Aplicații și utilizări [306214]

CAPITOLUL 1 CITOMETRIA ÎN FLUX

Citometria în flux este o parte integrală atât a [anonimizat] a diagnosticării clinice în patologie și este o metodă foarte importantă ce permite analiza rapidă a particulelor/celulelor ce trec una câte una prin dreptul unei raze laser. [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat] o metodă foarte performantă pentru analiza detaliată a unui numărul mare de evenimente (500 000 evenimente) care pot fi înregistrate în câteva secunde până la un minut. [anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat], conținutul de ADN sau ARN dar și o gamă largă de receptori membranari și proteine intracelulare.

Principiu

Citometria în flux (lb gr.kytos = celulă, metrion = măsurare) este o [anonimizat], [anonimizat] (light scatter) și fluorescența emisă de celule/ particule în momentul în care acestea trec prin punctul de interogare al unei raze laser (Roederer, 2002) (Sack, Tarnok, & Rothe, 2009).

Această tehnică se bazează pe proprietățile de dispersie a [anonimizat]. Lumina dispersată din diferite unghiuri pune în evidență diferențe din punct de vedere al mărimii și al complexității interne a celulelor, în timp ce lumina emisă de anticorpii marcați fluorescent poate identifica o gamă largă de celule de suprafață și antigene citoplasmatice. Această metodă poate fi combinată cu sortarea electrică sau mecanică a celulelor. [anonimizat]. Prin citometria în flux se măsoară caracteristicile fiecărei celule sau particule cu dimensiuni între 0,5 și 150 µm, [anonimizat]-se analize multiparametrice simultane. Astfel, [anonimizat] ”șir indian”. [anonimizat] 10-120 µl/min, iar rata de achiziție a evenimentelor poate ajunge până la 50000 celule/secundă. [anonimizat] (Longobardi Givan, 2001).

Aplicații și utilizări

Metoda a fost inițial dezvoltată de către imunologi care doreau separarea diferitelor populații celulare pentru utilizarea acestora în cadrul experimentelor ulterioare cu multiple culturi pentru a determina funcția celulelor din cadrul sistemului imunitar. [anonimizat] a fost îndeplinit utilizând sortarea celulară activată fluorescent (FACS) în cadrul citometriei în flux. Instrumentul inițial era capabil să analizeze una sau două culori fluorescente, în timp ce astăzi instrumentele sunt capabile să analizeze până la 11 culori ale fluorescenței (Marion G., 2007).

Utilizarea citometriei în flux în laboratoarele clinice a crescut în ultimii ani atât datorită dezvoltării unor aparate din ce în ce mai mici, mai ușor de utilizat și mai ieftine, cât și datorită creșterii aplicabilității metodei în laboratoare. Astăzi, citometrele în flux au dimensiuni mult mai mici, sunt mai puțin costisitoare și mult mai ușor de utilizat.

Astfel, astăzi cu ajutorul citometrului în flux se pot analiza:

1. Probe fluorescente – anticorpi marcați fluorescent:

• Proteine de suprafață

• Proteine intracelulare

2. Proteine fluorescente (GFP)

3. Probe fluorescente – activitatea funcțională a celulelor:

• ADN

• Mitocondrii

• Enzime

• Concentrația unor ioni

De asemenea, citometrul în flux facilitează:

Numărarea particulelor/ celulelor în suspensie

Separarea între particule viabile și moarte și între sisteme biologice și nonbiologice

Evaluarea particulelor, realizează în mai puțin de un minut

Măsurarea împrăștierii luminii, precum și autofluorescență (fluorescența intrinsecă) și fluorescența extrinsecă

Sortarea particulelor, care vor fi mai apoi analizate

Aplicații clinice ale citometriei în flux Sursă: (Brown & Wittwer, 2000)

Prezentarea generală a componentelor

Figure 2Prezentarea generală a componentelor

Proprietățile măsurate prin citometria în flux sunt determinate utilizând un sistem de cuplare optic-electronic care înregistrează modul în care celula sau particula împrăștie lumină incidentă laser și emite fluorescență. Astfel, componentele majore ale citometrului în flux sunt sistemul fluidic, sistemul optic cu detectoarele optice și sistemul electronic. De asemenea, după prelucrare semnalelor este necesară achiziția și analiza datelor, care este efectuată utilizând un computer, un monitor, o imprimantă și un software specializat.

Sistemul fluidic transportă particulele/ celulele în fluxul de fluid, în șir indian, către punctul de interogare, unde interactioneaza cu sursele de excitatie (lasere).

Sistemul optic este compus din lasere care au rolul de a “interoga” particulele (marcate sau nemarcate fluorescent) din fluxul fluid, din filtre optice și oglinzi dicroice care au rolul de a direcționa semnalele optice rezultate către detectorii specifici.

Sistemul electronic se ocupă de convertirea semnalelor optice detectate anterior în semnale electronice. Acestea sunt stocate în vederea analizei ulterioare cu ajutorul unui computer și a unui program adecvat. De asemenea, unele instrumente conțin în alcătuire și componente de sortare, în acest caz sistemul electronic având și rolul de a iniția decizii de sortare (Becton & Dickinson, 2002).

Componente tehnice

Dintre componentele tehnice mai fac parte, în afară de sistemele anterior menționate sistemul de detecție și sistemul de iluminare.

Sistemul de detecție

Alcătuit din 3-9 tuburi de (PMTs) și diode care detectează lumina împrăștiată, sistemul de detecție analizează simultan numeroase caracteristici fizice ale particulelor microscopice, în mod individual, una câte una, pe măsură ce acestea sunt transportate în fluxul de lichid prin fața sursei laser de excitație.

Sistemul de iluminare

Sursele laser de excitație pot fi reprezentate fie de lasere (350-363, 405, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) cu Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag sau de lămpi arc cu Mercur sau Mercur-Xenon. Cea mai utilizată sursă de lumină din cadrul unui instrument clinic cu o singură rază de lumină este o sursă de lumină monocromatică, cel mai adesea un laser cu argon (488 nm lungimea de undă).

Sistemul fluidic

Sistemul fluidic transportă particulele printr-un curent către fasciculul laser pentru analiză (interogare). Celulele în suspensie sunt aliniate, una după alta, în vederea prezentării individuale a sitemuli de excitare.

Rolul jucat de acest sistem în funcționarea citometrului este de a transporta particulele în flux către punctul de interogare. Astfel, fluxul de particule din fluid trebuie poziționat în centrul unei raze laser pentru a interacționa și pentru ca acestea să fi excitate. De asemenea, particulele trebuie să se deplaseze una câte una prin punctul de interogare la un moment dat.

Principiul de bază al funcționării sistemului fluidic este focalizare (concentrare) hidrodinamică, ce constă în alinierea succesivă a particulelor în fața punctului de interogare. Curgerea în regiunea centrală a coloanei de fluid a celulelor/ particulelor aflate în suspenstie în mediu lichid este restricționată de o teacă de fluid generată prin fenomenul de focalizare hidrodinamică (fig. 2). Sistemul fluidic este format din două coloane de fluid, fluidul de antrenare/ sheat fluid (o soluție salină izotonă) și fluidul din probă (soluție salină), care se deschid în regiunea superioară de la nivelul unei camere de flux (lb. engl. flow chamber). În conditii normale, particulele aflate în suspensie în mediu lichid sunt aliniate în partea centrală a canalui și nu se amestecă cu lichidul de antrenare (sheat fluid), existând un flux laminar. În această curgere laminară a fluidelor reale (fluide care prezintă vâscozitate) vitezele straturilor de fluid vor avea valori diferite. Vitezele frontului de fluid vor avea aspect parabolic, cea mai mare viteză a straturilor de fluid fiind în regiunea centrală, iar cea mai redusă viteză fiind în regiunea marginală. Profilul parabolic al vitezelor de curgere a fluidului va antrena particulele din suspensie în regiunea centrală a coloanei de fluid. Odată ce proba este injectată în lichidul de antrenare în regiunea de constricție a camerei de flux, are loc focalizarea hidrodinamică a lichidului din probă și astfel, proba se va concentra într-un canal central foarte îngust în care vor fi antrenate celulele.

Focalizarea hidrodinamică poate fi definită ca fiind o tehnică ce se bazează pe comprimarea unuia dintre fluxurile de fluid într-o intersecție cu 4 microcanale prin 2 fluxuri laterale și remodelarea acestuia aval într-un film subțire cu teacă.

Tipul de curgere a fluidelor este determinat de numărul lui Reynolds(Re), o constantă adimensională ce furnizează informații despre stabilitatea traseului fluidelor. Astfel, dacă Re<2300, fluxul este laminar, iar dacă Re>2300, fluxul este turbulent (Shapiro, 2003) (Serway & Vuille, 2014). Curgerea laminară are loc în cazul eritrocitelor umane cu aspect elongat, orientate uniform datorită focalizării hidrodinamice iar curgere turbulentă are loc în apropierea peretelui tubului, unde celulele sunt deformate, iar deplasarea acestora este perturbată.

NR = dρv/η

unde, NR = numărul lui Reynolds (adimensional), d= diametrului fluxului [m], ρ (rho) = densitatea fluidului [kg/m3], η (eta) = vâscozitatea fluidului [kg/m∙s], iar v= viteza medie a fluidului pe direcția de curgere [m/s].

Fluxul celor două lichide este controlat de sistemele de presiune: un sistem de presiune ce acționează asupra lichidului de antrenare și un sistem de presiune care reglează debitul din proba de analizat. Dacă proba este injectată lent în centrul lichidului de antrenare (debit de 12 µl/mim, de exemplu, analiza ADN) atunci diametrul regiunii centrale/ al probei este de aproximativ 20 µm, iar dacă proba este injectată rapid (debit de 60 µl/min, de exemplu, imunofenotipare) diametrul regiunii centrale/ al probei poate ajunge la 60 µm. Acest aspect este important pentru măsurătorile de ciclu celular când se dorește o înregistrare a datelor cu rezoluție crescută pentru a caracteriza ploidia probei analizate. În afara rezervorului cu lichid de antrenare, citometrul în flux este echipat cu un rezervor pentru îndepărtarea deșeurilor lichide, care trebuie să conțină o soluție pe bază de clor pentru a preveni dezvoltarea fungilor sau a bacteriilor. Acest rezervor se golește periodic, conform normelor privind îndepărtarea deșeurilor biologice pentru a preveni contaminarea mediului (Longobardi Givan, 2001) (Sack et al., 2009).

Lichidul de antrenare și lichidul din probă sunt soluții izotonice în care solventul este apa. De aceea pentru leucocite și pentru celulele mamaliene se utilizează soluții tampon saline. Dacă suspensia celulară conține aglomerări/ flocoane vizibile, se recomandă filtrarea cu filtre care au diametrul porilor de maxim 40 µm. Particulele cu dimensiuni cuprinse între 50 și 250 µm pot bloca sistemul de aspirare sau orificiul duzei (lb. engl. nozzle) în cazul citometrelor cu funcție de sortare. Citometrele în flux care au și funcție de sortare sunt restricționate de diametrul duzei prin care va trece fluxul de curgere, cu valori între 50-100 µm (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000).

Sistemul Optic

Sistemul optic are rolul de a ilumina proba, particulele marcate/ ne-marcate fluorescent și de a detecta semnalele luminoase emise de probă, respectiv împrăștierea luminii și fluorescența. Iluminarea probelor se realizează cu o sursă laser, în timp ce fenomenul de împrăștiere a luminii are loc la 180° și este definit ca forward scatter, precum și la 90°, side scatter, față de sursa de lumină, iar ultima etapă mediate de sistemul optic este colectarea semnalului luminos, care se realizează cu ajutorul oglinzi dicroice, filtre optice și fotofotodetectoare.

Figure5 Forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC)

Împrăștierea luminii furnizează două tipuri de informații (fig. 5): direcția forward scatter (FSC), lumina împrăștiată la unghiuri mici (0.5-5ș), oferă informații privind dimensiunea celulei, însă este afectată și de alti factori precum indexul de refracție, în timp ce direcția side scatter (SSC), lumina împrăștiată la unghiuri mari (15-150ș) oferă informații despre granularitatea internă și rugozitatea suprafeței celulare. De asemenea, FSC poate fi utilizată pentru diferențierea celulelor moarte de celulele vii iar SSC poate fi utilizată pentru diferențierea celulelor cu granularitate ridicată de celulele cu conținut omogen.

După interacțiunea radiației laser cu o celulă și detectarea împrăștierii luminii pe ambele direcția FSC, cât și SSC, care furnizează informațiile necesare, acesrea sunt corelate și permit mai apoi identificarea populațiilor de celule dintr-o suspensie heterogenă. Pentru majoritatea citometrelor în flux este necesară utilizarea unei mese antivibrație care să mențină sistemul optic stabil, deoarece modificările în alinierea laserelor sau a detectoarelor pot conduce la achiziția datelor eronate. Componentele unui sistem optic sunt reprezentate în fig. 6.

Citometrele în flux sunt echipate cu sisteme laser ca surse de lumină, iar sistemul optic este compus din lentile care se focuseză și modelează fasciculul iluminat de aceste sisteme astfel încât să poată oferi o zonă de iluminare optimă pentru fluxul de celule, iluminând fiecare celulă individual. Radiația laser este monocromatică, polarizată, coerentă, intensă, destinată iluminării unor particule de dimensiunimici ce trec cu viteză crescută prin dreptul ei. Punctul unde are loc intersecția dintre fluxul de curgere și radiația laser poartă denumirea de punct de interogare. Pentru înregistrarea optimă a radiației luminoase citometrele sunt dotate cu sisteme ce permit formarea de raze laser eliptice (20/ 60 µm). De exemplu, o celulă ar putea trece nedetectată pe lângă raza laser circulară cu diametrul de 20 µm , iar o rază laser circulară cu diametrul de 60 µm ar putea aduce informația de la trei celule simultan, ceea ce nu este de dorit (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000). Lumina iluminează ficare celulă sau particulă în punctul de observare (analiză), ceea ce duce la difuzia fasciculului incident și emisia luminii fluorescente. Aceste semnale variate (emise și fluorescente) sunt mai apoi colectate, colmatate și direcționate prin filtrele aranjate apropiat, spre fotodetectori (Martin, Stevenson, & Jack, 2001)

Filtrele optice sunt utilizate pentru a detecta, separa și a selecta diferite semnale fluorescente (albastru, verde, galben, portocaliu și roșu). Alegerea diferențiată a filtrelor, precum și dispunerea lor, permite evaluarea simultană a mai multor parametri pentru fiecare celulă, chiar dacă una dintre culori este mult mai strălucitoare decât celelalte (Martin et al., 2001).

În funcție de modul în care transmit semnalul luminos, filtrele utilizate sunt:

1) filtre optice de margine: short pass SP- transmit semnalul luminos cu lungime de undă scurtă și blochează radiația cu lungime de undă mare (de exemplu, SP560 transmite semnalul luminos sub 560 nm și blochează semnalul luminos peste 560 nm) și long pass LP- transmit semnalul luminos cu lungime de undă lungă și blochează semnalul cu lungime de undă mică;

2) filtre optice band pass- transmit semnalul luminos dintr-o regiune spectrală sub formă de bandă (un filtru optic band pass 530/30 va selecta lungimea de undă cuprinsă între 530 ± 15 nm; va transmite semnalul luminos între 515 și 545 nm) Regiunea de 530 nm se numește regiunea centrală a filtrului, iar ± 15 nm reprezintă fereastra filtrului.

3) filtre optice dicroice- (oglinzi dicroice/ divizoare de fascicul- lb. engl. dichroic mirrors/ beam spliters) reflectă radiația luminoasă cu lungime de undă scurtă și transmit radiația luminoasă cu lungime de undă mare (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000).

Figure 6 Principalele componente ale Sistemului Optic O sursă laser ce emite la o lungine de undă de 488 nm interacționează cu particulele/ celulele la nivelul punctului de interogare. Radiația FSC este detectată de o fotodiodă (lb engl. photodiode, PD), iar radiația SSC este detectată de un tub fotomultiplicator (lb engl. photomutiplier tube, PMT). Fluorescența este detectată cu PMT și cu filtrele corespunzătoare. Oglinzile dicroice LP (lb engl. dichroic mirror, DM) permit trecerea radiației cu lungime de undă mai mare decât valoarea înscrisă și reflectă radiația cu lungime de undă mai mică. LP, long pass (adaptare după (Telford, 2012).

Semnalul luminos emis de probă este recepționat de fotodetectoare ce pot fi fotodiode- PD (recepționează semnalul FSC) sau tuburi fotomultiplicatoare-PMT (recepționează semnalul SSC și fluorescența). Fotodetectoarele au rolul de a transforma semnalul luminos în semnal electric, în timp ce tuburile fotomultiplicatoare amplifică semnalul la o rată de107 electroni/foton incident. Fotodioda pentru direcția FSC prezintă în regiunea centrală o placă obturatoare (o bară metalică) ce blochează trasmiterea radiației laser principale și permite numai înregistrarea semnalului FSC. În fața fiecărui fotodetector este plasat un filtru pentru culoarea albastră, pentru semnalele FSC și SSC, în timp ce unn PMT în asociere cu filtrul corespunzător este responsabil de decția unei singure culori. De asemenea, pentru detectarea fluorescenței, în fața fotomultiplicatoarelor sunt plasate filtre în ordinea crescătoare a lungimii de undă. Fotodetectoarele nu pot identifica culoarea (lb. engl. color blind), dar utilizarea filtrelor permite recunoașterea culorii pe care o emite fiecare celulă marcată fluorescent. Astfel, există filtre pentru culoarea verde, portocalie, roșie și așa mai departe. Unele citometre pot detecta până la 17 culori. Detectoarele pot avea diferite aranjamente: trigon, octogon sau zig-zag în funcție de compania producătoare a citometrului în flux. Radiația luminoasă este direcționată la nivelul detectoarelor de oglinzi dicroice, ce permit să treacă o anumită lungime de undă, iar o altă lungime de undă este reflectată (Ormerod, 2000). De aici, semnalele luminoase sunt direcționate către un preamplificator și mai apoi amplificate.

Sistemul electronic

Sistemul electronic are rolul de a monitoriza și a controla operațiile citometrului în flux, de a converti semnalele electronice (curent electric de intensitate mică) în date digitale/ numerice și explică rolul setării unor valori prag pentru efectuarea măsurătorilor. Pentru unele instrumente care sunt echipate cu un element de sortare, sistemul electronic este de asemenea capabil să inițializeze decizii de sortare pentru a încărca și a devia particule (Becton & Dickinson, 2002). Intensitatea acestor semnale convertite este măsurată pe o scară relativă care în mod obișnuit este setată fie la 256 sau 1.024 canale egale. Acești paramentri corelați sunt acumulați, digitalizați și stocați pentru a fi preluați pentru analize ulterioare cu ajutorul unor programe specifice.

Procesarea semnalului are loc prin intermediul fotodetectoarelor, care convertesc semnalul luminos în semnal electric, amplitudinea semnalului electric fiind corelată cu intensitatea semnalului luminos. Astfel, în momentul achiziției datelor, PMT exercită control asupra voltajului, modificând tensiunea electrică aplicată fotomultiplicatorului (lb. engl. voltage), iar apoi modifică amplitudinea intensității curentului electric după ce părăsește fotomultiplicatorul (lb. engl. amplification gain).

Figure 7 Sistemul electronic

Amplificarea poate fi de două tipuri, liniară (de exemplu, de la 0 la 1023 canale) sau logaritmică (de exemplu, patru decade/ de la 1 la 10000 canale), iar un aspect important îl constiuie factorul de amplificare. Amplificarea logaritmică liniară este, de obicei, utilizată pentru măsurarea fluorescenței particulelor, această tehnică mărind scala în cazul semnalelor slabe și comprimând-o în cazul semnalelor fluorescente puternice. Scala logaritmică are rolul de a amplifica semnalele cu intensitate scăzută și de a comprima semnalele cu intensitate crescută. De regulă semnalele pentru imunofenotipare se achiziționează pe scala logaritmică, iar cele pentru analiza ADN (a ciclului celular) pe scala liniară. De asemnea, semnalele FSC și SSC pentru celulele mamaliene se achiziționează pe scala liniară, iar cele de la bacterii și fitoplancton se achiziționează pe scala logaritmică. Tot în momentul prelucrării semnalului electric se pot corecta suprapunerile spectrale dintre două molecule fluorescente. Procedeul poartă denumirea de compensare spectrală, fiind analizat în cadrul analizei fluorescenței (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000).

Pentru efectuarea optimă a măsurătorilor, sistemul electronic oferă posibilitatea stabilirii unei valori prag pentru a se înregistra numai celulele care au un semnal al intensității luminoase adecvat, mai mare decât valoarea prag. De regulă valoarea prag este stabilită pentru detectarea semnalului FSC. În acest mod vor fi îndepărtate din proba de analizat resturile celulare și zgomotul electronic produs de aparat. Selectarea optimă a valorii prag este critică deoarece o valoare prag prea mare poate conduce la îndepărtarea semnalului de interes în momentul înregistrării probei (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000) (Shapiro, 2003).

Figure 8 Valoarea Prag (Ormerod, 2000)

Achiziția și analiza datelor

Cea mai importantă parte a analizei datelor citometriei în flux constă în prezentarea grafică

a acestora, care se realizează în funcție de aplicațiile protocolului experimental, precum și de datele ce vor fi analizate. Cele mai utilizate modalități de reprezentare grafică a datelor sunt:

histogramele (este reprezentat grafic un singur parametru)

– scala lineară- FSC/SSC versus cell

– scala log- Intensitatea fluorescenței (IF) versus cell counts

diagramele prin puncte (sunt reprezentați grafic doi parametri)

Dot plot

Countour plot

Density plot

tomograma (sunt reprezentați garfic trei parametri)

Cele mai importante aspecte ale reprezentării grafice sunt selectarea unui tip de grafic și

menținerea sa de-a lungul analizei, notatarea axelor graficului astfel încât acesta să include cel puțin reactivul măsurat, iar în cazul marcării cu anticorpi este necesară atât notarea specificitatea, cât și a fluorocromului și de asemenea, indicarea numărului de evenimente expuse pe orice tip de grafic. Achiziția datelor de citometrie în flux se realizează sub forma fișierelor flow cytometry standard (FCS).

Primul pas pentru analiza datelor este schițarea histogramei cu un singur parametru, care ilustrează pe axa 0Y numărul de evenimente iar pe axa 0X intensitatea luminii fluorescente. Astfel, integrarea zonelor de curbă oferă date privind numărul de celule definite în limitele intensității fluorescente selectate, putând fi obținute nu numai coeficientul median de variație, dar și decalajul distribuției. Intervalul de detecție al celulelor variază de la 100% celule care exprimă un anumit antigen dat, până la 0.01% celule (o celulă din 10 000 de celule). !!! Histogramele pot fi suprapuse pentru a se evalua diferențele între populații sau efectele unor tratamente asupra unei populații celulare. De asemenea, în imunofenotipare prin histograme se pot identifica populațiile negative (intensitate scăzută) și populațiile pozitive (intensitate crescută) pentru un antigen de suprafață marcat fluorescent (de exemplu, CD3-FITC) (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000). Un exemplu îl constituie limfocitele din sângele periferic care sunt un mix complex de subpopulații de celule care demonstrează combinarea dintre celule negative și pozitive, definite de separarea liniei de bază. Cu toate acestea, este posibilă și evaluarea celulelor care prezintă histograme de fluorescență suprapuse, însă interpretarea datelor este mai complicată dar această problemă poate fi evitată prin alegerea reactivilor corespunzători și strategiile de desemnare a porților. Prin această tehnică, populația negativă oferă informații privind nivelul de legare nespecifică dintre reactivi și autofluorescența celulară.

A doua etapă a analizării datelor implică o histogramă colorată în două culori, utilizate pentru a codifica diferite frecvente ale evenimentelor, care poate fi expusă ca un punct, ca un contur sau ca o densitate, reprezentând corelarea datelor provenite de la doi parametrii. Diagramele prin puncte (lb. engl. dot plot) sunt reprezentări grafice ale intensității semnalului luminos pe axele 0X și 0Y pentru doi parametri simultan, fiecare punct corespunzând unei celule/particule analizate prin citometrie in flux. Uneori sunt denumite citograme. Analiza cadranelor într-o diagramă prin puncte va permite identificarea populațiilor celulare pozitive numai pentru un parametru, populații pozitive pentru ambii parametri sau negative pentru ambii parametri (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000).

Această metodă este utilizată mai ales pentru detectarea subpopulațiilor suspectate sau ascunse în distribuția cu un singur parametru. Expunerea în două culori este recomandată în citometria clinică în flux oricând este posibil (‘Clinical applications of flow cytometry: Immunophenotyping of leukemic cells’, 1998), fiecare generând patru imunofenotipuri diferite. Trei reactivi, atunci când sunt utilizați simultan, creează opt imunofenotipuri diferite, în timp ce o combinație de patru reactivi produc 16 subpopulații (2n subpopulații) (Martin et al., 2001).

O analiză fenotipică detaliată poate determina alinierea și clonalitatea unei celule, cât și gradul de diferențiere celulară și activare, însă aceasta este utilă și pentru diagnosticarea diferențială sau în clarificarea tulburărilor limfoproliferative strâns legate (Martin et al., 2001).

Variante ale diagramelor prin puncte ale histogramelor cu doi parametrii sunt diagramele în funcție de densitatea populației (lb. engl. density plot) și diagramele sub forma unor hărți (lb. engl. contour plot) în care intensitatea semnalului luminos este reprezentată sub forma de contururi (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000). Capacitatea de a urmări subpopulațiile de celule codate după culoare în diferitele porțiuni bivariate este eficace pentru analiza utilizând metoda citometriei în flux, corelarea informațiilor furnizate de cei doi parametrii permițând diferențierea tipurilor celulare într-o populație celulară heterogenă.

Un aspect foarte important este faptul că toate programele software pentru conturare care există pe piață nu operează egal, în același fel,astfel încât, pentru analiza evoluată a datelor se utilizează chiar și inteligența artificială care interpretează populațiile de limfocite.

Datele pot fi analizate fie imediat după achiziție, fie ulterior, utilizând programe dedicate de analiză. De asemenea, în cazul utilizării citometrelor digitale, este posibil să se realizeze compensarea datelor după ce acestea au fost achiziționate (compensări off-line). Citometrele în flux generează o cantitate mare de date, de aceea este de preferat să existe o modalitate de stocare a acestor date (Ormerod, 2000).

Analiza datelor de citometrie se realizează utilizând regiunile și porțile. O regiune poate fi definită ca un set de puncte atent selectate de către operator care delimitează o zonă pe un grafic, însă pot fi definite pe același grafic mai multe regiuni care pot avea forme diferite. Construirea unei regiuni permite izolarea clusterelor/ grupurilor/ populațiilor de interes în funcție de profilul de expresie a unui marker (ilustrat într-o histogramă) sau a doi markeri distincți (ilustrat într-un grafic bi-parametric).

Porțile reprezintă combinații de regiuni, utilizate pentru a delimita un subset de particule sau populații pe un plot, astfel încât analiza să se focalizeze asupra parametrilor specifici numai pentru acel subset de particule și asupra unui grup de evenimente definit prin utilizarea succesivă a mai multor regiuni, în funcție de scopul urmărit. În mod frecvent, întreg procedeul(lb. engl. gating strategy) este cunoscut sub denumirea de strategie de selectarea porților (Longobardi Givan, 2001) (Ormerod, 2000).

În funcție de scopul utilizării, există 3 tipuri de porți:

Rectangulare- definirea unei regiuni

Poligonale- definirea unei populații de interes

Quadrat – utilizată în analizele cu mai multe culori pentru distingerea populațiilor negative pentru un parametru, de cele positive pentru unul sau doi parametri.

Fluorescența

Fluorescența este proprietatea unor substanțe de a emite semnale luminoase atâta timp cât absorb lumină sau se află sub influența altei forme de radiație electromagnetică (fig. 18). După absorbția unui foton (a unei cuante de lumină-lumina albastră in fig. 18), un electron se deplasează pe un nivel energetic superior, în stare excitată, pentru un interval foarte scurt. După o scurtă perioadă de timp (absorbția fotonului 10-15 s, iar emisia 10-11– 10-14 s), electronul se reîntoarce la nivelul energetic fundamental cu emiterea unei cuante de lumină( lumina verde în fig. 18). Astfel, la interacția moleculelor cu un fascicul de radiații pot avea loc fenomene de absorbție a radiației, ce constă în tranziția moleculelor din stare fundamentală în stare excitată și emisia radiației. Prin acest fenome, moleculele aflate în stare excitată pot reveni la stări cu energie mai mică prin emisie de energie: fenomene de fluorescență și fosforescență

Figure 18 Fluorescența 2012, Hellen C. Ishikawa‐Ankerhold et al., Molecules

Natura radiației electromagnetice se bazează pe proprietățile de undă și pe proprietățile de particulă. Din prima categorie fac parte lungimea de undă λ, notată cu litera grecească Lambada și frecvența ν, notată cu litera grecească Nu, iar proprietățile de particulă se rezumă la fasciculul de fotoni.

Lungimea de undă a radiației emise (λ = 515 nm) este mai mare decât lungimea de undă a radiației absorbite (λ = 488 nm), în spectrul vizibil cele două lungimi de undă corespunzând radiației de culoare verde și respectiv de culoare albastră (Sack et al., 2009) (Serway & Vuille, 2014).

Diferența dintre maximul lungimii de undă la emisie și maximul lungimii de undă la absorbție(câțiva zeci de nm) a primit denumirea de deplasarea Stokes (lb. engl. Stokes shift). Această diferență este produsă de pierderea de energie din momentul deplasării electronilor pe diferite niveluri de excitare, energia unui foton fiind invers proporțională cu lungimea de undă:

(2)

unde,

E = energia fotonilor,

h = constanta lui Planck (6,626 ∙ 10-34 J∙s),

ν = frecvența,

c = viteza luminii în vid (3 ∙ 108 m/s),

λ = lungimea de undă (Shapiro, 2005).

Caracteristicile principale ale fluorescenței sunt randamentul cuantic (quantum yield, Φ) și

durata fluorescenței (fluorescence lifetime, τ). Rnadamentul cuantic reprezintă o măsură a eficienței emisiei fluorocromului, fiind egal cu raportul dintre numărul de fotoni emiși și numărul de fotoni absorbiți iar durata fluorescenței este durata medie de timp pe care un electron o petrece în stare excitată înainte de a se reîntoarce la starea fundamentală.

În imunofenotipare se utilizează anticorpi monoclonali marcați fluorescent pentru detectarea antigenelor celulare, moleculele fluorescente fiind cuplate cel mai adesea, cu anticorpii. Spectrele de absorbție și emisie ale moleculelor fluorescente sunt foarte variate și acoperă atât domeniul vizibil (400 – 700 nm), cât și o parte din spectrul ultraviolet sau infraroșu. Preocuparea continuă a companiilor care construiesc citometre este de a crește performanța prin creșterea numărului de parametri celulari identificabili concomitent (analiza multiparametrică). Deoarece există constrângeri de natură tehnică care limitează numărul de lasere și de detectoare care se pot insera în construcția unui citometru în flux, creșterea numărului de parametri analizabili a fost posibilă prin utilizarea moleculelor fluorescente în tandem (de exemplu, PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, APC-Cy7, tabelul 1). La baza funcționării moleculelor tandem stă fenomenul de transfer de energie între molecule fluorescente/ tranfer de energie prin rezonanță de tip Förster (lb. engl. Fluorescence resonance energy transfer/ Förster resonance energy transfer/ FRET) (Zlei & Mocanu, n.d.). FRET depinde de apropierea dintre cele două molecule fluorescente (donor și acceptor), distanța optimă dintre dintre ele fiind mai mică de 10 nm. Astfel, molecula fluorescentă donor absoarbe lumina laserului și emite la o lungime de undă care excită molecula acceptor; acesta va emite la rândul său un semnal fluorescent și doar această ultimă emisie este înregistrată de citometru. Pe lângă avantajele utilizării moleculelor tandem, există și dezavantaje: moleculele fluorescente au stabilitate redusă, iar după degradare are loc decuplarea donorului de acceptor, generând artefacte (date fals pozitive sau fals negative) cu impact negativ asupra rezultatelor investigațiilor (Shapiro, 2003).

Reactivii Fluorocromi

Anticorpii monoclonali marcați direct fluorescent sunt probele obișnuite utilizate în clinică în citometria în flux, deoarece simplifică combinarea anticorpilor în analizele care utilizează mai multe culori. În plus, colorarea indirectă se poate efectua în prima fază cu un anticorp nemarcat, urmat de un anticorp secundar conjugat. Deoarece citometrul în flux utilizat în clinică este echipat cu un singur laser de argon cu un fascicul de excitație de 488 nm, fluorocromii selectați trebuie să fie compatibili, excitații de lumină la 488nm. Printre acești fluorocromi se numără: fluoroscein izotiocianat (FITC), ficoeritrina (PE), propid de iod (PI), 7-amino-actinomicin D (7AAD), proteina peridin-cloropfill-A (PerCP) și dimeri de oranj tiazol (TOTO-1), însă recent s-au descoperit o serie de conjugați Alexa Fluor care au fost descriți ca fiind mai luminoși, mai stabili și independenți de pH, comparativ cu FITC.

Utilizarea fluorocromilor care nu pot fi excitați la lungimea de undă de 488nm necesită utilizarea unor lasere adiționale cu lungimi de undă corespunzătoare excitării, un astfel de exemplu fiind utilizarea unui laser care furnizează lumină cromatică la o lungime de undă superioară (neon heliu- HeNe), pentru o fluoro proteină, alloficocianină (APC). Mai mult decât atât, un laser ultraviolet (helium cadmium) s-a dovedit a fi foarte folositor pentru detectarea reactivilor indolici în decursul evaluării fluxului de calciu asociat cu activarea celulelor coloranților ADN-ului, 4, 6-diamidino-2fenilindol (DAPI) și Hoechst.

De asemenea, o altă clasă de compuși fluorocromi face referire la conjugații în tandem, un exemplu fiind combinarea PE cu cianina indodicarbonică (Cy5), sub denumirea PE-Cy5. Energia emisă de către molecula PE este transferată sau cuplată cu molecula Cy5, legată covalent, furnizând excitare pentru acest fluorocrom, care are fluorescența la o lungime de undă mai mare (Shapiro, 2003).

Atunci când se utilizează doi sau mai mulți fluorocromi, trebuie luată în considerare problema suprapunerii fluorescente, după cum se întâmplă atunci când emisia unui fluorocrom intervine în detectarea celui de-al doilea fluorocrom. Semnalul indezirabil se datorează suprapunerii spectrale și trebuie îndepărtat (compensat) obligatoriu. Această scădere poate fi realizată direct în hardware, denumită compensare bazată pe scăderea electronică sau utilizând un software adecvat (Martin et al., 2001).

CAPITOLUL 2 SISTEMUL IMUNITAR

Imunitatea este definită ca fiind rezistența la boli, în mod special rezistența la boli infecțioase, astfel încât multitudinea de celule, țesuturi și molecule care mediază rezistența la infecții se găsește sub denumirea de sistem imun. Acesta are rolul de a oferi apărare față de infecția cu patogeni, iar reacția care se produce odată cu pătrunderea patogenilor în organism este denumită răspuns imun. Cea mai importantă funcție fiziologică a sistemului imun este cea de a preveni și de a eradica infecțiile și cea care are la bază patru acțiuni principale: de a recunoaște agenții străini (sau non-self); de a elimina acești agenți prin diverse funcții efectoare, una dintre ele fiind cea fagocitară; de a reglementa atenuarea răspunsului imun pentru a proteja organismul împotriva daunelor colaterale și de a reține agenți de intruziune, astfel aceștia nu vor fi capabili să provoace infecție din nou. (Nordenfelt, 2010).

În mod normal, sistemul de apărare al organismului gazdă care acoperă toate aceste mecanisme este împărțit în două subgrupe, imunitatea înnăscută și imunitate dobândită. În timp ce imunitatea înnăscută oferă protecție imediată împotriva invaziei microbiene și este prezentă în toate organismele multicelulare, cea dobândită se dezvoltă mai încet, oferind o protecție specializată împotriva infecțiilor și este specifică vertebratelor. Aceste două ramuri diferite ale sistemunlui imunitar se completează și lucrează împreună pentru a-și îndeplini funcțiile. Imunitatea înnăscută (naturală sau nativă) este prezentă mereu la indivizii sănătoși, pregătită să blocheze intrarea microbilor și să îi elimine în cazul în care reușesc să intre în țesuturile gazdă, bazându-se pe identificarea unor modele mai conservate, prezente în majoritatea patogenilor. Imunitatea dobândită (specifică) necesită extinderea și diferențierea limfocitelor ca răspuns la agenții patogeni înainte de a putea oferi o apărare eficientă, bazându-se pe recunoașterea modelelor specifice ale unei unei specii.

Figure 10 Sistemul imunitar înnăscut și dobândit

Un indiciu esențial asupra importanței sistemului imunitar în sănătatea organismului este faptul că persoanele care prezintă răspunsuri imune deficitare sunt susceptibile la infecții grave, care pot amenința viața individului. În schimb, un mod de a preîntâmpina această situație și de protejare este vaccinarea, prin care se produce stimularea răspunsurilor imune împotriva infecțiilor. În afară de această funcție esențială, sistemul imunitar împiedică creșterea anumitor tumori (inclusiv cancer), participă la clearance-ul celulelor moarte și la inițierea reparării țesuturilor.

În contrast, răspunsurile imune anormale pot determina multe boli inflamatorii cu morbiditate și mortalitate grave. Răspunsul imun este bariera majoră în calea transplantului de organe, care este adesea utilizat pentru a trata insuficiențele organelor. Produsele celulelor imune pot fi, de asemenea, de mare folos practic (anticorpii).

Rolurile sistemului imunitar

Sistemul Imunitar Înnăscut

Nevoia de apărare a organismelor împotriva altor factori externi a existat din totdeauana, încă din Cambrian, acum 550 de milioane de ani în urmă, iar odată cu evoluția organismelor multicelulare (plante, nevertebrate, vertebrate), acestea au trebuit să își dezvolte un sistem de apărare propriu împotriva infecțiilor microbiene și pentru eliminarea celulelor lezate și repararea în urma distrugerii țesuturilor (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2016). Astfel, mecanismul filogenetic de apărare care s-a dezvoltat prima dată a fost cel de imunitate înnăscută, numită și nativă sau naturală, care este mereu prezent în organism, încă de la naștere, pregătit să recunoască și să elimine microbii și celulele moarte.

Sistemul imunitar înnăscut constituie prima linie de apărare a organismului împotriva infecțiilor, celulele și moleculele responsabile pentru imunitatea înnăsctă alcătuind acest sistem.

Sistemul imunitar înnăscut răspunde aproape imediat în fața microbilor și a celulelor rănite, însă expunerile repetate invocă răspunsuri imune aproximativ identice.(2018) Astfel, apărarea este asigurată de barierele epiteliale ale țesuturilor pielii și ale mucoaselor și de celulele și antibioticele naturale prezente în epitelii, acestea având rolul de a bloca intrarea agenților patogeni prin aceste bariere. În cazul în care aceștia încalcă epiteliul și intră în țesuturi sau în circulație, sunt atacați de fagocite, limfocite specializate numite celule limfoide înnăscute, care includ celule naturale ucigașe și câteva proteine ​​plasmatice, inclusiv proteine ​​ale sistemului complementar. Toate aceste mecanisme de imunitate înnăscuta recunosc și reacționează în mod specific împotriva microbilor, fiind capabile să distrugă majoritatea microbilor ce intră în organism și să regleze sau chiar să oprească infecțiile (Abbas et al., 2016).

În concluzie, răspunsul imun înnăscut este capabil să combată microbii imediat după infectare, în contrast cu răspunsul imunitar adaptiv, care trebuie să fie indus de antigen și, prin urmare, este întârziat. De asemenea, răspunsul imun înnăscut modulează sistemul imunitar adaptiv pentru a răspunde microbilor în moduri eficiente pentru combaterea microbilor (Abbas et al., 2016).

Specificitatea răspunsului imun înnăscut

Sistemul imunitar înnăscut își îndeplinește rolul defensiv printr-un set mai restrâns de

reacții, care sunt mai limitate decât reacțiile variate și specializate ale sistemului imunitar dobândit.

Astfel, specificitatea imunității înnăscute este, de asemenea, diferită din mai multe privințe față de specificitatea limfocitelor, celulele de recunoaștere a antigenului în cadrul imunității dobândite, în special datorită recunoașterii structurilor moleculare produse de patogenii microbiali.

Principalele reacții ale sistemului imunitar înnăscut în fața patogenilor sunt inflamarea și apărarea antivirală, prima reacție constând în acumularea și activarea leucocitelor și a proteinelor plasmatice la locul infecțiilor sau a leziunilor tisulare. Aceste celule și proteine ​​acționează împreună pentru a ucide în principal microbii extracelulari și pentru a elimina țesuturile deteriorate. Protecția imună înnăscută împotriva virușilor intracelulari este mediată de celulele natural killer (NK-natural criminale), care ucid celulele infectate cu virus și de citokine specifice numite interferoni de tip I, care blochează replicarea virală în celulele gazdă (Abbas et al., 2016).

Răspunsul imun dat de cele două sisteme diferă notabil și pune în evidență specificitatea mult mai mare a imunității dobândite, întru cât la interacții repetate cu un microb sistemul imunitar înnăscut oferă același răspuns imun. În același timp, răspunsurile sistemul imunitar dobândit sunt mai puternice și mai eficiente la fiecare interacțiune succesivă cu agentul patogen, ceea ce indică faptul că sistemul înnăscut nu prezintă o memorie a interacțiilor cu patogenii și se resetează după de fiecare dată la valoarea inițială, nefiind capabil să își creeze o memorie imunologică.

Sistemul imun înnăscut recunoaște strucuturi moleculare care sunt produse de patogeni microbiali, substanțele microbiale care stimulează imunitatea înnăscută fiind aceleași la mai multe clase de microbi, sub denumirea de modele moleculare asociate patogenilor (PAMPs). Diferitele tipuri de microbi (de exemplu, virusuri, bacterii gram-negative, bacterii gram-pozitive, ciuperci) exprimă PAMPs diferite, iar receptorii imunității înnăscute care recunosc aceste structuri sunt denumiți receptori de recunoaștere a modelului. Cu toate că sistemul înnăscut are specificitate la un număr limitat de molecule microbiene, mult mai mic decât numărul aproape nelimitat de antigeni microbieni și non-microbieni recunoscuți de sistemul adaptiv, fiecare componentă a imunității înnăscute poate recunoaște multe bacterii, viruși sau ciuperci (fagocitele exprimă receptori pentru lipopolizaharidă-LPS) (Abbas et al., 2016).

Componentele imunității înnăscute au evoluat astfel încât pot recunoaște structuile esențiale ale microbilor pentru supraviețuirea și infecțiozitatea lor, ceea ce face ca aceasta să fie un mecanism de apărare eficient întrucât microbii nu pot evita răspunsul imun prin mutații sau prin neexprimarea țintelor imunității înnăscute.

Sistemul imun innăscut prezintă specificitate și pentru moleculele eliberate din celulele lezate sau necrotice ale organismului gazdă, denumite modele moleculare asociate leziunilor (DAMPs). Răspunsurile ulterioare față de DAMP servesc la eliminarea celulelor deteriorate și la inițierea procesului de reparare a țesuturilor (Abbas et al., 2016). Tot în scopul menținerii sănătății orgaismului, sistemul înnăscut nu are nici un răspuns imun la celulele și țesuturile normale, sănătoase.

Receptorii sistemului imunitar înnăscut sunt codați de către gene moștenite (germline), identice în toate celulele, ceea ce face ca receptori identici să fie xprimați pe toate celulele de un tip (macrofagele). Prin urmare, multe celule responsabile de imunitatea înnăscută pot recunoaște și răpunde la același agent patogen. Pe cealaltă parte, receptorii antigeni ai sistemului imunitar adaptiv sunt codificați de gene formate prin rearanjarea somatică a segmentelor genetice în timpul dezvoltării limfocitelor, rezultând receptori unici în fiecare clonă a limfocitelor B și T (Abbas et al., 2016).

Astfel, diversitatea receptorilor sistemului imunitar înnăscut și domeniul de specificitate al lor sunt mici comparativ cu cele ale celulelor B și T ale sistemului adaptiv, recunoașterea imunității înnăscute fiind mediată de aproximativ 100 de receptori diferiți ce aparțin câtorva familii de proteine, în timp ce sistemul imunitar adaptiv se bazează pe două familii de receptori (2018).

Receptorii celulari pentru microbi și celule lezate

În cadrul sistemului înnăscut, foarte multe celule prezintă receptori de recunoaștere, fiind capabile să participe în elaborarea răspunsului imun înnăscut. Acești receptori sunt exprimați într-o varietate și într-un număr foarte mare atât pe suprafața fagocitelor, cu precădere pe macrofage, cât și pe suprafața celulelor dendritice, contribuind la rolurile acestor celule. Astfel, ajută fagocitele în a detecta microbii și celulele lezate și a le ingera și contribuie la rolul celulelor dendritice de a reacționa la microbi, provocând inflamații și determinând imunitate adaptivă ulterioară.

De asemenea, ei sunt exprimați și în diferite compartimente celulare: în endozomi, unde produșii microbiali sunt ingerați, precum și în citosol, unde au rolul de a detecta microbii citoplasmatici. Receptorii de recunoaștere sunt legați de căile de transducție a semnalului intracelular, care activează diferite răspunsuri celulare, inclusiv producerea de molecule care promovează inflamația și molecule care distrug microbii. (2018)

Receptori Toll-like

Receptorii Toll-like (TLRs), prezenți la suprafața celulelor și în endozomi, reprezintă familia cea mai importantă de receptori de recunoaștere a modelelor, recunoscând o varietate mare de liganzi, dintre care componentele pereților celulari bacterieni și acizi nucleici microbiali (2018).

Receptorii Toll-like sunt o familie de receptori conservați evolutiv, ce au fost descoperiți ca fiind omologi cu o proteină a Drosophilei numită Toll, descoperită tocmai pentru rolul său în dezvoltarea musculiței, ca mai apoi să se dovedească și rolul esențial în protejarea musculiței împotriva infecțiilor. Diferiți TLRs sunt specifici pentru diferite componente ale microbilor, în organismal uman fiind prezente 9 tipuri funcționale de TLRs, notați de la TLR1 până la TLR9.

Acești receptori specifici pentru proteine, lipide și polizaharide microbiene sunt localizați la suprafața celulelor, unde recunosc aceste componente ale microbilor extracelulari, iar TLR-urile care recunosc acizi nucleici sunt localizați în endozom, unde microbii sunt ingerați și digerați, fiind eliberați acizii nucleici (Abbas et al., 2016). Recunoaștereade către TLR a liganzilor microbieni determină activarea mai multor căi de semnalizare, ceea ce duce la activarea factorilor de transcripție care stimulează expresia genelor care codifică citokine, enzime și alte proteine, implicate în răspunsurile inflamatorii și antivirale (2018 &2016)

Receptorii NOD-like și Inflamazomul

Receptorii NOD-like (NLRs) sunt o familie mare, de peste 20 de proteine citosolice diferite, care recunosc PAMPs și DAMPs din citosol și recrutează alte proteine pentru a forma complexe de semnalizare care promovează inflamarea. Receptori tipici au în alcătuire un domeniu repetitiv C-terminal bogat în leucină, care semnalizează prezența ligandului, un domeniu NOD central (domeniu nucleotidic de oligomerizare), necesar pentru ca proteinele NLR să se lege unele de altele pentru a forma oligomeri și un domeniu efector N-terminal, care recrutează proteine pentru a forma complexele de semnalizare. Sunt cunoscute trei subfamilii NLR care servesc sistemul imunitar înnăscut, fiecare utilizând un domeniu efector diferit pentru a iniția semnalizarea, acestea fiind NOD-1, NOD-2 și NLRP-3. (2018)

NOD-1 și NOD-2 sunt protein citosolice ce prezintă domenii N-terminal CARD (asociate caspazelor), acestea fiind specifice peptidoglicanilor bacterieni, care sunt componente comune ale pereților bacterieni. NLRP-3 (familia de receptori asemănători NOD) este un receptor NLR citosolic cu un domeniu de pirină N-terminal care răspunde atât la structuri microbiene independente, cât și la modificări patologice din citosol, reacționând prin creșterea producerii citokinei inflamatoare IL-1β. De asemenea, NLRP-3 recunoaște microbii și substanțele care indică lezarea celulelor și necroza, dintre acestea făcând parte și adenozina și forma inactive a caspazei-1 și determină activarea acesteia. Caspaza-1 activă scindează o formă precursoare a interleukinei-1β (IL-1β) pentru a genera IL-1β biologic activ, care induce inflamații acute și provoacă febra (Abbas et al., 2016).

Acest complex citosolic multiproteic format din NLRP-3, care funcționează drept senzor, o proteină adaptoare și caspaza-1 este cunoscut sub denumirea de inflamazom, însă pot exista inflamazomuri activate de caspaza-1 care conțin și alte proteine senzor, în afară de NLRP3.

Inflamazomul se formează în urma prezenței în citosol a PAMP și DAMP, funcția sa fiind de a genera forme active ale citokinelor inflamatoare IL-1β and IL-18, care sunt apoi eliberate din celule și determină răspunsuri inflamatorii. Astfel, inflamazomul este important nu numai pentru apărarea organismului gazdă, dar și datorită rolului său în mai multe boli, mutațiile funcției NLRP-3 putând cauza sindroame autoinflamatorii rare, caracterizate prin inflamații necontrolate. Â

Inflamazomul mai poate contribui și la formarea aterosclerozei și a diabetului tip 2, asociat obezității.

Componente ale sistemului imun

Celulele sistemului imun înnăscut au rolul de baiere în calea infecțiilor, detectînd microbii și celulele lezate de la nivelul țesuturilot și îndeplinesc funcții esențiale pentru apărarea împotriva microorganismelor. O parte din aceste celule exprimă diferiți receptori de recunoaștere, discutați anterior, iar după recunoașterea PAMP și DAMP, celulele răspund prin producerea de citokine inflamatorii și proteine antivirale, în timp ce alte celule ucid microbii și celulele infectate.

Mai mult decât atât, unele dintre celulele imunății înnăscute sunt esențiale pentru stimularea răspunsurilor imune adaptive. (2018)

Astfel, dintre componentele sistemului înnăscut fac parte: celulele epiteliale, celule de pază din țesuturi (macrofage, celule dendritice, celule mast ș.a), celulele limfoide înnăscute (celule NK) și câteva proteine plasmatice (Abbas et al., 2016).

Celulele epiteliale

Celulele epiteliale formează epitelii continue ce protejează organismul de lumea externă și care asigură bariere fizice și chimice împotriva infecțiilor. Microbii pot intra în organismele gazdă prin piele și prin mucoasele ce protejează tractul gastrointestinal, respirator și genitourinar prin contact fizic, ingerare sau inhalare. Astfel, toate aceste portale sunt căptușite cu epitelii continue, alcătuite din celule care formează joncțiuni strânse între ele, care prezintă numeroase funcții, dintre care formarea unei bariere împotriva trecerii microbilor. De asemenea, keratina de la suprafața pielii și mucusul secretat decelulele epiteliale mucoase împiedică microbii să prolifereze și să

producă infecția epiteliilor (Abbas et al., 2016).

Celulele epiteliale produc, de asemenea, compuși antibiotici peptidici, denumiți defensin și catelicidin, care formează o barieră chimică împotriva infecțiilor, omorând bacteriile. Mai mult decât atît, epiteliile conțin limfocite din linia de cellule T denumite limfocite T intraepiteliale dar care exprimă receptori de antigen cu o diversitate limitată.

Fagocitele

Odată ce microbii încalcă bariera epitelială și intră în organism, celulele fagocitare

care prezintă funcții specializate fagocitare (în principal macrofagele și neutrofilele) reprezintă prima linie de apărare.

Neutrofilele și monocitele reprezintă cele două tipuri de fagocite circulante din sânge care sunt selectate la locul infecției pentru a recunoaște și pentru a ingera microbii, cu scopul de a-i omorî intracelular. Neutrofilele, denumite leucocite polimorfonucleare (PMN), sunt primele tipuri celulare care răspund infecțiilor, în special celor cu bacterii și fungi, și astfel sunt cele mai numeroase leucocite prezente în sânge. Mai mult decât atât, ca răspuns în fața infecțiilor, producția de neutrofile de la nivelul măduvii osoase crește rapid. Acestea ingeră microbii din circulație și intră rapid în țesuturile extravasculare de la locurile de infecție, unde fac și fagocitoză și distrug microbii (Abbas et al., 2016).

În contrast, monocitele sunt mai puțin abundente în sânge decât neutrofilele. De asemenea, ele ingerează microbii în sânge și țesuturi, iar în timpul reacțiilor inflamatorii monocitele ies în țesuturi extravasculare și se diferențiază în celule denumite macrofage care supraviețuiesc o perioadă mai mare (Abbas et al., 2016).

În cadrul apărării gazdei, macrofagele au roluri importante întru cât ele ingeră și distrug microbii, produc citokine care determină și reglează inflamația și mai apoi îndepărtează țesuturile moarte și inițiază procesul de reparae al țesuturilor.

Celulele dendritice

Celulele dendritice (DC) detectează rapid și efficient microbii datorită localizării

lor în țesuturi și datorită faptului că exprimă numeroși receptori de recunoaștere pentru PAMP și DAMP. (2018) Celulele dendritice răspund acestor microbi producând citokinele, care prezintă două funcții: inițiază inflamația și stimulează răspunsul imun adaptive. Astfel, prin detectarea microbilor și interacția cu limfocite, mai ales cu celulele T, celulele dendritice reprezintă legătura dintre sistemul imun înnăscut și cel dobândit. (2018)

Celulele Mast

Celulele Mast sunt celule derivate din măduva osoasă, prezente în piele și în mucoasa epitelială care secretă citokine proinflamaorii și mediatori lipidici (prostaglandine) care stimulează inflamarea. În aceste celulele sunt prezente granule citomplasmatice abundente, care conțin mediatori inflamatori, care sunt eliberați odată cu activarea celulelor. Aceste granule conțin amine vasoactive (histamine) care provoacă vasodilatarea și creșterea permeabilității capilare, precum și enzime proteolitice care fie pot să omoare bacteriile, fie pot inactive toxinele microbiale.

Celulele Mast pot fi activate atât prin legarea produșilor microbiali la TLR, ca parte a producerii răspunsului imun înnăsut, cât și printr-un mecanism special dependent de anticorpi.

Importanța acestor celule este dată de faptul că determină apărarea împotriva helminților și a altor patogeni responsabili de simptome provocate de alergii (Abbas et al., 2016).

Celule Limfoide Înnăscute

Celulele limfoide înnăscute sunt celule derivate din măduva osoasă cu morfologie de limfocite, care produc citokine și a care au funcții similare cu limfocitele T, dar nu prezintă receptori antigenici ai celulelor T (TCR). Aceste celule au fost împărțite în trei grupuri majore, având la bază citokinele secretate. Aceste grupuri, numite ILC1, ILC2 și ILC3 produc citokine diferite, care determină mai apoi rolul pe care îl au celulele în apărare și exprimă factori de transcriere diferiți. ILC-urile determină apărarea timpurie împotriva infecțiilor și de asemenea, ghidează răspunsul celulelor T. (2018).

Celule Natural Killer (NK)

Aceste celule, considerate primele ILC descoperite, sunt celule citotoxice care joacă un rol important în răspunsurile imune înnăscute, majoritar împotriva virusurilor și a bacteriilor intracelulare. Celulele NK recunosc celulele infectate și cele care se află sub stress iar rolul lor principal efector este de a răspunde prin uciderea acestor celule prin secreția citokinei IFN-γ, care avtivează macrofagele pentru a distruge microbii fagocitați.

Celulele NK conțin granule citomplasmatice abundente care prezintă proteine care mediază ditrugerea celulelor țintă, dar care nu prezintă imunoglobuline sau recepori ai celulelor T, dar nici receptori antigenici ai limfocitelor B sau T. Atunci când celulele NK sunt activate, exocitoza granulară eliberează aceste proteine ​​adiacente celulelor țintă. Perforina, proteină granulară a celulelor NK, facilitează introducerea altor proteine ​​granulate, denumite granzime, în citozolul celulelor țintă. Granzimele sunt enzime proteolitice care inițiază o secvență de evenimente de semnalizare care determină moartea celulelor țintă prin apoptoză. Prin uciderea celulelor infectate cu virusuri și bacterii intracelulare, celulele NK elimină sursele de infecție. (2018)

Activarea celulelor NK este determinată de un echilibru între implicarea receptorilot activatori și inhibitori. Receptorii activatori care recunosc moleculele de suprafață celulară exprimate pe celule infectate cu virusuri și bacterii intracelulare, precum și celulele stresate prin leziuni ADN, permit celulelor NK să elimine aceste celulele infectate. Unul dintre cei mai studiați receptori de activare este NKG2D, care recunoaște moleculele asemănătoare proteinelor complexului de histocompatibilitate majoră (MHC) de clasa I și care sunt exprimate ca răspuns la diferite tipuri de stress celular. Receptorii care provoacă inhibarea celulelor NK prin blocarea semnalizării prin activarea receptorilor sunt specifici pentru molecule MHC de clasă I, care sunt exprimate pe toate celulele nucleate sănătoase. Prin urmare, expresia MHC de clasa I protejează celulele sănătoase de distrugerea celulelor NK. (2016)

Limfocitele cu diveristate limitată

Sistemul complement

Citokinele

Reacțiile imune înnăscute

Sistemul imunitar înnăscut are rolul de a elimina microbii prin elaborarea unui răspuns

acut inflamator și prin mecanisme de apărare antivirale. Diferiți microbi pot provoca diferite tipuri de reacții imunitare înnăscute, fiecare dintre acestea fiind deosebit de eficient în eliminarea tipului specific de microb. Astfel, principalele răspunsuri imune înnăscute pentru protecția organismului în fața a diferiți microbi sunt:

Bacteriile și ciupercile extracelulare sunt respinse în principal de răspunsul inflamator acut, în care neutrofilele și monocitele sunt atribuite la locul infectării și prin sistemul complementar;

Bacteriile intracelulare, care pot supraviețui în interiorul fagocitelor, sunt eliminate prin fagocite, care sunt activate de receptorii Toll-like și de alți senzori, precum și de citokine;

Apărarea împotriva virusurilor este asigurată de interferoni de tip I și de celule NK. (2016)

Inflamarea

Figură16 Răspunsul inflamator acut Citokinele și alți mediatori sunt produși de macrofage, celulele dendritice, mastocitele și alte celule din țesuturi ca răspuns la produsele microbiene și la celulele gazdă deteriorate. Acești mediatori măresc permeabilitatea vaselor de sânge, conducând la intrarea proteinelor plasmatice în țesuturi și mișcarea leucocitelor din sânge în țesuturi, unde distrug microbii și celulele deteriorate și promovează mai multe inflamații și reparații

Metoda principală prin care sistemul imun înnăscut se ocupă de infecții și leziuni tisulare

este prin stimularea inflamației acute, care reprezintă acumularea de leucocite, proteine ​​plasmatice și lichid derivat din sânge într-o zonă de țesut extravascular ce prezintă infecția sau vătămarea.

Scopul este cel a încerca limitarea răspândirii infecției prin coagularea sângelui și apoi recrutarea moleculelor și celulelor efectoare pentru omorârea microbilor. Inițierea inflamației are loc prin celulele Mast și macrofagele tisulare, care, la infectare, eliberează citokine și chemokine. Aceasta declanșează un răspuns din partea celulelor endoteliale ducând la dilatarea vaselor sanvine și scurgerea vasculară a proteinelor plasmatice în locul infectării (Nordenfelt, 2010).

Procesul inflamației este urmat de selectarea acestor celule și circulația proteinelor plasmatice prin vasele de sânge, precum și activarea acestora în țesuturile extravasculare, cu scopul de a-și exercita funcțiile efectoare prin care omoară microbii și încep repararea țesutului lezat. Eliminarea inițială a histaminelor, a substanței P și a altor mediatori de către celulele mast și de către macrofage determină creșterea fluxului sanguin local, separarea proteinelor plasmatice și declanșarea terminațiilor nervoase. Toate acestea provoacă roșeață, eliberare de căldură, umflare și durere, acestea fiind caracteristicile inflamației. Aceasta este deseori urmată de o acumulare locală în țesut a fagocitelor, de cele mai multe ori neutrofile, ca răspuns pentru citokine. Fagocitele activate cuprind microbii și materialele moarte și distrug aceste substanțe potențial nocive. (2016)

Prima etapă în producerea inflamației este recrutarea fagocitelor la locurile de infecție și leziune tisulară. În această etapă neutrofilele și monocitele migrează la locurile extravasculare ale infecției prin legarea la moleculele venoase de adeziune endotelială și ca răspuns la chemoattractanții produși de celulele țesutului care reacționează la infecție sau leziuni. Migrarea leucocitelor din sânge în țesuturi este un proces în mai multe etape în care interacțiunile adezive slabe inițiale ale leucocitelor cu celule endoteliale sunt urmate de o adeziune fermă și apoi de transmigrare prin endoteliu. Dacă un microb infecțios trece printr-un epiteliu și intră în țesutul subepitelial, celulele dendritice reziduale, macrofagele și alte celule recunosc microbii și răspund prin producerea de citokine. Două dintre aceste citokine, TNF și IL-1, acționează asupra endoteliului venos, în apropierea locului de infectare și inițiază procesele de migrare leucocitară în țesuturi. (2016)

Figură 17 Migrarea leucocitelor la locul de infecție. Macrofagele, celulele dendritice și alte celule care au întâlnit microbii produc citokine, cum ar fi factorul de necroză (TNF) și interleukina-1 (IL-1) care activează celulele endoteliale ale venelor din apropiere pentru a exprima selectine și liganzi pentru integrine și pentru a secreta chemokine. Selectinele mediază legarea slabă a neutrofilelelor pe endoteliu, integrinele mediază aderența fermă a neutrofilelor, iar chemokinele activează neutrofilele și stimulează migrarea lor prin endoteliu la locul infecției

A doua etapă în cadrul inflamațiilor constă în în fagocitoza și distrugerea microbilor, realizată prin intermediul neutrofilelor și macrofagelor care ingerează microbii, realizând fagocitoza și apoi îi distrug în vezicule intracelulare.

Astfel, fagocitoza constă în procesul de ingerare a particulelor cu dimensiuni mai mari de 0.5 μm diametru, care are loc odată cu legarea microbului la receptorii membranari care au fost anterior descriși. După ce are loc alipirea microbului la celulă, membrana plasmatică fagocitară se extinde astfel încât să cuprindă particula și apoi se închide, internalizând microbul într-o veziculă legată de membrană, denumită fagozom. Acesta mai apoi fuzionează cu lizozomul, formând fagoligozomul, unde actionează o serie de enzime anterior activate. Enzimele activate catalizează producerea mai multor substanțe toxice pentru microb, în timp ce un al treilea set de enzime descompune proteinele microbului. (2016)

Mai mult decât uciderea intracelulară, neutrofilele utilizează mecanisme adiționale pentru distrugerea microbilor, eliberând granule microbicide în spațiul extracelular.

În tot acest proces neutrofile mor, eliberându-și conținutul nuclear pentru a forma rețele de cromatină numitele capcane extracelulare neutrofile (NET), care conțin substanțe antimicrobiene. Aceste rețele NET rețin bacteriile și ciupercile și ucid organismele, eliberând enzimele și ROS, care pot răni gazd, acesta fiind motivul pentru care deși inflamațiile sunt un răspund de protecție la infecții, acestea pot provoca leziuni tisulare. (2016)

Protecția antivirală

Un tip special de răspuns elaborat de gazde este părarea împotriva virușilor, implicând interferonii, celulele NK și alte mecanisme. Interferonii de tip I inhibă replicarea virală și induc o stare antivirală, în care celulele devin rezistente la infecții. Tipul I IFN-uri include mai multe forme de IFN-α și o formă de IFN-β, este secretat de mai multe tipuri de celule infectate cu viruși. (2016)

Atunci când tipul I de IFN-urile de tip I, secretate din celulele dendritice sau alte celule infecatte, se leagă la receptorii specifici pentru IFN, căile de semnalizare sunt activate și inhibă replicarea virală și provoacă distrugerea genomurilor virale. De asemenea, celulele infectate de virusuri mai pot fi distruse de către celulele NK. (2016)

Reglarea răspunsurilor imune înnăscute

Rolul în stimularea răspunsurilor adaptive imune

Imunodeficiența

Integritatea sistemului imun este stă la baza apărării împotriva agenților patogeni și a produselor lor toxice, așadar este esențială pentru supraviețuirea individului. Defectele de la nivelul uneia sau a mai multor componente, precum și ale funcțiilor sistemului imunitar determină creșterea sensibilității la virusuri și duc la multiple tulburări, care pot fi fatale. Toate aceste defecte sunt grupate sub denumirea de imunodeficiențe și sunt împărțite în două grupuri. Prima categorie este cea a imunodeficiențelor congenitale, rezultate din anomalii genetice ale componentelor sistemului, ce duc la o sensibilitate crescută la infecții, manifestată frecvent în primii ani de viață și în copilărie, dar uneori este detectată mai târziu în viață. A doua categorie este cea a imunodeficiențelor dobândite, care rezultă ca o consecință a mai multor condiții, cum ar fi infecțiile (HIV, SIDA), malnutriția sau tratamentul cu medicamente imunosupresoare care provoacă funcționarea inadecvată a componentelor sistemului imunitar.

Pe lângă creșterea susceptibilității la infecții, pacienții care suferă de imunodeficiențe sunt de asemenea predispuși anumitor tipuri de cancer, care cel mai adesea sunt cauzate de virusuri oncogenetice, cele mai cunoscute exemple fiind virusul Epstein Barr (EBV) și virusul Papilloma umană (HPV). 2018

În mod paradoxal, anumite imunodeficiențe sunt asociate cu o creștere a autoimunității, aceasta fiind observată în general atunci când se produce atenuarea unui anumit mecanism de reglare, datorită unei mutații hipomorfice cauzată de pierderea incompletă a unei populații sau a unei funcții imune.

Defectele care provoacă imunodeficiențele pot avea loc atât la nivelul dezvoltării sau activării limfocitelor, cât și în mecanismele efectoare ale imunității înnăscute și adaptive. Deoarece sunt implicate componente diferite ale sistemului imunitar, bolile de imunodeficiență sunt clinic și patologic eterogene. (2018)

Imunodeficiențele primare (congenitale)

Aceste imunodeficiențe sunt cauzate de defecte genetice care duc la determinarea unor blocaje în maturare sau în cadrul funcționării diferitelor componente ale sistemului imunitar, ale sistemului imunitar înnăscut, precum și în dezvoltarea și răspunsul limfocitelor.

A fost estimat că unul dintre 500 de indivizi chestionați în SUA și Eurpoa suferă de imunodeficiență congenitală cu severitate variabilă. Aceste imunodeficiențe prezintă câteva proprietăți, dintre acestea făcând parte capacitatea de a dezvolta complicațiile infecțioase, precum și varietatea mare a manifestărilor clinice și patologice. Din această cauză, unele diagnostice sunt ușor de determinat utilizând citometria în flux a celulelor imune, măsurarea nivelelor imunoglobulinelor serice (Ig) sau evaluând funcționarea neutrofilelor în vitro, în timp ce pentru alte diagnostice este necesară examinarea amănunțită. (2016 2018)

Defecte ale Imunității Înnăscute

Imunitatea înnăscută prezintă două componente importante, care nu numai că formează prima linie de apărare împotriva organismelor infecțioase, dar care participă și în faza efectoare a imunității dobândite. Aceste două componente sunt fagocitele și sistemul complement, deficiențele congenitale ale acestora ducând la producerea infecțiilor recurente. Dintre aceste deficiențe vom studia în continuare tulburările fagocitare congenitale, deficiențele celulelor NK, precum și defectele genetice în căile mediate de receptoriiToll-like (TLR) și în calea interleukin-12 (IL-12)/ interferon-γ (IFN-γ). Cele mai commune tulburări determinate de defectele fagocitare sunt infecțiile pielii și a tractului respirator cu bacterii sau fungi, abscese profunde și stomatite orale. (2018)

Tulburări congenitale ale imunității înnsăcute

3.3.1. Acticvitatea microbicidă defectivă a fagocitelor: Boala Cronică Granulomatoasă

Boala cronică granulomatoasă (CGD) este cauzată de mutații ale genelor care codifică subunitățile enzimei fagocit oxidază, care catalizează producerea de specii reactive de oxigen microbicid în lizozom. În urma acestei mutații a producerii defectuoase a speciilor reactive de oxigen, neutrofilele și macrofagele nu mai posedă capacitatea de a omorî microbii pe care i-au fagocitat, în special bacterii și fungi (Yazdani & McGhee, 2011). În această situație, sistemul imun încearcă să compenseze prin aducerea mai multor macrofage și prin activarea celulelor T, care stimulează recrutarea și activarea fagocitelor. Astfel, are loc acumularea macrofagelor activate în jurul focarului de infecție al microbilor intracelulari, însă aceștia nu pot fi ditruși efficient. Această acumulare a fagocitelor seamănă cu granuloamele, de unde și vine denumirea bolii. 2016

Această boală este destul de rară, afectând aproximativ un individ din 200.000 de pe teritoriul SUA, dintre care două treimi este reprezentată de forma X-linkată, cauzată de mutații ale unei subunități a enzimei fagocite oxidază care este codificată de o genă situată pe cromozomul X. Pacienții prezintă abscese și infecții recurente și severe cu fungi și bacterii intracelulare (Staphylococcus), care implică în special plămânii, ganglionii limfatici cutanat și ficatul, începând din copilărie (Yazdani & McGhee, 2011). Infecția invazivă cu ciuperca Aspergillus este principala cauză a decesului. 2018

3.3.2 Deficitul de aderare lucocitar

Deficitul de aderare al leucocitelor este reprezentat de un grup de tulburări autozomale recesive cauzat de mutații în genele codificatoare ale integrinelor, care sunt molecule necesare pentru exprimarea liganzilor pentru selectină sau mutații ale moleculelor de semnalizare necesare pentru a activa integrinele. Integrinele și liganzii selectinei sunt implicați în adeziunea leucocitelor la alte celule. Ca urmare a acestor mutații, leucocitele din sânge nu au posibilitatea de a se leaga ferm la endoteliul vascular și tot leucocitele, în special neutrofilele, nu sunt recrutate în mod normal la locurile de infecție. Aceste deficiențe au ca rezultat incapacitatea de a forma puroi și apariția parodontitei acute, precum și a altor infecții recidivante care apar relativ devreme în viață. De asemenea, aceste deficiențe de adeziune ale leucocitelor sunt provovate de mutații în gene diferite, astfel se cunosc trei tipuri diefrite ale acestei deficiențe (2016, 2018.)

Deficitul de aderare al leucocitelor tip 1 (LAD-1) este o tulburare recesivă autozomală rară, caracterizată prin infecții bacteriene și fungice recidivante și prin vindecarea insuficientă a rănilor. De asemenea, pacienții suferind de această boală pot prezenta întârzierea separării cordonului ombilical și leucocitoză, iar majoritatea funcțiilor dependente de adeziune ale leucocitelor sunt defecte (aderența la endoteliu, agregarea neutrofilelor și chemotaxia, fagocitoza și citotoxicitatea mediate de neutrofile, cellule NK și limfocite T).

Deficitul de aderara al leucocitelor tip 2 (LAD-2) este, de asemenea, o tulburare rară în care copii nu numai că prezintă infecții recurente și leucocitoza, așa cum se produce în cazul LAD-1, dar aceștia suferă și de o întârziere severă la nivel mental și la nivelul creșterii.

Deficitul de aderare al leucocitelor tip 3 (LAD-3) este prezent la pacienții care suferă de infecții repetate și de separarea întârziată a cordonului umbilical, asemănător LAD-1, însă aceștia prezintă și tulburări de sângerare grave, care necesită transfuzii de sânge din cauza agregării defectuoase a trombocitelor, cu toate că numărul trombocitelor sanguine este normal. (2018)

3.3.3. Defecte la nivelul celulelor NK și a fagocitelor

Răspândirea acestei deficiențe este destul de mică, numărul pacienților care suferă de un nivel scăzut de celule NK este destul de mic, datorită mutațiilor autozomale dominate în gena care codifică factorul de transcripție GATA-2. Astfel, pierderea activității factorului de transcripție GATA-2 are ca rezultat scăderea populațiilor precursoare din măduva osoasă, ceea ce duce la o pierdere a celulelor NK, precum și la scăderea numărului monocitelor, a celulelor dendritice și a celulelor B. Pacienții prezintă infecții severe cu virusuri, în special din familia de herpesvirusuri și papilomavirusuri.

Sindromul Chédiak-Higashi este o tulburare autozomală recesivă în care granulele lizozomale ale leucocitelor nu funcționează normal, ceea ce afectează fagocitoza și celulele NK și manifestă și o sensibilitate crescută la infecțiile bacteriene.

Pacienții suferind de această imunodeficiență prezintă neutrofile, monocite și limfocite ce conțin lizozomi foarte mari, această manifestare fiind cauzată de mutații ale genei codificatoare a proteinei LYST, care reglementează traficul intracelular de lizozomi. Mutațiile conduc la fuziunea defectuoasă a fagosomelizomilor în neutrofile și macrofage (determinând rezistență redusă la infecție), precum și la formarea defectuoasă a melanozomilor în melanocite (provocând albinismul) și la anomalii lizozomale în celulele sistemului nervos (provocând defecte nervoase), iar la nivelul trombocitelor provoacă tulburări ale sângerării. De asemenea, unii dintre precursorii neutrofilelor mor prematur, ducând la leucopenie moderată. Neutrofile care supraviețuiesc pot conține niveluri reduse ale enzimelor lizozomale care funcționează în mod normal în uciderea microbiană, însă aceste celule sunt deficiente în chemotaxie și fagocitoză, astfel contribuind la activitatea microbicidă deficitară. (2016, 2108)

3.3.4. Defectele moștenite în căile TLR, factorul nuclear-κB: Semnalizarea și interferonii de tip I

Frecvența acestor deficiențe este foarte mică, foarte puțini pacienți fiind descriși ca suferind de aceste boli moștenite. Mutațiile afectează receptorii Toll-like (TLR) sau căile de semnalizare în aval de TLR-uri, inclusiv moleculele necesare pentru activarea factorului de transcripție nuclear κΒ (NF-κB). În mod surprinzător, aceste mutații determină sensibilitatea pacienților la un număr limitat de infecții. De exemplu, mutațiile care afectează MyD88, o proteină adaptor situată în aval de multe TLR-uri, sunt asociate cu pneumonii severe bacteriene (cel mai adesea pneumococice), iar mutațiile care afectează TLR3 sunt asociate cu encefalita herpesvirus recurentă, însă nu sunt determinate alte infecții virale. Aceste fenotipuri clinice destul de limitate sugerează o redundanță considerabilă în mecanismele de apărare ale gazdei, astfel încât defectele unei căi pot fi compensate de alte căi, iar pacienții nu sunt susceptibili la o mare varietate de infecții. (2016)

Unele deficiențe imune sunt cauzate de defecte care afectează în mod specific activarea NF-kB. Mutațiile punctuale în inhibitorul κB kinazei γ (IKKγ), contribuie la afecțiunea recesivă X-linkată, cunoscută dub denumirea de displazie ectodermică anhidrotică cu imunodeficiență (EDA-ID). Acești pacienți suferă de infecții cu bacterii piogenice încapsulate, precum și cu agenți patogeni intracelulari bacterieni, dintre care micobacterii, virusuri și ciuperci, cum ar fi Pneumocystis jiroveci (2018).

3.3.5. Defecte ale căii IL-12/IFN-γ

Celulele dendritice și macrofage secretă IL-12, iar semnalizarea receptorului IL-12 (IL-12R) stimulează sinteza IFN-γ de către celulele T helper, celulele T citotoxice și celule. Mutațiile în genele care codifică IL-12p40, lanțul IL-12Rβ1 și ambele lanțuri ale receptorul IFN-γ duc la sensibilitatea la speciile de Mycobacterium (adesea numite micobacterii atipice), cum ar fi Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasii și Mycobacterium fortuitum, pemtru aceste tulburări utilizându-se termenul de susceptibilitate mendeliană la boli micobacteriană (MSMD). 2018

3.3.6 Tratamentul Imunodeficiențelor Cngenitale

Tratamentul imunodeficiențelor primare variază în funcție de boală, însă cel mai utilizat tratament este cel al transpantului de celule stem hematopietice. Acest procedeu presupune potrivirea perfectă dintre donor și beneficiar, astfel încât să nu se dezvolte boli grave între grefă versus gazdă. Cu toate că tratamentul ideal pentru rezolvarea tuturor imunodeficiențelor congenitale este reprezentat de înlocuirea genei defecte, acest lucru rămâne un obiectiv greu de atins, întru cât deși terapia cu gene a fost realizată la pacienții cu SCID X-linkat, acești pacienți au dezvoltat consecutiv leucemia celulelor T. 2018