Antocianii

Drept

Antocianii

Byadmin ianuarie 1, 2024

CUPRINS

Introducere

Antociani

Definiția antocianilor

Clasificarea antocianilor

Surse de antociani

Funcțiile antocianilor

Stabilitatea antocianilor

Influența pH-ului

Efectul temperaturii

Efectul de copigmentare

Proteine din zer

Definiția proteinelor din zer

Caracterizarea principalelor proteine din zer

Rolul nutritiv și biologic al proteinelor din lapte

Proprietățile nutriționale și funcționale ale proteinelor din zer

Noțiuni teoretice privind microîncapsularea

Definiția încapsulării

Metode de microîncapsulare

Beneficiile microcapsulelor

Calitatea microcapsulelor

Modelare moleculară

Aspecte metodologice

Determinarea acidității fructelor congelate

Determinarea pH-ului

Uscare fructelor

Metode de extracție a antocianilor

Tratamentul izotermic al extractelor

Metode spectrofotometrice

Determinarea conținutului de antociani

Determinarea conținutului de polifenoli

Determinare conținut total de flavonoide

Metode spectrofluorimetrice

Evalurea proprietăților conformaționale a extractelor din fructe, a proteinei și a complexului proteină-antociani;

Evaluarea proprietăților structurale a extractelor din fructe, a proteinei și a complexului proteină-antociani;

INTRODUCERE

Antocianii reprezintă una dintre cele mai răspândite clase de pigmenți naturali din regnul vegetali care conferă o mare diversitate de culori, atingând practic toate spectrele vizibile, de la portocaliu și roșu la nuanțe de violet și albastru (Harborne și al., 1988).

Antocianii prezintă foarte multe efecte benefice pentru sănătate, motiv pentru care încorporarea lor în industria alimentară și a băuturilor reprezentă un interes major. Punerea în aplicare a unor metode mai bune de extracție și identificare va avea în viitorul apropiat un impact asupra costului acestor coloranți și a standardelor lor; precum și crearea de noi instrumente pentru autentificarea produselor alimentare și descoperirea falsurilor sofisticate.

Compușii polifenolici prezintă un interes major de cercetare datorită efectelor lor benefice asupra sănătății, în special în tratamentul și prevenirea cancerului (Chen și al., 2011;. Weng și Yen, 2012), a bolilor cardiovasculare (Kuriyama și al., 2006; Mursu și al., 2008), prezintă efecte benefice: anticarcinogenice (Jeong și al., 2011; Ogunleye și al., 2009), antiulceroase (Zakaria și al., 2011), antitrombotice (Han și al., 2012; Tao și al., 2012), anti-inflamatoare (Beara și al., 2012; Zimmer și al., 2012), antialergenice (Chung și Champagne, 2009; Schmitz-Eiberger și Blanke, 2012), anticoagulante (Bijak și al., 2011), imunomodulatoare (Schütz și al., 2010), antimicrobiane (Silva și al., 2012; Xia și al., 2011), vasodilatatoare și activități de analgezice (Santoz și al., 2010). Este foarte bine cunoscut așa numitul “paradox francez” potrivit căruia mortalitatea din cauza bolilor cardiovasculare este mult mai mică decât cea atribuită proporției de acizi grași saturați din dieta zilnică a francezilor, acest lucru fiind pus pe seama consumului cu regularitate a vinului roșu, bogat în antociani și alte flavonoide.

Studiul interacțiunii proteinelor din zer (β-LG) cu antociani (polifenoli) reprezintă o temă de actualitate datorită faptului că populația tinde din ce în ce mai mult spre produse nutriționale și funcționale care să asigure efecte benefice pentru sănătate, iar antocianii au stabilitate scăzută.

Interacțiunile compușilor fenolici cu proteinele poate duce la modificări ale proprietăților fizico-chimice ale proteinelor, cum ar fi solubilitatea, stabilitate termică, și digestibilitate (Labuckas și al., 2008; Rawel și al., 2001). Din punct de vedere nutrițional, proprietățile proteinelor pot fi afectate și de modificările aminoacizilor esențiali, precum și de inhibarea proteazelor (Kroll și al., 2003). Pe de altă parte, interacțiunile cu alți compuși, inclusiv lipide (Smith, 2012), proteine (Hsu și al., 2007; Thangudu și al., 2012), vitamine
(Relkin, 2012) pot determina schimbări acestor compuși. Polifenolii pot interacționa cu proteinele atât reversibil și ireversibil, aspect important pentru obținerea de produse noi funcționale.

CONSIDERAȚII TEORETICE

Antociani

Definiția antocianilor

Antocianii sunt compuși bioactivi prezenți în multe fructe și legume. Antocianii sunt responsabili pentru gama largă de culori prezente în natură si sunt un sub-grup în cadrul flavanoidelor caracterizate de un schelet C6-C3-C6. Antocianii conferă culoarea caracteristică fructelor și legumelor, având un rol important asupra calității deoarece influențează acceptarea senzorială a consumatorilor.

Cuvântul „antocian” provine din limba greacă anthos care înseamnă floare și kyanos care înseamnă albastru închis, fiind utilizat pentru prima dată în anul 1835 de către Marquart pentru a denumi pigmentul din florile de albăstrele, Centaurea cyanus. Din punct de vedere chimic, antocianii sunt flavonoide (flavan), în consecință sunt bazați pe un schelet C15 cu un inel croman care prezintă un inel secundar B aromatic în poziție 2(C6-C3-C6) și una sau mai multe molecule de zahăr legate la diferite poziții hidroxilați din structura de bază. Antocianii sunt glicozide de săruri de fenil-2-benzopirilium (antocianidine) (Counsell și al., 1979; Takano și al., 1997).

Majoritatea antocianilor sunt mono-, di- sau triglicozide ale grupării hidroxil din poziția 3 a antocianidinelor. Dintre fructele cultivate, cea mai importantă sursă de antociani o reprezintă strugurii, aparținând genului Vitis, speciei Vitis vinifera, din familia Vitaceae. Alte familii de plante a căror fructe sunt bogate în antociani aparțin genului Fragraria (căpșuni) și Rubus (zmeură), Vaccinium (afine, merișoare) și Ribes (coacăze negre).

Andersen și Jordheim indicau în anul 2006 existența unui număr de aproximativ 600 de compuși antocianici, a căror structură a fost complet elucidată, însă din care doar șase sunt întâlniți frecvenți în plantele superioare.

In ultimii ani, interesul științific pentru îmbunătățirea tehnicilor de separare și identificare a antocianilor din surse vegetale a crescut semnificativ, datorită potențialelor utilizări ca și coloranți naturali, în special în industria alimentară, unde reprezintă o alternativă netoxică a coloranților sintetici. Pe lângă proprietățile lor tinctoriale, antocianii prezintă o activitate biologică semnificativă, având, în special, remarcabile proprietăți antioxidante, ce joacă un rol vital în prevenirea bolilor neuronale, cardiovasculare, a unor anumite tipuri de cancer, a diabetului (Lule și Xia, 2005; Konczak și Zhang, 2004; Kong și al., 2003).

Clasificarea antocianilor

Structura de bază a antocianilor este C6-C3-C6 și reprezintă sursa unei infinități de culori produse de ei în combinație chimică cu glicozide și / sau grupuri acil și prin interacțiunea cu alte molecule sau în condiții diferite (Brouillard și al., 1993).

Harborne și Gryer (1988) au menționat existența a 17 antocianidine, cu diferențe în numărul și poziția grupărilor hidroxil și / sau a grupărilor metil-eterice, dar șase dintre ele sunt cele mai comune antocianidine de acest gen de pigmenți. De la aceste 17 structuri au apărut combinații cu cel puțin o moleculă de zahăr pentru a obține compuși de antociani. Astfel, antocianii au fost clasificați în acord cu numărul de molecule de zahăr care constituie moleculele lor. Având în vedere diversitatea de zahăr și toate punctele structurale de glicozilare posibile, numărul de compuși este probabil mult mai mare. Ordinea de apariție a zahărului în antocianii naturali este: glucoza, ramnoza, xiloza, galactoza, arabinoza și fructoza. De asemenea, multe antocianine au arătat în structurile lor ester și legături între zaharuri și acizi organici (antociani acilați). În natură cele mai comune grupări acil sunt: cumaric, cafeic, ferulic, p-hidroxi benzoic, sinapic, malonic, acid acetic, succinic, oxalic și malic (Francis, 1989).

Substituția de grupări hidroxil și metoxil influențează culoarea antocianilor. Creșterea numărului de grupări hidroxil au tendința de a aprofunda culoarea la o nuanță mai albăstruie. Pe de altă parte, creșterea numărului de grupări metoxil crește roșeața..

Din punct de vedere structural, antocianii reprezintă una dintre cele douăsprezece clase principale de flavonoide. Antocianii sunt glicozide ale antocianidinelor, agliconi la baza cărora se află cationul flaviliu, format dintr-un nucleu benzopirilic și un inel fenolic (Konczak și Zhang, 2004). Toate antocianidinele conțin grupări hidroxilice: de regulă în pozițile 3, 5, 7 pe nucleul benzopirilic, respectiv în pozițiile 3’, 4’, 5’ pe cel fenolic (Figura 1).

Figura1. Structura generală a antocianilor (Castaneda-Ovando și al., 2009)

Tabelul 1. Identificarea structurală a antocianinelor (agliconi) (Castaneda-Ovando și al., 2009)

NR*- nu s-a raportat

Aproximativ 90% din numărul total de antociani conțin ca și aglicon una dintre cele mai răspândite antocianidine, a căror denumiri provin de la speciile vegetale în care agliconii respectivi s-au izolat și identificat pentru prima dată: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, petunidina și malvidina, a căror structură diferă prin poziția grupărilor hidroxil și metoxi pe nucleul flavanic (Clifford, 2000).

Figura 2. Structura principalelor antocianidine prezente în antociani

Dintre cele șase antocianidine majoritare în plantele superioare, cianidina este cea mai răspândită, cele mai rar întâlnite fiind malvidina și petunidina (Kong și al., 2003).

Surse de antociani

Antocianii sunt responsabili pentru varietatea de culori atractive, de la stacojiu la albastru din flori, fructe, frunze și organele de depozitare (Harborne, 1988; Harborne și Grayer, 1988).

De exemplu cyanidin se găsește în mere, cireșe, smochine, piersici, iar delfinidina se găsește în vinete și rodie; unele fructe au doi antociani principali, cum ar fi cireșele și afinele (cyanidin și peonidin), iar strugurii au mai mulți antociani. În general, concentrația de antociani în cele mai multe fructe și legume ajunge de la 0,1 până la 1% din cantitatea de substanță uscată (Swain și al., 1962).

O sursă importantă de antociani este și Prunus Spinosa. Acesta este un arbust sălbatic ce face parte din familia rozaceelor (Rosaceae). Acest arbust poate ajunge la 5 metri înălțime, are scoarța negricioasă și ramurile dense, rigide și spinoase. Frunzele sunt ovale cu marginea zimțată, cu dimensiuni între 2 și 4.5 cm (în lungime) și 1,2-2 cm (în lățime). Florile au cinci petale de culoare alb-crem și sunt produse la începutul primăverii, cu putin timp înaintea frunzelor. Fructul este numit „porumbe” și este o drupă de aproximativ 10-12 cm (în diametru) ce are culoarea violet albastru. Acestea ajung la maturare toamna, fiind recoltate după ce cade bruma. Au un gust puternic astingent atunci când sunt proaspete.

Prunus spinosa poate fi folosit ca plantă medicinală, având în vedere conținutul ridicat de antociani, pentru diverse afecțiuni, cum ar fi: afecțiuni renale, gută, diaree, tulburări de creștere, tuse convulsivă, anorexie, deficit imunitar.

Funcțiile antocianilor

Antocianii sunt benzopiran derivați la fel ca flavonoidele. Din acest motiv antocianii prezintă funcții similare în plante cu cele ale flavonoidelor: antioxidante, de fotoprotecție, mecanism de apărare, precum și alte funcții ecologice (fenomenul de simbioza). Antocianii sunt cei mai importanți compuși de pigmentare dintre flavonoide și prezintă un rol important în multe mecanisme de reproducere a plantelor, cum ar fi polenizarea, împrăștierea semințelor și antifeedant. In plus, antocianii pot fi folosiți ca markeri taxonomici (Swain și al., 1962; Harborne și al., 1988; Harborne, 1988).

Stabilitatea antocianilor

Antocianii izolați prezintă instabilitate ridicată și sunt foarte susceptibili la procesele de degradare (Hernandez-Herrero și al., 2011).

Antocianii au o structură moleculară mică hidrofilă care prezintă stabilitate mare în mediul lor natural, iar după extracție în mediu foarte acid la tunci când sunt proaspete.

Prunus spinosa poate fi folosit ca plantă medicinală, având în vedere conținutul ridicat de antociani, pentru diverse afecțiuni, cum ar fi: afecțiuni renale, gută, diaree, tulburări de creștere, tuse convulsivă, anorexie, deficit imunitar.

Funcțiile antocianilor

Antocianii sunt benzopiran derivați la fel ca flavonoidele. Din acest motiv antocianii prezintă funcții similare în plante cu cele ale flavonoidelor: antioxidante, de fotoprotecție, mecanism de apărare, precum și alte funcții ecologice (fenomenul de simbioza). Antocianii sunt cei mai importanți compuși de pigmentare dintre flavonoide și prezintă un rol important în multe mecanisme de reproducere a plantelor, cum ar fi polenizarea, împrăștierea semințelor și antifeedant. In plus, antocianii pot fi folosiți ca markeri taxonomici (Swain și al., 1962; Harborne și al., 1988; Harborne, 1988).

Stabilitatea antocianilor

Antocianii izolați prezintă instabilitate ridicată și sunt foarte susceptibili la procesele de degradare (Hernandez-Herrero și al., 2011).

Antocianii au o structură moleculară mică hidrofilă care prezintă stabilitate mare în mediul lor natural, iar după extracție în mediu foarte acid la valori ale pH-ului mai mic de 3. Degradarea rapidă la pH ridicat limitează utilizarea lor ca aditiv alimentar (Cabrita, 2000). În plus, după digestie biodisponibilitatea este mai scăzută și recuperarea după digestie indică o rezistență scăzută a antocianilor față de condițiile de mediu din tractul gastro-intestinal uman (Clifford, 2000).

Principalii factori care afectează stabilitatea antocianilor sunt: structura chimică, concentrația, temperatura, pH-ul, lumina, prezența oxigenului, natura solventului, prezența unor enzime, flavonoide, proteine sau ioni metalici (Iacobucci și al., 1983; Francis, 1989; Cabrita, 1999).

Interesant e faptul că antocianii se pot găsi sub mai multe forme chimice în funcție de pH-ul soluției în care se află. Asfel la pH 1 se evidențiază cationul flaviliu și contribuie la culorile purpuriu și roșu, la valori ale pH-ului între 2-4 sunt predominate speciile chinoidale albastre, iar în intervalul de pH=5-6 se identifică două specii incolore: pseudobaza carbinolică și calcona. În soluții apoase cu pH mai mare de 7, antocianii se degradează în funcție de grupele substituente.

Având în vedere investigațiile privind stabilitatea antocianilor și variația de culoare la diferite pH-uri se poate afirma că modificările de culoare ale acestor compuși sunt mai semnificative în regiunea alcalină, datorită instabilității lor (Cabrita și al., 2000).

Pentru a evidenția dependența de pH a antocianilor, în figura 3 sunt redate principalele forme chimice ale antocianilor, unde R1= H sau o zaharidă, R2 și R3= H sau metal.

Figura 3. Formele chimice ale antocianilor dependente de pH

Prezența adițională a grupărilor hidroxil sau metoxil precum și substituenții inelului B influențează stabilitatea antocianidinelor. Monoglicozidele și diglicozidele sunt mai stabile la pH neutru decât agliconii (Fleschhut și al., 2006). Acest fenomen poate fi explicat prin faptul că molecula de zahăr împiedică degradarea intermediarilor instabili în acizii fenolici și aldehide.

Numeroase studii referitoare la antocianii acilați izolați din surse naturale, cum ar fi varza roșie sau ridichea roșie, au evidențiat faptul că aceștia prezintă o stabilitate mai mare la schimbările de pH, la tratamentul termic și la expunerea la lumină. Acest lucru facilitează utilizarea lor în soluții cu pH mai ridicat (4,2-4,5), de exemplu pentru produsele lactate cum ar fi: iaurtul, smântâna fermentată și brânză.

Creșterea temperaturii duce la o degradare mai rapidă a antocianilor, având în vedere că acești pigmenți sunt foarte termo sensibili. Această influență negativă a temperaturii asupra stabilității antocianilor a fost observată de mulți cercetători.

Durata de încălzire și temperatura au o influență majoră asupra stabilității antocianilor. Într-un studiu, Sadilova, Stintzing și Carle (2006) au observat că antocianii din soc au fost foarte sensibile la tratamentul termic. După 3 ore de încălzire la 950C, doar 50% din pigmenți din soc au rămas intacți. Foarte multe studii au raportat faptul că o creștere aritmetică a temperaturii determină o distrugere logaritmică a antocianilor (Drdak și Daucik 1990; Rhim, 2002).

Temperaturile ridicate (opărire la 950C/3 min în combinație cu pasteurizarea), implicate în prelucrarea afinelor în piureuri, induc pierderi de aproximativ 43% din totalul antocianilor monomerici prezenți în fructele proaspete. Acest lucru sugerează că factorii labili de căldură poate accelera distrugerea antocianilor și sprijină ferm ipoteza că enzimele endogene din fructe provoacă distrugerea pigmentilor în prelucrare sucului (Brownmiller și al., 2008). De asemenea, Patras, Brunton și Butler (2009) au demonstrat că antocianii (cyanindin-3-glucozida și pelargonidin-3-glucozidă) din mure și piure de căpșuni au fost afectați în mod semnificativ de tratamentul termic la 700C timp 2 minute.

Antocianii pot fi degradați și enzimatic în prezența polifenoloxidazei. Această enzimă poate fi inactivată prin încălzire ușoară, motiv pentru care, unii autori susțin că opărirea la 500C poate avea un impact pozitiv asupra reținerii antocianilor (Skrede și al., 2000). De asemenea, Rossi și colab. (2003) au sugerat că efectuarea unei etape suplimentare, cum ar fi opărirea, în prelucrarea sucurilor poate avea un impact pozitiv atunci când se evaluează efectele produselor din fructe asupra sănătății, deoarece opărirea inactivează polifenoloxidaza.

Pacheco-Palencia, Hawken și Talcott (2007) au cercetat stabilitatea antocianilor în ansamblu și au observat o rată de degradare de 3,5 ori mai mare, atunci când probele au fost depozitate la 200C, decât atunci când acestea au fost depozitate la 40C. Ersus și Yurdagel (2007) au studiat stabilitatea microcapsulei de antociani din morcovi negri și au observat o pierdere de 33% după 64 zile de depozitare la 250C, în timp ce la 40 C pierderea a fost de 11%.

Stabilitatea antocianilor se poate îmbunătăți cu ajutorul unor reacții complexe de copigmentare intra- și intermoleculare, fenomene de agregare, adăugarea unor săruri anorganice sau prin complexare cu metale.

Degradarea rapidă a antocianilor la temperaturi ridicate poate fi influențată de prezența zaharurilor și a proteinelor care poate duce la reacția Maillard în timpul procesării alimentelor la temperaturi ridicate. Conform Von Elbe și Schwartz (1996), prezența zaharurilor sau a produșilor rezultați din degradarea lor poate accelera degradarea antocianilor. Compușii rezultați din zaharuri de la reacția Maillard (furfurol, hidroximetilfurfuralul) condensează cu antocianii, rezultând astfel compuși cu colorație maro. Această reacție este dependentă atât de temperatură cât și de prezența oxigenului. Umiditatea joacă un rol important în degradarea antocianilor sub formă de pulbere. Astfel, cu cât conținutul de apă este mai mare, cu atât mobilitatea moleculară este mai mare și se facilitează reacțiile fizico-chimice de degradare.

Efectul copigmentării

Copigmentarea poate fi definită ca un fenomen complex, în care pigmenții și diverși compuși organici fără culoare (ioni metalici) formează asocieri moleculare generând o schimbare sau o creștere a intensității culorii. În industria alimentară, copigmentarea este considerată o interacțiune foarte importantă, având în vedere că pentru acceptarea unui produs culoarea este un factor decisiv.

Antocianii reacționează și cu alcaloizi, aminoacizi, acizi benzoici, cumarină, acizi cinamic și cu o mare varietate de alți compuși flaviliu. Această asociere slabă este numită copigmentare intermoleculară. Copigmentarea intramoleculară se datorează acilării în moleculă și este mult mai eficientă decât copigmentarea intermoleculară; în antocianii acilați se sugerează că grupările acil interacționează cu structura de bază a antocianilor, evitând formarea speciilor hidratate. Rolul de bază al copigmenților este de a proteja cationul flavilium de atacul nucleofil al moleculei de apă. Alte fenomene importante, care arată o mare contribuție la culoarea antocianilor, iar în unele modele au fost sugerate de contribuția complexelor metalice (Saito, N. și al., 1995; Baublis și al., 1995).

Numeroase studii de cercetare evidențiază faptul că fenomenul de copigmentare a antocianilor cu alți compuși reprezintă principalul mecanism de stabilizare a culorii în plante. Copigmenții reprezintă sisteme bogate în electroni π, fiind astfel capabili să se asocieze cu ioni flaviliu, care sunt săraci în electroni.

Copigmenții sunt în general fără culoare, dar când interacționează cu o soluție de antociani are loc un efect hipercromic și o deplasare batocromică în spectrul de absorbție (regiunea UV-Vis). Copigmenții pot fi: flavonoizi, alcaloizi, acizi organici, aminoacizi, nucleotide, polizaharide, metale sau alți antociani.

Definiția proteinelor din zer

Datorită calităților nutriționale și a proprietăților funcționale, laptele a început să fie studiat cu mai bine de 50 ani în urmă. Laptele conține ≈3,5% proteine, dintre care ≈80% sunt proteine din cazeină și 20% fac parte din proteinele zerului. Termenul de proteinele zerului este atribuit acelor proteine care râmăn în faza apoasă a laptelui după precipitarea cazeinei la pH 4,6 și temperatura de 200C și separarea acesteia.

Caracterizarea generală a principalelor proteine din zer

Zerul conține 6 fracțiuni proteice: α-lactalbumina (α-LA), β-lactoglobulină (β-LG), glicomacropeptide, proteazo-peptone 3, imunoglobuline (Ig) și serum albumină. Toate aceste fracțiuni reprezintă ≈85% din proteinele zerului (Korhonen și Philanto, 2007).

În cele ce urmează sunt caracterizate din punct de vedere structural următoarele fracțiuni: β-lactoglobulina, α-lactalbumina, serum albumina bovină, imunoglobulina și lactoferina.

β-lactoglobulina

β-lactoglobulina (β-LG) reprezintă proteina majoritară din zer, găsindu-se în laptele de vacă în concentrație de 2-4 g/l (De la Fuente, 2002). Proprietățile structurale și fizico-chimice ale β-LG sunt foarte bine definite, însă aceste proprietăți continuă să prezinte interes în actualele cercetări, având în vedere faptul că proprietățile acestei proteine au fost revizuite în timp (Tilley, 1960, Hambling și McAlpine, 1992).

Compoziția proteinei în aminoacizi, secvența polipeptidică și punctul izoelectric au pus în evidență existența unui polimorfism genetic. Au fost identificate aprox. 10 variante genetice ale β-LG bovine, dintre care 7 au fost izolate și caracterizate, primind denumirea de variantele genetice A, B, C, D, E, F și G; cele mai răspândite fiind variantele A și B (Tabel. 1.1.). Toate variantele genetice ale β-LG conțin 162 resturi de aminoacizi, diferența apărând în una sau trei poziții.

Tabel 1.2. Proprietățile moleculare și fizico-chimice ale variantelor genetice β-LG (după Eigel și al. 1984)

Variantele genetice A și B diferă doar în două poziții, iar substituția restului de Gly cu Asp în proporția 4 a variantei genetice A, prezintă o importanță deosebită, deoarece mărește capacitatea de autoasociere a variantei genetice A comparativ cu varianta B. Acest fenomen se poate explica prin faptul că se formează o punte de sare suplimentară între gruparea carboxilică a restului de Asp și oricare grupare bazică.

Structura primară a β-LG

Secvența de aminoacizi a monomerului de β-LG și poziția resturilor substituită în variantele genetice a fost determinată de Braunitzer și al. (1973). Comparând secvența de aminoacizi a variantelor genetice, Godovac-Zimmermann și al. (1988) au constatat că toate variantele genetice au în comun 33 aminoacizi, ceea ce indică faptul că aceste resturi au rol semnificativ pentru structura și conformația proteinei.

Deși β-LG conține un număr ridicat de aminoacizi esențiali, biodisponibilitatea acestora este redusă, datorită rezistenței la proteoliză în domeniul acid al pH-ului (Reddy și al., 1988).

Compoziția în aminoacizi a proteinei de referință este: Asp10, Asn5, Thr8, Ser7, Glu16, Gln9, Pro8, Gly4, Ala15, Cys5, Val9, Met4, Ile10, Leu22, Tyr4, Phe4, Lys15, His2, Trp2 și Arg3, cu o masă moleculară calculată la 18 277 Da.

Structura secundară a β-LG

Creamer și al. (1983) afirmă că molecula de β-LG este structurată astfel: 15% α-helix, 50% β-foaie pliată și aprox. 15-20% structuri neordonate.

Monaco și al. (1987) au descris forma sferică a moleculei ca având un diametru de 2,5Ǻ, fiind alcătuită dintr-o porțiune scurtă de α-helix și 8 lanțuri polipeptidice antiparalele cu structură β-foaie pliată. Sawyer și al. (1985) a denumit cele 8 lanțuri polipeptidice antiparalele de la A la H și sunt prezentate de resturile 15-27 (A), 35-44 (B), 49-56 (C), 65-74 (D), 82-85(E), 91-97(F), 102-111(G) și 116-124 (H). Fragmentul 131-140 are structură α-helix, iar fragmentele 28-31, 45-48, 61-64, 98-101 și 112-115 prezintă structuri inversate β-foaie pliată, în timp ce segmentele 74-82 și 125-130 se prezintă sub formă de inele cu structură nu foarte bine definită.

Elasticitatea structurii proteice poate fi corelată cu funcționalitatea proteinei, motiv pentru care susceptibilitatea la proteoliză este folosită ca indicator al flexibilității proteice, deoarece o modificare parțială a moleculei conduce în general la creșterea vitezei de hidroliză (Kato și al.,1985).

Structura proteică este semnificativ influențată de condițiile de mediu. Modificarea pH-ului, a tăriei ionice, temperaturii sau prezența/absența stabilizatorilor influențează conformația proteică, modificându-se astfel funcționalitatea proteinei.

α-lactalbumina

α-lactalbumina (α-LA) este o proteină mică, cu masa moleculară de 14 174 Da, pH-ul izoelectric este cuprins între 4,0-6,0. Această proteină este capabilă să lege ionii de calciu, cu implicații deosebit de importante. În primul rând, α-LA îndeplinește o funcție importantă în celulele secretorii mamare, fiind una dintre cele două componente ale lactoz-sintetazei, enzima ce catalizează etapa finală de biositeză a lactozei. Celălalt component al acestui complex este β-1,4-galactoziltransferaza, care mediază transferul grupărilor galactozil din UDP-galactoză în glicoproteinelor ce conțin N-acetilglucozamină. În glandele mamare, specificitatea galactoziltransferazei este determinată de interacțiunea cu α-LA. Reacția de sinteză a lactozei are loc în aparatul Golgi din celulele epiteliale mamare și necesită prezența ionilor de Mn2+.

În al doilea rând α-LA posedă un singur loc de legare a ionilor Ca2+, fiind utilizată ca sistem model pentru studiul efectelor de legare ale ionilor de calciu la proteine, peptide, membrane și compuși cu masa moleculară redusă care au de cele mai multe ori semnificații fiziologice.

În al treilea rând α-LA poate forma o serie de stări intermediare parțial depliate, fiind utilizată drept model clasic pentru moleculele topite (molten) pentru elucidarea mecanismelor proteice de pliere/depliere.

Laptele de vacă conține aproximativ 1,2-1,5 g/L, α-LA reprezentând 20% din totalul proteinelor serice.

Structura primară, secundară și terțiară a α-LA

Structura primară a proteinei conține 123 resturi de aminoacizi, cu două variante genetice majore (A și B). Varianta genetică B este prezentă în laptele provenit de la specia Bos taurus, iar varianta A în laptele speciei Bos indicus. Varianta genetica A conține un rest Glu în poziția 10, în timp ce în varianta B acest rest este substituit de Arg.

A fost identificată și a treia variantă genetică (C) în laptele provenit de la specia Bos javanicus, însă nu a fost confirmată. Se presupune că această variantă diferă de varianta B prin substituția Asp cu Asn sau a Glu cu Gln în poziția 10.

Structura primară a α-LA este alcătuită din următorii aminoacizi: Ala3, Arg1, Asn8, Asp13, Cys8, Gln8, Glu7, Gly6, His3, Ile8, Leu13, Lys12, Met1, Phe4, Pro2, Ser7, Thr7, Trp4, Tyr4, Val6 și o masă moleculară de 14 178 Da.

α-LA are un conținut ridicat de aminoacizi esențiali (Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Thr, Met, Cys, Lys și Val), reprezentând 63,2% din conținutul total de aminoacizi ai proteinei și 51,4% din totalul aminoacizilor esențiali ai proteinelor de lapte.

Astfel compoziția în aminoacizi și faptul că este similară în proporție de 72% cu α-LA din laptele uman explică rolul deosebit de important al acestei proteine în alimentația copiilor. O fracțiune minoră din lapte este glicozilată la restul de Asn. În forma nativă, α-LA nu este fosforilată.

În lapte concentrația de α-LA scade spre sfârșitul lactației, în contrast cu celelalte proteine din zer a căror concentrație crește cu lactația. Acest aspect a fost corelat cu scăderea concentrației de lactoză spre sfârșitul lactației. Concentrațiile scăzute de α-LA se înregistrează și în cazul infecțiilor mamare. Proteina are o structură similară în proporție de 62,6% cu a lizozimului și aceeași secvență de aminoacizi în proporție de 35,8%. α-LA este o metalo-proteină, având capacitatea de a lega ionii de calciu, zinc și alte metale. Legarea calciului este necesară pentru formarea punților disulfurice în starea nativă (Stănciuc, 2009).

Imunoglobulinele

Imunoglobulinele (Ig) sunt reprezentate de o serie de glicoproteine care au capacitatea de a lega alte molecule cu un grad ridicat de specificitate. Reprezintă cca. 1,9-3,3 din totalul proteinelor din lapte și cca. 6% din proteinele zerului, provenind din sânge. Sunt cunoscute următoarele clase distincte: Ig A, E, M și G cu variantele G1 și G2. Aceste proteine sunt heterogene din punct de vedere al mărimii, sarcinii electrice și funcției.

Ig din laptele de vacă sunt identice cu cele din laptele uman. Se prezintă sub formă de polimeri sau protomeri ai unei unități de bază sub forma literei Y, formată din patru lanțuri polipeptidice legate prin punți disulfurice intra- sau intermoleculare.

Monomerii sunt alcătuiți din două lanțuri grele identice (notate cu H) cu o masă moleculară cuprinsă între 55 și 76 kDa, în funcție de clasă și două lanțuri ușoare identice (notate cu L) cu masa moleculară cuprinsă între 22,5 și 27,3 kDa. Lanțurile H sunt alcătuite dintr-o regiune constantă (C) alcătuită din 3-4domenii formate din cca. 110 resturi de aminoacizi și o regiune N-terminală variabilă (V).

Lanțurile L sunt alcătuite dintr-un domeniu C-terminal constant și o regiune N-terminală variabilă.

Domeniile V ale lanțurilor H și L converg pentru a forma locurile de legare a antigenilor. Deoarece fiecare unitate monomerică este alcătuită din două lanțuri H și două L, fiecare monomer este bivalent. Domeniile V teremină specificitatea moleculelor de Ig, în timp ce domeniile C stabilesc clasele, respectiv A, M, G1 și G2 precum și implicațiile biologice. Fiecare domeniu al Ig, incusiv regiunile V sunt pliate astfel încât structurile β-foaie pliată se leagă între ele prin intermediul unui segment flexibil. În cazul domeniilor V, aceste segmente flexibile converg la capetele N-terminale pentru a forma situsuri de formare a antigenilor.

Ig M, E și A sunt mult mai rezistente la proteoliză deși ultima e sensibilă la așa numitele Ig-proteaze. Deși Ig sunt alcătuite din 4 lanțuri polipeptidice, atât Ig M cât și Ig A pot forma polimeri (pentameri și respectiv dimeri) prin intermediul unui lanț polipeptidic cu masa moleculară de 15 kDa, cunoscut sub denumirea de lanțul de joncțiune (J). Lanțul J are un rol deosebit de important în legarea specifică a polimerilor și transportul lor de-a lungul celulelor epiteliale.

Monomerii de Ig au o masă moleculară de 160 000 Da. Lanțurile H au o regiune constantă formată din 310-500 resturi de aminoacizi și o regiune variabilă cu 107-115 resturi de aminoacizi. Lanțurile L prezintă o regiune constantă formată din 107-110 resturi și o regiune variabilă cu 107-115 returi de aminoacizi.

Fracțiune Ig G1 predomină în laptele de vacă și colostru. Prezintă un pHi 5,5 și 6,8, cu un caracter acid și un pHi mai mic decât Ig G2 care prezintă un punct izoelectric între 7,5-8,3.

Cele două variante G sunt diferite în ceea ce privește compoziția în aminoacizi.

Apariția în concentrație mai mare a clasei Ig G1 în laptele de vacă sugerează un mecanism de transport preferențial, neelucidat încă.

Zerul conține concentrații egale de imunoglobulină G1 și G2, însă acest rapot se modifică în colostru și lapte. În cazul infecțiilor și/sau inflamațiilor, concentrația tututor proteinelor din zer crește (Stănciuc, 2009).

Lactoferina

Lactoferina (LF) provine din glanda mamară, regăsindu-se în laptele provenit de la toate speciile, din secrețiile altor celule epiteliale și leucocite polimorfonucleare. Proteina de origine mamară se găsește în lapte în concentrație de 20-200 μg/L, concentrație care crește în cazul infecțiilor sau inflamațiilor.

LF este alcătuită dintr-un singur lanț polipeptidic cu diferite grade de glicozilare. Lanțul este alcătuit din 689 resturi de aminoacizi și anume: Ala67, Arg37, Asn29, Asp36, Cys34, Gln29, Glu40, Gly49, His10, Ile16, Leu66, Lys54, Met4, Phe27, Pro30, Ser45, Thr36, Trp13, Tyr21 și Val46, cu o masă moleculară calculată de 76 110 Da și 17 punți disulfurice. Masa moleculară diferă în funcție de gradul de glicozilare.

Rolul principal al LF este acela de a proteja organismele împotriva infecțiilor și a inflamațiilor. LF joacă un rol important în bacteriostază, datorită capacității de a lega ionii de fier, îndepărtând astfel din mediu elementele nutriționale esențiale pentru bacterii.

O serie de studii au evidențiat funcții ale LF care implică sau nu ionii de fier. Una dintre acestea este activitatea antibacteriană determinată de capacitatea apoLF de a se lega de membrana bacteriilor Gram (-), fapt care determină eliberarea rapidă a lipopolizaharidelor și creșterea permeabilității membranei. De asemenea, LF prezintă activitate antivirală, activând asupra ADN-ARN-virusurilor.

Din punct de vedere tehnologic LF are rol multifuncțional. Deși se găsește într-o concentrație mică în lapte, este izolată și putificată la scară industrială din zerul rezultat de la fabricarea brânzeturilor, în special în Europa și Japonia. Este foarte stabilă la pasteurizare, astfel încât își menține structura și funcțiile.

Este utilizată ca atare sau sub formă hidrolizate proteice ca nutraceutice în formulele pentru copii, suplimentele alimentare și hrana animalelor. De asemenea, se utilizează în industria cosmeticelor datorită activității antioxidante. Un alt rol important este dat de lactofercină, un polipeptid alcătuit din 15 resturi de aminoacizi rezultat din hidroliza LF cu pepsină și care prezintă activitate antimicrobiană individuală (Stănciuc, 2009).

Proteinele din zer sunt o sursă importantă de peptide bioactive care exercită diferite funcții precum: antihipertensive, antilipemice, antimicrobiale, antioxidative, opiacee și imunomodulatoare (Pihlanto, 2011).

Rolul nutritiv și biologic al proteinelor din lapte

Alimentația constituie una dintre cele mai importante necesități fiziologice ale omului deoarece:

are rol plastic, asigurând dezvoltarea și continua renovare a celulelor și țesuturilor;

furnizează energia necesară organismului uman în repaos și efort;

constituie sursă de substanțe biologic active cu caracter indispensabil (aminoacizi esențiali, vitamine, săruri minerale, acizi grași polinesaturați etc) (Costin și Segal, 1999).

Laptele și produsele lactate sunt produse indispensabile unei alimentații echilibrate, acoperind aproximativ 30% din necesarul de proteine și lipide și 80% din necesarul de calciu în dietă (Borda, 2007).

Digestibilitatea proteinelor din lapte este aproximativ 100%, cu o valoare mai mică pentru produsele tratate termic. Valoarea PER pentru cazeină este de aproximativ 2,5, pentru proteinele din zer 3,0, iar pentru proteinele totale 3,3. Valoarea PER este mai mare în cazul proteinelor totale deoacere cazeinele și proteinele din zer sunt complementare în ceea ce privește concentrația în aminoacizi esențiali: cazeinele sunt bogate în Tyr și Phe, iar proteinele din zer în Cys și Met.

Rolul principal al proteinelor este acela de a furniza aminoacizii esențiali precum: Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp și Val, iar pentru nou-născuți și His.

În timpul digestiei, proteinele laptelui și în special cazeina are un rol important în asimilarea multor elemente din alimente cum sunt vitamina A, calciul și fierul. Distribuția aminoacizilor în proteinele din lapte este prezentată în tabelul 1.2. (Expósito și Recio, 2006).

Tabel 1.3. Conținutul în aminoacizi a proteinelor din laptele de vacă (g/100 g proteină)

În tabelul 1.4. este prezentată distribuția aminoacizilor în lapte, doza recomandată pentru adulți precum și aportul de aminoacizi la consumul zilnic.

Aceste substanțe diferă din punct de vedere chimic și acționează adițional sau sinergetic. De exemplu, unii acizi grași sau peptide devin active numai după eliberarea lor în timpul digestiei gastrointestinale (Expósito și Recio, 2006).

Tabel 1.4. Distribuția aminoacizilor în lapte, dozele zilnice recomandate și aportul de aminoacizi la consumul zilnic

Proprietățile nutriționale și funcționale ale proteinelor din zer

Proprietățile nutriționale

Zerul conține componente care furnizează elemente nutritive importante, cum ar fi: protecție imunologică și substanțe bioactive (Warner și al., 2001). Proteinele din zer pot fi folosite ca și supliment de proteine simple, precum și ca ingrediente sănătoase în industria alimentară. Proteinele din zer oferă funcții benefice de promovare a sănătății și de prevenire a bolilor.

Proteinele din alimente sunt hidrolizate în stomac și intestin până la aminoacizi care intră în circuitul sanguin și sunt distribuiți în organism pentru sinteza de novo a proteinelor specifice. Simultan, proteinele endogene uzate sunt hidrolizate la aminoacizi, care împreună cu cei din alimente formează fondul metabolic comun de aminoacizi.

Proteinele prezintă o serie de caracteristici nutriționale, după cum urmează:

Digestibilitate aparentă și digestibilitate reală

Digestibilitatea este sinonimă cu biodisponibilitatea proteinelor alimentare la atacul enzimelor digestive. Prin fierbere și prăjire, proteinele devin mai ușor atacate de enzime datorită scindării lanțurilor.

Valoarea biologică arată cât din azotul proteinei ingerate a fost folosit de organism pentru funcții biologice. Aceasta depinde de aminoacizii esențiali limitanzi.

Coeficientul de utilizare netă a proteinelor reprezintă fracția din azotul proteinelor ingerate utilizat de organism pentru refacerea propriilor proteine.

Raportul eficienței proteice reprezintă raportul dintre creșterea în greutate înregistrată în dietă controlată și masa de proteină alimentară ingerată.

În afara acestor indicatori se mai folosește concentrația plasmatică de aminoacizi, constanta balanței de aminoacizi în diverse condiții de testare și altele (Florea, 2008).

Proprietățile funcționale

În știința alimentelor, principalele proprietăți fizice ale proteinelor au fost încadrate ca proprietăți funcționale pentru că ele definesc contribuția acestora, alături de ceilalți constituenți, la realizarea unor caracteristici particulare ale alimentelor.

Proprietățile funcționale reflectă relațiile dintre structura chimică și efectele produse sub acțiunea unor variabile sau parametri: temperatură, forțe mecanice, pH, tărie ionică, polaritatea și hidrofobicitatea mediului și componentelor de contact etc.

Investigații ample au fost efectuate pe proprietățile funcționale ale proteinelor din zer, cum ar fi: capacitatea de gelifiere, spumare, emulsionare și stabilizare (Burrington, 1998; DeWit, 1998; Huffman, 1996; Szczesniak, 1998). Înțelegerea și controlul proprietăților funcționale reprezintă cheia pentru utilizarea proteinelor din zer.

Serum albumina bovină (SAB) a primit puțină atenție în ceea ce privește rolul său în proprietățile funcționale ale concentratelor de proteine din zer. SAB este una dintre proteinele cu profiluri bune de aminoacizi esențiali. Acizii grași liberi, lipidele și compușii de aromă pot fi ușor absorbiți de SAB (Kinsella și Whitehead, 1989).

Structura proteică depinde de o serie de parametri hidrofobi și electrostatici care au o importanță deosebită atunci când se evaluează proprietățile biologice și funcționale, care conferă produselor alimentare textura și forma caracteristică (Haskard și Li-Chan, 1998).

Datorită structurii macromoleculare a proteinelor, hidrofobicitatea de suprafață (H0) sau hidrofobicitatea efectivă sunt parametrii esențiali care afectează structura proteinelor și interacțiunile acestora cu alte molecule (Nakai, 1983). Hidrofobicitatea influențează interacțiunile intermoleculare cum ar fi asocierea liganzilor sau a altor macromolecule, precum și interacțiunile proteină-proteină și proteine-lipide.

Denaturarea, indiferent de metoda prin care este indusă, determină o modificare a distribuției grupărilor funcționale în molecula proteică. Din acest punct de vedere, hidrofobicitatea de suprafață reprezintă un instrument valoros care poate fi utilizat în studiul modificărilor conformaționale, pe baza căruia pot fi efectuate corelații pe de o parte cu intensitatea tratamentului termic și pe de altă parte cu implicațiile corespunzătoare asupra proprietăților funcționale (Stănciuc, 2009).

Interacțiunea polifenolilor cu proteinele din zer

Interacțiunile necovalente dintre polifenoli și proteinele globulare poate duce la complexarea (Chaudhuri și al., 2011; Li și al., 2010), stabilizarea structurii proteinelor (Kanakis și al., 2011), desfășurarea și precipitarea proteinelor (Ma și al., 2011; Papadopoulou și Frazier, 2004; Siebert și al., 1996). Puterea de interacțiune depinde, în mare măsură, de dimensiunea polifenolilor, structura polifenolilor și aminoacidul din secvența proteinei (Frazier și al., 2010).

Structura secundară a proteinei poate fi modificată semnificativ atunci când molecule mici se leaga de o proteina nativă (Ascenzi și Fasano, 2010). Pentru interacțiuni polifenoli-proteină, natura proteinei dirijază dacă schimbările structurale vor avea loc sau nu (Poncet-Legrad și al., 2007).

Complexarea polifenolilor cu proteinele pot afecta activitatea antioxidantă a polifenolilor prin afectarea capacității lor de donare a electronilor și reducerea numărului de grupe hidroxil disponibile în soluție (Arts și al, 2002;. Niseteo și al., 2012). Cu toate acestea, datorită vieții prelungite a polifenolilor în complexe, efectul de complexare poate fi benefic pentru întreaga activitate antioxidantă a polifenolilor.

O corelație pozitivă a fost, de asemenea, găsită între gradul de oligomerizare a polifenolilor și inhibarea elastazei, având în vedere numărul mare de grupe de proteine cu care interacționează (Bra' și al., 2010). In plus, complexul proteina-polifenoli poate reduce legarea IgE de alergeni din cauza precipitării ireversibile a alergenilor (Chung și Champagne, 2009; Chung și Reed, 2012).

Atât studiile in vitro, in vivo cât și cele epidemiologice au sugerat că polifenolii alimentari induc efecte benefice asupra sănătății și pot previni bolile cardiovasculare și cancerul (Lambert și Elias, 2010; Yang și al., 2009). Aceste efecte se datorează în principal proprietăților antioxidante și antiinflamatoare (Tachibana, 2009; Wu și al., 2009). Inhibarea enzimelor digestive implicate în metabolismul proteinelor, lipidelor și glucidelor cu polifenolii alimentari pot fi un alt mecanism important pentru beneficiile pentru sanatate atribuite unei alimentatii bogate în fructe și legume (Hanhineva și al, 2010; McDougall și al., 2008).

Definiția încapsulării

Încapsularea este un proces complex prin intermediul căruia se realizează înglobarea și izolarea unor substanțe solide, lichide sau gazoase în spații închise, bine definite, asigurându-se în acest mod o eliberare a acestora în anumite condiții. Peretele care protejază substanța activă de factorii externi și spațiul în care se află substanța activă definesc o unitate structurală numită capsulă.

Capsule pot fi clasificate în funcție de dimensiunea lor în nanocapsule (sunt mai mici de 1 μm), microcapsule (au dimensiuni cuprinse între 1 μm-1000 μm) și macrocapsule (sunt mai mari de 1000 μm).

Microîncapsularea reprezintă o tehnică prin care un compus bioactiv este încapsulat de un biopolimer, protejându-se astfel compusul bioactiv de oxigen, apă, lumină sau de alți factori care ar putea afecta stabilitatea. Această tehnică îmbunătățește stabilitatea, facilitează manipularea compușilor (Gharsallaoui și al., 2007) și se face astfel economie de spațiu.

Tehnici de microîncapsulare

În literatura de specialitate, metodele de obținere a microcapsulelor sunt clasificate după mai multe criterii, astfel unii autori clasifică metodele în funcție de tipul de capsule obținute în mononucleare, multinucleare, matriciale (Vilstrup, 2004) , alți autori după procesle care stau la baza metodei: chimice, fizico-chimice și mecanice (Kamishny și Magdassi, 2006), iar alții îmbină cele două criterii, evidențiind corelația între metodă și tipul de capsule obținute (Thies, 1996; Arshadi, 1999).

În general, pentru obținerea unui tip de microcapsule se folosesc două sau mai multe metode, în funcție de caracteristicile componentelor care sunt încapsulate, astfel pentru microîncapsularea unor componente în stare lichidă mai întâi se realizează emulsionarea urmată de gelifiere, pulverizare și altele.

Poncelet (2007) susține că procesul de încapsulare cuprinde 3 etape principale:

încorporarea substanței active în rezervorul microcapsulei sau în matricea microsferei prin dizolvare sau prin dispersare, dacă substanța activă este lichidă și prin absorbție sau aglomerare, dacă matricea este solidă;

prepararea microcapsulelor, această etapă presupune o serie de operații mecanice care constau în dispersarea componentelor sau în pulverizarea lor.

Stabilizarea microcapsulelor prin diferite reacții chimice (polimerizare), fizico-chimice (gelifiere, coacervare) și fizice (evaporare, solidificare, coalescență).

Metodele chimice și fizico-chimice au la bază reacții chimice, fie un ansamblu de transfomări de fază sau procese fizice.

Dintre tehnicile de microîncapsulare, uscarea prin pulverizare este o metodă eficientă atât punct de vedere economic, cât și din punct de vedere a stabilității, deoarece se obțin pulberi stabile. Structural, compușii bioactivi sunt înveliți într-un polizaharid sticlos sau într-o matrice proteică care se formează atunci când suspensia de lichid atomizat intră în contact cu aerul cald. Comparativ cu metodele convenționale de uscare, temperaturile utilizate în uscarea prin pulverizare sunt mai mari, iar timpul de uscare este în general mai scurt. Numeroase studii de cercetare au fost efectuate pentru a observa ce efect are uscarea asupra antocianilor, influența materialului încapsulant (cum ar fi polizaharide sau proteine), eficiența încapsulării și capacitatea antioxidantă a antocianilor microîncapsulați. Materiale încapsulante ar putea influența randamentul produsului, precum și menținerea activităților antioxidante (Fang și Bhandari, 2012; Tonon și al., 2009).

Microîncapsularea prin tehnica uscării prin pulverizare este foarte folosită deoarece permite încapsularea unei game largi de ingrediente: compuși de aromă, coloranți, antioxidanți, vitamine, proteine, uleiuri sau grăsimi, culturi starter, fructe și altele.

Polifenolii au un rol esențial în calitatea si siguranța alimentelor și totodată aduc numeroase beneficii pentru sănătatea consumatorilor. Pentru încapsularea prin tehnica uscării prin pulverizare sunt folosiți diverși agenți cum ar fi: polizaharide (maltodextrine, gumă arabică), lipide (mono și digliceride) și proteine (gelatină, caseină, proteine din soia și din zer) (Gibbs și al., 1999). Proteinele reprezintă un material încapsulant delicat, deoarece prezintă instabilitate la pH acid și au o văscozitate ridicată (Florea și al., 2009).

Pentru obținerea microcapsulelor prin tehnica uscării prin pulverizare trebuie să se parcurgă următorii pași:

Prepararea amestecului (material încapsulant+ingredient);

Atomizarea (pulverizarea);

Uscarea picăturilor;

Separarea capsulelor;

Uscarea capsulelor.

Prepararea amestecului presupune, înainte de toate, alegerea materialului încapsulant. Acesta trebuie hidratat la temperatura camerei sau prin încălzire ușoară. După ce se realizează hidratarea, materialul încapsulant se amestecă cu ingredientul care urmează sa fie încapsulat. În funcție de natura ingredientului, acesta se amestecă ușor cu suspensia apoasă a materialului încapsulant sau, dacă ingredientul este lipofil, acesta se include într-o emulsie U/A, în care faza discontinuă este reprezentată de ingredient, iar faza continuă este reprezentată de dispersia apoasă a materialului încapsulant. La această etapă vâscozitatea amestecului trebuie sa fie relativ scăzută pentru a nu îngreuna procesul de pulverizare sau de uscare.

Pentru realizarea atomizării (pulverizării) se pot folosi mai multe tipuri de pulverizatoare, cum ar fi: turbină centrifugă, pulverizator cu duză, pulverizator cu duză cu două fluide, pulverizator cu duză de pulverizare ultrasonică. Acestea se aleg în funcție de îngredientele încapsulate și de cantitatea amestecului lichid ce urmează a fi încapsulat.

Uscarea picăturilor se realizează într-o cameră de uscare, prin care trece aer cald în același sens cu picăturile pulverizate. Temperatura aerului la intrare trebuie să fie ajustată în funcție de stabilitatea termică a ingredientelor încapsulate. Reineccius (1988) a demonstrat că temperatura optimă a aerului la intrare este de 160-2100C, însă această temperatură poate fi și mai mare (280-3500C). Trebuie ținut cont de faptul că temperatura ridicată poate influența stabilitatea emulsiei și poate produce apariția tranzițiilor de fază la nivelul materialului încapsulat, ceea ce va conduce la modificarea calității capsulelor.

Când iese din uscator, aerul are o temperatură de 80-900C, astfel încât capsulele părăsesc uscătorul la o temperatură de 40-500C.

Capsulele formate în camera de uscare se separă cu ușurință, deoarece acestea cad la partea inferioară a uscătorului datorită greutății lor, însă ramân și particule fine la partea superioară a camerei de uscare. Aceste particule fine trec într-un ciclon, unde are loc aglomerarea și transformarea acestora în capsule (Figura 4). Prin acestă tehnică se realizează microcapsule multinucleare a căror dimensiune este diferită.

Figura 4: Reprezentare schematică a instalației de uscare prin pulverizare

Pulverizarea soluției de alimentare sau a emulsiei în picături mici se realizează cu ajutorul unui atomizator.

Uscarea capsulelor se realizează în instalații de uscare prin pulverizare. Acestea funcționează în doi timpi. Capsulele formate în uscător și în ciclon sunt fluidizate într-un vibrofluidizor constituit dintr-o bandă vibratoare perforată prin care trece aer cald ce asigură o uscare suplimentară a capsulelor (Florea și al., 2009).

Uscarea prin pulverizare este un proces alternativ de a produce pulbere
cu conținut ridicat de antociani din diferite fructe bogate în acest compus. Această tehnică este foarte utilizată în microcapsularea ingredientelor alimentare susceptibile la degradare.

Microîncapsularea este folosită în industria alimentară cu scopul de a proteja ingredientele alimentare sensibile în timpul depozitării, pentru a masca arome sau conserva
arome, pentru a proteja produsele alimentare împotriva pierderilor nutriționale sau
chiar pentru a adăuga materiale nutritive produselor alimentare după prelucrare (Rѐ, 1998).

Modelarea moleculară

Modelarea moleculară reprezintă unul dintre domeniile care au avansat foarte mult în știință, având foarte multe aplicații: de la construirea și vizualizarea moleculelor și până la efectuarea unor calcule complexe privind sistemele moleculare. De asemenea, se pot efectua diferite simulări moleculare pe complexe lipide-proteine, gererându-se grafice ce pot oferi informații despre mișcarea lipidelor în interiorul proteinei. Modelarea moleculară computerizată reprezintă un instrument puternic pentru estimarea spațială moleculară prin calcule de reducere a energiei la minimum, pe baza mecanicii cuantice (http://www.nyu.edu/pages/mathmol/quick_tour.html (10 Martie 2015)).

Modele moleculare de calcul

Modelele moleculare de calcul sunt reprezentate de rezultatele ecuațiilor matematice de estimare a pozițiilor și de răspunsurile electronilor și nucleelor. Modelele matematice sunt împărțite în abordări mecanice clasice și mecanice cuantice. Modelele matematice a mecanicii clasice exprimă moleculele ca o colecție de atomi și legături care sunt tratate ca bile și arcuri. Informațiile referitoare la razele atomice și rigiditatea arcelor sunt folosite pentru a găsi poziția atomului "cea mai bună". Este o metodă rapidă și precisă pentru localizarea unei molecule cu geometrie stabilă. Metode mecanice cuantice se rezolvă cu ecuația lui Schrodinger în două moduri: semi-empiric și ab initio (de la început). Metodele semi-empirice utilizează date experimentale pentru a simplifica soluția ecuației lui Schrodinger, astfel încât să poată fi rezolvată mai repede. S-au dezvoltat numeroase metode pentru această simplificare. Fiecare metodă are un set de parametri bazat pe măsurători experimentale pentru numeroși compuși. În schimb, metodele ab initio utilizeză anumite aproximări matematice standard. Deși aceste metode sunt teoretic "pure", ele necesită calcule intensive și computere ultra performante.

MATERIALE ȘI METODE

Determinarea acidități fructelor congelate

20g fructe congelate sunt tăiate în jumătăți și omogenizate în blender cu 100 ml apă. Amestecul se diluează până la 150 ml și se fierbe timp de 30 de minute. După ce se răcește, se aduce iar la 150 ml și este centrifugat. Din acest amestec se iau 10 ml pentru determinarea acidității.

Aciditatea a fost determinată cu ajutorul metodei descrisă de Tang și Tigerstedt (2001), prin titrare cu 0,1 N soluție de NaOH în prezența fenolftaleinei. Aciditatea este exprimată în procente de acid malic.

Determinarea pH-ului

25 g fructe congelate se amestecă în blender și se pun la centrifugă timp de 10 minute la 1500 rpm, apoi se determină pH-ul cu pH-metru.

Uscarea porumbelor

Această metodă de uscare a fructelor a fost descrisă de Haq și al., însă prezintă mici modificări. Inițial are loc spălarea probelor (fructelor), apoi are loc uscarea la 400C/25 h cu o viteză a aerului de 0,2 m/s. După o uscare parțială a fructelor se poate efectua scoaterea sâmburilor, apoi se continuă uscarea în aceleași condiții.

Metodă de extracție antociani

1 g pulbere de fructe + 8 ml etanol 70 % menținere pe agitator orbital 4 h. Se centrifughează timp de 10 minute, apoi se filtrează. Acest extract se poate folosi ca atare, însă se poate realiza și concetrarea acestuia la 45-400C.

Determinarea conținutului total de antociani

Determinarea conținutului total de antociani se face conform metodei oficiale AOAC din 2005. Intr-o cuvă se pun 200 μL extract peste care se adaugă 800 μL clorură de potasiu 0,025 M cu pH=1 se menține 15 minute pentru echilibrarea probei apoi se măsoară absorbanța la 520 nm și la 700 nm. In altă cuvă se adaugă 200 μL extract și 800 μL acetat de sodiu 0,4 M cu pH= 4,5 se menține 15 minute pentru echilibrarea probei apoi se citește absorbanța la 520 nm și la 700 nm.

Pentru calibrare se folosește apa distilată, iar rezultatele obținute se exprimă în mg C3G/L și reprezintă antocianii monomerici.

Conținutul de antociani se determină cu ajutorul formulei:

C3G= cianidin-3-glucozida;

ΔA= (A520nm-A700nm)pH 1.0-( A520nm-A700nm)pH4,5

MW=masă moleculară= 449,2 g/mol cianidin-3-glucozida;

DF=factor de diluție;

L=lungimea cuvei (1 cm);

ε (coeficient de extincție molară )= 26 900

103= factor de conversie din g în mg;

Determinarea conținutului de polifenoli

Determinarea conținutului total de polifenoli s-a realizat aplicând metoda modificată Folin-Ciocalteu (Singleton și al., 1999).

200 μl extract se mixează cu 15,8 ml apă distilată și cu 1 mL reactiv Folin-Ciocalteu și se mențin 10 minute. Se adaugă 3 mL carbonat de sodiu de concentrație 20 % și se mențin 60 de minute. În final se măsoară absorbanța la 765 nm. Pentru exprimarea rezultatelor s-a folosit curba etalon realizată cu soluții standard de acid galic (μg/mL).

Determinarea conținutului total de flavonoide

Într-o cuvă se adaugă 0,25 mL extract diluat, 1,25 mL apă distilată și 0,075 mL NaNO2 de concentrație 5% și se mențin 5 minute. Apoi se adaugă și 0,15 mL AlCl3 de concentrație 10% și se mențin 10 minute. În final se mai adaugă 0,5 mL NaOH de concentrație 1M și apă distilată până la volum 3 mL. Absorbanța se citește la 510 nm.

Conținutul de flavonoide se determină cu ajutorul curbei standard catehinică și se exprimă în mg Ec/100 g FS (Dewanto, 2002; Jia, 1999).

Evalurea proprietăților conformaționale

În experimentele efectuate s-au utilizat tehnicile de spectroscopie de fluorescență cu ajutorul cărora s-au descris modificările conformaționale și structurale induse de diferite valori ale pH-ului și respectiv ale temperaturii în moleculele extractului din porumbe (Prunus spinosa) din perspectiva stabilirii unor mecanisme de denaturare a antocianilor.

În acest sens, s-a urmărit influența tratamentului termic în intervalul de temperatură 250C – 1000C și influența pH-ului în intervalul 2-9:

spectrele de emisie

diagrama de faze;

experimente de anizotropie;

Tratamentul izotermic aplicat extractelor

Extractele au fost introduse în tuburi flexibile Eppendorf pentru evaluarea proprietăților fluorescente. Toate experimentele izoterme s-au efectuat într-o baie termostat de apă (F33 MC), la temperatură constantă.

Pentru experimentele de fluorescență, un volum de 30 μL extract a fost introdus în tuburi flexibile Eppendorf cu diametrul de 1 cm. Tratamentul termic a fost efectuat în intervalul de temperatură 25°C-100°C timp de 10 minute. Imediat după tratamentul termic, tuburile au fost introduse în apă cu gheață pentru a preveni propagarea efectului indus de tratamentul aplicat.

Materiale

Pentru aplicarea tehnicilor de fluorescență în vederea evaluării modificărilor conformaționale ale extractului din Prunus spinosa s-au utilizat următoarele materiale:

-extract din Prunus spinosa obținut prin extracție cu etanol 70%;

– soluția tampon Tris-HCl de concentrație 0,02M cu pH=2…9;

Pentru determinarea conținutului de antociani monomerici s-au folosit următoarele materiale:

extract antocianinic;

clorură de potasiu 0,025 M cu pH=1;

acetat de sodiu 0,4 M cu pH=4,5

Pentru determinarea conținutului total de polifenoli s-au folosit următoarele materiale:

– carbonat de sodiu 20%;

– reactiv Folin-Ciocalteau;

– extract antocianinic;

Echipamente

Pentru evaluarea proprietăților fluorescente s-a utilizat spectrofluorimetrul de luminiscență Perkin Elmer LS 55 (PerkinElmer Life Sciences, Shelton, CT) din dotarea platformei BioAliment.

Pentru determinarea conținutului total de polifenoli și a conținutului de antociani monomerici s-a folosit spectrofotometru JENWAY UV 6505/Vis din dotarea platformei BioAliment.

Metode:

Spectre de emisie

Spectrele de emisie au fost obținute prin excitarea soluțiilor la mai multe lungimi de undă, iar intensitatea de fluorescență la emisie a fost înregistrată în diferite intervale, la fante de 10 nm, cu o viteză de scanare de 500 nm·min-1. În tabelul 1.5 sunt redate lungimile de undă de excitație și intervalele în care s-au inregistrat intensitățile de fluorescență la emisie.

Tabelul 1.5. Caracteristicile spectrelor de emisie

Diagrama de faze

Este o metodă utilizată pentru detectarea intermediarilor proteici în cursul proceselor de depliere/repliere (Kuznetsova și al. 2004). Esența acestei metode constă în construirea unei diagrame pe baza ecuației 2.1.

I (λ1) = a + b I (λ2)

(2.1.)

în care I(λ1) și I(λ2) sunt valorile intensităților spectrale determinate la lungimile de undă λ1 și λ2 în condiții experimentale diferite pentru compusul care suferă o serie de transformări conformaționale; a și b sunt interceptul și panta reprezentării grafice I(λ1) versus I(λ2). În principiu, λ1 și λ2 sunt lungimi de undă arbitrare, dar în practică astfel de diagrame se obțin dacă λ1 și λ2 se situează pe pante diferite a spectrelor, cum ar fi de exemplu 320 și 365 nm.

Măsurătorile realizate pentru a determina fluorescența au utilizat celule de cuarț, lungimea de undă pentru excitație folosită a fost de λex=292 nm. Emisia a fost colectată (λem) la valoarea de 320 și, respectiv, 365 nm. Fantele la excitație și la emisie au avut valoare de 10 nm, iar viteza de scanare a fost de 500 nm·min-1 (Bushmarin și al., 2001). Soluțiile proteice (50 µL) au fost diluate în 3 mL apă ultrapură, probele fiind menținute la temperatura camerei timp de 15 minute pentru echilibrare.

Anizotropie

Pentru studiile de anizotropie, lungimile de excitație și de emisie au fost de 292 nm și respectiv 340 nm cu fante de 10 nm atât la excitație cât și la emisie. Anizotropia de fluorescență este definită prin ecuația 2.2.

(2.2.)

în care : IVV este intensitatea de fluorescență înregistrată atunci când polarizoarele de excitație și de emisie se găsesc în poziție verticală, și IVH este intensitatea de fluorescență măsurată atunci când polarizoarele sunt aliniate în poziție orizontală. Factorul G reprezintă un raport care ține cont de senzitivitatea sistemului de detectare pentru lumina polarizată vertical și orizontal.

Identificarea antocianilor din porumbe prin metoda HPLC

Prepararea probei pentru HPLC

Peste extractul concentrat obținut din 1 g fructe de Prunus spinosa uscate anterior se adaugă 1 mL acid formic de concentrație 3% și 3 mL metanol pur.

Activare cartuș

Pentru activarea cartușului este necesar sa se treaca prin cartus 3 mL metanol pur, apoi 5 mL acid formic. Amestecul rezultat se aruncă.

Pregătirea probei de analizat pentru HPLC

o primă etapă este reprezentată de activarea cartușului (a se vedea procedeul de activare);

A doua etapă presupune încărcarea cartușului ( C18 cartridge waters) cu 1 mL probă, se va spăla cartușul cu 3 mL acid formic 3% (ceea ce rezultă se va arunca), apoi se va spăla cu 2 mL metanol de puritate HPLC, iar soluția colectată va fi folosită ca probă de analizat pentru HPLC.

Lungimea de undă utilizată pentru detecția antocianilor este 520 nm (Lamuela-Raventós and Waterhouse, 1994).

Bibliografie

Andersen, O. M., Jordheim, M. (2006). The anthocyanins. In O. M. Andersen & K. R. Markham (Eds.), Flavonoids (2nd ed.. Chemistry, biochemistry and applications, pp. 452–471). Boca Raton, FL: CRC Press.

Araceli Castaneda-Ovando, Ma. de Lourdes Pacheco-Hernandez, Ma. Elena Paez-Hernandez, Jose A. Rodriguez, Carlos Andres Galan-Vidal, Chemical studies of anthocyanins: A review, 2009;

Baublis, A.J. and Berber-Jiménez, M.D., (1995), Structural and conformational characterization of a stable anthocyanin from Tradescantia pallida, J. Agric. Food Chem.; 43: 640–646;

Beara, I. N., Lesjak, M. M., Orcic, D. Z., Simin, N. D., Cetoyevic-Simin, D. D., Bozin, B., et al. (2012). Comparative analysis of phenolic profile, antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxic activity of two closely-related Plantain species: Plantago altissima L. and Plantago lanceolata L. LWT — Food Science and Technology, 47, 64–70;

Bijak, M., Bobrowski, M., Borowiecka, M., Podsędek, A., Golański, J., & Nowak, P. (2011). Anticoagulant effect of polyphenols-rich extracts from black chokeberry and grape seeds. Fitoterapia, 82, 811–817;

Braunitzer, G. și al., (1973), Sequence analysis of β-lactoglobulin, Phisiological Chemistry, 354: 867-878;

Brouillard, R., Dangles, O., Jay, M., Biolley, J. P., and Chirol, N., Polyphenols and pigmentation in plants. In: Scalbert, A., Ed., Polyphenolic Phenomena. Paris: INRA, 1993, 41–47;

Brownmiller, C., Howard, L. R., & Prior, R. L. (2008). Processing and storage effects on monomeric anthocyanins, percent polymeric colour, and antioxidant capacity of processed blueberry products. Journal of Food Science, 5(73), H72eH79;

Borda D., (2007), Tehnologii în industria laptelui –Aplicații ale tratamentului la presiune înaltă, Ed. Academica, Galați;

Burrington , K.J., (1998), More than just milk, Food Product Design, 7: 91 – 111;

Cabrita, L., Fossen, T., & Andersen, Ø. M., (2000), Colour and stability of the six common anthocyanidin 3-glucosides in aqueous solutions. Food Chemistry, 68, 101–107;

Cabrita L. (1999). Analysis and stability of anthocyanins. [dissertation].University of Bergen, Department of Chemistry, Bergen;

Chen, D., Wan, S. B., Yang, H., Yuan, J., Chan, T. H., & Dou, Q. P. (2011). EGCG, green tea polyphenols and their synthetic analogs and prodrugs for human cancer prevention and treatment. Advances in Clinical Chemistry, 53, 155–177;

Chung, S. Y., & Champagne, E. T. (2009). Reducing the allergenic capacity of peanut extracts and liquid peanut butter by phenolic compounds. Food Chemistry, 115, 1345–1349;

Clifford, M. N., (2000), Anthocyanins—nature, occurrence and dietary burden. Journal of the Science of Food and Agriculture, 80, 1063–1072;

Costin G.M. și Segal R., (2001), Alimente pentru destinație specială, Ed. Academica, Galați;

Counsell, J. N., Jeffries, G. S., and Knewstubb, C. J. Some other natural colors and their applications. In: Counsell, J. N. and Dunastable, J. A., Eds., Natural Colors for Foods and Other Uses. Applied Science, London, 1979, 122–151;

Creamer, L.K., Parry, D.A.D., Malcom, G.N., (1983), Secondary structure of bovine β-lactobulin, achive of biochemistry and Biophysics 227, 98-105;

Dewanto, V.; Wu, X.; Adom, K. K.; Liu, R. H. Thermal processing enhances the nutritional value of tomatoes by increasing total antioxidant activity. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3010-3014;

De la Fuente, M., Singh, H., Hemar, Y., (2002), Recent advanced in the characteristion of heat-induced aggregates and intermediates of whey proteins, Trends in Food Science and Technology, 13, 262-274;

Drdak, M., & Daucik, P. (1990). Changes of elderberry (Sambucus nigra) pigments during the production of pigment concentrates. Acta Aliment, 19, 3e7;

Eigel VN., Buyetler JE., Ernstorm CA. și al., (1984), Nomenclature of proteins of cow’s milk; fifth revision J. Dairy Sci 76 1599-1631;

Ersus, S., & Yurdagel, U. (2007). Microencapsulation of anthocyanin pigments of black carrot (Daucuscarota L.) by spray dryer. Journal of Food Engineering, 80(3), 805–812;

Florea T., (2008), Chimia alimentelor;

Fleschhut, J., Kratzer, F., Rechkemmer, G., & Kulling, S. E. (2006). Stability and biotransformation of various dietary anthocyanins in vitro. European Journal of Nutrition, 45(1), 7–18;

Francis, F. J., Food colorants: anthocyanins, Crit.Rev. Food Sci. Nutr., 1989; 28(4): 273–314;

Gibbs S, Alli KI, Mulligan CN: Encapsulation in the food industry: a review. Int J Food Sci Nutr 1999, 50:213-224. A good review about the application of encapsulation in food science;

Godovac-Zimmermann, J., (1988), The structural motif of β-lactoglobulin and retinol binding protein, Trends in Biochemical Science, 13, 64-66;

Hambling, S.G., McAlpine, A., Sawyer, L., (1992), β-lactoglobulin. In Milk Proteins, (Fox, P.F. Ed.) pg. 141-190, Elsevier, London, Marea Britanie;

Han, N., Gu, Y., Ye, C., Cao, Y., Liu, Z., & Yin, J. (2012). Antithrombotic activity of fractions and components obtained from raspberry leaves (Rubus chingii). Food Chemistry, 132, 181–185;

Harborne, J. B. and Grayer, R. J., (1988), The anthocyanins. In: Harborne, J.B., Ed. The Flavonoids. London: Chapman and Hall Ltd, 1-20;

Harborne, J. B., (1988), The flavonoids: recent advances. In Goodwin, T. W., Ed., Plant Pigments. Academic Press, London, 298–343;

Haskard, A.C., Li-Chan, E.C.Y., (1998), Hydrophobicity of bovine serum albumin and ovalbumin determined using uncharged (Prodan) and anionic (ANS-) fluorescent probes, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46, 2671-2677;

Huffman, L., (1996), Processing whey protein for use as a food ingredient . Food Technology 50: 49 – 52;

Hsu, W. T., Pang, C. N. I. P., Sheetal, J., & Wilkins, M. R. (2007). Protein–protein interactions and disease: use of S. cerevisiae as a model system. Biochimica et Biophysica Acta, 1774, 838–847;

Iacobucci GA, Sweeny JG. 1983. The chemistry of anthocyanins, anthocyanidins and related flavylium salts. Tetrahedron 39: 3005-3038;

Jeong, W. Y., Jin, J. S., Cho, Y. A., Lee, J. H., Park, S., Jeong, S. W., et al. (2011). Determination of polyphenols in three Capsicum annuum L. (bell pepper) varieties using high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry: their contribution to overall antioxidant and anticancer activity. Journal of Separation Science, 34, 2967–2974;

Jia, Z.; Tang, M.; Wu, J. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem.1999, 64, 555-559;

Kato, A., Komatsu, K. și al., (1985), Relationship between surface functional properties and flexibility of proteins detected by protease susceptibility, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 33, 931-934;

Kinsella, J.E., and Whitehead, D.M., (1989), Proteins in whey: chemical, physical, and functional properties. Advances in Food & Nutrition Research 33 : 343 – 438;

Konczak, I., Zhang, W., (2004), Anthocyanins-more then nature’s colours (2004). Journalof Biomedicine and Biotehnology, 2004(5), 239-240;

Kong, J. M., Chia, L. S., Goh, N. K., Chia, T. F., & Brouillard, R. (2003). Analysis and biological activities of anthocyanins. Phytochemistry, 64(5), 923–933;

Korhonen, H. and Pihlanto, A., (2007), Technological options for the production of health – promoting proteins and peptides derived from milk and colostrum. Current Pharmaceutical Design 13: 829 – 843;

Kuriyama, S., Shimazu, T., Ohmori, K., Kikuchi, N., Nakaya, N., Nishino, Y., et al. (2006). Green tea consumption and mortality due to cardiovascular disease, cancer and all causes in Japan. Journal of the American Medical Association, 296, 1255–1265;

Kroll, J., Rawel, H. M., & Rohn, S. (2003). Reactions of plant phenolics with food proteins and enzymes under special consideration of covalent bonds. Food Science and Technology Research, 9, 205–218;

Labuckas, D. O., Maestri, D. M., Perelló, M., Martínez, M. L., & Lamarque, A. L., (2008), Phenolics from walnut (Juglans regia L.) kernels: Antioxidant activity and interactions with proteins. Food Chemistry, 107, 607–612;

López-Expósito, I. and Recio, I., (2006), Antibacterial activity of peptides and folding variants from milk proteins, International Dairy Journal 16: 1294-1305;

Lamuela-Raventos RM, Waterhouse AL. (1994). A direct HPLC separation of wine phenolics. Am J Enol Vitic 45: 1-5;

Lule, S. U., & Xia, W. (2005). Food phenolics, pros and cons: A review. Food Reviews International, 21(4), 367–388;

Monaco, H.L. și al., (1987), Crystal structure of the trigonal form of bovine β-lactoglobulin and of its complex with retional at 2.5A rezolution, Journal of molecular biology, 197, 695-706;

Mursu, J., Voutilainen, S., Nurmi, T., Tuomainen, T. P., Kurt, S., & Salonen, J. T. (2008). Flavonoid intake and the risk of ischaemic stroke and CVD mortality in middle-ages Finnish men. Journal of Nutrition, 100, 890–895.

Nakai, S., (1983), Structure-Function Relationship of food proteins with emphasis on the importance of protein hydrofobicity, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 31, 676-683;

Ogunleye, A. A., Xue, F., & Michels, K. B. (2009). Green tea consumption and breast cancer risk or recurrence: A meta-analysis. Breast Cancer Research and Treatment, 119, 477–484;

Pacheco-Palencia, L. A., Hawken, P., & Talcott, S. T. (2007). Phytochemical, antioxidant and pigment stability of açaí (Euterpe oleracea Mart.) as affected by clarification, ascorbic acid fortification and storage. Food Research International, 40(5), 620–628.

Patras, A., Brunton, N. P., Gormely, T. R., & Butler, F. (2009). Impact of high pressure processing on antioxidant activity, ascorbic acid, anthocyanins and instrumental colour of blackberry and strawberry puree. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 10(3), 308e313

Philanto A., (2011), Whey proteins and peptides;

Rawel, H. M., Kroll, J., & Rohn, S. (2001). Reactions of phenolic substances with lysozyme-physicochemical characterisation and proteolytic digestion of the derivatives. Food Chemistry, 72, 59–71;

Reddy M., Kella N.K.D., Kinsella J.E., (1988), Structural and conformational basis of the resistance of β-lactoglobulin to peptidic and chymotryptic digestion, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 36:737-741;

Ré, M. I. (1998). Microencapsulation by spray drying. Drying Technology, 16(6), 1195–1236;

Rein, M. J., Heinonen, M (2004). Stability and enhancement of berry juice. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 3106-3114;

Relkin, P., & Shukat, R. (2012). Food protein aggregates as vitamin-matrix carriers: Impact of processing conditions. Food Chemistry, 134, 2141–2148;

Rentzsch, M., Schwarz, M., Winterhalter, P. (2007). Pyroanthocyanins – an overview on structures, occurrence, and pathways of formation. Trends in Food Science and Technology, 18(10)526-534;

Rhim, J. W. (2002). Kinetics of thermal degradation of anthocyanin pigment solutions driven from red flower cabbage. Food Science and Biotechnology, 11, 361e364;

Rossi, M., Giussani, E., Morelli, R., Lo Scalzo, R., Nani, R. C., & Torreggiani, D. (2003). Effect of fruit blanching on phenolics and radical scavenging activity of highbush blueberry juice. Food Research International, 36, 999e1005;

Santoz, M. D., Almeida, M. C., Lopez, N. P., & Souza, G. E. P. (2010). Evaluation of the anti-inflammatory, analgesic and antipyretic activities of the natural polyphenols CGA. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 29, 2236–2240;

Sadilova, E., Stintzing, F. C., & Carle, R. (2006). Thermal degradation of acylated and nonacylated anthocyanins. Journal of Food Science, 71, C504eC512;

Saito, N., Ku, M., Tatsuzawa, F., Lu, T. S., Yokoi, M., Shigihara, A., and Honda, T., Acylated cyanidin glycosides in the purple-red flowers of Bletilla striata, Phytochemistry, 1995; 40: 1521–1529;

Sawyer, l. Papiz, M.Z. și al., (1985), Structure and function of bovine β-lactoglobulin, Biochemistry Society trans., 13, 265-266;

Schmitz-Eiberger, M. A., & Blanke, M. M. (2012). Bioactive components in forced sweet cherry fruit (Prunus avium L.) antioxidative capacity and allergenic potential as dependent on cultivation under cover. LWT — Food Science and Technology, 46, 388–392;

Schütz, K., Saß, M., With, A., Graubaum, H. J., & Grünwald, J. (2010). Immune-modulating efficacy of a polyphenol-rich beverage on symptoms associated with the common cold: a double-blind, randomised, placebo-controlled, multi-centric clinical study. British Journal of Nutrition, 104, 1156–1164;

Silva, J. C., Rodrigues, S., Feas, X., & Estevinho, L. M. (2012). Antimicrobial activity, phenolic profile and role in the inflammation of propolis. Food and Chemical Toxicology, 50, 1790–1795;

Singleton, V.L., Orhofer, R., Lamuela-Raventos, R.M. (1999). Analysis of total phenols and orher oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent. Methods in Enzimology, vol 299, pp 152-178;

Skrede, G., Wrolstad, R. E., & Durst, R. W. (2000). Changes in anthocyanins and polyphenolics during juice processing of highbush blueberries (Vaccinium corymbosum L.). Journal of Food Science, 65, 357-364;

Smith, A. W. (2012). Lipid–protein interactions in biological membranes: A dynamic perspective. Biochemica et Biophysica Acta, 1818, 172–177.

Swain, T. and Bate-Smith, E. C., Flavonoid Compounds. In: Florkin, M. and Mason, H. S., Eds., Comparative Biochemistry Vol. III: Constituents of Life. Part A, Academic Press, New York, 1962, 755–809;

Stănciuc, N., (2009), Proteinele laptelui, Relație structură-funcție;

Szczesniak, A.S., (1998), Sensory texture profi ling —Historical and scientific erspectives, Food Technology 52: 54 – 57;

Takano, Y., Kubo, Y., Kawamura, C., Tsuge, T., and Furusawa, I., The Alternaria alternata melanin biosynthesis gene restores appresorial melanization and penetration of cellulose membranes in the melanindeficient albino mutant of Colletotrichum lagenarium, Fungal Genet. Biol., 1997; 21: 131–140;

Tang, X.; Tigerstedt, M.A. (2001). Variation of physical and chemical characters within an elite seabuckthorn (Hippophae rhamnoides L.) breeding population. Scientia Horticulturae, 88, 203–214;

Tao, W. W., Duan, J. A., Yang, N. Y., Tang, Y. P., Liu, M. Z., & Qian, Y. F. (2012). Antithrombotic phenolic compounds from Glycyrrhiza uralensis. Fitoterapia, 83, 422–425;

Tilley, J.M.A. (1960), The chemical and physical properties of bovine β-lactoglobulin, Dairy Science Abstract, 22, 111-125;

Thangudu, R. R., Bryant, S. H., Panchenko, A. R., & Madej, T. (2012). Modulating protein–protein interactions with small molecules: the importance of binding hotspots. Journal of Molecular Biology, 415, 443–453;

Von Elbe, J. H., Schwartz, S. J. (1996). Colorants. In O. R. Fennema (Ed.), Food Chemistry (3rd ed.). New York: Marcel Dekker;

Wu, X., Wu, H., Liu, M., Liu, Z., Xu, H., & Lai, F. (2011). Analysis of binding interaction between (−)-epigallocatechin (EGC) and β-lactoglobulin by multi-spectroscopic method. Spectrochimica Acta. Part A. Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 82, 164–168

Zakaria, Z. A., Hisam, E. E. A., Rofiee, M. S., Norhafizah, M., Somchit, M. N., Teh, L. K., et al., (2011). In vivo antiulcer activity of the aqueous extract of Bauhinia purpurea leaf. Journal of Ethnopharmacology, 137, 1047–1054;

Zimmer, A. R., Leonardi, B., Miron, D., Schapoval, E., Oliveira, J. R., & Gosmann, G. (2012). Antioxidant and anti-inflammatory properties of Capsicumbaccatum: fromtraditional use to scientific approach. Journal of Ethnopharmacology, 139, 228–233;

Xia, D., Wu, X., Shi, J., Yang, Q., & Zhang, Y. (2011). Phenolic compounds from the edible seeds extract of Chinese Mei (Prunus mume Sieb. Et Zucc) and their antimicrobial activity. LWT — Food Science and Technology, 44, 347–349;