Asist. Univ. Dr. Balaș Mihaela Absolvent Panfil Emilia 2020 UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI FACULTATEA DE BIOLOGIE LUCRARE DE LICENȚ Ă Nanoparticule… [625415]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Coordonator științific
Asist. Univ. Dr. Balaș Mihaela Absolvent: [anonimizat]

2020

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚ Ă

Nanoparticule magnetice de oxid de fier conjugate cu porfirin ă
pentru terapia fotodinamic ă – studiu in vitro

Coordonator științific
Asist. Univ. Dr. Balaș Mihael a

Absolvent: [anonimizat]

2020

1

CUPRINS
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 3
A. PARTEA TEORETICĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 5
I. Nanoparticule magnetice ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 6
1. Nanoparticulele de oxizi de fier: tipuri si structuri ………………………….. ………………………….. ….. 6
2. Proprietățile nanoparticulelor de ox izi de fier ………………………….. ………………………….. …………. 9
3. Acoperiri și modificări funcționale ale suprafeței nanoparticulelor de oxizi de fier …………….. 12
4. Aplicații în biomedicină ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 18
II. Porfirinele ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………………. 22
1. Structuri, tipuri și caracteristici ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 22
2. Acțiunea porfirinelor în terapia fotodinamică ………………………….. ………………………….. ……….. 25
3. Sisteme de livrare a porfirinelor în terapia cancerului ………………………….. ………………………… 28
III. Potențialul toxic și terapeutic al nanoparticulelor magnetice și al porfirinelor …………. 31
1. Toxicitatea nanoparticulelor de oxizi de fier in vitro și in vivo ………………………….. ……………. 31
2. Efecte biologice și moleculare i nduse de porfirine la nivel celular ………………………….. ………. 33
3. Studii privind acțiunea nanoconjugatelor cu porfirină în terapia cancerului ………………………. 35
B. PARTEA PRACTICĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 38
Scop și obiective ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 39
IV. Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 41
1. Caracteristicile liniilor celulare folosite MCF7 și C32 ………………………….. ……………………….. 41
2. Procedura de dezghețare a celulelor ………………………….. ………………………….. …………………….. 42
3. Procedura d e subcultivare (tripsinizare) a celulelor ………………………….. ………………………….. .. 42
4. Procedura de inghețare a celulelor ………………………….. ………………………….. ………………………. 43
5. Nanoparticulele magnetice conjugate cu profirină ………………………….. ………………………….. …. 43

2
6. Testul MTT de viabilitate celulară ………………………….. ………………………….. ………………………. 44
V. Rezultate, discuții și perspective ………………………….. ………………………….. ……………………… 48
1. Efectul nanoparticulelelor conjugat e cu profirină asupra viabilității celulelor MCF7 ………….. 48
2. Efectul nanoparticule lelor conjugate cu profirină asupra viabilității celulelor C32 …………….. 50
3. Perspec tive ale experimentului ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 52
Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 53
Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 54

3
Introducere

Cancerul este un ansamblu de boli ce reprezintă a doua cauză de mortalitate la nivel global
(1 din 6 morți sunt cauzate de cancer) , după maladiile cardio -vasculare , conform Organizației
Mondiale a Sănătății . (https://www.who.int/en/news -room/fact -sheets/detail/cancer ). În presă este
adesea numit „boala secolului” întrucât incidența lui a c rescut dramatic în ultimii zeci de ani. El se
caracterizează printr -o multiplicarea haotică a celulelor dintr -un țesut , cu posibilitatea migrării din
locul inițial afectat către alte zone (în cazul tumorilor maligne ) sau nu (în cazul tumorilor benigne) .
Acesta poate fi declanșat de o varietate de factori fizici, chimici sau biologici
(https://www.cancer.gov/about -cancer/understanding/what -is-cancer ). Cercetătorii încearcă
înțelegerea mecanismului apariției și a progresiei în timp a bolii în s copul descoperirii unui
tratament salvator.
Nanotehnologiile se dovedesc a avea un potențial imens în acest sens , interesul pentr u ele
crescând exponențial în ultimii ani, dovadă și numărul uriaș de publicații pe această temă . Ele fac
posibilă manipularea unor materiale de ordin nanometric (10-9) și îmbinarea lor cu obținerea de noi
produse ce prezintă un ansamblu de caracteristici , adesea diferite de cele ale materialel or din care
au fost confecționate (în stare brută) .
Nanoparticulele magnetice de oxid de fier sunt foarte studiate în prezent datorită
numero aselor avantaje pe care le prezintă. Printre ace stea se numără dimensiunile reduse , forma
lor (cele două influențând foarte mult biodistribuția și răspunsul celular ) ( Kuchma și colab l., 2017;
Zhu și colab ., 2017 ) și comportamentul magnetic care permite co ordonarea transportului lor în
organism (Wu și colab ., 2019 ). Aceste particule au capacitatea de generare a radicalilor liberi care,
odată internalizați prin endocitoză, determină apariția stresului oxidativ prin activarea mediatorilor
pro-inflamatori. Radicalii liberi afectea ză de ase menea și proteinele și lipidele membranare ( sau de
la nivelul organitelor), care suferă peroxidare. Consecința tuturor acestor modificări este alterarea
funcțiilor celulare normale, și implicit moartea celulelor (Ghartavol și colab ., 2020 ; Nedyalkova și
colab., 2017 ). Cu toate acestea, nanoparticulele de oxid de fier sunt toxice doar la doze mari, ceea
ce le face candidați excelenți pentru îndeplinirea rolului de transportor al agentului anti -tumoral
(Patel și colab ., 2019) .
Porfirina este un compus alcătuit din patru inele pirolice conjugate (Rabiee și colab .,
2020) . Aceasta prezintă proprietăți fot osensibilizatoare, fiind utilizată în terapia fotodinamică .

4
Porfirina este deja folosită în tratarea a trei ti puri de cancere, de la nivelul esofagului, plămânilo r
și pielii (Rajora și colab ., 2017) . Principalul avantaj pe care îl aduce fo losirea ei este activarea non-
violentă pen tru organismul gazdă prin intermediul luminii infra -roșii sau roșii. Prin acest mod este
determină o acumulare de porfirină la nivel tisular unde este stimulată , predominant , formarea de
oxigen singlet (1O2), dar ș i a altor tipuri de specii reactive de oxi gen care alterează funcția celulară
normală , asemeni cazului nanoparticulelor de oxid de fier (Rajora și colab ., 2017) . Solubilitatea
porfirinelor poate fi crescută prin c onjugare la nanoparticule (Makarska -Bialokoz, 2018) .
Îmbinarea celor două elemente într -un singur sistem poate duce la producerea uno r particule
mult mai eficiente și mai puțin invazive în afara situsului țintă.
Studiul de față urmărește evidențierea posibilelor efecte toxice ale nanoparticulelor
magnetice de oxid de fier conjugate cu porfirină asupra a două tipuri celulare canceroase , de
adenocarcinom și de melanom amelanotic. Parametrii urmăriți sunt viabilitatea celulară,
concentrația speciilor reactive de oxigen și modificările morfologice.
Lucrarea a re o structură formată din două părți. P rima dintre ele prezintă, pe baza
public ațiilor de până acum din literatura științifică, aspectele teoretice referitoare la componentele
acestor nanoconjugate, proprietățile lor și aplicațiile în care joacă rolul pri ncipal. Cea de a doua se
axează pe exper imentele desfășurate în cadrul Departame ntului de Biochimie și Biologie
Moleculară a Facultății de Biologie, Universitatea București, în sensul evaluării toxicității
particulelor asupra celor două linii celulare.

5

A. PARTEA TEORE TICĂ

6
I. Nanoparticule m agnetice

1. Nanoparticulele de oxizi de fier: tipuri si structuri
Nanoparticulele (NP) sunt fragmente submicronice, cu diametre variind între 1 și 100 nm,
formate din materiale organice sau anorganice ce le conferă proprietăți inovatoare comparativ cu
ansam blul materialelor luate individual . Un exemplu concret în acest sens sunt NP magnetic e care
prezintă proprietăți magnetice de tipul supermagnetismului, coercivit ății ridicat e, temperatur ii
Curie scăzut e sau înalt ei susceptibilit ăți magnetic e (Wu și colab ., 2008) .
NP sunt molecule cu o structură destul de simplistă , fiind alcătuite din trei straturi : (a) stratul
de suprafa ță ce poate fi funcționalizat cu o varietate de molecule de dimensiuni mici, io ni metalici,
surfactanți și polimeri , (b) stratul de mijloc care diferă din punc t de vedere chimic de nucleu și (c)
stratul central, numit și nucleu, care reprezintă partea centrală a NP, sau adesea chiar NP în sine
(Khan și colab ., 2019) .

Figura 1 . Design -ul tipic al nanoparticulelor magnetice utilizate în biotehnologii (Dobson, 2008) .
Nanosistemele nucleu – strat de mijloc sunt adesea folosite pentru a atașa diferite
medicamente la aceste NP . Nanoparticul a corespunde miezului, în timp ce învelișul reprezintă
acoperirea de suprafaț ă pentru funcționalizarea nanoparticulelor, îmbunătățirea stabilității,
farmacocineticii, biodi stribuției și biocompatibilității. Polimerii sintetici sau naturali, surfactanții
organici, compușii anorganici și moleculele bioactive pot funcționa ca înveliș pentru NP de oxid
de fier (Arias și colab ., 2018) .

7
În prezent, catego ria NP magnetice include NP metalice, NP de oxid metalic și NP din aliaje
metalice. Cele mai uzuale NP utilizate sunt cele din aur, argint, fier, cobalt și nichel (Guo și colab .,
2018) .
NP din oxid de fier ies în evidență dintre celelalte tipuri de NP datorită costurilor reduse
pe care le asigură utilizarea lor, dar și datorită comportamentului supermagnetic, biocompatibilității
și biodegradab ilității . Acestea au ridicat în prezent un interes extrem de mare în domeniul terapiei
cancerului tocmai datorită acestor proprietăți, mai cu seamă a supermagnetismului. Acesta
reprezintă virtutea de a își ridica temperatura odată expuse la un câmp magnet ic extern sau de a
putea fi mobilizate la un situs țintă cu ajutorul unui magnet extern. NP din oxid de fier sunt
singurele aparținând categoriei lor care pot fi utilizate în tehnica imagisticii prin rezonanță
magnetică (Thoidingjam și Tiku, 2017) .
Mai multe tipuri de coloizi de fier pot fi folosiți în sensul obținerii NP de oxid de fier. Printre
acestea se numără magnetita (Fe 3O4), hematit ul (α-Fe2O3), maghemit ul (γ-Fe2O3), Wüstit -ul (FeO),
ε-Fe2O3 și β-Fe2O3, dar dintre acestea mai reprezentative în ceea ce privește supermagnetismul sunt
primele trei (Ranmadugala și colab ., 2018) .
Un oxid magnetic de fier frecvent utilizat în aplicațiile biomedicale este magnetita (Fe 3O4).
Aceasta are o structură cubică de spinel invers în care oxigenul formează o împachetare compactă
cu cationii de fier ce ocup ă situri tetraedrice interstițiale și situri octaedrice. Electronii pot sări între
ionii Fe2+ și Fe3+ din siturile octaedrice la temperatura camerei, redându -i magnetitei o clasă
importan tă de materiale semi -metalice. Cu o acoperire corespunzătoa re a suprafeței, aceste
nanoparticule magnetice pot fi disp ersate în solvenți adecvați, formând suspensii omogene numite
fero-fluide. O astfel de suspensie poate interacționa cu un câmp magnetic ex tern și poate fi
poziționată într -o zonă specifică, facilit ând imagistica prin rezonanță magnetică pentru diagnosticul
medical și terapia cancerului asistată de câmp magnetic (Gupta și Gupta, 2005) .
Magnetita și maghemitul au structuri similare de cristale de tip spinel, cu una din fiecare
șase situri cationice ră mânând vacante în cazul maghemit ului. Magnetita are o stabilitate chimică
destul de scăzută datorită descompunerii sale în maghemit la temperaturi mai mari de 50° C (Kuma r
și colab ., 2017) .

8
(a) (b)
Figura 2. (a) Structura de spinel cubic centrată pe față a magnetitei. (b) Mărirea unui tetraedru și a unui
octaedru adiacent care împarte un atom de oxigen . Sferele mari etichetate de Fetet și Feoct reprezintă atomii
de fier tetraedric, respectiv octaedric. Atomii de oxigen sunt reprezentați ca sfere mici. Par ametrii de rețea
a în planul (001) și c în direcția perpendiculară cu acesta sunt identici în condiții de echilib ru, dar diferă
pentru sistemel e tetragonale. Simetria inferioară în acest caz duce, de asemenea, la distincția dintre Oax
axial și atomi de Oeq ecuatoriali. Săgețile indică direcțiile de deplasare a atomilor de oxigen din pozițiile
lor ideale pentru un parametru intern u> 0 (Friák și colab ., 2007) .
Maghemitul este izostructural cu magnetita, î nsă prezintă posturi cationice vacante. De
asemenea, proprietățile celor două tipuri de oxizi sunt similare, cu diferența că maghemitul este
mai puțin magnetic comparativ cu magnetita. Maghemitul poate fi sintetizat extrem de simplu prin
oxidarea mag netite i. Deși maghemitul nu necesită întotdeauna un strat stabiliza tor, un start sau o
grefă la suprafață cu polimeri precum polietilenglicolul , ei sunt adesea utiliza ți într-un sistem
biologic și cresc timpul de înjumătățire a NP în sânge . Timpul de înjumătățir e crescut se datorează,
de regulă, amânării procesului de opsonizare în ca re particulele sunt vizate pentru distrugere de
către celulele imune fagocitice, ceea ce duce la o eliberare rapidă a lor la nivelul ficatului sau splin ei
de către sistemul reticuloe ndotelial (Israel și colab ., 2020) .
Wüstit -ul, spre deosebire de celelalte două tipuri de oxizi prezentate, este aproape non –
stoichiometric, având o ușoară deficiență de fier. Acest lucru poate fi notat astfel : Fe1-xO. Wüstit –
ul prezintă proprietăți electronice neobișnu ite, având capacitatea de a își modifica tipul de „carrier”
de la p la n în jurul valorii 0,08 a lui x. Din punct de vedere magnetic, tipul stoichiometric (FeO)
este un antiferomagne t. Structura cristalului este una asemănătoare cu cele ale rocilor saline, având
o împachetare compactă în care oxigenul prezintă un aranjament ce aduce cu aspectul unor zăbrele
în care ionii de fier ocupă siturile interstițiale octaedrice. În sensul conse rvării electroneutralități i

9
structurii cristaline, o parte dintre ionii de Fe bivalenți eliberează un electron devenind ioni Fe3+.
(Gheisari și colab ., 2008)
Figura 3. Evidențierea diferențelor conformaționale ale cristalelor de (a) Wüstit (FeO), (b) magnetită
(Fe 3O4) și (c) hematit (α-Fe2O3) (Yu și Ji, 2017)

2. Proprietățile nanoparticulelor de oxizi de fier
Datorită toxicității scăzute , a proprietățil or superpar amagnetice , a raportu lui
supraf ață/volum și a metodologi ei de separare simplă, NP magnetic e de oxid de fier au trezit interes
în folosirea lor în aplicațiile biomedicale, cum ar fi diagnostic ul prin imagistic a de rezonanță
magnetic ă, terapi a termică și administrarea de diverse medicament e (F. Hasany și colab ., 2013) .
Dimensiunile NP de oxid de fier sunt într -o relație strânsă cu efectele lor asupra
comportamentului in vivo și asupra absorbției la nivel celular . Modificările aduse asupra mărimii
și for mei NP pot aduce alterări în ceea ce pr ivește răspunsul celular. NP ale căror diametre sunt
cuprinse între 10 și 100 nm sunt considerate optime aplicațiilor in viv o cu o farmacocinetică
convenabilă. Există NP de oxid de fier „ultrasmall” ( < 10 nm) și „ultr afine” (< 5 nm). Acestea
prezintă potențial în ceea ce privește utilizarea lor în terapie întrucât pot fi excretate la nivel renal,
având și un timp de degradare foarte scurt după internalizarea lor la nivel celular s au la nivelul
organelor sistemului reti culoendotelial. De asemenea, NP de dimensiuni mici pot părăsi vasele de
sânge tumor ale, datorită permeabilit ății crescute și efectului de retenție , și apoi naviga prin
barierele stromale tumorale mai eficient decât na noparticulel e mai mari care au o tendin ță de
agregare în condiții fiziologice. Forța de impuls este mai puternică în particule le mai mari, ceea ce
duce la o probabilitate ridicată de coliziune cu peretel e și la o eliminare mai rapidă de către sistemul

10
fagocitic mononuclear . Macrofagele au afini tăți diferite față de diferitele tipuri de NP de oxid de
fier, preluându -le eficient pe cele de dimensiuni mai mari. Inhibarea absorbției macrofagelor a
prelungit timpul de circulație a NP la nivel sangvin (Zhu și colab ., 2017) .
După cum am menționat anterior, forma NP induce o variet ate de proprietăți. Ea afectează
în principal biodistribuția in vivo a NP de oxid de fier , atașarea și absorbția celulară ulterioară a
acestora, dar și toxicitatea . NP pot fi preparate în diferite fo rme, incluzând sfere, hexagoane,
cuburi, tije și discuri . S-a dovedit că NP în formă de tijă sunt mai toxice decât cele în formă de
sferă (Kuchma și colab l., 2017; Zhu și colab ., 2017) . De asemenea, NP sub formă de tijă sunt
prezente pe o perioadă mai lungă în circulația sangvină. O explicație a acestei favorizări poate fi
faptul că activitatea macrofagelor este stimulat ă într -o măsură mai mică de aceste particule decât
de cele sferice. Cu toate acestea, magnetita sferic ă și particulele de maghemit oferă o suprafață
uniformă pentru acoperirea și conjugarea liganzilor țintă sau a agenților terapeutici , ceea ce constă
într-un avantaj (Wahajuddin și Arora, 2012) .
Un alt parametru care influențează proprietățile NP este și tipul de structură a oxidului
de fier . S-a constatat că starea de oxidare a fierului (Fe2+ sau Fe3+) din NP supermagnetice poate
afecta proprietățile citotoxice ale NP din țesuturile biologice. Uneori, NP maghemit ului (Fe 2O3)
prezintă o genotoxicitate mai semnificativă decât cele ale magnetitei (Fe 3O4). Cu toate acestea, în
alte cazuri, NP di n Fe 2O3 nu provoacă daune semnificative la nivel ADN (Kuchma și colab ., 2017) .
Comportamentul magnetic al materialelor poate fi clasificat în cinci grupe majore: fero -,
feri-, para -, antifero – și dia -magnetism. Fero – și ferimagnetismul sunt mecanismele de bază ale
magneț ilor permanenți. Magneții permanenți pot fi magnetizați prin câmpuri magnetice externe și
rămân în această stare și după îndepărtarea câmpurilor . Feritele cubice compuse din oxizi de fier și
alte elemente prezintă ferimagneti sm. Atât materialele feromagnetice, cât și cele ferimagnetice
dezvoltă magnetizări spontane sub temperaturile Curie . Cu toate acestea, odată depășit acest prag
de temperatură, ele devin paramagnetice. Spre deosebire de cele două , paramagne tismul este
caracte rizat prin lipsa m enținerii magnetiz ării în absenț a câmpurilor magnetice externe, fluctuația
termică randomiz ând momentele magnetice. În prezența unui câmp magnetic, paramagne ții au o
aliniere parțială a momentelor magnetice atomice în direcția câmpului, r ezultând o magneti zare și
o susceptibilitate netă pozitivă (Wu și colab., 2019) .

11

Figura 4. Alinierea momentelor magnetice atomice individuale în diferite tipuri de materiale (Wu și
colab ., 2019) .
Momentul magnetic (µ) reprezintă o proprieta te esențială în ceea ce privește aplicabilitatea
NP magnetice în domeniul nano -medicinei. Acesta este egal cu produsul dintre magnetizare (M) și
volumul centrului magnetic (Vm). Un moment magnetic mai mare produce un semnal de detecție
mai pronunțat (pentr u aplicații de biosensibilitate magnetică și de imagistică), precum și o forță
magnetică mai mare (pentru manipulare magnetică și aplicații legate de furnizarea de
medicamente/gene). Din cauza lipsei de simetrie a cristalului translațional în stratul de su prafață,
proprietățile magnetice de la nivel superficial sunt foarte diferite de regiunea interioară a NP, iar
ca urmare, are loc o scădere a magnetizărilor de saturație (Ms) și o creștere a constantei de
anizo tropie , comparativ cu materialele lor vrac cor espunzătoare (Wu, Su, Liu, Saha, și J. P. Wang,
2019) .
Datorită caracteristicilor fizico -chimice unice, NP supermagnetice din oxid de fier prezintă
o suprafață mare p entru generarea radicalilor liberi . Cea mai mare parte a toxicit ății intracelulare
și in vivo apare din producția exagerată a speciilor reactive de oxigen precum radicalii liberi de
tipul radical ilor hidroxil, anionul ui superoxi d și peroxidul ui de hidrogen non-radical ic, care sunt
capabili să acționeze asupra proteinel or și lipid elor din structura celulei și organitelor celulare
(mitocondrii, nucleu și reticulul endoplasmic) . Activitatea enzimatică de la nivelul organism ului
poate degrada suprafața NP și, ca urmare, ionii de fier levigați cauzează generarea speciilor reactive
de oxigen . Ulterior, acestea se internalizează în celulele unde pot provoca stres oxidativ prin

12
activarea mediatorilor pro -inflamatori. Mai mult, speciile reactive de oxigen, datorită r eacției cu
macromoleculele , pot deteriora celulele prin : peroxidarea lipidelor, alterar ea proteinel or,
deteriorarea material ului genetic, interferarea cu funcțiil e de semnalizare și modularea transcripției
genice , ducând în final la moartea celulelor, prin necroză sau apoptoză (Vakili -Ghartavol și colab .,
2020) .
NP de oxizi de fier sunt extrem de reactive cu agenții de oxidare , în special cu aerul.
Pentru o protecție completă și permanentă împotriva oxidării, fiecare NP este acoperită cu un
înveliș subțire care nu are impact asupra proprietăților magnetice ale acestora, sau dacă există es te
unul redus. În acest sens sunt utilizate diferite materiale de acoperire. Utilizarea aurului și silicelor,
deși prezintă efecte pozitive în acest sens, po ate însă dezvolta și efecte nedorite, mai exact
reducerea proprietăților magnetice ale particulelor . Se folosesc, de asemenea, și învelișurile din
magneziu, care au un efect mai scăzut asupra magnetismului NP de fier (Ali și colab ., 2016) .
Toxicitatea NP magnetice de oxid de fier este destul de scăzut ă. Efectele citotoxice
dezvăluite pentru magnetită și maghemit sunt de obicei neglijabile sau limitate la condiții extre me,
cum ar fi doze foarte mari ( >0,5 mg Fe/m L) sau timpi lungi de expunere ( >120 h). Cu toate acestea,
în majoritatea cazurilor este evaluată numai scăderea viabilității celulare , alte efecte toxice
potențiale (genetice sau cancerigene printre altele) nu s unt studiate în general. De asemenea, nu au
fost găsite semne de toxicitate s uplimentară pentru diferitele NP anisometrice în acord cu
observațiile raportate pentru cele sferice (Roca și colab. , 2019) .

3. Acoperiri și modificări funcționale ale suprafeței nanoparticulelor de oxizi de
fier
Organismul , în sensul apă rării împotriva entităților străine , inclusiv a unor agenți terapeutici
injectați și agenți de contrast , prezintă o serie de „bariere biologice” care îi împiedic ă să ajungă la
destinațiile propuse. Aceste bariere pot restricționa și funcția NP , alterându -le mobilitatea ,
provocând modificări fizice sau inducând un răspuns negat iv al gazdei folosind semnalizarea
biochimică . Barierele intracelulare sunt un motiv esențial pentru care multe medicamente și
sistemele de administrare a medicamentelor eșuează, lucru valabil și pe ntru s istemele NP. Odată
ce o NP cu specific itate celular ă s-a legat de membrana țintei sale, ea este de obicei preluată de
către celulă prin endocitoz ă mediată de receptor, fiind apoi internalizat ă în compartimente le

13
endo zomale pentru preluc rare și distrugere prin acidifierea endo zomilor. Majoritatea acestor
endo zomi sunt apoi transferați în lizozomi unde reacțiile hidrolitice și enzimatice metabolizează
complet macromoleculele (Veiseh și colab ., 2010) .
NP supermagnetice de oxid de fier nud e (care nu au o acoperire ) agreg ă în apă, prezintă
instabilitate chimică în aer și o lipsă de biodegradabilitate în mediul fiziologic. C u toate acestea ,
cea mai semnificativ ă problem ă întâmpinat ă în folosirea lor este faptul că acestea suferă
interacțiuni nespecifice cu proteinele serice , tinzând să se aglomereze in vivo datorită
interacțiunilor hidrofobe dintre particule atunci când sunt expuse unui medi u fiziologic. Ca urmare
a acestei agregări, NP magnetice de oxid de fier sunt eliminate rapid din circulație în urma
adsorbției proteinelor serice pe suprafața lor, dar și din cauza faptului că nu form ează interacțiun i
specific e cu organele sau țesuturile organismului . Din aceste motive enumerate , suprafața NP
trebuie să fie hidrofilă pentru utilizarea lor în aplicații in vivo și să prezinte stabilitate pentru o
circulați e prelungită în interiorul corpului (Muthiah și colab ., 2013 ).
NP necesită o acoperire de suprafață bioc ompatibilă, netoxică și care să permită transportul
de medicamente în anumite zone. NP pot fi stabilizate prin diferite strategii de protecție : acoperirea
organică (polietilenglicol, polizaharidă, acid dodecanethiol -polimetacrilic și chitosan ) sau
acoperir ea cu un înveliș anorganic (silice, metal sau nemetal, oxid de metal sau sulfură ). Acest strat
de suprafață protejează nanomaterialele de aglomerare și, în același timp, îl funcționa lizează. NP
magnetice funcționalizate se pot lega la medicamente, proteine , enzime, anticorpi sau nucleotide
și pot fi direcționate către un organ, țesuturi sau o tumoare folosind un câmp magnetic extern . (Shah
și colab ., 2017) Acoperirea poate fi proiectată astfel încât :
• să furnizeze un strat reactiv pentru grefarea / legarea compușilor terapeutici;
• să îmbunătăț ească comportamentul biologic al NP de oxid de fier prin limit area
interacțiunilor nespecifice și a absorbției de către sistemul mononuclear fagocit ar;
• să îmbunătăț ească eficaci tatea internalizării NP de oxid de fier (Vangijzegem și colab .,
2019) .
Acoperirea NP se poate realiza prin două metode :
a. Adsorbție . Molecule le organice mici sunt grefat e pe suprafața NP datorită fragmentelor
de ancorare precum silani i, carboxilat ul sau organofosfor ul care prezintă o afinitate
puternică față de suprafața oxidul ui metalic. La fel de eficienți sunt și polimeri i precum

14
polietilenglicol ul, alcool ul polivinilic, p olivinilpirolidon a, sau molecule le naturale, cum
sunt amidon ul, zahăr ul, albumina sau celuloz a.
b. Încapsulare . NP de oxi zi de fier sunt încapsulate într -o structură amfifilică auto –
asamblată (lipide, polimeri, vezicule) pentru a forma nanoa nsambluri magnetic e care
prezintă o bună dispersibilitate și biocompatibilitate (Vangijzegem și colab ., 2019) .
NP din oxid de fier căptușite cu diferiți compuși organici prezintă un mare potențial de
aplica bilitate în mai multe arii. Structura acestor NP aduce două mari avantaje : conservarea
proprietăți i magnetice a oxizilor ma gnetici de fier și menținerea proprietăți lor adiționale ale
moleculelor organice. NP de oxid de fier funcționalizate cu materiale organice se pot împărți în trei
categorii (considerând oxidul de fier a fi nucleul) : miez – înveliș (unde miezul poate fi orice oxid
de fier, iar învelișul orice material organic), matri ce (care se împarte la rându l lui în structura
înveliș -miez – care constă dintr -un nucleu de NP din compu și organic i și un înveliș de particule de
oxid de fier, legate înt re ele prin legăturilor chimice – și structura mozaic – la care învelișul este
constituit din molecule organic e, acoperi nd uniform o mulțime de NP magnetice de oxid de fie r) și
înveliș a – miez – înveliș b (cele două învelișuri pot fi de același tip sau di n materiale funcționale
diferite, de obicei polim eri sau biomolecule, miezul fiind alcătuit din NP de oxid de fie r) (Wu și
colab ., 2008) .

Figura 5 . Prezentare figurativă a tipurilor de NP de oxid de fier funcționalizate cu materiale organice. Cu
roșu, respectiv gri, este evidențiat compusul organic, iar în albastru NP de oxid de fier (Wu și colab. ,
2008) .
Mulți polimeri și polizaharide sunt folosiți ca agenți de acoperire . Printre aceștia mai folosiți
sunt polietilenglicol ul, dextran ul, alginat ul, agaroz a, chitosan ul, alcool ul polivi nilic, acid ul
poliacrilic, pululan ul și polivinilpirolidon a. Acești compuși constituie un șablon c u rol în control ul

15
creșter ii particulelor , mențin ându -le dimensiunea, forma și stabilitatea coloidală . De asemenea,
învelișul polimeric limitează interacțiun ea fizi că dintre particulele formate în soluția coloidală și
previn atacul imunogen în fluide le biologice . De asemenea, combate eroziunea și scurgerea
materialelor cu miez magnetic după administrarea în corp și asigură eliberarea medicamentului
într-o mani eră controlată, fie prin eroziunea de suprafață , fie prin difuzarea suprafeței, în funcție
de tipul de polimer, greutate și capacitatea de încărcare. Sarcina de suprafață a polimerului de
acoperire are efect asupra limit ării agregări i particule lor. În cazu l NP stabilizate cu citrat, repulsia
electrostatică între grupările hidroxil (OH -) crește stabilitatea particulelor în soluție (Abd Elrahman
și Mansour, 2019) .
Chitosanul este un polizah arid liniar , compus din glucozamină și unități de N –
acetilglucozamină , fiind singurul polimer pseudonatural cationic, obținut prin deacetilarea chitinei
(al doilea biopolimer cel mai abundent din natură , derivat în principal din e xoscheletul
crustaceelor ). Chitosanul este considerat un material non -toxic care prezintă biocompatibilitate și
biodegradabilitate, fiind deci considerat un produs regenerabil, durabil și accesibil . În plus, datorită
structurii chimice deosebite, are propr ietăți fizico -chimice și b iologice utile în sensul prepa rării NP
cu acest tip de înveliș , cum ar fi bioadezivitatea și capacitatea de formare a filmului pe piele și
mucoase și activitate antibacteriană. Mai mult, chitosanul este cunoscut pentru facilita rea
mobilității particulelor peste barierele celulare și deschide rea tranzitori e a joncțiunil or strânse
dintre celulele epiteliale . Gradul de deacetilare definește solubilitatea acelor polizaharide,
chitosan ul fiind solubil în medii apoase acide (deacetilare mai mare de 50%), în timp ce chitina
este insolubilă (Frank et al. , 2020; Muthiah, I. -K. Park, et al. , 2013) .
Polietilenglicolul (PEG) este un polimer solubil în apă, utilizat pe scară largă pentru a
îmbunătăți solubilitatea apoasă a medica mentelor hidrofobe. Un înveliș din PEG minimizează
absorbția de către sistemul fagocitelor mononucleare și crește timpul de circulație , fără a provoca
interacțiuni imune. Acesta reduce la minimum absorbția nespecifică a organismului, ceea ce ajută
în continuare în acumularea tumor ală datorită creșterii permeabilității și efectului de retenție. Odată
ce NP magnetice de oxid de fier sunt acoperite cu PEG, acesta acționează ca un distanțier pentru
atașarea diferitelor biomolecule. Dacă se atașează liganzii, precum o proteină sau un anticorp,
acumularea NP va fi mai specifică regiunii de interes, evitând astfel țesuturile normale . Există
câteva probleme întâmpinate în eliberarea eficientă a medicamentului la locul vizat. În primul rând,
de obicei, medicamentele sunt atașate fizic de suprafața NP, astfel încât pot fi eliberate rapid la

16
injectare înainte de a atinge ținta. În cele din urmă, doar un mic procent din medicament va ajunge
la destinația finală. O altă problemă este că acoperirea pe particule poate fi digerată în condiții
citosolice, expunând astfel particulele la celule. Aceste particule se pot agrega și pot determina
reacții adverse pentru supravieț uirea celulelor (Muthiah, I. K. Park, și colab ., 2013) .
Dextranul este un glucan ra mificat complex (polizaharid derivat din condensarea
glucozei). El este de origine microbiană , având legături glicozidice predominant C -1 → C -6".
Lanțurile au lungimi variate (de la 3 la 2000 de kilodaltoni) , cel principal constând din le gături
glicozidice α-1,6 între monom erii glucozei, cu ramuri de la legăturile α-1,3. Această ramificare
caracteristică distinge un dextran de o dextrină, un polimer glucozic cu lanț drept având legături α –
1,4 sau α -1,6 (Heinze și colab ., 2006; McNaught și Wilkinson, 1997) . NP de oxid de fier cu înveliș
din dextran sunt agenți clinici de contrast bine stabiliți și disponibili comercial pentru imagistica
MR, fiind dovedit că posedă capacități de stadializare a nodului cancer os. Acoperirea cu dextran a
fost îmbunătățită prin introducerea unei grupări carboximetil pentru o stabilitate și funcționalitate
sporită. Chiar și după introducerea grup ării a fost încă necesară o atașare mai puternică, deoarece
acest polimer e ste destul de susceptibil pentru detașa re. În consecință, dextranul a fost reticulat cu
epiclorohidrină pentru o stabilitate mai mare decât NP anterioare, chiar și în condiții dure, fără a
suferi modificări în dimensiun e sau în timpul de înjumătățire din circu lația sângelui.
Funcționalita tea lor a fost îmbunătățită p rin tratarea lor cu amină pentru a oferi o grupare amină
primară, care se poate lega covalent cu peptide sau proteine (Muthiah, I. K. Park, și colab ., 2013) .
Alcoolul polivinilic (PVA) este un polimer n on-ionic solubil în apă, utilizat pe scară largă
ca o componentă a biomaterial elor și a diverselor sisteme de administrare a medicamente lor. Acesta
prezintă adesea proprietăți active de suprafață, ceea ce face ca acest polimer să fie potrivit ca un
emulgator pentru stabilizarea diferitelor sisteme coloidale . PVA nu poate fi sintetiz at prin
polimerizarea directă a alcoolului vinilic datorit ă naturii instabile a acestui monomer . Din acest
motiv el este sintetizat în mod tipic prin polimerizarea poliacetat ului de vinil, cu hidroliza
(saponificarea) ulterioară a acestuia pentru a se forma alcool vinilic. Ca urmare, compusul conține
adesea grupe reziduale de acetat de vinil care influențează foarte mult proprietățile fizico -chimice
ale acestuia (Khutoryanskiy, 2018) . PVA a fost utilizat cu succes pentru repararea tendoanelor, în
producerea lentilel or de contact și a altor materialele oftalmice, în administrarea de medicamente
și alte aplicații biomedicale diverse. Printre a vantajele utilizării lui se numără rezist ența la adsorbția
de proteine și la adeziunea celule lor, având și o biocompatibilitate ridicată. Pri n urmare, PVA poate

17
servi ca un excelent material de acoperire biocompatibil și solubil în apă pentru NP magnetice de
oxid de fier . Particulele acoperit e cu carboxi -PVA au o stabilitate excelentă chiar și la temperaturi
ridicate datorită încărcărilor negat ive ale acizilor carboxilici, iar NP acoperit e cu amino -PVA a u o
absorbție celulară mai mare datorită încărcărilor pozitive ale grupărilor amin o (Muthiah, I. K. Park,
și colab ., 2013) .
Diverse molecule biologice (precum proteine, polipeptide, anticorpi, biotină , avidină, etc. )
pot fi, de asemenea, legate la suprafața NP cu oxid de fier , direct sau indirect , prin cuplarea chimică
prin intermediul unor grup ări pentru a face ca țintele NP să fie specifice. NP de oxid de fier
funcționalizate cu m oleculele biologice își vor îmbunătă ți mult biocompatibilitatea. Astfel de NP
magnetice pot fi fo arte utile pentru a ajuta la o separare eficientă a proteinel or, a moleculelor de
ADN, celulelor, produselor biochimice (Wu și colab ., 2008) .
Dioxidul de siliciu este utilizat pe scară largă pentru modificarea suprafeței NP de oxid de
fier. Acoperirea cu silice are următoarele avantaje: scade tendința de aglomerare a particulelor ,
sporind stabilitatea și reducând e fectele citotoxice ale acestora . De asemenea, s -a evidențiat și o
bună biocompatibilitate, hidrofilicitate și stabilitate (Zhu și colab ., 2018) . Îndeplinind rol de
protecție , învelișul de dioxid de siliciu este destul de ușor de sintetizat , existând și posibilitatea de
a controla dimensiunile . Producția de astfel de învelișuri poate fi abordată în două moduri: prin
metoda Stober clasică (în fază apoasă) și metoda sol -gel (atât în faza apoasă cât și în cea oleică) .
Funcț ionali zarea învelișului de dioxid de siliciu este similară cu adsorbția ligandului. Acest lucru
poate însă produce creșterea exagerată a diam etrul NP modificate, ceea ce afectează
biocompatibilitatea, fluiditatea, stabilitatea și performanțele magnetice al e acestora . Pentru a
controla grosimea învelișului de silice sunt necesare condiții atent controlate (Chu și colab ., 2015) .
Elementele metalice utilizate pentru modificarea suprafeței sunt relativ inerte pentru a
acționa ca un strat de protecție. Metalul de acoperire și NP magnetice sunt strâns cuplate printr -un
proces de reacți i chimic e. Învelișul metalic este mai ușor biof uncționalizat decât su prafața NP nude .
Aurul este elementul principal dintre metal ele nobile folosite în realizarea de învelișuri . Datorită
conjugării puternice cu sulful, aurul oferă avantaje remarcabile în acoperirile de suprafață care
conțin sulfi dril. Din cauza inertității chimice a aurului, formarea de învelișuri de aur este dificilă,
astfel încât NP acoperite cu aur sunt complet stabile. Argintul este un alt metal nobil utilizat în
acest scop . Acoperirea cu argint face ca NP germici de, deoarece argintul are o capacitate de

18
sterilizare foarte puternică. De asemenea, argintul poate forma atât structuri miez -înveliș , cât și
heterostructuri (Chu și colab ., 2015) .
Oxizii metalici și sulfidele metalice , datorită proprietăților fizico -chimice aparte pe care
le posedă, sunt adesea uzitate în funcționalizarea NP de oxid de fier. În funcție de structura pe care
o prezintă, oxizii meta lici se împart în șase mari categorii : M2O (Cu 2O, Ag 2O etc .), MO (ZnO,
MgO, CoO, ZnS, CdS etc.), M 2O3 (Al 2O3, Y2O3 etc.), MO 2 (TiO 2, SnO 2 etc.), M 2O5 (V2O5 etc.) și
MO 3 (WO 3, MoO 3 etc.) (Zhu și colab ., 2018) . De exemplu, NP fusiforme acoperite cu SnO 2, TiO 2
și ZnO, sintetizate prin diferite procese chimice umede , prezintă abilități fotocatalitice îmbunătățite
pentru coloranții organici, în principal datorită efectului sinergic dintre semiconductorii cu zonă
interzisă îngustă și largă și separarea efectivă a lacunelor de electroni la interfețele oxizilor de fier/
semiconductorilor (Wu și colab ., 2015) .
NP protejate cu un înveli ș din carbon s-au remarcat prin stabilit atea excelentă chimic ă și
termic ă și prin conductivit atea electric ă intrinsec ă ridicat ă. Acoperirea cu carbon oferă o barieră
eficientă de oxidare și previne corodarea materialelor cu miez magnetic. Acoperirea cu carbon
hidrofil pe miezurile de NP de oxid de fier conferă o mai bună dispers abilitate și stabilitate decât
cele prezentate de NP nude (Wu et al. , 2015) .

4. Aplicații în biomedicină
Dezvoltarea nanotehnologiei a reprezentat un pa s de o deosebită însemnătate în extinderea
domeniul medical prin asigurarea resurselor necesare diverse lor aplicați i, mai ales în ceea ce
privește diagnosticul, detectarea biologică, terapia și administrar ea de medicamente. În acest
context, NP magnetice c uprind caracteristici importante care le cresc pertinența pentru o varietate
de aplicații biomedicale, inclusiv agenți de contrast în imagistica prin rezonanță magnetică (RMN),
separarea și detectarea celulelor, tratamentul p rin hipertermie și administrare a de medicamente. NP
magnetice de oxid de fier sunt stabi le din punct de vedere fizic și chimic, biocompatibile și
ecologice, prezentând astfel caracteristici unice pentru aplicațiile clinice. Atunci când ating
dimensiuni mai mici (aproximativ 10 – 20 nm p entru oxidul de fier), proprietățile
superparamagnetice d evin evidente, astfel încât particulele ating o performanță mai bună pentru
majoritatea aplicațiilor amintite anterior (Arias și colab ., 2018) .

19
Imagistica prin rezonanță mag netică (RMN) este una dintre cele mai promițătoare
aplicații ale NP de oxid de fier (Laurent și colab., 2008) . RMN este o tehnică puternică și non –
invazivă folosită în diagnosticare, caracterizată prin rezoluție spațială „ultrahigh ” bazată pe
detectarea relaxării protonilor într -un câmp magnetic extern. Relaxarea și intensificarea
semnal ului/contrastului pot fi crescute cu ajutorul agentului de contrast. Cele bazate pe oxizi de
fier superpara magnetic i sunt capabil e să modifice substa nțial relaxarea spin -spin a moleculelor de
apă (relaxare T2) în apropierea NP magnetice și să îmbunătățeasc ă contrastul negativ al imagin ii.
Proprietățile de contrast pot fi influențate și de mărimea și hidrofilicitatea NP sau de grosimea
suprafeței înveli șului.
Există d ouă tipuri generale de agenți de contrast negativ bazate pe NP de oxid de fier :
agenții de contrast perorali pentru imagistica sistemului digestiv și agenții utiliza ți prin administrări
intravenoase.
Caracteristicile cheie ale agenților de contrast negativ perorali sunt toxicitatea lor scăzută ,
combinată cu buna stabilitatea cu scopul de a rezista mediului acid al stomacului. Proiectarea
precisă a materialelor de acoperire a suprafeței nu este atât de importantă pentru preparatele
perorale, însă în cazul NP utilizate pentru administrarea intravenoasă proiectarea este mult mai
dificilă .
Cerin țele de bază pentru folosirea NP ca agenți de contrast negativ intraveno și în RMN
sunt: toxicitate scăzută, stabilitatea coloidală în condiții fiziologice, diametrul hidrodinamic scăzut
și stabil în plasmă, mică predispoziție pentru agregare, sarcini de su prafață bine controlate și
adsorbția redusă a proteinelor. Toate aceste variabile determină biodistribuția NP și capacitatea
acesteia de a depăși barierele biologice in vivo . În general, NP cu dimensiuni hidrodinamice de
până la 5 –8 nm (similar cu dimensiu nile proteinelor serice de 30 –50 kDa) și agenți de contrast cu
greutate moleculară mică pot suferi excreție renală. NP cu dimensiuni sub 5 nm sunt destul de
neobișnuite și sunt mult mai predispuse la procesele de extravasare, fiind eliminate foarte rapid.
Majoritatea NP funcționale au diametre hidrodinamice mai mari și sunt capturate de sistemul
reticuloendotelial (Hola și colab ., 2015) .
În prezent, NP de oxid de fier sunt adesea utilizate ca precursori pentru dezvoltarea agen ților
de contrast RMN cu specific itate pentru țintă datorită capacității lor de a difuza liber prin capilare
și de a fi fagocitat e de celulele sistemului reticuloendotelial. Eficacitatea acestor NP a fost
confirmată de studiile experimentale și clinice , fiind fol osite în diagnosticul și monitorizarea

20
cance relor splinei, ficatului și ganglionilor sau metastazelor. Mai mult decât atât, NP utilizate ca
agent de contrast prezintă specificitate, fiind capabile să pătrundă în unele țesuturi , iar în altele nu .
De exemplu , în diagnostic ul cancerului hepatic, NP pătrund în celule Kupffer sănătoase ale
ficatului, dar sunt excluse din celulele canceroase . Astfel, în cazul unui individ bolnav, se va f orma
o imagin e în care zonele întunecate , indicatoare ale țesutului sănătos, pot prezenta pete mai
luminoase , indicatoare ale unui țesut canceros , facilitând extrem de tare diagnosticul (Martinkova
și colab ., 2018) .
NP de oxid de fier pot fi utilizat e și în domeniul administrării de medicamente , fie ca NP
individuale, fie ca nanoa nsambl uri magnetice (NP încapsulate în matrice macromoleculare ). În
domeniul oncologi ei, urmărirea precisă a răspunsului terapeutic este de foarte mare interes pentru
monitorizarea evoluției tumorii și gestionarea tratamentelor ulterioare. Având în vedere eficacitatea
ridicată ca agenți de contrast pentru RMN și capac itatea lor de a transp orta compuși
chimioterapeutici pentru livrarea țintită, NP de oxid de fier au fost studiate pe scară largă pentru
aplicații în administrarea evaluată prin RMN de medicamente (Vangijzegem și colab ., 2019) .
NP de oxid de fier se pot, de asemenea, comporta ca un agen t citotoxic printr -un proces
numit hipertermie , implicând aplicarea unui câmp magnetic alternativ asupra NP injectate în
situsul tumorii, ceea ce va duce la conversia energiei de rezonanță electromagnetică în căldură
suficient de mare pentru a produce apoptoza celulelor cancero ase. Hipertermia poate fi, de
asemenea, utilizată ca sistem de administrare controlată prin două mecanisme;
• Un medicament este atașat la NP prin intermediul unui grup de link er-i labili la căldură . Pe
măsură ce căldura este generată prin câmpul magnetic o scilant, legătur ile se rup, eliber ând
medicamentului încărcat.
• Medicamentul și NP sunt obstrucționate în matricea polimerică . Generarea de căldură
stimul ează perforarea matricei , permițând astfel o eliberare susținută.
Cu toate acestea, e xistă rapoarte despre toxicita tea NP, apărută din inducerea radicalilor
liberi prin NP libere de fier . Acestea cauzează probleme grave precum ateroscleroza, degenerarea
neuronală și maculară. Toxicitate este considerată a fi dependentă de doză, formă și dimensiunea
particulelor. Prin urmare, există o necesitate de a controla acești factori pentru o farmacodinamică
optimă sigură și eficientă (Abd Elrahman și Mansour, 2019) .
Termenul de teranostică se referă la combinația de diagnostic și terapie. Din punct de
vedere clinic și translațional, acesta se referă la o combinație intimă de intervenții diagnostice și

21
terapeutice . În domeniul nanomedicinei, termenul este adesea utilizat atunci când agenții imagistici
și moleculele medicamentoase sunt co -încărcate într -o singură NP. NP cu oxid de fier sunt intrinsec
foarte potrivite pentru scopuri teranostice datorită capacității lor de a fi vizualizate prin tehnologia
RMN sau MPI, în timp ce învelișul lor p oate fi încărcat fizic sau chimic cu agenți terapeutici. NP
cu oxid de fier pot fi, de asemenea, ușor integrate în micro -bule și în materiale „macroscale ” pentru
inginerie de țesuturi, contribuind la gama de aplicații teranostice pentru care pot fi utiliza te.
Capacitățile imagistice și proprietățile terapeutice pot fi combinate într -o NP ter anostică , în
locul utiliz ării NP de diagnostic însoțitoare pentru a monitoriza acumularea în situsul țintă și pentru
a prezice răspunsul la terapie. În acest context, învelișul NP de oxid de fier poate fi, modificat cu
diferiți compuși activi farmacologic , fie prin conjugarea chimică cu linker clivabi l, fie prin
interacțiuni intermoleculare fizice, precum stivuirea tip π-π. NP de oxid de fier pot fi încărcat e cu
o varietate de medicamente terapeutice , în special cu agenți anti -cancer (Dadfar și colab ., 2019) .

22
II. Porfirinele

1. Structuri , tipuri și caracteristici
În ultimii ani a existat un i nteres crescut pentru chimia porfirinelor și a complexelor lor
metalice , datorat în mare parte caracterul ui universal al acestor molecule. Porfirinele sunt capabile
să forme ze complexe metalice cu majoritatea elementelor tabelul ui periodic și, în funcție de tipul
centrului metalic, prezintă diferite proprietăți el ectronice, mag netice și chimice , dar și funcții
biologice diverse , obținute prin modificarea structur ii macroci clului sau prin plasarea unor
substituenți la periferia acestuia. În combinație cu stabilitatea ridicată a moleculelor, metalo –
porfirinele devin centre de activitate în multe biomolecule: de la structuri de tip hem – grupe care
leagă oxigenul în globulele roșii – până la clorofilă – care acționează ca bază biochimică a
fotosintezei plantelor. Derivații porfirin ei și complexele lor metalice prezintă potenți al pentru
aplicații în domenii strâns le gate de știința de supraf ață (incluzând cataliz a și electrocataliz a
eterogenă, sisteme de senzori, electronic a organic ă, diverse tipuri de sisteme de recoltare a luminii,
etc.). Crearea și dezvoltarea acestor noi aplicații este susținută , pe d e o parte de progrese în sinteza
noilor porfirine și, pe de altă parte, de dezvoltarea metodelor de formare a materialelor pe baza lor
(Kuzmi n și colab ., 2018) .
Porfirinele aparțin unei clase de macrocicluri heterociclice. Acești compuși organici sunt
forma ți din patru inele pirolice conjugate dispuse într -un cerc. Atomii α -carbon ai pirolului sunt
conectați cu punți metilenice . Porfirinele au un total de 26 electroni π, dintre care 18 electroni se
află într -un macrociclu plan ar, continu u (Rabiee și colab ., 2020) . Exemple obișnuite de porfirine
importante includ hem ul și citocrom ul (cu fier chelat), clorofil a (cu magneziu chelat), coenzima
B12 (cu nichel chelat) (http://nsdl.niscair.res.in/jspui/handle/123456789/762 ).
Pentru a exista o diferențiere între izomerii structurali, Fisher a dezvoltat o serie de tipuri
nomenclaturale, utilizând cifre romane (Dolphin, 2012) . Porfirinele sunt denumite și clasificate pe
baza grup ărilor lor substituente ale lanțului lateral. În cazul por firinelor naturale, diverse lanțuri
laterale sunt în locui tori pentru ce i opt atomi de hidrogen din nucleul porfinei. Acestea pot fi de
două tipuri: tip I (prezintă un aranjament complet simetr ic al substituenților acetat, propionat și
metilen ) și tip III (prezintă un aranjament complet asimetric al compușilor enumerați anterior)
(http://nsdl.niscair.res.in/jspui/handle/123456789/762 ).

23

Figura 6. Structura chimică de bază a porfirinelor și a principalilor membri ai familiei (Rabiee și
colab. , 2020) .

Figura 7 . Structura porfirinelor de tip I și III.
În tipul I : Pozițiile 1, 3, 5 și 7 sunt ocupate de grupări acetil / metil; Pozițiile 2, 4 , 6 și 8 repre zintă grupări
propionil; În tipul III : Pozițiile 1, 3, 5 și 8 sunt ocupate de grupări acetil / metil; Pozițiile 2, 4, 6 și 7
reprezintă grupări propionil (http://nsdl.niscair.res.in/jspui/handle/123456789/762 ).
Denumirea a cestor macrocicluri pigmenta re derivă de la un termen grecesc , „porphura”,
care se referă la culoarea purpuri e, făcând aluzie la proprietățile foto -fizice de la care derivă
funcțiile biologice ale porfirinelor și ale deriva ților lor. În secolul trecut, aplicațiile care impli că
porfirinel e s-au extins în domeniul tratamentului și al imagisticii de diagnostic . Proprietățile foto –
fizice care stau la baza acestor aplicații biome dicale își au rădăcina în structura aromatică
macrociclică a porfirinelor. Porfirinele cu bază liberă c onțin patru grupe pirolice , cu punți constând
din 22 de electroni p, dintre care 18 sunt conjuga ți. Acest lucru dă naștere unor tranziții facile pp*,
cu obțin erea a două semnături optice în spectrul luminii vizibile:

24
• o bandă Soret (sau B ) puternică la B400 nm, care rezultă dintr -o tranziție electronică din
stare a fundamentală la a doua stare de singlet excitat (S0 – S2)
• patru benzi Q de energie , mai reduse și mai puțin intense , între B450 -650 nm, rezultate din
tranziții din starea fundamentală până la prim ele stări de excitație singulare (S0 – S1).
Reducerea unuia sau a două legături duble de pirol, determină derivați de clor și de
bacterioclor ină, cu benzi Q cu o absorbție mai mare , deplasate în spectrul roșu între 650 –800 nm,
ca urmare a unei simetrii t etrapirol ice perturbate. La absorbția luminii, electronii de porfirină sunt
excitați la o stare electronică de sing let de scurtă durată ( de ord inul nanosecund elor). După
conversia internă în S1, porfirinele pot reveni la starea fundamentală prin relaxare v ibrațională non –
radiativă, emisie de fluorescență sau pot suferi o tranziție electronică n on-radiativă a spin -ului către
o stare triplă (T1). Durata de viață relativ mai lungă a stării triplete (Bmicro până la milisecunde)
permite porfirinelor să sufere descompunere radia tivă prin fosforescență sau să interacționeze cu
împrejurimile lor pentru a genera specii reactive de oxigen (Rajo ra și colab ., 2017) .
Cel mai simplu compus tetra pirolic din această grupă de compuși este porfina. Prin
substituții realizate în poziții le mezo – și β- este posibilă obținerea de porfirine cu structuri simetrice
și asimetrice. Complexele metalice de porfi rină se formează prin substituirea protonilor, legați de
azot, cu ioni metalici. Pentru me talele cu o valență superioară, în se nsul asigurării
electroneutralit ății complexului metalic , ionul metalic este legat de extra -liganzi (Cl -, O2- și mulți
alții). Interacțiunile intermoleculare ale substituenților invocă deformări ale moleculelor: o
înclinare a substituentului în afara planu lui porfirinei (unghiul Φ) și o răsucire în jurul legăturii
C⸺C către miezul porfirinei (unghiul Θ) (Kuzmin și colab ., 2018) .
Deși macrocic lul π-conjugat determin ă o structură plană, există și o oarecare flexibilitate la
nivel molecular . Cele mai frecve nte distorsiuni structurale sunt de tip șa, cupolă, structură încrețită
(„ruffled”) și structură vălurită , distorsiuni le tip elice și spirală fiind mai puțin frecvente.
Conformațiile n on-plane pot fi cauzate de :
• introducerea substituenților la periferia macrociclurilor ;
• protonarea și deprotonarea atomilor de azot pirolici ;
• interacțiunea metaloporfirinei cu ligandul axial ;
• metalizarea liganzilor cu bază liberă (Kuzmin și colab ., 2018) .
Distorsiunea porfirinei are un efect semnificativ atât asupra activităților catalitice și de
reacție, cât și asupra capacității liganzilor de a se coordona cu ionii metalici. În plus, denaturarea

25
duce la modificări în structura electronilor moleculei de po rfirină, care modifică parametrii
fotofizici și potențialele de reducere a oxidării (Kuzmin și colab ., 2018) .
Porfirinele , în general, nu sunt solubile în apă, însă solubilitatea lor poate fi modificată prin
adăug area la nivelul inelul ui porfirin ic a unor substituenți, gener ându -se astfel compuși solubili în
apă ce pr ezintă toate proprietățile aromatice ale inelului de porfirină. În funcție de tipul
substituentului adăugat , se pot obține porfirine anionice sau cationice. Porfirinele cationice
reprezintă un obiect de cercetare destul de interesant, mai ales datorită capacităț ii de interacțiun e
cu proteinele și cu dublul helix ADN (Makarska -Bialokoz, 2018) .

2. Acțiunea porfirinelor în terapia fotodinamică
Terapia fotodinamică este o tehnică terapeutică combinatorie , minim -invazivă ,
prezentând o serie de avantaje , mai ales conserv area normal ă a țesuturilor țintă, durere a relativ
mică și aplicabilitate clinic ă pentru boala în stadiu precoce, în special pentru cancer. Terapia
fotodinamică se bazează pe exercit area citotoxicit ății specific e asupra tumorii care duce la moartea
celulelor. Aplica bilitatea acestor terapii nu se limitează doar la domeniul oncologie i, ci și în diferite
alte tipuri de maladii precum cele dermatologie, cardiovasculare și oftalmologie. Tehnica poate fi
efectuat ă în prezența oxigenului, la o lungime de undă specifică a luminii și în prezența
fotosensibili zatorilor . După absorbția lumin ii, fotosensibilizatorul se transformă din starea
fundamentală într-o stare excitată care produce specii radicale și reactive de oxigen. Apariția
acestora po ate provoc a leziuni celulare duc ând la uciderea tumorii prin necroză sau apoptoză.
Agentul terapeutic este farmacologic inactiv până în momentul în care este expus la lumină în
prezența oxigenului (Baskaran și colab ., 2018) .
Terapia f otodinamică tumoral ă presupune , în primul rând , găsirea unui fotosensibilizator
bun, c u o anumită selectivitate pentru foto lezarea țesutului tumoral . Acest compus este injecta t și,
într-o anumită perioadă de timp, dependentă de tipul fotosensibili zator ului și de tipul t umorii , are
loc echilibrarea dintre compartimentele biologice pentru a da diferența maximă dintre țesutul
normal și cel tumoral – în acest stadiu tumora va emite fluorescență în lumina ultravioletă . După
această etapă se realizează iradierea tumora lă cu lumină vizibilă. (Bonnett, 1995) .
Există două tipuri de mecanisme ale acestei terapii: tip I și tip II . În cazul tipului I ,
fotosensibilizatorul , în stare triplă excita tă T1 , poate transfera energie către biomolecule le din

26
împrejurimile sale. Ca urmare, are loc un transfer între fotosensibiliza tor și țesutul canceros
(substrat ) al unui atom de hidrogen sau a unui electron , ceea ce duce la formarea radicalilor liberi
și a radicalilor anionici ai fotosensibilizatoru lui și a substratului. Electronii interacționează cu
moleculele de oxigen, care rămân în starea lor energetică fundamentală . Proces ul duce la
producerea specii lor react ive de oxigen – inițial sub formă de radical anion superoxid, care creează
o nouă genera ție de specii reactive în interiorul celulelor. Cascada de reacții duce la producerea
stresul oxidativ care determină distrugerea celulelor canceroase .
În cazul tipul ui II , ca urmare a tranziției fotosensibiliz atorului în starea triplă excitată,
energia este transferată direct către molecula de oxigen în starea energetică fundamentală ,
transferul direct de energie dintre molecule fiind posibil datorită spinului identic . În acest fel sunt
generate particule de ox igen excitate – oxigen sing let – care se caracterizează prin proprietăți de
oxidare extrem de puternice. Majoritatea compușilor organici sunt în stare de singlet fundamentală .
Particulele de fotosensibilizare excitate nu afectează structurile celulare orga nice și reacționează
doar cu moleculele de oxigen dizolvate în ci toplasmă întrucât moleculele de oxigen sunt
caracterizate, pe lângă starea fundamentală, și de o stare excitată . Se presupune că mecanismul de
tip II este cel mai important proces care condiț ionează eficiența terapiei fotodinamice .
Raportul contribuției ambelor mecanisme depinde de mai mulți factori, printre care se
numără și concentrația de oxigen, constanta dielectrică a țesu tului și pH -ul și structura
fotosensibilizatorului. Pe măsură ce oxigenul se epuizează, primul tip de mecanism începe să
predomine (Knap și colab ., 2018) .
Potențialul agent fotostabilizator trebuie să înd eplinească anumite cerințe: (a) să fie un
singur compus pur , obținut c u randament ridicat printr -o metodologie sintetică bine stabilită în
câteva etape; (b) să fie stabil, cu un termen de valabilitate adecvat și cu caracteristici polare sau
amfifile pentru administrarea formul ării sau pentru administrarea în lipozomi fo sfolipidici; (c) să
fie un bun generator de oxigen singlet cu randament considerabil cuantic de fluorescență; (d) să
aibă absorbanță în spectrul roșu / roșu îndepărtat (λ 620 -850 nm) unde rad iațiile prezintă penetrări
mai profunde; (e) să aibă o toxicitate mică sau inexistentă la întune ric (Gomes și colab ., 2018) .
Porfirinele și derivații lor sunt unii dintre cei mai importanți fotosensibili zatori utilizați în
această terapie , fiind studiați și aplicați pe scară largă în clinică datorită avantajelor lor multiple
precum randamentele cuantice de oxigen singlet ridicate și toxicitatea scăzută pentru organism. Cu
toate acest ea, există încă limită ri în tratamentele cu fotosensibilizatori porfirinici (ce inclu d

27
hidrofilicitate a scăzută, biocompatibilitate a slabă și neselectivitate a), astfel că se depu n efort uri
considerabil e pentru reducerea lor prin dezvolta rea unei întregi variet ăți de strategii pentru
îmbunătățirea eficacității terapeutice a fotosensibilizatorilor porfirinic i. Dintre acestea, prezintă un
potențial ridicat fotosensibilizatorul porfirinic încorporat cu polimeri ce are capacitatea de a
îmbunătăți proprietățile foto -fizice și foto -chimice , spori nd astfel și mai mult eficacitatea
compușilor . În acest sens, e xistă, în principal, două strategii de preparare a fotosensibilizatorilor de
porfirină pe bază de polimer:
• moleculele de porfir ină sunt încapsulate direct în matrice polimerică ( încapsulare fizică ) –
fotosensibiliza torii porfirin ici molecular i mici sunt încapsula ți direct în matrice a polimerică
prin strategii de auto -asamblare sau nano -coprecipitare .
• părțile de porfirină sunt conj ugate covalent pe lanțurile polimerice ( conjugarea chimică ) –
moleculele de porfirină pot fi conjugate pe lanțurile polimerice prin altoire sau
copolimeriz are (Tian și Zhang, 2019) .
Porfirinele sunt în prezent aprobate clinic pentru tratamentul cancerului pulmonar, cutanat
și esofagian (Rajora și colab ., 2017) . Fotosensibilizatorii de tip porfirină includ clori ne, purpurine,
benzoporfirine, ftalocianine și feoforbide. Fotofrina și fotosanul sunt forme parțial purificate de
HPD (dihematoporfirinester -dihematoporfirineter purificat ), în prezent aflate în uz clinic pentru
terapia fotodinamică a cancerului pulmonar. Bolile benigne și maligne ale pielii sunt evaluate
pentru răspunsurile lor la terapie fotod inamică din mai multe motive: incidența cancerului de piele
este în creștere, pielea este ușor accesibilă la aplicarea topică și topică a fotosensibilizatorilor și
rezultatele clinice sunt ușor de observat. În dermatologie, substratul sub cea mai inte nsă invest igare
în terapia fotodinamică topică este acidul 5 -aminolevulinic (Fuchs și colab ., 2000) .
Dacă terapia fotodinamică este acum o procedură consacrată pentru tratamentul anumitor
boli non -oncologice și oncologice, aceasta nu este încă utilizată în tratarea infecții lor. În plus,
potențial ul aplic ării acestei terapii pentru a distruge (micro)organ ismele depășește domeniul
medical, cu accent special pe domeniul mediu lui (Alves și colab ., 2015) .
Avantajele tera peutice ale porfirinei fotosens ibilizatoare constau în: ( a) fotoactivare minim –
invazivă cu lumină roșie sau infraroș ie în interiorul ferestrei optice clare 700-900 din țesut, prin
benzile Q de energie scăzută, ( b) predilecție către acumul area în celulele m aligne sau sănătoase și
(c) randamente cuantice relativ ridicate de 1O2, permițând o distanț ă de difuzare de 10 -55 nm a 1O2
în țesut pentru exploata rea în terapia localizată. Colectiv, aceste caracteristici permit porfirinelor

28
să medieze terapia cancerului într-un mod minim -invaziv, loc alizat, sănătos, non-discriminant de
țesut, non-ioniz ant, control at și țint it, o combinație imposibil de atins prin chirurgie, radioterapie
sau chimioterapie (Rajora și colab ., 2017) .

Figura 8. Diagrama Jablonski care ilustrează excitația și relaxarea fotosensibilizantă în terapia
fotodinamică. După relaxarea fotosensibilizatorului de la starea de triplet la starea fundamentală , se
formează specii reactive de oxigen (ROS) sau oxigen s inglet (1O2) (Kauscher și colab ., 2019) .

3. Sisteme de livrare a porfirinelor în terapia cancerului
Livrarea direcționat ă este considerată cea mai eficient ă opțiune de a îmbunătăți tratamentul
multor maladi i. Aceasta ne oferă avantaje valoroase pe care livrarea sistemică tradițională nu le
poate asigura. În primul rând, această terapie acțion ează la loc usul prevăzut, limitând efectele în
afara țintei, inclus iv efectele secundare dăunătoare ale chimioterapiei . De asemenea, doza mai mică
necesară livrării poate concentra mai bine agentul terapeutic pe locul vizat , reduc ând efectele
secundare sistemice și prin această metodă de l ivrarea țintită este posibil transport ul agentului în
zone mai puțin accesibile medicamentel or tradiționale. Prima încerca re de a îmbunătăți acest sistem
de livrare a constat în atașa rea transportatori lor la anticorpi (Rabiee și colab ., 2020) .
Una dintre provocările majore în utilizarea porfirinelor și a derivaților săi în terapia
fotodinamică este administrarea de medicament e hidrofob e. Acești compuși au o solubilitate
scăzută în medii apoase, ceea ce în greunează biodistribuirea lor. Din acest motiv , dezvoltarea

29
strategiilor de administrare a medicamentelor care pot transporta ace ști fotostabilizat ori la nivelul
celulel or canceroase prezintă o importanță enormă. De fapt , dezvoltarea sistemelor de f urnizare a
medicamentelor fotostabilizatoare bazate pe nanotehnologie reprezintă o abordare emergentă a
terapiei fotodinamice . Lipozomii, ciclodextrinele dendrimere, nanoparticulele polimerice și
metalice, porfisomii, punctele cuantice și nanotuburile de carbon sunt exemple de formulări care
pot fi utilizate ca platforme multifuncționale pentru terapia fotodinamică a cancerului (Gomes și
colab ., 2018) .
Dintre toate sistemele de administrare a medicamentelor, lipozomii , descoperiți cu mai bine
de 50 de ani în urmă, sunt cei ma i studiați nano -transportori, fiind considerați cei mai versatili din
punct de vedere al compoziției, formei, dimensiunilor și morfologiei. Aceștia prezintă un potențial
enorm de a fi utilizați în încapsularea medicamentele hidrofile, în prelungirea timpul ui de
circulație, în creșterea conc entrației de medicamente la locul t umorii și în reducerea efectelor
secundare, asociate biocompatibilității lor. Lipozomii pot fi formulați cu lipide sensibile la lumină
pentru a declanșa modificări structurale foto -indus e membranei lipidice a lipozomilor sub diferite
mecanisme precum foto -izomerizarea, foto -clivajul și foto -polimerizarea, ceea ce duce la
distrugerea lipozomului și eliberarea conținutului de medicamente (Eloy și colab ., 2014) .
Utilizarea convențională a lipozomi lor nu poate face față condițiilor fiziologice complicate
prezente în tumorile eterogene care împiedică atingerea utilit ății terapeutic e. Mai mult, lipozom ii
necesită, de obicei, adăugarea de markeri fluorescen ți pentru a putea fi urmări ți și pentru a se
măsu ra farmaco -cinetica și biodistribuți a lor (deși există șansa ca acești markeri să „scape”, astfel
având loc alterarea rezultatel or). În scopul rezolvări i acestor probleme s-a dezvoltat un lipozom
multifuncțional, bazat pe porfirină, denumit porfizom . Porfi zomul a fost obținut prin asambla rea
conjugate lor porfirin o-lipidice, dimensiune ideală a particulelor pentru administrarea de
medicamente fiind în juru l valorii de 100 nm. Porfizomul ui permite formarea de imagini foto –
acustice și prezintă proprietăți imag istice fluorescente în infraroș u. Fluorescența imagistic ă de
infraroșu -apropiat a porfirinei este stinsă când porfizomul este intact, dar ar putea fi restabilită după
disocierea lipozomului. Aceste proprietăți conferă o precizie mai bună imagisticii deoare ce
fluorescența de fundal a imaginii optice este redus ă la maxim ul posibil , numai locul tumorii fiind
luminat (Xue și colab ., 2019) .
Nanoparticulele care sporesc livrarea de fotostabilizatori la nivel tumor al cuprind cea m ai
mare clasă de structuri supramoleculare porfirin ice relevante din punct de vedere biologic explorate

30
până acum. Nanoparticulele pot crește acumularea tumorii de porfirine prin: creșterea solubilității
porfirinei și, prin urmare, a biodisponibilit ății ac esteia; extinderea timpului de înjumătățire a
porfirinei din circulație ; asigurarea protecției împotriva foto -degradării premature și facilitarea
eliber ării situs-specific e. Ultimele două caracteristici menționate asigură îndeosebi scăderea
toxicității acestui tip terapeutic în afara țesutului țintă și sunt strâns legate de exploatarea micro –
ambientului tumoral și a terapiei fotodinamice activ abile ; o strategie în care fluorescența porfirinei
și generarea de oxigen singlet sunt limita te la administrarea par ticulelor și restabilite la valori
normale la aplicarea unui stimul (Rajora și colab ., 2017) .
Dendrimerele sunt polimeri extrem de ramificați care pot încărca fotosensibilizatori în
dendronii lor nucleari sau perife rici. Dendrimerele sunt avantajoase ca agenți de eliberare datorită
hidrofobicității lor reglabile, funcționalizării facile cu fragmentel e de direcționare și abilității de a
părăsi sistemul fagocit ic mononuclear (o caracteristică importantă deoarece celule le de asimilație
a acestui sistem se degradează și, ulterior, elimină nanoparticulele ). Separarea nucleului porfiri c de
ramurile dendrimerului previne agregarea intracel ulară, crescând astfel potențialul de generare a
1O2 de către porfirină. Cu toate acest ea, pot fi întâmpinate dificultăți în realizarea creșterii sintezei,
eliminarea eficientă a produselor secundare de reacție și în obținerea randamentel or favorabile ale
produsului (Rajora și colab ., 2017) .

31
III. Potențialul toxic și terapeutic al nanoparticulelor magnetice și al
porfirinelor

1. Toxicitatea nanoparticulelor de oxizi de fier in vitro și in vivo
Nanoparticulele superparamagnetice de oxid de fier , așa cum am menționat într -un capitol
anterior, sunt biocompatibile, biodegradabile și netoxice , fiind utilizate într-o gamă largă de
aplicații biomedicale, precum imagistica tumorală sau vascular ă, transportul de medicamente,
terapia genică , urmărirea in vivo a celulelor marcate, separarea magnetică a celulelor sau a
moleculelor sau în administrarea supliment elor de fier pentru pacienții cu anemie (Arami și colab .,
2015) .
Pentru a obține date fiabile și reproductibile prin testele in vitro , este extrem de important ă
stabil irea unor medii analitice adecvate și repr oductibile în ceea ce privește, de exemplu, alegerea
celulelor, condițiile de creștere sau procedurile de pregătir e a probelor. Evaluarea posibilei
toxicități a NP de oxid de fier este, de obicei , determinată inițial folosind teste de toxicitate in vitro
(teste de viabilitate a celulelor – sau citotoxicitatea, de stres oxidativ, de reacții inflamatorii și de
genotoxicitate ), asemănător ca și în cazul altor tipuri de NP . Dacă testele de toxicitate i ndică doar
efecte minore sau inexistente în concentrațiile c are se doresc a fi utilizate, atunci eșantioanele vor
fi transmise pentru testele in vivo (pe model animal ) într -un model relevant. Dacă și acestea au
rezultate pozitive , atunci produsul este înregistrat la FDA (Food and Drug Administration ) pentru
obținere a aprob ării în scopul realizării primel or studii clinice umane (Mahmoudi și colab ., 2012) .
Toxicitatea nanomaterialelor este studiată în general pe modele in vitro . Până în prezent au
apărut diverse rapoarte de cerce tare contradictorii privind toxicitatea NP de oxid de fier. Unele
dintre acestea afirmă existența unei toxicit ăți de grad scăzut , cu generarea speciilor reactive de
oxigen intracelular , sau absența oricărei forme de toxicitate la doze mai mici. Cert este c ă doze ma i
mari de NP de oxid de fier determină o scădere a funcțiilor fiziologice celulare, în principal din
cauza daunelor de la nivel ADN sau de la nivel mitocondrial, modulației transcripției genice și a
cascadei de semnalizare dependentă de calciu. Studii ale efecte lor toxice ale acestor NP pe model e
anima le aflate în curs de dezvoltare au raportat o eclozare întârziată, malformații embrionare și
mortalit ate la embrionii de pești zebr ă, dar și alterarea dezvolt ării și maturizarea întârziată la șoareci
și iepuri (Patel și colab ., 2019) .

32
O serie de studii in vitro au evaluat efectele expunerii materialului genetic la NP de oxid de
fier. O parte dintre acestea au raportat diferite tipuri de deteriorare a moleculelor ADN, inclusiv
ruperea catene lor și formarea de micronuclei , însă altele au infirmat existența modific ărilor
genotoxic e. Lipsa de consecvență în rezultatele obținute în diferitele cercetări de genotoxici tate
realizate face necesară investigarea ulterioară în această arie . Cu toate aces tea, studiile publicate în
ultimii ani în general mențin dezacordul , controversa fiind departe însă de a fi rezolvată (Laffon și
colab ., 2018) .
Unul dintre p rincipal ele mecanism e de toxicitate celulară prezentat e de nanomaterialele pe
bază de fier este constituit de producția de specii reactive de oxi gen. NP de oxid de fier pot
determina , în unele cazuri, cre șterea producți ei intracelular e a acestor compuși. Deteriorarea
materialului genetic sau a semnalizării intracelulare poate duce la reducerea viabilității celulare și
la moartea programată a celule lor. Stresul oxidativ mitocondrial este produs în special în celulele
imune – Shah și colab . (2018) demonstr ând că aceste NP suprimă funcția imună a limfocitelor T
umane. Modificările structurii și funcției mitocondriale , după expunerea la NP de oxid de fier, au
fost asociate cu reducerea prol iferării celulelor T activate mitogen și cu producția de citokine a le
acestora (Paunovic și colab ., 2020) .
Spec iile reactive de oxigen provoacă în principal peroxidarea lipidelor, ducând la un
dezechilibru la nivelul membran ei (bistartul fosfolipid ic) care produce moartea celulelor. NP de
oxid de fier sunt internalizate în mod eficient de către celule prin endocito ză, datorită mărimii lor
de scală nanom etrică, fiind ulterior degradate prin hidroliză la ioni de fier în endo zomi sau lizozomi
unde există un pH acid. Ionii de fier liberi sunt apoi transportați prin membranele organ itelor prin
transportorul de ioni metal ici divalenți (DMT1) în citosol, unde suferă reacția Fenton cu peroxidul
de hidrogen mitocondrial (H 2O2) pentru a forma radicali hidroxilici (•OH) , extrem de reactivi . De
obicei, toxicitatea este dependentă de mediul de transport intracelular al NP de oxid de fier . Pentru
aplicațiile în diagnosticarea cancerului ș i separarea/sortarea și urmărirea celulelor, e liberarea
precoce a NP de oxid de fier de la nivel endo zomal este crucială pentru prevenirea manifestării
toxicității în celulele țintă. Expunerea dire ctă a acestor NP în lizozomi poate crește semnificativ
toxicitatea intracelulară, existând posibilitatea îmbunătăți rii eficacității lor în tratamentul
cancerului (Nedyalkova și colab ., 2017) .
Toxicitate a în modelele animale (in vivo ) este studiată prin evaluarea modificărilor chimic e
de la nivel sangvin și a variați ilor parametrilor celulelor din sânge , a profilurilor de expresie genică

33
din ficat sau a modific ării caracteristicilor brute sau histologice ale organelor, precum și prin
monitorizarea modificărilor clinice și în greutate după administrarea NP de oxid de fier (Arami și
colab ., 2015) . NP de oxid de fier sunt adesea clasificate drept biocompatibile, fără a prezenta efecte
toxice severe in vivo . Predicția precisă a destinului biologic al NP de oxid de fier se află în
dependență strictă de compoziția și can titatea de proteine asociate la suprafața NP (cu alte cuvinte
este esențială cunoașterea exactă a proprietăților fizico -chimice ale particulelor ). În plus față de
proprietățile fizico -chimice ale NP, tipul de celul ă este și el recunoscut c a un factor cruci al pentru
absorbția celulară, soarta intracelulară și răspunsul toxic manifestat (Mahmoudi și colab ., 2012) .

2. Efecte biologice și moleculare induse de porfirine la nivel celular
Porfirina și derivații săi posedă multiple func ții ce merită exploatate în scop de diagnostic ,
dar și terapeutic . Aceste molecule posedă capacitatea de a absorb i energia lumi noasă și de a o
transform a în efecte terapeutice puternice. Cu alte cuvinte , odată activate de energia luminii ,
porfirinele reacț ionează cu oxigenul din împrejurimi având ca rezultat formarea specii lor reactive
de oxigen . După cum am mai menționat, aceste specii sunt substanțe pute rnic energizate și
citotoxice care dotează porfirine cu efecte fotodinamice terapeutice excelente . Porfirinele pot
determina , de asemenea, hipertermie , profitând de energia eliberată ca vibrație moleculară a
fotonului care duce la efectul fototermal terape utic (Xue și colab ., 2019) .
Înlocuind atomi i de carbon α sau β ai porf irinelor (sau din alte poziții) cu alți atomi (cum
este azotul) pot avea loc modificări dramatic e ale proprietățil or moleculelor și, ca urmare, și a
aplicațiil or biomedicale bazate pe acestea . Porfirinel e pot acționa ca liganzi în complexe de
coordonare, în funcție de proprietățile structurale ale acestora care sunt controlate de unghiurile de
legătură și distanțele de legătură, precum și de natura metalului și de prezența grupurilor
funcționale. În general, f olosind membrii primului rând de metale de tranziție în structura
porfirinelor, toxicitatea este redusă la minimum, iar prin folosirea unor metale de tranziție din al
doilea și al treilea rând, precum Pt, Pd și Ru, determină o toxicitate celulară scăzută (Rabiee și
colab ., 2020) .
Fotosensibilizatorii produc , în general, specii reactive de oxigen , în special oxigenul si nglet
(1O2), ceea c e poate duce la creșterea permeabilității membranelor celulare și la interferenț e
suplimentar e cu funcția normală a celulelor. Cu toate acestea, din cauza hipoxiei tisulare și a

34
capacității limitate de penetr are a luminii, efectele fotodinamice ale porfiri nei independente
prezintă o oarecare insuficiență de tratament. Din acest motiv , este important ă îmbinarea terapiei
fotodinamice cu alte metode de tratament, precum chimioterapia și terapia chimiodinamică .
Aceasta din urmă poate converti peroxidul de hidro gen endogen (H 2O2) la localizarea tumorii în
radicalul hidroxil toxic (•OH) care distruge celulele tumorale, compensând astfel limitele de
dependență de O 2 ale terapiei foto dinamice . Efectele sinergice ale acestor tipuri terapeutice ar putea
spori eficiența tratamentului tumorilor maligne. Combinația de chimioterapie și terapiei
fotodinamice a fost extinsă și s -a dovedit a fi o abordare eficientă pentru a obține un rezultat optim
al tratamentului și a reduce efectele secundare ale fi ecărei metode de tratamen t (Lei și colab .,
2018).
Odată produs , oxigenul s inglet, dar și alte specii reactive de oxigen citotoxice , reacțion ează
cu numeroase componente celul are canceroase, inclusiv lipide nesaturate, re sturi de aminoacizi și
acizi nucleici. O remodelare oxidativă a structurilor celulare poate produce o moarte programată
(apoptoză) sau neprogramată (necroză) a respectivelor celule . Oxigenul si nglet, produs prin
iradierea porfirinelor , interacționează cu diversele componente celulare printr -o serie de reacții
chimice definite. Pro teinele și moleculele ADN sunt două tipuri macromolecul are biologice cu rol
esențial în interiorul celulei , fiind responsabile de funcția celulară . Apoptoza p oate fi declanșată
chiar și printr -o modificare moderată a acestor sisteme. O serie de resturi de aminoacizi prezintă o
sensibilitate mai ridicată l a oxidarea provocată de oxigenul sing let, printre acestea numărându -se
cisteina (Cys) și metionina (Met) care sunt oxidate la sulfoxizi , tirozina (Tyr), histidina (His) care
dă endoperoxizi și tirozina (Tyr) care dă un produs de cu plare oxidantă feno lică. Helixul dublu
catenar al moleculei ADN poate fi deteriorat oxidativ atât la bazele acidului nucleic, cât și la părțile
dezoxiriboase care leagă bazele cu catena , însă în cea mai mare parte are loc la dezoxiguanozină,
prin intermedi ul descărcării Diels -Alder cu oxige nul s inglet cu produce re de 8-oxo-2'-
deoxiganozină. Oxidarea lipidelor d uce de obicei la formare de hidroperoxizi având configurație
E. Așadar, c a urmare a deteriorării protei ce, ADN și lipid ice de la nivel celular și mem branar,
funcționarea normală va fi perturbată și există șansa declanșării apoptoz ei, sau a altor moduri de
moarte celulară (Sandland și colab ., 2018) .

35
3. Studii privind acțiunea nanoconjugatelor cu porfirină în terapia cancerului
Porfirinele sau derivații lor hidrogena ți (clorinele) sunt fotosensibi lizatori tetrapirolici
foarte eficienți datorită stabilității lor crescu te și a sintez ei facile . Cu toate acestea, există și limitări
date de macrocic lul tetrapirolic din structura acestora atunci când sunt utilizați ca
fotosensibilizatori . Printre acestea se numără și hidrofobicitate a, biocompatibilitate a și livrare a
neselectivă în sistemel e biologice. N P au fost utilizate în mare parte pentru administrarea eficientă
a medicamentelor în tumori, datorită îmbunătățirii permeabilit ății și retenție i la nivel t isular . În
prezent , NP metalice biocompatibile câștigă popularitate în sistemele de livrare a medicamente lor
hidrofobe și/sau a agenți lor imagistici , incorporarea fotosensibilizatorilor hidrofobi în NP (prin
încapsulare sau conjugare) facilit ând livrarea l or în sistemele biologice. S -a dovedit că un
nanoconjugat fotosensibiliza nt posedă hidrofilicitate , selectivitate și biocompatibilitate crescut e în
comparație cu fotosensibilizatorul utilizat ca atare .
Porfirinele sunt hidrofobe datorită prezenței m acroc iclulu tetrapirolic , ceea ce reprezintă un
impediment în folosirea lor în terapiile fotodinamice . Biocompatibilitatea lor poate fi îmbunătățită
prin încorporarea lor în NP. Macrocic lurile porfiri nice pot servi ca fotosensibilizatori
bioconjugatabili atunci când le sunt adiționate grupările funcționale adecvate (Bhaumik și colab .,
2016) .
Kan și colab . (2018) a proiect at un nou fotosensibilizator de tip UiO-66 dintr-un cadrul
nanoscalar metalo -organic (NMOF) utilizând porfirină fără metal monosubstituit ă cu S-etiltiol
ester (TPP -SH) cu ajutorul unei modificări postsintetice. Compozitul rezultat TPP -SH @ UiO -66
a arătat o activitate fotodinamică superioară, ceea ce îl face un pote nțial agent PDT în terapia
cancerului (Bhaumik și colab ., 2016) . Kan a evidențiat că există o excelentă conservare a
caracteristic ilor structural e, de cristalinitate, morfologi ce și de mărime a particulelor de NMOF în
timpul procesului post -sintetic. În comparație cu NMOF care conțin fotosensibilizator porfirinic
localizat în interior, speciile NMOF care conțin porfirin a situat ă la suprafață au prezentat o generare
mai eficientă de specii de oxigen. Mai mult decât atât, aceste particule au prezenta t și o
citotoxicitate scăzută, o eficie nță fotocatalitică îmbunătățită și o permeabilitate bună a membranei,
precum și o producție de oxigen si nglet intracelular extrem de eficientă, făcându -l un potențial
agent în tratamentul tumorii (Kan și colab ., 2018) .
Li și colab. (2017) a realizat un studiu care a avut ca scop obținerea unor fotosensibilizatori
nanoconjugați eficienți în tratamentul cancerului ovarian, cu o putere de penetrare mai mare. Î n

36
acest sens, a fost folosită albumin a (având un diametru de 7 nm ) ca moleculă miez pentru
transport ul unui fotosensibilizator cu porfirină, IRDye 700DX (IR700). Pentru a obține
selectivitatea față de celulele canceroase ovariene , cRGD a fost funcționaliz at la suprafața
conjugațil or de albumină cu PEG. Studiul a fost unul de succes , nanoconjugate le multivalente de
dimensiuni extrem de mici, foarte specifice cancerului și non-toxice pentru celulele normale ,
arătându -se foarte eficiente . Nanoconjugatele viza te au demonstrat creșteri dramatice ale absorbției
celulare integrin o-specifice , ale penetrării tumor ilor sferoide și ale fototoxicității în celulele
canceroase. Datorită dimensiunilor mici, transportului eficient la nivel celular și a unei bune
fotoactivi tăți, nanoconjugate RGD direcționate reprezintă un instrument eficient pentru terapia
fotodinam ică a cancerului ovarian (Li și colab ., 2017) .
Dezvoltarea porfirinei funcționalizate capabile să form eze nanostructuri care pot reține
molecule cu efic acitate semnificat ivă a supra oxigenului singlet , care să prezinte o bună
fotostabilitate și solubilitate în mediul biologic este destul de solicitantă pentru aplicațiile
terapeutice fotodinamice și joacă un rol cheie în furnizarea de medicamente. Marydasan și colab
(2019) au participat la un studiu în care s -a urmărit obținerea unor fotosensibilizatori eficien ți
construiți pe baza aza-BODIPYS, squaraine și sisteme porfirin ice pentru utilizarea lor în terapiile
fotodinamice. Asfel, s -au proiectat și sintetizat derivați de porfirină modifica ți cu grupări de
picolilamină , unul simplu (notat 1) și celălalt complex at cu zinc (notat 2), structurile lor
autoasamblate fiind ulterior cercetate prin diferi te tehnici spectrale și de microscopie . Activitatea
fotodinamică a acestor nanostructuri de porfirină a fost stabilită prin starea excitată de triplet,
precum și prin eficacitatea gener ării oxigenului singlet . Experimentul a demo nstrat că inserția
zincului în compusul 1 , atât în centru, cât și la suprafață, a dus la îmbunătăț irea eficienț ei de
încrucișare intersistem ică. Mai mult decât atât, investigațiile de terapie fotodinamică in vitro ale
conjugatelor de porfirină , folosind linia celulelor cancero ase de sân MDA -MB 231 , au relevat
faptul că , dintre cei doi, compusul 2 cu cinci ioni de zinc complexați a arătat o fotocitotoxicitate
mai bună , determinând moartea celulară prin apopto ză. Pe scurt, r ezultate studiului au demonstr at
că inserția ioni lor de Zn2+ în picolilporfirină ajută la creșterea eficienței gener ării oxigen ului singlet
și a activității fotodinamice (Marydasan și colab ., 2019) .
În anul 2016 a fost publicat un articol referitor la sinteza și caracterizarea conjugatelor din
porfirină și metale nobile (mai precis, aur și argint) . Nanoconjugatele metalice fotosensibiliza nte
au fost dezvoltate ca o alternativă mai bună la fotosensibilizarea convențională. Aceste a au fost

37
concepute pentru a poseda o mai bună biocompatibilitate, lucru demonstrat de stabilitatea
prezentată în condiții fiziologice. Aceste nanoconjugate fotosensib ilizante au o eficacitate
îmbunătățită în comparație cu fotosensibilizatoarele clasice sau NP native. Luate împreună, aceste
sonde nanofotosensibilizante sunt potențiali candidați pentru fotomedicină (Bhaumik și colab .,
2016) .
Studiile menționate mai sus sunt doar câteva dintr -o între agă gamă , numărul articol elor
publicate pe această temă crescând semnificativ de la an la an, ceea ce demonstrează potențialul
uriaș pe care îl prezintă acestea pentru viitorul terapiei cancerului.

38

B. PARTEA PRACTICĂ

39
Scop și obiective
Nanotehnologia, așa cum au arătat numer oasele studii publicate până în prezent , este o
cărămidă de o însemnătate deosebită în structura edificiului reprezentat de viitorul terapiei
cancerului.
NP de oxid de fier și porfirina prezintă o gamă de proprietăț i ce merită a fi exploatate în
sensul d ezvoltării de noi abordări terapeutice de tratament a diverselor tipuri de cancere. NP
magnetice de oxid de fier sunt niște vectori de transport extrem de valoroși datorită
biocompatibilității lor cu organismul gazdă, dar și datorită proprietăților magneti ce, bunei
biodistribuți i și capacității de depășire a barierelor biologice in vivo , prin difuzi e la nivel capilar.
Costurile reduse de producție aduc și ele un avantaj întrucât , odată ce utilizarea lor în terapia
cancerului devine posibilă, va avea loc o c reștere a accesibilității acestor trata mente la nivel global
și pentru pacienții cu posibilități materiale precare. Porfirina este un fotosensibilizator care s -a
arătat extrem de eficient până acum în terapia cancerul ui, principalul mecanism de distrugere a
celulelor tumorale fiind prin dezvoltarea stresului oxidativ în urma form ării speciilor reactive de
oxigen în exces , determin ând astfel apoptoza celulară. Marele avantaj al acesteia este posibilitatea
activării în m omentul în care ajunge în țesutul țintă, redu cându -se astfel drastic exercitarea efectului
toxic în alte țesuturi. Deși are o solubilitate scăzută, aceasta poate fi îmbunătățită prin construirea
nanoconjugatelor. Date fiind numeroasele avantaje pe care le au ce i doi compuși chimici
individual, îmbinarea lor poate duce la obținerea unor particule mult mai avantajoase și mai eficace
în terapie.
În această lucrare s -a abordat determinarea efectului toxic al NP conjugate cu porfirină
asupra celulelor de cancer de sân (adenocarcinom) și de piele (în acest caz de melanom amelanotic).
Principal ul scop al lucrării fost evaluarea capacit ății anti-tumoral e a porfirinei sub formă
nanoconjugată asupra a două tipuri celulare umane – cancer de sân și cancer de piele.
Obiectivele studiului sunt:
• Evaluarea viabilității celulelor tumorale în condiții normale după expunerea la nanoconjugatele
cu porfirină ;
• Evaluarea viabilității celulelor tumorale în condiții de iluminare după expunerea la
nanoconjugatele cu porfi rină;
• Evaluarea unor aspecte de morfologie celula re prin microscopie optică în urma expunerii ;

40
• Determinarea producției de specii reactive de oxigen generate în urma tratamentului în condiții
de iluminare pentru selectarea condițiilor optime de iluminare și a concentrațiilor de
nanoparticule la care efect ul anti -tumoral al porfirinei este maxim;
• Efectuarea testului de viabilitate în condițiile selectate și pe o linie de celule normale.
Nanosistemul testat este destinat aplicațiilor de teranostică a cancerului, NP magnetice
putând fi folosite în scop de di agnostic (ca agenți de contrast in imagistica prin rezonanță
magnetică) sau ca agenți de hipertermie, iar por firina ca agent terapeutic pentru dist rugerea țintită
a celulelor tumorale.

!Notă: D in cauza situație i de pandemie instalată la nivel național stu diile au fost întrerupte. În
această lucrare sunt prezentate doar studiile efectuate până la momentul declarării stării de urgență
care nu a permis continuarea lucrului în laborator.

41
IV. Materiale și metode

1. Caracteristicile liniilor celulare folosite MCF7 ș i C32
Studiul de față a fost realizat pornind de la două linii celulare canceroase : MCF7 (ATCC ,
HTB -22) și C32 (ATCC , CRL -1585 ).
MCF7 (ATCC, HTB -22) este o linie celulară epitelială de cancer de sân (adenocarcinom),
izolat ă de la un pacient de sex femin in de 69 de ani (din glanda mamară; țesutul este metastazat cu
efuziune pleurală) și depozita tă prin congelare în nitrogen lichid în fază de vapori.
(1) (2)
Figura 9. Câmpuri de c elule MCF7 la densități diferite : (1) la densitate mică ; (2) la dens itate mare –
celulele ating confluența
Linia celulară C32 (ATCC, CRL -1585) este una de melanom amelanotic, izolată de la un
pacient de sex masculin de 53 de ani. Modul de păstrare este identic cu linia celulară anterioară .
(1) (2)
Figura 10. Câmp uri de cellule C32 la densități diferite : (1) la densitate mică ; (2) la densitate mare – la
confluenț ă

42
Celulele utilizate în cadrul experimentului sunt la al optulea pasaj. Acestea au fost
menținute în mediu DMEM (Dulbeco’s modified Eagle’s medium) cu 4. 5 g/L glucoza și 1.5 g/L
NaHCO 3 suplimentat cu 1% mix de antibiotic (Pen/Strep/Amf) și 10% ser fetal bovin . Ambele linii
celula re au fost cultivate în flas k-uri de 25 cm2 (T25) în condiții standard ( 37°C, 5% CO 2, 95%
umiditate ), unde au format culturi ader ente.

2. Procedura de dezghe țare a celulelor
Celulele, anterior depozitate la -80°C în tuburi de criogenare în mediul de cultivare DMEM
la care s -a adăugat agentul de înghețare dimetil sulfoxid – DMSO ( Sigma, D2650 ) 5%, s -au
dezgheț at pe baie de apă (la 37°C), prin agitare ușoară, cât mai rapid pentru a se evita riscul alterării
probei de către agentul DMSO. Un volum de 1 mL din suspensia celulară dezghețată a fost preluată
cu o pipetă și ad ăugată peste 5 mL de mediu de cultură DMEM suplimentat, pregătit în prealabil și
adus la 37°C . Amestecul obținut a fost centrifugat timp de 5 minute , la 1500 r pm și 20°C, iar,
ulterior, sedimentul celular a fost resuspendat în 5 mL mediu de cultură și distribuit apoi uniform
în flask-ul de 25 cm2. Celulele au fost apoi i ncubate la 37°C în incubator cu 5% CO 2, fiind
recomandată pasarea lor de cel puțin o dată înaintea aplicării oricărui tratament.

3. Procedura de subcultivare (tripsinizare) a celulelor
Celulele, după o perioadă de incubare de 2 -3 zile de la însămânțare, au fost supuse
procedurii de tripsinizare ce const ă în mai mulți pași.
Toți compușii utilizați sunt aduși în prealabil la 37 °C (în baie de apă) . Într-o primă fază s -a
realizat îndepărta rea mediului de cultură în condiții sterile și spălarea cu tampon fosfat salin ( PBS)
(1 mL) a suprafeței flask -ului de 25 cm2 ce conține celulele, evitându -se adăugarea soluției pe
suprafața de cultură în jet puternic pentru a nu avea loc desprinderea celu lelor. Ulterior, a avut loc
incubarea flask-ului la 37°C, timp de 5 min ute cu o soluție de tripsină 0.25% – EDTA 0.53 mM (1
mL). Tripsina este o serin protează care are rolul de a degrada proteinele implicate în adeziunile
focale ce ancorează celulele de suprafața flask -ului de cultură, iar compusul EDTA are rol în
chelatarea cationilor divalenți de Ca2+ și Mg2+ implicați în interacțiile celulă -celulă și celulă -matrix .
La scoaterea flask -ului din incubator, desprinderea celulelor a fost verific ată prin înclinarea ușoară
a flask -ului sau observarea la microscop . Inactivarea trip sinei se realizează prin adăugarea unui

43
volum dublu (2mL) de mediu de cultură complet (cu ser fetal bovin) față de volumul din pasul
inițial. Serul fetal bovin conține pro teine care sunt inhibitori ai tripsinei. Este esențială nedepășirea
perioadei de incu bare întrucât există riscul degradării membr anei prin acțiunea enzimei asupra
proteinelor din structura acesteia. Suprafața flas k-ului a fost spălată cu atenție și suspens ia a fost
apoi centrifugată timp de 5 minute, la 1500 rpm și 20°C . Peletul obținut a fost resuspendat în mediu
proaspăt (5 mL) și distribuit într -un nou flask care a fost lăsat în incubator timp de 2 zile până la
reînnoirea mediului.

4. Procedura de înghe țare a celulelor
După desfășurarea experimentelor, celulele rămase au fost supuse p rocesului de înghețare
în scopul depozitării. Acesta presupune realizarea într-o primă etapă a unei trip sinizări (cultura de
celule aflându -se într -un flask) când celulele ati ng o densitate de 70 -90%. Suspensia de celule a
fost centrifugată timp de 5 min, la 1500 rpm și 20°C. După îndepărtarea supernatantului, peletul
celular s e resuspen dă rapid în mediu de congelare (mediu de cultură complet + 5% DMSO) și se
alicote ază câte 1 mL per criotub pe gheață. Viteza de lucru trebuie să fie cât mai mare întrucât
DMSO p oate afecta arhitectura celulară prin acțiunea sa. Suspensi a obținută s -a congel at la -80°C
în containere Mr. Frosty, Nalgene cu izopropanol (care are rol în scăde rea treptată a temperaturii
pentru a proteja celulele de un eventual șoc termic, incompatibil cu viața) . După o perioadă de 24
de ore, criotuburile au fost transfer ate în containere cu azot lichid sau în freezer la -80°C pentru o
perioadă de stocare nelimi tată.

5. Nanoparticulele magnetice conjugate cu p orfirin ă
Nanoparticulele (NP) de oxid de fier (de tip γ -Fe2O3) utilizate în acest studiu au fost
sintetizate de către un grup de cercetători de la Institutul Național de Cercetare -Dezvoltare pentru
Fizica Las erilor, Plasmei și Radiației (INFLPR). Sinteza lor s -a realizat din precursorul
pentacarboni l de fier , prin piroliză laser. După sinteză, NP au fost resuspendate în apă distilată în
concentrație de 0.5 g /L și ultrasonicate pe baie de ultrasunete.
Probele cu porfirină au fost ob ținute prin amestecarea solu ției de porfirină – mai exact,
tetraamon iu de 5,10,15,20 -(tetra -4-sulfonato fenil) porfirină (TPPS) – cu suspensia de NP. Acestea
au fost lăsate la incubat o perioadă de timp pentru realizarea conjug ării. Surplusul de porfirină

44
neconjugată a fost î ndepărta tă prin parcurgerea unor etape de spălare și centrifugare. Sedimentul
rămas a fost resuspendat în apă distilată. Înainte de incubarea cu celulele , NP au fost sterilizate p rin
expunere la lampa UV timp de 1 h.

Figura 11. Structura chimică a tetraamoniului de 5,10,15,20 -(tetra -4-sulfonatofenil) p orfirină (TPPS)
(https://shop.porphychem.com/5 -10-15-20-tetra-4-sulfonatophenyl -porphyrin -tetraammonium.html )

6. Testul MTT de viabilitate celulară
Acest test este o metodă colorimetrică ce se bazează pe măsurarea reducerii compusului
MTT [bromură de 3 -(4,5 dimetiltiazol -2-il)-2,5-difeniltetrazoliu ], de culoare galbenă , sub acțiunea
succinat dehidrogenazei mitocondriale NAD(P)H -dependente. La nivel mitocondrial, în urma
clivării nucleului de tetrazoliu, are loc formarea unui produs insolubil în apă , dar solu bil în solvenți
organici (în acest caz izopropanol), numit cristal de formazan, de culoare violet. Cantitatea de
formazan rez ultată în urma acțiunii enzimatice poate fi determinată spectrofotometric la 595 nm
(Mosmann, 1983) .

Figura 12. Formarea formazanului din MTT (https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma –
aldrich/articles/protocols/biology/roche/metabolization -of-mtt.png)

45
Reactivii necesari acestui experiment sunt:
• soluția MTT [BCIP (5-brom -4-clor-3-indolil -1-fosfat ) / NBT (nitroblue tetrazoliu) ], de
concentrație 1 mg/mL, preparată în PBS
• tampon fosfat salin (PBS)
• izopropanol 100% acidifiat (1 µL HCl concentrat / 1 mL izopropanol) 0,04 -0,1 N HCl
Pentru efectuarea acestei analize, celulele au fost mai întâi tripsinizate pentru a fi folosite
pentru îns ămânțare, iar peletul de celule obținut în urma centrifugării s-a resuspenda t într-un volum
de mediu complet de 1 mL (în tuburi Eppendorf) . Pentru aflarea concentrației de celule din
suspensia obținută s-a realizat mai întâi o diluție de 10 ori într-un volum de 200 µL .
Înaintea însămânțării propriu -zise este însă necesară o etapă de verificare a concentrației de
celule. Astfel, 10 µL din diluție au fost transfera ți într-o cameră de număr are de tip Burker -Turk.
În cazul liniei celulare MCF7 s -a obținut o concentrație celulară de 225 x 104 celule/mL, iar în
cazul C32 de 138,75 x 104 celule/mL . Din fiecare suspensie s -a realizat o diluție astfel încât
concentrația finală de celule din fiecar e godeu să fie de aproximativ 5 x 104 celule/mL .
Însămânța rea s-a realizat în plăci de 96 de godeuri . Volumul adăugat în fiecare godeu a fost de 200
µL. Plăcile au fost apoi incubate standard timp de 24 de ore în scopul aderării celulelor.
Pentru determin area concentrației de tratament cu eficiență maximă s -a lucrat în gradient
de concentrație, în triplicat. Cele patru concentrații de tratament aplicate pe celule au fost
următoarele: 1 µg/mL ; 2,5 µg/mL; 5 µg/mL și 7,5 µg/mL. Diluțiile s -au realizat din sol uțiile stoc
de porfirină simplă (0,16 mg/mL), suspensie de NP simple (0,5 mg/mL) și suspensie de NP
conjugate cu porfirină (0,5 mg/ml NP simple și 0,09 mg/mL porfirină), sterilizate în prealabil timp
de o oră la lampa UV. Pentru control s -au utilizat celul e netratate. După aplicarea tratamentului,
plăcile au fost incubate standard timp de 24, respectiv 48 de ore.
În cazul acestui studiu s -a evaluat în mod practic doar efectul celor trei tipuri de tratamente
asupra celulelor MCF7 și C32 în condiții normale . Activarea porfirinei s -a dorit a se face cu o
lampă de tip modul colimator de diode laser , de clasă de siguranță 3R, având o lungime de undă
de 405 nm și o putere de 4.5 mW. Dimen siunile unității diodă sunt 11 mm x 40 mm. Forma
fasciculului emis este una eliptică (3.8 mm x 1.8 mm).

46

Figura 13 . Lamp a utilizată pentru iluminarea celulelor (modul colimator de diode laser)
Lampa avea inițial capacitatea de a ilumina un singur godeu pe rând, ceea ce ar fi putut
îngreuna obținerea unor rezultate reproductibil e. Din acest motiv, mărirea ariei de iluminare s-a
realizat prin improvizarea unui sistem ce utilizează un obiectiv optic cu două lentile . Perioada de
iluminare aleasă pentru testare a fost de 30, respectiv 60 de minute.
(A) (B)
Figura 14. Evidenție rea ariei de iluminare după adiționarea lentilei. (A) Testarea iluminării după
adăugarea lentilei; (B) Godeurile iluminate simultan cu ace eași intensitate a luminii în placa cu 96 de
godeuri (restul godeurilor se acoperă cu o bucata de foaie neag ră pentru a limita r eflexia luminii din alte
godeuri)
După tratament , mediul de cultură a fost îndepărtat cu atenție și suprafața godeurilor a fost
spălată cu PBS în două rânduri (200 µL PBS/godeu). Ulterior, peste celulele aderate s -au pipetat
80 µL de soluție MTT de concen trație 1 mg/mL per godeu și a avut loc o incubare la 37 °C, la
întuneric , timp de 2 ore. După scurgerea perioadei de timp menționate, soluția MTT a fost
îndepărtată cu atenție din godeuri și a fost adăugat izopropanolul (150 µL/godeu), cu o
omogen izare ușoară, în scopul dizolvării cristalelor de formazan formate în urma acțiunii
enzimatice . Absorbanțele tuturor soluțiilor s -au realizat cu ajutorul unui aparat de citit plăci

47
FlexStation 3 (Molecular Devices), dotat cu software -ul SoftMax P ro, versiu nea 5.4.6.005.
Rezultatele obținute au fost calculate ca medie a valorilor absorbanței și reprezentate în procente
față de proba control (100% viabilitate). Deviația standard (STDEV) a fost calculată din cele trei
replicate realizate iar semnific ația stati stică a pr obelor vs. control a fost realizată cu testul t -student
(TTEST).

48
V. Rezultate, discu ții și per spective

1. Efectul nanoparticulelelor conjugate cu p orfirin ă asupra viabilității celulelor
MCF7
Evaluarea efectului NP conjugate cu porfirină asupra viabi lității celulare s-a realizat în urma
testului MTT după aplicarea tratamentului , în condiții normale, pentru a testa efectul toxic al
nanoconjugatelor și al componentelor individuale în absența iluminării . Celulele au fost expuse pe
perioade diferite de ti mp, de 24 și 48 de ore , la trei tipuri diferite de tratament (NP simple, porfirină
simplă și nanoconjugate ).

Figura 15. Diagramă ce evidențiază diferențele de viabilitate celulară în cazul liniei MCF7 la aplicarea
tratamentelor de N P simple, porfirină si mplă și NP conjugate c u porfirină la timpuri de expunere diferite
(24 și 48 de ore) . Barele de eroare reprezintă abaterea standard. Rezultatele au fost semnificative pentru
*p>0.05, distinct semnificative pentru **p>0.01 și foarte semnificative pentru ***p >0.001.
În urma evaluării s -a observat o scădere a viabilității celulelor proporțion ală cu concentrația
de tratament și intervalul de expunere. Așa cum se poate observa în Figura 15 ., prin raportarea la
celulele control, s -a înregistrat c ea mai mare scăder e a vi abilității în cazul NP conjugate cu
porfirină. În urma supunerii celulelor MCF7 la acest tratament, cea mai mare concentrație (138,8
µg/mL NP simple + 25 µg/mL porfirină) s -a dovedit a fi cea mai eficientă, rezultatele fiind foarte
semnificative (ev idențiate prin simbolul *** în figură) atât după 24 cât și după 48 de ore de
expunere . La 24 de ore , scăderea viabilității a fost de 29,21%, în timp ce la 48 de ore a fost de
49,873% . Datele obținute arătă că la această concentrație se obține o inhibiție d e 50% a viabilității

49
celulelor tumorale după 48 de ore chiar și în condi ții fără ilum inare sugerând o toxicitate sporită.
La concentrație mai mică (de 55,5 µg/mL NP simple + 10 µg/mL porfirină) s -au înregistrat
rezultate semnificative (simbolizate prin * ) doar la expunerea timp de 48 de ore, unde viabilitatea
a ajuns la 86,345%. În cazul celorlalte concentrații (de 5,5 µg/mL NP simple + 1 µg/mL porfirină
și 27,7 µg/mL NP simple + 5 µg/mL porfirină) nu s -au obținut efecte importante.
Celulele tratate cu NP au înregistrat scăderi ușoare ale viabilit ății la concentrațiile cele mai
mici, l a ambele perioade de expunere. În cazul concentrației de 55,5 µg/mL, efectul a fost unul mai
evident, semnificativ , la expunerea de 48 de ore (83,132% viabilitate). La cea mai mare
concentrație (138,8 µg/mL), la o expunere de 24 de ore nu s -a înregistrat o modificare a viabilității
față de concentrația anterioară, însă la 48 de ore rezultatele au fost distinct semnificative (notate în
figură cu simbolul **), existând o scăd ere de 37,976 %.
Porfirina simplă a determinat scăderi mai ușoare comparativ cu celelalte probe . La cele mai
mici concentrații , de 1 µg/mL și 5 µg/mL, viabilitate nu a suferit modificări aproape deloc. Primele
efecte vizibile sunt prezente la o concentrați e de porfirin ă de 10 µg/mL unde, la expunerea de 48
de ore s-a obținut o scădere a viabilității celulare la 85,508%. Cea mai mare concentrație de
porfirină s -a dovedit a fi și cea mai eficientă, rezultatele obținute fiind semn ificative la supunerea
celulel or la tratament timp de 24 de ore (s -a înregistrat o scădere de 23,494%) și distinct
semnificative la tratamentul de 48 de ore (unde scăderea a fost de 35,938%).
În anul 2010 a fost publicat un studiu realizat pe linia celula ră MCF7 care a evaluat efectul
toxic a patru derivaț i (notați P1-P4) de meso -tetrafenilporfirină modificat ă cu ioni : doi dintre ei (P1
și P2) conținând ionul trifenilfosfoniu , iar celelalte două (P3 și P4 ) ionul trietilamoniu , lanțul
cationic fiind ancorat pe gruparea fenil în pozițiil e para- sau meta -. Citotoxicitatea în condiții de
întuneric a derivaților s-a realizat printr-o expunere în gradient de concentrație a fiecărui derivat de
porfirină timp de 24 de ore. Asemeni lucrării de față, viabilitatea s -a evaluat prin intermediul
testului MTT. Experimentul desfășurat a determinat o citotoxicitate semnificativă la întuneric la
concentrați i mai mari de 10 µM. Derivații P3 și P4 s-au dovedit a fi mult mai citotoxic i decât P1 și
P2. Citotoxicitatea în condiții de întuneric a compușilor urmează ordinea P4> P3> P2> P1 la
concentrațiile examinate (de exemplu, l a 25 µM, celulelor tratate cu P1 a u prezentat o viabilitate
de 65%, în timp ce în cazul compusului P4 a fost de doar 25% ). Toți acești compuși prezintă
toxicitate semnificativă, dar negli jabilă la întuneric în concentrații cuprinse între 6-10 µM,
dovedin du-și potențialul pentru utilizarea în terapia fotodinamică (Lei W. și colab ., 2010)

50
Un studiu mai vechi, datând din anul 1987, care a avut ca scop elucida rea mecanismel or de
retenție s electivă a porfirinelor și metaloporfirinelor de către celulele canceroas e, a utilizat, de
asemenea, linia celulară MCF7 și linia derivată din aceasta, rezistentă la adriamicină. Acesta a
urmărit evaluarea toxicit ății sulfonat ului de tetrafenilpor firină și a complexul ui său cu Mn (III) .
Celulele au fost expuse la concentrații de tratament cuprinse între 0,1 și 1,5 mg/m L. Pentru
concentrația cea mai mică nu au fost observate efecte citotoxice în cazul ambelor tipuri celulare .
Concentrația de 0,2 mg/ml a dete rminat o ușoară inhibiție a creșterii pentru celulele MCF7, dar nu
a afec tat tipul rezistent . Pentru concentrații le mai mari creșterea a fost inhibată în ambele linii
celulare (între 10 și 90% ). Viabilitatea ambelor linii celul are a fost confirmată prin tehnica de
excludere „Trypan blue dye ”, cu aproximativ 90% celule viabile p entru ambele linii celulare
(Megnin și colab ., 1987) .
Luând în con siderare datele obținute pe celulele MCF7 în cadrul studiului de față , care au
demonstrat că la concentrații mai mari de 55 µg/mL NP de oxizi de fier prezintă o toxicitate
semnificativă s-a luat decizia testării unor concentrații mai mici de NP implicit și din celelalte
suspensii pe celulele C32.

2. Efectul nanoparticulelelor conjugate cu porfirin ă asupra viabilității celulelor
C32
În cazul liniei celulare C32 , spre deosebire de datele ob ținute pe linia de celule MCF7,
modificările de la nivelul viabilității celulare nu au fost proporț ionale cu doza de tratament aplicată.
S-au înregistrat efecte diferite la aceleași doze din cele trei tratamente între cele două linii celulare
folosite . Rezultatele obținute sunt evidențiate în Figura 16 .
Scăderile viabilității în cazul celulelor C32 expuse la concentrațiile de NP și porfirină testate
au fost ușoare , nu mai mult de 20% , chiar dacă anumite scăderi au ieșit statistic semnificative.
Astfel, c elulele canceroase tratate cu NP simple au relevat o c reștere a viabilității celulare cu
16,829% la o concentrație de 13,8 µg/mL și o expunere de 24 de ore . Aceasta este singura
modificare apărută la ace st timp de expunere. Celulele supuse tratamentului timp de 48 de ore au
suferit scăderi semnificative (simb olul * în figu ră) de viabilitate doar la concentrații de 5,5 µg/mL
(viabilitatea fiind de 83,778%) și 41,6 µg/mL (86,343%). Celelalte două concentrații nu au indus
alterări semnificative.

51

Figura 16. Diferențele de viabilitate celulară î n cazul liniei MCF7 la aplicarea trata mentelor de NP
simple, porfirină simplă și NP conjugate cu porfirină la timpuri de expunere diferite (24 și 48 de ore).
Barele de eroare reprezintă abaterea standard. Rezultatele a u fost semnificative pentru *p>0.05.
Tratamentul cu porfirină simplă a determinat modificări semnificati ve de viabilitate în patru
dintre cele opt cazuri. La fel ca și în cazul NP simple , există o valoare a concentrație i care a
determinat o creștere a rezistenței celulare la expunerea de 24 de ore , de această dată cu 12,338%
la o concentrați e de porfirină de 2,5 µg/mL. Trei dintre concentrațiile porfirinice s -au arătat
eficiente la o expunere de 48 de ore , și anume 1 µg/mL, 5 µg/mL și 7,5 µg/mL , inducând scăderi
de viabilitate cu 12,714%, 16,53% și respectiv 17,045%.
NP conjugate cu porfirină nu au determina t o scădere a viabilității la concentrațiile testate
în condiții normale fără iluminare. Singurele rezultate semnificative s -au înregistrat la două
concentrații, expunerea în ambele cazuri fiind de 24 de ore . Una di ntre acestea, mai precis cea de
13,8 µg/mL NP simple + 2,5 µg/mL porfirină a determinat o creștere a viabilității cu 14,072%,
asemănătoare cu tratamentele anterioare. Concentrația de 27,7 µg/mL NP simple + 5 µg/mL
porfirină a determinat și ea o creștere su rprinzătoare a viabilității până la valoa rea de 109,81% .
Aceste rezultate sugerează faptul că la aceste concentrații testate, în condiții normale, fără
iluminare, nanoconjugatele nu au efecte toxice asupra celulelor. Rămâne de văzut care vor fi
efectele la aceleași concentrații pe celule normale, dar și în condiții de iluminare. Aceste doze non –
toxice pot fi utilizate în terapia fotodinamică țintită (locală) pentru a evita efectele secundare asupra
țesuturile adiacente sănătoase.

52
3. Perspective ale experiment ului
Dată fiind situația carantinei impu se la nivel național care nu a per mis lucrul în laborator, o
mare parte a evaluărilor necesare unei analize desăvârșite nu au putut fi îndeplinite.
Testul MTT desfășurat , deși reprezintă un pas important în vedere a îndeplinirii scopului
acestui studiu și în generarea unei analize obiective și complete a efectului acestui tratament asupra
celor două linii celulare, nu oferă posibilitatea valorificării proprietății esențiale a porfirinei . Fiind
un fotosensibilizator , în urma fotoactiv ării în momentul locali zării ei la nivel tumoral , porfirina
poate avea un efect toxic mai puternic asupra celulelor testate , dând și posibilitatea împiedicării
apariției efectelor secundare la nivelul altor țesuturi . Aceasta reprezintă și caracteristica de bază
care permite util izarea acestor nanoconjugate în terapia fotodinamică a cancerului.
În acest studiu erau planificate și alte activități precum evaluarea viabilității celulelor și în
condiții de iluminare, evidențiere a modificărilor morfologice determinate de aplicarea ac estui
tratament la nivel celular prin microscopie optică întrucât acestea sunt indicatori extrem de
importanți ai mecanismului de acțiune a acestor particule, dar și a intensității efectului. De
asemen ea, studiul viza evaluarea nivelului de specii reactive de oxigen generate la nivel intracelular
în urma aplicării tratamentului printr -o metodă fluorimetrică, întrucât este principalul mod de
manifestare a toxicității porfirinei, care joacă în acest caz r ol de agent anti -tumoral . În mod teoretic ,
cu cât toxicitatea unui compus este mai crescută, cu atât concentrația acestor specii este mai mare.
Acest test este un indicator al intensității efectului citotoxic și al capacității de acțiune anti -tumorală
a nanoconjugatelor prin inducerea stresului o xidativ.
În urma acestor evaluări și a rezultatelor care se obțin se selectează condiții le optime de
iluminare și concentrațiil e de NP la care efectul anti -tumoral al porfirinei este maxim . Acest pas
are rolul de a determina care este tratamentul cu efect ele pozitive cele mai eficient e.
Concluzionarea studiului de față s-ar fi realizat odată cu obținerea rezultatelor testului MTT
de viabilitate în condițiile selectate și pe o linie de celule normale pentru evidenț ierea efectelor
maxime posibile date de n anoconjugatele cu porfirină.

53
Concluzii
Testul MTT de viabilitate celulară, desfășurat doar în condiții normale, fără iluminare , a
arătat o citotoxicitate dependentă de concentrație a nanoparticulelor magnetice și a porfirinei, dar
și de intervalul de ex punere în cazul celulelor MCF7, dar nu și în cazul celulelor C32. Deși nu s -a
putut realiza acest test și în condiții de iluminare, convingerea mea este aceea că rezultatele ar fi
fost favorabile în sensul unei toxi cități mai mari induse de porfirina activ ată, afirmația fiind
susținută de numeroasele studii publicate deja despre aceste nanoconjugate .
Având în vedere faptul că principalul mecanism de exprimare a toxicității porfirinei este
generarea speciilor reactive de oxigen care determină peroxidarea fo sfolipidelor membranare ce
duce la o dezorganizare a membranei, și implicit la moarte celulară, vor exista modificări
morfologice vizibile ale aspectului celular caracteristice morții celulare . Determinarea
concentrației de specii reactive de oxigen format e în urma tratamentului reprezintă de asemenea un
indicator al nivelului de toxicitate prin stres oxidativ indus la nivel celular. Rămâne de văzut, însă,
care este concentrația ideală de nanoconjug at care determină formarea celei mai mari cantități de
astfel de specii.
NP magnetice de oxid de fier, conform rezultatelor testului MTT de viabilitate derulat în
condiții de întuneric, determină toxicitate la concentrații peste 55 µg/mL , mai ales la o expunere
mai îndelungată. Însă aceasta este mai mică decât ce a înregistrată în cazul porfirinei simple, și chiar
a NP conjugate cu porfirină, ceea ce le demons trează , posibil, eficiența în transportul intracelular.
În terapia fotodinamică este esențială utilizarea unor vectori de transport care să aibă o toxicitate
cât mai redusă și să nu afecteze celulele organismului în cursul transportului agentului
fotosensi bilizator la țesutul țintă . Cu alte cuvinte, în această terapie este fundamentală exercitarea
efectului toxic strict la nivel tumoral .
Ținând cont de toate i nformațiile, tind să cred că nanoconjugatele cu porfirină își vor dovedi
eficiența anti -tumorală a supra celor două linii celulare de cancer de sân și de piele în condiții de
iluminare fiind astfel candidați promițători pentru teranosticul cancerului . Cu to ate acestea, nu
există certitudine fără dovezi experimentale.

54
Bibliografi e
Articole din reviste de specialitate :
• Abd Elrahman A.A. și Mansour F.R. , 2019 . Targeted magnetic iron oxide nanoparticles:
Preparat ion, functionalization and biomedical application . J Drug Deliv Sci Technol . 52, 702-
712.
• Ali A., Zafar H., Zia M., ul Haq I., Phull A.R., Ali J.S. și Hussain A. , 2016 . Synthesis,
characterization, applications, and challenges of iron oxide nanoparticles . Nanotechnol. Sci.
Appl. 9, 49 -67.
• Alves E., Faustino, M.A.F. Neves, M.G.P.M.S. Cunha, Â. , Nadais, H. și Almeida, A. , 2015 .
Potential applications of porphyrins in photodynamic inactivation beyond the medical scope .
J. Photochem. Photobiol. C . 22, 34 -57.
• Arami H., Khandhar A., Liggitt D. și Krishnan K.M. , 2015 . In vivo delivery, pharmacokinetics,
biodistribution and toxicity of iron oxide nanoparticles . Chem. Soc. Rev . 44, 8576 -8607 .
• Arias L., Pessan J., Vieira A., Lima T., Delbem A. și Monteiro D. , 2018 . Iron Oxide
Nanoparticles for Biomedical Applications: A Perspective on Synthesis, Drugs, Antimicrobial
Activity, and Toxicity . Antibiotics . 7, 46.
• Baskaran R., Lee J. și Yang S. -G., 2018 . Clinical development of photodynamic agents and
therapeutic applicat ions. Biomater. Res. 22, 25 .
• Bhaumik J., Gogia G., Kirar S., Vijay L., Thakur N.S., Banerjee U.C. și Laha J.K. , 2016 .
Bioinspired nanophotosensitizers: Synthesis and characterization of porphyrin -noble metal
nanoparticle conjugates . New J. Chem . 40, 724 -731.
• Bonnett R. , 1995 . Photosensitizers of the porphy rin and phthalocyanine series for
photodynamic therapy . Chem. Soc. Rev. 24, 19 -33.
• Chu X., Yu J. și Hou Y.L. , 2015 . Surface modification of magnetic nanoparticles in
biomedicine . Chinese Phys. B . 24, 1.
• Dadfar S.M., Roemhild K., Drude N.I., von Stillfried S., Knüchel R., Kiessling F. și Lammers
T., 2019 . Iron oxide nanoparticles: Diagnostic, therapeutic and theranostic applications . Adv.
Drug Deliv. Rev. 138, 302-325.
• McBain S.C., Yiu H.H.P., Dobson J., 2008. Magnetic nanoparticles for gene and d rug delivery .
Int. J. Nanomedicine . 3(2), 169 -180.

55
• Eloy J.O., Claro de Souza M., Petrilli R., Barcellos J.P.A., Lee R.J. și Marchetti J.M. , 2014 .
Liposomes as carriers of hydrophilic small molecule drugs: Strategies to enhance encapsulation
and delivery . Colloids Surf. B. 123, 345 -363.
• Frank L.A., Onzi G.R., Morawski A.S., Pohlmann A.R., Guterres S.S. și Contri R.V. , 2020 .
Chitosan as a coating material for nanoparticles intended for biomedical applications. React.
Funct. Polym. 147, 104459.
• Friák M., Schindlmayr A. și Scheffler M. , 2007 . Ab initio study of the half -metal to metal
transition in strained magnetite . New J. Phys. 9, 5-5.
• Fuchs J., Weber S. și Kaufmann R. , 2000 . Genotoxic potential of porphyrin type
photosensitizers with particular emphasis on 5-aminolevulinic acid: Implications for clinical
photodynamic therapy . Free Radic. Biol. Med. 28, 537-548.
• Gheisari M., Mozaffari M., Acet M. și Amighian J. , 2008 . Preparation and investigation of
magnetic properti es of wüstite nanoparticles . J. Magn. Magn. Mater. 320, 2618 – 2621 .
• Gomes A.T.P.C., N eves M.G.P.M.S. și C avaleiro J.A.S ., 2018 . Cancer, Photodynamic Therapy
and Porphyrin -Type Derivatives . An. Acad. Bras. Cienc. 90, 993-1026.
• Guo T., Lin M., Huang J., Zhou C., Tian W., Yu H., Jiang X., Ye J., Shi Y., Xiao Y., Bian X.
și Feng X. , 2018 . The recent advances of magnetic nanoparticles in medicine . J. Nanomater.
2018 , 7805147 .
• Gupta A.K. și Gupta M. , 2005 . Synthesis and surface engineering of iron oxide nanopart icles
for biomedical applications . Biomaterials . 26, 3995 -4021.
• Hasany S.F., Ahmed I., Rajan J. și Rehman A. , 2013 . Systematic Review of the Preparation
Techniques of Iron Oxide Magnetic Nanoparticles . Nanosci. Nanotechnol. 2, 148-158.
• Hola K., Markova Z., Zoppellaro G., Tucek J. și Zboril R., 2015 . Tailored functionalization of
iron oxide nanoparticles for MRI, drug delivery, magnetic separation and immobilization of
biosubstances . Biotechnol. Adv. 33, 1162 -1176.
• Israel L.L., Galstyan A., Holler E. și Ljub imova J.Y. , 2020 . Magnetic iron oxide nanoparticles
for imaging, targeting and treatment of primary and metastatic tumors of the brain . J. Control.
Release . 320, 45-62.
• Kan J.L., Jiang Y., Xue A., Yu Y.H., Wang Q., Zhou Y. și Dong Y. Bin. , 2018. Surface
Decorated Porphyrin ic Nanoscale Metal -Organic Framework for Photodynamic Therapy .
Inorg. Chem. 2018, 57, 5420 –5428 .

56
• Kauscher U., Holme M.N., Björnmalm M. și Stevens M.M. , 2019 . Physical stimuli -responsive
vesicles in drug delivery: Beyond liposomes and polym ersomes . Adv. Dru g Deliv. Rev. 138,
259-275.
• Khan I ., Saeed K. și Khan I. , 2019 . Nanoparticles: Properties, applications and toxicities . Arab.
J. Chem. 12, 908-931.
• Khutoryanskiy V.V. , 2018 . Beyond PEGylation: Alternative surface -modification of
nanopartic les with mucus -inert biomaterials . Adv. Drug Deliv. Rev. 124, 140-149.
• Knap B., Przystupski D., Saczko J., Ewa K., Knap -czop K., Kotli J., Michel O., Kotowski K.
și Kulbacka J. , 2018 . Biomed icine & Pharmacotherapy Photodynamic therapy – mechanisms,
photose nsitizers and combinations . Biomed. Pharmacother. 106, 1098 -1107 .
• Kuchma E.A., Zolotukhin P.V., Belanova A.A., Soldatov M.A., Lastovina T.A., Kubrin S.P.,
Nikolsky A.V., Mirmikova L.I. și So ldatov A.V. , 2017 . Low toxic maghemite nanoparticles
for theranost ic applications . Int. J. Nanomedicine . 12, 6365 -6371 .
• Kumar N., Kulkarni K., Behera L. și Verma V. , 2017. Preparation and characterization of
maghemite nanoparticles from mild steel for magnetically guided drug therapy. J Mater Sci:
Mater Med . 28, 116.
• Kuzmin S.M., Chulovskaya S.A. și Parfenyuk V.I. , 2018. Structures and properties of
porphyrin -based fi lm materials part I. The films obtained via vapor -assisted methods. Adv.
Colloid Interface Sci. 253, 23-34.
• Laurent S., Forge D., Port M., Roch A., Robic C. , Vander Elst L. și Muller R.N. , 2008.
Magnetic iron oxide nanoparticles: Synthesis, stabilization, vectorization, physicochemical
characterizations and biological applications. Chem. Rev. 108, 2064 -2110 .
• Lei W., Xie J ., Hou Y ., Jiang G ., Zhang H. , Wang P. , Wang X., Zhang B., 2010, Mitochondria –
targeting properties and photodynamic activities of porphyrin derivatives bearing cationic
pendant . J. Photochem. Photobiol. B, Biol. 98, 167-171
• Lei Z., Zhang X., Zheng X., Liu S. și Xie Z. , 2018. Porphyrin -ferrocen e conjugates for
photodynamic and chemodynamic therapy. Org. Biomol. Chem. 16, 8613 -8619 .
• Li F., Zhao Y., Mao C., Kong Y. și Ming X. , 2017. RGD -Modified Albumin Nanoconjugates
for Targeted Delivery of a Porphyrin Photosensitizer. Mol. Pharm. 14, 2793 -2804 .
• Mahmoudi M., Hofmann H., Rothen -Rutishauser B. și Petri -Fink A. , 2012. Assessing the in
vitro and in vivo toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Chem. Rev. 112, 2323 –

57
2338 .
• Makarska -Bialokoz M. 2018. Comparative study of binding interactio ns between porphyrin
systems and aromatic compounds of biological importance by multiple spectroscopic
techniques: A review. Spectrochim. Acta – Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 200, 263-274.
• Martinkova P., Brtnicky M., Kynicky J. și Pohanka M. , 2018. Iron O xide Nanoparticles:
Innovative Tool in Cancer Diagnosis and Therapy. Adv. Healthc. Mater. , 7, 1-14.
• Marydasan B., Nair R.R., Saneesh Babu P.S., Ramaiah D. și Asha Nair S. , 2019. Picolyl
Porp hyrin Nanostructures as a Functional Drug Entrant for Photodynamic Therapy in Human
Breast Cancers. ACS Omega. 4, 12808 -12816 .Megnin F., Faustino P.J., Lyon R.C., Lelkes P.I.
și Cohen J.S., 1987. Studies on the mechanism of selective retention of porphyrins and
metalloporphy rins by cancer cells. BBA – Mol. Cell Res. , 929. 173 -181.
• Megnin F., Faustino P.J., Lyon R.C., Lelkes P.I. și Cohen J.S., 1987. Studies on the mechanism
of selective retention of porphyrins and metalloporphyrins by cancer cells. BBA – Mol. Cell
Res., 929. 173-181.
• Mosmann T. , 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to
proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods . 65, 55-63.
• Muthiah M., Park I. -K. și Cho C. -S., 2013. Surface modification of iron oxide nanop articles by
biocompat ible polymers for tissue imaging and targeting. Biotechnol. Adv. 31, 1224 -1236.
• Nedyalkova M., Donkova B., Romanova J., Tzvetkov G., Madurga S. și Simeonov V. , 2017.
Iron oxide nanoparticles – In vivo/in vitro biomedical applications a nd in silico studies. Adv.
Colloid Interface Sci. 249, 192 -212.
• Patel S., Jana S., Chetty R., Thakore S., Singh M. și Devkar R. , 2019. Toxicity evaluation of
magnetic iron oxide nanoparticles reveals neuronal loss in chicken embryo. Drug Chem
Toxicol. 42, 1-8.
• Paunovic J., Vuc evic D., Radosavljevic T., Mandić -Rajčević S. și Pantic I. , 2020. Iron -based
nanoparticles and their potential toxicity: Focus on oxidative stress and apoptosis. Chem. Biol.
Interact. 316, 108935 .
• Rabiee N., Yaraki M.T., Garakani S.M., Garakani S .M., Ahmadi S., Lajevardi A., Bagherzadeh
M., Rabiee M., Tayebi L., Tahriri M. și Hamblin M.R. , 2020. Recent advances in porphyrin –
based nanocomposites for effective targeted imaging and therapy. Biomaterials . 232, 119707 .
• Rajora M.A., Lou J.W. H. și Zheng G. , 2017. Advancing porphyrin’s biomedical utility: Via

58
supramolecular chemistry. Chem. Soc. Rev . 46, 6433 -6469.
• Ranmadugala D., Ebrahiminezhad A., Manley -Harris M., Ghasemi Y. și Berenjian A. , 2018.
Magnetic immobilization of bacteria using ir on oxide nanopa rticles. Biotechnol. Lett. 40, 237-
248.
• Roca A.G., Gutiérrez L., Gavilán H., Fortes Brollo M.E., Veintemillas -Verdaguer S. și Morales
M. del P. , 2019. Design strategies for shape -controlled magnetic iron oxide nanoparticles. Adv.
Drug Deliv. Rev. 138, 68 -104.
• Sandland J., Malatesti N. și Boyle R. , 2018. Porphyrins and related macrocycles: Combining
photosensitization with radio – or optical -imaging for next generation theranostic agents.
Photodiagnosis Photodyn Ther. 23, 281 -294.
• Shah A., Mank us C.I., Vermil ya A.M., Soheilian F., Clogston J.D. și Dobrovolskaia M.A. ,
2018. Feraheme® suppresses immune function of human T lymphocytes through
mitochondrial damage and mitoROS production. Toxicol. Appl. Pharmacol. 350, 52‐63.
• Shah S.T., Yehye W.A., S aad O., Simaran i K., Chowdhury Z.Z., Alhadi A.A. și Al -Ani L.A. ,
2017. Surface functionalization of iron oxide nanoparticles with gallic acid as potential
antioxidant and antimicrobial agents. Nanomaterials . 7, 306 .
• Thoidingjam S. și Tiku A.B. , 2017. New d evelopments in breast cancer therapy: Role of iron
oxide nanopar ticles. Adv. Nat. Sci. Nanosci. Nanotechnol. 8, 023002 .
• Tian J. și Zhang W. , 2019. Synthesis, self -assembly and applications of functional polymers
based on porphyrins. Prog. Polym. Sci. 95, 6 5-117.
• Vakili -Ghartavol R., Momtazi -Borojeni A.A., Vakili -Gharta vol Z., Aiyelabegan H.T., Jaafari
M.R., Rezayat S.M. și Arbabi Bidgoli S. , 2020. Toxicity assessment of superparamagnetic iron
oxide nanoparticles in different tissues. Artif. Cells, Nanomedic ine, Biotechnol. 48, 443-451.
• Vangijzegem T., Stanicki D. și Lau rent S. , 2019. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug
delivery: applications and characteristics. Expert Opin Drug Deliv . 16, 69 -78.
• Veiseh O., Gunn J.W. și Zhang M. , 2010. Design and fabr ication of magnetic nanoparticles for
targeted drug delivery and imaging. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 284-304.
• Wahajuddin și Arora S. , 2012. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles: Magnetic
nanoplatforms as drug carriers. Int. J. Nanomedicine . 7, 3445 -3471.
• Wu K., Su D., Liu J., Saha R. și Wang J. -P., 2019. Magnetic nanoparticles in nanomedicine: A
review of recent advances. Nanotechnology . 30, 502003.

59
• Wu W., He Q. și Jiang C. , 2008. Magnetic Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis and Surface
Functionalizati on Strategies. Nanoscale Res. Lett. 3, 397-415.
• Wu W., Wu Z., Yu T., Jiang C. și Kim W.S. , 2015. Recent progress on magnetic iron oxide
nanoparticles: Synthesis, surface functional strategies and biomedical applications. Sci.
Technol. Adv. Mater. 16, 23501 .
• Xue X., Lindstrom A. și Li Y. , 2019. Porphyrin -Based Nanomedicines for Cancer Treatment.
Bioconjug. Chem. 30, 1585 -1603.
• Zhu L., Zhou Z., Mao H. și Yang L. , 2017. Magnetic nanoparticles for precision oncology:
theranostic magnetic iron oxide nanoparticle s for image -guided and targeted cancer therapy.
Nanomedicine . 12, 73-87.
• Zhu N., Ji H., Yu P., Niu J., Farooq M.U., Akram M.W., Udego I.O., Li H. și Niu X. , 2018.
Surface modification of magnetic iron oxide nanoparticles. Nanomaterials . 8, 1-27.
Capitole din c ărți:
• Dolphin D., 2012, Porphyrins and related compounds: the Fischer nomenclature În: Dolphin
D. (eds) The Porphyrins V1: Structure and Synthesis, Part A, Elsevier , 4-9.
• Heinze T., Liebert T., Heublein B. și Hornig S, 2006, Functional polymers based on dextran,
În: Klemm D. (eds) Polysaccharides II. Advances in Polymer Science, 205. Springer, Berlin,
Heidelberg, 199-291
• Laffon B., Fernández -Bertólez N., Costa C., Brandão F., Teixeira J.P., Pásaro E. și Valdiglesias
V., 2018. Cellular and molecular to xicity of iron oxide nanoparticles. În: Saquib Q., Faisal M.,
Al-Khedhairy A., Alatar A. (eds) Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles. Adv.
Exp. Med. Biol. 1048 , Springer, Cham , 199-213
• Yu X. și Ji Z., 2017. Grain Boundary in Oxide Scale During High -Temperature Metal
Processing. În: Tanski T, și Borek W . (eds). Study of Grain Boundary Character . IntechOpen .
59-78
Cărți :
• McNaught A.D. și Wilkinson A., 1997. Compendium of chemical terminology. Blackwell
Science Oxford ,

60
Pagini web:
• https://www.who.int/en/news -room/fact -sheets/detail/cancer
• https://www.cancer.gov/about -cancer/understanding/what -is-cancer
• http://nsdl.niscair.res.in/jspui/handle/123456789/762
• https://shop.porphychem.co m/5-10-15-20-tetra-4-sulfonatophenyl -porphyrin –
tetraammonium.html
• https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma –
aldrich/artic les/protocols /biology/roche/metabolization -of-mtt.png