ASPECTE CITOLOGICE ȘI HISTOPATOLOGICE ALE COLULUI UTERIN [301826]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator științific: Lector doctor Cristina Mătanie

Îndrumător științific: Doctor Mihaela Badea

Absolvent: [anonimizat] – Andreea

București

2019

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

ASPECTE CITOLOGICE ȘI HISTOPATOLOGICE ALE COLULUI UTERIN

Coordonator științific: Lector doctor Cristina Mătanie

Îndrumător științific: Doctor Mihaela Badea

Absolvent: [anonimizat] – Andreea

București

2019

INTRODUCERE:

[anonimizat], a [anonimizat], afectând preponderent femeile de vârstă fertilă sau încă active social și profesional. Perioada critică pentru dezvoltarea cancerului de col uterin este cea cuprinsă între 35-55 de ani.

[anonimizat] 2018, [anonimizat] a depășit 300 000.

[anonimizat], din păcate, o [anonimizat]. Organizația Mondială a Sănătății precizează faptul că rata mortalității prin patologia discutată este de 6 ori mai mare decât media europeană. [anonimizat] 3000 de femei sunt diagnosticate anual în țara noastră cu aceasta afecțiune. [anonimizat], [anonimizat] (HPV), cunoscut drept factor princeps în dezvoltarea neoplaziilor de col uterin. Descoperirea acestui virus ca fiind principal agent etiologic al cancerul de col uterin și al stadiilor precursoare acestuia, a revoluționat screeningul de col uterin și rolul citologiei în procesul de screening.

Diagnosticul cât mai precoce al leziunilor cu potențial malign sau al celor maligne de la nivelul colului uterin rezidă atât în posibilitatea inițierii unui tratament adecvat cât și în evitarea apariției unei adevărat cohorte de implicații negative asupra calității vieții celor în cauză sau a aparținătorilor acestora. [anonimizat], [anonimizat] o eficiență și sensibilitate crescute.

Lucrarea de față și-a propus să evidențieze importanța realizării testelor histopatologice și de imunhistochimie a materialului biologic recoltat în cadrul testului Papanicolau pentru diagnosticarea precoce a leziunilor maligne de col uterin.

Pentru posibilitatea întreprinderii acestui studiu mulțumesc D-nei Doctor Mihaela Badea, D-[anonimizat].

PARTEA TEORETICĂ

CAPITOLUL I: ASPECTE STRUCTURALE ȘI FUNCȚIONALE ALE TRACTULUI GENITAL FEMININ

1.1 Trompele uterine

Trompele uterine mai sunt cunoscute și sub denumirea de oviducte sau tube utermine. Acestea se extind lateral din uter spre ovare (fig. 1). [anonimizat] a ovarului, unde se încurbează posterior. Acestea sunt în număr de două, situându-se între ovar și uter, fiind un organ extrem de mobil. Trompele uterine constituie prima porțiune a căii genitale (Marcu-Lapadat, 2005).

O trompă uterină, măsoară în medie 10 – 12 cm și are un diametru intern de 1 – 2 m. Trompele sunt alcătuite din patru părți: infundibul, ampulă tubară, ismul și porțiunea uterină care traversează cornul uterin.

Fig. 1 – Alcătuirea sistemului reproducător feminin (Sursă: https://www.calivitavelcu.ro/aparatul-genital-feminin.html)

Infundibilul are forma unui palier, reprezentând extremitatea laterală a trompei uterine (fig. 2). Acesta se deschide în cavitatea peritoneală. Pereții cavității peritoneale sunt adânc crestați și formează fimbriile trompei uterine, înconjurând ovarul. Baza pavilionului este formată din 10 – 15 fimbrii, dintre care una este cea mai lungă, numită fimbria ovarică. Aceasta aderă la ligamentul tubo-ovarian și are o lungime de 20 mm.

Când ovarul este eliberat în cavitatea peritoneală, este captat de trompa uterină, apoi este condus de-a lungul acesteia prin mișcări peristaltice, până la uter.

Fig. 2 – Structura tractului genital feminin (Sursa: http://medicaldictionary.thefreedictionary.com/uterus)

La nivelul extremității distale a trompei uterine se găsește o dilatare numită ampulă tubară. Aceasta are lungimea cuprinsă între 7 – 9 cm, fiind cel mai lung segment din alcătuirea trompelor uterine. O data cu apropierea de infundibulul tubar ampula tubară se lărgește , la acest nivel având loc fecundația (fig. 3). Epiteliul ampulei tubare este cilindric, fiind alcătuit din două tipuri de celule: ciliate și secretorii. Celulele ciliate sunt mai numeroase în infundibulum, reprezentând aproximativ 60 – 70% din populația celulară și mai puține în istm, adică 25% din populația celulară. Mișcările cililor sunt orientate în direcția cavității uterine. Celulele secretorii sunt neciliate, dar au în alcătuire microvilozități spre lumenul trompei. Acestea produc și secretă lichidul tubar, care reprezintă material nutritiv pentru ovul (Marcu-Lapadat, 2005).

Fig. 3 – Fecundarea (Sursa: http://www.copilul.ro/sarcina/saptamani-sarcina/Saptamana-2-desarcina-ovulatia-si-fecundarea-a5431.html )

Ismul este un segment îngust, adiacent uterului și se întinde între ligamentul rotund al uterului și ligamentul propriu al ovarului. De asemenea, acesta are o lungime de 3 – 4 cm.

Porțiunea intramurală și intrauterine ce traversează cornul uterin are o lungime de aproximativ 1 cm, cu o direcție oblică, deschizându-se în uter la nivelul ostiului uterin, iar apoi străbate peretele uterin.

Trompele uterine se fixează prin următoarele mijloace:

• Mezosalpingele;

• Ligamentul tubo-ovarian sau infundibulo-ovarian;

• Legătura cu cornul uterin.

Trompele uterine sunt fixate în mezosalinge, adică în marginea superioară a ligamentului larg. Prin mezosalpinge trec vase de sânge, vase limfatice, iar nervii vegetativi pătrund în trompe prin mezosalinge, adică prin aripioara superioară a ligamentului larg al uterului.

În interior, tuba uterină delimitează un canal care reprezintă plici longitudinale (fig. 4). Plicile sunt slab dezvoltate la nivelul ismului, dar sunt foarte bine reprezentate la nivelul ampulei tubare.

Fig. 4 – Secțiune transversală prin tub uterin (Sursa:  http://www.glowm.com/section_view/heading/Clinical%20Anatomy%20of%20the%20Uterus,%20Fallopian%20Tubes,%20and%20Ovaries/item/1 )

Peretele trompelor uterine este reprezentat de tunicile musculară, seroasă și mucoasă. Tunica musculară este formată din două straturi de fibre musculare netede, situate în stratul intern circular și mai gros, iar în stratul extern fiind dispuse longitudinal, mai subțire. Limitele dintre cele două straturi sunt de obicei distincte deoarece acestea au o dispoziție spiralată.

Mucoasa trompei uterine este alcătuită din plice longitudinale cu aspect stelat. Mucoasa fiind alcătuită din epiteliu și lamina proprie. Lamina fiind alcătuită dintr-un strat subțire de țesut conjunctiv lax. Plicele sunt formate din celule epiteliale cilindrice, ale căror cili vibratili se mișcă în direcția uterului. Plicele mucoasei sunt mai accentuate în lumen, alcătuind un labirint, care parcă astupă lumenul.

Epiteliul trompei uterine suferă modificări ciclice, în funcție de ciclul menstrual. În prima fază a ciclului: ziua 1 – 14, celulele cresc în înălțime, atingând înălțimea maximă în jurul ovulației. După ovulație, înălțimea lor scade sub acțiunea progesteronului, diminuând în același timp și numărul celulelor ciliate.

1.2 Uterul

Este un organ muscular, cavitar și piriform, fiind situat în cavitatea bazinului mic (fig. 5). În interior, uterul are o cavitate sub formă de pară răsturnată, grandulară, cu rol de a găzdui ovulul fecundat și este situat în oasele centurii pelviene. În funcție de vârsta femeii și a perioadei ciclului menstrual, endometrul suferă modificări importante, iar dacă fencundarea nu a avut loc, acesta se elimină în timpul menstruației. Uterul este situat deasupra vezicii urinare și comunică cu trompele uterine în lateral, iar în partea de jos comunică prin colul uterin cu vaginul.

Din punct de vedere anatomic, uterul prezintăă trei porțiuni: suprioară, fiind cea mai dilatată, corpul uterin, o zonă mijlocie mai îngustă, istmul și o porțiune inferioară, cilindrică, colul uterin. Prin intersecția cu vaginul, colul este împărțit în două zone: supravaginală și subvaginală cu predominanță în vagin. La acest nivel se găsesc trei cavități: cavitatea corpului uterin, canalul istmului și canalul colului uterin sau canalul cervical.

Fig. 5 – Tractul genital feminin – imagine de ansamblu (Sursa: http://www.calivitavelcu.ro/aparatul-genital-feminin.html)

Uterul se dezvoltă alături de celelalte organe genitale interne feminine ( trompe uterine și vagin, din canalele lui Müller denumite și canalele paramezonefrotice).

Canalele lui Müller prezintă trei porțiuni: o porțiune cranială, dilatată, numită ostium, o porțiune intermediară care se deschide prin mai multe orificii în cavitatea cloacală și una caudală, în care cele două canale Müller se apropie, dar rămân separate printr-un sept ce se resoarbe în luna a treia de viață intrauterină, când se va forma prin unirea celor două canale, canalul uterovaginal. Astfel, din porțiunea cranială și din zona de început a porțiunii intermediare se vor forma trompa uterină, porțiunea intermediară, corpul și cervixul uterin, iar din porțiunea inferioară a canalului uterovaginal se va forma vaginul.

Greutatea uterului variază de la 30 până la 100 g, iar dimensiunile uterului variază chiar și la aceeași persoană, în funcție de vârsta acesteia. Pe timpul sarcinii dimensiunile se modifică semnificativ: de la o medie de 6 – 8 cm lungime și 3 – 4 cm lățime, poate atinge spre sfârșitul perioadei gestaționale aproximativ 30 cm. Lungimea uterului la o femeie care a născut reprezintă 8 – 9 cm, istimea fiind de 4 – 5 cm, diametrul antero-posterior de 2,5 cm, grosimea peretelui muscular proximativ 1,2 cm, iar la femeia nulipară uterul măsurând aproximativ 7,5 cm lungime, 5 cm lățime și 2,5 cm grosime.

Colul prezintă la palpare o rezistență reductibilă, dar în graviditate, prezintă o consistență moale, catifelată. Culoarea acestuia este roz pal. În preajma menstruației sau a unei sarcini devine roșu violaceu.

Uterul este alcătuit din două părți: corpul uterin și cervixul sau colul uterin. Acesta este capabil de schimbări majore în timpul perioadei fertile. Îcepând cu pubertatea și terminând cu menopauza, endometrul este eliminat în cursul menstruației, fiind înlocuit treptat în cursul următorului ciclu menstrual.

Cervixul poate fi simțit la palpare ca o mică gropiță (fig. 6). La o femeie nulipară, orificiul extern al colului este circular și de dimensiuni mici, iar în timpul nașterii, acesta se dilată pentru a permite trecerea copilului. După naștere, acesta capătă o formă de fantă. Uterul se destine în timpul sarcinii, permițând dezvoltarea fătului și asigurându-i acestuia protecția și nutriția. În același timp împiedică contracțiile fibrelor musculare. Uterul își modifică rolul și începe să se contracte atunci când fătul este matur pentru a permite expulzia copilului și a placentei. După naștere acesta se contractă strâns pentru a închide vase mari de sânge care au aprovizionat placenta, revenind repede la starea anterioară, dvenind capabil să adăpostească alt ou. Înainte de pubertate și după menopauză, uterul pare să nu aibă nici o funcție. Toate modificările suferite de uter sunt orchestrate de hormonii eliberați de hipofiză, de ovare și de substanțele asemănătoare denumite postglandine, eliberate prin țesutul uterin.

Fig. 6 –Cervix (Sursa: http://www.medindia.net/patients/patientinfo/cervix-function.htm)

1.2.1 Corpul uterin

Are aspectul unui trunchi de con, fiind turtit antero-posterior. Prezintă două fețe: anterioră sau vezicală și una posterioară sau intestinală. Acesta se mai numește fun uterin.

Corpul uterin prezintă două margini laterale cu forme concave la femeile nulipare, iar la cele multipare fiind convexe. La femeile multipare fundul uterin prezintă două unghiuri tubare, numite coarne uterine care se continuă cu trompele uterine, iar la femeile nulipare este drept.

Peretele uterului prezintă trei tunici:

tunica mucoasă sau endometrul;

tunica musculară sau miometrul;

tunica externă sau perimetrul, seroasa peritoneală.

Miometrul, la rândul lui are arhitectura alcătuită din trei straturi: extern, mediu și intern. Stratul extern este compus din fibre oblice și longitudinale. Fibrele musculare ale stratului vascular sau mediu constituie un strat bine dezvoltat. Stratul subvascular este constituit din fibre musculare și circulare dispuse în spirală.

Endometrul este format din chorion și epiteliu de acoperire. Ca structură, acesta constituie un epiteliu unistratificat cilindric. Epiteliul unistratificat cilindric are în componența sa două tipuri de celule:

celule ciliate, ce predomină în faza proliferativă estrogenică;

celule secretorii, predominante în faza secretorie.

Tunica mucoasă este alcătuită din două straturi: unul funcțional și unul bazal.

Mucoasa colului este tapetată cu epiteliu pavimentos pluristratificat, iar mucoasa canalului cervical este formată din celule ciliare cilindrice și calciforme ce secretă mucus.

Chorionul este format din țesut conjunctiv lax, fiind foarte bogat în celule. Celulele chorionului sunt reprezentate de firbroblaste dispuse în vârtejuri. În structura sa, chorionul are și glande uterine, care sunt simple sau ramificate din punct de vedere tubular.

Endometrul este împărțit în două zone:

zona superficială – zona care se necrozează, eliminându-se în cursul fazei menstruale. Este irigată de arteriole spiralate care sunt hormono-dependente, adică suferă modificări în funcție de hormoni;

zona regenerativă – aflată în treimea inferioară a endometrului. Aceasta nu se elimină și este responsabilă de regenerarea endometrului, fiind irigata de artere obișnuite, nutritive.

Cea mai groasă tunică a peretelui uterin este reprezentată de miometru, fiind alcătuită din fibre musculare netede, dispuse în trei straturi:

stratul intern – orientat longitudinal;

stratul mijlociu – este cel mai gros strat. Conține fibre musculare orientate circular. O particularitate importantă este faptul că acest strat conține vase sangvine mari lipsite de adventice;

stratul extern – orientat circular.

1.2.2 Colul uterin

Este porțiunea inferioară a colului uterin, are formă cilindrică, fiind de fapt singura parte din uter care se poate simți cu ușurință prin palpare. Inserția vaginului împarte colul uterin în două porțiuni: una supravaginală și una intravaginală. Colul este strbătut de canalul cervical care se continuă apoi cu cavitatea corpului uterin. Peretele prezintă două tunici:

țesut conjunctiv bogat în fibre elastice și adventice;

mucoasă mulsculo-elastică fiind alcătuită din fibre musculare netede.

În timpul sarcinii, la naștere sau chiar în timpul ciclului menstrual se poate observa plasticitatea deosebită a colului uterin. Consistența la nulipare este clasică, fermă, asemănătoare cu cea a cartilajului din vârful nasului. Pe parcursul fazei proliferative se produce o scădere a tonusului cervical, aceasta fiind maximă în perioada preovulatorie, când orificiul extern se dilată, spre deosebire de faza luteală unde colul se închide și consistența crește. Este considerat faptul că estrogenii ar avea efect de relaxare asupra fibrelor musculare, printr-un mecanism Pg E2, al cărui nivel crește preovulator și premenstrual (Bygdeman M. Și colaboratorii, 1979). Consistența colului uterin este în scădere în perioada de gestație a femeii din cauza vascularizației intense. Structura și consistența sa devine moale și catifelată în această perioadă. La femeile multipare, această consistență este mai redusă în mod normal.

Colul uterin are formă de butoiaș, cilindrică. Acesta are în componența sa ostiul uterin sau orificiul uterin, care la multipare are formă de fantă transversală de aproximativ 1 cm, iar la nulipare este punctiform.

Axul central al colului uterin conține fibre musculare netede, în proporție de aproximativ 15 % și țesut conjunctiv abundent, circa 85 %.

Colul uterin prezintă două versante cu structură diferită:

endocolul;

exocolul.

Exocolul este porțiunea vizibilă îndreptată către cavitatea vaginală, fiind acoperit de un epiteliu stratificat, pavimentos, necheratinizat și cu un corion aglandular. La nivelul orificiului extern al canalului cervical se face bruc tranzacția dintre cele două structuri.

Canalul endocervical sau endocolul ce continuă istmul este format din epiteliu simplu, cilindric, cu numeroase celule mucoase și un corion glandular. Conține glande cervicale de tip mucos, secreția acestor glande fiind foarte fluidă la ovulație pentru a permite ascensiunea spermatozoizilor în uter. Secreția devine foarte vâscoasă în faza secretorie, de asemenea și în timpul sarcinii, pentru a preveni pătrunderea microorganismelor în uter (Albu M.R, 1996).

În timp inflamația colului uterin poate declanșa obstrucția canalelor glandelor secretoare, adică se pot forma chisturi Naboth.

Colul uterin este alcătuit din punct de vedere histologic din:

seroasă;

tunica musculară;

miometru;

mucoasă.

Pe fața anterioră și la nivelul marginilor laterale de o adventice alcătuită din țesut conjunctiv se găsește seroasa colului uterin. Pe fața posterioară colul este protejat de peritoneu.

Structura cervixului constituie componenta proeminentă în care pot fi observate fibre musculare, fiind o structură conjunctivo-vasculară.

Fibrele netede ale cervixului se continuă în partea superioară cu cele ale miometrului, iar la limita înserției cu vaginul se vor continua cu cele din tunica musculară a acestuia. În partea superioară, fibrele musculare netede sunt groase, dense, dispuse radiar sau în spirală. Aceste fibre sunt aranjate sub formă de fascicule unite între ele printr-un țesut elastic, puternic vascularizat, mai ales în porțiunea supravaginală. Aceste fibre se răresc și sunt mai groase în jurul vaselor de sânge mai mari, iar țesutul conjunctiv este mai bine evidențiat, iar în porțiunea inferioară fibrele musculare netede se răresc. Prin urmare, în porțiunea vaginală a colului predomină șesutul elastic și conjunctiv, fibrele musculare rărindu-se și având o dispoziție oblică. Tot în această zonă mai sunt prezente și fibrele musculare ce fac legătura între straturile profunde și cele periferice. Sunt și situații în care predomină cantitativ fibrele musculare netede în comparație cu țesutul elastic.

La nivelul colului, mucoasa este alcătuită din corion și epiteliu care sunt separate printr-o membrană bazală. Între mucoasa de la nivelul porțiunii vaginale și cea a canalului cervical există o diferență evidentă. Aceste deosebiri sunt evidente în primul rând prin epiteliul ce căptușește și protejează cele două porțiuni.

Pars vaginalis sau exocolul și endocolul sunt cele două porțiuni ale colului. Endocolul este acoperit de un epiteliu unistratificat cilindric, iar exocolul este căptușit de un epiteliu stratificat pavimentos scuamos. Exocolul este necheratinizat fiind asemănător celui vaginal (Băniță M, 2006).

La femeia adultă epiteliul stratificat pavimentos al exocolului este alcătuit din următoarele straturi, dispuse din profunzime spre suprafață astfel:

stratum cilindricum sau stratul bazal – numit și strat germinativ, fiind în contact cu membrana bazală. Este format dintr-un singur strat de celule cubice, mici, cu nuclei mari, hipercromi și cu un raport nucleo-citoplasmatic ridicat. Stratul germinativ este din punct de vedere funcțional este stratul regenerator, unde au loc fenomene de multiplicare;

stratul prabazal sau stratul spinos profund – alcătuit din mai multe straturi poliedrice, cu nuclei hipercromi și mari. Din punct de vedere funcțional are tot rol de regenerare, de aceea în acest strat se pot remarca mitoze;

stratul intermediar sau stratul spinos superficial – format din mai multe rânduri de celule poligonale turtite, cu nuclei mici și slab colorați. Celulele din acest strat au citoplasmă clară, iar datorită acestui fapt se mai numește și stratul celulelor clare, deseori vacuolizate. În acest strat este elaborat glicogenul;

stratul de cornificare intraepitelială Dierks sau stratul granulos conține numai câteva rânduri de celule plate. Celulele din acest strat au citoplasma și nucleul au tendința de colorare mai intense și uneori se pot remarca granulări de cheratohialin;

stratul extern superficial sau stratum corneum (Papanicolau) sau stratum functionalis (Dierks). În zona superficială a acestui strat celulele sunt uneori anucleate și apar scuame anucleare.

Limita acestor straturi ale exocolului nu este bine definită, în special în stratul spinor profund și superficial, lucru determinat și demonstrat de Hackemann și colaboratorii săi. Din acest motiv, aceștia au diferențiat dor trei straturi: germinativ, spinos și superficial.

Deși se pierd celule de la suprafață, integritatea structurală a epiteliului exocolului este menținută deoarece echilibrul se paăstreză prin proliferarea din profunzime. Populația de celule ale epiteliului se reînnoiește în patru faze: formarea celulară prin diviziune mitotică a celuleror bazale, diferențierea sau faza de activitate funcșională și descuamarea.

Epiteliul exocolului are nevoie de 96 de ore pentru aceste procese. Prin studiile de cinecetică celulară s-a demonstrat că cel mai mare indice de marcaj se înregistrează în stratul parabazal, iar în stratul bazal are loc cel mai mare ciclu celular.

Prin cercetările acestui domeniu și a histochimiei s-au descoperit și s-a demonstrat că în epiteliul pavimentos al exocolului există următoarele componente biochimice, acestea prezentând și diferite varietăți fiziologice, cum ar fi:

acizii nucleici – exită un declin progresiv între cantitatea de ARN și ADN instalat odată cu apariția maturității celulare. Cantitatea de ARN din citoplasma celulelor influențează potențialul de crștere al celulelor, iar bazofilia citoplsmatică a celulelor bazale și parabazale este reflectată de conținutul de ARN;

în stratul superficial se găsesc mucopolizaharide neutre ce prezintă numeroase modificări ciclice importante: în primă fază a ciclului se înregistrează o cantitate mare de glicogen, iar în a doua etapă se obeservă un nivel reidicat al mucopolizaharidelor;

glicogenul se găsește în porțiunile superioare ale epiteliului exocolului. În acest țesut cantitatea glicogenului variază în funcție de vârstă, faza ciclului ovarian și de sarcină.

în stratul intermediar și cel superficial se identifică rar cheratină;

în zona glanulară și în stratul bazal găsim evidemțiate lipide.

Canalul endocervical și glandele care sunt pătrunderi ale zonei epiteliale în stromă sub formă de „cripte” sunt tapetate de un singur trat de celule epiteliale cilindrice. În acest strat celulele pot fi secretante-mucipare, iar altele pot fi ciliate, fiind extrem de rare. Celulele mucipare oferă citoplasmei claritate și bazofilie datorită bogăției de mucină. Aceste celule mai pot avea citoplamă PAS-pozitivă, Alcalin blau pozitivă cu un pH de 2,5. În funcție de activitatea accesorie a fiecărei celule, celulele mucipare au nucleul dispus bazal sau central.

Howard și colaboratorii au descoperit în 1951 că celule cilindrice, celulele „de rezervă”, celulele de talie mică sunt considerate sursa de regenerare a epiteliului cilindric. Joncțiunea dintre epiteliul exocolului și endocolului și stroma subadiacentă este referită ca membrana bazală, care în microscopia optică se evidențiază sub forma unei texturi fibrilare foarte fine, prin reacția PAS și impregnarea argentică (Rodica Duțu, 1985).

Stroma densă este constituită din numeroase celule conjunctive, fibre elastice și colagenice, rar fiind reprezentate în alcăturie și fibre musculare netede, cu precădere în porțiunea suprioară. Subepitelial, se găsește uneori și o zonă foarte îngustă de țesut cvasimixoid lax. Subepitelial, zona este vascularizată de o rețea complexă de capilare sangvine. De asemenea, se mai pot observa papile ale stromei care înglobează capilarele. Această rețea de capilare devine vizibilă ușor după menopauză, atunci când epiteliul devine atrofic.

La nivelul orificiului extern se realizează joncțiunea dintre cele două epitelii. Aceasta se realizează fie prin contact direct, fie printr-o zonă de transformare formată dintr-un epiteliu metaplazic. Această diferențiere a epiteliilor are diferite variații individuale pe parcursul vieții. În cursul activității genitale, mucoasa endocervicală are tendința de a se extinde peste orificiul extern, iar după pubertate și după încetarea activității ovariene, epiteliul cilindric este împins în canal de către epiteliul stratificat pavimentos (Rodica Duțu, 1985).

Aspectul exocolului variază în diferitele parioade ale vieții. La nou-născuții de sex feminin epiteliul este foarte gros, iar stratul celulelor intermediare este reprezentat de celule voluminoase, bogate în glicogen.

Ca urmare a procesului intens de descuamare, după aproximativ 2 – 3 săptămâni, se instalează o hipoplazie fiziologică ce va dura până în perioada pubertății. În plină activitate genitală, este prezentă dezvoltarea maximă a epiteliului, adică în ziua a 15-a a ciclului menstrual.

După ovulație și după instalarea fazei luteinice apar modificări regresive care se manifestă prin:

dispariția sau diminuarea zonei de cornificare Dierks;

reducerea stratului superficial;

diminuarea numărului de celule intermediare.

Modificările periodice ale epiteliului sunt întrerupte de sarcină: celulele bazale proliferează intens, iar celulele din stratul intermediar cresc în volum prin hipersecreție glicogenică. Epiteliul exocolului se turtește după naștere și în perioada alăptării se instalează proliferarea. După instalarea ciclului menstrual apare structura normală a acestui epiteliu, iar epiteliul pavimentos al exocolului suferăo nouă ovulație în menopauză, fapt ce determină foarmarea și instalarea unui epiteliu atrofic, alcătuit doar din celule bazale.

La nivelul mucoasei endocolului modificările celulare nu sunt la fel de evidente așa cum sunt în epiteliul exocolului. Se constată o proliferare mai intensă a țesutului în perioada ciclului menstrual de maximum estrogenic și apariția de papile. În mucoasa endocervicală, apar modificări hiperplazice în perioadele de sarcină fiind însoțite și de fenomene de metaplazie pavimentoasă. Corpul endocervixului este infiltrat în leucocite și bine vascularizat. Pot există și modificări deciduale în acestă perioadă, fiind destul de intense în dezvoltare, imprimând astefel zonei respective caracter polipos.

CAPITOLUL II: ASPECTE PATOLOGICE ALE COLULUI UTERIN

2.1 Modificări citologice descrise prin Sistemul Bethesda.

Aurel Babeș descoperă pentru prima dată că efectuarea frotiului citologic este o metodă utilă pentru diagnosticul leziunilor de col uterin. El a fost primul care a descris prezența celulelor canceroase pe frotiuri realizate cu celule recoltate de la nivelul colului uterin și a remarcat potențialul utilizării metodei citologice în diagnosticul cancerului de col uterin. Aurel Babeș împreună cu profesorul de ginecologie Constantin Daniel, a prezentat lucrarea cu titlul “Posibilitatea diagnosticului cancerului uterin cu ajutorul frotiurilor” în sesiunea Societății de Ginecologie din București din 23 ianuarie 1927, cu un an înainte de comunicarea științifică a lui Papanicolaou. Lucrarea lui Babeș a fost mai apoi publicată în Analele Societății de Ginecologie din București din 5 aprilie 1927, sub titlul “Diagnosticul cancerului colului uterin prin frotiuri”. Întregul text al lucrării precum și ilustrațiile realizate de către autor, reprezentând modificările celulelor epiteliale maligne au fost preluate de prestigioasa revistă medicală franceză Presse Médicale, care le publică în numărul din 11 aprilie 1928 sub titlul „Diagnostic du cancer du col utérin par les frottis”

Faptul că examenul citologic este recunoscut peste tot în lume sub numele ”Pap-test” este din cauză că Babeș a publicat în limba română și în literatura medicală de limbă franceză, ambele fiind necunoscute comunității științifice de limbă engleză, cât și din cauză că, după acest articol excepțional, el a revenit foarte puțin asupra subiectului .

George Papanicolaou (1883-1962), american de origine greacă, contemporan cu Aurel Babeș a prezentat aceeași metodă de diagnostic citologic, independent de Babeș, în ianuarie 1928, într-o scurtă comunicare intitulată “New Cancer Diagnosis”.

Chiar dacă prima sa comunicare a apărut după un an față de cea a lui Babeș, Papanicolaou revine la tema frotiului citologic după 13 ani și publică monografia devenită celebră cu titlul de “Diagnosticul cancerului uterin prin frotiuri vaginale” în colaborare cu ginecologul H.F. Trout. Această lucrare marchează nașterea interesului internațional față de utilizarea acestei metode ca și unealtă eficace în depistarea leziunilor precanceroase ale colului uterin.

George Papanicolaou este, de asemenea și autorul primelor categorii de clasificare a rezultatelor frotiurilor citologice, care au fost utilizate pe scară largă în practica medicală până la începutul anilor '90.

Clasificarea Papanicolau presupune încardarea frotiurilor în 5 clase:

clasa I – citologie normală, absentă de celule atipice;

clasa a II -a – citologie atipica dar fara evidenta pentru malignitate;

clasa a III -a – citologie sugestivă dar neconcludentă pentru malignitate;

clasa a IV -a – citologie puternic sugestivă pentru malignitate;

clasa a V -a – citologie concludentă pentru malignitate.

Conduita medicală utilizată în funcție de clasa Papanicolau era urmatoarea:

-frotiurile din clasa I și II nu au celule atipice și nu necesită biopsie;

frotiurile persistente de tip II necesită biopsie;

frotiurile de clasa III , IV , V necesită biopsie.

Sistemul Bethesda de raportare a rezultatelor citologiei cervico-vaginale a apărut ca o nevoie de adaptare a interpretării examenului citologic la noile descoperiri științifice privind implicarea Human Papilloma Virus (HPV) în dezvoltarea leziunilor precanceroase și apariția cancerului de col. Autorul cercetărilor care au condus la incriminarea virusului HPV pentru modificările patologice ale colului uterin este medicul german Harald zur Hausen laureat al premiului Nobel în anul 2008 pentru această descoperire.

Transformarea celulelor infectate viral în celule displazice și apoi în celule canceroase necesită însă și existența altor factori. Infecția cu HPV, apare mai frecvent în legătură cu: debutul precoce al vieții sexuale, parteneri multipli, fumat. Există categorii cu risc de a dezvolta o leziune displazică și chiar cancer invaziv în urma infecției HPV, respectiv paciente cu nivel scăzut al imunității care nu pot elimina virusul sau localiza leziunile determinate de acesta. În același timp este important și genotipul viral, deoarece există peste 100 tipuri de HPV, dintre care aproximativ 40 au tropism pentru tractul genital inferior și s-a demonstrat că în cele mai multe cazuri persistența aceluiași tip viral mai mulți ani la rând reprezintă un pericol crescut de aparițe a displaziei (Zur Hausen 2000, Zaharia 2002).

Pe criterii epidemiologice aceste tipuri de HPV au fost clasificate în;

cu risc scăzut (low-risk ): 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 81 și CP6108, care determină leziuni precanceroase dar care nu progresează spre leziuni de grad înalt și cancer;

probabil cu risc crescut: 26, 53, 66; rareori determină leziuni de grad înalt și cancer

cu risc crescut (high-risk):16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , 68,73 și 82 determină leziuni de grad înalt și cancer, cele mai des întâlnite în cazurile de cancer fiind tipurile 16 și 18.

Sistemul Bethesda și recomandările privind modul de rezolvare a cazurilor cu rezultate citologice sau histopatologice anormale au fost introduse prin consens internațional în 1988 și revizuite în trei rânduri în 1991, 2001 și 2014, fiind în prezent utilizate de majoritatea laboratoarelor de specialitate din lume.

Criteriile pe care trebuie să le îndeplinească frotiurile citologice referitor la calitatea acestuia, conform sistemului Bethesda se referă la:

Celularitate. Pentru a putea fi interpretate în siguranță, un frotiu trebuie sa conțină un număr suficient de celule.

Calitatea recoltării. Pentru a considera că recoltarea a inclus și zona de transformare pe frotiu trebuie să fie prezente celule endocervicare sau celule metaplaziate (în număr de cel puțin 10).

Prima dihotomizare a rezultatelor frotiurilor citologice în Sistemul Bethesda este:

“Negativ pentru o leziune intraepitelială sau malignă”;

“Cu anormalități celulare”.

“Negativ pentru o leziune intraepitelială sau malignă” înseamnă că pe frotiu nu sunt celule cu anormalități detectabile (fig. 7).

În această categorie sunt incluse diferite variații din spectrul normal cum sunt cele care țin de vârstă, ciclul menstrual, tratamente efectuate (cum ar fi cele hormonale sau contraceptive), infecții cu Candida, Trichomonas, Herpes, Gardnerella , Actinomyces.

Fig. 7 – Diferite tipuri de celule scuamuase normale – A: celule superficiale B: celule intermediare; C: celule parabazale; D: celule metaplaziate (ob. 20x, Sursa: https://screening.iarc.fr/atlascyto.php)

“Cu anormalități celulare”

Anormalitățile celulare pe care le puteți găsi în rezultatele examenului citologic sunt de mai multe feluri, în funcție de tipul celulelor afectate (scuamoase sau glandulare) și de severitatea acestor modificări celulare:

Anormalități ale celulelor scuamose:

În aproximativ 5% din lamele examinate se constată prezența unor mici modificări celulare care nu permit încadrarea lor în categoria rezultatelor cert “negative”, dar nu sunt nici suficient de importante pentru a defini o leziune precanceroasă. Aceste modificări formează o categorie aparte numită celule scuamoase atipice cu semnificație nedeterminată (fig. 8) (cu acronimul în limba engleză ASC-US) (Ng. ADP, Reagan JW 1974).

Fig. 8 – Celulă scuamoasă intermediară cu nucleu mărit de volul și cromatină omogenă (ob. 10x, Sursa: https://screening.iarc.fr/atlascyto.php)

În categoria ASCUS intră modificările citologice sugestive pentru o leziune LSIL dar insuficiente pentru a o afirma. Acestea sunt:

celule scuamuase superficiale și intermediare cu nuclei măriți de 2-3 ori față de cel al altor celule normale;

parakeratoza atipică

celule scuamuase superficiale și intermediare binucleeate.

Studiile de cercetare privind această categorie de rezultate (Studiul ALTS) arată că aproximativ jumătate din ele au drept cauză o infecție cu HPV care la momentul respectiv nu a produs leziuni celulare semnificative, în timp ce cealaltă jumătate reprezintă mici modificări tranziente.

Prin urmare, un rezultat ASC-US înseamnă că poate exista o problemă, fapt pentru care este necesară continuarea investigațiilor. În acest sens, medicul poate recomanda una din cele trei căi de mai jos:

testul HPV (de preferat ori de câte ori este posibil);

repetarea examenului citologic după un tratament antiinflamator;

efectuarea unei colposcopii.

Atunci când evocă în mod clar o modificare precanceroasă, anormalitățile celulare sunt clasificate în două categorii principale, în funcție de riscul lor:

Leziune scuamoasă intraepitelială de grad scăzut (cu acronimul în limba engleză LSIL); Modificările care se încadrează în această categorie sunt:

celule scuamuase superficiale și intermediare cu nuclei măriți de volum disproporțional, hipercromatici;

celule multinucleate;

prezența de celule patognomonice pentru categoria LSIL – koilocite care sunt celule scuamuase superficiale și intermediare ce prezintă un halou perinuclear clar cu liziera citoplasmatică ușor îngroșată și nuclei cu diferite grade de modificări (fig. 9).

Fig. 9 – Celule scuamoase cu halou perinuclear și cu nuclei moderat măriți de voulum – koilocite tipice (Ob. 20x, Sursa: https://screening.iarc.fr/atlascyto.php )

Leziune scuamoasă intraepitelială de grad înalt (cu acronimul în limba engleză HSIL).

Celulele afectate sunt celule mici, imature, bazale și parabazale cu nuclei măriți de volum, hipercromatici, cromatina dispusă neregulat, margini nucleare iregulate (fig. 10).

Fig. 10 – Celule parabazale cu nuclei măriți și hipercromatici cu margini iregulate (Ob. 40x, Sursa: https://screening.iarc.fr/atlascyto.php)

O altă parte din frotiuri este inclusă în categoria “celule scuamoase atipice, fără a se putea exclude o leziune scuamoasă intraepitelială de grad înalt” (fig. 11) (cu acronimul în limba engleză ASC-H). În această situație pasul următor necesar este din nou colposcopia (Valente P.T, 1991).

În categoria ASCH intră modificările sugestive pentru o leziune HSIL dar insuficiente cantitativ și calitativ pentru a o afirma.

Fig. 11 – Celule atipice bazale (Ob. 40x, Sursa: https://screening.iarc.fr/atlascyto.php)

Anormalități ale celulelor glandulare:

Modificările celulelor glandulare sunt interpretate în funcție de severitatea lor în:

celule atipice(AGC), care pot fi:

– endocervicale AGC ec;

– endometriale AGC em;

– nu se pot preciza exact AGC NOS (not otherwise specified).

celule atipice în favoarea unei neoplazii;

adenocarcinom in situ (AIS);

adenocarcinom (ADK).

În această situație este nevoie de alte investigații diagnostice, care să permită luarea unei decizii potrivite în privința tratamentului.

Examenul citologic poate arăta uneori prezența celulelor canceroase, fie de tip scuamos, fie de tip glandular. Pentru diagnosticul final este nevoie de recoltarea unei biopsii, de preferat tot sub colposcop (Zaharia, 2002).

2.2 Modificări histopatologice ale colului uterin

Carcinoamele epidermoide reprezintă neoplazia cea mai frecventă a colului uterin, urmată de adenocarcinoame.

Alte variante mult mai rare sunt reprezentate de carcinoamele cu celule mici, adenocarcinoamele și sarcoamele.

În practica medicală, carcinomul de col uterin este clasificat astfel:

carcinom in situ;

microcarcinom;

carcinomul invaziv.

Carcinomul in situ – Carcinoamele intraepiteliale reprezintă o categorie morfologică și clinică bine diferențiată de carcinoamele invazive. Definiția carcinomului in situ este prezența unui epiteliu malign de tip pavimentos ce substituie epiteliul normal al colului uterin, fără a invada stroma.

Există 3 forme de carcinoame in situ:

carcinoamele in situ cu celule mari nekeratinizate;

carcinomul in situ cu celule mici;

carcinomul in situ cu celule mari keratinizate.

Cea mai frecventă formă este acea cu celule nekeratinizate ce survine exclusiv în zona de transformare, de unde se extinde spre exocervix sau la criptele endocervicale (Timmerman A, 2010).

Displazia este o leziune intraepitelială cu anomalii celulare. Se deosebesc 3 grade de displazie conform clasificării Richard introdusa în anii '60:

CIN-gradul I displazie ușoară (low grade squamous intraepitelial lesion în sistemul Bethesda) (fig. 12);

Fig. 12 – Koilocitoză ușoară și dezorganizarea treimii inferioare a epiteliului (Sursa: https://screening.iarc.fr/atlascyto.php)

CIN-gradul II displazie moderată (fig. 13);

Fig. 13 – Dezorganizarea jumătății inferioare a epiteliului, celule binucleate, mitoze anormale, koilocite (Sursa: https://screening.iarc.fr/atlascyto.php)

CIN-gradul III: displazie severă (fig. 14);

Fig. 14 – Dezorganizarea celulară a epiteliului (Sursa: https://screening.iarc.fr/atlascyto.php)

Este mai mult de 2 treimi inferioare. Se observă un grad înalt de anomalii nucleare și celulare cu motoze atipice.

Această clasificare este realizată pe baza gradului de gravitate a anomaliilor celulare și ale alterărilor structurii epiteluilui.

Din cauza gradului mare de subiectivitate implicat de distincția morfologică bazată pe aspectele clinico-terapeutice s-a adoptat conceptul unicității leziunilor intraepiteliale.

Termenul de neoplazie intraepitelială cervicală sau CIN (cervical intraepithelial neoplasia) a înlocuit termenul de displazie.

CIN I corespunde displaziei ușoare care este caracterizată printr-o scădere a polarității celulelor din treimea inferioară a epiteliului scuamos.

CIN II corespunde displaziei medii caracterizată prin înlocuirea epiteliului normal până la treimea medie cu celule imature care prezintă anomalii nucleare moderate.

CIN III corespunde displaziei severe descrisă prin dezorganizarea celulară care pătrunde și în treimea superioară a epiteliului iar celulele prezintă un grad înalt de anomalii nucleare și mitoze atipice.

Există posibilitatea de regresie spontană a CIN I, CIN II și în cazuri foarte rare, chiar a CIN III.

Carcinomul invaziv preclinic (denumiri similare: microcarcinom, carcinom microinvaziv).

Carcinomul invaziv (microcarcinom sau carcinomul microinvaziv) este acel carcinom în care epiteliul neoplazie invadează stroma în unul sau mai multe puncte, cu o profunzime mai mică sau egală cu 3 mm, dincolo de membrana bazală a epiteliului fără să fie demonstrată interesarea vaselor limfatice și sanguine (definiția societății de oncologie ginecologică FIGO din USA).

Clasificările mai recente FIGO (1986) și TNM-UICC 1997 au eliminat termenul de „carcinom invaziv preclinic" diagnosticat numai microscopic.

Astăzi, aceasta este subdivizată în Ia Is cu invazie stromală minimă și Ia2 în care componenta invazivă este mai mică sau egală cu 5 mm, localizată la baza epiteliului și cu extensie orizontală mai mică sau egală cu 7 mm. Eventuala interesare vasculară (limfatică sau venoasă) nu modifică definiția (Tsao AS, 2001).

Carcinomul invaziv

Carcinomul scuamos invaziv este subîmpărțit în 2 forme. Acestea sunt:

carcinomul scuamos cu celule mari keratinizat (cu formare de perle de keratină);

carcinomul scuamos cu celule mici fără keratinizare.

În ceea ce privește histogeneza se disting forme plurifazice și forme bifazice.

Forma plurifazică este mai frecventă (85% din cazuri). Evenimentele care se succed în carcinomul invaziv sunt reprezentate din forme de: CIN I, CIN II, CIN III și carcinom invaziv.

În forma bifazică se observă o trecere directă de la CIN I și CIN II la carcinomul invaziv. Forma bifazică este mai frecventă la femeile tinere (Utsugi K, 2004).

Schema clasică de evoluție este:

CIN I → CIN II → CIN III → CIS → cancer invaziv (Lewin SN, Herzog TJ, Barrena Medel LI et al. 2010).

CONTRIBUȚII PERSONALE

CAPITOLUL III: MATERIALE ȘI METODE

3.1. Materiale

Pentru realizarea lucrării au fost analizate microscopic frotiuri cervico-vaginale provenind de la 6 paciente și preparate microscopice provenind de la 6 paciente cu patologie de col uterin. Atât frotiurile, cât șii preparatele histologice au fost realizate la Clinica Micomi.

3.2. Metode

3.2.1. Tehnica de realizare a probelor de imunohistochimie (IHC)

Pentru a preciza diagnosticul și pentru clasificare, este foarte important să realizăm examenul imunohistochimic. În oncologie este importantă și obligatorie certitudinea diagnosticului și trebuie să se țină cont că nu este permisă începerea unui tratament specific bolii canceroase fără a avea certitudinea diagnosticului. Este o metodă ce are la bază localizarea diferiților constituienți tisulari, prin recunoașterea cu ajutorul anticorpilor a diverselor antigene tisulare. Prin această metodă se poate răspunde la următoarele întrebări: „este tumoră?, ce tip de tumoră este?, ce origine are sau de unde a pornit tumora în cazul celor cu punct de plecare necunoscut; dacă a metastazat sau care va fi evoluația bolii?”

Metoda de lucru

Deparafinarea și hidratarea:

deparafinarea se realizează prin 3 băi succesive cu toluen câte 10 minute;

hidratarea se realizează prin 2 băi de alcool etilic absolut câte 10 minute și o baie de alcool etilic 96 ș timp de 10 minute;

imersarea se realizează într-o baie de alcool 70ș timp de 10 minute.

Pretratarea lamelor:

preparatele se fierb în baia termostatată la 97 ș în soluții cu pH diferit timp de 30 de minute, apoi se răcesc și se spală cu apă distilată, după care se realizează inhibarea cu apă oxigenată 3% timp de 20 de minute, fiind tratate apoi enzimatic 2 minute, spălate cu: apă distilată de 2 * 10 minute, substrat de polimer de 2 * 10 minute;

se incubează cu ser normal de animal 20 de minute la 50 ș pentru a facilita pătrunderea anticorpului primar.

Incubarea cu anticorp primar:

se developează cu soluția primară timp de 30 de minute și apoi se spală de 2 * 10 minute.

Polimer:

se menține în soluția de polimer timp de 30 de minute, iar apoi se spală cu tampon de polimer de 2 * 10 minute;

se spală sub jet slab de apă curentă (din abundență).

DAB:

soluția de diaminobenzidină (DAB) se realizează prin: DAB – cromogen, substrat buffer;

în această soluție sunt incubate 5 – 10 minute lamele, iar apoi sunt spălate cu apă de la robinet.

Colorare cu hematoxilină cu coral pentru IHC:

Colorantul se aplică pe lame astfel încât să acopere complet lamele;

se lasă apoi 30 de minute, după care se spală cu apă de la robinet.

Contracolorare:

se face cu carbonat de litiu timp de un minut;

se spală cu apă de la robinet.

Deshidratare și clarificare:

se ralizează prin trecerea succesivă prin: alcool etilic 70 ș – 10 minute, alcool etilic de 96 ș – 10 minute, alcool etilic absolut de 2 * 10 minute și toluen de 3 * 10 minute.

Anticorpi primari utilizați uzual:

KI 67;

P16.

3.2.2. Tehnica de realizare a frotiurilor

Este o tehnică simplă, folosită în studiile microbiologiei, hematologiei, imunologiei, oncologiei etc. Principiul care stă la baza tehnicii histopatologice constă în transformarea unui prelevat dintr-un organ sau țesut, dintr-o masă tisulară opacă într-un preparat fin, translucid ce permite analizarea microscopică a detaliilor structurale tisulare. Pentru realizarea preparatului, prelevatul este supus unei serii de transformări:

Fixarea care previne alterarea și autoliza țesutului;

Prelucrarea histopatologică prin deshidratare, clarificare, impregnare cu parafină;

Includerea în bloc de parafină;

Secționarea la microtom a prelevatului inclus în parafină;

Etalarea pe lame a secțiunilor pentru a obține preparate histopatologice necolorate;

Colorarea lamelor;

Montarea lamelor pentru a fi protejate și conservate preparatele histopatologice colorate.

Produsul final este reprezentat de preparatul histopatologic permanent care permite interpretarea corectă în vederea stabilirii diagnosticului anatomo-patologic.

Pentru recipientul în care se află preparatul histopatologic, se vor efectua următorii pași:

Centrifugarea;

Întinderea pe frotiuri a meterialului histopatologic;

Uscarea preparatului;

Fixarea cu alcool etilic de concentrație 96% sau alcool metilic;

Efectuarea unei noi etape de uscare;

Coloarea Giemsa sau hematoxilină-eozină.

3.2.3. Colorarea

Este etapa prin care se urmărește creșterea contrastului dintre diferite componente tisulare prin modificarea indicilor de reacție a substratului morfologic cu ajutorul coloranților. Tehnica de colorare depinde de natura fixatorului utilizat și de țesutul care va fi examinat. Substațele folosite pentru colorare se numesc coloranți. Aceste colorări doar îl ajută pe anatomo-patolog să facă diferența între tipurile de celule dacă este vorba de o posibilă tumoră. Nu există colorații specifice care să pună în evidență tumorile maligne sau benigne.

3.2.3.1. Tehnica de realizare a preparatelor cu hematoxilină-eozină

Este o tehnică complexă de colorare a preparatelor histopatologice. Aceasta este cea mai folosită colorație în majoritatea laboratoarelor de anatomie patologică. Este o colorație uzuală, reprezentând o metodă directă progresivă, combinată, succesivă și desigur, ortocromatică. În această metodă este folosit un colorant nuclear bazic, alcătuit din hemateină și alaun de potasiu și un colorant citoplasmatic acid, eozina.

Hamtoxilina este un colorat bazic care colorează în albastru structurile bazofile, cum ar fi ADN-ul din nucleu sau ARN-ul ribozomal. Conținutul nuclear este bazofil, datorită radicalilor fosfat din alcătuirea acizilor nucleici. Preparatul va fi scufundat în hematoxilină 3 minute.

Eozina este un colorant acid care colorează în roșu structurile eozinofile și pe cele acidofile, cum ar fi proteinele din citoplasmă și din matricea extracelulară. Preparatul se va ține în eozină aproximativ 30 – 45 de secunde.

Rezultatul colorării preparatului cu această colorație standard se poate observa cu ușurință și în cazul preparatelor studiate. Astfel cu ajutorul colorației hematoxilină-eozină se remarcă modificările nucleare care sunt semne de transformări maligne ale țesutului. Se identifică grupuri de celule neoplazice care au suferit diferite modificări.:

S-a inversat raportul nucleu – citoplasmă, deoarece la o celulă normală nucleul este mai mic și rotund, iar la una tumorală, nucleul devine alungit și mare;

Nucleii pleiomorfi ocupă aproape toată citoplasma și sunt inegali ca mărime și formă. Cormatina nucleară este laxă;

Nucleii sunt denudați, iar cromatina nucleară are marginile neregulate și este incizată. Citoplasma este redusă;

Mitozele la celulele neoplazice sunt atipice, la începutul inițierii fiind abundente, iar pe parcursul evoluției tumorilor acestea se reduc;

De asemenea, nucleolii sunt modificați ca fromă și mărime (Jamamoto Ls, 2004, Sajin Maria, 2003).

3.2.3.2. Colorația Giemsa

Este o metodă care folosește un amestec de coloranți acizi, bazici și neutri. Colorează toate componentele celulei în funcție de afinitățile lor. Colorantul bazic este reprezentat de albastru de metilen, iar cel acid de eozină.

Colorația May-Grünwald-Giemsa face parte din gama coloranților neutri și este o colorație panoptică, adică permite identificarea în mod selectiv a componenților celulari în funcție de pH-ul secific. Este colorantul de elecție al frotiurilor sangvine, citologice sau tisulare.

Colorația Giemsa colorează nucleul într-un albastru intens, pe când citoplasma este mai pal colorată. Preparatul este lasat în colorant aptoximativ 20 – 30 de minute.

3.2.3.3. Colorația Papanicolau

Se utilizează pentru punerea în evidență a posibilelor celule tumorale, cum ar fi celulele de a nivelul colului uterin. Pentru realizarea colorației Pap se urmăresc o serie de pași:

Fixarea cu alcool de 96% timp de 10 minute;

Hidratarea cu apă de la robinet – 5 scufundări;

Colorarea cu soluție Harris timp de 5 minute;

Spălarea cu apă distilată – 10 scufundări;

Decolorarea cu acid – alcool – 2 secunde (alcool 70% – 1000 mL; HCL concentrat 10 mL);

Spălarea cu apă de la robinet – câteva scufundări;

Hidratarea cu alcool etilic 70%, 80%, 96% – 2 scufundări;

Colorarea cu Orange timp de 5 minute;

Spălarea cu alcool etilic 95% – 3 băi;

Colorarea cu soluție EA timp de 5 minute;

Deshidratarea cu alcool 95% Absolut – 8 – 10 scufundări;

Clarificarea în Xilen – 3 băi;

Montarea în Balsam de Canada.

CAPITOLUL IV: REZULTATE ȘI DISCUȚII

Histopatologia și imunohistochimia colului uterin

Caz 1 – Metaplazie scuamoasă imatură fără atipii, 33 ani.

Fig. 15 – Metaplazie scuamoasă imatură fără atipii, 33 ani (colorație hematoxilină – eozină, ob. 20x).

Pacientă de 33 ani cu citologii repetate interpretate Ascus, HPV 16 pozitiv, colposcopie cu modificări minore. S-a recoltat cu biotomul un fragment.

Caz 2 – Ectopie micropapilară cu metaplazie scuamoasă fără atipii, 26 ani.

Fig. 16 – Ectopie micropapilară cu metaplazie scuamoasă fără atipii, 26 ani (periaj endocervical, colorație hematoxilină – eozină, ob. 40x).

Pacientă de 26 ani, cu citologii modificate repetate, interpretate Ascus, HPV pozitiv de 2 ani pentru tipurile 6, 16, 53, 66. Se recoltează periaj endocervical.

Caz 3 – LSIL cu koilocite, 33 ani.

Fig 17 – LSIL cu koilocite, 33 ani (biopsie fragmentată, colorație hematoxilină – eozină, ob. 20x).

Metaplazie pavimentoasă cu celule poliedrice, agregate similar pietrelor de pavaj; koilocite. Celulele cu displazie moderată ce prezintă nuclei măriți, hipercromatici.

Fig. 18 – LSIL cu koilocite, 33 ani (IHC KI67, ob. 20x) – colorație nucleară în peste 30% din celulele intermediare.

Fig.19 – LSIL cu koilocite, 33 ani (IHC P16, ob. 20x) – imunoexpresie pentru markerul p16 în treimea inferioară a epitelilui (nucleu și citoplasmă).

Pacientă 33 ani, antecedente: electroexcizie în aprilie 2018, cu rezultat histopatologic CIN 2, HPV preparator pozitiv pentru 53. Citologia post excizie este interpretată LSIL – se recomandă biopsie fragmentată.

Caz 4 – Leziune intraepitelială scuamoasă de grad înalt HSIL, 35 ani.

Fig. 20 – Leziune intraepitelială scuamoasă de grad înalt HSIL, 35 ani (colorație hematoxilină – eozină, ob. 10x).

Modificări displazice semnificative: nuclei hipercromatici măriți; dispoziția celulelor tumorale în plaje extinse cu tendință de invazie.

Fig. 21 – Leziune intraepitelială scuamoasă de grad înalt HSIL, 35 ani (IHC P16, ob. 10x) – imunoexpresie pozitivă pentru P16, intensă citoplasmatică și nucleară, omogenă în toată grosimea stratului epiteliului scuamos lezional.

Pacientă de 35 de ani cu citologie modificată în urmă cu o lună, interpretată ASCH, colposcopic se descriu modificări de grad minor/mediu și se practică biopsie cu microtomul.

Caz 5 – Leziuni epiteliale scuamoase de grad scăzut LSIL și grad înalt HSIL CIN 2, 43 ani.

Fig. 22 – LSIL – HSIL cu koilocite, 43 ani ( biopsie fragmentară, colorație hematoxilină – eozină, ob. 20x).

Aspecte caracteristice LSIL și anume: proliferare pavimentoasă cu ușoare modificări displazice.

Fig. 23 – LSIL – HSIL CIN 2, 43 ani (IHC, ob. 20x) – imunoexpresie pentru markerul p16 în treimea inferioară a epiteliului (nucleu și citoplasmă) până în jumătatea epiteliului.

Modificări displazice de grad înalt, zone cu celule maligne ce prezintă nuclei hipercromatici, măriți,

Pacientă de 43 ani, fără antecedente, își face prima citologie în urmă cu două luni și este interpretată ASCH, concomitant I se recoltează și genotipare HPV care este pozitivă pentru 16. Se recomandă colposcopie cu biopsie.

Caz 6 – Carcinom scoamos invaziv, 54 ani.

Fig. 24 – Carcinom scuamos invaziv, 54 ani (colorație hamtoxilină – eozină, ob. 10x).

Celule maligne de tip pavimentos, cu nuclei intens hipercromatici, dispuși în treimea inferioară a epiteliului.

Fig. 25 – Carcinom scuamos invaziv, 54 ani ( IHC KI67, ob. 10x) – imunohistochimie ki-67, pozititvitate intens nucleară.

Fig. 26 – Carcinom scuamos invaziv, 54 ani (IHC P16, ob. 10x) – pozitivitate intensă citoplasmatică și nucleară, omogenă în toată tumora.

Pacientă 54 ani, cu citologii modificate în ultimii ani, fără să se poate afirma rezultatele. Spotting în ultima lună. La examinarea colului cu valve se vizualizează formașiune exosftică cu sângerare activă pe buza anterioară. Biopsie cu biotomul.

Citologie cervico – vaginală

Martor I – Frotiu negativ pentru o leziune intraepitelială sau malignă, 22 ani.

Fig. 27 – Frotiu de tip 1, Babeș – Papanicolau, 22 ani (citologie în mediul lichid Thin Prep, colorație Papanicolau, ob. 20x).

Se observă celule pavimentoase de tip superficial, cu aspect poligonal și nucleu pignotic.

Fig. 28 – Frotiu de tip 1, Babeș – Papanicolau – detaliu, 22 ani (citologie în mediul lichid Thin Prep, colorație Papanicolau, ob. 40x).

Detaliu – celule intermediare și celule superficiale.

Pacientă 22 ani, fără antecedente în patologia colului uterin, control de rutină în ziua a 15-a a ciclului menstrual, se recoltează frotiu în mediul lichid cu precitire automată ThinPrep. Colorație Papanicolau.

Martor II – Frotiu de menopauză preatrofică, negativ pentru o leziune intraepitelială sau malignă, 57 ani.

Fig. 29 – Frotiu de tip 1, Babeș – Papanicolau, 57 ani (citologie în mediul lichid, colorație Papanicolau, ob. 10x).

Celule superficiale și intermediare relativ puține.

Fig. 30 – Frotiu de tip 1, Babeș – Papanicolau, 57 ani (citologie în mediul lichid, colorație Papanicolau, ob. 40x).

Detaliu – placard de celule din straturile profunde (bazal și parabazal), caracteristic pentru un frotiu atrofic.

Pacientă 57 ani, fără antecendente de patologie a colului uteri, pacientă aflată la menopauză. Control de rutină. Se recoltează citologie în mediu lichid. Colorație Papanicolau.

Caz 3 – Analiză citologică – Leziune intraepitelială scuamoasă de grad scăzut (LSIL) de etiologie HPV, 33 ani.

Fig. 31 – Koilocite, 33 ani (citologie în mediul lichid, colorație Papanicolau, ob. 40x).

Celule superficiale și intermediare normale, prezente post-terapie, aspecte inflamatorii polimorfonucleare de asemenea post-terapiei; prezintă koilocite ceea ce susține prezența infecției HPV.

Pacientă 33 ani, antecedente: electroexizie în aprilie 2018, cu rezultat histopatologiec CIN 2, HPV preoperator pozitiv pentru 53. Revine la control în ziua a 19-a a CM. Se recoltează citologie în mediul lichid.

Caz 7– Leziune intraepitelială scuamoasă de grad înalt (HSIL), 50 ani, sex feminin

Fig. 32 – HSIL, 50 ani (citologie în mediul lichid, colorație Papanicolau, ob. 40x).

Pacientă 50 ani, pacienta se află în preclimax cu sângerări de câteva săptămâni, prima citologie făcută. Se recoltează citologie în mediu lichid.

Caz 8 – HSIL, 60 ani.

Fig. 33 – HSIL, 60 ani (citologie convențională, ASCH, menopauză trofică, colorație Papanicolau, ob. 40x).

Celulele scoamoase atipice din straturile profunde (bazal și parabazal), celule cu nuclei măriți, cromatină dispusă în agregate; absența celulelor din straturile superficiale sugerează un frotiu atrofic datorită menopauzei.

Pacientă de 60 de ani, aflată în climax cu sângerări de câteva săptămâni, prima citologie din viață, se recoltează citologie convențională.

Caz 9 –HSIL cu suspiciune de invazie, 32 ani.

Fig. 34 – HSIL cu suspiciune de invazie, 32 ani (citologie convențională, colorație Papanicolau, ob. 40x) – se obeservă prezeța numeroaselor hematii.

Se observă placarde de celule maligne cu nuclei de mărimi și forme diferite, cu dispunerea cromatinei în agregate, caracteristică celulelor maligne. Limitele celulelor slab distincte, citoplasmă redusă cantitativ; pe frotiu lipsesc celulele normale (intermediare și superficiale) dar sunt prezente numeroase hematii (invazie).

Pacientă de 32 ani, prezintă sângerări de câteva săptămâni, cu citologii modificate în ultimii 2 ani, fără a putea preciza diagnosticul. Se recoltează citologie convențională.

I. Histopatologia și imunohistochimia (IHC) colului uterin.

Joncțiunea scvamo-cilindrică reprezintă zona de delimitare dintre epiteliul pavimentos stratificat care tapetează exocolul (și vaginul) și epiteliul unistratificat cilindric la nivelul endocolului. Această zonă suferă fluctuații dinamice modficțnd de multe ori poziția de-a lungul diferitelor etape biologice din viața femeii. La persoanele adulte de sex feminin, această jonțiune este localizată la nivelul orificiului extern al colului uterin (Jie LIU 2010, Simionescu C 2009, Stolnicu S 2003).

În perioada activă genital epiteliul pavimentos stratificat mai rezistent la condițiile de mediu vaginale tinde „să urce” către endocol, practic epiteliul pavimentos stratificat substiutuie epiteliul unistratificat cilindric. Acest proces poartă numele de metaplazie pavimentoasă (Georgescu, 2000) – proces aflat sub influența hormonilor ovarieni.

Conform literaturii prin metaplazie se înțelege transformarea unui țesut complet diferențiat într-un alt tip de țesut bine diferențiat – în acest caz transformarea epiteliului cilindric în pavimentos și e posibil și în sens opus (Georgescu, 2000) (fig. 15). Joncțiunea scvamocilindrică este în mod fiziologic o zonă aflată în permanentă schimbare, astfel aceste procese de substituție a unui epilteliu în alt tip de epiteliu poate fi uneori perturbată prin intervenția a diferiți factori (virotici, spermatici, hormonali).

În primul caz, pacienta prezintă pe biosie metaplazie scuamoasă imatură fără atipii, cauza fiind virală și anume HPV, apare pozitiv pentru tipul 16 (fig. 15).

În cel de-al doilea caz analizat zona de joncțiune relevă ectopie micropapilară cu metaplazie scuamoasă (fig. 16). Similar primului caz metaplazia nu este însoțită de atipii. Pe biopsie se observă proliferări scvamoase cu dispoziție papilară, iar genotiparea HPV susține infecția cu HPV tipurile 6, 16, 53, 66.

În al treilea caz se observă că zona de joncțiune relevă mataplazia pavimentoasă bine exprimată cu celule de formă poliedrică și aranjate similar pietrelor de pavaj cu spații între ele, cu aspect de crăpături (fig. 17), de asemenea se observă celule tipice pentru infecția cu HPV și anume koilocite (Georgescu, 2000).

Celulele de tip koilocit sunt de talia unei celule pavimentoase intermediare sau superficiale, cu nucleu voluminos, hipercromatic, înconjurat de o cavitate cu aspect neregulat – halou clar perinuclear. Koilocit provine din grecescul „koilos” care însemnă cavitate (fig. 17). Prezența koilocitelor reprezintă expresia caracteristică a infecției HPV. Modificările asociate infecției HPV pot fi multiple: prezența de celule atipice, cu nuclei măriți, hipercromi, modificări nucleare (fig. 17) (Deligeoroglou E, 2013).

Diagnosticul LSIL asociat acestui caz este susținut de modificările cito-patologice induse de infecția HPV și expuse mai sus.

Analiza biopsiei este completată cu investigația imunohistochimică ce relevă imunomarcajul nuclear pentru markerii KI67 (fig. 18) și P16 (fig. 19).

Imunoexpresia pentru acesti markeri se asociază cu zona inferioară a epiteliului pavimentos, zonă unde biopsia relevă prezența de numeroase celule cu nuclei intens hipercromi și cu dimensiuni variabile.

Prezența modificărilor semnificative pentru o leziune intraepitelială scuamoasă de grad înalt HSIL. În infecția cu HPV se disting două situații:

Prezența de celule cu modificări caracteristice HPV – koilocite, precum și a unor modificări nucleare discariotice incluse în categoria ASCUS (caz. 1 și 2).

Cuprinde o varietate de modificări care sunt greu de clasificat ca modificări reactive – benigne sau ca modificări specifice unui grad înalt de displazie (HSIL).

Cel de al patrulea caz (fig. 20 și 21) relevă modificări displazice semnificative, cum ar fi: nuclei hipercromatici, creșterea ratei nucleo-citoplasmatice, dispunerea celulelor tumorale în plaje extinse cu tendință de invazie. Toate aceste modificări se încadrează conform Sistemului Bethesda în displazie de grad înalt HSIL chiar cu tendință de invazie (fig. 20). Analizele imunohistochimice relevă prezența markerului tumoral P16 și se corelează cu modificări relevate de analiza biopsică (fig. 21).

Cazul cinci relevă o zonă de leziuni epiteliale scuoamoase de grad scăzut (LSIL) (fig. 22) dar și de grad înalt (HSIL) (fig.23). Modificările displazice de grad înalt constau în: acumulări de celule maligne cu nuclei intens hipercromatici, măriți, limite celulare slab distincte (fig. 23). Aceste zone displazice vizualizate pe biopsie se asociază în investigații IHC cu prezența markerului P16. Genotiparea HPV este pozitivă pentru tipul 16.

Cazul șase relevă o metaplazie pavimentoasă cu zone distincte de tranfosrmare malignă de tip carcinom scvamos. Astfel, se observă celule maligne de tip pavimentos cu nuclei intens hipercromatici, cu rată nucleocitoplasmatică în favoarea nucleului, cu slabe limite celulare (fig. 24). Analizele IHC relevă pozitivitatea intens nucleară pentru KI67 (fig. 25) și intens citoplasmatică și nucleară pentru P16 (fig. 26).

II. Citologia cervico – vaginală

Martorul unu este reprezentat de un frotiu de tip I Babeș – Papanicolau, la o persoană activă sexual (22 ani) (fig. 27 și 28), iar martorul doi de un frotiu de tip I Babeș – Papanicolau preatrofic la o persoană aflată la menopauză (fig. 29 și 30).

Analiza citologică a leziunii intraepiteliale scuamoase de grad scăzut (LSIL) de etiologie HPV. Pentru unul din cele patru cazuri analizate citologic, această analiză are valoare de verificare post-operatorie. Astfel, pacienta de 33 de ani diagnosticată histopatologic cu LSIL cu koilocite, relevă post-operator următoarele aspecte citologice: prezența de koilocite (fig. 31), dar și de celule intermediare și superficiale cu aspect normal (fig. 31), De asemenea, se observă aspecte specifice inflamației – polimorfonucleare.

HSIL cuprinde displazia moderată, severă și carcinomul in situ. Celulele displazice apar izolate sau grupate (fig. 32). Se observă celulele displazice bazale și parabazale cu nuclei măriți, cromatină dispusă în agregate; de asemenea, se observă nuclei denudați.

Frotiul citologic relevă absența celulelor din straturile superficiale ceea ce se corelează cu statusul preclimax al pacientei (50 ani).

Al treilea caz analizat citologic, cazul opt, relevă prezența de celule pavimentoase atipice – celule cu proveniență în straturile profunde (bazal și parabazal) (fig. 33). Celulele prezintă nuclei măriți, cromatina este dispusă în agregate mari – dispunere neregulată (fig. 33). De asemenea, se observă celule multinucleate – celule trinucleate (fig. 33). Aspectul general al frotiului relevă absența celulelor superficiale și intermediare ceea ce sugerează un frotiu atrofic, iar vârsta pacientei (60 ani) și anamneza susțin că atrofia se datorează menopauzei.

Frotiul citologic pentru cazul nouă relevă placarde de celule tumorale maligne (fig. 34), cu următoarele caracteristici: nucleii de mărimi diferite, de forme diferite care prezintă grade diferite de hipercromazie (fig. 34). De asemenea, se observă dispunerea în agregate a cromatinei, aspect carcteristic celulelor maligne. Citoplasma este bazofilă (albăstruie), redusă cantitativ.

Pe frotiu lipsesc celulele normale, dar sunt prezente numeroase hematii. Prezența hematiilor sugerează un proces malogn în stadiu de invazie.

CONCLUZII:

Primnele două cazuri analizate relevă aspecte de metaplazie a epiteliului pavimentos fără asocierea cu modificări celulare semnificative (fără atipii); prezența virusului HPV 16 în ambele cazuri susțin o leziune intraepitelială în stadiu incipient;

Prezența celulelor pavimentoase de tip koilocit și a altor modificări displazice (nuclei măriți, hipercromi) se corelează cu prezența markerilor KI67 și P16 și susțin diagnosticul de LSIL, leziune HPV indusă (conform genotipării) (caz. 3);

Prezența modificărilor nucleare semnificative și cracteristice unei displazii severe precum și dispunerea celulelor maligne în plaje extinse cu tendință de invazie a țesutului adiacent susțin diagnosticul de HSIL și sugerează caracterul invaziv al transformărilor celulare (caz. 4).

Corelarea analizelor histopatologice, IHC și genetice susțin diagnosticul de HSILCIN2 cu etiologie HPV 16 pentru cazul 5;

Analiza histopatologică relevă aspecte caracteristice modificărilor maligne pavimentoase de tip carcinom scvamo, iar analizele IHC (prezența markerilor KI67 și P16) susțin diagnosticul de carcinom scuamos invaziv (caz. 6);

Prezența celulelor intermediare și superficiale normale, post – operatorii, precum și polimorfonucleare susțin o îndepărtare chirurgicală eficientă a zonei cu transformare malignă;

Prezența de tip koilocit susține persistența infecției HPV la nivelul epiteliului cervical;

Prezența celulelor displazice de tip parabazal și bazal cu semnificative modificări nucleare (cromatină în agregate) susțin diagnosticul de HSIL (caz. 7);

Prezența celulelor atipice de tip bazal și parabazal în asociere cu absența celulelor intermediare și superficiale susțin diagnosticul de HSIL, la o persoană aflată la menopauză (atrofia structurilor superficiale) (caz. 8);

Plancardul de celule maligne cu importante modificări nucleare și citoplasmatice sugerează o leziune intraepitelială de grad înalt (HSIL), iar prezența numeroaselor hematii de pe frotiul citologic ridică suspiciunea de invazie și sugerează un posibil carcinom în stadiu invaziv (caz. 9).

BIBLIOGRAFIE:

Albu M.R., M. Mincu ,1996, Anatomia și fiziologia omului ,Editura Corint, București.

Baniță M., Pisoschi C., 2006, Compendiu de Histologie – Țesuturi fundamentale, Editura Medicală Universitară.

Bygdeman M. et al. New prostaglandin e2 analogue for pregnancy termination. 1979. The Lancet. 313: 1136.

Deligeoroglou E, Giannouli A, Athanasopoulos N, Karountzos V, Vatopoulou A, Dimopoulos K Creatsas G, “HPV Infection: immunological aspects and their utility in future therapy”, 2013, Infect Dis Obstet Gynecol.

Duțu R. Diagnosticul morfologic al carcinoamelor. Editura Medicala.. 1985

Georgescu D, Carmen Turlea. Citologie exfoliativa cervico-uterină.  Ed. Ars Docendi, București 2000.

Jamamoto Ls., Alves VA., Maeda My., Longatto Flito A, Utaggawa Ml, Elufneto J. “Amorpfological protocol and guide-list on uterine cervix cytology associated to Papilloma virus infection”, 2004, Rev Inst Med Trop Sao Paulo

Jie LIU, Yuan LI, Shuang LI, Dan Wang, Ting HU, Yuhan Meng, Ding MA, Hongbing Cai, Zehua Wang, Huiping Zhang, Chengliang Xiong, “Clinicopathological Features and Prognosis of Small Cell Carcinoma of the Cervix”, 2010, J Huazhong Univ Sci Technol [Med Sci] 30(5):626-630

Lewin SN, Herzog TJ, Barrena Medel LI et al. Comparative performance of the 2009 International Federation of Gynecology and Obstetrics’ Staging System for uterine corpus cancer. Obstet Gynecol 2010; 116:1141–1149.

Mihaela Marcu-Lapadat Anatomia Omului Ed. Editura Universitatii din Bucuresti (2005).

Ng. ADP, Reagan JW, Hawliczek S, et al., 1974, Significance of endometrial celles in the detection of endometrial adenocarcinoma and its precursors. Acta cytol; 18:356-361.

Sajin Maria “Colul uterin – Citohistopatologia leziunilor epiteliale”, 2003, Editura Universitara Carol Davila

Simionescu C., Cernea Nicolae., Mărgăritescu C., Georgescu C., Iliescu D., 2009, Patologia colului uterin, Editura Medicală Universitară Criova.

Stolnicu S., Rădulescu D., Mocan S., Pușcașiu L., 2003, Patologia colului și a corpului uterin Editura. Polirom.

Timmerman A, Opmeer BC, Khan KS et al. Endometrial thickness measurement for detecting endometrial cancer in women with postmenopausal bleeding: a systematic review and meta-analisys. Obstet Gynecol, 2010; 116: 160–167.

Tsao AS., RothLM., Sandler A., Hurteau JA., 2001, Cervical primitive neuroectodermal tumor.

Utsugi K., Shimizu Y., Akiyama F., et al, 2004, Clinicopathologic features of villoglandular papillary adenocarcinoma of the uterine cervix Gynecol Oncol.; 92(1):64-70.

Valente P.T., Schantz H.D., Trabal J.F., 1991, The determination of Papanicolau smear adequacy using a semiquantitative method to evaluate cellularity. Diagn Cytopathol; 7:576-580.

Zaharia Maria, Pelinescu-Onciul Dimitrie, 2002, Afecțiunile Genitale cu Virusul Papilloma Uman, Editura Diasfera.

Zur Hausen H., 2000, Papillomaviruses causing cancer: evasion from host-cell control in early events in carcinogenesis, J.Natl Cancer Inst, 92: 690-8.

Bibliografie Online

https://www.calivitavelcu.ro/aparatul-genital-feminin.html)

http://medicaldictionary.thefreedictionary.com/uterus)

http://www.copilul.ro/sarcina/saptamani-sarcina/Saptamana-2-desarcina-ovulatia-si-fecundarea-a5431.html

http://www.glowm.com/section_view/heading/Clinical%20Anatomy%20of%20the%20Uterus,%20Fallopian%20Tubes,%20and%20Ovaries/item/1 )

http://www.calivitavelcu.ro/aparatul-genital-feminin.html)

http://www.medindia.net/patients/patientinfo/cervix-function.htm

https://screening.iarc.fr/atlascyto.php

https://screening.iarc.fr/atlascyto.php

https://screening.iarc.fr/atlascyto.php

https://screening.iarc.fr/atlascyto.php

https://screening.iarc.fr/atlascyto.php

https://screening.iarc.fr/atlascyto.php

https://screening.iarc.fr/atlascyto.php

https://screening.iarc.fr/atlascyto.php