APLICAREA TEHNOLOGIILOR VERZI DE EXTRACȚIE , PENTRU [629034]

1
UNIVERSITATEA „LUCIAN BLAGA” DIN SIBIU
FACULTATEA DE ȘTIINȚE
SPECIALIZAREA: BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Conducător științific:
Prof.univ.dr. Simona OANCEA

Absolvent: [anonimizat]
2018

2

UNIVERSITATEA „LU CIAN BLAGA” DIN SIBIU
FACULTATEA DE ȘTIINȚE
SPECIALIZAREA: BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

TEMA:
APLICAREA TEHNOLOGIILOR VERZI DE EXTRACȚIE , PENTRU
VALORIFICAREA PIGMENȚILOR DIN HIBISCUS SABDARIFFA

Conducător științific:
Prof.univ.dr. Simona OANCE A

Absolvent: [anonimizat]
2018

3
CUPRINS

INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 4
CAPITOLUL 1: CONSIDE RAȚII TEORETICE ASUP RA SPECIE I DE HIBISCUS ……………… 6
1.1 HIBISCUS SP . CARACTERIZARE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 6
1.1.1. Încadrarea sitematică a genului Hibiscus sp. ………………………….. ………………………….. ……… 7
1.1.2. Hibiscus trionum ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 8
1.1.3. Hibiscus esculentus ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 9
1.1.4. Hibiscus rosa -sinensis ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 9
1.1.5. Hibiscus syriacus ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 10
1.1.6. Hibiscus paramutabilis ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 10
1.1.7 Hibiscus sabdariffa ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 11
1.2 ANTOCIANII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 16
COMPOZIȚIE , RĂSPÂNDIRE , ROL BIOLOGIC ………………………….. ………………………….. ………………….. 16
Biosinteza antocianilor în plante ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 19
CAPITOLUL 2: CONTRIB UȚII ORIGINALE PRIVI ND EXTRACȚIA ………………………….. ….. 23
2.1 SE LECTAREA PR OBE LOR ȘI ME TODELOR DE LUCRU ………………………….. ………………………….. …. 23
2.1.1 Materiale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 23
2.1.2 Metode de extracție (Tehnica verde de extracție) ………………………….. ………………………….. .. 28
2.2 EXTRACȚIA DE ANTOCIAN I DIN CALICELE DE HIBISCUS SABDARIFFA ………………………….. ……… 32
2.2.1 Obținerea extractului apos de Hibiscus ………………………….. ………………………….. …………….. 32
2. 3 REZULTATE ȘI DISCUȚII ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 35
A) Evaluarea conținutului de antociani din extractele apoase ne -acidifiate ………………………….. .. 35
B) Evaluarea cantității de antociani din extractele apoase acidifiate cu acid acetic ………………… 37
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 44
ANEXA 1. FIGURI ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………………. 45
ANEXA 2. TABELE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 47
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 48

4
INTRODUCERE

Sunt cunoscute mai multe specii de plant e, care prezintă generic numele de trandafir
japonez sau zămoșiță, precum: Hibiscus sabdariffa , Hibiscus trionum , Hibiscus esculentus ,
Hibiscus rosa -sinensis , Hibiscus syriacus , Hibiscus paramutabilis . Pentru realizarea extracție s –
a folosit calicele speci ei de Hibiscus sabdariffa .
Hibiscus sabdariffa este o plantă cultivată în zonele tropicale, ce se caracterizează prin
prezența unor flori mari de culoare roșie. Aceasta este o plantă originară din Africa de Nord și
Asia de Sud -Est, însă este mult cultivat ă în Mexic, Japonia, Thailanda și China. Din punct de
vedere al compoziției chimice al acesteia, prezintă acizi organici, mucilagii, antociani și fenoli.
Utilizările plantei de Hibiscus sabdariffa sunt variate, ținându -se cont de țară, popor. Cea mai
cunoscută aplicație a aceste ia este cea de băutură răcoritoare fără alcool. Această băutură este
larg răspândită în Africa și în Asia, unde în f uncție de zona, regiune, poate prezenta mai multe
denumirii populare. De exemplu, în Senegal este foarte apreciată ș i cun oscută sub denumirea de
„bissap” . În Mali și Burkina Fasa băutura se numește „da bilenni”. În Egipt este bine cunoscută
sub denumirea de „Băutura faraonilor”. În Sudan se cunoaște sub denumirea de „ceai de tarkade”.
În Jamaica este o băutură tradițion ală de Crăciun, ce este preparată din calicele de H. sabdariffa
amestecat cu ghimbir, zahăr și apă fiartă. Lichidul este apoi filtrat și servit cu rom. În Nigeria
este cunoscut sub denumirea de „zobo”. Pe lângă utilizarea calicelui în fabricarea de băutu ri
răcoritoare nealcoolice, acesta este utilizat și în fabricarea de băuturi alcoolice; băuturi ce rezultă
din fermentația alcoolică, ce se aseamănă cu cea a vinului.
Un alt mod de utilizare este drept colorant practicat în industria alimentară (patiserie ,
sucuri de fructe, băuturi etc.), dar are de asemenea și aplicații în industria farmaceutică. Însă cea
mai comună utilizare a acestei plante este pentru ceai. Având astfel scop medicinal important. În
țările sudice și nordice joacă un rol important în med icina tradițională. Această plantă servește la
obținerea unui ceai alimentar răspândit în ultimele decenii. Ceaiul acestei plante este recomandat
pentru: menținerea tensiunii arteriale în limite normale, eliminarea lichidelor reținute în exces în
corp, men ținerea sănătății aparatului respirator, protejarea celulelor împotriva stresului oxidativ,
menținerea sănătății părului și multe altele.
Această lucrare a fost efectuată în scopul realizării extracției de antociani din calicele de
Hibiscus sabdariffa prin utilizarea unor tehnici verzi de extracție și evitarea extracției acestora în
solvenți organici cu impact negativ asupra mediului și sănătății umane . Prin utilizarea
spectofotometrului s -a urmărit evaluarea și compararea cantității de antociani ce s -au extras în
diferite tipuri de apă (apă pl ată, apă minerală, apă de izvor ) din calicele de H. sabdariffa fiind
utilizată ca și metodă de extracție macerarea.

5
Cunoscân du-se proprietățile și beneficiile pe care le aduce specia de Hibiscus sabdariffa
s-a urmăr it extracția antocianilor din petalele sale, utilizând ca solvent apa, cu diferite proprietăți
fizico -chimice (apă plată, minerală, de fântână), urmată de analiza cantitativă a pigmenților
prezenți.
Obiectivele ce au fost urmărite pe parcursul întregului experiment s de extracție sunt:
a. documentarea tehnico -științifică;
b. utilizarea metodelor moderneîn vederea obținerii unei cantități de antociani cât mai mare din
calicele de Hibiscus sabdariffa;
c. evaluarea conținutuluide antociani, rezultați în urma extracției apoase din calicele de Hibiscus
sabdariffa;
d. testarea eficienței extracției de antociani în sisteme apoase ;
e. reducerea utilizării solvenților organici .

Nu în ultimul rând aș dori să aduc mulțumiri și gânduri de recunoștință către
coordonat orul lucrării de licență prof. univ. dr. Simona Oancea, care a îndrumat munca mea cu
multă competență punându -mi la dispoziție toate cunoștiințele sale . De asemenea gânduri de
recunoștință doresc să aduc și către prof. asistent univ. Ioan Tăușan pentru aju torul și sprijinul
lui acordat în realizarea graficelor lucrării de licență și către întregul corp academic al Facultății
de Științe al Universității „Lucian Blaga” din Sibiu, care au contribuit la dezvoltarea mea
personală și profesională.

6
CAPIT OLUL 1: CONSIDERAȚII TEORETICE ASUPRA SPECIEI DE
HIBISCUS
1.1 Hibiscus sp. Caracterizare

Generic genul Hibiscus este cunoscut sub denumirea de trandafir japonez sau trandafir
chinezesc.
Hibiscus sp. este o plantă ce se remarcă prin florile sale viu co lorate și mari, fiind utilizată
în cele mai multe cazuri ca și plantă decorativă. Florile de Hibiscus sp. pot avea o vastă colorație.
Însă pe lângă frumusețea pe care o redă în grădinile oamenilor aceasta are și un rol medical
important.
Mai mult de 500 de specii de Hibiscus sunt cunoscute în lume, din care 200 de specii sunt
întâlnite în regiunile tropicale și subtropicale ale lumii. Majoritatea fiind utilizate ca și plante
ornamentale cu excepția tipului sabdariffa .
Plantele din Genul Hibiscus au difer ite utilități. Unele sunt folosite pentru realizarea de
produse alimentare ( H. esculenta ) și alte specii sunt utilizate în medicina tradițională ( Hibiscus
sabdariffa ). Altele infestează alte plante din jurul lor. Doar anumite părți din plante sunt util izate.
De exemplu: fructele unor speci sunt utilizate în alimentație, iar semințele acestora sunt utilizate
ca un substituent al boabelor de cafea, în special în Turcia ( H. esculenta ). Deasemenea, florile
unor specii sunt utilizate pentru realizarea de di ferite băuturi, care sunt foarte apreciate în toată
lumea pentru senzațiile aromatice proaspete pe care le dau sau mai sunt utilizate ca și ingrediente
alimentare; în timp ce o parte din flori pot fi utilizate în medicina tradițională, în variate activităț i
biologice. ( H. sabdariffa ). O singură specie de Hibiscus este cultivată în scop ornamental sau
ajută în vindecarea ulcerului. ( H. rosa -sinensis ). ( Aslan et al, 2011)

7
1.1.1. Încadrarea sitematică a genului Hibiscus sp.

Genul: Hibiscus sp.
Familia: Malvaceae
Ordinul: Malvales
Subclasa: Dilleniideae
Clasa: Magnoliatae (Magnoliopsida,
Dicotyledonatae)
Subîncrengătura: Magnoliphytina
(Angiospermate)
Încrengătura: Spermatophyta
Regn: Plantae

Familia Malvaceae

Familia Malvaceae cupri nde plante ierboase și arbuști. Acestea prezintă frunze simple,
lobate sau divizate cu o nervațiune palmată. Florile sunt mari, pentamere. Filamentele staminelor
sunt concrescute într -o coloană în jurul stilului. Fructele plantelor din această familie sunt
unscate, capsuliforme sau care se desfac în achene (mericarpi). Din această familie fac parte, pe
lângă specia de Hibiscus și alte specii de plante precum: Gossypium hirsutum (bumbac), Malva
sylvestris (nalbă), Athaea officinalis (nalbă mare). (L. Popovic i et al. 2007 ) Există mai multe
specii de Hibiscus care aparțin acestei familii Malvaceae. O parte din acestea sunt:

Figura 1: Specii diverse de Hibiscus (Colaj propriu făcut
cu imagini preluate de pe internet)

8
1.1.2. Hibiscus trionum

Este o sp ecie ce aparține Fam. Malvaceae, ce
este cultivată și răspândită în principal în zona
estică a Australiei. ( Ramsey et al. 2003) Mai este
cunoscută în domeniul cercetării ca și Trioni
herba , însă popular este cunoscută sub denumirea
de Zămoșiță. Din punct de vedere genetic, aceasta
prezintă 2n=28,56.
Este o specie de plantă anuală, cu tu lpina
deobicei ramificată de la bază, înaltă de 30 -70
cm, păroasă.
Frunzele inferioare ale acesteia sunt rotunde
întregi sau puțin divizate, spre deosebire de cele superioare care pot fi lobate (cu 3 -5 lobi) sau
sectate.
Floarea acestora se formează la sub soarea frunzelor. Acestea sunt solitare și de o colorație
gălbuie.
Caliciul este dublu. Cel extern este format din 12 lacinii (foliole) liniare, ciliate; iar cel
intern din 5 sepale membranoase, verzui.
Corola este alcătuită din 5 petale cu lungimea de 2 -3 cm, care la bază prezintă o culoare
purpurie închisă. Staminele sunt filamentoase de
culoare închisă concrescute, pe când stigmatele sunt
globuloase, purpurii sau aproape negre. Fructul este
o capsulă, care se desface la maturitate în cinci părți
și este protejat de caliciul persistent și umflat.
Semințele sunt reniforme.
Această specie înflorește din iunie până în
septembrie. Pentru oameni, această plantă reprezintă
o buruiană prășitoare ce crește pe lângă drumuri.
În compoziția sa chimică, aceasta conține
flavonozide și substanțe mucilaginoase. Hibiscus
trionum are un rol important în pielite, cistite, dar mai cu seamă în calculoza renală, preventiv și
pentru eliminarea nisipului sau a caliculilor renali mici. Se poate asocia cu alte produse diuret ice
și anume cu: „cozile de cireșe” ( Cerasus avium ) sau cu „mătasea” de porumb ( Zea mays ). Are o
Figura 2: Hibiscus trionum
(Peter M. Dźuk, 2004)

Figura 3: Semințe de Hibiscus trionum
(Nataliatalent)

9
acțiune diuretică cu indice salurietic favorabil. (A. Laza and G. Ráez, 1975; A. Radu et al., 1981;
I. Tiță, 2005)

1.1.3. Hibiscus esculentus

Această spe cie mai este cunoscută în botanică și
sub denumirea de Abelmoschus esculentus sau
Abelmoschus moschatus . În limbajul popular este
cunoscută sub numele de bamă, okra, gombo sau
bendee. Este originară din Egipt și Asia de Sud, fiind
introdusă și în America tropicală.
Această plantă este o specie anuală, cu o tulpină
oarecum lemnoasă , care poate atinge o înălțime de 30 –
70 cm. Frunzele sunt serate, putând apărea sub trei
forme: unghiular, palmat și subdigitată. Florile sunt
solitare și mari, de o culoare g albenă pal și o colorație
purpurie la bază. Porțiunile erbacee ale plantei sunt
acoperite cu țepi și prezintă pete purpurii.
Fructele acesteia sunt pentagonale, înguste și cilindrice, cu o lungime de la 10 până la 25
cm, ce conțin numeroase semințe de o c olorație închisă.
Din punct de vedere chimic, aceasta prezintă substanțe mucilaginoase și substanțe
hrănitoare, iar la nivelul frunzelor se formează o capsulă emoliantă.
Semințele acestei plante au fost considerate ca fiind importante în stimularea stoma cului,
antipasmodică sau nervoasă, însă în prezent este folosită de parfumierii și de asemenea unele țării
utilizează aceste semințe ca subtituient al cafelei. (I. Tiță, 2005; www.britannica.com ) De
asemenea semințele de la această specie sunt utilizate în producerea de biodiesel. (Anwar et al.,
2010)
S-a descoperit de asemenea că vitaminele, polifenoli, favonoidele și polizaharidele pe
care aceasta le prezintă în compoziția s -a chimică
prezintă un potențial chimioprotectiv mare precum:
antidiabetic, ne uroprotector, antihiperlipidemic etc.
(F. D. Shahreza, 2015)

1.1.4. Hibiscus rosa -sinensis
Hibiscus rosa -sinensis este un arbust cu o
înălțime de 5 -6 m și o grosime de 3 m. Frunzele sunt
Figura 4: Planta de Hibiscus esculentus
-floarea și fructele (Derek Fell)
Figura 5: Floarea de Hibiscus rosa –
sinensis (Fotografie din Baranquila )

10
de o culoare verde închis și cu o formă ovală ce prezintă pe ma rginea lor zimți. Această specie
este cunoscută și sub denumirea de trandafirul japonez. Este o plantă de apartament cu flori mari
și roșii ce prezintă un diametru de aproximativ 10 cm. Fructul este o capsulă uscată, care poate
conține până la 3 semințe. A ceastă plantă este originară din Asia de Est. Această specie prezintă
mai multe soiuri, fiind caracterizate prin colorația variată a florii (roșu, portocaliu, galben,
combinații de două culori etc.) (I. Tiță, 2015; worldoffloweringplants.com,www.latin -wife.com ;
Ross, 2003 )

1.1.5. Hibiscus syriacus

La fel ca și H.trionum , această specie este cunoscută
popular sub denumirea de zămoșiță. Aceasta este un
arbust de 2 -3 metri, ce poate fi invazivă. Este cultivată ca
și plantă ornamentală. Coloritul și dease menea și
dimensiunile acestei specii variază. Frunzele în general
sunt simple sau palmat lobate și cu flori sub formă de
pâlnie. ( I. Tiță, 2005; www.rhs.org.uk )

1.1.6. Hibiscus paramutabilis
Este o specie endemică din Centrul Chinei,
care crește până la o înălțime de 2 m sau mai mult.
Poate fi întâlnită la înălțimi cuprinse între 500 -1000
m, în zonele de provincie ca: Gangxi, Hunan și
Jiangxi. Această specie prezintă două varietăți și
anume: Hibiscus paramutabilis var. paramutabilis și
Hibiscus paramutabilis var. longipedicelatus. În
general, Hibiscus paramutabilis este o plantă ce
prezintă frunze mari, caduce de culoare verde.
Prezintă flori mari (diametru de 20 cm) cu aspect frumos. Deasemenea, este cunoscută specia și
sub denumirea similară de Hibiscus mutabilis, deși nu este strâns legată de aceasta. Hibiscus
mutabilis înflorește din primăvară în toamnă, producând flori pe toată perioada sezonului activ
de creștere. Prin combinații genetice între specia de Hibiscus paramutabilis și Hibiscus sy riacus
sau Hibiscus sinosyriacus rezultă alte 3 speci ale genului Hibiscus . (L. H. Bailey, 1920)
Figura 6: Hibiscus syriacus – arbust
(http://centred ejardinbrossard.com/en/s
hop/hibiscus -syriacus -aphrodite -2/)
Figura 7: Floarea de Hibiscus
paramutabilis (Michelle Casler)

11
1.1.7 Hibiscus sabdariffa

Se cunosc două varietăți ale speciei de Hibiscus sabdarifa
și anume: Hibiscus sabdariffa altisima și Hibiscus sabdariffa
sabdari ffa. Hibiscus sabdariffa sabdariffa este o plantă de talie
înaltă, viguroasă, puțin ramificată și foarte fibroasă. În sezoanele
de creștere poate ajunge la o înălțime de 25 cm. Ea este cultivată
în principal pentru fibrele sale. Tulpina și frunzele sale s unt de
culoare verde închisă până la o culoare vișinie. Florile sunt de
culoare crem, galben pal sau roșu. (www.britannica.com)
Este o specie foarte cunoscută în botanică și sub numele
de Hibisci flos . Această specie are numeroase denumirii
populare, ac estea diferind de la o țară la alta. De exemplu:
Rosella fruit – Australia; Belchanda – Nepal; Chukor – Bengal; Pundi – Canada; KraJiabDaeng
– Thailanda; Bissap – Senegal, Mali, Nigeria etc.
Subspecie a acestui gen, Roselle ( Hibiscus sabdariffa ) este o p lantă erbacee anuală,
nativă din Africa de Vest, cultivată atât ca plantă ornamentală, cât și ca legumă. Fiind o specie
exotică este cultivată -n condiții tropicale sau subtropicale din ambele emisfere, ca de exemplu în
Philippines, Malysia, Ethiopia, Seneg al și Mexic. La noi, în țară, perioada de vegetație este prea
scurtă, pentru ca aceasta să poată forma fructe. Se folosește caliciul cu varietăți de roșu din care
se obține un ceai de culoare roșie, cu gust acru. (A. Laza and G. Ráez, 1975; I. Tiță, 2005)

Calicele măsoară 2 -3,5 cm lungime. Este concrescut
și urceolat în jumătatea sa inferioară, în timp ce în
partea superioară se împarte în cinci părți acuminate
sau recurbate. (Figura 9) Petalele sunt prevăzute cu o
nervațiune mediană groasă, ce este puț in proeminentă.
Se găsește o glandă nectariferă cu un diam etru de
aprox imativ 1 mm. Caliculul prezintă 8 -12 foliole de 6 –
15 mm, cu bază largă și vârful î ngust, ce se leagă la
baza calicelui. Atât calicele cât și calulculul sunt
cărnoase, uscate, friabile ș i de o culoare roșie briliantă. (Canigueral, 2003)
Calicele este mult utilizat și este caracterizat de concentrația mare a acestuia în antociani. Astfel
el poate cântări 1,5 g x kg^( -1). Calicele de H.sabdariffa , principala parte comestibilă de la
această plantă, are o compoziție foarte variată. Exceptând compoziția în apă și lipide sunt abateri
între valorile minimale și maximale pentru diferite elemente considerate importante. Această
Figura 8: Hibiscus sabdariffa
(Ferallas)
Figura 9: Floarea de Hibiscus sabdariffa

12
variabilitate poate fi datorată mai multor factori: condițiile de cultu ră, natura solului, precipitațiile
și țara de origine a caliciului.
Calicele este bogat în acizi organici. Acizii organici prezenți sunt: acidul tartric, citric,
malic și hibiscic. (Stuart, 1987; Wong et al 2002) Acidul succinic, oxalic, tartric și malic sunt
prezente în concentrații diferite [(0,5; 0,43; 0,17; și 0,12) 〖g x kg〗^(-1)]. Acidul succinic și
oxalic reprezintă doi acizi organici majori din constituția acestei specii (76%). Conținutul în acid
ascorbic este foarte variabil ținând cont de spațiile cultivate din unele zone geografice, cum ar fi
Nigeria.
De asemenea, zaharurile sunt prezente în calicele de H. sabdariffa și sunt constituite din
glucoză, fructoză și zaharoză. Glucoza reprezintă 40% din totalul de zaharuri, fiind prezentă în
cea mai ma re cantitate față de celelate zaharuri prezente. (M. Cissé et al, 2009)

Tabel 1: Compoziția chimică a calicelui de Hibiscus sabdariffa în funcție de zona sa de cultivare
raportat la doza maximă autorizată a elemntelor chimice p rezente. (M. Cisse, M. Dornier, M. Saktto, A.
Ndiaye, M. Reynos, O. Sock, 2009)

Studii pentru determinarea cantității de minerale din calicele de Hibiscus sabdariffa au
mizat para lel pe concentrația maximă autorizată în alimentație și pe zona geografică.
Se consideră că acest calice de H. sabdariffa reprezintă o bună sursă de minerale esențiale
(Fe, Ca, K, Mn, Zn). Cu excepția valorii reprezentate de plumb, toate celelate valori se găsesc
sub pragul admis de Organizația Mondială de Sănătate, astfel încât acestea ne putând să
reprezinte un risc pentru consumatorii de Hibiscus sambdariffa . Concentrația mineralelor este Nr.
crt. Elementele
chimice prezente Originea calicelui Doza maximă
autorizată Nigeria Mali
1 Ca2+ 1583 Nedete. –
2 Cu2+ Nedet. 0,6 4
3 Cr – 0,6 12
4 Fe 37,8 40 45
5 Mg 31,6 Nedet. –
6 Mn Nedet. 24 2-5
7 Zn 6,5 3,7 6
8 Ni – 0,31 1
9 P Nedet. Nedet. –
10 Pb – 0,18 0
11 Po 2060 Nedet. –
12 Na 5,5 Nedet. –

13
datorată anumitor factori precum: condițiile geo -climatice, acti vitățiile oamenilor din jurul
culturii (câmpului), practicile culturale utilizate. (Tabelul 1)
Nu trebuie uitat că la nivelul calicelui sunt prezente, pe lângă minerale și substanțele
enumerate și vitamine ca: tiamine, riboflavină, niacină și acid ascorb ic.

Deasemena la nivelul calicelui este prezent β -carotenul și licopenul, fiecare în concentrații
diferite: 1,9 〖mg x 100 g 〗^(-1) și respectiv 〖164,3 μg x
100 g〗^(-1) de materie proaspătă. Acest calice mai conține
mucilagii și s -au identi ficat 37 de componenți volatili. Una
dintre caracteristicile plantei de H. sabdariffa este prezența
bogată de antociani. Petalele de Hibiscus sabdariffa sunt un
bun colorant și de asemenea sunt o bună sură de antioxidanți.
Sunt nevoie multe experimente pentru a clarifica relația dintre
culoarea pe care o dau antocianii și activitatea antioxidantă a
acestora. ( Tsai et al, 2002 ) Au fost identificați 2 -4 antociani
la varietățile de Hibiscus sabdariffa . Aceștia sunt: delfinidin –
3-sambubio zid sau hibiscina, cianidin 3 -sambubiozid sau
gosisipieciamine, delfinidin 3 – glucozid, cianidin 3-glucozid.
Figura 14 – Figura 11: Structura chimică a
riboflavinei Figura 10: Structura chimică a acidului
ascorbic
Figura 12: Structura chimică a tiaminei
Figura 13: Structura chimică a niacinei
Figura 14: Structura chimică a hibiscinei

14
Principalul colorant antocianidinic căruia i se datorează culoarea roșie -violet este
hibiscina. (Figura 14) Ea reprezintă 70% din concentrația tot ală de antociani. Farmacia Spaniolă
a prescris faptul că pentru un medicament este în regulă, utilizarea unui minim de 13,5 % acid
hibiscic (Canigueral, 2003). Calicele conține componenți polifenolici. pH -ul acestei plante este
unul foarte acid, iar acest lucru s -a demonstrat prin mai multe experimente.
Antocianii sunt responsabili de 50% din activitatea antioxidantă a acestora. D oi antociani
majori: delfinidin 3 -sambubiozid și cianidin 3 -sambubiozid sunt foarte repede absorbiți de tractul
intestinal. Aces t lucru s -a dovedit printr -un experiment făcut pe șobolani.
Semințele de Hibiscus sabdariffa au un diametru de 5,6 nm. Greutatea pentru 1000 de
semințe este de aproximativ 36 g. Din punct de vedere chimic, semițele de Hibiscus sabdariffa
prezintă cantităț i importante de proteine (26%), lipide (20%) și glucide (40%). Glucidele sunt
reprezentate în aceste semințe de zaharoză, glucoză și amidon în concentrații diferite de: 17,6;
4,0 și respectiv de 16,1 g x 100 g^( -1). Din categoria proteinelor, aminoacizii prezenți în cantități
majore în aceste semințe sunt: acidul glutamic (22%), glicina (18%) și acidul aspartic (11%).
Toți aminoacizii esențiali sunt prezenți, astfel încât aceștia se găsesc în cantități diferite: leucina
(7%), fenilalanina (5%) și treonina (4%). Concentrația totală de aminoacizi este de 36 g x 100
g^(-1). (M. Cissé et al. 2009)
Pe lângă substanțele enumerate, ce sunt prezente în semințe, flori, frunze și scoarță
(ritidom) , se întâlnesc și compuși fenolici. Aceștia sunt solubili în apă și au un rang mare de
aromare și combinare a unui număr de grupări hidroxilice și a unei molecule de zahăr ,
determinând gradul de aromare. ( Muchuweti et al. 2007; Vattem et al. 2005). O importanță a
acestor compuși fenolici este redată de protecția plantelor împotriva stresului biologic sau al
mediului înconjurător. Aceștia sunt sintetizați ca răspuns împotriva insectelor, bacteriilor,
fungilor și virusurilor, dar de asemenea și împotriva radiațiilor UV (ultraviolete). (Johnosn, 2003)
În zonele tropicale, da torită culorii roșii a calicelui de Hibiscus sabdariffa altisima, acesta
este utilizat pentru prepararea de băuturi, sosuri, jeleuri, conserve și multe alte produse. Frunzele
și tulpina acesteia sunt utilizate în prepararea de salate sau alte preparate veg etale. Deasemenea
uleiul prezent în semințe este utilizat în Africa. (www.britannica.com)
Cea mai comună utilizare a speciei de Hibiscus este cea sub formă de ceai, cu scopul
tratării unor boli.

15
Ceaiul poate fii administrat în trei moduri:
 Pulbere cu administrare sublinguală – planta va fi măcinată
fin cu o râșniță electrică. Se ia o linguriță rasă de 4 ori pe zi,
pe stomacul gol. Pulberea se ține sub limbă timp de 10 -15
minute, după care se înghite cu apă.
 Maceratul la rece – se prepară dintr -o lin gură cu plantă
adăugată la 250 de ml de apă, se menține timp de 6 -8 ore la
temperatura camerei, apoi se strecoară și se bea pe stomacul
gol. Se adminisrează 3 căni cu macerat pe zi, cu 30 de mnute
înainte de mese.
 Infuzia – se prepară dintr -o lingură cu p lantă
adăugată la 250 de ml de apă clocotită, se menține timp
de 15 minute la temperatura camerei, apoi se strecoară și se bea pe stomacul gol. Se
administrează 3 căni cu infuzie pe zi cu 30 de minute înainte de mese.
Un alt mod de utilizare al calicelui de Hibiscus sp. este pentru extracția de substanțe solide
cu apă fiartă, prin infuzie aromatică ce redă o culoare roșie -purpurie. Extractul este utilizat
ca și colorant pentru diferite alimente (jeleuri, marmeladă, băuturi și multe altele).
(Simonetti, 199 1)
Infuzia are și ea un rol important fiind utilizată de către oameni, datorită proprietăților
sale diuretice, strigentice și digestive și de asemenea pentru tratatrea diferitelor tipuri de
cancer, pentru reducerea presiunii sangvine, pentru persoanele ca re prezintă pietre la rinichi
și pentru tratarea colesterolului mărit. (Büyükbalci and El, 2008)
Într-o lucare publicată de Canigueral în 2003, acesta afirmă faptul că există mai multe
experimente care s -au realizat pentru a se observa care este activita tea benefică a calicelui
de Hibiscus sp. Toate experimentele s -au realizat pe animale, în special șobolani, și/ sau
modele in vitro. S-a observat prin acestea că calicele are o activitate antioxidantă și
hepatoprotectoare. Această activitate este asociată cu antocianii și cu acidul protocatetic,
substanță la c are s -a demonstrat activitatea antitumorală. Din extracția apoasă a
medicamentului s -a observat că acesta are activitate antihipertensivă, iar extractul metanolic
al medicamentului are activitate espas molitică. Polizaharidele din medicament, a fost
demonstrat că au activitate hipercolesterolemică, iar acidul hibiscinic are activit ate
inhibitorie al α -amilazei, g osipetina a fost demonstrat că este antiim flamatorie. ( Canigueral,
2003)

Figura 15: Metodologia de preparare
a ceaiului de Hibiscus sabdariffa (
Fotografie personală )

16
1.2 Antocianii
Com poziție, răspândire, rol biologic

Antocianii sau flavonoizii sunt substațe solubile în apă, ce se întâlnesc în celulele
vegetale, mai exact în vacuolele celulare. Spre deosebire de pigmentul plantelor verzi și anume:
clorofila, antocianii nu au rol fotos intetic. Pot fi întâlniți și în regiuni mai discrete ale plantei
asemănătoare vacuolelor numite antocianoplaste. (Pecket și Small, 1980; Ortí z et al., 2011 ; Du
et al., 1973 ) Ei, defapt, sunt pigmenții naturali responsabili pentru o varietate de culori atra ctive
și briliante ale fructelor, florilor ș i frunze lor, variind de la culoarea roșie până la violet -albastru
și fiind prezenți sub formă de glicozide. Aceștia se obțin ușor prin extracția lor cu etanol, metanol
sau chiar apă. Se găsesc în concentrații dif erite, iar compoziția depinde de partea genetică a
plantei, dar și de factorii înconjurători. (Mohr et al, 1995; Oancea, 2011)
Se găsesc în plante mari, cuprind 27 de familii, 73 genuri și o multitudine de specii de
plante, în care antocianii sunt prezenț i. În majoritatea cazurilor antocianii sunt asociați cu
fructele, deoarece cea mai mare cantitatea din aceștia se găsesc în această parte a plantei . (Bridle
and Timberlake, 1996) Se mai găsesc și în flori, frunze, steme și rădăcină, bulbi, tuberculi, atât
la legume cât și la cereale. Culoarea lor depinde foarte mult de structura lor chimică sau de
aciditatea pe care respectiva structură posesoare de atocianii o prezintă. Este un aditiv alimentar
E cu numărul E 163. (www. food -info.net)
Aceștia sunt produș i de metabolismul secundar al plantelor. Totodată prin metabolismul
secundar rezultă și alți numeroși compuși. În mod normal acest tip de metabolism se efectuează
în celule diferite. Metabolismu l secun dar este indus de condițiile mediului înconjurător, ast fel
încât o importanță prezintă: radiațiile UV (ultraviolete), salinitate a sau deficit ul de nutrienți.
Ciclul metabolismul ui secundar este mai complex de cât cel primar. Compușii rezultați aparțin
diverselor clase de alcaloizi, terpene și terpenoide,
polizo prene, compuși fenolici rari și amine. Unii
metaboliți rezultați sunt caracterist ici doar unei
anumite specii. ( Oancea, 2011)
Structura chimică a acestuia este bazată pe o
parte agliconică și una gliconică. Sunt cunoscuți în
număr de 500 de antociani, ca re au putut fi izolați.
Sunt bazați pe o singură structură și anume ionul
flavinic.
Antocianii prezintă în structura sa 7 locuri,
care se prind de ionul flavinic. La nivelul acestor locuri de leagă diferite structuri: atomii de
hidrogen, gruparea hi droxi d sau o grupare metoxid Figura 16: Structura chimică a
atocianilor (ww.food -info.net)

17
Antocianii apar în conformații diferite dependen te de pH, cu variații de culori sau
intensități de culoare. La pH acid, inelul din mijloc conferă o culoare intensă a moleculei.
(www.food -info.net ) Ei pot avea structură primară (echilibrul structural este dat de cationul de
flavil), secundară ( determinată de transf erul unui proton) și terțiară ( rezultă din asocierea formei
secundare cu cea primară (asociați i moleculare între forme sau alte molecul e – copigmentare
intermoleculară )). ( Bridle and Timberlake, 1996)

După cum se poate vedea în tabe lul prezent, în urma unor combinații diferite ale
radicalilor rezultă diferiți antocianidini, care sunt utilizați ca aditivi, unii din ei: petunidin,
peonidin etc. De asemenea, diferitele combinații dau și variatele culori ale plantei .
Culoarea antocian ilor este dependentă de mulți factori. Totalul antocianilor poate fi
determinat numai într -o soluție puternic acidă. În izolare antociani dau o colorație slabă, la un Antocianidin R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 culoare E-
număr
Apigeninidin -H –
OH -H -H -OH -H -OH Portocaliu
Aurantinidin -H –
OH -H –
OH -OH –
OH -OH Portocaliu
Capensinidin –
OCH 3 –
OH –
OCH 3 –
OH –
OCH 3 -H -OH Albăstrui -roșu
Cianidin -OH –
OH -H –
OH -OH -H -OH Fucsină (colorant
roșu de anilină) E163a
Delphinidin -OH –
OH -OH –
OH -OH -H -OH Mov-albăstrui E163b
Europinidin –
OCH 3 –
OH -OH –
OH –
OCH 3 -H -OH Albăstrui – roșu
Hirsutidin –
OCH 3 –
OH –
OCH3 –
OH -OH -H -OCH 3 Albăstrui -roșu
Luteolinidin -OH –
OH -H -H -OH -H -OH Orange
Pelargonidin -H –
OH -H –
OH -OH -H -OH Portocaliu,salmon E163d
Malvidin –
OCH 3 –
OH –
OCH 3 –
OH -OH -H -OH Mov E163c
Peonidin –
OCH 3 –
OH -H –
OH -OH -H -OH Fucsină (colorant
roșu de anilină) E163e
Petunidin -OH –
OH –
OCH 3 –
OH -OH -H -OH Mov E163f
Pulchellidin -OH –
OH -OH –
OH –
OCH 3 -H -OH Albăstrui -roșu
Rosinidin –
OCH 3 –
OH -H –
OH -OH -H -OCH 3 Roșu
Triacetidin -OH –
OH -OH -H -OH -H -OH Roșu Tabel 2: Tipurile de antocianidini și grupările lor funcționale (www.food -info.net)

18
pH= 3,5, însă în mediul natural antocianii au o colorație mult mai puternică. Acest fenom en a
fost descris pentru prima dată acum 60 de ani. (Robinson and Robinson, 1931; Bridle and
Timberlake, 1996) În soluție acidă antocianii prezintă o deviație de culoare negativă ( culoarea se
intensifică odată cu creșterea concentrației). La un pH mare , v alorile deviației au fost pozitive.
Aceste deviații pot fi date și de asociațiile care apar între structurile antocian ilor și copigmentație.
( Bridle and Timberlake, 1996 )
Cei mai comuni agliconi de antociani sunt pelargonidina, delfinidina, cianidina,
peonidinia, petu inidin a și malvidina. Pe de altă parte, cei mai importanți antociani sunt cianidin –
glicozidele, fiind prezente intr -un procentaj de 50 % în compoziția pigmenților din fructe.
(Oancea et al, 2011)
Antocianii prezintă o mare
diversitate, din punct de vedere al
structurii lor, astfel încât în urma unor
combinații de zaharuri cu diferiți acizi
organici ca: acidul acetic, acidul
succinic, acidul cafeic și mulți alții.
Aceste combinații vor duce la acilarea
antocianilor. De exemplu, cianidin -3-
(acetilglucozid) în portocale. (www.
food-info. net) Prezența radicalilor
acizii conferă moleculei antocianice,
rezistență în cazul în care se pot găsii în
condiții extreme de pH sau temperatură.
Dacă în molecula antocianinică sunt
prezenți radicali acil, atunci aceasta
poate fi considerată ca fiind o moleculă
acilată. ( Salmas et al., 2010; Ortíz et al.,
2011)
În funcție de numărul de zaharuri prezente -n structura antocianilor, aceștia se clasifică în:
monoglicozide, digliozide și tr iglicozide. Zaharurile care ar putea fi întâlnite în structura
antocianilor sunt: monozaharide, dizaharide sau trizaharide. Monozaharidele coumune întâlnite
sunt: pentozele ca: arabinoza și xiloza și de asemenea hexoze ca: D -glucoza -cea mai frecvent
întâln ită și de asemenea poate fi prezentă galactoza sau ramoza. Dizaharidele prezente sunt: Aliment Antociani (mg/100 g
hrană)
Vânătă 750
Stafide negre 130-400
Mure 83-326
Afine 25-497
Cireșe 350-400
Merișor 60-200
Soc 450
Portocale ~200
Ridiche 11-60
Zmeură 10-60
Stafide roșii 80-420
Struguri roșii 30-750
Ceapă roșie 7-21
Vin roșu 24-35
Căpșună 15-35 Tabel 3: Cantitatea de antoci ani prezentă în anumite plante

19
getobioza, soforoza, sambubioza și rutinoza. Trizaharidele pot fi sub aspect liniar ca: getotrioza
sau poate fi sub aspect ramificat ca: xilosilrutinoza sau glicosilruti noza. (Strack și Wramy, 1989)
Locul de proveniență este foarte variat al antocianilor, astfel încât aceștia sunt prezenți în
afine, fragi, unele vegetale, avocado. Alte surse sunt: portocalele, măslinele, ceapa roșie și
mango. Producția naturală de antoc iani este de 109 tone într -un an. (www.food -info.net)
În tabelul alăturat se poate observa că, toate alimentele pe car e omul le ingeră prezintă o anumită
cantitate de antociani. Această cantitate variază de la un aliment la altul. Astfel antocianii sunt
administrați în organism prin alimentație.
Din punct de vedere al toxicității, aceasta este foarte mică la antociani. Astfel în momentul
ingestiei acestora nu apar indicații adverse sănătății la oamen i. (Burton -Freeman et al, 2016)

Biosinteza antociani lor în plante

Flavonoizii din plante variază în funcție de diferiți factori:
 diferențe genetice între diferite specii de plante;
 factorii mediului înconjurător pot acționa asupra dezvoltării plantei (temperatură, lumină)
 factori agronomici
Antocianii s unt prezenți în toate speciile de plante, fiind acumulați în toate părțile din
fructele plantelor și vegetale. Concentrația antocianilor din fructe este mai mare decât
concentrația acestora din vegetale.
Biosinteza începe cu calea pentozofosfaților, unde în urma acesteia rezultă din glucoză,
fosfoenolpiruvat. Se continuă cu calea Shikimate, rezultând fenialanina. După aceasta intră în
calea flavonoizilor. La nivelul fenilalaninei are loc eliminarea a grupării amino, cu producerea
de acid cinamic, care va f i hidroxilat rezultând acidul p -coumaric. Acesta este activ sub formă de
tioester coenzima A.

20

Funcțiile antocianilor este foarte variată. Aceș tia având o mare inportanță atât din punct
de vedere biologic , cât ș i din punct de vedere industrial.
Din punct de vedere biologic funcțiile antocianiilor sunt :
– formează molecule solitare (fitohormoni);
– reprezintă pigmenți florali, ce ajută în polenizare prin comunicarea plantei cu agenții de
polenizare;
– apărare față de insecte;
– apărare față de infecția fungilor;
– inhibă dezvoltarea altor plante prin utilizarea unor substanțe alelochimice. (Oancea, 2011; www.
food-info. net ; He et al. 2010 ) Glucoză
Calea pentozofosfaților
Fosfoenolpiruvat
Fenialanină Calea Shikimate
Tirozina
Acid cinamic
Acid coumaric
Coumaric – Co A
Dihidromiricetin
Leucodelfinidin

Antocian
Figura 17: Biosinteza antocianilor ( adaptată din Pascal -Teresa et al. 2008)
(Oancea și Oprean, 2011)

21
Un antocian important ce este comun mai multor plante este cianidin 3 -glucozid, care are
un rol deosebit în protecția plantei de unele larve. Nu este singurul antocian cu această funcție
mai sunt și alții. ( www. food -info. net)
Antocianii reprezintă un larg grup de pigmenți. Ei sunt foarte apreciați în industria
alimentară, da torită capacității lor de colorare, care poate varia de la culoarea roșie până la violet.
Multe plante rep rezintă o sursă bogată de antociani. ( Mazza, 2000; Prodanov et al. 2005; Mertz
et al. 2007; Reyes and Cisneros -Zevallos, 2007; Cissé, 2012 ; Mateus și Freitas, 2008 ).
Extracția apoasă reprezintă un mare interes, fiind utilizată de oameni în producerea de
băuturi și de asemenea ca și colorant natural pentru alimente. Extracția și purificarea antocianilor
din surse naturale au devenit foarte importante în realizarea unor substanțe fitochimice, utilizate
în special în prepararea suplimentelor alimentare, a ingredientelor alimentare, a aditivilor
alimentari și a produselor farmaceutice sau cosmetice.( Cissé et al. 2012)
Deși au o răspândire destul de mare și
sunt utilizați în industria alimentară, totuși
antocianii sunt limitați în utilizarea lor. Acest
lucru se datorează naturii chimice ale acestor
coloranți care în multe cazuri, prezintă o
instabilitate, in special la lumină, pH și căldură.
De aceea utilizarea lor este mult mai indicată în
produsele de cofetărie (bomboane dure sau
moi, jeleuri coloarte, coajă confeti etc.), într -un
mediu foarte slab de apă sau în prezența unor
agenți de gelifiere culoarea este stabilizată. pH -ul la care antocianii dau cea mai intesă c uloare
este de 2 -4,5, (Figura 18 ) cu condiția ca aceștia să se adapteze la condițiile de acidifiere și la
reglatorii acestora. De exemplu, să se adapteze la acidul citric prezent în multe fructe. De
asemenea, utilizarea unor produse care sunt supuse unor tratamente termice sau sunt ambalate în
ambalaje transparente, necesită utilizarea unor antociani care nu sunt sensibili la temperatură sau
lumină, ci dimpotrivă sunt stabili (termostabili și fotostabili), pentru a nu -și pierde culoarea.
(www. macchinealimentari. it)
Figura 18: Schimbarea culorii la antociani în
funcție de pH (www.macchinealimantari.it)

22
Pe lângă importanța lor în industria
alimentară și alte funcții aduse plantelor în care
aceștia se întâlnesc, antocianii prezintă un rol
important și pentru sănătatea omului. Ei modifică
expresia și activitatea celulară și tisulară, influențând
variate sisteme. Acestea sunt asociate cu diferite
beneficii aduse sănătății omului, fiind incluse:
cancerul -anticancer, sănătatea vasculară, metabolică
și neuronală. (Burton -Freeman et al. 2016).
Antocianii sunt de asemenea și buni antioxidanți, protejând plantele de radicalii liberi, care pot
distruge ADN -ul , care în final aceștia să ducă la moartea celulei. Pe lângă aceștia, incluzând
flavonoizii, acizii, tocoferolul, carotenoizii și vitamina C ( Howard et al. 2003), pot neutrali za
efectul oxidativ al radicalilor liberi. ( Yanishlieva – Maslarova, 2001). Radicalii liberi ce sunt
capturați de antioxidanți sunt: superoxide O2−, hidroxil HO−, peroxid H2O2 și oxigen O2.
Activitatea antioxidanților este strâns legată de structura chimică a acestora. ( Rice -Evants et al.
1995).
În funcție de ce tip de extracție se folosește și procesele care se utilizează vor rezulta
diferite tipuri de antociani:
 Ingrediente cu prorietăți colorate -din această categorie fac parte sucurile concentrate, care
păstrează caracteristicile esențiale și sunt procesate simplu. Acestea nu poartă un nume
„E”, conform legislației Europene;
 Coloranți alimentari –ce sunt extrași prin orice altă tehnică decât cea cunoscută. Aceștia
poartă numărul E163.( www.ingredex.ro )

Figura 19: Colorant antoc iani

23
CAPITOLUL 2: CONTRIBUȚII ORIGINALE PRIVIND EXTRACȚIA
2.1 S electarea probelor și metodelor de lucru

După cum a fost menționat și anterior antocianii prezenți în calicele de Hibiscus
sabdariffa au o serie de proprietăți benefice. Ei sunt folosiți în industria alimentară, farmace utică
și cosmetică, datorită ca pacității lor antioxidante. În cadrul acestei lucrări ne -am propus să
studiem care din solvenții utilizați în realizarea experimen tului, are o capacitate mai mare de
extracție a antocianilor fiind utilizate tehnici de extracție moderne.
2.1.1 Materiale
Pentru realizarea extracției apoase de antociani a fost luată în lucru o vastă aparatură:
1. Centrifuga
2. Balanța analitică
3. pH – metru
4. Spectofotometru
5. Etuva
6. Termobalanța
7. Râșnița electronică
1. Centrifuga – este utilizată în laboratoare pentru separarea unor substanțe care prezintă
densitate diferită, într -un amestec. Principa lii factori care condiționeaza extracția
antocianilor, cu formarea supranatantului sunt: turația centrif ugei, durata de centrifugare
și gradul de măr unțire al materialului vegetal ( https://ro.m.wikipedia.org/wiki/Centrifugă
) (Figura 25 )
2. Balanța analitică – este utilzată pentru cântărirea precisă, a unor cantități mai mi ci de
substanță, ce a fost luată în lucru.
3. pH-metru – are rolul principal în măsurarea pH -ului. Cu ajutorul acestuia se măsoară
activitatea ionilor de hidrogen pentru soluțiile formate pe bază de apă, astfel încât va fi
indicată aciditatea sau alcalinitate a și exprimată ca și pH. Acesta este construit din doi
electrozi (electrod de referință și un electrod de lucru), între care se va face o diferență de
potențial electronic. (ro.wikipedia.org/wiki/PH -metru) (Figura 28 )
4. Spectofotometru – este un instrument c apabil să măsoare cu precizie cantitaea de fotoni
(intensitatea luminii) absorbită de trecerea lor printr -o probă. Cu acesta se poate
determina indirect și cantitatea de substanță. În funcție de spectrul lungimilor de undă pe
care le emite sursa de lumină, spectofotometria are două variante: – UV/VIS care
utilizează lungimi de undă cuprinse între 185 – 400 nm (UV) și 400 – 750 nm (VIS); –
IR care utilizează lungimi de undă cuprinse între 750 nm – 1000 μm. Spectofotometria

24
UV/VIS este utilizată cel mai frec vent în chimia analitică pentru determinarea cantitativă.
(Figura 26 )
5. Etuva – este utilizată în special pentru sterilizarea sticlăriei, a ustensilelor metalice, la o
temperatură de 180 ͦ C, timp de 30 – 60 min. Tot cu ajutorul etuvei se poate determina
substanța uscată din biomasa celulară sau din alte produse, la temper aturi de 130 – 150 ͦ
C, timp de 1 – 3 ore sau să se realizeze evaporări și concentrări de lichide, la temperaturi
de 40 – 80 ͦ C, timp de 5 – 24 de ore.
6. Termobalanța – este un apart utilizat pentru măsurarea umidității unei cantități de
substanțe luate în lucru. (Figura 27 )
7. Râșnița electronică – este un aparat utilizat în laboratoare pentru mărunțirea unor
materiale vegetale.

Reactivi utilizați pentru desfășurarea
experimentului au fos t următorii: apa cu diferite
proprietăți, pulberea de Hibiscus sabdariffa , etanol
70% și acid acetic de concentrații diferite 1%, 2% și
3%. Apele ce au fost luate în lucru au o proveniență
diferită. O parte din acestea sunt ape îmbuteliate. De
asemenea în realizarea experimentelor s -au utilizat și două ape de izvor. Acestea au fost preluate
de la două izvoare din comuna Barcani, județul Covasna.
Comuna Barcani se află în partea de sud – vest a județului Covasna . Aceasta aparține
Depresiunii Întorsura Buză ului. Se știe de la oamenii din sat că una din ape este apă cu sulf. (n.d)
(Figura 24) Izvorul acestei ape este adăpostit de o pădure, numită Coșa. Acest tip de apă este
cunoscut ca fiind bună pentru organism. Iar cealaltă apă de izvor este preluată de la un izvor
situat în „Părăul Pătrunjel”, cunoscut sub această denumire de oamenii din sat. Apele îmbuteliate
au surse variate, ele provenind din județele: Vâlcea, Suceava (Dealu Floreni, comuna Dorna
Candrenilor), Argeș (comuna Dâmbovicioara) și Harghita.
Figura 20: Râșnița electronică (fotografie proprie)

Figura 21: Balanța analitică (fotografie
proprie)

25

Apele îmbuteliate luate în lucru sunt: Apa Craiului (carbogazificată și necarbogazificată),
Apa Dorna (carbogazificată și necarbogazificată) și Apa Borsec (carbogazificată și
necarbogazificată). Distribu irea apelor se face de către di ferite compani, vezi tabelul 4.

Figura 22: Distribuția pe hartă a provenienței probelor de apă îmb uteliată și de
izvor

Figura 23: Izvorul cu apă potabilă
Barcani

Figura 24: Izvorul cu apă cu sulf
Barcani

26

Tabel 4: Distribuitorii apelor îmbuteliate luate în lucru

Fiecare apă luată în lucru prezintă un pH diferit. Acest lucru ne va ajuta să aflăm care
extracție este mai bună, ce pH este mai potrivit pentru extracția de antociani. pH -urile apelor
luate în luc ru sunt prezente în Tabelul 5 .
Se poate observa în tabelul 5 că pH -ul apelor variază între 4,92 – 5,327, cel mai acid pH
și între 7,8 – 8,014, cel mai bazic pH. Fiecare tip de apă prezină o compoziție chimică diferită,
chiar și dacă aceasta aparține aceleiași surse/ distribuitor. A cest lucru se poate observa foarte
ușor în tabelul următor.
Nr. crt. Apa Distribuitor
1 Apa Dorna (plată) S.C. COCA -COLA HBC ROMÂNIA S.R.L Republica
Moldova ”Coca -Cola Îmbuteliere Chișinău” S.R.L.
2 Apa Dorna
(carbogazificată) S.C. COCA -COLA HBC ROMÂNIA S.R.L Republica
Moldova ”Coca -Cola Îmbuteliere Chișinău” S.R.L.
3 Apa Borsec (plată) Produs și îmbuteliat de: Romaqua Group S.A Borsec
4 Apa Borsec
(carbogazifica tă) Produs și îmbuteliat de: Romaqua Group S.A Borsec
5 Apa Craiului (plată) Produs și îmbuteliat în România de Cheresta
Dâmbovicioara
6 Apa Craiului
(carbogazificată) Produs și îmbuteliat în România de Cheresta
Dâmbovicioara
Nr.crt. Apa pH-distri buitor pH-măsurat î n laborator
1 Apă de izvor – Barcani – 7,009
2 Apă cu sulf – Barcani – 8,014
3 Apă ușoară -Vâlcea – 7,688
4 Apă Borsec – plată 7,4 7,525
5 Apă Borsec – minerală 5,9 6,063
6 Apă Dorna – plată 7,8 7,737
7 Apă Dorna – minerală 5,64 5,823
8 Apa craiului – plată 7,55 7,483
9 Apa Craiului – minerală 4,92 5,327
10 Apă distilată – 6,653 Tabel 5: Valorile de pH ale probelor de apă luate în lucru

27

Pentru realizarea experimentului, principala substanță solidă utilizată în experiment a fost
pulberea de Hibiscus sabdariffa, rezultată în urm a mărunțirii calicelui acestei plante cu ajutorul
râșniței electronice. În urma unui studiu de marcketing s -a ales pulberea de Hibiscus pură, 100
% Hibiscus. Această plantă nu se găsește doar sub formă pură, ci se găsește și în compoziția altor
ceaiuri sub un procentaj diferit.

Nr.
crt. Proba de apă luată în
lucru Compoziția chimică ( mg/l )
HCO3− Ca2+ Mg2+ Na+ Cl− SO4− K+ NO3−
1 Apă Borsec – plată 344,3 61,1 27,6 2,8 – – – –
2 Apă Borsec –
minerală 1874,7 382,4 101 90,2 – – – –
3 Apa Craiului – plată 201,3 65,19 1,48 0,72 1,06 6,17 0,46 –
4 Apa Craiului –
minerală 195,2 76,95 1,81 0,86 1,1 5,9 0,38 –
5 Apă Dorna – plată – 63,24 2,1 0,95 4,8 – 0,4 3,9
6 Apă Dorna –
minerală 960 297 9,7 21,9 5,6 – – 0,6 Tabel 6: Compoziția chimică a apelor îmbuteliate, luate în lucru

Figura 28: pH-metru

Figura 27: Termobalanță
Figura 26: Spectofotometru
Figura 25: Centrifugă

28
2.1.2 Metode de extracție (Tehnica verde de extracție)

Pentru a se realiza extracția unor substanțe bioactive se utilizează următoarele metode de
extracție: macerarea, percolarea, infuzarea, decoctie, extracția accelerată cu solvent, extracția
asistată de microunde, extracția cu fluid supercritic, extracția continuă cu solvenți organici,
percolare continuă, e xtracția Soxhlet. Fiecare tip de tehnică prezintă anumite principii sub care
se realizează. De exemplu:
 Macerarea – presupune menținerea în contact a unei anumite cantității de produs vegetal cu
o cantitate necesară de solvent. Menținerea lor în contact variază de la un solvent la altul. În
cazul apei este de preferat menținerea în contact timp de 8 -12 ore, iar în cazul unor solvenți
organici acest lucru se poate realiza pe o perioadă mai lungă, timp de mai multe săptămâni.
Macerarea presupune de asemenea și agitarea intermediară sau continuă și apoi filtrarea
soluției extractive, de reziduu. Macerarea se poate face la t emperaturi variate:
– la rece – la temperatura camerei (17 -22℃)
– la cald (denumită și digerare) – se rea lizează macerarea cu un solvent încălzit la o temperatură
de 40 -60 ͦ C. Deobicei la o temperatură inferioară celei de fierb ere, pentru ca principiile active să
poată trece ușor în soluție și de asemenea pentru ca temperatura foarte ridicată să nu ducă la
degradarea principiilor actve. Această metodă este utilizată pentru obținerea uleiurilor, alifi ilor
și unguentelor din plant e. De asemenea această macerare poate fi simplă, dublă sau repetată.
Macerarea simplă are un randament scăzut, astfel încât s -a recurs la mac erarea dublă și repetată.
Macerarea dublă presupune amestecarea produsului vegetal cu solventul, fiind urmată de
separarea lichidului de reziduu, acesta fiind ulterior supus unei noi extracții. Lichidele rezultate
în urma ambelor extracții sunt amestecate și din nou filtarate, după ce au stat în repaus timp de
24 de ore. Macerarea repetată presupune că produsul vegetal după ce a fost mărunțit se tratează
succesiv cu volume de solvent, fiind menținute în vase închise tot timpul. Acest lucru se repetă
până când se epuizează volumul total de lichid extractiv. După se amestescă toate extractele între
ele. Maceratele pot fi păstrate la frigider în vase de sticlă închise, timp de 2 -3 zile. După o
perioadă mai lungă se vor dezvolta microorganisme, care vor degrada acele substanțe bioactive.
 Percolarea – este un proces prin care se extrag subsanțele bioactive din plantă, la rece , fiind
utilizat un solvent în contracurent.
 Infuzarea – este un proces de extracție a substanțelor bioactive ce presupune umectarea
produsului vegetal. Deobicei această umectare se face cu ajutorul apei, însă nu și în cazul
plantelor ce conțin uleiuri vol atile, unde se folosește alcool diluat. După cca. 5 min, peste plantele
umectate de adaugă apa prevăzută pentru extracție. Apa fiind fierbinte. Acestea se lasă în contact
timp de 30 min. După care are loc filtrarea soluției.

29
Indiferent de ce metodă este u tilizată pentru extracție, pentru o extracție cât mai bună,
trebuiesc u rmați niște pași. (Figura 29 )

 Recepția materialului vegetal presupune verificarea acestuia pe baza următorilor parametrii:
autenticitatea plantei, umidita tea, conținutul în impurități și de ase menea conținutul în corpuri
străine organice și minerale.
 Cântărirea se realizează de obicei cu ajutorul balanței analitice, fiind totul realizat cu precizie.
Este importantă această etapă, deoarece ne ajută să realiz ăm soluții cu o concentrație determinată.
 Mărunțirea produsului este un proces important în extracție. Odată cu micșorarea produsului
vegetal, are loc o creștere a suprafeței de contact dintre produsul vegetal și solventul în care este
pus acesta. De aseme nea are loc o micșorare a timpului de extracție.
 Omogenizarea este procesul în care produsul vegetal, după ce a fost mărunțit, va trebui
omogenizat man ual și vor trebuii verificați parametrii calitativii ai produsului.
 Extracția compușilor bioactivi se rea lizează cu ajutorul uneia dintre metodele de extracție:
macerare, percolare, infuzare etc. Cea mai eficientă fiind macerarea. Extracția apoasă este o
tehnică verde de extracție, deoarece pentru extracția unor substanțe bioactive dintr -o plantă se
Figura 29: Etapele urmărite pentru realizarea
extracției de antociani (Păun et al. 2011)

30
utilizeaz ă ca și solvent, apa. Este de preferat ca apa să fie apă distilată, cea potabilă prezentând
diferite săruri care pot micșora puterea de dizolvare și de extracție. De exemplu: sărurile de calciu
și magneziu pot forma diferite substanțe insolubile cu taninur ile, acizii organici etc.
În mod obișnuit parametrii ce sunt urmăriți pentru extracția apoasă sunt:
Materialul vegetal………………………………….condițiile de calitate
Solvent de extracție………………………………..apă di stilată
Temperatura de extracție…………………………temperatura camerei
Timp de extracție……………………………………24 ore
Metoda de extracție………………………………..macerare
Concentrat de extrac…………………………… ….8-10% (g plantă/ml apă)
Apa are capacitatea de a dizolva în molecule: acizi, alcooli, fenoli, esteri, aldehide, amine,
glicozide și săruri de alcaloizi. De asemenea pe lângă acestea mai poate dizolva și gume,
mucilagii, enzime sau taninuri.
Soluțiile extractive alcoolice și hidroalcoolice presupu ne utilizarea ca și solvent a
alcoolului etilic de diferite concentrații. Dacă ca și solvent se utilizează alcoolul amestecat cu
apă, acesta va căpăta o putere de dizolvare mai mare. Este de preferat ca alcool ul să aibă o
concentrație de 30 -50%.
Alcoolul care prezintă o concentrație mai mică, poate extrage unele substanțe doar că
acestea cu timpul vor deveni sedimente. Etanolul ex trage din produsele vegetale: polifenoli,
alcaloizi, săruri, glicozide, aminoaciz i. Alcoolul concentrat (70 -95%) va duce la obținerea unui
randament mai bun, neîmbibând țesutul vegetal, astfel încât într -un timp mai îndelungat va avea
loc difuzarea substanțelor bioactive. Chiar dacă are un avantaj mare în extracție, alcoolul poate
prezenta și dezavantaje, imprimând un miros și un gust caracteristic și de asemenea este
inflamabil.
Pentru extracția alcoolică sunt utilizați ca și parametri:
Materialul vegetal……………………………………condiții de calitate ale plantei
Solve nt de extracție………………………………….alcool etilic 30 -70%
Metoda de extracție………………………………….macerare
Temeratura de extracție……………………………..temperatura camerei
Timp de extracție…………….. ……………………….8 -10 zile
Concentrația exractului……………………………..8 -10% (g plantă/ ml alcool)
Fiecare metodă duce la formarea unui anumit tip de soluție, extractivă apoasă, respectiv
macerat sau infuzie etc.
 Filtrarea soluție i presupune îndepărtarea subs tanțelor aflate în suspensie. În laboratoare, această
filtrare se poate realiza folosinduse hârtie de filtru, la vid. La nivel industrial filtrarea se face cu

31
ajutorul preselor. Cea mai utilizată metodă de filtrare este microfi ltrarea tangențială. Aceasta
presupune utilizarea unor membrane asimetrice microscopice la nicelul cărora se vor reține
particule coloidale cu un diametru cuprins între 0,1 -1 μm.
 Purificarea soluției extractive presupune îndepărtarea substanțelor care pot duce la un preparat
instabil precum: rășini, albumine, pectine etc. Pentru realizarea acestui proces de purificare, sunt
utilizate următoarele metode: termoprecipitare, precipitare fracțională, extracție în sistemul
lichid -lichid, cromatografie și microfil trare.
 Concentrarea soluției extractive presupune valorificarea superioară a extractelor din plante.
Concentrarea se poate realiza prin: evaporare sub vid la temperaturi scăzute (25 -50 ͦ C), închețare
urmată de îndepărtarea cristalelor prin centrifugare sa u ultrafiltrare și osmoza inversă.
 Controlul interfazic presupune analiza compușilor bioactivi din punct de vedre calitativ și
cantitativ. (Păun et al, 2011)

32
2.2 Extracția de antociani din calicele de Hibiscus sabdariffa

2.2.1 Obținerea extractul ui apos de Hibiscus

Experimentul ce constă în extracția
substanțelor bioactive din planta de Hibiscus
sabdariffa s-a efectua în laboratoru l de
Biochimie al Facultății Ș.A.I.A.P. M., ULBS. S –
au realizat mai exact 2 experimente. În cadrul
primului expe riment s -a urmărit care dintre
apele luate în lucru cu diferite proprietăți fizico
– chimice, au o capacitate mare de extracție a
antocianilor, iar în cadrul celui de -al doilea
experiment s -a comparat capacitatea de extracție
a apei, care a avut cel mai bu n rezultat în urma
primului experiment, cu etanolul 70%. În mod
obișnuit pentru extracție este utilizat metanolul sau etanolul în extracții care conțin o cantitae
mică de acid. Astfel se așteaptă ca în momentul realizăriii experimentului cea mai acidă apă ,
„Apa Craiului” , care are un pH= 4,92, să realizeze cea mai bună extracție.
Etapele urmărite pentru relizarea experimentală au fost: cântărirea, omogenizarea,
termostatarea, filtrarea , centrifugarea, amestecarea și analiza propriu -zisă. Pentru ambele
experimente aceste etape sunt esențiale, astfel încât pentru cele două serii experimentale, probele
au fost supuse următoarelor procese:
a) Materialul vegetal de Hibiscus sabdariffa este supus mărunțiri cu ajutorul râșniței electronice
și sunt cântărite ≈ 2 g de pulbere, cu ajutorul balanței analitice.
b) Pentru fiecare probă sunt folosite 10 recipiente, în care sunt puse 2 g de material vegetal și
este omogenizat cu apă minerală, apă plată sau apă de izvor, astfel încât vor rezulta 10 probe
de analizat.
c) Înainte de tratatrea termică a extractului se măsoară pH -ul acestuia cu pH -metrul, pentru a se
observa dacă apar modificări.
d) Se omogenizează amestecul după care este pus în etuvă la 40 ͦ C. După fiecare 30 de min se
agită amestecul pentru o mai bună extragere a a ntocianilor. Această agitare a borcănelelor se
face de aproximativ 6 -7 ori.
e) Filtratul este supus timp de 10 min la 4 ͦ C și 8000 de rotații/min, la centrifugare.
Figura 30: Organizarea experimentului
chimic în laboratorul de Biochimie al
Facult ății Ș.A.I.A.P.M

33
f) După ce a fost centrifugat se lasă 15 min la temperatura camerei, în repaus, după care din
fiecare eprubetă se ia câte 1 ml de extract supernatant și se diluează cu 4 ml de apă distilată.
La fiecare extract este măsurat pH -ul cu ajutorul pH -metrului. ( Figura 28 )
g) După diluare se i -a din fiecare probă diluată câte 1 ml de probă diluată și se pune în câte 2
eprubete. Peste conținutul uneia, va fi adăugată soluție tampon pH=4,5, iar peste conținutul
celeilalte va fi adăugată soluție tampon cu un pH=1,0. Se va observa la toate eprubetele o
schimbare a culorii conținutului. În eprubetele, în care a fo st adăugată soluție tampon de
pH=1,0 a rezultat o culoare roz, iar în eprubetele în care s -a adăugat soluție tampon cu un
pH=4,5, s -a observat o coloarție a soluției în mov.
h) După se vor analiza probele la spectofotometru la lungimi de undă diferite, de 5 10 nm și
respectiv 700 nm, unde proba marto r este apa distilată. (Figura 26 )
Pentru realizarea celui de -al doilea experiment, după ce s -a aflat care este apa care a extras
cel mai bine substanțele bioactive, aceasta este pusă în comparație cu etanol de co ncentrație
70%. Acestea vor fii amestecate cu acid acetic de concentrații diferite, respectiv 1%, 2% și
3%.
În baloane cotate de 20 ml se pun cantității diferite de acid acetic CH3COOH .
Ρ=m
V ; m=ρ x V
Densitatea acidului acetic este de 1,05 g/m l, iar volumul este de 1 ml; astfel înc ât masa și
densitatea au aceași valoare. m=ρ=1,05
 În balonul I se pune acid acetic c= 1% și apă plată Borsec
100 ml sol CH3COOH …………………………….1 g CH3COOH
25 ml …………………….. …………………………..x g
x= 25 x 1
100 x=0,25 g
1 ml CH3COOH ……………………..1,05 g CH3COOH
y ml ……………………………………0,25g
y=0,25
1,05=0,238 ml
 În balonul II se pune acid acetic c=2% și apă plată Borsec
100 ml sol CH3COOH …………………………….2 g CH3COOH
25 ml…………………………………………………….x
x=25×2
100=0,5 g
1 ml CH3COOH ……………………1,05 g CH3COOH
y ml……….. ………………………….0,5 g CH3COOH

34
y=0,5 g
1,05g=0,476 ml
 În balonul III se pune acid acetic c=3% și apă plată Borsec
100 ml sol CH3COOH ……………………………….3 g CH3COOH
25 ml……………………………………. ………………….x g
x=25×3
100=0,75 g
1 ml CH3COOH ……………………….1,05 g CH3COOH
y…………………………………………….0,75 g CH3COOH
y=1×0,75
1,05=0,714 ml

La fel ca și în cazul primului experiment, se respec tă aceleași etape de lucru și anume:
cântărirea, omogenizarea, termostatarea, amestecarea, filtrarea, centrifugarea și analiza propriu –
zisă.
Analiza propriu -zisă a extractelor se realizează prin determinarea colorației la
spectofotometru, la lungimi de un dă diferite, de 510 nm respectiv 700 nm.

Figura 32: Diluarea
supernatantului din
extract, cu apă distilată

Figura 31: Filtrarea
extractului, după
centrifugare

Figura 33: Tratarea
termică a extractelo r
apoase, în etuvă

35
2. 3 Rezultate și Discuții

A) Evaluarea conținutului de antociani din extractele apoase ne -acidifiate

Prin ambele experimente s -a urmărit care din solvenți au cea mai bună capacitat e de
extracție a subsanțelor bioactive. În cadrul primului experiment solventul utilizat a fost apa. Iar
ca și probă de comparație s -a utilizat etanolu l 70%. (Tabelul 7 )

După realizarea primului experiment, în urma extragerii antocianilor din Hibiscus , în
diferitele tipuri de apă, s -a observat în urma calculelor că o bună e xtracție s -a realizat la proba cu
numărul 4, ce este reprezentată de amestecul dintre apa plată Borsec și pulberea de Hibiscus .
Această extracție s -a realizat din 2,03 g Hibiscus sp. În 20 ml apă plată Borsec cu un pH al
solventului de 7,525. Cantitatea to tală de antociani ce a rezultat este de 597,960 mg% antociani,
ceea ce arată cantitatea de antociani prezentă în extractul apos. Acest lucru se poate observa și în
Figura 34

Probă Tpul de
solvent Volum
(ml) Masă
(g) pH-
solvent pH-extract
după
tratament
termic pH-extract
înainte de
tratamentul
termic Umiditatea
(%)
1 Apă de izvor –
Barcani 20 2,02 7,009 2,555 2,566

5,848 % 2 Apă cu sulf –
Barcani 20 2,07 8,014 2,577 2,619
3 Apă ușoară –
Vâlcea 20 2,10 7,688 2,594 2,590
4 Borsec -apă
plată 20 2,03 7,525 2,614 2,617
5 Borsec -apă
minerală 20 2,01 6,063 2,718 2,760
6 Dorna -apă
plată 20 2,01 7,737 2,597 2,608
7 Dorna -apă
minerală 20 2,03 5,823 2,644 2,734
8 Apa craiului –
apă plată 20 2,03 7,483 2,579 2,570
9 Apa craiului –
apă minerală 20 2,02 5,327 2,614 2,562
10 Apă distilată 20 2,00 6,653 2,596 2,534
M Etanol -70% 20 2,00 7,037 3,212 3,089 Tabel 7: Tipurile de apă utilizate și pH -ul acestora

36

În cadrul aceluiași experiment după ce a avut loc tratarea termic ă a amestecului, la
măsurarea pH -ului extractului s -au determinat valori acide cuprinse între 2,5 și 3. Valorile
acestora variind de la 2,555 -2,718, în extractele cu apă, spre deosebire de proba martor făcut ă în
etanol, pH=3,212. (Figura 35 ) Diferențe mino re de pH pot fi observate și în cadrul celorlalte
extracte apoase de Hibiscus sp.

Figura 34: Cantitatea de antociani prezentă în fiecare extract apos din Hibiscus sp.

0100200300400500600
AIB ASB AV ABP ABM ADP ADM ACP ACM AD MCantitatea de antociani găsită în
probă (mg%)
Extractele de antociani
Figura…. pH -ul extractului de antociani înainte și după tratamentul termic
01234
AIB ASB AV ABP ABM ADP ADM ACP ACM AD MpH-ul extractului
Extractele de antociani
pH-extract după tratament termic pH-extract înainte de tratamentul termic
Figura 35: pH-ul extractelor antocianice înainte și după tratamentul termic

37
B) Evaluarea cantității de antociani din extractele apoase acidifiate cu acid acetic

În cadrul celui de -al doilea experiment s -a realizat acidifierea apei Borsec și a etanolului
cu acid acetic în trei concentrații diferite. Astfel încât s -a urmărit dacă apa Borsec are o capacitate
mai mare de extracție a subsanțelor bioactive spre deosebire de etanol 70%. În urma calculelor
făcute, pe baza formulei ce s -a folosit ș i în cadrul primului experim ent, s -a demonstrat că etanolul
70% are o capacitate mult mai mare de extracție.

Dacă în cadrul primului experiment amestecul care conținea apa Borsec și proba avea cea
mai mare cantitate de antociani, în cel de -al doilea experiment amestecul ce conține etanol și acid
acetic 1 % conține cea mai mare cantitate de antociani . Cea mai bună extracție s -a realizat la
proba c u numărul 4. ( Figura 36) Proba a rezultat din amestecul a 2.00 g Hibiscus cu acid acetic
1% și etanol 70%. De asemen ea se poate observa în Figura 36 , că între probele care conțin aceași
concentrație de acid acetic, cantitatea de antociani ce a fost ext rasă variază, ținându -se cont de
asemenea și de solventul utilizat: apă Borsec plată sau etanol 70%. Între proba care conține apă
Borsec cu acid acetic de concentrație 1% și proba ce conține etanol 70% acidifiat cu acid acetic
de aceași concentrație se p oate observa că, etanolul 70% a extras cea mai mare cantitate de
antociani. O aceași variație a cantității de antociani, se poate observa și în cazul probelor care Probe
(Nr.
crt.) Solvenți Masa (g) Volum
(ml) Umiditate
(%)
1 Apă plată
Borsec acidif
ac. Acetic 1% 2.00 20
6.312
2 Apă plată
Borsec acidif
ac. Acetic 2% 2.02 20
3 Apă plată
Borsec acidif
ac. Acetic 3% 2.00 20
4 Etanol 70%
acidif ac.
Acetic 1% 2.00 20
5 Etanol 70%
acidif ac.
Acetic 2% 2.03 20
6 Etanol 70%
acidif ac.
Acetic 3% 2.00 20
Tabel 8: Caracteristici experimentale ale probelor de solvent luate în lucru

38
conțin acid acetic de concentrație 3%. Pe de altă parte în cazul probelor care conțin acid acetic
2% se observă o variație mică, aproape nesemnificativă a cantității de antociani ce a fost extrasă
din pulberea de Hibiscus sp.
Extractul înainte de tratarea sa termică avea un pH de 3,101, astfel încât după tratarea
termică a acestuia apare o m ică variație, pH -ul fiind egal cu 3,234. Acest lucru se poate observa
și la celelal te tipuri de solvent. (Tabel 9 )

Probă Solvent pH-solvent pH extract după
tratament
termic pH-extract
înainte de
tratament
termic
1 Apă plată+ acid
acetic 1% 3,239 2,592 2,541
2 Apă plată+acid
acetic 2% 3,001 2,629 2,547
3 Apă plată +acid
acetic 3% 2,846 2,689 2,520
4 Etanol 70%+acid
acetic 1% 3,738 3,234 3,101
5 Etanol 70%
+acid acetic 2% 3,609 3,231 3,080
6 Etanol 70%+
acid acetic 3% 3,391 3,228 3,012 Tabel 9: pH-urile solvențilo r luați în lucru
Figura 36: Diferențele dintre solvenții care în compoziția lor conțin aceași concentrație de acid acetic
637.116693.440
664.427
655.008
604.320665.278
540.000560.000580.000600.000620.000640.000660.000680.000700.000720.000
Apă plată
Borsec acidif ac.
Acetic 1%Etanol 70%
acidif ac. Acetic
1%Apă plată
Borsec acidif ac.
Acetic 2%Etanol 70%
acidif ac. Acetic
2%Apă plată
Borsec acidif ac.
Acetic 3%Etanol 70%
acidif ac. Acetic
3%Cantitate de antociani mg%
Solventul

39

Tabel 10: Factorii de corelație între antoc iani și minerale, pe
fiecare probă Coeficentul lui Pearson

40
În tab elul 10, în urma calculării coeficientului Pearson, se poate obseva că valorile
acestuia sunt cuprinse între -0,06552 și -0,46176. Ținând cont că aceste valori sunt foarte
apropiate, putem spune că, cantitatea de antociani, care a fost extrasă în urma expe rimentului a
fost influențată de compoziția chimică pe care apele îmbuteliate au avut -o. De asemenea se poate
observa în tabelul următor faptul că, coeficentul Pearson pentru pH are o valoare cuprinsă între
valorile [ -1, 1], ceea ce demonstrează faptul că pentru extracția antocianilor, pH -ul solvenților a
jucat un rol important.

Tabel 11: Coeficientul Pearson pentru pH
Figura 37: Eficiența apelor minerale în
extracția antocianilor Legendă
1- Apa Borsec neacidifată plată
2- Apa Borsec neacifiaită minerală
3- Apa Borsec plată acidifiată cu acid acetic 1 %
4- Apa Boresc plată acidifiată cu acid acetic 2 %
5- Apa Boresc plată acidifiată cu acid acetic 3%
6- Etanol 70% + acid acetic 1 %
7- Etanol 70% + acid acetic 2 %
8- Etanol 70% + acid acetic 3 %
9- Etanol 70% neacidifiat

Cantitatea de antociani (mg%)
Solvenții acidifiați și neacidifiați

41

În figura 37, poate fi observat care din extractele acidifiate și neacidifiate prezintă o
eficiență mai mare de extracție. În urma analizei grafice se poa te observa că extractele acidifiate
ale etanolului au extras o cantitate mai mare de antociani spre deosebire și de cele care nu conțin
acid acetic și cele care conțin. Acest lucru demionstrează facptul că pentru o extracție cât mai
eficientă este nevoie d e o anumită cantitate de acid slab, în cazul de față acidul acetic 1%, 2%,
3%.
Trebuie să nu uităm și să luăm în calcul și faptul că extractul cu apă Borsec neacidifiată
are o concentrație de antociani destul de mare, în comparație cu etanolul neacidifiat și cu
extractele cu apă Borsec acidifiată cu acid acetic de diferite concentrații. Cantitatea de antocianii
ce a putut fi extrasă în urma realizării experimentului este de 597,960 mg%. Dacă ne uităm la
figura 38, putem observa că valoarea aceasta este o v aloare intermediară, între cea indicată la
extractu cu etanol 70% și celelalte extracte cu apă Borsec acidifiată.

S-au realizat numeroase experimente pentru extracția antocianilor și observarea activității
lor. În cele mai multe cazuri ca și s olvent s -a utilizat metanolul sau etanoulul.
În general antocianii sunt extrași din diferite plante fiind utilizate diferiți solvenți pentru
extracție, ca: metanolul acidificat, cu o cantitate mică de acid formic sau acid hidrocloric, care
previne degrada rea pigmenților antocianici. De asemenea, pentru extracția de antociani poate fi
utilizată ca și solvent, acetona pentru unele specii de plante. Pentru analiza antocianilor s -au
utilizat diferite tehnici. Numeroși cercetători au investigat antocianii din d iferite pante. De
exemplu, Glassgien et al. (1992) a investigat antocianii din morcov ( Dancus carota L. ); Baladi
et al. (1995) a identificat doi noi derivați antocianici din Vitis vinifera ; Piovan et al (1998) a
Cantitatea de antociani mg%
Extractele acidifiate și neacidifiate Legendă
1 – Apă Borsec plată + Acid acetic 1%
2 – Apă Borsec plată + Acid acetic 2%
3 – Apă Borsec plată + Acid acet ic 3%
4 – Apă B orsec plată neacidifiată
5 – Etanolul neacidifiat
Figura 38: Comparație între extractele acidifiate,
cele neacidifiate și etanolul neacidifiat

42
analizat anocianii din Catharanthus roseus ; de asemenea Costa et al. (1998) a determinat
antocianii din Ribes nigrum . ( Kong et al, 2003)
Rao et al. (1942) descrie un alt experiment, în care are loc extracția alcoolică din petale
de Hibiscus sp. Aceasta este concentrată și menținută așa pentru u n timp, unde vor rezulta
fracțiuni de hibiscină. După distilarea alcoolică, materialul este „spălat” cu apă. Extracția eterică
din această soluție nu duce la formarea de produse cristaline, pe când la soluțiile apoase se
depozitează un solid care este cole ctat în două fracțiunii, acestea fiind reprezentate de hibiscină
și gosipetrină. Dacă se utilizează acetatul de plumb neutru, acesta va precipita un compus numit
sabdaritrin, în timp ce acetatul de plumb bazic prezintă fracțiuni prea mici pentru a putea fi
studiate. Sabdaritrina are formula C21H20O14∙3H2O. La o temperatură de 251 -53 ͦ, se
descompune. Prin fieberea acesteia cu acid sulfuric ( H2SO4), vor rezulta niște cristale de culoare
galbenă, care vor purta numele de sabdaretin. Produsul va avea formula: C15H10O9∙3H2O, dar
nu se va topi la 350 °. La rândul ei această substanță are o culoare variată, dacă este pusă în soluție
cu încărcătură alcalină. Culoarea roșie poate apărea când este redusă cu Mg și acid hidrocloric,
dar de asemenea poate prezenta un precipitat roșu cu acetatul de plumb. Astfel acest compus este
considerat a fi cel mai probabil un flavonol.
Mizukani et al. (1988) ne amintește că au fost identificați patru antociani din Hibiscus cu
o importanță mai mare sau m ai mică. dintre antocianii cu importanță mare amintim: cianidin -3-
sambubiozid și delfinidin -3-sambubiozid, iar cei care au o importanță mai scăzută, mai mică
sunt: cianidin -3-monoglicozidul și delfinidin -3-monoglicozidul.( Du and Francis, 1973 ;
Mizukani et al. 1988 )
Extracția și izolarea pigmenților antocianici a fos făcută fiind folosite diferite metode, iar
ca și solvent fiind utilizat MeOH acidifiat. După ce țesutul calicelui de Hibiscus a fost măcinat,
mărunțit (1g), din acesta s -a extras cu ajutorul M eOH acidifiat cu 1% HCl, la o temperatură de 4
℃, fiind lăsată peste noapte în repaus. Extractul a fost pe urmă centrifuga la 1000 x g timp de 5
min. După supernatantul a fost filtrat, iar ceea ce a rezultat a fost spălat cu apă. Pigmenții
antocianici au f ost separați de preparatul celulozic, utilizând AcOH -conc., HCl și apă ca solvent.
Țesutul proaspăt al calicelui a fost extras cu 1% HCl -metanolic la o temperatură de 4 ͦ C. În urma
tuturor metodelor efectuate au fost detectațidoia antociani, ca antociani majoritari. Rezultatele
indică faptul că ambi pigmenți prezintă o grup ortho -dihidroxi. ( Harborne, 1958 ; Mizukani et al.
1988 )
Metanolul și etanolul pentru a putea fi utilizați vor fi amestecați cu o cantitate mică de
acid și sunt cei mai comuni solvenți. Extracția se face ținându -se cont de anumiți parametrii
ca:temperatura, pH -ul solventului. ( Mantell et al. 2002, 2004; Pinelo et al. 2005, Cissé et al.
2012 ) Apa fierbite este de asemenea utilizată pentru extracție. (Tsai et al. 2002, Wong et al.

43
2003, Cissé et al. 2012) Asupra antocianilor s -au făcut numeroase studii legate de influența pH –
ului asupra gradului / coeficienetului de extracție al pigmenților antocianici. (Turker and Edogdn,
2006) De asemenea a fost studiat și efectul temperaturii asupra de gradării antocianilor. ( Cissé et
al. 2009 C, 2012)
Un experiment care s -a realizat folosind ca și solvent apa este cel descris de Cissé et al.
2012. În cadrul acestui experiment s -a urmărit efectul temperaturii, mărimea particulelor , timpul
de contact ș i consistența extracției în antociani din Hibiscus sabdariffa. Pentru realizarea
experimentului s -a folosit calicele acestei plante. Mai întâi aceata a fost pusă la uscat , la soare
timp de 5 zile. (Cissé et al. 2009 b). După acesta a fost amestecat cu apă plată. temperatura la
care s -a realizat extracța a fost variată între 25 ͦ C și 90 ͦ C, într -un intervaș de timp de 10 min la
10 h, iar concentrația solventului fiind între 1/5 și 1/30.
În cadrul unor experimente s -a urmărit chiar și efectele extractulu i apos din florile uscate
de Hibiscus sabdariffa L. și efectul antocianilor întâlniți în Hibiscus (HAs), pe paracetamol ce
induce hepatotoxicitate la șobolani. Extractul apos a fost dat la șobolani în locul la apă pentru
timp de 2, 3 sau 4 săptămâni, iar a ntocianii au fost administrați oral într -o doză de 50, 100 și 200
mg/ kg, timp de 5 zile. Paracetamolul a fost administrat după ce a fost realizat tratamentul cu
extract apos, respectiv antociani (HAs). Doza de paracetamol ce a fost administrată a fost de 700
mg/kg, pentru a induce hapatotoxicitatea. Șase ore după, șobolani au fost omorâți și au fost
evaluate funcțiile lor biochimice și histologice. Extractul ce a fost administrat timp de 4
săptămâni, aîmbunătățit câteva funcții vitale ce au fost evaluate , dar nu și după tratatrea
histologică cu paracetamol. În timpul multor evaluări pentru siguranță și eficacitate, antocianii
(HAs) pot fi potențial utilizați în reducerea hapatotoxicității indusă de paracetamol. (Ali et al.,
2003)

44
CONCLUZI I

Studiul efectuat prezintă o importanță deosebită legată de extracția antocianilor în
solvenți prietenoși (apa). Antocianii au un interes mare în industria alimentară și farmacologică.
Rezultatele obținute indică capacitatea mare de extracție a antociani lor din calicele de
Hibiscus sabdariffa în diferiți solvenți organici . Antocianii sunt pigmenți importanți și totodată
antioxidanți fiind formați dintr -un aglicon și un zaharid, fiind produși în plantă prin biosinteză,
folosinduse 3 căi: pentozofostat, ski kinate și flavonoidă.
În experimentul de față, cantități diferite de antociani din calicele mărunțit de Hibiscus
sabdariffa au fost extrase cu solvenți apoși, acidificați și ne -acidificați. Apa plată Borsec a
demonstrat că are cea mai mare capacitate de extracțieîn comparație cu celelalte ape luate în lucru
chiar mai mare decât etanolul 70 %, utilizat ca solvent martor. Atât înainte cât și după tratarea
termică a extractului, la temperatura de 40 ͦ C, pH -ul acestuia rămâne acid.
Cu ajutorul acestei lucr ări am contribuit la îmbogățirea datelor din literatură, am propus
utilizarea tehnicilor verzi de extracție ale antocianilor, utilizând solvenți apoși cu diferite
compoziții minerale.
Cercetările prezente au arătat următoarele:
– în solvenții apoși neacidif iați, concentrația cea mai mare de antociani a fost în extractul cu
apă Borsec (597,960 mg%)
– în solvenții apoși acidifiați cu acidul acetic 2%, concentrația de antociani extrasă a fost de
664,427 mg%
Rezultatele cercetării sunt cuprinse într -o lucrare ști ințifică în curs de dezvoltare.

45
ANEXA 1. FIGURI

Figura 1: Specii diverse de Hibiscus (Colaj propriu făcut cu imagini p reluate de pe internet) …………… 7
Figura 2: Hibiscus trionum ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 8
Figura 3: Semințe de Hibiscus trionum (Nataliatalent) ………………………….. ………………………….. ………… 8
Figura 4: Planta de Hibiscus esculentus -floarea și fructele (Derek Fell) ………………………….. …………….. 9
Figura 5: Floarea de Hibiscus rosa -sinensis (Fotografie din Baranquil a )………………………….. ……………. 9
Figura 6: Hibiscus syriacus – arbust (http://centredejardinbrossard.com/en/shop/hibiscus -syriacus –
aphrodite -2/)………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 10
Figura 7: Floarea de Hibiscus paramutabilis (Michelle Casler) ………………………….. ……………………….. 10
Figura 8: Hibiscus sabdariffa (Ferallas) ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 11
Figura 9: Floarea de Hibis cus sabdariffa ………………………….. ………………………….. ………………………….. 11
Figura 10: Structura chimică a acidului ascorbic ………………………….. ………………………….. ……………….. 13
Figura 11: Structura chimică a riboflavinei ………………………….. ………………………….. ………………………. 13
Figura 12: Structura chimică a tiaminei ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 13
Figura 13: Structura chimică a niacinei ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 13
Figura 14: Structura chimică a hibiscinei ………………………….. ………………………….. …………………………. 13
Figura 1 5: Metodologia de preparare a ceaiului de Hibiscus sabdariffa ( Fotografie personală ) ……… 15
Figura 16: Structura chimică a atocian ilor (ww.food -info.net) ………………………….. ………………………… 16
Figura 17: Biosinteza antocianilor ( adaptată din Pascal -Teresa et al. 2008) (Oancea și Oprean, 2011)
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 20
Figura 18: Schimbarea culorii la antociani în funcție de pH (www.macchinealimantari.it) ……………… 21
Figura 19: Colorant antociani ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 22
Figura 20: Râșnița electronică (fotografie proprie) ………………………….. ………………………….. …………….. 24
Figura 21: Balanța analitică (fotografie proprie) ………………………….. ………………………….. ……………….. 24
Figura 22: Distribuția pe hartă a provenienței probelor de apă îmbuteliată și de izvor …………………….. 25
Figura 23: Izvorul cu apă potabilă Barcani ………………………….. ………………………….. ……………………….. 25
Figura 24: I zvorul cu apă cu sulf Barcani ………………………….. ………………………….. ………………………… 25
Figura 25: Centrifugă ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 27
Figura 26: Spectofotometru ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 27
Figura 27: Termobalanță ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 27
Figura 28: pH -metru ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 27
Figura 29: Etapele urmărite pentru realizarea extracției de antociani (Păun et al. 2011) ………………….. 29
Figura 30: Organizarea ex perimentului chimic în laboratorul de Biochimie al Facultății Ș.A.I.A.P.M 32
Figura 31: Filtrarea extractului, după centrifugare ………………………….. ………………………….. …………….. 34
Figura 32: Diluarea supernatantului din extract, cu apă distilată ………………………….. ………………………. 34

46
Figura 33: Tratarea termică a extractelor apoase, în etuvă ………………………….. ………………………….. ….. 34
Figura 34: Cantitatea de antociani prezentă în fiecare extract apos din Hibiscus sp. ……………………….. 36
Figura 35: pH -ul extractelor anto cianice înainte și după tratamentul termic ………………………….. ………. 36
Figura 36: Diferențele dintre solvenții care în compoziția lor conțin aceași conce ntrație de acid acetic
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 38
Figura 37: Eficiența apelor minerale în extracția antocianilor ………………………….. ………………………….. 40
Figura 38: Comparație între extractele acidifiate, cele neacidifiate și etanolul neacidifiat ……………….. 41

47
ANEXA 2. TABELE

Tabel 1 : Compoziția chimică a calicelui de Hibiscus sabdariffa în funcție de zona sa de cultivare
raportat la doza maximă autorizată a elemntelor chimice prezente. (M. Cisse, M. Dornier, M. Sakt to,
A. Ndiaye, M. Reynos, O. Sock, 2009) ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 12
Tabel 2: Tipurile de antocianidini și grupările lor funcționale (www.food -info.net) ……………………….. 17
Tabel 3: Cantitatea de antociani prezentă în anumite plante ………………………….. ………………………….. .. 18
Tabel 4 : Distribuitorii apelor îmbuteliate luate în lucru ………………………….. ………………………….. ……… 26
Tabel 5 : Valorile de pH ale probelor de apă luate în lucru ………………………….. ………………………….. ….. 26
Tabel 6: Compoziția chimică a apelor îmbuteliate, luate în lucru ………………………….. …………………….. 27
Tabel 7: Tipurile de apă utilizate și pH -ul acestora ………………………….. ………………………….. ……………. 35
Tabel 8 : Caracteristici experimentale ale probelor de solvent luate în lucru ………………………….. ………. 37
Tabel 9: pH -urile solvenților luați în lucru ………………………….. ………………………….. ……………………….. 38
Tabel 10: Factorii de corelație între antociani și minerale, pe fiecare probă Coeficentul lui Pearson … 39
Tabel 11: Coeficientul Pearson pentru pH ………………………….. ………………………….. ………………………… 40

48
BIBLIOGRAFIE

A. Laza, G. Rácz (1975) „Plante medicinale și aromati ce”, Editura „Ceres” – București
A. Radu, E. Andronescu, I. Füzi (1981) „Botanica farmaceutică”, Editura didactică și pedagogică, pp
421
B. H. Ali, H. M. Mousa, S. El -Mougy (2003) „The Efect of a Water -Extract and Anthocyanins of
Hibiscus sabdariffa L. on P aracetamol -induced Hapatoxicity in Rats”, Phytotherapy Research, vol 17,
pp. 56 -59
B. He, J. Ge, P. Yue, XY. Yue, R. Fu, J. Liang, X. Gao (2017), „Loading of anthocyanins on chitosan
nanoparticles influences anthoyanin degradation in gastrointestinal fluid s and stability in a beverage”,
Food Chemistry 221, pp 1671 -1677
C. S. Kihҫ, S. Aslan, M. Kartal, M. Coșkun (2011), „Fatty Acid Composition of Hibiscus trionum L.
(Malvaceae) ”, Records of Natural Products 5:1, pp 65 -69
C. Salazar -González, F. T. Vergara -Balderas, A. E. Ortega -Regules, J. Á. Guerero -Beltrána (2012)
„Antioxidant properties and color of Hibiscus sabdariffa extracts”, Ciencia e Investigación AGRARIA
39 (1), pp 79 -90
C. T. Du, F. J. Francis (1973) „ANTHOCYANINS OF ROSELLE (Hibiscus sabdariffa, L.), Journal of
Food Sience, Vol. 38, pp 810
F. Anwar, U. Rashid, M. Ashraf, M. Nadeem (2010), „Okra (Hibiscus esculentus) seed oil for
biodiesel production”, Applied Energy, Vol. 87, Issue 3, pp 779 -785
F. He , l. Mu, G -L. Yan, N -N. Liang, Q -H. Pan, J. Wan g, M. J. Reeves, C -Q Duan (2010), „
Biosynthesis of Anthocyanins and Their Regulation in Colored Grapes”, Molecules, vol 15, pp 9057 –
9091
G. Păun, O. Gheorghe, M. Diaconu (2011) „Procesare avansată a plantelor medicinale”, MedPlaNet,
pp1-86
H. Mizukami, K. Tomita, H. Ohashi, N. Hiraoka (1988), „Anthocyanin production in callus cultures of
roselle ( Hibiscus sabdariffa L.), Plant Cell Reports 7: pp 553 -556
H. W. Felter, M. D., J. U. Lloyd, Phr. M., Ph. D. (1898), King's American Dispensatory
I. A. Ross (2003) „Hibiscus rosa -sinensis”, Medicinal Plants of the World, pp 253 -266
I. Tiță (2005) „Botanică farmaceutică”, Ediția a II -a, Editura didactică și pedagogică R.A., pp 743 -744

49
J-M. Kong, L. -S. Chia, N. -K. Goh, T. -F. Chia, R. Brouillard (2008) „Corrigendum to ”Anaysis and
biological activities of anthocyanins””, Phytochemistry 69 pp 1939 -1940
L. Popovici, C. Moruzi, I. Toma (2007) „Atlas botanic”, Editura Didactică și pedagogică, București,
pp 92 -93
M. Cissé, M. Dornier, M. Saktto, A. Ndiaye, M. Reynes, O. Sock (2009) „Le bissap (Hibiscus
sabdariffa L.): composition et principales utilisations”, Fruits vol 64, pp 179 -193
M. Cissé, P. Bohuon, F. Sambe, C. Kane, M. Sakho, M. Dornier (2012), „Aqueous extraction of
anthocyanins from Hibiscus sabdariffa : Experimental kinetics and modeling”, Journal of Food
Engineering 109, pp 16 -21
M. Mateus, V. de Freitas (2008) „Anthocyanins as Food Colorants”, Anthocyanins, Springer, pp 284 –
304
M. Ramsey, L. Seed, G. Vaughton (2003) „Delayed selfing and low levels of inbreeding d epression in
Hibiscus trionum (Malvaceae)” Australian Journal of Botany, Vol 51(3), pp 275 – 281
P. Bridle, C. F. Timberlake (1996) „Anthocyanins as natural food colours -selected aspects”, Food
Chemistry, Vol. 58, No 1 -2, pp 103 -109
P. S. Rao, T. R. Sesha dri (1942) „Pigments of flowers of Hibiscus sabdariffa ”, Departament of
Chemistry, Andhra University, Waltair, pp 323 -327
P.-J. Tsai, J. McIntosh, P. Pearce, B. Camden, B. R. Jordan (2002) „Anthocyanin and antioxidant
capacity in Roselle ( Hibiscus Sabdarif fa L.) extract”, Food Research International 35, pp 351 -356
S. Cañigual (2003) „Plantas Medicinales y Drogas Vegetales” Farmacia Práctica, vol 22, no. 5 pp 185 –
186
S. Oancea, L. Oprean (2011), „ Anthocyanins from biosynthesis in plants to human heath benef its”,
Acta Universitatis Cibiniensis Series E: FOOD TECHNOLOGY, vol XV, no 1, pp 3 -13
http://cesamancam.ro/hibiscus -ceai-extract.html
http://www.hiddenvalleyhibiscus.com/care/alkalinity.htm
http://quimica.laguia2000.com/elementos -quimicos/antocianinas
http://www.sabelotodo.org/glosario/antocianinas.html
https://plantepedia.wordpress.com/2015/11/08/roselle -hibiscus -sabdariffa/
https://www.britannica.com/plant/roselle -plant

50
http://worldoffloweringplants.com/hibiscus -rosa-sinensis -chinese -hibiscus -china -rose/
https://www.britannica.com/plant/okra
https://www.rhs.org.uk/Plants/114547/Hibi scus-syriacus -Oiseau -Bleu/Details
http://tropical.theferns.info/image.php?id=Hibiscus+trionum
http://hibiscus -malvaceae.blogspot.ro/2007/12/hibiscus -paramutabilis.html
https://examine.com/supplements/hibiscus -sabdariffa/
http://tom -piergrossi.squarespace.com/hibiscus/hibiscus -sabdariffa -var-altissima -h-cannabinus
http://jn.nutrition.org/content/140/2/29 8.long
http://www.tropilab.com/roselletincture.html
http://www.macchinealime ntari.it/2013/11/10/coloranti -naturali -nuove -possibilita -di-applicazione/2/