitive și se formează PbS, de culoare neagră.

[NUME_REDACTAT] (citrat-agar)

Fosfat de amoniu 1,0 g

1,0 g

NaCl 5,0 g

Citrat de sodiu 2,0 g

Sulfat de Mg 0,2 g

Agar 15,0 g

Albastru de brom timol 0,08 g

Apă distilată pH=6,9 1000 ml

Ingredientele se suspendă în apă și se dizolvă prin încălzire;

Mediul se repartizează în tuburi;

Se sterilizează la , 15 min.

Inoculul provine dintr-o cultură crescută pe agar înclinat pentru a elimina posibilitatea aportului unei surse externe de carbon combinat. Inocularea se face prin înțeparea coloanei.

Mediul diferentiază între E. coli, A.aerogenes și unele specii de Salmonella, pe baza capacității de a utiliza citratul. Cele care utilizează citratul alcalinizează mediul și îi schimbă culoarea de la verde la albastru intens în 24-48 ore la . E. coli nu se dezvoltă pe acest mediu pentru ca nu utilizează citratul.

Mediu de bază cu uree (Christensen)

Peptonă 1,0 g

Glucoză 1,0 g

NaCl 5,0 g

2,0 g

Uree 20,0 g

Roșu fenol 0,012 g

Apă distilată 100 ml

Ingredientele se dizolvă în 100 ml apă și se sterilizează prin filtrare, deoarece prin încălzire ureea hidrolizează;

Se dizolvă 15 g agar în 900 ml apă distilată și se autoclavează la , 15 min;

Se răcește la 50-. Cele 2 soluții se amestecă;

Se repartizează în tuburi și se solidifică înclinat.

Se inoculează porțiunea înclinată. Coloana va servi pentru controlul culorii. Mediul permite diferențierea coloniilor de Proteus, Escherichia, Salmonella, Shigella. Dacă ureea este utilizată, se eliberează amoniu și mediul devine roșu. Proteus este pozitiv pentru urează chiar la 2-4 ore de incubare. Salmonella, Shigella și Escherichia sunt negative pentru testul ureazei.

[NUME_REDACTAT]

Extract de carne 8,0 g

Peptonă 9,0 g

NaCl 75-100 g

Manitol 10-100 g

Roșu fenol 0,025 g-0,25

Agar 20,0 g

Apă distilată 1000 ml

Ingredientele se dizolvă prin agitare și încălzire;

Se ajustează pH=7,6 și se sterilizează la , 30 min.

Mediul diferențiază stafilococii patogeni de cei nepatogeni. Stafilococii patogeni fermentează manitolul și virează culoarea mediului în galben. Cei nepatogeni nu fermentează manitolu, nu acidifică mediul și nu-i modifică culoarea. În același timp este și mediu selectiv deoarece prin conținutul ridicat de NaCl inhibă dezvoltarea altor microorganisme.

[NUME_REDACTAT]-[NUME_REDACTAT] de levuri 2,0 g

Triptonă 10,0 g

Gelatină 30,0 g

Manitol 10,0 g

NaCl 55,0 g

75,0 g

5,0 g

Agar 15,0 g

Apă distilată pH=7,0 1000 ml

Ingredientele se dizolvă prin agitare și încălzire;

Mediul se repartizează în plăci Petri;

Se autoclavează la , 15 min.

Este un mediu selectiv pentru izolarea stafilococilor dar și diferențial, pentru liniile patogene de cele nepatogene. Conținutul ridicat de NaCl inhibă creșterea altor microorganisme. După o incubare de 48 ore la , coloniile de stafilococi patogeni apar colorate în galben sau oranj, înconjurate de o zonă clară, datorită lichefierii gelatinei. Fermentează manitolul și sunt pozitivi pentru testul coagulazei. Coloniile de stafilococi nepatogeni sunt albe. Deoarece mediul conține sulfat de amoniu se testează direct lichefierea gelatinei (fără tratament suplimentar). Hidroliza gelatinei este indicată de apariția unei zone clare în jurul coloniei. Pentru a determina fermentarea manitolului se adaugă o picătură de albastru de bromcresol în zonele din care coloniile tipic pigmentate au fost îndepartate.

Mediul diferențial pentru streptococi

Triptonă 15,0 g

Peptonă de carne 5,0 g

Glucoză 1,0 g

Sucroză 50,0 g

4,0 g

Albastru triptan 0,075 g

Cristal violet 0,0008 g

Agar 15,0 g

Apă distilată pH=7,0 1000 ml

Ingredientele se dizolvă prin agitare și încălzire la fierbere;

Mediul se repartizează în flacoane;

Se autoclavează la , 15 min;

După răcirea la se agaugă 1 ml soluție sterilă de telurit de K 1% și se repartizează în plăci.

Mediul este diferențial și selectiv pentru izolarea și identificarea coloniilor de Streptococcus mitis și S. salivarius (viridans), care sunt α-hemolitici și pentru streptococii nehemolitici (y). Coloniile de S. mitis și S. salivarius sunt albastre cu diam. de 0,2 mm și respectiv l-5 mm. Prin adăugarea telirutului de K mediul devine foarte selectiv pentru creșterea streptococilor.

Medii selective

[NUME_REDACTAT] Conkey agarizat

Peptonă 20,0 g

Lactoză 10,0 g

Săruri biliare 1,5 g

NaCl 5,0 g

Agar 13,5 g

Roșu neutru 0,03 g

Cristal violet 0,001 g

Apă distilată pH=7,1 1000 ml

Ingredientele se dizolvă prin încălzire și fierbere;

Mediul se repartizează în plăci Petri;

Se sterilizează la , 15 min.

Mediul este selectiv pentru izolarea primară și identificarea bacililor enterici, pe baza capacității de a fermenta lactoza. Sărurile biliare inhibă dezvoltarea germenilor Gram pozitivi. Coloniile coliforme au culoarea roșu-cărămizie, înconjurate de o zonă de săruri biliare precipitate, sub acțiunea acizilor rezultați din fermentația lactozei. Coloniile de Shigella și Salmonella (nu fermentează lactoza) sunt transparente și necolorate.

Mediul cu lactoză și cristal violet

Peptonă 5,0 g

Lactoză 5,0 g

5,0 g

1,0 g

Cristal violet 0,0014 g

Apă distilată 1000 ml

Ingredientele se dizolvă prin încălzire și agitare;

Mediul se repartizează în tuburi;

Se autoclavează la , 15 min.

Mediul este selectiv pentru selectarea germenilor coliformi pe baza capacității lor de a fermenta lactoza cu producere de gaz. Cristal violetul inhibă creșterea germenilor [NUME_REDACTAT].

[NUME_REDACTAT]-[NUME_REDACTAT] 20,0 g

Lactoză 10,0 g

NaCl 5,0 g

Agar 15,0 g

Purpură de brom crezol 0,03 g

Cristal violet 0,004 g

Apă distilată 1000 ml

Ingredientele se dizolvă prin agitare și încălzire la fierbere;

Mediul se repartizează în tuburi;

Se autoclavează la , 15 min.

Mediul este selectiv pentru izolarea germenilor patogeni intestinali (Salmonella, Shigella) din materiile fecale. Coloniile de E. coli (fermentează lactoza) sunt înconjurate de o zonă galbenă, datorită reacției acidului cu purpură de brom crezol.

Mediul pentru [NUME_REDACTAT] de carne 1,0 g

Peptonă 10,0 g

NaCl 75,0 g

D-manitol 10,0 g

Agar 15,0 g

Roșu fenol 0,025 g

Apă distilată pH=7,4 1000 ml

Ingredientele se dizolvă prin agitare și încălzire la fierbere;

Mediul se repartizează în plăci Petri;

Se autoclavează la , 15 min.

Mediul este foarte selectiv pentru izolarea stafilococilor dintr-o probă contaminată, ca și pentru diferențierea tulpinilor patogene de cele nepatogene, pe baza particularității fermentării manitolului. Conținutul ridicat de NaCl inhibă dezvoltarea altor microorganisme. Tulpinile patogene de stafilococi fermentează manitolul și formează colonii care sunt înconjurate de zone galbene, datorită reacției dintre roșu fenol și acidul rezultat din fermentearea manitolului. Coloniile de stafilococi nepatogeni (nu fermentează manitolul) sunt înconjurate de zone colorate roșu sau purpuriu. Dezvoltarea coloniilor necesită 36 ore la .

3.1.2 [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT] Șuții este situată în partea de sud-est a județului Dâmbovița, la circa 20 km de municipiul Târgoviște și este compusă din 2 sate:

[NUME_REDACTAT] ( reședința de comună ) – 3511 locuitori

Sperieteni – 1968 locuitori.

Teritoriul administrativ al comunei se învecinează cu:

comuna Perșinari la N

comuna Nucet la E

comuna Sălcioara la S

comuna Mătăsaru la V

Numărul total al locuitorilor este de 5479 pe toata comuna [NUME_REDACTAT].

Ambele sate sunt electrificate, beneficiază și de iluminat public și de asemenea dispune de rețea de alimentare cu apă, iar rețeaua de gaze se află, momentan, doar pe raza satului [NUME_REDACTAT].

[NUME_REDACTAT] Șuții (numit astfel dupa paraul Șuța)nu este menționat în documente pana la 1800, iar satul Speriețeni există la sfârșitul sec.XIV.

Din punct de vedere al structurii rețelei de circulație, satul [NUME_REDACTAT] este format din două zone distincte: o zonă cu structura regulată în partea de nord și o zonă mai extinsă având o structură amorfă, destul de afânată. Relieful relativ plan și stabil (zona cunoscută sub numele „[NUME_REDACTAT] de Munte”) și rețeaua hidrografică rară, compusa în principal din pârâul Șuța și râul Dâmbovița (limita naturală cu comuna Nucet) oferă un cadru propice dezvoltării localităților și activităților în teritoriul administrativ, fără riscuri naturale majore.

Teritoriul comunei se încadreaza în zona macroseismică de gradul VII, iar din punct de vedere geotehnic, terenul se prezintă bun pentru construire neexistând fenomene naturale care să impună măsuri speciale.

Principalele căi de comunicație rutieră care străbat comuna sunt:

DJ721 (cca 20 km pana la Târgoviște), pe care este amplasat satul [NUME_REDACTAT];

DJ 721 A [NUME_REDACTAT]-Speriețeni-Cupăru-DN7;

DC 64 Speriețeni-Picior de Munte.

Comuna nu dispune de acces direct la calea ferată, cea mai apropiata statie CF fiind Nucet, la cca 6 km de [NUME_REDACTAT], pe linia ferata Târgoviște -Titu.

Satele comunei sunt amplasate la cca. 2,5 km unul de altul (pe DJ721A); între zonele centrale sunt cca. 5km.

Profilul economic dominant al comunei este agricultura, solurile fiind favorabile marilor culturi: porumb, grâu, legume.

Din punct de vedere climatic, teritoriul comunei [NUME_REDACTAT] este supus unui climat temperat continental.

Pe pârâul Șuța la intrarea în satul [NUME_REDACTAT], precum și în apropiere de ieșirea din satul [NUME_REDACTAT] pe o distanță de aproximativ 1km gospodăriile cetățenilor sunt predispuse a fi în pericol în cazul unor căderi abundente de precipității.

[NUME_REDACTAT] care traversează de la N la S satul Speriețeni pune în pericol gospodăriile cetătenilor amplasate de o parte și de alta a acestui pârâu.

Un eveniment mai important s-a întâmplat în toamna anului 1978 când a fost inundată toata zona de vest a satului [NUME_REDACTAT], de-a lungul pârâului Șuța, eveniment în urma căruia nu s-au înregistrat însă pagube materiale importante sau pierderi de vieți omenești.

3.1.3 Cuantificarea prezenței și activității microorganismelor în natură

Înțelegerea structurii și a funcției ecosistemului, obiectul primordial, esențial, pentru înțelegerea schimbului de materie și de energie între și în cadrul diferitelor sale compartimente vii sau nevii implică, cu necesitate, cunoașterea și cuantificarea cât mai aproape de realitate a unor parametrii ecologici cu importanță fundamentală.

Inițial, studiile de ecologia microorganismelor din sol și din mediile acvatice au recurs la metodele de laborator utilizate în microbiologia clasică (examenul direct, studiul microorganismelor izolate pe medii de cultură). Ulterior s-a demonstrat ca aceste date nu sunt relevante pentru realitățile din mediile naturale. Fără a renunța la acest tip de determinări, s-a demonstrat, fără echivoc, necesitatea de a lua în considerație doua aspecte fundamentale pentru înțelegerea ecologiei asociațiilor de microorganisme în natură și anume:

aprecierea cantitativă a biomasei, care formează baza lanțurilor trofice

activitatea metabolică și potențialul de creștere și multiplicare, care, pe plan global, reprezintă forța motrice a ciclurilor biogeochimice

Câteva probleme specifice complică studiul comunităților de microorganisme în mediile naturale și fac ca metodele de cercetare ale ecologiei microorganismelor să fie dintre cele mai puțin precise în cadrul științelor microbiologice:

Microorganismele trăiesc în microhabitate, cu dimensiuni micrometrice sau milimetrice, separate de zone lipsite de microorganisme, în condiții fizico-chimice (calitatea și cantitatea nutrienților, pH, presiune osmotică) foarte diferite de macrohabitatul înconjurător;

Marea heterogenitate a mediilor naturale, care pot conține uneori cantități mari de materie organică dispersată sau particulată, ce împiedică aprecierile indirecte de biomasă pe baza cantității totale de C, N, proteine;

Microorganismele sunt prezente frecvent atașate de diferite suprafețe sau sub formă de agregate sau microcolonii greu de dispersat;

Pe lângă formele active sau de latență (spori, chisti), microorganismele pot exista ca forme “stresate”, a căror capacitate de multiplicare este adesea blocată;

În condiții naturale, viteza activităților fiziologice (viteza de producere a biomasei și a diviziunilor celulare este mai mică decât potențialul fiziologic demonstrat în laborator. De aceea, tehnicile de apreciere a activităților metabolice trebuie să fie suficient de sensibile pentru a putea detecta o serie de activități cunoscute;

Microorganismele apar frecvent în consorții (asocieri cu grad mare de heterogenitate ca activități fiziologice și natură), care includ bacterii, fungi, alge și protozoare, în care celulele vii sunt asociate cu celule moarte, materie organică neanimată (detritus)

Recoltarea probelor

Examinarea și analiza microorganismelor în ecosistemele naturale se lovesc de dificultăți tehnice insurmontabile. În același timp, lipsa de cunoștințe suficiente privind creșterea lor în natură, constrângerile și interacțiunile la care sunt expuse în spațiu și în timp fac imposibilă construcția de analogie de laborator capabili să modeleze sistemele naturale. Pentru moment, singura soluție rămâne “izolarea” unor părți din ecosistemele complexe și examinarea lor în condiții controlate de laborator.

Recoltarea probelor este considerată ca prima dificultate majoră în studiul comunităților naturale de microorganisme, pentru că înseamna îndepartarea lor din mediul natural. Alegerea probelor reprezentative trebuie să țină seama de variabilitatea temporală și spațială a distribuției microorganismelor în natură, să reflecte diversitatea lor și, pe cât posibil, densitatea în întregul ecosistem din care au fost preluate. Recoltarea lor și amestecul pentru rațiuni de semnificație statistică perturbă microheterogenitatea normală spațială prezentă originar în mediul respectiv și ignoră particularitățile asociate cu regiuni ca: rizosfera, colonizarea unor particule organice sau minerale.

În cazul unor ecosisteme stratificate heterogene, cum sunt cele acvatice, recoltarea convențională a probelor de apă și reunirea lor au drept consecință nu numai amestecul diferitelor populații, ci și al organismelor aerobe și anaerobe, cu consecințe importante asupra acurateții estimării lor cantitative. În general, se consideră că proba unică este prea mică în raport cu întregul ecosistem și nesemnificativă pentru aprecierea rolului microorganismelor.

Mărimea și numărul probelor recolate reprezintă un alt factor important. Riscurile de eroare sunt minimalizate prin prelucrarea unor probe complexe obținute prin amestecul unor probe individuale. În cele mai multe lucrări numărul de probe este mic, astfel încât extrapolarea rezultatelor la nivel de ecosistem este expusă unor erori prin supra- sau subestimare.

Datorită heterogenității ecosistemelor și particularităților microorganismelor (care trăiesc sub formă de agregate sau microcolonii și niciodată uniform sau aleatoriu), obținerea unor probe reproductibile este practic imposibilă. Cel puțin pentru unele medii, semnificația determinării are valoarea unui “instantaneu fotografic” al prezenței și densității microorganismelor în momentul examinării în spațiul analizat, foarte diferit de zonele imediat adiacente.

Transportul probelor

Datorită dificultăților tehnice, cele mai multe determinări trebuie efectuate în laboratoare specializate. Aceasta implică transportul probelor, în condiții cât mai apropiate de cele naturale ( temperatura, cantitatea și calitatea iluminării, în cazul microorganismelor fotosintetizante) și respectiv adaptate după caz (sol, apă, sedimente).

Se consideră, în mod convențional, că aceste condiții, foarte rar respectate, nu afectează viteza metabolismului caracteristic în situ, numărul și proporția diferitelor populații, ceea ce este greu de verificat și, în același timp, greu de presupus.

Un exemplu tipic a fost denumit “efectul sticlei (flaconului)”, în cazul probelor de apă de mare. Menținerea lor în flacoane de sticlă mai mult de 24 de ore determină modificări drastice, imprevizibile și variabile în compoziția populațiilor și în viteza metabolismului lor. Modificările sunt variabile după specie, condiții de transport (temperatură, pH) și, în unele cazuri, apar chiar după 1-3 ore. Fenomenul este determinat de concentrarea nutrienților prin absorbție pe suprafața internă a flaconului, pe care unele microorganisme se dezvoltă în exces, în timp ce altele pot sa moară. De aceea, durata transportului trebuie redusă la minimum.

În cazul probelor utilizate pentru dozarea fosfolipidelor, păstrarea la +4 determină o scădere de 20% din concentrația în situ, iar transportul la -70 o scădere de 40%.

Prelucrarea probelor

Trebuie să fie rapidă și în condiții care să împiedice multiplicarea sau moartea microorganismelor. Probele recoltate din mediile naturale sunt numai rar în densități adecvate pentru o analiză directă. Frecvent, ele trebuie fie diluate, fie concentrate prin filtrare sau centrifugare și omogenizare, fapt care, de asemenea, determină modificări față de situația din natură.

Analizele trebuie efectuate în condiții de sterilitate, mai ales când se urmăresc prezența sau absența unor grupuri specifice de microorganisme. În general însă, contaminările chimice sunt mai grave devât lipsa de sterilitate a diferitelor dispozitive.

Studiul ecologiei microorganismelor implică, în principal:

determinări ale numărului lor în mediile naturale, fie direct, fie prin tehnici de cultivare (pentru aprecierea celulelor viabile);

determinări de biomasă;

determinari de activitate metabolică, asociată eventual cu stabilirea potențialului de creștere și multiplicare.

3.2 Metode de lucru

3.2.1 Tehnica prelevării apei potabile

[NUME_REDACTAT] procedură stabilește tehnicile de prelevare, manipulare, transport, recepționare și conservare a probelor de apă potabilă.

Echipamente de prelevare

Recipientele trebuie să protejeze compoziția probei de pierderile prin absorbție, evaporare sau impurificări cu substanăe străine.

Recipientele trebuie să corespundă următoarelor criterii

rezistența la temperaturi extreme

rezistența mecanică

ușurința la închiderea etanșă și la redeschidere

posibilitate de spălare și reutilizare

Pentru analizele microbiologice, trebuie să se utilizeze recipiente din polietilenă de bună calitate care să reziste la sterilizări repetate de 1200C. Recipientele trebuie să rămână sigilate până la deschiderea lor în laborator și să fie protejate împotriva tuturor contaminărilor exterioare.

Mod de prelevare

Prelevarea la stațiile de apă potabilă – probele trebuie să se preleveze la ieșirea din stație și cât mai aproape de rezervor.

Prelevarea în sistemul de distribuție – prelevarea trebuie făcută în diferite locuri ale sistemului de distribuție și în special la extremitățile sistemului.

Metoda prelevării – Prelevarea pentru analizele microbiologice

În figura 3.1 este prezent fluxul de tratare a apei dintr-o sursă de adâncime.

În figura 3.2 este prezentat fluxul de tratare a apelor de suprafață (râu sau lac).

Înainte de prelevare trebuie să se sterilizeze cu o flacără robinetele metalice și să se dezinfecteze robinetele din material plastic cu o solutie de clor pentru evitarea contaminării secundare a probei. După prelevare, recipientul trebuie închis ermetic și trebuie evitată contaminarea dopului.

Volumul probei

Pentru analizele microbiologice se prelevează 300 ml apă.

Codificarea și etichetarea recipienților de prelevare

Imediat după prelevarea probei fiecare recipient trebuie etichetat cu numere de la 1 la n unde n reprezintă numărul de probe solicitat, pentru a identifica ușor proba. Numărul de pe etichetă trebuie să corespundă cu numărul din fișa de prelevare.

Transportul probelor

Probele de apă sunt depozitate în lăzi frigorifice care asigură o temperatură de 5+30C și sunt transportate cu autovehicul cu rol de autolaborator.

Conservarea probelor

Probele se păstreaza la temperatura de 2-40C timp de maxim 24 ore.

3.2.2 Determinarea numărului de mircroorganisme care dezvolta colonii la 220C și 370C

Determinarea numărului total de germeni

Numărul total de germeni reprezintă numărul de colonii care se dezvolta in urma insamantarii de 1cm3 de apa in mediu de cultura, după 48 ore de termostatare la .

In cazul in care se considera ca apa reprezintă un grad ridicat de contaminare mai mare se fac insamantari din diluții (fig. 3.3) coloniilor se face din placile cu 30-300 colonii.

Determinarea NTG la 37°C

din proba de apă se fac diluții zecimale;

din fiecare diluție se însamanțează câte 1 ml pe o placă Petri peste care turnăm geloză simplă; se fac mișcări de rotație în plan orizontal pentru ca geloza să înglobeze apa însămânțată.

se incubează la 37°C, 48 ore

NTG 37°C / ml =, n= nr.colonii

d= inversul diluției

N= nr.plăci

[NUME_REDACTAT] o metodă specifică de cultivare și numărare a microorganismelor din

apă potabilă, cu numărarea coloniilor dezvoltate pe/în mediul de cultură nutrient agar după o încubare aerobă la 370C si 220C.

Definiții și prescurtări

Cultură microorganisme = toate bacteriile aerobe, drojdii și mucegaiuri, capabile să formeze colonii în mediul specific

NTG – număr total de germeni

YE – mediu de cultură extract agar de drojdie

Descrierea analizei

Metoda se utilizează pentru determinarea parametrului numărul total de germeni conform SR ISO 6222 /2004. Se aplică apei potabile.

[NUME_REDACTAT] probelor se efectuează procedurii generale ‘’Eșantionarea probelor’’, în recipiente de polietilenă. Fiecare probă se prelevează în conformitate cu programul de prelevare defalcat pe lună, zi, punctele de prelevare fiind fixe. În situații deosebite șeful de laborator/biologul decide modificarea frecvenței de prelevare și poate stabili noi puncte de prelevare.

Conservare și stocare probe

Dacă păstrarea probei este inevitabilă, se conservă în frigider la întuneric la 5±30C. Durata trebuie să fie cât mai scurtă posibil, în nici un caz să nu depășească 24 ore și este necesară precizarea timpului de stocare la prezentarea rezultatului. Pe sticlă se aplică o etichetă care conține data/ora conservării.

Subeșantionare probă pentru analiză

Această operație se efectuează prin măsurarea unui volum de probă din proba prelevată, necesară efectuării analizei. Cel care efectuează operația va lua toate măsurile pentru a nu impurifica proba prin folosirea de sticlărie curată.

Principiul metodei

Inocularea prin amestec în placa cu mediu a unui volum de probă sau diluție probă. Incubarea se realizează la: 360C /44-48h și 220C /68-72h. Calcularea numărului de colonii formatoare de unități (C.F.U.)/ml de probă = colonii dezvoltate la suprafață și în mediu de cultură.

Aparatură

aparat de sterilizat cu aburi (autoclav)

incubator cu menținere temperatură la (36±2)0C și (22±2)0C

plăci Petri de sticlă sau plastic sterile cu diametrul de 90-100mm

baie de apă capabilă să mențină temperatura la (45±1)0C

[NUME_REDACTAT] preparare medii se utilizează ingrediente de calitate uniformă și alternativ se utilizează un echivalent – mediu deshidratat urmărind instrucțiunile de preparare. Pentru hidratare mediu se utilizează apă deionizată (apă distilată) în concordanță cu EN ISO 3696 categoria 2, fără substanțe care să inhibe creșterea microorganismelor.

Pentru diluție se utilizează apa peptonată tamponată (peptonă) conform ISO 8199.

Mediul de cultură. Extract agar de drojdie (Yeast extract agar) – conține:

triptonă 6,0g

extract deshidratat de drojdie 3,0g

agar 10-20,0g

apă 1000ml

Mediul deshidratat cântărit cu balanța tehnică se dizolvă în apă distilată, pe baia

de apă, pîna la încalzire. Se ajustează ph-ul dacă este necesar,după sterilizare ph-ul trebuie să fie 7,2 ± 0,2 la 25 0C. Mediul dizolvat se distribuie în eprubete, baloane, dupa care se sterililează. Pentru utilizare mediul este adus la (45±1)0C utilizând baia de apă. Mediul nu se ține mai mult de 4 ore la 450C înainte de descarcare mediu în placă.

Mod de lucru

Pregătire și însămânțare

Se plasează un volum de probă (ori diluție), de 1ml în cutia Petri sterilă, adăugăm 15-20ml mediu de cultură, se amestecă cu grijă prin rotire placă. Timpul scurs între plasare probă și adăugare mediu plus încorporare să nu fie mai mare de 15 minute.

Incubare și examinare

Plăcile inoculate, omogenizate și solidificate, se incubează: unele la (36±2)0C /44-48h, iar altele la (22±2)0C /68-72h. Examinarea plăcilor se realizează imediat după incubare; dacă nu este posibil, plăcile se stochează la (5±3)0C și se vor examina în 48 ore. Se exclud plăcile care prezintă colonii confluente.

Numărare colonii

Pentru fiecare temperatură de incubare se numară coloniile prezente în fiecare placă și se calculează un număr estimativ: unități formatoare de colonii (C.F.U.)/1ml probă.

Exprimarea rezultatelor

Mod de calcul

Număr: cfu/ml – pentru fiecare probă, pentru fiecare temperatură de incubare.

Dacă în plăcile însămânțate cu un volum de probă nu sunt prezente colonii,rezultatul se exprimă: nu s-au detectat colonii/1ml probă. Dacă se numară mai mult de 300 colonii pe placa inoculată, împreună cu diluții avansate, rezultatul se exprimă: peste 300colonii/placă.

Verificarea rezultatelor

Rezultatele analizelor sunt verificate de către șeful de laborator prin verificarea calculelor și/sau rezultatelor intermediare și transferul datelor. Metodele de verificare a rezultatelor pot fi:

compararea cu rezultatele similare anterioare

repetarea analizei folosind aceeași probă și metodă, alt executant și același executant.

Activități finale

După însămânțare se curăță și dezinfectează cu soluție alcoolică masă de lucru și se aprinde lampa UV pentru sterilizarea incintei în care s-a realizat însămânțarea probelor, timp de 20min.

Recipientele de prelevare, pipetele se spală cu apă curentă și detergent, se clătesc cu apă distilată, apoi se lasă la uscat.

Materialele infecte (plăci Petrii, eprubete) rezultate de la însămânțări și citirea probelor sunt supuse sterilizării în autoclav la (134±2)0C/30 min., după ce s-au răcit sunt spălate cu apă și detergent, clătite cu apă distilată.

3.2.3 Detecția și numărarea de [NUME_REDACTAT] și de bacterii coliforme.

Metoda prin filtrare pe membrană

Determinarea bacteriilor coliforme (fig. 3.4)

Sursa cea mai importantă de poluare bacteriană a apei o constituie reziduu-rile, excrementele umane și animale, care pot conține germeni patogeni, de aceea în analiza apei se urmărește detectarea poluării fecale-folosind indicatorii coliformii.

Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include teste prezumtive, de confirmare, bazate în primul rând pe capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO2, H2, în timp de 48 ore la C.

Testul prezumtiv constă în inocularea probei în mediu nutritiv cu lactoza (BCLP –bulion de carne cu lactoză și plutitor), mediu de îmbogățire favorabil înmulțirii atât a bacteriilor coliforme cât și a altor bacterii care folosesc lactoza ca sursă de carbon.

Testul de confirmare, constă în inocularea culturilor din eprubetele pozitive ale testului prezumtiv pe medii selective (BBLVP- bulion bilă cu lactoza verde briliant și plutitor) care inhibă dezvoltarea bacteriilor însoțitoare și asigură înmulțirea bacteriilor coliforme.

Din grupul coliform, cel mai frecvent este întalnit genul Escherichia cu specia Escherichia coli, care indică o contaminare fecală recentă.

[NUME_REDACTAT] o metodă specifică de cultivare și numărare a microorganismelor din apă, cu numărarea coloniilor dezvoltate pe/în medii de cultură: lactoză TTC agar și bulion Tryptofan după o incubare aerobă la 36+30C si 44+0,50C.

Definiții și prescurtări

Bacterii lactozo-pozitive – test standard – bacterii capabile să formeze colonii în

condiții aerobe la (36±3)0C pe un mediu de cultură selectiv cu lactoză, cu producere de acid timp de (21±3)h.

Bacterii coliforme – test standard – sunt bacterii lactozo-pozitive cu reacția oxidazei negativă.

Escherichia coli – test standard – sunt bacterii coliforme care produc reacția de indol din tryptofan la (44±0,5)0C timp de (21±3)h.

Escherichia coli – test rapid – bacterie bilă rezistentă – bacteria care dă o reacție pozitivă cu indol în prezența β–glucuronidazei la 36±30C timp de 30-120 minute și prin expunere la radiații UV,afișând o colorație bleu deschisă florescentă și formând un inel roșu, după adăugarea reactivului Kovacs.

BCT – bacterii coliforme totale

E. coli – Escherichia coli

LTTC – lactoză TTC agar cu heptadecilsulfat de sodiu (Tergitol 7)

TTC – supliment pentru Tergitol 7

BT- Bulion tryptofan

TSA – [NUME_REDACTAT] Agar

ROx – reactiv oxidaze

Rkov – reactiv [NUME_REDACTAT] analizei

Metoda se utilizează pentru determinarea parametrilor bacterii coliforme și E. coli conform SR ISO 9308-1/AC/2009.

[NUME_REDACTAT] probelor se efectuează în recipiente de polietilenă. Fiecare probă se prelevează în conformitate cu programul de prelevare defalcat pe lună, zi, punctele de prelevare fiind fixe. În situații deosebite șeful de laborator/biologul decide modificarea frecvenței de prelevare și poate stabili noi puncte de prelevare.

Conservare și stocare probe

Dacă păstrarea probei este inevitabilă, se conservă în frigider la întuneric la 5±30C. Durata trebuie să fie cât mai scurtă posibil, în nici un caz să nu depășească 24 ore și este necesară precizarea timpului de stocare la prezentarea rezultatului. Pe sticlă se aplică o etichetă care conține data/ora conservării.

Subeșantionare probă pentru analiză

Această operație se efectuează prin măsurarea unui volum de probă din proba prelevată, necesară efectuarii analizei. Cel care efectuează operația va lua toate măsurile pentru a nu impurifica proba prin folosirea de sticlărie curată.

Principiul metodei

Metoda bazată pe membrana filtrantă conține 2 părți: testul standard de referință și testul rapid – care se folosește pentru confirmarea exactă a parametrului E coli. Testul standard include incubarea membranei pe un mediu selectiv cu caracterizare biochimică a coloniilor tipice lactozo-pozitive conducând la determinarea și enumerarea bacteriilor coliforme și E. coli în 2-3 zile. Testul rapid constă în 2 etape de incubare permițând determinarea și enumerarea E. coli în (21±3)h.

Filtrare și incubare

Un volum de 100ml din probă este filtrat prin membrane care rețin bacteria. Pe urmă, membrana (test standard) este planșată pe mediul Chapman care se pune la incubat la (36±2)0C timp de (21±3)h.

Evaluare și confirmare. Test standard.

Coloniile caracteristice de pe membrană sunt numărate ca bacterii lactozo-pozitive. Pentru bacteriile coliforme și E. coli subcultura se realizează la întimplare selectând colonii caracteristice pentru testele de confirmare: reacția de oxidază și de indol. Se numără bacteriile coliforme lactozo-pozitive și E.coli care pot fi prezente în proba de 100 ml.

Test rapid – coloniile de pe membrană care sunt capabile să producă reacția de indol, cu ajutorul β–glucuronidazei, sunt numărate ca E. coli.

[NUME_REDACTAT] utilizează echipamentul standard al unui laborator de microbiologie și în

special urmatoarele:

aparat pentru sterilizat cu abur (autoclavă)

sticlăria (plăci Petri, epubete, baloane, pipete) trebuie sterilizată conform ISO 8199/1988.

incubator controlat cu termostat pentru temperatură (36±2)0C

incubator controlat cu termostat pentru temperatură (44±0,5)0C

ph-metru, cu acuratete de ±20C

echipament pentru filtrarea prin membrană

membrane filtrante cu diametrul 47-50 mm, gridate, diametrul porilor 0,45μm

forceps cu capete fără striații pentru manipularea membranei

lampă de UV, la lungimea de undă 366nm

Pentru prepararea mediilor de cultură și reactivilor se folosește apa distilată/ apă deionizată lipsită de substanțe care ar putea inhiba dezvoltarea microorganismelor și care este în conformitate cu ISO 3696. Mediul gata preparat este stabil cel puțin 15 zile în condițiile în care este stocat la întuneric, temperatura de (5±3)0C și protejat de evaporare.

Lactoza TTC agar cu heptadecilsulfat de sodiu (Tergitol 7 Agar) care conține:

peptonă din carne 10g

extract din carne 5g

lactoză 20g

extract de drojdii 6g

bromtimol 0,05g

sulfat de heptadecil de sodiu 0,1g

agar 15-25g

Mediul deshidratat se dizolvă în apă distilată, conform instrucțiunilor de utilizare ale producătorului, după care este sterilizat prin autoclavare la (121±3)0C pentru 15 minute, se răcește la 45-500C, se adaugă suplimentul TTC și apoi se toarnă în plăcile Petri sterile 5-10ml mediu. Plăcile solidificate se depozitează la (5±3)0C.

Mod de lucru

Pentru pregătire probă, filtrare și incubare pe mediul specific se respectă ISO 8199 și ISO 6887-1. Examinarea probei să se facă preferabil imediat după recoltare probă. Dacă probele sunt la o temperatură nu mai mult de 250C și întuneric, examinarea trebuie să se realizeze în maxim 6 ore de la prelevare. În condiții exceptionale, probele pot fi păstrate la (5±3)0C pentru 24 ore înainte de examinare.

[NUME_REDACTAT] filtrează 100ml de probă pe membrană. Se aplică membrana pe mediul Chapman, fără să se prindă bule de aer între membrană și mediu.

Incubare și diferențiere

Incubarea membranei pe mediul Chapman la (36±2)0C timp de (21±3)h,după care se examinează membranele și se numără coloniile caracteristice de bacterii lactozo-pozitive, indiferent de dimensiune, care apar galbene dezvoltate în mediu pe membrană.

Exprimarea rezultatelor

Prin numărare colonii caracteristice de pe membrană și ținând cont de

rezultatele subculturilor se calculează numărul de colonii de E. coli, coliformi, și dacă este necesar, de bacterii lactozo-pozitive.

Verificarea rezultatelor

Rezultatele analizelor sunt verificate de către șeful de laborator prin verificarea calculelor și/sau rezultatelor intermediare și transferul datelor.

Metodele de verificare a rezultatelor pot fi:

compararea cu rezultatele similare anterioare

repetarea analizei folosind aceeași probă și metodă, alt executant și același executant.

Activitățile sunt înregistrate în documente cum ar fi: caietul de lucru,registrul de analize microbiologice, buletinele de analiză.

Activități finale

După însămânțare se curăță și se dezinfectează cu soluție alcoolică masa de lucru și se aprinde lampa UV pentru sterilizarea incintei în care s-a realizat însămânțarea probelor, timp de 20min.

Recipientele de prelevare, pipetele se spală cu apa curentă și detergent, se clătesc cu apă distilată, apoi se lasă la uscat.

Materialele infecte (plăci Petrii, eprubete) rezultate de la însămânțări și citirea probelor sunt supuse sterilizării în autoclav la (134±2)0C/30 min., după ce s-au răcit sunt spălate cu apă și detergent, clătite cu apă distilată.

3.2.4 Identificarea și numărarea enterococilor intestilali.

Metoda prin filtrare pe membrană

[NUME_REDACTAT] o metodă specifică pentru determinarea și numărarea enterococilor intestinali din apă potabilă prin filtarea cu membrană.

Definiții și abrevieri

Enterococii intestinali sunt coci sferici sau ovalari, Gram pozitivi, imobili, așezați izolați, în perechi sau lanțuri scurte care se dezvoltă la temperatura de 44±0,5 0C, în prezența a 40% săruri biliare și a azidei de sodiu.

ml – mililitru

sol.- soluție

g – grame

EI – enterococi intestinali

SB – Slanetz – [NUME_REDACTAT], mediu de cultură

TTC – supliment

BE – [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], mediu de cultură

AP – Apă peptonată, mediu pentru diluții probă

Descrierea analizei

Metoda se utilizează pentru determinarea parametrilor enterococi intestinali conform SR EN ISO 7899-2/2002.

[NUME_REDACTAT] probelor se efectuează în recipiente de polietilenă. Fiecare probă se prelevează în conformitate cu programul de prelevare defalcat pe lună, zi, punctele de prelevare fiind fixe. În situații deosebite șeful de laborator/biologul decide modificarea frecvenței de prelevare și poate stabili noi puncte de prelevare.

Conservare și stocare probe

Dacă păstrarea probei este inevitabilă, se conservă în frigider la întuneric la 5±30C. Durata trebuie să fie cât mai scurtă posibil, în nici un caz să nu depășească 24 ore și este necesară precizarea timpului de stocare la prezentarea rezultatului. Pe sticlă se aplică o etichetă care conține data/ora conservării.

Subeșantionare probă pentru analiză

Această operație se efectuează prin măsurarea unui volum de probă din proba prelevată, necesară efectuarii analizei. Cel care efectuează operația va lua toate măsurile pentru a nu impurifica proba prin folosirea de sticlărie curată.

Principiul metodei

Numărarea enterococilor intestinali este bazată pe filtarea unui volum de apă din probă printr-un filtru cu membrană cu mărimea porilor suficientă pentru a reține bacteriile. Filtrul este plasat pe un mediu selectiv solid care conține azidă de sodiu și 2,3,5 triphenyltetrazoliumchloride, o substanță incoloră care este redusă la formazan roșu de enterococii intestinali. Coloniile tipice crescute au o culoare roșie, maro sau roz fie în centrul coloniei sau de un capăt la celălalt. Dacă se observă colonii tipice atunci este necesară etapa de confirmare prin tansferul membranei cu toate coloniile pe agar-bilă –aesculin-azidă preîncălzit la 440C -450C. Enterococii intestinali hidrolizează aesculinul în acest mediu în 2 ore. Produsul final 6,7 dihidroxicumarin combinat cu ionii de fier (lll) dau o colorație neagră compusului care difuzează în mediu.

[NUME_REDACTAT] utilizează echipamentul standard al unui laborator de microbiologie și în special urmatoarele:

aparat pentru sterilizat cu abur (autoclavă)

sticlăria (plăci Petri, epubete, baloane, pipete) trebuie sterilizată conform ISO 8199/1988.

incubator controlat cu termostat pentru temperatură (36±2)0C

incubator controlat cu termostat pentru temperatură (44±0,5)0C

echipament pentru filtrarea prin membrană

membrane filtrante cu diametrul 47-50 mm, gradate, diametrul porilor 0,45μm

forceps cu capete fără striații pentru manipularea membranei

lampă de UV, la lungimea de undă 254nm

baie de apă

[NUME_REDACTAT] prepararea mediilor de cultură și reactivilor se folosește apă distilată/apă deionizată lipsită de substanțe care ar putea inhiba dezvoltarea microorganismelor și care este în conformitate cu ISO 3696.

Mod de lucru

Pentru pregătire probă, filtrare și incubare pe mediul specific se respectă ISO 8199/2008 și SR ISO 6887-1/2002 . Examinarea probei să se facă preferabil imediat după recoltare probă. Dacă probele sunt la o temperatură nu mai mult de 250C și intuneric, examinarea trebuie să se realizeze în maxim 6 ore de la prelevare. În condiții excepționale, probele pot fi păstrate la (5±3)0C pentru 24 ore înainte de examinare.

Filtare și incubare

Se filtrează un volum potrivit de apă din fiecare probă de analizat. Se pune membrana filtrantă pe mediu Slanetz-Bartley. Se incubează plăcuțele la 360C+20C timp de 44 ore+4 ore.

Confirmare și numărare

După incubare se consideră colonii tipice, toate coloniile crescute care au culoare roșie, maro sau roz. Dacă sunt colonii tipice se transferă membrana care conține coloniile cu o pensa sterilă fără ale inversa pe o placuță cu agar care a fost preincalzită la 440 C.Se incubează la 440C+0,50C timp de 2 ore. Se citește imediat și se observă că toate coloniile tipice prezintă o colorație de la maro la negru.

Exprimarea rezultatelor

Pentru exprimarea rezultatelor se consultă instrucțiunile din SR ISO 8199:2008– Ghid general pentru determinare și numărare microorganisme din culturi.

Verificarea rezultatelor

Metodele de verificare a rezultatelor pot fi:

compararea cu rezultatele similare anterioare

repetarea analizei folosind aceeași probă și metodă, alt executant și același executant.

Activități finale

După însămânțare se curăță și se dezinfectează cu soluție alcoolică masa de lucru și se aprinde lampa UV pentru sterilizarea incintei în care s-a realizat însămânțarea probelor, timp de 20min. Recipientele de prelevare, pipetele se spală cu apă curentă și detergent, se clătesc cu apă distilată, apoi se lasă la uscat.

Materialele infecte (plăci Petri, eprubete) rezultate de la însămânțări și citirea probelor sunt supuse sterilizării în autoclav la (134±2)0C/30 min., după ce s-au răcit sunt spălate cu apă și detergent, clătite cu apă distilată.

3.2.5 Numărarea microorganismelor de cultură

[NUME_REDACTAT] pentru izolarea și enumerarea micro-organismelor, bazate pe abilitatea lor de a crește în medii de cultură stabilite, reprezintă un mijloc important și considerabil de a evalua calitatea microbiologică a apei.

Domeniu de aplicare

Procedura reprezintă un îndrumar pentru îndeplinirea operațiilor de manipulare care sunt comune pentru fiecare tehnică în examinarea microbiologică a apei, în special în pregătirea probelor, mediilor de cultură și instrumentelor de lucru.

Descrie, de asemenea, diferitele tehnici de enumerare disponibile și criteriile pentru alegerea unei tehnici particulare pentru studiul bacteriilor.

Definiții și abrevieri

Cultură microorganisme = toate bacteriile aerobe mezofile, drojdii și mucegaiuri, capabile să formeze colonii în mediul specific.

ml- mililitru

sol.- soluție

g – grame

Nr. col. – număr colonii de microorganisme

Principiul metodei

Principiul general al acestor tehnici constă în inocularea unui volum cunoscut de probă de apă pe sau într-un mediu de cultură (solid sau lichid). Se presupune ca după inoculare fiecare micro-organism prezent se multiplică, dând naștere unei colonii vizibile direct pe mediul solid, sau se schimbă în proprietăți vizibile pe mediul lichid. Alegerea unei metode anume depinde nu numai de natura micro-organismelor căutate, dar și de natura apei și de motivele examinării.

[NUME_REDACTAT] de lucru, perioadele de incubație și perioadele de depozitare generale sunt aplicate pentru organismul țintă viza, cu excepția cazului în care acestea sunt stipulate în metoda specifică de determinare.

Temperaturi de depozitare (-70±10)°C; (-20±5)°C; (5±3)°C;

Temperaturi de incubație (22±2)°C; (36±2)°C;

Temperaturi de sterilizare (115±3 )°C; (121±3)°C; (170±10)°C;

Perioade de incubație (21±3)h; (44±4)h ;(68±4)h

Limitele superioare ale temperaturilor de incubație sunt foarte stricte (ele pot avea influențe importante asupra dezvoltării). Limitele inferioare ale temperaturilor de incubație pot fi depășite pentru scurte perioade, de exemplu datorită deschiderii ușii unui incubator, dar recuperarea va fi rapidă.

Toleranța la volum și masă: în afara cazului în care este stipulat altfel, gradația acceptată a oricărei valori măsurate este: valoare stabilită ± 5%.

Sticlărie și ustensile de laborator

pahare Erlenmayer de 100 ml, 250 ml

pipete gradate de 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml sterile

flacoane Soxlet 250 ml

plăci Petri din plastic sau sticlă sterile, cu diametrul de 90mm – 100mm

eprubete de 16/160mm sterile

[NUME_REDACTAT] diluanților și a mediilor de cultură în containere potrivite pentru sterilizare prin autoclavare. Pentru majoritatea obiectivelor, o temperatură de (121 ± 3)°C pentru un interval de 15 min este potrivită.

Oricum, o perioadă de timp diferită și o temperatură diferită sunt necesare uneori, iar detalii sunt oferite în fiecare metodă de determinare a microorganismului vizat.

În cazul substanțelor instabile la caldură, îndepartarea micro-organismelor poate fi efectuată prin strecurarea realizată printr-un filtru cu dimensiunea porului de 0,2 µm, specificat de producător ca fiind potrivit pentru "sterilizare”.

Medii de cultură

Odată cu desfacerea unei sticle (recipient) conținând mediul deshidratat, se va indica data pe recipient și o perioadă maximă de depozitare. În general, majoritatea mediilor deshidratate după ce au fost desigilate pot fi depozitate în mod satisfăcător pentru mai multe luni la temperatura camerei, cu condiția să rămână la întuneric și să rămână etanșate.

Mediile preparate și distribuite în condiții de asepsie pot fi depozitate la (5 ± 3)°C pentru o perioadă de până la o lună. Înainte de utilizare, se verifică cu atenție gradul de contaminare, evaporări excesive, sau alte dovezi ale deteriorării. Majoritatea reactivilor sunt cel mai bine ținuți la (5 ± 3)°C.

Se utilizează mediile de cultură furnizate deshidratat în conformitate cu instrucțiunile fabricantului. Se pre-răcește mediul sterilizat la 45°C – 50°C și i se adaugă suplimentele sensibile la căldură, apoi acesta se distribuie în condiții aseptice în recipientele de lucru.

Echipamente

incubator controlat cu termostat pentru temperatură (36±2)0C

incubator controlat cu termostat pentru temperatură (22±2)0C

balanță tehnică pentru dozare mediu de cultură

ph-metru de laborator

etuvă pentru sterilizare sticlărie și ustensile de lucru la (180±1)0C

autoclav pentru sterilizare medii de cultură la (121±2)0C/15 minute

autoclav pentru sterilizare infecte

baie de apă menținută la (45±2)0C

Prepararea probelor test

Examinarea probei să se facă preferabil imediat după recoltare probă. Dacă probele sunt la o temperatură nu mai mult de 250C și întuneric, examinarea trebuie să se realizeze în maxim 6 ore de la prelevare. În condiții excepționale, probele pot fi păstrate la (5±3)0C pentru 24 ore înainte de examinare. Înainte de examinare, se amestecă proba în profunzime printr-o agitare viguroasă pentru a obține o distribuție uniformă a micro-organismelor și, în funcție de natura apei și a conținutului microbian anticipat, se produc diluții necesare în acest stadiu.

În cazul insămânțării în plăci Petri, se utilizează diluții zecimale. Pentru metoda filtrării prin membrană, sunt recomandate etape cu diluție mai mică.

Pentru diluții de maximum 10%, se masoară 90 ml sau 90 ml de diluant în sticle sterile de diluție sau tuburi. Alternativ, volumele de diluant, pre-sterilizat în sticle cu dop etanș, pot fi folosite.Una sau mai multe diluții de maximum 10% sunt realizate prin transferul unei probe de volum de apă în nouă volume de diluant. Se amestecă soluția în profunzime (cu o pipetă nouă sau prin mijloace tehnice) și se transferă un volum din aceasta diluție în alte nouă volume de diluant. Aceste etape se repetă de cate ori este necesar. Se prepară suficiente volume din fiecare diluție pentru ca toate testele să fie executate pe mostră.

Pentru diluții diferite de cele zecimale, volumul de diluant la volumul probei va fi ajustat în consecință.

Diferite abordări pot fi evidențiate, de exemplu în serii de diluție de maximum 3-4%, sau serii de diluție zecimală din care ambele volume de 10 ml și 30 ml sunt filtrate. Diluțiile de maximum 4% pot fi realizate așa cum este descris mai sus pentru diluțiile de maximum 10%, cu excepția ca, în acest caz, un volum de probă de apă se amestecă cu trei volume de diluant.

În cazul în care concentrația organismului țintă este preconizată să fie mare, pot fi utilizate etapele diluției de maximum 100%. Pentru îndrumare generala asupra preparării diluțiilor se urmărește SR ISO 6887-1.

Plăcile inoculate, omogenizate și solidificate, se incubează:

unele la (36±2)0C/44-48h,

iar altele la (22±2)0C/68-72h.

Examinarea plăcilor se realizează imediat după incubare; dacă nu este posibil , plăcile se stochează la (5±3)0C și se vor examina în 48ore. Se exclud plăcile care prezintă colonii confluente.

Enumerarea porțiunilor-test ale probei după inocularea acestora în (sau pe) mediile solide.

Principiu

O porțiune-test a probei de apă, sau o diluție, este inoculată în mod direct sau concentrat pe o membrană pe suprafața unui mediu de cultură solid specific sau într-un mediu topit astfel încât, la incubare, micro-organismele formează colonii pe sau în mediu.

În scopuri practice, fiecare colonie se consideră a proveni dintr-un organism singular sau dintr-un grup de micro-organisme prezente în porțiunea-test în momentul inoculării.

Se ia în considerare volumul porțiunii-test și numărul de colonii formate, rezultatul fiind, prin urmare, exprimat ca un număr de unități de formare a coloniei, sau particule de formare a coloniei într-un volum dat al probei, de exemplu 1 ml sau 100 ml.

[NUME_REDACTAT] proceduri importante pot fi utilizate pentru inocularea mediului solid.

Tehnica plăcii turnate: Porțiunea – test este amestecată cu mediul, care a fost în prealabil topit și răcit la o temperatură aproape de solidificare; după incubare, coloniile care se dezvoltă în interiorul său pe suprafața mediului sunt numărate.

Tehnica plăcii întinse: Porțiunea – test este întinsă pe suprafața uscată al unui mediu agar și, după incubare, coloniile care se dezvoltă pe această suprafață sunt numărate.

Tehnica filtrării membranei: Porțiunea test este trecută printr-un filtru membrană, care reține micro – organismele căutate; membrana este apoi plasată pe un mediu agar sau pe un suport absorbant impregnat cu lichid sau pe un mediu rehidratat. În procesul de incubare, coloniile se formează pe suprafața membranei. Alternativ, în cazul anumitor organisme, cum ar fi cele anaerobe, membrana poate fi plasată cu fața în jos într-o placă Petri și acoperită cu mediu agar topit.

Tehnica plăcii turnate

Volumul porțiunii-test a probei, sau a unei diluții a probei, poate varia între 0,1 ml și 5 ml, în funcție de dimensiunea plăcii Petri și de volumul mediului de cultură utilizat.

Diluția trebuie aleasă astfel încât numărul preconizat de colonii tipice formate pe plăci având diametrul între 90 mm și 100 mm este cuprins între 10 și 150. Numărul total de colonii pe placa Petri (tipic și atipic) va fi mai mic decât 300. Se observă, oricum, ca numărul total de colonii depinde de dimensiunea coloniilor, iar numărul ar trebui redus pentru coloniile mari.

[NUME_REDACTAT] topește mediul necesar în apă care fierbe sau printr-un alt proces corespunzator (de exemplu un incubator de aer potrivit, o autoclavă cu trecere a aburului sau un cuptor cu microunde, dacă combinația perioadă/temperatură de încălzire a fost validată pentru mediul de preparare).

Se evită supra-încălzirea și se înlătură mediul de îndată ce acesta a fost topit. Se plasează mediul topit într-o baie de apă la (45±1)°C pentru un timp suficient astfel încât mediul să se mențină la această temperatură. Este de preferat să nu se țină mediul topit mai mult de 4h.

Să nu se topească mediul agar mai mult de o dată.

Se pregatesc și se marchează placile Petri necesare.

Se realizează diluțiile necesare în conformitate cu pct. 5.5.

Se distribuie, după o amestecare meticuloasă, porțiunile test în plăcile Petri.

Se extrage fiecare eprubetă sau flacon de mediu topit din baia de apă, se usucă partea exterioară a eprubetei sau flaconului și se încălzește gâtul sticlei. Se adaugă fără întarziere mediul la fiecare placă Petri, se evită ca porțiunea de test să diminueze șocul termic, și să amestece cu atenție astfel încât să obțină o distribuție uniformă a micro-organismelor.

In mod general, un mediu de 15 ml este utilizat pentru o portiune test de 1 ml sau 2 ml; pentru portiuni de test mai mari, se ajusteaza concentratia mediului in concordanta. Se lasa placile Petri la rece pe o suprafata orizontala pentru a permite ca agar sa se solidifice. De indata ce agarul s-a solidificat, se incubeaza placile Petri.

Tehnica plăcii întinse

Pentru o placă Petri cu un diametrul cuprins între 90 mm și 100 mm, volumul porțiunii test al probei, sau o diluție a probei, va fi de 0,1 până la 5ml. Se alege diluția astfel încât numărul preconizat de colonii tipice formate să se încadreze între 10 și 150. Numărul total de colonii de pe placă (tipice sau atipice) ar trebui să fie mai mici de 200. Numărul total de colonii numărabile depinde de dimensiunea coloniilor și numărul poate fi redus pentru coloniile mai mari.

[NUME_REDACTAT] prepară și se marchează plăcile, fiecare conținând aproximativ 15 ml de mediu de cultură. Se usucă suprafața mediului înainte de utilizare (daca este necesar). Se pune cu pipeta porțiunea test pe suprafața mediului și se întinde pe suprafață cu ansa. După absorbția substanței folosite pentru inoculare, se incubează plăcile.

Pentru uscarea plăcilor, trebuie luate în considerare următoarele puncte importante:

gradul de umiditate în mediul de cultură este important deoarece o dezvoltare optimă a bacteriilor va depinde de condițiile de umiditate în și pe mediu. Pierderea intensă a umidității va conduce, de exemplu, la o creștere în concentrația inhibitorilor în medii de cultură selective și la o reducere în activitatea apei la suprafața mediului.

când bacteriile care nu se răspândesc rapid sunt cultivate, iar plăcile par deshidratate după aclimatizare, circumstanțele sunt de așa natură încât uscarea nu este întodeauna necesară. În acest caz, uscarea poate fi omisă, deoarece aceasta doar crește probabilitatea contaminării și pierderii inutile de umiditate.

se selectează temperatura și perioada de deshidratare astfel încât probabilitatea de contaminare să fie ținută la un nivel scăzut pe cât de posibil iar încălzirea nu va afecta în mod negativ calitatea mediului de cultură. Perioada de uscare va depinde de gradul de condensare din placa Petri, dar va fi ținută la un grad scăzut pe cât posibil.

Pentru a evita contaminarea, și dacă plăcile Petri nu sunt sterilizate într-o etuvă, plăcile vor fi întotdeauna sterilizate pe suprafața mediului de cultură ce trebuie inoculat îndreptat în jos.

În practică, plăcile vor fi sterilizate prin plasarea lor cu suprafețele mediului agar orientate în jos și cu capacele pe jumatate deschise într-un incubator ajustat la o temperatură cuprinsă între 25° și 50°C. Se sterilizează plăcile până când picăturile au dispărut de pe suprafața capacelor. Nu se mai sterilizează în plus. Plăcile agar pot fi de asemenea sterilizate (în aceeași modalitate descrisă mai sus) într-o etuvă (la temperatura camerei) pentru o perioadă de timp cuprinsă între 30 minute și 60 de minute, sau se lasă peste noapte la temperatura camerei cu capacele în poziție.

Tehnica de filtrare prin membrană

Volumul maxim al porțiunii test depinde de capacitatea de filtrare a probei de apă și de membranele folosite. Această tehnică este potrivită pentru apele care conțin (macro) particule și materia coloidală (de exemplu, fier) în suspensie, de exemplu apă potabilă. Cu membranele care au o dimensiune medie a porului de 0,45 µm, este posibilă filtrarea mai multor litri de astfel de apă printr-o singură membrană, pentru a obține un nivel înalt de precizie a testului. Pentru unele organisme, cum ar fi Legionella, filtrarea se realizează prin membrană cu o dimensiune medie a porului de 0,2 µm poate fi necesară.

Un volum test al probei sau o diluție a ei va fi aleasă astfel încât numărul preconizat al coloniilor tipice formate pe o membrană de 47 mm până la 50 mm în diametru să fie cuprinsă între 10 și 100. Numărul total de colonii de pe filtru (tipice sau atipice) va fi mai mic decât 200. Numărul total de colonii numărabile depinde de dimensiunea coloniilor și numărul ar putea fi redus în cazul coloniilor mai mari.

[NUME_REDACTAT] de lucru este explicitată în ITL 12. Se alege membrana cu dimensiunea porilor de 0,45 µm, în general, iar volumul probei filtrate se alege în funcție de microorganismul analizat, astfel:

un volum cunoscut al probei, sau diluție a ei, amestecat cu atenție (cel puțin 10 ml);

conținutul unui flacon sau unei sticle porțiune test sau diluant suficient pentru a aduce volumul total la cel puțin 10 ml;

cel puțin 10 ml de diluant, la care porțiunea test, măsurată cu o pipetă, este adăugată direct și amestecată cu pipeta.

Transferul membranei pe care s-a realizat filtrarea se realizează astfel:

pe un mediu agar într-o placă Petri;

pe suport absorbant steril saturat în prealabil cu un mediu lichid, sau un suport mediu deshidratat reconstituit cu apă sterilă, într-o placă Petri (pentru a evita o dezvoltare degenerată, scurgerea mediului în exces, de preferabil înainte de plasarea membranei pe suport).

în placa Petri, sau mediu agar într-o placă Petri, ulterior acoperind membrana cu mediu agar topit la (45±1)°C.

Pentru diferite volume ale aceleași probe, pâlnia poate fi refolosită fără dezinfectare numai dacă cele mai mici volume și/sau cea mai diluată mostră sunt filtrate mai întâi. Pentru a filtra alta mostră, se utilizează un instrument steril.

[NUME_REDACTAT] inversează plăcile inoculate și se plasează într-un incubator. Nu se așează sub formă de stivă mai mult de 6 plăci Petri pentru a se asigura că toate plăcile ating rapid temperatura de incubare. Se alege durata și temperatura de incubare luându-se în considerare o metodă standard, din moment ce acestea depind de micro-organism, sau grupuri de micro-organisme, căutate.

Incubarea poate fi realizată în două etape, după cum urmează:

pre-incubarea la o durată variabilă, de exemplu de la 2h până la 4h la o temperatură mai mică ( 25°C-30°C), poate fi folosită pentru resuscitarea organismelor solicitate, urmată de o perioadă mai lungă de incubare la temperatura obișnuită pentru organismul căutat;

în mod alternativ, membranele pot fi incubate pentru o perioadă limitată (de exemplu de la 2h la 4h) pe un mediu de resuscitare și apoi transferate pe mediu selectiv, pentru o incubare ulterioară.

[NUME_REDACTAT] examinează plăcile sau membranele imediat după incubare. Dacă acest lucru nu este posibil, acestea pot fi ținute la (5±3)°C pentru perioade mici de timp, 24 ore, numai dacă acest proces nu afectează numărul, apariția sau confirmare ulterioară a coloniilor. Dacă plăcile sau membranele sunt depozitate, se validează perioada de depozitare ca fiind acceptabilă pentru metoda și tipul mostrei.

Pentru numărarea totală pe un mediu non-selectiv, toate coloniile sunt numărate. Pe mediile selective și diferențiale, se numără numai acele colonii care prezintă aspectul caracteristic al organismului căutat. Este imposibil, oricum, dacă sunt mai multe colonii, să se confirme identitatea fiecăreia dintre ele. În astfel de cazuri, se examinează toate coloniile tipice dintr-o sub-zonă a plăcii sau membrană.

Calcularea rezultatelor date poate fi folosită în cazurile în care numărul total al coloniilor de pe plăci se încadrează între 10 și 200 (tehnica plăcii întinse și a filtrării prin membrană) sau între 10 și 300 (tehnica plăcii turnate), și când numărul de colonii tipice se încadrează între 10 și 100 (tehnica filtrării membranei).

Din moment ce se presupune ca fiecare colonie provine dintr-un micro-organism sau dintr-un singur agregat de micro-organisme, rezultatul este reprezentat ca numărul de unități de formare a coloniilor sau particule de formare a coloniilor într-un volum de referință specificat al mostrei (în general 100 ml sau 1ml).Ecuația (1):

Z * Vs ; unde :

Vtot

CS – este numărul total al unităților de formare a coloniilor sau al particulelor de formare a coloniilor din volumul de referință VS a probei;

Z – este suma coloniilor numărate pe placă sau pe membranele derivate din diluții d1,d2,…di sau derivate din volume separate a porțiunii test (mostră sau diluție);

VS – este volumul de referință ales să exprime concentrația micro-organismelor din probă;

Vtot – reprezintă volumul total calculat din mostra inițială inclusă în plăcile enumerate. Vtot este suma volumelor separate din porțiunea test (mostră sau diluție) sau calculată prin Ecuația (2):

Vtot=(n1V1D1) + (n2V2D2)+………..+ (niViDi) ; unde :

Vtot – este volumul total calculat probei inițiale incluse în plăcile enumerate;

n1V1D1 – reprezintă numărul de plăci Petri numărate pentru diluția d1,d2,…di ;

V1,V2,…Vi – reprezintă volumul test utilizat cu diluția d1,d2,…di;

d1,d2,…di – este diluția folosită pentru volumul test V1,V2,…Vi (D=1 pentru o mostră nediluată, d=0,1 pentru o diluție zecimală, etc.).

Notă 1: Rezultatul final astfel obținut este o funcție a mediei ponderate a numerotării de pe fiecare placă. Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative, când se raportează rezultatele finale. Pentru a realiza acest lucru, dacă a treia cifră este mai mică decât 5, nu se modifică cifra precedentă; dacă a treia cifră este mai mare sau egală cu 5, atunci se mărește cifra precedentă cu o unitate.

Se exprimă rezultatul printr-un număr cuprins de preferat între 1,0 și 9,9 multiplicat prin puterea specifică lui 10, sau un număr întreg cu două cifre semnificative.

Este dezirabil să se raporteze rezultatele numerotării coloniei împreună cu 95% din limitele de siguranță, care pot fi derivate prin aplicarea următoarelor ecuații:

când Z ≥ 20, rezultatul final cu 95% interval de siguranță (CI) este dat de Ecuația (3):

unde simbolurile sunt cele definite mai sus.

Când Z < 20, efectul de creștere a înclinării (asimetrie) distribuției lui Poisson în limitele de siguranță este luat în considerare prin adăugarea unor mici corecturi incluse în Ecuația (4):

Superior și inferior 95%

Notă 2. Ultima ecuație oferă o valoare medie și 95% CI chiar și pentru Z=0, care poate induce în eroare.

Notă 3. Numărul "2" (înainte de rădăcina pătrată) în ecuații este o rotunjire a lui 1,96 (=2).

Notă 4. Calculele 95% CI presupun o distribuție Poisson în toate cazurile.

Caz după identificare și confirmare.

Când metoda folosită necesită identificare sau confirmare, toate coloniile suspecte presupuse vor fi inoculate din fiecare din plăcile reținute din procesul de numărare a coloniilor. Când acest lucru este imposibil, toate coloniile tipice (n) vor fi examinate dintr-o sub-zonă a plăcii sau membrană (n poate varia de la o placă la alta).

Principalul motiv pentru recomandarea confirmării tuturor coloniilor probabile dintr-o anumită zonă în loc de o selecție aleatorie este acela că laboratoarele nu pot izola un subansamblu aleatoriu obiectiv al coloniilor suspecte. Dacă o mostră aleatorie sigură poate fi obținută, atunci minimum și în același timp numărul mediu suficient pentru monitorizarea de rutină este de aproximativ n=5 colonii pentru fiecare placă Petri. Practica recomandată este de a izola toate coloniile atunci când numărul este cuprins între 1 și 5. Apoi, o medie de n=5 este potrivită. Dacă numărul de colonii probabile este de 6 sau 7, nu are sens să se selecteze numai un subansamblu a n =5.

După identificare sau confirmare, se calculează pentru fiecare dintre plăci rezultatul confirmat ca proporție a coloniilor probabile conforme cu criteriile de identificare și confirmare, folosind Ecuatia (5):

unde:

x – este numărul estimat de colonii confirmate pentru fiecare placă Petri;

k – este numărul de colonii conforme cu criteriile de identificare și confirmare printre coloniile inoculate n;

n – este numărul de colonii pozitive probabile inoculate dintr-o placă Petri pentru confirmare;

z – este numărul de colonii pozitive probabile numărate pe placa Petri.

Nu se rotunjesc rezultatele intermediare confirmate ale testului x.

Se calculează numărul CS a micro-organismelor identificate sau confirmate prezente în mostra test prin înlocuirea lui Z cu X (suma lui x), folosind Ecuația (1). Se rotunjeste și se formulează rezultatul așa cum este recomandat în nota 1.

În cazul distribuției Poisson, x este calculat de Ecuația (6):

X = 1 / W2

Dacă w este fixat la 0,50 (50%) ca limită a preciziei relative acceptate (care pare a fi rezonabilă în microbiologie) limita de determinare mai scăzută va fi la numărul de colonie dat de:

X = 1 / 0,502 = 4

Astfel, rezultatele bazate pe numărările a mai puțin de patru vor fi abordate ca simplă detectare a prezenței organismului.

Sintetizare: dacă toate plăcile Petri conțin mai puțin de 10 colonii, dar numărul total de colonii din toate plăcile disponibile este de 4 sau mai multe, rezultatul este calculat după modelul oferit în cazul general, dar stabilit ca număr estimativ. Dacă totalul este cuprins între 3 și 1, precizia rezultatului este așa de scăzută încât este recomandabil să se raporteze rezultatul ca organism prezent în volumul studiat.

3.3 Rezultate și discuții

NTG reprezintă numărul total de germeni, fiind o metodă folosită la determinarea bacteriilor mezofile și organotrofe, acestea fiind cuprinse în intervalul 10-10000 microorganisme/cm3;

Numărul bacteriilor coliforme reflectă prezența bacteriilor de origine intestinală, E. coli fiind bacteria cea mai monitorizată dintre acestea datorită rezistenței mari în apă prin două tipuride teste:

– IC (indexul colic) care reprezintă numărul probabil de coliformi/l apă, de exemplu apa potabilă are valori între 3-10/l apă;

– TC (titrul coli) reprezintă cantitatea cea mai mică de apă în care se admite prezența E.coli, acesta fiind egal cu 300cm3 la o apă cu IC=3.

Escherichia coli

Este unul dintre membrii microbiotei normale din tractul intestinal uman și a altor specii animale. Multe dintre tulpinile de Escherichia coli nu vătămează omul, în schimb există și tipuri patogene.

Există următoarele tipuri de Escherichia coli patogene :

– Escherichia coli enteropatogene pentru copii (EPEC);

– Escherichia coli enterotoxine (ETEC);

– Escherichia coli enteroinvazive (EIEC);

– Escherichia coli verotoxicogene (VTEC).Acest grup înglobează și E.coli enterohemoragice (EHEC);

– Escherichia coli enteroagregative (EAEC);

– Escherichia coli difuziv aderente (DAEC).

Tabel 3.1

PUNCTE DE PRELEVARE

19.Viforata

21.Sotanga

11.Priseaca

30.Ocnita

46.Moreni

4.Razvad

14.PT. Micro VI

Tabel 3.2

PUNCTE DE PRELEVARE

36.Titu

40.Produlesti

20.Aninoasa

12.Muntenia

15.Micro V

18.Al. [NUME_REDACTAT] 3.3 VALORILE PARAMETRILOR MICROBIOLOGICI

Perioada de monitorizare 1-29.11.2013

Capitolul IV. [NUME_REDACTAT] parcursul lucrării mele am analizat diferite surse de apă în vederea cunoașterii unor microorganisme din sursele respective. Microorganismele au dezvoltare optimă la presiune osmotică intracelulară egală cu presiunea osmotică a mediului. Tipurile de microorganisme din apă sunt reprezentate de bacterii aerobe, facultativ anaerobe și strict anaerobe. Bacteriile patogene sunt și ele uneori prezente, fiind surse primare de îmbolnăvire pentru oameni și animale cu germeni din genul Salmonella. Un mediu de cultură poate fi definit ca un suport nutritiv steril, care permite dezvoltarea și studiul unui microb în afara nișei ecologice naturale. Mediul de cultură este reprezentat de orice amestec de substanțe lichide sau solide, de la cele mai simple, anorganice, până la cele mai complexe din categoria factorilor de creștere, care favorizează dezvoltarea microorganismelor. Complexitatea chimică a mediilor de cultură necesare cultivării diferitelor tipuri de microorganisme este în dependență directă de capacitățile lor de biosinteză.

Prelucrarea probelor

Trebuie să fie rapidă și în condiții care să împiedice multiplicarea sau moartea microorganismelor. Probele recoltate din mediile naturale sunt numai rar în densități adecvate pentru o analiză directă. Frecvent, ele trebuie fie diluate, fie concentrate prin filtrare sau centrifugare și omogenizare, fapt care, de asemenea, determină modificări față de situația din natură.

Analizele trebuie efectuate în condiții de sterilitate, mai ales când se urmăresc prezența sau absența unor grupuri specifice de microorganisme. În general însă, contaminările chimice sunt mai grave devât lipsa de sterilitate a diferitelor dispozitive.

Determinarea numărului total de germeni

Numărul total de germeni reprezintă numărul de colonii care se dezvolta in urma insamantarii de 1cm3 de apa in mediu de cultura, după 48 ore de termostatare la .

In cazul in care se considera ca apa reprezintă un grad ridicat de contaminare mai mare se fac insamantari din diluții (fig. 3.3) coloniilor se face din placile cu 30-300 colonii.

[NUME_REDACTAT] o metodă specifică de cultivare și numărare a microorganismelor din

apă potabilă, cu numărarea coloniilor dezvoltate pe/în mediul de cultură nutrient agar după o încubare aerobă la 370C si 220C.

Eschierichia coli (numita de asemenea si E. coli) este o bacterie ce poate cauza infectii serioase. Mai multe sute de tipuri sau specii de E. coli traiesc in mod obisnuit in tubul digestiv la oameni si animale. Daca prezenta E. Coli-lor este insotita de valori inalte ale nitratilor si clorurilor, de obicei acest lucru arata o contaminare din apa menajera, fosa septica prin infiltratii sau conducte fisurate. Patru sau mai putine colonii /100 ml coliformi in absenta valorilor inalte nitratilor si clorurilor implica prezenta infiltratiilor din apa de suprafata.

[NUME_REDACTAT]. 2.1 Micrococcus radiodurans Fig. 2.2 Thermococcus gammatolerans Sursă: [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT]. 2.3 mucegaiurile Fig. 2.4 drojdiile

Sursă: [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT]. 2.5 [NUME_REDACTAT]. 2.6 [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT]. 2.7 Aspergillus fumigatus

Sursă: [NUME_REDACTAT]. 2.8: Reprezentarea schematică a procesului de nutritie

Sursă: [NUME_REDACTAT]. 2.9 – Dezvoltarea cianobacteriilor în funcție de reacția mediului (pH) și de temperatură

Fig. 2.9 Salinitatea apelor de suprafață Fig. 2.10 Escherichia coli

Sursă: [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT]. 2.11 [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT] 3.1 Schema bloc a fluxului de tratare a apei din sursa de adâncime
1- captare din puț de adâncime, 2-bloc de aerare, 3-filtre rapide cu nisip, 4-sistemul de dezinfecție (clor gazos, dioxid de clor)

Sursă: [NUME_REDACTAT] 3.2 Schema bloc de tratare convențională a apei din surse de suprafață
1-priza de captare, 2-sistemul de admisie a apei, 3-blocul de injecție a reactivilor de tratare,4-gospodaria de reactivi, 5-tanc de reacție, 6-decantoare, 7-filtre cu cărbune activat,  8-filtre cu nisip, 9-sisteme de tratare specială a apei (osmoza inversă, dedurizare, oxigenare, deferizare), 10- stația de clorare (dozare clor, generare și dozare dioxid de clor), 11-rezervorul de apă potabilă.

Sursă: [NUME_REDACTAT]. 3.3 Determinarea numarului total de germeni

Fig. 3.4 Determinarea bacteriilor coliforme

Tabelul 2.1

Principalele tipuri de metabolism bacterian, în funcție de natura surselor de C, de energie și a donatorului de H

Tabelul 2.2

Longevitatea unor spori și forme vegetative și condițiile în care pot supraviețui

[NUME_REDACTAT], C., Virusologie medicală, [NUME_REDACTAT], București, 1996.

Dobrea, M., Microbiologie generală, practicum, [NUME_REDACTAT], București, 2002.

Răducănescu, H., Bica-Popii, V., Bacteriologie veterinară, [NUME_REDACTAT], București, 1986

Răducănescu, H., Bica-Popii, V., Bacteriologie veterinară aplicată, 1974, [NUME_REDACTAT], București, 1986.

Șerban, M., Biochimie animală, Curs, LITO.IANB București, 1984.

Șerban, M., Biochimie animală, Lucrări practice, LITO.IANB, 1983, București.

Tamaș, V., Biochimie animală, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1975.

http://www.apafiltrata.ro/problemele-apei/bacterii-in-apa

http://ro.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli