Aplicabilitatea Crioconservarii Ovocitelor de Pisica Prin Vitrificare

BIBLIOGRAFIE

1. AL-HASSANI S., J. KRISCH, K. DIEDRICH, S. BLANKE, H. VAN DER VEN AND D. KREBS, 1989, Successful embryo transfer of cryopreserved and in-vitro fertilized rabbit oocytes, [NUME_REDACTAT], 4:77-79.

2. ANDRABI SMH., MAXWELL WMC. 2007; A review on reproductive biotechnologies for conservation of endangered mammalian species. Anim. Reprod. Sci. 99: 223-243.

3. ASHWOOD-SMITH MJ. 1987, Mechanisms of cryoprotectant action. Symp. Soc. Exp. Biol.;41:395-406.

4. CABRITA E, ANEL L, HERRAEZ MP. Effect of external cryoprotectants as membrane stabilizers on cryopreserved rainbow trout sperm. Theriogenology 2001;56:623-635.

5. CANVIN AT, BUHR MM. 1989,Effect of temperature on the fluidity of boar sperm membranes. J Reprod. Fertil.;85:533-540.

6. CAROLL J, WHITTINGHAM D.G., WOOD M.J., TELFER E., GOSDEN R.G., 1990; Extra-ovarian production of mature viable mouse oocytes from frozen primary follicles, 90:321-327.

7. CARPENTER J.F., HANSEN T.N., 1992, Antifreeze protein modulates cell survival during cryopreservation: mediation through influence on ice crystal growth. Proc.Natl. Acad. Sci. USA;89:8953-8957.

8. CHECURA C.M ., G.E. SEIDEL,2007, Effect of macromolecules in solutions for vitrification of mature bovine oocytes,Theriogenology, 67:919-930

9. CHEN C., 1988, Pregnacies after human oocyte cryopreservation, Annals of the [NUME_REDACTAT] Academy of Sciences, 541:541-549.

10. CIUPE SIMONA, 2004 Cercetări privind morfologia embrionilor în vederea conservării și transferului embrionar. Teză de doctorat.

11. DHALI A, MANIK RS, DAS SK, SINGLA SK, PALTA P. 2000, Post-vitrification survival and in vitro maturation rate of buffalo (Bubalus bubalis) oocytes: effect of ethylene glycol concentration and exposure time. Anim. Reprod. Sci.; 63: 159-165.

12. ECHLIN P, SKAER HB, GARDINER BO, FRANKS F, ASQUITH MH. 1977, Polymeric cryoprotectants in the preservation of biological ultrastructure. II. Physiological effects. J Microsc;110:239-255.

13. EL-DANASOURI I., SELMAN H., 2001; Successful pregnancies and deliveries after a simple vitrification protocol for day 3 human embryos. [NUME_REDACTAT] ;76:400-402.

14. FAO, 2012Cryoconservation of animal genetic resources, Rome,Italy.

15. FULLER B., N. LANE, E. BENSON, 2004 Life in the [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT]: CRC Press, p.672.

16. GAO D, CRITSER JK.. 2000;Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J 41:187-196.

17. GONZALEZ N. 1994, Fertilization and early embryonic development, Reproduction of the domestic animals. Ed. Aedos, 6: 167-178.

18. GOSDEN R. AND M. NAGANO, 2002, Preservation of fertility in nature and ART, Reproduction, 123:3-11.

19. GROZA I., MORAR I. 2004, [NUME_REDACTAT], Ed. Gryphon, Brasov.

20. GROZA I. si MUNTEAN M. 2002, Elemente de fiziologia reproducției la animale, E. [NUME_REDACTAT], Cluj-Napoca.

21. GROZA I., BOGDAN L.M., CATANA R., CENARIU M., CIUPE S., CIUPERCESCU D., MORAR I., MUNTEAN M., POP R., STEGEREAN B. 2006 – Ginecologie, andrologie si obstetrica veterinara : compendiu. Edit. [NUME_REDACTAT], Bucuresti.

22. HETTIG ANDREA KLARA, 2011,Vitrificarea ovocitelor provenite de la suine:efectul concentrației de crioprotector și a timpului de expunere. Teză de doctorat.

23. HOCHI S. Cryopreservation of follicular oocytes and preimplantation embryos in cattle and horses, Journal of [NUME_REDACTAT], 49:13-21; 2003.

24. HOCHI S., M. HIRABAYASHI, M. HIRAO, 2001, Effects of cryopreservation of pronuclear-stage rabbit zygotes on the morphological survival, blastocyst formation, and full-term development after DNA microinjection, [NUME_REDACTAT] and Development, 60: 227-232.

25. KASAI M, MUKAIDA T. 2004, Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod. [NUME_REDACTAT];9:164-170.

26. LE GAL F., DE ROOVER R., VERHAEGHE B., ETIENNE D.,MASSIP A., 2000 – Development of vitrified matured cattle oocytes following thawing and in vitro culture. Vet. Rec. [NUME_REDACTAT].

27. LEDDA S, LEONI G, BOGLIOLI L, NAITANA S. 2001, Oocyte cryopreservation and ovarian tissue banking. Theriogenology; 55: 1359-1371.

28. LEIBO S.P., 2004, Cryopreservation of mammalian oocytes. [NUME_REDACTAT], T and Gosden, RG (eds) Cryopreservation of mammalian oocytes Taylor and Francis, London, pp. 141-155

29. LEIBO S.P., J.J. MCGRATH AND E.G. CRAVALHO, 1978, Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of colling rate, Cryobiology,15:257-271.

30. LUNA H.S., FERRARI I., RUMPF R., 2001 – Influence of stage of maturation of bovine oocytes at time of vitrification on the incidence of diploid metaphase II at completion of maturation. Anim. Reprod. Sci., 68: 23-28.

31. LUYET B. 1969,On the amount of water remaining amorphous in frozen aqueoussolution. Biodynamica;10:277-291.

32. LUYET B., RAPATZ G. 1958;Patterns of ice formation in some aqueous solutions. Biodynamica 7:171-174.

33. MAGISTRINI M. AND SZOLLOSI, 1980, Effects of cold and isopropyl-N-phenilcarbamate on the second meiotic spindle of mouse oocytes, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], 22:699-707.

34. MARTINO A., J.W. POLLARD, S.P. LEIBO,1996, Effect of chilling bovine oocytes on their developmental competence, [NUME_REDACTAT] and Development, 45:503-512.

35. MASSIP A. 2003; Cryopreservation of bovine oocytes: current status and recent developments. 43: 325-330

36. MAVRIDE A, MORROLL D. 2002,Cryopreservation of bovine oocytes: is cryoloop vitrification the future to preserving the female gamete? [NUME_REDACTAT] Dev 2002; 42: 73-80.

37. MAZUR P. 1984,Freezing of living cells: mechanisms and implication;247:125-142.

38. MAZUR P., 1963 Kinetics of water loss from cells st subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing , Journal of Genetics and Physiology, 47:347-369.

39. MAZUR P., 1970, Cryobiology: The freezing of biological systems, Science 168:939-949.

40. MCGEE HA, MARTIN WJ. 1962, Cryochemistry. Cryogenics;2:1-11.

41. MEN H., MONSON R.L., RUTLEDGE J.J., 2001 – Effect of meiotic stages and maturation protocols on bovine oocyte’s resistance to cryopreservation. Theriogenology, 64: 245-250.

42. MERYMAN H.T.,1971,Osmotic stress as a mechanism of freezing injury. Cryobiology 8, 489-500.

43. OTOI, T., SHIN, T., KRAEMER, D.C.,WESTHUSIN, M.E., 2004: Influence of maturation culture period on the canine oocytes after in vitro maturation and fertilization. Reprod. Nutr. Dev. 44, 631–637.

44. PARKENING TA, TSUNODA Y, CHANG MC. 1976,Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability anddevelopment of frozen-thawed mouse eggs. J [NUME_REDACTAT];197:369-74.

45. PARKES A.S., 1960, Marshall`s Physiology of Reproduction. 3rd ed. Longmans, London.

46. PEREIRA RM, MARQUES CC. 2008, Animal oocyte and embryo cryopreservation. [NUME_REDACTAT] Bank; 9: 267-277.

47. PICTON HM, HARRIS SE, MURUVI W, CHAMBERS EL. 2008,The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction;136:703-715.

48. POLGE C, SMITH AU, PARKES AS. 1949, Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature;164:666.

49. POLLARD J.W., MARTINO A., RUMPH N.D., 1996 – Effect of ambient temperatures during oocytes recovery on in vitro production of bovine embryos. Theriogenology 46: 849-858.

50. PRENTICE JENNIFER R., , Cryopreservation of [NUME_REDACTAT] for Conservation of [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 2011 (2011), Article ID 146405, 11 SAGE-[NUME_REDACTAT] to Research, [NUME_REDACTAT] International, Volume 2011, Article ID 146405

51. RALL WF, MAZUR P, SOUZU H. 1978, Physical-chemical basis of the protection of slowly frozen human erythrocytes by glycerol. Biophys J;23:101-120.

52. RUFFING N.A., P.L. STEPONKUS, R.E PITT, J.E. PARKS,1993, Osmometric behavior, hidraulic conductivity, and incidence of intracellular ice formation in bovine oocytes at different developmental stages, Cryobiology,30:526-580.

53. SCHWARTZ G.J., DILLER K.R., 1983 ,Osmotic response of individual cells during freezing. II. Membrane permeability analysis. Cryobiology;20:542-552.

54. SHAW J.M., ORANRATNCACHAI A., TROUNSON A.O., 2000 – Fundamental cryobiology of mammalian oocytes and ovarian tissue. Theriogenology, 53: 59-72

55. SIDEL G.E. JR., 2006, Modifying oocytes and embryos to improve there cryopreservation. Theriogenology, 65: 228-235.

56. STACHECKI J.J., MUNNE S., COHEN J., 2004, Spindle organization after cryopreservation of mouse, human, and bovine oocytes. [NUME_REDACTAT] Online; 8: 664–77.

57. TUKER J.M., LIEBERMANN J. 2007,Vitrification in [NUME_REDACTAT]. Ed. Informa.

58. VAJTA G., NAGY ZP., 2006, Are programmable freezers still needed in the embryo laboratory? Review on vitrification. [NUME_REDACTAT] Online; 12: 779-796.

59. VINCENT C, PICKERING SJ, JOHNSON MH. 1990, The hardening effect of dimethylsulphoxide on the mouse zona pellucida requires the presence of an oocyte and is associated with a reduction in the number of cortical granules present. J [NUME_REDACTAT];89:253-259.

60. WATSON P.F. AND W.V. HOLT, 2001, Cryobanking the [NUME_REDACTAT], Taylor and Francis, London.

61. WHITTINGHAM D.G., 1977, Fertilization in vitro and development to term of unfertilized mouse oocytes previously stored at -196° C, Journal of Reproduction and Fertility, 49:89-94.

62. WILLISi JS, ELLORY JC, BECKER JH. 1978 Na-K pump and Na-K-ATPase: disparity of their temperature sensitivity. Am J Physiol;235:C159-167.

63. WOODS E.J., J. BENSON, Y. AGCA, J.K.CRITSERA, 2004Fundamental cryobiology of reproductive cells and tissues, , Cryobiology,48:147.

64. *** www.ming-mei.com

65. ***http://commons.wikimedia.org

REZUMAT

ABSTRACT

INTRODUCERE

Capitolul 1

STUDIU BIBLIOGRAFIC

1.1 PRINCIPIILE CRIOCONSERVĂRII

1.2METODE DE CRIOCONSERVARE A OVOCITELOR

1.2.1Congelarea lentă convențională

1.2.2Congelarea rapidă

1.2.3 Vitrificarea sau congelarea ultra rapidă

1.2.3.1PRINCIPIILE VITRIFICĂRII

1.2.3.2FACTORI CARE INFLUENȚEAZĂ VITRIFICAREA

1.2.3.3PROTOCOALE UTILIZATE PENTRU VITRIFICAREA OVOCITELOR

Vitrificarea în paiete convenționale

Metoda de conservare pe grile de cupru

Vitrificarea în paiete deschise

[NUME_REDACTAT]

Vitrificarea pe suprafață solidă

[NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] în paiete închise

[NUME_REDACTAT]

1.2.3.4SUBSTANȚELE CRIOPROTECTOARE

Capitolul 2

CERCETĂRI PROPRII

2.1 SCOPUL LUCRĂRII

Material biologic

Recoltarea chirurgicală a ovarelor

După identificare și izolare, ovocitele au fost supuse examenului morfologic la stereolupă și la microscopul în fază inversată NIKON ECLIPSE Ti-E.

2.4Vitrificarea ovocitelor maturate

2.5Decongelarea paietelor după vitrificare

2.6Aprecierea viabilității ovocitelor ovocitelor după decongelare

2.7Analiza statistică

Capitolul 3

3.1REZULTATE ȘI DISCUȚII

3.1.1Cultivarea in vitro a ovocitelor

3.1.2Aprecierea morfologică a ovocitelor după maturare

Capitolul 4

CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

RECOMANDĂRI

BIBLIOGRAFIE

ABREVIERI

CUPRINS

REZUMAT 2

ABSTRACT 3

INTRODUCERE 3

Capitolul 1 7

STUDIU BIBLIOGRAFIC 7

1.1 PRINCIPIILE CRIOCONSERVĂRII 7

1.2METODE DE CRIOCONSERVARE A OVOCITELOR 9

1.2.1Congelarea lentă convențională 9

1.2.2Congelarea rapidă 9

1.2.3 Vitrificarea sau congelarea ultra rapidă 10

1.2.3.1PRINCIPIILE VITRIFICĂRII 10

1.2.3.2FACTORI CARE INFLUENȚEAZĂ VITRIFICAREA 11

1.2.3.3PROTOCOALE UTILIZATE PENTRU VITRIFICAREA OVOCITELOR 13

Vitrificarea în paiete convenționale 14

Metoda de conservare pe grile de cupru 14

Vitrificarea în paiete deschise 15

[NUME_REDACTAT] 15

Vitrificarea pe suprafață solidă 16

[NUME_REDACTAT] Straw 16

Vitrificarea în paiete închise 16

[NUME_REDACTAT] 17

1.2.3.4SUBSTANȚELE CRIOPROTECTOARE 18

Capitolul 2 19

CERCETĂRI PROPRII 19

2.1 SCOPUL LUCRĂRII 19

Material biologic 21

Recoltarea chirurgicală a ovarelor 21

După identificare și izolare, ovocitele au fost supuse examenului morfologic la stereolupă și la microscopul în fază inversată NIKON ECLIPSE Ti-E. 33

2.4Vitrificarea ovocitelor maturate 37

2.5Decongelarea paietelor după vitrificare 39

2.6Aprecierea viabilității ovocitelor ovocitelor după decongelare 40

2.7Analiza statistică 41

Capitolul 3 42

3.1REZULTATE ȘI DISCUȚII 42

3.1.1Cultivarea in vitro a ovocitelor 51

3.1.2Aprecierea morfologică a ovocitelor după maturare 52

Capitolul 4 63

CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI 63

RECOMANDĂRI 65

BIBLIOGRAFIE 66

ABREVIERI 71

CERCETĂRI PRIVIND APLICABILITATEA CONSERVĂRII OVOCITELOR DE PISICĂ PRIN VITRIFICARE

Maria-Aura ROMAN

coordonator științific: Prof.Dr. Ioan GROZA

Îndumători: Conf.Dr. Simona CIUPE; [NUME_REDACTAT]. Emoke PALL

Universitatea de [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT], Facultatea de [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] nr. 3-5, 400372, Cluj-Napoca, România

e-mail:auraroman81@yahoo.com

REZUMAT

Scopul acestui studiu a fost de a evalua efectul diferitelor protocoale de vitrificare aplicate pe ovocitele pisicilor recoltate și maturate în vitro, menținerea viabilității ovocitelor după decongelare fiind apreciată prin examen morfologic și colorație.

Maturarea ovocitelor s-a realizat prin cultivare timp de 24 ore în două medii.

Consevarea ovocitelor maturate s-au realizat prin trei protocoale de vitrificare.

În protocolul I ovocitele au fost adăugate în mediul de conservare compus din DMEM/F12 suplimentat cu 30%FCS și 60%DMSO (dimetilsulfoxid).

Ovocitele supuse vitrificării pe baza protocolului II au fost menținute pentru echilibrare timp de 1 minut în mediul de vitrificare compus din etilenglicol (EG) 20% și sucroză 0.5M, după care ovocitele au fost aspirate împreună cu acest mediu în paiete de 250 µl și au fost plonjate în azot lichid.

Pentru protocolul III de vitrificare, ovocitele au fost menținute 30 minute pentru echilibrare în mediul TCM 199 suplimentat cu 10% FCS. După echilibrare ovocitele au fost adăugate în mediu cu concentrații diferite de EG: EG 2% suplimentat cu sucroză 0.5M – 5 minute, EG 5% -5 minute,2 minute în EG 10%, 1 minut în EG 20% suplimentat cu sucroză 0.5M, după care ovocitele au fost aspirate împreună cu acest mediu în paiete de 250 µl și au fost plonjate în azot lichid

Pentru evaluarea celor trei protocolale de vitrificare s-au luat în studiu 90 (n=90) de ovocite maturate in vitro. Utilizând protocolul I de vitificare viabilitatea ovocitelor după decongelare a fost de 40.83%±2.21, 56.66±2.16 utilizând protocolul II, iar prin evaluarea protocolului III gradul de viabilitate a fost de 70%±3.65

Cuvinte cheie: vitrifiacare, ovocite, in vitro,conservare.

CERCETĂRI PRIVIND APLICABILITATEA CONSERVĂRII OVOCITELOR DE PISICĂ PRIN VITRIFICARE

Maria-Aura ROMAN

coordonator științific: Prof.Dr. Ioan GROZA

Îndumători: Conf.dr. Simona CIUPE; Cercetător. Dr. Emoke PALL

University of [NUME_REDACTAT] and [NUME_REDACTAT], Faculty of [NUME_REDACTAT],

Mănăștur no. 3-5, 400372, Cluj-Napoca, Romania

e-mail:auraroman81@yahoo.com

ABSTRACT

The purpose of this study was to evaluate the effect of different vitrification protocols applied to oocytes matured in vitro cats harvested and maintaining the viability of oocytes after thawing was assessed by morphological examination and staining.

The maturation of the oocytes was achieved by cultivation for 24 hours in the two media.

Conservation or matured oocytes were performed by three vitrification protocols.

In protocol I, the oocytes were added to the preservative consists of DMEM/F12 supplemented with 30% FCS and 60% DMSO (dimethylsulfoxide).

Oocytes subjected to vitrification to the protocol II were kept for 1 minute for stabilization in the glass transition ethylene glycol consisting of (EG) 20% sucrose 0.5M and then oocytes were aspirated along with the medium flakes and 250 µl was plunged into liquid nitrogen.

For vitrification protocol III, oocytes were maintained in 30 minutes to equilibrate the TCM 199 supplemented with 10% FCS. After equilibration in the environment oocytes were added to different concentrations of EG: EG 0.5 M sucrose supplemented with 2% – 5 minutes, 5% EG -5 minutes, 2 minutes in 10% EG, EG 1 minute supplemented with 20% sucrose 0.5 M, after which oocytes were aspirated with this environment sequins 250 µl and were plunged into liquid nitrogen

To evaluate the three vitrification protocol in the study were 90 (n = 90) of oocytes matured in vitro. Using the protocol I viability upon thawing of the oocytes was 40.83% ± 2.21, 56.66 ± 2.16 using protocol II, and protocol III by evaluating the degree of viability is 70% ± 3.65

Keywords: vitrification, oocytes, in vitro, conservation.

INTRODUCERE

Cercetările efectuate în domeniul crioconservării embrionilor și ovocitelor aparținând speciilor animalelor domestice, au fost mereu animate de dezideratul perfecționării unor tehnici, care pe lângă eficiență, să ofere și posibilitatea utilizării lor pe scară largă.

Interesul este cu atât mai mare cu cât metoda își lărgește aria de aplicabilitate în direcția stocării nelimitate în timp a informației genetice a speciilor pe cale de dispariție.

Cercetările din lucrarea de față au fost realizate în perioada septembrie 2012 – aprilie 2014 pe un număr de 414 ovocite de pisică, recoltate din 46 ovare provenite de la 23 pisici ovariectomizate în clinica Disciplinei de Reproducție, Obstetrică și Ginecologie, [NUME_REDACTAT].

Conservarea unor proprietăți genetice ale animalelor a devenit o prioritate internațională; cu toate acestea majoritatea protocoalelor de conservare in vitro sunt extrem de costisitoare (Andrabi și Maxwell, 2007, Prentice și col., 2011). Prin urmare, eforturile se concentrează pe dezvoltarea unor metode de crioconservare eficientă pentru conservarea ovocitelor, care ulterior să fie stocate în bănci de ovule (Ledda și col., 2001). Congelare lentă, o metodă comună pentru crioconservare a ovocitelor, provoacă șoc osmotic și cristalizarea intracelulară a particolelor de apă care duce la deteriorarea celulelor. Vitrificarea este o metodă alternativă pentru crioconservare în care celulele sunt expuse la o concentrație mai mare de crioprotectori, iar viteza de congelare este rapidă. Supraviețuirea celulară depinde în esență de condițiile în care se produc modificările apei celulare, agentul crioprotector, concentrațiile acestuia în mediu, viteza de răcire, viteza de decongelare și modul de eliminare a crioprotectorului (Leibo S.P. și col., 1978, Woods și col., 2004, Checura și Seidel 2007).

În prezent, vitrificare este o metoda comună de crioconservare a embrionilor. Cu toate acestea, vitrificare ovocitelor este încă o provocare din cauza structurii lor complexă și sensibilitații la refrigerare (Prentice și col., 2011).

Cercetătorii au crezut, mult timp că temperaturile scăzute exercită doar efecte negative asupra celulelor și țesuturilor ([NUME_REDACTAT] M. și col. 2002). În anul 1600, [NUME_REDACTAT] a congelat un țipar în apă sărată, iar după decongelare a constatat că este încă activ. Power a fost primul care a emis teoria că „răcirea nu are așa multe proprietăți ucigașe pe care le posedă căldura” ([NUME_REDACTAT] F. și col., 2000).

Ideea de a folosi congelarea și uscarea pentru a păstra alimente și alte materiale perisabile datează de mii de ani. Munca de pionierat în crioconservare a fost realizată în Italia de preotul si omul de stiință [NUME_REDACTAT] în 1776. El a fost primul care a conservat materialul seminal de armăsar în zăpadă (Tuker si Lieberman,2007). Mai târziu, în secolul al 19-lea și prima jumătate a secolului 20, oamenii de stiință au elucidat anumite aspecte ale mecanismelor de adaptarea la rece a materiei vii. Cele mai importantă contribuție a fost făcută de către părintele Luyet, care a fost numit pe bună dreptat fondator al științei de Criobiologie.

În 1938, Luyet și Hodapp obțin supraviețuirea spermatozoizilor de broască vitrificați cu azot lichid. În 1940 [NUME_REDACTAT] și colaboratorii de la Universitatea din Cambrigde au descoperit accidental capacitățile protectoare ale glicerolului în crioconservarea spermatozoizilor de taur (Polge C. și col., 1949). Descoperirea abilității glicerolului de a proteja celulele împotriva congelării a dus la apariția științei biologiei la temperaturi scăzute.

În 1960, [NUME_REDACTAT] extinde experimentele și studiază răspunsul microorganismelor expuse la temperaturi scăzute și la congelare. Aceste studii timpurii au dus la dezvoltarea disciplinei care poartă numele de criobiologie (Mazur,1963,2004).

Procesul de crioconservare, a fost descris pentru prima dată în anul 1960 de către Mazur și Luyet care au demonstrat anumite fenomene legate de mișcarea moleculelor prin membrana plasmatică (PM) în funcție de permeabilitatea membranară, schimburile de volum celular și formarea unor cristale de gheață în și în afara celulelor (Luyet și Rapatz, 1958;Mazur, 1963; Luyet, 1969; Mazur, 1970; Mazur, 1984).

Succesul crioconservării celulelor mamifere depinde de o serie de variabile ce includ: mediul de cultură, concentrația crioprotectorului adăugat, rata de răcire, metodele de îndepărtare a crioprotectorului din celulă. În funcție de mediul de cultură, celulele se comportă diferit și au rate de răcire diferit ce pot porni de la 0,2ºC/min. la 1ºC/min. În anumite condiții, celulele pot supraviețui chiar la o rată de răcire de peste 100ºC/min (Shi D.S. și col., 1998).

De-a lungul anilor au fost descrise diferite protocoale pentru crioconservarea embrionilor și ovocitelor (Stechecki J.J. și col., 2004). Deși crioconservarea embrionilor este astăzi o procedură standard, s-a demonstrat că ovocitele mamiferelor sunt mult mai dificil de crioconservat. Cercetările efectuate pe ovocitele de șoricioaică crioconservate prin protocoale convenționale utilizate pentru embrioni s-au soldat cu rate de dezvoltare mici de 6-14%, însă s-a reușit obținerea de produși de concepție din ovocite crioconservate la șoarece (Parkening T.A. și col., 1976; Whittingham D.G., 1977), la iepure (Al-Hasani S.K. și col., 1989), la vacă (Hochi S., 2003; Otoi T.S. și col., 1998) și la om (Chen C., 1988).

Ovocitele sunt dificil de crioconservat datorită dimensiunilor mari, raporturilor dintre suprafață/volum, cantității mari de apă (și conductivității hidraulice scăzute (Leibo S.P., 2004). Aceste aspecte au condus la sporirea investigațiilor legate de vitrificarea ovocitelor ca o alternativă a crioconservării. Optimizarea metodei de crioconservare a ovocitelor va constitui baza unor aplicații multiple, printre acestea amintind: crearea unor bănci de gene și conservarea materialului genetic al animalelor pe cale de dispariție (Watson P.F. și Holt W.V., 2001). În plus, crioconservarea ovocitelor va putea asigura producerea de linii transgenice de animale, iar pentru medicina umană, stocarea prin crioconservare a ovocitelor, va veni în sprijinul reducerii aspectelor etice și morale legate de această biotehnologie (Gosden R. și Nagano M., 2002).

Capitolul 1

STUDIU BIBLIOGRAFIC

1.1 PRINCIPIILE CRIOCONSERVĂRII

Crioconservarea implică congelarea de celule sau țesuturi întregi la temperaturi sub zero grade (-196 ° C), în azot lichid (LN2). La această temperatură, activitatea biologică se reduce, iar viabilitatea celulelor și starea funcțională pot fi păstrate perioade lungi de timp. Cu toate acestea, diferite procese fizice pot distruge celulele, prin urmare, majoritatea protocoalelor de congelare utilizează paralel deshidratarea, congelarea, suprarăcire și vitrificarea intracelulară în scopul evitării deteriorării celulare. Deasemenea foarte important este natura și concentrația de crioprotector în crioconservarea germoplasmei în orice protocol de crioconservare(Hettig,2011).

Substanțele crioprotectoare din gama dimetil sulfoxidul (DMSO), etilenglicolul (EG) sau glicerolul singuri sau în combinație protejează celulele și țesuturile de modificări ireversibile care pot să apară în timpul congelării. În plus, rata de răcire și metoda de congelare sunt, deasemenea, factori importanți ce trebuie să fie luat în considerare în prevenirea crioinjuriilor. Congelare lentă, care utilizează o curbă de înghețare controlată, este frecvent utilizată pentru crioconservarea celulelor. Cu toate acestea, vitrificarea, care utilizează congelarea ultra rapidă și concentrații mari de crioprotectori, câștigă popularitate din cauza ratelor sale de succes(FAO,2012).

În general crioconservarea implică respectarea a trei etape critice: expunerea celulelor sau țesuturilor la crioprotectori (Fuller B. și col., 2004); răcirea la temperaturi sub 0ºC; decongelarea, diluarea și îndepărtarea crioprotectorilor (Sidel G.E. JR., 2006).Ratele de răcire reprezintă unul dintre factorii determinanți pentru supraviețuirea celulei în timpul crioconservării. Racirea prea lentă distruge celula prin expunerea la soluții concentrate, iar racirea prea rapidă pot cauza moartea celulei prin formarea de cristale de gheață (Leibo S.P., și col.,1996).

Atunci când celulele sunt răcite la temperatura sub 0ºC, în soluția extracelulară se formează cristale de gheață, iar citoplasma celulelor va colapsa. Pe măsură ce citoplasma este răcită la temperaturi scăzute (sub –10ºC sau –15ºC), cristalele de gheață se formează rapid, fenomen numit nucleația intracelulară, letală pentru celulă. Răcire provoacă o reducerea activității enzimatice (Heber, 1968), reducerea transportului activ: ca o consecință a activiății enzimatice reduse (Willis și colab., 1978), modificări membranare (Canvin și Buhr, 1989). Înghețul poate provoca alte tipuri de modificări și anume modificări membranare datorită unor leziuni provocate de cristalele de gheață (Gao și Critser, 2000); modificări membranare ireversibile și leziuni ale organitelor celulare datorită șocului termic și osmotic (Schwartz și Diller, 1983).

Factorii biologici și fizici fundamentali pentru succesul vitrificării se referă la conținut de apă intracelular, permeabilitatea membranei și raportul dintre suprafață celulară/volum.

Factorii importanți pentru a preveni formarea gheții intracelular și pentru realizarea echilibrului osmotic și termic în timpul crioconservării sunt: vitezele de răcire și de încălzire, soluțiile crioconservante și nu în ultimul rând etapele de diluare permițând astfel refacerea optimă a micromediului intracelular (Mazur, 1963; Mazur, 1970, Meryman,1974).

Prin procesul de vitrificare nu se mai formează cristale intracelulare de gheață, ceea ce duce la creșterea ratei de viabilitate a celulelor (Hochi S. și col., 2001). La -196 ° C un au loc procese metabolice deoarece apa este menținută la starea cristalizată sau sticlosă (McGee și Martin, 1962). Singurele reacții care pot apărea sunt evenimente fotofizice, cum ar fi formarea de radicali liberi în macromolecule induse de radiatii ionizate (Mazur, 1984).

Rata de încălzire este de asemenea importantă pentru succesul crioconservării celulelor de mamifere. Aceste rate variază în funcție de tipul de celulă, fiind dependente de rata de răcire utilizată. Cercetările au demonstrat că ratele rapide de încălzire după crioconservare au fost întotdeauna mai bune datorită scurtării timpului necesar pentru recristalizare și de expunere la crioprotector. Cea mai utilizată metodă pentru decongelarea ovocitelor după vitrificare este metoda rapidă și directă. Obișnuit ovocitele sunt plasate în soluții calde la 20 – 37ºC, iar după decongelare ele se rehidratează (Parkes A.S., 1960)

1.2METODE DE CRIOCONSERVARE A OVOCITELOR

1.2.1Congelarea lentă convențională

Congelarea lentă, convențională, este bazată pe principiul deshidratării, unde ratele de răcire sunt optimizate pentru a elimina apa din ovocită, prevenind astfel crioinjuriile prin formarea cristalelor de gheață, concomitent cu minimalizarea toxicității chimice și a stresului osmotic rezultat din expunerea la concentrații mari de crioprotector (Caroll J și col., 1990, Carpenter și Hansen, 1992). Răcirea lentă implică folosirea în medii a concentrațiilor scăzute de crioprotectori (1-2M) cât și rate lente de răcire (0,1 – 1,0ºC/min) asigurate de aparate de congelate programabile. Celulele suferă deshidratarea pe parcursul procesului de răcire lentă, celula este afectată din cauza șocului osmotic,datotită formării de cristale de gheață sau toxicității crioprotectoarelor utilizați. Metodele de răcire lentă permit schimbul de soluții dintre compartimentele intracelular și extracelular fără inducerea unor efecte osmotice serioase. Succesul depinde de obținerea unui echilibru optim între rata la care apa părăsește celula și rata la care aceasta se transformă în gheață, echilibru atins la o concentrație scăzută a crioprotectorului și la rate scăzute de răcire, ceea ce permite și deshidratarea celulei pe parcursul congelării ([NUME_REDACTAT], 2004). Utilizând metoda de congelare lentă, deshidratarea ovocitei este uzual obținută prin plasarea ovocitei într-o soluție cu o concentrație de 10 – 11% crioprotector, temperatura fiind treptat scăzută și apariția cristalelor de gheață este inițiată prin seeding, care este realizat prin atingerea coloanei de soluție cu o baghetă metalică răcită.

1.2.2Congelarea rapidă

Mavrides A. și col., 2002 au simplificat metoda de congelare a ovocitelor, realizând un protocol de congelare rapidă, folosind ca și crioprotectori propandiolul și sucroza. Astfel, ovocitele au fost echilibrate prima dată în 1,5M propandiol 10 min. și 10 min. în amestec de 1,5M propandiol și 0,1M sucroză, apoi au fost aspirate în paiete transparente care au fost introduse într-o baie de alcool la temperatura de -10OC, după care imersate în LN2 (fig.1.1).

Fig. 1.1 Protocolul de congelare rapidă

(după Mavrides A. și col., 2002)

1.2.3 Vitrificarea sau congelarea ultra rapidă

1.2.3.1PRINCIPIILE VITRIFICĂRII

De-a lungul anilor a existat un efort considerabil concentrat pe reducerea timpului de proceduri de congelare și eliminând nevoia de congelatoare programabile necesare în timpul congelării lente convenționale. Mai mult decât atât, congelare echilibrată nu poate fi metoda cea mai avantajoasa pentru crioconservarea ovocitelor pentru că acestea sunt deteriorate din cauza expunerii îndelungate la temperaturi aproape de 0°C (Massip A. 2003).

Termenul "vitrificare" provine de la cuvântul latin "Vitrum". Aceasta se referă la un proces fiziologic prin care o soluție trece de la o stare lichidă la o stare vitroasă la temperaturi scăzute, ocolind formarea cristalelor de gheață.

Vitrificarea este metoda alternativă de crioconservare (Hettig, 2011) care utilizează o rată de răcire ultra rapidă, eliminând necesitatea unui echipament de congelare programabil.

Vitrificarea este o tehnică de răcire rapidă care se bazează pe contactul direct dintre soluția de vitrificare care conține agenți crioprotectori și azotul lichid (LN2). Protocoalele pentru vitrificare sunt foarte simple și ele permit ca celulele și țesuturile să fie plasate în crioprotector și apoi plonjate direct în azot lichid (LN2) ([NUME_REDACTAT],2004). În plus, tehnica de vitrificare folosește o concentrație ridicată crioprotector care evită precipitarea apei, prevenind formarea cristalelor de gheață intracelular (Pereira RM și col 2008). În ultimii ani, aproape toate progresele din crioconservare ovocitelor au fost realizate folosind tehnici de vitrificare (Vajta G, și col 2006, Pereira RM și col 2008, Prentice și col., 2011).

Există multe variabile în procesul de vitrificare, care pot influența rata de supraviețuire a ovocitelor. Diferențele de viabilitate post vitrificare și ratele de dezvoltare după decongelare sunt variabile care depind de specie, stadiul de dezvoltare și de origine (Pereira RM și col 2008). Tipul și concentrația de crioprotector, temperatura soluției de vitrificare în momentul expunerii celulelor și durata expunerii la crioprotector înainte de imersare în LN2 sunt factori importanți care trebuie să se ia în considerare, în scopul îmbunătățirii ratelor de supraviețuire. Timpul de expunere a ovocitelor și a embrionilor la crioprotectori poate fi scurtat, dacă aceștia sunt pre-echilibrați într-o soluție de vitrificare care conține o concentrație mai mică de crioprotectori, pentru a evita orice șoc toxic anticipat (Dhali A,și col 2000). Cu toate acestea, nu este încă clar dacă este necesară o pre-expunerea la concentrații mai mici de crioprotectori și dacă da, care este momentul optim pentru o astfel de expunere.

În timpul încălzirii, principalul factor biofizic în perturbarea celulară este un prejudiciu osmotic, care poate apărea în timpul îndepărtării crioprotectorilor penetranți din celulă. Timpul ideal pentru suspendarea ovocitelor în soluție de încălzire este încă incert. În cazul în care timpul este insuficient, pot apărea modificări osmotice, ceea ce este deosebit de important având în vedere că celulele crioconservate sunt mult mai sensibile decât celulele non-congelate (Pedro PB,și col 1997).

1.2.3.2FACTORI CARE INFLUENȚEAZĂ VITRIFICAREA

Ovocita este cea mai mare celulă din corpul majorității speciilor și aproximativ 80% din volumul ei este reprezentat de apă. Când sunt răcite la temperaturi sub 0ºC se formează cristale intracelulară de gheața în funcție de ratele de răcire (Gonzalez N., 1994).

Ovocitele mature conțin un fus de diviziune care obișnuit este blocat în stadiul metafazic al celei de a doua diviziuni meiotice. Fusul de diviziune este constituit din microtubi conectați la cromozomii materni. Microtubii ovocitelor sunt vulnerabili la crioprotectori și la modificările de temperatură, ceea ce poate determina depolimerizarea tubulinei din ovocită. Afectarea fusului meiotic poate modifica proporțiile de cromozomi și prin aceasta să limiteze capacitatea fecundantă a ovocitelor. Afectarea fusului de diviziune poate determina apariția anormaliilor cromozomiale ale embrionilor rezultați. Magistrinisi și Szallosi., 1980 descriu pentru ovocitele de șoarece dezasamblarea și dezagregarea microtubilor din fusul meiotic atunci când ovocitele sunt răcite la temperaturi apropiate de 0OC timp de câteva minute (Ruffing N.A., 1993). Observații ale distrugerilor la ovocitele de vacă au fost realizate de Martino A. și col., 1996a.

Afectarea ovocitelor poate fi datorată expunerii la diferiți crioprotectori. Ledda S. și col. în 2001 demonstrează că expunerea scurtă a ovocitelor la crioprotectorul DMSO determină emergența stelelor microtubulare, iar expunerea prelungită cauzează dezasamblarea fusului și dispersia cromozomilor. Vincent C. și col., 1990 au descoperit că crioprotectorul DMSO afectează microtubii și fusul de diviziune a ovocitelor. Shaw J.M. și Trounson A.O. în 2000, au raportat că propilen glicolul cauzează activarea partogenică a ovocitelor de șoarece. Activarea partogenetică este activarea artificială a ovocitelor apărută în urma creșterii concentrației de Ca2+ care în mod normal vine din partea spermatozoidului. Valul de Ca2+ cauzează eliberarea de granule corticale din ovocite, ceea ce determină reînceperea meiozei și formarea celui de-al doilea globul polar.

Ovocitele pot fi crioconservate atât în metafaza II (MII) ori în stadiul de veziculă germinativă (GV) (Men H. și col., 2001). Ovocitele în stadiul metafază II de dezvoltare trebuie să parcurgă diferite stadii de dezvoltare, incluzând maturarea citoplasmatică și nucleară, extruzia primului globul polar și aranjarea cromozomilor în fusul metafazic (Luna H.S. și col., 2001). Ovocitele mai tinere aflate în stadiul GV se află în interiorul foliculului de Graaf, au cromatina încă în faza de diploten al profazei I, stadiu în care nu au încă fus de diviziune( Groza I. și Morar I., 2004). Ovocitele MII sunt vulnerabile la criodistrucții datorită finului fus de diviziune pe care îl posedă(Groza I.și Muntean M.,2002).Dimpotrivă, ovocitele în stadiu de GV sunt mai puțin susceptibile la crioinjurii, deoarece sunt mai mici, posedă zonă pelucida și granule corticale și se află într-un stadiu incipient de dezvoltare. Aceste ovocite imature au o perioadă mai lungă de recuperare după injurii deoarece trebuie să se matureze „in vitro” înainte de inseminare sau alte manipulări (Shaw J.M. și col, 2000).

Vitrificarea este o metodă nouă care elimină formarea gheții intracelulare și extracelulare, producând „o stare sticloasă (vitroasă)”. La o temperatură suficient de scăzută, soluțiile devin foarte vâscoase și solidificarea apare fără formarea cristalelor de gheață. Acest lucru se realizează prin deshidratare și creșterea vâscozității cauzate de ratele de răcire rapide. Stadiul de tranziție la starea vâscoasă are loc la temperatura de –130ºC (Kasai M. și Mukaida T., 2004), dar variază în funcție de componentele soluției de vitrificare (fig.1.2).

Fig. 1.2 Protocolul de vitrificare (congelarea ultra-rapidă)

(după Kasai M. și Mukaida T., 2004)

Multe variabile care există în procesul de vitrificare pot influența eficacitatea protocolului și potențialul de a îmbunătăți ratele de supraviețuire a celulelor vitrificate: concentrația și tipul crioprotectorului; temperatura soluției de vitrificare la expunere; durata expunerii la crioprotector înainte de plonjarea în LN2; tipul de aparat care este utilizat pentru vitrificare (care influențează mărimea învelișului de vapori sau ratele de răcire); calitatea și stadiul de dezvoltare a celulelor; variabilitatea volumului de soluție crioprotectoare care înconjoară celula; contactul direct al azotului cu soluția de vitrificare care conține materialul biologic; mediul utilizat ca mediu de bază (Pollard J.W. și col., 1996). Așadar beneficiile vitrificării constau din: asigurarea contactului direct ovocită – LN2; cristalizarea apei la congelare; utilizarea concentrațiilor crescute de crioprotector;reducerea timpului de criocongelare (2 – 10 min.); protocoale foarte simple și nu în ultimul rând eliminarea costurilor mari ale echipamentului de congelare ([NUME_REDACTAT] 2004).

1.2.3.3PROTOCOALE UTILIZATE PENTRU VITRIFICAREA OVOCITELOR

Există numeroase tehnici de vitrificare a ovocitelor, dintre care cele mai utilizare sunt: vitrificarea în paiete convenționale; metoda de conservare pe grile de cupru; vitrificarea în paiete deschise; metoda CRYOLOOP; vitrificarea pe suprafață solidă; metoda Hemi-Straw carrier; vitrificarea în paiete închise; metoda CRYOTOP; metoda CRYOTIP (Tucker și Liebermann, 2007).

Vitrificarea în paiete convenționale

Pentru această metodă se utilizeaza paiete tradiționale de 0,25 ml pentru vitrificarea ovocitelor si embrionilor de mamifere (Tucker și Liebermann 2007). În paieta de 0,25 ml, se aspiră 1 cm mediu de vitrificare, apoi 0,5 cm aer, urmat de 2 cm mediu de vitrificare care conține ovocitele, urmat de aspirarea a 0,5 cm aer și 3,5 cm mediu de vitrificare(fig.1.3). Paietele astfel pregătite sunt plonjate direct în azot lichid ([NUME_REDACTAT], 2004).

Fig.1.3 Vitrificarea ovocitelor în paiete convenționale

(după Cetin Y., Bastan A., 2006)

Metoda de conservare pe grile de cupru

Această metodă presupune transferarea ovocitelor pe o grilă de cupru (fig.1.4). Pentru a reduce volumul soluției de vitrificare partea inferioară a glilajului este ștearsă cu un filtru cu membrană. Volumul mic este important pentru a prevenii injuriile ce pot să apară. Grila de cupru cu ovocite este imersată în azot lichid cu ajutorul unui pense, după care este plasată într-un criotub. Criotuburile se depozitează în azot lichid până la decongelare. La decongelare grila este adăugată în soluția de diluare (Tucker și Liebermann 2007).

Figura1.4 – Grilaj de cupru

http://commons.wikimedia.org

Vitrificarea în paiete deschise

Pentru această metodă se utilizează paiete de plastic de 0,25 ml. Paieta se taie la vârful conic. Diametrul interior al paietei are 0,8 mm iar peretele acesteia are 0,07 mm. Se pune paieta într-o picătură cu mediu de vitrificare în care se află ovocitele, iar prin capilaritate paieta se încarcă. Pentru decongelare, vârful paietei este pus în soluția de diluare, iar ovocitele sunt expulzate spontan de către presiunea care se produce la încălzirea paietei (Tucker și Liebermann 2007).

[NUME_REDACTAT]

Cryoloop este un dispozitiv care conține o buclă de neylon (fig.1.5), de 0,5-0,7 mm diametru, care este montată pe o tijă se oțel inoxidabil, care este introdus în capacul unui criotub. Când ovocitele sunt suspendate în soluția de pretratament, Cryoloop este pus în soluția de vitrificare pentru a se forma un strar subțire de soluție pe suprafața ei. Ovocitele sunt puse apoi în soluția de vitrificare și transferate pe stratul de deasupra buclei de nailon. Prin metoda Cryoloop volumul soluției de vitrificare este foarte mic. Cryoloop se pune în azot lichid într-un criotub care în prealabil a fost pus în azot lichid. La decongelare ovocitelor, criotubul se deschide si se ia Cryoloop-ul și se pune direct în soluția de diluare. Ovocitele sunt eliberate imediat din buclă în soluție (Tucker și Liebermann 2007).

Fig.1.5 [NUME_REDACTAT]

www.ming-mei.com

Vitrificarea pe suprafață solidă

Pentru această metodă sunt folosite grupuri de 5-10 ovocite, în micropicături de 1-2 µl, care sunt transferate pe suprafața unei folii de aluminiu, așezată anterior pe un cub de oțel care este răcit la -180ºC, prin imersie parțială în azot lichid. Prin această metodă se evită expunerea la vapori de azot lichid. Picăturile vitrificate sund adăugateîn criotuburi de 1 ml răcite în azot lichid. Pentru decongelare, ovocitele sunt puse într-o soluție de diluare de 39ºC (Tucker și Liebermann 2007).

[NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] această metodă se folosește un volum de 0,3 µl de soluție de vitrificare care conține ovocite care este aspirat în vârful unei paiete. Paieta este plasată apoi în azot lichid, după care paieta cu ovocite este introdusă într-o paietă prerăcită cu diamtru mai mare (Tucker și Liebermann 2007).

Vitrificarea în paiete închise

Metoda presupune încărcarea paietelor cu o seringă cu 2mm mediu de vitrificare, 2mm aer, 2 mm mediu de vitrificare care conține ovocite, 2 mm aer, 2 mm mediu de vitrificare (fig1.6). Paietele astfel pregătite sunt plonjate în azot lichid pentru răcire și stocare. Pentru decongelare paietele sunt scoase din azot lichid, apoi vârful se imersează în soluția de diluare. Conținutul paietei este expulzat datorită creșterii presiunii aerului cauzată de schimbarea termică (Tucker și Liebermann 2007).

Fig1.6 Pregătirea paietelor închise pentru vitrificare

(după Vajda G. și col., 1998)

[NUME_REDACTAT]

Această metodă folosește o bandă de polipropilenă de 0,4 mm lățime, 20mm lungime și 0,1 grosime. Această bandă este atașată la un suport de plastic care este echipat cu un tub de plastic de protecție sigilat la un capăt. Ovocitele sunt încărcate pe bandă cu mediu de conservare, apoi Cryotopul este cufundat în azot lichid. Banda este acoperită cu tubul de plastic în azot lichid pentru protecție în timpul depozitării. La decongelare, se îndepărtează tubul de protecție timp în care Cryotopul este în azot lichid. Banda se scoate și se pune direct în soluția de diluare (Tucker și Liebermann 2007).

[NUME_REDACTAT]

Cryotipul este format dintr-o paietă de plastic cu o parte îngustă, care are următoarele dimensiuni: 250 µm diametrul interior, 20µm grosimea peretelui și 3 cm lumgime,care este conectată la o parte mai largă. Cryotipul este echipat cu un manșon mobil de protecție din metal. Cryotipul se încarcă prin aspirație cu o seringă în partea îngustă cu aproximativ 1µl soluție de vitrificare. Cryotipul este imersat în azot lichid după ce a fost sigilat la ambele capete. Pentru decongelare Cryotipul se scoate din azot lichid și se pune într-o baie de apă la 37ºC timp de 3 secunde, conținutul se adaugă în mediu de cultură (Tucker și Liebermann 2007).

1.2.3.4SUBSTANȚELE CRIOPROTECTOARE

Agenții crioprotectori sunt soluții organice utilizate pentru a proteja organitele intracelulare pe parcursul crioconservării în azot lichid. Sunt substanțe solubile în apă, cu vâscozitate ridicată și cu toxicitate redusă atunci când sunt utilizate la concentrație și la o temperatură adecvată. Permeabilitatea lor este strâns legată de natura chimică și protocolul utilizat pentru crioconservare (Ashwood-Smith, 1987).

După modul lor de acțiune sunt clasificate în:

-crioprotectori permeabili cu greutate moleculară mică (<400 Da): metanol, etilen glicol (EG), 1,2-propandiol (PrOH), dimetil sulfoxid (DMSO), 2,3-butandiol,glicerol și alți alcooli. Acesti substanțe înlocuiesc apa din interiorul celulelor în timpul procesului de deshidratare, minimizând scăderea celulară și formarea cristalelor de gheață intracelular.

-crioprotectori non-permeabili, cu greutate moleculară mică (> 1.000 Da): galactoză, glucoză, zaharoză, trehaloză și alte zaharuri. Aceste substanțe induc deshidratarea celulelor înainte de răcire prin creșterea osmolarității soluției extracelular cu reducerea formării cristalelor de gheață.

-agenti crioprotectori non-permeabili, cu greutate moleculară mare (> 50.000 Da): polivinilpirolidona (PVP), alcool polivinilic, amidon hidroxietil, sodiu hialuronat și alți polimeri, reduc cristalizarea și modifică forma și dimensiunea cristalelor de gheață, în scopul de a le face inofensive.

Efectul protector al agenților crioprotectorilor se produce prin diverse mecanisme: i. prin modificarea mediului intra-și extracelular, ocupând locul apei și scăderea formării de cristale de gheață (Echlin și colab., 1977); ii. prin scăderea punctului de congelare a soluției, care permite o mai bună deshidratare a celulei (Rall și colab., 1978) sau prin efect direct asupra membranei celulelor, care interacționează cu grupurile polare de fosfolipide (Cabrita și colab., 2001).

Agenții crioprotectori sunt esențiali pentru crioconservarea celulelor. Datorită utilizării în concentrațiilor mari ca crioprotectori, aceștia devin toxici, ei reprezentând factorul cheie limitator în criobiologie. De aceea, obiectivul major al oricărui protocol de vitrificare este supresia toxicității fără pierderea eficacității agenților crioprotectori ([NUME_REDACTAT] 2004). Pentru a evita efectul toxic al crioprotectorului, ovocitele sunt echilibrate în soluții cu concentrație scăzută înainte de imersarea în soluția de vitrificare care conține o concentrație crescută de crioprotector. Soluțiile de echilibrare conțin între 10 – 15% crioprotector, iar soluțiile de vitrificare conțin 35 – 40% crioprotector (aproximativ 5.5M). Selectarea concentrației optime de crioprotector este o etapă critică, deoarece el trebuie să aibă o permeabilitate mare (greutate moleculară mică) și toxicitatea redusă (El-Danasouri I., Selman H., 2005).

Capitolul 2

CERCETĂRI PROPRII

2.1 SCOPUL LUCRĂRII

Interesul este cu atât mai mare cu cât metoda își lărgește aria de aplicabilitate în direcția stocării nelimitate în timp a informației genetice a speciilor pe cale de dispariție.

De la primul succes raportat în 1972 de Whittingham și col. pe embrioni de șoarece, tehnicile utilizate pentru crioconservarea prin frig, adaptate pentru embrionii și ovulele multor specii de animale domestice, de laborator, sălbatice și chiar la om, au cunoscut o dezvoltare tot mai intensă. Cronologic succesul pe specii a fost realizat astfel :

vacă : 1973 Wilmut și Rowson;

iepure : 1974 Bank și Maurer;

oaie : 1974 Willadsen și col.;

șobolab : 1975 Whittingham;

capră : 1976 Bietone și Moore;

iapă : 1982 Yamanoto și col.;

antilopă : 1983 Kramer și col.;

om : 1983 Trounson și Mohr.

Congelarea ovocitară oferă o serie de avantaje economice și practice. Unul dintre acestea este legată de asigurarea unui genofond util în biotehnologia producerii și transferului de embrioni valoroși din punct de vedere genetic.

Congelarea embrionilor și ovulelor face posibilă transportarea și transferul acestora pe distanțe mari, reducându-se astfel costurile necesare, iar în cazul animalelor vii evitându-se stresul și diseminarea unor boli infecto-contagioase. Datorită acestui fapt, comerțul internațional al embrionilor bovini congelați a luat o mare amploare, fiind o metodă sigură de control al normelor de sanitație în ceea ce privește controlul bolilor ușor transmisibile.

Consecințele fizico-chimice ale crioconservării sunt legate de înlăturarea apei din citoplasma celulelor, urmată de formarea cristalelor de gheață și de creșterea concentrației substanțelor solubile. Aceste procese sunt influențate de tipul mediului de congelare, osmolaritate, pH și de rata de coborâre a temperaturii.

Pe timpul congelării, distrugerea masei ovulare este cauzată de formarea cristalelor de gheață în interiorul celulelor, de concentrația ionică și de interacțiunea dintre acești doi factori fizici.

În scopul prevenirii acestor fenomene, sunt utilizate substanțe crioprotectoare, care asigură menținerea viabilității celulelor în timpul proceselor de congelare și decongelare datorită rolului lor în schimbarea mărimii și a formei cristalelor de gheață.

Tehnicile de congelare/decongelare a ovulelor au evoluat în direcția simplificării etapelor de lucru, reușindu-se să se dezvolte metode rapide, ușor de utilizat în producție.

Avantajele crioconservării ovulelor sunt considerabile și vor asigura un impact substanțial asupra industriei creșterii animalelor, asemănătoare celor obținute prin intermediul crioconservării materialului seminal. Trebuie menționat de asemenea rolul crioconservării la specia felină în conservarea și menejmentul resurselor genetice ale unor specii pe cale de dispariție, în ingineria genetică și transferul nuclear. Procedura are potențialul de a deveni o tehnică importantă pentru conservarea gameților femelelor a căror fertilitate este compromisă de tratamente medicamentoase. Toate rezultatele obținute pe modelul felin, pot fii extrapolate atât în medicina veterinară cât și în cea umană.

În consens cu orientările prezentate în literatura de specialitate, cercetările prezentei lucrări au vizat utilizarea și adaptarea unor protocoale de conservare prin vitrificare pentru ovocitele de pisică. Studiul a urmărit aprecierea viabilității ovocitelor de pisică după recoltare, maturarea in vitro a acestora și conservarea prin vitrificare. Efectul protocoalelor vitificării asupra viabilității ovocitelor de pisică după decongelare a fost cuantificat prin încadrarea în clase de calitate, pe baza examenului morfologic și a colorației intravitale cu iodură de propidium și Hoechst 33342.

2.2 MATERIALE ȘI METODĂ DE LUCRU

Material biologic

Cercetările au fost realizate în perioada septembrie 2012 – aprilie 2014 pe un număr de 414 ovocite de pisică, recoltate din 46 ovare provenite de la 23 pisici ovariectomizate în clinica Disciplinei de Reproducție, Obstetrică și Ginecologie, [NUME_REDACTAT].

Recoltarea chirurgicală a ovarelor

Obținerea ovarelor necesare desfășurării cercetărilor s-a realizat chirurgical, prin ovariohisterectomie, una din cele mai frecvente intervenții chirurgicale ce se practică pe aparatul genital al carnivorelor domestice, fiind atât o urgență obstetricală cât și o operație de conveniență, cerută de proprietar, pentru a evita gestațiile ulterioare.

Ca intervenție de urgență, se practică în cazul infecțiilor uterine grave ca piometrul, deșirări, necroze sau destinderi mari ale uterului prin fetuși voluminoși sau intrați în putrefacție. Se mai practică în afecțiuni ovariene importante sau în cazul unor intervenții precoce pe uterul gestant care se pot solda cu hemoragii importante.

Contraindicații:

starea sănătății precară;

vârsta avansată;

boli intercurente cu afectarea stării generale;

starea de estrus sau de gestație (care necesită amânarea intervenției).

Fie că este o intervenție de conveniență sau terapeutică, ovariectomia este o operație delicată datorită particularităților anatomice ale pediculului ovarian, respectiv dimensiunilor reduse ale acestuia și vascularizației abundente, înglobate în țesutul adipos al ligamentului larg. Consecutiv acestei particularități, una din complicațiile ce duc la eșecul terapeutic este hemoragia inițiată la nivelul pediculului ovarian cauzată, în principal de alunecarea suturii sau aplicarea necorespunzătoare a acesteia (neasigurarea unei hemostaze eficiente).

Tehnica operatorie a constat din parcurgerea următorilor timpi:

pregătirea animalul pentru intervenție (tundere, radere), realizarea anesteziei, contenționarea în decubit dorsal și apoi realizarea laparatomiei pe linia albă de la ombilic până spre pubis (fig. 2.1).

Fig.2.1 Pregătirea pentru intervenție și realizarea

laparatomiei pe linia albă (original)

după efectuarea laparatomiei și menținerea deschisă a cavității abdominale, cu ajutorul penselor s-a reperat cornul uterin stâng;

continuarea tracționării cu ajutorul croșetei până la exteriorizarea cornului uterin; prinderea cu amândouă mâinile a cornului astfel exteriorizat;

cu indexul și degetul mijlociu se face o breșă în ligamentul larg la o distanță suficientă de corn, evitând vecinătatea imediată a vaselor colaterale ale uterului;

se deșiră ligamentul larg pe o distanță cât mai mare, plasând indexul și degetul mijlociu al fiecărei mâini în breșă (fig.2.2);

Fig.2.2 Exteriorizarea cornului uterin și a ovarului (original)

pentru a facilita tracțiunea pe vârful cornului, s-a plasat o pensă hemostatică pe ligamentul ovarian (fig.2.3);

Fig.2.3 Fixarea ligamentului ovarian (original)

cu mâna dreaptă s-a ținut sub tensiune ovarul, iar cu indexul mâinii stângi, s-a rupt ligamentul ovarian ( se poate secționa cu foarfeca, când acest lucru nu este posibil cu degetele);

s-a dilacerat țesutul adipos și conjunctiv cu o pensă hemostatică, pentru a reduce pediculul la o dimensiune care să se preteze ligaturii. O atenție deosebită a fost acordatată reperării și protejării vaselor care irigă ovarul, prin plasarea unei pense hemostatice la o distanță suficientă de ovar;

Fig.2.4 Izolarea și hemostaza realizată la

nivelul ovarului (original)

sub prima pensă hemostatică s-a plasat o a doua și apoi s-a prins cu mâna stângă pensa inferioară, iar cu dreapta cea superioară. Prin rotirea pensei de sus cu 90º, a fost răsucit pediculul (fig.2.4);

ovarul a fost detașat prin răsucirea în jurul axei longitudinale a pensei superioare, trăgând concomitent spre operator.

Fig.2.5 Indepărtarea ovarului (original)

O altă tehnică a presupus secționarea pediculului între cele două pense. Pediculul a fost fixat prin ligatură transfixică sub pensa rămasă. S-a urmărit ca ligatura să fie suficient de joasă ca să nu existe riscul de a se desface în momentul ridicării pensei.

Firul a fost trecut la început prin centrul pediculului, apoi a fost dirijat spre partea unde sunt vasele ovariene, iar în final cele două capete au fost aduse în jurul pediculului și înnodate în partea opusă primului nod.

Înaintea ridicării pensei de pe pedicul, vârful acestuia s-a prins într-o pensă anatomică. Dacă ligatura este bine aplicată se lasă să alunece încet bontul în cavitatea abdominală. În caz contrar se aplică o a doua ligatură.

Pentru reperarea cornului drept se ține ovarul stâng în palmă și se trage de cornul uterin stâng spre înapoi. Dacă incizia este suficient de lungă, cornul drept nu întârzie să apară și este tras complet în plagă; se procedează cu cornul drept la fel cum s-a procedat și cu cel stâng; cele două ovare izolate sunt trase împreună cu coarnele uterine spre înapoi, până când apare bifurcația uterului.

Cu ajutorul foarfecii s-a decupat ligamentul larg până când nu a rămas decât o bandă îngustă de-a lungul arterei utero-ovariene.

S-a aplicat o pensă hemostatică curbă pe corpul uterin în apropierea bifurcației. Urmând concavitatea pensei s-a secționat cu bisturiul și s-a îndepărtat ansamblul ovare – coarne uterine – corp uterin.

Separarea se poate face și prin aplicarea unei a doua pense pe corpul uterin și torsiunea ei. Arterele utero – ovariene se ligaturează cu catgut nr. 0 prin metoda transfixică de corpul uterin (fig. 2.6).

Fig.2.6 Ligatura aplicată la nivelul bontului cervical (original)

Această precauție este necesară pentru evitarea hemoragiilor când femela este în alte circumstanțe ce duc la mărirea vascularizației uterului; se închide bontul uterin printr-o ligatură transfixică înnodată la început pe o parte apoi adusă în jurul ansamblului organului pentru a doua ligatură; după strângerea ultimului nod se verifică dacă nu este posibilă o hemoragie și se reintroduce bontul în cavitatea abdominală care se închide conform tehnicii descrise la laparatomie (fig. 2.7).

Fig.2.7 Aspectul bontului cervical (original)

Pregătirea ovarelor și recoltarea ovocitelor

Ovarele au fost plasate după recoltarea chirurgicală într-un termos, în soluție 0,9% clorură de sodiu suplimentată cu 100 µm/ml streptomicină și 100 UI/ml penicilină, la o temperatură de 30 – 33ºC, care să asigure menținerea viabilității ovocitelor până în momentul prelucrării (fig. 2.8).

Această metodă de recoltare se practică cu precădere pentru ovarele colectate de la pisici, cățele și animale de laborator (șoricioaice), datorită dimensiunilor lor mici care fac impracticabile celelalte metode (Groza I. și col., 2006).

Fig. 2.8. Ovare de pisică înainte de recoltarea ovocitelor

Ovarele au fost plasate în plăci Petri care conțin mediu de spălare (PBS), au fost pasate de trei ori în recipiente cu mediu proaspăt și apoi mărunțite cu ajutorul unei foarfece. Au fost identificate și notate formațiunile de pe suprafața ovarelor, manopera realizându-se pentru fiecare pisică și pentru fiecare ovar (fig. 2.9).

Fig.2.9 Aspecte din timpul pregătirii ovarelor pentru

recoltarea ovocitelor

Izolarea COCs (complex ovocit cumulus) din mediul de recoltare s-a realizat prin examinare la stereolupă. Identificarea s-a bazat pe evidențierea structurilor specifice înconjurate de membrana pelucida și implicit de coroana radiată. Odată identificate, ovocitele au fost colectate și adăugate în mediul de maturare (fig. 2.10).

Fig.2.10 Aspectul ovocitelor recoltate la stereolupă

După identificare și izolare, ovocitele au fost supuse examenului morfologic la stereolupă și la microscopul în fază inversată NIKON ECLIPSE Ti-E.

2.3Aprecierea morfologică și măsurătorile morfometrice a ovocitelor

Aprecierea și clasificarea ovocitelor de pisică înainte și după maturare s-a bazat pe examenul morfologic și a măsurătorilor morfocitometrice realizate.

Au fost supuse maturării ovocitele care prezentau următoarele caracteristici morfologice:

diametru mare;

ooplasma integră, pigmentată închis;

membrană pelucidă integră;

celulele cumulus dispus pe cel puțin un strat în jurul ovocitei.

Capacitatea de dezvoltare a ovocitelor include abilitatea acestora de a forma un embrion viabil după parcurgerea procedeului de fertilizare in vitro. Această abilitate este condiționată de maturarea citoplasmatică și nucleară a ovocitei. În condiții naturale, ovocitele prezintă o competență ridicată de dezvoltare, dar in vitro, capacitatea de dezvoltare a ovocitelor scade drastic în ciuda optimizărilor aduse în acest domeniu.

Maturarea ovocitelor s-a realizat prin cultivare timp de 24 ore în două medii: mediul DMEM/F12, suplimentat cu 10% FCS (fetal calf serum) (Gibco), 75µg/ml penicilină și 50µg/ml streptomicină (Sigma) 10µg/ml FSH (Sigma), 10 µg/ml LH (Sigma), și mediul TCM 199 (Sigma) suplimentat cu 10% FCS, 500µl piruvat de Na și 500µl antibiotice (fig. 11, 12). În fiecare placă de cultivare au fost plasate 5-10 ovocite în 100µL mediu, sub ulei mineral steril embriologic testat (Sigma). Cultivarea s-a efectuat la temperatura de 380C, în atmosferă îmbogățită cu 5 % CO2 și umiditate 90%.

Au fost cultivate un total de 312 ovocite, 156 în mediul DMEM/F12 și 156 în mediul TCM 199 .

Fig.2.11 Pregătirea mediilor pentru cultivarea ovocitelor

Fig. 2.12 Aspecte din timpul cultivări „in vitro” a

ovocitelor de pisică

Încadrarea în clase de calitate a ovocitelor s-a realizat după recoltare și maturare prin intermediul stereolupei și a microscopului în fază inversată, în două clase de calitate în funcție de :

expansiunea cumulusului;

mărimea spațiului perivitelin;

integritatea zonei pelucida;

aspectul citoplasmei.

Măsurătorile morfocitometrice efectuate înainte și după maturarea ovocitelor s-au realizat în scopul perfecționării metodelor de clasificare și au vizat stabilirea:

diametrului ovocitei;

grosimeai cumulusului ooforus;

grosimea zonei pelucida;.

Analiza morfometrică s-a realizat cu softul de imagistică NIS – Elements, luându-se în considerare grosimea zonei pelucida (ZP) și a expandării cumulusului după maturare, diametrul ovocitei, apariția și dimensiunea primului globul polar (fig.2.13, 2.14).

Fig. 2.13 Examinarea ovocitelor la microscopul în fază inversată (original)

Fig. 2.14 Analiza morfometrică cu software-ul de imagistică NIS – [NUME_REDACTAT] morfocitometrice efectuate, completate de examenul morfologic, a permis reîncadrarea ovocitelor în clase de calitate în funcție de:

diametrul ovocitei;

dimensiunea cumulusului expandat;

grosimea ZP.

2.4Vitrificarea ovocitelor maturate

Consevarea ovocitelor maturate s-au realizat prin trei protocoale de vitrificare. În protocolul I ovocitele au fost adăugate în mediul de conservare compus din DMEM/F12 suplimentat cu 30%FCS și 60%DMSO (dimetilsulfoxid). Conservarea s-a realizat în paiete convenționale de 250µl.

În paieta s-a aspirat prima dată 1 cm mediu de vitrificare, apoi 0,5 cm aer, urmat de 2 cm mediu de vitrificare împreună cu ovocite (5 ovocite/paietă), terminându-se cu aspirarea a 0,5 cm aer și 3,5 cm mediu de vitrificare (fig.2.15). Paietele încărcate au fost menținute în vapori de azot timp de 20 minute după care au fost plonjate în azotul lichid.

Fig. 2.15 Protocolul de vitrificare în paiete convenționale

Fig. 2.16 Protocolul II de vitrificare a ovocitelor

Pentru protocolul III de vitrificare, ovocitele au fost menținute 30 minute pentru echilibrare în mediul TCM 199 suplimentat cu 10% FCS.

După echilibrare ovocitele au fost adăugate în mediu cu concentrații diferite de EG:

EG 2% suplimentat cu sucroză 0.5M – 5 minute

EG 5% -5 minute,

2 minute în EG 10%

1 minut în EG 20% suplimentat cu sucroză 0.5M, după care ovocitele au fost aspirate împreună cu acest mediu în paiete de 250 µl și au fost plonjate în azot lichid (fig. 2.17, 2.18).

Fig. 2.17 Protocolul III de vitrificare a ovocitelor

Fig. 2.18 Aspecte din timpul vitrificării paietelor

2.5Decongelarea paietelor după vitrificare

Protocolul decongelării (încălzirii) paietelor a constat din:

extragerea paietei din cisterna containerului de depozitare;

menținerea paietei în aer timp de 5 secunde;

plonjarea paietei în apă caldă la 37˚ C, timp de 10 secunde;

conținutul paietei se trece într-un recipient pregătit cu sucroză 0,5 mol/l (fig. 2.19).

Fig. 2.19 Decongelarea paietelor în baie marină

2.6Aprecierea viabilității ovocitelor ovocitelor după decongelare

Una din cele mai importante etape ale transferului embrionar și ale fecundației in vitro a ovocitelor o reprezintă evaluarea viabilității înainte și după maturare. Metodele de apreciere pot fi simple, non invazive, altele fiind mai complexe.

Aprecierea viabilității ovocitelor de pisică după maturare și după protocoalele de vitrificare s-au realizat cu iodură de propidium (PI) și Hoechst 33342. În acest scop ovocitele au fost incubate cu un amestec de 10µg/ml PI și 10µg/ml Hoechst timp de 10 minute la temperatura camerei. După colorare, ovocitele au fost spălate în mediu PBS și apoi examinate la microscopul cu epifluorescență (Nikon).

Ovocitele colorate (cu distrucții la nivel membranar) în roșu pozitive pentru PI au fost considerate neviabile în momentul colorării iar cele fluorescente (PI negative) au fost considerate ca fiind viabile.

2.7Analiza statistică

Analiza globală a datelor colectate s-a realizat cu programul statistic Origin 7. Rezultatele au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic când valoarea a fost p ≤0.05.

Capitolul 3

3.1REZULTATE ȘI DISCUȚII

Au fost ovariohisterectomizate pentru recoltarea chirurgicală a ovocitelor un număr de 23 pisici având vârsta cuprinsă între 9 luni și 3 ani, de rase diferite (tab.3.1).

Tabel 3.1 – Evidența pisicile ovariohisterectomizate

De la cele 23 de pisici, au fost recoltate 46 (n=46) ovare. Metoda recoltării prin mărunțirea ovarelor a permis recoltarea unui număr de 414 (n=414) ovocite, media per ovar fiind de 9 ovocite.

În funcție de caracterele morfologice identificate cu ajutorul stereolupei, ovocitele de pisică recoltate au fost clasificate în două clase de calitate:

ovocite cultivabile care prezentau cumulus compact în jurul ovocitei, multistratificat (cel puțin două – trei straturi), citoplasmă omogenă, ușor granulată, membrană pelucida intactă, fără distrucții sau rupturi, precum și spațiu perivitelin uniform;

ovocite necultivabile care prezentau denudări parțiale sau totale, citoplasmă heterogenă, deformată, puternic granulată, zona pelucida ruptă și spațiu perivitelin neuniform, care nu s-au supus cultivării pentru maturare datorită capacității scăzute de a parcurge acest eveniment deosebit menit să le pregătească pentru fertilizarea in vitro.

Din totalul de 414 ovocite recoltale, 291 (n=291), (70,30%) au fost incluse în categoria ovocitelor cultivabile, restul de 123 (n=123), (29,70%), fiind considerate nepretabile pentru cultivare.

În urma examinării la microscopul inversat cele 414 (n=414) ovocite recoltate, au fost reclasificate în patru categorii de calitate pe baza caracteristicilor morfologice:

ovocite de tipul I – 174 (n=174), (42,02%) ovocite (grafic nr.1), care au prezentat cumulus compact în jurul ovocitei, multistratificat (mai mult de 4 straturi de celule), citoplasmă omogenă, ușor granulată, membrană pelucida intactă, fără distrucții sau rupturi, precum și spațiu perivitelin uniform (fig.3.1 );

ovocite de tipul II – 138 (n=138), (33,30%) ovocite (grafic nr. 1), care au prezentat cumulus compact în jurul ovocitei, multistratificat (mai puțin de 4 straturi de celule), citoplasmă omogenă, ușor granulată, membrană pelucida intactă, fără distrucții sau rupturi, precum și spațiu perivitelin uniform (fig.3.2);

ovocite de tipul III – 69 (n=69), (16,60%) ovocite (grafic nr. 1), care prezentau celulele cumulusului în stadiu de expansiune, acoperite de o substanță gelatinoasă, citoplasmă heterogenă, granulată periferic (fig. 3.3);

ovocite de tipul IV – 33 (n=33), (7,97%) ovocite (grafic nr. 1), care prezentau denudări parțiale sau totale, citoplasmă heterogenă, deformată, puternic granulată, zona pelucida ruptă și spațiul perivitelin neuniform (fig.3.3).

Din totalul de 414 (n=414) ovocite recoltale, 312 (n=312) (75,36%) au fost incluse în categoriile de calitate I și II, restul de 102 (n=102) (24,63%), calitate III și IV fiind considerate nepretabile pentru cultivare (grafic nr. 2).

Fig.3.1 Ovocite încadrate în clasa I de calitate (original)

Fig.3.2 Ovocite încadrate în clasa a II –a de calitate (original)

Fig.3.3 Aspectul ovocitelor încadrate în clasele III și IV

de calitate (original)

Distribuția ovocitelor pe categorii de calitate este reprezentată în graficul 3.1.

Grafic 3.1 Distribuția ovocitelor pe categorii de calitate

după examenul la microscopul inversat

Grafic 3.2 Rezultatele comparative a clasificării ovocitelor în ceea

ce privește pretabilitatea pentru maturare (MFI microscop în fază inversată, S stereolupă)

Doar ovocitele aparținând categoriilor I și II au fost utilizate pentru maturarea in vitro datorită capacității acestora de a traversa această etapă importantă reprezentată de redistribuirea organitelor, migrarea mitocondriilor și a granulelor corticale. Ovocitele încadrate în categoriile III și IV au fost excluse din experiment.

Comparând rezultatele obținute prin cele două metode de apreciere, observăm că metoda microscopiei în fază inversată oferă posibilități mai exacte de apreciere, între cele două metode existând diferențe de 5,07% în ceea ce privește numărul ovocitelor cultivabile.

Analiza morfocitometrică a ovocitelor înainte de cultivare a permis stabilirea diametrului ovocitei, a coroanei radiate și a membranei pelucida. Măsurătorile realizate au reprezentat o metodă de verificare a clasificării pe categorii de calitate, în funcție de caracteristicile morfologice stabilite la microscopul inversat. Valorile medii a acestor măsurători sunt prezentate în tabelul 3.2.

Tabel 3.2 Morfocitometria ovocitelor înainte de cultivare

Aspectul și valorile măsurătorilor ovocitelor din clasele I și II de calitate, sunt prezentate în figurile 3.4, 3.5, 3.6.

Fig.3.4 Ovocite din clasa I de calitate (original)

Fig.3.5 Ovocite din clasa I de calitate (original)

Fig.3.6 Ovocită din clasa II de calitate (original)

Parametrii morfometrici a ovocitelor după recoltare, încadrate în clasa cultivabile au prezentat următoarele valori:

diametrul ovocitei a fost în medie de 75.7 µm ± 1.2;

grosimea ZP a fost în medie de 8.25 µm ±0.6;

grosimea coroanei radiată a fost în medie de 17,56 µm±0.8.

3.1.1Cultivarea in vitro a ovocitelor

Cultivarea in vitro a ovocitelor de pisică s-a efectuat timp de 24 ore în două medii de cultură suplimentate în mod original, având drept scop finalizarea maturării lor.

Ovocitele de pisică recoltate din clasa cultivabile, respectiv clasele de calitate I și II, au fost supuse protocolului de maturare in vitro pe termen mediu (24 de ore) la o temperatură de 38,5OC, ulterior efectuându-se un examen morfologic la stereolupă și microscopul invers pentru stabilirea gradului de maturare (fig.3.7).

Fig.3.7 Aspectul microscopic al ovocitelor în

timpul cultivării (original)

3.1.2Aprecierea morfologică a ovocitelor după maturare

Aprecierea morfologică realizată la stereomicroscop a permis încadrarea ovocitelor în două categorii de calitate: ovocite mature (celulele cumulus expandate, citoplasma omogenă sau ușor granulată, spațiul perivitelin uniform, ZP integră) și ovocite degenerate (pierderi totale sau parțiale de celule cumulus, citoplasma puternic granulată, vacuolizată, spațiu perivitelin neuniform, ZP ruptă), (fig.3.8).

Fig. 3.8 Aprecierea morfologică a ovocitelor maturate

În urma aprecierii gradului de maturare a ovocitelor prin examen morfologic putem să afirmăm faptul că din totalul de 156 ovocite cultivate în mediul DMEM/F12, 127 (n=127) (82%) au prezentat semnele maturării, restul de 29 (n=29) (18,50%) suferind procese de degenerare sau stagnare a dezvoltării (grafic nr. 3). În cazul utilizării pentru maturarea a mediului TCM 199, 112 (n=112) (71,70%) au prezentat semnele maturării, restul de 44 (n=44) (28,3%) suferind procese de degenerare sau stagnare a dezvoltării (grafic 3.3).

Rezultatele obținute demonstrează superioritatea mediului DMEM/F12 suplimentat în susținerea procesului maturării, între cele două medii existând diferențe de 10,30%, în ceea ce privește ovocitele mature.

Grafic 3.3 Rezultatele maturării in vitro a ovocitelor

în funcție de examenul morfologic

Morfocitometria ovocitelor realizată la microscopul inversat a ovocitelor după cultivare a permis stabilirea gradului de maturare în funcție de diametrului ovocitei, grosimea coroanei radiate și a membranei pelucida.

La reevaluarea gradului de maturare prin realizarea morfocitometriei ovocitelor cultivate au fost obținute următoarele rezultate:

în mediul DMEM/F12 suplimentat din 156 (n=156) ovocite cultivate, 135 (n=135) (86,60%) au prezentat semnele maturării, restul de 21 (n=21) (13,40%) suferind procese de degenerare sau stagnare a dezvoltării (grafic nr. 4).

în mediul TCM 199 suplimentat c din cele 156 (n=156) ovocite cultivate, 118 (n=118) (75,60%) au prezentat semnele maturării, restul de 38 (n=38) (24,40%) suferind procese de degenerare sau stagnare a dezvoltării (grafic 3.4).

Grafic 3.4 Rezultatele aprecierii gradului de maturare a ovocitelor

prin examen morfocitometric

Valoriile medii ale măsurătorilor realizate pe ovocitele mature sunt prezentate în tabelul 3.3.

Tabel 3.3 Valorile medii obținute prin morfocitometrie după

maturarea in vitro a ovocitelor

Făcând o trecere în revistă a rezultatelor obținute, din totalul de 312 ovocite cultivate în cele două medii, examenul morfologic a permis evidențierea maturării la un număr de 239 (n=239) (76,60%), (127 în mediul DMEM/F12, 112 în mediul TCM 199). Restul de 73 (23,40%) ovocite (29 respectiv 44), prezentând semne de degenerare sau stagnare a dezvoltării (grafic3.5).

Reevaluarea procesului maturării prin intermediul morfocitometriei a permis stabilirea mai exactă a procesului astfel încât din totalul de 312 ovocite cultivate în cele două medii de cultură, 253 (n=253) (81,10%), (135 respectiv 118), au fost considerate mature, restul de 59 (18,90%) (21 respectiv 38), prezentând semne de degenerare sau stagnare a dezvoltării (grafic 3.5).

Grafic 3.5 Rezultatele comparative ale maturării ovocitelor între

examenul morfologic și cel morfocitometric

La măsurătorile realizate, s-au constatat creșteri în special a diametrului ovocitei și a coroanei radiate. Diametrul ovocitelor mature a crescut de la 75,7 µm cât a fost media înainte de cultivare la 141,6 µm. În ceea ce privește coroana radiată creșterile au fost de la 17,6 µm la 252,3 µm. Membrana pelucida a prezentat și ea creșteri însă ne-a interesat mai mult integritatea morfologică și lipsa unor leziuni care să influențeze rezistența ovocitei.

Aspectul ovocitelor maturate, măsurate cu ajutorul softul de la microscopul Nikon sunt prezentate în fig.3.9.

Fig.3.9 Aspectul microscopic a măsurătorilor ovocitelor maturate in vitro

Ovocitele degenerate sau cu stagnări în dezvoltare, prezentau modificări de formă, retractarea citoplasmei, mărirea spațiului perivitelin, afectarea pelucidei și pierderea coroanei radiate (fig.3.10).

Fig.3.10 Ovocite degenerate după cultivarea in vitro (original)

Comparând rezultatele obținute în ceea ce privește aprecierea gradului de maturare prin cele două metode, se constată diferențe după cum urmează:

pentru mediul DMEM/F12 între cele două metode de apreciere au existat diferențe de 8 ovocite;

pentru mediul TCM 199, între cele două metode de apreciere au existat diferențe de 6 ovocite.

Verificarea veridicității metodei de apreciere prin morfocitometrie a fost testată prin intermediul colorării cu PI și Hoechst. În paralel, au fost realizate verificări ale gradului de viabilitate și din categoria ovocitelor considerate degenerate sau cu retard în dezvoltare.

Rezultatele evaluării vibilității sunt prezentate în tabelul.3. 4.

Tabel 3.4 Rezultatele colorării intravitale a ovocitelor cu PI și Hoechst 33342

Din cele 14 ovocite colorate din categoria mature și viabile, 12 ovocite nu s-au colorat iar 2 au prezentat o colorație ștearsă, ceea ce a demonstrat exactitatea aprecierii realizate prin morfocitometrie (fig. nr. 30).

Analiza globală a rezultatelor indică că mediul DMEM/F12 suplimentat poate fi utilizat cu succes in protocolalele de maturare a ovocitelor. Diferențele dintre cele două medii de maturare (DMEM/F12, 50.16%±11.9, TCM 199, 14.83%±5.6) sunt semnificative din punct de vedere statistic p=0.002 (p≤0.05), ( grafic3.6).

Grafic 3.6 Analiza globală a rezultatelor vitrificării

Grafic3.7 Evaluarea celor trei protocoale de vitrificare

Fig.3.11 Aspectul ovocitelor viabile după colorarea PI si Hoechst 33342

Cele 14 ovocite colorate din categoria celor degenerate sau cu întârziere în dezvoltare sau colorat în proporție de 100%, ceea ce a certificat lipsa maturării (fig.3.12).

Fig.3.12 Aspectul ovocitelor neviabile după colorarea PI si Hoechst 33342

Capitolul 4

CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

În urma cercetărilor efectuate s-au desprins următoarele concluzii:

sterilizarea chirurgicală de conveniență a pisicilor reprezintă o sursă ieftină de ovocite necesare cercetărilor din domeniul biotehnologiilor aplicative realizate în scop medical și experimental;

recoltarea ovocitelor din ovarele animalelor ovariohisterectomizate, s-a realizat prin metoda mărunțirii, manoperă care oferă posibilitatea asigurării unui număr considerabil de ovocite (din 46 ovare, 414 ovocite, media fiind de 9 ovocite/ovar);

aprecierea morfologică la stereolupă a ovocitelor după recoltare, permite stabilirea pretabilității pentru cultivare pe seama formei, aspectului citoplasmei, integrității mambranei pelucida și a coroanei radiate;

completarea examenului morfologic realizat la stereolupă cu cel microscopic (microscopul inversat) a permis reîncadrarea ovocitelor pretabile pentru cultivare în categorii de calitate, ceea ce conferă procesului exactitate și șansă mai mare de reușită (din 414 ovocite recoltate, 312 cultivabile; 102 degenerate);

maturarea ovocitelor recoltate a fost asigurată prin cultivarea în două medii de cultură cunoscute dar suplimentate în mod original. Aceste medii au fost reprezentate de SOF modificat (DMEM/F12), suplimentat cu 10µg/ml FSH, 10 µg/ml LH, antibiotice și mediul TCM199 suplimentat cu 10%FCS, 500µl piruvat de Na și 500µl antibiotice. Parametrii cultivaționali respectați au fost: temperatura de 380C, în atmosferă de 5 % CO2, 5% O2 și 90% N2;

din totalul de 156 ovocite cultivate în mediul DMEM/F12 suplimentat cu 10% FCS, 1%AA, 10µg/ml FSH, 10 µg/ml LH, antibiotice, 127 (82%) au prezentat semnele maturării, restul de 29 (18,5%) suferind procese de degenerare sau stagnare a dezvoltării;

din cele 156 ovocite cultivate în mediul TCM 199 suplimentat cu 10%FCS, 500µl piruvat de Na și 500µl antibiotice, 112 (71,7%) au prezentat semnele maturării, restul de 44 (28,3%) suferind procese de degenerare sau stagnare a dezvoltării;

morfocitometria ovocitelor realizată la microscopul în fază inversată a ovocitelor după cultivare a permis stabilirea gradului de maturare în funcție de diametrului ovocitei, grosimea coroanei radiate și a membranei pelucida;

examenul morfologic a permis evidențierea maturării la un număr de 239 (76,6%), (127 în mediul DMEM/F12, 112 în mediul TCM 199), restul de 73 (23,3%) ovocite (29 respectiv 44), prezentând semne de degenerare sau stagnare a dezvoltării;

reevaluarea procesului maturării prin intermediul morfocitometriei a permis stabilirea mai exactă a procesului astfel încât din totalul de 312 ovocite cultivate în cele două medii de cultură, 253 (81,08%), (135 respectiv 118), au fost considerate mature, restul de 59 (18,9%) (21 respectiv 38), prezentând semne de degenerare sau stagnare a dezvoltării;

măsurătorile morfocitometrice a ovocitelor mature au consemnat creșteri în special a diametrului ovocitei și a coroanei radiate. Diametrul ovocitelor mature a crescut de la 75,7 µm cât a fost media înainte de cultivare la 141,6 µm pentru cele mature.

În ceea ce privește coroana radiată creșterile au fost de la 17,6 µm la 252,3 µm. Membrana pelucida a prezentat și ea creșteri însă ne-a interesat mai mult integritatea morfologică și lipsa unor leziuni care să influențeze rezistența ovocitei;

RECOMANDĂRI

În urma cercetărilor efectuate recomandăm:

utilizarea ovarelor provenite de la animalele ovariohisterectomizate ca sursă de ovocite necesare realizării biotehnologiilor aplicative;

recoltarea ovocitelor de pisica prin metoda mărunțirii ovarelor;

vor fi selectate pentru cultivare ovocitele care prezintă următoarele caracteristici morfologice și morfometrice:

citoplasmă omogenă, ușor granulată;

spațiul perivitelin uniform;

cumulus compact;

membrană pelucidă intactă;

diametrul mediu de 75,7 µm;

grosimea medie a membranei pelucida de 8,25 µm;

grosimea medie a coroanei radiate de 17,6 µm.

în urma rezultatelor obținute, recomandăm utilizarea mediului DMEM/F12 pentru cultivarea in vitro a ovocitelor deoarece, acesta asigură microclimatul necesar dezvoltării și diviziunii celulare;

încadrarea în categoria ovocitelor mature presupune menținere caracteristicilor morfologice și încadrarea în următoarele valori morfometrice:

diametrul mediu de 141,3 µm;

grosimea medie membranei pelucida de 10,4 µm;

grosimea medie a coroanei radiate de 252,3 µm.

pentru conservarea ovocitelor de pisică recomandăm protocolul III de vitrificare care presupune punerea în contact a ovocitelor mature cu concentrații succesive de etilenglicol.