Asist. Univ. Dr. Balaș Mihaela Petre Andreea -Mihaela [626594]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

EFICIENȚA ANTI -TUMORALĂ A
UNOR SISTEME
NANOSTRUCTURATE ÎN TERAPIA
CANCERULUI

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC: Absolvent: [anonimizat]. Univ. Dr. Balaș Mihaela Petre Andreea -Mihaela

2020

1
CUPRINS

INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 4
A. PARTE TEORETICĂ
CAPITOLUL I. NANOPARTICULELE DE OXIZI DE FIER ………………………….. ………………………….. …………………. 7
I.1 TIPURI ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 7
I.2 SURSE ȘI METODE DE SINTEZĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 9
I.3 PROPRIETĂȚI ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 11
I.4 TIPURI DE ACOPERIRI ȘI FUNCȚIONALIZĂRI ALE SUPRAFEȚEI ………………………….. ………………………….. 13
I.5 APLICAȚII ÎN BIOMEDICINĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 17
CAPITOLUL II. UTILIZAREA NANOPARTICULELOR DE OXIZI DE FIER ÎN TERAPIA CANCERULUI DE SÂN …… 20
II.1 PATOLOGIA CANCERULUI DE SÂN ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 20
II.2 SISTEME NANOSTRUCTURATE PE BAZĂ DE OXIZI DE FIER UTILIZATE ÎN T ERAPIA CANCERULUI DE SÂN
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 25
II.3 MECANISME DE TOXICITATE INDUSE DE NANOPARTICULELE DE OXIZI DE FIER IN VITRO ȘI IN VIVO.
STUDII IN V ITRO ȘI IN VIVO ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 28
B.PARTE PRACTICĂ
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE LUCRĂRII ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 34
CAPITOLUL III. MATERIALE ȘI METODE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 35
III.1 NANOPARTICULELE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 35
III.2 LINII CELULARE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 36
III.3 TRATAMENTUL CU NANOPARTICULE ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 37
III.4 DETERMINAREA CITOTOXICITĂȚII NANOPARTICULELOR PRIN TESTUL MTT ………………………….. ……. 37
III.5 ANALIZA MORFOLOGIEI CELULARE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 39
III.6 DETERMINAREA NIVELULUI DE LDH ELIBERAT ÎN MEDIUL DE CU LTURĂ ………………………….. …………. 40
III.7 DETERMINAREA PRODUCȚIEI DE SPECII REACTIVE DE OXIGEN ………………………….. ……………………… 41
III.8 MĂSURAREA NIVELULUI DE OXID NITRIC ÎN MEDIUL DE CULTURĂ ………………………….. ………………… 42
CAPITOLUL IV. REZULTATE ȘI DISCUȚII ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 45
IV.1 EFECTELE NANOCONJUGATELOR CU DOXORUBICINĂ ASUPRA MORFOLOGIE I ȘI VIABILITĂȚII
CELULELOR MAMARE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 45
IV.2 EFECTE INDUSE DE NANOCONJUGATELE CU DOXORUBICINĂ ASUPRA GRADULUI DE
PERMEABILIZARE A MEMB RANEI CELULARE ………………………….. ………………………….. …………………………. 48

2
IV.3 POTENȚIALUL OXIDANT AL NANOCONJUGATELOR CU DOXORUBICINĂ ÎN CELULELE TUMORALE DE
SÂN ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 50
IV.4 POTENȚIALUL INFLAMATOR AL NANOCONJUGATELOR CU DOXORUBICINĂ ÎN CELULELE TUMORALE
DE SÂN ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 53
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 56
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 58

3
ABREVIERI

NP = nanoparticulă
ER = estrogen receptor ( receptor de estrogen )
ROS = reactive oxygen species (specii reactive de oxigen)
PLGA = acid polilactic -co-glicolic
BSA = bovine serum albumin (albumină serică bovină )
ADN = acid dezoxiribonucleic
Ppm = părți per milio n
PBS = phosphate -buffered saline (tampon salin fosfat)

4
INTRODUCERE

Nanotehnologia este domeniul folosit pentru a putea discuta și întelege conceptul de
nanomaterial ( ”nano”, gr = mic, pitic). Acest domeniu este definit î n dicționarul Webster ca fiind
„arta manipulării unor dispozitive minuscule, de dimensiuni moleculare ”. În nanotehnologie, toate
procesele care au loc și care sunt studiate, au ca unitate de măsură nanometrul (nm), ce reprezintă
a miliarda parte a unui metru. Noțiunea de nanotehnologie a fost prezentată de către fizicianul
Richard Feynman , în cursul anului 1959, în discursul numit „There’s Plenty of Room at the
Bottom”. În cadrul acestui discurs, Feynman evidențiază faptul că nanomaterialele pot fi produse
cu ajutorul ingineriei și le pot fi exploatate proprietățile în diverse domenii. Nanotehnologia s -a
dezvoltat tot mai mult, în cadrul acesteia fiind folosite nanoparticulele , care au utilizări în diferite
domenii, precum biotehnologiile, biomedicina, industria alimentară , în optică , în electronică și
multe altele . Nanoparticulele au mărimi ce variază de la 1 la 100 de nanometri, putând fi ușor
inhalate sau ingerate de către om, sau absorbite prin piele, ori injectate, ca și tratament împotriva
anumitor boli. Deși pot fi evitate problemele cauzate de expunerea la nanoparticule a organismului
prin teste asupra moficărilor morfologice și nivelului de stopare a proliferării celulare,
nanoparticulele încă pot induce efecte negative precum leziuni sau activarea răspunsului imun, care
luptă împotriva acestora.
Nanoparticulele de oxizi de fier sunt stabile din punct de vedere fizic, biocompatibile și
sigure pentru mediul înconjurător. Oxizii de fier sunt compuși minerali care se găsesc în cantitate
mare în natură, dar pot fi creați și în laborator. Acestea prezintă diferite caracterist ici fizice, chimice
și magnetice, putând fi utilizate astfel în diferite domenii, precum medicina și farmacia. Formele α
și γ ale oxidului de fier se găsesc preponderent în natură, în timp ce formele β și ε ale oxidului de
fier pot fi sintetizate în labora tor. În medicină , particulele de oxizi de fier sunt utilizate în imagistica
de rezonanță magnetică (IRM), în repararea țesuturilor și ca medicament împotriva anumitor boli,
de asemenea, pot ajuta la îmbunătățirea eficienței medicamentelor. Ansamblurile de nanoparticule
pot fi create pentru a răspunde la factorii de mediu, precum temperatura, pH -ul, câmpul magnetic,
lumina, ultrasunetele, sau activitatea enzimatică. Suprafața lor se poate lega de anumite structuri,
numite liganzi, iar complexul format poate determina răspunsuri la stimuli externi, în aplicațiile
farmaceutice.

5
Scopul lucrării este evaluarea in vitro a toxicității și a potențialului terapeutic al
nanoparticulelor de oxizi de fier conjugate cu doxorubicină pentru tratamentul cancerului de sân .
Studiul de față a fost realizat pe două linii celulare, și anume MCF -7, care este o linie celulară de
cancer de sân și MCF -12A, care este o linie de celule normale de sân . Studiul a presupus folosirea
a diverse tehnici și analize , precum tehnici de manipulare a culturilor celulare , tehnici de
microscopie optică și de fluorescență testul MTT, de determinare a viabilitatii celulare , testul lactat
dehidrogenazei (LDH), testul Live /dead, , metoda Griess de determinare a oxidului nitric și met oda
de dozarea a speciilor reactive de oxigen (SRO) .
Am structurat lucrarea în două capitole, și anume “A. Parte teoretic ă” și “B. Parte
practic ă”, în prima parte fiind prezentate aspecte teoretice ale literaturii de specialitate, iar în cea
de-a doua pa rte este prezentat studiul experimental pe care l -am realizat în cadrul laboratorului, în
care am expus celulele canceroase și celulele normale la diferite doze de tratament pe bază de
nanoparticule de oxizi de fier conjugate cu doxorubicină și am analizat efecte le indus e de acestea
asupra celule lor. Activitatea a avut loc în cadrul Departamentului de Biochimie și Biologie
Moleculară, sub atenția profesorului îndrumător.

6

A. PARTE TEORETICĂ

7
CAPITOLUL I. NANOPARTICULELE DE OXIZI DE FIER
Nanoparticulele sunt o clasă largă de materiale, reprezentate de substanțe sub formă de
particule, care prezintă cel puțin o dimensiune cuprinsă între 1 și 100 nm (Lin și colab., 2006).
Nanoparticulele sunt împărțite în ma i multe categorii, în funcție de dimensiune, structură și
proprietățile deținute, fiind distinse astfel trei categorii de nanoparticule conform Lin și
colaboratorilor săi :
a) Nanoparticule organice (lipozomi, micelii, molecule lipidice solide și polimeri), ca re se pot
degrada și pot să transporte substanțe hidrofobe și hidrofile;
b) Nanoparticule anorganice (metale, oxizi metalici, ceramică);
c) Nanoparticule pe bază de carbon (nanotuburi) (Lin și colab., 2018).
Printre nanoparticulele anorganice reprezentate de oxi zi metalici se numără și oxizii de fier.
Datorită dimensiunilor sale, care sunt comparabile cu cele ale celulelor, virusurilor, proteinelor și
genelor, acestea dețin capacitatea de a interacționa cu procesele biologice fundamentale
(McNamara și colab., 201 5). Nanoparticulele de oxizi de fier sunt foarte utilizate , datorită formei
nanometrice, aceste forme fiind de o importanță majoră în aplicațiile farmaceutice.

I.1 TIPURI
Oxizii de fier există în natură sub mai multe forme cum ar fi: magnetita (Fe 3O4), maghemita
(γ-Fe2O3 )și hematita (α-Fe2O3) fiind cele mai întâlnite, aceștia având o deosebită importanță
tehnologică.
Hematita (α-Fe2O3 ) (Figura 1) este cel mai vechi oxid de fier cunoscut și se găsește la
nivelul rocilor ș i solurilor. Este cunoscut și sub numele de oxid de fier, limonit roșu sau martit.
Hematita are o culoare roșie precum cea a sângelui, dacă este fin divizat și o culoare neagră sau
gri, dacă se găsește în forma sa cristalină, neprelucrată. Este stabil în m od normal și de obicei este
produsul final al transformării altor oxizi de fier. Forma de cristalizare este romboedrică, este opac,
este insolubil în acid clorhidric, structura sa cristalină este asemănatoare cu cea a ilmenitului sau
corindronului, nu este radioactiv, nu prezintă proprietăți magnetice la temperatura ambientală, iar
după încălzire prezintă un magnetism slab (Pârvu, 1983).

8

Figura 1 – Structura cristalină a hematitei (Teja, 2009)

Magnetita (Fe 3O4) (Figura 2) este cunoscut și ca oxidul de fier negru, minereu d e fier
magnetic, magnet natural, ferită feroasă sau piatra lui Hercules. Este una dintre cele mai interesante
faze ale unui oxid de fier, datorită polimorfismului său și proprietăților sale magnetice. Prezintă
cel mai puternic magnetism dintre toți oxizii de fier. Prezintă o mare rezistență la acizi și baze,
forma sa cristali nă este reprezentată de un sistem cubic, nu este radioactiv . Se găsește în natură sub
formă granulată, compactă sau cristalină, la nivelul rocilor magnetice (bazalt, diabaz). Poate fi
folosit ca materie primă, de asemenea, poate fi folosit de anumite anima le, precum albinele sau
porumbeii, pentru a se putea orienta, intră în componența semiconductorilor și poate fi folosit ca
material de construcție, intrând în componența betoanelor grele (Bragg, Cavendish, 1915).

9

Figura 2 – Structura cristalină a magneti tei (Teja, 2009)
Maghemita (γ-Fe2O3) apare în sol ca un produs asemănător magnetitei , sau ca produs al
încălzirii altor oxizi de fier. Maghemita este instabil termic și poate fi transformat în hematit ă, sub
acțiunea unei temperaturi ridicate. Este un oxid metastabil , într-o atmosferă oxidativă, formează
soluții solide cu magnetita . Are o structură asemănătoare cu cea a magnetitei , cu ioni de Fe3+
distribuiți randomic între situsurile octaedric si tetraedric și ioni de Fe2+ plasați în situsul octaedr ic
(Klotz și colab., 2008).

I.2 SURSE ȘI METODE DE SINTEZĂ
Sursele de nanoparticule de oxizi de fier pot fi atât natural e, cât și sintetice. Nanoparticulele
se găsesc oriunde pe Terra, atât în oceane, ape subterane, sol, cât și în organisme. Acestea sunt
compuși de fier și oxigen , având mai mult de o structură cristalină și proprietăți magnetice. Pot fi
de obicei sintetizate ca material sub formă de particule, cu dimensiuni mai mici de 100 nm, care
pot fi influențate de un câmp magnetic extern și, astfel, pot fi manipulate (Lu și colab., 2017).
Nanoparticulele sunt formate în natură pornind de la incendiile de păduri, vulca ni active,
sau datorită unor fenomene naturale precum formarea de minerale, eroziune provocată de apă sau
de vânt. Nanoparticulele natural pot exista în aer timp de câteva zile.
Nanoparticulele pot fi, de ase menea, sintetizate în laborator. De-a lungul ti mpului, sinteza
nanoparticulelor de oxizi de fier a fost cercetată prin sinteza unui mediu restrâns, reacții
hidrotermale și care au loc la temperature ridicate, reacții sol -gel, metoda poliol, injecție cu flux,
prin vapori, sau sonoliză (Campos și colab., 2015; de Toledo și colab., 2017; Assa și colab., 2016).

10
În tabelul următor sunt evidențiate metodele sintetice de formare a nanoparticulelor de oxizi de
fier:
Tabelul 1: Diferitele metode de obținere a nanoparticulelor de oxizi de fier prin căi sintetice
(Bruschi, 2019 ; Ali și colab., 2016 )
CALEA SINTETICĂ METODE
Fizică Piroliză
Litografie cu fascicul de electroni
Depunerea fazei gazoase
Chimică Co-precipitație
Microemulsie
Sinteză hidrotermală și solvotermală
Descompunere termică
Sinteză sol -gel
Sinteză prin microunde
Oxidare
Injecție cu flux
Faza aerosol/vapor
Biologică Biosinteză

Sinteza nanoparticulelor de oxizi de fier duce la existența acestora sub mai multe forme,
care au caracteristici îmbunătățite ale stabilității, biocompatibilității, răspândire mare, formă
potrivită și dimensiune controlată (Noqta și colab., 2019) . Producerea de nanoparticule de oxizi de
fier în hidrogeluri, geluri, emulsii sau alte tipuri de formule poate fi realizată prin câteva metode,
precum: amestec, in situ sau funcționalizare. Aceste metode sunt des folosite, deoarece au timp de
lucru redus și un număr mai mic de pași. Metoda de grefare este foarte folosită și este singura prin
intermediul cărei a se formează legături între nanoparticulele de oxizi de fier și sistem ul terapeutic
(Helminger și colab., 2014 ). Prin metoda de amestecare, nanoparticulele de oxizi de fier sunt
sintetizate separat de formulă, ca ma i apoi particulele precipitate și uscate din sistem să fie
dispersate. De exemplu, a fost preparat un fluid din fier și a fost adăugat într-o dispersie de n –
isopropilacrilamidă pentru a produce hidrogel magnetic.

11
Un alt punct important care trebuie luat î n considerare în timpul pregătirii nanoparticulelor
de oxizi de fier pentru produse farmaceutice este că trebuie să prezinte atât saturație magnetică
ridicată, cât și o acoperire particulară a suprafeței. Nanoparticulele ar trebui să nu fie toxice, ar
trebui să fie biocompatibile și trebuie să permită eliberarea medicamentului la locul de interes. Este
necesar ca suprafața nanoparticulelor să aibă anumite caracteristici care să permită utilizar ea
acestora in vitro și in vivo (Bruschi & de Toledo, 2019) .

I.3 PROPRIETĂȚI
Toate nanoparticulele au o serie de par ticularități chimice și fizice, precum morfologia
suprafeței, compoziția chimică și distribuția spațială a grupelor funcționale, acestea fiind
evidențiate cu ajutorul razelor X (difracție, spectroscopie fotoelectronică ), cu ajutorul
microscoapelor TEM sau SEM , AFM și prin analiza mărimii acestor particule (Buzea și colab.,
2010).
Diferitele materiale pot fi clasificate în funcție de comportamentul magnetic , pe baza
răspunsului lor la un câmp magnetic extern, care la nivel microscopic interacționează cu dipolii
atomici , producând un moment magnetic macroscopic, care poate fi măsurat. Sunt cunoscute cinci
tipuri de magnetism: diamagnetism, paramagnetism, feromagnetism , antiferomagnetism și
ferimagnetism. Materialele ferimagnetice și feromagnetice au proprietăți magnetice remarcabile.
În particular, materialele feromagnetice prezintă o magnetizare mare, M, în timpul interacției cu
un câmp, H (Khan și colab., 2015).
Dime nsiunea nanoparticulelor de oxizi de fier determină raportul suprafață -volum, care
are, de asemenea, legătură și cu reactivitatea acestora, care este responsabilă pentru fenomenul de
atracție. Magnetismul nanoparticulelor de oxizi de fier este dominat de e fectele provocate de
dimensiune, datorită structurii domeniului magnetic al materialului feromagnetic. La momentul
actual, cea mai eficientă metodă pentru determinarea mărimii nanoparticulelor de oxizi de fier este
spectroscopia prin care lumina este dispe rsată dinamic. Nanoparticulele care au o dimensiune mai
mică de 200 nm dețin multe proprietăți speciale, precum efectul de suprafață, efectul cuantic și
efectul de tunel, care deosebesc nanoparticulele de materiile brute din care provin (Chen și colab.,
2018).

12

Figura 3 – Imagini în microscopie optică de baleiaj (SEM) ale nanoparticulelor de oxizi de fier
de diferite dimensiuni (Li și colab., 2017).
Forma nanoparticulelor de oxizi de fier este de obicei neregulată și diferă de la un compus
la altul. Diametrul acestora poate influența biodistribuția in vivo a lor, nanoparticulele care au un
diametru mai mare de 200 nm putând fi ușor îndepărtate de sistemul reticuloendotelial și, de
asemenea, cele care au diametrul mai mic de 8 nm pot fi excretate din organism prin porii de la
nivelul laminei bazale a rinichilor, astfel fiind redus timpul de circulație prin sânge al acestora. Un
diametru cuprins între 10 -40 nm este ideal pentru o circulație mai îndelungată în sânge, permițând
nanoparticulelor să tra verseze pereții capilarelor și de multe ori să fie fagocitate de macrofage din
ganglionii limfatici și măduva osoasă. Astfel, dimensiunea nanoparticulelor de fier permite o
sedimentare mai mică, o suprafață efectivă mai mare și o difuzie tisulară îmbunătățită (Moghimi și
colab., 2001; Champagne și colab., 2018; Akbarzadeh și colab., 2012; Campos și colab., 2015).
Biocompatibilitatea și toxicitatea se găsesc în strânsă legătură cu natura componentelor
magnetice ale nanoparticulelor. Mai mult decât atât, nanoparticulele de oxid de fier precum
magnetita sau forma sa oxidată, maghemita , sunt cele mai utilizate. Acestea trebuie să fie făcute
din materiale neimune și netoxice, iar dimensiunea trebuie să fie suficient de mică, încât să rămână
în circulați e după ce au fost administrate și să poată trece prin capilarele mici ale organelor și
țesuturilor, pentru a evita embolia vaselor de sânge. În plus, nanoparticulele de oxid de fier trebuie

13
să prezinte un magnetism ridicat, pentru a fi controlate în interi orul sângelui și imobilizate de un
câmp magnetic în apropierea țesutului țintă (Akbarzadeh și colab., 2012).

I.4 TIPURI DE ACOPERIRI ȘI FUNCȚIONALIZĂRI ALE SUPRAFEȚEI
Funcționalizarea nanoparticulelor reprezintă procesul prin care suprafeței acestora i se atribuie
modificări, astfel încât ele capătă o afinitate mai puternică pentru mediul biologic în care sunt
introduse, putând să realizeze mai multe sarcini la nivelul organismului.
Nanosistemele core -shell sunt de obicei realizate pentru a atașa diferite medicamente la
nanoparticulele de oxizi de fier. Nanoparticula este corespunzătoare miezului, în timp ce învelișul
reprezintă acoperirea suprafeței pentru funcționalizarea nanoparticulei, îmbunătățindu -i
stabilitatea, proprietățile farmaceutice, biodistrib uția și biocompatibilitatea. Polimerii sintetici și
naturali, surfactanții organici, compușii anorganici și moleculele bioactive pot funcționa ca înveliș
pentru n anoparticulele de oxizi de fier (Wu și colab., 2010).

Figura 4 – schema principalelor învelișuri pentru funcționalizarea nanoparticulelor de oxizi de
fier. Cercul gri reprezintă miezul nanoparticulelor (Arias și colab., 2018).
Nanoparticulele de oxizi de fier care nu prezintă acoperiri la nivelul suprafeței se confru ntă cu
multe probleme, precum formarea de agregate în apă, instabilitate chimică în aer,
biodegradabilitate redusă în mediul fiziologic și interacții nespecifice cu proteinele serice. Pentru

14
a preveni apariția acestor probleme, învelirea suprafeței nanopar ticulei cu un înveliș biocompatibil
este necesară. Interacția cu celula și funcționalizarea nanoparticulelor depinde de tipul de mate rial
folosit (organic sau anorga nic) pentru a acoperi suprafața ace stora (Sodipo și colab., 2016).

Figura 5 – Materiale folosite pentru funcționalizarea suprafeței nanoparticulelor (Ansari și colab.,
2019)
În figura 5 sunt evidențiate tipurile de materiale organice și anorganice care au fost folosite
pentru funcționalizarea și acoperirea suprafeț ei nanoparticulelor de oxizi de fier.
Nanoparticulele de oxizi de fier sunt stabile din punct de vedere fizic și chimic, biocompatibile
și sigure pentru mediul încojurător. Sinteza acestor nanoparticule t rebuie să fie cunoscută și,
totodată, controlată, pentru că are legătură cu dimensiunea, forma, acoperirile și stabilitate a
moleculelor de oxizi de fier . Mai mult decât atât, din moment ce metodele de sinteză afectează
distribuția spațială a nanoparticulelor de oxizi de fier , gradul defectelor structurale, suprafața
chimică și comportamentul magnetic, influențează, de asemenea, și interacțiunea cu barierele

15
biologice ( de exemplu: bistratul lipidic al membranei) și biocompatibilitatea în organismul gazdă
(Akbarzadeh și colab, 2012; Ajdary și colab, 2018).
În mod normal, nanoparticulele de oxizi de fier sunt formate dintr -un miez cristalin și acoperiri
ale suprafeței (de exemplu: dextran, citrat, chitosan, albumină, polietilen glicol etc.), care au
dimensiuni variate, care le conferă stabilitate, le măresc nivelul de biocompatibilitate și le
optimizează biodistribuția. Aceste acoperiri ale nanoparticulelor pot fi modificate cu ajutorul unor
molecule specifice sau medicamente . Stabilizarea nanoparticulelor de oxizi de fier poate fi realizată
prin a coperirea suprafeței acestora cu proteine, amidon, detergenți neionici sau polielectroliți,
deoarece adsorbția acestor substanțe stabilizează concentrația electrolitică a nanoparticulelor, care
în alte situații ar fi fost destul de ridicată (Massart și col ab., 1987).
Oxizii de fier cu suprafață neizolată tind să formeze aglomerate din cauza atracției magnetice
puternice dintre particule, forțelor van der Waals și energiei de suprafață ridicată și astfel, sistemul
reticulo -endotelial determină eliminarea acestor aglomerate din organism. Formarea aglomeratelor
poate fi evitată prin producerea unor acoperiri la nivelul suprafeței nanoparticulelor, precum o
capsulă, care le conferă proprietăți hidrofile, devin compatibile cu mediul biologic și, totodată,
funcțio nale. Praticulele se deplasează astfel la țintă și nu au efect toxic, fiind biocompatibile.
Acoperirile suprafeței nanoparticulelor pot fi proiectate pentru:
– A asigura un înveliș reactiv pentru legarea de compuși terapeutici;
– A îmbunătăți sau a modifica dispersia acestora la nivelul țesuturilor;
– A îmbunătăți activitatea suprafeței nanoparticulelor;
– A îmbunătăți biocompatibilitatea;
– A asigura proprietăți fizico -chimice ș i mecanice nanoparticulelor;
– Îmbunătățirea comportamentului biologic al nanoparticulelor de oxizi de fier prin limitarea
interacțiilor nespecifice și preluarea de către sistemul fagocitic mononucleat;
– A spori eficacitatea internalizării nanoparticulelor de oxizi de fier ( Laurent și colab., 2014).

Acoperirea nanoparticulelor se poate realiza prin două modalităși diferite:
– Adsorbție – molecule organice mici sunt alipite la suprafața nanoparticulelor, cu ajutorul
fragmentelor de ancorare;

16
– Încapsulare – nanoparticulele de oxizi de fier sunt încapsulate într -o structură amfifilică
auto-asamblată.
În tabelul următor sunt prezentate diferitele materiale care au fost folosite p entru a acoperi
nanoparticulele de oxizi de fier:
Tabelul 2: diferite molecule de acoperire pentru nanoparticulele magnetice, folosite pentru a
le stabiliza (Attard și colab., 2016)
Molecule/polimeri Beneficii
PEG Îmbunătățesște biocompatibilitatea prin
pătrunderea necovalentă a PEG la nivelul
suprafețe i, eficiență a internalizării
nanoparticulelor, timp îmbunătățit de circulație
în sânge
Dextrani Stabilizează soluția coloidală și crește timpul
de circulație în sânge
PVP Stabilizează soluția coloidață și sporește timpul
de circulație în sânge
Acizi grași Stabilitate coloidală și a grupărilor carboxil
terminale
PVA Creștere a particulelor dispersate și previne
coagularea particulelor
Acid poliacrilic Îmbunătățește biocompatibilitatea particulelor,
ajută la bioadeziune, crește stabilitatea
Polipeptide Direcționarea către celule
Polifosforilcolina Activator al coagulării și stabilizator al soluției
saline
PoliNIPAAM Separare celulară și conducerea
medicamentului la locul de acțiune

17
Chitosan Cation polimeric linear, e biocompatibil, folosit
în tratamentul apei, biotehnologii, agricultură
etc
Gelatină Biocompatibilă, polimer natural, utilizată ca
agent de gelifiere.

I.5 APLICAȚII Î N BIOMEDICINĂ
Nanoparticulele au proprietăți unice, care le confer ă un domeniu larg de aplicabilitate . Astfel
acestea pot fi folosite în microelectronică, ca și compuși catalitic i, în producerea de pigmenți, în
producerea de straturi pentru acoperire și adezivi, pentru protecția solară, în producerea de
cosmetic e, oase si ntetice și ferofluide, ca și neutralizatori chimici, în producția de combustibili și
motorină, echipamente sportive, sau în industria farmaceutică și în medicină (Buzea și colab.,
2010).
Superparamagnetismul nanoparticulelor de oxizi de fier le conferă acestora o utilitate
însemnată în știința biomedicală . Comparativ cu alte nanomateriale, nanoparticulele de oxizi de
fier pot fi acoperite cu materiale anorganice precum silicați, acizi grași, polifosfolipide și astfel pot
fi direcționate către situsul țintă, (Li și colab., 2013).
Nanoparticulele de oxid de fier, formate din magnetită sau maghemit ă, datorită
biocompatibilității au o gamă largă de întrebuințări în domeniul biomedical, precum: agenți de
contrast pentru imagistica de rezonanță magnetică, transportul specific de medicament e, separare
magnetică, eliberarea controlată a medicamentului, terapie celulară, etichetare celulară și
embrionară, repararea țesuturilor, separarea și prelucrarea celulară, purificarea populațiilor
celulare, boli ale sistemului muscular și scheletic, inflamații severe, dizabilități și durere ,
bioimagistică, tratamentul prin hipertermie , biosenzori și ap licații de diagnosticare ( Attarad și
colab., 2016 , Khanna și colab., 2018; Xie și colab., 2018). De asemenea acestea pot fi folosite
în chimioterapie (cancer sau tumori), ca biosenzori de dimensiuni nanometrice și imagistică, pentru
implanturi, ca nanopurtători pentru vaccinuri, activitate antimicrobială, în tratarea virusului

18
hepatitei B, virusului respirator, virusului HIV, transportul de antigene pentru o anumită boală în
circulația sangvină, la prevenirea îmbătrânirii pielii .
Cele mai importante dintre utilizări le nanoparticulelor magnetice în biomedicină, în tratarea și
diagnosticul bolilor sunt:
1) Imunoanaliză;
2) Agenți de contrast în imagistica de rezonanță magnetică;
3) Transportul specific al medicamentului;
4) Terapie termică.
Toate a ceste aplicații presupun ca nanoparticulele de oxizi de fier să exercite un comportament
superparamagnetic , la temperatura camerei. Biomedicina folosește nanoparticule care sunt stabile
din punct de vedere magnetic în apă, la pH neutru în condiții fiziolog ice. Această stabilitate depinde
de dimensiunea nanoparticulelor, care trebuie să fie suficient de mică pentru a minimaliza
precipitarea acestora sub acțiunea forței gravitaționale și, de asemenea, depinde și de încărcarea și
chimia suprafeței nanoparticul elor. Magnetita și maghemita sunt cele mai folosite nanoparticule în
biomedicină , datorită biocompatibilității lor și toxicității scăzute la nivelul organismului uman .
Nanoparticulele de magnetit ă și maghemit ă cu funcție superparamagnetică, în prezența unu i câmp
magnetic extern, asigură transportul de medicament la ținta dorită, unde poate fi eliberat local.
Acest lucru permite ca doza de medicament să fie redusă și orice efect negativ al medicamentului
să fie diminuat. Suprafața nanoparticulelor folosite î n transportul de medicament este acoperită cu
medicamente, proteine și materiale genetice astfel încât să poată ajunge în locul unde trebuie să fie
eliberat medicamentul (Lubbe și colab., 1996; Kohler și colab., 2005).
Nanoparticulele magnetice sunt folosi te in vivo ca agenți de contrast în rezonanța magnetică ,
pentru imagistică celulară și moleculară. Magnetita superparamagnetic ă este utilizat ă ca și miez în
cadrul acestor agenți, pentru a putea face diferența între țesutul sănătos și cel bolnav. Particulele
superparamagnetice sunt în general acoperite cu un strat de polizaharide, care le conferă acestora
stabilitate coloidală. Particulele magne tice cu acoperire polimerică sunt folosite în separarea
celulară, purificarea proteinelor , analiza alimentelor și a mediului, sinteză organică și biochimică,
tratarea apei industriale și bioștiință. Acoperirea nanoparticulelor cu polimeri organici este fol osită
pentru a îmbunătăți stabilitatea chimică, dispersabilitatea și funcționalitatea (Kohler și colab.,
2005).

19
Nanoparticulele magnetice sunt, de asemenea, folosite în terapia cancerului prin hipertermie .
Atunci când sunt expuse unui câmp magnetic alterna tiv, nanoparticulele magnetice cu proprietăți
superparamagnetice pot fi folosite pentru a încălzi celulele tumorale, aducându -le la o temperatură
de 41 -45șC, caz în care aceste celule sunt distruse, în timp ce un țesut sănătos se poate recupera
după aceast ă procedură (Neuberger și colab., 2005).
În figura următoare sunt prezentate câteva dintre utilizările nanoparticulelor de oxizi de fier în
medicină și anume, în tratarea prin hipertemie, sunt folosite ca nanoadjuvanți, nanopurtători și
suplimente nutrițio nale.

Figura 6 – aplicații ale nanoparticulelor de oxizi de fier în medicină și sănătate
(Shivani Thoidingjam & Ashu Bhan Tiku, 2017).

20
CAPITOLUL II. UTILIZAREA NANOPARTICULELOR DE OXIZI DE FIER ÎN
TERAPIA CANCERULUI DE SÂN

II.1 PATOLOGIA CANCERULUI DE SÂN
Angiogeneza cancerului
Rata de creștere a tumorilor este determinată de difuzia de nutrienți și de oxigen și de obicei
debutează ca o aglomerare de celule care pot fi maligne sau benigne (figura 7 ). În momentul în
care dimensiunea tumorii este mai mare de 1 -2 mm, celulele nu mai pot crește și prolifera, din
cauza unei deficiențe de substanțe nutritive și devin inactive sau necrozează, formându -se astfel o
structură alcătuită din trei straturi: în centru se găsesc celule moarte, înconjurate de un strat de
celule statice, iar la exterior se găsește un strat subțire alcătuit din celule proliferative (Kerbel,
2000).

Figura 7 – Cele două tipuri de tumori – la tumorile maligne, celulele care au suferit mutații
(albastre) sunt aranjate dezordonat printre celulele normale (verzi), atacând țesuturile din jurul
lor. La tumorile benigne, celulele care au suferit mutații se găsesc la i nterior, separate de celulele
normale. Celulele roșii din centru sunt celule necrozate/moarte. (Katarzyna Rudzka, 2013)

Tumoarea poate să rămână în stare latentă, în timp ce între moartea celulelor și proliferarea
acestora există un echilibru. Prin crear ea de noi vase de sânge, tumoarea poate ieși din starea de
latență . Cauzele formării și dezvoltării vaselor de sânge la nivelul tumorii sunt asemănătoare cu

21
angiogeneza va selor normale de sânge (figura 8 ). În cazul angiogenezei cancerului, există trei etap e
semnificative care au loc pentru a se putea crea noi vase de sânge: dezintegrarea membranei bazale,
deplasarea celulelor endoteliale și proliferarea de noi celule pentru formarea vaselor de sânge
(Hobson și Denekamp, 1984).

Figura 8 – evenimentele care determină formarea tumorilor: A) tumoarea se află în apropierea
vasului de sânge, în stare latentă; B) dizolvarea membranei bazale (punctele negre), rezultând
proliferarea și migrarea celulelor endoteliale care conduc la formarea de no i vase de sânge, lucru
evidențiat în figurile C) și D)
Cancerul de sân este una dintre cauzele mortalității în rândul femeilor din întreaga lume.
Rata mare de metastază și rezistența la antibiotice sunt factori care fac ca tratarea cancerului să fie
dificil de realizat. Tratamentele convenționale, cum ar fi chimioterapia, radioterapia sau
intervențiile chirurgicale nu mai oferă rezultate favorabile și din această cauză trebuie să se
dezvolte tratamente care să producă deteriorări minore la nivelul țesutur ilor neafectate și o viață
mai calitativă pentru persoanele afectate.

22
Statisticile globale despre cancer evidențiază faptul că, deși s -au dezvoltat tehnici noi și
inovative pentru detectarea și tratarea cancerului, rata mortalității cauzată de această boal ă a crescut
la nivelul întregii lumi. Printre diferitele tipuri de cancer diagnosticate și tratate, cancerul de sân se
află pe locul 5 pentru cele mai multe decese . În India, cancerul de sân este cel mai frecvent întâlnit
dintre tipurile de cancer existent e, un procent de 21% suferind de această boală și este printre cele
mai fatale tipuri de cancer, cu o rată a mortalității de 21% (Ferlay și colab., 2012).
Riscul de prezentare a unei boli de tipul cancerului mamar devine mai crescut odată cu
înaintarea în vârstă, altfel că femeile care au o vârstă de 40 de ani, sau mai mare de 40 de ani pot
prezenta această afecțiune la nivelul sânilor.
Ca și simptome, cancerul este caracterizat în principal de formarea unui nodul sau țesut îngroșat
la nivelul sânului, care nu transimte durere. De asemenea, printre simptome se numără și:
– Umflarea sânului, în totalitate sau parțial;
– Iritație la nivelul sânului;
– Mamelonul se poate retrage către interior;
– Secreții spontane la nivelul mameloanelor;
– Exfolierea pieli i din jurul mamelonului sau de pe întregul sân.
În figura următoare este prezentat modul în care celulele canceroase invadează țesutul sănătos
și, de asemenea, faptul că un cancer metastatic se poate răspândi și la alte organe ale corpului și la
ganglionii limfatici.

23

Figura 9 – modul în care se produce cancerul de sân și cum afectează țesutul invadat, dar și
celelalte organe. ( https://ro.wikipedia.org/wiki/Fi%C8%99ier:Cancer_mamar.jpg )
Dove zile moleculare evidențiază diferitele căi care duc la producerea cancerului de sân
invaziv. Studiile despre schimb area numărului de modele de copii de gene și mutațiile prezente
evidențiază anumite modificări ge netice (cum ar fi deleții ale brațului lung al cromozomului 16 sau
adiții la brațul lung al cromozomului 1) în cancerele ER -pozitive, modificări care sunt rare în
tipurile de cancer ER -negative. Cancerul ER -negativ este predispus la apariția unor aberații
genetice mai severe, precum mutații ale genei p53, amplificări ale genei HER2, disfuncții ale genei
BRCA1 și instabilitate genomică ridicată. Este sugerat astf el ca cele două tipuri de cancer, ER –
pozitiv și ER -negativ, au două căi distincte de formare, care nu se suprapun în mod frecvent.
Aproximativ 50% dintre cancerele ER -pozitive de gradul 3 au aceleași modificări la nivelul
brațelor lungi ale cromozomilor 16 și 1 ca și în cazul cancerelor ER -pozitive de gradul 1, ceea ce
confirmă faptul că aceste două tipuri de cancere au o cale comună de formare. Cancerele ER –
pozitive de grad 3 tind să aibă acumulate mai multe modifcări genetice, ceea ce determină o rată a
proliferării mai mare și instabilitate la nivelul genomului (Natrajan și colab., 2010).

24
În figura care urmează este prezentată patogenia moleculară a cancerului de sân. Cea mai
comună cale de formare a cancerului este prezentată în partea de sus, iar căile mai puțin comune
de formare sunt prezentate în partea de jos.

Figura 10 – Căile de formare a cancerului de sân (Allison K., 2012)

Cancerul ER -pozitiv invaziv și in situ, ductal și lobular, sunt aproape identice dintr -un
anumit punct de vedere, având aceleași modificări ale brațelor lungi ale cromozomilor 1 și 16, dar
este evidențiată, în plus, o pierdere a expersiei E -caderinei in fenotipul lobular.
Studiile care evidențiază heterogenitatea mole culară și genetică a cancerului au adus în
prim -plan conceptul de evoluție clonală în cancer. Acest concept presupune că diferitele
subpopulații care au dobândit diferite mutații genetice sunt în competiție unele cu altele, odată ce
cancerul crește, progresează și metastazează ( Nik-Zainal și colab., 2012; Greaves și colab., 2012).

25
II.2 SISTEME NANOSTRUCTURATE PE BAZĂ DE OXIZI DE FIER UTILIZATE
ÎN TERAPIA CANCERULUI DE SÂN
În prezent, o gamă largă de materiale magnetice sunt studiate pentru a putea fi folosite în
transportul de medicamente pentru terapia cancerului. Un beneficiu adus de aceste particule este
transportul medicamentului direct la zona tumefiată. Nanoparticulel e magnetice sunt utilizate în
prezent în biomedicină, da torită dimensiunii lor, pot fi controlate și răspund la mijloace externe
precum câmpul magnetic variabil, astfel energia fiind transmisă de la câmpul magnetic la
nanoparticulele magnetice. Aceste prop rietăți fizice ale nanoparticulelor magnetice le oferă
acestora importanță în medicină și biologie (Pankhurst și colab., 2003).
Nanoparticulele magnetice includ nanoparticule metalice, nanoparticule de oxizi de
metale, sau nanoparticule de aliaje metalice . Nanoparticulele de oxizi de metale includ oxizii de
fier (magnetit și maghemit) și diferite tipuri de ferită (ferita de cobalt: CoFe 2O4). Nanoparticulele
magnetice de hematit ă (Fe2O3) și magnetit ă (Fe3O4) sunt cele mai utilizate nanoparticule de acest
tip, putând fi prelucrate manual și ușor de controlat din punctul de vedere al formei și dimensiunii
particulelor.
Nanoparticulele magnetice au capacitatea de a traversa barierele biologice și au o suprafață
reactivă mai mare decât omologii lor care au dimensiuni micrometrice, fapt care favorizează
utilizarea lor în sistemele de transport al medicamentelor. Diferite clase de medicamente pot fi
legate direct la nanoparticulele de oxizi de fier sau de nanosistemele core -shell, așa c um este
reprezentat în f igura 11 . O astfel de legare între medicament și nanoparticule se poate forma în
urma adsorbției, dispersiei în matricea polimerică, încapsulării în nucleu, interacțiilor electrostatice
sau atașării covalente la suprafață, fiindu -le astfel îmbunătățite pro prietățile farmaceutice.

26

Figura 11 – reprezentare a legării medicamentului direct la nanoparticula de oxid de fier sau la
nanosistemele core -shell (Arias și colab., 2018)
Maghemita este una dintre cele mai favorite nanomateriale, deoarec e nu reprezintă un
pericol mare pentru sănătatea organismului și de asemenea, datorită proprietăților sale magnetice :
ionii de Fe3+ sunt răspândiți în organism, astfel că pierderea de metal nu ar trebui să producă efecte
negative semnificative. Utilizarea alternativă a na noparticulelor de magnetit ă poate fi dăunătoare,
din cauza eliberării de ioni de Fe2+ , care produc radi cali hidroxil în reacția Fenton (Yoshida și
colab., 1999).
Una dintre cele mai mari provocări în tratamentul cancerului este toleranța dobândită pe
parcursul terapiei , fapt care duce la reducerea răspunsului la medicament. În momentul în care un
medicament este legat la o nanoparticulă de oxid de fier , toleranța poate fi depășită, datorită
reducerii „pompelor de eflux ”, care transportă m edicamentul la exteriorul celulei, ceea ce în cele
din urmă duce la o creștere a concentrației de medi cament în țesuturile canceroase .
Nanoconductorii pe bază de particule de oxizi de fier sunt, de asemenea, capabili să reducă
interacțiile nedorite cu alte molecule și efectele toxice la nivelul țesuturilor normale. În plus, aceste
nanosisteme sunt mai puțin specifice decât moleculele precum anticorpii și pepidele, acționând
astfel asup ra diferitelor tipuri de cancer (Nigam și colab., 2018).
În ultimii ani , unul dintre medicament ele împotriva cancerului, care a fost legat cu succes
la nanoparticulele de oxizi de fier, a fost doxorubicina. Acest medicament poate fi legat covalent

27
la nanoparticulele funcționale sau poate stabili interacții electrostatice cu g rupările încărcate
negativ prezente la nivelul nanoconductorilor magnetici. Un sistem cu nanoparticule de oxizi de
fier acoperite cu hidroxiapatită mezoporoasă, pentru eliberarea doxorubicinei, a fost capabil să
încorporeze 93% doxorubicină de la o concent rație de 5 ppm. În 24 de ore, doar un procent de 10%
din doxorubicină a fost eliberat la un pH de 7.4, în timp ce la un pH de 5.5 s -a eliberat 70%, făcând
astfel sistemul nanoparticulă de oxid de fier -doxorubicină -hidroxiapatită favorabil pentru
tratamen tul tumorilor solide acide ( Abbasi Aval și colab., 2016).
Cercetătorii au sintetizat nanoparticule de oxizi de fier care au diferite învelișuri pe bază de
agenți anticanceroși administrați în mod convențional, precum β -ciclodextrina, carmustina,
cetuximab , citarabina, daunorubicina, docetaxel , epirubicina, fluorouracil, gemcitabina,
metotrexat, mitoxantrona și paclitaxel (Nigam și colab., 2018).
Medicamentele alternative pot fi, de asemenea, legate la nanosisteme. Curcumina, un
compus polifenolic natural, hidrofob din Curcuma longa , a fost încorporat la nivelul
nanoparticulelor de oxizi de fier pentru a preveni și a distruge cancerul. Se crede că produsul acestei
plante rămâne capturat la interfața hidrofobă dintre componentele nanoconductorilor stabilizate
prin surfactanți. În acest scop, Unterweger și colab. propun folosirea terapiei fotodinamice în
asociere cu fotosintetizatorul de hipericină (c omponentă a plantei Hypericum perforatum , care are
proprietăți antitumorale), cu nanoparticule de oxizi de fier și dextran, ajungând la concluzia că
această combinație este o alternativă favorabilă pentru terapia cancerului. Hipericina a fost cuplată
coval ent cu nanoparticulele de oxizi de fier acoperite de dextran, prin intermediul glutaraldehidei,
iar particulele acestui nanosistem au fost astfel capabile să inducă moartea celulelor canceroase, pe
lângă faptul că nu formează aglomerate nici după 12 săptăm âni de la depozitarea în apă.

28
II.3 MECANISME DE TOXICITATE INDUSE DE NANOPARTICULELE DE
OXIZI DE FIER IN VITRO ȘI IN VIVO . STUDII IN VITRO ȘI IN VIVO
Nanoparticulele de oxizi de fier prezintă un mare potențial pentru administrarea
medicamentelor la ț intă, îmbunătățind această terapie ca urmare a unui efect mai mare al
medicamentului în concentrații mai mici, fiind astfel reduse efectele secundare și toxicitatea.
Este permisă sinteza nanoparticulelor de oxizi de fier prin diferite metode, formându -se astfel în
difer ite forme, dimensiuni și având modificări la nivelul suprafeței. Acestea sunt avantaje care
susțin utilizarea acestor nanoparticule în aplicații farmaceutice și eliberarea controlată a
medicamentului la nivelul țesutului țintă ar putea fi benefică pentru diferite situații clinice, precum
infecții, inflamații și cancer.
Nanoparticulele de oxizi de fier sunt stabile din punct de vedere chimic și fizic, sunt
biocompatibile și sigure pentru mediu. Un înveliș de suprafață adecvat al acoperirilo r organice sau
anorganice poate diminua problemele legate de toxicitatea și oxidarea na noparticulelor de oxizi de
fier (Arias și colab., 2018).
Magnetita , hematita și maghemita sunt principalele forme de oxizi de fier.
Biocompatibilitatea și toxicitatea a cestor nanoparticule este determinată de componentele
particulei care reacționează magnetic. Având o gamă largă de utilizări în biomedicină și farmacie ,
nanoparticulele posedă caracteristici foarte importante, precum superparamagnetism, dimensiune
și posib ilitatea de a primi un înveliș biocompatibil, astfel, cercetările fiind concentrate pe
diminuarea concentrației de medicament, toxicitate sau alte efecte secundare și îmbunătățirea
terapiei (Arias și colab., 2018) .
Nanotoxicologia se referă la studiul po tențialelor efecte dăunătoare ale nanoparticulelor în
organismele vii. Acestea pot pătrunde în corpul uman prin inhalare, absorbție la nivelul pielii sau
pe cale orală. Având dimensiuni de ordinul nanometrilor, se pot deplasa de -a lungul mucoasei
olfactive , membranei alveolare, endoteliului capilar și bariera sânge -creier. Prin urmare, este foarte
important să înțelegem potențiala toxicitate a nanoparticulelor de oxizi de fier, având în vedere
gama de modificări care are loc la nivelul suprafeței, care perm ite funcționalizarea acestor
nanoparticule. Studiile in vitro și in vivo despre toxicitatea nanoparticulelor au arătat rezultate
contradictorii. Modificările în dimensiunea și forma nanoparticulelor au fost raportate ca factori
inerenți nanosistemelor cap abili să influențeze toxicitatea acestora. S -a demonstrat că

29
nanoparticulele sub formă de tijă și cu dimensiuni nanometrice sunt mult mai toxice decât cele care
au formă de sferă și dimensiuni micrometrice. Configurația nanosistemelor poate, de asemenea, s ă
influențeze toxicitatea acestora (Arias și colab., 2018; Assa și colab., 2016).
Mai mult decât atât, citotoxicitatea și genotoxicitatea celulară poate fi afectată de încărcarea
suprafeței nanoparticulelor de oxizi de fier. S-a demonstrat că p articulele încărcate pozitiv sunt mai
toxice, deoarce acestea pot suferi interacțiuni nespecifice și endocitoză adsorbtivă cu membrama
celulară încărcată negativ, crescând astfel acumularea lor celulară și afectând integritatea
membranei celulare. Influența altor fac tori, precum concentrația, modul de administrare, tipul de
înveliș și linia celulară, poate fi răspunsul pentru diferitele tipuri de toxicitate induse de aceste
nano particule.
Mecanismele de toxicitate ale nanoparticulelor de oxizi de fier pentru diferite linii celulare
se explică prin producerea de specii reactive de oxigen (ROS), care cauzează stresul oxidativ la
nivel celular. În momentul în care nanoparticulele de oxizi de fier sunt preluate de celule prin
endocitoză, tind sa se acumuleze la nivelul li zozomului și sunt degradate la ioni de fier. Acești ioni
sunt capabili să traverseze membranele și să ajungă în regiuni precum mitocondria sau nucleul
celular. Acolo pot reacționa cu peroxidul de hidrogen și oxigenul, formând specii reactive de
oxigen (Lau rent și colab., 2008; Liu și colab., 2019).
Supraîncărcarea cu fier, cauzată de expunerea la nanoparticulele de oxizi de fier, poate
conduce la efecte dăunătoare și moarte celulară. Prin urmare, o doză mare de nanoparticule ar putea
determina metabolismul ridicat al lipidelor, defectarea homeostaziei fierului și pierderi grave ale
funcțiilor ficatului. În contrast, a fost demonstrat că magnetitul induce creșterea nivelului de
peroxidare lipidică și reduce enzimele antioxidante din celulele epiteliale ale a lveolelor pulmonare
umane, in vitro fiind evidențiată o toxicitate dependentă de concentrație ( Dwivedi și colab., 2014).
Strategia de acoperire a suprafeței nanoparticulelor de oxizi de fier este folosită pentru a le
face biocompatibile și netoxice, datorită numărului redus de situsuri oxidative, având consecințe
mai mici asupra moleculei de ADN. Pentru a evita producția de specii reactive de oxigen, au fost
dezvoltate învelișuri pe bază de acid lauric, o c oroană proteică de BSA sau dextran și a fost
demonstrat că nu prezintă efecte genotoxice pe celulele granulare umane. Polimerii (PLGA) și
uleiurile esențiale (uleiul esențial de patchouli) reduc efectul toxic al nanoparticulelor de oxizi de
fier (Mahmoudi și colab., 2010 ; Laurent și colab., 2008).

30
Prin urmare, există o necesitate din ce în ce mai mare de a efectua teste suplimentare, altele
decât testele de viabilitate celulară, pentru a avea mai multe cunoștințe despre efectele toxice ale
nanoparticulelor de oxizi de fier.
Studii in vitro
Testarea in vitro a soluțiilor de medicamente pentru a preveni biodistribuția in vivo poate fi
considerată a fi o evoluție rezonabilă a sistemelor de eliberare controlată de medicamente. Aceste
sisteme vor furniza agentul citotoxic într -o cantitate determinată de nevoile ariei din corp afectată,
într-o perioadă de timp. Controlul eliberării este folositor pentru menținerea constantă a nivelului
de medicament antitumora l în celulele sau țesutul țintă (Rudzka și colab ., 2012) .
Studiul 1
O soluție de nanocompozite a fost amestecată cu o soluție de doxorubicină și au fost lăsate
pe agitator timp de 24 de ore. Suspensia formată a fost centrifugată de două ori, pentru a se
îndepărta supernatantul care include medicamentul antitumoral neabsorb it. Nanoparticulele au fost
redispersate în soluție PBS și păstrate la 37șC, unde are loc eliberarea medicamentului. La anumite
intervale de timp, proba a fost centrifugată, supernatantul extras și măsurată absorbanța pentru
detecția doxorubicinei din supe rnatant .
Au fost folosit e două linii celulare de cancer uman, mai exact PLC -PRF-5 (linie celulară
din cancer de ficat) și DLD -1 (linie celulară din adenocarcinom colorectal). Mediul lor de cultură
a fost suplimentat cu ser fetal bovin , penicilină, streptomicină și apoi au fost inc ubate la 37șC, la o
atmosferă cu 5% CO 2. Celulele au fost tratate cu diferite diluții de doxorubicină, nanocompozite și
doxorubicină absorbită pe nanoparticule. După tratament, celulele au fost fixate cu
paraformaldehidă pentru 10 minute și colorate cu DAPI (4’-6-Diamidino -2- phenylindole, Sigma
Aldrich) . Sistemele de administrare a medicamentelor vor furniza agentul citotoxic într -un ritm
determinat de nevoile zonei afectate într -o anumită perioadă de timp. Eliberarea controlată este
utilă pentru menținerea nivelurilor constante de medicament antitumoral în țesuturile și celulele
țintă. S -a observat o diminuare a multiplicării celulelor afectate, sub acțiunea doxorubicinei, pe o
perioadă lungă de timp (Rudzka et al., 2012) .

31
Studiul 2
Au fost utilizate celule canceroase umane, provenite de la cancerul de sân, din linia MCF –
7, care au fost însămânțate pe plăci cu baza pătrată de 18 mm, la 37șC și 5% CO 2 în atmosferă,
până au aderat, iar ulterior au fost adăugate suspensii de nanoparticule de oxizi de fier de
concentrații diferite. După 24 de ore de la incubare, celulele aderente au fost spălate cu PBS, fixate
cu formaldehidă timp de 30 de minute și tratate cu 4 ’,6-diamino -2-fenilindol (DAPI) pentru a se
colora nucleul celular. Nanoparticulele de oxizi de fier au inhibat multiplicarea celulelor din linia
MCF -7, fiind foarte puțin toxice, fapt care este convenabil pentru sistemele de distribuire a
medicamentului (Marcu și colab ., 2013) .
Studii in vivo
Studiile in vivo au demonstrat că cercetările clinice actuale sunt o sarcină dificilă, din cauza
controlului dimensiunii, stabilității, biocompatibilității și stratului de acoperire pentru legarea
medicamentului și a altor parametri fiziologici. Nanoparticulele magnetice pot transporta doze mari
de medicamente pentru a atinge o concentrație locală ridicată, fiind evitate efectele toxice și alte
reacții adverse care apar din cauza dozelor mari de medicamente în alte zone ale organismului (Gul
și colab. , 2019) .
Studiul 1
Într-un studiu publicat în 2016 s -a arătat că r ezistența de legare a moleculelor de acoperire
la miezurile nanoparticulelor de oxizi de fier influențează durata de circulație a acestor
nanoparticule. Acoperirile care for mează o legătură necovalentă slabă cu nanoparticulele de oxizi
de fier sunt predispuse la detașarea de pe nanoparticule, in vivo , după injectare și astfel, o mare
parte dintre aceste molecule mici sau produșii de biodegradare ai acestora se acumulează la n ivelul
rinichilor și sunt eliminați prin urină, în timp ce nanoparticulele de oxizi de fier care au rămas în
corp se agregă și sunt transportate la ficat. Rețeaua de legătură generată de moleculele de acoperire
formează un hidrogel în jurul nanoparticulelo r de oxizi de fier, care le oferă protecție împotriva
opsonizării și le crește durata de existență în sânge. Ca și exemplu, moleculele de dextran
interacționează foarte puțin cu nanoparticulele de oxizi de fier, formând legături de hidrogen între
grupările hidroxil ale fragmentului de dextran și grupările de hidroxid de pe suprafața
nanoparticulei. În momentul în care moleculele de dextran sunt interconectate între ele folosind 1

32
– cloro – 2,3 – epoxipropan (epiclorhidrină) ca și agent de alchilare, durata de existență a
nanoparticulelor de oxizi de fier în sânge crește până la 12 ore, în cazul șoarecilor. Creșterea
procentului de legături între moleculele de dextran duce la scăderea adsorbției proteice și
prelungește durata de circulație a nanoparticulelor de oxizi de fier în sânge. Aceleași efecte au fost
evidențiate și în cazul folosirii nanoparticulelor de oxizi de fier conjugate cu amidon (Carr R. M.,
Oranu A., Khungar, 2016) .
Studiul 2
Gu și colaboratorii au studiat in vivo toxicitatea nanoparticulelor de oxizi de fier acoperite
cu acid oleic și un strat de co -polimer de fosfolipid -PEG. Studiil e hematologice au arătat o creștere
a numărului de neutrofile la o zi după injectare, procent care a revenit la normal în decursul a 30
de zile (Gu și colab., 2012)
Acest eveniment a fost atribuit răspunsului de apărare a organismului al gazdei, cauzat de
prezența nanoparticulelor de oxizi de fier. De asemenea, s -a evidențiat și o creștere a enzimelor
aspartataminotransferaza (AST) și alaninaminotransferaza (ALT), cauzată de transferul
moleculelor de acid oleic de la macrofagele ficatului la hepatocite. Cei lalți parametri au rămas în
limitele normale. Rezultatele prezentate de acest studiu și cele prezentate de Jain și colaboratorii
pentru nanoparticulele de oxizi de fier acoperite cu poloxameri, au fost atribuite unor specii diferite
(șoarece vs. șobolan) ș i abordărilor de preparare a nanoparticulelor de oxizi de fier (Carr, R. M.,
Oranu, A., Khungar, 2016) .
Studiul 3
Gao și colaboratorii au stabilit o cale sintetică de obținere a nanoparticulelor de oxizi de
fier solubile în apă și biocompatibile, acoperite cu PEG. Studiile în rezonanță de câmp magnetic
au demonstrat că aceste nanoparticule sunt utile în detecția tumorilor prin țintire pasivă sau activă,
in vivo . Aceste nanoparticule au fost utilizate pentru a detecta plăci dintr -un model de leziune
ateroscl erotică perivasculară în arterele carotide ale șoarecilor care au deficiență de apolipoproteină
E (apoE -/-). Rezultatele arată că nanoparticulele superparamagnetice au capacitate foarte bună de
diagnostic ca și agent de contrat în imagistica de rezonanță magentică, sugerând un potențial
suplimentar pentru caracterizarea leziunilor aterosclerotice de la nivelul carotidei (Gao și colab.,
2010).

33

B. PARTE PRACTICĂ

34
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE LUCRĂRII

Lucrarea, intitulată ”Eficiența anti -tumorală a unor sisteme nanostructurate în terapia
cancerului”, are ca scop evaluarea toxicității și potențialului terapeutic al nanoparticulelor de oxizi
de fier care au fost conjugate cu doxorubicină, în cazul tratame ntului cancerului de sân, acest studiu
fiind realizat pe două linii celulare, mai exact linia celulară MCF -7, care corespunde celulelor
canceroase prelevate de la cancerul de sân și linia celulară MCF -12A, care reprezintă linia celulară
normală.
Obiective le lucrării sunt:
a) Urmărirea efectelor induse de nanoconjugatele cu doxorubicină asupra viabilității celulelor
normale și tumorale de sân ;
b) Evidențierea modificărilor induse de nanoconjugatelor cu doxorubicină asupra morfologiei
și a integrității membranare a celulelor mamare
c) Evidențierea potențialului oxidant al nanoconjugatelor cu doxorubicină în celulele tumorale
de sân, prin determinarea producției de specii reactive de oxigen;
d) Evidențierea potențialului inflamator al nanoconjugatelor cu doxoru bicină în celulele
tumorale de sân;

35
CAPITOLUL III. MATERIALE ȘI METODE

III.1 NANOPARTICULELE
Nanoparticulele utilizate în acest studiu au fost sintetizate de către un grup de cercetători
de la Institutul Național de Cercetare -Dezvoltare pentru Fizica Laserilor, Plasmei și
Radiației (INFLPR). Acestea sunt nanoparticule de oxid de fier de tip γ -Fe2O3 care au fost
sintetizate prin piroliză laser cu pentacarbonil de fier ca precursor. După sinteză, nanoparticulele
au fos t resuspendate în apă distilată în concentrație de 0.5 g /L și ultrasonicate pe baie de ultrasunete.
Pentru stabilizarea lor , nanoparticulele de γ-Fe2O3 au fost acoperite cu o sare sodică a
carboximetilcelulozei (CMCNa). Carboximetilceluloza ( CMC ) este un derivat polizaharidic al
celulozei utilzat pe scară largă ca stabilizator în biologie, medicină și preparate farmaceutice dar și
pentru nanopreparate pentru costul sau redus, biocompatibiliate a crescută, biodegradabili tate,
toxicitate scăzută dar și pentru posibilitatea modific ării chimic e a reactivității sale.
Probele cu doxorubicină au fost obținute prin amestecarea soluției de doxorubicină cu
suspensia de nanoparticule care au fost apoi lăsate la incubat pentru legarea medicamentului la
nanoparticule. Îndepărtarea medicamentului nelegat s -a făcut prin etape de spălare și centrifugare .
Sedimentul ramas a fost resuspendat în apă distilată . Înainte de incubarea cu celulele
nanoparticulele au fost s terilizate prin expunere la lampa UV ti mp de 1 h.
Probele testate au fost: (1) Nanoparticule de γ-Fe2O3 simple, (2) Nanoparticule de γ-Fe2O3
stabilizate cu CMCNa, (3) Nanoparticule de γ-Fe2O3 simple conjugate cu doxorubicină, (4)
Nanoparticule de γ-Fe2O3 stabilizate cu CMCNa și conjugate cu doxorubicină , (5) Suspensie de
doxorubicină simplă.

36
III.2 LINII CELULARE
Pentru studiul potențialului anti -tumoral al nanoparticulelor de oxizi de fier s -au folosit
liniile celulare umane MCF -12A, acestea fiind celule normale de sân și MCF -7, care sunt celulele
canceroase. Aceste linii celulare au fost folosite datorită proprietăților morfologice și funcționale
pe care le dețin (Aljarrah și colab., 2012; Baba și colab., 2012; Seema și colab., 2012).

Linia celulară MCF -7 (ATCC , HTB­22 )
Această linie celulară reprezintă celulele canceroase prelevate de la cancer de sân uman.
Mediul de bază folosit pentru această linie de celule este DMEM ( Dulbecco's Modified Eagle
Medium ), cu 4.5 g/L glucoza și 1.5 g/L NaHCO 3 suplimentat cu 1% mix de antibiotic (Penicilină/
Streptomicină /Amfotericin ă) și ser bovin fetal de concentrație 10%. Celulele au fost cultivate în
flask -uri de 25 și 75 cm2, incubate la 37șC într -un incubator potrivit, într -o atmosferă cu 5% CO 2.
A. B.
Figura 12 – Câmpuri de celule MCF -7: A – la densitate mică; B – la densitate mare
Linia celulară MCF -12A (ATCC, CRL-1078 )
Această linie celulară reprezintă celulele mamare umane normale. Celulele au fost crescute
în mediu de cultură c e conține un mix 1:1 de mediu DMEM (Dulbeco’s modified Eagle’s medium)
și mediu Ham’s F12, , suplimentat cu 20 ng/mL factor de creștere epidermal uman, 100 ng/mL
toxină Cholera , 0,01 mg/mL insulină bovină, 1% mix de antibiotic ( Penicilină/
Streptomicină /Amfotericin ă), 500 ng/mL hidrocortizon de concentrație 95% și ser fetal bovin de
concentrație 10%. Celulele au fost cultivate în flask -uri de 25 și 75 cm2, incubate la 37șC într -un
incubator potrivit, într -o atmosferă cu 5% CO 2.

37
A. B.
Figura 13 – Câmpuri de celule MCF -12A: A – la densitate mică; B – la densitate mare

III.3 TRATAMENTUL CU NANOPARTICULE
Pentru a se putea realiza testele in vitro în vederea tratamentului cu nanoparticule, celulele
au fost însămânțate la o densitate de 3 × 104 celule/mL în plăci cu 96 godeuri și lăsate să adere 24
de ore la incubator. După această perioadă ambele tipuri de celulele au fost expuse la diferite doze
de nanoparticule conjugate cu doxorubicină prin adăugarea lor în mediul de cultura în concentrații
cuprinse între 0.015 – 62,5 µg/mL nanoparticule și între 0.5 – 500 ng/mL doxorubicină. Celulele
au fost incubate cu nanoparticulele pe o perioadă de maxim 48 de ore. Testele au fost efectuate
după 24 și respectiv 48 de ore. Celulele care nu au fost tratate cu nanoparticule au repr ezentat proba
de control.

III.4 DETERMINAREA CITOTOXICITĂȚII NANOPARTICULELOR PRIN
TESTUL MTT
Prin testul MTT, descris de Mosmann în anul 1983, se poate măsura viabilitatea celulară și
activitatea metabolică a celulelor.
Principiul metodei const ă în reducerea compusului MTT [bromură de 3 -(4,5-dimetiltiazol –
2-il)-2,5-difeniltetrazoliu], de culoare galbenă sub acțiunea succinat dehidrogenazelor
mitocondriale NAD(P)H -dependente în celulele viabile . După ce nucleul de tetrazoliu a fost clivat,
la nive lul mitocondriilor are loc formarea unui produs de culoare violet (cristale de formazan) care
este insolubil în apă, dar solubil în solvenți organici, precum izopropanolul. Cantitatea de formazan
formată se măsoară spectrofotometric la 570 nm.

38

Figura 14 – Reacția care stă la baza testului MTT, în urma căreia compusul MTT este transformat
sub acțiunea enzimei succinat dehidrogenaza în formazan,.
Testul MTT poate fi utilizat pentru testarea supraviețuirii și proliferării celulare. Compusul
MTT e ste scindat de toate celulele vii, metabolic active, însă nu poate fi scindat de celulele moarte.
Cantitatea de formazan formată este direct proporțională cu numărul de celule dintr -o populație
omogenă. (Mosmann, 1983).
Reactivii folosiți în această meto dă sunt: soluția de MTT 1 mg/mL preparată în tampon
fosfat salin (PBS), PBS, isopropanol .
Modul de lucru. Celulele au fost însămânțate în plăci cu 96 godeuri, la densitatea de 0.6 ×
104 celule/ godeu /200 µL și incubate timp de 24 de ore pentru aderarea celulelor . A doua zi celulele
au fost tratate cu suspensiile de nanoparticule în diferite concentrații de γ-Fe2O3 (3.125, 6.25, 12.5
și 31.25 µg/mL) și doxorubicină ( 25, 50, 100, 250 ng/mL ). După 24 și 48 de ore de expunere mediul
a fost îndepărtat și celulele spălate cu 100 µL/godeu PBS o dată. S -a adăugat apoi 80 µL/godeu din
soluția de MTT și celulele au fost incubate două ore la întuneric la 37oC. După îndepărtarea soluției
de MTT a fost a dăugat un volum de 150 µL/godeu izopropanol și s-a omogenizat pentru a se
solubiliza cristalele de formazan formate . Densitatea optică a probelor a fost citită la un
spectrofotometru cititor de plăci de tip FlexStation3 de la Molecular Devices la 595 nm. Cu cât
este mai mare intensitatea culorii violet dată de cristalele de formazan (respectiv absorbanța), cu
atât viabilitatea celulelor este mai mare.
Absorbanțele probelor au fost raportate la control unde viablitatea celulară a fost
considerată 100% și exprimate în procente ± deviația standard . Valorile absorbanțelor probelor mai
mici decât valorile din control evidențiază reducerea viabilității celulare sau a ratei de proliferare
celulară, iar valorile mai mari decât cele din control indică o creștere a acestora .

39
III.5 ANALIZA MORFOLOGIEI CELULARE
Analiza morfologiei celor două tipuri de celule a fost realizată după o expunere de 24 și 48
de ore la tratamentul cu nanoparticule, putând fi vizualizată astfel diferența între celulele supuse
tratamentului cu nanoparticule le conjugate cu medicament și celulele tratate cu nanoparticule
simple .
Caracteristicile morfostructurale ale celulelor normale și canceroase de sân au fost puse în
evidență prin microscop ie optică în contrast de fază cu magnificație 20X utilizând un microscop
Olympus IX73 (Olympus, Tokyo, Japan) echipat cu o cameră Hamamatsu ORCA -03G (A3472 –
06, Hamamatsu, Ja pan). Imaginile au fost achiziționate cu ajutorul softului CellSens Dimension
(v1.11, Olympus) după 24 și 48 de ore de expunere.

Figura 15 – microscopul Olympus IX73 (Olympus, Tokyo, Japan)

40
III.6 DETERMINAREA NIVELULUI DE LDH ELIBERAT ÎN MEDIUL DE
CULTURĂ
LDH (lactat dehidrogenaza) este o oxidoreductază care se găsește la nivelul celulelor,
aceasta fiind implicată în transformarea piruvatului în lactat și conversia NADH la NAD+.

Figura 1 6 – Conversia piruvatului la lactat prin intermediul LDH
Pentru evalularea potențialului anti -tumoral al nanoparticulelor funcțonalizate asupra
celulelor de cancer de sân normale și canceroase s-a analizat gra dul de permeabilizare al
membranei celulare printr -un test de citotoxicitate (testul LDH ) folosind un kit denumit
Cytotoxicity Detectio n Kit (LDH), 14115700 de la Roche. Kitul conține soluția de colorare ce
cuprinde clorură de tetrazoliu și substratul reprezentat de lactatul de sodiu și un catalizator
reprezentat de un amestec de diaforază și NAD+. Astfel citotoxicitatea nanoparticulelor
funcționalizate a fost evidențiată prin cantitatea de lactat dehidrogenază (LDH) eliberată în mediul
de cultură al celulelor de sân în urma degradării membranei celulelor după 24 și 48 de ore de
expunere. Pierderea i ntegrității membranei celulare reprezintă și un marker al necrozei celulare, un
tip comun de moarte celulară.
Principiul metodei se bazează pe activitatea enzimatică a LDH care reduce NAD+ la
NADH în urma oxidării lactatului la piruvat. Reacți a este cuplată cu transformarea sării de
tetrazoliu la un formazan de culoare roșie de către diaforază care utilizează NADH/H+ rezultat în
reacția precedentă. Acest compus colorat poate fi măsurat spectr ofotometric la 490 nm, intensitatea
culorii fiind dire ct proporțională cu activitatea LDH.
Modul de lucru. Testul s -a realizeat într -o plăcuță cu 96 de godeuri, celulele fiind
însămânțate la o densitate de 0.6 x 104 celule/ godeu/ 200 µL, în triplicat. După expunerea la
nanoparticule, s -au colectat câte 100 µL de mediu de cultură din fiecare godeu și s -au transferat
într-o placă cu 96 de godeuri curată. Peste mediu a fost adăugat apoi un volum de 100 µL mix de
reacție ( ce conține un amestec format din catalizator și soluția de colorare în proporție de 1:45 ) în

41
fiecare godeu, după care plăcuța a fost incubată timp de 15 de minute la o temperatura camerei, la
întuneric. După această perioadă s -a măsurat absorbanța la 490 nm la un spectrofotometru cititor
de plăci de tip FlexStation 3 de la Molecular Devices. Rez ultatele au fost exprimate în valori
relative (procente) ± deviaț ia standard prin comparție cu proba control.

III.7 DETERMINAREA PRODUCȚIEI DE SPECII REACTIVE DE OXIGEN
Capacitatea de oxidare a nanoparticulelor a fost evaluată prin măsurarea producț iei de
specii reactive de oxigen (SRO) intracelulare cu compusul 2’,7’ -diclorofluorescein diacetat
(H2DCF -DA) (Roesslein și colab. , 2013).
Principiul metodei. Forma ester acetică a compusului este o moleculă ce are capacitatea
de a trece prin m embrana celulară. Odată pătruns în celulă, sub acțiunea esterazelor celulare , acest
compus trece în unul non-fluorescent care rămâne captiv în celulă. Prin oxidarea compusului non –
fluorescent de către speciile reactive de oxigen ( SRO ), acesta este converti t la 2',7' dicloro -dihidro-
fluorescein (DCF) – un compus puternic fluorescent.

Figura 1 7 – Formarea compusului fluorescent DCF, în urma oxidării compusului non -fluorescent
de către speciile reactive de oxygen

42
Mod ul de lucru. Celulele normale și canceroase au fost însămânțate în plă ci cu 96 godeuri
la o densitate de 0.6×104 celule/godeu. După 24 de ore, celulele au fost incubate la 37 °C și 5%
CO 2, timp de o oră cu 100 µL soluție de H2DCF -DA (D6883, Sigma) 50 µM preparată î n solu ție
salin ă Hanks' Balanced (HBSS) , timp în care compusul a fost internalizat în celulă . După incubare
soluția a fost îndepărtată, iar godeurile au fost spălate cu 100 µL soluție PBS pentru a elimina
compusul care nu a fost internalizat. Suspensiile de nanoparticulel e au fost diluate la concentrațiile
dorite în tampon HBSS și adă ugate în volum de 100 µL per godeu. Intensitatea fluorescenței a fost
măsurată în aceeași placă după 4, 24 ș i respectiv 4 8 ore după incubare utilizâ nd un
spectrofluorimetru de microplăci la 48 5 nm excitație și 520 nm emisie. Fluorescența a fost
înregistrată în unități relative de fluorescență (RFU) și exprimată în media RFU ± deviaț ia standard.

III.8 MĂSURAREA NIVELULUI DE OXID NITRIC ÎN MEDIUL DE CULTURĂ
Măsurarea nivelului de oxid nitric din mediul de cultură se face prin metoda colorimetrică
Griess, prin care se determină cantitativ concentrația de oxid nitric din probă cu ajutorul
determinării densității optice a produșilor colorimetrici obținuți.
Prin cipiul metodei se bazează pe mai multe reacții. Într-o primă etapă, nitritul este tratat
în mediu acid cu un agent de diazotare S (sulfanilamida), formându -se o sare de diazoniu instabilă.
Apoi, a ceastă sare de diazoniu instabilă, în prezență de naftil -etilen -diamină (NED), formează un
compus colorat. Produ cția de oxid nitric este apreciată indirect, prin cuantificarea nitritului din
probă (dat fiind faptul că oxidul nitric se transformă spontan atât în nitrit, cât și în nitrat, care, la
rândul lui, se transformă în nitrit) (Griess, 1879).

43

Soluțiile necesa re sunt: soluție standard NaNO 2 100mM , Soluție NED (naftil -etilen –
diamina) 10% (Soluția N) , Soluție Sulfanilamida (Soluția S) , care sunt aduse la temperatura
camerei și omogenizate.
Modul de lucru. După expunerea la nanoparticule, mediul de cultură din fi ecare godeu a fost
colectat și supus testării pentru determinarea nivelului de oxid nitric produs. Astfel, într -o placă cu
96 de godeuri s -au pipetat 80 µl probă (mediu)/godeu în triplicat. Peste standard și probe s -au
adăugat 80 µl soluție amestec soluții N:S în raport 1:1. Densitatea optică a fost citită la 540 nm la
un spectrofotometru cititor de plăci .
Pentru determinarea concentrației de oxid nitric s -a utilizat o curbă standard. Pentru realizarea
ei, s-au pipetat într-o plăcuță cu 96 de godeur i conform tabelului 3 volumele de soluție de NaNO 2
200 µM și de mediu de cultură. Pregatirea standardului a presupus diluarea soluției stoc de NaNO 2
100 mM până la 200 µM în mediu de cultură cu 10% ser fetal astfel:
1. 20 µl NaNO 2 100 mM + 380 µl mediu (diluț ie 20x)
2. 20 µl diluție 20x + 480 µl mediu (diluție 25x)

44
Tabelul 3 – Curba standard
Nr. crt. µM Mediu de cultură +
10% ser fetal (µl) Soluție NaNO 2 200
µM (µl)
1 100 80 80
2 50 80 80 din 1
3 25 80 80 din 2
4 12,5 80 80 din 3
5 6,25 80 80 din 4
6 3,125 80 80 din 5
7 1,562 80 80 din 6
8 0,781 80 80 din 7
9 0,390 80 80 din 8
10 0,195 80 80 din 9
11 0,097 80 80 din 10 ( -80)
12 0 80 0

Rezultatele au fost exprimate în valori relative (procente) ± deviaț ia standard prin
comparație cu probele control.

45
CAPITOLUL IV. REZULTATE ȘI DISCUȚII

IV.1 EFECTELE NANOCONJUGATELOR CU DOXORUBICINĂ ASUPRA
MORFOLOGIEI ȘI VIABILITĂȚII CELULELOR MAMARE
Viabilitatea celulelor mamare din liniile MCF -12A și MCF7 a fost evaluată în urma
expu nerii la nanoconjugatele cu doxo rubicină, cu ajutorul testul ui MTT, prin care este identificat
procentul de celule viabile și celule moarte, urmărind activitatea dehidrogenazelor mit ocondriale .
Pentru ace st test, celulele au fost tratate cu diferite concentrații de nanoparticule de γ-Fe2O3 (3.125,
6.25, 12.5 și 31.25 µg/mL) și doxorubicină (25, 50, 100, 250 ng/mL) timp de 24 și 48 de ore. Pe
lângă nanoconjugatele cu doxorubicină au fo st testate și componentele individuale ale sistemului
respectiv , nanoparticulele de γ-Fe2O3 simple și cele stabilizate cu CMCNa precum și doxorubicina
liberă.
În figura 18 și figura 19 sunt prezentate efectele nanosuspensiilor asupra viabilității
celulelor de sân normale (MCF -12A) și respectiv cele canceroase (MCF7) după 24 și, respectiv,
48 de ore de expunere . În urma analizei, s-a observat o scădere semnificativă a viabilității celula re
în cazul ambelor tipuri de celule tratate cu Fe 2O3_Dox și Fe 2O3_CMCNa_Dox față de control .
Scăderea viabilității a fost proporțională cu creșterea concentrației de nanoparticule conjugate cu
doxorubicină și similară între nanoconjugatele nestabilizate și cele stabilizate cu CMCNa. O
scădere de aproximativ 50% a viabilității celuare a fost înregistrată în urma expunerii celulelor la
doza de 12.5 µg/mL nanoparticule cu 100 ng/mL doxorubicină . În schimb, componentele
individuale în aceleași concentrații nu au avut nici un efect semnificativ asupra viabilitații celulelor.
Doar în cazul celulelor de sân canceroase MCF7 s -a observat o scădere semnificativă de 22% față
de control la cea mai mare c oncentrație de doxorubicină folosită (250 ng/mL) după 48 de ore de
expunere. Aceste rezultate sugerează toxicitatea și eficiența antitumorală a doxorubicinei asupra
celulelor de sân în combinație cu nanoparticulele de γ-Fe2O3 , însă independent de stabiliza torul
folosit – CMCNa.
Studiile in vitro din literatură arată că nanoparticulele de oxizi de fier induc scăderea
viabilității celulare peste 50% la doze mai mari de 200 µg/mL (Ansari și colab ., 2019) , iar
doxorubicina la doze de 2.5 µg/mL (Ravid și colab. , 1999) .

46

Figur a 18 – viabilitatea celulelor din linia celulară MCF -12A, supuse la concentrații diferite de
γ-Fe2O3 (3.125, 6.25, 12.5 și 31.25 µg /mL) și doxorubicină (25, 50, 100, 250 ng/mL). Asterixurile
reprezintă semnificația statistică obținută prin testul Student, astfel: p < 0.05 * (semnificativ); p
< 0.01 ** (distinct semnificativ); p < 0.001 *** (foarte semnificativ).

Figura 19 – viabilitatea celulelor din linia celulară MCF -12A, s upuse la concentrații diferite de
γ-Fe2O3 (3.125, 6.25, 12.5 și 31.25 µg /mL) și doxorubicină (25, 50, 100, 250 ng/mL). Asterixurile
reprezintă semnificația statistică obținută prin testul Student, astfel: p < 0.05 * (semnificativ); p
< 0.01 ** (distinct se mnificativ); p < 0.001 *** (foarte semnificativ).
**
**
*****
**
****
**
***
020406080100120140
0
25
50
100
250
3.125
6.25
12.5
31.25
3.125
6.25
12.5
31.25
3.125 + 25
6.25 + 50
12.5 + 100
31.5 + 250
3.125 + 25
6.25 + 50
12.5 + 100
31.5 + 250
Control Dox Fe2O3 Fe2O3_CMCNa Fe2O3_Dox Fe2O3_CMCNa_DoxViabilitatea celulara (%)
[µg/mL NP + ng/mL Dox]MTT
MCF -12A
24 h
**
****
*****
**
****
***
020406080100120140
0
25
50
100
250
3.125
6.25
12.5
31.25
3.125
6.25
12.5
31.25
3.125 + 25
6.25 + 50
12.5 + 100
31.5 + 250
3.125 + 25
6.25 + 50
12.5 + 100
31.5 + 250
Control Dox Fe2O3 Fe2O3_CMCNa Fe2O3_Dox Fe2O3_CMCNa_DoxViabilitatea celulara (%)
[µg/mL NP + ng/mL Dox]MTT
MCF -7
24 h

47
Datele obținute în urma testului MTT au fost confirmate de imaginile de microscopie optică
în contrast de fază. Morfologia celulelor MCF -12A și MCF7 a fost analizată după 24 și 48 de ore
de expunere la nanoparticule . În figurile 20 și 21 au fost prezentate imaginile achiziționate după
48 de ore de expunere la doza de 100 ng/mL Dox unde modificările au fost vizibil semnificative.
Din imaginile de microscopie s-a putut observa o diminuare a numărului de celule în cazul
celor tratate cu nanoconjugatele cu doxorubicină și de asemenea un aspect neregulat al lor sub
formă de prelungiri nespecifice ale mebranei celulare , în comparație cu celulele din control, care
prezentau o morfologie normală, caracteristică celulelor epiteliale cu un contur regulat și bine
delimitat . De asemenea celulele tratate cu elem entele individuale au prezentat un aspect morfologic
normal nemodificat. În cazul celulelor canceroase , modificările morfologice au fost mult mai
evidente, observâ ndu-se urme de resturi celulare în mediul de cultură rezultate probabil în urma
dezintegrării membranelor celulare .
Imaginile de microscopie au arătat totodată că scăderea viabilității celulare observate prin
testul MTT poate fi și o cauz ă a unei inhibiții a proliferării celulare și nu doar a unei morți celulare
datorită unei densități vizibil mai scăzute în cazul c elor tratate cu nanoconjugate .

Figura 20 – Celulele MCF -12A (normale de sân) după expunere tim p de 48 h la doza de 100
ng/mL D ox

48

Figura 21 – Celulele MCF7 (de cancer de sân) după expunere tim p de 48 h la doza de 100 ng/mL
Dox

IV.2 EFECTE INDUSE DE NANOCONJUGATELE CU DOXORUBICINĂ ASUPRA
GRADULUI DE PERMEABILIZARE A MEMBRANEI CELULARE
Gradul de permeabilizare al celulelor mamare normale și canceroase a fost evaluat prin
măsurarea nivelului concentrației de lactat dehidrogenază (LDH) eliberată în mediu l de cultură
după 24 și 48 de ore de la expunerea la nanoparticule. Pentru această eva luare s -au luat în
considerare două doze de nanoparticule și doxorubicină selectate în urma testului MTT. Astfel,
s-a observat că în celulele de sân normale MCF -12A, nivelul de LDH eliberat în mediul de cultură
nu a fost modificat față de control în nici una dintre condiții ( figura 22 ) ceea ce sugerează că
celulele si -au păstrat integritatea membranară .

49

Figura 22 – gradul de permeabilizare a membranei celulare după expunerea celulelor din linia
MCF -12A la diferite concentrații de nanoparticule de Fe 2O3 (6.25 și 12.5 µg /mL) și doxorubicină
(50 și 100ng/mL) timp de 24 și 48 de ore.
În schimb în celulele de sân canceroase MCF7, nivelul de LDH a crescut semnificativ după
primele 24 de ore cu aproximativ 30% față de control în celule tratate cu o concentrație de 12.5
µg/mL nanoparticule și 100 ng/mL doxorubicină atât în cazul nanopartic ulelor stabilizate cu
CMCNa , cât și în cazul celor nestabilizate ( figura 23 ). După 48 de ore de expunere nivelul de LDH
în acest caz a crescut cu încă 5%. La concentrația mai mică aleasă ( 6.25 µg/mL nanoparticule și 50
ng/mL doxorubicină) nu s -au înregistrat modificări semnificative ale nivelului de LDH. Aceste
rezulatate indică o lezare a membranei celulare și o creștere a permeabilității ei caracteristică
celulelor necrotice la concentrații mari de nanoparticule și doxorubi cină dependentă de timpul de
expunere. De asemenea , aceste date se corelează cu cele obținute în cazul testului MTT de
viabilitate celulară, sugerând o moarte a celulelor canceroase prin necroză.
Pe de altă parte, absența unui nivel c rescut de LDH în medi ul celulelor normale, corelată
cu scăderea viabilității celulare , poate indica inhibiția proliferării celulelor , dar și o altă formă de
moarte celulară indusă de nanoparticule care nu implică în fazele timpurii permeabilizarea
membranei celulare , cum ar fi apoptoza .
020406080100120140
0 50 100 6.25 12.5 6.25 12.5 6.25 + 50 12.5 +
1006.25 + 50 12.5 +
100
Control Dox Fe2O3 Fe2O3_CMCNa Fe2O3_Dox Fe2O3_CMCNa_DoxNivelul de LDH eliberat in mediu (%)
[µg/mL NP + ng/mL Dox]MCF -12A
24 h
48 h

50

Figura 23 – gradul de permeabilizare a membranei celulare după expunerea celulelor din linia
MCF7 la diferite concentrații de nanoparticule de Fe 2O3 (6.25 și 12.5 µg /mL) și doxorubicină
(50 și 100ng/mL) timp de 24 și 48 de ore. Asterixurile reprezintă semnificația statistică obținută
prin testul Student, astfel: p < 0.05 * (semnificativ); p < 0.01 ** (distinct semnificativ).

IV.3 POTENȚIALUL OXIDANT AL NANOCONJUGATELOR CU DOXORUBICINĂ ÎN
CELULELE TUMORALE DE SÂN
Speciile react ive de oxigen (SRO) sunt indicatori importanți pentru determinarea stresului
oxidativ și al potențialului oxidant al nano conjugatelor . Producția de SRO indusă în urma expunerii
la tratament a fost monitorizată în celulele normale și canceroase de sân pe o perioadă între 4 și 48
de ore. Rezultatele obținute sunt prezentate în figura 24 și figura 25 . Nivelul de SRO a crescut în
cele 2 tipuri celulare dependent de timpul de expunere.
În celulele normale, în urma analizei s -a observat o creșterea semnificativă a producției de
SRO față de control , proporțională cu timpul , după expunere a celulelor la nanoparticulel e
stabilizate și nestabilizate, conjugate cu doxorubicină în doza mare de 12.5 µg/mL nanoparticule și
** ** *
020406080100120140160
0 50 100 6.25 12.5 6.25 12.5 6.25 + 50 12.5 +
1006.25 + 50 12.5 +
100
Control Dox Fe2O3 Fe2O3_CMCNa Fe2O3_Dox Fe2O3_CMCNa_DoxNivelul de LDH eliberat in mediu (%)
[µg/mL NP + ng/mL Dox]MCF7
24 h
48 h

51
100 ng/mL doxorubicină . După 48 de ore , nivelul de SRO a fost cu aproximativ 50% mai mare
față de control și similar între cele 2 tipuri de nanoconjugate. De asemenea , o ușoară creștere tot la
doza mai mare a fost înregistrată și pentru nanoparticulele stabilizate cu CMCNa după 48 de ore.
Pentru celelalte condiții nu s -au observat modificări semnificative statistic ale nivelului de SRO.

Figura 24 – nivelul producției de specii rective de oxigen după expunerea la diferite concentrații
de nanoparticule și doxorubicină comparativ cu proba control, care reprezintă 100%. Valorile
sunt exprimate ± deviația standard (SD) . Asterixurile reprezintă semnific ația statistică obținută
prin testul Student, astfel: p < 0.05 * (semnificativ); p < 0.01 ** (distinct semnificativ) .

În cazul celulelor din linia MCF7, modificările observate în urma analizei producței de SRO
au fost puțin diferite față de cele prezentate anterior pe celulele normale. Astfel , în acest caz,
creșteri semnificative ale SRO au apărut la ambele doze testate de nanoconjugate . De asemenea ,
au fost observate creșteri ale nivelului de SRO la ambele doze de nanoparticule de γ-Fe2O3
stabili zate cu CMCNa după 48 de ore de expunere , spre deosebire de cele nestabilizate unde nu
s-a înregistrat o creștere semnificativă a nivelului de SRO din punct de vedere statistic . Aceste date
sunt în corelație cu datele din literatură care arată că nanopa rticulele de oxizi de fier nu sunt toxice
la concentrații mai mici de 50 -100 µg/m L (Singh și colab ., 2010) . Generarea SRO în cazul
nanoparticulelor acoperite cu CMCNa se poate datora reactivității grupărilor hidroxil și carboxil ******
*****
020406080100120140160180
0 50 100 6.25 12.5 6.25 12.5 6.25 + 50 12.5 +
1006.25 + 50 12.5 +
100
Control Dox Fe2O3 Fe2O3_CMCNa Fe2O3_Dox Fe2O3_CMCNa_DoxNivelul relativ al productiei de specii reactive
de oxigen (%)
[µg/mL NPs + ng/mL Dox]MCF -12A
4 h 24 h 48 h

52
din componența CMCNa care pot iniția la suprafața membranelor celulare sau în interiorul
celulelor, reacții de oxidare .
Studii in vitro din literatură au arătat că nanoparticulele de oxizi de fier pot pătrunde în
celule prin endocitoză și se acumulează în lizozomi. La nivelul acestor organite, în mediul acid ele
se descompun în ioni de Fe2+ care sunt eliberați apoi în citoplasmă și pot reacționa cu peroxidul de
hidrogen și oxigenul molecular produs de mitocondri i, ducând la formarea de radicali hidroxil
foarte reactivi și ioni de Fe3+ prin reacți a Fenton , ce conduc mai departe la inducerea stresului
oxidativ ca mecanism de toxicitate moleculară (Singh și colab ., 2010 ).
Nivelul de SRO produs în cazul celor 2 tipuri de nanoconjugate în celulele canceroase de
sân poate fi o consecință a acțiunii sinergice a nanoparticulelor de γ-Fe2O3 dar și a doxorubicinei
care induce formarea de SRO la nivelul mitocondriilor prin intermediul activi tății NADPH
oxidazelor mitocondriale , dar și o consecință a nivelului scăzut de enzime antioxidante caracteristic
celulelor canceroase , comparativ cu cele normale.

Figura 25 – nivelul producției de specii rective de oxigen după expunerea la diferite concentrații
de nanoparticule și doxorubicină comparativ cu proba control, care reprezintă 100%. Valorile
sunt exprimate ± SD. Asterixurile reprezintă semnificația statistică obținută prin testul Student,
astfel: p < 0.05 * (semnificativ); p < 0.01 ** (distinct semnificativ) .
**
* ***
** **
*****
** **
020406080100120140160180200
0 50 100 6.25 12.5 6.25 12.5 6.25 + 50 12.5 +
1006.25 + 50 12.5 +
100
Control Dox SF30 SF30_CMCNa SF30_Dox SF30_CMCNa_DoxNivelul relativ al productiei de specii
reactive de oxigen (%)
[µg/mL NPs + ng/mL Dox]MCF7
4 h 24 h 48 h

53
IV.4 POTENȚIALUL INFLAMATOR AL NANOCONJUGATELOR CU
DOXORUBICINĂ ÎN CELULELE TUMORALE DE SÂN
Oxidul nitric (NO) este o moleculă implicată în numeroase pro cese biologice , inclusiv în
răspunsul celular la inflamați a acută și cronică . Acesta este un gaz sub formă liberă, produs în
organism prin descompunerea aminoacidului L -arginină în L -citrulină, prin intermediul unui grup
de enzime, numit nitric oxid sintetaza (NOS).
În condiții normale NO are un effect anti -inflamator însă atunci când es te produs în exces, NO
devine un mediator pro -inflamator care induce un proces de inflamație la nivelul celulelor
(Sharma și colab ., 2007 ). De exemplu studiile au indicat că nivele crescute de NO pot interacționa
cu superoxizii , ducând la formarea de per oxinitriți și radicali hidroxil (Pacher și colab., 2007 ). NO
este produs în exces în procesul de inflamație sub acțiunea nitric oxid sintaz ei inductibil e (iNOS )
și este responsabil pentru lez iunile celul are.
Determinarea nivelului de NO a fost utilizată pentru detecția de procese inflamatorii la nivelul
celule lor de sân normale și canceroase în urma expunerii la tratament. După 24 și 48 de ore , mediul
de cultură în care s -a eliberat oxidul nitric a fost colectat pentru măsurători. Rezultatele obținute
sunt evidențiate în figura 26 , pentru celulele din linia MCF -12A și figura 27 , pentru celulele din
linia MCF7.
În cazul liniei celulare MCF -12A, s-a observat o creș tere semnificativă (nu mai mult de
20% față de control) a nivelului de NO din mediul de cultură în cazul nanoparticulelelor simple
stabilzate cu CMCNa și nestabilizate la doza mai mare analizată ( 12.5 µg/mL nanoparticule și 100
ng/mL doxorubicină) începând cu 24 de ore de expunere. Totodată , o creștere semnificativă a putut
fi remarcată și în cazul nanoparticulelor stabilzate cu CMCNa și conjugate cu doxorubicină tot la
doza mai mare însă nivelul a fost similar cu cel obținut în cazul nanoparticulelor neconjugate. După
48 de ore de expunere nu s -a înregistrat o creștere semnificativă față de nivelul observat după 24
de ore. Aceste date sugerează inducerea unui răspuns inflamator moder at în celulele MCF -12A
datorat nanoparticulelor de γ-Fe2O3 la o doză de 12.5 µg /mL.

54

Figura 26 – nivelul producției de oxid nitric după expunerea la diferite concentrații de
nanoparticule și doxorubicină comparativ cu proba control, care reprezintă 100%. Valorile sunt
exprimate ±SD, n=3 experimente. Asterixurile reprezintă semnificația statistică obținută prin
testul Student, astfel: p < 0 .05 * (semnificativ).

În cazul liniei celulare MCF7 , rezultatele au fost similare cu cele obținute pe linia MCF –
12A. Și în acest caz creșterea nivelului de NO nu a fost mai mare de 20% față de control. În cazul
nanoparticulelor neconjugate , o creștere sem nificativă a fost înregistrată abia după 48 de ore de
expunere. Expunerea la doxorbicină nu a produs modificări ale nivelului de NO la nici una dintre
tipurile celulare , rezultatele sugerând că nanoparticulele de γ-Fe2O3 utilizate pot avea un potențial
inflamator în celulele normale și canceroase de sân la doze mai mari de 12.5 µg /mL.
Studiile din literatură sugerează că interacția NO cu radicalii superoxid, tiolii și metalele
(în special cu ionii de Fe2+) poate fi importan tă atât în procesul de tamponare a excesului de NO
produs de iNOS , dar și în canalizarea acestuia către condiții fiziopatologice (Stoclet și colab.,
1998) . Condițiile în care NO trece de la un rol protector la un rol dăunător asupra țesuturilor nu au
fost pe deplin elucidate. * * ** * *
020406080100120140
0 50 100 6.25 12.5 6.25 12.5 6.25 + 50 12.5 +
1006.25 + 50 12.5 +
100
Control Dox Fe2O3 Fe2O3_CMCNa Fe2O3_Dox Fe2O3_CMCNa_DoxNivelul relativ al productiei de NO (%)
[µg/mL NPs + ng/mL Dox]MCF -12A24 h 48 h

55

Figura 27 – nivelul producției de oxid nitric după expunerea la diferite concentrații de
nanoparticule și doxorubicină comparativ cu proba control, care reprezintă 100%. Valorile sunt
exprimate ±SD, n=3 experimente. Asterixurile reprezintă semnificația statistică obținută prin
testul Student, astfel: p < 0.05 * (semnificativ).

* * * *
020406080100120140
0 50 100 6.25 12.5 6.25 12.5 6.25 + 50 12.5 +
1006.25 + 50 12.5 +
100
Control Dox Fe2O3 Fe2O3_CMCNa Fe2O3_Dox Fe2O3_CMCNa_DoxNivelul relativ al productiei de NO (%)
[µg/mL NPs + ng/mL Dox]MCF724 h 48 h

56
CONCLUZII

În acest studiu, s-au urmărit efectele citotoxice ale nanoparticulelor de γ-Fe2O3 conjugate
cu doxorubuicină pe două linii celulare umane: linia de celule MCF -12A (celule mamare normale)
și linia de celulele MCF7 (celule mamare canceroase) . Aceste celule au fost supuse la diferite doze
de nanoparticule iar efectele au fost monitorizate pe o perioadă de 24 și 48 de ore . În urma testărilor
s-au identificat nu meroase modificări ale parametrilor biologici analizați precum :

➢ Nanoconjugatele Fe2O3_Dox și Fe 2O3_CMCNa_Dox au determinat o scădere a viabilității
celulelor normale și canceroase proporțională cu creșterea concentrației de nanoparticule și
doxorubicină și dependentă de perioada de expunere. O doză de 12.5 µg/mL nanoparticule și
100 ng/mL doxorubicină a indus scăderea viabilității celuare cu aproximativ 50% față de
control. Componentele libere nu au determinat scăderi ale viabilității celulel or la
concentrațiile utilizate ;
➢ În urma expunerii la nanoconjugatele cu doxorubicină, c elulele de sân normale și canceroase
au prezentat modificări semnificative ale morfologie celulare sub formă de prelungiri
nespecifice și contur neregulat, precum și o scădere a densității celulare posibil datorită unei
inhibiții a proliferării celulare ;
➢ Nivelul de LDH eliberat în mediul de cultură în urma expunerii la tratament a crescut doar în
celulele canceroase de sân la concentrații mari de nanoparticule și doxorubicină indicând o
lezare a membranei celulare și o creștere a permeabilității ei caracteristică celulelor necrotice.
➢ Nivelul de SRO produs în cazul celor 2 tipuri de nanoconjugate în celulele canceroase de sân
poate fi o consecință a acțiunii sinergice a nanoparticulelor de γ-Fe2O3 dar și a doxorubicinei
care induce formarea de SRO la nivelul mitocondriilor prin intermediul activității NADPH
oxidazelor mitocondriale dar și o consecință a
➢ Nanoconjugatele Fe2O3_Dox și Fe 2O3_CMCNa_Dox au determinat o creșterea semnificativă
a producției de SRO față de control, proporțională cu timpul mai accentuată însă în celulele
canceroase posibil ca ur mare a nivelului scăzut de enzime antioxidante caracteristic celulelor
canceroase comparativ cu cele normale.

57
➢ Nivelul de NO în mediul de cultură a crescut cu maxim 20% față de control pentru ambele
tipuri de celule după expunerea lor la nanoparticulele simple stabilizate cu CMCNa și
nestabilizate dar similar și la cele conjugate cu doxorubicină sugerând că nanoparticulele de
γ-Fe2O3 utilizate pot avea un potențial inflamator în celulele normale și canceroase de sân la
doze mai mari de 12.5 µg /mL.
În concluzie, rezultatele demonstrează un potențial antitumoral al nanoconj ugatelor cu
doxorubicină stabilizate și nestabilizate cu CMCNa în terapia cancerului de sân , însă toxicitatea
asupra celulelor normale ramâne o problemă care trebuie soluționată .

58
BIBLIOGRAFIE

Articole:
• Abbasi Ava l, N.; Pirayesh Islamian, J.; Hatamian, M.; Arabfirouzjaei, M.; Javadpour, J.;
Rashidi, M.R., 2016. Doxorubicin loaded large -pore mesoporous hydroxyapatite coated
superparamagnetic Fe3O4 nanoparticles for cancer treatment. Int. J. Pharm. 509, 159 –167;
• Ajda ry, M.; Moosavi, M.A.; Rahmati, M.; Falahati, M.; Mahboubi, M.; Mandegary, A.;
Jangjoo, S.; Mohammadinejad, R.; Varma, R.S., 2018. Health Concerns of Various
Nanoparticles: A Review of Their in Vitro and in Vivo Toxicity. Nanomaterials 8, 634;
• Akbarzadeh , A.; Samiei, M.; Davaran, S., 2012. Magnetic nanoparticles: Preparation,
physical properties, and applications in biomedicine. Nanoscale Res. Lett . 7, 144;
• Aljarrah K., Mhaidat N.M., Al -Akhras M.A., 2012. Magnetic nanoparticles sensitize
MCF -7 breast canc er cells to doxorubicin -induced apoptosis. World J Surg Oncol .
• Allison, K. H., 2012. Molecular pathology of breast cancer: What a pathologist needs to
know. American Journal of Clinical Pathology , 138(6), 770 –780;
• Ansari S. A. M. K., Ficiarà E., Ruffinatti F. A., Stura I., Argenziano M., Abollino O.,
Cavalli R., Guio t C., D’Agata F., 2019. Magnetic iron oxide nanoparticles: Synthesis,
characterization and functionalization for biomedical applications in the Central Nervous
System. Materials , 12(3);
• Arias L. S., Pessan J. P. , Vieira A. P. M., De Lima T. M. T., Delbem A. C. B., Monteiro
D. R., 2018. Iron oxide nanoparticles for biomedical applications: A perspective on
synthesis, drugs, antimicrobial activity, and toxicity. Antibiotics , 7(2);
• Assa F., Jafarizadeh -Malmiri, H., Ajamein, H., Anarjan N., Vaghari H., Sayyar Z.,
Berenjian A., 2016. A biotechnological perspective on the application of iron oxide
nanoparticles. NanoRes , 9, 2203 –2225;
• Attarad A., Hira Z., Muhammad Z., Ihsan ul Haq, Abdul R. P., Joham S. A., Altaf H.,
2016. Nanotechnology, Science and Applications

59
• Baba D, Seiko Y, Nakanishi T, Zhang H, Arakaki A, Matsunaga T, Osaka T., 2012. Effect
of magnetite nanoparticles on living r ate of MCF -7 human breast cancer cells. Colloids
Surf B Biointerfaces , 95, 254 –257;
• Bragg W. H., Cavendish F. R. S., 1915. The Structure of the Spinel Group of Crystals .
Phil. Mag. , 30(176), 305 -315;
• Bruschi M. L., de Toledo L. de A. S., 2019. Pharmaceutical Applications of Iron -Oxide
Magnetic Nanoparticles. Magnetochemistry , 5(3), 50;
• Buzea C., Pacheco I., Robbie K., 2010. Nanomaterials and nanoparticles: Sources and
toxicity. Biointerphases 2, MR17 –MR71.
• Campos E.A., Pinto D.V.B.S., de Oliveira J.I.S., da Costa Mattos E., de Cássia Lazzarini
Dutra R., 2015. Synthesis, Characterization and Applications of Iron Oxide
Nanoparticles —A Short Review. J. Aero sp. Technol. Manag ., 7, 267 –276;
• Carr R. M., Oranu A., & Khungar V., 2016. Physiology & Behavior , 176(1), 139 –148;
• Champagne P.O., Westwick H., Bouthillier A., Sawan M., 2018. Colloidal stability of
superparamagnetic iron oxide nanoparticles in the central nervous system: A review.
Nanomedicine , 13, 1385 –1400;
• Chen L., Wu L.Y., Yang W.X., 2018. Nanoparticles induce apoptosis via mediating
diverse cellular pathways. Nanomed. Nanotechnol. , 13, 2939 –2955;
• Dwivedi S., Siddiqui M.A., Farshori N.N., Ahamed M., Musarrat J., Al -Khedhairy A.A.,
2014. Synthesis, characterization and toxicological evaluation of iron oxide nanoparticles
in human lung alveolar epithelial cells. Colloids Surf. B Biointerfaces , 122, 20 9–215;
• Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin D M,
Forman D and Bray F., 2013. Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC
CancerBase No. 11;
• Gao Q., J. Zhang , G. Hong , and J. Ni, 2010 . One -pot reaction to synthesize PEG -coated
hollow magnetite nanostructures with excel – lent magnetic properties., J. Nanosci.
Nanotechnol. , 10, 6400 – 6406;
• Greaves M, Maley CC., 2012. Clonal evolution in cancer. Nature , 481, 306 -313;
• Gu L, Fang RH, Sailor MJ, Park J -H., 2012. In vivo clearance and toxicity of monodisperse
iron oxide nanocrystals. Acs Nano. , 6, 4947 –4954;

60
• Gul S., Khan S. B., Rehman I. U., Khan M. A., Khan M. I., 2019. A Comprehensive
Review of Magnetic Nanomaterials Modern Day Theranostics. Frontiers in Materia ls, 6,
1–15;
• Helminger M., Wu B., Kollmann T., Benke D., Schwahn D., Pipich V., Faivre D., Zahn
D., Cölfen H., 2014. Synthesis and Characterization of Gelatin Based Magnetic Hydrogels.
Adv Funct Mater . 24,3187 –3196;
• Hobson B., Denekamp J., 1984. Endotheli al proliferation in tumours and normal tissues:
continuous labelling studies. Br J Cancer., 49, 405 –413;
• Kerbel R., 2000. Tumor angiogenesis: past, present and the near future. Carcinogenesis,
21, 505 –515.
• Khan S., Rizvi S.M.D., Ahmad V., Baig M.H., Kamal M.A., Ahmad S., Rai M., Zafar
Iqbal A.N.M., Mushtaq G., Khan M.S., 2015. Magnetic Nanoparticles: Properties,
Synthesis and Biomedical Applications. Curr. Drug Metab ., 16, 685 –704;
• Khanna L., Verma N.K., Tripathi S.K., 2018. Burgeoning tool of biomedical applications
– Superparamagnetic nanoparticles. J. Alloys Compd ., 752, 332 –353;
• S. Klotz, G, Steinle -Neumann, T. Strassle, J. Philippe, T. Hansen, 2008. Magnetism and
the Verwey tran sition in Fe 3O4 under pressure. Physical Review B , 77, 411;
• Kohler N, Sun C, Wang J, Zhang M., 2005. Methotrexate -modified superparamagnetic
nanoparticles and their intracellular uptake into human cancer cells. Langmuir , 21(19), 8858‐
8864;
• Laurent S., Forge D., Port M., Roch A., Robic C., Elst L. V., Muller R. N., 2008. Magnetic
Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis, Stabilization, Vectorization, Physicochemical
Characterizations and Biological Applications. Chem. Rev. , 108, 2064 -2110;
• Laurent S., Saei A. A., Behzadi S. et al., 2014. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles
for delivery of therapeutic agents: opportunities and challenges. Expert Opin Drug Deliv .,
11, 1449 -1470;
• Li L., Jiang W., Luo K., Song H., Lan F., Wu Y. et al., 2013. Sup erparamagnetic iron oxide
nanoparticles as MRI contrast agents for non -invasive stem cell labeling and tracking.
Theranostics , 3, 595;

61
• Li O., Kartikowati C.W., Horie S., Ogi T., Iwaki T., Okuyama K., 2107. Correlation
between particle size/ domain structur e and magnetic properies of highly crystalline Fe 3O4
nanoparticles. Sci. Rep ., 7, 9894;
• Lin W., Huang Y., Zhou X.D., Ma Y., 2006. In vitro toxicity of silica nanoparticles in
human lung cancer cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 217, 252 –259;
• Liu Y.L., Chen D ., Shang P., Yin D.C., 2019. A review of magnet systems for targeted
drug delivery. J. Control. Release , 302, 90 –104;
• Lu J., Kong X., Hyeon T., Ling D., Li F., 2017. Dynamic Nanoparticle Assemblies for
Biomedical Applications. Adv. Mater., 29(14), 10.1002 ;
• Lubbe A. S., C. Bergemann, H. Riess, F. Schriever, P. Reichardt, K. Possinger, M.
Matthias, B. Dorken, F. Hermann, R. Gurtler, P. Hohenberger, N. Haas, R. Sohr, B. Sander,
W. Huhnt, D. Huhn, 1996. Clinical experiences with magnetic drug targeting: a phase I
study with 4' -epidoxorubicin in 14 patients with advanced solid tumors. Cancer Research,
56 (20), 4686 -4693;
• Mahmoudi M., Simchi A., Imani M., Shokrgozar M., Milani A., Hafeli U., Stroeve P.,
2010. A new approach for the in vitro indentification of the cytotoxicity of
superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Colloids Surf B Biointerfaces , 75, 300 –309;
• Marcu A., Pop S., Dumitrache F., Mocanu M., Niculite C. M., Gherghiceanu M., Lungu
C. P., Fleaca C., Ianchi s R., Barbut A., Grigoriu C. & Morjan I., 2013. Magnetic iron oxide
nanoparticles as drug delivery system in breast cancer. Applied Surface Science , 281, 60–
65;
• Massart R, Cabuil V., 1987. Effect of some parameters on the formation of colloidal
magnetite in alkaline -medium -yield and particle -size control. J de Chimie Physique et de
Physico -Chimie Biologique, 84 (7 -8), 967 -973;
• Moghimi S.M., Hunter A.C., Murray J. C., 2001. Long -circulating and target -specific
nanoparticles: Theory to practice. Pharmacol. Rev ., 53, 283 –318;
• Mosmann Tim., 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of i mmunological
methods, 65(1-2), 55 -63;

62
• Neuberger T., Schopf B., Hofmann H., B. von Rechenberg, 2005. Superparamagnetic
nanoparticles for biomedical applications: Possibilities and limitations of a new drug
delivery system. Journal of Magnetism and Magnetic Materials , 293 (1), 483 -496;
• Nigam S., Bahadur D., 2018. Doxorubicin -loaded dendritic -Fe3O4 supramolecular
nanoparticles for magnetic drug targeting and tumor regression in spheroid murine
melanoma model. Nanomedicine, 14, 759 –768;
• Nik-Zainal S., Van Loo P., Wedge D. C., 2012. The life history of 21 breast cancers cell.
Cell, 149(5), 994‐1007;
• Noqta O.A., Aziz A.A., Usman I.A., Bououdina M., 2019. Recent Advances in Iron Oxide
Nanoparticles (IONPs): Synthesis and Surface Modification for Biomedical Applications.
J.Supercond. Nov. Magn. , 32, 779 –795;
• Pacher P, Beckman JS, Liaudet L., 2007. Nitric o xide and peroxynitrite in health and
disease. Physiol Rev ., 87(1), 315‐424;
• Pankhurst Q., Connolly J., Jones S. & Dobson J., 2003. Applications of magnetic
nanoparticles in biomedicine. J. Phys. D: Appl. Phys ., 36, R167 –R181;
• Pârvu, G., 1983. Minerale și roci . Editura Științifică și Enciclopedică, București,
• Roesslein M., Hirsch C., Kaiser J. P., Krug H. F., Wick P., 2013. Comparability of in vitro
tests for bioactive nanoparticles: A common assay to detect reactive oxygen species as an
example. Int. J. Mol.Sci., 14, 24320 -24337;
• Rudzka K., Delgado Á. V.,Viota J. L., 2012. Maghemite functionalization for antitumor
drug vehiculization. Molecular Pharmaceutics , 9, 2017 -2028;
• Ravid, A., Rocker, D., Machlenkin, A., Rotem, C., Hochman, A., Ke ssler-Icekson, G.,
Liberman, U. A., & Koren, R. (1999). 1,25 -Dihydroxyvitamin D3 enhances the
susceptibility of breast cancer cells to doxorubicin -induced oxidative damage. Cancer
Research , 59(4), 862 –867;
• Seema D.M.J., Saifullah B., Selvanayagam M., Gotha i S., Hussein M.Z., Subbiah S.K.,
Esa N.M., Arulselvan P., 2018. Designing of the Anticancer Nanocomposite with
Sustained Release Properties by Using Graphene Oxide Nanocarrier with Phenethyl
Isothiocyanate as Anticancer Agent. Pharmaceutics ., 10(3), 109;
• Sharma J.N., Al -Omran A., Parvathy S.S., 2007. Role of nitric oxide in inflammatory
diseases. Inflammopharmacol, 15, 252–259;

63

• Shivani Thoidingjam & Ashu Bhan Tiku, 2017. New developments in breast cancer
therapy: Role of iron oxide nanoparticles. Adv. Nat. Sci: Nanosci. Nanotechnol ., 8, 2043 –
6254;
• Singh N., Jenkins G.J., Asadi R., Doak S.H., 2010. Potential toxicity of superparam agnetic
iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Rev ., 1, 10.3402;
• Sodipo B.K., Aziz A.A., 2016. Recent advances in synthesis and surface modification of
superparamagnetic iron oxide nanoparticles with silica. J. Magn. Magn. Mater ., 416, 275 –
291;
• Stoclet J. C., Muller B., Andriantsitohaina R, Kleschyov A., 1998. Overproduction of nitric
oxide in pathophysiology of blood vessels. Biochemistry (Mosc) ., 63(7), 826‐832.
• Wu W., Chen B., Cheng J., Wang J., Xu W., Liu L., Xia G., Wei H., Wang X., Yang M.,
et al., 20 10. Biocompatibility of Fe 3O4/DNR magnetic nanoparticles in the treatment of
hematologic malignancies. Int. J. Nanomed., 5, 1079 –1084;
• Xie W., Guo Z., Gao F., Gao Q., Wang D., Liaw B.S., Cai Q., Sun X., Wang X., Zhao L.,
2018. Shape, size and structure -controlled synthesis and biocompatibility of iron oxide
nanoparticles for magnetic theranostics. Theranostics , 8, 3284 –3307;
• Yoshida J., Kobayashi T., 1999. Intracellular hyperthermia for cancer using magnetite
cationic liposomes. Journal of Magnetism and Magnetic Materials , 194, 176 –184;

Site-uri:
• https://ro.wikipedia.org/wiki/Hematit
• https://ro.wikipedia.org/wiki/Magnetit
• https://en.wikipedia.org/wiki/Maghemite
• https://ro.wikipedia.org/wiki/Fi%C8%99ier:Cancer_mamar.jpg