Aplicatii In Biomedicina a Spectrometriei de Masa cu Capcana Ionica Si Fragmentari In Camp de Radiofrecventa

Diversitatea structurală a glicoconjugaților în țesuturi și celule este determinată de complexitatea foarte mare a compoziției lor precum și de specificitatea tisulară a acestor molecule. Pentru a elucida structura unei anume specii de glicoconjugați implicată într-un anume proces fiziologic sau patologic este necesară o foarte precisă și detaliată analiză structurală. În ultimii ani, prin metode bazate pe electroforeză capilară și pe gel (1 și 2 –dimensională), cromatografie lichidă, cromatografie pe strat subțire (TLC) cât și prin metode imunochimice și imunohistochimice [168] a fost demonstrată diferența în compozitia și cantitatea glicoconjugaților din diferitele matrici umane, precum și distribuția lor la suprafața celulelor și în spațiul extracelular. Rezultatele experimentale obținute cu tehnicile enumerate mai sus, sunt însă bazate doar pe comparații și oferă date numai asupra componentelor majore prezente în amestecurile native complexe. Acest neajuns a fost atribuit atât sensibilității reduse a metodelor implicate până acum în analiza compusilor glicoconjugați cât și a posibilităților lor de detecție, limitată numai la caracterizarea structurală a speciilor majore din diferitele matrici umane. Elucidarea structurală a speciilor individuale de glicoconjugați în amestecurile complexe extrase din matrici umane (celule, țesuturi, fluide ale corpului etc) reprezintă o cerință fundamentală pentru determinarea compoziției lor în regiuni specifice și pentru corelarea specificitații acestor structuri cu funcția specializată a fiecărei matrici umane, în condiții de subiect sănătos și bolnav.

Pentru a defini și înțelege interelația structură-funcție a fiecărei entități structurale de glicoconjugați, implicată într-un anume proces fiziologic/patologic, și pentru a îmbunătăți potențialul lor terapeutic și de diagnostic, în deceniul trecut spectrometria de masă cu ionizare prin electrospray a fost aplicată pentru analize la sensibilități de ordin micromolar. În prezent însă, sunt necesare noi platforme spectrometrice de masă pentru a permite analize care să ofere date privitoare la complexitatea structurală ridicată a glicoconjugaților [169-176].

Defectele de tub neural (anencefalia, spina bifida deschisă și encefalocelul) sunt un grup heterogen de malformații congenitale decurgând dintr-un eșec de fuziune a tubului neural. Acestea apar cu o incidență de aproximativ 1 caz la 1.000 de nașteri vii. Acest defect este reprezentat de un orificiu în maduva spinării sau creier care apare timpuriu în dezvoltarea embionară. În a 3-a saptamână de gestație – care poartă numele de gastrulație, celulele specializate de pe fața dorsală a fetusului încep să fuzioneze și să formeze tubul neural. Când acest tub nu se închide complet se dezvoltă un defect de tub neural [177,178].

Există doua tipuri de defecte de tub neural: cele deschise, fiind mai frecvente și închise. Cele deschise apar când creierul și/sau măduva spinării sunt expuse, fiind detectabile, din punct de vedere morfologic, printr-o anomalie a craniului sau vertebrelor. Defecte deshise ale tubului neural sunt: anencefalia, encefalocelul, hidrancefalia, iniencefalia, schizencefalia și spina bifida. Mai rar apar defectele închise de tub neural, cum sunt: lipomielomeningocelul și lipomeningocelul [179].

Acidul folic (vitamina B9) și vitamina B12 sunt foarte importante în reducerea incidenței defectelor de tub neural. S-a sugerat că embrionul uman este în mod particular sensibil la deficitul de folat datorită diferențelor enzimelor funcționale în acest stadiu al embriogenezei. Totuși, un deficit izolat de folat nu determină aceste anomalii, iar deficitul de vitamina B12 participă de asemenea [180]. Rata de supraviețuire, gradul handicapului și coeficientul de inteligență al copilului cu spina bifidă sau encefalocel variază cu localizarea și severitatea leziunii și cu tratamentul aplicat. Incidența estimată a defectelor de tub neural este de 1/1300 nou-nascuți vii [181].

Testele pentru defecte de tub neural cuprind examenul ecografic și măsurarea alfa-proteinei serice materne. Adesea aceste defecte sunt aparente la naștere, dar defectele oculte pot să nu fie diagnosticate decât foarte târziu. Un nivel ridicat al alfa-proteinei serice materne la 16-18 saptamini de gestație este un bun predictor pentru defectele de tub neural [182]. Tratamentul depinde de severitatea complicațiilor. Nu există un tratament disponibil pentru anencefalie, deoarece copiii nu supraviețuiesc mai mult de câteva ore.

Anencefalia apare în procesul de neurulație, în timpul căruia, neuroporul cranian al tubului neural fetal nu se închide (săptămâna a 4-a de gestație). În cazul anencefaliei fătul prezintă un rest de insule gliale, formate din astrocite și oligodendrocite, în locul emisferelor cerebrale, iar oasele superioare ale scalpului lipsesc (fig. 4.1).

Figura 4.1 Fetus care manifestă malformatia congenitală numită anencefalie. Se poate observa nevroglia (formată din oligodendrocite si asterocite) expusă mediului extern, lipsa oaselor craniene, scalpului, precum și nedezvoltarea encefalului

Probele de țesut anencefalic (25 săptămȃni gestaționale) au fost recoltate la Universitatea de Medicină din Zagreb, iar prelucrarea lor s-a realizat în aceeași locație. Probele de țesut folosite pentru analiza biochimică au fost cântărite și stocate la -200C. Toate experimentele cu țesut uman au fost efectuate în conformitate cu normele de etică stabilite prin Declarația Asociației Mondiale Medicale de la Helsinki, revizuită la Edinburgh în anul 2000.

Extracția gangliozidelor a fost efectuată conform metodei Svennerholm și Fredman modificată în laboratorul nostru. Probele de țesut au fost cântărite și omogenizate în apă distilată înghețată pentru obținerea a 10% omogenat. Lipidele au fost extrase de două ori folosind un amestec de solvenți cloroform:metanol (1:2 raport volumetric) urmată de partiția și repartiția prin adăugare de cloroform, metanol și apă la un raport volumetric final 1:1:0.8. Faza superioară conținând glicosfingolipide polare (gangliozide) a fost colectată. Extractul de gangliozide uscat a fost în final purificat prin dializă (peste noapte, la 400C) și folosit pentru analiza calitativă și cantitativă a gangliozidelor.

Pentru analiza MS, soluția stoc de gangliozide a fost preparată prin dizolvarea materialului uscat în metanol pentru a fi stocat la -270C. Diluția soluției stoc cu metanol pur a fost efectuată în scopul de a obține probele uscate la concentrații brute estimate de aproximativ 5 pmol/µL (calculată pentru o masă moleculară medie de 2000 g/mol) pentru experimentele cu nanoESI HCT MS cu chip. În vederea eliminării posibilității de blocare a orificiilor extrem de înguste ale microchipurilor de siliciu, toate soluțiile au fost centrifugate 1h. Probele cu conținut ridicat de săruri au fost desalifiate prin dializa (4 zile) în 5 mM acetat de amoniu la 40ᵒC.

Atribuirile ionilor precum și postularea structurilor a fost realizată pe baza evidențelor acumulate în studiile noastre anterioare, a criteriilor căilor de biosinteză coroborate cu informațiile asupra maselor moleculare derivate din calcul exact al valorilor m/z aferente peak-urilor din figuri.

După cum se poate observa din analiza spectrului din figura 4.2 au fost identificate 31 de specii de gangliozide, cu o neașteptată diversitate a porțiunii ceramidice într-un timp de achiziție relativ scurt.

Figura 4.2 Spectrul (-) nanoESI chip HCT MS1 al amestecului nativ de GG din țesutul ANC. Solvent: MeOH; concentrația probei 5 pmol/μL; timp de achiziție a semnalului 10 min; potențialul Chip ESI: -0.8 kV; potențialul pe capilar: -50 V; presiune azot: 0.6 psi.

Conform calcului aferent interpretării spectrului din figura 4.2, cel mai scurt acid gras, conținut de porțiunea ceramidică a gangliozidelor, conține 14 atomi de carbon în moleculă, iar cel mai lung 27. Cel mai scurt acid gras a fost identificat în specia GM3(d18:1/14:0) detectată ca ion [M-H]- la m/z 1139.11, în timp ce acidul gras cu 27 de atomi de carbon se regăsește în specia GM1(d18:0/27:0), detectată ca ion [M-H]- la m/z 1671.17 (tabelul 4.1).

Tabel 4.1. Desemnarea ionilor din proba ANC

O caracteristică notabilă a spectrului MS1este expresia majoritară a gangliozidelor cu lanț scurt GD3(d18:0/18:0), GD2(d18:1/18:0), GM3(d18:1/14:0), GM3 (d18:1/18:0) și GT3(d18:1/24:1), precum și a speciilor polisialilate cum sunt GT1(d18:1/18:0), GT1(d18:1/20:0) și GQ2(d18:1/18:0). Ionii dublu încărcați GT1(d18:1/18:0), detectat la m/z 1063.41 și GD1(d18:1/18:0), cu m/z-ul având valoarea de 917.55, reprezintă speciile cele mai abundente (fig. 4.2).

Pentru a determina exactitatea experimentelor realizate, s-a calculat acuratețea ȋn determinarea maselor. Cea mai mare valoare a acesteia a fost de 145 ppm ȋn cazul speciei GD1(d18:1/24:1) cu m/z 1918.30, detectată ca ion [M-H]-. Cea mai mică acuratețe a fost calculată pentru specia GD3(d18:0/18:0) cu m/z acurateții ȋn determinarea m/z 734.86, detectată ca ion [M-2H]2-. De asemenea s-a calculat dependența experimentală ȋn funcție de abaterea relativă a spectrometrului de masă HCT, care este ȋncadrat ȋn categoria instrumentelor cu rezoluție joasă. S-a determinat că toate valorile obținute pentru toate speciile de gangliozide din amestecul complex ANC s-au situat sub valoarea erorii maxime admise ȋn cazul HCT (fig. 4.4).

Figura 4.4 Dependența acurateții în determinarea (m/z)exp în funcție de abaterea relativă a instrumentului HCT față de (m/z)teor aferentă speciilor de gangliozide extrase din insulele gliale ale fetusului afectat de anencefalie

4.2 Determinarea expresiei gangliozidelor din lobul fetal frontal sănătos (FL)

În scopul determinării numărului de specii de gangliozide și a fezabilității nano chip-ESI MS, a fost utilizat un eșantion de cortex frontal provenit dintr-un creier al unui fetus sănătos (27 săptămȃni gestaționale) care a decedat printr-un avort accidental. Țesuturile au fost caracterizate morfoanatomic si histopatologic la Universitatea de Medicină din Zagreb, iar materialul analizat a fost reprezentat exclusiv de extrase de glicosfingolipide. Analiza morfoanatomică si histopatologică a aratat că creierul nu avea nici o afecțiune de tip malformativ și era dezvoltat normal pentru vârsta respectivă.

Extrasele de gangliozide native țesutului lobului fetal frontal, notat FL, au fost supuse analizei prin (-)nano chip-HCT HCT MS1 în condiții identice celor amintite în capitolul în care s-a descris analiza amestecului de gangliozide ANC, cu privire la parametrii instrumentali și cei ai soluției de analizat. Concentrația probei a fost de 5 pmol/µL, calculată pentru o masă moleculară medie de 1500 Da. Solventul volatil utilizat a fost metanolul, iar presiunea azotului a avut valoarea de 0.6 psi. În figura 4.3 se poate observa diversitatea structurală a speciilor de gangliozide detectate în cazul lobului frontal fetal de 27 săptămâni gestaționale.

Figura 4.3 Spectrul (-)nano chip-ESI HCT MS1 al amestecului nativ de GG din țesutul normal lob frontal (proba FL). Solvent: MeOH; concentrația probei 5 pmol/μL; timp de achiziție a semnalului 10 min; potențialul Chip ESI: -0.8 kV; potențialul pe capilar: -50 V; presiune azot: 0.6 psi.

Ionii cei mai abundenți (fig. 4.3) aparțin clasei gangliozidelor di și trisialilate, și anume GD1(d18:1/18:0), GD2(d18:1/20:0), GT1(d18:1/18:0), detectați la m/z 917.56, 851.56 și 1063.24, avȃnd compoziția ionică de tipul [M-2H]2-, [M-H]-, respectiv [M-2H]2-.

Tabel 4.2. Desemnarea ionilor din proba FL

Figura 4.5 Dependența acurateții în determinarea (m/z)exp în funcție de abaterea relativă a instrumentului HCT față de (m/z)teor aferentă speciilor de gangliozide extrase din lobul frontal fetal sănătos.

4.3 Studiul comparativ al gangliozidelor din amestecurile native ANC/FL

Dupa cum rezultă din analiza atentă a spectrelor și tabelelor condițiile nanoESI chip HCT MS optimizate au permis formarea simultană a ionilor dublu și simplu încărcați, au favorizat ionizarea lanțurilor lungi polisialilate de tip GT și GQ, au indus o ionizare/detecție excelentă a speciilor minore existente în amestecul complex și au împiedicat fragmentarea nespecifică și necontrolată în sursă a modificărilor labile de tip carbohidrat și ne-carbohidrat precum acidul sialic NeuAc si gruparea acetil O-Ac. În următorul tabel este prezentată o sistematizare comparativă a speciilor de gangliozide identificate în lobul frontal fetal și în nevroglia afectată de anencefalie.

Tabel 4.3. Sistematizarea comparativă a structurilor identificate în ANC și FL

d- bază sfingoidă dihidroxilată

+ structura a fost detectată

– structura nu a fost detectată

Prin metoda chip-ESI HCT MS au putut fi identificate 31 specii distincte în proba ANC și 53, din care 5 O-acetilate și 3 asialilate, în proba FL. Aceste rezultate indică faptul că în studiile noastre anterioare efectuate asupra probei FL numai pe baza cromatografiei pe strat subtire (HPTLC) fiecare bandă de migrare conținea de fapt mai multe specii ce au putut fi discriminate numai prin metoda de față bazată pe ionizare prin chip electrospray și detecție prin HCT MS.

O caracteristică comună a celor două probe o reprezintă expresia lanțurilor scurte, în particular a celor cu conținut scăzut de acid sialic. Astfel, speciile GD3 (d18:1/18:0), GD2 (d18:1/18:0), GM1 (d18:1/18:0) și izomerii lor au fost detecțati in ambele amestecuri de gangliozide ANC si FL ca ioni monoîncărcați sau dublu deprotonați de o abundență redusă similară.

Ȋn urma examinării spectrelor ANC/FL, s-a remarcat o diferență clară în ceea ce privește expresia gangliozidelor în proba ANC față de proba control FL. În ANC GT1 (d18:1/18:0) detectat ca ion [M-2H]2- la m/z 1063.41, urmat de GD1 (d18:1/18:0) detectat ca ion [M-2H]2- la m/z 917.55 și [M+Na-2H]- la m/z 1857.70 sunt speciile cele mai abundente în timp ce pentru proba FL distribuția abundențelor relative este inversată.

Un aspect notabil este acela că deși în ambele probe structurile dominante sunt mono-, di- și trisialotetraozele, anumite structuri din ANC apar clar asociate bolii. Astfel, în condiții absolut identice de masură abundența ionilor corespunzând componenților polisialilați GT și GQ apare complet diferită pentru cele două probe. GT1 este mai bine exprimat in ANC decât în FL în timp ce GQ1 și GQ2 deși vizibile în ANC se află sub limita de detecție în FL care este în fond dominat de structuri de tip GM3.

Mai mult, 3 ioni monodeprotonați la m/z 1037.51, 1165.90 și 1252.17 detectați în proba FL au putut fi atribuiți speciilor asialo de gangliozide având compozițiile HexNAcHex2Cer(d16:0/16:0), HexNAcHex2Cer(d18:0/22:0) și HexHexNAcHex2Cer (d18:1/18:0). Aceste specii și nici alte variante complet desialilate nu au putut fi detectate în proba ANC. Interpretarea acestor rezultate se poate face ținând cont de descoperirile noastre atenrioare, conform cărora există o directă corelare între gradul de sialilare și tipul țesutului. Grade ridicate de sialilare sunt specifice țesuturilor aberante în stadii incipiente de dezvoltare precum ANC în timp ce sialilarea scazută sau chiar asialilarea este caracteristică unei organizări superioare de tipul țesutului FL normal. În consecință prezența structurilor polisialilate în ANC și absența lor în FL respectiv prezența celor asialo în FL, constituie un marker al dezvoltării aberante în cazul țesutului ANC.

Spectrele celor două probe relevă și prezența unor modificări periferice labile ale lanțurilor de oligozaharide din gangliozide. Aceste modificări sunt acetilările de tip O prin unitatea O-Ac. Aceste structuri sunt și ele marker al dezvoltării tumorale. În timp ce cinci specii O-acetilate GM3 au fost detectate în FL, numai două prezentând lanț lipidic de tip (d18:1/20:0) și (d18:0/22:0) au fost detectate în ANC.

4.4 Analiza structurală prin stagii multiple de fragmentare în câmp de radiofrecvență a gangliozidelor din anencefalie ca posibili biomarkeri ai malformației

Datele de screening MS au demonstrat că structura de tip GT1 este asociată anencefaliei. Din acest motiv, pentru a putea identifica tipul de izomer asociat malformației și a realiza o analiză structurală detaliată a posibilului biomarker, ionul dublu deprotonat aflat la m/z 1063.41 a fost izolat și fragmentat prin stagii multiple MS2-MS3 de disocieri induse prin ciocnire (CID).

Această analiză împreună cu schemele de fragmentare ale moleculei aferente fiecărui stagiu de disociere sunt prezentate în figurile 4.6, 4.7, 4.8 și 4.9.

Figura 4.6 Spectrul de fragmentare (-)nano chip-ESI HCT MS2 al ionului dublu încărcat la m/z 1063.34 corespunzând speciei GT1(d18:1/18:0) detectată în amestecul nativ ANC. Solvent: MeOH; concentrația probei 5 pmol/μL; timp de achiziție a semnalului 10 min; potențialul Chip ESI: -0.8 kV; potențialul pe capilar: -50 V; presiune azot: 0.6 psi; timp maxim de acumulare al ionilor în capcană: 300 ms.; amplitudine RF variabilă în intervalul 0.6-1.0 V.

După cum se poate observa (fig. 4.6), desi spectrul înregistrat este o sumă de scanuri consecutive, obținute în conditii de amplitudine variablă cu rampă ascendentă, la diferite energii de excitare ale ionului (0.6-1.0 V), procesul dominant în MS2, ca prim stagiu de fragmentare, este desialilarea extensivă. Pierderea acidului sialic (C11H19NO9) NeuAc terminal este documentată de ionii fragment B1β- la m/z 290.95, B2β- la m/z 581.92 și C3β- la m/z 908.25. Ionul de la m/z 908.25 substanțiază aditional desialilarea extensivă indusă de experimentul MS2. El corespunde fragmentului trisialo C3β-. Astfel, devine un fragment de interes structural crescut, deoarece se poate asocia ca ion diagnostic complementar fragmentului Z2α-. C3β- și Z2α- pot fi asociate izomerului GT1c (fig. 4.7).

Figura 4.7 Schema de fragmentare prin (-)nano chip-ESI HCT MS2 a ionului dublu încărcat la m/z 1063.41 corespunzând speciei GT1c(d18:1/18:0) detectată în amestecul nativ ANC.

Ruperea succesivă a NeuAc sau clivajul direct a două entități NeuAc este confirmată de ionii abundenți Y2β- la m/z 1544.28 și Y2β- la m/z 1836.82, în timp ce dubla scindare cu eliminare completă de NeuAc este atestată de ionul, mai puțin abundent, asialo, Y1β- la m/z 1254.17.

Spectrul din figura 4.6 prezintă, de fapt, o singură scindare, ce poate fi atribuită ruperii legaturii glicozidice, și anume Y2α/Z1β- (GalGlcCer) abia detectabil la m/z 888.62. Unica informatie structurală oferită de acest ion este confirmarea compoziției (d18:1/18:0) a părții ceramidice. În structura din figura 4.7, ce ilustrează calea de fragmentare în MS2, elementul NeuAc3 este legat de Gal internă conducând la o configurație aferentă izomerului GT1c; însă schema a putut fi fost realizată numai ținând cont de datele structurale colectate în stagiile superioare de disociere, asa cum se va discuta in continuare.

Imposibilitatea de a obține ioni fragment diagnostic pentru un anumit tip de izomer a putut fi însă depășită prin introducerea de stagii superioare de fragmentare. Astfel, ionul monoîncărcat la m/z 1544.28 cu o compoziție de tip GM1(d18:1/18:0), detectat ca fragment de tipul Y2β- în spectrul MS2 al speciei GT1 (d18:1/18:0), a fost izolat într-o fereastră de 2 u și supus disocierilor induse prin ciocnire într-un experiment de tip MS3 (fig.4.8).

Figura 4.8 Spectrul de fragmentare (-)nano chip-ESI HCT MS3 al fragmentului 1544.28, calculat ȋn spectrul ANC MS1 ca fiind Y2β-. Solvent: MeOH; concentrația probei 5 pmol/μL; timp de achiziție a semnalului 10 min; potențialul Chip ESI: -0.8 kV; potențialul pe capilar: -50 V; presiune azot: 0.6 psi; timpul de achiziție al semnalului: 7 min; amplitudine RF variabilă în intervalul 0.6-1.0 V.

O inspecție generală a spectrului din figura 4.8 indică faptul că, desialilarea rămâne procesul major și dominant de fragmentare demonstrată de abundența majoritară a fragmentului Z1β- cu m/z 1253.81, reprezentat de structura GalGalNAcGalGlcCer. Clivarea ceramidei este documentată de ionul Y0- la m/z 564.62. Similar cu MS2,acest fragment ionic, in conjunctie cu Z2α/Z1β- (GalGlcCer)- la m/z 888.42, sprijină încă o dată structura de tip (d18:1/18:0) a ceramidei (fig. 4.9).

Figura 4.9 Schema de fragmentare prin (-)nano chip-ESI HCT MS3 al fragmentului 1544.28, corespunzând, ȋn spectrul ANC MS1 , structurii Y2β-.

Remarcabilă este și generarea porțiunii NeuAcGalGlcCer detectată la m/z 1179.48 ca fiind fragmentul Y2α- și NeuAcGalNAcGalGlcCer prezentă la m/z 1382.56 ca Y3α- și la m/z 1364.83 ca Y3α- dehidratat. Acești ioni aduc dovezi suplimentare pentru poziția de atașare a NeuAc la molecula de Gal internă (fig. 4.9). Așa cum se poate distinge din figura 4.9, ȋn contrast cu MS2, stadiul de fragmentare avansat, MS3, a condus la caracterizarea completă a secvenței glucidice. O importanță deosebită are identificarea NeuAcGalGalNAcGalGlc detectat la m/z 980.32 ca ion fragment B4- și NeuAcGalNAcGalGlc detectat la m/z 1090.80 ca ion fragment Z3α-. Acești ioni aduc informații suplimentare ȋn ceea ce privește structura lanțului zaharidic, precum și dovezi clare asupra zonei de atașare a NeuAc la galactoza internă, ceea ce contribuie la demonstrarea speciei GT1 ca fiind izomer de tip c.

Datorită abundenței majoritare a speciei GT1(d18:1/18:0) detectată în amestecul nativ ANC, se poate postula că această gangliozidă, demonstrată ca fiind izomerul GT1c, este cel mai probabil un posibil biomarker al acestui tip de malformație congenitală. Prin nano chip-ESI HCT MS, completat de stadii multiple de fragmentare CID, s-a demonstrat, nu numai importanța biologică deosebită a speciei de gangliozide analizate, dar și poziția de atașare a NeuAc. Atașamentul NeuAc de lanțul glucidic este caracterizat print-o legătură labilă, care a rămas de cele mai multe ori intactă pe parcursul efectuării experimentelor de fragmentare, oferind astfel posibilitatea obținerii ionilor diagnostic care au confirmat prezența izomerului GT1c(d18:1/18:0) ȋn amestecul complex de gangliozide din ANC.