Aprobat, Aprobat, [602579]
Universitatea Politehnica București
Facultatea Ingineria Sistemelor Biotehnice
Departamentul Sisteme Biotehnice
Aprobat, Aprobat,
Decan Director Departament
Prof. Dr. Ing. Gheorghe Voicu Prof. Dr. Ing. Sorin Ștefan Biriș
Tema
Lucrarea de disertație al masterand: [anonimizat]: Culturi starter de mucegaiuri utilizate în industria alimentară
Date inițiale: Cercetă ri experimentale pentru obținerea culturilor sporifere de Penicillium utilizate
în industria alimentară .
1. Studiul documentar
1.1. Introducere.
1.2. Metode de conservare a culturii starter.
1.3. Sisteme de producție pentru culturile starter.
1.4. Funcțiile culturilor starter.
1.5. Tipuri de culturi starter.
1.6. Metabolismul la culturi starter din lactate.
2. Materiale și metode
2.1. Prepararea și sterilizarea mediilor de cultură.
2.2. Materiale.
2.3. Mod de lucru.
3. Rezultate și discuții
3.1. Determinarea numărului de spori de mucegai la microscop .
3.2. Riscuri pentru producție, desfacere și consum.
3.3. Concluzii .
Data elaborării temei: 15 noiembrie 2015
Termen de predare: 16 iunie 2017
Titular de disciplină
Prof. Univ. Dr. In g. Mariana Ferdeș
Conducător științific Masterand: [anonimizat]. Univ. Dr. Ing. Mariana Ferdeș Ing. Ion Mar ian Mincu
CUPRINS
1. Studiul documentar . ……………………………………………………………………………………………………….1
1.1. Introducere………………………………………………………………………………………………. …………………1
1.2. Metode de conservare a culturii starter………………………………………………. ………………………….3
1.2.1. Startere lichide…………………………………………………………………. ……….. ………………………….4
1.2.2. Startere uscate……………………………………………………………………………. ………………………….5
1.2.3. Startere congelate………………………………………………………………………. ………………………….9
1.3. Sisteme de producție pentru culturile starter………………………………………. ………………………… 10
1.3.1. Observații preliminare………………………………………………………………. ………………………… .10
1.3.2. Tehnici microbiologice simple………………………………… ……………….. ………………………….. 11
1.3.3. Sisteme mecanice protejate………………………………………………………. ………………………… ..12
1.4. Funcțiile culturilor starter……………………… …………………………………………. ………………………..17
1.5. Tipuri de culturi starter…………………………………………………………………….. ………………………..18
1.5.1. Clasificarea pe b aza caracteristicilor fiziologice și de creștere…………. ………………………..18
1.5.2. Clasificarea pe baza activităților biochimice………………………………….. ………………………..19
1.5.3. Caracteristicile cu lturilor starter lactice selectate…………………………………………………. …..20
1.6. Metabolismul la culturi starter din lactate. ………………………………………….. ………………………..23
2. Materiale și metod e…………………………………………………………………………….. ………………………..29
2.1. Prepararea și sterilizarea mediilor de cultură……………………………………… …………………………29
2.2. Materiale………………………………………………………………………………………… ………………………..30
2.2.1. Medii de cultură…………………………………………………………………………. ………………………..30
2.2.2. Materiale alimentare………………………………………………………………….. …………………………31
2.3. Mod de lucru…………………………………………………………………………………… ………………………..35
3. Rezultate și discuții………………………………………….. …………………………………. ………………………..38
3.1. Determinarea numărului de spori de mucegai la microscop ………………….. ………………………..38
3.2. Riscuri pentru producție, desfacere și consum ………… …………………………………………………….40
3.3. Concluzii………………………………………………………………………………………… ………………………..42
BIBLIOGRAFIE.. ………………………………. …………………………………………………………………. ………..44
1
CAPITOLUL I
1. Studiul documentar
1.1. Introducere
Culturile starter sunt microorganisme sau populaț ii microbiene mixte atent selecționate care sunt
adăugate în mod intenț ionat pentru a produce fermentația dorită în condiț ii controlate. Sunt utilizate
pentru a produce anumite modificări specifice în compoziția chimică și în proprietăț ile senzoriale
ale substratului.
Ca microorganisme starter pot fi utilizate diferi te tipuri de bacterii, drojdii ș i mucegaiuri. Multe
dintre bacterii fac parte din categoria bacteriilor lactice ( Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus
si Leuconostocs ).
Fabricarea de iaurt este acum mai centralizată decât în trecut și în timp ce producția de succes
este direct legată de prelucrarea tehnicilor utilizate, selecția corectă, conservare a, de manipulare și
de propagare a culturilor starter vă ajută să omogenizeze și să mențină uniformitate a în calitatea
produsului final.
Culturi le de iaurt consta u în două specii (adică Streptococcus thermophilus și Lactobacillus
delbrueckii subsp . thermofilus) și cum aceste organisme sunt în principal cultivate și propagat e
împreună, sunt menț ionate c a, culturi starter amestecate prelungite. Organismele de cultură sunt
conservate în cantități mici cunoscut e ca culturi de stoc. Atunci când aceste culturi sunt reactivate
pentru utilizarea în produse lactate, o scală de sistem de propagare este angajat ă să furnizeze
volumul necesar. De e xemplu, dacă zilnic producția de iaurt este de 25 000 l și rata de inocu lare
este de 2 ml 100 ml-1, cantita tea de starter are nevoie de 500 l.
Culturile mamă și de stoc sunt multiplicate în laborator, în timp ce tra nsportorul și vrac ul sunt
produse î n culturile starter de cameră de produse lactate. Eta pele preparării culturii sunt ilustrate în
Fig. 1 .1.
O cultura starter vrac trebuie să aibă următoarele caracteristici:
Aceasta trebuie să conțină numărul maxim de celule viabile.
Acesta trebuie să fie liberă de orice contaminanți, de ex. bacterii coliforme sau drojdii și
matrițe.
Acesta trebuie să fie activ în condiții de prelucrare în produse lactate și deci menținerea
imediată și a altor culturi este extrem de i mportant ă.
Culturile mamă și de transport sunt crescute într -un mediu steril, î n principal, lapte în condiții
aseptice și activitatea de astfel de culturi poate fi menținută prin aplicarea uneia dintre următoarele
abordări (Foster, 1962). Prima, red ucerea sau controlul activită ții metabolice a organismelor prin
refrigerare a obișnuită ; aceasta este pentru depozitarea pe termen scurt a unei culturi starter ș i poate
fi păstrat viabil până la o săptămân ă. La a doua, concentrația și separarea organismelor de deșeuri,
urmat de resuspendarea într -un mediu steril și în final conservarea prin uscare sau congelare
(Tamime și Robinson, 1976; Robin son, 1983; Tamime, 1990). Aceste din urmă forme sunt utilizate
pentru o depozit are prelungită a culturi i starter de bacterii și astfel pot fi obținute din colecțiile de
stoc disponibil în unităț ile de cercetare de lactate, cole giile sau organizațiile de bancă , sau de cul tură
de la producători de starter comercial .
2
Fig. 1 .1 Pregatirea de cultură starter
Notă: Sistemul 1: cultura de stoc po at fi lichid ă, liofilizată sau înghețată la -196°C pent ru producția
de starter vrac . Sistemele 2 & 3: cultura de sto c poate fi concentrată, liofilizată sau înghețată la –
60°C la -196°C pentru producția de starter vrac, și respectiv iaurt.
Culturile starter trebuie să îndeplinească următoarele cerinț e:
Să fie inofensive (nepatogene) sau să aibă efecte be nefice asupra consumatorului; să nu
form eze metaboliț i toxici;
Procesul să poată fi controlat și să fie reproductibil;
Să protejeze împotriva alterării microbiene ș i a microorganismelor toxicogene;
Să poată fi obținute în cantităț i mari pe substrate ieftine;
Să fie tipice pentru un anumi t produs, de exemplu pentru formarea unei arome specifice;
Să poată fi ușor ș i specific detectabile.
3
Tabelul 1.1.
Microorganisme utilizate în culturile starter
Drojdii Produsul obț inut
Saccharomyces Alcool alimentar, pâine, sos de soia
Brettanomyces bere
Debaryomyces Cârnați fermentați
Candida Kefir, carnați fermentați
Kluyveromyces Kefir, băuturi alcoolice
Schizosaccharomyces Băuturi alcoolice
Mucegaiuri
Aspergillus Sos de soia, jambon crud
Geotrichum brânzeturi
Monascus Orez roșu
Penicillium Brânzeturi, salamuri crude maturate
Rhizopus Tempeh
Bacterii
Bacterii lactice Produse lactete fermentate
Propiobacterium Brânzeturi
Micrococcaceae Cârnați fermentați
1.2. Metode de conservare a culturii starter
Este esențial ca culturi le starter să fie păstrate în scopul de a menține un stoc disponibil de aceste
microorganisme pentru producția de starter vrac și, în cazul unui eșec de pornire, unele tipuri de
culturi conservate ar putea fi utilizate pentru i nocularea directă în cazan(cisternă) (DVI). De
asemenea, transferurile de cultură succesive sau fiecare subcultură poate induce mutaț ii care pot
modif ica comportamentul și caracteris ticile generale ale culturii starter . Mai mult, în cazul culturilor
starter mixte, se evită subcultivarea succesivă care ar putea modifica echilibrul sau raport ul de S.
thermophilus : L. delbrueckii subsp. thermofilus; în "bio" startere numărătorile de Lactobacillus
acidophilus și Bifidobacterium spp. va fi modificată.
În gener al, culturile starter de lactate pot fi conservate prin una dintre următoarele metode:
• starter lichid;
•starter uscat: (a) neconcentrat (spray uscat sau liofilizare/CANIPARVOVAC Vaccin; aceste
metode sunt destul de vechi și nu sunt utilizat e în prezent), și (b) concentrație uscată înghțată.
•starter congelat : (a) îng hețat la -20°C (neconcentrat ), (b) congelat la -40°C la -80°C (concentrat),
și (c) înghețare la o foart e joasă temperatură -196 °C în azot lichid (concentrat ).
Poate fi observat că principalele metode de conservare a culturii starter imp lică concentrația de
bacteri e, precum și diferitele tehnici de uscare și co ngelare, și deci, viabilitatea conservelor de
cultură poate depinde de:
• Creșterea de bază medie ;
4
• Prezen ța agenților crioprotectivi;
• Îndepărtarea rapidă a compușilor metabolici , de ex. acid lactic și compușii carbonil;
• Natura de suspendare a mediului (dacă e angajată);
• Condițiil e de congelare și/sau de uscare;
• Rata de decongelare (culturi congelate);
• Metode de concentrare.
Acesta d in urmă aspect, la care se face referire uneori că concentrația de biomasă de celule, este
de mare importanță ; numărul de celule bacteriene per unitatea de volum sau greutate este măsurată
prin numărar ea coloniilor produse după o diluare de serie de pe un mediu agar și rezult atele sunt
înregistrate de unități (ufc) ml-1 sau g-1. Cu toate acestea, c elula biomasă poate fi concentrată
folosind sisteme diferite.
Cu toate acestea, bacterii le starter supuse la aceste condiții fizice pot muri sau să fie rănit e și,
având în vedere importanța economică a culturilor starter în industria de p roduse lactate, scopul
general al oameni lor de știință din acest domeniu a fost de a minimi za rata de deces sau vătămar e a
culturi i de conservar e.
1.2.1. Startere lichide
Culturile starter poate fi conservat e în formă lichidă folosind una din două suporturi de creștere.
Primul tip este lapte praf degresat reconstituit (SMP) (10 -12 g 100 g-1 negrase SNF (solide -nu-
grăsime)) care este liber de antib iotice. Laptele este sterilizat prin autoclavizare la 69 -103 kPa sau
121°C pentru 10 -15 min, și o probă este incubată timp de o saptămână de la 30°C pentru a verifica
sterilitatea. După inoculare (1 sau 2 ml 100 ml -1), laptele este incubat la 30 °C pentru 16 -18 de ore
sau l a 42°C timp de 3 – 4 ore. La sfârș itul perioad ei de incubaț ie, coagulaț i culturii trebuie să fie
răciți imediat și poate fi apoi păstrat până la o săptămână la temperatura de refrigerare obi șnuită (de
ex. 10°C). Experiența personală suge rează că dacă aciditatea culturii este de aproximativ 0,85 rece g
100 g -1 acid lactic, a tât activitatea starterului și raportul dintre S. thermophilus la L. delbrueckii
subsp. thermofilus (1 : 1 ) sunt ușor de întreținut. Acest tip de cultură starter e ste menționat în
industrie ca o cultură stoc în lucru . Alternativ, rece, laptele autoclavat poate fi inoculat cu o cultură
starter și apoi depozitat sub refrigerare incubare ori de câte ori este nec esar. Este util arătând că
fiecare subcultură succesivă , intensivă a muncii este costisitoare și poate induce mutante; mai mult,
personalul calificat este necesar pentru efectuarea acestora î n laborator. Limita maximă de 15 -20
subcivilizația este recomanda tă pentru iaurt cu bacterii starter de salvgardare a raportului corect
între cocci și tijele pentru a reduce efectul de mutație .
O ușoara conservare extinsă a culturilor de lichide (adică rezervate c ulturii de stoc) poate fi
atinsă cu ajutorul laptelu i de turnesol [(g 100 g -1) reconstituite SMP 10 -12, soluția de turnesol 2,
extract de drojdie de 0,3, dextroza/lactoza 1; suficient de carbonat de calciu pentru a acoperi fundul
tubul ui de test; panmede 0.25 și lecitina 1, și ambele reglată PENTRU FAZA 7]. Mediul este
autoclavat la 69 kPa pentru 10 min și se incubează timp de o săptămână pentru a verifica sterilitatea
(Shankar, p ersonal de comunicare). Mediul inseminat este incubat timp de o perioadă scurtă de timp
(42°C pentru 12 de ore), și depozitat sub refrigerare obișnuită ; este necesar doar pentru a reactiva
cultura o dată la fiecare 3 luni. Cu toate acestea , Kang et al. (1985) conservarea culturi lor de lichid
în prezența CaCO3 și găsite, de exemplu, L. acidophilus au ramas active pentru 150 de zi l a 37 °C
5
atunci când medi ul de creștere a fost completat cu 1,5 g 100 g-1 CaCO3, în timp ce culturile de iaurt
au fost pästrate pentru 150 de zi de la 0°C cu adaos de CaCO3 (0,5 g 100 g-1). Metode altern ative
pentru pastrarea starterului lichid sunt date: ( a) culturi pot fi păstrat e pentru 12 luni la 4°C cu soluț ie
de citrat de sodiu sau K -fosfat soluțiile tampon (Sultan et al., 1987), (b) activ itatea și viabilitatea
culturilor de concentrat lichid de L. delbrueckii subsp. thermofilus au fost îmbunătățite at unci când
celulele sunt cultivate în mediu suplimentat cu span 80 și apoi păstrat în 0,1 g 100 g-1 Na-de
ascorbat de dup ă barbotarea azotului în cultură (Kaneko et al., 1987), și (c) L. delbrueckii subsp.
thermofilus a fost păstrat cu succes in gelatina s pherules (20 g 100 g -1 gelatina) la 4°C sau până la 3
luni la temperatura camerei fără pierderi semnificative de activitate (Zlotkowska și Ilnicka –
Olejniczak, 1993).
Activitatea culturii starter este afectat ă de rata de răcire după incubare, nivel de aciditate de la
sfârșitul perio adei de incubație și temperatură și durata de stocare . Răcirea este important ă pentru a
control a activitatea metabolică a starte rului. Lapte le de capră poate fi de asemenea utilizat ca mediu
de creștere și de întreținer e a culturilor de iaurt și lactococus (Abraha msen et al., 1982), dar tipurile
de lapte semidegresat pot reduce sau inhiba creștere a unor culturi după 10 transferuri; excesul de
acizi grași din lapte le de capră pot fi dovedit e inhibitoare.
1.2.2. Starterele uscate
O metodă alternativă pentru conservarea culturilor starter de iaurt este de uscare. Diferitele
metode de uscare folosite sunt:
•De uscare în vid (vechile m etode nu este utilizat în prezent) ;
•Uscare prin stropire ;
•Uscare înghețată sau liofilizare (larg utilizat î n laborator) ;
•Culturile concentrat e de uscare (larg utilizate din punct de vedere comercial).
Obiectivele principale în spatele acestor evenimente sunt în primul rând, pentru a reduce
volumul de activitate care este implicat în menținerea culturilor de lichide, al doilea, pentru a
îmbunătăți durata de conservare a conservelor de culturi, și al treilea, pentru a facilita expedierea de
culturi de post fără pierderi apreciabile î n activit atea lor.
Potrivit Tofte -Jespersen (1974A,B, 1976), procesul de uscare înain te de anii 1950 a fost efectuat
sub vid și rezultatele nu au fost încurajatoare (adică culturile uscate conservate conținute de numai
1-2% viabile bacterii). Pentru a recâștiga maxim de activitate mai multe subc ulturi au fost necesare.
În esență, această metodă de conservare a constat în luarea culturii starter lichid e activ e, adăugarea
de lactoză ca un agent de protecție și carbonat de calciu pentru a neutraliza excesu l de acid, urmat
de concentrația parțială de amestec (adică demontare de zer). Starterele concentrat e, care au fost de
atunci în forma granulară , au fost uscate sub vid.
Datori tă rezultatelor slabe realizat e prin uscare în vi d, metode alternative au fost că utate, și una
dintre aceste meto de a fost cea de uscare prin stropire care a fost utilizat ă prima dată în Olanda
pentru conservarea culturilor starter de brânză (Stadhouders e t al., 1969). Deși rezultatele s-au
dovedit promiță toare, această tehnică nu a fost dezvoltat ă comercial. Cu toate acestea, pr ocesul
olandez ar putea fi rezumat după cum urmează:
•Se hidrolizează proteine le din lapte cu tripsina timp de 4 ore la 37°C urmate de abur.
•Se propagă cultura starter la 20°C cu controlul pH-lui folosind Ca(OH)2 ca agent de
neutraliza re.
6
•Se evaporă starterul la 27 °C la 22 g de 100 g-1 TS (total solide) și de stropire (temperatură a er
uscat 70°C) la 9 g de 100 g-1 de praf de umiditate cu o temperatură care nu depășește 42°C.
•uscare în vid la 27 °C și 1 -2 mm Hg; cultura prin uscare are aproximativ 5 g de 100 g-1
umiditate.
Munca î n Statele Unite (Porubca n și Sellars, The Eiger a) arată că adăugarea anumitor c ompuș i,
de exemplu acid ascorbic și glutamat monosodic, a ajutat la proteja rea celulelor bacteriene în
timpul procesului de uscare. Mai mult, Porubcan și Sellars (a) The Eiger au recomandat că culturile
starter trebuie multiplicate într -un mediu tamponat. Obiectivele de rezervor sunt în primul rând,
pentr u a mări numărul de organisme viabile/volumul probei și în al doilea r ând, pentru a neutraliza
anumiți metaboliți, î n principal acid lactic, care po ate inhiba dezvoltarea bacteriilor dincolo de un
anumit nivel. Culturi conservate prin acest proces au reținut activitatea lor după depozitare pentru 6
luni la 21°C.
O altă metodă de uscare prin stropire a culturi i de iaurt a fost dezvoltat ă în Suedia (Anderson,
The Eiger a, b) pentru care avantaje le de uscare la temperaturi ridicat e (75 -80 °C), fără a cauza
deteriorări și menținerea diferite lor raporturi bacteriene dintre S. thermophilus : L. delbrueckii
subsp. thermofilus în cultura conservată au fost revendicate. De exemplu, un raport de 40 : 60 într-o
cultură uscată poate fi utilizată pentru produ cția de iaurt cu aromă ascuțită (datorită nivelului ridicat
de L. delbrueckii subsp. thermofilus), în timp ce pen tru un iaurt cu aromă mai moale un raport de 60
: 40 poate fi utilizat. Metoda de uscare suedeză prin stropire po ate fi rezumată după cum urmează:
•se propagă cultura starter în laptele concentrat sterilizat (18 -24 g 100 g -1 TS);
•se fortifică mediul de c reștere cu lisină, cistină și cianocobalamină ;
•se usucă la o temperatură de 75 -80°C.
Deși această dezvoltare a susținut multe avantaje, sistemul nu este folosit pe scară largă.
Recent, Teixeira et al. (1994, 1995a -c) a raportat că moartea cinetică de L. delbrueckii subsp.
thermofilu s folosind procesul de uscare prin stropire a fost influențat de mulți factori precum (a) –
(f). (a) rapor tul de supraviețuire logaritmică a scă zut cu temperatura aeru lui de ieșire crescută cu
prima comandă cinetică si pseudo -z pentru organism a fost de aproximativ 17°C. (b) calculează
energia de acti vare (Ea) , valorile au fost 33,5 kJ mol-1 peste 70°C și 86 kJ mol-1 la mai puțin de
70°C. (c) relația între entropie și având entalpia pentru uscare a și încălzire a prin stropire într -un
mediu lichid a fost lin ear; datele pentru uscare, totuș i, au căzut î n gama de entropie negativă. (d)
Temperatura de stocare înaltă și activitate a apei a redus supravieț uirea celulelor uscate. (e) rata de
supraviețuire a fost mai mare în prezența mon o-Na- glutamat ș i acid ascorbic în timpul depozitării
la 4°C în com parație cu 20°C. (f) la celule au fost uscate sensibil la anumiți inhibatori (de ex.
inhibitori de penicilina, pyronin Y, lizozim și clorura de sodiu) din cauza unei defecțiuni a ADN,
peretele celular și respectiv membrana celulară,
Adăugarea de dextrină în ainte de uscare, folo sind un lichid cu două atomizotoare inclus e și
reducerea temperatu rii din aer a îmbunătățit rata de supraviețuire a organismelor de iaurt (Metwally
et al., 1989; Abd -El-Gawad et al., 1989). Alți adi tivi și/sau metode de uscare care au îmbunătățit
rata de supra viețuire a culturilor starter de iaurt L. acidophilus poate include adăugarea de betaine la
un mediu sub presiune osmotică protejat de unele specii, deși nu L. delbrueckii subsp. thermofilus
(Kets e t al., 1996; Kets, 1997), uscând culturile de pe cordoane de porțelan (Magdoub et al., 1987)
sau gel de siliciu (de Silva et al., 1983), u tilizarea de zer completată cu extract de drojdie plus
7
glucoză ca un agent cri oprotective (Gandhi si Shahani, 1994) și uscare a celulelor pe un uscăto r pat
fluidizat ( Rossi și Clementi, 1987).
Culturile de iaurt uscat înghețate sunt produse atunci când culturile starter sunt uscat e în stare
congelate. Această metodă de conservare a starterului se bucură de popularitate și scopurile de a
crește fiabilitatea culturi lor de conservare, care , culturi uscate trebuie să furnizeze un număr mare
de organisme viabile și procentul maxim de depozitare, de supraviețuire în comparație cu culturile
în vid sau s tropire -uscată (consultați Cattaneo et al., 1986; Porubcan, 1990).
În culturile celulare, rata de supraviețuire este mai mare și numai o cantitate mică este necesară
pentru a se inocula cultura mamă. Numarul de bacterii viabile/unitatea de plus este de același ordin
de mărime ca și în cultura starter lichidă (adică 2 ml 100 ml -1) (Tofte -Jespersen, 1974b, 1976).
Acesta poate fi observat totuși că înghețarea și uscarea poate deteriora conservelor de organisme și,
în special, membrana celulei bacteriene. Astfel, Porubcan și Sellars (b) a depus o The Eige r brevet
la mijlocul anilor 1970 pentru producția de culturi starter Lliofizate cu mediul de creștere
suplim entat cu anumiț i aditivi pentru a minimiza deteriorarea membranei celulare bacteriene.
Mediul de creștere a constat din următoarele componente:
•baza de lapte (pH ajustat la 6.0 – 6.5);
•aditivi (de exemplu, acid ascorbic, mono -Na-glutamat, aspartatul de compus);
•agenți crioprotectivi (de ex. a colinelor, sorbitol, manitol, glucoza, de sirop de porumb, dimetil
sulpoxidul (DMSO măsurat cu metoda), PVO, maltose, de monozaharide sau dizaharide).
O altă abordare utilizată de Morichi (1972, 1974) pentru a minimiza deteriorar ea celulei
bacteriene a fost adă ugarea anumitor agenți criogenici de suspensie de celule. Substanț e dizolvate
de protecție sunt de o lipire de hidrogen și/sau radiaț ii ionizante de grup în natură. Prin urm are,
acești compuși stabilizează membrana celulară și evită astfel, la un anumit grad, accidentele
celulare în timpul procedurilor de conserva re. Se poate concl uziona din lucrul cu Morichi (1972) că
supravieț uirea L. delbrueckii subsp. thermofilus a fost îmbunătățită de l -acidul gl utamic, l -arginine
și acetil gli cine și că din S. thermophilus și L. acidophilus de compuși menți onate mai sus și dl –
cetonele pi rolid one acid și dl -malic; mai mult, L. delbrueckii subsp. thermofilus este mai vulnerabil
la pagubele celul elor decât S. thermophilus .
Astfel, din cauza ratei de supraviețuire a culturilor st arter, primele culturi înghețat -uscate nu
erau adecvate pentru DVI și a fost necesar pentru a propaga aceste culturi de câteva ori pentru a
restabili activitatea lor înainte de fermentare (Porubcan și Sel lars, 1979). În anii 1980, Ame n și
Cabau (1984, 1986) au patentat un pro ces în care culturile starter de brânză a u fos t cultivate în
mediu de specialitate care conține un substrat nutritiv și faza a fost menț inută > 5,5 prin adă ugarea
unui agent de neutrali zare precum hidroxid de amoniu. Îndepartarea inhibatorului lactatul ui de
amoniu a fost efectuat de fn și adăuga rea de apă. A fos t apoi cultura concentrată înghțat uscată și
facută potrivit ă pentru aplicația DVI; acesta este în siguranță pentru a presupun e că o abordare
similară ar putea fi utilizată pentru culturile starter concentrate de iaurt pentru utilizarea în sistemele
DVI.
Având în vedere importanța re lativă a sensibilității organismelor iaurtului la procesul de uscare
îngheț are, mulți compuși diferiti de protecție au fost studiați. Solide de lapte sunt larg acceptați ca
agenți criogenici foarte buni pentru protejarea culturilor starter și utilizarea de niveluri până la 20 –
25 g 100 g-1 TS a fost raportat ; totusi, 16 g 100 g-1 TS din mediul de creș tere este un nivel realist și
8
o procedură tipi că pentru conservarea mixtă de iaurt a fost raportată de cul tura starter de Tamime și
Robinson (1976).
Este evident că rata de supraviețuire a culturilor starter este influențată de mai mulți factori.
Mediul de creștere
Lapte degresat și/sau zer completat cu extract de drojdie sau proteine hidrolizate sunt bune de
creștere și suspendarea medie pentru conservarea culturii liofilizate (Alaeddinoglu et al. 1989).
Organismele trebuie multiplicate la temperaturi optime lor. Cu toate acestea, rata de supraviețui re
îmbunătățit ă în timpul congelării și uscarea înghețată L. delbrueckii subsp. thermofilus era atins ă
după creșterea în prezența de calciu (Wright și Klaenhammer, 1983). De asemenea neutralizare a
mediul de creștere la pH 5 -6 este recomandată.
Biomasa și mediul de suspensie al celulelor
Oferind o cultura >1010 cfu ml-1 inclu siv de neutralizare a mediului de suspensie îmbunătățește
rata d e supraviețuire a culturii starter în prezența agenților crioprotectivi. Înlăturarea compuș ilor de
carbonil; de la mediul de creș tere este de asemenea recomandat că pot reacț iona cu grupuri de
aminoacizi în celulele bacteriene și poate accelera moartea lor . Creș terea L. delbrueckii subsp.
thermofilus înt r-un mediu cu pH constant 5.7 și suplimentat cu so luție de citrat de sodiu și Tween
80 a îmbunătățit rata de supraviețuire cu un factor de zece (Sampanie et al ., 1991a). Cu toate
acestea, adă ugarea anumitor polimeri (gelatina și maltodextrins) a avut un efect negativ la
stabilitatea S. thermophilus în tim pul depozitării la 20°C, în timp ce a și b galactozidaz e au pierderi
în activitate a Bifidobacterium longum în timpul depozitării la 20°C au fost mai mare de culturi
paralele stocate la 4°C sau -20°C (Sampanie et al., 1996).
Înghețare – uscare, ambalare și depozitare
Wolff et al. (1990) a raportat că a fost mai potrivit uscare a prin înghețare în vid pentru S.
thermophilus compar ativ cu presiunea atmosferică prin uscare; suspendarea de c elule î n lapte
degresat reconstituit prevaz ut ca protecție bună pentru celule. În timp ce depozitare a cultur ii uscate
sub vid sau azot prevăzute mai bine de supraviețuire a culturilor de iaurt, S. thermophilus nu a fost
găsit pentru a păstra bine, în timp ce L. delbrueckii subsp. thermofilus era mai sensibile la îngheț și
uscare (Bozoglu et al., 1987). În studii recente raportate de Castro et a l. (1995, 1996, 1997),
supravieț uirea lactobacilli era mai mare atunci când cultura a fost memorat ă la uscat 11% umiditate
relativă și 5°C.
Reactivare
Este recomandat ca utilizatori să urmați instrucțiunile producă torului de cultură starter . Cu toate
acestea, mediul de rehidratare și temperatură (adică 20°C) poate afec ta scurgerile ribonucleice
celulare din celulele deteriorate. Studii deta liate pe ambele mespohilic și de termofili eale acidului
lactic au fost raportate de Morichi et al. (1967) și font de Valdez et al. (1985b -e, 1986) (vezi de
asemenea review prin Tamime, 1990).
9
Culturile liofizate tind să aibă o lungă fază și necesita tea de o largă recoltare cel puți n de două
ori pentru a obține o cultură lichid ă activ ă. Prin urmare, pentru producția de vrac starter , sistemul 1
este utilizat (consultați Fig. 1 .1), în caz contrar cantități mari de cultură uscată sunt necesare pent ru
însămânțarea starter direct și o durată vrac pe perioada de incubaț ie este necesară.
Această abordare nu este recomandat ă pentru do uă motive, întâi, starterul vrac s -ar putea să nu
fie activ atunci când e folosit pentru fabricarea de iaurt și al doilea, din punct de vedere economic,
abordarea poate fi foarte costisitoare. Ma i recent, culturi concentrate liofizate au apărut pe piață și
este posibil să utilizați aceste culturi pentru direcția de inoculare starter vrac(consultați Fig. 1 .1,
Sistemul 2) sau alternativ, pentru DVI de lapte pentru fabric area de iaurt (consultați Fig. 1 .1,
Sistemul 3; Gatto et al., 1993; Kreuder et al., 1994; Riis et al., 1995). În ambele cazuri, deși timp ul
de producție poate fi exti ns 2 -3 ore, economii considerabile pot fi atins e prin eliminarea nevoii de
personal inst ruit pentru a gestiona culturi starter .
1.2.3. Startere congelate
Culturile starter de iaurt pot fi de asemenea conservate în formă îngh ețată; astfel de culturi
congelate sunt pro duse de către două rute diferite :
• adânc sau sub zero îngheț ( -30 la -80 °C) ;
• de înghețare la temperatură foarte joasă (-196°C) în azot lichid .
Lapte lichid steril proaspăt inoculat cu o cultură starter activ ă este profund înghețată la
-30 la -40°C pentru a păstra natura sau cultura transportorului. Aceste culturi congelate pot păstra
activitatea lor de mai multe luni atunci când sunt depozitat e la -40°C și această metodă de
conservare a culturii a devenit popular ă în industria de produse lactate deoarece culturile co ngelate
produse în laboratoare centralizat e ar putea fi expediate la fabrica de produse lactate în gheață
uscată ori de câte ori es te necesar. Aceste culturi sunt în principal ambalate în recipiente de plastic
și un exemplu tipic este sticla de plastic de tip ul Astell. Procedura de reconectare pentru aceste
culturi congelate este după cum urmează:
• Scoateți starterul de la congel ator, adică la -40°C,
• Dezghețați starterul foarte repede în baie de apă la 20°C,
• Se incubează la 42 °C până când este atins ă aciditate a dorit ă,
• Răciți și stocați peste noapte în frigider,
• Subcultura de înmulțire a alimentatorului pentru starter vrac (consultați Fig. 1 .1, Sistemul 1).
Un alt tip de alternativă de a congela puternic cultura implică îngheț area starterului lichid activ la
-40°C. Proc esul constă în prepararea materialului de cultură într-un mediu de creștere continuu
neutralizat pentru a se optimiza numărul de celule de bacterii pe mililitru. Masa bacteriană este apoi
separat ă cu aj utorul unui separator Sharples și celulele sunt extrase steril din mediul de creștere
și/sau din agent ul de protecție înainte de ambalare ș i înghe țare. Așa cum am menționat anterior,
conservele de culturi trebuie să fie stocate la -30°C la -40°C și să fie expediate către fabricile de
produse lactate în casetele izolate umplut e cu gheață uscată.
10
Procesul de cong elare poate cauza deteriora rea c elulelor bacteriene î n special la L. delbrueckii
subsp. ther mofilus, și deci activitatea culturi lor congelate pot tinde să se deterioreze după un anumit
timp de depozitare din cauza mai multor factori.
Mediul de creștere plus compușii criogenici
Imai și Kato (1975) au raportat că un mediu pentru culturi de ameliorare congelate la -30°C
conține lapt e degresat completat cu zaharoză, smântână proaspătă și CaCl2 sau gelatină. D e
asemenea aceeași lucrători au observat că pre zența de ac etat de sodiu la startere este cauza
sensib ilității la prejudiciu. În plus, celule le concentrate (1010 -1012 cfu ml-1) înghețate la -30 °C în
prezența anumitor amestecuri de compuși criogenici ( citrat de Na, glicerol, na -b-glicerofosfatul,
extract de drojdi e, calciu , zaharoză, smântână, lapte steril degresat, peptonă sau lactoză) au păstrat
activitatea de culturi starter din lapte (Wright și Klaenhammer, 1983; Fayed et al., 1985; Avraam et
al., 1990; Tamime, 1990; consultați de asemenea de Antoni et al., 1989 ; Zlotkowska et al., 1993).
Alți factori care afectează rata de supraviețuire a S. thermophilus în timpul congelării sunt în faza
de dezvoltare și de variație a tulpinii (Morice et al., 1992); factorii care afectează supraviețuirea de
lactobacilli au fost r evizuiți de Antoni et al. (1989).
Temperatura de congelare și de depozitare
Deși congelare a și depozitare a la -40°C s -a dovedit a fi un proces de succes pentru conservarea
culturilor sta rter de produse lactate, stocare la -80°C la -100 °C în azot lic hid îmbunătățește rata de
vapori de supraviețuire a organismelor; de asemenea rata de congelare nu ar trebui ignorată
(Tsvetkov și Shishkova, 1982; Kim Si Yu, 1990; Foschino et al., 1992; Béal et al., 1994).
Efectul de decongelare
Îngheț ul și dezgheț ul pot deteriora membrana celulară a L. delbrueckii subsp. thermofilus și
poate induce sensibilitate la NaCl și extractul de ficat. Sistemul de transport de aminoacid de celule
poate fi deteriorat, dar leziuni le celule lor sunt reversibil e dacă celulele sunt suspendate în soluția de
piruvat, KH2PO4 și MgSO4 (Font de Valdez et al., 1993; Libudzisz și Mokrosinska, 1995;
Oberman et al., 1995; Piatkiewicz și Mokrosinska, 1995).
1.3. Sistemele de producție pentru culturile s tarter
1.3.1. Observații preliminare
Este evident din informațiile de mai sus că culturile conservate sunt relativ mai mic i în
comparație cu cultura de lichid . Ca urmare, starterele DVI (de ex. Culturile concentrate liofilizat e
sau culturi le congelate) tind să arate o ușoară întârziere a fazelor.
Deși concentrația de celule este în regiunea de 109 -1012 cfu ml-1, rata de inoculare este relativ
mică . Utilizarea ratelor de inoculare mai mare nu este recomandat ă pent ru două motive. În primul ,
crește costul de producție și în al doilea , ea conduce la activitat ea metabolică excesivă de starter
care poate însemna dificultăți î n contro larea procesului de fermentare ș i iaurtul poate fi de o calitate
inferio ară (adică amar) . În plus, cu c ât este mai mare inocularea culturii starterului (inclusiv
11
culturile de lichide), cu atât este mai mare tendința de zer să apară în iaurt. În plus, este indicată
întârzierea culturii aceste i faze, metabolismul lor în momentul inocularii f iind la un nivel foarte
scăzut, și deci este necesar mai mult timp pentr u adaptarea esențială . Întâmplător calitatea laptelui
trebuie să fie foarte bun ă, deoarece prezența oricărui agent inhibator (de ex. antibiotice sau
reziduurile de detergent) pot în final reduce activitatea culturi starter.
În prezent, culturile starter de iaurt constituie tulpini amestecate de diferite microorganisme.
Potrivit Stenby (1998) u nele dintre criteriile folosite pentru a selecta sușe pentru cultura starter
amestecuri sunt:
•Aciditate: gust de la blând la mediu sau ascuțit în produsul final , post-acidifiere în timpul
depozitării (adică capacitatea tulpini i de a produce acid la temperaturi joase) nivelul de acid acetic
(adică numai pentru culturi bio) ;
•Aroma: redus ă, medie sau cu conținut ridicat de acetaldehida ;
•Vâscozitatea: redus ă, medie , înaltă sau foarte înaltă ;
•Fermentare: scur ată (aproximativ 6 ore) sau lung ă (până la 16 de ore) de incubare ;
•Bacteriofagi: amestec de bacteriofagi independenți de tulpini.
În unele țări regulamentele legale pot stipula ca există un raport de 1 : 1 între S. thermophilus și
L. delbrueckii subsp. thermofilus, un număr minim de cfu ml-1 în produsul final și a nivelului pH
4,4. Asemenea constrânger i vor limita opțiunile producători lor să diversifice și să ofere
consumatorilor o gamă largă de produse. În unele țări de exemplu, L. delbrueckii subsp. lactis și L.
helveticus sunt amestecate cu organisme de iaurt sau alte specii de culturi bio lactoba cilli și
Bifidobacterim spp. sunt utilizate. Astfel, pentru a menține caracteris ticile de cultură starter
menționa te mai sus și de a menține numărul dorit de organisme probiotic e (de ex. L. acidophilus, L.
paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus rhamnosu s și/sau Bifidobacteri um spp.), utilizarea
starterului DVI adaugat direct în baz a de lapte (consultați Fig. 1 .1, Sistemul 3) a devenit o p ractică
de populare în industrie . Totuși, există o cerere mai ales în fabrici de dimensiuni mari, pentru culturi
starter mixte alcătuit e tradițional numai S. thermophilus și L. delbrueckii subsp. thermofilus pentru
fabricarea de iaurt.
Prin urmare, după cum est e ilustrat mai devreme în Fig. 1 .1, există două metode principale
pentru producț ia de starter vrac. Prima metodă (Sistemul 1) este un sistem de s cară simplă de
înmulțire starter (stoc AE mama AE sau interme diar alimentator AE vrac); totuși, a doua metodă
(sistem 2) e ste Inocularea DVI mediul ui a starterului vrac . În oricare dintre sisteme scopul este fie
de a produce o cultura pură liberă de contamina nți, în principal bacteriofagi , și diferite metode care
au fost elaborate pot fi împărțite în trei categorii principale, tehnici microbiologice simple , folosirea
echipamentului mecanic protejat și rezer voarele și propagarea starterelor din bacteriofagi
rezistenți/mediu inhibant (BRM/BIM).
1.3.2. Tehnici microbiologice simple
În acest sistem echipament ul/materiale le sunt practic ustensile de laborator și un rezervor de
starter și poate consta din eprubete, sticle McCartney, 250 ml (baloane de propagare a cult urii
mamă), 2 -5 l (baloane pentru producț ia de cult ura transportorului) și gradat ș i pipete Pasteur.
Lapte praf degresat reconstituit (10 -12 g 100 g-1 TS) este utilizat ca m ediu de creșter e și de sticlă
conținând lapte este înfundat cu vata absorbantă. Întregul este sterilizat în autoclavă la 121°C timp
de 10 min pentru volume mici (până la 250 ml) sau pentru 15 min pentru cantități mai mari (2 -3 l).
12
Totuși, laptele pentru cu ltura transportorului este în mod normal numai în aburi timp de 1 oră. Este
recomandat ca un eșantion de lapt e sterilizat pentru culturile mamă să fie incubate la 30°C sau 50°C
pentru 2 zile , înainte de utilizare pen tru a verifica sterilitatea sa. Pipetele sunt sterilizate î n cuptor la
160°C timp de minim 2 ore.
Procedurile de reactivar e și subculturarea eprub etelor trebuie să fie efectuate s ub condiții de
igienă extremă. De exemplu, fiola de uscare înghțată este ște arsă cu alcool înainte de s pargere a
geam ului, sau alternativ, dacă un stoc de lichid este utilizat cultura, buza tub ul de test McCartney
sau de expansiune trebuie sa fie "ars " peste un bec Bunsen când vata de bumbac sau ca pacul filetat
este îndepărtat din nou și imediat înainte de înlocuirea sa. Este de asemenea recomanda t ca zona de
lucru a starterului și atmosfera trebuie să fie curat e (adică trebuie filtrat aerul), și dacă este posibil,
întreagul laborator de starter trebuie sa fie sub presiune pozitivă astfel încât aerul nefil trat să nu
intre în cameră când se deschide ușa. Alternativ, fiecare subc ultură poate fi efectuată sub o capotă
laminară pentru a reduce posibilitatea de contaminare propagat ă. Producția unui starter vrac cu
ajutorul acest ui sistem necesită un rezervo r sim plu (adică lot pasteuriser/starter incubator).
Rezervorul nu es te sub presiune și la punctul în care capacul fiecare i subculturi este deschis și
starterul este turnat în lapte. Cantități foarte mici (45 l) a starterului în vrac pot fi produse în bidon
de lapte sau similare în recipient din oțel inoxidabil . O baie de apă sau cabinet de control at
termostatic poate fi folosit ca un pasteurizator combinat, răc itor și incubator pentru producția de
volume limitat de starter vrac .
Este uti l menționând în această etapă că această metodă poate fi de asemenea folosit ă pentru
producția de cultură a alimentatorului utilizată pentru a inocula sistemul protejat mecanic Jones .
1.3.3. Sisteme mecanice protejate
Două aspecte ale starterului în producție din punct de vedere al acestui sistem este important:
primul, mediul de creș tere este tratat termic și răc it la temperatura de incubare complet închis și a
doua, inocularea starterului are loc prin tr-o barie ră care împiedică intrarea de aer. Din 1950 a
existat o mare îmbunătățire î n echipamente de cultură starter, î n principal datorită centralizării
fabricării produselor lactate fermentate și deci a cererii pentru cant itățile mari de starter vrac . Ca
urmare, diferite tipuri de sistem protejat mecanic au fost dezvoltate; totuși, deoarece de la
publicarea primei ediții a aceastei carți, câteva evoluții tehnice au avut loc cu privire la proiectarea
și structura acestor rezervoare. Sub iectul a fost îndelung revi zuit în altă parte (consultați mai jos
pentru informații suplimentare). Ca o consecință și de aplicare mai largă a DVI de lapte pentru
fabricarea de iaurt, numai principalele sisteme sunt descrise. Unele exemple de sisteme mecanice
protejate sunt date mai jos.
Sistemul Lewis
Dezvoltarea aceastei tehnici este bine documentat ă de catre Lewis (1956, 1987) și Cox și Lewis
(1972) și implică utilizarea de ace hipodermice cu două căi pentru a efectua transferul de la cultura
mamă de stoc la cultura starter vrac ; toate inoculãr ile au loc printr-o barieră de apă clorurată. Pentru
a facil ita transferul ușor de culturi în fiecare etapă de înmulț ire, refolosibile, sunt utilizate sticle de
polietilenă comprimabile (115 ml și 850 ml capacitate) respectiv pentru cultura mamă și de
transport . Flacoane de polietilenă sunt echipate cu garnituri de cauciuc Astell și un șurub cu cap.
13
Aceste sticl e sunt umplute cu mediul de creș tere (10 -12 g 100 g-1 lapte degresat reconstituit liber de
antiobiotice ), sigilate și astupat e; conținutul fiind astfel izolat de contaminare a antenei în întreaga
sterilizare, inocularea și etapele de incubare. La punctul de transferuri de intermediar, spațiul
circular al Astell garnitura de cauciuc este inundat ă cu 100 -200 mg l-1 de hipoclorit de sodiu, și în
final de expansiune care conțin stabilit cultura este presată pentru de scărcarea inocularii. Tehnica
global a este ilustrată schematic în Fig. 1.2 .
Fig.1.2 . Ilustrarea schematică a sistemului Lewis pentru transportul cultur ii
A. Cultură mamă B. Cultură intermediară. C. Cultură vrac D. Asamblarea acelor (1 -robinet; 2 –
etanșare; 3 -soluție hipoclorit).
Pentru sistemul Lewis, lapt ele este încălzit într -un vas etanșat și din motive de securitate pentru
rezervor este echipat cu o supapă de eliberare a presiunii. În timpul etapei de încălzire aer ul poate
scăpa, dar când laptele este răcit, nu intră în rezervor. Vas ul de presiune din oțel inoxidabil este total
scufundat în ter men de un rezervor de apă izolat, care oferă protecție maximă de la contaminare
antenei precum și menținerea unei temperaturi constante în timpul incubării. Arborele agitator este
echipat cu o d ublă etanșeitate mecanică și apa sub presiune e ste alimentată în carcasa de e tanșare
pentru a asigura protecția eficientă împotriva contamină rii, ră cire și lubrifiere. Transferul
alimentatorului vrac la rezervorul de cultura este realizat prin intermediul unei bariere steril e (adică
apă conținând sol uție d e hipoclorit de sodiu). Figura 1.3 ilustrează o vizualizare on -site.
14
Fig. 1.3 Privirea de ansamblu a sistemului Lewis pentru transferul culturii printr -o barieră sterilă de
apă.
Sistemul Jones
Rezervorul nu este un vas de cultură starter sub presiune, deoarece aerul din capătul rezervor ului
este forțat în timpul tratamentul termic al laptelui și intră din nou în timpul etapelor de răcire.
Totuși, o ușoară presiune pozitivă în interiorul reze rvorului poate fi realizat ă prin încorporarea un ui
gmv în sistemul de filtrare a aerului/sterilizare. Specificații detaliate ale acestui sistem de pornire în
vrac au fost raportate de Tamime (1990) inclusiv un sistem combinat Lewis/Jones.
Sistemele sterile și de aer filtrat
Diferite tipuri de starter vrac în rezervor au folosit filtrul de aer steril (sub presiune po zitivă) au
fost puse la dispoziție procesoare de produse lactate în multe țări de către furnizori de echipamente
majore d e lactate . Un exemplu tipic de mare eficiență cu ajutorul particulelor de aer (HEPA)
sisteme le de filtrare pe starterele vrac în rezervoare a fost studiat la NIZO (în Olanda) în anii 1970
și o ilustrație a rezerv oarelor este prezentat în fig. 1.4 (consulta ți de asemenea Stadhouders et al.,
1976; Tofte -Jesperson, 1979; Stadhouders, 1986). Leenders et al. (1984) a evaluat efectele filtrului
HEPA [ultrapoli membrane PF -PP 30/ 3 (0,2 mm HF)] de pe intrarea aerului în startere vrac din
recipientele di n fabrici și observă că mai puțin decât un fag din 1.9 ¥ 108 fag care a trecut prin
aceasta este o cerință de prioritate.
15
Fig. 1.4 . Rezervorul de cultivare pentru producția de starter vrac cu suprapresiunea aerului steril
Sistemul Tetra Pak
Acest sistem este descris în detaliu de către Baudet (1983) și Bylund (1995) și în principiu este
oarecum similar cu metoda Lewis c u excepția a două aspecte. Un prim aspect este rezervorul
conceput diferit fiind echipat cu un filtru special format din hârt ie hidrofobă cu prefiltre pe fiecare
parte; toată unitatea de filtrare este închisă într -o carcasă de protecție. În timpul tratării termice a
laptelui, aerul este difuzat prin filtrul de la rezervor și viceversa în timpul etapelor de răcire. Este
esențial ca filtrul de aer să reducă efectul de sterilizare la contaminarea propagat ă. Al doilea aspect ,
în sistemul Lewis de transfer starter, de la un recipient la altul se bazează în întregime pe stoarcerea
comprimabilă de polietilenă de expansiune pentru a scoa te cultură, în timp ce metoda Tetra Pak
utilizează aer steril(Fig. 1.5 ).
Fig.1.5 . Producția culturii starter folosind sistemul de transfer aseptic
1-incubator cunoscut ca Viscubator. 2 -containerul culturii intermediare 3 -rezervorul starterului
vrac 4- filtru HEPA 5 -supapă de aer 6 -filtru de abur 7 -unitate de masurare a pH
16
Fig. 1.6 . Transferul aseptic al culturii mamă la rezervorul culturii intermediare
1-filtru steril 2 -ac aseptic 3 -sticla culturii mamă 4 -recipient din oțel al culturii intermedia re
Recipiente le de sticlă sunt utilizate la înmulțire a culturii mamă și canistra din oțel inoxidabil
pentru alimentatorul/stadi u intermediar (consultați Fig. 1.6 .). Sticlele sunt sigilate cu dopuri de
cauciuc și un metal iar capacul filetat cu un spa țiu circular. În timpul transferului de cultură sunt
utilizate două seringi sterile de unică folosință . Prima seringă , care este scurt ă este conectat ă la
alimentarea cu aer și este echipată cu un filtru aseptic pentru steriliza rea aerului. A doua seringă
este suficient de lung ă pentru a ajunge la fundul vasului de sticlă și este conectat ă la alimentatorul
recipient ului. Astfel, atunci când alimentarea este pornită, aer ul este sterilizat prin filtru și intră în
expansiune prin acul scurt. Aceasta duce la o acumulare de presiune în spațiul capului din sticlă ,
forțând cultura prin acul lung în canistra de alimentare . Întâmplător, biberoane le care conț in lapte
degresat sunt în mod normal autoclavate și apoi răcit e la temperatura de incubație corespunzatoare.
Amestecul de cultură este injectat ă în expansiun ea culturi i mamă folosind o seringă sterilizată
introdusă prin membrană sau, alternativ, amestecul de cultură liofilizată se adaugă într-o sticlă în
condiții aseptice ( capacul vasului de expansiune este deșurubat la un debit laminar și se adaugă
cultura uscată; o altă abordare este rehidratarea culturii în lapte sterilizat și se injectează în sticlă cu
ajutorul unei seringi sterile).
Alimentatorul/cultura intermediar ă este pregătit ă cu ajutorul dispozi tivului special conceput din
oțel inoxidabil după cum urmează:
• Umpleți containerele cu lapte degresat și fixați capacul de închidere.
• Încălziți la temperatura de 95°C pentru 30 -45 min și se răcește la temperatura de incubare cu
ajutorul Viscubato rului (consultați Fig. 1.5 ).
• Transferul culturii mamă conform descrierii de mai sus, se răceș te la 10°C;. cultura este gat a să
inoculeze starterul vrac în rezervo r.
Alimentatorul/containerul intermediar are două garnituri speciale, unul pe ntru aer comprimat, și
celelalt sub formă de tub din oțel inoxidabi , la conducta care se conect ează la rezervor în timpul
transferului de cultură starter vrac. Aceste recipiente sunt echipate cu supape speciale cu eliber are
17
rapidă. O ilustrație pe loc a al imentatorului/culturii intermediare care arată conexiunile conductei de
recipient este prezentat ă în fig. 1.7. Un sistem similar de producț ie starter în vrac a fost raportat de
Rasic și Kurmann (1978) și schema generală și o ilustrație de transfer a cultu rii din alimen tatorul
/recipientul intermediar a starterului vrac la r ezervor este prezentat în fig. 1.5 . (consultați de
asemenea Tamime, 1990; Bylund, 1995).
Fig. 1.7 Țevi, supape, legături și conexiuni pentru recipientul culturii intermediare
A.Valoa rea temperaturii, țeava din dreapta pentru adaosul de aer, cea din stânga din plastic pentru
eliberare; B. Supape de legătură specială cu eliberare rapidă, descrierea țevii este ca la (A)
Potrivit Bylund (1995), în mod normal este recomandat că două rezervoare trebuie să fie folosit e
în rotație; unul conține startere gata făcute pentru utilizare și altul este pentru pregătirea startarului
pentru următoarea zi . Specificațiile starterului vrac din rezervor ar putea fi rezumate după cum
urmează:
• Rezervorul este de un design aseptic (adică închise ermetic și triplu căptușit ).
•Este capabil să reziste presiunilor negative și pozitive până la 30 și respectiv 100 kPa, .
•Agitator ul este acționat prin intermediul unui motor cu două viteze și axu l de agitare este dublu
sigilat.
•Este echipat cu filtre HEPA (consultați Fig. 1.5) care pot fi sterilizate cu abur la 140°C și un pH –
metru staționar proiectat pentru a rezista în condiții extreme a diferențe lor de temperatură în timpul
curățirii rezervoru lui, prepararea laptelui și pr oducția de cultură starter .
1.4. Funcțiile culturilor starter
Culturile starter pot fi utilizat e ca o singur ă tulpină , tulpini amestecate și mai multe tulpini în
funcție de tipul de produs pregătit. Capacitatea culturilor starter pentru a efectua funcțiile sale în
18
mod e ficient în timpul fabricării alimente lor din produse lactate fermentate depinde î n primul rand
de puritate și a ctivitatea culturilor starter .
Principalele roluri ale culturii starter în timpul fermentării lapte lui sunt:
a) Producția în primul rând de acid lactic si de alți acizi organici, precum acid formic și acid
acetic.
b) Coagularea protei nelor din lapte și schimbările interioare și de textură în produs e finale.
c) P roducerea de compuși de aromă, de exemplu, diacetil, aceto nă și acetaldehidă.
d) Ajută la maturarea brâ nzeturi lor prin activităț ile lor enzimatice.
e) Produc substanțe antibacteriene în produsul finit.
f) În plus, acestea pot să dețină proprietăți funcționale.
Astfel, o cultură starter ideală trebuie să fie selectată pentr u prepararea diverselor tipuri de lapte
fermenta t cu următoarele caracteristici:
1. Acesta trebuie să fie rapidă și stabilă în producția de acid.
2. Ar trebui să producă produsul cu fine și curățaț i aroma lactic.
3. Ar trebui să nu producă pigmenți, gaz, aromă și amărăciune în produse le finite.
4. Ar tr ebui să fie de natură asociativă în dezvoltarea unui produs.
1.5. Tipuri de culturi starter
Există două mari grupe de culturi starter care sunt folosite î n prepararea produselor de lapte
fermentat clasificate pe baza acestora:
a) Caracteristicile fiziologice și de creștere, cum ar fi :
(i) Cultura starter mezofilă;
(ii) C ultura starter termofilă;
b)Caracteristicile biochimice precum :
(i) Bacterii h omofermentative de acid lactic;
(ii) Bacterii h eterofermentative de acid lactic .
1.5.1. Clasificarea pe baza caracteristicilor fiziologice și de creștere
Cultura st arter mezofilă
Aceste culturi au temperatura optimă de dezvol tare între 20 și 30°C și includ speciile
Lactococcus și Leuconosto c. Aceste culturi lactice mezofile sunt utilizate în producția de m ai multe
soiuri de brânză unde caracteristici le importante sunt:
1. Activitatea producătoare de acid ;
2. Producția de gaze;
3.Producția activității enzimatice pentru brânză maturată, de ex., proteaze și enzime peptidaze .
19
Importanța laptelui fermentat derivă din fermentarea mezofilă și este consistența care se
datorează coagulării acidului lactic a proteinelor din lapte și aromei și gustul ui produs de acid ul
citric și fermentarea lactozei.
Cultura starter termofilă
Aceste culturi au temperatura optimă pentru dezvoltare înt re 37 la 45°C. Culturile termofile sunt
în general utilizate în p roducția de iaurt, lapte acidofil, brânză de tip șvaițer . Culturile de termofili
includ specii de Streptococcus și Lactobacillus. Aceste culturi cresc în asociere cu lapte le și au
forma tipi că a culturilor starter de iaurt. Această creș tere este considerat ă simbiotică deoarece rata
de dezvoltare a acidului este mai mare atunci cân d două bacterii sunt cultivate împreună în
comparaț ie cu o tulpină unică (Fig. 1.8).
Streptococcus
thermophilus
Lactobacillus delbruec kii
ssp bulgaricus
Fig. 1 .8 : Culturi de iaurt
Culturile starter termofile sunt microaerofilli și laptele proaspăt încălzit ar trebui să fie utilizat
pentru a obține o creștere mai bună a culturii deoarece tratamentul termic reduce cantitatea de
oxigen din produs. Cele mai importante activități metabolice ale culturilor termofile în dezvoltarea
de produse lactate fermentate sunt:
• producția de acid, de ex. acid lactic;
• compuși de aromă, ex. acetaldehida;
• consistență și vâscozitate, de ex., polizaharide;
• activități proteolitice și lipolitice, de ex., peptide, aminoacizi, acizi grași;
• posedă semnificație terapeutică, cum ar fi:
(a) îmbunătățirea organismelor intestinale;
(b) produc substanțe antibacteriene;
(c) îmbunătățirea imunității.
20
.
1.5.2. Clasificarea pe baza activităților biochimice
Cultură starter lactică homofermentativă
Aceste bacterii lactice sunt caracterizate pentru capacitatea lor de a fermenta lactoza aproape
exclusiv de acid lactic în timp ce pentozele și gluconat ul nu sunt fermentat e. Exemple de aceste
culturi sunt: lb. acidophilus, lb. thermofilus.
Cultură starter lactică heterofermentativă
Principalele caracteristici ale acestor bacterii sunt c apacitatea de a fermenta hexoze și pentoze la
acid lactic, acid acetic, alcool și CO2. Exemple de aceste culturi sunt lb. brevis, lb. fermentum.
1.5.3. Caracte risticile culturilor starter lactice selectate
1. Specii din genul La ctobacillus
Aceste culturi sunt g ram pozitive, bacterii sub formă de bară , care sunt homo sau hetero
fermentative ( fig. 1.9). Caracteristicile biochimice ale diferitelor grup e de lactobacili sunt
prezentat e în Tabelul 1. 2.
Fig. 1.9: Examinarea microscopică a culturii de Lactobacillus acidophilus
21
Tabelul 1.2
Caracteristicile biochimice ale diferitelor grupuri de lactobacili
Caracteristici Lactobacilli
Grup I Obligativ
Homof ermentativ Group II Faculta tiv
Heterofermentativ Group III Obligativ
Heterofermentativ
Grup Orla-Jenson Ther mobacteri i Streptobacteri i Batabacter ii
Încălzire la 45 C
+
–
±
Încălzire la 15 C
–
+
+
Fermentarea
ribozei
–
+
+
Gaz de la gluconat
–
+
+
Prezența aldolazei
+
+
–
Prezența
fosfochetolazei
Absent
Inducti bil
Constit utiv
Exemple Lb. delbrueckii subsp.
delbrue ckii
Lb. delbrueckii subsp.
bulgaricus
Lb. delbrueckii subsp.
lactis
Lb. helveticus
Lb. acidophilus Lb. casei subsp. casei
Lb. casei subsp.
paracasei
Lb. rhamnosus
Lb. plantarum
Lb. curvatus Lb. kefir
Lb. ferment um
Lb. brevis
Lb. Reuteri
2. Specii din genul Lactococcus
Aceste culturi sunt sferice sau coci ovoid ale, 1,0 µm în diametru, lanțuri sau perechi, gram
pozitive, microaerofile , acid lactic homofermentativ , produce L (+) -lactatul din lactoza, mezofil
(absența de creștere la 45°C).
L. lactis subsp . lactis
L. lactis subsp . cremoris
L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis
3. Specii din genul Leuconostoc
Aceste organisme sunt tulpini de formă cocoidă , singur e sau în perechi, lanțuri scurt e, gram
pozitive, microaerofile , fermentație de acid lactic heterofermentativ , produce D( -)-lactatului de CO2
și compuși de aromă din lactoză, mezofil (creșterea optimă de la 20 la 30°C).
22
Tabelul 1.3
Diverse culturi starter de lapte cu metaboliții acestora
Bacterii mezofile de acid lactic Metabolitul major
Lactococcus lactis ssp. lactis L (+) La ctat
Lactococcus lactis ssp. diacetylactis L (+) Lactat, Diacet il
Lactococcus lactis ssp. cremoris L (+) La ctat
Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides D (–) Lactat, Diacet il
Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris D (–) Lactat, Diacet il
Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum D (–) Lactat, Diacet il
Pediococcus acidilactici DL Lactat
Bacterii termofile de acid lactic
Streptococcus thermophilus L(+)Lactat, Acetaldeh ida
Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii D (–) Lactat
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus D (–) Lactat, Acetal dehida
Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis D (–) Lactat
Lactobacillus fermentum DL Lactat, CO 2
Lactobacillus helveticus DL Lactat
Lactobacillus kefir DL Lactat, CO 2
Lactobacillus kefiranofaciens DL Lactat, CO 2
Bacterii terapeutice acid lactic
Lactobacillus acidophilus DL Lactat
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei L (+) La ctat
Lactobacillus paracasei ssp. biovar. Shirota L (+) La ctat
Lactobacillus rhamnosus L (+) La ctat
Lactobacillus reuteri DL Lactat, CO 2
Bifidobacterium adolescentis L(+) Lactat, acetat
Bifidobacte rium bifidum Lactate, acetat
Bifidobacterium breve L(+) Lactat, acetat
Bifidobacterium infantis Lactat, acetat
Bifidobacterium longum L(+) Lactat, acetat
23
Producatorii de aromă :
-Leu. mesenteroides subsp. cremoris
-Leu. mesenteroides subsp. dextranicum
-Leu. lactis
Lista diferitelor startere de lapte cu metaboliții acest ora sunt prezentate în tabelul 1.3 .
1.6.Metabolismul la culturi starter din lactate
Când cultura starter se dezvoltă în lapte, acesta vizează constituenți ai laptelui și aduce
modificări metabolice fermentative. Acesta va produce diferitți intermediari sau produse finale, care
dau atribute tipice pentru lapte fermentat. Rolul jucat de sta rtere în ti mpul fermentării lapte lui sunt:
• produce acid lactic ;
• aduce coagularea proteinelor sub formă de gel ;
• produce compuși de aromă volatili precum diacetil, acetaldehidă și mai mulți compuși
intermediar i;
• să posede activități lipoli tice și proteolitice;
• produce alți compuși precum CO2, alcool, acid propionic, care sunt esenția le în produse precum
chefir, caș caval șvaițer;
• controlează creșterea agenților patogeni și a organismelor dăunătoare ;
• unele culturi alimentare cum ar fi Lb. acidophi lus, oferă beneficii pentru sănătate și p roduce
substanțe antibacteriene;
• ajută la texturarea și maturarea brânzei .
Metabolismul carbohidraților
Lactoza este carbohidratul major din lapte, care este utilizat în diferite proporții în startere .
Bacteriile de acid lactic care conțin aldoze, adică streptococi , Lact ococci, Pediococci și obligatoriu
Lactobacilli homofermentativi efectuează homolactic fermentare a cu producerea de acid lactic
numai ca produsul final. Bacteriile a cidul ui lactic care conțin fosfat -acetilare poate fi împărțită în 2
grupuri. Primul fiind Leuconostocs și obligatoriu Lactobacilli heterofermentativi , urmați de 6-P-
gluconat cu producerea de cantități ech imolar e de CO2, lactat și acetat (Fi g. 1.10), în timp ce
Bifidobacterium, urmea ză calea bifidus, cu formare de acetat și lactat în raport 3:2 m olar. O fosfat –
acetilare induc tibilă este efectuată facultativ de către Lactobacilli heterofermentativi, ceea ce face
posibilă producerea de lactat și acetat de pentoze .
Bacterii lactice au două mecanisme diferite pentru a prelua lactoza din hi droliza ulterioară a
mediului :
1.Cele mai multe dintre Lactobacilli, Leuc onostocs și S. thermophilus încep lactoza prin enzima
permează specifică situat ă în celulă. Lactoza din inter iorul celule i este apoi divizată de enzime B –
galactozidaz e în glucoză și galact oză. A -galactoză este convertit ă la glucoză cu "calea Leloir' și
împreună cu glucoza este fermentat ă cu glicoliza. Fig.1.10 .
24
Glucoză
Glucoză 6 -P
Fructoză 6 -P
Fructoză 1,6 di -P
Gliceraldehidă 3 -P
Aldolase dihydroxy acetone phosphate
1,3, diphosphoglycerate
3, phosphoglycerate
2, phosphoglycerate
Phosphoenol pyruvate
Pyruvate
Lactate dehydrogenase
Lactate or lactic acid
Fig. 1.10 : Cale glicolitică homofermentativă de bacterii acido -lactice
2.Lactococci și câțiva lactobacilli cum ar fi Lb. casei, strâng lactoza și galactoza prin acți unea
sistemului fosfotransferază dependent fosfoenolpiruvat , care implică activitatea catalizatorului de
patru proteine specif ice. Lactoza este fosforilată în timpul tra nsportului și este hidr olizat de β-fosfo
galactozidaza în glucoză și 6 -P galactoză . Galactoza este utilizat ă în acid lactic prin calea 6 -P
tagalose . S. thermophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus și, ocazional, Le. Lactis nu
metaboliz ează g alactoza, dar elimină excreț iile în mediu (Fig. 1.11 ), căile de lactoză și utilizarea
galactozei prin diferite bacterii producătoare de acid lactic a fost descris în Fig. 1.12 ..
Propionibacterii le fermentează acidul lactic, carbohidrați și alcooli polihidroxilici la acidul
propionic, acidul acetic și dioxid de carbon (CO2). Conversia acidului lactic la acidul propionic dă
aromă dulce caracteristic ă cașcavalului șvaițer , în timp ce CO2 ajută la formarea de găuri, găuri
regulate tipice în corpul brânzei, care sunt esențiale în cașcavalul șvaițer .
25
Fig. 1.11 . Cale metabolică heterofermentativă de bacterii acido -lactice
Fig. 1.12 : Utilizarea lactozei și galactozei de diferite bacterii lactice
26
Metabolismul citratului
Citrat ul sau acidul citric este prezent în laptele în concentrații scăzute (media 0,16%) și este
metabolizat numai pe specii producătoare de aromă de culturi mezofile, adică Lc. lactis biovar
diacetilactic și Leuconostoc spp. Metaboliții produși adică diacetil, acetoină, acetat și CO2 sunt
comp uși de aromă importanți în lapte fermentat , brânză maturată și smântână .
Calea de utilizare pentru citrat ul de început în Fig. 1.13 indică faptul că există două moduri de a
produce d iacetil. Acesta este format prin decarboxilare a oxidativă a α -acetolactat ului, care se
exercită în laptele de celule bacteriene. Aici are loc un proces chimic în prezența acidului lactic la
pH scăzut. Cealaltă teorie afirmă că diacetil ul este f ormat în int eriorul celulei bacteriene prin reacția
Co-A-acetil și acetaldehida activă.
Fig. 1.13 : Producerea de compuși aromatizanți de către bacterii producătoare de acid lactic, prin
metabolizare acidului citric
Producția de acetaldehidă
Acetaldehida este unul dintre cei mai imp ortanți compuși de aromă produsă de culturi starter în
lapte fermentat ș i este un compus important de aromă în iaurt. Î n culturile me zofile, precursorul
acetaldehidei este treonina în timp ce în culturile termofile, precursor este zahărul. În afară de
aceasta, acetaldehida poate fi produsă de bacterii producătoare de acid lactic din acizi nucleici,
lipide și com puși aromatici din lapte (fig. 1.14 ).
27
Fig. 1.14 : Producerea de acetaldehidă de culturi starter lactice
Metabolismul proteinelor
Bacteriile de acid lactic sunt pretențio ase nutrițional în natură și necesită mai mulți aminoacizi și
vitamine pentru creșterea lor. Ansamblul sistemul proteolitic de bacterii producătoare de acid lactic
este foarte slab , dar este suficient pentru a permite o creștere exponențială a laptelui. Numerele,
localizarea și specificitatea enzimelor care acționează asupra proteinelor din lapte diferă în mod
considerabil în diferite tulpini. Cazeina este hidrolizat ă în afara peret elui celulă -cu-celulă legat sau
secretat cu proteaze în oligopeptide . Acestea sunt hidrolizate în continuare la peptide și aminoacizi
mici de peptidaze legate de membrană, conform indicațiilor de mai jos :
Protein e de lapte Peptide Aminoacizi
Protei naze Peptida ze
Metabolismul proteinelor în startere lactice
Activitatea proteolitică a culturii starter este importantă deoarece duce la :
(I) Eliberare a de peptide și aminoacizi, care afectează structura fizică a produsului.
(Ii) Mulți a minoacizi produși sunt esențiali pentru creșterea mai multor culturi.
(Iii) Peptidele și aminoacizi acți onează ca precursori de arome.
28
Metabolismul lipidic
Bacterii le starter sunt foarte slab lipolitic și pot avea lipaze și esteraze care pot hidroliza
trigliceridele la scăderea acizilor grași. Startere le pot produce anumiți acizi grași volatil i, (C2 – C6)
din aminoacizi . Această ac tivitate a starterului contribuie la aromă la produse le lactate fermentate.
Metabolismul vitaminelor
Laptele conține mai multă apă sau vitamine liposolubile. Atunci când culturile starter cresc în
lapte, unele vit amine pot fi utilizate de acestea, ceea ce duce la scăderea acestora. Pe de altă parte
anumite vitamine pot fi sintetizate , de ase menea, ceea ce duce la sporirea conținutului în laptele
fermentat. Această creștere sau descreștere depinde în ma re măsură de tulpina starterului . Cu toate
acestea, în general, este raportat că bacteriile din iaurt sintetizează acid folic, niacina si vitamina B6.
Propionibacteria este cunoscută pentru producerea de vitamina B12.
Producția de bacteriocine
Bacteriile de acid lactic exercită efect antagonist împotriva multor altor organisme, din cauza
producției mai multor substanțe antimicrobiene. Acestea includ acidul lactic, acidul acetic, alți acizi
organici, peroxid de hidrogen, diacetil, reducerea pH-ul și EH și a unui număr de bacteriocine.
Bacteriocine le sunt proteine le produse de bacterii care sunt inhibitoare la specii înrudite. Cu toate
aceste a, unele dintre bacteriocine producătoare de bacterii de acid lactic au arătat activități cu
spectru larg. Mecanismul exact de sinteză și alte caracteristici ale multor bacteriocine nu sunt încă
clare. Cu toate acestea, nisin este singura care este complet caracterizat ă și utilizat ă ca și conservant
alimentar, alte bacteriocine produse de bacterii producătoare de acid lactic sunt Acidophilin,
Lactocidin, Brevicin, Helveticin etc.
29
CAPITOLUL II
2. Materiale și metode
2.1. Prepararea și sterilizarea mediilor de cultură
Un mediu de cultură reprezintă un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie să asigure
microorganismelor cantitatea necesară de apă, sursa de carbon, de azot, săruri minerale, factori de
creștere, deci care să le furnizeze substanțele și energia necesare în procesele de creștere,
reproducere și întreținerea funcțiilor vitale.
Mediul de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiții:
-să corespundă din punct de vedere nutritiv;
-să aibă o concentrație a substanț elor dizolvate care să nu influențeze negativ schimburile
osmotice ale celulei ;
-să nu conțină substanț e toxice;
-să aibă un anumit pH ;
-să fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel încât să se dezvolte numai celulele introduse
prin inocul.
Mediile de cultură se folosesc în practica de laborator sau în practica industrială și sunt foarte
diferențiate în funcție de scopul urmărit. În tehnica de laborator mediile se folosesc pentru izolarea
din mediul natural a diferitelor microorganisme, pentru obținerea de culturi pure, pentru întreținerea
culturilor selecționate. În scopuri industriale, me diile de cultură sunt utilizate pentru obținere de
biomasă sau a unor compuși de natură microbiană.
După scopul utilizării lor, mediile de cultură se împart în:
-medii de cultură generale care asigură dezvoltarea unui mare număr de specii ;
-medii de cultură selective care permit dezvoltarea unui număr restrâns de microorganisme ;
-medii de cultură de diferențiere care permit separarea speciilor în funcție de anumite caractere
biochimice ;
-medii de îmbogățire destinate separării și cultiv ării unor microorganisme pretențioase din punct
de vedere nutritiv sau care se află în număr redus ;
-medii de conservare ;
-medii de cultură industriale ;
Din punct de vedere al compoziției chimice, mediile de cultură se împart în 3 categorii:
-medii naturale (empirice) de origine animală sau vegetală, cu o compoziție chimică nedefinită în
mod exact;
-medii sintetice: acestea sunt soluții de substanțe chi mice pure în apă distilată, cu o compoziție
perfect determinată;
-medii semi -sintetice: sunt constituite din produse chimice bine definite, dar și din produse de
origine naturală (cu compoziție cunoscută).
Constituenții principali ai mediilor de cultu ră sunt:
30
1. Extracte de carne și macerate
Aceste produse, comercializate în formă concentrată sub denumirea de “extracte de carne”,
conțin în principal proteine puțin hidrolizate, glucide, săruri minerale, vitamine hidrosolubile.
Compoziția lor variază î n funcție de carnea utilizată pentru preparare.
2. Extracte de drojdie
Aceste extracte, comercializate sub formă deshidratată, sunt preparate din drojdia de bere,
fiind utilizate ca sursă de aminoacizi și de vitamine hidrosolubile (vitamine din complex ul B).
3. Peptone și hidrolizate
Peptonele reprezintă un amestec de compuși solubili în apă care provin în urma acțiunii
enzimelor asupra materialului proteic. Pot fi: peptonă pepsică din carne, peptonă tripsică din
cazeină (cu conținut crescut în tripto fan), peptonă pancreatică de cazeină, peptonă tripsică de carne,
peptonă papainică de soia, peptone compuse.
Hidrolizatele sunt peptone obținute în urma acțiunii compușilor anorganici asupra
proteinelor (acid clorhidric de ex.). Cel mai des întrebuințat e ste hidrolizatul acid de cazeină,
conținând aminoacizii constitutivi ai cazeinei din lapte.
4. Agar -agarul sau geloza
Agar -agarul denumit și geloză este un extract de alge roșii (Rhodophyceae) din genul
Gelidium și Gracilaria, recoltate în mările Japonie i sau ale Noii Zeelande. Se dizolvă în apă la o
temperatură în jur de 900C și se solidifică sub 450C, fiind utilizat pentru solidificarea mediilor de
cultură. Nu este degradat de microorganismele obișnuite. Este comercializat în forma sa inițială
deshidrat ată, numit “agar fibre” (foarte impur), sub formă de paiete (mai puțin impur), sau sub
formă de pulbere.
Numeroase firme sunt specializate în producerea și comercializarea mediilor de cultură de
laborator (firma Difco, Merck, Biokar, Oxoid).
Mediile fermentative sunt medii de cultură industriale destinate producerii unor cantități
mari de celule sau produși de metabolism. În compozitia acestor medii intră ca surse de carbon:
melasa, produs secundar rezultat la fabricarea zahărului și care conț ine 45 – 55% zaharoză, diferite
tipuri de făinuri, cereale boabe, zer bogat în lactoză, tărâțe etc. Dintre sursele de azot cel mai des
folosite sunt: făinurile proteice de soia, sulfatul de amoniu, ureea, îngrășământul complex. Ca săruri
minerale se adaugă fosfați, sulfați, cloruri etc. Pentru cultivarea microorganismelor care necesită
factori de creștere, se adaugă extract de porumb (obținut prin concentrarea apelor rezultate la
înmuierea porumbului, bogat in aminoacizi, vitamine, acid lactic, microelement e), extract de
drojdie, extract din radicele de malț și germeni de grâu și porumb.
2.2.Materiale
2.2.1.Medii de cultură
Mucegaiurile au fost izolate și cultivate pentru întreținerea pe mediul de cultură POTATO
DEXTROSE AGAR cu următoarea compoziție: Potato Extract (5 g/L); Glucose (20 g/L); Agar (17
g/L). Acest mediu a fost sterilizat timp de 15 minute la 121 ̊ C în a utoclav.
Mediul de cultură natural pentru sporularea mucegaiurilor a fost reprezentat de următoarele
boabe: grâu, soia, porumb și orez (50 g de boabe + 10 mL apă sterilă).
31
2.2.2.Materiale alimentare
Tulpinile de mucegai au fost izolate din următoarele sortimente de brânză:
-Brie (mucegai alb) -Penicillium Camembert;
-Paladine (mucvegai verde) -Penicillium Roqueforti;
Speciile special selecționate
Dincolo de multitudinea speciilor de mucegaiuri dăunătoare, printre cele benefice se numără și
cele cultivate datorită calităților deosebite și importanței pe care o au în industria alimentară.
Definite general, mucegaiurile sunt microorganisme ale că ror celule sunt de tip eucariot, cu organ
vegetal monocelular sau pluricelular – organ reproducător diferențiat. Habitatul mucegaiurilor este
stratul superficial al solului, unde rezistă uscăciunii și diferențelor de temperatură, majoritatea
speciilor fiin d aerobe. Ca urmare a capacității de adaptare la cele mai diferite medii, mucegaiurile se
pot răspândi în alte habitaturi, dacă nu sunt controlate. În apă, prezența lor este ocazională, din
cauza lipsei condițiilor de dezvoltare.
Mucegaiurile selecțio nate, mucegaiuri
folosite în industria alimentară și
farmaceutică, se regăsesc și în fabricarea
brânzeturilor cu pastă mucegăită,
echipamentul enzimatic contribuind la
procesul de maturare. Celula de bază a
mucegaiurilor deține anumite particularități
care îi conferă o structură
complexă. Creșterea și reproducerea
mucegaiurilor este evidențiată prin
momentul în care sporii sau fragmentele de
mucegaiuri ajung pe un mediu nutritiv,
odată cu germinarea și creșterea radială a
tuburilor germinative, numite “hife ” –
organe ale creșterii vegetative. Hifele
îndeplinesc funcția de absorbție a
substanțelor nutritive, de fixare a mucegaiului pe mediu nutritiv (rizoizi), funcția de extindere
(stoloni) și funcția de reproducere.
Totalitatea hifelor ce se dezvoltă în tr-un por formează colonia cu aspecte diferite, în funcție de
specie. Coloniile mucegaiurilor superioare au o creștere limitată și un aspect prăfos, catifelat, de
culori date de pigmenții sintetizați: alb, roz, portocaliu, verde, brun, până la negru. Pe de altă
parte, coloniile mucegaiurilor inferioare se extind pe întreaga suprafață a mediului de cultură, cu un
aspect pâslos, de culori mai puțin variate: alb, cenușiu, brun.
Mucegaiul nobil alb (Penicillium candium) este folosit curent în industria brân zeturilor, datorită
aromelor inoculate produsului care îl găzduiește, arome apreciate de către consumatori. De
exemplu, Penicillium cammemberti și Penicilium roquefort derivă din denumirile brânzeturilor pe
care le domină organoleptic.
32
Înnobil ate cu mucegai
Enumerate alfabetic, pentru a evita suspiciunile apărute în urma aleatoriului, sortimentele Blue
Stilton, Brie, Camembert, Gorgonzola și Roquefort sunt brânzeturi obținute din lapte de vacă, oaie
sau capră, cărora li s -au adăugat cult uri de mucegai nobil cultivat (Penicilium), încât acestea să se
evidențieze, pe lângă aroma distinsă și distinctă, prin striații cu mucegai albastru, albastru -gri sau
albastru -verde.
E unul dintre motivele pentru care grupa acestor sortimente de brânzeturi se numește Blue
cheese (brânză albastră). Brânzeturile învechite în mediu, cu temperatură controlată, sortimentele
Blue cheese au o aromă fină, potrivit de sărată și ușor iute -picant. Mirosul este datorat, aproape în
exclusivitate, mucegaiurile dezvoltate în compoziție. “Blue cheese” este însă o denumire
metaforică, brânza Camembert prezentând mucegai alb la exterior, în timp ce Roquefort este
caracterizată prin dâre de mucegai v erzi-cenușii.
Brânza Camembert
Istoric
Conform tradiției , ar fi fost creat de țăranca Marie Harel, sub îndrumarea unui preot „refractar”
(fidel papei de la Roma în timpul Revoluției f ranceze ) venit din Meaux , unde se produce
brânza Brie. Producția s -a dezvoltat puternic cu inaugurarea lini ei de c ale ferată între Paris și orașul
normand Caen , care a permis producătorilor să vândă brânzeturi camembert în capitala franceză. În
anul 1890, inginerul Jules Charrel a inventat o cutie de lemn pe ntru a proteja brânza camembert în
timpul transportului, ceea ce a avut ca rezultat o nouă creștere substanțială a vânzărilor. În anul
1894 se vindeau 2.330 tone de camembert la piața centrală din Paris, Les Halles.
În lipsa unei protecții, camembertu l a fost copiat rapid de producători situați într -o altă regiune.
În anul 1909 s -a înființat „Sindicatul producătorilor adevăratului camembert din Normandia”
(în franceză Syndicat des Fabricants du Véritable Camembert de Normandie , prescurtat SFVCN),
care a încearcat să -și protejeze producția. La momentul respectiv, camembert -ul a fost definit ca „o
brânză cu pasta moale scursă, nepresată, nemalaxată, ușor sărată, cu crust ă de mucegai, cu formă
rotundă, cu greutatea maximă de 350 g, cu diametrul de 10-11 cm, cu un conținut de substanță
uscată grasă mai mare decât 38%, preparată din lapte de vacă pur și produs în Normandia
inferioară.”Totuși, Curtea de Apel din Orléans a sta tuat în 1926 ca numele „camembert” a devenit o
denumire generică, trecută în domeniul public.
Denumirea de origine controlată (AOC) „camembert din Normandia” a fost creată în 1983
pentru a proteja producția în Normandia și metoda tradițională de prepa rare a brânzei, cu lapte crud
și modelare cu polonic. Această protecție a fost extinsă în anul 2009 asupra întregii Uniunii
Europene printr -o denumire de origine protejată (AOP).
Producț ia
Brânza Camembert poartă denumirea localității franceze de origine cu același nume, situată în
Normandia, unde sortimentul a fost preparat pentru prima dată, în anii 1600, din lapte de vacă
nepasteurizat, adăugat cu cheag și bacterii specifice. Forma actuală, necoaptă și n epresată, se
33
fabrică de aproximativ 200 de ani. Camembert este un sortiment cu umiditate mare (66%), maturat
prin utilizarea bacteriilor lactic și mucegai alb, dezvoltat la suprafața calupului.
Există mai multe metode de fabricație. În general, laptel e este coagulat prin adăugarea de cheag.
Numai laptele crud este folosit pentru camembertul din Normandia AOP, dar ceilalți producători
pot utiliza lapte microfiltrat, tratat termic sau pasteurizat. Laptele închegat este tăiat, pus în forme și
scurs. Ciupe rca Penicillium candidum (sau Penicillium camemberti ) este aplicată prin pulverizare.
Acest mucegai este direct responsabil de crusta caracteristică albă a camembert -ului; orice punct
roșu este cauzat de bacteria Brevibacterium linens . Brânza este apoi mat urată pentru o perioadă de 4
până la 12 de săptămâni. Procentul de grăsimi în camembert este de 23% (45% în substanța uscată).
La maturare, sunt folosite bacterii lactice , precum Streptococcus lactis și Streptococcus
diacetilactis, bacterii alcalinizante (Brevibacterium limens – bacterie producătoare a pigmentului
roșiatic) și spori de mucegai Penicilium casei colum (Penicilium candidum) sau Penicilium
Camemberti (Penicilium album), cu care se însămânțează laptele. De asemenea, se adaugă cult urile
alcalinizante Bacillus firimitatis și Micrococus meldensis.
Adaosul de spori de mucegai, în proporție de 30 -80 ml/100 litri lapte, trebuie să conducă la o
suspensie de spori, care trebuie să
conțină 20 de milioane spori/centimetru
cub. În proce deul original, concentratul
ultrarafinat (17 -19% total substanțe
azotoase) este standardizat prin adaos
de smântână dulce, înaintea inseminării
cu bacterii lactice și inoculării sporilor
Penicillium.
Maturarea laptelui pentru
Camembert, realizată până la o aciditate
ridicată, durează aproximativ 30 de zile
și începe (după 4 -6 zile) cu dezvoltarea
mucegaiului Penicilium candidum (P.
album), care consumă acidul lactic și surplusul de lactoză, la suprafața calupului, realizând condiții
optime dezvoltării bacteriilor alcalinizante, realizatoare a proteolizei.
Producția totală franceză de camembert a fost de 105.296 tone în anul 2013,
inclusiv 5.112 tone (5%) de camembert din Normandia AOP. În fiecare an se exportă
aproximativ 30.000 tone din Franța.
Brânza Roquefort
Specia P. roqueforti apartine Regnului Fungi, Subregnul Ascomycota, Clasa Eurotiomycetes,
Familia Trichomaceae, Genul Penicillium.
Este un mucegai saprotrofic, larg răspandit în natură și poate fi izolat din sol, în substanțe
organice și părț i ale plantelor.
Rolul major al acestui mucegai este în industria brâ nzeturilor – producerea brâ nzetu rilor albastre,
producerea agenților de aromă , antib acterian, producerea de lipaze și proteaze ș i alte enzime.
34
Este constituentul major al brânzei Roquefort, Stilton, și a altor tipuri de brânză albastră;
consumate încă din anul 500 . Însă în anumite condiț ii Penicillium roqueforti este capabil să producă
metaboliți secundari dăunători, cum sunt alcaloizii ș i micotoxine le, constituind astfel un risc major
pentru oameni.
Roquefortul este o brânză franceză din lapte de oaie, cu pastă cu mucegai . Se produce în sudul
Franței și în special în comuna Roquefort -sur-Soulzon , al cărei nume îl poartă.
Aceasta este produsă din lapte care pro vină exclusiv de oaie din rasa Lacaune . Laptele este
încălzit la 28 -34°C, închegat și coagulat, după care coagulul este tăiat, bătut, scurs și pus în forme
pentru o a doua scurgere. Formele de brânză sunt sărate și perforate cu ace pentru o bună circulație
a aerului, după care sunt maturate. Brânzeturi Roquefort AOP sunt maturate exclusiv în pivnițe
specifice pe terito riul satului Roquefort, denumite „fleurines”.
Brânza Roquefort este tot un sortiment specific franțuzesc, preparat din lapte de oaie. Face parte
din familia brânzeturilor inseminate cu mucegai și este una dintre cele mai cunoscute brânze
albastre. La începuturi, mucegaiul care determina caracterul distinctiv al acestui produs (Penicilium
roqeforti) era obținut, în mod tradițional, din pâinea lăsată de producători în peșteri, timp de 1 -2
luni. În engleză, este folosită denumirea de Roquefort cheese .
Este necesar un total de 4,5 litri de lapte pentru
prepararea unui kilogram de brânză. Rasele de oi
acceptate pentru laptele materie primă destinat
brânzei originale trebuie să fi pășunat în regiuni
delimitate. Doar șapte producători respectă aceste
reguli stricte. Numele “Roquefort” este protejat,
având statut de produs cu denumire de origine
(PDO), fabricat în Franța.
Studiile cercetătorilor evidențiază că, în afara
culturilor de bacterii lactice și de Penicillium
roqueforti, microflora brânzei Roq uefort fabricată
din lapte de oaie crud conține drojdii, lactobacili, micrococi, stafilococi, bacterii coliforme.
Lactococii sunt întotdeauna dominanți în brânză, iar drojdiile și speciile de Leuconostoc sunt
prezente încă de la începutul maturării.
Produsul finit se prezintă sub forma unui cilindru, cu greutatea între 2 și 3 kg. Pasta este de
culoarea fildeșului, cu mucegai albastru ( Penicillium Roqueforti ) distribuit uniform. Are un conținut
minim de substanță uscată de 55% și un conținut minim de grăsime de 52%.
Roquefortul a fost menționat pentru prima dată în secolul al XI -lea. În secolul al XV -lea,
regele Carol al VII -lea al Franței le-a acordat monop olul de maturare locuitorilor din Roquefort. În
anul 1925, a devenit prima brânză protejată de o denumire de origine controlată (AOC) în Franța .
Denumirea a fost extinsă la nivelul internațional în 1951. În prezent, Roquefortul este reglementat
de o denumire de origine protejată (AOP) în Uniunea Europeană . Producția de Roquefort AOP era
de 19.000 tone în anul 2005.
Varianta românească a brânzei Roquefort (Bucegi) este o brânză moale, a cărei fermentare are
loc sub acțiunea unui mucegai verde -albastru, care se dezvoltă în interiorul brânzei, sub forma unor
artere, imprimând produsului gust aparte și aromă specifică. Se prepară din lapte de oaie, din
35
amestec de lapte de oaie cu lapte de vacă sau numai din lapte de vacă. Pentru a putea permite
accesul aerului necesar dezvoltării mucegaiului în interiorul bucăților de brânză, acestea sunt
înțepate cu ace speciale, în 50 -70 de locuri sau sunt perforate cu ajutorul unei mașini speciale.
Pentru maturare, brânzeturile sunt transportate în încăperi unde nivelul temperaturii este de 5 -7
grade Celsius, iar umiditatea relativă a aerului (90 -95%) s timulează o bună dezvoltare a
mucegaiului. În camerele de maturare, pe suprafața brânzei apare un mucilagiu, care se îndepărtează
cu un cuțit. După 3 -5 săptămâni de la procesare, bucățile de brânză se ambalează în foiță metalică,
continuând fermentarea sub această formă. Pasta este alb -gălbuie, prezentând artere de mucegai
verde -albăstrui.
Gorgonzola este un sortiment de brânză produs în Italia (regiunile nordice Lombardia și
Piemont), din lapte de vacă integral căruia i se adaugă bacterii starter și s pori de mucegai din grupul
Penicilium. De -a lungul maturării, derulată la temperaturi scăzute, din/în brânză sunt constant și
rapid introduse și retrase tije din metal destinate deschiderii de canale de aer, pentru a facilita
dezvoltarea sporilor de muceg ai. Rezultatul constă în apariția nervurilor colorate albastru -verzui,
caracteristice Blue cheese .
Gorgonzola devine mai fermă în consistență, pe timpul unui proces de maturare mai îndelungat,
durata medie a acestuia variind între trei și patru luni. Conform legislației italiene, Gorgonzola se
bucură de statutul “denumire geografică protejată”, putând fi produsă exclusiv în provincii italiene
precum Milano, Novara, Como, Brescia s.a.
2.3. Mod de lucru
Izolarea tulpinilor de mucegai s -a făcut cu ansa prin prelevare de spori din probele de brânză.
Culturile au fost efectuate pe mediul PDA în eprubete și au fost păstrate până la utilizare în
frigider la 4̊ C.
Culturile pe mediile naturale r eprezentate de boabe de: grâu, soia, porumb și orez au fost
obținute astfel: în flacoane Erlenmayer conținând 50 g de mediu sterilizat s -au introdus câte 10 mL
de inocul sporifer obținut din eprubetele cu mucegai.
Culturile au fost păstrate pentru dez voltare la temperatura camerei timp de trei săptămâni cu
agitare zilnică.
Aparatură utilizată: hotă microbiologică, termostat, microscop, autoclav, balanțe.
Fig. 2.1. Paharele Erlenmayer cu mediul de cultură
36
Fig. 2.2. Mediu de cultură de porumb cu Penicillium din brânza Brie și Paladine
Fig. 2.3. Mediu de cultură de soia cu Penicillium din brânza Paladine și Brie
37
Fig. 2.4. Mediu de cultură de orez cu Penicillium din brânza Brie și Paladine
Fig. 2.5. Mediu de cultură de grâu cu Penicil lium din brânza Paladine și Brie
38
CAPITOLUL III
3.Rezultate și discuții
3.1.Determinarea numărului de spori de mucegai la microscop
Metoda Camera Thoma
Estimarea densității populațiilor microbiene cu ajutorul camerei Thoma este o metodă directă de
numărare a celulelor, rapidă și ușor de efectuat, cu utilizări în stabilirea dinamicii de acumulare a
celulelor microbiene într -un mediu de cultură, în scopul urmăririi formării de biomasă, de obținere a
unui inocul sau în diferitele procese fermentative. Metoda prezintă dezavantajul că nu deosebește
celulele vii de cele moarte, este greu de aplicat pentru bacterii de dimensiuni mici, necesită
suspensii celulare destul de dese și nu este foarte exactă.
Principiul metodei: Camerele de numărat reprezintă lame de sticlă prevăzute cu trei platforme,
din care platforma centrală este denivelată față de celelalte două cu 0,10 mm. Camera Thoma
prezintă o rețea cu suprafața de 1 mm2, divizată în 400 microcelule elementare, numărătoarea
făcându -se în grupuri de 1 6 microcelule.
Materiale utilizate:
– suspensii de celule de drojdie și spori de muceagi în apă;
– lamele;
– camera Thoma;
– pipete sterile.
– microscop.
Fig. 3.1.
39
Mod de lucru:
Se execută un preparat umed, plasând suspensia de celule pe suprafața rețelei. Se așează lamela,
care, sprijinindu -se pe cele două platforme laterale, va delimita înălțimea stratului de lichid, egală
cu adâncimea camerei (0,1 mm). Pre paratul astfel obținut se fixează cu cleme de platina
microscopului și se caută imaginea rețelei. In câmpul microscopic , prin deplasarea platinei se pot
aduce grupe de câte 16 microcelule elementare și se face numărarea celulelor de drojdii. Se exclud
de la numărare celulele care se află cu mai mult de jumătate din suprafața celulei în exteriorul
careului de 4 x 4. Se fac numărări din mai multe câmpuri microscopice (minimum 5) și se
calculează numărul mediu de celule dintr -o microcelulă. Cunoscând supr afața unei microcelule și
volumul său (
V mm 1
4001
103 ), în funcție de diluția folosită la numărare, se poate calcula numărul
de celule prezente într -un cm3 lichid de analizat,
cu formula:
N = n x 4000 x 1000 x k
în care:
n = numărul mediu de cel ule pe microcelulă;
4000 = volumul microcelulei, în cm3;
1000 = factor de transformare în cm3;
k = coeficientul de diluție.
Rezultate obținute:
Fig. 3.2. Aspectul microscopic al sporilor de mucegai Penicillium Camembert din brânza Brie
40
Fig. 3.3. Aspectul microscopic al sporilor de mucegai Penicillium Roqueforti din brânza Paladine
Tabelul 3.1.
Rezultatele o bținute prin citirea la microscop
Grâu Soia Porumb Orez
Brie
13,25×106 spori/ml
30×106 spori/ml
9×106 spori/ml
24×106 spori/ml
Paladine
22,5×106 spori/ml
39×106 spori/ml
12×106 spori/ml
28,5×106 spori/ml
3.2. Riscuri pentru producție, desfacere și consum
Brânza cu mucegai nobil albastru conține o cantitate considerabilă de sodiu și grăsimi saturate,
compoziție ce trebuie adusă la cunoștința consumatorului pentru ca acesta să și -o asume, la alegerea
sortimentelor. Deși pentru brânzeturile cu mucegai, atât levurile cât și fungii filamentoși au un rol
foarte important în procesul de maturare, dezvoltarea lor trebuie prevenită în majoritatea cazurilor.
Ignorând pierderile economice rezultate din alterarea acestor microorganisme, prezența fungilor
prezintă un interes considerabil pentru sănătatea umană, datorită posibilității formării micotoxinelor,
metaboliți fungici toxici. Suprafața brânzei este considerată un foarte bun substrat pentru
dezvoltarea fungilor, maturarea făcându -se pentru majoritatea sortimentelor în aer liber și la o
umiditate relativă ridicată.
Simultan cu posibilitatea contaminări i la maturare, acest tip de contaminare micotică
semnificativă este urmarea probabilă a manipulărilor repetate, ținând cont că aceste probe sunt
achiziționate din super sau hipermarket, unde produsele rezultate din calupuri mai mari sunt
reambalate și recâ ntărite. Respectarea condițiilor de igienă de -a lungul fluxului productiv
41
garantează sănătatea consumatorului, prin calitatea neîndoielnică a produsului, chiar dacă acesta
este preparat tradițional, fără pasteurizarea laptelui materie primă.
Multe linii de Penicillium roqueforti izolate din branza albastra comerciala, din boabele de
cereale mucegaite si nuci produc in laborator micotoxine (Jong si Gantt, 1987).
Aceste micotoxine includ isofumigoclavina C, acidul penicilic, toxina PR, botriodip loidina si
roquefortina.
Efectele rezultate in urma ingestiei acestor micotoxine sunt mutagenitate, cancerogeneza,
leziuni hepatice, renale si ale nervilor. Studii in laborator au demonstrat toxicitatea acestor
micotoxine pentru oameni (Wei et al., 1 985). Dozele la care au fost observate aceste efecte se
bazeaza pe DL50 (doza letala medie). Doua dintre aceste toxine, roquefortina si toxina PR au la
vertebrate valoarea (Kough,1991):
DL50 10 mg/ kg administrata intraperitoneal.
La unele specii de soareci doza este mai crescuta, respectiv
184 mg/ kg i.p.(Arnold si col, 1987). Nu exista inca date
referitoare la o doza orala letala.
Productia acestor toxine este legata de compozitia
substratului de crestere si de obicei apare in fa zele stationare
ale culturilor.
Dintre riscurile brânzei Roquefort asupra consumatorului
se evidențiază Roquefortina și toxina PR. Roquefortina este o
micotoxină cu indol, produsă de Penicilium roqueforti și de
alte specii precum: Penicilium notatum, Penicilium oxalicum,
Penicilium urticae sau Penicilium expansium. Roquefortina
este prima care ocupă micelii de suprafață ai culturilor de
Penicilium roqueforti.
Formele chimice pentru roquefortina, toxina PR si
isoflumicina A, micotoxinele P. r oqueforti
Sursa: Austwick.P.K.C. 1986. Human mycotoxicosis – past,
present and future. Chemistry and Industry. 6 Aug. 547 -551
Este produsă, în fapt, pe toate liniile Penicilium roqueforti din brânza albastră sau folosită ca
starteri pentru aceasta. Studii de laborator au demonstrat posibilitatea apariției leziunilor hepatice
sau renale, în urma ingestiei micotoxinelor de acest tip. Pe de altă parte, au fost infirmate
“proprietățile mutagene” sau “efectul carcinogen”, ce ar rezulta din existența unor cantități reduse
de Roquefortina în brânza albastru. Totuși, acestea nu pot parafa lipsa unor riscuri pentru sănătatea
consumatorului.
Scott and Kennedy (1976) au gasit concentratii pana la 6.8 mg/kg in probele de branza albastra
din magazine pe care le -au examinat.
42
Ware si col. (1980) au raportat nivele de 0.42 æg/g in 12 probe de branza albastra si nivele de
0.045 æg/g in doua pro be de invelis de branza albastra.
Toxina PR este unul dintre metaboliții cei mai toxici ai Penicilium roqueforti. Condițiile de
formare a Toxinei PR țin de dezvoltarea acesteia, exclusiv în culturile staționare, între zilele 9 și 35
de incubație, sc ăzând până la dispariția din ziua a 120 -a. Toxina, remarcată doar în mediile în care
pH-ul s-a situat între valori de 4,5 și 9, s -a dezvoltat la o temperatură optimă de 24 de grade Celsius.
În condiții de microaerofilie, nu s -au format toxine, ceea ce pres upune că, în general, Toxina PR nu
apare în sortimentele de brânză care asigură condiții de microaerifilie.
Folosind cromatografia, toxina PR poate fi detectata prin fluorescenta cu lumina ultravioleta.
Toxina PR reacționează în contact cu amoniacul și cu aminoacizii liberi, prezenți în brânza
albastră, în concentrații crescute. Toxina intră în reacții datorită funcției sale aldehidice. Aceasta a
fost izolată pe medii de Penicilium roqueforti incubate în medii speciale și medii de producție a
brânzet urilor, constatându -se că apariția Toxinei PR nu este favorizată de maturarea brânzeturilor.
Compoziția mediului conform, utilizat pentru producerea brânzei albastre și lunga perioadă pe
care o necesită maturarea acesteia, precum și condițiile de ferm entare corecte conduc spre
posibilitatea limitată a producerii Toxinei PR sau spre inexistența acesteia. Astfel, producerea
toxinelor formate de penicilium Roqueforti, utilizat pentru producerea lipiazei, reprezintă un risc
scăzut pentru sănătatea și sigur anța consumatorilor.
Efectele micotoxinei
Doza letala de toxina PR pura administrata intraperitoneal la soareci este de 11 mg/kg. Cea orala
este de 115 mg/kg. Dupa 10 minute de la administrare animalele prezinta dificultati in respiratie
care persista pana la moarte care apare in maxim 36 de ore. Necropsic, leziunile prezente la
animalele moarte au fost: congestia gastrica si a mucoasei intestinale cu prezenta de gaze intre
mucoasa si seroasa, congestia si edem pulmonar, leziuni degenerative renale si ale sistemului
nervos central (Wei et al., 1973 ).
Chen si col. (1982) au studiat efectul toxic al toxinei PR pe soareci, sobolani, pisici si preparate
celulare cardiace. Efectele toxice au fost reprezentate de: dureri abdominale, scaderea activitatilor
motorii si a respiratiei, slabiciune muscula ra si ataxie. Mai tarziu, a aparut ascita, edeme scrotale si
pulmonare, lichide pleurale si pericardice. In stadiile avansate, de soc, a aparut aritmia cardiaca.
Concluziile finale au fost ca toxina PR produce efecte toxice acute la animale prin cresterea
permeabilitatii capilare si lezarea directa a plamanilor, inimii, ficatului si rinichilor.
Polonelli si col.(1982) au facut primele studii in ce priveste efectul cancerogen al toxinei PR pe
soareci. Rezultatele au fost de tu mori in 20% din cazuri; tumorile fiind: epiteliom scuamos celular –
in maxim 449 de zile si sarcom uterin – in 551 de zile.
3.3. Concluzii
-Mediul de cultură de porumb cu Penicillium din brânză Brie și Paladine s -a dezvoltat cel mai
puțin.
43
-Mediul de cultură de orez cu Penicillium din brânza Brie a crescut foarte bine având un aspect
pufos , de culoare albă foarte curat, în timp ce cu Penicillium din brânza Paladine nu prea s -a
dezvoltat.
-Mediul de cultură de grâu cu Penicillium d in brânza Paladine s -a dezvoltat foarte bine având un
aspect pufos de culoare închisă, în timp ce cu Penicillium din brânza Brie s -a dezvoltat foarte puțin.
-Pe mediile de cultură de soia sau dezvoltat cel mai bine, pe cel cu Penicililium din brânza B rie
având un aspect pufos de culoare albă, iar la cel din brânza Paladine are un aspect pufos, dar de
culoare închisă.
-La toate aceste medii de cultură am verificat aspectul la microscop, la toate s -au vazut foarte
clar hifele și sporii prezenți, înt r-un număr mai mic sau mai mare, în funcție de categoria mediului
de cultură.
Riscul pentru oameni
Penicilium roqueforti este un organism benign, nepatogen.
In literatura a fost citat un singur caz de patogenitate: Campbell si col. (1983) au descris un
pacient care lucra intr -o fabrica in care se fabrica branza albastra utilizandu -se P. roqueforti. Acest
pacient prezenta tuse, dispnee, reducerea volumului pulmonar. O radiografie pulonara a relevat
infiltrate bilaterale. Lichidul de lavaj bronho -alveolar a continut multe limfocite si anticorpi anti -P.
roqueforti. Astfel de anticorpi au fost de asemenea prezenti in serul pacientului. Oricum reactiile
alergice date de acest mucegai sunt reduse tinand cont de productia extensiva a branze turilor.
Efectul potential asupra sanatatii omului al P. roqueforti este producerea de micotoxine. Cele
mai toxice dintre acestea sunt reprezentate de catre toxina PR si Roquefortina. Celelalte miotoxine
produse de catre acesta sunt mai putin toxice s i produse la un nivel mai scazut. Efectele asupra
sanatatii omului ale toxinei PR si roquefortinei se bazeaza in principal pe date obtinute din studii pe
animale.
Roquefortina a fost extrasa din branza albastra in cantitati mici si nu s -au raportat ef ecte adverse
ale consumatorilor acestui tip de branza.
Toxina PR cauzeaza efecte toxice la animale de experienta si chiar moartea acestora. Ea a fost
extrasa din branza albastra in cantitati mici, ca si roquefortina, insa datele din literatura indica faptul
ca toxina PR este instabila in acest tip de branza. Tocmai acest lucru este responsabil de absenta
efectelor adverse ale consumatorilor acestui tip de branza.
Compozitia mediului utilizat pentru producerea branzei albastre si perioada lunga de timp
necesara maturarii ei, precum si conditiile de fermentare au dus la rezultate variabile privind
compozitia si cantitatea de micotoxine produse. In aceste conditii producerea de micotoxine este
anticipata a se produce la nivele reduse sau deloc.
In concluzie formarea acestor micotoxine produse de P. roqueforti utilizat pentru producerea de
lipaza este considerata a avea un risc scazut pentru sanatatea si siguranta publica.
44
BIBLIOGRAFIE
[1] Arnold, D.L., P.M. Scott, P.F. McGuire, J. Hawig and E.A. Nera. 1987. Acute toxicity studies
on roquefortine and P.R. toxin, metabolites of Penicillium roqueforti in the mouse. Cosmet.
Toxicol. 16:369371.
[2] Bibek Ray, Arun Bhijnia, Fundamental food microbiology, Fourth edition, RC Press, 2008
[3] Campbell, J.A., M.J. Kryda, M.W. Trauhaff, J.J. Marx, Jr., and R.C. Roberts. 1983. Cheese
workers hypersensitivity pneumonitis. Ann.(3) Rev. Resp. Dis. 127:4954 96.
[4] Chen, F.C., C.F. Chen and R.D. Wei. 1982. Acute toxicity of PR Toxin, a Mycotoxin from
Penicillium roqueforti . Toxicol. 20:433, 431.
[5] D. N. Gandhi, Food and industrial microbiology, Microbiology of fermented dairy products,
September 2006
[6] Dan V., Microbiologia alimentelor, editura Alma, Galati, 2001
[7] Dire, D., S. Moreau and M. Cacan. 1978. Use of a Ciliate Protozoan for Fungal Toxin Studies.
Bull. Environ. Contam.Toxicol. 19:489495.
[8] James M. Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden, Modern food microbiology, Seventh
edition, Ed. Springer, 2005
[9] Mariana Ferdeș , Microbiologie , partea I, ed. Printech ISBN 978 -606-521-123-0, 2008
[10] Mariana Ferdeș , C. Ungureanu, Microbiologie II, ISBN 978 -606-521-584-9, Ed. Printech,
2010
[11] Scott, P.M., B.P.C. Kennedy, J. Harwig and B.J. Blanchfield. 1977. Study of Conditions for
Production of Roquefortine and Other Metabolites of Penicillium roqueforti. Appl. Environ.
Microbiol. 33:249253.
[12]*** http://www.meat -milk.ro/mucegaiuri -nobile
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Aprobat, Aprobat, [602579] (ID: 602579)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.