Arhitectura Intracelulară

Capitolul 1

Arhitectura intracelulară

1.1.Membrana celulară

Membrana celulară este un termen folosit pentru orice membrana dintr-o celulă.Membrana celulară are funcție de barieră și este o structură plană cu grosimea cuprinsă între 6nm și 10nm.Plasmalema masoară aproximativ 80Ȧ.Membranele au încărcătură electrică sunt polarizate prin prezența componentei glucidice astfel la interior sunt încărcate negativ iar la exterior au încărcătură pozitivă.Toate organitele unei celule sunt delimitate de o membrană.

Arhitectura tuturor membranelor celulare atât plasmatice cat si cea a organitelor prezintă drept caracteristică comună asamblarea prin legaturi necovalente a lipidelor si proteinelor. Membranele celulare au rolul de a compartimenta interiorul celulei,dar si rolul de a separa mediul intracelular de cel extracelular.In interiorul celulei membranele delimitează:reticulul endoplasmic ,aparatul Golgi,mitocondriile,nucleul,peroxizomii,lizozomii,ribozomii.

Membranele care delimitează organitele se numesc endomembrane.Membrana e alcătuită din membrana propriu-zisă și componentele atașate ei :glicocalixul,învelișurile mucoase și membranele bazale.(N.Avram și colab., 1980)

Membrana celulară este formată dintr-un bistrat fosfolipidic in care sunt inclavate proteine.Structura sa este cea a "mozaicului fluid"(Singer Nicolson 1972).Conform modelului Singer și Nicolson care mai este numit și "modelul mozaicului fluid"astfel se postuleză faptul că membranele sunt formate dintr-un dublu strat lipidic in care lipidele se afla în stare de cristal lichid.Printre lipidele în stare de cristal lichid se află proteine.Și lipidele și proteinele sunt libere în plan membranar și sunt dispuse sub formă de mozaic.Structura semifluida a membranei este dată de deplasarea lipidelpr și proteinelor în planul membranei.Bistratul fosfolipidic este fluid doar în anumite condiții de temperatura astfel se face trecerea de la faza de gel la faza de cristal lichid.Componentele de baza sunt lipidele si proteinele.Glucidele nu se găsesc separat ci in combinații cu lipide sau proteine formând:glicolipide si glicoproteine.Lipidele reprezinta o clasă de hidrocarbonati de origine biologică.Lipidele care intră in alcatuirea membranelor sunt:fosfolipidele,colesterolul si forme moleculare complexe(glicolipide si lipoproteine).Raportul lipide-proteine diferă în funcție de rolul pe care îl indeplinește membrana.

Lipidele se organizează in structuri numite bistraturi.Lipidele au rol în:structura membranelor celulare,în controlul transportului moleculelor prin membrana plasmatică,au rol energetic,rol în structura hormonilor.Fosfolipidele au în alcatuirea lor o grupare fosfat,sunt formate dintr-o moleculă de glicerol care are doua grupări hidroxil esterificate cu doua parti de acizii grasi.După fosfolipide a doua clasă de lipide membranare ca abundenta sunt sfingolipidele.

Sfingolipidele sunt structuri lipidice mai complexe:lipoproteine,glicolipidele.Glicolipidele se împart in :glicolipide neutre si gangliozide.In membrana celulelor eucariote se gaseste o cantitate mare de colesterol,unei molecule de colesterol îi corespunde o moleculă de fosfolipid. Colesterolul este o molecula cu structură amfifila adica deține un capăt hidrofil si un capăt hidrofob.

Moleculele de colesterol influențează fluiditatea membranei plasmatice ,acestea inserandu-se între moleculele de fosfolipide.La temperaturi de 37 de grade Celsius fluiditatea membranei începe sa se micșoreze.Pentru ca la temperaturi mai mici fluiditatea membranei să fie menținută de colesterol.El influențeaza atât fluiditatea cât și permeabilitatea membranelor plasmatice.Făra colesterol membranele devin fragile iar organismul care prezintă astfel de membrane nu poate supraviețui,are viabilitate scazută.

Fosfolipidele ce intra in alcătuirea celor două straturi din structura membranei celulare sunt molecule amfifile ,prezintă un cap hidrofil si două cozi hidrofobe.Aceste molecule sunt orientate astfel încat capatele hidrofile sa fie in exterior iar cozile hidrofobe sa fie in interiorul bistratului.Capetele hidrofile se mai numesc si grupari polare iar cele hidrofobe se numesc grupari nepolare.Proteinele ce intra în alcătuirea membranelor sunt responsabile de funcțiile membranelor.Cu cat membranele conțin mai multe proteine cu atât ele îndeplinesc mai multe funcții ,de exemplu:membrana mielinică are rolul de a proteja și de a acoperi neuronii.Aceasta membrana conține 18%proteine.

Diferitele membrane ale unor organite sau organisme conțin în raporturi diferite:proteine,lipide si glucide în unele glucidele pot lipsi.În funcție de topografia lor proteinele se împart în două clase:proteine extrinseci se afla pe o fața și pe alta a membranei și proteine intrinseci sunt inserate în membrana plasmatica..Proteinele intrinseci sau proteine intergrate in membrana ,transmembranare sunt greu de îndepartat ,îndepartarea se realizeaza cu detergenți si solvenți organici.

Proteinele inclavate pot sa străbată toată membrana sau să fie inclavate parțial,cele care străbat total membrana se numesc proteine transmembranare.

Proteinele extrinseci sau proteine membranare periferice sunt ușor de îndepartat din bistrat cu ajutorul electroliților si agenților chelatori.Proteinele extrinseci sunt mai abundente pe fața internă a membranei plasmatice și interacționeaza cu citoscheletul celular.Proteinele intrinseci pot să strabată o dată sau de mai multe ori membrana celulara,Orientarea proteinelor transmembranare determină asimetria membranelor plasmatice.

Asimetria membranelor este determinată de asimetria proteinelor membranare.Existența lanțurilor glucidice și a grupărilor sulfhidril din proteinele membranare dau asimetrie membranelor celulare.În alcatuirea membranei intra si proteine cu funcție de receptori care funcționeaza ca senzori ai semnalelor externe care determină modificarea activității celulei ca raspuns la semnalele recepționate de la alte celule.

Comunicarea între celule este menținută prin semnale moleculare extracelulare .Unele semnale acționeaza pe distanțe lungi iar altele doar in apropiere.Proteina receptor fixează ligandul.Receptorii pot recunoaște substanțe din afara organismului denumite substanțe exogene dar și substanțe sintetizate în interiorul oraganismului numite substanțe endogene.

Liganzii reprezintă semnale chimice pe care receptorii de pe suprafata membranei îi recunosc si îi transmit in interiorul celulei.

Proteinele Carrier îndeplinesc funcție de transport,acestea transportă:ioni,aminoacizi de pe o față pe alta a membranei. Proteinele canal asigură trecerea ionilor de pe o față pe cealaltă a membranei.Exista proteine care au rolul de a ancora citoscheletul si proteine de adeziune.

Proteinele au mobilitate în bistrat:pot executa mișcari de rotație în jurul propriului ax sau pot efectua mișcari în planul bistratului.Mobilitatea proteinelor membranare a fost pusă în evidență prin tehnici de fluorescență s-a constatat că 30-90% din proteinele membranare se deplasează în planul membranei.Datorită faptului că lipidele sunt molecule hidrosolubile acestea conferă impermeabilitate bistratului.În funcție de raportul dintre lipide si proteine membranele celulare sunt clasificate în mai multe tipuri:membrana plasmatica/plasmalema are o structură bidimensională și separă celula de mediul extracelular ,membrana internă este prezentă doar la celulele eucariote,are grosimea maximă de 6nm și are rolul de a compartimenta interiorul celulei ,delimitează diferitele organite celulare astfel reacțiile biochimice se pot realiza corespunzător.

La nivelul lizozomului se realizează degradarea macromoleculelor ,acestea pot fi din afara sau din interiorul celulei exemplu:lipide sau proteine.

Membrana externă are un ph acid datorita prezenței pompei de protoni care asigura acest ph.

Membranele speciale au particularitați structurale,de exemplu:teaca de mielină a celulelor Schwann.Deriva din membrana plasmatică a celulelor Schwann.

Capacitatea de autoasamblare a moleculelor membranei plasmatice a fost studiată pe membrane artificiale acestea au aceeasi compoziție moleculară.Prin plasarea fosfolipidelor de sinteză într-un mediu apos acestea se vor orienta astfel încât capătul lor hidrofob să nu fie în contact cu apa.Prin orientarea fosfolipidelor în mediul apos se realizează procesele de reînnoire și refacere a membranei plasmatice.În funcție de concentrația lor în bistrat,fosfolipidele artificiale formează două tipuri de structuri:micele atunci când fosfolipidele se află în concentrație mică și bistrat atunci când fosfolipidele sunt în concentrație mare.În cazul unei concentrații mari de fosfolipide în mediul apos lipidele formează dublul strat lipidic și închid în interior un compartiment apos în care pot fi adăugate medicamente,structura care se formează poartă denumirea de lipozom și aceste structuri sunt utilizate în farmacologie.

Membranele celulare sunt structuri dinamice,fluide .Fluiditatea membranelor depinde de mișcările fizico-chimice necovalente și de cele realizate de fosfolipide și proteine în bistrat.Aceste mișcări sunt:mișcări de rotație în jurul axului,mișcări în planul membranei și mișcări de flip-flop(de pe un strat pe altul al membranei).Fosfolipidele realizează rar mișcări de tip flip-flop iar la proteine aceste mișcări sunt inexistente.

Organitele celulare dețin membrane cu mecanisme de import si mecanisme de încorporare in organite a unor proteine specifice.Cele mai abundente fosfolipide din membranele celulare sunt fosfogliceridele.Lipidele membranare formează o barieră care menține concentrația solutiilor din citosol care este diferită față de cea extracelulară sau față de cea din alte organite celulare.În membrana celulara se găsesc diferite canale pentru ioni,acestea permit trecerea ionilor din interiorul celulei catre mediul extrecelular sau din mediul extracelular in interiorul celulei in funcție de concentratia ionilor.

Asadar membrana are permeabilitate selectiva,permite doar trecerea anumitor ioni anorganici dar nu si a celorlalti.Rolul canalelor ionice este acela de a permite ionilor să difuzeze rapid prin bistratul lipidic.Ionii pozitivi care difuzează prin bistrat sunt ionii de:calciu,sodiu,potasiu iar cei negativi sunt de exemplu ionii de clor.In general concentrația de potasiu din interiorul celulei este de 10-30 de ori mai mare decât in afara celulei.

Prin intermediul membranelor este reglat transportul :gazelor,nutrientilor,apei si ionilor.Tot prin intermediul membranei sunt exportati in afara celulei produsii si moleculele deteriorate,sunt eliminati ionii toxici.Membranele sunt implicate in: acumularea de nutrienți,transport energetic,de reproducere si locomotie.

Înțelegerea organizării și funcționării membranei celulare s-a realizat prin :difracție cu raze X,măsurarea tensiunii superficiale a membranei,RMN și prin microscopie electronică.

(Alberts și colab.,2008 , G. Zarnea si O.V. Popescu,2013)

În Figura 1 este prezentată structura membranei plasmatice alcătuită dintr-un dublu strat fosfolipidic,în straturile de lipide sunt inclavate proteine ,acestea pot să strbată bistratul sau să fie inclavate parțial .Proteinele pot să străbată de mai multe ori bistratul.În strucuta membranei sunt integrate și proteine periferice.În exteriorul membranei se află structuri glucidice care formează glicocalixul.Capetele polare ale lipidelor sunt orientate către exterior iar cele nepolare către interior.

Figura 1 Structura membranei plasmatice www.qreferat.com

1.2.Citoplasma

Citoplasma celulară este un sistem format din: glucide,proteine,lipide,apă și substanțe minerale.La celulele tinere citoplasma este densă,omogenă,se colorează intens și aderă de peretele celular.Iar la celulele bătrâne citoplasma capătă o structură granulară cu vacuole,se retrage de peretele celular și are afinitate scăzută pentru coloranți.

Citoplasma e situată sub membrana plasmatică a celulei și conține organitele celulare:nucleu ,ribosomi,incluziuni,vacuole,mitocondrii,reticul endoplasmatic.La nivelul citoplasmei se realizează reînnoirea permanentă a structurii.

Corticala celulară reprezintă o zonă de ordinul nanometrilor din citoplasmă care tapetează pe interior membrana plasmatică .Este o zonă mai densă din citoplasmă ,are o concentrație mai mare de molecule:proteine,glicoproteine.La acest nivel se stabilesc relații între citoscheletul celular și membrana plasmatică.

Citoplasma exercită un control asupra nucleului.Prin transplantarea unui nucleu în alt mediu citoplasmatic ,nucleul suferă modificării în ceea ce privește activitatea genelor modificările sunt datorate mediului citoplasmatic nou în care este plasat nucleul.Acest proces care cuprinde modificările de la nivelul nucleului se numește reprogramare nucleară.

(Zărnescu O.,1999)

Citoscheletul este întâlnit în citoplasma celulelor eucariote,animale.Este alcătuit din: microtubuli de tubulină,microfilamente de actină și filamente intermediare extinse de la nucleu până la interiorul membranei plasmatice în tot citosolul.Tubulina și actina sunt proteine contractile au rol în menținerea formei celulei,rol mecanic.Toate filamentele din citoschelet au proprietății:dinamice,mecanice și biologice diferite dar toate aceste filamente funcționează împreună ca un sistem pentru ca citoscheletul pe care îl alcătuiesc să poată realiza funcțiile sale în celulă.Cele trei tipuri de filamente interacționează cu alte proteine și determină menținerea formei interne a celulei,dau formă și modelează suprafața celulei.Au rol în mutarea organitelor dintr-un loc în altul și cand s-au apropiat filamentele însele se muta într-o nouă locație.Citoscheletul determină arhitectura citoplasmei ,dă o anumită formă celulei și determină capacitatea de pinocitoză a celului.

Citoscheletul are rol în atașarea unor agregate de enzime de alte enzime astfel îmbunătățește circulația metaboliților,este implicat în procese de la nivelul suprafeței celulare. Filamentele din alcătuirea citoscheletului au roluri diferite.Filamentele intermediare au putere mecanică,microtubulii au rol în transportul organitelor și determină poziția lor.Filamentele intermediare se găsesc pe suprafața internă a anvelopei nucleare ,protejează ADN-ul celulei și sunt împachetate în așa fel încât pot menține celulele epiteliale împreună.Filamentele de actină dau formă celulei și determină locomoția întregii celule.Toate filamentele sunt interconectate prin proteine.Datorită faptului că filamentele sunt dinamice celula este capabilă să răspundă rapid la anumite evenimente.

Citosolul reprezintă matricea citoplasmatică,este partea fluidă din citoplasmă,lipsită de particule.Citoscheletul este dinamic și se poate adapta.Datorită dinamicii și asamblării filamentelor celulele eucariote pot să construiască un număr mare de structuri.

Filamentele de actină sunt responsabile de legarea de substrat,avand rol contractil permite astfel contracția mușchilor.Aceste filamente de actină intră în alcătuirea unor structuri de tipul:lamelipodii,filopodii,microvili și stereocili.Tropomiozina este o proteină contractilă care se leagă de șapte subunități de actină.Această legare a tropomiozinei cu actina previne interacția filamentelor cu alte proteine .Tropomiozina are rol important în contracția mușchilor.Filamentele citoscheletului se leagă de centromerul cromozomilor realizând astfel poziționarea lor în placa metafazică și distribuirea lor corectă în următoarele etape ale diviziunii celulare ,în anafază cromozomii sunt repartizați în mod egal prin intermediul filamentelor fusului de diviziune în cele două celule fiice care se vor forma după ce va avea loc și separarea citoplsmei în două, proces numit citochineză.Prin urmare filamentele citoscheletului au rol și în procesul de diviziune celulară.Atât filamentele de actină cât și microtubulii pot forma polimeri necovalenți.

Moleculele de actină și tubulină au funcție enzimatică pot cataliza hidroliza de ATP sau GTP.Subunitățile filamentelor fiind mici ele pot fi transportate rapid prin citoplasmă pe când în stare asamblată (sub formă de filamente)sunt greu de transportat.Filamentele sunt dezasamblate în subunității mici care sunt transportate în altă regiune a celulei în citoplasmă și apoi sunt reasociate formând alte filamente .Structura diferită a subunităților și diferența forței de atracție dtermină proprietăți diferite ale fiecărui tip de filament.

Proteinele reglatoare legate de subunitățile filamentelor determină:modul de asamblare al subunitaților,forța filamentelor,modul de legare al filamentelor de anumite organite sau structuri celulare.Prin aceste proteine semnalele extracelulare și intracelulare acționează asupra activității citoscheletului.Proteinele legate de subunitățile filamentelor citoscheletului mențin organizarea celulei dar și mobilitatea acesteia și a organitelor sale.

Toate aceste filamente și molecule alcătuiesc citoscheletul care reprezintă o rețea

conținută în citoplasmă cu rol în dinamica organitelor,în procesele de diviziune și în menținerea formei celulei ,determină structura interioară a celulei alături de citosol .Citosolul și citoscheletul formează citoplasma .

1.3. Nucleul

Nucleul este cel mai mare organit din celula eucariota,este înconjurat de anvelopa nucleară .Anvelopa nucleară separă interiorul nucleului de citosol,ea este alcătuită din două membrane:membrana externă și membrana internă.Cele două membrane sunt străbătute de pori. Acești pori se numesc pori nucleari și reprezintă 10% din anvelopa nucleară.Conținutul în proteine al celor două membrane diferă, astfel în membrana internă se gasesc proteine cu rol în ancorarea cromatinei.Membrana externă se continuă cu membrana reticulului endoplasmic rugos.Această membrană conține ribosomi cu rol în sinteza proteică.Spațiul dintre cele două membrane ale nucleului se continuă cu lumenul reticulului endoplasmic rugos.Proteinele produse de ribosomi sunt transportați în spațiul dintre membrana internă și cea externă.Sub membrana internă a nucleului se află nucleoplasma alcătuită din : cromatină ,bogată în ADN și nucleoli .Nucleoli conțin ARN la acest nivel se sintetizează cea mai mare parte a ARNr.Replicarea și transcrierea sunt procese ce au loc în nucleu.

Prin porii nucleari se realizează un trafic bidirecțional între citosol și nucleu.În citosol sunt produse:histone,ADN și ARN polimerazele,proteine reglatoare ale genelor,proteine care procesează ARN toate aceste proteine sunt transportate din citosol în nucleu.ARNt și ARNm sunt sintetizate în nucleu și transportate în citosol .Odata ajunse în citosol moleculele de ARNt și ARNm are loc traducerea ARNm în proteine.Anvelopa nucleară conține 3000-4000 de pori nucleari.Prin fiecare por nuclear sunt transportate 500 de macromolecule pe secundă.Dimensiunea moleculelor influențează viteza lor de transport prin porii nucleari.Moleculele mici difuzează repede în timp ce moleculele mari sunt transportate mai lent ,cu cât moleculele sunt mai mari cu atât sunt transportate mai lent .

Datorită faptului că moleculele prea mari din citosol nu pot străbate porii nucleari se menține o compoziție diferită a proteinelor din citosol față de cele din nucleu.

Informația genetică este transmisă de la celula mamă la celulele fiice prin diviziune și de la o generație la alta prin intermediul celulelor reproducătoare .Informația genetică este conținută în gene și determină caracteristicile unei specii sau ale unui individ.

Informația genetică este reprezentată de macromolecula de ADN .ADN-ul asociat cu proteine (histone sau non-histone) formează fibra de cromatină.ADN-ul este împachetat pentru a avea loc în celulă .Pentru a fi împachetat ADN-ul parcurge mai multe stadii de împachetare.Primul stadiu este acela de nucleosom în care un miez histonic care este format din opt molecule de histone câte doua din fiecare tip:H2A,H2B,H3 și H4 este înconjurat de două ori de un segment de ADN.La om fiecare cromozom conține milioane de nucleosomi.Al doilea stadiu de împachetare este fibra de cromatină de 30 de nm.Este de trei ori mai groasă decât înșiruirea nucleosomilor și se numește solenoid(cuprinde 10-12 nucleosomi împachetați).

Stadiul al treilea este acela de fibră de cromatină de 700nm se formează prin răsucirea fibrei de 30nm în jurul unei structuri de proteine non-histonice.

Stadiul al patrulea este cel de cromozom metafazic are 1400 de nm.Cromozomii conțin genele ,anumite regiuni ale cromozomilor sint mai bogate în gene iar altele mai sărace.Gena este un segment al macromoleculei de ADN format dintr-o secvență de nucleotide.Cromozomul 11 conține cele mai multe gene aproximativ 15000 de gene.

Se consideră că la om există aproximativ 30000 de gene,o genă nu codifică o singură proteină ci poate codifica mai multe proteine .Cromozomul reprezintă cromatina condensată ,în această stare de condensare cromozomii sunt vizibili la microscopul optic.

Cromozomii conținuți în nucleu parcurg mai multe faze în timpul diviziunii celulare .În profază are loc condensarea cromatinei se vor forma cromozomii,în metafază cromozomii se dispun în placa metafazică pentru ca în anafază cromozomii să migreze la cei doi poli ai celulei ,în telofază se decondensează cromatina.Dupa diviziunea nucleului numită cariochineză are loc și diviziunea citoplasmei numită citochineză și se formează două celule fiice .

(Alberts și colab.,2008, G. Zarnea si O.V. Popescu ,2013,)

1.4.Reticulul endoplasmic

Reticulul endoplasmic este o structură caracteristică celulelor vegetale și animale,este alcătuit din membrane.Membranele reticulului endoplasmic prezintă o organizare similară tuturor membranelor,sunt formate dintr-un dublu strat fosfolipidic.Reticulul endoplasmatic este un organit celular localizat în citoplasmă în apropierea nucleului având rol datorită prezenței ribosomilor în prelucrarea informației genetice.

Este format din cisterne care comunică între ele,acestea sunt structuri rezultate prin plierea membranei.Între membrane se află un spațiu care se numește lumen acesta se gasește în continuarea spațiului dintre membrana nucleară internă și membrana nucleară externă.La microscopul electronic se evidențiază două tipuri de reticul endoplasmic:

reticul endoplasmic rugos (RER)se numește astfel deoarece prezintă pe membrana externă ribosomi și reticul endoplasmic neted (REN) nu prezintă ribosomi pe suprafața lui.

Reticululu endoplasmic este format dintr-o rețea de tubuli și zone dilatate ,saciforme aplatizate.

O Parte din reticulul endoplasmic reprezintă reticulul endoplasmic rugos și o parte reticulul endoplasmic neted.Diferitele regiuni din reticulul endoplasmic s-au specializat pentru a îndeplini anumite funcții,mai ales reticulul endoplasmic rugos .Unele regiuni din reticulul endoplsmic sunt specializate în stocarea calciului.Pompele ionice sunt implicate în transportul ionilor de calciu din citosol în lumenul reticulului endoplasmic.

Dacă există calciu în concentrație mare în retticul ,el este legat de proteine și depozitat în reticulul endoplasmic.

Reticulul endoplsmatic rugos și cel neted îndeplinesc funcții diferite în celulă.Astfel reticulul endoplasmatic rugos are rol în sinteza de proteine,sunt produse proteine care vor fi exportate în citosol cât și proteine care intră în structura organitelor.Proteinele produse intră în structura membranelor organitelor:aparat Golgi,lizozomi,membrana plasmatică .

Reticulul endoplasmic rugos reprezintă locul asamblării proteinelor și verificării corectitudinii asamblării lor.Dezvoltarea reticulului endoplasmic neted este mai restrânsă decât cea a reticulului endoplasmic rugos.

Reticulul endoplasmatic neted are rol în sinteza lipidelor,colesterolului și acizilor grași.cele două tipuri de reticul endoplasmic nu sunt delimitate clar între ele există o comunicare funcțională.Hepatocitele sunt celule care conțin o cantitate mare de reticul endoplasmatic neted.În reticulul endoplasmatic neted sunt sintetizate fosfolipidele care se vor insera în dublul strat lipidic pentru a forma structura membranei reticulului.

În reticulul endoplasmic rugos sunt produse proteine care intră în structura mitocondriilor și a cloroplastelor. În membrana reticulului endoplasmatic neted sunt sintetizate enzime aceste enzime au rol în desfășurarea reacțiilor metabolice și în reacțiile de detoxifiere .În reacțiile de detoxifiere foarte importante sunt enzimele din familia citocrom P450.Prin reacțiile de detoxifiere sunt eliminate medicamente și compuși toxici din celulă.Datorită prezenței ribosomilor pe suprafața reticulului endoplasmatic rugos ,acesta are rol în procesul de traducere a ARNm .Proteinele care urmează să se formeze în urma traducerii sunt transportate prin membrana reticulului endoplasmatic rugos cu ajutorul unor proteine-translocon.Pentru ca procesul de translocare să se poată realiza translocatorul se asociază cu proteine accesorii.Asimetria membranei reticulului endoplasmatic este dată de orientarea proteinelor pe membrana externă a reticulului astfel modul în care o proteină proaspăt sintetizată este inserată în membrana reticulului determină orientarea proteinei în toate membranele reticulului. (Alberts Molecular biology of the cell 5th , Dictionarul de microbiologie generala si Biologie moleculara, autori G. Zarnea si O.V. Popescu,)

1.5.Aparatul Golgi

Aparatul Golgi este un organit al celulei eucariote este denumit astfel după numele cercetătorului care l-a descoperit.Acest organit se aseamănă ca structură și funcție cu reticulul endoplasmic deoarece și aparatul Golgi este format din structuri saciforme turtite dispuse în stive ele se numesc cisterne.Aparatul Golgi este o structură vizibilă la microscopul electronic.

Fiecare stivă cuprinde câteva cisterne,numărul lor variază în funcție de celulă.

Cu cât celula desfășoară o activitate mai complexă cu atât crește numărul și dimensiunea cisternelor.În celulele cu activitate secretoare mare numărul cisternelor este de câteva sute.Spațiul care se află între cisterne se numește lumen al aparatului Golgi.O stivă prezintă trei regiuni care îndeplinesc funcții diferite.

Prima regiune este regiunea cis care are formă convexă.Această regiune cuprinde membrane ce delimitează tubuli în regiunea cis ajung vezicule cu lipide și proteine produse în reticulul endoplasmic.Regiunea cis se află în apropierea reticulului endoplasmic.

A doua regiune este regiunea mediană urmată de cea de-a treia regiune numită regiune trans.În regiunea mediană cisternele sunt aproape drepte și au dimensiuni mai mari decât în celelalte regiuni.

Aparatul Golgi este un complex de membrane prin care sunt transportate proteine .Sensul de transport al proteinelor prin aparatul Golgi este dinspre reticulul endoplasmatic apoi proteinele ajung în regiunea cis după care trec prin regiunea mediană și ajung în final în regiunea trans.Pe parcursul deplasării proteinelor prin aparatul Golgi ele interacționează cu enzime diferite conținute în cele trei zone ale aparatului Golgi.Fiecare zonă din aparatul Golgi conține enzime diferite față de celelalte zone ,enzimele îndeplinesc funcții diferite .

Sunt transportate:proteine care vor fi secretate extracelular,proteinele care intră în structura membranelor,proteine de pe suprafața celulelor,enzime lizozomale și enzime din complexul Golgi.Veziculele din reticulul endoplasmatic ajung în regiunea cis a aparatului Golgi ,conținutul lor este transportat prin aparatul Golgi până în regiunea trans de unde sunt eliminate în afara aparatului Golgi printr-un alt set de vezicule de transport produse în regiunea trans.Transportul moleculelor de la aparatul Golgi către membrana plasmatică se numește transport antrograd.

Când în urma acestui transport veziculele ajung la membrana plasmatică și fuzionează cu aceasta vărsându-și conținutul prin exocitoză la exteriorul celulei ,membrana veziculei provenită din reticulul endoplasmatic intră în componența membranei plasmatice. Pentru a se putea forma noi vezicule o parte din produșii transportați:lipide și proteine sunt reciclați prin transport retrograd de la aparatul Golgi la reticulul endoplasmic.

Aparatul Golgi are rol în prelucrare,după ce veziculele provenite din reticulul endoplasmatic fuzionează cu aparatul Golgi și sunt transportate prin acesta conținutul lor e modificat apoi transportat prin al doilea set de vezicule (formate în regiunea trans a aparatului Golgi) către destinațiile finale respectiv deferite organite celulare și membrane celulare inclusiv membrana plasmatică.La nivelul aparatului Golgi are loc glicozilarea proteinelor cu ajutorul enzimelor din cele trei regiuni ale aparatului Golgi.

În funcție de destinația lor finală proteinele sunt sortate la nivelul regiunii trans în vezicule diferite de transport.După ieșirea din aparatul Golgi o parte din vezicule suferă exocitoză iar altele vor forma vezicule de secreție.Aparatul Golgi are rol în procesul de reciclare a membranei plasmatice prin includerea unor părți din ea în vezicule ce se vor întoarce la aparatul Golgi și vor fuziona cu acesta.

Aparatul Golgi este implicat în sinteza polizaharidelor și în formarea lizozomilor și a veziculelor de secreție. Acest organit îndeplinește un rol intermdiar între reticulul endoplasmic și membrana plasmatică sau celelalte organite.Este localizat în citoplasmă în proximitatea reticulului endoplasmic.( G.Zarnea si O.V.Popescu,2013)

Figura 2 www.rasfoiesc.com

Figura 2 prezintă un sistem de membrane ce alcătuiesc Aparatul Golgi cu rol în tramsportul veziculelor.Este alcătuit din 3 părți : o parte cis ,una mediană și o parte trans.

1.6.Ribosomii

Ribosomii reprezintă un complex de enzime cu rol în realizarea traducerii,în sinteza proteică pornind de la ARNm. Baza procesului de sinteză a proteinelor în ribosomi este transferul polipeptidelor. Ribosomi prezintă un situs de legare pentru ARNm(mesager) și trei situsuri de legare pentru ARNt(de transfer).Ribosomii sunt formați din două subunități ribosomale :subunitatea mare și subunitatea mică ,ambele conțin ARNr(ribosomal)și proteine ribosomale.Unii factori proteici catalizează diferite etape ale sintezei proteice legându-se tranzitoriu de ribosomi.Traducerea corespunzătoare a codului genetic este importantă pentru producerea de proteine funcționale care își pot realiza funcțiile în celulă.

(http://www.sciencedirect.com.ux4ll8xu6v.useaccesscontrol.com/,http://www.sciencedirect.com.ux4ll8xu6v.useaccesscontrol.com/)

Unii dintre ridosomi sunt localizati la nivelul reticulului endoplasmatic rugos și au rol în traducerea ARNm.Prin traducere nu se realizează o corespondență directă intre o nucleotidă și un aminoacid dintr-o proteină.Secvența de nucleotide a unei gene din ARNmeste tradusă într-o secvență de aminoacizidintr-o proteină conform codului genetic.

Grupuri de câte trei nucleotide din ARNm formează codoni,codonii pot funcționa ca repere pentru inițierea traducerii:AUG,AAA

Codonii stop sunt implicații în oprirea traducerii,aceștia sunt:UAA,UAG.UGA.Traducerea ARNmesager depinde de molecule adaptor care se leag[ cu o parte de codon și cu o altă parte de aminoacid.Aceste molecule adaptoare sunt reprezentate de molecule de ARNt(de transfer) care au câte 80 de nucleotide.Moleculele de ARN de transfer au formă de trifoi.La nivelul capătului 3' al ARNt se atașează aminoacidul (Fenilalanină: Phe)iar la nivelul uneia din buclele ARNt se află anticodonul care reprezintă o succesiune de trei nucleotide complementare cu codonul din ARNm.Unii aminoacizi au mai multe molecule de ARNt atașate.Pentru a se asigura traducerea corectă a ARNm în proteine proces ce are loc în ribosomi, sunt necesare aproximativ 50 de proteine ribosomale diferite și molecule de ARN alcătuind un complex catabolic.În citoplasmă celulele eucariote conțin milioane de ribosomi.

Ribosomii pot fi liberi în citoplasmă sau atașați de reticulul endoplasmic.Subunitățile ribosomale sunt asamblate cu proteine sintetizate.Un ribosom format din cele două subunității ribosomale are o masă moleculară de câteva milioane de daltoni.Subunitatea mică oferă cadrul de citire unde ARNt se potrivește cu codonii ARNm.

La nivelul subunității mari se formează legături peptidice și aminoacizii sunt legați formând lanțuri polipeptidice.Când nu sintetizează proteine subunitățile ribosomale nu sunt asamblate.Moleculele de ARNt așează fiecare aminoacid la capătul lanțului polipeptidic.

Atunci când apare un codon stop proteina este eliberată și subunitățile se separă.Apoi se atașează o altă moleculă de ARNm cu cele două subunității ridosomale și este sintetizată o altă proteină.Ribosomul conține trei situsuri pentru ARNt ,acestea sunt numite:A-aminoacil,P-peptidil și E-exit și un situs pentru ARNm.Când începe sinteza proteinei sunt adăugați aminoacizi astfel lanțul polipeptidic este alungit.

Pe parcursul traducerii ribosomii se deplasează pe molecula de ARNm și nu invers.

ARNt leagă un aminoacid pe care îl aduce la nivelul situsului aminoacil (A)din subunitatea mare a ribosomului.

ARNr(ribosomal)e responsabil de poziționarea ARNt peste ARNm și formează legături polipeptidice.ARNr este localizat în centrul ribosomului iar proteinele ribosomale sunt localizate la suprafață ele au rol în stabilizarea ARNr.

1.7.Mitocondria

Mitocondriile sunt organite cu rol în producerea energiei implicată în metabolismul celulei.Sunt prezente în aproape toate celulele animale.Au dimensiuni cuprinse între 1-10µm lungime și un diametru de 0.5-1µm.Prin microscopie electronică George Emil Palade și Victor Sjostrand au stabilit ultrastructura mitocondriei prin studii efectuate independent.

Mitocondria prezintă două membrane:o membrană externă care este întinsă și o membrană internă aceasta este pliată formând creste mitocondriale.Între membrane se află spațiul intermembranar iar în interiorul membranei interne se găsește matricea mitocondrială.Datorită compoziției diferite în proteine și fosfolipide cele două membrane îndeplinesc funcții diferite.

În membrana externă există un raport egal de proteine și lipide această membrană manifestând o permeabilitate ridicată pentru molecule mici.În timp ce în membrana internă se realizează procesul enzimatic de fosforilare oxidativă iar raportul proteine:lipide este de patru ori mai mare în ceea ce privește proteinele.În membrana internă sunt localizate enzime cu rol în sinteza de ATP,în transportul ionilor,componente ale lanțului respirator.Enzimele implicate în reacția ATP+AMP rezultă o reacție de echilibru 2ADP.

Mitocondriile conțin ADN propriu,ribosomi și componente utilizate pentru sinteza proteinelor.Compartimentele delimitate de cele două membrane :spațiul intermembranar și matricea mitocondrială au compoziții diferite de proteine.Creșterea acestor organite depinde de importul de proteine sintetizate în alte organite.Proteinele produse în reticulul endoplasmatic de către ribosomi sunt exportate în citosol de unde sunt preluate de către mitocondrii cu ajutorul unor secvențe semnal.Secvențele semnal au rol important pentru importul și localizarea corespunzătoare a proteinelor în mitocondrie.Unele proteinele sunt plasate în matrixul mitocondrial.O proteină poate fi inclusă în matrixul mitocondrial după ce traversează cele două membrane.Există două complexe implicate în transportul secvenței semnal prin mitocondrie acestea sunt complexele:TOM și TIM.

Mai întâi complexul TOM transportă secvența semnal prin membrana externă apoi prin spațiul intermembranar unde se leagă de celălalt complex TIM.Lanțul polipeptidic intră în matrixul mitocondrial sau se inseră în membrana internă.Cele două complexe de transport al proteinelor pot funcționa și independent.La procariote responsabilă de producerea de ATP este membrana plasmatică dar la eucariote care sunt mai complexe membrana plasmatică a preluat alte funcții iar funcția de producere de energie a fost preluată de mitocondrii.Translocaza este un sistem de transport care are rol în schimbul dintre ADP și ATP.Aceste organite pot avea formă sferică,ovală chiar cilindrică.

Cea mai mare contribuție în producerea de ATP o are membrana internă a mitocondriei.

Etapele producerii de ATP : prima etapă e reprezentată de trasportul electronilor rezultații din oxidarea moleculelor sub acțiunea luminii, în membrană .În urma acestui transport de electroni se produce energie utilizată pentru a introduce protoni în membrană și pentru a produce un gradient electrochimic de protoni care este o formă de stocare a energiei.

În a doua etapă ATP sintetaza permite gradientului de protoni să inițieze producerea de ATP. Mitocondria a permis evoluția celulei animale care până la apariția mitocondriei era dependenta de glicoliza anaerobă pentru a produce ATP.Prin glicoliză este convertită glucoza în piruvat eliberându-se o cantitate mică de energie comparând cu ce cantitate s-ar produce prin oxidarea glucozei.Glicoliza era un mecanism de producere a energiei puțin eficient.Prin glicoliză anaerobă dintr-o moleculă de glucoză se produc două molecule de ATP.După oxidare completă a dioxidului de carbon și a apei se produc 36 de molecule de ATP.

În urma studiilor efectuate s-a constatat că mitocondriile sunt organite cu o mobilitate și plasticitate ridicată sunt capabile să-și modifice forma.În celulă mitocondriile formează o rețea.Celulele ficatului conțin între 1000 și 2000 de mitocondrii.Mitocondriile se pot fixa de microtubuli sau pot rămâne în locurile din celulă în care există un consum mare de ATP.În funcție de necesitățile energetice ale celulei crește și numărul mitocondriilor.

(Alberts și colab.,2008, G. Zarnea si O.V. Popescu,2013)

În figura 3 este ilustrată alcătuirea mitocondriei ,organit implicat în procesele de fosforilare oxidativă și în producerea de emergie sub formă de ATP.Mitocondria este delimitată de două membrane :membrana externă și membrana internă.Membrana externă este străbătută de pori. În interiorul membranei interne se află matricea mitocondrială.Spațiul dintre cele două membrane se numește spațiu intermembranar.

Mitocondria conține ADN mitocondrial acesta se transmite doar pe linie maternă,dar și ribosomii .ATP sintetaza are rol în producerea de ATP important în majoritatea proceselor biologice de la nivelul celulei.

Figura 3 www.anatomie romedic.ro

1.8.Lizozomi,Peroxizomi

Lizozomi sunt structuri membranare ce conțin în lumenul lor enzime hidrolitice implicate în digestia macromoleculelor,sunt structuri veziculare.

Enzimele conținute în lizozom pot fi:proteaze,lipaze,nucleaze,glicozilaze,fosfolipaze,

fosfataze și sulfataze.Lizozomul are în interior un ph acid de 4,5-5 care asigură o bună desfășurare a activității enzimelor.Membrana lizozomilor este alcătuită dintr-un singur strat de lipide iar lumenul organitului are caracter acid.

Lizozomi joacă un rol important în degradarea lipidelor,au rol de senzor metabolic.

Prin degradarea proteinelor,lipidelor și carbohidraților se formează :acizi,aminoacizi și piruvat.Acești compuși pot produce ATP implicat în metabolismul energetic.

Trigliceridele sunt cel mai frecvent întâlnite lipide din corpul uman și sunt depozitate în organite specializate .Aceste organite reprezintă cel mai important component implicat în liza adipocitelor,ele se întâlnesc în majoritatea tipurilor celulare:în hepatocite,neuroni,macrofage etc.În aceste organite hidroliza este realizată de trei lipaze.Expresia enzimelor metabolice și transportul proteinelor implicate în catabolismul lipidelor sunt reglate prin mecanisme transcripționale prin intermediul semnalelor :endocrine,paracrine și autocrine.

Lizozomi utilizează două mecanisme de degradare a substanțelor înglobate: prin endocitoză și prin autofagie.În urma procesului de endocitoză se formează endozomul.

Lizozomii conțin numeroase enzime hidrolatice : fosfataza alcalină,RN-ază,DN-ază și lipaze.

Degradarea veziculelor endozomale are loc în endolizozom structură formată prin fuziunea endozomului cu lizozomul. Proteinele membranare lizozomale sunt glicozilate astfel sunt protejate de acțiunea degradativa a proteazelor din lumenul lizozomului. Când majoritatea substanțelor au fost degradate organitul(lizozomul) devine mic și rotund și poate relua ciclul fuzinând cu un endozomul întârziat care nu diferă de un endozom, diferă doar momentul în care acesta fuzioneză cu lizozomul.

Procesul de autofagie implică două organite : autofagozomul și lizozomul .Autofagozomul reține substanțele care vor fi degradate de lizozom.Membrana autofagozomului conține molecule provenite din alte organite: reticul endoplasmic,mitocondrii,aparat Golgi și mambrana plasmatică.Pe parcursul formării membranei autofagozomului substanțele care urmează să fie degradate sunt reținute în receptori din membrană .Acesta este al doilea mecanism de degradare folosit de lizozom.Autofagia pe lânga rolul de a menține funcțiile de bază ale celulei în echilibru sau de a îndepărta componentele îmbătrânite ale celulei are rol în dezvoltare și sănătate.

Produșii finali ai digestiei cum sunt: aminoacizii și nucleotidele sunt transportate în citoplasmă unde celula îi poate reutiliza sau îi poate elimina .Pomparea de ioni de hidrogen în lizozom menține ph-ul acid al lumenului.Lizozomii sunt prezenți în toate celulele eucariote și variază ca formă și dimensiuni.La microscopul electronic lizozomii sunt evidențiați prin tehnici histochimice.Din punct de vedere morfologic lizozomii variază .Această diversitate morfologică reflectă multitudinea de funcții digestive pe care hidrolazele acide le mediază.

Moleculele ce urmează să fie degradate sunt transportate în vezicule către organite mici intracelulare cu formă neregulată,aici intră în contact cu hidrolazele lizozomale care ajung în lizozom din aparatul Golgi.În urma degradării substanțelor unele dintre moleculele rezultate ajung în membrana plasmatică,sunt reciclate iar altele ajung în endozomi întârziați .În

interiorul endozomi întârziați ph-ul este mediu are valoarea de 6,aici are loc digestia hidrolitică a substanțelor.

Lizozomul este un organit specializat în digestia intracelulară a diferitelor substanțe folosind un echipament enzimatic caracteristic.El fuzionează cu alte organite pentru a realiza procesul de degradare ,organite precum:endozomi și autofagozomi.

(Alberts și colab.,2008, Settembre C. & Ballabio A.,Dr.N.Avram și colab.,1980)

1.9.Elemente de conectivitate celulară

În ceea ce privește conectivitatea celulară poate fi vorba de o comunicare prin semnalizare și de o conectivitate fizică.Există diferite substanțe care funcționează ca semnale în procesul de înperechere,aceste substanțe se numesc feromoni.

Alte molecule controlează modul în care funcționează metabolismul unei celule,foema celulei și deplasarea sa,deplasarea e influențată de modificări de la nivelul citoscheletului.

Pentru a se realiza comunicarea între două celule este nevoie de: o celulă secretoare și o celulă care funcționează ca receptor.

Celula secretoare poate elibera hormoni sau mediatori chimici,în funcție de produșii lor de secreție celulele se împart în : celule endocrine,celule paracrine și celule autocrine în ultima categorie de celule produsul de secreție acționează asupra celulei care l-a secretat și nu asupra unei alte celule.

Liganzii reprezintă diverse molecule cu rol în semnalizare,aceste molecule pot acționa în două moduri: fie traversează membrana plasmatică acționând asupra receptorului din interiorul celulei fie acționează doar la suprafața membranei.În urma interacției dintre ligand și receptor se elaborează un raspuns celular.

Liganzii au un mod diferit de a produce raspunsuri celulare ,astfel doi liganzi care acționează pe doi receptori au ca rezultat același răspuns celular iar un singur ligand poate produce raspunsuri celulare diferite în funcție de receptorul la care se leagă.

Dacă ligandul e un peptid adică e ligand hidrofil receptorul se află în membrana plasmatică dacă ligandul e hidrofob atunci străbate membrana pentru a se lega de receptorii citoplasmatici.Există mai multe tipuri de hormoni,în funcție de receptorii lor se clasifică în : hormoni cu receptori intracelulari,în această categorie intră:hormonii steroizi,tirozina și retinoizii a doua categorie e reprezentată de hormonii cu receptori de suprafață: hormoni peptidici(factori de creștere) și molecule care au sarcină electrică(neurotransmițătorii).

După legarea ligandului de receptor se produc mesageri secundari:AMPc,GMPc și DAG.Mesagerii secundari au rol în :utilizarea glucozei în organism și depozitarea grasimilor și a unor produși de secreție,în proliferarea și supraviețuirea celulelor.Există patru clase de receptori celulari:receptori cuplați cu proteina G,receptori canal ionic,receptori legați cu tirozin kinaze și receptori cu activitate enzimatică intrinsecă.Proteinele G au rol în formarea citoscheletului și în sinteza unor proteine.

Mai multe celule care au același tip celular formează țesuturi iar țesuturile se asociază într-un organ pentru îndeplinirea unei anumite funcții.Celulele dintr-un țesut se află în contact ca într-o rețea .Contactul dintre celule este asigurat de molecule de adeziune,rețeaua în care sunt incluse celulele și care facilitează comunicarea dintre ele se numește matrice extracelulară.Celulele pot interacționa direct prin proteine membranare care se organizează în joncțiuni specializate sau pot interacționa indirect prin interacțiuni cu matricea extracelulară.

Moleculele de adeziune celulară funcționează ca receptori deoarece se pot lega de ligand.

Aceste molecule sunt plasate în membrana plasmatică și sunt reprezentate de proteine trannsmembranare.Între celulele sistemului imunitar au loc interacții slabe iar între celulele sistemului nervos adeziunile sunt de durată.

Caderinele sunt implicate în recunoașterea celulelor embrionare și orientarea lor pe o anumită cale de diferențiere .Cele mai multe caderine se afla la nivelul creierului astfel se formează numeroase onexiuni între celule.În procesul de inflamație la locul leziunii sunt atrase celulele sistemului imunitar (limfocitele) pentru repararea leziunii și pentru a lupta împotriva antigenelor (agenților patogeni).La locul leziunii sunt atrase și integrinele ele provoacă imobilizarea leucocitelor,au rol în ancorarea celulară.

Integrinele sunt activate de chemokine ,integrinele în stare activă facilitează conectarea celulelor între ele.Joncțiunile celulare conferă o aderare strânsă între celule astfel încât acestea formează o structură atât de compactă încât poate separa două compartimente .Joncțiunile se întâlnesc la nivelul celulelor epiteliale și pot fi: joncțiuni "înguste" numite și "zonula occludens",joncțiuni de ancorare sau "zonula adherens" și joncțiuni "gap" acestea din urmă fiind implicate în transmiterea semnalelor chimice între celule.

Joncțiunile aderente și filamentele de actină ancorează celulele iar joncțiunile "înguste" asigură o apropiere maximă între celule.

Desmozomii îndeplinesc un rol important în aderența celulelor iar hemidesmozomii sunt implicați în interacția celulelor cu matricea extracelulară.De desmozomi se leagă filamentele intermediare acestea dau formă celulei.Joncțiunile "gap" sunt implicate în comunicarea dintre celule și în transmiterea de : ioni,glucide și aminoacizi.Aceste joncțiuni au rol în hrănirea celulelor și în dezvoltarea lor .Procesul de chemotaxie reprezintă deplasarea celulelor în funcție de gradientul de concentrație al unui atractant .Celulele formează prelungiri și se atașează apoi se opresc din deplasare proces numit inhibiție de contact.

Datorită matricei extracelulare celulele formează țesuturi ,pentru ca matricea extracelulară să adere la celule e nevoie de receptori de adeziune reprezentați de integrine.

Matricea extracelulară conține : polizaharide,proteine,colagen,elastină,fibronectină și laminină.Aceste componente formează lamina bazală a cărei densitate depinde de concentrația de colagen.Lamina bazală se află la suprafața celulelor și are rol în refacerea structurilor deteriorate.Colagenul este o glicoproteină ce conferă rezistență țesuturilor supuse la întindere.Elastina determină elasticitatea țesuturilor și rezistența lor .

Proteoglicanii sunt implicați în cicatrizarea țesuturilor datorită capacității lor de a lega citokine.Fibronectina facilitează interacția celulelor cu proteoglicanii și cu elastina ,fibronectina are rol în mobilitatea celulelor și în cicatrizarea leziunilor.

Laminina intră în compoziția laminei bazale îndeplinește funcții similare fibronectinei.

Pe lângă aceste molecule și joncțiuni cu rol în interconectarea celulelor și adeziunea lor fie direct la o altă celulă fie la matricea extracelulară mai există și filamente de actină și miozina implicate în mobilitatea celulelor ,ele au un rol important în contracția musculară.

(Marieta Costache, 2005)

Capitolul 2

Tipuri de culturi celulare

2.1.Culturi celulare în suspensie

Pentru a fi studiate corespunzător celulele de interes sunt cultivate in vitro (în condiții de laborator)în mediu de cultură.Astfel se poate observa dezvoltarea și diferențierea lor sau evoluția lor anormală.Cultura de celule asigură creșterea celulelor în afara organismului.

Cultura în suspensie reprezintă un tip de cultură în care celulele se află în mod continuu suspendate într-un mediu de cultură.Starea lor suspendată este realizată printr-un dispozitiv de agitare cu elice sau prin vibromixer.

Mediul de cultură trebuie să conțină nutrienți și factori de creștere pentru a asigura multiplicarea celulelor.Pentru prima dată celulele au fost cultivate in vitro în 1907 de către Ross Harrison ,acesta a studiat diferențierea neuronilor.În laborator sunt cultivate diferite tipuri de celule pe medii cu compoziție diferită în funcție de scopul experimentului.

Prin cultivarea in vitro a celulelor s-a descoperit : modul de creștere al celulelor ,factorii implicați în creșterea celulară și receptorii lor,ciclul celular,modul de proliferare al celulelor tumorale ,structura genetică a celulei și memcanismele de apoptoză. Numeroase medii de cultură conțin: proteine,insulină și factori de creștere(EGF,FGF,NGF).

Un mediu de cultura des folosit este SFB (ser fetal bovin),mediile de cultură pot fi în stare lichidă sau pudră.Celulele sunt separate din țesut prin tehnici mecanice sau enzimatice , apoi sunt puse în suspensie.Celulele provenite dintr-un țesut formează cultura primară.În urma cultivării celulelor dintr-o altă cultură se formează cultura secundară.După mai multe pasaje celulele încă au activitatea pe care o prezentau și în tesutul din care au fost prelevate.În cultură celulele au o durată de viață limitată cu excepția celulelor canceroase care au proliferare nelimitată și sunt nemuritoare.

(Dr.N.Avram și colab.,1980;Marieta Costache,2005)

Particulele din suspensie sunt definite ca fiind materie filtrabilă din mediu lichid,aceste particule au origine și dimensiuni diferite.(Bram T.M.Mulling and colab.,2013)

În mediul bidimensional ,de monostrat celulele au creștere limitată la suprafața de cultivare pe când mediul în suspensie oferă posibilitatea cultivării unui volum mare de celule deoarece acele celule se află în suspensie.Cultivarea în monostrat presupune mai multe etape în care celulele pot fi afectate,lezate.Micropurtătorii care pot fi reprezentați de diferite particule precum : celuloză sau dextran au rol în aderarea,creșterea și multiplicarea celulelor.

Prin agitarea mediului se asigură o mai bună aprovizionare cu oxigen și nutrienți a celulelor cultivate pentru a le intensifica creșterea .Pe de altă parte o agitare excesivă produce coliziuni între celule ceea ce le scade viabilitatea.

(Alan Tin-Lun Lam și colab.,2015)

Mediul de suspensie lichid este influențat în funcție de tehnica de însămânțare astfel daca însămânțarea se face în profunzime și mediul este agitat continuu pentru oxigenarea mediului de cultură cultura va fi omogenă în mediu .Dacă însămânțarea se face la suprafață cultura se dezvoltă la acest nivel.Mediul de cultură poate fi universal sau restrictiv.

Cultivarea in vitro se face în scopul izolării și identificării celulelor de interes .Se utilizează probe biologice(fragmente de țesut,sânge,urină,apă).Un mediu de cultură este un substrat nutritiv a cărui compoziție diferă din punct de vedere al complexității și este utilizat pentru multiplicarea microorganismelor.

Pentru a asigura creșterea mediul de cultură trebuie să ofere: apă(pentru hidratare),sursă de C (pentru sinteza de aminoacizi și proteine),sursă de N (pentru sinteza de acizi nucleici),sursă de ioni,factori de creștere și mediul trebuie să aibă un ph corespunzător în jurul valorii de 7,3.Un mediu de cultură lichid des utilizat în microbiologie este bulionul nutritiv.

Însămânțarea reprezintă introducerea unei porțiuni dintr-o cultura de microorganisme într-un mediu de cultură,însămânțarea se face în condiții sterile.Inoculul lichid se referă la suspensia de microorganisme (însămânțare în mediu lichid). Însămânțarea în mediu lichid se face cu ajutorul unei pipete gradate sau cu ansa.

În cultura lichidă se observă : gradul de dezvoltare,omogenitatea sau formarea de agregate,daca se formează sediment pe fundul tubului,dacă se formează membrană la interfața mediu-aer și mirosul culturii care indică tipul de metabolism.Pentru determinarea numărului de celule dintr-o cultură în scop statistic se realizează diluții zecimale ,diluțiile se însămânțează în tuburi cu mediu de cultură lichid.Pentru a se asigura creșterea microorganismelor e nevoie de incubare la o anumită temperatură aproximativ 37°C pentru o anumită perioadă de timp.

Pentru a afla cât mai multe despre caracteristicile unei celule sunt necesare tehnici de separare a componentelor celulare.De interes este elucidarea proprietăților fizico-chimice ale moleculelor(sarcină electrică , ph)sau proprietăți legate de afinitatea antigen-anticorp.

Prin acțiunea forței gravitaționale în urma suspendării unor celule într-un lichid ,corpurile cu greutate mai mare vor sedimenta la fundul recipientului.Un rol important îl are densitatea lichidului comparativ cu densitatea corpului suspendat.Pentru sânge durata medie de sedimentare este de o oră timp în care se disting trei tipuri de celule în funcție de sedimentarea lor în tub:eritrocitele vor sedimenta pe fundul tubului,leucocitele se plasează în partea superioară a lichidului și celelalte celule care raman suspendate în soluție.

Acest principiu stă la baza procesului de centrifugare ,accelerația gravitațională favorizează depunerea mai rapidă a celulelor.Pentru a îmbunătății procesul de separare al celulelor în biologie s-a utilizat forța centrifugă care produce o sedimentare mult mai rapidă a moleculelor și celulelor comparativ cu greutatea.

Această forță a putut fi folosită prin intermediul unui aparat numit centrifugă,foarte util în cazul moleculelor mici care sedimentează greu și ar avea nevoie de o perioadă lungă de timp pentru a sedimenta doar pe baza greutății lor.Centrifuga este alcătuită dintr-un ax și rotorul în care se plasează eprubetele ce conțin substanțele ce trebuie separate.Tuburile se plaseaza simetric în locașurile de pe rotor pentru ca centrifuga să se echilibreze și centrifugarea să fie optimă pentru toate probele din centrifugă.În cazul neechilibrării centrifugii se poate produce ruperea axului .Pentru a se evita astfel de accidente în laborator centrifugile moderne dețin un sistem de verificare care împiedică pornirea centrifugării dacă centrifuga nu este echilibrată.Rotația axului este produsă de un motor care are o viteză de mii de rotații pe minut.Datorită vitezei mari de rotație a axului și rotorului în urma frecării cu aerul se produce încălzirea ,ceea ce poate altera probele biologice .Acest inconvenient a fost eliminat prin introducerea unor sisteme de răcire a rotorului centrifugii și prin eliminarea frecării prin introducerea unor pompe de vid.Viteza cu care sedimentează moleculele se măsoară în Svedberg(S) dacă valoarea Svedberg e mare molecula sedimentează mai repede.

În urma sedimentării moleculelor cu greutate mare se formează pe fundul tubului sedimentul acesta are o consistență relativ solidă iar faza lichidă lichidă se numește supernatant conține molecule care nu se alfă în sediment.Dacă centrifugarea se face în gradient de densitate are loc o purificare bună a moleculelor

În centrifugarea în gradient de densitate moleculele sedimentează în benzi ,densitatea variază descrescător din partea inferioară la cea superioară a tubului.

Cromatografia este o tehnică de separare a moleculelor din soluție (lichid)prin interacția cu un suport.Separarea are la baza proprietățile moleculelor:sarcină electică,afinitate,masă moleculară. Cea mai simplă cromatografie este cea pe hârtie.Principiul pe care se bazează această tehnică este separarea moleculelor din lichidul probă prin capilaritate . Moleculele migrează cu viteze diferite astfel se formează benzi verticale pe hârtia de filtru.

(Marieta Costache,2005)

2.2. Culturi celulare aderente la substrat

Mediile de cultură pot fi în funcție de originea lor: naturale (lapte,cartof),artificiale(sânge de berbec,gălbenuș de ou,aminoacizi)au componente naturale și artificiale și medii semisintetice (mediu Gauze)conține doar componente de sinteză.

Culturile de celule în monostrat presupun un strat de celule cultivate pe o suprafață solidă sticlă neutră sau material plastic atoxic.Culturile celulare aderente la substrat sunt culturi solide care conțin pe lângă celelalte componente care sunt prezente în toate mediile de cultură și factori de adeziune care au rolul de a fixa celulele la nivelul recipientului de cultură.

Ca și în cazul mediilor lichide durata de viață a celulelor în mediile solide este limitată.Celulele care se pot cultiva pe mediu de cultură sunt:celule musculare,epiteliale,celule de natură conjunctivă,celule nervoase,celule tumorale și alte tipuri de celule.Pentru identificarea tipurilor de celule se folosesc markeri celulari.Celulele tumorale cultivate duc la formarea de linii celulare.Liniile celulare se caracterizează prin : cresc cu viteză mare,nu necesită medii de cultură complexe,pot crește atât pe medii în suspensie cât și pe suprafață dar prezintă instabilitate genetică.Subtulpina se formează prin izolarea unei celule dintr-o tulpină această celulă prezintă markeri absenți la alte celule.

Clona se formează după mitoze repetate dintr-o singură celulă,oncogenitatea reprezintă capacitatea unui virus de a determina formarea de tumori când sunt inoculate la diverse organisme.Un mediu de cultură solid folosit frecvent în laboratoarele de microbiologie este geloza simplă solidificarea se realizează prin utilizarea agarului extras din alge marine.Mediile solide simple conțin un minim de substanțe nutritive pentru creșterea celulelor.Mediile speciale au o compoziție mai complexă și asigură creșterea anumitor specii de microorganisme.Mediile selective nu permit creșterea unor specii de microorganisme ci doar a celor de interes pentru respectivul studiu.Spre exemplu mediu Chapmann permite selectarea speciilor de Staphylococcus aureus.Mediile de îmbogățire sunt necesare pentru cultivarea unor specii de bacterii care necesită pentru cultivare un mediu mai bogat pentru a le satisface exigențele de creștere.

Pentru a se obține rezultate concludente în privința culturilor microbiene însămânțarea și manipularea culturilor se face în condiții sterile.În vederea asigurării creșterii celulelor cultivate sau speciilor de microorganisme trebuie să se asigure un ph optim.

Însămânțarea mediilor solide se face cu ajutorul ansei sau al pipetei Pasteur ,în cazul cultivării de specii de microorganisme inocularea se va face în condiții sterile în apropierea becului de gaz la aproximativ 20 cm.Se poate repartiza mediul solid în tuburi sau în plăci Petri.În cazul cultivării în mediu solid se poate inocula atât inocul solid cât și lichid.

Pentru inocularea cu ansa se folosesc mai multe tehnici de însămânțare.În mediu înclinat în tub se realizează cu ansa mișcări în zig-zag,acest tip de inoculare cu ansa se realizează și în cazul inoculării în plăcii Petri.În plăcile Petri se realizează și inocularea în pânză tot cu ajurorul ansei rotindu-se placa cu câte 45° față de primul rând de striuri.

Scopul acestor tipuri de inoculări este obținerea de colonii izolate(populație de microorganisme ce rezultă în urma multiplicării unor celule de același tip).În cazul mediilor din plăcile Petri se examinează aspectul coloniei și dimensiunea ei .Coloniile pot fi : punctiforme au sub un mm,colonii mici cu 1-2mm,colonii medii și colonii mari au aproximativ 5 mm.Din punct de vedere al aspectului coloniile pot fi uniforme sau neregulate și pot prezenta margini : netede,serate,crenelate,dințate sau filiforme.

Pot exista două tipuri de culturi netede /smooth sau rugoase/rough,cele netede se întâlnesc la culturile tinere care au o aderență slabă la substrat ,sunt bombate iar cele rugoase sunt caracteristice culturilor îmbătrânite ,sunt foarte aderente la substrat .

În cultivarea celulelor în mediu solid ,în urma izolării celulelor din țesut acestea se pot cultiva în două moduri:cultivare în masă se cultiva un număr mare de celule care formează pe fundul recipientului un monostrat de celule și a doua modalitate constă într-o cultură clonală numărul de celule cultivate este mai mic ele aderă la substrat la distanță unele de altele astfel se formează colonii individuale.

(Marieta Costache,2005)

Aderența celulelor este un factor important în cultivarea lor,celulele pot fi aderente sau nonaderente.Pentru a fi plasate într-o co-cultură de folosește un agent de ancorare situat în membrană cuplat cu o proteină.Monocitele măresc sensibilitatea la medicamente a celulelor canceroase,acestea acționeză doar asupra celulelor canceroase din apropierea monocitelor.Înglobarea celulelor nonaderente într-o co-cultură este folosită pentru a crea culturi ce conțin celule imunitare.

Diferențierea celulelor pe o anumită cale de dezvoltare și apariția în consecință a unor tipuri celulare diferite a contribuit la dobandirea capacității de realizarea cu eficiență a unor funcții de către celulele diferențiate.Funcționarea celulelor este influențată de moleculele solubile care le înconjoară dar și de contactul cu celelalte celule.Co-cultura reprezintă cultivarea mai multor tipuri celulare pe un substrat în scopul observării comunicării celulare .

Celulele aderente precum: astrocitele,neuronii,hepatocitele,au fost utilizate în culturi aderente la substrat în schimb celulele sângelui sunt celule neaderente și nu pot fi cultivate prin această metodă.Interacția celulelor nonaderente cu cele aderente a fost evidențiată în anumite procese fiziologice.În cancer ,celulele sistemului imunitar sunt atrase de celulele canceroase ,astfel concentrația de monocite și limfocite este mare în prezența celulelor canceroase. (Hironori Yamazoe și colab.,2015)

După izolarea celulelor în scopul realizării culturii celulare ,se plasează celulele în vase de cultură apoi se subcultivă seriat.Celulele exprimă receptori de membrană diferiți si au capacități diferite de aderare la substrat.Prin asigurarea anumitor condiții de cultură se favorizează aderența doar a anumitor celule.Celulele care au receptori integrinici pe suprafața membranei aderă preponderent la suprafețe acoperite cu fibronectină.

Celulele embrionare au viabilitate mai mare și sunt dezagregate din țesut mai ușor.Modul de evoluție a celulelor în cultură :în subcultură celulele se divid intens și continuu,din momentul inițierii culturii numărul celulelor crește până în săptămâna a 14-a când celulele evoluează în două moduri diferite,unele celule suferă senescență și moarte celulară iar altele se transformă și inițiază linia celulară continuă.(www.umfiasi.ro)

Figura 3 evidențiază evoluția celulelor într-o cultură,acestea trec prin patru mari etape de creștere:faza de lag când celulele se acomodează la mediul de cultură și numărul lor e relativ constant în aceasă etapă ,faza log /de creștere logaritmică în care numărul celulelor crește exponențial celulele se hrănesc,numărul lor nu poate fi prevăzut cu exactitate,în faza de platou unele celule se divid iar altele mor astfel numărul de celule rămâne constant și scade cantitatea de nutrienți,faza de declin cultura este îmbătrânită lipsa nutrienților duce la declinul celulelor și acestea mor.

Figura 3 www.creează.ro

Creșterea se realizează pe baza nutrienților din mediu și reprezintă marirea celulelor cănd e atins un anumit volum celula se oprește din creștere și începe să se dividă.

Multiplicarea reprezintă creșterea numărului de celule prin diviziune.Timpul de generație reprezintă perioada necesara pentru ca numarul de celule să se dubleze în urma diviziunii celulare.(M.C.Chifiriuc și colab.,2011)