Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase 1 [615722]

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 1
INTRODUCERE
STADIUL ACTUAL ALCUNOAȘTERII

2| Hancu Gabriel
1. Electroforeza capilar ă–caracterizarea metodei
Electroforeza este o metodă fizică de analiză, care se bazează pe migrarea
particulelor încărcate electric, dizolvate sau dispersate într -o soluție de electrolit și
supuse ac țiunii unui câmp electric [1,2].
Denumirea de electroforeză provine din asocierea cuvântului grec electron
(electric) cu cel latin phore(purtător) [3].
Mobilitatea electroforetică a unei particule se calculează conform formulei:
m= d / tE
unde m–mobilitatea electroforetică (în metri pătra ți pe volt și secundă); d –distanța
parcursă de particulă într -un timp t (în metri); t –timpul de migrare a particulei (în
secunde), E –gradientul de poten țial (în volți pe m etru) [1].
Mobilitatea electroforetică variază în func ție de o serie de factori ce depind de
particulă (natura, mărimea, forma, sarcina electrică, gradul de disociere) și de soluția
de electrolit (natura, concentra ția, pH-ul, vâscozitatea, temperatura). Migrarea
particulel or în câmp electric va avea loc în sens opus sarcinii electrice; astfel
particulele încărcate pozitiv vor migra către catod în timp ce particulele cu sarcină
negativă vor migra către anod [1,2].
Electroforeza a început să fie utilizată ca metodă analitică de separare în urma
cercetărilor privind separarea unor proteine (1937) elaborate ch imistul suedez Arne
Tiselius (1902 -1971), laureat al premiului Nobel (1948), supranumit și“părintele
electroforezei ”[3].
Tehnicile clasice de electroforeză implică migrar ea fracțiunilor în medii poroase
(hârtie de filtru, acetat de celuloză, agaroză -gel, agar-gel, etc.) impregnate cu o solu ție
de electrolit [1,3].
Introduse pe scară largă în practica clinică acum mai bine de 50 de ani, metodele
electroforetice de analizăau cunoscut o ascensiune deosebită datorită descoperirii
unor noi suporturi electroforetice (mult mai sensibile, specifice și cu un grad de
rezoluție mai ridicat), automatizării complete a ciclului de analiz ăși diversificării
utilizărilor tehnicilor electr oforetice pentru o gamă largă de compuși (hemoglobine,

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 3
lipoproteine, izoenzime) și fluide biologi ce (lichid cefalorahidian, urină, lacrimi, salivă ,
lichid amniotic, sinovial, lapte matern) [3-5].
Modalitatea cea mai comună de efectuare a determinărilor electroforetice este
prin utilizarea unei “coloane”umplute cu soluție tampon; l a cele două capete
montându-sedoi electrozi prin care serealizează câmpul electric necesar deplasării
electroforetice, iar în dreptul unuia dintre capete se plasează detectorul sistemului [4].
Cea mai nouă tehnică electroforetică utilizează un capilar de silice pentru
separarea electroforetică, această tehnică fiind denumită, electroforeză capilară. Totul
a început la începutul anilor 1980 cu separarea unor peptide în capilare de sticlă cu
diametrul de 75 µm de către Jorgenson și Lukacs și a continuat în anii 1990 cu apari ția
primelor sisteme complet automatizate de electroforeză capilară, sisteme ce au
început să fie utilizate în analizele de laborator clinic și biologic [3].
Electroforeza capilară (EC) esteo tehnică de separare electrofo retică oficina lă
în Farmacopeea Europeană edi ția a 9-a (EurPh 9) [2],în care separarea are loc în
interiorul unui capilar subțire de silice umplut cu o soluție de electroliți, putând fi
utilizatăpentru separarea speciilor încărcate cu sarcini electice, dar și a celor
neîncărcate electric când se introduc î n soluția de electroliți aditivi potriviți, sau se
utilizează doar deplasarea electroosmotică [3-5].
Avantajele unei separări eficiente, autom atizăriicomplete a ciclului de analiză,
costului relativ scăzut al consumabilelor, consumului sc ăzut de reactivi și analiți șia
posibilității de utilizare a diferite sisteme de detecție au fost valorificate din plin în
analiza și controlul substanțelor m edicamentoase, domeniu în care tehnicile
electroforetice au fost prea puțin utilizate anterior [6-8].
Ținând cont de avantajele enumerate anterior ,EC câștigă din ce în ce mai mult
teren în ultimii ani în analiza substan țelor de interes farmaceutic, fiind percepută la
ora actuală ca și o alternativă și în același timp o metodă complementară la mult mai
utilizatele metode cromatografice, referindu -ne aici în special la cromatografia de
lichide de înaltă performanță -HPLC.
Schema unui sistem de EC este relat iv simplă, acesta fiin dcompus dintr -un
capilar de silice învelit cu poliimidă, un sistem de injectare , o sursă de înaltă tensiune,
doi electrozi, două recipiente pentru solu ția tampon și un sistem de detectare (figura
1.1.)[4].

4| Hancu Gabriel
Figura 1.1. Schema simpl ificată a unui sistem de EC
Capilarul este compartimentul în care are loc separarea și deobicei detecția, este
constituit din silice topită și este umplut cu o soluție de electroliți care va conduce
curentul în interiorul lui. Capetele capilarului sunt imersateîn două rezervoare ce
conținsoluțiade electroliți . Se utilizează capilare cu lungime de 25 -100 cm și
diametru intern 25-100 μm; având peretele exterior acoperit cu un strat poliimidic ce
îi conferă capilarului flexibilitate și rezistență. Ținând c ont că poliimida nu este
transparentă pentru radia țiile UV, s tratul extern de poliimidă este întrerupt în dreptul
detectorului (prin ardere sau radere) ,pentru a permite efectuarea detectării
spectrale .Capilarul trebuie să fie rezistent din punct de veder e chimic și fizic,
transparent la radiațiile UV în dreptul detectorului și să aibă cu o conductivitate
termică bună. Suprafața internă a capilarului poate fi alcătuită din silice simplă sau
căptușită cu polimeri, care protejează suprafața capilarului de in teracțiunile cu
solvenții modificând astfelcondițiile electroforetice [9].
Pentru a se realiza separări reproductibile, capilara este fixată într -ocasetă
termostată, ceea ce îiasigură stabilitate termică. Porțiunea dezvelită de poliimidă a
capilarul va fi introdus ăîntr-o fereastră optică poziționată în casetă în dreptul
detectorului. Controlul eficient al temperaturii în compartimentul de separare este o
cerință fundamentală pentru a realiza separări reproductibile , o creștere a

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 5
temperaturii interne a c apilarului putândcauza modificarea vâscozității tamponului și
implicit a vitezei de migrare a analiților [9].
Sursa de tensiune este capabilă să genereze un voltaj extrem de ridicat depână
la + 30 kV, dar datorită caracteristicilor capilarei și implicit a diminuării efectului Joule
curentul generat va fi unul de intensitate scăzută (100 -200 µA). Rezistența electrică
mare a capilarei permite aplicarea unui potențial electric foarte mare cu generarea
unei cantități minime de căldură; î n plus, datorită rapor tului mare suprafață/volum în
cazul capilarei, are loc o disipare eficientă a căldurii care este generată la transportul
speciilor încărcate prin soluția de electrolit [9].
Electrozii suntconfecționați din material inert (platină) șisunt de asemenea
imersați în rezervoarele cu electrolit alături de capilare pentru a completa circuitul
electric.Diferența de potențial furnizată de sursa de alimentare este impusă între cei
doi electrozi [9].
În EC se pot utiliza două tehnici de injectare: hidrodinamică resp ectiv
electrocinetică. Injectarea hidrodinamică utilizează aplicarea unei presiuni în timp ce
capătul capilarului este scufundat în soluția de analizat, în timp ce injectarea
electrocinetică utilizează aplicarea unui voltaj. Injectarea hidrodinamică nu est e
selectivă, practic ce se injectează are aceeași compoziți ecu proba, în timp ce în cazul
injectării electrocinetice ce se injectează depinde de mobilitatea și de încărcătura
electrică a ionilor din probă. Deși teoretic, injectarea electrocinetică este su perioară în
cea ce privește selectivitatea, ea poate fi influențată puternic de factori dificili de
controlat, fiind dependentă de compozi ția probei, ceea ce necesită eforturi
suplimentare în optimizarea și validarea metodelor electroforetice . În general, pentru
separarea substanțelor medicamentoase se preferă utilizarea injectăriihidrodinamic e
[4,10].
La un capăt al capilarei se injectează proba, apoi se aplică un voltaj, ionii probei
se deplasează spre electrodul corespunzător încărcăturii lor electrice ,trecând prin
detector ce răspunde cu o înregistrare a componenților determina țiîn funcție de timp
respectiv cu o electroforegramă.
Sistemul de det ectarecel mai des utilizat estecelspectrofotometric UV-VIS;
majoritatea sistemelor moderne de EC fiind do tate cu detectori DAD, ce permit
înregistrarea spectrelor anali ților la mai multe lungimi de undă concomitent . Se mai

6| Hancu Gabriel
utilizează șisisteme de detecție spectrofluorimetrică, conductometrică ,
amperometrică sau prin cuplarea EC cu un spectrometru de masă (MS ). Detecția
spectrofluororimetrică oferă o sensibilitate mult mai ridicată decât detec ția
spectrofotometrică în UV -VIS, dar necesită de regulă derivatizarea analitului cu un
reactiv de derivatizare fluorescent. Spectrometria de masă prezintă la rândul ei o
sensibilitate extrem de ridicată, oferind de asemenea informa ții structurale privind
analiții dar interfața EC -MS este una relativ complicată. EC se cuplează cu sisteme MS
ce utilizează ionizarea prin electropulverizare (ESI) saudesorbția cu laser a matr iței
asistate (MALDI) [3,4,11].
Capilarele sunt fabricate din silice topită, suprafa ța internă a acestora conți nând
grupări silanol SiOH, care în contact cu solu ția de electrolit, la un pH al tamponului de
peste4 (grupările silanol a vândcaracter acid) , disociază în grupări SiO-, imprimând
peretelui capilar uluio sarcină negativă. Această ionizare a pere ților capilarei
determină acumularea de sarcini pozitive la suprafața fluxului de electroliți, în contact
cu peretele capilarei , rezultând o diferen ță depotențial (potențial zeta) limitată la
pereții capilarei .Aplicarea unei tensiuni electrice cauzează o deplasare a ionilor
probei de analizat de -a lungul capilarului; astfel rezultă o curgere a electrolitului de -a
lungul capilarului, curgerenumităflux electroosmotic (FEO)șicareestede obicei
îndreptată spre detector (figura 1.2 .)[3].
Figura 1.2. Formarea FEO
Mobilitatea FEOeste strâns legată de potențialul zeta, existând o directă
proporționalitate cu pH -ul (când pH -ul crește, potențialul zeta cre ște datorită

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 7
încărcăturii suprafeței peretelui capilar, iar FEOcrește, de asemenea, datorită
deprotonării grupărilor silanol) și o dependență inversă de punctul izoelectric a
soluției de electrolit (cînd acesta crește, potențialul zeta scade datorită dubl ului strat
ce se comprimă, și în consecin țăFEOscade) [12].
VitezaFEOse definește astfel:
VFEO= εζE / 4πη
unde ε-constanta dielectric ă,ζ-potențialul zeta iarη–vâscozitatea [12].
FEOare o viteză constantă pe toată lungimea capilarului, ob ținându-se un profil
de curgere plat ,superior celui obținut în HPLC, unde proba este împinsă sub presiune
în coloană, viteza soluției de la marginile coloanei fiindmai scăzută față de cea din
mijlocul ei, aceasta conducând la un profil parabolic și la o lărgi re a bazei peak -urilor
(figura 1. 3.) [13].
Figura 1. 3.Profilul de curgere a lFEO
Ca urmare a influen țeiFEO, analiții purtători de sarcini electrice (ionizați)
suferă două deplasări care se însumează sau seexercită co ntrar în funcție de sarcina
lor;odeplasare datorit ămobilității lor electroforetice proprii și o a doua datorită
influențeiFEO. Analiții neîncărcați cu sarcini electrice se deplasează numai datorită
FEOcare îi antrenează ( figura 1.4 .)[3,4].

8| Hancu Gabriel
Figura 1.4. Influența FEO asupra mobilității electroforetice ( µa–mobilitatea
electroforetică totală, µe–mobilitatea electroforetică efectivă, FEO–flux
electrosmotic)
Datorită direcției FEO, care la capilarele de silice (ca urmare a ionizării
grupărilor silanolice) este înspre catod, polarit atea obișnuită este cu anodul
(electrodul pozitiv) la capătul capilarului unde are loc injectarea și catodul (electrodul
negativ) la capătul opus, unde are loc detectarea . DirecțiaFEOpoate fi manipulată
prin inversarea polarită ții[3,4].
Existăcâteva di ferențe semnificative între nomenclatura utilizată în
cromatografie respectiv electroforeză. De exemplu un termen fundamental în
cromatografie este reprezentat de timpul de retenție. În electroforeză însă, în condiții
ideale, nimic nu este reținut de pereț ii capilarei, prin urmaretermenul analog pentru
timpul de retenție devine timpul de migrare. Timpul de migrare este timpul necesar
pentru ca analitul să se deplaseze de la locul injectării până în dreptul detectorului.
Dar comportamentul electroforetic al analiților poate fi definit mai bine prin
mobilitatea electroforetică (µ) decât prin timpul de migrare .Mobilitatea
electroforetică poate fi determinată din raportul dintre viteza electroforetică de
migrare și potențialul electric aplicat șise exprimă co nform ecua ției:
µ =v/ E =Ld/tm/ V/Lt
undev–viteza de migrare electroforetică, E –voltajul aplicat, L d–lungimea efectivă a
capilarului, L t–lungimea totală a capilarului, t m–timpul de migrare iarV-voltajul
[4,11].

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 9
Practic însă mobilitatea es te independentă de lungimea capilarului și de voltajul
aplicat dar depinde de natura tamponului, pH -ul acestuia și de temperatura
sistemului. Ecuația de mai sus este utilă în determinarea mobilității aparente a
analiților. Pentru a determina mobilitatea pr opriu-zisă, trebuie luat în calcul și
electroosmoza și implicit FEOgenerat de aceasta. Aceasta se calculează folosind
formula:
μef= μa-μFEO= LdLt/V (1/t m–1/tFEO).
undeμa-mobilitatea aparentă ,μFEO-mobilitatea electroosmotică ,Ld-lungimea
efectivă capilarului (de la locul unde are loc injectarea până la detector), Lt-lungimea
totală a capilarului ,tm-timpul de migrare aanalitului ,tFEO-timpul de migrare a FEO
iarV-voltajul aplicat [4,11].
Când vorbim despre EC nu vorbim despre o sing ură metodă de analiză, ci despre
mai multe tehnici: electroforeza capilară zonală (engleză –capillary zone
electrophoresis –CZE),electroforeza capilară micelară (engleză -micellar
electokinetic capillary chromatography –MECC),electroforeza capilară p e gel
(engleză –capillary gel electrophoresis –CGE),electroforeza prin focalizare
isoelectrică (engleză -capillary isoelectric focusing –CIEF),electrocromatografia
capilară(engleză –capillary electrochromatography) [3,4].
Dintre aceste tehnici în analiza substan țelor de interes farmaceutic se utilizează
în general: electroforeza capilară zonală (ECZ) șielectroforeza capilară micelară
(ECM).
Electroforeza capilară zonală (ECZ) sau “electroforeza în soluție liberă ” este
cea mai simpl ă tehnică electro foretică. Separarea se bazează pe diferen țele dintre
mobilitățile electroforetice ale analiților la care se adaugă sau se scade FEO[4,5,11].
Cationii migrează spre catod, deplasarea lor fiind accelerată de FEOcare se
deplasează în același sens. Anionii,încărcați negativi, ar trebui să migreze spre anod,
dar cum FEOeste mai puternic decât depla sareaelectroforetică, într -un final se vor
deplasatot către catod, prin urmare separarea lor derivă din rezistența la FEO.În
sfârșit moleculele neutre, deși ant renate de FEO, nu se pot separa prin această
metodă, acestea migrând împreună cu FEO .Schema separ ării prin ECZ este prezentată
înfigura 1.5 [4].

10| Hancu Gabriel
Figura 1.5. Schema separării în ECZ
Această tehnică, de ECZ se poate aplica tuturor substanțelor purtătoar e de
sarcini electrice , dar nuși moleculelor neutre din punct de vedere electroforetic .
Pentru acizi și baze slabe, mobilitatea electroforetică a moleculelor este
dependentă de gradul de disociere a diferitelor grupe ionizabile, conform ecuației:
μeff= αμa
undeμa-mobilitatea electroforetică a analitului iar α reprezint ă gradul de disociere,
care va depinde de valorile pKaale analitului și de pH-ul soluției tampon [4].
În prezența FEO, viteza de migrare a analiților ar putea fi exprimată prin
următoar ea ecuație:
v = (μe0+μa) V/L
unde este μ FEO–mobilitatea FEO,μa-mobilitatea electroforetică a analitului, V –
potentialul aplicat, L –lungimea capilarului [4].
Electroforeza capilară micelară (ECM) sau cromatografia electrocinetică
micelară capilară poate fi considerată o metodă hibrid ce îmbină perceptele separării
din electroforeză și cromatografie. Separările de acest tip se fac în prezența
substanțelor micelare, ad ăugate direct solu ției de electrolit .Pentru a putea fi folosit în
ECM un surfactan t trebuie să corespundă anumitor criterii: să fie suficient de solubil

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 11
în soluția de electroliți pentru a forma micele, să formeze soluții micelare omogene și
transparente la radiații UV șisă formeze soluții micelare cu vâscozitate scăzută
[4,5,14].
ECZ se bazează pe diferențele între mobilitățile electroforetice ale analiților,
prin urmare este greu de aplicat în cazul moleculelor neutre, ce vor migra către
detector cu aceeași viteză cu FEO.ECMînsăextinde aplicabilitatea EC și asupra
moleculelor neutre din punct de vedere electroforetic [4,5,14].
Metoda se bazează pe adaosul la soluția tampon a unei faze micelare
“pseudostaționare”, care interacționează cu solutul conform mecanismelor de partiție,
specifice metodelor cromato grafice. În acest sistem, FEOva acționa ca și “faza mobilă”
în cromatografie. Din “punct de vedere cromatografic” profilul de curgere al FEOeste
ideal pentru a minimiza lățireabenzilor de migrare (band broadening) ce po tapărea
în urma procesului de separare [14,15].
“Faza pseudost aționară” este reprezentată de surfactantul ce se adaugă soluți ei
tampon în concentație mai mare decât concentrația micelară critică (CMC) a acesteia.
Adaosul de substanțe tensioactive duce la formarea de micele, agregate sferice
purtătoare de sarcină elec trică,care suferă migrarea eletroforetică ca și oricare altă
specie încărcată electric. Micelele sunt formate din lanțuri ale căror extremități
hidrofobe sunt întoarse spre interior, iar extremitățile care conțin păr țile hidrofile
încărcate electric sunt orientate înspre exterior. Formarea micelelor este un proces
dinamic, ele dezagregându -se și refăcându -se continuu, alcătuind astfel o fază
„pseudostaționară”, care înglobează analiții, antrenându -le în migrarea lor
electroforetică [14,15].
În ECM separare a se bazează pe reparti ția analitului între faza micelară și faza
apoasă.Când un analit neutru este introdus în soluția micelară, o parte din el este
încorporat în micele și migrează cu viteza acestora, iar fracțiunea rămasă liberă a
analitului migrează c u viteza FEO. Viteza de migrare a analitului depinde de
coeficientul de distribuție dintre faza micelară și cea non -micelară (apoasă). Cu cât
procentul de analit încorporat în micele este mai mare, cu atât analitul va migra mai
încet[14,15].
Cea mai utilizatăsubstanță tensioactivă în ECMeste lauril sulfatul de sodiu
(dodecil sulfat de sodiu -DSS). Micelele anionice de DSS sunt atrase electrostatic către

12| Hancu Gabriel
anod, dar datorită vitezei superioare a FEO, vor migra cu viteză scăzută spre catod în
direcția detec torului[14].
În consecință, micelele scad selectiv vitezele de migrare a analiților neionici cu
care interacționează, care altfel ar migra cu aceeași viteză cu a FEO. În funcție de
echilibrul de partiție individual ce se stabilește între analiți idin mice lă și soluția
tampon apoasă, se poate observa scăderea vitezelor de migrare a analiților,
obținându -se astfel separarea lor în capilar. Schema separ ării prin EC Meste
prezentată în figura 1.6 [16].
Figura 1.6. Schema separării în ECM
Moleculele mai pola re vor migra mai rapid decât compușii mai puțin polari și
hidrofobi, iar toate moleculele neutre vor migra în fereastra de migrare dintre viteza
de migrare a FEO și v iteza de migrare a micelelor [15].
Ordinea de migrare la utilizarea micelelor formate cu D SS ar fi anioni urmați de
moleculele neutre și de cationi. Anionii vor rămâne în mare măsură în soluția apoasă
datorită respingererii electrostatice de către micele. Cu cât încărcătura electrică a
acestora este mai ridicată cu atât viteza de migrare va fi mai mare. Moleculele neutre
vor fi separate pe baza hidrofobicității acestora. Cationii vor migra ultimii datorită
atracției electrostatice fa ță de micele. Ordinea de migrare poate fi însă modificată de
mobilitățile electr oforetice proprii ale analițilo r[16]
Electroforeza capilară pe gel (ECG) implică imobilizarea în gel a solu ției de
electroliți, în tubul capilar. Un astfel de suport poate fi utilizat la “separări prin

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 13
cernerea analiților” în funcție de masa lor moleculară, proces ce poate fi asemuit cu o
“filtrare electroforetică selectivă și fracționată”. Pe geluri ,fenomenele de difuzie sunt
limitate, iar FEOeste neînsemnat, deoarece gelul aderă la pereții capilarei de silice.
Există două clase fundamentale de geluri care pot fi utilizate în ECG: chimi ceși fizice.
Gelurile fizice se obțin din structuri poroase prin prinderea de polimeri și sunt destul
de robuste la schimbările de tampon. Gelurile chimice folosesc legături covalente
pentru a forma structura poroasă, sunt mai puțin robuste fiinddificilăschimbarea
tampoanele care rulează odată ce gelurile sunt formate. Utilitatea ECG s -a dovedit
remarcabilă, în cazul separării acizilor nucleici și a proteinelor [17].
Electroforeza capilară prin focalizare isoelectrică implică separarea
moleculelor prinaplicarea unui câmp electric î ntr-un sistem de tampon complex; se
formeazăun gradient de pH între cei doi electrozi, analiții focusându -se unde pH -ul
local este egal cu punctul lor isoelectric. În ECprin focalizare isoelectrică compuși
zwitterionici sunt adăugați soluției tampon din capilar. Capătul anodic al capilarului se
introduce într -o soluție acidă, în timp ce capătul catodic se imersează într -o soluție
alcalină. La aplicarea tensiunii, moleculele vor migra în interiorul capilarului până ce
ating punctul lor isoelectric, unde se opresc, generând un gradient de pH în interiorul
capilarului. După focalizare, benzile imobilizate sunt deplasate către detector prin
metode hidrodinamice, adăugând clorură de sodiu într -unul din rezervoare, care va
modifica gradientul de pH, cauzând migrarea zonelor separate [18].
Electrocromatografia capilară este o tehnică de EC relativ nouă în care
capilarul este umplut cu o fază sta ționară utilizată în determinările prin HPLC.
Capilarul este umplut cu solu ția de electroli tși la aplicarea unui voltaj se generează
FEOcare va pompa solu ția de electrolit prin coloană. Analiții se separă be baza
interacțiunilor cu faza cromatografică din capilar și de asemenea pe baza mobilităților
electroforetice. Sub influen țavoltajului ap licatse realizeaz ăscurgerea sist emului
tamponcătrecapătul catodic al capilarului ,separarea realizându -sedatoritămigrării
eletroforetice în cazulparticulelor încărcateși a proceselor de adsorb ție/distribuț ie
pentruparticulele neutre. În esență această tehnică este o combina ție între EC și
HPLC, oferind practic o n ouă dimensiune tehnicilor de EC [19].
Electroforeza capilară chirală este o tehnică electroforetică utilizată pentru
separarea enantiomerilor un orsubstanțe optic active. Se utilizează deo bicei o tehnică

14| Hancu Gabriel
directă de separare prin dizolvarea unui selector chiral în solu ția de electrolit. În EC
chirală se pot utiliza un număr relativ mare de selectori chirali: ciclodextrine,
antibiotice macrociclice, eteri de coroană, proteine; dar cei mai uti lizați selectori
chirali în EC sunt ciclodextrinele. Pentru a separa doi enantiomeri trebuie ca, ori
enantiomerii ori selectorul chiral să fie încărca ți electric; iarenantiomerii trebuie să
prezinte afinită ți diferite pentru selectorul chiral ceea ce gene rează viteze de migrare
diferite ale complec șilor analit -selector chiral. Deși prin mecanisme diferite, în funcție
de selectorul chiral utilizat, separarea va rezulta din interacțiunile stereospecifice a
moleculelor selectoare, care prezintă afinitate dife rită față de cei doi enantiomeri,
apărând astfel diferențe între vitezele de migrare a acestora sub influența unui câmp
electric[20].
Unul dintre marile avantaje ale EC îl reprezintă flexibilitatea, practic toate aceste
tehnici electroforetice enumerate m ai sus pot fi aplicate pe acela și sistem de EC
schimbând doar condi țiileanalitice și parametri electr oforetici.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 15
2. Electroforeza capilară în analiza substan țelor de interes
farmaceutic
Cea mai utilizată metodăîn analiza substan țelor de interes farmace utic este fără
îndoială, HPLC, dar EC și-a câștigat în ultimii ani un loc binemeritat în cercetarea
farmaceutică , fiind considerată o metodă alternativă și complementară pentru HPLC .
Aplicațiile EC în analiza substanțelor de interes farmaceutic vizează analiza
tuturor aspectelor legate de dezvoltarea medicamentului și de controlul calității
acestuia inclusiv determinarea con ținutului unui ingredient farmaceutic; analiza
impurităților înrudite chimic, anali ze chirale; determinarea parametrilor fizico –
chimici, cum ar fi valorile pKa, lipofilitatea (valorile log P) sau îndeterminări
farmacocinetice [4].
Majoritatea substan țelor medicamentoase sunt compuși având caracter acid
și/sau bazic ,solubile în apă . CZE se bazează pe exploatarea diferen țelor dintre
mobilitățile electroforetice ale analiților, care sunt strâns legate de sarcina și mărimea
moleculelor în cauză. De exemplu, o substan ță medicamentoasă având caracter acid
poate fi determinat ăîn forma sa anionică la un pH bazic iar o substan ță
medicamentoasă a vând caracter bazicpoatefideterminat ăla unpHacidîn forma sa
cationică. Medicamentele zwitterionice (cele care con țin atât grupe acide cât și grupe
bazice) pot fi analizate pe un interval larg de pH, putând fi determinate atât în mediu
bazic cât și acid. Medicamentele neutre din punct de vedere electroforetic pot fi
rezolvate prin adaosul un orsubstanțe tensioactive, aplicând tehnicaECM[6].
Determinarea impurită ților înrudite chimic este unul din principalele utilizări
ale EC în analiza farmaceutică modernă, provocarea reprezentând -o obținerea unor
selectivită ți și sensibilități cât mai ridicate. Analiza unor substanțe avândcaracteristici
structurale și fizico-chimice extrem de asemănătoare reprezintă o provocare deoarece
acestea vor genera comporta mente electroforetice asemănătoare ale anali ților.
Impurită țile pot fi calculate și raportate ca % din aria totală a peakului. Aceasta
presupune un factor de răspuns egal pentru toate impurită țile cunoscute și
necunoscute. În mod alternativ, dacă sunt disp onibile, se pot utiliza standarde de

16| Hancu Gabriel
impurități. Acești factori de răspuns sunt apoi utilizați pentru a calcula nivelele de
impurități în%(m/m)[7,8].
Aplicarea unor diferite tehnici de EC permit determinarea substan țelor înrudite
chimic cu nivel ede sensibilitate capabile dea detecta concentra ții de 0,1% sau chiar
maijoase. Tehnicile de preconcentrare, în special procedurile avansate de “stacking” ,
contribuie la ob ținerea unor sensibilități mai mari pentru substanțele înrudite chimic.
Capacitatea EC de a rezolva un număr ridicat de substan țe cu proprietăți structurale și
fizico-chimie dife rite, inclusiv aspeciilorionizate și neionizate,demonstrează
selectivitatea ridicată a metodei analitice [7,8].
EC se utilizează cu succes și la determinarea cantit ativă a substan țelor
farmaceutice din diverse forme farmaceutice. Ca și în cazul HPLC, soluțiile de probă
sunt analizate în raport cu standarde de concentra ție cunoscută . Dacă se utilizează un
standard intern pentrucreșterea preciziei, atuncipot fi luate în calcul rapoartele ariile
peakurilor solu țiilor probă și ale standard ului inter n[8].
Testarea purită ții substanței este de obicei necesară pentru medicamentele cu
stabilitate redusă, în timp ce determinarea substan țelor înrudite chimic este esențială
pentru a se asigura că precursorii sau reactivii din sinteză nu depă șesc limitele admise
[8].
Dar probabil cele mai bune rezultate au fost ob ținuteîn analiza substan țelor
chiraleprin EC,însepararea chirală a enantiomerilor. Utilizarea EC pentru analize
specifice, cum ar fi analiza chirală, poate avea beneficii în ceea ce prive ște robustețea
metodei, costurile și timpul de analiză .În separările substan țelor chirale, EC este
considerată ca metodă de primă alegere nu numai datorită eficacită ții sale excele nte
de separare, dar și a flexibilității în alegerea selectorului chiral adecvat și a costurilor
reduse prin compara ție cu HPLC. Nivelul de dete cție de 0,1% pentru impuritățile
enantiomerice, poate fi atinsprin metode deEC, chiardacă în unele cazuri este
necesară utilizarea unor tehnici de concentrare a probelor [20].
Metodele deECși-au dovedit utilitatea și în testarea purită ții chirale ,care este la
ora actuală o necesitate în cercetarea substan țelor farmaceutice optic active utilizate
sub formă de e nantiomer optic pur [20].
EC este, de asemenea, aplicabilă pentru determinarea parametrilor fizico –
chimici ai medicamentelor, inclusiv legarea de proteine ,valorilor log Psau a valorilor

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 17
pKa.Constantele de disociere ( pKa) ale produselor farmaceutice pot fi determinate pe
baza timpilor de migrare ob ținuți în diferite soluții de electroliți pe un anumit interval
de valori de pH. Mobilitatea anili ților la fiecare valoare de pH se poate calcula luând în
calcul timpul de migrare șiFEO(folosind un marker neut rupentru FEO, cum
dimetilsulfoxidul). Valoarea pKaa unui compus se calculează utilizând mobilită țile
electroforetice ale analiților la diferite valori de pH. Tehnicile de EC care utilizează
introducerea unor faze “pseudostationare ”în soluția de electrol it,și anume ECM,
permit măsurarea valorilor log P pe bazapartiției analiților între faza apoasă și faza
micelară [21].
Aplicabilitatea EC în analiza substan țelor medicamentoase este mult lărgită prin
utilizarea tehnicilor de EC în mediu neapos; acestea p oate oferi avantaje în ceea ce
privește manipularea selectivității separării și creșterea solubilității compușilor
hidrofobi [22,23].
Diferitele tehnici de EC, au devenit deja recunoscute pentru aplicabilitatea lor nu
numai în determinarea produselor farma ceutice, ci și pentru analizaprodusele
biofarmaceutice. Provocările legate de sensibilitate ascăzută sau de precizie (prin
compara ție cu metodele HPLC) , în special în cazul determinărilor biofarmaceutice, pot
fi evitate, prin aplicarea unor strategii conc rete de dezvoltare, optimizare și validare a
metodelor electroforetice.

18| Hancu Gabriel
3. Chiralitatea substan țelor medicamentoase
Chiralitatea este o proprietate de asimetrie care ne guvernează existen ța.
Termenul provine din cuvântul grec “kheir”,adicămână,dat fiind că mâinile umane
sunt cel mai comun și mai simplu exemplu de “obiecte”chirale.Chiralitatea este
importantă în multe ramuri ale științei, cum ar fi în matematica , fizica, biologiași
bineînțelesînchimia.
Un obiect chiral nu este super -impozabil cu i maginea sa din oglindă; obiectul
chiralși imaginea sa în oglindă se numesc enantiomorf i(“enantios”–contrar,
„morphe”–formă).
Este un lucru cunoscut faptul că în natură toate moleculele biologic active sun
homochirale, și aș exemplifica aici că toți a minoacizii sunt levogiri și toate zaharurile
sunt dextrogire [24].
Dar dacă în chimie putem vorbi oarecum non șalant despre enantiomeri optic
puriși amestecuri racemice, totul se schimbă în momentul când vorbim despre
substanțe chirale de interes farmaceut ic. Astfel este cunoscut și demonstrat faptul că
efectul farmacologic urmărit este în general limitat doar la unul dintre enantiomeri,
numit eutomer, în timp ce celălalt enantiomer, numit distomer poate fi inactiv, mai
puțin activ sau în unele cazuri chiar poate fi responsabil pentru efectele adverse
[25,26].
Corpul uman este alcătuit din elemente chirale, putând fi considerat cel mai
mareși complex selector chiral, ceea ce poate explica răspunsul diferit al acestuia la
acțiunea enantiomerilor. Cel mai cun oscut exemplu de substan ță chirală ce a creat
“probleme” la administrare ,este cel al talidomidei, substan ță sedato -hipnotică
administrată la începutul anilor 1960 pentru prevenirea gre țurilor matinale la
gravide. Dar administrarea talidomidei în prim ul semestrude sarcină a împiedicat
dezvoltarea adecvată a fătului, ducând la malforma ții congenitale îngrozitoare la mii
de copii din întreaga lume. De ce ? Talidomida este o substan ță optic activă, având un
atom de carbon asimetric, iar medicamentul s -a utilizat în terapie evident sub formă
de amestec racemic, darulterior s -a demonstrat că în timp R -talidomida este

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 19
responsabilă pentru efectul sedato -hipnotic, S -talidomida este responsabilă pentru
efectul teratogen [27].
Aproape 50% din moleculele organice uti lizate în terapie sunt chirale posedând
cel puțin un centru de asimetrie în structură, dar majoritatea sunt comercializate ca
amestecuri racemice și doar aproximativ 25% dintre acestea ca enantiomeri puri.
Multe medicamente chirale sunt încă utilizate clin icsub forma unui amestec de
stereoizomeri, de și s-a stabilit că efectele farmacologice, toxicitatea și farmacocinetica
enantiomerilor este diferită. De ce nu se folosesc mai des în terapie enantiomeri puri ?
Dezvoltarea de metode de sinteză enantioselecti ve este o sarcină dificilă, elaborarea
unor metode de separare chirală este un proces laborio s, iar prețul enantiomerilor
puri este unulridicat.Totuși în ultimii 25 ani se observă o tendință crescută privind
introducerea în terapie a enantiomerilor optic puri, fapt demonstrat de numărul
relativ mare substan țe enantiopure oficinal eîn EurPh 9[2].
Izomerii sunt analițicu aceeași structură moleculară, dar cu proprietăți diferite,
dar în timp ce izomerii constitu ționali diferă prin secvența de legare a atom ilor,
stereoizomerii au aceea și constituție, dar au configurație spațială diferită. Între
stereoizomeri, putem distinge enantiomerii (izomeri cu aceea și structură chimică și
proprietă țile fizico -chimice) și diasteromeri (izomeri cu aceeași structură chimic ă, dar
cu proprietă ți fizice și reactivitate chimică diferite).
Nomenclatura unui enantiomer poate fi stabilită luând în considerare direc ția în
care acesta rote ște planul luminii polarizate. Dacă enantiomerul rotește lumina în
sensul acelor de ceasornic ( când lumina se deplasează înspre privitor), acel
enantiomer este etichetat drept dextrogir (+) ,iar dacă rote ște lumina în sens invers
acelor de ceasornic acesta este etichetat levogir ( -). Această nomenclatură însădescrie
purși simplu o proprietate opticăa substan țelor și nu configurația l or. Sistemul R/ S
este ceamaiutilizată nomenclatură pentru d iferențiereaenantiomerilor. Acesta
“etichetează ”fiecare centru chiral cuR sau S, conform unui sistem prin care fiec ărui
substituent al centrului de chiral itate iseatribuieun ordin de prioritate, conform
regulilor de prioritate Cahn -Ingold-Prelog (CIP), pe baza numărului atomic .Regula CIP
implicăstabilirea sensului descrescător de prioritate a substituen ților centrului de
chiralitate; se prive ște formul a de configura ție perspectivică astfel încât ligandul cu
cea mai mică prioritate să fie situat cât mai departe de privitor și se stabilește

20| Hancu Gabriel
succesiunea descrescătoare a priorită ții celorlalți trei liganzi. Dacă aceasta este în
sensul rotirii acelor de ceas ornic, avem o configura ție R (rectus) iar dacă ordinea este
în sens invers rotirii acelor de ceasornic, avem o configura ție S (sinister) [28].
Practic există o diferen ță bine stabilită între configurație și conformație.
Configuratia R nu înseamnă că acel e nantiomer este dextrogir; a șa cum configurația S
nu înseamnă ca acel enantiomer este levogir (sau invers). Nomenclatura
dextrogir/levogir se referă doar la activitatea optică a unui enantiomer și nu la
configura ția lui. Rși S sunt niște descriptori stereo chimici și caracterizează
configura ția relativă a unui enantiomer față de altul în scopul de a -i diferenția formal.
IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry ) recomandă utilizarea
nomenclaturii R/S pentru diferen țierea enantiomerilor. Configurația absolută a unui
enantiomer se stabile ște însă doar prin metode ce permit vizualizarea efectivă a
configura ției acestuia (ex: Difractometrie RX) [29].
Diastereomerii sunt stereoizomerii cu doi sau mai mul ți centrii de chiralitate și
au proprietă ți fiziceși chimice diferite . Pentru a distinge diastereomerii se utilizează
două prefixe treo și eritro, izomerul eritro având doi substituenți identici pe aceeași
parte iar izomerul treo substituen ții identici de o parte și alta a ax ei moleculei .
Diastereom erii sunt stereoizomeri care nu sunt imagini în oglindă și nu se pot
suprapune peste celălalt.
De ce răspunsul farmacologic prezintă variabilitate atunci când administrăm un
amestec racemic sau un enantiomer pur ?
Enantiomerii au proprietă ți farmacocinetic eși farmacologice diferite iarcorpul
uman este un mediu chiral (fiind construit din structuri chirale: proteine, aminoacizi,
enzime, fosfolipide). Activitatea farmacologică a medicamentelor depinde în principal
deinteracțiunea lor cu diferite ținte, cum ar fi proteinele (receptori, enzime), acizi i
nucleici (ADN și ARN) și biomembrane le(fosfolipide și glicolipide) [24].Într-un mediu
achiral, enantiomerii auproprietă ți fizice și chimice identice, dar într -un mediu chiral
enantiomerii cu diferite proprie tăți farmacologice și farmacocinetice pot acționa ca
medicamente diferite. Astfel, atunci când administrăm un amestec racemic, corpul
uman fiind un mediu chiral, percep ecei doi enantiomeri ca două entită ți
farmacologice diferite. De asemenea receptorii pe care acționează enantiomerii sunt
elemente chirale, interacțiunea cu enantiomerii este stereoselectivă și decurge după

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 21
un mecanism tip “lacăt–cheie”.Interacțiunea unui medicament chiral cu receptorul
specific determină un profil farmacologic diferit în trucât receptorul recunoaște doar
un singur enantiomer ,S sau R[25].
Legareaenantiomerilor de receptori este prezentată schematic în figura 3.1 . Se
poate observa că pentru ca medicamentul să fie activ farmacologic secvențetele din
structura acestuia nota te cu A, B, C, trebuie să interacționeze cu regiunile
corespunzătoare de pe situsul de legare chiral –a, b, c.
Figura 3.1 . Legarea de receptori a enantiomerilor
Enantiomerul activ are o conformație tridimensională, ce îi permite orientarea
favorabilă a stfel încâ t secvențete A, B, C să interac ționeze cu regiunile a, b, c din situsul
de legare; deși enantiomerul inactiv posedă aceleași secvențe structurale nu poate
adopta o structură tridimensională care să -i permită plierea pe regiunile specifice din
situsul de legare și ca urmare este lipsit de efecte lebiologice urmărite [26].

22| Hancu Gabriel
Tabel 3.1. Exemple de substan țe chirale din diferite clase terapeutice
Clasa terapeutică Exemple
AINS Ibuprofen, Ketoprofen, Fenprofen,
Naproxen, Ketorolac
Anticoagulante oral e Warfarina, Acenocumarol
Antihistaminice H1 Clorfeniramina, Cetirizina
Beta-blocante Propranolol, Atenolol, Metoprolol,
Timolol, Carvedilol, Sotalol, Labetalol
Benzodiazepine Oxazepam, Lorazepam, Clorazepat
Blocanți ai canalelor de calciu Verapamil, D iltiazem, Amlodipina,
Felodipina, Nitredipina, Nicardipina
Inhibitori selectivi ai recaptării
serotoninei/noradrenalineiFluoxetina, Citalopram, Sertralina,
Paroxetina, Venlafaxina, Duloxetina
Inhibitorii pompei de protoni Omeprazol, Pantoprazol, Lansopr azol,
Rabeprazol
IECA Captopril, Enalapril, Perindopril,
Benazepril
Tabel 3.2. Exemple de substan țe chirale utilizate în terapie cașienantiomer ioptic
puri
Enantiomer optic pur Utilizare terapeutică
Escitalopram (S -citalopram) antidepresiv -ISRS
S-duloxetina antidepresiv -ISRSN
Paroxetin a(trans(-) 3,S,4R) antidepresiv –ISRS
Sertralina(cis(+) 1S,4S) antidepresiv -ISRS
S-naproxen AINS
Dexketoprofen AINS
Diltiazem ( cis (+)2S,3S ) blocant al canalelor de calciu
Levocetirizina antihistaminic H1
Levodopa antiparkinsonian
S-timolol β-blocant
R-tamsulosin α-blocant
S-clopidogrel antiagregant plachetar
Esomeprazol IPP
Levofloxacina fluorochinolonă
D-penicilamina agent chelator (Boala Wilson)
Ciclofosfamida anticanceros

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 23
Tabel 3.3. Exemple de substan țe chirale în care unul dint re enantiomeri prezintă
efectul terapeutic urmărit în timp ce celălalt este responsabil pentru efectele adverse
Substanță optic activă Eutomer Distomer
Talidomida R-talidomida
antiemeticS-talidomida
teratogen
Ketamina S-ketamina
anestezic generalR-ketamina
halucinogen
Etambutol (S,S)(+)-etambutol
tuberculostaticR,R)(-)-etambutol
toxic (orbire)
Naproxen S-naproxen
AINSR-naproxen
toxicitate hepatică
DOPA Levodopa
antiparkinsonianDextrodopa
agranulocitoză
Penicilamina S-penicilamina
agent chelatorR-penicilamina
neurotoxic
Tabel 3.4. Exemple de substan țe chirale în care enantiomerii prezintă efecte
terapeutice diferite
Substanță optic activă Enantiomer (+) Enantiomer ( -)
Sotalol blocant al canalelor de K β-blocant
Venlafaxina ISRSN ISRS
Propoxifen analgezic antitusiv
Albuterol efect proinflamator bronhodilatator
Potențialele avantaje ale utilizării în terapie a enantiomerilor puri sunt legate
de: eliminarea efectelor secundare nedorite de care esteresponsabil distomerul ,
scăderea dozelor admi nistrate, un profil farmacodinamic mai simplu și mai selectiv,
un profil farmacocinetic mai predictibil, reducerea interac țiunilor medicamentoase,
reducerea încărcăturii metabolice asupra sistemului enzimatic, poten țial terapeutic
îmbunătă țit și o relație mai puțin complexă între concentrația plasmatică și efectul
farmacologic urmărit [25,26].
În ultimii 25 ani pe lângă introducerea în terapie a unor enantiomeri puri, o
serie de amestecuri racemice "vechi" au fost reevaluate pentr u a fi înlocuite cu
enantiomeripuri. Astfel a devenit tot mai proeminent procesul de “chiral switch”,
acestafiindun termen ce se referă la înlocuirea unui medicament chiral utilizat sub
formă de amestec racemic cu enantiomerul optic pur al acestuia. Fenomenul de “chiral
switch” a dus la prezen ța pe piața farmaceutică de substan țe farmaceutice disponibile

24| Hancu Gabriel
în același timp atât sub formă de enantiomer pur, cât și ca amestecuri racemice. Acest
proceseste adeseori legat de expirarea patentului pe amestecul racemic, șia dusla
acuzații de“evergreening” între producătorii de originale și generice [30].
Tabel 3.5. Exemple de substan țe chirale ce au suferit procesul de “chiral switch”
Amestec racemic Enantiomer pur Avantaje
Ketoprofen Dexketoprofen scăderea dozelor
efecte adverse gastr o-
intestinale mai reduse
Omeprazol Esomeprazol scăderea ratei metabolice,
clearencului plasmatic,
creșterea biodisponibilității
Citalopram Escitalopram scăderea dozelor
reducerea inciden ței
efectelor adverse
creșterea profilului de
tolerabilitate
Cetirizina Levocetirizina scăderea dozelor
Potențiale beneficii ale procesului de “chiral switch” sunt în legătură cu: un
indice terapeutic îmbunătă țit prin creșterea selectivității și potenței față de receptori ,
reducerea efectelor adverse, scăderea variabili tății inter-individuale a răspunsului
terapeutic , scăderea dozelor administrate , îmbunătă țirea profilului farmacocinetic,
scăderea interac țiunilor medicamentoase [30].
Un aspect important care trebuie luat în calcul la administrarea unei substan țe
optic active, este și posibilul metabolism stereoselectiv al acesteia, mai pe scurt
inversia chirală. Aceasta poate fi: unidirec țională sau bidirecțională [31].
Inversia unidirecționalămediată enzimatic fost descrisă laAINS-urile din grupa
derivaților acidului a ril-propionic (ibuprofen, ketoprofen); la ace ști compuși numai
enantiomerul S este activ, având efect antiinflamator și analgezic; dar î n organism,
enantiomerul R inactiv poate suferi o inversare chirală sub influen ța enzimelor
hepatice în enantiomerul S a ctiv. Acest proces este unidirec țional, doar enantimerul
mai puțin activ fiind transformat în enantiomerul mai actv, și nu invers [32].
Inversia chiral ă bidirec țională se referă la transformarea in vivo a
enantiomerului pur administrat într -un amestec race mic. Această transformare a fost
observată în cazul talidomidei. Concluzia ar fi că în anii 1960 chiar dacă s -ar fi

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 25
administrat eutomerul R -talidomidă, acesta ar fi suferit o inversie chirală
biderecțională și în organism s -ar fi regăsit atât R -talidomidă câtși distomerul S –
talidomidă [33].
Procesele de absorb ție, distribuție, metabolizare și eliminare sunt factori
decisivi ai ac țiunii medicamentului. Prin urmare, potențialul de discriminare chirală
între enantiomeri în fiecare dintre aceste etape este imp ortantși subliniază
necesitatea studiilor stereo -farmacocinetice și a determinărilor cantitative
stereospecifice [ 34].
Dar avantajele utilizării medicamentelor enantiopure în compara ție cu
amestecurile racemice trebuie judecate de la caz la caz, acest nef iind un percept
universal valabil . Cert este că fiecare enantiomer al unui medicament chiral poate avea
propriul profil farmacologic particular și o formulare enantiopură a unui medicament
poate avea proprietă ți diferite față de formularea racemică a acelu iași medicament.
În ansamblu, obiectivul final al profesioni știlor din domeniul sănătății ar trebui
să fie ob ținerea de medicamente de calitate superioară (amestecuri racemice,
enantiomeri optic puri) pentru a face terapia medicamentoasă mai eficace, mai
specificăși mai sigură.

26| Hancu Gabriel
4. Metode de separare chirală a substan țelor medicamentoase
Separarea chirală, denumită și rezoluție chirală este o procedură utilizată în
analiza stereoselectivă a substan țelor medicamentoase optic active pentru
discriminarea en antiomerilor unui amestec racemic.
Analiza chirală se realizează în general prin metode fizice, incluzând aici
cromatografia lichidă de înaltă performan ță (HPLC), cromatografia de gaze (GC),
cromatografia cu fluide supercritice (SFC) și electroforeza capil ară (EC)[24,25].
În timpul sintezelor chimice multe medicamente ob ținute pot fi racemizate in
situprintr-o varietate de reac ții chimice, chiar dacă procedura de obținereutilizează
cași reactivi enantiomeri puri. Pentru a rezolva o asemenea problemă tehnica clasică
vizeazărezoluția chirală prin formarea de diasteromeri. În această strategie, este
implicată o reac ție acido-bazică între amestecul racemicși un enantiomer opticpur.
Această reac ție conduce la formarea a două săruri diastero merice care au p roprietăți
fizico-chimice diferite. Ace ști doi diastereomeri obținuți pot fi separați fie prin
cristalizare, fie prin filtrare dacă unul este solubil, iar celălalt este insolubil. În cele din
urmă, sarea este descompusă prin t ratarecuunacid sau obază,obținându-seastfel
enantiomerul pur . Cei doi diastereomeri forma ți pot fi de asemenea separați prin
cromatografie de lichide achirală clasică [35].
O metodă mai modernă ar viza utilizare a unei metode de HPLC peparativ; HPLC
chiralădovedindu -sea fi una d intre cele mai bune metode pentru separarea
enantiomerilor și analiza purității enantiomerice a acestora . În metodele HPLC chirale ,
seutilizează două tehnici: in directăși directă . HPLC indirectă implică derivatizarea
probelor cu un reactiv de derivatizar e chiral, adică cuun enantiomer pur, având ca
rezultat formarea a doi diaster omeri care pot fi separa ți pe o coloană clasică pe fază
inversă. Această metodă HPLC indirectă este rar utilizată în industrie, dar este
frecvent aplicată înbionaliză datorită s ensibilită ții sale ridicate. Tehnica indirectă
necesită prezen ța unui grup funcțional în s tructura analitului (amină, hidroxil,
carboxil, carbonil, tiol) care să poată fi derivatizată . Un reactiv de derivatizare chiral
(un enantiomer opticpur)esteadăugat în probă ,iaracestava reacționa cu aceste
funcții pentru a forma doi diaster omeri care pot fi separa țiulterior pe o coloană

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 27
clasicăpefază inversă (C18 sau C8) .Metoda indirectă prezintă avantajul utilizării
unor coloane achirale clasice cu preț accesibil,și unei sensibilități și selectivități
extrem de ridicate, respectiv dezavantajul posibilită țiiderivatizării incomplete a
analitului chiral ca rezultat a unor reac ții secundare de descompunere și racemizare.
De asemenea trebuie ca analițiisă posed eanumite grupele func ționale ce urmează să
fie derivatizate, iar reactivii de derivatizare trebuie să aibă o puritate chirală înaltă
[36,37].
Pe de altă parte, HPLC directă utilizează un selector chiralimobilizat în faza
staționarăsauintrodus în faza m obilă.Ultima variantă este rar utilizată datorită
costurilorridicateși eficienței reduse. Separările chirale directe utilizând faze
staționare chirale suntcele preferate în analiza HPLC chirală .La ora actuală există o
multitudine de faze sta ționare ch iraledisponibile în comer ț.În HPLC preparativă se
utilizează faze staționare pe bază de :polizaharide (celuloză, amiloză), poliacrilamidă
saufaze chirobiotice (vancomicină, teicoplanină) .În cea ce prive ște fazele staționare
chirale cele mai utilizate î n bioanaliză acestea pot fi pe bază de: ciclodextrină și
derivați,polizaharide (celuloză, amiloză) , faze Pirkle (de tip “perie”) sau faze
chirobiotice. Cu toate acestea, nu există o fază sta ționară chirală care să aibă
capacitatea de a separa toate clasel e de compu șioptic activi . Alegerea coloanei
potrivite pentru enantiosepararea unui compus racemic este o sarcină dificilă, și se
bazează pe în țelegerea mecanismelor de recunoaștere chiralăa selectorilor chirali de
către enantiomeri. Metoda directă prezin tă dezavantajul faptului că necesită utilizarea
unor coloane chirale costisitoare, dar și avantajul limitelor de detecție ridicate,
acurateții și reproductibilității [36,37].
Determinarea medicamentelor chirale din lichidele biologice estemult mai
dificilde realizat decât cuantificările și separările lor în industrie, deși utilizează
aceleași concepte ale separărilor chirale. Datorită complexității probelor biologice și a
concentra țiilor scăzute de medicamente în ser și urină, determinarea acestor
medicam ente necesită mai întâi o extragere cu randament ridicat din probele
biologice, apoi utilizarea unei tehnici analitice precise și reproductibile cu sensibilitate
ridicată.
În ultimii 20 de ani, EC a devenit o alternativă interesantă pentru metodele
HPLC în analiza chirală a substan țelor de interes farmaceutic. Avantajele utilizării EC

28| Hancu Gabriel
în analiza chirală a substan țelor medicamentoase sunt legate de selectivitatea ridicată
a separării, dezvoltarea rapidă a metodei analitice, consumul scăzut de anali ți, reactivi
și selectori chirali și mai ales de flexibilitatea ridicată în alegerea și schimbarea
selectorului chiral. Metodele de separare prin EC chirale pot fi de două tipuri: directe
și indirecte; exact ca și în tehnica HPLC, dar în cvasimajoritatea cazurilor s e preferă
tehnica directă. Aceasta constă în introducerea selectorului chiral directîn soluția
tampon de electroli ți[38].
EC chirală este o metodă mai versatilă și mai puțin costisitoare decât HPLC,
deoarece HPLC necesită consumul unui volum mare de solv enți organici și coloane
chirale scumpe pentru a acoperi o arie de aplicabilitate rezonabilă, durata de “viață” a
unei coloane cromatografice chirale tinzând să fie relativ scurtă.
În EC se pot utiliza o gamă largă de selectori chirali: ciclodextrine (CD),eteri de
coroană, antibiotice macrociclice (vancomicina, antibiotice polipeptidice, macrolide),
proteine (albumina serică umană), săruri biliare sau complec și metalici
enantioselectivi . Dintre aceste substan țecei mai utiliza țiși mai eficien țiselectori
chiralisunt ciclodextrinele [39].
Pentru a obține rezolu ția chirală, enantiomerii trebuie să intre în contact cu un
mediu chiral și să formeze doi complecși diasteromerici diferiți. Conform regulii lui
Dlagliesh, recunoașterea chirală depinde de existența a cel puțin trei interacțiuni
simultane între selector și molecula chirală și cel puțin una dintre aceste interacțiuni
trebuie să fie stereoselectivă. Deși prin diferite mecanisme în funcție de natura
selectorilor chirali utilizați, separarea chirală va f i rezultatul interacțiunilor specifice a
moleculor selectoare cu afinități diferite față de cei enantiomeri, ducând astfel la
diferențe între vitezele de migrare ale enantiomerilor la aplicarea unei tensiuni [40].
Un avantaj în separările chirale prin EC î l reprezintă faptul că selectorii chirali
utilizați pot avea mobilitate electroforetică proprie, și în consecință pot influența
puternic procesul enantioselectiv.
Selectorii chirali neutrii se pot utiliza pentru separarea chirală a anali ților
ionizați înECZ darși a analiților neutrii în ECM. Când se urmărește analiza unor analiți
având caracter bazic se utilizează o solu ție de electrolit cu un pH acid, analiții se vor
protona și vor migra către catod în timp ce selectorii chirali fără mobilitate
electroforetică proprie vor fi antrena ți de către FEO(cu o magnitudine însă slabăîn

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 29
mediu acid). Enantiomerii mai puternic complexa ți de selectorul chiral vor migra mai
încet în timp ce enantiomerii ce sunt lega ți mai slab de selectorul chiral vor migra mai
repede. Deoarece dimensiunea complexului enantiomer -selector chiral este mai mare
decât a analitului liber, complexul va migra mai încet. Când se urmăre ște analiza unor
analiți având caracter acid se utilizează o soluție de electrolit cu un pH bazi c, analiții
încărcați negativ vor migra către anod dar vor fi transportați către catod de către FEO
(puternic în mediu bazic). Prin urmare, enantiomerii mai puternic complexa ți de
selectorul chiral vor migra mai repede [40].
Selectorii chirali ioniza ți se pot utiliza atât pentru separarea anali ților ionizați
câtși pentru a celorneutrii. Analiza substan țelor bazice utilizând selectori chirali
anionici poate fi realizată într -o soluție de electrolit cu pH acid, unde selectorul chiral
anionic va migra către anod în timp analitul bazic va migra către catod. Selectarea
unui selector chiral cu sarci nă opusă analitului ce urmează a fi separat permite
utilizarea unor concentra ții mici de selector chiral și poate rezulta în eficientizarea
separării. La utilizarea unei concentr ații ridicate de selector chiral sau în cazul legării
puternice a analitului de selector, există posibilitatea ca complexul să nu se deplaseze
către catod ci către anod datorită mobilității electroforetice a selectorului anionic;
pentru a rezolva acest inc ovenient se inversează polaritatea și detecția se facela
capătul anodic al capilarului. În această situa ție enantiomerul mai puternic complexat
va migra primul către detector [40].
La un pH bazic, selectorii ioniza ți se pot utiliza atât pentru separarea a naliților
neutrii cât și a celor bazici. În acest caz analiții bazici vor fi neionizați și se vor deplasa
către catod exact ca și analiții neutrii, selectorul chiral anionic va migra către anod și
va complexa anali ții, prin urmare enantiomerul mai puțin co mplexat de către selector
va migra primul. Analiții anionici vor exercita doar interacțiuni stereoselective slabe
cu selectorii chirali încărca ți negativ datorită respingerii electrice, în timp selectorii
chirali încărca ți pozitiv se pot utiliza pentru sep ararea chirală a anali ților neutrii și
cationici [40].
Cei mai de succes selectori chirali în EC, ciclodextrinele (CD) sunt oligozaharide
cicliceavând o suprafață externă hidrofilă și o cavitate internă hidrofobă în care pot
încorpora diferiți analiți pri n interacțiuni hidrofobe. Mecanismul de incluziune este
steric selectiv, deorece analiții trebuie să încapă în cavitatea CD, diameterul acesteia

30| Hancu Gabriel
depinzând de numărul unităților de glucoză din structura CD (6, 7, 8 pentru ,și
respectiv -CD). Fiecare un itate de D-glucoză din structura CD conține 5 atomi de
carbon chirali, prin urmare și macrociclul CD este unul chiral. Datorită chiralității
grupărilor hidroxil din molecula glucozei care formează marginea cavității CD,
formarea complexului de incluziune v a fi chiral selectivă [41].
Figura 4.1. Structura chimică a CD naturale
Figura 4.2 . Caractere structurale ale CD
Proprietățile fizice ale celor 3 CD naturale diferă, ele deosebindu -se prin:
solubilitate, masă moleculară, diametrul cavității interne e tc. Este de remarcat
solubilitatea în apă inferioară a -CD (1.85g/100 ml apă). [41].
Stabilitatea complexului enantiomer -CD format este influențată de o serie de
parametrii, incluzând aici structura chimică și hidrofobicitatea analitului, tipul și

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 31
concentrația CD, compoziția soluției tampon de electrolit, pH -ul tamponului și
temperatura [41].
CD naturale sunt molecule rigide care oferă posibilități limitate de utilizare în
cea ce privește forma, dimensiunea sau existența unor grupe funcționale. Pentru a
crește solubilitatea în apă, a mări selectivitatea și pentru a extinde domeniul de
aplicabilitate, s -au derivatizat (modificat chimic) diferiți derivați de CD. Majoritatea
CD derivatizate pornesc de la -CD. CD derivatizate pot fi: neutre (metil --CD,
hidroxipropil--CD, hidroxietil --CD),anionice (carboximetil, carboxietil, succinil,
sulfoetil –CD) sau cationice (amino, alchilamino –CD). CD derivatizate prezintă
avantajele: solubilității superioare în apă, hidrofobicității diferite a cavității interne,
posibilității de a forma diferite legături secundare cu analiții care ar îmbunătăți
procesul de complexare și a faptului că CDionizate pot fi folosite în analiza unor
enantiomeri neutrii din punct de vedere electroforetic . Cele mai utilizate CD în
separăril e electroforetice prin EC sunt prezentate în Tabelul 4.1 [42].
Tabel 4.1 CD utilizate ca selectori chirali în EC
Tip CD CD
CD naturale neutre α-CD
β-CD
γ-CD
CD derivatizate neutre Hidroxipropil -α-CD (HP-α-CD)
Hidroxipropil -β-CD (HP-β-CD)
Hidroxip ropil-γ-CD (HP-γ-CD)
Hidroxietil -β-CD(HE-β-CD)
Metil-β-CD(M-β-CD)
Heptakis(di -O-metil)-β-CD(DM-β-CD)
Heptakis(tri -O-metil)-β-CD(TM-β-CD)
CD derivatizate anionice Carboximetil -β-CD (CM-β-CD)
Carboxietil -β-CD (CE-β-CD)
Carboximetietil -β-CD(CME-β-CD)
β-CD-sulfatată (S -β-CD)
Sulfobutileter -β-CD (SBE-β-CD)
Sulfoetileter -β-CD (SEE-β-CD)
CD derivatizate cationice Metilamino -β-CD (MA-β-CD)
Dimetilamino -β-CD (DMA -β-CD)
Din cauza dimensiunii diferite a cavită ții CD utilizate, diferitele tipuri de CD
permit complexarea unor structuri chimice diferite. Anali ții cu o catenă liniară

32| Hancu Gabriel
formează complec șii cei mai stabili cu α-CD, pe când anali ții având în structură una
sau mai multe inele aromatice, formează complec și mai stabili cu β-CD;analiții cu o
structură mai complexă pot fi complexa ți cuγ-CD.Mecanismul de incluziune este
steric selectiv, implicând complexarea par țială sau totală a analitului, prin urmare
acestatrebuie să încapă (fie și parțial), în cavitatea internă a CD. Ținând cont de
structura și dimensiunile substanțelor chirale de interes farmaceutic, se poate observa
că separarea enantiomerilor implică utilizarea în majoritatea cazurilor a -CDși a
derivaților acesteia , cavitatea acesteia fiind în general ideală pentru molecule or ganice
de dimensiune relativ mică utilizate în practicafarmacie [43].
Recunoașterea chirală cu CD implică includerea părții hidrofobe a analitului
chiral în cavitatea internă dar și interacțiuni ale grupărilor hidroxil de pe cavitatea
externă hidrofilă a moleculei cu analitul chiral prin formarea unor legături de
hidrogenrespectiv interac țiuni dipol -dipol[43].
Separarea enantiomeri lorpoate fi ob ținută atunci când stabilitatea complecșilor
enantiomer -CD diferă suficient pentru a asigura o viteză de migra rediferită.Existăun
model teoretic pentru s eparările chirale bazate pe utilizarea CD care corelează
diferențele de mobilitate electroforetică a enantiomerilor cuconcentra ția CD. În
această abordare, s -a demonstrat că pentru complexul CD -analit în propo rție1:1,
diferența de mobilitate prezintă un maxim, iar acest maxim apare atunci când
concentra ția CD este egală cu rădăcina pătrată a constantelor de formare a
complexului de incluziune a fiecărui enantiomer cu CD. Corela ția dintre rezoluția
chiralăși concentrația CD nu este una lineară, o concentrație crescută de selector
chiral nu va asigura întotdeauna o rezolu ție chirală superioară [44].
Gradul de substitu ție a CD derivatizate a fost considerat a fi o mare importanță
pentru separările chirale, dar deo arece, de obicei, CD derivatizate reprezintă
amestecuri de produse care prezintă diferite modele de substitu ție, separările cu CD –
derivatizate sunt de multe ori greu reproductbile [45].
O altă abordare eficientă este introducerea CD într -un tampon micelar cu
dodecil sulfat de sodiu. CD neionizate sunt neutre și hidrofile în consecință vor migra
cu viteza FEO, nefiind încorporate în micele. Când un analit hidrofob este introdus în
acest sistem, acesta va fi încorporat total sau parțial fie în CD fie în micel ă. Viteza de
migrare a complexului format va fi diferit față de cel al moleculei libere, datorită

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 33
mărimii mai mari a complexului . Viteza de migrare a compușilor hidrofobi depinde de
proporția împărțirii analitului între CD și micele. Prin urmare cu cât afi nitatea față de
CD este mai mare, cu atât mobilitatea electroforetică a analitului este mai mică.
Adăugarea de CD la soluția micelară reduce coeficientul de distribuție a analiților în
micele, permițând astfel separarea compușilor puternic hidrofobi, care ar fi
încorporați aproape în totalitate în micele în absența CD. Efectiv, adiția de CD duce la
formarea a două faze „pseudostaționare” în soluția de electrolit, rezultând timpi de
migrare scăzuți și posibilitatea unei separări îmbunătățite [40].

34| Hancu Gabriel
CONTRIBU ȚII PERSONALE

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 35
1. Aplica ții ale EC în analiza chirală a substanțelor
medicamentoase
1.1.Separarea chirală a β-blocantelor prin EC
Din punctul de vedere al chiralită ții,clasaβ-blocantelor esteprobabil cea mai
interesantă clasă de substan țe medicamentoase largutilizate în terapie; ținând cont că
toți compușii din această clasă auîn structură cel pu țin un centru de asimetrie, și că
diferențele între proprietățilefarmacologice și farmacocinetice ale enantiomerilor
sunt dovedite și documentate. Cu toate acestea marea majoritate a β-blocantelor se
utilizează în te rapie cași amestecuri racemice; cu o singură excep ție, timololul, utilizat
în tratamentul glaucomului sub forma enantiomerului pur, S-timolol[46].
La compușii β-blocanți de tip ariloxi propanolamină enantiomerii dextrogiri au o
configurație R, în timp ce enantiomerii levogiri prezintă o configurație S. Enantiomerii
Ssunt în general β-blocanți mai potenți decât enantiomerii R,raportul eudismic
variind de la un compus la altul. O excepți edela această regulă este reprezentată de
sotalol, la care atomul de carbon asimetric este localizat într -ocatenă laterală
etanolaminică; și la care prioritatea celo rsubstituen țilorse schimbă, R-sotalolul
(enantiomerul levogir) fiindun β-blocant mai eficient decât S-sotalolul (enantiomerul
dextrogir) [46,47].
Un caz particular este reprezentat de β -blocantele care prezintă în structură doi
atomi de carbon asimetrici (labetalol, nadolol) , ceea ce duce la existența a patru
stereoizomeri R,R,S,S,R,SșiS,R; în cazul labetalolului izomerul R,Sprezintă activitatea
β-adrenergică cea mai potentă,în timp ce izomerul S,Sprezintă acțiune α-adrenergică
[47].
Separarea chirală a β-blocantelor prin EC utilizând CD ca și selectori chirali a
fost studiată intens în ultimele două decenii. Cu toate acestea, condițiile optime de
separare diferăîn mod semnificativ de la un studiula altul,iarexplicațiile pentru
aceste diferențe nu au fost clar identificate și explicate [48-50].

36| Hancu Gabriel
Pentru a explica interac țiunile chir aleβ-blocant-CD trebuie luate în considerare
trei aspecte majore: rolul structurii chimice analitului, efectul parametrilor
experimentali și structura selectorului chiral [51].
Scopul nostru a fost dezvoltarea unor metode rapide, simple și rapide pentru
separarea chirală a unor β-blocante frecvent utilizate în terapie prin aplicarea unui
screening sistematic a unorCD naturale și derivatizate, neutre și ionizate, și
optimizarea condițiilor analitice pentru a obține o rezoluție chirală îmbunătățită și un
timp de analiză scurt.
Structurile β -blocantelor studiate în cadrul acestui studiu sunt prezentate în
figura 1.1.1 .
Figura 1.1. 1.Structura chimic ă aβ-blocantelor studiate (* marchează centrul chiral)

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 37
Pentru acest studiu am ales 9β-blocante avândcaracteristici structurale
diferite: R,S-atenolol (Ipca Laboratories, India), R,S-bisoprolol fumarat (Moehs
Productos Quimicos, Spania), R,S-carvedilol (Sun Pharmaceutical Industries, India),
R,R,S,S-labetalol clorhidrat (Sicor, Franța), R,S-metoprolol tartrat (E steve Quimica,
Spania), R,S-oxprenolol clorhidrat (Moehs Productos Quimicos, Spania), R,S-pindolol
(Clearsynth Labs Limited, India), R,S-propranolol clorhidrat (Bioeel, România), R,S-
sotalol clorhidrat (Moehs Productos Quimicos, Spania).
Pentru cinci dintr e aceste substanțe am avut la dispoziție și enanti omeri optic
puri:S-atenolol (Ipca Laboratories, India), S-carvedilol (Sun Pharmaceutical
Industries, Mumbai, India), R-propranolol clorhidrat (Moehs Productos Quimicos,
Barcelona, Spania), S-sotalol clorhi drat (Moehs Productos Quimicos, Barcelona,
Spania),S-metoprolol tartrat (Moehs Productos Quimicos, Barcelona, Spania).
Ca și selectori chirali am utilizat următorii derivați de CD : CD naturale neutre ( α-
CD,β-CD,γ-CD), CD derivatizate neutre ( hidroxiprop il-β-CD-HP-β-CD, β-CD metilată
aleator–M-β-CD), CD derivatizate anionice (carboximetil β -CD sare de sodiu –CM-β-
CD, sulfobutil eter -β-CD sare de sodiu –SBE-β-CD). Toate CD au fost achiziționatede
la Cyclolab (Ungaria) cu excepția SBE -β-CD–Capsitol® (Cydex, SUA).
Derivații de CD prezentați în acest studiu au fost utilizați în studii anterior
publicate pentru separarea chirală a unora dintre β-blocantelor selecționate, în
general înstudii individuale, dar studii comparative nu a fost raportate deo camdată.
Separările s -au efectuat pe un sistem de EC, Agilent 1600 CE (Agilent, Germania)
echipat cu un detector DAD. Separările s -au efectuat pe un capilar de siliciu de 48 cm
lungime (40 cm lungime efectivă) x 50 m D.I (Agilent, Germania). Electroferogr amele
au fost înregistare și procesate cu programul Chemstation 7.01 (Agilent, Germania).
Soluțiile stoc s -au preparat prin dizolvarea substanțelor în metanol într -o
concentrație de 100 g mL-1și au fost diluate ulterior cu același solvent până la
concentrațiilecorespunzătoare .În toate determinările s -a utilizat injectarea
hidrodinamică; probele au fost injectate la capătul anodic al capilarului.
Capilarele au fost condi ționate înainte de utilizare cu hidroxid de sodiu 0,1M 30
minute, apă 15 minute și cu soluția tampon de electrolit utilizată pentru determinare

38| Hancu Gabriel
15 minute. Capilarul a fost precondi ționat pentru câ te 1 minut cu hidroxid de sodiu
0,1 M și cu soluția tampon de electrolit înaintea fiecărei determinări.
În analiza preliminară am utilizat următoarelecondiții electroforetice :
concentra ția soluției tampon 25 mM, temperatură 20˚C, voltaj + 25 kV, presiune/timp
de injectare 50 mbar/3 sec unde, concentrația probelor 10 μg mL-1.
Spectrele UV ale analiților au fost înregistrate anterior determinărilor EC;un
maxim specific de absorbție pentru fiecare compus în partea fost ales ca lungime de
undă specifică de detectare; 210 nma fost aleasă ca lungime de undă de control.
Interacțiunile chirale au fost evaluate pe baza f actoruluide separare ( )și
rezoluției chirale (R). a fost calculat ca fiind raportul dintre timpii de migrare a celor
doi izomeri optici, în timp ce Rs-a calculat utilizând ecuația R=2(t 2-t1)/(w1+ w2),
unde timpii de migrare (t 1și t2) și lățimea picurilor (w 1și w2) corespund
enantiomerului ce migrea ză mai rapid respectiv mai lent; o valoare de 1.04 pentru α și
de peste 1.40 for R s-a considerat că reprezent intă valori ce caracterizează separarea
pe linia de bază a celor doi enantiomeri.
Pentru a stabilicondițiile optime separării chirală a β-blocantelor studiate am
efectuat o serie de de experimente preliminare utilizând soluții tampon cu compoziții
diferite la diferite valori de pH: 25 mM acid fosforic (pH –2,5), 25 mM
dihidrogenofosfat monosodic (pH–5,0),25 mM di hidrogenofos fat monosodic –
hidrogenofosfat disodic (1:1) (pH –7,0) și 25mM tetraborat de sodiu (pH –9,3);pH-ul
soluției tampon s-a modificat prin adaosul un ei soluții de NaOH0,1M.β-blocantele
sunt compuși bazici, și în consecință se ionizează la un pH acid. Cele mai bune
rezultate într-un mediu achiral le-am obținut utilizînd un tampon fosfat la un pH de
2.5.
În cadrul analizei preliminare achirale compușii studiați au fost injectați în
absența CD și am calculat mobilitatea electroforetică a acestora. Apoi am ef ectuat
măsurători chiraleutilizând aceeași soluție tampon la care am adăugat o cantitate
corespunzătoare de selector chiral ,pentru a stabiliinfluența acestuia asupra
mobilitățiielectroforetic ea analiților. Concentrații inițiale de 10 mM pentru CD neut re
au fost adăugate soluției tampon, iar pentru CD ionizate am adăugat concentrații mai
scăzute de 5 mM,pentru a limita creșterea curentului ce ar putea duce instabilitatea

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 39
sistemului electroforetic. Dacă la concentrațiile inițiale s -a observat complexare dar
rezoluția chirală a fost necorespunzătoare , am crescut concentrația selectorului chiral
în soluția de electrolit .
Prima cerință pentru un proces de incluziune -complexare este ca analitul să
încapă în cavitatea internă a CD, în consecință alegerea CD o ptimecomplexării este în
strânsă legătură cu forma și dimensiunea analiților.
În mod evident α-CD nu a fost capabilă să complexeze β-blocantel estudiate,
deoarece cavitatea internă a acesteia este prea mică pentru a încorpora anali ții, β-CD a
prezentat re zoluție chirală în cazul carvedilolului și propranololui iar în cazul γ-CD nu
am observat complexarea analiților probabil deoarece dimensiunea moleculelor este
prea micăpentru cavitatea internă a CD.
La utilizarea unei CD derivatizate, recunoașterea chira lă este dependentă de
derivatizarea grupărilor hidroxil de pe inelul CD. Prin derivatizare, hidrofobicitatea și
ionizarea pot fi modificate și acestea pot influența mobilitatea electroforetică și
abilitatea de complexare a analitului.
Utilizarea CD derivat izate acrescut marcat interacțiunile stereoselective CD-
analit;astfel am observat interacțiuni stereoselective pentru șase compuși (atenolol,
carvedilol, labetalol, oxprenolol, propranolol, sotalol) la utilizarea HP -β-CD respectiv
pentru toți cei nouă an aliți (atenolol, bisoprolol, carvedilol, labetalol, metoprolol,
oxprenolol, pindolol, propranolol, sotalol) la utilizarea M -β-CD.
La utilizarea de CD anionice într-unpH puternic acid, nu am reușit detectarea
peakurilor analiților într-un timprezonabil ( 30 minute) ; deoarece FEO slab nu a putut
compensa mobilitatea electroforetică CD ionizate caremigrează în sens opus β-
blocantelor studiate. CD anionice s -au dovedit eficiente pentru separarea β –
blocantelelor doar la un pH depeste 5,0, cele mai bune rezultate obținându -se la pH
7,0. S-au obser vat interacțiuni stereos elective la pH 7, 0la utilizarea CM -β-CDpentru
opt compuși ( atenolol, bisoprolol, carvedilol, metoprolol, oxprenolol, pindolol,
propranolol, sotalol) , respectiv la utilizarea SBE -β-CDpentru ș ase compuși
(bisoprolol, carvedilol, labetalol, metoprolol, oxprenolol, sotalol ).Diferențeledintre
rezultatele obținute la utilizarea unor CD neutre respectiv ionizate poate fi explicat
prin interacțiunile ionice dintre grupările încărcate negativ ale CD anionice și
gruparea aminică protonată a β-blocantelor.

40| Hancu Gabriel
Stereoselectivitatea separării este i nfluențată de anumiți parametri
experimentali, cum ar fi tipul și concentrația CD, concentrația și pH -ul soluției de
elecrolit, temperatura, voltajul aplicat, lun gimea capilarului sau adaosul de aditivi în
soluția tampon. Pentru optimizarea procesului electroforetic, s -a studiat influen ța
fiecăruia dintre ace ști parame trii asupra rezolu ției chirale.
Rezoluția chirală este puternic influențată de compoziția soluției de electrolit, și
prin urmare selectarea unei soluții tampon adecvate, concentrația și pH -ul acesteia
trebuie atent luate în considerare. Scăderea tăriei ionice a soluției de electrolit duce în
general la scăderea timpilor de migrare și a rezoluției chira le, datorată probabil
fenomenului de dispersie, în timp ce creșterea concentrației soluției tampon duce la
creșterea timpilor de migrare a analiților; limita superioară a acesteia fiind dictată de
creșterea curentului și de efectul Joule care poate reduce eficiența separării. Rezoluția
chirală a crescut în general cu creșterea concentrației CD până la atingerea
concentrației optime de CD, iar apoi a scăzut gradat. Scăderea temperaturii cauzează o
scădere a vâscozității tamponului, care duce la creșteratimpilor de migrare; la
creșterea temperaturii rezoluția chiral ăa scăzut, probabil datorită interacțiunilor
limitate analit -CD.
Tipul și concentrația CD, pH -ul soluției tampon și temperatura sistemului au
avut o influență puternică asupra eficienței separării chirale. Modificările de
concentrație ale CD și de pH a soluției tampon au avut însă un efect neuniform asupra
rezoluției chiraleaβ-blocantelor.
Rezultate obținute la utilizarea condițiilor electroforetice optimizate sunt
sumarizate în tabelul 1.1.1.
Separarea stereoizomerilor labetalolului nu a fost rezolvată în condițiile
studiate, cei patru izomeri optici migrând în două zone distincte, obținându -se două
picuri cu arii aproximativ egale.
Este interesant de observat faptul că β-blocantele cu proprietă ți structurale
comune (ex: metoprolol –bisoprolol) au prezentat interacțiuni stereoselective
aproape similare.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 41
Tabel 1 .1.1.Separarea electroforetic ă a enantiomerilor β-blocantelor studiate
utilizând CD ca și selectori chirali
Nr
.β-blocant pHConcentra ția CD [mM] t1(min) t2(min) Rsα
1.Atenolol 2.5 20 mM HP -β-CD 9.9 10.2 0.881.03
2.5 20 mM M -β-CD 10.8 11.3 1.041.04
7.0 10 mM CM -β-CD 11.2 11.4 0.901.01
2.Bisoprolol 2.5 40 mMM-β-CD 16 16.3 0.841.01
7.0 10 mM CM -β-CD 16.5 16.8 1.101.01
7.0 5 mM SBE -β-CD 17.5 17.9 1.251.02
3Carvedilol 2.5 10 mM β -CD 11 11.6 2.741.05
2.5 20 mM HP -β-CD 12.9 13.5 2.541.04
2.5 30 mMM-β-CD 15.3 15.9 1.981.04
7.0 10 mM CM -β-CD 13.8 14.2 1.351.02
7.0 5 mM SBE -β-CD 13.2 13.6 1.481.03
4Labetalol 2.5 20 mM HP -β-CD 13.2 13.7 1.271.03
2.5 30 mMM-β-CD 15.9 16.4 1.481.03
7.0 5 mM SBE -β-CD 16.4 16.8 1.201.02
5Metoprolol 2.5 40 mMM-β-CD 15.4 15.9 1.081.03
7.0 10 mM CM -β-CD 17.8 18.1 1.081.01
7.0 5 mM SBE -β-CD 18.2 18.6 1.281.02
6Oxprenolol 2.5 20 mM HP -β-CD 11 11.5 1.771.04
2.5 20 mMM-β-CD 10 10.4 1.141.04
7.0 10 mM CM -β-CD 11.4 11.8 1.251.03
7.0 5 mM SBE -β-CD 12.8 13.2 1.351.03
7Pindolol 2.5 20 mM RAMEB 10.6 111.021.03
7.0 10 mM CM -β-CD 10.6 10.9 0.881.02
8Propranolol 2.5 10 mM β -CD 9.4 9.8 1.131.04
2.5 10 mM HP -β-CD 11 11.5 1.461.04
2.5 20 mMM-β-CD 13 13.4 1.211.03
7.0 10 mM CM -β-CD 16.1 16.7 1.531.03
9.Sotalol 2.5 20 mM HP -β-CD 9.3 9.7 0.931.04
2.5 30 mM M -β-CD 9.1 9.6 1.521.05
7.0 10 mM CM -β-CD 12.4 12.9 1.481.04
7.0 5 mM SBE -β-CD 12.1 12.5 1.451.03
Ordinea de migrare a celor doi enantiomeri a fost determinată prin metoda
adaosului respectiv prin injec tarea enanantiomerului optic pur și urmărirea timpului
de migrare al acestuia utilizând condițiile analitice optimizate ( tabel 1.1.2 ).Ordinea
de migrare a enantiomerilor pentru un anumit derivat a fost aceeași cu toate CD cu
care acesta a avut interacțiuni chirale în condițiile optimizate.

42| Hancu Gabriel
Tabel1.1.2.Ordinea de migrare a enantiomerilor β -blocantelor studiate în condițiile
optimizate
Nr. β-blocant Enantiomer 1 Enantiomer 2
1 Atenolol S(-)-atenolol R(+)-atenolol
2Carvedilol R(+)-carvedilol S(-)-carvedilol
3Metoprolol S(-)-metoprolol R(+)-metoprolol
4Propranolol S(-)-propranolol R(+)-propranolol
5 Sotalol R(-)-sotalol S(+)-sotalol
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Muntean DL. Hancu G. (autor corespondent) Kelemen H. Rusu A. Ciurba A.,
Cyclodextrine screening for the chira l separation of beta -blockers derivatives. Revista de
Chimie, 2015, 66(7): 1019 -1023,articol indexat ISI, FI: 0,956[52].
În continuare am efectuat studii mai complexe privind rezolu ția chirală a
carvedilolului și sotalolului; cele două substanțe au fost alese pe baza proprietă ților
structural eșistereoselective particulare și a influenței acestora asupra acțiunii
farmacologice.
Carvedilolul (1-(4-carbazoliloxi) -3-(2-(2-metoxi) etil -amino)-2-propanol ) este
unβ-blocantlipofilneselectiv având și acțiune α-adrenolitică. Carvedilol uleste utilizat
în tratamentul hipertensiunii arteriale și anginei pectorale, dar și în tratamentul
insuficien ței cardiace simptomatice. Utilizarea carvedilolului în insuficiența cardiacă
congestivă poate fi explicată datorită c ombinării rezisten ței vasculare scăzute
(antagonismul α -adrenergic) și lipsei tahicardie ireflexe(antagonismul β -adrenergic)
[53].
Cașitoate celelalte β-blocante utilizate în practica farmaceutică , carvedilolul
conține un atom de carb on asimetric în cat ena laterală, care duce la existen ța a doi
enantiomeri ,R-carvedilol șiS-carvedilol (figura 1.1.2).
Figura 1. 1.2. Structura chimică a carvedilolului (* marchează centrul chiral)

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 43
Carvedilolul este utilizat în terap ie cași amestec racemic, dar S(-)-carvedilolul
este unβ-blocantmai puternic (de 200 de ori mai potent) decât R(+)-carvedilolul, în
timp ce ambii enantiomeri s -au dovedit a fi la fel de eficien ți ca șiα-blocanți. Mai mult,
concentra țiile plasmatice ale celor doi enantiomeri diferă semnificativ la
administrarea amestecului racemic, concentra țiileenantiomerului R(+)fiind mai mari
decât cele ale enantiomerului S(-)[53].
Metabolizarea carvedilolului este, de asemenea, stereoselectivă, ducând la
biodisponibilită ți diferite ale enantiomerilor ,deaproximativ 15% pentru S(-)-
carvedilol și aproximativ 31% pentru R(+)-carvedilol; în timp ce timpul de
înjumătă țire pentru R(+)-carvedilol variază între la 5-9 ore, comparativ cu 7 -11 ore
pentruS (-)-carvedilol [54].
Separarea chirală a enantiomerilor car vedilolului utilizând EC a fost publicată
anterior utilizând HP-β-CD cași selector chiral [55]. Un studiu comparativ al separ ării
enantiomerilor carvedilolului prin EC respectiv HPLC reliefează avantajele utilizării
EC legate de dezvoltarea rapidă a metod ei, consumul uiscăzut de analit și selector
chiral, timpul uide analiză scurtdarși dezavantajele legate de detectabilitatea și
reproductibilitatea mai scăzută decât în metodele HPLC [56].
Prin compara ție cu alte β-blocante care prezint ăvaloripKaîn jurul valorii de 9 –
9,5, carvedilolul are o valoare pKade 7,97; explica ția acestei discrepanțe fiind atribuită
în special efectului inductiv al atomului de oxigen din pozi țiaβ, care scade bazicitatea
grupării amino. Pentru o substan ță având caracter bazic cumestecarvedilolul,
mobilitatea sa electroforetică nu diferă semnificativ pe un interval de pH între 2 și 5,
interval pe care efectul FEO este unul pu țin semnificativ. Timpul de migrare a
carvedilolului a crescut u șor atunci când pH -ul tamponului a fost modificatde la 2 la 5
și a scăzut pe măsură ce pH -ula fost modificat de la 5 la 7. Cele mai bune rezultate s -au
obținut la utilizarea unui tampon fosfat de25 mM la un pH de 2,5. La acest pH
puternic acid , efectul FEO este minim, iar analitul va migra datorită propriei mobilități
electroforetic e.
Am efectutat un screening complex deCD, naturale și derivatizate, neutre și
ionizate, pentru stabilirea selectorului chiral optim .Screeningul selectorilor chirali a
arătatinteracțiuni chirale ale carvedilolului cuβ-CD,HP-β-CDșiM-β-CDla un pH acid .
Dacă s-a observat complexarea analitului , pentru îmbunătă țirea rezoluției chirale , am

44| Hancu Gabriel
crescut concentra ția selectorului chiral (5 -40 mM) până la obșinerea unei rezoluții
chiralesatisfăcătoare. La utilizarea β-CDcași selector chiral, concentrația maximă
utilizatăa fost de 20 mM, datorită solubilită ții modeste a acesteiCD înapă.
Utilizarea unei CD ionizate (SBE -β-CD) la un pH 2,5 a dus la timpi de migrare
lungi (peste 25de minute), șidoarla o mică splitare a peakului analitului. La acest pH,
SBE-β-CD este încărcat ănegativ în timp ce carvedilolul este încărcat pozitiv, în
consecință, SBE-β-CD se deplasează spre anod în timp ce carvedilol ulspre catod. Dar,
utilizarea unei solu ții tampon fosfat cu un pH de 7 ,0șia5 mM SBE -β-CD cașiselector
chiral a condus la separarea chirală a celor doi enantiomeri și la un timp de analiză
rapid (5 minute), cei doi enantiomeri migrând mai repede decât FEO ; cu toate acestea
la utilizarea CD ionizate nu am reu șit să obținem o separare completă pe linia de bază
aenantiomerilor .
S-a urmărit influen ța concentrației soluției tampon, pH -ului solu ției tampon,
concentra ției selectorului chiral, voltajului, temperaturii și parametrilor de injectare
asupra rezolu ției chirale utilizân d tehnica “one factor at time”, variind c âte un
parametru pe rândîn timp ce ceilal ți au fost menținuți constanți.
Tabelul 1. 1.3rezumă condi țiile experimentale (concentrația și tipul
selectorului chiral, pH, tensiune, temperatură) și rezultatele (timpii d e migrare ai
enantiomerilor separa ți, factorul de separare , rezoluția) obținute pentru CD care au
prezentat interac țiuni chirale cu enantiomerii carvedilolului.
Tabel 1. 1.3Separarea prin EC a enantiomerilor carvedilolului utilizând diver și
derivați de CDca selectori chirali
CD pHVoltaj
(kV)Temperatura
(0C)t1
(min)t2
(min)Rs
10 mM β -CD2.520 15 11 11.5 1.042.46
20 mM HP -β-CD2.520 15 12.9 13.5 1.042.74
30 mMM-β-CD2.520 15 15.4 15.9 1.031.98
5 mM SBE -β-CD720 15 5.5 5.71.030.83
Cea mai bună separare a enantiomerilor carvedilolului s -a obținut la utilizarea
următoarelor condi țiiexperimentale : tampon 25 mM fosfat, pH 2,5, selector chiral 10
mM β-CD,voltaj+ 20 kV, temperatura 150C, presiune/timp de injectare 50 mbar/1
secundă, detecție UV 242nm(figura 1.1.3 ). De asemenea, HP -β-CD (20 mM) (figura

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 45
1.1.4)sau RAMEB (30 mM) pot fi utilizate cu succes ca șiselectori chirali în
enantiosepararea carvedilolului, cu rezolu ții chirale bune, dar cu timpi de migrare mai
lungi decât în cazul β-CD.
Ordinea de migrare a celor doi enantiomeri a fost determinată prin injectarea
unei solu ții a racematului îmbogățit cu enantiomerul pur (metoda adaosului) ; ordinea
de migrare a fost R(+)-carvedilol urmat de S(-)-carvedilol .
Figura 1. 1.3.Separarea chir ală a carvedilolului prin EC utilizând β-CD cași selector
chiral (condi ții electroforetice: 25 mM fosfat, pH 2,5, 10 mMβ-CD,+ 20 kV, 150C, 50
mbar/1 sec undă, UV 240 nm, 10 µg/mL)
Figura 1. 1.4.Separarea chirală a carvedilolului prin EC utilizând HP -β-CD cași
selector chiral (condi ții electroforetice: 25 mM fosfat, pH 2,5, 20 mM HP -β-CD,+ 20 kV,
150C, 50 mbar/1 sec, UV 240 nm, 10 µg/mL)
Enantiomerul pur al unui alt β-blocant, S -propranolol a fost utilizat ca standard
intern (IS); timpul său de migrar e fiind mai scurtdecât cel al R(+)-carvedilolului ,

46| Hancu Gabriel
enantiomerul cu timp de migrare mai scăzut . Cuantificarea a fost realizată pe baza
raportului între aria peakului enantiomerului carvedilolului și aria peakului IS.
Performan țele analitice ale metodei au fost verificate în ceea ce prive ște
reproductibilitatea, precizia ,linearitatea și s-au calculat limitele de detec ție(LOD)și
limitele de cuantificare (LOQ)ale enantiomerilor. LOD au fost de 1,13 și 1,18μg mL-1,
iar LOQ au fost de 3,43 și 3,57μg mL-1pentruR(+)-carvedilol respectiv S(-)-carvedilol.
Metoda a fost aplicată pentru determinarea enantiomerilor carvedilolului din
forme farmaceutice tipizate, tablete de Carvedilol (Sandoz, România) con ținând 25 mg
de substan ță activă. Peakurile obținute din f orma farmaceutică au fost similare cu cele
obținute din soluțiile standard și nu a uexistat interferen țevizibiledin partea
excipienților.
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Hancu G. Cârje A. Iuga I. F ülöp I. Sza bó Z.Cyclodextrine screening for the chiral
separation of carvedilol by capillary electrophoresis . Iranian Journal of Pharmaceutical
Research, 2015, 14(2):425-433,articol indexat ISI ,FI: 1,352 [57].
Sotalolul (N–4-[1-hidroxi-2-[(1-metil-etil)-amino]-etil]-metan-sulfonamid a)
esteeste un β -blocant hidrofil utilizatca un antiaritmic de clasa a III -a (deși are și
efecte care pot fi legate de antiaritmicele de clasa a II -a, cum sunt încadrate de obicei
alteβ-blocantele) [58].
Sotalolul este un derivat de fenil -etanol-amină care areîn structură un atom de
carbom asimetric, ceea ce duce la existen ța a doi enantiomeri, S-sotalolșiR-sotalol
(figura 1.1.5).
R(-)-sotalolul prezintă atât efect β-blocant(agent antiaritmic clasa II), cât și de
blocare a canalelor de potasiu (agent antiari tmic de clasa III), în timp ce enantiomerul
S(+)-sotalol este un blocant al canalelor de potasiu ,afinitatea sa fa ță dereceptorii β-
adrenergici fiind de 30 -60 de ori mai scăzută decât aR(-)-sotalolului. Ac țiuneaS(+)-
sotalolului este asociată cu încetini rea ritmului cardiac sinusal, iaracțiuneaR(-)-
sotalolului prin efectul său de blocare a receptorilor βcontribuie la scăderea ritmului
cardiac [59].

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 47
Figura 1. 1.5. Structura chimică a sotalolului (* marchează centrul chiral)
Sotalolul este utilizat în t ratamentul aritmiilor ventriculare și supraventriculare;
dar datorită efectelor sale paradoxale proaritmice, aceasta se administrează numai în
aritmii severe care pun în pericol via ța pacientului [58].
La începtul anilor 2000 a fost publicat studiu lclinicSWORD ( Survival with oral
d-sotalol) care a investigat ac țiunea terapeutică aS(+)-sotalolului, cu rezultate
surprinzătoare, deoarece administrarea de S(+)-sotalol a dus la creșterea mortalității
cu 65% la pacien ții cuantecedente de infarct miocardic; ac centuând u-se astfel și mai
mult poten țialul pericol care ar putea fi generat de administrarea distomerului unui β-
blocant. Luând în considerare aceste aspecte, se presupune că administrarea R(-)-
sotalolului ar putea fi mai eficientă în prevenirea decesului după infarct miocardic
decâtadministrarea amestecul uiracemic, care con ține în procent de 50% un
medicament cu potențial dăunător demonstrat, și anume S(+)-sotalolul [60].
Sotalolul are două valori pKa, unul (pKa-8,3) corespunzător substituentului
sulfonamidic, în timp ce celălalt ( pKa-9,8) corespunde grupării aminice; prin urmare
va fi ionizat într -un mediu acid .După cum era de a șteptat,cele mai bune rezultate s-au
obținut la utilizarea unuitampon fosfat de 25 mM la un pH de 2,5.
Pentru determinar ea selectorului chiral optim a m efectutat un screening
complex al CD, naturale și derivatizate, neutre și ionizate. S-au observat interac țiuni
chirale cu HP -β-CDși M-β-CD;darcele mai promi țătoare rezultate le-am obținutla
utilizarea M -β-CD.
Cele două C D (M-β-CDși HP-β-CD), care au prezentat interac țiuni chirale cu
enantiomeri sotalolului, sunt CD derivatizate; au avantajul unei solubilită ți bune în

48| Hancu Gabriel
soluția tampon apoasăși a unei selectivită ți mai ridicate prin comparație cu β-CD
naturală.
Creșterea co ncentrațieiM-β-CDa condus la o cre ștere a rezoluției chirale și, de
asemenea, a timpilor de migrare ai enantiomerilor; o concentra ție de 30 mM M-β-CD
ducând la separarea pe linia de bază a celor doi enantiomeri. Concentra ția optimă a
selectorului chiral depinde de afinitatea stereoizomerilor fa ță de selectorul chiral. La o
concentra ție scăzută de CD, nu este posibilă separarea enantiomerilor deoarece nu
există o cantitate suficientă de selector chiral disponibil pentru a forma un complex
stabilcu analitu l, în timp ce la o concentra țieprearidicată de CD, enantiomerii pot fi
complet complexa ți. Prin urmare, este esențial să se determine concentrația optimă de
CD pentru a ob ține cea mai bunărezoluție chirală.
S-a urmărit influen ța concentrației soluției t ampon, pH -ului solu ției tampon,
concentra ției selectorului chiral, voltajului, temperaturii și parametrilor de injectare
asupra rezolu ției chirale utilizând tehnica “one factor at time”, variind c âte un
parametru în timp ce ceilal ți au fost menținuți const anți.
Tabelul 1. 1.4.rezumă condi țiile de separare optimizate (concentrația și tipul
selectorului chiral, pH, tensiune, temperatură) și rezultatele (timpii de migrare ai
enantiomerilor, factorul de separare, rezolu ția).
Tabel 1.1.4.Separarea prin EC a ena ntiomerilor sotalolului utilizând diver și derivați
de CD ca selectori chirali
CD pHVoltaj
(kV)Temperatura
(0C)t1(min) t2(min) R
30 mM RAMEB 2.525 15 9.1 9.5 1.041.40
20 mM HP -β-CD2.525 15 9.3 9.6 1.030.73
Cea mai bună separare a enantiomerilo rsotalolului s-a obținut la utilizarea
următoarelor condi ții optimizate: tampon 25 mM fosfat, pH 2,5, selector chiral 30 mM
M-β-CD,voltaj+ 25kV,temperatura 150C, presiune/timp de injectare 50 mbar/2
secunde, detecție UV 232 nm (figura 1.1.6 ).

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 49
Figura1.1.6.Separarea chirală a sotalolului prin EC utilizând M -β-CD cași selector
chiral (condi ții electroforetice: 25 mM fosfat, pH 2,5, 30 mM M -β-CD,+ 25 kV,150C, 50
mbar/2 sec, UV 232 nm, 10 µgmL-1)
Figura 1. 1.7.Separarea chirală a sotalolului pri n EC utilizând HP -β-CD cași selector
chiral (condi ții electroforetice: 25 mM fosfat, pH 2,5, 20 mM HP -β-CD,+ 25 kV, 150C,
50 mbar/2 sec, UV 232 nm, 10 µgmL-1)
Performan țele analitice ale metodei elaborate au fost evaluate în ceea ce
privește precizia intra-day, precizia inter -day, linearitatea și s-au calculat LODșiLOQ
ale enantiomerilor. LOD au fost de 1,13 și 1,25μg mL-1, iar LOQ au fost de 3,45 și 3,75
μg mL-1pentruR-sotalol respectiv S-sotalol.
Metoda optimizată a fost aplicată pentru determin area enantiomerilor
sotalolului din tablete de Darob (Knoll Pharmaceuticals, Germania) con ținând 80 mg
clorhidrat de sotalol.

50| Hancu Gabriel
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Hancu G . Sămărghițan C. Rusu A. Mircia E. Sotalol c hiral separation by capillary
electrophoresis . Journal of Chilean Chemical Society 2014, 59(3): 2559 -2562,articol
indexat ISI, FI: 0.469 [ 61].
Numărul ridicat de publicații care abordează caracteristicile stereoselective a
substanțelor medicamentoase chi rale incluzând aici și β-blocantele demonstrează din
ce în ce mai mult că stereoselectivatea în activiatea farmacologică a acestor compuși
este mai de grabă o regulă decât o excepție. D ezvoltarea de noi metode analitice
enantioselective, de tehnici de enant ioseparare preparativă și sinteză stereoselectivă,
stau labaza dezvoltării de substanțe medicamentoase enantipure .
Avantajele utilizării EC în separări chirale sunt legate de cantitatea scăzută de
solvenți și selectori chirali consumați, ceea ce permite s chimbarea rapidă a
selectorului și a soluției de elecrolit în timpul screeningului pentru alegerea
selectorului chiral potrivit și a condițiilor electroforetice. EC oferă flexibiliate
deosebită în separările chirale, necesitând doar adăugarea selectorului chiral la soluția
de electrolit; CD și derivații acestora reprezentând de departe cei mai utilizați
selectori chirali.
Studiul a fost finațat printr -un grant intern individual de cercetare al UMF Tîrgu
Mureș“Screening sistematic al unor selectori chirali în vederea utilizării
acestora la separarea enantiomerilor unor substanțe de interes farmaceutic
prin metoda electroforezei capilare” (director proiect: Hancu Gabriel) ( contract de
finanțare nr.22/11.12.2013)

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 51
1.2. Separarea chirală a antihistaminicelor H 1prin EC
Antihistaminicele H1 sunt medicamente de sinteză, care prin blocarea
competitivă și reversibilă areceptorilor histaminergici H1 protejează organismul față
de acțiunea histaminei. Se administrează în tratamentul unor manifestări alergice;
precumrinita alergică, conjunctivita alergică sau urticaria ,efectul lor preventiv fiind
mai intens decât cel curativ [62].
Pe baza parametri lorfarmacocinetici și farmacodinamici, antihistaminicele H1
pot fi clasificate în două grupe: antihistaminice de primă generație (antihistaminice
clasice-sedative)și de a doua generație ( antihistaminice moderne -non-sedative).
Prima genera ție de antihistaminice H1, datorită caracterulu i lipofil și amasei
moleculare scăzute, traversează rapid bariera hemato -encefalică, acționând și asupra
receptorilor H1 centrali ;în plus, ele au un efect antimuscarinic slab, provocând sedare
semnificativă . A doua genera ție de antihistaminice H1 prezintă o structură moleculară
mai hidrofil ăși afinități mai sla be pentru receptorii musca rinici, penetrând mult mai
puțin bariera hemato -encefalică ,și nu prezintă efect sedativ semnificativ [63].
Pe baza structurii lor chimice, antihistaminicele H1 sunt clasificate în șaseclase
chimice: alchilamine, etanolamine, etilendiamine, fenotiazine, p iperazine și piperidine.
Unii dintre acești compuși prezintă un atom de carbon asimetric, iar în unele cazuri în
afară de racemat, eutomerul este de asemenea înregistrat și utilizat în terapie
(dexclorfen iramina, dexbromfeniramina, levocetirizina )[63].
CDsuntselectorii chirali utiliza ți cel mai frecvent în CE pentru rezoluția chirală
a antihistaminelor H1; astfel rezolu ția chirală a clorfeniraminei a fost rezolvată prin
ECZși ECM utilizând β-CD ca selector chiral, și uree ca ad itiv al solu ției tampon [6 4],
rezoluția chirală a bromfeniraminei a fost realizată prin ECZ utilizând β-CDși TM-β-
CD cașiselectori chirali [65]; enantiomerii clorfeniraminei și bromfeniraminei au fost
separațiși prin utilizarea uneiCD ionizate, CE -β-CD [66]iarenantiomerii cetirizinei
au fost separa ți prin utilizarea , unel alte CD ionizate, S-β-CD [67].
Metodele analitice pentru separarea chirală a antihistaminelor H1 au fost
dezvoltate în general pentru rezolu ția chirală individual ă afiecăruicompus; această
abordare fiin d aleasă probabil, deoarece antihistaminicele H1 nu sunt utilizate în

52| Hancu Gabriel
terapieîn combina ții. Cu toate acestea, dezvoltarea unei proceduri analitice simpleși
rapide care poate fi utilizată pentru determinarea chiralăsimultană a mai multor
antihistaminice H1, fără a fi necesară elaborarea un ormetode separate pentru fiecare
analit, ar putea fi o variantă interesantă și utilă.
În acest studiu am ales 4 antihistaminice H1 larg utilizate în terapie având
caracteristici structurale diferite: bromfeniramina (3-(4-bromfenil) -N,N-dimetil-3-
piridin-2-propan-1-amină) (BPA), clorfeniramina (3-(4-clorfenil) -N,N-dimetil-3-
piridin-2-propan-1-amină) (CPA),prometazina (N,N-dimetil-1-fenotiazin -10-propan-
2-amină) (PMZ) șicetirizina (acid-2-[4-(4-clorbenzhidril) -1-piperazinil]-etoxiacetic)
(CTZ)(figura1.2.1).
Figura1.2.1.Structura chimică antihistaminicelor H1 studiate ( *marchează centrul
chiral)
Deoarece anali ții selectați sunt din clase eterogene din punct de vedere
structural: deriva ți de alchilamină (bromfenirami na, clorfeniramina), deriva ți de
fenotiazină (prometazina) și derivați de piperazină (cetirizina), obținerea unei
rezoluții chirale simultane prin utilizarea unui sistem dual de ciclodextrine devine o
variantă viabilă [68].
Scopul acestui studiu a fost de a efectua un screening eficient al CD ca și selectori
chiraliși de determina influența parametrilor electroforetici asupra rezoluției chirale,
pentru a optimiza ulterior un sistem dual CD aplicabil în separarea chirală simultană a
substanțelor selecționat e.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 53
Am autilizat următorii anali ți de calitate farmaceutică: clorhidrat de
prometazină, diclorhidrat de cetirizină, diclorhidrat de levocetirizină (Orex Pvt Ltd,
India), maleat de bromfeniramină (Nivedita Chemicals Pvt. Ltd, India) maleat de
clorfeniramină (Caesar & Lorentz Gmbh, Germania), maleat de dexbromfeniramină,
maleat de dexclorfeniramină (Keshava Organics Pvt. Ltd, India). Ca și selectori chirali
am utilizat următorii derivați de CD : CD naturale neutre ( α-CD,β-CD,γ-CD), CD
derivatizate neutre ( hidroxipropil -β-CD-HP-β-CD, β-CD metilată aleator –M-β-CD),
CD derivatizate anionice (carboximetil β -CD sare de sodiu –CM-β-CD, sulfobutil eter –
β-CD sare de sodiu –SBE-β-CD). Toate CD au fost achiziționatede la Cyclolab
(Budapesta, Ungaria) cu excepția SBE-β-CD–Capsitol® (Cydex, SUA).
Toate experimentele s -au efectuat pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD. Separările s -au efectuat pe un capilar de silice
cu o lungime totală de 48 cm (lungime efectivă de 40 cm), av ând un diametru interior
de 50µm (Agilent, Germania). Electroferograme le au fost înregistrate și procesate cu
software -ul Chemstation 7.01 (Agilent, Germania).
Capilarul a fost condi ționat prin spălare cu NaOH 0,1 M timp de 30 minute, cu
apă ultrapură tim p de 10 minute și cu soluția tampon timp de 10 minute. Înainte de
fiecare determinare, capilarul a fost precondi ționat timp de 3minute cu NaOH 0,1 M, 2
minuteapă ultrapură și 2 minute cu soluția tampon.
S-au preparat solu ții stocîn metanol conținând 1 m g mL-1din fiecare analit ,
acestea au fost diluateînainte de utilizare la 100 μg mL-1cu apă.S-a utilizat o injectare
hidrodinamică la capătul anodic al capilarului, detectarea având loc la catod .
Detectarea a fost efectuată la 214 nm, anali ții au fost i dentificați pe baza spectrelor în
UV;datorită spectrelor foarte asemănătoare ale CPA și BPA, pentru a diferenția
compușii am utilizat metoda adaosului.
Pentru a evalua comportamentul electroforetic al anali ților într -un sistem
achiral, am utilizat o tehni că de ECZ și trei sisteme tampon (tampon fosfat pH 3,0,
tampon fosfat pH 7,0, tampon borat pH 9,0) ,concentra ție a soluți ilortampona fostde
25 mM. Ordinea de migrare a fost acela și în toate cele trei sisteme tampon: BPA și CPA
au migrat primele fără a f i separate pe linia de bază , urmate de PMZ și CTZ. Cei doi
derivați de feniramină au valori ale pKaaproape identice (BPA-pKa= 9,10, CP A-pKa=
9,20)și o structură foarte asemănătoare, care diferă doar prin natura atomului de

54| Hancu Gabriel
halogende la nivelul ine luluiaromatic, ceea ce explică comportamentul electroforetic
similar. PMZ ( pKa= 9.10) are o valoare pKaasemănătoare cu cea a deriva ților de
feniramină, rezultând un profil de ionizare aproape similar, dar datorită prezen ței
inelelor condensate , are o st ructurămaivoluminoasă, ceea ce îi conferă o mobilitate
electroforetică mai scăzută. CTZ are trei func ții ionizabile, o grupare bazic ă(pKa1=
8,17)șidouăgrupăriacide(pKa2= 2,10; pKa3= 3,01) în consecin ță va exista
predominant sub formă de zwitterionși poate fi ionizatănegativ sau pozitiv în func ție
de pH-ul soluției tampon. Datorită caracterului predominant zwitterionic, CTZ a
migrat ultim aîn toate situa țiile studiate. Dacă luăm în considerare valorile pKași
caracteristicile structurale ale com pușilor studiați, putem afirma că toate aceste
substanțe vor fi ionizate în mediu acid, prin urmare , o soluție tampon cu un pH acid ar
trebui să fie adecvată pentru determinarea lor.
În continuare am adăugat în solu ția de electrolit selectorul chiral, concentrații
de 10 mM pentru CD neutre, în timp ce pentru CD ionizate am adăugat o concentra ție
de 3 mM. Pentru evaluarea performan ței separării s -au calculat valorile R s, conform
ecuației: R s= 2 (t2-t1)/(w1+ w2); unde se iau în calcul timpii de migra ție (t1și t2)și
lățimilela bazăpicurilor (w 1și w2) pentru cei doi enantiomeri.
Într-unpH acid, la utilizarea deCD neutre ( β-CD, HP-β-CD,γ-CD), s-auobținut
rezultate aproape similare în cazul CPA și BPA,la care s-a observat oușoarăsplitare a
picurilor, în timp ce PMZ a prezentat interac țiuni chirale cu β-șiγ-CD. După cum era
de așteptat, datorită dimensiunii reduse a cavități, α-CD nu a prezentat interac țiuni
chiralecu anali ții studiați. De obicei, CD anionice prezintă o capacitate
enantioselectiv ă mai ridicată decât CD neutre, deoarece ele pot ac ționa atât ca și
selector chiral, cât și ca purtător (“carrier”) al complexului de incluziune. SBE -β-CD,
care este încărcat negativ pe intervalul de pH studiat și are o mobilitate în
contracurent cu anali ții, aprezentat interacțiuni crescute cu antihistaminicele
încărcate pozitiv, ceea ce a dus la o cre ștere a timpului de analiză. SBE -β-CD a
prezenta tinteracțiuni chirale cu CTZ și PMZ; enantiomerii PMZ fiind separați cu o
valoareaRsde 1,28.
La un pH ne utru, BPA, CPA și PMZ sunt complet ionizate; rezoluția chirală a
crescut pentru BPA și CPAla utilizarea de CD neutre ( β-CD, HP-β-CD,γ-CD, M-β-CD),
iar pentru PMZ am eviden țiat interac țiuni chirale numai cu SBE -β-CD.La pH 7,0 , CTZ

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 55
este în forma zwiterio nicăși se comportă ca un compus neionizat , prin urmare, nu
poate fi rezolvate la utilizarea de CD neutre și prezintă rezoluție chirală numai la
utilizarea de CD ionizate .
La un pH bazic, valorile R sau prezentat o u șoară scădere față de valorile
obținutela pH neutru; atât BPA și PMZ au prezentat interacțiun ichiralecu toate CD
studiate, în timp ce în cazul enantiomerilor CTZ nu s -auobservat interac țiuni chirale
cu nici unul dintre selectorii chirali analiza ți
Rezultatele analizelor electroforetice chira le preliminare sunt prezentate în
tabelul1.2.1.
Tabel1.2.1.ValorileRsobținutela utilizarea CD ca selectori chirali la diferite valori de
pH în determinarea chirală a antihistaminicelor H1
pH 3 CPA BPA PMZ CTZ
α-CD – – – –
β-CD < 0.20 0.21 0.45 –
γ-CD 0.20 < 0.20 0.62 –
HP-β-CD < 0.20 < 0.20 – –
M-β-CD < 0.20 – – –
SBE-β-CD – – 1.28 < 0.20
CM-β-CD – – – –
pH 7 CPA BPA PMZ CTZ
α-CD – – – –
β-CD 0.91 1.31 – –
γ-CD 1.30 1.00 – –
HP-β-CD 1.29 1.00 – –
M-β-CD 0.48 0.42 – –
SBE-β-CD – – 0.81 1.41
CM-β-CD – – – –
pH 9 CPA BPA PMZ CTZ
α-CD – – – –
β-CD 1.11 1.47 0.51 –
γ-CD 0.44 < 0.20 0.59 –
HP-β-CD 0.39 < 0.20 0.33 –
M-β-CD 0.37 0.33 0.42 –
SBE-β-CD – 0.57 0.21 –
CM-β-CD 0.42 0.61 0.31 –
Înconcluzie, în condi țiile electroforetice utilizate, în cazul CPA și BPA am
evidențat interacțiuni chirale cu CD neutre,cele mai ridicate valori ale Rs obținându-
se cu β-CD,la un pH alcalin, 1,11 respectiv 1,47; în timp ce pentruPMZși CTZ cele mai

56| Hancu Gabriel
ridicate valori ale Rs 1,28 la un pH acid șirespectiv 1,41la un pH neutru s-au obținut
la utilizarea ca selector chiral alSBE-β-CD.
Deși separarea chirală poate fi îmbunătățită prin creșterea concentrației de CD
și/sau optimizarea compozi ției soluției tampon, scopul urmărit a fost acela de a
identifica selectorii chirali cei mai potrivi ți pentru dezvoltarea unui sistem dualdeCD
(un amestec CD neutră +CD ionizată ). Aplicarea unui astfel de sistem compensează
adeseori lipsa unui design experimental și permite o mai mare flexibilitate în
dezvoltarea metodei analitice . Atunci când se utilizează un sistem dual deCD,
mobilitatea electroforetică proprie a analitilor, interac țiunile lor cu CD neutr ășiCD
ionizată respectiv FEO vor contribui la viteza de migrare diferen țiată a
enantiomerilor . SBE-β-CD afost ales ca component aionică a sistemului , deoarece a
fost singurul selector care a prezentat interacțiuni stereoselective față de CTZ, în timp
ce β-CD, HP-β-CD,M-β-CDșiγ-CD au fost investigate fiecarecașicomponentă neutră
a sistemului .Amadăgato concentra ție de 3 mM SBE -β-CDși 10 mM pentru CD neutre ,
rezultatele fiind sumarizate în tabelul 1.2.2 .
Tabel1.2.2.Valorile R sobținute la utilizarea unor sistemele duale deCDutilizând un
tampon fosfat pH 7,0
CD-1
(3 mM)CD-2
(10 mM)Rs
CTZ CPA BPA PMZ
SBE-β-CDβ-CD 0.73 < 0.20 1.00 1.49
HP-β-CD – < 0.20 0.53 0.70
M-β-CD – – < 0.20 0.73
γ-CD < 0.20 – – 0.87
Sistemul dual care folose șteβ-CDși SBE-β-CD a arătat cele mai promi țătoare
rezultate în timpul analizei preliminare. Atunci când β-CD a fost utilizat ca CD neutră,
s-a obținut enantiorezoluția parțială pentru toți analiții , aspect ce nu a putut fi
evidențiatla utilizarea celorlalte CD neionizate .Rscea mai scăzută a fost observată
pentru enantiomerii CPA, unde a apărut doar o splitar e apeakului, în timp ce
enantiomerii PMZ au fost separați pe linia de bază, cu oRsde1,49.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 57
Figura1.2.2.Separarea chirală a enantiomerilor antihistaminicelor H1 prin EC,
utilizând un sistem dual CD compus din β-CDși SBE-β-CD (condi ții electrofore tice: 25
mMfosfat, 10 mM β-CD + 3 mM SBE -β-CD, pH 7,0, +25 kV, 25 ° C, 50 mbar/5 sec,
214nm)
Deși valorile R spentru CPA și BPA au fost mai ridicate la utilizarea β-CD,
sistemul dual de CD prezintă avantajul recunoa șterii chirale a tuturor analitilor. Mai
mult decât atât, comparativ cu utilizarea SBE -β-CD, s-a observat o cre ștere
semnificativă a mobilită ții electroforetice a tuturor analitilor, și o schimbare a ordinii
de migrare, CTZ migrând prima . Scăderea timpilor de migrare poate fi explicată prin
scăderea afinită ții analițilorfață de CD anionică și, probabil, prin distribuția
enantiomerilor între cele două CD .
Pentru a stabili concentra ția optimă de selector chiral, am crescut treptat
concentra țiile CD. Rezultatele arată că creșterea concentrației de SBE -β-CD are un
efect dramatic asupra enantioseparării.
Tabel1.2.3. Efectul cr eșterii concentrației de CD asupra rezoluției chiral e utilizând un
tampon fosfat pH 7,0
raportSBE-β-CD / β-CDîn
soluția tampon (mM)Rs
CTZ CPA BPA PMZ
3 / 100.73 < 0.20 0.96 1.49
10 / 100.93 0.97 1.50 1.57
10 / 150.83 1.00 1.41 1.57
15 / 103.11 1.77 3.14 3.57
20 / 151.42 0.78 1.13 1.43

58| Hancu Gabriel
Creșterea concentrației de SBE -β-CD de la 3 mM la 15 mM, men ținând în același
timp concentra ția deβ-CD la 10 mM, a condus la o cre ștere notabilă a Rs pentru to ți
analiții și la separarea pe linia de bază a acestora.
Rezultatele ob ținute indică faptul că cea mai bună separare chirală a celor patru
perechi de enantiomeri s -a obținut atunci când am utilizat un tampon fosfat de 25 mM
la unpH de 7,0 și un amestec de 15 mM SBE -β-CDși 10 mM β-CD cași selectori chirali.
Folosind acest sistem de CD, am stabilit, de asemenea, ordinea de migrare a
enantiomerilor, la substan țele în care am avut la dispoziție enantiomeri optic puri
(CTZ, CPA, BPA ), prin metoda adaosului. Rezultatele au arătat că în toate cazurile
studiate eutomerii au fost cei care au migrat primii.
Optimizarea metodei dezvoltate a fost efectuată într -o manieră univariată
(modificând câte un factor pe rând în timp ce îi păstrăm co nstanți pe ceilalți),
urmărind influen ța soluției de tampon (15 -35 mM), temperaturii (15 -30°C)și
tensiunii aplicate (20 -30 kV) asupra separării chirale.
Figura1.2.3.Separarea chirală a enantiomerilor antihistaminicelor H1 prin EC, în
condiții optimiza te (CD (condi ții electrofore tice: 25mMfosfat, 10 mM β-CD + 15 mM
SBE-β-CD, pH 7,0, +25 kV, 25 ° C, 50 mbar/5 sec, 214nm)
Utilizând metoda astfeloptimizată, au fost evaluate performan țele analitice ale
metodei pe baza liniarită ții, sensibilității și repe tabilității(tabel 1.2.4 ).
Metoda a fost aplicată pentru determinarea levocetirizinei din preparate
farmaceutice comerciale; au fost utilizate tablete Xyzal (UCB Pharma, Germania),
fiecare comprimat con ținând 5 mg R (-)-CTZ. Con ținutul în substanță activă a fost de
98,85 ± 1,54% (n = 6) din cantitatea declarată (5 mg). Peakurile obținute din tablete

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 59
au fost similare cu cele din solu țiile standard și nu a existat interferențe din partea
excipienților de tabletare. Recuperările au fost între 98 -102% din valor ile declarate de
producători.
Tabel 1.2.4. Performan țele analitice ale metodei optimizate (liniaritate, sensibilitate)
AnalitEcuația de
regresieCoeficient de
corelațieLOD
(µg mL-1)LOQ
(µg mL-1)
R(-)-CTZy = 0.097x + 1.123 0.991 1.9 6.3
S(+)-CTZy= 0.087x + 1.497 0.986 1.6 5.3
S(+)-CPAy = 0.074x + 0.340 0.995 2.6 9.2
R(-)-CPAy = 0.103x + 0.866 0.995 2.9 9.6
S(+)-BPAy = 0.109x + 1.136 0.994 2.8 9.2
R(-)-BPAy = 0.103x + 0.595 0.994 2.9 9.6
PMZ1*y = 0.160x + 0.026 0.998 2.3 7.6
PMZ2*y = 0.158x + 0.058 0.997 2.6 8.6
Screeningul ini țial rapid al CD s -a dovedit a fi adecvat pentru identificarea
componentelor individuale ale sistemului dual de CD și a condus la o separarea pe
linia de bază a perechilor de enantiomeri într -un timp de analiză scurt , de sub 7
minute.Este adevărat că, utilizând doar un număr limitat de experimente preliminare
(în cazul nostru, am utilizat doar o concentra ție de CD și trei valori diferite ale pH –
ului) există șansede a omite elemente importante ale recunoa șteriichirale. Cu toate
acestea acea stă abordare este foarte eficientă din punct de vedere al costurilor și
rapidă în identificarea celor mai promi țători agenți de rezoluție chirală;sistemele
duale CD p utândfi optimizate în continuare, această abordare permițând o mai mare
flexibilitate a separării [68].
Acest studiu eviden țiază, de asemenea, beneficiile utilizării metodelor
universale pentru determinarea simultană a mai multor antihistaminice H1 din
diferite clase avândcaracteristici structurale diferite fără a fi nevoie de elaborarea
unei metode separate și distincte pentru fiecare compus.
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
SzabóZI. Tóth C. Hancu G. (autor corespondent) Muntean DL. Simultaneous chiral
separation of four H1 -antihistamines by capi llary zone electrophoresis using a dual
cyclodextrin system , Chromatograhia, 2015, 78(21): 1377 -1384,articol indexat ISI ,FI:
1,332[69].

60| Hancu Gabriel
1.3. Separarea chirală a inhibitorilor de pompă de protoni prin EC
Inhibitorii pompei de protoni (IPP) sunt substan țe farmaceutice cu structură
benzimidazolică care ac ționează printr -o scădere pronun țată și de lungă durată a
producției de acid gastric; suntconsidera țiîn terapia modernă cei mai puternici
inhibitori ai secretiei acide ,fiindutilizațiîn tratamentul ma i multor afec țiunigastrice,
cum ar fi: dispepsia, ulcerul peptic, boala de reflux gastroesofagian, refluxul
laringofaringian și sindromul Zollinger -Ellison[70].
Toate IPP -urile au caracteristici structurale și mecanisme de acțiune comune,
acționând prin blocarea ireversibilă a unei enzime a celulelor parietale gastrice
(H+/K+-ATP-aza-pompa de protoni) [ 70].
Studiul de fa țăa vizatanaliza chirală a omeprazolului (5-metoxi-2-[[(4-metoxi-
3,5-dimetil-2-piridinil) metilsulfinil] -1H-benzimidazol )șipantopra zolului (6-
(difluoromet oxi)-2-[(3,4-dimetoxi -2-piridinil)metilsulfinil]-1H-benzimidazol ),ceimai
utilizațiIPP în terapie; aceștia sunt derivați de sulfinilbenzimidazol, care conțin o
grupare sulfinil ata șată de un fragment benzimidazolic. Ambii compuși conțin un atom
de sulf asimetric într -o structură piramidală, ceea ce duce la existen ța a doi
enantiomer, RșiS(figura 3.1 ).
Figura1.3.1.Structura chimică a omeprazolului și pantoprazolului (* marchează
centrul chiral)
În clasa IPP, enantiomerii puri S prezintă un profil metabolic și farmacocinetic
superior comparativ cu racema ții acestora, administrarea acestora ducând în final la o
eficacitate terapeutică superioară. În timp ce omeprazolul este utilizat în terapie atât
cașiracemat, cât și ca enant iomer pur (S -omeprazol); pantoprazolul este utilizat
numai ca racemat, de șiS-pantoprazolul oferă avantaje terapeutice dovedite în
compara ție cu pantoprazolul racemic [71].

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 61
Compușii studiați sunt substanțe hidrofobe cu proprietăți bazice slabe,
acumularea în celule parietale fiind dependentă de gradientul de pH și de valoarea pK a
a fiecărui compus. Din trecei doi compu și studiați, pantoprazolul are un pK ade 3,95, în
timp ce omeprazolul are un pK aasemănător de 4,10.
În literatura de specialitate au fost pu blicate mai multe lucrări științifice
referitoare la enantiosepararea IPP , în special al omeprazolului, prin metode de EC
[72]. Separarea chirală a pantoprazolului și a omeprazolului a fost rezolvată prin EC
utilizând albumină serică bovină ca selector chi ral, dar datorită absorb ției puternice a
sistemului tampon, limitele de detec ție au fost destul de modeste [ 73].Rezultate mai
bune s-au obținut la utilizarea CD, enantiomerii omeprazolului fiindseparați prin EC
folosind un tampon fosfat, la un pH acid șiS-β-CD sau M -β-CD cași selectori chirali
[74]. O altă metodă pentru separarea enantiomerică a omeprazolului și a
metabolitului său 5 -hidroxiomeprazol a fost raportată utilizând o metodă de EC în
mediu neapos în tr-un tampon de acetat de amoniu acidificat cu acid formic în metanol
și DM-β-CD cași selector chiral [75]. Recent, a fost dezvoltată și validată o altă metodă
pentru determinarea purită ții enantiomerice aesomeprazolului și a substanțelor
înrudite ale acestuia utilizând un tampon Tris -fosfatșiHP-β-CD cașiselector chiral
[76]. Separarea chirală a pantoprazolului a fost mai pu țin studiată, dar putem
menționa o metodă ECce utilizează un tampon mixt borat -fosfat, launpH neutru șiS-
β-CDca selector chiral, cu dezavantajul unor timpilungi de migrare[77].
Scopul nostru a vizat dezvoltarea unei noi metode simple, rapide și precise
pentru enantiosepararea omeprazolului și a pantoprazolului, optimizarea condițiilor
electroforetice și determinarea enantiomerilor în formulări farmaceutice tipizate.
Amutilizat următorii anali ți de calitate farmaceutică: R,S-omeprazol ,S-
omeprazol (Sun Pharmaceutical Industries, India); R,S-pantoprazol sare de sodiu șiS-
pantoprazol (Cipla, India).
Pentru determinarea IPP din forme farmaceutice am utilizat Omez (Dr Re ddy’s ,
India)capsule gastrorezistente con ținând 20 mg omeprazol, Emanera (Krka, Slovenia)
capsule gastrorezistente con ținând 20 mg S -omeprazol și Nolpaza (Krka, Slovenia)
capsule gastrorezistente con ținând 20 mg panoprazol).
Determinările au fost efectua te pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD. Separările s -au efectuat pe un capilar de 48 cm

62| Hancu Gabriel
lungime (40 cm lungime efectivă) x 50 µmdiametru (Agilent, Germania).
Electroferograme le au fost înregistrate și procesate cu ajutorulsoftware -ului
Chemstation 7.01 (Agilent , Germania ).
Ca și selectori chirali am utilizat următorii derivați de CD : CD naturale neutre ( α-
CD,β-CD,γ-CD), CD derivatizate neutre ( hidroxipropil -β-CD-HP-β-CD, β-CD metilată
aleator–M-β-CD), CD deriv atizate anionice (carboximetil β -CD sare de sodiu –CM-β-
CD, sulfobutil eter -β-CD sare de sodiu –SBE-β-CD). Toate CD au fost produse de la
Cyclolab (Budapesta, Ungaria) cu excepția SBE -β-CD–Capsitol® (Cydex, SUA).
Soluțiile stoc de probă au fost prepar ate prin dizolvarea substan țelor în metanol
într-o concentra ție de 100 μgmL-1și apoiau fostdiluatecu același solvent la
concentra țiile corespunzătoare. Probele au fost introduse în sistem prin injectare
hidrodinamică la capătul anodic al capilarului. Determinările electroforetice au fost
efectuate cât mai repede posibil, dar nu mai târziu de 4 ore după prepararea solu țiilor,
pentru a evita posibil adescompuner ea probelor.
Capilarele au fost condi ționate înainte de utilizare cu NaOH0,1 M, cu apă
deionizatăși cu soluția tampon utiliza tă timp de 30 de minute. Înainte de fiecare
analiză, capilarele au fost precondi ționate prin spălare timp de 1 minut cu hidroxid de
sodiu 0,1 M și apoi cu soluția tampon utilizată.
Anterior, am înregistrat spectrele UV ale omeprazolului și pantoprazolului și am
găsit maxime de absorb țiela303 nm pentru omeprazol respectiv la 290 nm pentru
pantoprazol; în consecin ță, 300 nm a fost ale asăcalungimi de undă pentru analiză;
210 nm a fost aleasă ca lungime de undă de control.
În analiza preliminară am utilizat următoarele condi ții electroforetice :
concentra ția tamponului 25 mM, temperatura 20 ˚C, tensiune a aplicată + 20 kV,
presiunea/timp de injectare 50 mbar/ 3 secunde, concentra ția probei 10 μgmL-1.
Pentru a stabilicondițiileelectroforetice adecvate pentru separarea chirală a
celor două IPPstudiate, s -au efectuat o serie de experimente preliminare utilizând
diferitecompoziții ale soluțiiei tampon la diferite valori de pH . În analiza preliminară
au fost utilizate următoarele soluții tampon: 25 mM acid fosforic (pH -2,5), 25 mM
hidrogenofosfat monosodic (pH-5,0) 25 mM hidrogenofosfat monosodic –
hidrogenofosfat disodic (1:1) (pH = 7,0) și 25 mM hidrogenofosfat disodic (pH -9,0),

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 63
modificând pH-ul tamponului prin adăugarea unei soluții deNaOH0,1 M. Ambele
substanțe pot fi detectate pe întregul interval de pH studiat (2 -11).
Soluției tampon i s -au adăugat concentra ții inițiale de 10 mM în cazul CD neutre
și 5 mM pentru CD ionizate. S-au observat interac țiuni chirale pentru omepr azol la
utilizarea β-CD, HP-β-CDși M-β-CD peuninterval de pH cuprins între 2,0 -4,0 iar
pentru pantoprazol atunci când s -a utilizat SBE -β-CD peuninterval îngust de pH
cuprins între 7,0 și 8,0. Pentru separarea chirală a omeprazolului a fost selectat un pH
de 2,5, în timp ce pentru pantoprazol am selectat un pH optim de 7,0.
La pH 2,5, β-CDși derivații acesteia (HP -β-CD, M-β-CD) nu vor prezenta
mobilitate electroforetică, omeprazolul va migra spre catod pe baza mobilită ții
electroforetice proprii iar ef ectul FEO va fi minim, toate aceste aspecte crescând
timpul de migrare a analitului și oferind timpul necesar ca acesta să interac ționeze cu
selectorul chiral .
La pH 7,0, CD anionică SBE-β-CD este încărcat ănegativ în timp ce pantoprazolul
esteneionizat sauslab ionizat negativ, prin urmare analitul și selectorul chiral se vor
deplasa cu mobilită ți electroforetice diferite ; separarea chirală rezult ânddin
diferențeledintre constantele de asociere ale enantiomerilor cuselectorul chiral.
M-β-CD a fost sele ctat cași cel mai bun candidat pentru enantiosepararea
omeprazolului în timp ce SBE -β-CD s-a dovedit a fi cea mai bună op țiune pentru
enantiosepararea pantoprazol ului.Am stabilit o concentra ție optimă de 20 mM pentru
CD neutre selectate pentru separarea omeprazolului; în timp ce pentru separarea
pantoprazolului am folosito concentra ție optimă de 5mM SBE -β-CD.
O problemă de stabilitate poate apărea în cazul omeprazolului, care poate fi
degradat rapid în condi ții acide. Luând în considerare materialelor pu blicate anterior
[74], pentru a preveni degradarea omeprazolului am utilizat ca și antioxidant o sol uție
de 5 mM disulfură de sodiu adăugată solu ției tampon.
Ordinea de migrare a celor doi enantiomeri a fost determinată prin injectarea
unei solu ții de race mat îmbogă țit cu enantiomerul pur; enantiomerii R(+)eluând mai
întâi pentru ambii compu și, urmați de enantiomerii S(-).
Tabelul 1.3.1rezumă condi țiile experimentale (tipul și concentrația CD, pH -ul
tamponului) și rezultatele (timpii de migrare ai celor d oi enantiomeri, factorul de
separare -α, rezoluția-Rs).

64| Hancu Gabriel
Tabel1.3.1.Separarea electroforetică aizomerilor optici ai omeprazolului și
pantoprazolului
Tipulși
concetra ția CDpHTimp de migrare
enantiomer S (min)Timp de migrare
enantiomer R (min)Rsα
Omeprazol
20 mMβ-CD 2.5 7.70 7.90 1.741.02
20 mM HP -β-CD2.5 7.80 8.10 2.031.03
20 mM RAMEB 2.5 7.90 8.30 2.971.05
Pantoprazol
5 mM SBE -β-CD7.0 6.20 6.50 2.521.04
Electroferogramele separării chirale a omeprazolului și pantoprazolului în
condiții optimizate sunt prezentate în figura1.3.2și respectiv în figura1.3.3.
Figura1.3.2.Separarea chirală a enantiomerilor omeprazolului prin EC, în condi ții
optimizate (condi ții electroforetice: 50mM fosfat, 5 mM disulfură de sodiu, 20 mM M –
β-CD,pH2,5, +20kV,15 °C, 50 mbar/ 1sec,300nm)

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 65
Figura1.3.3.Separarea chirală a enantiomerilor pantoprazolului prin EC, în condi ții
optimizate (condi ții electroforetice: 50 mM fosfat, 5mMSBE-β-CD, pH7,0, +20 kV, 1 5
°C, 50 mbar/1 sec, 300 nm)
Separareachirală simultană a celor două substan țe a fost realizată atunci când s –
a utilizat un tampon fosfat compus din 25 mM hidrogenofosfat disodic -25 mM
didodrogenofosfat de sodiu (1: 1), la un pH -7,0și SBE-β-CD cași selector chiral, dar
rezoluția enantio merilor omeprazolului a fost doar par țială (figura 3.4 ).
Figura1.3.4.Separarea chirală a enantiomerilor omeprazolului și pantoprazolului
prin EC, în condi ții optimizate (condiții electroforetice: 50 mM fosfat, 10 mM SBE -β-
CD, pH 7,0, +20 kV, 1 5 °C, 50mbar/1 sec, 300 nm)

66| Hancu Gabriel
Performan țele analitice ale celor două metode elaborate și optimizate au fost
verificate în cea ce prive ște precizia, liniaritatea, acuratețea și s -au calculat LODși
LOQ.
Precizia metodei s -a verificat prin injectarea de șase ori cons ecutiv, a unor
probe de 10 µgmL-1substanță activă, calculându -se RSD (%) pentru timpii de
migrare, aria peakului și înălțimea peakului. Liniaritatea metodei a fost investigată pe
un interval de concentra ție specific (5 -100 μgmL-1) pe baza a șase conce ntrații
diferiteși trei repetări pe concentrație, coeficienții de corelație obținuți având valori
mai mari de 0,99 pentru ambii compu și.LODșiLOQau fost estimate ca fiind: devia ția
standard a ecuației de regresie/ panta a ecua ției de regresie înmulțită cu 3,3, respectiv
cu 10(tabel 1.3.2 ). Acurate țea a fost demonstrată prin metodaadaosului folosind
enantiomerii puri, RSD(%) dintre valorile teoretice preconizate și datele
experimentale obținuteau fost de sub 2%. Robuste țea metodei a fost examinată
variind următorii parametrii : concentra ția tamponului (45 -55 mM), tensiunea
aplicată ( 18-22 kV), temperatura (15 -17 °C)și presiunea de injec tare(40-50 mbar) ,
s-au efectuat măsurători pentru trei valori a fiecărui parametru, luând în considerare
variațiatimpilor de migra țiea analiților.Variața parametrilor pe intervalele alese nu
modifică semnificativ timpii de migrare (RSD <2%).
Tabel 1.3.2 . Performan țele analitice ale metodei optimizate
Analiți Ecuația de regresie Coeficient de
corelațieLOD
(μg mL-1)LOQ
(μg mL-1)
Omeprazol
R-omeprazol y=0.1232x -1.2907 0.999 0.90 2.75
S-omeprazol y=0.142x -1.9499 0.998 0.87 2.62
Pantoprazol
R-pantoprazol y = 0.0809x + 1,32 0.999 1.06 3.21
S-pantoprazol y=0.0854x+1,2522 0.998 1.12 3.40
Metodele dezvoltate au f ost aplicate pentru analiza chirală a omeprazolului și
pantoprazolului din diferite preparate farmaceutice. Peakurile ob ținute din formele
farmaceutice studiate au fost similare cu cele din solu țiile standard ale IPP, neexistând
interferen țe din partea exc ipienților. Au fost obținute rezultate reproductibile, iar
recuperările au fost în intervalul 95 -105% din valorile declarate de producători ( tabel
1.3.3).

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 67
Table1.3.3.Determinarea IPP din forme farmaeutice
Produse
farmaceuticeCantitate enantiomer
declarată(mg)Cantitate de enantiomer
găsită(mg)± SD (n =3)
S-IPP R-IPP S-IPP R-IPP
Omez
(20 mg omeprazol)10 10 10,11±0,14 10,24±0,12
Nolpaza
(20 mg pantoprazol)10 10 9,73±0,08 9,68±0,09
Emanera
(20 mg S -omeprazol)- 20 – 19,58±0,23
Utilizarea EC ca metodă de separare chirală și a CD ca și aditivi chirali s -a
dovedit a fi o tehnică rapidă, rentabilă și fiabilă pentru enantiosepararea
omeprazolului și a pantoprazolului, necesitând cantități mici de probe, reactivi și
selectori chirali. Metodele propuse au fost aplicate pentru determinarea anali ților din
preparate farmaceutice, reprezentând o alternativă valoroasă a analizelor chiraleprin
metode HPLC, acestea fiind metode m ai scumpe și mai puțin versatile prin compara ție
cu EC.
Rezultatele studiului de fa ță confirmă faptul că metodele CE propuse pot fi ușor
adaptate pentru analiza de rutină a racema ților PPI (pantoprazol, omeprazol).
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Hancu G. Papp L.Rusu A., Chiral separation of the enantiomers of omeprazole and
pantoprazole by capillary electrophoresis . Chromatographia, 2015, 78 : 279-284, articol
indexat ISI ,FI: 1,332 [78].

68| Hancu Gabriel
1.4. Separarea chirală a fluoxetinei prin EC
Fluoxetina (N-metil-3-fenil-3-[4-(trifluormetil) fenoxi] propilamina) ( FLX)
este un antidepresiv modern din clasa inhibitorilor selectivi ai recaptării serotoninei
(ISRS), fiind utilizat în tratamentul tulburărilor depresive majore, tulburărilor
obsesiv-compulsive , atacurilor de panicăși a bulimiei nervoase . Introdusă în terapie la
începutul anilor 90 ’FLXa devenit unul dintre cele mai prescrise medicamente a
tuturor timpurilor, și cel mai prescris medicament antidepresiv, fiind considerat un
medicament "blockbuster" iar introduc erea ei în terapie “momentul zero” în
tratamentul modern al depresiei [79].
FLXprezintă unatom de carbon asimetric în structura sa (figura1.4.1),
rezultând existen ța a doi enantiomeri, R -FLXși S-FLX(figura1.4.2).
Figura1.4.1.Structura chim ică a FLX(*marchează centrul chiral)
Figura 1.4.2. Structura enantiomerilor FLX
FLXeste utilizată în terapie ca amestec racemic; dar stereospecific itatea acțiunii
enantiomerilor FLXși a metabolitului său activ, norfluoxetina (NFLX), este
demonstrată și documentată.FLXeste metabolizată hepatic prin demetilare, la NFLX,
metabolit activ, cu acțiune ISRS, care prelunge ște timpul de acțiune al substan ței
(figura 1.4.3 )[80].

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 69
R-FLXșiS-FLXau poten țial similar ca ISRS, dar metaboli ții activi au potențe
diferite, S-NFLXfiind un inhibitor mai puternic al serotoninei decât R-NFLX.R-FLXși
S-FLXprezintă profile metabolice diferite, clearance -ulR-FLXfiind de aproximativ
patru ori mai mare decât cel al S-FLX; aceasta ducând la diferen țeîntre timpii de
înjumătă țire a enantiomerilor, timpul de înjumătă țire alS-FLXfiind de un sfert din cel
alR-FLX[80,81].
Figura 1.4. 3.Metabolismul stereoselectiv al FLX
Prin urmare, e ra de așteptat ca utilizarea în terapie a R-FLXsă conducă la
scăderea nivel elorplasmatice a leFLXșiNFLXprin compara ție cuceleînregistrate la
administrarea amestecului racemic; dar dezvoltarea clinică a R-FLXpentru
tratamentul depresiei a fost oprită deoarece administrarea de dozeridicate a
determinat o cre ștere mică, dar semnificativă statistic, a repolarizării cardiace
(prelungirea timpului QT) în studiile clinice de fază II [82].S-au înterprins de
asemenea și eforturi în dezvoltarea S-FLXpentru tratamentul durerilor migrenoase,
dar până în acest moment S-FLXnu a primit aprobarea FDA pentru această posibilă
indicație terapeutică [83].Experien ța nereușită de "chiral switch" în cazul FLX
evidențiază potențiale le diferen țedintre enantiomerii unui medicament chiral și
necesitatea de a lua în considerare formulările enantiomeric pure aleunui
medicament, de la caz la caz, în func ție de caracteristicile stericeși farmacologice a
fiecărei substan țe[84].

70| Hancu Gabriel
Luând în calcul aspectele prezentate anterior, dezvoltarea de metode
enantioselective pentru analiza chirală a FLX care să permită estim arearaportului
enatiomeric din forme farmaceutice tipizate este de mare importan ță în industria
farmaceutică; a ceste metode inclu zândîn special metode de cromatografia lichidă de
înaltă performan ță (HPLC), darșideelectroforeza capilară ( EC).
Desiderio șicolab. audezvoltat și optimizat o metodă stereoselectivă pentru
determinarea simultană a FLX șiNFLX, din ser și plasmă, utilizând un tampon fosfatla
unpH 2,5și un sistem dual deCD compus dintr -oCDneutră(M-β-CD)șioCDanionică
(γ-CD-fosfatată).Concentra țiilescăzutede CDșiutilizarea uneicelule de detectare cu
sensibilit ate ridicată (așa-numita " celulă-zeta") a permis atingerea unor limite de
detecție de 0,005și 0,01μgmL-1pentru FLX, respectiv NFLX, comparabile cu cele
obținute prin tehni ciHPLC, permițând determinarea enantiomerilor FLX și NFLX la
niveluri terapeutice dinplasmă. Raportul FLX și NFLX a confirmat stereoselectivitatea
procesului metabolic [85].
Inoueși Chang au efectuat un screening complex a 11 CD,neutreși ionizate
pentru a stabili selectorul chiral optim pentru separarea enantiomerilor FLX. Patru
analogiaiFLXcusubstituen ți diferiți pe fragmentul structural aminic au fost de
asemenea analiza ți pentru a studia implicațiilestructurale ale acestora asupra
recunoașteriichirale; trei dintre ace știaavândsubstituen ți alchilici simpli au
prezentat un comportament electroforetic similar cu cel al FLX, în timp ce adăugarea
unei grupări carboxil pe fragmentul aminic a avut o influen ță semnificativă asupra
separării chirale .Pentru a stabili efectul pH -ului asupra separării chirale a FLX,
separarea a fost efectuată atât la pH 2,5 cât și lapH9,0, iar rezultatele obținuteau fost
comparate. CD anionice au avut o capacitatede rezolu țiechiralămai bun ăprin
compara ție cu cele neutre la pH 2.5 datorită mobilită țiielectroforetice propriia
acestorași a migrării în direcțieopusă FLX .Creșterea pH -ului de la 2,5 la 9,0 a redus
rezoluția chirală, explicabilă prin interacțiunea ionică mai slabă dintreFLXșiCD
studiate la un pH b azical soluției tampon [86].
Structural FLX este o amină, un analit bazic cu o valo are pKa de 9,80, în
consecință este ionizată pozitiv pe un domeniu relativ mare de pH. O solu ție
interesantă pentru a evita posibil eleinteracțiuniionicealeFLXcu select ori chirali
încărcați negativ, a fo st publicată de Javid și colab.; pentru a îmbunătă ți separarea

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 71
chirală, guanidina a fost utilizată ca aditiv cationic altamponul ui în cazul utilizării unei
CD anionic e (S-β-CD)cașiselector chiral [87].
Asensi-Bernardi și colab. audezvoltat o metodă enantioselectivă pentru analiza
chirală a FLXdinproduse farmaceutice prin tehnica cromatografiei electro cinetice
capilare în contra curent, utilizându -se ca selector chiral HS-β-CD. Mobilitatea contra –
curentîn interiorul capilarului a CD anionic eși a analitului cu încărcătură opusă CD ,a
permis enantio separarea FLX cu o rezolu ție ridicată utilizând concentra ții scăzute ale
selectorului chiral și obținerea unor timpi foarte scur ți de analiză (<2 min) [88].
Informațiileprivind proprietă țile stereoselective ale FLX respectiv metodele
enantioselective de determinare a enantiomerilor acest eiaau fost publicate în
reviewul :
Hancu G. Cârcu-Dobrin M. Budău M. Rusu A. Analytical methodologies for the
stereoselective determination of fluoxetine: an overview. Biomedical Chromatography,
2018, 32(1), articolindexatISI,FI:1,613 [89].
Pebazaobservațiiloracestui studiubibliografic complex, amurmărit
dezvoltarea uneimetodealternative deECpentrusepararea enatiomerilor FLXdin
formefarmaceutice.
Am utilizat un amestec racemic R,S-fluoxetina, și enantiomerul optic pur S-
fluoxetina (Solmag, Mulazzano, Italia) ; substan țe de calitate farmaceutică .
Ca și selectori chirali am utilizat următorii derivați de CD: CD naturale neutre ( β-
CD,γ-CD), CD derivatizate neutre ( hidroxipropil -β-CD-HP-β-CD, β-CD metilată
aleator–M-β-CD, heptakis (2,6-di-O-metil)-β-CD–DM-β-CD,heptakis(2,3,6 -tri-O-
metil)-β-CD–TM–β-CD), CD derivatizate anionice (carboximetil β -CD sare de sodiu –
CM-β-CD, sulfobutil eter -β-CD sare de sodiu –SBE-β-CD). Toate CD au fost
achiziționatede la Cyclolab (Budapesta, Ungaria) cu excepția SBE -β-CD–Capsitol®
(Cydex,SUA).
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD. Separările s -au efectuat pe un capilar de 48 cm
lungime (40 cm lungime efectivă) x 50 µm diametru (Agilent, Germania).
Electroferograme le au fost înregistrate și procesate cu ajutorul software -ului
Chemstation 7.01 (Agilent, Germania).

72| Hancu Gabriel
Pentru determinarea din produse farmaceutice amutilizat capsule Prozac (Eli
Lilly, SUA) și Fluoxin (VimSpectrum, România) ,conținând 20 mg FLX.
Soluțiile stoc conținând 1 mg mL-1deR,S-FLX au fost preparate în metanol și
diluate înainte de utilizare cu acela și solvent la concentra țiile corespunzătoare.
Capilarul a fost condi ționat cu NaOH 0,1 M timp de 30 minute, apă purificată
timp de 15 minute și soluțietampon timp de 15 minute, respectiv precondi ționat cu
NaOH 0,1 M, apă purificată și soluție de electroli t, fiecare timp de 2 minute. Probele și
standardele au fost injectate prin injectare hidrodinamică la capătul anodic al
capilarului , detectarea având loc la catod . Condițiile inițiale de EC au fost următoarele:
concentra ția soluției tampon 25 mM, tensiune aplicată+ 20 kV, temperatura
capilarului 25°C, presiune/ timp de injectare 50 mbar/ 1 secundă,lungimea de detec ție
230 nm, concentra ția probei 25 μg mL-1.
FLX este un analit bazic având în structură un atom de azot ter țiar, cu o valoare
pKade 9,80, prin ur mare, este ionizată pozitiv pe un domeniu relativ mare de pH .
Pentru a urmăricomportamentul electroforetic al analitului într -un sistem achiral, am
utilizat diferite solu ții tampon fosfat , peundomeniu de pH cuprins între 2,5 și 11,0.
FLX apututfi detectată într -un interval de pH cuprins între 2,5 și 7,0.
Inițial am efectuat un screening de CD la trei niveluri de pH: 2,5, 5,0 și 7,0. În
timpul procesului de screening CD, la solu ția tampon am adăugat concentrații inițiale
de CD neutre de 10 mM, în timp c e pentru CD ionizate am adăugat o concentra ție de 5
mM pentru a limita cre șterea puterii ionice a soluției tampon.
Singura CD care a prezentat interac țiuni chirale cu FLX a fost TM-β-CD, o CD
derivatizată ,neutră din punct de vedere electroforetic ( figura1.4.4).Cea mai ridicată
Rsîn condițiile inițiale, a fost obținută la utilizarea unui tampon fosfat la pH 5,0.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 73
Figura 1.4. 4.Structura chimică a heptakis(2,3,6 -tri-O-metil)-β-CD–TM-β-CD
Pentru a îmbunătă ți rezoluția de separare a enantiomerilor, oetapă crucială o
reprezintă procesul de optimizare a metodei analitice. Metoda de optimizare
convenționalăse bazează pe modificarea unei variabile, men ținând constant ecelelalte
variabile; această abordare meticuloasă este a șa-numita abordare " one factor at time"
și implică un număr mare de experimente individuale consumând mult timp; prin
urmare,metodele ce utilizează variația simultană a mai multor factori au devenit din
ce în ce mai răspândite și utilizate [90].
Abordarea multivariată sau designul expe rimental, duce , la stabilirea condi țiilor
optime de separare prin efectuarea unui număr relativ redus de determin ări
experimentale și oferă informații mai complexe asupra sistemului de separare; făcând
posibilă detectarea eventualelor corelațiiîntre facto rii studia ți.Designul experimental
ortogonal oferă o modalitate simplă și eficientă de a examina un număr mare de
factoriprin efectuarea unui număr redus de determinări experimentale ,pentru a
diferenția variabilele experimentale semnificative de celemai puțin importante [91].
Pentru optimizarea separ ăriichirale a FLX , am utilizat o matrice ortogonală L18
(63), unde 18 reprezintă numărul total de experimente care rezultă din varia ția a 6
factori experimentali la 3 nivele diferite. Factorii selecta ți pentruoptimizare au fost:
concentra țiasoluției tampon (25, 50, 100 mM), pH -ul soluției tampon (4,5, 5,0, 5,5),
concentra ția CD (5, 10, 15 mM) ,voltajul aplicat (15, 20, 25 kV), temperatura (15, 20,
25 °C)șiparametrii de injec tare(50 mbar/1 sec undă, 50 mbar/3 secunde, 30 mbar/ 5
secunde). Ca factor de răspuns, valorile rezolu țieichiraleau fost înregistrate în fiecare
Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 73
Figura 1.4. 4.Structura chimică a heptakis(2,3,6 -tri-O-metil)-β-CD–TM-β-CD
Pentru a îmbunătă ți rezoluția de separare a enantiomerilor, oetapă crucială o
reprezintă procesul de optimizare a metodei analitice. Metoda de optimizare
convenționalăse bazează pe modificarea unei variabile, men ținând constant ecelelalte
variabile; această abordare meticuloasă este a șa-numita abordare " one factor at time"
și implică un număr mare de experimente individuale consumând mult timp; prin
urmare,metodele ce utilizează variația simultană a mai multor factori au devenit din
ce în ce mai răspândite și utilizate [90].
Abordarea multivariată sau designul expe rimental, duce , la stabilirea condi țiilor
optime de separare prin efectuarea unui număr relativ redus de determin ări
experimentale și oferă informații mai complexe asupra sistemului de separare; făcând
posibilă detectarea eventualelor corelațiiîntre facto rii studia ți.Designul experimental
ortogonal oferă o modalitate simplă și eficientă de a examina un număr mare de
factoriprin efectuarea unui număr redus de determinări experimentale ,pentru a
diferenția variabilele experimentale semnificative de celemai puțin importante [91].
Pentru optimizarea separ ăriichirale a FLX , am utilizat o matrice ortogonală L18
(63), unde 18 reprezintă numărul total de experimente care rezultă din varia ția a 6
factori experimentali la 3 nivele diferite. Factorii selecta ți pentruoptimizare au fost:
concentra țiasoluției tampon (25, 50, 100 mM), pH -ul soluției tampon (4,5, 5,0, 5,5),
concentra ția CD (5, 10, 15 mM) ,voltajul aplicat (15, 20, 25 kV), temperatura (15, 20,
25 °C)șiparametrii de injec tare(50 mbar/1 sec undă, 50 mbar/3 secunde, 30 mbar/ 5
secunde). Ca factor de răspuns, valorile rezolu țieichiraleau fost înregistrate în fiecare

74| Hancu Gabriel
experiment. Ordinea influențeivariabilelor studiate a fost după cum urmează: pH -ul
soluției tampon , temperatura capilarului , concentra ția CD, concentra țiasoluției
tampon,voltajul aplicat , parametrii de injectare (tabelul 1.4.1 ).
Tabel 1.4.1. Design-ul experimental ortogonal utilizatpentru optimizarea metodei
electroforetice de discriminare chirală a FLX
Experiment Conc.
soluției
tampon
[mM]pH-ul
soluției
tamponConc.
CD
[mM]Voltaj
[kV]Temperatură
[0C]Parametrii
injectare
(mbar x
sec)Rs
1 25 4,5 5 15 15 50 x 1 1,05
2 50 5,0 10 20 15 30 x 5 1,80
3 100 5,5 15 25 15 50 x 3 1,62
4 50 5,5 5 15 20 30 x 5 1,24
5 100 4,5 10 20 20 50 x 3 1,20
6 25 5,0 15 25 20 50 x 1 1,48
7 100 5,0 10 15 25 50 x 1 1,28
8 25 5,5 15 20 25 30 x 5 1,25
9 50 4,5 5 25 25 50 x 3 1,01
10 50 5,0 15 15 15 50 x 3 1,77
11 100 5,5 5 20 15 50 x 1 1,30
12 25 4,5 10 25 15 30 x 5 1,23
13 25 5,5 10 15 20 50 x 3 1,20
14 50 4,5 15 20 20 50 x 1 1,37
15 100 5,0 5 25 20 30 x 5 1,54
16 100 4,5 15 15 25 30 x 5 1,09
17 25 5,0 5 20 25 50 x 3 1,32
18 50 5,5 10 25 25 50 x 1 1,30
Q1 1,26 1,15 1,24 1,27 1,46 1,29
Q2 1,41 1,51 1,43 1,37 1,33 1,35
Q3 1,33 1,31 1,33 1,36 1,20 1,35
R 0,15 0,36 0,19 0,09 0,26 0,06
Q1–Q3: valoarea rezolu ției medii pentru fiecare nivel de variabile (Q1 –nivel scăzut;
Q2–nivel mediu; Q3 –nivel ridicat), R: interval de valori, diferen ța între valoarea
maximăși valoarea minimă pentru cele trei nivele testate pe ntru fiecare parametru în
parte
Deoarece am ob ținutsepararea pe linia de bază a enantiomerilor iaranaliza
ANOVA a rezultatelor experimentale a arătat că nici unul dintre parametrii investiga ți
nu a avut un efect semnificativ indiv idual asupra valorilor Rsîn intervalul investigat,
nu a fost necesară o optimizare suplimentară a metodei analitice .
Pe baza rezultatelor designului experimental, condițiile optimizate pentru
separarea chirală a FLX constau în utilizarea unui tampon fosfatde 50 mM ,la unpH
de5,0, 10 mM TM-β-CDcașiselector chiral ,temperatură 15° C,voltaj+ 20kV,

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 75
parametrii de injec tare 50 mbar/ 1 secundă. Adoptând aceste condi ții optimizate, s -a
obținut separarea chirală a FLX, într-un timp de analiză scurt desub 5minute,cu o
valoare Rs de 1,90 șiαde 1,04 (figura 1.4. 5).
Ordinea de migrare a celor doi enantiomeri a fost determinată prin metoda
adaosului, aceasta fiind R-FLX urmată de S-FLX.
Figura 1.4. 5.Separarea chirală a enantiomerilor FLX în condi ții optimi zate(condiții
electroforetice: 50 mM fosfat, 10 mMTM-β-CD, pH 5,0, +20 kV, 15° C, 50 mbar/1 sec,
230 nm)
Performan țele analitice ale metodei au fost evaluate pe baza repetabilității,
preciziei, linearită ții și acurateței și s -au calculat LOD și LOQ.
Precizia “intra -day” a fost evaluată prin injectarea unui standard de R,S-FLX la
trei nivele de concentra ție diferite (10, 25, 50 μg mL-1) deșase ori în aceeași zi , iar
precizia“inter-day”a fost verificată prin injectarea acelora și trei concentra ții(10, 25,
50 μg mL-1) deșase ori pezi peun interval de trei zile consecutiv e.S-au calculat
deviațiile standard relative pentru timpii de migrare și aria peakului pentru cei doi
enantiomeri , metoda dovedindu -se repetabilă și precisă . Liniaritatea metodei s -a
verificat prin injectarea unor soluții standard lașasenivele de concentra ție diferitepe
un domeniu de concentra țiispecific(2,5-50μg mL-1).LODși LOQ au fost estimate ca
fiind: deviația standard a ecuației de regresie raportată la panta dreptei ecua ției de
regresie multiplicată cu 3,3 respectiv 10. LOD a fost de 1,69 și 1,77μg mL-1iar LOQ a
fost de 5,63 și 5,90μg mL-1pentruR-FLXșirespectivS-FLX.Acuratețea metodei a fost
verificată prin testul de recuperare; o cantitate adecvată de pulbere obținută prin

76| Hancu Gabriel
trituarea unor tablete de FLX a fost cântărită, dizolvată în metanol iar lasoluția astfel
obținutăfost adăugată o cantitate cunoscută de standard , determinâdu -seulterior
cantitatea enantiomerilor din acest amestec .Pentru verificarea robuste ții metodei ,am
variat voltajul (18-22 kV), temperatura (14 -160C) respectiv pH -ul (4,5-5,5);
urmărindu -se influen ța acestor mici modificări asupra timpilor de migrare a analiților,
prin calcularea RSD(%).
Metoda optimizată a fost aplicată pentru determinare a enantiomerilor FLX din
forme farmaceutice existente pe pia ța din România: medicamentul original -Prozacși
un medicament generic –Fluoxin. Electroferogramele ob ținute au fost asemănătoare
cu cele ob ținute din soluția standard, fără interferențe din pa rtea excipien ților
formelorfarmaceutice ( figura 1.4. 6).
Figura 1.4. 6.Separarea chirală a enantiomerilor FLX din forme farmaceutice (condiții
electroforetice: 50 mM fosfat, 10 mMTM-β-CD, pH 5,0, +20 kV, 15 °C, 50 mbar/1 sec,
230 nm)

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 77
Cantitățile găsite a u fost conforme cu cele declarate de producători, raportul
enantiomerilor fiind 1:1 ( tabel 1.4.2 ).
Tabel 1.4.2. Determinarea enantiomerilor FLX din preparatele farmaceutice
Produs
farmaceuticCantitate declarată
enantiomeri (mg)Cantitatea găsită enanti omeri
(mg)± SD (n =3)
R-FLX S-FLX R-FLX S-FLX
Prozac (20 mg FLX)10 10 10,1 ± 0,35 9,9±0,32
Fluoxin (20 mg
FLX)10 10 10,15±0,31 9,85±0,24
Sistemul de separare dezvoltat a fost optimizat prin utilizarea unui design
experimental ortogonal; principale le avantaje ale utilizării abordărilor multivariate
fiind reducerea numărului de experimente și prelucrarea statistică a datelor în
vederea găsirii unor condi ții experimentale optime.
În compara ție cu metodele de separare chiral ăHPLCpublicate anterior pentru
separarea enantiomerilor FLX, metoda noastră are avantajele că nu necesită
derivatizare, coloane chirale scumpe sau cantită ți mari de solvenți ca șifază mobilă. În
plus, dacă comparăm metoda noastră cu metodele ECpublicate anterior în literatura
despecialitate, metoda noastră utilizează o CD derivatizată neutră (TM -β-CD) în loc de
CD derivatizate anionice [86,88] sau a unui sistem dual de CD[85],și condiții
electroforetice relativ simple ob ținându-se o rezolu ție chirală bună într -untimp scurt
deanaliză(mai puțin de 5 minute).
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Cârcu-Dobrin M. Budău M. Hancu G. (autor corespondent) Gagyi L. Rusu A. Kelemen
H.Enantioselective analysis of fluoxetine in pharmaceutical for mulations by capillary
zone electrophoresis . Saudi Pharmaceutical Journal, 2017, 25, 397 -403, articol indexat
ISI, FI: 2,302 [92].

78| Hancu Gabriel
1.5. Separarea chirală a indapamidei prin EC
Indapamida (4-cloro-N-(2-metil-2,3-dihidro-1H-indol)-3-sulfamoilbenzamid a)
este o sulfonamid ǎ non-tiazidicǎavând în structură un inel indolic, înrudit ǎ
farmacologic cu diureticele tiazidice; esteutilizată ca monoterapie sau în asociere cu
alte antihipertensive în tratamentul hipertensiunii arteriale precum și pentru
tratamentul e demelor asociate cu insuficiența cardiacă congestivă [ 93].
Structura indapamidei con ține atât un fragment polar de sulfamoil
clorbenzamidă, cât și o parte hidrofobă metilindolică. Structural diferă de tiazide le
clasiceprin faptul că nu posedă un ineltiazidicși conține numai o singurăgrupă
sulfonamid ică.
Indapamida prezintă unatom de carbon asimetric în structura sa ,rezultând
existența a doi enantiomeri, R-indapamida șiS-indapamida ( figura1.5.1),
Figura1.5.1.Structura chimică a indapamidei (*marcheazăcentrul chiral)
Înpofidaprevalen țeiridicatea indapamide i în terapia modernă, studiile privind
eventualele diferen țe farmacocinetice și farmacologice al celor doi enantiomeri sunt
puțineiar rezultatele prezentate sunt inconsecvente [94,95]. Consultând literatura de
specialitate nu am găsit nici un studiu privind separarea chirală prin EC a
enantiomerilor indapamidei.
Scopul nostru a fost dezvoltarea unei metode alternative simple, rapide și
rentabile pentru separarea chirală a enantiomerilor inda pamideiutilizând un
screening sistematic a unor CD cașiselectori chirali și optimizarea condițiilor
electroforetice în scopul ob țineriiunei rezolu țiichiraleridicateși a unuitimp scurt de
analiză.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 79
Pentru separare am utilizat un a mestect racemic deR,S-indapamida (Moehs
Productos Quimicos, Barcelona, Spania) de calitate farmaceutică .Pentru determinarea
indapamidei din produse farmaceutice am utilizat Indapamid (Labormed, România)
comprimate con ținând 2,5 mg indapamidă .
Ca și selectori chirali am util izat următorii derivați de CD : CD naturale neutre ( α-
CD,β-CD,γ-CD), CD derivatizate neutre ( hidroxipropil -β-CD-HP-β-CD, β-CD metilată
aleator–M-β-CD), CD derivatizate anionice (sulfobutil eter -β-CD sare de sodiu –SBE-
β-CD). Toate CD au fost achiziționatede la Cyclolab ( Budapesta, Ungaria) cu excepția
SBE-β-CD–Capsitol® (Cydex, SUA).
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD. Separările s -au efectuat pe un capilar de 48 cm
lungime ( 40 cm lungime efectivă) x 50 µm diametru (Agilent, Germania).
Electroferograme le au fost înregistrate și procesate cu ajutorul software -ului
Chemstation 7.01 (Agilent, Germania).
Soluția stoc de indapamidă au fost preparate prin dizolvarea substanței în
metanol într -o concentra ție de 100 μg mL-1și apoi diluate înainte de utilizare cu
același solvent la concentrația corespunzătoare. Probele au fost introduse în sistem
prin injectare hidrodinamică la capătul anodic al capilarului.
Capilarul a fost condi ționat înainte de utilizare cu NaOH 0,1 M timp de 30 de
minute, apă ultra -purăși cu soluția de electrolit timp de 15 minute și precondiționat
timp de 1 minut cu NaOH0,1 Mșisoluția de electrolit înainte de fiecare determinare
electroforetică.
Condițiile electroforetice ini țiale au fost: temperatura 20 ˚C, tensiunea aplicată
20 kV, presiune / timp de injectare 50 mbar/ 3 secunde, concentra ția probelor 10 μg
mL-1. Am înregistrat spectrul UV ale indapamidei cu un maxim de absorb ție la 242 nm,
lungimedeundăceafost aleasă pentru determinările electroforetice.
Pentru a stabili condi țiile adecvate separării chirale a indapamidei, am efectuat
o serie de experimente preliminare în mediu achiral utilizând solu țiitampon de
diferite compozi țiila diferite valori de p H (2,5–10,0). Indapamida a fost detectabilă
pe un interval de pH cuprins între 5,0 și 10,0.
Tipulși concentrația CD adăugate soluției de electrolit are o importanță
primordială în obținerearezoluției chirale. Inițialamadăugat concentra ții de 10 mM

80| Hancu Gabriel
CDpentru CD neutre șiconcentra ții de5 mM CD pentru CD ionizate, pentru a
preîntâmpina o cre ștere a curentului generat în interiorul capilarului.
La utilizarea unui tampon fosfat, pe intervalul de p H–5,0-8,0,nu s-auobservat
interacțiuni chirale cu nici una dintre CD neutre, cidoar o cre ștere a timpilor de
migrarea analitului .Singura CD , care a prezentat interac țiuni chirale cu indapamida ,a
fostCD anionică, SBE-β-CD.
La utilizarea unui tampon borat, pe intervalul de pH –9,0-11,0,s-a observat o
ușoară splitare a peakului indapamidei la utilizarea β-CDși a HP-β-CD,și interacțiuni
chirale evidente cu SBE -β-CD.
Utilizarea unei CD ionizate (SBE -β-CD) poate juca un rol profund în mecanismul
de rezolu ție chirală; principalele caracteristici fiind interacțiunile electrostatice cu
analitul, migrarea selectorului chiral în direc ția opusă enantiomerilor analitului și
posibilitatea separării compu șilor neionizați [96].SBE-β-CD conține patru grupări
hidroxil primare modificate cu unlanț butilic și grupări s ulfonice(figura 1.5.2 );fiind
încărcatănegativșiputândfi utilizat ăîn mod obi șnuit în separările prin EC peun
intervallarg depH (2-11).
Figura 1.5.2 . Structura chimică a sulfobutil eter -β-CD–SBE-β-CD
pH-ulsoluției tampon joacă un rol importa nt în separările prin EC , deoarece
determină gradul de disociere al selectorului chiral ionizat și al analitului precum și
magnitudinea FEO . Indapamida este o substan ță bazică cu un pK ade 8,8;prin urmarea
ionizarea sa nu diferă semnificativ pe intervalul de pH între 2,5 și 7,0.Cu toate acestea,
este binecunoscut faptul că FEOestedependent de pH peintervalul cuprins între 3,0

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 81
și 7,0;scăzând considerabil la un pH puternic acid . Indapamida a fost detectabilă la un
pH mairidicatde 5,0, dar nu a eluat cătrecatod atunci când pH -ul tampon uluia fost
scăzutla 3,0; acest lucru fiind explicabil prin scăderea semnificativă a FEO și chiar
inversarea vectorului aparent de mobilitate. De asemenea, am observat că timpul de
migrare indapamidei a scăzut pe măsură ce pH-ul soluției tampon a crescut de la 5 ,0la
11,0,în timp ce rezolu ția chirală a crescut în intervalul de pH 5 ,0-7,0și s-a deteriorat
în intervalul de pH 9 ,0-11,0.Ținând cont de toate aceste aspecte un tampon fosfat de
50 mM la un pH 7,0 a fost co nsiderat ca fiind optim pentru determinare.
Parametrii analitici au fost optimiza ți într-o manieră univariată, cele mai bune
rezultate ob ținându-se la utilizarea următoarele condi ții analitice: tampon fosfat 50
mM (25 mM de hidrogenofosfat disodic -25 mMhidrogenofosfat monosodic), 5 mM
SBE-β-CD selector chiral, pH 7,0, tensiune aplicată + 25 kV, temperatura 150C,
presiune/ timp de injec tare 50mbar/ 1 secundă, detecție UV la 242 nm ( figura 1.5.3 ).
Aplicând condi țiile electroforetice optimizate, am reușit sep ararea celor doi
enantiomeri în aproximativ 6 minute, cu Rsde 4,30șiαde 1,08. Pentru că nu am avut
la dispozi ție enantiomeri puri, nu am putut stabili ordinea migrării acestora.
Figura 1.5.3. Separarea chirală a enantiomerilor indapamidei în condițiioptimizate
(condiții electroforetice: 50 mM fosfat, 5mMSBE-β-CD, pH 7,0, +25 kV, 15 °C, 50
mbar/1 sec, 242nm)
Metoda dezvoltată a fost evaluată pe baza preciziei, linearită ții și s-au calculat
LOD (1,85 și 1, 62μg mL-1)și LOQ (5,25 și 4,85 μg mL-1) pentru cei doi enantiomeri.

82| Hancu Gabriel
Metoda s -a aplicat pentru determinarea enantiomerilor indapamidei din forme
farmaceutice.
Metoda dezvoltată raportează în premieră separarea enantiomerilor
indapamidei prin EC, utilizândun tampon de fosfat simplu șiSBE-β-CDcașiselector
chiral,obținându-sesepararea pe linia de bază a celor doi enantiomeri cu o rezolu ție
chirală excelentă și timp relativ scurt de analiză. Rezultatele buneau fost ob ținutela
analiza din forme farmaceutice , indicând că metoda este specifică, ex actăși potrivită a
fi utilizată în analiza chirală de rutină a indapamidei.
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Tero Vescan A. Hancu G. (autor corespondent )Oroian M. Cârje A. Chiral separation of
indapamide enant iomers by capillary electrophoresis . Advanced Pharmaceutical
Bulletin 2014, 4(3): 267 -272, revistă indexată ISI [97].
Într-un alt studiu am urmărit separarea chirală a enantiomerilor indapamid ei
printr-o tehnică HPLC, folosind o coloană chirală cu con ținut proteic, ovomucoid.
Enantiosepararea indapamidei s -a realizat cu ajutorul unui s istem Agilent 1100 Series
HPLC(Agilent Technologies, SUA) dotat cu detector UV -VIS. S-a utilizat o coloană
chirală de tip Ultron ES Ovomucoid, 150 x 4,6 mm, 5 µm (Shinwa Che mical Industries
LTD, Agilent Technologies). Detec ția s-a realizat la 242 nm, lungimea de undă specifică
indapamidei. Determinările cromatografice au fost efectuate folosind o fază mobilă
compusă din tampon fosfat ( 10 mMfosfat disodic )și acetoni trilcașimodificator
organic.
Am utilizat elu ție izocratică, optimizarea condițiilor analitice efectuându -se
printr-o tehnică univariată; s -a urmărit influen ța următoarelor condiții experimentale
asupra rezolu ției chirale și selectivității: proporția modificatoru lui organic în
compoziția fazei mobile, pH -ul fazei apoase, tempe ratura coloanei cromatografice.
Optimizarea separării HPLC a fost efectuată ținând cont de natura fazei
staționare și de proprietățile fizico -chimice ale indapamidei. Din punct de vedere
chimic, ovomucoidul este o glicoproteină utilizabilă pentru diferen țierea chirală a
unor compu și neutri dar și ionizați pozitiv sau negativ. Domeniul de pH recomandat
de producător este cuprins între 3,0 și 7,5; procentul maxim de modificator organic
utilizabil este de 50%, iar concentra ția maximă recomandată a tamponului de fosfat

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 83
este de 20 mM. La un pH < 4 faza sta ționară este ionizată pozitiv, la un pH între 4 și 4,6
aceasta este într -o formă neutră (punct izoelectric), iar la valori ale pH -ului de peste
4,6 suprafa ța fazei staționare este ionizată negativ.
Condițiile optime ale enantioseparării amestecului racemic de indapamidă
analizat s -au dovedit a fi următoarele: fază mobilă formată din 10% acetonitril și 90%
tampon fosfat (10 mM fosfat disodic ), pH = 3 ,1, eluție izocratică (debit 1 mL/min),
temperatura coloanei 20°C.Utilizând condi țiile optimizate am reușit o separare
eficientă cu o valoare Rs de 3,83 șiα1,28 într -un interval de timp de aproximativ 7
minute. Rezultatele sunt comparabile cu cele ob ținute prin EC.
Metoda HPLC propusă, datorită simplicită ții și a eficienței crescute, s -a dovedit a
fi ideală pentru separarea chirală a am estecului racemic de indapamid.
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Cârje AG. Ion V. Muntean DL. Hancu G. Balint A. Imre S. Enantioseparation of
indapamide by high performance liquid chromatography using ovomucoid glycoprotein
as chiral selector. Farmacia, 2016, 64(2), 181 -186, revistă indexată ISI ,FI: 1,348 [98].

84| Hancu Gabriel
1.6. Separarea chirală a sibutraminei prin EC
Sibutramin a(2-[1-(4-clorofenil) -ciclobutil] -3-metil-N,N-dimetil-propilamina)
(SIB), este un anorexigen oral care ac ționează prin inhib area recaptării serotoninei,
noradrenalinei și înmăsură mai mică a dopaminei, ducândlacreșterea concentrației
acestor neurotransmi țători în fanta sinaptică ,ceea ce duce la instalarea senza ției de
sațietate[99].Spre deosebire de al ți agenți anorexigeni ca și amfetamina, SIBnu
interferă cu elib erareaacestor neurotrasmi țători. Prezintă unmecanism dual de
acțiuneprin instalarea sa țietății cu reducerea consumului de alimente și instalarea
termogenezei cu cre șterea consumului de energie [100].
SIBeste o moleculă chirală, având o structură un atom de carbon asimetric, ceea
ce duce la existe nța a doi enantiomeri, R-SIBșiS-SIB(figura 1.6.1 ).
Figura 1.6.1. Structura chimică a sibutraminei (*marchează centrul chiral)
SIBeste utilizată în terapie sub formă de amestec racemic, de și s-au pus în
evidență diferențe în ceea ceprivește activita tea farmacologică a enan tiomerilor;
acțiunea anorexigenă a R-SIBfiindsuperioară celei a S-SIB.
SIBsuferă îm organism o metabolizare hepatică prin demetilare, rezultând doi
metaboli ți activi, mono -desmetilsibutramină (MDS) respect iv di-desmetilsibutramin ă
(DDS),metaboli ți cu timp de înjumătățire mai lung decât al SIB;ambii metaboli țiactivi
prezentândactivitate optică ( figura 1.6.2 ). Stereoselectivitatea ac țiunii farmacologice
aSIBse resfrânge și asupra metaboliților activi, enantiomerii Ra acestora având o
acțiune anorexigenă mai puternică decât enantiomerii S[101].

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 85
Figura 1.6.2. Metabolizarea sibutraminei (*marchează centrul chiral)
La dozezilnice de 10 -20 mg,SIBa fost considerat ăinițiala avea un profil bunde
siguranță; dar rezultatele st udiului SCOUT ( Sibutramine Cardiovascular and Diabetes
Outcome Study) ,un studiu clinic menit să evalueze raportul eficacitate/siguran ță la
administrarea SIBîn cazul populațiilorde risc, au demonstrat că administrarea pe
termen îndelungat a SIBa crescut în mod semnificativ riscul de infarct miocardic și
atac vascular cerebral la pacien ții cu antecedente cardiovasculare. S-a concluzionat că
beneficiie adus ede utilizarea SIBnu compensează riscurile induse pacien ților, prin
urmarela recomandarea EMA resp ectiv FDA aceasta a fost retrasă de pe pia ța UE
(2010)și SUA(2011)[102].
La ora actuală SIBmai este comercializată în unele țări din spațiul ex -sovietic,
Asia, America Centrală și de Sud. Un alt aspect ce trebuie luat în considerare ar fi
prezența ilicită aSIBîn diferite suplimente alimentare utilizate pentru slăbit [103].
Consultând literatura de specialitate am observat un număr relativ redus de
metode de analiză stereoselective ale SIB, majoritatea implicând utilizarea unor
tehnici HPLC.
Discrimina rea chirală a SIB prin EC a fost rezolvată prin utilizarea unui tampon
compusdin20 mM fosfat/10 mM citrat la un pH de 6,5 și o CD anionică CM -β-CD cași
selector chiral; tamponul compus din două componene a demonstrat rezultate
superioare fa ță de soluții le tampon individuale; metoda a fost aplicată pentru
determinarea SIB din forme farmaceutice [104].

86| Hancu Gabriel
Într-o altă publica ție, EC și rezonența magnetică nucleară (1H-NMR) a fost
utilizată pentru discriminarea chirală a enantiomerilor SIB. S -au observat corela ții
bune între rezultatele1H-NMRși cele obținute prinEC. Separarea chiralăprin EC a fost
rezolvată utilizând un tampon fosfat 50 mM la pH 3,0 și 10 mM M -β-CD cași selector
chiral[105].
Informațiile privind proprietățile stereoselective ale sibutramin ei respectiv
metodele enantioselective de determinare a enantiomerilor acesteia au fost publicate
în reviewul:
Vlad RA. Hancu G. (autor corespondent) Kelemen H. Ciurca D. Tero -Vescan A.
Analytical methodologies for the stereoselective determination of sibu tramine: an
overview, Acta Medica Marisiensis, 2017;63(2):52 -55[106].
Scopul nostru a fost dezvoltarea unei metode alternative simple șirapide pentru
separarea chirală a enantiomerilor SIButilizând un screening sistematic a unor CD ca
selectori chirali și optimizarea condițiilor electroforetice în scopul ob țineriiunei
rezoluții chirale ridicate și a unuitimpcât maiscurt de analiză.
Pentru această analiză electroforetică am avut la dispozi țiesubstanțede calitate
farmaceutică :amestecul racemic clorhidrat de R,S-sibutramină și enantiomerul optic
purR-sibutramină (Chemos GmbH, Germania ).
Ca și selectori chirali am utilizat următorii derivați de CD : CD naturale neutre ( α-
CD,β-CD,γ-CD), CD derivatizate neutre ( hidroxipropil -HP-β-CD,hidroxietil -β-CD–
HE–β-CD,β-CD metilată aleator –M-β-CD), CD derivatizate anionice ( carboximetil -β-
CD sare de sodiu -CM-β-CD,sulfobutil eter -β-CD sare de sodiu –SBE-β-CD). Toate CD
au fostachiziționatede la Cyclolab ( Budapesta, Ungaria) cu excepția SBE -β-CD–
Capsitol® (Cydex, SUA).
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD. Separările s -au efectuat pe un capilar de 30cm
lungime ( 22cm lungime efectivă) x 50 µm diametru (Agilent, Germania).
Electroferograme le au fost înregistrate și procesate cu ajutorul software -ului
Chemstation 7.01 (Agilent, Germania).
Soluția stoc de SIBau fost preparate prin dizolvarea substan ței în metanol într -o
concentra ție de 100 μg mL-1și apoi diluate înainte de utili zare cu acela și solvent la

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 87
concentra ția corespunzătoare. Probele au fost introduse în sistem prin injectare
hidrodinamică la capătul anodic al capilarului.
Capilarul a fost condi ționat înainte de utilizare cu NaOH 0,1 M, apă ultra -purăși
cu soluția de ele ctrolit timp de 30minuteși precondiționat timp de 1 minut cu NaOH
0,1 M, apă ultra -purăși soluția de electrolit înainte de fiecare determinare
electroforetică.
Condițiile electroforetice inițiale au fost următoarele :temperatura 20˚C,
tensiunea aplicată 25kV, presiune/ timp de injectare 50 mbar/1secundă, concentra ția
probelor 20μg mL-1, lungime de undă de detectare 220 nm.
Din punct de vedere structural SIB este o amină (pK a-8,5), în consecin ță aceasta
poate fi detectată la un pH acid, unde SIB este ionizată pozitiv. În analiza preliminară
am utilizat mai multe soluții tampon cu diferite compoziții la diferite valori de pH,
acoperind un interval larg de pH între 2 ,5și 12,0. pH-ul tamponului a fost ajustat cu
NaOH 1M sau cu H 3PO41M. pH-ul joacă un ro l esențial în analiza electroforetică,
deoarece atât mobilitatea electroforetică cât și FEO sunt pH dependente .S-a reușit
detectarea sibutraminei pe un interval de pH cuprins între 2 ,5și 7,0,la o valoare a pH –
ului de peste 7 nu am observat semnalul electroforetic al analitului .
Am ales trei nivele de pH 3,0, 5,0 și 7,0 și am adăugat selectorul chiral soluțiilor
tampon, în concentra ții de 10 mM în cazul CD neutre și 5 mM în cazul CD ionizate. S -au
observat interac țiuni chirale în cazul utilizării HP-β-CDși M-β-CDla pH 3,0 și 5,0; și î n
cazul CM -β-CDla pH 7,0.
Cea mai bună rezolu ție în condițiile inițiale a fost observată cu CM -β-CD (Rs–
1,60), dar CM-β-CD este o CD derivatizată anionică, în care grupările carboxil sunt fost
protonate la un pH < 4, și disociate la un pH > 4, ceea ce va duce la o migrare
electroforetică opusă FEO la pH 7,0, aceasta duc ând la un timp lung de migrare (peste
10 minute). În schimb M -β-CD este o CD derivatizată neutră care nu prezintă
mobilitate electroforetică proprie, rezult ândastfeltimpi de migrare mai scur ți (sub 5
minute). De și CM-β-CD a prezentat o rezolu ție mairidicată în condi țiile inițiale ,M-β-
CDa fost ale asăcașiselector chiral optim în acest studiu datorită timpului maiscurt
de analiză și datorită obținerii u nui raport mai bun al raportului semnal/zgomot
(S/N).

88| Hancu Gabriel
Am urmărit influen ța diferiților parametrii electroforetici asupra separării
chirale: concentra ția soluției de electrolit, concentrația selectorului chiral,
temperatura, voltajul, parametrii de injectar e. Optimizarea metodei a fost efectuată
într-o manieră univariată.
Separarea chirală a enantiomerilor SIB a fost puternic influen țată de pH –ul
soluției tampon, tipul și concentrația CD utilizate ca și selector chiral cât și de
temperatura sistemului. Concentrația CD și pH -ul soluției tampon au avut un efect
neunifom asupra separării chirale; Rsa crescut odată cu cre șterea concentrației de CD
până la concentra ția optimă, iarapoi a scăzut .
Condițiile optime pentru separarea celor doi enantiomeri ai SIB s -au dovedit a fi:
tampon fosfat 50 mM, pH -4.5, 10 mM M-β-CDselector chiral, voltaj + 20 kV,
temperatură 20șC, parametrii de injectare 50 mbar/ 1 secundă. Utilizând condi țiile
optimizate am reușit separarea pe linia de bază a celor doi enantiomeri, într -un
interval de timp de sub 5 minute, cu o Rs de 1,80 șiα1,05(figura 1.6.3 ). Ordinea de
migrare a enantiomerilor a fost stabilită prin metoda adaosului , aceasta fiind S-SIB
urmată de R-SIB.
Figura 1. 6.3.Separarea chirală a enantiomerilor sibutraminei în condi ții optimizate
(condiții electroforetice: 50 mM fosfat, 10mMM-β-CD, pH 4,50, +20 kV, 20 °C, 50
mbar/1 sec, 220nm)
Metoda elaborată a fost evaluată prin verificarea performan țelor analitice ale
acesteia pe baza preciziei (pentru timpii de migrare, ariei și înălțimii peakurilor),

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 89
liniarității (trasarea curbelor de calibrare și calcularea ecuațiilor de regresie, respectiv
coeficien ților de corelație), limitelor de detecție și cuantifica re. LOD a fost 3,42 și 3,69
μg mL-1iar LOD afost de 11,40 și 12,30μg mL-1pentruS-SIB respectiv R-SIB.
Metoda dezvoltată de către noi este avantajoasă prin compara ție cu alte metode
enantioselective descrise în literatura de specialitate, deoarece este rapidă, necesită
un consum scăzut de analițiși reactivi și prin comparație cu metodele HPLC nu
necesită utilizarea de coloane chirale și cantități mari de solvenți ca și fază mobilă .
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în arti colul:
Hancu G. Hilochie A. Vlad R.A. Cârje A. Tero -Vescan A., Enantiomeric separation of
sibutramine by capillary zone electrophoresis. Journal of the Brazilian Chemical Society,
2016, 26(7): 1116 -1120,revistă indexată ISI, FI: 1,198 [107].

90| Hancu Gabriel
1.7. Separa rea chirală a amlodipinei prin EC
Amlodipina (acid3-etil 5-metil 2-[(2-aminoetoxi)metil]4(2 -clorofenil) -1,4-
dihidro-6-metil-3,5-piridindicarboxilic) (AML)este un inhibitor al canalelor lante de
calciu de tip dihidropiridinic, utilizat în tratamentul hip ertensiunii arteriale și a
anginei pectorale [108].
AML este o moleculă chirală, având o structură un atom de carbon asimetric,
ceea ce duce la existen ța a doi enantiomeri, R-AMLșiS-AML (figura 1.7.1 ).
Figura 1. 7.1.Structura chimică a amlodipinei (*marcheazăcentrul chiral)
AML este utilizată în terapie sub formă de amestec racemic, de și s-au pus în
evidență diferențe în ceea privește activitatea farmacologică a enantiomerilor;
acțiunea blocant ăal canalelor de calciu și prin urmare proprietățile vaso dilatatoare
fiind limitate la enantiomerul S-AML. Este utilizat în terapie sub formă de sare a
acidului benzen sulfonic (besilat) [109].
Consultând literatura de specialitate am observat un număr relativ ridicat de
metode de EC utilizate pentru separarea c hirală a enantiomerilor AML, utilizând CD ca
și selectori chirali. Discriminarea chirală a enantiomerilor AML a fost realizată
utilizând diverse CD, de la CD naturale –α–CD[110]la CD derivatizate neutre –HP-β-
CD[111]respectiv CD derivatizate anionic e-SBE-β-CD[112]sau HS-β-CD[113].
Scopul nostru a fost dezvoltarea unei metode alternative simple șirapide pentru
separarea chirală a enantiomerilor AMLutilizând un screening sistematic a unor CD ca
selectori chirali și optimizarea condițiilor electr oforetice în scopul ob țineriiunei
rezoluții chirale ridicate și a unuitimpcât maiscurt de analiză.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 91
Pentru această analiză electroforetică am avut la dispozi țieamestecul racemic
besilat de R,S-amlodipină și enantiomerul optic pur S -amlodipină (Moehs Pr oductos
Quimicos, Barcelona, Spania ); cași standard intern (IS)am utilizat un enantiomer
optic pur,S-propranolol ( Moehs Productos Quimicos, Barcelona, Spania );substanțele
au fost de calitate farmaceutică. Pentru analiza AML din forme farmaceutice am
utilizat comprimate de AML (Pfizer, SUA), con ținând 10 mg AML.
Ca și selectori chirali am utilizat următorii derivați de CD : CD naturale neutre ( α-
CD,β-CD,γ-CD), CD derivatizate neutre ( hidroxipropil -HP-β-CD, β-CD metilată
aleator–M-β-CD), CD derivatiz ate anionice ( carboximetil -β-CD sare de sodiu -CM-β-
CD,sulfobutil eter -β-CD sare de sodiu –SBE-β-CD). Toate CD au fost achiziționatede
la Cyclolab ( Budapesta, Ungaria) cu excepția SBE -β-CD–Capsitol® (Cydex, SUA).
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD. Separările s -au efectuat pe un capilar de 48cm
lungime ( 40cm lungime efectivă) x 50 µm diametru (Agilent, Germania).
Electroferograme le au fost înregistrate și procesate cu ajutoru l software -ului
Chemstation 7.01 (Agilent, Germania).
Soluția stoc de AMLau fost preparate prin dizolvarea substan ței în metanol într –
o concentra ție de 100 μg mL-1și apoi diluate înainte de utilizare cu același solvent la
concentra ția corespunzătoare. Pr obele au fost introduse în sistem prin injectare
hidrodinamică la capătul anodic al capilarului.
Capilarul a fost condi ționat înainte de utilizare cu NaOH 0,1 M, apă ultra -purăși
cu soluția de electrolit timp de 30minuteși precondiționat timp de 1 minut cu NaOH
0,1 M, apă ultra -purăși soluția de electrolit înainte de fiecare determinare
electroforetică.
Condițiile electroforetice inițiale au fost următoarele: temperatura 20 ˚C,
tensiunea aplicată 25 kV, presiune/ timpde injectare 50 mbar/ 3secunde, concentrația
probelor 10μg mL-1, lungime de undă de detectare 2 38nm.
AML este o amină primară cu o valoare pK ade 9,10,și poate fi detectată pe un
interval larg de pH, între 2,50 și 10. Determinările electroforetice inițiale au fost
efectuate la patru nivel e de pH: 2,5, 5,0, 7,0 și 9,0. Am observat că timpul de migrare a
AML scade cu cre șterea pH -ului,și că AML migrează mai rapid decât FEO la valori de

92| Hancu Gabriel
pH de peste 5,0. La un pH acid, AML este ionizată poziti v, dar într -un mediu alcalin,
mobilititatea electr oforetică proprie a acesteia scadedatorită deprotonării.
În continuare am adăugat selectori chirali solu ție tampon, în concentrație de 10
mM pentru CD neutre respectiv 5 mM pentru CD ionizate. S -au observat interac țiuni
chirale cu un număr mare de CD: α-CD, β-CD,HP-β-CDși M-β-CD pe un interval de pH
între 2,5 și 5,0;CM-β-CDșiSBE-β-CD pe un interval de pH între 7.0 -9.0.Ținând cont
de timpii de migrare și rezoluțiile obținute dar și de metodele publicate anterior în
literatura de specialitate, am ales să continuăm în dezvoltarea metodei cu M-β-CDla
un pH de 3,0.
Am urmărit influen ța diferiților parametrii electroforetici: concentrația soluției
tampon, concentra ția CD, voltajul aplicat, temperatura și a parametrilor de injectare
asupra rezolu ției chira le. Optimizarea metodei analitice a fost făcută într -o manieră
univariată.
Condițiile optime pentru separarea celor doi enantiomeri ai AMLs-au dovedit a
fi: tampon fosfat 50 mM, pH -3,0,20mMM-β-CDselector chiral, voltaj + 2 5kV,
temperatură 15șC, parametrii de injectare 50 mbar/1 secundă. Utilizând condi țiile
optimizate am reu șit separarea pe linia de bază a celor doi enantiomeri, într -un
interval de timp de sub 6 minute, cu o Rs de 2,48 șiα1,09 (figura 1. 7.2). Ordinea de
migrare a fost stabilită pr in metoda adaosului , fiindR-AML urmată de S-AML.
Metoda dezvoltată prin verificarea performan țelor analitice ale acesteia pe baza
preciziei (pentru timpii de migrare, ariei și înălțimii peakurilor), liniarității (trasarea
curbelor de calibrare și calcular ea ecuațiilor de regresie, respectiv coeficienților de
corelație),acurateței și s-au calculatlimitelede detecție șidecuantificare. LOD au fost
2,43și2,31μg mL-1iar LOQau fost de 8,24și7,88μg mL-1pentruR-AMLrespectiv S-
AML.
Metoda a fost apl icată pentru determinarea raportului enantiomeric al AML din
forme farmaceutice. Peakurile ob ținute au fost identice cu cele obținute din substanța
standard, fără interferen țe din partea excipienților. Rezultatele obținute au fost în
concordan ță cu cantită țile declarate de către producător.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 93
Figura 1. 7.2.Separarea chirală a enantiomerilor amlodipinei în condi ții optimizate
(condiții electroforetice: 50 mM fosfat, 20mMM-β-CD, pH 3,0, +25 kV, 15 °C, 50
mbar/1 sec, 238nm)
Metoda dezvoltată este simplă șirapidă, oferind o altăalternativă metodelor de
EC deja publicate pentru a ob ține rezoluția chirală a AML, și poate fi aplicată cu succes
în analiza chirală preliminară a AML.
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Hancu G.Budău M. K ántor L.K. C ârje A.Cyclodextrine screening for the chiral
separation of amlodipine enantiomers by capillary electrophoresis. Advanced
Pharmaceutical Bulletin, 2015, 5(1): 35 -40,revistă indexată ISI [115].

94| Hancu Gabriel
8. Separarea chirală a asenapi nei prin EC
Asenapina ((3aRS,12bRS) -5-cloro-2-metil-2,3,3a,12b -tetrahidro –
1Hdibenzo[2,3:6,7]oxepino[4,5 -c]pirol-(2Z)-2-butenedioat )este un antipsihotic atipic
dinclasa dibenzo -oxepino-pirolilor; acțiunea sa este caracterizată prin afinitatea
ridicată fa ță de diferitele subtipuri de receptori serotoninergici, norad renergici și
dopaminergici, fărăa aveaactivitate apreciabilă pe receptorii colinergici muscarinici
[115].
Asenapina este o moleculă chirală, având o structură doi atomi de carbon
asimetrici, p rezentând izomerie geometrică. Datorită afinită ții superioare față de
receptori, în terapie se utilizează izomerul trans,sub forma unui amestec racemic a l
enantiomerilor S,SșiR,R[116](figura 1. 8.1).
O
N
CH3H H
Figura 1.8.1 Structura chimic ă atrans-asenapinei
Consultând literatura de specialitate nu am găsit publicată nici o metodă care să
vizezerezoluția chirală a enantiomerilor asenapinei prin EC.
Scopul urmărit a fost dezvoltarea unei metode de separare chirală prin EC a
enantiomerilor asenapinei utilizând CD ca și selectori chirali. Pentru a determina
stoichiometria complec șilor asenapină –CDs-auutilizat tehn ici de spectroscopie RMN
și modelare moleculară ESI -MS.
Înaceastă analiză electroforetică am avut la dispozi țietrans-asenapină (Sigma
Aldrich, Germania) de calitate farmaceutică .
Ca și selectori chirali am utilizat următorii derivați de CD : CD naturale neutre ( α-
CD,β-CD,γ-CD), CD derivatizate neutre ( hidroxipropil α-CD-HP-α-CD hidroxipropil β –

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 95
CD-HP-β-CD,hidroxipropil γ-CD-HP-γ-CD, metilα-CD-M-α-CD, metilβ-CD-M-β-CD,
metilγ-CD-M-γ-CD), CD derivatizate anionice ( carboximetil -β-CD sare de sodiu -CM-
β-CD,sulfobutil -α-CD sare de sodiu –SB-α-CD,sulfobutil -β-CD sare de sodiu –SB-β-
CD,sulfobutil eter -γ-CD sare de sodiu –SB-γ-CD). Toate CD au fost achiziționatede la
Cyclolab ( Budapesta, Ungaria).
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD. Separările s -au efectuat pe un capilar de 48cm
lungime (40cm lungime efectivă) x 50 µm diametru (Agilent, Germania).
Electroferograme le au fost înregistrate și procesate cu ajutorul software -ului
Chemstation 7.01 (Agilent, Germania).
Soluțiilestoc de asenapină au fost preparate prin dizolvarea substan ței în
metanol într -o concentra ție de1mg mL-1și apoi diluate înainte de utilizare cu același
solvent la concentra ția corespunzătoare. Probele au fost introduse în sistem prin
injectare hidrodinamică la capătul anodic al capilarului.
Capilarul a fost condi ționat înainte de utilizare cu NaoH 1M timp de o oră iar mai
apoi cuNaOH 0,1 M, apă ultra -purăși cu soluția de electrolit timp de 30minuteși
precondi ționat timp de 2minutecu NaOH 0,1 M , apă ultra -purăși soluția de electrolit
înainte de fiecare determin are electroforetică.
În experimentele preliminare am utilizat tampon 50 mM de Tris -acetat la pH 4, 7,
temperatura capilarului 25 ° C. voltajul aplicat 25 kV, presiune/timp de injectare 50
mbar/3 sec unde, detectare UV la 215 nm. Pentru a stabili selectorul ch iral potrivit
pentru enantiosepararea asenapinei, s -au folosit o gamă largă de CD -uri la diferite
niveluri de concentra ție, variind concentra țiile CDde la 1 la 30 mM.
Pentru a separa cu succes enantiomerii unei substan țe, este necesară o diferență
în mobilitatea aparentă electroforetică a acestora [117]:
]CD[K1]CD[K
]CD[K1]CD[K
2stab2stab2cplx free
1stab1stab1cplx free
21   
unde,μ1șiμ2sunt mobilită țileelectroforetice primului și celui de -al doilea
enantiomer, respectiv K stab1șiKstab2sunt constantele aparente de stabilitate între
enantiomerii indi viduali și selectorul chiral, μfreeșiμcplxsunt mobilită țile

96| Hancu Gabriel
electroforetice aparente ale analițilorliberișiacomplecșilor, în timp ce [ CD] este
concentra ția selectorului selectorului chiral .
În cele mai multe cazuri, separarea chirală în EC rezultă din diferen țele dintre
constantele aparente de stabilitate ale enantiomerilor (K stab1≠ Kstab2). Cu toate acestea,
în EC, spre deosebire de tehnicile cromatografice, perechile de enantiomeri pot fi
rezolvate chiar și în absența selectivității intrinseci (K stab1= Kstab2), cu condi ția ca
mobilitățile complecșilor diastereomeric itranzitorii să fie diferite ( μcplx1≠μcplx2)[118].
Tabelul 1.8.1 rezumă rezultatele analizei preliminare, cu constante aparente de
stabilitate medii și valorile Rs cele mai ridicat e obținute la concentrația optimă de CD .
211][
stabstaboptKKCD
Tabelul 1.8.1. Constantele de stabilitate aparente ale complec șilor asenapină -CD
(Kstab1, Kstab2) pentruși rezoluția maximă (Rs) obținute la concentrația optimă de CD
CD DS Kstab1 Kstab2 Rs
α – 72 ± 5
β – 150± 3 186 ± 1 1.00
γ – 35 ± 1
HP-α 3 112 ± 11 141 ± 1 0.78
HP-β 3 91 ± 7 99 ± 9 0.66
6.3 158 ± 12
HP-γ 4.5 23 ± 4 27 ± 3 <0.20
M-α 11 167 ± 1
M-β 12 224 ± 4 229 ± 3 <0.20
M-γ 12 55 ± 1 59 ± 5 0.40
TM-β 21 63 ± 2 66 ± 2 0.44
CM-β 3 2327 ± 52 3092 ± 8 0.56
SB-α 4 321 ± 6 725 ± 30 0.47
SB-β 6.3 2778 ± 117
SB-γ 4 1497 ± 113 1512 ± 135 <0.20
Pentru aproape toate CD neutre, modelul de afinitate a urmat tendin țaβ-CD> α-
CD> γ-CD. S-au obținut complec și mai stabili pentru β -CDși derivații acesteia,
indicând faptul că acestea au dimensiunea corespunzătoare a cavită ții pentru a
încorpora molecula asenapinei. În cazul CD neutre, deriva ții hidroxipropilați au
prezentat constante de stabilitate similare ca CD naturale, în timp ce o creștere a
stabilității a fost observată în cazul CD metil substituite.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 97
Dintre deriva ții CD ionizabili, CD sulfobutilate sunt ionizate în totalitate la pH
4,75, în timp ce CM -β-CD este doar par țial ionizată. Deoarece asenapina este complet
protonată la a ceastă valoare a pH -ului, în afară legăturile la hidrogen, se poate
presupune că între selector și analit au loc și interacțiunile electrostatice. Aceste
ipoteze sunt subliniate de constantele stabilitate ridicate ale asenapinei cu aceste CD;
asenapina a f ormat cei mai stabili complec și cu CM-β-CDși SB-β-CD.
Deși cu niciuna dintre CD utilizate în timpul screeningulu inu am reu șit
separarea pe linia de bază a enantimerilor asenapinei în condi țiile preliminare, am
observat o clivare a peakului asenapinei pen tru 11 din cele 15 CD testate. Dintre
acestea, β -CD a prezentat cele mai promi țătoare rezultate, cu unRs maxim de peste 1
la concentra ția optimă (6 mM), astfel că ace astăCD a fost selectat ăca selector chiral
optim.
Pentru a optimiza separarea chirală a asenapinei, am utilizat un design
experimental, o matrice ortogonală L18 (63), unde 18 reprezintă numărul total de
experimente care rezultă din varia ția a 6 factori experimentali la 3 nivele diferite.
Factorii selecta ți pentru optimizare au fost următorii: concentrația soluției tampon
(160, 180, 200 mM), pH-ul soluției tampon (3,5, 4,0, 4,5), concentra ția CD (5, 6, 7 mM),
temperatura (15, 20, 25 ° C), tensiunea aplicată (10, 15, 20 kV), concentra ția aditivului
organic–metanol (0, 10, 20%) ( tabel 1.8.2 ).
Rezultatele designului experimental au arătat că metanolul, are un efect negativ
asupra separării chirale, deci ar trebui evitat. Ordinea influen ței variabilelor asupra
separării chirale fost după cum urmează: pH -ul soluției tampon, temperatura
capilarului, concentra ția soluției tampon, tensiunea aplicată și concentrația CD.
Pe baza rezultatelor designului experimental, condi țiile optime de separare
constau în utilizarea unui tampon 160 mM TRIS -acetat, la pH = 3,5, 7 mM β -CD cași
selector chiral, temperatura 15 °C, voltaj 20 kV. Adoptând aceste condi ții, s-a obținut
separarea enantiomerică asenapinei într-un interval de timp de aproximativ 18
minute, cu o valoare Rs de 2,40 ( figura 1.8.2 ).

98| Hancu Gabriel
Tabel 1.8.2 Designul experimental ortogonal utilizatpentru optimiza rea metodei
electroforetice de discriminare chirală a asenapinei
Experiment Conc.
soluției
tampon
[mM]pH-ul
soluției
tamponConc.
CD
[mM]Voltaj
[kV]Temperatură
[0C]Conc.
metanol
[%]Rs
1 160 3.5 510 15 01.87
2 180 4.5 615 15 10 1.44
3 200 5.5 720 15 20 0.74
4 180 5.5 510 20 10 1.16
5 200 3.5 615 20 20 1.10
6 160 4.5 720 20 0 1.98
7 200 4.5 610 25 0 1.72
8 160 5.5 715 25 10 1.30
9 180 3.5 520 25 20 0.70
10 180 4.5 710 15 20 0.64
11 200 5.5 515 15 0 1.81
12 160 3.5 620 15 10 1.78
13 160 5.5 610 20 20 0.63
14 180 3.5 715 20 0 2.21
15 200 4.5 520 20 10 1.32
16 200 3.5 710 25 10 1.34
17 160 4.5 515 25 20 0.84
18 180 5.5 620 25 0 0.78
Q1 1.39 1.50 1.28 1.23 1.38 1.73
Q2 1.16 1.32 1.24 1.45 1.40 1.39
Q3 1.34 1.07 1.37 1.22 1.11 0.78
R 0.24 0.43 0.13 0.23 0.29 0.95
Q1–Q3: valoarea rezolu ției medii pentru fiecare nivel de variabile (Q1 –nivel scăzut;
Q2–nivel mediu; Q3 –nivel ridicat), R: interval de valori, diferen ța între valoarea
maximăși valoarea minimă pentr u cele trei nivele testate pe ntru fiecare parametru în
parte
Figura 1.8.2. Separarea chirală a enantiomerilor asenapinei în condi ții optimizate
(condiții electroforetice: 160 mM TRIS -acetat,7mM β-CD, pH 3,5, +20kV, 15°C, 50
mbar/1 sec, 2 15nm)

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 99
Metodadezvoltată a fost evaluată prin verificarea performan țelor analitice ale
acesteia pe baza preciziei (pentru timpii de migrare șiariei peakurilor), liniarită ții
(trasarea curbelor de calibrare și calcularea ecuațiilor de regresie, respectiv
coeficien țilorde corela ție), acurateței și s -au calculat LODși deLOQ.Sensibilitatea
metodei a fost evaluată prin diluarea secven țială a soluțiilor de probă. Concentrația de
asenapină racemică de 2 μg mL-1a dat un răspuns semnal -zgomot de 10: 1 (LOD), în
timp ce conc entrația LOQ de 5 μg mL-1a dat un răspuns semnal -zgomot de 3: 1 (LOQ).
În acest studiu c aracterizarea complexării asenapină -CDși separarea chirală
ulterioară a enantiomerilor ASN prin ECa fost realizată pentru prima dată, folosind o
combinație inovatoar e de tehnici analitice complementare.
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
SzabóZI. Tóth G. Völgyi G. Komjáti B. Hancu G. Szente L. Sohajda T. Béni S. Muntean
DL. Noszál B., Chiral separation of asenapine enantiome rs by capillary electrophoresis
applying different cyclodextrin derivatives and characterization of cyclodextrin
complexes by NMR spectroscopy and mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, 2016, 117, 398 -404, revistă indexată IS I, FI:3,255 [119].

100| Hancu Gabriel
9. Captisolul ca selector chiral în EC
Captisolul este o β-CD polianionică derivatizată cu o sare sulfonată de sodiu;
prezintă în structură șase saușapte grupări sulfobutiler în moleculă (DS–7)(figura
1.9.1).Se utilizează în tehnol ogia farmaceutică, pentru îmbunătă țirea solubilității,
stabilității și administrării unor substanțe farmaceutice; fiind preparat la scară
industrială oferă avantajul unui pre ț mai accesibil prin comparație cu alte CD ionizate
utilizabilecașiselectori ch irali în EC [120].
Datorită pK ascăzut a grupările sulfonice acide, se poate ioniza negativ pe un
interval larg de pH, având un poten țial ridicat de interacțiuni ionice cu analiți ionizați
pozitiv[121].
Figura 1.9.1. Structura chimică a Captisolului
Studiul nostru a vizat verificarea poten țialului Captisolului ca și selector chiral
în EC; pentru aceasta am ales 9substanțe chirale model. Acestea au fost alese pe baza
caracteristicilor structurale și stereoselective particulare: β-blocante (carvedilol,
propranolol, sotalol), antihistaminice H1 (cetirizina , prometazina ),antidepresive ISRS
(fluoxetina), blocante ale canalelor de Ca (amlodipina), diuretice “thiazide -like”
(indapamida), analgezice opioide (tramadol) (figura 1.9.2 ).

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 101
Figura 1.9.2. Structura substanțelor model utilizate
Toate moleculele model au avutcaracter bazic, cu excep ția cetirizinei care este
un zwitterion. Am lucrat la 4 nivele de pH: 2,5, 5,0, 7,0 și 9,0, utilizând un tampon
fosfat de 25 mM. Pentru compara ție am utilizat și două CD n eutre:β-CDși HP-β-CD.
CD au fost adăugate solu ției tampon; am utilizat concentrații inițiale de 10 mM pentru
CD neutre și 5 mM pentru SBE -β-CD. În cazul identificării unor interac țiuni chirale am
crescut cantitatea de CD încercând să ob ținem o îmbunătăț ire a rezolu ției chirale.
Condițiile electroforetice au fost următoarele: 25 mM tampon fosfat, voltaj 25 kV,
temperatură 150C, presiune/timp de injectare 50 mbar/3 sec unde, detectare UV 210
nm, concentra ția analiților 25 μg mL-1.

102| Hancu Gabriel
Rezultatele ob ținute sunt sumarizate în tabelul 1.9.1 .
Tabel 1.9.1. Rezultatele separării substan țelor model
Analit Selector
chiralConcentra ția
CD [mM]pH t1
(min)t2
(min)Rsα
Amlodipina β-CD 15 2.506.30`6.450.861.02
HP-β-CD 20 2.504.504.902.171.08
SBE-β-CD 5 7.0011.4012.302.791.08
Carvedilol β-CD 10 2.5011.0011.502.741.04
HP-β-CD 20 2.5012.9013.502.541.04
SBE-β-CD 5 9.305.806.201.931.05
Cetirizina β-CD – ––
HP-β-CD – ––
SBE-β-CD 5 7.006.407.002.541.08
Fluoxetina β-CD – ––
HP-β-CD – ––
SBE-β-CD 5 9,306.206.300.551.01
Indapamida β-CD – ––
HP-β-CD – ––
SBE-β-CD 5 7.005.706.304.301.10
Prometazina β-CD 10 2.5010.5010.700.881.02
HP-β-CD – ––
SBE-β-CD 5 7.009.7010.101.551.04
Propranolol β-CD 10 2.509.409.801.131.04
HP-β-CD 10 2.5011.0011.501.461.04
SBE-β-CD 5 9.304.805.001.231.04
Sotalol β-CD – ––
HP-β-CD 20 2.509.309.700.931.03
SBE-β-CD 5 9.304.204.451.531.05
Tramadol β-CD – ––
HP-β-CD – ––
SBE-β-CD 5 9.303.954.201.521.06
Am observat interac țiuni chirale ale Captisolului cu toate cele nouă substanțe
optic active, opt dintre ele au prezentat R speste 1, iar în cazul fluoxetinei am observat
doar o mică spli tare a peakului. Rezultatele ob ținute în cazul utilizării Captisolului au

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 103
fost superioare celor ob ținute cu β-CDși HP-β-CD la pH neutru și bazic, în ceea ce
privește timpii de migrare și rezoluția chirală.
La un pH puternic acid, Captisolul va migra către anod în timp ce enantiomerii
substanțelor bazice migrează către catod, efectul FEO fiind neglijabil; toate acestea vor
duce timp lung de migrare a anali ților. Magnitudinea modestă a FEO nu poate
compensa mobilitatea electroforetică negativă a CD ionizate, care astfel v or
interacționa puternic cu substanțele bazice, întârziind astfel deplasarea acestora către
catod.
Captisolul s -a dovedit a fi eficient ca și selector chiral la valori de pH peste 5,0;
dat fiindcă la un pH neutru sau bazic sunt favorizate int eracțiunile ionice între CD
anionică și analiți ionizați pozitivi; complexul CD -analit fiind transportat către anod.
Captisolul cre ște diferențele dintre mobilitatea electroforetică a complecșilor
enantiomer -CD, datorită poten țialului ridicat de a genera i nteracțiuni electrostatice
care stabilizează complec șii formați cu analiții ionizați pozitiv. Grupările sulfonice ale
CD, fac ca această CD anionică să fie ionizată pe întreg intervalul de pH accesibil
experimentelor de EC; separarea bazându -se atât pe int eracțiunileioniceanalit-CD cât
și pe procesul de incluziune a analitului în cavitatea hidrofobă a CD.
Captisolul poate fi utilizat cu succes la separarea chirală a unei mari varietă ți de
substanțe optic active, demonstrând o putere de rezoluție chirală p uternică, în special
către medicamente neutre și bazice.
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul :
Budău M. Hancu G. (autor corespondent) Szabó ZI. Kelemen H. Rusu A. Muntean DL.
Cârje AG. Captisol® as chiral selector in capillary electrophoresis of non -acidic drugs.
Journal of the Chilean Chemical Society, 2017, 62(3):3566 -3571,revistă indexată ISI ,
FI: 0,422 (2016) [122].

104| Hancu Gabriel
2. Aplica ții ale EC în determinarea substan țelor
medicamentoase din combina ții fixe
2.1. Determ inareaprin EC a unor substa nțe farmaceutice din
combina ții fixeutilizate în medica ția cardio -vasculară
Tendințele recente întratamentul hipertensiunii arteriale (HTA) vizează
reducerea eficientă a TAprin utilizarea a două sau mai multe medicamente
antihipertensive. Medicamentele antihipertensive din clasele d iferite pot fi combinate
dacăse pretează unor deziderate după cum urmează :au mecanisme de ac țiune
diferite dar complementare; există dovezi că efectul antihipertensiv al combina ției
este mai efic ient decât cel al fiecărui component; combina ția poate avea un profil de
toleranțăfavorabil mecanismele complementare de ac țiune ale componentelor
diminuând efectele secundare individuale [123].
Înfigura 2.1.1. sunt eviden țiate clasele de antihipertensiv e ce s-au dovedit a fi
eficiente în combina ții fixe, iar cu linie continuă sunt reprezentate combinațiile
recomandate dintre acestea. Ghidurile dinultimii ani elimină însăβblocantele din
combinațiile fixe recomandate de antihipertensive [124].
Figura2.1.1.Combina ții recomandatede agenți antihipertensivi
Combina țiile fixe aduc multiple beneficii în patologiile cardiovasculare, printre
care amintim :creșterea complianței pacientului latratamentul antihipertensiv (două
pastile devin doar una), elimin area unor reac ții adverse și blocarea simultană a mai

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 105
multor verigi patogenice ale HTA–făcând astfel posibilă combinarea efectelor
sinergice/aditive ale mai multor medicamente antihipertensive.
Datorită prevalen ței deosebite a combina țiilor fixe în ter apia modernă este de
actualitate majoră elaborarea unor metode de determinare simultană a substan țelor
medicamentoase ce intră în compozi ția medicamentelor de acest tip.
Combina țiile dintre medicamentele ce interferă cu sistemul renină –
angiotensină -aldostero n (inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei –IECAși
antagoniștii receptorilor de angiotensinei II –ARAT)și diuretice tiazidice
(hidroclorotiazida) saublocante canalelor de calciu (amlodipina) sunt printre cele mai
utilizate în terapie în conte xtul efectului sinergic al acestorîn tratamentul HTA.
Una dintre aceste combina ții este cea dintre unblocantalcanalelor de calciu
amlodipin a(AML)șiunARATtelmisartan (TEL)[125]. Structurile chimice ale
amlodipinei ( RS-3-etil 5-metil 2-[(2-aminoeto xi)metil]-4-(2-clorofenil) -6-metil-1,4-
dihidropiridin -3,5-dicarboxilat) și telmisartanului (acid 2 -(4-{[4-metil-6-(1-metil-1H-
1,3-benzodiazolil) -2-propil-1H-1,3-benzodiazolil]metil}fenil )benzoic) sunt prezentate
înfigura 2.1. 2.
Figura 2.1. 2.Structura ch imică aAMLșiTEL
Examinând literatura de specialitate am observat că nu s-a publicat anterior nici
o metodă de EC pentru determinarea simultană a AML și TEL din forme farmaceutice
combinate .Scopul urmărit a fost dezvoltarea unei metode de EC simple șirapide
pentru determinarea AML și TEL din combinații fixe.

106| Hancu Gabriel
În studiu am utilizat substan țe de calitate farmaceutică: amlodipin abesilat
(Orex Pvt. Ltd, India) și telmisartan ( RA ChemPharma L td.,Hyderabad, India). Pentru
determinarea din forme farmaceutice amutilizatcomprimate de Twynsta ( Boehringer
Ingelheim, Germania), con ținând un raport TEL/AML de 40/5 respectiv 80/10 mg.
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD; electroferograme le aufost înregistrate și
procesate cu ajutorul software ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările s –
au efectuat pe un capilar de 48 cm lungime (40 cm lungime efectivă) x 50 µm diametru
(Agilent, Germania).
Soluțiastocde AML a fost preparată prin dizolvarea substan ței în metanol, în
timp ce solu ția stoc de TEL a fost preparată prin dizolvarea a 10 mg TEL într -un 1 mL
de HCl 0,1M și apoi diluare până la 10 mL cu metanol; ambele substanțe au fost
preparate în concentra ție de 1 mg mL-1și apoi diluate înainte de utilizare cu metanol
la concentra ția corespunzătoare. Probele au fost introduse în sistem prin injectare
hidrodinamică la capătul anodic al capilarului.
Capilarul a fost condi ționat înainte de utilizare cu NaOH 0,1 M, apă ultra -purăși
cu soluția de electrolit timp de 30 minute și precondiționat timp de 1 minut cu NaOH
0,1 M, apă ultra -purăși soluția de electrolit înainte de fiecare determinare
electroforetică.
Condițiile electroforetice inițiale au fost următoarele: temperatura 20 ˚C,
tensiunea aplicată 20 kV, presiunea /timp de injectare 50 mbar /3 secunde,
concentra ția probelor 25 μg mL-1, lungime de undă de detectare 2 10 nm.
AML este o bază slabă cu o valoare pK ade 8,7, prezentând în structură o grupare
ionizabilă amino ( -NH2), în timp ce TEL este un acid slab cu o valoare pK ade 3,5
prezentând în structură o grupare ionizabilă carboxil (-COOH).Pentru stabilirea pH –
ului optim determinării electroforetice au fost testate solu ții tampon cu diverse
compoziții la diferite valori de pH (2, 5-11,0).Cei doi anali ți pot fi determinați simultan
pe intervalul de pH 3,5 -8,0; cea mai bună corela ție între timpii de migrare, rezoluție și
forma peakurilor ob ținând-o la utilizarea unui tampon fosfat cupH 4,50.
Condițiile electroforetice: concentrația soluției tampon, temperatura sistemului,
voltajul aplicat, parametrii de injectare au fost optimizate într -o manieră univariată ,

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 107
urmărind influen ța parametrilor electroforetici asupra rezoluției și a timpilor de
migrare.
Cele mai bune rezultate le -am obținut la ut ilizarea următoarelor condi ții
analitice: tampon fosfat 50 mM, pH 4,50, temperatura 25˚C, voltaj 25 kV,
presiune /timp de injectare 50 mbar /2 secunde. Utlizând condi țiile optimizate am
reușit în separarea celor doi analiți în aproximativ 3 minute cu o R sde4,90șiα1,09
(figura 2.1. 3).
Figura 2.1. 3.Separarea simultană a AML șI TEL prin ECZ în condiții optimizate
(condiții electroforetice: 50 mM fosfat ,pH 4,5, +25kV,25°C, 50 mbar/ 2sec, 210nm)
Performan țele analitice ale metodei optimizate au fost ev aluate din punct de
vedere a preciziei, linearită ții și reproductibilității ,și s-au calculat LOD și LOQ (tabel
2.1.1)
Tabel 2.1.1. Performan țele analitice ale metodei (liniaritate, sensibilitate)
Analit Ecuația de
regresieCoeficient de
corelațieLOD
(μgmL-1)LOQ
(μg mL-1)
AML y = 0.318x + 10.39 0.9916 0.66 2.18
TEL y = 0.166x + 4.714 0.9907 1.14 3.42
Metoda a fost aplicată pentru determinarea simultană a celor două substan țe
din forme farmaceutice ( tabel 2.1.2 ). Rezultatele ob ținute au fost în concor danță cu
cantitățile declarate de către producător.

108| Hancu Gabriel
Tabel 2.1.2. Determinarea simultană a AML și TEL din forme farmaceutice
Preparat
farmaceuticCantitate declarată
(mg)Cantitate găsită
(mg)RSD (%)
AML TEL AML TEL AML TEL
Twynsta 40/5 5 40 4.90 40.80 0.56 0.68
Twynsta 80/10 10 80 9.80 80.95 0.67 0.85
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Modroiu A. Hancu G. (autor corespondent) Vlad RA. Stăcescu Ș. Soare R. Kelemen H.
Simultaneous determination of amlodipine a nd telmisartan from pharmaceutical
products by capillary electrophoresis , Current Issues in Pharmacy and Medical
Sciences. 2016. 29(1): 42 -45, articol indexat ISI [126].
O altă astfel de combina ție larg utilizată în terapie este cea dintre un ARAT,
telmisartan(TEL)și un diuretic tiazidic, hidroclorotiazida (HCT)[127]. Structurile
chimice ale hidroclorotiazidei ( 6-cloro-1,1-dioxo-3,4-dihidro-2H-1,2,4-benzotiazidin –
7-sulfonamid a)și telmisartanului (acid 2 -(4-{[4-metil-6-(1-metil-1H-1,3-
benzodiazolil) -2-propil-1H-1,3-benzodiazolil]metil}fenil)benzoic) sunt prezentate în
figura 2.1. 4.
Figura 2.1. 4. Structura chimică a HCT și TEL
În literatura de specialitate am găsit o singură metodă EC pentru determinarea
simultană a HCT șiașase derivați ARA ( candesar tan, eprosartan, irbesartan, losartan,

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 109
telmisartan, valsartan) [128].Scopul urmărit a fost dezvoltarea unei metode de EC
simpleși rapide pentru determinarea AML și TEL din combinații fixe.
În studiu am utilizat substan țe de calitate farmaceutică: hidrocl orotiazida și
telmisartan ( RA ChemPharma Limited, Hyderabad, India). Pentru determinarea din
forme farmaceutice am folosit comprimate de Micardis Plus (Boehringer Ingelheim,
Germania) , conținând un raport TEL/HCT de 80/25 mg.
Determinările au fost efectuat e pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD; electroferograme le au fost înregistrate și
procesate cu ajutorul software -ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-au efectuat pe un capilar de 38cm lungime ( 30cm lungime efectivă) x 50 µm
diametru (Agilent, Germania).
SoluțiastocdeHCTa fost preparată prin dizolvarea substan ței în metanol, în
timp ce solu ția stoc de TEL a fost preparată prin dizolvarea a 10 mg TEL într -un 1 mL
de HCl 0,1M și apoi dilu are până la 10 mL cu metanol; ambele substan țe au fost
preparate în concentra ție de 1 mg mL-1și apoi diluate înainte de utilizare cu metanol
la concentra ția corespunzătoare. Probele au fost introduse în sistem prin injectare
hidrodinamică la capătul anodic al cap ilarului.
Capilarul a fost condi ționat înainte de utilizare cu NaOH 0,1 M timp de 60
minute, apă ultra -purăși cu soluția de electrolit timp de 30minuteși precondiționat
cu NaOH 0,1 M , apă ultra -purăși soluția de electrolit timp de 1 minut înainte de
fiecare determinare electroforetică.
Am studiat comportamentul electroforetic al anali țilorutilizând tampoane fosfat
cu diferite compozi ții și valori de pH peun interval de pH între 2,5 –11,0.TEL este un
acid slab având o valoare pKade 3,50ionizându -seîn mediu bazic ;iarHCT este un
compusslabbazicavândo valoare pKade 7,90șiva fi ionizat într -un mediu acid .
Ambele substan țe pot fi determinate simultan printr-o tehnică ECZ, pe un
interval de pH cuprins între 2,50 și 4,50, dar cele mai bune rezult ate au fost ob ținute
folosind un pH de 2,50; la acest pH ob ținându-se cea mai bună corela ție între timpii de
migrare, rezolu ție și forma peakurilor.
Am dezvoltat și o metodă ECM, prin adăugarea în soluția tampon borat a unei
substanțe tensioactive anionice (DSS);; ambii anali ți pot fi determinați prin ECM într –

110| Hancu Gabriel
un interval de pH cuprins între 9,0 și 11,0, cele mai bune rezultate fiind ob ținute la un
pH de 9.50.
Optimizarea celor două metode (ECZ și ECM) propuse a fost efectuată într -o
manieră univariată ;s-a urmărit infl uența concentrației soluție tampon, pH -ului
soluției tampon, temperaturii, voltajului aplicat și parametrilor de injectare asupra
rezoluției separării și atimpilor de migrare .
Condițiile de separare optime pentru determinarea simultană a HCTși TEL prin
ECZ au fost următoarele : tampon fosfat 50 mM, pH 2,50, tensiune a plicată + 25 kV,
temperatură 25 °C,parametri de injectare 50 mbar/ 1 secundă,lungimea de undă de
detectare 230 nm. Utilizând condi ții optimizate, am ob ținut separarea celor doi a naliți,
în aproximativ 3 minute, ordinea migrării fiind ,TEL urmată de HCT (figura2.1.5)
Figura 2.1. 5.Separarea simultană a HCT și TEL prin ECZ în condiții optimizate
(condiții electroforetice: 50 mM fosfat ,pH 2,5, +25kV,25°C, 50 mbar/ 1sec, 230nm)
În ECZ, la un pH acid, ambii anali ți suntionizațipozitiv, iar ordinea migrării
poate fi explicată prin diferen țele dintre mobilitățile electroforetice proprii ale
analiților.
În cazul metodei ECMcondițiile de separare optime pentru determinarea
simultană aHCTși TELau fosturmătoarele : tampon borat 25 mM, 25 mM DSS, pH
9,50, tensiune apl icată + 25 kV, temperatură 25 ° C, parametri de injectare 50 mbar/1
secundă, lungime de undă de detectare UV 230 nm . Utilizând condi țiileoptimizat e, am

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 111
obținut separa rea celor doi anali ți, în aproximativ 3 minute, dar ordinea migrării a fost
modificată ,HCTfiindurmată de TEL (figura 2.1. 6).
Figura 2.1. 6.Separarea simultană a HCT și TEL prin ECM în condiții optimizate
(condiții electroforetice: 25 mM borat ,25 mM S DS, pH 9,5 , +25kV,25°C, 50 mbar/ 1
sec, 230nm)
În ECM, ambele substan țe sunt ioniza tenegativși migrează după FEO; ordinea
migrării depinzând de distribu ția celor doi analiti între faza micelară și faza apoasă .
Performan țele analitice ale metodelor au fost evaluate în ceea ce prive ște
precizia, liniaritatea, acuratețeași robustețea și s-au calculat LOD și LOQ (tabel 2.1.3 ).
Tabel 2.1.3. Valorile LOD și LOQ al metodelor elaborate
Analiți ECZ ECM
LOD(mgmL-1)LOQ(mgmL-1)LOD(mgmL-1)LOQ(mgmL-1)
TEL 0.017 0.051 0.036 0.108
HCT 0.008 0.024 0.062 0.185
Metoda a fost aplicată pentru determinarea simultană a celor două substan țe
din forme farmaceutice ( tabel 2.1. 4). Rezultatele ob ținute au fost în concordanță cu
cantitățile declarate de către prod ucător.
Tabel 2.1.4. Determinarea simultană a HCT și TEL din forme farmaceutice
Metoda Cantitate declarată (mg) Cantitate găsită (mg) RSD (%)
TEL HCT TEL HCT TEL HCT
ECZ 80 25 79.2 23.9 0.45 0.67
ECM 80 25 79.4 24.2 0.75 0.82

112| Hancu Gabriel
Ambele metode .ECZși ECM pot fi aplicate cu succes la determinarea calitativă și
cantitativă a compu șilor studiați dinformulări farmaceutice combinate .
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Stăcescu Ș.HancuG.(autor corespondent) GagyiL.SoareRM.Kelemen H.
Simultaneous determination ofhydrochlorthiazide andtelmisartan from
pharmaceutical preparations usingcapillary electrophoresis. StudiaChemiaUBB,2017,
LXII, 2, 189 -198, revistă indexată ISI, FI: 0,244 (2016) [129].
Hipertensiu neași dislipidemia sunt doi dintre cei mai frecvent întâlniți factori
de risc cardiovascular, care cauzează împreună o cre ștere a evenimentelor legate de
boala coronariană. Medicația antihipertensivă și hipolipemiantă reduce substanțial
riscul de boală co ronariană, accident vascular cerebral și deces la pacienții cu factori
de risc cardiovascular [130].
O combina țiede acest gen utilizată în terapia patologiilor cardiovasculare este
cea dintre un blocant al canalelor de calciu, amlodipina (AML)și un hipol ipemiant
inhibitor alHMG-CoA,atorvastatina (ATOR)[131].Combina ția cu doze fixe de AML și
ATOR gestionează simultan doi factori semnificativ de riscla pacien ții hipertensivi
care suferă de dislipidemii.
Structurile chimice ale amlodipinei ( RS-3-etil 5-metil 2-[(2-aminoetoxi)metil] -4-
(2-clorofenil) -6-metil-1,4-dihidropiridin -3,5-dicarboxilat) și atorvastatinei (acid
(3R,5R)-7-[2-(4-fluorofenil) -3-fenil-4-(fenilcarbamoil) -5-propan-2-pirolil]-3,5-
dihidroxiheptanoic) sunt prezentate în figura 2.1. 7.
Figura 2.1.7.Structura chimică a AML și ATOR

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 113
În literatura de specialitate am găsit o singură metodă EC pentru determinarea
simultană a AML și ATOR, metodă ce utilizează un tampon fosfat 25 mM și 20% aditiv
organic (metanol) la pH 6,50 [132]. Scopul urmărit a fost dezvoltarea unei metode de
EC simple și rapide pentru determinarea AML și ATOR din combinații fixe.
În studiu am utilizat substan țe de calitate farmaceutică: amlodipina besilat
(Fako Ilaclari, Istanbul, Turcia )șiatorvastatina sare de calciu (Morepen Laboratories,
New Delhi, India). Pentru determinarea din forme farmaceutice am folosit comprimate
de Caduet ( Pfizer, SUA), con ținând un raport AML/ATOR de 5/10 respectiv 10/10 mg.
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD; electroferograme le au fost înregistrate și
procesate cu ajutorul software -ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-au efectuat pe un capilar de 48 cm lungime ( 40 cm lungime efectivă) x 50 µm
diametru (Agile nt, Germania).
Soluțiile stoc de AMLși ATOR aufost preparat eprin dizolvarea substan țelorîn
metanol în concentra ție de 1 mg mL-1și apoi diluate înainte de utilizare cu metanol la
concentra ția corespunzătoare. Probele au fost introduse în sistem prin in jectare
hidrodinamică la capătul anodic al capilarului.
Capilarul a fost condi ționat înainte de utilizare cu NaOH 0,1 M, apă ultra -purăși
cu soluția de electrolit timp de 30 minute și precondiționat timp de 1 minut cu NaOH
0,1 M, apă ultra -purăși soluția de electrolit înainte de fiecare determinare
electroforetică.
Pentru a stabili condi țiile adecvate pentru determinarea simultană a AML și
ATOR, s-au efectuat o serie de experimente preliminare utilizând diferite compozi ții
tampon fosfat la diferite valori depH, pe un interval de pH între 2,5 -11,0.AML este un
compus bazic, având o valoare pK ade 9,1, în consecin ță înmediu acid (pH <5,0) este
ionizatpozitiv, dar pe măsură ce pH -ul devine alcalin, mobilitatea electroforetică
efectivăa acestuia scade, dat orită depr otonării. ATOR are o valoare pK ade 4,33și va fi
ionizat complet la un pH neutru sau alcalin.
Cei doi anali ți pot fi detectați simultan pe un interval de pH cuprins între 5,0 și
11,0. La un pH neutru AML a migrat înainte de FEO iar ATOR după FEO , în timp ce la
un pH bazic ambii anali ți au migrat după FEO. Ordinea migrării a fost AML urmată de

114| Hancu Gabriel
ATOR,ordinecare poate fi explicată prin diferen țele dintre mobilitățile electroforetice
proprii ale analitilor și influența FEO asupra separării. Am am alesuntamponfosfat la
pH 7,0,pentru a ob ține timpi de migrare mai rapizi.
Condițiile electroforetice: concentrația soluției tampon, temperatura sistemului,
voltajul aplicat, parametrii de injectare au fost optimizate într -o manieră univariată ,
urmărind i nfluența parametrilor electroforetici asupra rezoluției și a timpilor de
migrare.
Condițiile de separare optime pentru determinarea simultană a AML și ATOR
prin ECZ au fost următoarele: tampon fosfat 50 mM, pH 7,0, tensiune aplicată + 25 kV,
temperatură 25 °C,parametri de injectare 50 mbar/ 3secunde,lungimea de undă de
detectare 210 nm. Utilizând condi ții optimizate, am obț inut separarea celor doi anali ți,
în aproximativ 5 minute, ordinea migrării fiind: AML urmată de ATOR ( figura 2.1. 8)
Figura 2.1. 8.Separarea simultană a AML și ATOR prin ECZ în condiții optimizate
(condiții electroforetice: 50 mM fosfat ,pH 7,0, +25kV,25°C, 50 mbar/ 3sec, 210nm)
Performan țele analitice ale metodelor au fost evaluate în ceea ce privește
precizia, reproductibilitatea ,liniaritatea, acurate țea și robustețea și s -au calculat LOD
și LOQ (tabel 2.1.5 ).
Tabel 2.1.5 .Performan țele analitice ale metodei (liniaritate, sensibilitate)
Analit Ecuația de
regresieCoeficient de
corelațieLOD(μg mL-1)LOQ(μg mL-1)
AML y = 0.123x + 7,542 0.998 0.64 2.10
ATOR y = 0.042x + 1.419 0.997 0.47 1.53

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 115
Metoda a fost aplicată pentru determinarea simultană a celor două substan țe
din forme farmaceutice ( tabel 2.1. 6). Rezultatele ob ținute au fost în concordanță cu
cantitățile declarate de cătr e producător.
Tabel 2.1. 6.Determinarea simultană a AML și ATOR din forme farmaceutice
Preparat
farmaceuticCantitate declarată
(mg)Cantitate găsită
(mg)RSD (%)
AML ATOR AML ATOR AML ATOR
Caduet 10/5 5 10 4.90 9.84 0.86 0.72
Caduet 10/10 10 10 9.90 9.95 077 0.85
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Mircia E. Balaci T. Hancu G. Ion V. Cârje A. Simultaneous determination of amlodipine
and atorvastin by capillary electrophoresis from fixed pharmaceutical formula tions.
Farmacia, 2016, 64(3): 398 -402,revistă indexată ISI ,FI: 1,348 [133].
O altă combina ție utilizată în terapie pentru tratamentul dislipidemiilor este cea
dintre un inhibitor al HMG -CoAatorvastatina (ATOR)și un inhibitor al absorbției
colesterolul uiezetemib (EZE). Studiile clinice au demonstrat că c ombinarea acestor
două substan țe cu mecanisme de acțiune diferite duce la reduceri substanțiale ale
valorilor colesterolului LDL, cu influen ță favorabilă asupra colesterolului total [134].
Structurile c himice ale atorvastatinei (acid (3R,5R) -7-[2-(4-fluorofenil) -3-fenil-
4-(fenilcarbamoil) -5-propan-2-pirolil]-3,5-dihidroxiheptanoic) și ezetimibului
(3R,4S)-1-(4-fluorofenil) -3-[(3S)-3-(4-fluorofenil) -3-hidroxipropil] -4-(4-
hidroxifenil)azetidin -2-onă) sunt prezentate în figura 2.1. 9.
Figura 2.1. 9.. Structura chimică a ATOR și EZE

116| Hancu Gabriel
În literatura de specialitate am găsit o singură metodă EC pentru determinarea
simultană a ATORșiEZE, aceasta utilizând un tampon fosfat 25 mM și 30% aditiv
organic (metanol) la un pH 6,7 [135]. Scopul urmărit a fost dezvoltarea unei metode
de EC simple și rapide pentru determinarea ATORșiEZEdin combina ții fixe.
În studiu am utilizat substan țe de calitate farmaceutică: atorvastatina sare de
calciu(Morepen Laboratories, New Delhi, India) și ezetimib (MSN Laboratories Ltd.,
India).Pentru determinarea din forme farmaceutice am folosit comprimate de
Liptruzet ( Merck, Marea Britanie ), conținând un raport EZE/ATOR de 10/40 mg.
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD; electroferograme le au fost înregistrate și
procesate cu ajutorul software -ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-au efectuat pe un capilar de 48 cm lungime (40 cm lungime efectivă) x 50µm
diametru (Agilent, Germania).
Soluțiile stoc de ATORșiEZEau fost preparate prin dizolvarea substan țelor în
metanol în concentra ție de 1 mg mL-1și apoi diluate înainte de utilizare cu metanol la
concentra ția corespunzătoare. Probele au fost introd use în sistem prin injectare
hidrodinamică la capătul anodic al capilarului.
Capilarul a fost condi ționat înainte de utilizare cu NaOH 0,1 M, apă ultra -purăși
cu soluția de electrolit timp de 30 minute și precondiționat timp de 1 minut cu NaOH
0,1 M, apă ultra-purăși soluția de electrolit înainte de fiecare determinare
electroforetică.
Pentru a stabili condi țiile adecvate pentru determinarea simultană a ATORși
EZE, s-au efectuat o serie de experimente preliminare utilizâ nd diferite compozi ții
tampon la diferite valori depH, pe un interval de pH între 2,5 -11,0.ATOR are o
valoare pK ade 4,33și va fi ionizat comp let la un pH neutru sau alcalin, putând fi
determinată pe un interval de pH între 5,0 -11,0.EZE nu prezintă mobilitate
electroforetică proprie șiva fimigra împreună cu FEO, neputând fi determinată prin
tehnicaECZ.
Ținând cont de aceste aspecte, pentru separarea celor două substan țe am aplicat
o metodă ECM, prin adăugarea unui surfactant anionic, dodecilsulfat de sodiu ( DSS), la
soluția de electr olit.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 117
Optimizarea separării electroforetice s -a bazat pe studiul influen ței
concentra ției soluției tampon ,pH-ului solu ției tampon, concentra ției DSS,voltajului
aplicat,temperaturii sistemului , timpuluiși presiunii de injectare, asupra rezolu ției de
separareși a timpilor de migrare .
Cele mai bune rezultate pentru determinarea simultană a ATOR și EZE prin ECM
au fost următoarele: tampon 25mM borat, 25 mM DSS, pH 9,3, tensiune aplicată + 30
kV, temperatura sistemului 200C, presiune/timp de injectare 50 mb ar/1 secundă ,
detecție UV la 230 nm . Cei doi anali ți au fost separați în mai puțin de 2 minute, ordinea
de migrare a fost ATO Rurmat de EZE ; cu oRsde7,02șiαde 1,49(figura2.1.10).
Figura 2.1. 10.Separarea simultană a ATOR și EZE prin ECM în condiții optimizate
(condiții electroforetice: 25 mM borat ,25 mM DSS, pH 9,3, +30kV,20°C, 50 mbar/ 1
sec, 230nm)
Performan țele analitice ale metodelor au fost evaluate în ceea ce privește
precizia, reproductibilitatea, liniaritatea, acurate țea și robustețea și s -au calculat LOD
și LOQ (tabel 2.1.7 ).
Tabel 2.1. 7.Performan țele analitice ale metodei (liniaritate, sensibilitate)
Analit Ecuația de regresie Coeficient de
corelațieLOD
(μg mL-1)LOQ
(μg mL-1)
ATOR y = 0.8279x + 8.3137 0.996 0.27 0.89
EZE y = 0.9114x + 8.0645 0.998 1.29 4.31

118| Hancu Gabriel
Metoda a fost aplicată pentru determinarea simultană a celor două substan țe
din forme farmaceutice ( tabel 2.1. 8). Rezultatele ob ținute au fost în concordanță cu
cantitățile declarate de către producător.
Tabel 2.1.8. Determinarea simultană a ATORși EZE din forme farmaceutice
Preparat
farmaceuticCantitate declarată
(mg)Cantitate găsită
(mg)RSD (%)
ATOR EZE ATOREZE ATOREZE
Liptruzet 10/40 40 10 40.8 9.9 0.85 1.62
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articol ul:
Székely-Szentmiklósi B. Hancu G. Székely-Szentmiklósi I. Kovács B. Kelemen H.
Simultaneous determination of atorvastatin and ezetimibe from combined
pharmaceutical products by micellar electrokinetic capillary chromatography .Brazilian
Journal of Pharm aceutical Sciences, 2017, 53(1), 1 -6, revistă indexată ISI, FI: 0,474
(2016)[136].
Metodele de EC dezvoltate pentru determinarea simultană a două substan țe
medicamentoase din combina ții fixe prezentate în acest subcapitol prezintă avantajele
timpilor de analiză scur ți (sub 5 minute), simplității metodelor analitice, rezoluției
ridicatede separare și consumului scăzut de analiți și reactivi. Valorile LOD și LOQ
obținute demonstează aplicabilitatea metodelor pentru analiza compușilor studiați
din peparate f armaceutice tipizate de tip “combina ții fixe”.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 119
2.2. Determinarea prin ECși spectrofotometrie UV -VISa
amoxicilinei și acidului clavulanic din combinații fixe
Amoxicilina (acid (2S,5R,6R)-6-{[(2R)-2-amino-2-(4-hidroxifenil)-
acetil]amino}-3,3-dimetill-7-oxo-4-tia-1-azabiciclo[3.2.0]hepta n-24-carboxilic)(AMX)
este o penicilină semisintetică din clasa aminopenicil inelorcu un spectru
antibacterian larg,fiindutilizatăîntratareaunor infec țiicubacterii G ram+și Gram-.
Este unadintre ce le mai frecven t prescrise peniciline ,datorită absorb ției superioare la
administrare orală prin compara ție cu alte antibiotice β -lactamice .AMXeste
susceptibilă la degradare subacțiuneaβ-lactamaz elor; din acest motiv, este adesea
combinat cu acidul clavulanic, un inh ibitorde β-lactamază [137].
Acidul clavulanic (acid (2R,5R,S)-3-(2-hidroxietiliden) -7-oxo-4-oxa-1-aza-
biciclo[3.2.0]heptan -2-carboxilic) (CLA) este un derivat de oxopenam lipsit de restul
6-acilamino pe catena laterală, care prezintă activitate antibacter iană foarte slabă,
neutilizându -seca atare ca șiantibiotic. Se utilizează în combina ție cu antibiotice β-
lactamicepentru contracara rezistența la bacteriile secretoare de β-lactamază. CLA
poate fi descris ca un " inhibitor sinuciga ș", legând u-secovalent deun rest de serină
din structura β-lactamazei [137].
Structurile chimice ale AMX și CLA sunt prezentate în figura 2.2.1 .
Figura 2.2.1. Structurile chimice ale AMX și CLA

120| Hancu Gabriel
Combinarea acestor două substanțecrește eficiența tratamentului antibiotic
prinreducerea susceptibilită țiirezistențeila β-lactamază. Combina țiiledintre
trihidratuldeAMXși sarea de potasiu a CLA sunt disponibile în diferite forme de
administrare orală și injectabilă fiinddestinate tratamentului infec țiilor cutanate,
respirator iiși urinare cauzate de tulpini bacteriene producătoare de β-lactamaz e
[137].
În mod surprinzător, numai o singurămetodă de ECa fost raportată în literatur a
de specialitate pentru determinarea simultană a AMX și CLAdin forme farmaceutice;
Pajchelși colab. auelaborat un studiu comparativ a metodelor ECși LC pentru
determinarea simultană a AMX/CLAși ampicilinei/sulbactamului din formulări
farmaceutice cu utilizare injectabilă ; metoda EC Mutilizează un tamponcompusfosfat-
borat con ținând 14,4% dodecil sulfat de sodiu la pH 8,6 [138].
În studiu am utilizat substan țe de calitate farmaceutică: trihidrat de amoxicilin ă,
clavulanat de potasiu (Antibiotice Ia și, România) .Pentru determinarea din forme
farmaceutice am folosit comprimate de Augmentin (Glaxo We llcome, Marea Britanie )
625 mg, conținând un raport AMX/CLAde500/125mg.
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD; electroferograme le au fost înregistrate și
procesate cu ajutorul softwar e-ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-au efectuat pe un capilar scurtde28 cm lungime ( 20 cm lungime efectivă) x 50 µm
diametru (Agilent, Germania).
Soluțiile stoc de AML și ATOR au fost preparate prin dizolvarea substanțelor în
apăînconcentra ție de 1 mg mL-1și apoiau fostdiluate înainte de utilizare cu apăla
concentra ția corespunzătoare. Determinările electroforetice s-au efectuat cât mai
repede posibil după prepararea probelor , datorită instabilită țiiβ-lactamelor în solu ție
apoasă.Probele au fost introduse în sistem prin injectare hidrodinamică la capătul
anodic al capilarului.
Capilarul a fost condi ționat înainte de utilizare cu NaOH 0,1 M, apă ultra -purăși
cu soluția de electrolit timp de 30 minute și precondiționat timp de 1 minut cu NaOH
0,1 M, apă ultra -purăși soluția de electrolit înainte de fiecare determinare
electroforetică.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 121
În analiza preliminară am aplicat următoarele condiții electroforetice:
temperatura 20 ˚C, tensiu nea aplicată + 25 kV, presiunea/timp de injectare50 mbar/3
secunde, concentra ția probei 10 μg mL-1, lungimi de undă de detectare 210 nm și 230
nm.
Pentru separare am ales cea mai simplă tehnică electroforetică, ECZ, în care
separarea se bazează pe diferen țele între mobilitățile electroforetice proprii a le
analiților.
Un aspect important în alegerea condi țiilorelectroforetice optime este
repezentat de consultarea constantelor de ionizare și a caracteristicilor structurale ale
analiților. AMX are două valori pK a; 2,8 corespunzător grupării -COOHși 7,3
corespunzător substituentului -NH2;și, prin urmare, pot fi detectat atât în medi u acid,
câtși în medi u alcalin; în timp ce CLA prezintă o valoare pK a2,6 corespunzătoare
grupăriii-COOHși, în consecință, va ioniza numai într -un mediu alcalin. Prin urmare ,
pentru separarea simultană a AMX și CLA am ales un tampon bazicconținând
tetraborat de sodiu.
Scopul nostru a fost nu numai dezvoltarea unei metode eficiente de determinare
simultană a celor doi a naliți, cișiefectuarea unui studiu sistematic privind i nfluența
diferiților parametri ianaliticiși electroforetici asupra procesului de separare.
Eforturile s -au axat pe optimizarea condițiiloranalitice (concentra ția tamponului, pH –
ul tamponului ,adaosul unor modificatori ai tamponului )șia parametrilor
electroforetici (tensiunea aplicată, temperatura sistemului, parametrii de injectare ),în
vederea ob ținerii unei rezoluțiiridicateșia unortimpi de analiză s curți.
Utilizând o solu ție tampon conținând 25 mM tetraborat de sodiu, la un pH de
9,3, aplicând unvoltajde +25 kV la o temperatură de 25 ° C, am ob ținut separarea
simultană a celor doi anali țiîn mai pu țin de 2 minute, ordinea de separare fiind: AMX
urmat de CLA (figura 2.2.2 ).

122| Hancu Gabriel
Figura 2.2.2. Separarea simultană a AMX și CLA prin ECZ în condiții opt imizate
(condiții electroforetice: 25 mM borat ,pH 9,3, +25kV,25°C, 50 mbar/ 1sec, 230nm)
Deși stabilitatea antibioticelor β-lactamice în stare solidă este satisfăcătoare, în
soluție apoasă ele sunt hidrolizate lent la produși de degradare . Studiile no astre
preliminare utilizând un standard intern (clorhidrat de ciprofloxacină) au arătat că în
decurs de 24 de ore de la dizolvare, degradarea celor doi anali ți a fost nesimnificativă
(sub 5%).
Performan țeleanaliticealemetodei a ufost evaluat eînceea ce privește
reproductibilitate a, precizia, robuste țea, acuratețeași liniaritate ași s-au calculat LOD
și LOQ; utilizând condi țiile analitice optimizate anterior.
Ca standard intern (IS) am utilizat un derivat de fluorochinolonă, clorhidrat ulde
ciprofloxacină; un compus zwitterionic, care pot ioniza atât în mediu acid, cât și în
mediu alcalin. Ciprofloxacina prezintă o mobilitate electro foretică mai mică decât cei
doi deriva țiβ-lactamiciși va migra după ace știaiarstabilitatea sa în soluțieapoasă
este foarte bună. Cuantificarea a fost realizată prin raportarea ariilor peakurilor
analițilorlaaria peakului IS.
Performan țele analitice ale metodei sunt prezentate în tabelul 2.2.1 .

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 123
Tabel 2.2.1. Performan țele analitice ale metodei
Parametru AMX CLA
Repetab ilitate “intra -day”
RSDtimp de migrare (%) 0.33 0.41
RSDaria peak (%) 0.97 1.12
Repetabilitate “inter -day”
RSDtimp de migrare (%) 0.48 0.55
RSDaria peak (%) 1.44 1.97
Linearitate
Ecuația de regresie y= 0,474x + 0,9406 y= 0,5057x + 1,2639
Coeficient de corela ție 0.9980 0.9950
LOD (μg mL-1) 2.87 2.95
LOQ (μg mL-1) 8.69 8.95
Metoda a fost aplicată pentru determinarea simultană a celor două substan țe
din forme farmaceutice ( tabel 2.2.2). Rezultatele ob ținute au fost în concordanță cu
cantitățile declarate de către producător.
Tabel 2.2.2.Determinarea simultană a AMX și CLA din forme farmaceutice
AnalițiCantitate declarată (mg)Cantitate găsită (mg)RSD (%) SD (%)
AMX 500 496.44 0.38 0.92
CLA 125 123.35 0.24 1.88
Diferențele dintre com portamentul electroforetic și mobilitatea electroforetică a
AMXși CLA permit o bună separare și o determinare simultană a anali tilor studia ți
folosind o metodă ECZ.În compara ție cualtemetode publicate anterior, avantajele
metodei noastre de ECsunt legate de: timpul de analiză scurt, dezvoltarea rapidă a
metodeianalitice și consumul redus de anali țiși solvenți organici.
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Hancu G. Neacșu A. Papp LA. Ciurba A. Simultaneous dete rmination of amoxicillin and
clavulinic acid in pharmaceutical preparations by capillary electrophoresis . Brazilian
Journal of Pharmaceutical Sciences, 2016, 52(2): 281 -286,revistă indexată ISI, FI:
0,474[139].
Ca alternativ ăam dezvoltat și o metodă sp ectrofotometrică UV -VIS pentru
determinarea simultană a AMX și CLA. Spectrele au fost înregistrate pe un
spectrofotometru UV -VIS Specord 210 (Analytik Jena, Germania), iar interpretarea s -a

124| Hancu Gabriel
efectuat cu ajutorul softului WinAspect (Analytik Jena, Germania). Spectrele au fost
înregistrate pe domeniul spectral 200 -1100 nm, în cuve de 1 cm, confecționate din
cuarț.
Maximele de absorbție înregistrate în diferiți solvenți sunt prezenta teîn
tabelul 2.2.3 . Nu s-a putut înregistra maximul de absorbție în metanol al CLA datorită
insolubilității acestuia în solvenți organici (se utilizează sub formă de sare de potasiu).
Ținând cont de aceste valori am ales pentru determinare să utilizăm spectrele în
NaOH 0,1M.
Tabel 2.2.3. Maximele de absorbție ale AMX și CLA în difer iți solvenți
Solvenți AMX CLA
Apă purificată 229 210
Acid clorhidric 0,1N 231,273 213,340
Hidroxid de sodiu 0,1N 248,278 259
Metanol 233 –
Spectrele suprapuse a celor două substanțe sunt prezetate în figura2.2.3.
Figura 2.2.3. Spectrele UV suprap use aleAMXșiCLA
Pentru a dezvolta metoda de determinare cantitativă a celor două substanțe am
recurs la o derivată de ordinul 1. Derivata s -a efectuat cu softulWinAspect prin
tehnica“zero-crossing”.Spectrele derivate sunt mai structurate decât spect rele de
ordin 0 permi țând amplificarea celor mai mici diferențe din spectrele inițiale .

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 125
Derivata de ordinul 1 începeși se termină la valoarea 0 și intersectează axa
Ox la aceea și lungime de undă la care A este maximă în spectrul de ordin 0. Astfel,
maximul din spectrul ini țial devine 0 în derivata de ordinul 1, iar punctele de
inflexiune ale spectrului original sunt transformate în maxime și minime. Funcțiile
bipolare de acest fel sunt caracteristice tuturor derivatelor de ordin impar.
Ținând cont de aces te aspecte AMXs-a determinat la 259 de nm în timp ce
CLAla 278 nm.
Figura 2.2.4. Spectrele derivate de ordinul 1 suprapuse ale AMXși aCLA
S-a verificat liniaritatea metodei și s-au calculat LOD și LOQ (tabel 2.2.4 ).
Tabel 2.2.4. Date privind liniar itateași sensibilitatea metodei
Parametriianalitici AMX259nm CLA278nm
Ecuația de regresie y=-0,0016x+0,0003 y=-0,0035x-5E-05
Coeficient de corelație 0,9992 0,9997
LOD(µg mL-1) 0,83 0,28
LOQ(µgmL-1) 2,53 0,86
Metoda a fost aplicată pentru determinarea AMX și CLAdin comprimate de
Augmentin 625 mg ( tabel 2.2.5 ).
Tabel 2.2.5. Determinarea simultană a AMX și CLA din forme farmaceutice
Analiți Cantitatea
declarată(mg)Cantitatea
găsită (mg)RSD% (n=6) SD(%)
AMX 500 502,5±3,68 0,73 +0,50
CLA 125 121,5±0,53 0,44 -2,79

126| Hancu Gabriel
2.3.Determinarea prin ECși spectrofotometrie UV -VIS a isoniazidei
și rifampicinei din combinații fixe
Tuberculoza (TBC) este o boală infec țioasă cauzată de bacteria Mycobacterium
tuberculosis, care afectează de obicei plamanii, dar poate afecta șialte organe. Există
mai mult de douăzeci de medicamente care sunt utilizate în prezent pentru
tratamentul tuberculozei, dar ceea ce este alarmant este că aproape toate au fost
dezvoltate cuani în urmă; m edicamentele tuberculostatice sunt utilizate în dif erite
combinații înfuncție decircumstan țe[140].
Dintre medicamentele utilizate,izoniazida (INH)șirifampicina (RIF) sunt
probabil cele mai eficiente și cele mai frecvent utilizate în combinați epentru
tratamentul TBC, fiind medicamente de primă linie în lupta împotriva TBC [141].
INH este o hidrazidă a acidului izonicotinic, care ac ționează prin blocarea
producerii de acid micolic, o componentă esen țială a peretelui celular a bacteriei
Mycobacterium tuberculosis; este un prodrug activat prin intermediu lunei enzime cu
activități duale de catalază si peroxidază [141].
RIF este un antibiotic cu spectru larg f ăcând parte din clasa ansamicinelor, care
acționează prin inhibarea sintezei ARN -ului bacterian [141].
Structurile chimice ale INH și RIF sunt prezen tate înfigura 2.3.1.
Figura 2. 3.1.Structurile chimice ale INH și RIF
ECZa fost aplicat pentru analiza simultană a etambutolului, isoniazidei,
pirazinamidei și rifampicinei din forme farmaceutice utilizând un tampon complex

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 127
format din 50 mM acid aceti c/acetat de sodiu și 12,5 mM CuSO 4,probele au fost
preparate într -un amestec 2 mM Brij 35 și 12,5 mM CuSO 4[142]. ECMa fost aplicat ă
pentru determinarea isoniazidei, pirazinamidei și rifampicinei din forme farmaceutice
utilizând un tampon borat 40 mM șiDSS100mMla unpHde8,5[143].
În studiu am utilizat substan țe de calitate farmaceutică: isoniziadă (Merck,
Germania), rifampicină (Antibiotice Ia și, România) .
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu u n detector DAD; electroferogramele au fost înregistrate și
procesate cu ajutorul software -ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-au efectuat pe un capilar scurt de 38 cm lungime (30 cm lungime efectivă) x 50 µm
diametru (Agilent, Germania) .
Soluțiile stoc de INH și RIF au fost preparate prin dizolvarea substanțelor în
metanol în concentra ție de 1 mg mL-1și apoi diluate înainte de utilizare cu metanol la
concentra ția corespunzătoare. Probele au fost introduse în sistem prin injectare
hidrodinamică la capătul anodic al capilarului.
Capilarul a fost condi ționat înainte de utilizare cu NaOH 0,1 M, apă ultra -purăși
cu soluția de electrolit timp de 30 minute și precondiționat cu NaOH 0,1 M, apă ultra –
purăși soluția de electrolit timp de 1 minut înainte de fiecare determinare
electroforetică.
Pentru a caracteriza comportamentul electroforetic al celor doi anali ți,am
efectuat determinări preliminare folosind soluții tampon cu diferite compozițiila
diferite valori de pH pe un interval de pH cupri ns între 2,5 și 11,0.
RIF este un zwitterion care prezintă două valori pK a, 1,7 datorită grupării
hidroxiși 7,9 datorită azotului din nucleul piperazinic, prin urmare, este ionizat pe un
interval larg de pH și poate fi detectat pe întregul domeniu de pH s tudiat.
INH are trei valori pK a, 1,8,3,5și 10,8,darare o mobilitate electroforetică
proprieredusă, migrând cu FEO la un pH peste 5,0 .
Într-un mediu acid, timpii de migrare ai INH și RIF au fost mari, de peste 10
minute; în timp ce în mediu neutru și bazic INH a migrat împreună cu FEO. Prin
urmare ECZ nu este o metodă adecvată pentru determinarea simultană a INH și RIF
(figura2.3.2).

128| Hancu Gabriel
Figura2.3.2.Separarea INH și RIF prin ECZ (condiții analitice: 25 mMborat, pH 9.30,
+ 20 kV,25˚C, 50 mbar/1 sec, 2 30 nm,10 µgmL-1)
Soluția ideală pentru determinarea concomitentă a INH și RIF a fost aplicarea
unei metode de ECM prin adaosul în solu ția tampon a unei substanțe tensioactive,
DSS.Utilizând o solu ție tampon conți nând 25 mM tetraborat de sodiu și 25 mM DSSla
un pH de 9,3, aplicând un voltaj de + 25 kV la o temperatură de 2 0°C, am ob ținut
separarea simultană a celor doi anali țiîn mai pu țin de3minute, ordinea de separare
fiind,INHurmatădeRIF(figura2.3.3).
Figura2.3.3.Separarea INH și RIF pri n ECM(condiții analitice: 25 mM borat, 25mM
DSS,pH 9.30, + 2 5kV,20˚C, 50 mbar/1 sec, 230 nm, 20 µg mL-1)

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 129
Performan țeleanaliticealemetodei a ufost evaluat eînceea ce prive ște
reproductibilitate a, precizia, robuste țeași liniaritate ași s-au calculat LODși LOQ
(tabel2.3.1); utilizând condi țiile analitice optimizate anterior.
Tabel2.3.1.Performan țele analitice ale metodei (liniaritate, sensibilitate)
AnalițiEcuația de regresie Coeficient
de corela țieLOD
(µg mL-1)LOQ
(µg mL-1)
INH y = 0.017x –0.0405 0.995 4.59 15.32
RIF y = 0.013x –0.0835 0.997 4.47 14.91
Aplicabilitatea metodei a fost verificată pe amestecuri preparate de INH și RIF în
concentra ție corespunzătoare ce lor utilizate în terapie ( tabel 1.3.2 ),obținându-se un
raport adecvat între valorile calculate și celeregăsite.
Tabel2.3.2.Rezultatele ob ținute în analiza unor amestecuri INH:RIF
Amestec Cantitate declarată (mg) Cantitate găsită (mg) RSD (%)
INH RIF INH RIF INHRIF
1 : 1 150 150 150.5 ±2.4 150.2 ±2.5 0.750.60
1 : 2 150 300 153 ±2.2 299.8 ± 2.5 0.770.82
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Iriminescu D. Cârcu -Dobrin M. Hancu G. Mircia E. Kelemen H. Rusu A. Tilinca M.
Simultaneous determination of isoniazid and rifampicin by mice llar electrokinetic
chromatography , Studia Universitas “Vasile Goldi ș” Seria Științele Vieții, 2016, 26(3):
353-357[144].
Două metode alternative de spectrofotometrie în UV au fost dezvoltate pentru
determinarea simultană a INHșiRIFîn amestec, aplicân d metoda ecua țiilor simultane
(metoda I) și spectrofotometria derivată de ordinul 1(metoda II) .
Spectrele au fost înregistrate pe un spectrofotometru UV -VIS Specord 210
(Analytik Jena, Germania), iar interpretarea s -a făcut cu ajutorul softului WinAspect
(Analytik Jena, Germania). Spectrele au fost înregistrate pe domeniul spectral 200 –
1100 nm, în cuve de 1 cm, confecționate din cuarț.
Spectrele INH și RIF s-au înregistrat în diferi țisolvenți: apă, metanol, HCI 0,1M ,
NaOH 0,1 M (tabel 1.3.3 ).Metanolula fost selectat ca solvent pentru metodele

130| Hancu Gabriel
spectrofotometrice; selec ția a fost făcută după evaluarea solubilității și a absorbției
ambelor substanțeîn solven ții studiați.
Tabel 2.2.3. Maximele de absorbție ale INHșiRIFîn diferiți solvenți
Analiți Maxime de absorb ție în UV λ (nm)
Apă Metanol HCl0,1M NaOH0,1M
INH 264 nm 263 nm 268 nm 266 nm
RIF 242 nm
258 nm
335 nm242 nm
259 nm
338 nm245 nm
256 nm
342 nm245 nm
256 nm
333 nm
RIF poate fi determinat atât înUV, câtșiîn vizibil, dar INH poate f i determinată
direct numai în UV, dar două dintre maximele de absorb țieale RIFîn UV (242, 259
nm) sunt foarte apropiate de maximul de absorb ție alINH(263 nm).
Spectrele suprapuse ale INH și RIF în UV sunt prezentate în figura 2.3.4 .
Figura 2.3.4. Spectrele suprapuse ale INH și RIF în UV (25 μg mL-1)
Am preparat un amestec de INH: RIF 1: 1 șiamobservat că absorban țelecelor
două substan țela 263 nmsunt aditive, absorban țaamestecului fiind suma
absorban țelor componentelor individuale (figura 2.3.5 ).

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 131
Figura 2.3.5. Spectrul UV alamestecului INH:RIF (1:1)
S-a verificat liniaritatea celor două substan țepe uninterval de concentra ție
cuprins între 5 -50 μgmL-1la maximele de absorb ție corespunzătoare (263 nm
pentru INH și 338 nm pentru RIF). Pentru determinarea simultană a INH și RIF, s-au
preparat o serie de solu ții (n = 6) de concentrații diferite pe domeniul de liniaritate
stabilit; absorb ția acestei serii de soluții a fost înregistrată la 263 și 338 nm.
Considerând un amestec de două componente Xși Y, unde o lungime de undă
corespunde maximului de absorb ție a componentului X, iar cea de -a doua lungime de
undă corespunde celui de -al doilea maxim de absorb ție al componentului Y unde X
absoarbe slab, putem determina ambele componente aflate în ame stec prin metoda
sistemului de ecua ții folosind următoarea formulă de calcul:
Cx = A 2ay1–A1ay2/ ax2ay1–ax1ay2
Cy = A 1ax2–A2ax1/ ax2ay1–ax1ay2
unde:
ax1= absorbtivitatea RIFla 338nm
ax2= absorbtivitatea RIFla 263 nm
ay1= absorbtivit ateaINHla 338nm
ay2= absorbtivitatea INHla 263 nm
Cx= concentra țiaRIF
Cy= concentra țiaINH
A1= absorban ța amestecului la 335 nm

132| Hancu Gabriel
A2= absorban ța amestecului la 263 nm
Spectrele de ordin zero au fost derivate pentru a ob ține spectrele primei
derivate folosind tehnica "zero -crossing". Lungimile de undă alese au fost puncte de
inflexiune ale spectrelor originale, transpuse în maxime și minime ale spectrelor
derivate, astfel am citit maximele de absorb ție la 263 nm pentru RIFși la 290 nm
pentruINH(figura 2.3.6 ).
Figura 2.3. 6.Spectrele derivate de ordinul 1 suprapuse ale INHși aRIF
Ambele metode au fost validate conform prevederilor ICH pentru validarea
procedurilor analitice privind precizia, repetabilitatea, liniaritatea , acurate țeași
sensibilitatea.
Tabel 2.2.4. Liniaritatea metodelor UV dezvoltate (concentra ții 5-50µgmL-1)
Analiți Metoda I Metoda II
Ecuația de regresie Coeficient de
corelațieEcuația de regresie Coeficient de
corelație
INH y = 0.041x –0.121 0.991 y = 0.0418x –0.065 0,998
RIF y = 0.041x –0.082 0.992 y = 0.0416x –0.044 0,996
Tabel 2.2.5. Sensibilitatea metodelor UV dezvoltate
Analiți Metoda I Metoda II
LOD (µgmL-1)LOQ (µgmL-1)LOD (µgmL-1)LOQ (µgmL-1)
INH 2.60 8.58 1.30 4.30
RIF 3.50 11.70 2.30 7.80

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 133
Metodeleoptimizat eau fost aplicate cu succes pentru determinarea simultană a
INHși RIF în comprimatul co -formulat, Rifinah (Sanofi Aventis, Fran ța), care con ține
150 mg INH și 300 mg RIF.
Tabel 2.2.6. Determinarea simultană a INH și RIF din forme farmaceutic e
Metoda Cantitate declarată (mg) Cantitate găsită (mg) RSD (%)
INH RIF INH RIF INH RIF
MetodaI150 300 148.84 297.68 0.87 0.92
MetodaII 150 300 149.14 299.02 0.56 0.64
Dacă o probă con ține două substanțe cu absorbție bună în UV (în cazul nostru, o
combinație între I NHși RIF) și fiecare are un maxim de absorbție diferit , este posibil
să se determine simultan ambele medicamente prin metodaecuațiilor simultane .O
altă opțiune pentru determinarea simultană a INH și RIF care evită eventuale
interferen țedin partea altor medicamente sau a excipien țilorestemetoda
spectrofotometrică derivată de ordinul 1.
Metodele dezvoltate pot fi caracterizate prin simplitatea și rapiditatea lor,
necesitând doarcantități mici de analit și solvent.
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Tilinca M. Hancu G. (autor corespondent) Mircia E. Iriminescu D. Rusu A. Vlad RA.
Barabás E. Simultaneous determination of isoniazid and rifampicin by UV
spectrophotometry .Farmacia, 2017, 65(2), 2 19-224,revistă indexată ISI , FI: 1,348
(2016)[145].

134| Hancu Gabriel
2.4.Determinarea prin EC a paracetamolului și tramadolului din
combina ții fixe
Tramadolul este un opioid sintetic cu structură fenilpiperidinică, utilizat ca
analgezic în dureri severe și moderate, acutesaucronice; prezintă un mecanism de
acțiune complex :agonist opioid central central (agonist total slab al receptorilor μ și
k)și monoaminergic spinal (la nivelul căilor descendente inhibitoare ale durerii )
[146].
Paracetamolul este un analgezic -antipiretic derivat de p -aminofenol ,indicat în
algii ușoare și moderate (nevralgii, mialgii, cefalee, dismenoree) șifebră de etiologie
diversă (infecții microbiene și virale) [146].
Pentru tratamentul dureri lormoderate până la severe, analgezicele opioide sunt
adesea administrate în asociere cu analgezice non -opioide. Combina ția fixăclorhidrat
de tramadol /paracetamol combină două substan țe cu efect sinergice , rezultând un
efect analgezic rapid; timpul de înjumătă țire rapid al paracetamolului fiind asociat cu
timpul de înjumătă țire mailung al clorhidratului de tramadol [146].
Structurile chimice ale paracetamolului și tramadolului sunt prezentate în
figura 2.4.1 .
Figura 2.4.1 . Structurile chimice ale paracetamolului și tramadolului
Scopul studiului a fo st de a dezvolta o nouă formulare farmaceutică conținând
37,5 mg clorhidrat de tramadol și 325 mg paracetamol cu diferiți excipienți; formulare
care poate fi utilizată pentru tratamentul durerii. Pentru determinarea celor două
substanțe din formele farmace utice formulate am ales tehnicaEC.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 135
În studiu am utilizat substan țe de calitate farmaceutică: paracetamol
(Nacharam, Hyderabad, India ), clorhidrat de tramadol ( Nacharam, Hyderabad, India ).
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agile nt,
Germania) echipat cu un detector DAD; electroferogramele au fost înregistrate și
procesate cu ajutorul software -ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-au efectuat pe un capilar scurt de 28 cm lungime ( 20 cm lungime efectivă) x 50 µm
diametru (Agilent, Germania).
Soluțiile stoc de paracetamol șitramadol au fost preparate prin dizolvarea
substanțelor înapă distilată în concentra ție de 100μg mL-1și apoi diluate înainte de
utilizare cu apăla concentra ția corespunzătoare. Probele au fos t introduse în sistem
prin injectare hidrodinamică la capătul anodic al capilarului.
Capilarul a fost condi ționat înainte de utilizare cu NaOH 0,1 M timp de 30
minute, apă ultra -purăși cu soluția de electrolit timp de 15 minute și precondiționat
timp de 1 minut cu NaOH 0,1 M, apă ultra -purăși soluția de electrolit înainte de
fiecare determinare electroforetică.
Detectarea a fost efectuată în UV la 210 nm (clorhidrat de tramadol) și 240 nm
(paracetamol), luând în considerare maximele de absorb ție UV înregi strate anterior.
Compoziția comprimatelor a fost stabilită astfel încât să se obțină comprimate
cu greutatea de 500 mg/comprimat în cazul comprimatelor cu superdezagregant
(tabel 2.4.1 ), iar în cazul comprimatelor fără superdezagregant să avem o masă de
490 mg/comprimat (tabel 2.4.2 ).
Tabel 2.4.1. Compozi ția formulărilor cu dezagregant
Formulare (mg)
Compoziție TPIdTPIIdTPIIIdTPIVdTPVdTPVIdTPVIId
Clorhidrat de tramadol 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5
Paracetamol 362,5 362,5 362,5 362,5 362,5 362,5362,5
Vivapur 102 50,0 – -59,5 42,5 59,5 42,5
Amidon 20,0 -59,5 25,5 42,5 – –
Tablettose 80 – -25,5 – -25,5 42,5
Ludipress -85,0 – – – – –
Prejel PA -5 15,0 – – – – – –
Stearat de magneziu 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Primojel 10,0 10,0 10,0 10,010,0 10,0 10,0
Masă totală (mg)/cpr. 500,00 mg/comprimat

136| Hancu Gabriel
Tabel 2.4.2 .Compozi ția formulărilor fărădezagregant
Formulare (mg)
Compoziție TPITPIITPIIITPIVTPVTPVITPVII
Clorhidrat de tramadol 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5
Paracetamol 362,5362,5 362,5 362,5 362,5 362,5 362,5
Vivapur 102 50,0 – -59,5 42,5 59,5 42,5
Amidon 20,0 -59,5 25,5 42,5 – –
Tablettose 80 – -25,5 – -25,5 42,5
Ludipress -85,0 – – – – –
Prejel PA -5 15,0 – – – – – –
Stearat de magneziu 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,05,0
Primojel – – – – – – –
Masă totală (mg)/cpr. 490,00 mg/comprimat
Pentru caracterizarea comprimatelor obținute cu tramadol clorhidrat 37,5 mg și
paracetamol 325 mg, s -au efectuat o serie de teste calitative și cantitative. Testele
efectuate au fosturmătoarele: uniformitatea masei, rezistența mecanică la rupere,
testul de friabilitate, dezagregarea comprimatelor, dozarea substanțelor active, testul
de dizolvare “in vitro” a substanțelor active în comparație cu un preparat industrial.
Pentru determi nareasubstanțelor studiate am re curs la cea mai simplă
variantă, ECZ , metodă în care separarea se bazează pe diferențele între mobilitățile
electroforetice ale analiților.
Luând în considerare valorile pK aa celor doi analiți (clorhidrat de tramadol
9,41și respectiv paracetamol 9,5) am ales cași soluție tampon o soluție de tet raborat
de sodiu (pH-9,3).Pentru a îmbunătă ți forma peakurilor , am ajustat pH -ul tamponului
prin adaos de soluție hidroxid de sodiu 0,1Mpână la 1 0.
Utilizând o soluție tampon conț inând 25 mM tetraborat de sodiu la un pH de 1 0,
aplicând un voltaj de + 20 kV, la o temperatură de 200C, am reușit separarea celor doi
analiți în aproximativ un minut, ordinea de migrare fiin d,clorhidrat de tramadol
urmat de paracetamol (figura 2.4.2 ).

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 137
Figura 2.4.2. Separarea paracetamolului șitramadolului prin ECZ(condiții analitice:
25 mM bora t,pH10, + 20kV,20˚C, 50 mbar/1 sec, 2 10 nm,25µg mL-1)
Performan țele analitice ale metodei au fost verificate în ceea ce privește
precizia, reproductibili tatea, liniaritatea și s-au calculat LOD și LOQ(tabel 2.4.3 ).
Tabel2.4.3.Performan țele analitice ale metodei (liniaritate, sensibilitate)
Analiți Ecuația de regresie Coeficient de
corelațieLOD
(µg mL-1)LOQ
(µg mL-1)
Paracetamol Y = 0.1936 X –0.6733 0.9994 1.15 3.70
Tramadol y = 0.013x –0.0835 0.997 2.05 6.45
Profilul de dizolvare a fost determinat utilizând un aparat Erweka II (Erweka,
Germania) la 50 rpm. Mediul de dizolvare a constat din apă (500 ml), temperatura
mediului de dizolvare a fost me nținutla 37 ± 0,5 ° C.Șase tablete din fiecare formulă au
fost testate, conform prevederilor EurPh8 .Profilele de dizolvare au fost determinate
pe un interval detimp de 35 de minute, iar probele au fost prelevate la fiecare 5
minute. Folosind probe de 5ml am determinat concentra ția de tramadol iarpentru
determinarea paracetamolului am făcut o dilu ție 1:10 cu apă distilată. Probele au fost
analizate prin EC, utilizând parametri ioptimiza ți anterior .
Profilele de dizolvare pentru cele șapte formulări cu d ezagregant pentru
tramadol și paracetamol sunt prezentate întabelul2.4.4(paracetamol) șitabelul
2.4.5(tramadol). Profilurile de dizolvare a formulărilor au fost comparate cu produsul
comercial Zaldiar (Grunenthal GmbH, Germania) .

138| Hancu Gabriel
Tabelul 2.4.4. Profilulde dizolvare pentru paracetamol (mg%)înformulări le
dezvoltate
Timp
(min)TPId
(mg%)TPIId
(mg%)TPIVd
(mg%)TPVd
(mg%)TPVId
(mg%)TPVIId
(mg%)TPcom
(mg%)
563.21 41.87 75.40 78.77 47.17 51.44 81.76
10 95.41 83.62 92.69 94.60 83.08 89.19 90.84
15 99.62 91.85 99.78 99.10 98.60 99.41 98.73
20100.12 97.17 100.51 100.70 99.38 100.60 99.10
25100.42 97.30 99.90 100.95 99.74 100.82 99.90
30100.30 98.87 99.90 101.83 99.71 100.99 100
35100.18 99.23 99.79 101.87 99.12 100.70 100.10
Tabelul 2.4. 5.Profilulde dizolvare pentru tramadol (mg%)înformulări ledezvoltate
Timp
(min)TPId
(mg%)TPIId
(mg%)TPIVd
(mg%)TPVd
(mg%)TPVId
(mg%)TPVIId
(mg%)TPcom
(mg%)
5 58.30 42.86 56.63 55.95 44.86 47.68 58.69
10 84.10 78.50 85.10 80.70 74.71 65.85 85.21
15 86.65 90.20 90.30 85.80 90.78 75.59 90.53
20 89.50 92.53 94.40 88.81 92.70 84.26 93.60
25 95.06 93.95 96.34 90.90 94.55 87.88 95.52
30 98,60 98,00 98.50 92.40 96.95 92.70 98.60
35 102.69 101.10 101.25 95.06 98.80 97.07 99.10
În ceea ce prive ște eliberarea substan țelor active, formulările conținând Vivapur
102și amidon au eliberat 55% tramadol și 60% paracetamol în primele 5 minute, în
timp ce cele cu Vivapur 102 și Tablettose 80 prezintă o viteză mai scăzută de eliberare
a substan țelor active .Clorhidratul de tramadol este eliberat integral din comprimate
în aproximativ 30 de minute comparativ cu paracetamolul, care se eliberează mai
repede, în aproximativ 15 minute.
Având în vedere to ți parametrii evaluați în acest studiu, compoziția adecvată a
unei combina ții complexe conținând 37,5 mg tramadol și 325 mg paracetamol
obținute prin comprimare directă ar trebuisă conținăceluloză microcristalină
Vivapur 102 și agentul superdisintegrant, amidon glicolat de sodiu (Primojel).
Rezultatele ob ținuteîn cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Ciurba A. Hancu G. (autor corespondent) Cojocea L. Sipos E. Todoran N. Development
of new formulation and its evaluation by capillary electrophoresis of tablets containing
tramadol hydrochloride and paracetamol . Pharmaceutical Development and
Technology 2014, 19(7): 833 -838, revistă indexată ISI, FI: 1.335 [147].

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 139
3. Aplica ții ale EC în determinarea substan țelor
medicamentoase înrudite chimic
3.1.Determinarea prin EC a penicilinelor β-lactamice
Înacest studiu am analizat patru deriva ți de penicilină larg utiliza ți în terapie cu
diferite caracteristici structurale: benzilpenicilina (PEN) -prima penicilină naturală
introdusă în terapie; ampicilina (AMP) și amoxicilina (AMO) -două aminopeniciline
semisintetice și oxacilina (OXA) -o izoxazolilpenicilină semisintetică.
Structurile chimicea penicilinelor studiate sunt prezentat eînfigura 3.1.1 .
NSCH3
CH3
COOH OR-OC-HN
Peniciline R
Benzilpenicilina C
H2
Oxacilina
N
OCH3
AmpicilinaCH
NH2
AmoxicilinaCH OH
NH2
Figura 3.1.1. Structurile penicilinelor studiate
Consultând literatura de specialitate putem observa un număr relativ ridicat de
studii privind determinarea penicilinelor prin ECZ respectiv ECM. De obicei, ECZ este
utilizată pentru a analiza un singur compus șieventualametaboli țiloracestuia [148],
iarECM este metoda aplicată pentru determinarea simultană a mai multor peniciline
[149].De asemenea, ECMpoate fi util ăpentru det erminarea penicilinelor provenite

140| Hancu Gabriel
dinprobecu conținut ridicat de proteine (probe biologice );în timp ce ECZ datorită
simplității sale esteutilizată pentru determinarea penicilinelor din formulări
farmaceutice [150].
Datorită caracteristicilor structural e comune, penicilinele studiate prezintă
mobilități electroforetice foarte asemănătoare, prin urmare o separare eficientă prin
metoda conven țională de ECZ (metoda bazată pe diferențele dintre mobilitățile
electroforetice proprii ale analitilor) este greu d e realizat. De la început, a fost clar că
separarea celor două aminopeniciline va fi dificilă, deoarece singura diferen ță dintre
AMOși AMP este prezența grupării hidroxil în catena laterală a AMO.
Datorită faptului că prin metoda ECZ nu am putut rezolva s epararea AMO de
AMP, pentru separare am ales o metodă ECM, adăugând o substan ță tensioactivă, DSS
soluției tampon.
În acest studiu am utilizat următorii compu șide calitate farmaceutică :
amoxicilină trihidrat, ampicilină trihidrat, benzilpenicilină sodi că,oxacilină sodică
monohidrat (Antibiotice,Iași, România ).
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD; electroferogramele au fost înregistrate și
procesate cu ajutorul software -ului Chemstati on 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-au efectuat pe un capilar de 56 cm lungime (48 cm lungime efectivă) x 50 µm
diametru (Agilent, Germania).
Soluțiile de probă au fost preparate prin dizolvarea sărurilor penicilinelor în
apă. Determinările electrofo retice au fost efectuate cât mai repede posibil, la cel mult
4 ore după preparare, datorită instabilită ții penicilinelor în soluție apoasă.
Penicilinele au caracter acid (datorită substituentului -COOH), în consecin ță
sunt ionizabile într -un mediu bazic.Aminopenicilinele pot fi detectate și în mediu acid,
datorită ionizării substituentului -NH2, dar OXA și PEN nu au putut fi detectate într-un
tampon acid.
Ionizarea anali ților va depinde de grupările carboxil, respectiv grupările amino
ale fiecărui analit, darși de pH -ul soluției de electrolit, deoarece disocierea acestor
grupări va depinde de pH -ul tamponului.
Pentru a optimiza metoda am urmărit influen ța parametrilor electroforetici
(concentra ția soluției tampon, pH -ul soluției tampon, concentra ția aditiv ilor

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 141
tamponului , voltajul aplicat, temperatura, parametrii de injectare) asupra rezolu ției
separăriișiatimpilor de migrare.
Utilizând o solu ție tampon conținând 25 mM tetraborat de sodiu și 100 mM DSS,
la un pH de 9,3, aplicând un voltaj de +25 kV la o temperatură de 25 ° C, am ob ținut
separarea simultană a penicilinelor studiate în mai pu țin de 5 minute, ordinea
separării fiind: AMO, AMP, BENZ, OXA ( figura 3.1. 3).
Figura 3.1. 3.Separarea penicilinelor prin ECM(condiții analitice: 25 mM borat, 100
mMDSS,pH9,30, + 25kV,25˚C, 50 mbar/ 3sec, 210 nm,25µg mL-1)
Ordinea de migrare poate fi explicată pe baza faptului că AMO este molecula cea
mai polară din amestec (din cauza substituentului -OH),șiprin urmare, are cea mai
scăzută afinitate fa ță de miceleși migrează cel mai rapid; în timp ce OXA este molecula
ceamai puțin polară din amestec (din cauza substituentului izoxazolil voluminos ),și
prin urmare are cea mai ridicatăafinitate față de micel eși migrează ultima.
Performan țele analitice ale me todei au fost evaluate pe baza preciziei,
liniarității, acurateței și s -au calculat LOD și LOQ.
Instabilitatea pencilinelor, dator atăprezenței inelului β-lactamic, este bine
cunoscută și reprezintă o problemă delicată. Pentru a evalua stabilitatea lor, d upă
dizolvarea penicilinelor în apă, probele au fost reinjectate de mai multe ori pe o durată
de două săptămâni, utilizând clorhidratul de ciprofloxacină ca IS. Ciprofloxacina este
un derivat de fluorochinolonă; un compus zwitterionic, care poate ioniza atâ t în mediu

142| Hancu Gabriel
acid, cât și în mediu alcalin. Ciprofloxacina prezintă o mobilitate electroforetică mai
mică decât deriva ții de penicilină, și va migra după ultima penicilină studiată iar
stabilitatea sa în apă este relativ bună (rata de descompunerepe un inter val de două
săptămâni a fost mai mică de 5%).
Stabilitatea penicilinelor a fost evaluată aplicând o metodă ECZ , utilizând un
tampon de 25mM borat, la un pH = 9,3, voltaj + 25kV, temperatură 20˚C,injectare
hidrodinamică 30 mbar/5 sec unde, detectare la 210 nm. Determinările au fost
efectuate pe un capilar de 38 cm (lungime efectivă: 30cm) x 50 μm I.D, pentru a ob ține
timpi mai scur ți de analiză.
Degradarea compu șilor depinde foarte mult de temperatura mediului, cu o rată
de descompunere mai mare la temperatur i ridicate. În experimentele noastre au fost
testate două temperaturi 25°C(temperatura camerei) și4°C(frigider); aria peakurilor
inițiale a celor patru analiți a fost considerată ca fiind 100%, ariile peakurilor obținute
îndecursul celor două săptămâni au fost comparate cu aceastași corelate cu cele ale
IS.
Înfigura 3.1.2 șifigura 3.1.3 sunt prezentate diagramele de stabilitate ale celor
patru peniciline studiate la 25 °C respectiv 4 °C.
Figura 3.1.2. Diagrama de stabilitate a celor patru penicilin e depozitate la
temperatura frigiderului (4 °C)

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 143
Figura 3.1.3. Diagrama de stabilitate a celor patru peniciline depozitate la
temperatura camerei (25 °C)
Este evident că cele trei peniciline semisintetice (AMO, AMP, OXA) prezintă un
profil de descompunere similar, degradarea lor a fost de aproximativ 20% după două
săptămâni la 4°C, respectiv 30 -40% la 25°C. PEN este de departe cea mai instabilă din
cele patru substan țe studiate, degradarea fiind de aproximativ 50% la 4°C și completă
după o săptămână la 25° C.
Rata de degradare este mult mai mică în cazul probelor depozitate la
temperaturi mai scăzute, în consecin ță probele penicilinelor trebuie depozitate la 4 °C
și analizate în decurs de 24 de ore de ladizolvare. Acest apoate fi un aspect important
în speci al dacă aplicăm metoda de separare pentru determinarea directă a
penicilinelor din probele clinice și de mediu .
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Simon B. Hancu G . (autor corespondent) Gyéresi Á. Application of c apillary
electrophoresis to the simultaneous determination and stability studies of four
extensively used penicillin derivatives. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences
2014, 50(3): 521 -527,revistă indexată ISI, FI: 0.264 [151].

144| Hancu Gabriel
3.2. Determinarea prin EC a cefalosporinelor
În terapia modernă, cefalosporinele sunt printrecele mai importante și probabil
cele mai frecvent utilizate antibiotice, atât din punct de vedere al numărului de
compuși care se află în prezent pe piața medicamentului, cât și a l utilizării acestora
pentru tratamentul bolilor infec țioase.
Structurile chimice a cefalosporinelor studiate sunt prezentate în figura 3. 2.1.
S
N
COOHR'OR-OC-HN
Cefalosporine R R’
Cefalexin-CFLCH
NH2-CH3
Cefadroxil -CFDCH OH
NH2-CH3
Cefaclor-CFCCH
NH2-Cl
Cefuroxim -CFRO
N-OCH3C-CH2-O-CO-NH2
Ceftazidim -CZIN
SNH2 NOCH3
CH3COOHC
CNC
H2+
Ceftriaxon-CTRN
SNH2 NOCH3CN
NN
CH2SOH
OCH3
Figura 3.2.1. Structurile chimice ale cefalosporinelor studiate

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 145
În acest studiu am analizat șasecefalosporine frecvent utilizate în terapie:
cefalexina (CFL), cefadroxil (CFD), cefaclor (CFC) -cefalosporine oral e de prima
generație, cefuroxima (CFR)-cefalosporină parenterală de generația a II-a, ceftazidim
(CZI), ceftriaxon (CTR) -cefalosporin eparenteral edegenerația a III-a.
Consultând literatura de specialitate putem observa un număr relativ ridicat de
studii privind determinarea cefalosporinelor prin EC Z respectiv ECM. În timp ce ECM
s-a dovedit a fi utilă pentru determinarea cefalosporinelor din probele biologice [152],
reducând efectele dezavantajoase ale matricei cauzate de materialele organice; ECZ s-
a dovedit a fi o metodă analitică eficientă pentru determinările din produsele
farmaceutice [153].
Scopul nostru a vizatdezvoltareauneimetoderapide, simpleși eficient epentru
separarea simultană a cefalosporinelor din diferite genera ții, precum și optimizarea
condițiilor analitice pentru a obține o r ezoluție de separare bună și un timp de analiză
scurt.
În acest studiu am utilizat următorii compu și de calitate farmaceutică: cefalexin
monohidrat, cefadroxil monohidrat, cefaclor monohidrat (Sandoz, T ârgu Mureș,
România); cefuroxim sare de sodiu (Medoche mie, Cipru); ceftazidim pentahidrat,
ceftriaxon sare de sodiu (Antibiotice, Ia și, România).
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD; electroferogramele au fost înregistrate și
procesate cu ajutorul software -ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-au efectuat pe un capilar de 56 cm lungime (48 cm lungime efectivă) x 50 µm
diametru (Agilent, Germania).
Soluțiile de probă au fost preparate prin dizolvarea sărurilor cefalosporin elor în
apă. Determinările electroforetice au fost efectuate cât mai repede posibil, la cel mult
4 ore după preparare, datorită instabilită ții cefalosporinelor în soluție apoasă.
Mobilitățile electroforetice ale cefalosporinelor vor depinde de numărul de
grupări-COOHși grupări –NH2ionizabile ale analitului, dar și de pH -ul soluției
tampon, deoarece disocierea acestor grupări este influen țată de pH.
Pentru a stabili condi țiile adecvate separării cefalosporinelor studiate, au fost
efectuate o serie de ex perimente preliminare utilizând soluții tampon cu diferite
compozițiila diferite valori de pH. Comportamentul electroforetic al cefalosporinelor

146| Hancu Gabriel
a fost semnificativ diferit în func ție de concentrația și pH -ul soluției de electrolit,
datorită bazicită ții diferite a grup ărilor func ționale din catena laterală a compușilor
studiați, dar tendințele în variația mobilității electroforetice au fost similare. Toate
cefalosporinele au putut fi detectate pe un interval de pH între 5,0 și8,0.
În analiza preliminară a m obținut cele mai bune rezultate utilizând un tampon
de fosfat de 100 mM la un pH de 7,0, dar curentul generat a fost unul ridicat de peste
100 μA, prin urmare au ap ărut dificultă ți experimentale datorită încălzirii excesive
generate de efectul Joule. Pentru a îmbunătă ți rezoluția de separare, am ales utilizarea
unui electrolit mixt având concetra ție mai scăzută conținând25 mMhidrogenofosfat
disodicși25 mMtetraborat de sodiu.
Optimizarea separării a fost realizată într -o manieră univariată prin
manipularea mai multor parametri analitici, cum ar fi pH -ulși concentrația
tamponului, temperatura sistemului și voltajul aplicat respectiv prin adăugarea de a
diferițiaditivi la solu ția tampon.
Am studiat influen ța pH-ului asupra timpului de migrare și a rezo luției de
separare a celor șase cefalosporine pe un interval de pH între 5,0 și 8,0. Timpul de
migrareacefalosporinelor studiate a crescut cu scăderea pH -uluisoluției tampon , dar
peintervalul de pH 6 ,0–7,0timpiide migrare au fostrelativconstanțiși s-a evitat
suprapunerea peakurilor CFLși CFC(figura 3.2.2 )
Figura 3.2.2. Influența pH-uluiasupra timpilor de migrare a cefalosporinelor (condiții
analitice: 25 mM borat, 25mM fosfat, + 25kV,25˚C)

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 147
Utilizând o solu ție tampon conținând 25 mM tetrab orat de sodiu și25 mM
hidrogenofosfat disodic , la un pH de 6,8, aplicând un voltaj de +25 kV la o
temperatură de 25 °Cam realizat separarea celor 6 cefalosporine în aproximativ 10
minute,ordinea de migrare fiind: CFD, CFL, CFC, CFR, CZI, CTR (figura 3.2 .3)
Figura 3.2.3. Separarea cefalosporinelor prin ECZ(condiții analitice: 25 mM borat,
25mM fosfat, pH6,80, + 25kV,25˚C, 50 mbar/ 3sec, 210 nm,25µg mL-1)
În analiza ECZcefalosporinele cu dimensiuni moleculare maimici au migrat mai
rapid decât ce le mai voluminoase. La un pH mai mare de 5, gruparea carboxilică a
cefalosporinelor este complet disociată, diferențele dintre mobilitățileelectroforetice
propriiale analițilorrezultând din creșterea gradului de protonare a grupărilor
amino, piridin osau tiazol.
Dificultățiau apărut la separarea celor trei cefalosporine de primă genera ție
(CFC, CFD, CFL), substan țe având caracteristici structurale foarte asemănătoare și,
prin urmare, mobilită ți electroforetice aproape similare. Aceste cefalosporine sunt
substanțe hidrofobe cu grupări polare similare, dar care prezintă comportament
diferit de parti ționare între cele două faze (faza micelară și faza apoasă )în ECM, prin
urmare această tehnică este adecvată pentru separarea lor.
Adaosul de DSS la solu ția tampon a dus la o cre ștere a timpilor de migrare a
analiților (separare în aproximativ 1 2minute), dar și la ceșterea rezoluției între cele
trei cefalosporine înrudite structural (CFD, CFL, CFC). Timpii de migrare a anali ților au
crescut odată cu cre șterea concentra ției de DSS, deoarece o concentrație mai mare de
DSS are ca rezultat cre șterea tăriei ionice a soluției tampom, și prin urmare va duce la
scăderea FEO ( figura 3.2.4 ).

148| Hancu Gabriel
LaunpH neutru, FEOputernic se deplasează în direc ția catodului; în timp ce
DSSeste un surfactant anionic, prin urmare migrarea electro foretică a micel elor
anionice formateeste în direc ția anodului.
Figura 3.2.4. Influența concentrației DSS asupra timpilor de migrare a
cefalosporinelor (condiții analitice: 25 mM borat, 25mM fosfa t, pH–7,0,+ 25kV,25˚C)
Utilizând o solu ție tampon conținând 25 mM tetraborat de sodiu și 25 mM
hidrogenofosfat disodic ,100 mM DSS, la un pH de 7,0, aplicând un voltaj de + 25 kV la
o temperatură de 25°Cam realizat separarea celor 6 cefalosporine înaproximativ 1 2
minute,ordinea de migrare fiind: CFD, CFL, CFC, CFR, CZI, CTR (figura 3.2.5 ).
Figura 3.2.5. Separarea cefalosporinelor prin ECM(condiții analitice: 25 mM borat,
25mM fosfat, 50 mM DSS, pH7,0, + 25kV,25˚C, 50 mbar/ 3sec, 210 nm,25µgmL-1)

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 149
Performan țele analitice ale metodei ECMau fost evaluate pe baza preciziei,
liniarității, acurateței și s -au calculat LOD și LOQ(tabel 3.1.1 ).
Tabel 3.1.1. Liniaritatea și sensibilitatea metodei ECM
Cefalosporine Ecuația de regresie Coeficient d e
corelațieLOD
(µgmL-1)LOQ
(µgmL-1)
CFD y= 2.3594 x+ 4.5439 0.999 1.20 4.00
CFL y= 1.6935 x+ 1.8458 0.998 2.35 7.80
CFC y= 2.1355 x+ 3.0514 0.999 1.40 4.66
CFR y= 2.0458 x+ 2.8607 0.998 1.55 5.16
CZI y= 1.7939 x+ 5.0322 0.992 1.90 6.35
CTR y= 1.668x+ 3.4163 0.997 2.05 6.82
Deși stabilitatea cefalosporine lor în stare solidă este satisfăcătoare, în solu ție
apoasăacestea sunt hidrolizate lent în diverșiprodușide degradare. Studiile noastre
preliminare utilizând un standard intern (clorhidrat de ciprofloxacină) au arătat însă
că în decurs de 4 ore de la prepararea solu țiilor apoase degradarea (hidroliza)
substanțelora fost nesemnificativă
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articol ele:
Hancu G. Kelemen H. Rusu A .Gyéresi Á. Development of capillary electrophoresis
method for the simultaneous determination of cephalosporins . Journal of Serbian
Chemical Society 2013, 78(9): 1413 -1423,revistă indexată ISI, FI: 0.889 [154].
Hancu G. Sasebeși A.Rusu A. Kelemen H. Ci urba A. Study of the electrophoretic
behavior of cephalosporins by capillary zone electrophoresis . Advanced Pharmaceutical
Bulletin, 2015, 5(2): 223 -229,revistă indexată ISI [155].

150| Hancu Gabriel
3.3. Determinarea prin EC a fluorochinolonelor
Chinolonele cuprind o se rie de agenți antibacterieni sintetici după modelul
acidului nalidixic, un derivat de naftiridină introdus în terapie pentru tratamentul
infecțiilor tractului urinar. Ca rezultat al cercetărilor structură chimică –activitate
terapeutică în cadrul acestei clase, s-a ajuns la compuși cu potență ridicată, spectru de
activitate extins, proprietățile de absorbție și distribuție îmbunătățite; aces ți compuși
având ca element comun un substituent fluor în pozi ția 6,și fiind denumiți generic
fluorochinolone [156].
Majoritatea metodelor de EC privind analiza fluorochinolonelor vizează
determinarea unuia sau a unui număr limitat de anali țidin genera ții diferite, având
caracteristici fizico -chimice diferite. Separarea anali ților asemănători din punct de
vedere struct ural, cum ar fi norfloxacina și ciprofloxacina, este o sarcină dificilă și nu
poate fi rezolvată prin ECZ [157].
Scopul studiului a fost realizarea un studiu sistematic privind comportamentul
electroforetic al unui număr mare de deriva ți chinolinici pentru a dezvolta metode
simple, rapide și eficiente de EC utilizabile în separarea simultană a derivaților de
chinolină din amestecuri complexe. În acest scop au fost selectate 13 chinolone
antibacteriene cu utilizare terapeutică extensivă din genera ții diferit e, incluzând atât
derivați cu caracteristici structurale diferite și câtși derivați cu structuri chimice
înrudite. Formulele constitu ționale ale chinolonelor studiate sunt în figura 3.3.1 .
Chinolonele au fost achizi ționate de la diverși distribuitori :acidnalidixic (NAL),
sparfloxacina (SPA) ( Sigma-Aldrich, Germania) ,clorhidrat de ciprofloxacin ă(CIP),
ofloxacin a(OFL)(Ranbaxy Laboratories , India), enoxacin a(ENO)(Fluka,Germania),
clorhidrat de moxifloxacin ă(MOX)(Bayer Schering Pharma, Germania), norfloxacin a
(NOR) (Smruthi Organics Limited, India),difloxacin a(DIF), 3'-metil-difloxacin a(3'M-
DIF)(Orichem International , India), lomefloxacin a(LOM), 8 -fluor-norfloxacin (8F –
NOR), 8-fluor-pefloxacin (8F -PEF)(Chinoin Pharmaceutical , Ungaria) ,mesiltade
pefloxacină (PEF)(Laropharm , România).

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 151
Figura 3.3.1. Structura chimică a fluorochinolonelor studiate
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD; electroferogramele au fost înregistrat eși
procesate cu ajutorul software -ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-au efectuat pe un capilar de 56 cm lungime (48 cm lungime efectivă) x 50 µm
diametru (Agilent, Germania).
Determinarea constantelor de protonare și apoi utilizarea lor pentru a prezice
mobilitatea electroforetică a anali ților dependentă de pH este o abordare sistematică
valoroasă în dezvoltarea unei separări de ECZ.
Într-un studiu recent s -a demonstrat că fluorochinolon ele sunt molecule
triprotice șis-au cuantificat centrele bazicitate ale acestora. La pH -ul fiziologic,
fluorochinolonele au două situ ride protonare, și anume atomul de azot din poziția
patruși gruparea carboxil . Atomul de azot din poziția 1 se protonează numai în medii
foarte acide și nu are influenț ămajorăasupra comportamentului electroforetic al
acestor compu și[158].
Macroconstan țele de protonare (valorile logK) au fost determinate prin tritrare
pH-potențiometrică utilizând un instrument GLpK a(Sirius Analytical Instruments)
combinat cu un electr od de pH Ag -AgCl.Valorile logK împreună cu punctele
izoelectrice (pHIEP) ale anali ților studiați sunt prezentate în tabelul 3.3.1 .

152| Hancu Gabriel
Mobilitatea electroforetică este legată de parametrii structurali precum
încărcătura și masa analiților ( μpHfață de q / M α).Pe baza metodelor de predic ție,
mobilitatea relativă (q / M α) a compu șilor studiați a fost calculată ca o funcție a pH –
ului.
Curbele trasate conform legiilui Offord sunt prezentate în figura 3.3.2 .
Utilizând aceste curbe se poate selecta intervalul opti m de pH pentru separare ,practic
cel mai important element într -o separare ECZ.
Tabel 3.3.1. Valorile logK și punctele izoelectrice (pHIEP) ale chinolonelor studiate
Chinolonă logK1 logK2 pHIEP
Acid balidixic (NAL) 6.13 ± 0.01 –
Ciprofloxacin (CIP) 8.53± 0.01 6.18 ± 0.01 7.36
Difloxacin (DIF) 7.45 ± 0.01 5.76 ± 0.01 6.61
3’metil-difloxacin (3’M -DIF) 8.42 ± 0.01 5.87 ± 0.01 7.15
Enoxacin (ENO) 8.69 ± 0.01 6.16 ± 0.01 7.43
Lomefloxacin (LOM) 8.93 ± 0.01 5.83 ± 0.01 7.38
Moxifloxacin (MOX) 9.32 ± 0.01 6.28 ± 0.01 7.80
Norfloxacin (NOR) 8.52 ± 0.01 6.29 ± 0.01 7.41
8-fluor-norfloxacin (8F -NOR) 9.00 ± 0.01 5.82 ± 0.01 7.41
Ofloxacin (OFL) 8.14 ± 0.01 6.03 ± 0.01 7.09
Pefloxacin (PEF) 7.51 ± 0.01 6.26 ± 0.01 6.89
8-fluor-pefloxacin (8F -PEF) 7.97 ± 0.01 5.80 ± 0.01 6.89
Sparfloxacin (SPA) 8.97 ± 0.01 6.32 ± 0.01 7.65
Figura 3.3.2. Curbele prevăzute conform ecua ției Offord

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 153
Luând în calcul aceste rezultate preliminare am alespentru determinare un
tampon de borat și am calculat mobilitățile electro foretice ale anali ților un un interval
de pH între 8,0 și 12.5.Folosind valorile experimentale alemobilitățile electroforetice ,
se poate verificași aplicabilitatea metodei de predicție (figura 3.3.3 ).
Figura 3.3.3. Corelația între valorile experimenta leși cele teoretice ale mobilității
electroforetice
Pentru optimizarea procesului electroforetic am studiat influen ța concentrației
tamponului, aditivilor tamponului, tensiunii aplicate, temperaturii, timpului și
presiunii de injectare asupra rezolu țieiseparării și a timpilor de migrare a analiților.
Utilizând o solu ție tampon conținând 25 mM tetraborat de sodiu la un pH de 9,3,
aplicând un voltaj de +25 kV la o temperatură de 25 °Cam realizat separarea a 12
fluorochinolone în aproximativ 10 minute ( figura 3.3.4).
Figura 3.3. 4.Separarea chinolonelor prin ECZ ( condiții analitice: 25 mM borat, pH
9,3, + 25kV,25˚C, 50 mbar/ 1sec, 210 nm,10µg mL-1)

154| Hancu Gabriel
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Rusu A. Hancu G. (autor corespondent) V ölgyi G. Tóth G. Noszál B. Gyéresi Á.
Separation and determination of quinolone antibacterials by capillary electrophoresis .
Journal of Chromatographic Science 2 014, 52(8): 919 -925,revistă indexată ISI ,FI:
1.363[159].
Ciprofloxacina (CIP),norfloxacina (NOR)șiofloxacina (OFL); sunt de departe
cele importante șimaiutilizate fluorochinolone în terapia modernă . CIPși NOR au
caracteristici structurale aproape similare, substituentul la atomul de azot din inelul
piridin-carboxilic (ciclopr opil respectiv etil) fiind singura diferen ță între cele două;
OFL este un derivat triciclic cuun substituent metil pe inelul piperazinic . Structurile
celor trei fluorochinolone studiate sunt prezentate în figura 3.3.5 .
Figura 3.3.5. Structura chimică a fluorochinolonelor studiate
În literatura de specialitate sunt publicate metode de ECelaborate pentru
determinarea individuală CIP, NOR și OFL, dar determinarea lor simultană este o
provocaredatorită mobilită ții lor electroforetice similare [160].
În acest studiu am utilizat următorii compu și de calitate farmaceutică : clorhidrat
de ciprofloxacină, norfloxacina (Sandoz, Tîrgu Mure ș, România), ofloxacina (Ranbaxy
Laboratories, India).

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 155
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD; electroferogramele au fost înregistrate și
procesate cu ajutorul software -ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-au efectuat pe un capilar de 48cm lungime (4 0cm lungime efectivă) x 50 µm
diametru (Agi lent, Germania).
Soluțiile stoc în concentrație de 100μgmL-1s-au preparat prin dizolvarea
fluorochinolenelor studiate în metanol și apoi diluare a soluției metanolice cu apă
(1:1).
Fluorochinolonele sunt substanțe amfoter e, carevor fiionizate negativ s au
pozitiv, în func ție de pH -ulsoluției tampon , oferind posibilitatea de a utilizafie un
tampon acid, fie un tampon alcalin pentru determinarea lor.Cele două valori ale pK a
corespund substituentului carboxilic acid de peciclul de piperidin icrespectiv
atomului de azot liber din ciclul piperazin ic.Valorile pK aa celor trei fluorochinolone
studiate sunt prezentate în tabelul 3.3.2 .
Tabel 3.3.2. Valorile pK aa celor trei fluorochinolone studiate
Analit pKa1(-COOH) pKa2(-NH2)
CIP 6.27 8.87
NOR 6.34 8.75
OFL 5.97 7.65
Fluorochinolonele studiatesuntzwitterion i datorită prezen ței în structură atât a
atomului de azot (acceptor de protoni), cât și a unui substituent carboxilic (donor de
protoni), astfel încât varia țiile pH-uluisoluției tampon vor modif ica mobilită țile
electroforetice ale acestora , influențând eficiența de separare .
Scopul nostru a fost nu numai elaborarea unei metode de ECpentru
determinarea simultan ă afluorochinolonelor studiate, dar și optimizarea condițiilor
de separare pentru a în țelegeși îmbunătăți procesul de separare.
Folosind un tampon con ținând 25 mM tetraborat de sodiu și 15% metanol la un
pH-10,5am reușit să separăm OFL de perechea CIP -NOR(figura 3.3.6 ).

156| Hancu Gabriel
Figura 3.3.6. Separarea fluorochinolonelor prin ECZ ( condiții analitice:25 mM borat,
15% metanol, pH10,5, + 20kV,20˚C, 50 mbar/ 3sec, 280 nm,25µg mL-1)
Separarea dintre CIP și NOR poate fi rezolvată prin ECM; adaosul unui agent
tensioactiv, DSS însoluția tampon peste concentra ția micelară critică (CMC)
generează agregarea moleculelor de surfactant și formarea micele, determinând
modificări a le mobilită ții aparente a analiț ilor datorită interac țiunilor hidrofobe
analit-micelă.
Odată cu cre șterea concentrației DSS, timpul de migrare al anali ților a crescut
datorităsolubilizării acestora în faza micelară; c reștere a concentrației DSSa dusși la
orezoluție îmbunătățită a separării (figura 3.3.7 ).
Figura 3.3.7. Influența concentrației DSS asupra separării ( condiții analitice: 25 mM
borat,pH9,3, + 20kV,20˚C, 50mbar/3sec)

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 157
Cea mai bună separare am obținut-outilizând o solu ție tampon conținând25
mMtetraborat de sodiu, 100 mMDSSși 5%metanol,cu care am realizat separarea de
bază a anali ților în mai pu țin de 10 minute. Separarea a avut loc în următoarea ordin e:
OFL, NOR, CIP ( figura 3.3. 8).
Figura 3.3. 8.Separarea fluorochinolonelor prin ECM ( condiții analitice: 25 mM borat,
100 mM DSS, 5% metanol, pH9,3, + 20kV,20˚C, 50 mbar/ 3sec, 280 nm,25µg mL-1)
În general, concentra țiile ridicate de surfactanți m ăresc vâscozitatea tamponului
și intensitatea curentului și ar trebui evitate; dar în acest caz, pentru a realiza
separarea, a trebuit să folosim o concentra ție relativ ridicată (100 mMDSS)și să
compensăm generarea de curen țiridicațiprin scăderea tensi unii aplicate și a
temperaturii capilare. Metanolul a fost utilizat pentru a reduce interac țiunile
hidrofobe dintre analițiși miceleși, în consecință, pentru a crește viteza lor de
migrare.
Ordinea de migrare a acestor compu șiva figuvernată de un efect combinat al
hidrofobicită ților lor (încorporarea partea hidrofobă ale micel elor)și al ionizării
acestora (interacțiuni ionice între suprafața micelară încărcată negativ și partea
cationică a anali ților).
Performan țele analitice ale metodei ECMau fost ev aluate pe baza preciziei,
liniarității, acurateței și s -au calculat LOD și LOQ(tabel 3.3.3 ).

158| Hancu Gabriel
Tabel 3.1.1. Liniaritatea și sensibilitatea metodei ECM
Fluorochinolone Ecuația de regresie Coeficient
de corela țieLOD
(µgmL-1)LOQ
(µgmL-1)
OFL y = 0.3862x + 1 5.195 0.993 2.49 8.30
NOR y = 0.5416x + 20.173 0.995 2.28 7.89
CIP y = 0.7322x + 30.735 0.993 2.07 7.53
ECs-a dovedit a fi o tehnică utilăși versatilă pentru separarea simultană a
derivațilorde fluorochinolonă cu structuri chimice asemănătoare. Separarea mai
multorfluorochinolone dintr-un amestec complex este probabil dincolo de capacitatea
de separare a tehnicii ECM , totuși această metodă poate fi utilă ca tehnică auxiliară
pentru a separa acele fluorochinolone a căror separare nu poatefirezolvată prin ECZ
(de exemplu CIP și NOR), dintr -un amestec de câteva componente.
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Hancu G. Rusu A. Simon B. Boia G. Gyéresi Á. Simultaneous separation of ciprofloxacin,
norfloxacin and ofloxacin by micellar electrokinetic chromatography . Journal of
Brazilian Chemical Society 2012, 23(10): 1889 -1894,revistă indexată ISI , FI: 1.283
[161].

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 159
3.4. Determinarea prin EC a antihistaminicelor H1
Antihistaminicele H1 moderne (de genera ția II)sunt substan țe cu o selectivitate
mult mai ridicată fa ță de receptorii H1 periferici, prin comparație cu antihistaminicele
H1 clasice (de genera ția I); această selectivitate reducând în mod semnificativ apariția
reacțiilor adverse, cum ar fi sedarea, în ti mp ce asigură o ameliorare eficientă
reacțiilor alergice. Cauza selectivității periferice a acestor compuși este că majoritatea
acestor compu și sunt zwitterionici la pH fiziologic; fiind compuși polari, care nu
traversează bariera hemato -encefalică iar ac țiunea lor asupra SNC este una redusă
[162].
Loratadina (4-(8-cloro-5,6-dihidro-11H-benzo[5,6]ciclohepta[1,2 -b]piridin –
11iliden) -1-piperidin -carboxilat de etil) (LOR) este un antihistaminic H1 cu acțiune de
lungă durată. LORprin metabolizare hepatică, se transformă într -un metabolit activ,
desloratadina (4-(8-cloro-5,6-dihidro-11H-benzo[5,6]ciclohepta[1,2 -b]piridin –
11iliden) -1-piperidina) (DSL) care î și păstrează activitatea antihistaminică. DSL
prezintă o activitate farmacologică similară dar cu o poten țăde două -trei ori mai
mare prin compara ție cu LOR, probabil datorită unei afinități mai mari pentru
receptorii histaminici H1.
Cetirizina (acid (RS) -2-[4-(4-clorbenzhidril) -1-piperazinil] -etoxiacetic) (CET)
este de asemenea un antihistaminic H1 cu ac țiune de lungă durată, metabolitul
principal al anxioliticului, hidroxizină. Enantiomerul levorotator (enantiomerul R) al
CET, levocetirizina este forma mai activă; și este comercializată și ca enantiomer optic
pur.
Structurile chimice ale antihistaminelor H1 studiate sunt prezentate în figura
3.4.1.
EC a fost utilizată pentru determinarea LOR și a impurităților asociate ale
acesteia, dar nu am găsit studii privind determinarea electroforetică simultană a LOR
și DSL[163].

160| Hancu Gabriel
Figura 3.4.1. Structurile chimice al e antihistaminicelor H1 studiate
În acest studiu am utilizat următorii compu și de calitate farmaceutică:
loratadin a(Tonira Pharma Limited, India), desloratadin a (Morepen Laboratories,
India),cetirizina(RA Chem Pharma Limited, India).
Pentru determinări le din produsele farmaceutice s -au utilizat următoarele
preparate comerciale: Symphoral (Gedeon Richter, România) comprimate conținând
10 mg LOR, Aerius (Schering Plough, SUA) comprimate conținând 5 mg DESL, Zyrtec
(UCB Pharma, Germania) comprimate conținând10 mg CET .
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD; electroferogramele au fost înregistrate și
procesate cu ajutorul software -ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-auefectuat pe un capilar de 48cm lungime (4 0cm lungime efectivă) x 50 µm
diametru (Agilent, Germania).
Soluțiilestocconținând100μg mL-1din fiecare compus s-au preparat în
metanolșiau fost diluate ulterior la concentra țiileconvenabil epentru analiză .
Pentru a stabilicondițiile adecvate pentru separare s -au realizat o serie de
experimente preliminare utilizând solu ții tampon de diferite compozi țiila diferite
valori de pH.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 161
LOR are un pK ade5,0corespunzător nucleului piridinic, în timp ce valorile p Ka
pentru DSL sunt 4,2 corespunzând nucleului piridinic și 9,7 corespunzând nucleului
piperidinic. CETaredouă func ții de baz iceși una acidă ,și în consecință treivalori pK a
de 2,2, 2,9 și 8,0 și, în funcție de pH, ex istă predominant ca zwitterion, fiin dîncărcată
negativ sau pozitiv în func ție de pH -ulsoluției tampon.
Optimizarea condi țiilor analitice s -a realizat într -o manieră univariată urmărind
influențaconcentra țieisoluției tampon , pH-ului soluției tampon ,aditivilor
tamponului ,voltajului aplic at, temperatur iiși aparametri lor de injectare asupra
rezoluției separării și timpilor de migrare a analiților.
Influența pH-ului solu ției tampon asupra timpilor de migrare a analiților este
reprezentată în figura 3.4.2 .
Figura 3.4.2. Influența pH-uluisoluției tampon asupra timpilor de migrare a
antihistaminicelor H1 studiate
Se poate observa că LOR poate fi determinat ăpe un interval de pH de 2 -5, în
timp ce DSL și CET pot fi detectate pe întregul interval de pH studiat. În intervalul de
pH 7-9 CET mi grează foarte aproape sau chiar cu FEO. Timpii de migrare ai
substanțelor analizate au crescut peintervalul de pH 2 -5, au fost aproape similare în
intervalul de pH 5 -9și au scăzut în intervalu del pH 9-11.
Utilizând o solu ție tampon conținând 25 mM fosfat, la un pH de 2,5, aplicând o
tensiune de + 25 kV la o temperatură de 20 ° C, am ob ținut separarea simultană a

162| Hancu Gabriel
antihistamin icelorH1studiate în aproximativ 5 minute, ordinea de separare fiind:
DES, CET, LOR (figura 3.4.3.)
Figura 3.4.3 . Separarea antihi staminicelor H1 studiate prin ECZ ( condiții analitice: 25
mMfosfat,pH2,5, + 25kV,20˚C, 50 mbar/ 1sec, 240 nm,15µg mL-1)
Performan țele analitice ale m etodeioptimizat eaufost evaluat epe baza
preciziei, linearit ății, robusteții,acurateței și s-aucalculat LOD șiLOQ(tabel 3.4.1 ).
Tabel 3.4.1. Liniaritatea și sensibilitatea metodei ECZ
AnalițiEcuația de regresieCoeficient de
corelațieLOD
(gmL-1)LOQ
(gmL-1)
DES y = 1.9195x + 2.622 0.993 1.25 3.50
CET y = 1.8798 + 1.9175 0.998 1.35 3.90
LOR y = 2.3931x + 4.3726 0.993 1.30 3.70
Procedura analitică optimizată a fost aplicată pentru analiza individuală a
antihistaminicelor H1 studiate dinpreparate farmaceutice. Rezultatele ob ținute au
fost în conformitate cu cantită țile declarate de către producători, regăsirile fiind în
intervalul de 95,5 -101,5% substan ță activă.
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Hancu G. Câmpian C. Rusu A. Mircia E. Kelemen H. Simultaneous determination of
loratadine, deslorata dine and cetirizine by capillary zone electrophoresis . Advanced
Pharmaceutical Bulletin 2014, 4(2): 161 -165,revistă indexată ISI [164].

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 163
3.5. Determinarea prin EC a unor hipolipemiante
Nivelurile ridicate de colesterol au fost corelate cu o inciden ță ridicată a bolilor
cardiovasculare, în spețăcu evenimente cardiovasculare grave cum ar fi angina
pectorală, infarctul miocardic sau accidentele vasculare cerebrale [165].
Statinele (inhibitori ai 3 -hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductazei -HMG-
CoA reductaza)sunto clasă de agen ți hipolipemianți utilizați în terapia modernă care
acționează prin scăderea nivelului de colesterol prin inhibarea HMG -CoA reductazei,
enzimă cheie în sintezei colesterolului responsabilă pentru conversia HMG -CoA înacid
mevalonic[165].
În funcție de structura lor, statinele au fost grupate în două mari grupe, statine
de tipul I, cunoscute ca și statine naturale șisemisintetice, respectiv statine de tipul II
denumite și statine sintetice.
Lovastatina (LOV A) a fost primul compu s din această clasă disponibil în terapie
pentru tratamentul hipercolesterolemiei, în timp ce simvastatina (SIMV) a fost
obținută din LOV Aprin înlocuirea catenei secundare 2 -metilbutiril cu gruparea 2,2 –
dimetilbutiril; ambii compu și sunt prodruguri fiind transforma țiin vivoîn metaboli ți
activi.
Atorvastatina (ATOR) și fluvastatina (FLUV) sunt doi inhibitori sintetici aiHMG-
CoA reductază, ambii deriva ți având în catenă secundară un rest de acid heptanoic cu
două grupe hidroxil înpozițiileβșiδ, aceasta fiindgrupareafarmacoforă care este
recunoscută de HMG -CoA reductază.
EC a fost aplicată pentru analiza FLUV din forme farmaceutice și probe biologice
[166]și, de asemenea, pentru separarea chirală a enantiomerilor FLUV [167]. Pentru
determinarea simul tană a ATOR și a substanțelor înrudite a fost aplicată o metodă
ECM[168].A fost elaborată o metodă ECMșipentru cuantificarea LOVA și SIMVdin
forme farmaceutic e[169]. Mai recent, a fost elaborată și aplicată o metodă ECM
pentru determinarea simultană așase statine diferite și analiza acestora dinforme
farmaceutice tipizate[170].
Structurile chimice ale statinelor studiate sunt prezentate în figura 3.5.1 .

164| Hancu Gabriel
Figura 3.5.1. Structurile chimice ale statinelor studiate
În acest studiu am utilizat următor ii compu și de calitate farmaceutică:
atorvastatin sare de calciu (Morepen Laboratories ,India), fluvastatin sare de sodiu
(Neo-Dankong Pharmaceutical ,China), lovastatin (Recordati Industria Chimica e
Farmaceutica, Italia), simvastatin ( Gedeon Richter, Tîr gu Mureș, Romania ).
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD; electroferogramele au fost înregistrate și
procesate cu ajutorul software -ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-au efectuat pe un capilar de 38cm lungime ( 30cm lungime efectivă) x 50 µm
diametru (Agilent, Germania).
Soluțiilestocconținând100μg mL-1din fiecare compus s-au preparat în
metanolșiau fost diluate ulterior la concentra țiileconvenabil epentru analiză.
Pentru a determina comportamentul electroforetic al anali țilorși pentru a
stabilicondițiileelectroforetice adecvate pentru separare, s -au efectuat o serie de
experimente preliminare utilizând solu ții tampon având compoziții diferite la valori
diferite ale pH -ului.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 165
ATORși FLUV prezintă o grupă carboxil prin urmare se pot ioniza complet într -o
formă anionică la utilizarea unui tampon cu pH alcalin, dar LOVA și SIMV sunt în
formă de lactonă neutră, prin urmare nu sunt ionizate, nu au mobilitate ele ctroforetică
proprieși vor migra împreună cu FEO.
Pentru a transforma forma lactonică a LOVA și SIMV într -o formă ionizabilă am
recurs la o hidroliză alcalină, adăugând o solu ție de NaOH 0,1N peste o soluțiile stoc de
LOVAși SIMV într -un raport 1:1 (figura 3.5.2).
Figura 3.5.2. Hidroliza alcalină a LOVA și SIMV
Efectuând această hidroliză am reu șit detectarea formelor acide ale LOVA și
SIMV în mediu alcalin, dar datorită similitudinilor structurale cele două substan țe au
migrat împreună, având aceea șimobilitate electroforetică. Prin urmare chiar și în
urma hidrolizei nu am reu șit detectarea simultană decât a trei compuși din cei patru
analizați.
Putem afirma că tehnica de ECZ poate fi utilizată cu succes la separarea ATOR de
FLUV dar nu poate rezolva s epararea simultană a LOVA și SIMV.Utilizând o solu ție
tampon con ținând 25 mM tetraborat de sodiu , la un pH de 9,3, aplicând o tensiune de
+ 25kV la o temperatură de 2 5°C, am obținut separarea simultană a celor două statine
în aproximativ 2minute, ordine a de separare fiind: ATOR, FLUV (figura 3.5.3 ).

166| Hancu Gabriel
Figura 3.5.3. Separarea ATOR și FLUV prin ECZ (condiții analitice: 25 mM borat, pH
9,3, + 25kV,25˚C, 50 mbar/ 1sec, 240 nm,15µg mL-1)
Pentru a separa LOVA și SIMV, am aplicat o metodă ECM, prin adăuga rea unui
surfactant anionic (DSS) la solu ția tampon. Separarea dintre LOVA și SIMV poate fi
rezolvată prin ECM, dar doar după o prealabilă hidroliză alcalină, formele neutre
lactonice neputând fi separate nici prin această metodă. O modificare a ordinii de
migrare între ATOR și FLUV a fost observată la aplicarea ECM.
Optimizarea condi țiilor analitice s -a realizat într -o manieră univariată urmărind
influențaconcentra țieisoluției tampon , pH-ului soluției tampon ,concetrației DSS,
voltajului aplicat , tempera turiiși aparametri lor de injectare asupra rezolu ției
separării și timpilor de migrare a analiților.
Mecanismul de separare în ECMpoate fi explicat pe baza reparti ției analiților
întrefaza micelară șiceaapoasă;cu câtprocentul de analit distribuit în micelăeste
mai mare , cu atâtacesta va migra mai lent . În cazul nostru, statinele încărcate negativ
nu au fost puternic atrase de micel ele anionice de DSS și, în consecință, au fost
separate ca urmare a diferen țelordintremobilitățileelectroforetice propriișia
hidrofobicit ății.
Utilizând o solu ție tampon conținând 25 mM tetraborat de sodiu și 25 mM DSS ,
la un pH de 9,3, aplicând o tensiune de + 25 kV la o temperatură de 25°C, am ob ținut

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 167
separarea simultană a celor patrustatine în aproximativ 3minute, ordinea de
separare fiind: FLUV , ATOR, LOVA, SIMV ( figura 3.5.4 ).
Figura 3.5.4. Separarea statinelor prin ECM(condiții analitice: 25 mM borat, 25mM
DSS,pH9,3, + 25kV,25˚C,30 mbar/2sec, 240 nm,15µg mL-1)
Performan țele analitice ale m etodeioptimizateaufost evaluat epe baza
preciziei, reproductibilită ții,linearității, robuste ții,acurateței și s-au calculat LOD și
LOQ (tabel 3.5.1).
Tabel 3.5.1.Liniaritatea și sensibilitatea metodei ECM
Analit Ecuatie de regresie Coeficient de
corelatieLOD
(gmL-1)LOQ
(gmL-1)
ATOR y = 0,253x + 0,016 0,997 3,58 10,86
FLUV y = 0,442x –0,368 0,997 4,09 12,41
LOVA y = 0,417x –0,688 0,996 5,44 16,50
SIMV y = 0,384x –0,713 0,995 5,62 17,03
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost public ate în articolul:
Mircia E. Hancu G. (autor corespondent) Rusu A. Cazacu A. Balaci T. Soare R.
Determination of HMG -CoA reductase inhibitors by micellar electrokinetic
chromatography , Acta Medica Marisiensis, 2016, 62(2): 187 -191, revistă indexată BDI
[171].

168| Hancu Gabriel
Fibrații sunt agenți hipolipemianți utilizați în tratamentul unui număr ridicat de
tulburări metabolice, în special în hipercolesterolemie, activând receptorii activatori
ai proliferării peroxizomilor. Fibrații scad ef icientnivelurile trigliceridelor plasmatice
(TG)și cresc nivelurile de HDL colesterolului , cu efecte variabile asupra LDL
colesterolului [172].
Structural fibra țiisunt deriva ți de acid fibric ( acid2-fenoxi-2-metilpropanoic) ;
în studiul de fa ță fiindincluși următorii compu și:bezafibrat(acid 2-[4-[2-[(4-
clorobenzoil) amino] etil] fenoxi] -2-metilpropanoic) ,clofibrat (esterul etilic al
acidului 2 -(4-clorfenoxi) -2-metilpropanoic), fenofibrat (esterului metilic al acidului
2-[4-(4clorobenzoilfenoxi] -2-metilpropanoic) șigemfibrozil(acid5-(2,5-
dimetilfenoxi)-2,2-dimetilpentanoic ).Structurile chimice ale fibraților studiați sunt
prezentate în figura 3.5. 5.
Figura 3.5.5 . Structurile chimice ale fibra ților studiați
Consultând literatura de specialitate am găsit doar câteva me tode de
determinare a fibra ților prin EC; astfel Komsta a descris o metodă ECZpentru
determinarea bezafibratului, ciprofibratului, gemfibrozilului din preparate
farmaceutice utilizând acid clofibric ca standard intern , dardeterminarea clofibratului
și fenofibratului nu a fost rezolvată deoarece anali ții au migrat împreună cu FEO
[173];o altă metodă de ECM pentru determinarea fenofibratului și a metabolitului
său, acidul fenofibric dincapsuleșiser,fiind publicată decătreShihabi[174].

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 169
În acest studi u am utilizat următorii compu și de calitate farmaceutică:
bezafibrat, clofibrat, fenofibrat, gemfibrozil (Cayman Pharmaceuticals, SUA) .
Determinările au fost efectuate pe un sistem Agilent 1600 CE (Agilent,
Germania) echipat cu un detector DAD; electrofero gramele au fost înregistrate și
procesate cu ajutorul software -ului Chemstation 7.01 (Agilent, Germania) . Separările
s-au efectuat pe un capilar de 38cm lungime ( 30cm lungime efectivă) x 50 µm
diametru (Agilent, Germania).
Soluțiilestocconținând1mg mL-1din fiecare compus s-au preparat în metanol
șiau fost diluate ulterior la concentra țiileconvenabil epentru analiză.
Pentru a determina comportamentul electroforetic al anali țilorși pentru a
stabilicondițiileelectroforetice adecvate pentru separare , s-au efectuat o serie de
experimente preliminare utilizând solu ții tampon având compoziții diferite la valori
diferite ale pH -ului.
Bezafibratul (pK a-3.6)și gemfibrozilul (pK a-4.5) au în structura lor o grupare
carboxilică ionizabilă și pot fi deter minatepe un interval de pH între 5,0 și 11,0unde
ambii fibra ți sunt în formă anionică ; dar clofibratul și fenofibratul sunt esteri și nu
ionizează, neprezentând mobilitate electroforetică proprie .În consecin ță,ECZpoate fi
aplicată numai pentru determi narea bezafibratului și gemfibrozilului, în timp ce
clofibratul și fenofibratul vor migra împreună cu FEO.
Pentru a separa to ți cei patru analiti, o substanță tensioasă anionică (DSS) a fost
adăugată solu ției tampon. Optimizarea condi țiilor analitice s -a realizat într -o manieră
univariată urmărind influen ța concentrației soluției tampon, pH -ului soluției tampon,
concetrației DSS, voltajului aplicat, temperaturii și a parametrilor de injectare asupra
rezoluției separării și timpilor de migrare a analiților.
Utilizând o solu ție tampon conținând 25 mM tetraborat de sodiu și 25 mM DSS ,
la un pH de 9,3, aplicând o tensiune de + 2 0kV la o temperatură de 2 0°C, am ob ținut
separarea simultană a celor patrustatine în aproximativ 4minute, ordinea de
separare fiind: bezafibrat, gemfibrozil, clofibrat, fenofibrat ( figura 3.5.6 ).

170| Hancu Gabriel
Figura 3.5.6. Separarea fibrațilorprin ECM(condiții analitice: 25 mM borat, 25mM
DSS,pH9,3, + 20kV,20˚C,50mbar/1sec, 210 nm,100µg mL-1)
Performan țele analitice ale m etodeioptimiza teaufost evaluat epe baza
preciziei, reproductibilită ții,linearității, robuste ții,acurateței și s-au calculat LOD și
LOQ (tabel 3.5.2).
Tabel 3.5.2. Liniaritatea și sensibilitatea metodei ECM
Analit Ecuatie de
regresieCoeficient de
corelatieLOD
(gmL-1)LOQ
(gmL-1)
Bezafibrat y=0,858x+1,488 0,999 0.028 0.092
Gemfibrozil y=0,787x+1,142 0,999 0.025 0.082
Clofibrat y=0,701x -0,077 0,998 0.029 0.097
Fenofibrat y=1,752x+0,385 0,999 0.022 0.073
Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au fost publicate în articolul:
Mircia E. Hancu G. Nițu O. Kelemen H. Cârcu-Dobrin M. Gâz ȘA. Balaci T. Simultaneous
determination of fibrates by micellar electrokinetic capillary chromatography .
Farmacia, 2017, 65(1), 109 -113,revistă indexată ISI , FI: 1,348 [175].

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 171
BIBLIOGRAFIE
1. ***, Farmacopeea Română, edi ția a-X-a, Editura Medicală, Bucure ști, 1993, 1049 –
1051.
2. ***, European Pharmacopoeia, 9thedition, 1stvolume, Council of Europe, Strasbourg,
2017.
3. Landers JP (editor), Handbook of capillary and micr ochip electrophoresis and
associated microtechniques, 3rdedition, CRC Press, Boca Raton, Florida, 2008, 3 -75.
4. Ahuja S, Jinidar MH (editors), Capillary electrophoresis methods for pharmaceutical
analysis, 1st edition, Academic Press, Amsterdam, 2008, 1 -62.
5. Schmitt -Kopplin P (editor), Capillary electrophoresis –methods and protocols,
Humana Press, Totowa, 2008.
6. Nishi H .Capillary electrophoresis of drugs: current status in the analysis of
pharmaceuticals, Electrophoresis .1999;20(15 -16):3237 -3258
7.Suntornsuk L .Capillary electrophoresis inpharmaceutica l analysis :a survey on
recent applications. J Chromatogr Sci. 2007;45(9):559 -77.
8.Deeb SE, Wätzig H, El -Hady DA, Albis hri HM, de Griend CS, Scriba GK. Recent
advances in capillary electrophoretic migration techniques for pharmaceutical
analysis, Electrophoresis .2014;35(1):170 -89.
9. Issaq H .A decade of capillary electrophore sis.Electrophoresis. 2000;21(10):1921 –
1939.
10. Priego-Capote F, Luque de Castro MD. Dualinjection capillary electrophoresis :
foundations and applications. Electrophoresis. 2004;25(23 -24):4074 -4085.
11. Altria DK .Overview of capillary electrophoresis andcapillary
electrochromatography .J Chromatogr A . 1999;856(1 -2):443-463.
12. Ghosal S .Fluid mechanics of electroosmotic flow and its effect on band broadeni ng
in capillary electrophoresis. Electrophoresis. 2004;25(2):214 -228.
13. Rathore AS. Theory of electroosmotic flow, retention and separation efficiency in
capillary electrochromatography .Electrophoresis. 2002;23(22 -23):3827 -3846.
14. Terabe S. Micellar electrokinetic chromatography for high -performance analytical
separation. Chem Rec. 2008;8(5):291 -301.
15. Terabe S. Capillary separat ion: micella r electrokinetic chromatography. Annu Rev
Anal Chem. 2009;2:99 -120
16.Hancu G , Simon B, Rusu A, Mircia E, G yéresi Á. Principles of micellar electrokinetic
capillary chromatography applied in pharmaceutical analysis .Adv Pharm Bull .2013,
3(1):1-8.

172| Hancu Gabriel
17.Zhu Z, Lu JJ, Liu S. Protein separation by capillary gel electrophoresis: a review .
Anal Chim Acta. 2012;709: 21 –31.
18.Rodriguez -Diaz R, Wehr T, Zhu M. Capillary isoelectric focusing . Electrophoresis.
1997;18(12-13):2134 -2144.
19. Bartle KD, Myers P. Theory of capillary electrochromatography .Journal of
Chromatography A .2001;916(1-2):3-23.
20.Scriba GK. Differentiation of enantiomers by capillary electrophoresis .Top Curr
Chem. 2013;340:209 -275.
21.Nowak P, Woźniakiewicz M, Kościelniak P. Application of capillary electrophoresis
indetermination of acid dissociation constant values .J Chromatogr A .
2015;16;1377:1 -12.
22. Kenndler E. A critical overview of non-aqueous capillary electrophoresis . Part I:
mobility and separation selectivity. J Chromatogr A. 2014;28;1335:16 -30.
23. Kenndler E .Acritical overview of non-aqueous capillary electrophoresis . Part II:
separation efficiency and analysis time. J Chromatogr A . 2014,28;1335:31 -41.
24. Patocka J, Dvorak A. Biomedical aspects of chiral molec ules. J Appl Biomed.
2004;2(2):95-100.
25.Sekhon SB. Exploiting the power of stereochemistry in drugs: an overview of
racemic and enantiopure drugs . J Modern Med Chem. 2013; 1:10-36.
26.Nguyen LA, He H, Pham -Huy C. Chiral drugs: An overview. Int J Biomed Sci .
2006;2(2):85-100.
27. Lenz W. Thalidomide and congenital anomalies. Lancet.1962;279(7219):45
28. Cahn RS, Ingold CK, Prelog V. The specification of asymmetric configuration in
organic chemistry . Experienta .1956;12: 81-124.
29. Stinson SC. Chiral pharmac euticals. Chem Eng News. 2001;79(40): 79 -97.
30. Agranat I, Caner H, Caldwell J. Putting chirality to work: the strategy of chiral
switches. Nat Rev Drug Discov .2002;1:753 -68.
31. Drayer DE. Pharmacodynamic and pharmacokinetic differences between drug
enantiomers in human: an overview. Clin Pharmacol Ther. 1986;40(2):125–133.
32. Landoni MF, Soraci A. Pharmacology of chiral compounds: 2 -Arylpropionic acid
derivatives. CurrDrug Metab .2001;2(1):37–51.
33. Raikumar SV. Thalidomide: Tragedy past and promisin g future. Mayo Clin Proc.
2004;79(7):899–903.
34.Lin JH, Lu AYH. Role of pharmacokinetics and metabolism in drug discovery and
development. Pharmacol Rev. 1997;49(4):403–449.
35. Anderson S, Allenmark SG. Preparative chiral chromatographic resolution of
enantiomers in drug discovery. J Bio Biophys Met. 2002;54(1-3):11–23.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 173
36.Gübitz G, Schmid MG. Chiral separation principles in chromatographic and
electromigration techniques. Mol Biotechnol .2006;32:159 –180.
37. Berthod A. Chiral recognition mechanisms. A nal Chem .2006;78:2093 -2099.
38.Gübitz G, Schmid MG. Recent advances in chiral separation principles in capillary
electrophoresis and capillary electrochromatography. Electrophoresis. 2004;23:398 –
3996.
39.Gübitz G, Schmid MG. Chiral separation by chromat ographic and electromigration
techniques. A review. Biopharm Drug Dispos .2001;22(7 -8):291–336.
40.Scriba GK. Differentiation of enantiomers by capillary electrophoresis .Top Curr
Chem. 2013;340:2 09-275.
41. Fanali S. Chiral separations by CE employing CDs. Electrophoresis .2009;1:S203 –
210.
42.de Boer T ,de Zeeuw RA ,de Jong GJ ,Ensing K .Recent innovations in the use of
charged cyclodextrins in capillary electrophoresis for chiral separations in
pharmaceutical analysis. Electrophoresis .2000;21(5):3220 -3229.
43. Scriba G, Jáč P.Enantioseparations by capillary electrophoresis using cyclodextrins
aschiralselectors .Methods Mol Biol . 2013;970:271 -287.
44. Wren SA , Rowe RC, Payne RS. A th eoretical approach to clinical capillary
electrophoresis with some practical implications. Electrophoresis .1994;15:774 –778.
45.Rezanka P ,Navrátilová K ,Rezanka M ,Král V,Sýkora D.Application of
cyclodextrins in chiral capillary electrophoresis. Electrophoresis .2014;35(19):2701 –
2021.
46. Stoschitzky K, Zernig G, Lindner W. Racemic beta -blockers –fixed combinations of
different drugs. J Clin Bas Cardiol. 1998;1(1):14 -19.
47.Mehvar R, Brocks DR. Stereospecific pharmacokinetics and pharmacodynamics of
beta-adrenergic blockers in humas. J Pharma Pharmaceut Sci. 2001;4(2):185 -200.
48. Egginger G, Lindner W, Vandenbosch C, Massart DL. Enantioselective bioanalysis
of beta-blocking agents: focus on atenolol, betaxolol, carvedilol, metoprolol, pindolol,
propranolol and sotalol. Biomed Chromatogr. 1993;7:277 -295.
49.Bretnall AE, Clarke GS. Selectivity of capillary electrophoresis for the analysis of
cardiovascular drugs. J Chromatogr A. 1996;745:145 -154.
50.Vargas MG, Van der Heyden Y, Maftouh M, Massart DL. Rapid development of the
enantiomeric separation of b -blockers by capillary electrophoresis using an
experimental design approach. J Chromatogr A. 1999;855:681 -693.
51. Gagyi L, G yéresi Á, Kilár F. Role of chemical structure in stereoselective recognition
of ß-blockers by cyclodextrins in capillary zone electrophoresis. J Biochem Biophys
Meth.2008;70:1268-1275.

174| Hancu Gabriel
52.Muntean DL, Hancu G ,Kelemen H, Rusu A, Ciurba A. Cyclodextrine sc reening for
the chiral separation of beta -blockers derivatives. Revista de Chimie.
2015,66(7): 1019-1023.
53. Di Nicola ntonio JJ, Hackam DG. Carvedilol: a third -generation β -blocker should be
a first-choice β-blocker.Expert Rev Cardiovasc Ther. 2012;10(1):13 -25.
54.Phuong NT, Lee BJ, Choi JK, Khan JS and Kwon K. Enantioselective
pharmacokinetics of carvedilole in human volunteers. Arch Pharm Res. 2004;27:973-
977.
55. Clohs L, McErlane KM. Development of a capillary electrophoresis assay for the
determination of carvedilol enantiomers in serum using cyclodextrins. J Pharmaceut
Biomed Anal. 2001;24:545 -554.
56. Clohs L, McErlane KM. Comparison between capi llary electrophoresis and high –
performance liquid chromatography for the stereoselective analysis of carvedilol in
serum.J Pharmaceut Biomed Anal. 2003;31:407 -412.
57.Hancu G. Cârje A. Iuga I. F ülöp I. Szabó Z. Cyclodextrine screening for the chiral
separation of carvedilol by capillary electrophoresis .Iran J Pharm Res.
2015,14(2):425 -433.
58. Anderson JL, Prystowsky EN, Sotalol: An important new antiarrhythmic. Am Heart
J. 1999;137(3):388 -409.
59.Fiset C, P hilippon F, Gilbert M, Turgeon J. Stereoselec tive disposition of (+/ -)-
sotalolat steady -state conditions. Br J Clin Pharmacol . 1993;36(1):75 -77.
60.Pratt CM, Camm AJ, Cooper W, Friedman PL, MacNeil DJ, Moulton KM, Pitt B,
Schwartz PJ, Veltri EP, Waldo AL. Mortality in the Survival With ORal D -sotalol
(SWORD) trial: why did patients die ? Am J Cardiol . 1998;81(7):869 -876.
61.Hancu G . Sămărghițan C. Rusu A. Mircia E. Sotalol chiral separation by capillary
electrophoresis . J Chil Chem Soc. 2014,59(3):2559 -2562.
62.Simons FER, Simons KJ. Histamine and H1-antihistamines: celebrating a century of
progress. J Allergy Clin Immunol. 2011;128:1139 –1150.
63.Mahdy AM, Webster NR. Histamine and antihistamines. Anaesth Intensive Care
Med. 2014;15:250 –255.
64. Otsuka K, Terabe S Optical resolution of chlorphenir amine by cyclodextrin added
capillary zone electrophoresis and cyclodextrin modified micellar electrokinetic
chromatography. J Liq Chromatogr. 1993;16:945 –953.
65. Chankvetadze B, Burjanadze N, Pintore G, Bergenthal D, Bergander K ,
Mühlenbrock C ,Breitkreu z J. Blaschke G. Separation of brompheniramine enantiomers
by capillary electrophoresis and study of chiral recognition mechanisms of
cyclodextrins using NMR -spectroscopy, UV spectrometry, electrospray ionization
mass spectrometry and X -ray crystallography . J Chromatogr A .2000;875:471 –484.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 175
66. Mikus P, Valásková I, Havránek E. Enantioselective determination of pheniramine
in pharmaceuticals by capillary electrophoresis with charged cyclodextrin. J Pharm
Biomed Anal .2005;38:442 –448.
67. Chou Y -W, Huang W -S, Ko C-C, Chen S -H Enantioseparation of cetirizine by
sulfated-beta-cyclodextrin -mediated capillary electrophoresis. J Sep Sci. 2008;1:845 –
852.
68.Servais AC, Fillet M. Application of dual cyclodextrin systems in capillary
electrophoresis enantioseparatio ns. Methods Mol Bio .2013;970:289 -295.
69. Szabó ZI. Tóth C. Hancu G. Muntean DL. Simultaneous chiral separation of four H1 –
antihistamines by capillary zone electrophoresis using a dual cyclodextrin system,
Chromatograhia. 2015;78(21):1377 -1384.
70.SachsG, Shin JM, Howden CW. Review article: the clinical pharmacology of proton
pump inhibitors. Aliment Pharmacol Ther. 2006;23:2 –8.
71. Anderson T, Weidolf L. Stereoselective disposition of proton pump inhibitors. Clin.
Drug Investig. 2008;28: 263 -279.
72. Bosch ME, Sanchez AJR, Rojas FS, Ojeda CB. Analytical methodologies for the
determination of omeprazole: An overview. J Pharm Biomed Anal. 2007;44: 831 -844.
73.Eberle D, Hummel RP, Kuhn R. Chiral resolution of pantoprazole sodium and
related sulfoxides by c omplex formation with bovine serum albumin in capillary
electrophoresis. J Chromatogr A .1997;759:185-192.
74.Nevado JJB, Penalvo GC, Dorado RMR. Method development and validation for the
separation and determination of omeprazole enantiomers in pharmace utical
preparation by capillary electrophoresis. Anal Chim Acta .2005;533: 127-133.
75. Olsson J, Stegander F, Marlin N, Wan H, Blomberg LG. Enantiomeric separation of
omeprazole and its metabolite 5 -hydroxymetabolite using non -aqueous capillary
electrophor esis. J Chromatogr A .2006;1129: 291 -295.
76. Estevez P, Flor S, Boscolo O, Tripodi V, Lucangioli S; Development and validation of
a capillary electrophoretic method for determination of enantiomeric purity and
related substances of esomeprazole in raw mat erials and pellet. Electrophoresis .
2014;315:804 -810.
77. Guan J, Yan F, Shi S, Wang S. Optimization and validation of a new CE method for
the determination of pantoprazole enantiomers. Electrophoresis .2012;33:1631 -1636.
78.Hancu G. Papp L. Rusu A .Chiral separation of the enantiomers of omeprazole and
pantoprazole by capillary electrophoresis . Chromatographia .2015;78:279-284.
79.Wong DT. Perry KW. Bymaster FP. Case history: the discovery of fluoxetine
hydrochloride (Prozac). Nature Reviews. Drug Discov ery.2005;4(9):764 -774.
80.Mandrioli R. Forti GC. Raggi MA. Fluoxetine metabolism and drug onteractions: the
role of cytocrome P450. Curr Drug Met .2016;7(2):127 -133.

176| Hancu Gabriel
81. Eap CB. Bondol G. Zullino D. Savary -Cosendai L. Powell -Golay K. Kosel M.
Baumann P. Concentrations of the enantiomers of fluoxetine and norfluoxetine after
multiple doses of fluoxetine in cytochrome P4502D6 poor and extensive metabolizers.
JClin Psychopharmacol .2001;21:330 -334.
82. McConathy J. Owens MJ. Stereochemistry in drug action. Prim Care Companion J
ClinPsychiatry .2003;5(2):70 -73.
83. Steiner TJ. Ahmed F. Findley LJ. MacGregor EA. Wilkinson M. S-fluoxetine in the
prophylaxis of migraine : a phase II double -blind randomized placebo -controlled
study.Cephalalgia .1998;18(5):283 -286.
84. Chhabra N. Aseri ML. Padmanabhan D. A review of drug isomerism and its
significance. Int J App BasicMed Res.2013;3(1):16 -18.
85.Desiderio C. Rudaz S. Raggi MA. Fanali S. Enantiomeric separation of fluoxetine and
norfluoxetine in plasma and serum s amples with high detection sensitivity capillary
electrophoresis. Electrophoresis .1999;20:3432 -3438.
86. Inoue T. Chang JP. Chiral separation of fluoxetine and its analogs with charged
cyclodextrins by capillary electrophoresis. J Liq Chromatogr Relat Tec hnol.
2003;26:2351 -2367.
87. Javid FS. Shafaati A. Zarghi A. Improvement of capillary electrophoretic
enantioeseparation of fluoxetine by a cationic additive. Iran J Pharm Res .2013;12:71 –
76.
88. Asensi -Bernardi L. Martin -Biosca Y. Fornet -Herrero E. Sagrad o S. Medina
Hernández MJ. Determination of fluoxetine enantiomers in pharmaceutical
formulations by electrokinetic chromatography –counter current technique. Biomed
Chromatogr .2013;27:377–381.
89.Hancu G. Cârcu-Dobrin M. Budău M. Rusu A. Analytical method ologies for the
stereoselective determination of fluoxetine: an overview. Biomed Chromatogr .2018,
32(1).
90.Hanrahan G. Montes R. Gomez F. Chemometric experimental design based
optimization techniques in capillary electrophoresis. Anal Bioanal Chem .
2008;390:169 -179.
91.Orlandini S. Gotti R. Furlanetto S. Multivariate optimization of capillary
electrophoresis methods: a critical review. J Pharm Biomed Anal .2014;87:290 –307.
92.Cârcu-Dobrin M. Budău M. Hancu G. Gagyi L. Rusu A. Kelemen H. Enantioselectiv e
analysis of fluoxetine in pharmaceutical formulations by capillary zone
electrophoresis. Saudi Pharm J .2017;25:397 -403.
93. Clarke RJ. Indapamide: a diuretic of choice for the treatment of hypertension? Am J
Med Sci.1991;301(3):215 -220.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 177
94.Albu F. Georgiță C. David V. Medvedovici A. Liquid chromatography –electrospray
tandem mass spectrometry method for determination of indapamide in serum for
single/multiple dose bioequivalence studies of sustained release formulations. J
Chromatogr B .2005;816:30 -40.
95.Du B. Pang L. Li H. Ma S. Li Y. Jia X. Zhang Z. Chiral liquid chromatography
resolution and stereoselective pharmac okinetic study of indapamid e enantiomers in
rats,J Chromatogr B .2013;932:88 -91.
96.Ren X. Dong Y. Liu J. Huang A. Liu H. Sun Y. Sun Z. Separation of chiral basic drugs
with sulfobutyl -β-cyclodextrin in capillary electrophoresis. Chromatographia .
1999;50: 363 -368.
97.Tero Vesc an A.Hancu G. Oroian M. Cârje A. Chiral separation of indapamide
enantiomers by capillary electrophoresis .Adv Pharm Bull. 2014, 4(3): 267 -272.
98.Cârje AG. Ion V. Muntean DL. Hancu G. Balint A. Imre S. Enantioseparation of
indapamide by high performance liquid chromatography using ovomucoid
glycoprotein as chiral selector. Farmacia .2016,64(2):181 -186.
99.Luque CA. Rey JA. The discovery and status of sibutramine as an anti -obesity drug.
Eur J Pharmacol. 2002;(2 -3):119-128.
100.Finer N. Sibutramine : itsmode of actionand efficacy. Int J Obes Relat Metab
Disord.2002;26(4):29 -33.
101.Glick SD. Haskew RE. Maisonneuve IM. Carlson JN. Jerussi TP. Enantioselective
behavioral effects of sibutramine metabolites. Eur J Pharmacol. 2000;397:93 -102.
102.Scheen A J.Cardiovascular risk -benefit profile of sibutramine .Am J Cardiovasc
Drugs.2010; 10(5):321 -334.
103. Dunn JD. Gryniewicz -Ruzicka CM. Kauffman JF. Westenberger BJ. Buhse LF. Using
a portable ion mobility spectrometer to screen dietary supplements for sibutramine. J
Pharm Biomed Anal .2011;54(3):469 -474.
104.Zhu H. Wu E. Chen J. Men C. Jang YS. Kang W. Choi JK. Lee W. Kang JS.
Enantioseparation and determination of sibutramine in pharmaceutical formulations
by capillary electrophoresis. Bull Korean Chem S oc. 2010; 31:1496-1500.
105. Lee YJ. Choi S. Lee J. Nguyen NT. Lee K. Kang JS. Mar W. Kim KH. Chiral
discrimination of sibutramine enantiomers by capillary electrophoresis and proton
nuclear magnetic resonance spectroscopy. Arch Pharm Sci Res. 2012;35(4):67 1-681.

178| Hancu Gabriel
106.Vlad RA. Hancu G. Kelemen H. Ciurca D. Tero -Vescan A. Analytical methodologies
for the stereoselective determination of sibutramine: an overview, Acta Medica
Marisiensis, 2017;63(2):52 -55.
107.Hancu G. Hilochie A. Vlad R.A. Cârje A. Tero -Vescan A., Enantiomeric separation
of sibutramine by capillary zone electrophoresis. J Braz ChemSoc. 2016,26(7):1116 –
1120.
108.Murdoch D. Heel RC. Amlodipine. A review of its pharmacodynamic and
pharmacokinetic properties, and therapeutic use in cardiovascular disease. Drugs.
1991,41(3):478 -505.
109.Luksa J. Josic D. Kremser M. Kopitar Z. Milutinovic S. Pharmacokinetic behaviour
of R-(+)-and S-(-)-amlodipine after single enantiomer administration. J Chromatogr B.
1997, 703: 185 -193.
110.Small SS, Fell AF, Co leman MW, Berridge JC. Central composite of ruggedness and
design for the rapid optimisation chiral separation of amlodipine in capillary
electrophoresis. Chirality. 1995;7: 226 -234.
111.Wang R. Jia Z. Fan JJ. Chen LR. Xie H. Ma J. Ge X. Zhang Q. Ao Y. Wa ng J.CE, with
hydroxypropyl -β-cyclodextrin as chiral selector, for separation and determination of
the enantiomers of amlodipine in the serum of hypertension patients.
Chromatographia. 2007;65: 575-579.
112.Owens PK. Fell AF. Coleman MW. Berridge JC. Effe ct of charged and uncharged
chiral additives on the resolution of amlodipine enantiomers in liquid
chromatography and capillary electr ophoresis. J Chromatogr A. 1998;797: 187–195.
113. Zandkarimi M. Shafaati A. Foroutan SM. Lucy CA. Rapid enantioseparation of
amlodipine by highly sulfated cyclodextrins using short -end injection capillary
electrophoresis. DARU. 2009;17(4): 269-275.
114.Hancu G. Budău M. Kántor L.K. C ârje A.Cyclodextrine screening for the chiral
separation of amlodipine enantiomers by capilla ry electrophoresis. Adv Pharm Bull,
2015;5(1):35 -40.
115.Shahid. M. Walker G. Zorn S. Wong E. Asenapine: a novel psychopharmacologic
agent with a unique human receptor signature, J. Psychopharmacol. 2008;23:65 –73.
116. Wadekar KR. Bhalme M. Rao SS. Reddy KV. Kumar LS. Balasubrahmanyam E.
Evaluating impurities in drugs (Part II of III), Pharm Technol. 2012;36:58 –72.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 179
117. Rundlett KL. Armstrong DW. Examination of the origin, variation, and proper use
of expressions for the estimation of association constant s by capillary electrophoresis,
J. Chromatogr. A. 1996;721:173 –186.
118. Lomsadze K. Martínez -Girón AB. Castro -Puyana M. Chankvetadze L. Crego AL.
Salgado A. About the role of enantioselective selector -selectand interactions and the
mobilities of diastereo meric associates in enantiomer separations using CE.,
Electrophoresis. 2009;30:2803 –2811.
119.SzabóZI. Tóth G. Völgyi G. Komjáti B. Hancu G. Szente L. Sohajda T. Béni S.
Muntean DL. Noszál B. Chiral separation of asenapine enantiomers by capillary
electrophoresis applying different cyclodextrin derivatives and characterization of
cyclodextrin complexes by NMR spectroscopy and mass spectrometry. J Pharm
Biomed Anal. 2016;117:398 -404.
120.Sotthivirat S. Haslam JL. Stella, VJ. Evaluation of various properti es of alternative
salt forms of sulfobuty lether-β-cyclodextrin, (SBE)7M -β-CD.Int JPharm.2007;330: 73-
81.
121.Skanchy DJ. Xie GH. Tait RJ. Luna E. Demarest C. Stobaugh JF. Application of
sulfobutylether β -cyclodextrin wih specific degree of substitution for the
enantioseparation of pharmaceutical mixtures by capillary electrophoresis.
Electrophoresis. 1999;20:2638 -2649.
122.Budău M. Hancu G. SzabóZI. Kelemen H. Rusu A. Muntean DL. Cârje AG.
Captisol® as chiral selector in capillary electrophoresis of no n-acidic drugs. J Chil
Chem Soc. 2017; 62(3):3566 -3571.
123.Chrysant SG. Using fixed-dosecombination therapies to achieve blood pressure
goals.Clin Drug Investig .2008;28, 713-734.
124.Wan X, Ma P, Zhang X. A promising choice in hypertension treatment: Fixed -dose
combinations. Asian J Pharm Sci. 2014;9:1-7.
125. Segura J. Ruilope LM. Clinical utility of fixed -combination telmisartan -amlodipine
in the treatment of hypertension. Integr Blood Press Control .2011;4:27-34.
126.Modroiu A. Hancu G. Vlad RA. Stăcescu Ș. Soare R. Kelemen H. Simultaneous
determination of amlodi pine and telmisartan from pharmaceutical products by
capillary electrophoresis Cur r IssuesPharmand Med Sci. 2016; 29(1): 42 -45.

180| Hancu Gabriel
127. Plosker GL. White WB. Telmisartan/Hydrochlorothiazide: a review of its use as
fixed-dose combinations in essential hyperte nsion. Drug s. 2008;68(13):1877 -1899.
128.Hillaert S. van den Bossche W. Simultaneous determination of
hydrochlorothiazide and several angiotensin -II-receptor antagonists by capillary
electrophoresis. J Pharm Biome Anal. 2003;31(2):329 -339.
129.Stăcescu Ș.HancuG.GagyiL.SoareRM.Kelemen H.Simultaneous determination
ofhydrochlorthiazide andtelmisartan frompharmaceutical preparations using
capillary electrophoresis. StudiaChemiaUBB,2017;LXII(2): 189-198.
130.McKeage K. Siddiqui MA. Amlodipine/Ato rvastatin fixed -dose combination: a
review of its use in the prevention of cardiovascular disease and in the treatment of
hypertension and dyslipidemia. Am J Cardiovasc Drugs. 2008;8(1):51 -67.
131.Curran MP. Amlodipine/Atorvastatin: a review of its use in the treatment of
hypertension and dyslipidaemia and the prevention o f cardiovascular disease. Drugs.
2010;70(2):191 -213.
132.Hefnawy M. Sultan M. Al -Johar H. Development of capillary electrophoresis
technique for simultaneous measurement of amlodipine an d atorvastatin from their
combination drug formulation. J Liq Chrom Relat Tech.2009;32(20): 2923-2942.
133.Mircia E. Balaci T. Hancu G. Ion V. Cârje A. Simultaneous determination of
amlodipine and atorvastin by capillary electrophoresis from fixed pharmac eutical
formulations. Farmacia .2016, 64(3): 398 -402.
134.Gagne C. Gaudet D. Bruckert E. Efficacy and safety of ezetimibe coadministered
with atorvastatin or simvastatin in patients with homozygous familial
hypercholesterolemia. Circulation. 2002;105:2469 -2475.
135.Al Sheri MM. A validated capillary electrophoresis method for simultaneous
determination of ezetimibe and atorvastatin in pharmaceutical formulations. Saudi
Pharm J. 2012;20:143 –148.
136.Székely-Szentmiklósi B. Hancu G. Székely-Szentmiklósi I. Kovács B. Kelemen H.
Simultaneous determination of atorvastatin and ezetimibe from combined
pharmaceutical products by micellar electrokinetic capillary chromatography. Braz J
Pharm Sci. 2017;53(1):1 -6.
137.Todd PA. Benfield B .Amoxicillin/clavulanic aci d. An update of its antibacterial
activity, pharmacokinetic properties and therapeutic use. Drugs.1990;39:264-307.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 181
138.Pajchel G. Pawlowski K. Tyski S. CE versus LC for simultaneous determination of
amoxicillin -clavulanic acid and ampicillin -sulbactam in pharmaceutical formulation
for injections. JPharm Biomed Anal . 2002;29:75-81.
139.Hancu G. Neacșu A. Papp LA. Ciurba A. Simultaneous determination of
amoxicillin and clavulinic acid in pharmaceutical preparations by capillary
electrophoresis. Braz J Pha rm Sci.2016;52(2): 281-286.
140.Caminero JA. Sotgiu G. Zumla A. Migliori GB. Best drug treatment for multidrug –
resistant and extensively drug -resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 2010;10:621 –
629.
141.Somasundaram S. Ram A. Sankaranarayanan L .Isoniazid and Rifampicin as
therapeutic regimen in the current era: a review, J Tuberc Res . 2014;2:40-51.
142.Faria AF. de Souza MVN. Burns RE. de Oliveira MAL. Simultaneous determination
of first-line anti-tuberculosis drugs by capillary zone electrophoresis using direct UV
detection. Talanta. 2010;82:333 -339.
143.Acedo-Valenzuela MI. Espinosa -Mansilla A. de la Peña AM.·Cañada -Cañada F.
Determination of antitubercular drugs by micellar electrokinetic capillary
chromatography (MEKC). Anal and Bioanal Chem. 200 2;374:432 -436.
144.Iriminescu D. Cârcu -Dobrin M. Hancu G. Mircia E. Kelemen H. Rusu A. Tilinca M.
Simultaneous determination of isoniazid and rifampicin by micellar electrokinetic
chromatography, Studia Universitas “VasileGoldiș” Seria Științele Vieții.
2016;26(3): 353-357.
145.Tilinca M. Hancu G. Mircia E. Iriminescu D. Rusu A. Vlad RA. Barabás E.
Simultaneous determination of isoniazid and rifampicin by UV spectrophotometry.
Farmacia, 2017;65(2):219 -224.
146. Dhillon S Tramadol/Paracetamol fixed -dose combination –A review of its use in
the management of moderate to severe pain. Clin Drug Investig 2010;30(10):711 -738.
147.Ciurba A. Hancu G. Cojocea L. Sipos E. Todoran N. Development of new
formulation and its evaluation by capillary electrophoresis of t ablets containing
tramadol hydrochloride and paracetamol . Pharm Dev Tech. 2014;19(7):833 -838.
148.Pajchel G. Michalska K. Tyski S.Analysis of phenoxymethylpenicillin potassium
by capillary electrophoresis. J Chromatogr B. 2005;1087: 197-202.

182| Hancu Gabriel
149.Bailon Perez MI. Cuadros Rodríguez L. Crusses–Blanco C .Analysis of different
beta-lactams antibiotics in pharmaceutical preparations using micellar electrok inetic
capillary chro matography. J Pharm Biomed Anal. 2007;43: 746–752.
150.Hernandez M. Borrull F. Calull M.Analysis of antibiotic in biological sampl es by
capillary electrophoresis. Trends Anal Che. 2003:22(7): 416-427.
151.Simon B. Hancu G .Gyéresi Á. Application of capillary electrophoresis to the
simultaneous determination and stability studies of fou r extensively used penicillin
derivatives. Braz J Pharm Sci. 2014;50(3): 521-527.
152.Pajchel G.Tyski S.Adaptation of capillary electrophoresis to the determination of
selected cephalosporins for injection. J Chromat A.2000,895: 27-31.
153.Gaspar A. Andrasi M.Kardos S. Application of capillary zone electrophoresis to
the analysis and to a stability study of cephalosporins. J Chromat B.2002;775: 239-246
154.Hancu G. Kelemen H. Rusu A. Gyéresi Á. Development of capillary
electrophoresis method for the si multaneous determination of cephalosporins . J Serb
Chem Soc . 2013;78(9): 1413-1423.
155.Hancu G. Sasebeși A.Rusu A. Kelemen H. Ciurba A. Study of the electrophoretic
behavior of cephalosporins by capillary zone electrophoresis. AdvPharm Bul l.
2015;5(2): 223-229.
156.Andersson MI. MacGowan AO. Development of the quinolones. JAntimicrob
Chemother. 2003;51:1 –11.
157.Pérez-Ruiz T. Martínez -Lozano C. Sanz A. Bravo E. Separation and simultaneous
determination of quinolone antibiotics by capillary zone electro phoresis.
Chromatographia .1999;49:419 -423.
158.Rusu A. Tóth G. Szőcs L. Kökösi J. Kraszni M. Gyéresi Á. Noszál B. Triprotic site –
specific acid –base equilibria and related properties of fluoroquinolone antibacterials; J
Pharm Biomed Anal. 2012;66:50 -57.
159.Rusu A. Hancu G. Völgyi G. Tóth G. Noszál B. Gyéresi Á. Separation and
determination of quinolone antibacterials by capillary electrophoresis .JChrom Sci .
2014;52(8): 919-925.
160.Fierens C. Hillaert S .Van den Bossche W . The qualitative and quantitat ive
determination of quinolones of first and second generation by capillary
electrophoresis. J Pharm Biomed Anal .2000;22(5):763-772.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 183
161.Hancu G. Rusu A. Simon B. Boia G. Gyéresi Á. Simultaneous separation of
ciprofloxacin, norfloxacin and ofloxacin by m icellar electrokinetic chromatography . J
Braz Chem Soc . 2012;23(10): 1889-1894.
162.Simon FER. H1 -antihistamines: current status and future directions. World
Allergy Organ J. 2008;1(9):145 -155.
163.Fernandez H .Ruperez FJ .Barbas C. Capillary electrophore sis determination of
loratadine and related impurities, JPharmBiomedAnal.2003;31: 499-506.
164.Hancu G. Câmpian C. Rusu A. Mircia E. Kelemen H. Simultaneous determination
of loratadine, desloratadine and cetirizine by capillary zone electrophoresis . Adv
Pharm Bull . 2014,4(2): 161-165.
165.Balk EM. Karas RH. Jordan HS .Kupelnick B . Chew P. Lau J.Effects of statins on
vascular structure and function: a systematic r eview. Am J Med. 2004;117: 775-790.
166.Dogrokul -Ak D.Kircali K. Tuncel M. Aboul -Enein H. Validated analysis of
fluvastatin in a pharmaceutical capsule formulation and serum by capillary
electropho resis. Biomed Chromatogr. 2001;15: 389-392.
167. Trung TQ. Dung PT .Hoan NN. Kim DJ. Lee JH. Kim KH.Chiral separation of
fluvastatin enantiomers by c apillary electro phoresis. Arch Pharm Res. 2008;31: 1066-
1072.
168. Nigovic B . Damic M. Injac R. Glavac NK. Strukelj B .Analysis of atorvastatin and
related substances by M EKC. Chromatographia. 2009; 69: 1299-1305.
169.Srinivasu MK. Narasa Raju A. Om Reddy G .Determination of lovastatin and
simvastatin in pharmaceutical dosage form by MEKC, J PharmBiomedAnal. 2002;
29:715-721.
170. Damic M. Nigovic B .Fast analysis of statins in pharmaceuticals by MEKC.
Chromatographia. 20 10;71:233-240.
171.Mircia E. HancuG.Rusu A. Cazacu A. B alaci T. Soare R. Determination of HMG –
CoA reductase inhibitors by micellar electrokinetic chromatography .Acta Medica
Marisiensis . 2016, 62(2): 187-191.
172.Duriez P. Mechanism of action of statins and fibrates. Therapie. 2003;58(1) :5-14.
173.Komsta L. Misztal G. Majchrzak E. Hauzer A. Separation of fibrate -type
antihyperlipidemic drugs by capillary electrophoresis and their quantitation in
pharmaceuticals. J Pharm Biomed Anal. 2006;41:408 -414.

184| Hancu Gabriel
174. Shihabi ZK. Fenofibrate and fenof ibric acid analysis by capillary electrophoresis.
Electrophoresis .2004;25:1648 -1651.
175.Mircia E. Hancu G. Nițu O. Kelemen H. Cârcu-Dobrin M. Gâz ȘA. Balaci T.
Simultaneous determination of fibrates by micellar electrokinetic capillary
chromatography. Farmacia. 2017;65(1): 109-113.

Aplicații ale electroforezei capilare în analiza substanțelor medicamentoase | 185