Anomaliile Structurale Cromozomiale

INTRODUCERE

Anomaliile structurale cromozomiale ridică o problemă de sănătate publică datorită incidenței ridicate și faptului că, de cele mai multe ori sunt asociate cu afecțiuni fizice și retard mental, având un caracter cronic. Datorită acestor probleme au apărut noi metode cu ajutorul cărora să se poată diagnostica cât mai precis încă din perioada prenatală, aceste tehnicii fiind utilizate în mod curent în laboratoarele specializate.

Aneuploidiile sunt cele mai frecvente aberații cromozomiale, și sunt caracterizate de adiția sau deleția unui cromozom față de setul normal. Aceste aberații pot fi detectate prin intermediul citologiei clasice sau cu ajutorul tehnicilor mai moderne, precum tehnica FISH.

Tehnica FISH (Hibridizarea fluorescentă in situ) vine în completarea tehnicilor clasice deoarece este o tehnică de citogenetică moleculară specifică, modernă și perfomantă, dar mai laborioasă.

Lucrarea de față vizează depistarea și stabilirea diagnosticului pre- și postnatal prin tehnici de citogenetică clasică și moleculară în cazul unor sindroame datorate aberațiilor cromozomiale structurale. În plus, s-a urmărit stabilirea incidenței acestor anomalii în vederea inițierii unei baze de date prin care să putem compara datele din România cu cele de la nivel internațional.

Pe lângă prezentarea rezultatelor personale, această lucrare cuprinde o scurtă trecere în revistă a caracteristicilor cariotipului uman normal și patologic, caracteristicile unora dintre cele mai frecvente sindroame, precum și o scurtă descriere a metodologiei folosite în diagnosticul citogenetic. În partea destinată rezultatelor proprii, după prezentarea metodelor de lucru utilizate, sunt analizate principalele date obținute, pe categorii de sindroame. Pentru diagnosticul postanatal, au fost facute, atunci cînd a fost posibil, corelații cu diagnosticul fenotipic.

Toate rezultatele confirmă superioritatea tehnicii FISH față de tehnicile citogenetice clasice în stabilirea diagnosticului unor sindroame cromozomiale, dar arată, în același timp necesitatea aplicării concomitente (în sindroamele de microdeleție) și a altor tehnici moleculare, pentru determinarea precisă a cauzelor care au declanșat maladia.

Capitolul 1

CARIOTIPUL UMAN

Pentru identificarea anomaliilor cromozomale este obligatoriu să se cunoască cariotipil uman normal. De aceea, în prima parte a acestui capitol sunt prezentate pe scurt câteva noțiuni legate cariotipul uman normal, urmate apoi de o trecere în revistă a celor mai comune aberații cromozomale numerice.

1.1 Cariotipul uman normal

Cariotipul definește procesul de aranjare a cromozomilor microfotografiați dintr-o metafază a unui organism în ordine descrescătoare a dimensiunii, în perechi omoloage.

Doar una din cele 22 de perechi este alcatuită din cromozomii de sex, denumiți și gonozomi sau heterozomi, restul sunt autozomi. Cariotipul unui individ la naștere este denumit constituțional. La 99% dintre indivizii care se nasc sănătoși, cariptipul constituțional este normal.

Conform Standardului Internațional de Nomenclatură Citogenetică (ISCN), cariotipul uman este redat prin numărul de cromozomi, urmat de formula cromozomală de sex ( XX pentru femei si XY pentru bărbat). Exemplu : 46, XX sau 46, XY (Mircea Covic, 2011).

Dezvoltarea cercetărilor de citogenică umană a făcut posibilă standardizarea complementului cromozomial uman, identificarea precisă a fiecărui cromozom și elaborarea unei nomenclaturi caracteristice. Nomenclatura cromozomilor normali umani se bazează pe rezultatele mai multor conferințe internaționle: Denver 1960, Londra 1963, Chicago 1966, Paris 1971,1975,1980, Stockholm 1977, Memphis 1944.

Cele mai importante noțiuni în caracterizarea cromozomilor umani sunt: cariotip, ideogramă, aneuploidie și poliploidie.

În ceea ce privește cariotipul acesta reprezintă dispunerea sistematizată pe grupe morfologice a cromozomilor unei singure celule, caracteristică pentru un individ sau specie (Denver, 1960).

Idiograma este o reprezentare grafică a careotipului, bazată pe măsurători ale cromozomilor din mai multe celule (Denver, 1960).

Aneuploidia reprezintă prezența suplimentară sau absența unor cromozomi din complementul cromozomial normal: trisomie (2n+1), tetrasomie (2n+2), disomie (2n), monosomie (2n-10), nulisomie (2n-2). În schimb, poliploidia reprezintă prezența unui număr mai mare de genomuri în celule: triploidie (3n), tetraploidie (4n) etc.

Cromozomii umani aparțin la 7 grupe morfologice (notate de la A la G), la care se adaugă cei doi heterozomi (vezi figura 1). În continuare, sunt prezentate pe scurt caracteristicile fiecărei grupe morfologice de cromozomi:

Grupa A (perechile 1-3): Din această grupă fac parte trei perechi de cromozomi de dimensiuni mari (9,08-7,06µ) metacentrici, care sunt ușor de distins unul de celălalt prin dimensiune si poziția centromerului (Mader, 1999).

Grupa B (perechile 4-5): Submetacentrici mari (6,55-6,13µ), aproape identice ca dimensiune și morfologie. Nu se deosebesc prin colorație clasică, iar prin bandarea G, sunt doar unele caracteristici stricte pentru fiecare dintre perechile 4 și 5 (Mader, 1999).

Grupa C (perechile 6-12): Este alcătuită din cromozomi de dimensiune medie (5,84-4,46µ), metacentrici sau sub-metacentrici (Mader, 1999). Cromozomul X seamănă cu cei mai mari cromozomi din această grupă. Sunt greu, sau imposibil de distins perechile învecinate prin colorație clasică.

Grupa D (perechile 13-15): Este reprezentată de cromozomi acrocentrici de dimensiune medie (3,64-3,36µ), cu sateliți, aproape identici ca dimensiune. Prin colorație convențională nu se poate stabili apartenența la perechea 13, 14 sau 15 (Mader, 1999).

Grupa E (perechile 16-18): Este formată din cromozomi metacentrici și sub-metacentrici relativ scurți și mici (3,23-2,76µ). Pot fi distinși pe perechi chiar și în colorație clasică, datorită morfologiei lor: perechea a 16-a este metacentrică, iar 17 și 18, submetacentrici (Mader, 1999).

Grupa F (perechile 19-20): Este formată din cromozomi metacentrici mici (2,52-2,33µ), cei mai mici metacentrici din cariotipul omului, identici în colorație convențională.

Grupa G (perechile 21-22): Reprezentată de cromozomi acrocentrici mici (1,83-1,68µ), cu sateliți. Nu se poate deosebi prin colorație convențională aparența lor la perechea 21 sau 22. Cromozomul Y este de dimensiunea acrocentricilor din grupa G, dar are ambele brațe paralele și nu are sateliți (Mader, 1999).

Pe lângă autozomi, careotipul uman cuprinde și heterozomi numiți și cromozomii sexului, reprezentați de cromozomii X și Y.

Cromozomul X este un submetacentric de dimensiune medie, care reprezintă 5,21% din genomul celular. În bandare G, evidențiază un model foarte caracteristic prin faptul că, pe brațul p și q, la distanță egală față de centromer se află benzi pozitive. Acesta are o lungime medie de 5,80µ, similară cromozomilor din grupa C.

Cromozomul Y este acrocentric mic, asemănător cu cei din grupa G, având dimensinea de 1,96µ. Reprezintă 2.15% din genomul celular. În bandare G se coloreză aproape omogen, dar în bandare C, evidențiază blocuri de heterocromatină constitutivă intens colorate pe două treimi din brațul lung (Mader, 1999).

Figura 1. Cariotip uman normal de sex feminin (Bandare G)

Sursa: Imagine proprie obținută în laborator

Cromozomii umani pot fi identificați cu precizie în funcție de modelul de bandare caracteristic. În funcție de metoda de bandare, există mai multe tipuri de benzi (vezi figura 2): benzi Q, benzi G, benzi R, benzi C și benzi T.

Figura 2. Modelul de bandare al cromozomilor umani

Sursa: Cromozonii umani și originea genetică a omului, Raicu Petre, 1997

Benzile Q se obțin prin colorarea cu agenți fosforescenți, cum este quinacrina, care a dat și denumirea benzilor.

Benzile G sunt observate prin colorare cu colorantul Giemsa, care a dat și denumirea benzilor.

Benzile R sau de reversie se realizează prin denaturare termică menajată și colorare cu acridin orange sau cu Giemsa, având o dispoziție inversă benzilor Q și G.

Benzile C sau centromerice se obțin după tratamente de denaturare-renaturare și colorare cu Giemsa, fiind localizate în regiunile pericentromerice (heterocromatina constitutivă).

Benzile T sau telomerice apar prin denaturare termică mai puternică pentru suprimarea benzilor R, astfel că prin, colorație Giemsa, telomerele apar intens colorate.

1.2 Cariotipul uman patologic

Anomaliile cromozomiale sunt modificări ale numărului sau structurii cromozomilor. Ele reprezintă o importantă componentă a patologiei genetice umane, atât datorită frecvenței globale, cât mai ales datorită consecințelor fenotipice și reproductive. Până în prezent au fost identificate peste 100 de sindroame cromozomice. Acestea afectează aproximativ: 0,7% din nou-născuți, 2% din sarcinile femeilor cu vârsta peste 35 de ani în momentul concepției și se regăsesc la peste 50% din produșii avorturilor spontane din primul trimestru.

Ele pot fi clasificate pe baza mai multor criterii, cele mai importante fiind: tipul anomaliei și numărul de celule modificate. În raport cu numărul de celule afectate, anomaliile cromozomice pot fi împărțite în: omogene și în mozaic. Anomaliile omogene se caracterizează prin prezența anomaliei în toate celulele individului afectat, iar cele mozaic sunt caracterizate de prezența a două sau mai multe linii (clone) celulare, care diferă prin numărul de cromozomi.

În raport cu modul de afectare a materialului cromozomic, anomaliile pot fi împărțite în: numerice și structurale. Prin anomalie cromozomială numerică se înțelege orice modificare a numărului de cromozomi în raport cu numărul normal de cromozomi (46 cromozomi).

Anomaliile numerice se clasifică în: poliploidii și aneuploidii.

Poliploidiile sunt caracterizate prin prezența în plus a unuia sau mai multor seturi complete de cromozomi (triploidie – 69 cromozomi; tetraploidie – 92 cromozomi).

Aneuploidiile se caracterizează prin absența (monosomie – 45 cromozomi) sau prezența în plus a unuia sau mai multor cromozomi (trisomie – 47 cromozomi, tetrasomie – 48 cromozomi, pentasomie – 49 cromozomi) din aceeași pereche sau din perechi diferite.

Anomaliile cromozomiale structurale se caracterizează prin modificarea structurii normale a cromozomilor. Ele se împart, în raport cu efectul fenotipic (modificarea stării de sănătate) în: anomalii echilibrate și anomalii neechilibrate.

Anomaliile echilibrate – translocații (anomalie cromozomică caracterizată prin schimbul de fragmente între cel puțin doi cromozomi diferiți) și inversii (anomalie cromozomică caracterizată prin modificarea poziției unui segment cromozomic) – nu afectează cantitatea totală de material genetic celular și nici fenotipul (purtătorii unor astfel de anomalii sunt sănătoși).

Cele neechilibrate − deleții, duplicații, cromozomi inelari, cromozomi dicentrici și isocromozomi − sunt caracterizate prin prezența suplimentară, absența sau asocierea dintre surplusul și lipsa unuia sau mai multor segmente cromozomice (trisomii sau monosomii parțiale), ceea ce determină o modificare a cantității totale de material genetic celular și un fenotip anormal (purtători afectați de o boală cromozomială).

Orice abatere de la numărul normal de cromozomi sau orice modificare apărută în structura cromozomilor poartă numele de aberație sau anomalie cromozomială.

Există două mari categorii de aberații cromozomiale detectabile: numerice și structurale.

Anomalii cromozomale numerice

Celulele somatice normale conțin două seturi haploide de cromozomi. În cazul oamenilor, o celulă prezintă un număr de 46 de cromozomi.

Modificarea numărului de cromozomi poate apărea atât prin creșterea numărului de cromozomi, dar și prin scăderea numărului acestora.

Modificările numerice au fost denumite după variația numărului de cromozomi comparativ cu setul normal diploid, astfel: poliploidia și aneuploidia.

Poliploidia umană apare prin diviziuni mitotice și meiotice anormale, în urma cărora pot apărea gameți diploizi, prin fecundarea cărora apar zigoți triploizi sau tetraploizi.

Triploidia la om este răspândită, între 15 și 20% dintre avorturile spontane manifestând triploidie. Au fost identificate trei tipuri de triploizi: 69, XXY; 69, XXX; 69, XYY. Aproximativ 75% dintre acești triploizi posedă două genome paterne și unul matern, ca urmare, se consideră că fenomenul cel mai comun care duce la apariția triploizilor este fecundarea unui ovul cu doi spermatozoizi.

Tetraploidia se observă la circa 5% dintre avorturile spontane și numai rareori duce la nașterea unor copii. În ce privește cromozomii sexului, indivizii respectivi sunt XXYY sau XXXX. Probabil că aceasta se datorează faptului că tetraploidia apare în urma primei diviziuni mitotice anormale după fecundare, iar replicația și separarea cromozomilor nu este urmată de citokineză. Dacă mitoza anormală se produce mai tarziu, apar indivizi mozaicați: o parte diploidă și o alta tetraploidă, iar acești indivizi supraviețuiesc ceva mai mult.

Poliploidia este de obicei un eveniment postmeiotic ce implică duplicarea unui set diploid, ca urmare a eșecului apărut în timpul clivajului mitotic precoce al zigotului (Eberhard, 2007). Atât triploidia cât și tetraploidia sunt letale.

Aneuploidia umană reprezintă adiția sau deleția unor cromozomi din complementul cromozomial (2n=46) și se datorează fenomenului de nondisjucție din timpul mitozei sau meiozei. Nondisjuncția mitotică timpurie dă naștere la o aberație prezentă în toate celulele organismului, pe când erorile de diviziune ce apar mai târziu, dau naștere la mozaicism (vezi figura 3).

Figura 3. Meioza normală; B. Nondisjuncție ân prima diviziune meiotică; C. Nondisjuncție în a doua diviziune meiotică.

Sursa: http://www.synevo.ro/analiza-cromozomiala-in-sange-cariotip-constitutional/, accesat în data de 10.04.2014.

Aneuploidia poate afecta atât autozomii cât și heterozomii.

Aneuploidiile autozomale sunt reprezentate prin trisomii, majoritatea având caracter letal, doar trisomiile 8,13 și 18 au caracter semiletal, iar trisomia 21 (sindromul Down), permite supraviețuirea persoanelor afectate până la vârsta adultă.

Trisomia 8 (47, +8) este foarte rară, persoanele afectate prezentând frunte înaltă și bombată, trunchiul foarte lung în raport cu membrele, buză inferioară groasă, bărbie pătrată.

Trisomia 13 (47,+13) a fost descoperită în 1960, are frecvența de 1/20000 de nașteri, 50% dintre copii murind în prima lună, iar restul până la 6 luni. Acest tip determină apariția sindromului Patau, caracterizat printr-un fenotip cu ochi mici, buze tăiate, polidactilie și malformații în sistemul nervos și cardiac.

Trisomia 18 (47, +18) sau sindromul Edwards, a fost descoperit în 1960, iar fenotipic se manifestă prin dezvoltare somatică redusă și întârziere mintală. Frecvența sindromului este de 1/8000 de nașteri, iar supraviețuirea este între 2 și 4 luni.

Trisomia 21 (47, +21) determină apariția sindromului Down, descris în 1866 de către L. Down, iar în 1959 s-a descoperit de către J. Lejeune că este vorba de o trisomie 21. Are o frecvență de 0,5 la toți produșii de concepție și 1/700 de nașteri. Persoanele afectate prezintă mongolism, anomalii cardiace, întărziere mintală, creștere întârziată, iar frecvența leucemiilor este de 15 ori mai mare decât la indivizii normali. Rareori depășesc vârsta de 50 de ani.

În concluzie, cele patru sindroame amintite mai sus sunt compatibile cu viața, dar indivizii ce prezintă aceste aberații sunt dignosticați cu retard mintal pe lângă semnele clinice specifice fiecărui sindrom (Constance, 2007).

Aneuploidiile heterozomale sunt întâlnite frecvent la nivelul populației umane, având un fenotip mai blând față de aneuploidiile autozomale. În această categorie intră sindroamele Turner, Klinfelter, XXX (Constance, 2007).

Sindromul Tuner (47, X) a fost descoperit în 1959, dar simptomele caracteristice au fost descrise în 1939 de către Henry Turner. Femeile cu un singur cromozom X și care nu posedă cromatină sexuală prezintă malformații cardiace, au statură mică și o dezvoltare sexuală rudimentară. Frecvența este de 1/10000 de nașteri, dar se consideră că 90-95% dintre embrionii XO mor înainte de naștere. Din totalitatea produșilor de concepție se consideră că 1% sunt 45X, iar cauza este fenomenul de nondisjuncție, mai ales la bărbați (75%).

Sindromul Klinefelter (47, XXY), la care simptomele fenotipice au fost prima oară descrise în 1942, dar fenomenul de trisomie caracteristic a fost descoperit în 1959. Frecvența maladiei este de 1/1000 de nașteri la băieți, iar persoanele afectate prezintă o slabă dezvoltare sexuală, o fertilitate redusă și o inteligență subnormală. O parte dintre persoanele afectate sunt mozaicuri genetice, cu linii celulare XXY și XY, iar nondisjuncția este de origine maternă în 60% dintre cazuri, iar vârsta înaintată a mamei constituie un factor de risc important (vezi figura 4).

Figura 4. Frecvența malformațiilor congenitale în funcție de vârsta mamei

Sursa: Cromozonii umani și originea genetică a omului, Raicu Petre, 1997

Anomalii cromozomale structurale

În timpul mitozei si meiozei pot avea loc erori care generează rearanjamente echilibrate și neechilibrate.

Pănă în prezent numărul de rearanjamente cromozomiale identificate depășește 4000, iar dacă se includ microdelețiile și duplicațiile cifra depășește 5000.

Anomaliile cromozomale structurale sunt reprezentate de:

Deleții – reprezintă fenomenul în care un cromozom își pierde o parte din materialul genetic (vezi figura 5).

Figura 5. Deleție intracromozomială

Sursa: http://www.synevo.ro/analiza-cromozomiala-in-sange-cariotip-constitutional/, accesat în data de 10.04.2014

Duplicații – prezența unei copii suplimentare de material genetic la nivelul unui cromozom. Acestă anomalie duce la apariția trisomiilor parțiale iar semnele clinice sunt mai severe cu cât porțiunea de material genetic duplicat este mai mare (vezi figura 6).

Figura 6. Duplicație pe brațul lung

Sursa: http://www.synevo.ro/analiza-cromozomiala-in-sange-cariotip-constitutional/, accesat în data de 10.04.2014

Inversii – reprezintă amplasarea unor segmente din cromozomi în alte poziții decât cele normale. Acest fenomen implică cel puțin două puncte de ruptura la nivelul cromozomului si poate fi paracentric sau pericentric.

Majoritatea inversiilor sunt echilibrate și prezintă semne clinice doar în momentul în care ruptura se produce în interiorul unei gene care perturbă sinteza genei respective.

În timpul meiozei există un risc crescut de erori, iar cei mai mulți purtători de inversie prezintă infertilitate sau pierderi precoce de sarcină datorită apariției unor produși de concepție cu dezechilibru cromozomial (Eberhard, 2007).

Există două tipuri cunoscute de inversii:

• Inversie paracentrică (vezi figura 7)

Figura 7. Inversie paracentrică

Sursa: http://www.synevo.ro/analiza-cromozomiala-in-sange-cariotip-constitutional/, accesat în data de 10.04.2014

• Inversie pericentrică (vezi figura 8)

Figura 8. Inversie pericentrică

Sursa: http://www.synevo.ro/analiza-cromozomiala-in-sange-cariotip-constitutional/, accesat în data de 10.04.2014.

Translocații clasice (reciproce) – proces în care este implicat unul sau mai mulți cromozomi neomologi, iar fiecare cromozom prezintă un singur punct de ruptura, segmentele rezultate schimbându-și locul intre ele rezultand astfel doi sau mai mulți cromozomi derivați. Majoritatea tranlocațiilor sunt echilibrate si apar semne clinice doar in momentul în care este implicată o genă structural (vezi figura 9) (Eberhard, 2007).

Figura 9. Translocație clasică

Sursa: http://www.synevo.ro/analiza-cromozomiala-in-sange-cariotip-constitutional/, accesat în data de 10.04.2014

Translocații Robertsoniene – este o variantă a translocației clasice și se produce între doi cromozomi acrocentrici prin fuziunea brațelor lungi ale acestora la nivelul centromerului cu pierderea ambelor brațe scurte (vezi figura 10).

Figura 10. Translocație Robertsoniană

Sursa: http://www.synevo.ro/analiza-cromozomiala-in-sange-cariotip-constitutional/, accesat în data de 10.04.2014

Izocromozomii- apar în urma unei erori de diviziune a centromerului, astfel sunt generate două copii ale unui singur braț, dar lipsind celălalt. În urma acestui fenomen rezultă doi cromozomi derivați, unul cu o duplicație inversată a brațului lung și un altul cu o duplicație inversată a brațului scurt (vezi figura 11). Dacă ambii izocromozomi sunt menținuți într-o celulă va rezulta o trisomie pentru cromozomul de baza, ceea ce este incompatibil cu viața. Dacă este menținut doar un izocromozom va rezulta o trisomie doar pentru unul din brațele cromozomului și o monosomie pentru celălalt braț (cel mai frecvent caz este monosomia brațului lung al cromozomului X – Sindromul Turner) (Constance, 2007).

Figura 11. Izocromozom

Sursa: http://www.synevo.ro/analiza-cromozomiala-in-sange-cariotip-constitutional/, accesat în data de 10.04.2014

Cromozomuii inelari apar în momentul în care se pierd ambele telomere, iar porțiunea rămasă fuzionează în vederea refacerii stabilitații cromozomiale (vezi figura 12).

Figura 12. Cromozom inelar

Sursa: http://www.synevo.ro/analiza-cromozomiala-in-sange-cariotip-constitutional/, accesat în data de 10.04.2014.

Cele mai cunoscute maladii apărute în urma restructurărilor cromozomiale sunt: sindromul Cri-du-Chat, sindromul Prader-Willi, sindromul Angelman.

Sindromul Cri-du-Chat este caracterizat de o deleție a brațului scurt al cromozomului 5, fenomen descoperit în 1963. Frecvența este de 1/100000 de copii născuți vii, iar copiii afectați prezintă întârziere mintală, defecte faciale, malformații gastrointestinale și dezvoltarea anormală a laringelui și glotei (din cauza malformației glotei emit un țipăt asemănător cu cel al pisicii).

Sindromul Prader-Willi este urmarea deleției unui mic fragment din brațul lung al cromozomului 15. Începând cu vârsta de 5-6 ani, copiii prezintă o poftă de mâncare anormală, de unde rezultă obezitate, diabet și alte probleme de sănătate, au dezvoltare fizică si psihică redusă, în special la sexul masculin și întârziere mintală. Frecvența sindromului este de 1/10000 – 1/25000, afectează în special băieții, mutația afectând genele cu funcție endocrină.

Sindromul Angelman apare prin mutații ale unor gene localizate pe cromozomul 15. Se manifestă prin probleme neurologice, dizabilități de dezvoltare, tremurături ale mâinilor și picioarelor, zâmbet și râs frecvent, crize epileptice, mers cu mâini ridicate, hipopigmentație.

Sindromul Prader-Willi și Angelman apar prin mutații ale unor gene localizate pe cromozomul 15, gene care oferă schița pentru caracteristicile omului. Fiecare om își primește genele în pereche de la părinți, iar în cazul acestor sindroame, partea feminină a cromozomului 15 lipsește, ambele gene fiind moștenite de la tată.

În concluzie, la om cariotipul a dobândit o mare stabilitate în cursul evoluției, din acest motiv variațiile numerice și structurale ale autozomilor și heterozomilor determină apariția unor maladii cromozomiale foarte grave, însoțite adesea de malformații ale diferitelor organe, de înapoiere mintală și de sterilitate.

Afectarea cromozomilor din grupele mari are consecințe mai grave decât a celor din grupele mici (pe cromozomii mari se găsesc dispuse mai multe gene a căror afectare poate avea consecințe negative sau letale).

S-a constatat că, o bună parte dintre produșii de concepție, care prezintă anomalii cromozomiale numerice sau structurale sunt eliminați în timpul vieții intrauterine prin avorturi spontane. Se consideră că avortul spontan acționează ca un mecanism selectiv.

Capitolul 2

SINDROAME ASOCIATE ANOMALIILOR STRUCTURALE

Microdeletiile sunt caracterizate prin fenotip clinic si comportamental complex care se datoreaza dezechilibrului genic intr-o anumita regiune cromozomala, ca urmare a unei deletii mai mici de 5 Mb.

Duplicatiile si deletiile sunt cunoscute sub denumirea generica de variante ale numarului de copii (copy number variants=CNV) și sunt cele mai frecvente variații structurale prezente în genomul uman (Merla 2010). Prin variantă a numărului de copii se înțelege un segment de ADN de 1 kpb sau mai mare care se găsește într-un număr variabil de copii față de un genom de referință.

Recent s-a demonstrat că aproximativ 5% din genomul uman este reprezentat de CNV-uri (Bailey 2002, McCarroll 2008). Aceste regiuni din genomul uman sunt în mod special predispuse la rearanjamente structurale, jucând un rol cheie în evoluția genomului și, în același timp, fiind una dintre cauzele importante ale unor maladii genetice umane (Stankiewicy 2002, Wain 2009 – din Merla 2010).

Cel mai bine studiat exemplu este asocierea dintre unele duplicații sau repetiții în număr redus de copii (LCR=low copy repeat) și sindroamele de microdeleție și microduplicație. Astfel, interacțiunea dintre regiuni cromozomale care conțin anumite secvențe repetate poate genera pierderea, adiția sau inversarea secvențelor situate între ele (Thomas 2006). În plus, când regiunea genomică respectivă conține gene a căror nivel de exprimare depinde de numărul copiilor răspândite în zone diferite din genom (dosage sensitive genes) sau gene imprintate, interacțiunea dintre LCR-uri poate genera maladii genetice specifice, după cum urmează:

deleția regiunii 5p13-5p15.2 duce la apariția sindromului Cri-du-Chat;

deleția regiunii 7q.11.23 duce la apariția sindromului Williams;

deleția regiunii 22q11 dă naștere sindroamelor DiGeorge și velocardiofacial;

deleția regiunii 15q11-q13 generează sindroamele Prader-Willi și Anghelman.

Mecanismul care stă la baza majorității acestor maladii genomice este recombinarea omologă non-alelică (non-allelic homologous recombination=NAHR) între LCR-uri greșit aliniate. Acest proces poate implica fie ambii cromozomi omologi (intercromozomală), fie cromatidele aceluiași cromozom (intracromozomală). NAHR pot avea loc fie pe cromozomul de origine maternă, fie pe cel de origine paternă, existând pentru anumite sindroame, diferențe în privința frecvenței cu care se manifestă acest mecanism la cele două sexe.

Recombinările non-alelice generează în egală măsură deleții și duplicații, așa încât pentru majoritatea regiunilor deletate pot fi identificate duplicații reciproce. Totuși, până în prezent, a fost caracterizat doar un număr redus de microduplicații, deoarece din punct de vedere tehhnic sunt mai greu de identificat, iar fenotipul asociat este de obicei mult mai blând și greu de definit.

În general, rearanjamentele cromozomale sub limita de detecție prin cariotipare convențională contribuie semnificativ la apariția retardului mental și a malformațiilor congenitale (Zang 2009 – din Merla).

2.1 Sindroamele asociate cromozomului 5

Cromozomul 5 este unul dintre cele 23 de perechi de cromozomi umani. Oamenii au în mod normal două copii al acestuia.

Cromozomul 5 are o anvergură de aproximativ 181 milioane de perechi de bază (blocuri de bază pentru ADN), și reprezintă aproape 6% din totalul de ADN din celule. Cromozomul 5 este unul dintre cele mai mari cromozomi umane, dar are unul dintre densitățile gena cea mai mică. Acest lucru este parțial explicat de numeroase regiuni de gene-săraci, care afișează un grad remarcabil de conservare non-codare si syntenic cu vertebratele non-mamifere, sugerând că sunt constrânse funcțional (vezi Figura 13).

Figura 13. Cromozomul 5

Sursa: http://genome.jgi-psf.org/chr5/chr5.home.html, accesat pe data de 24.04.2014.

Cromozomul conține aproximativ 1700 gene și perechi de bază de aproximativ 180 milioane, din care peste 95% au fost determinate.

Identificarea genelor la fiecare cromozom este un domeniu activ al cercetării genetice. Deoarece folosite de cercetători abordări diferite pentru a prezice numărul de gene pentru fiecare cromozom, numărul estimat de gene variază. Cromozomul 5 probabil, conține între 900 și 1.300 de gene.

Următoarele sunt câteva din genele situat pe cromozomul 5:

ADAMTS2: ADAM metallopeptidase cu thrombospondin de tip 1 motiv, 2

APC: Adenomatoză polyposis coli

EGR1: începutul creșterii răspuns proteine 1

DTDST: diastrophic displazie sulfat de transportator

ERCC8: excizia reparare cross-completând rozătoare repara deficit, complementation grupului 8

FGFR4: fibroblaste factorul de creștere receptorilor 4

GM2A: GM2 ganglioside activator

HEXB: hexosaminidase B (beta polypeptide)

MASS1: audiogenic monogenic, sechestrarea susceptibilitatea 1 homolog (mouse)

MCCC2: methylcrotonoyl-coenzima un carboxilază 2 (beta)

MTRR: ― reductaza 5-methyltetrahydrofolate-homocisteine methyltransferase

NIPBL: Nipped-B homolog (Drosophila)

NSD1: Transcrierea coregulator proteine

Pikachurin: Responsabil pentru funcționarea Sinapse panglică; permite ochi pentru a urmări obiecte în mișcare

SLC22A5: solutii transportator familie 22 (cationi organice transporter), membru 5

SLC26A2: solutii transportator familie 26 (sulfat transporter), membru 2

SMN1: supraviețuirea neuron motor 1, telomeric

SMN2: supraviețuirea motor neuron 2, centromeric

SNCAIP: synuclein, proteine interacționează alfa (synphilin)

TGFBI: keratoepithelin

TCOF1: Treacher Collins-Franceschetti sindrom 1

FGF1: de factorul de creștere fibroblaste 1 (factorul de creștere fibroblaste acide).

Sindromul Cri-du-Chat

Acest sindrom a fost descris pentru prima dată de către geneticianul Jerome Lejeune în anul 1963. Cercetătorul a observat că pacienții cu acest sindrom prezentau o deleție a brațului scurt al cromozomului 5. Numele sindromului vine de la plânsul copiilor, ce prezintă această anomalie, care seamănă cu mieunatul pisicilor.

Sindromul cri du chat este produs de monosomia parțială 5p-, banda 5p15 fiind absentă în toate cazurile. Genele implicate in apariția fenotipului caracteristic nu au fost încă descoperite, însă este cunoscut faptul că haploinsuficiența regiunii 5p15.2 determină majoritatea semnelor fenotipice, inclusiv retardul mintal iar haploinsuficiența regiunii 5p15.3 determină hipoplazia laringiană ce produce plânsul caracteristic.

Copii cu acest simptom prezintă încă de la naștere întârziere a creșterii și a dezvoltării, plânsul monoton, dismorfie cranio-faciala cu microcefalie, facies rotund, hipertelorism, epicantus, urechi jos înserate, micrognație, boltă palatină ogivală. Cu cât pacientul înainteaza în vârstă, dignosticul devine mai dificil deoarece plânsul caracteristic se atenuează iar dismorfia facială se modifică. Pacienții prezintă un retard mintal sever cu hiperactivitate, autoagresivitate, deficit al limbajului și alterări ale sistemului visual și auditiv, deseori fiind associate și malformații cardiace si genito-urinare.

Analiza citogenetică în cazul acestui sindrom relevă deleția 5p-, mărimea variind de la un pacient la altul, fiind cuprinsă in intervalul 5p13-5p15.2.

Acest sindrom evoluează cu un retard mintal sever iar rata mortalității fiind de aproximativ 10%. 90% din decesele provocate de acest sindrom survin în primul an de viață.

2.2 Sindroamele asociate cromozomului 15

Cromozomul 15 este unul dintre cele 22 de perechi de cromozomi umani, deci un autozom. Pe lângă cele 22 de perechi oamenii mai posedă și 2 cromozomi ai sexului (X și Y). In total în celulele omului sunt 46 de cromozomi. Oamenii au în mod normal o pereche de cromozomi 15, unul din aceștia provenind de la tată iar celălalt de mamă. Cromozomul 15 are o anvergură de aproximativ 100 milioane nucleotide (unitatea de baza a ADN-ului) în perechi, și reprezintă între 3% și 3,5% din totalul de ADN din celule.

Identificarea genelor la fiecare cromozom este un domeniu activ al cercetării genetice. Datorită diferitelor metode folosite de cercetători pentru a stabili numărul de gene pentru fiecare cromozom, acesta variază. Cromozomul 15, cel mai probabil, conține între 700 și 900 de gene (vezi Figura 14).

Figura 15. Cromozomul 15

Sursa: http://ro.wikipedia.org/wiki/Cromozomul_uman_15, accesat pe data de 24.04.2014

Sindromul Angelman este determinat de o deficiență a regiunii15q11-q13. Deleția la nivelul capătului proximal al brațului scurt al cromozomului 15 generează, în funcție de originea parentală, două sindroame distincte: Prader-Willi (PWS), când deleția este paternă și Angelman (AS), când deleția este maternă, întrucât regiunea critică conține mai multe gene imprintate.

Regiunea proximală a brațului lung a cromozomului 15 conține un cluster de LCR-uri, localizate la nivelul punctelor de rupere (breakpoints=BP) BP1-BP3, care flanchează un domeniu imprintat. Aceste puncte de rupere mediază diferite microdeleții și duplicații prin intermediul recombinării omoloage non-alelice (Locke 2004, Makoff 2007, Pujana 2002 din Burnside 2011). Thomas et al (2006) consideră că predominante pentru AS sunt predominante rearanjamentele intercromozomale, în timp ce pentru PWS ar exista un echilibru între cele intra și cele intercromozomale, deși, dacă se iau în discuție și alte cazuri din literatura se pare că cele mai frecvente sunt recombinările între cromozomii omologi. Cu toate acestea, există o tendință ca pentru delețiile de origine maternă rearanjamentele să fie intracromozomale.

Deleția clasică PWS/AS este flancată proximal fie de BP1 sau de BP2, iar distal de BP3 (vezi Figura 16). În general, indivizii cu deleție de tip I (BP1-BP3), au simptome mai severe, indiferent dacă au PWS sau AS (Burnside 2011).

Figura 16. Reprezentare schematică a regiunii 15q11-q13

Sursa: Tauber, 2006.

Regiunea BP1-BP2 se întinde pe aproximativ 500 kpb și conține 4 gene conservate (NIPA1, NIPA2, CYFIP1 și TUBGCP5), care nu sunt imprintate (Chai 2003 din Burnside 2011) (Figura 2). Trei dintre aceste gene sunt implicate în dezvoltarea/funcționarea sistemului nervos central, ceea ce explică severitatea diferită a simptomelor. De exemplu, gena NIPA1 este asociată cu paraplegia spastică (Goytain 2007 – din Burnside), iar gena înrudită NIPA2 a fost recent identificată ca transportor de magneziu, fiind puternic exprimată în sistemul nervos central (Goytain 2008). La rândul ei, gena CYFIP1 codifică o proteină prezentă în extractele sinaptosomale și interacționează cu produsul proteic al genei FMR1 care este responsabilă de sindromul X Fragil (Napoli 2008 – din Burnside).

În cazul sindromului Prader-Willi, 44% dintre cazuri se datorează deleției extinse (tip I), în timp ce 56% au deleție BP2-BP3 (tip II), aceste valorii fiind similare și pentru sindromul Angelman. BP1 este situat proximal față de locusul D15S541/S542, iar BP2 este situat între locii D15S541/S542 și D15S543. Cel de al treilea breakpoint este localizat telomeric, în apropiere de locusul P, implicat în hipopigmentare (Butler 2002).

AS este rezultatul unor diferite anormalități genetice precum: deleție a materialului de origine maternă (mai frecventă), disomie uniparentală (rară), defecte de imprinting sau mutatii ale genei UBE3A. De altfel, mutații la nivelul procesului de imprinting au fost observate pentru prima dată în AS Glenn 1993 – Ohta 1999). Astfel, la unii pacienți care nu prezentau nici deleția tipică, nici disomie uniparentală, a fost observată transmitere biparentală cu metilare ADN uniparentală și pattern de exprimare genic uniparental. Acești pacienți prezentau un defect de imprinting, datorat în unele cazuri (10-15%) unei deleții la nivelul unui element reglator, numit „centru de imprintare” (imprinting center=IC).

Pentru regiunea critică 15q11-q13 au fost, de asemenea, raportate duplicații, triplicații și tetrasomii (Butler 2002), cu grade diferite de manifestări clinice. În general, duplicațiile de origine maternă au fost asociate cu întârziere în dezvoltare și comportament autist, în timp ce, duplicațiile paterne nu au impact aparent asupra fenotipului pacientului. Duplicațiile materne și paterne au drept cauză, în egală măsură, rearanjamente intra și intercromozomale (Thomas 2006).

Sindromul Angelman este o boală genetică rară ce afectează 1 individ din 25.000, pacienții fiind caracterizati prin retard mental, comportamente caracteristice, precum și limitări severe în vorbire. Clinic, acest sindrom se manifestă prin retard intelectual și motor, ataxie, convulsii, dispoziție fericită, dimorfism facial care include: ochi adânciți în orbite, bărbie ascuțită, gura largă și zâmbitoare, brahicefalie.

Pacienții diagnosticați cu acest sindrom sunt foarte sociabili, au o atracție crescută pentru apă, prezintă tulburări ale somnului, iar in aproximativ 80-85% din cazuri apar și crizele de epilepsie. Pacienții adulți au o stare de sănătate generală bună deși sunt obezi, prezintă convulsii și scolioză.

Sindromul Angelman este determinat de o serie de probleme apărute în mecanismul genetic care interferă cu expresia genei UBE3A, genă responsabilă de sinteza proteinei ubiquin ligazei cu rol în degradarea proteinelor, fiind situată pe cromozomul 15. Aproximativ 70% din cazuri sunt rezultate ca urmare a deleției de novo materne, 25% prezintă mutații la nivelul genei UBE3A, restul cazurilor fiind rezultatul atât disomiei uniparentale paterne sau datorită unor defecte de imprinting (Kishno și colab., 1997).

Pacienții diagnosticați cu acest sindrom au nevoie permanentă de supraveghere, mai ales in copilărie datorită incapabilității de a face diferența între supt si înghițit.

Sindromul Prader-Willi

Sindromul Prader Willi este o anomalie cromozomială secundară absenței (deletiei) unor gene de pe cromozomul 15 moștenit de la tată sau disomiei materne a cromozomului 15 (ambii cromozomi 15 fiind moșteniți de la mamă).

Trăsăturile caracteristice sindromului Prader Willi sunt hipotonia neonatală, statura mică, mâinile și picioarele mici, obezitatea, retardul mintal și hipogonadismul.

Sindromul Prader Willi este o boală genetică rară cu o incidență de 1: 15 000 nou născuți, afectează ambele sexe și a fost identificată la toate rasele.

Exprimarea diferențiată a genelor in funcție de originea lor parentală se numește amprentare.

Sindromul Prader Willi cauzat de absența expresiei genelor paterne din regiunea cromo-zomială amprentată 15q11q13. Se cunosc mai multe gene din această regiune dar cauza precisă nu este elucidată.

70% din pacienți au o deleție a cromozomului 15 patern și 25% au ambii cromozomi 15 de la mamă. 5% au defecte ale centrului de amprentare și 1% au rearanjamente cromo-zomiale ale regiunii 15q11-q13.

Semne clinice

hipotonie severă în perioada de sugar

dificultăți de alimentare în primele luni de viață

alimentare excesivă

(hiperfagie =absenta sațietății)

obezitate dezvoltată gradual

deficiențe cognitive

fenotip comportamental particular

hipogonadism

statură mică

Metode de diagnostic

Diagnosticul clinic al pacienților cu sindrom Prader Willi este susținut de un scor clinic de diagnostic obținut din evaluarea unor criterii majore și minore:

– minim 5 puncte ( 4 din criterii majore) până la vârsta de 3 ani;

– minim 8 puncte (5 din criterii majore) după vârsta de 3 ani.

Diagnosticare

Criterii majore ( 1 criteriu = 1 punct)

• Hipotonie neonatală și infantilă, supt dificil

• Dificultăți de alimentare, greutate mică

• Creștere rapidă și excesivă a greutății între 1-6 ani

• Hiperfagie (absența sațietății)

• Facies caracteristic: îngustarea diametrului bifrontal, ochi migdalați, gură mică cu buză superioară subțire, comisuri bucale coborâte

• Hipogonadism, dependent de vârstă

• Retard mintal moderat

Criterii minore (2 criterii = 1 punct)

• Scăderea intensității miscărilor fetale;

letargie infantilă sau plânset slab, corectate cu vârsta

• Tulburări comportamentale: accese de furie, reacții violente, atitudine obsesivă, tendințe spre argumentare, opoziție, rigiditate, posesivitate, încăpățânare, mint, fură

• Tulburări de somn sau apnee în timpul somnului

• Statură mică, Hipopigmentarea părului și a pielii

• Mâini mici, picioare mici, mâini înguste, în continuarea liniară a cubitusului

• Anomalii oculare: ezotropie, miopie

• Salivă vâscoasă, cruste ale comisurilor bucale

• Defecte de articulare a cuvintelor, ciupirea pielii (Skin picking)

Suspiciunea clinică de diagnostic trebuie urmată de studiul microscopic citogenetic (cariotip) pentru identificarea unei deleții sau a unor rearanjamente cromo-zomiale care implică regiunea 15q11.2q13.

În absența unor modificări vizibile la nivelul cariotipului se indică efectuarea testelor moleculare (test FISH->, teste de metilare) pentru certificarea diagnosticului clinic de Sindrom Prader Willi.

Părinții pacientului cu sindrom PW sunt sănătoși.

Riscul de recurență depinde de mecanismul cauzal al sindromulu; datorită complexității cauzale a sindromului este necesar un sfat genetic individualizat fiecărui caz în parte.

Părinții cu un copil cu sindrom PW cauzat de deleția regiunii critice sau de disomia uniparentală maternă a cromozomului 15 au un risc mai mic de 1% de a mai avea încă un copil afectat.

În cazul unui defect al centrului de amprentare riscul de recurență este de 50%.

Majoritatea pacienților cu sindrom PW nu se reproduc, dar riscul de a avea un copil afectat cu sindrom Prader Willi (daca tatăl este afectat) sau cu sindrom Angelman (dacă mama este afectată) este de 50%.

Diagnosticul prenatal al sindromului Prader Willi este posibil și este indicat doar după confirmarea mecanimului genetic a cazului index și acordarea sfatului genetic privind riscul de recurență.

Diagnosticul prenatal se indică pentru cuplul cu un copil afectat prin defecte de amprentare și în cazul translocațiilor echilibrate cu punct de ruptură în regiunea critică, datorită riscului crescut de recurență.

Pacienții cu sindrom Prader Willi ajung adesea la vârsta adultă dar, datorită complexității afecțiunii, necesită îngrijiri particulare și multidisciplinare.

În perioada de sugar hipotonia se soldează cu supt dificil și retard motor. Tehnici speciale de alăptat, gavajul trebuie adaptate pentru a asigura o nutriție adecvată. Terapia fizică poate îmbunătăți statusul muscular. Criptorhidia se poate rezolva spontan sau necesită intervenție terapeutică hormonală sau chirurgicală. Strabismul necesită corecție oftalmologică.

La vârsta adultă obezitatea este elementul principal al morbidității fiind răspunzătoare de deficiențele cardio-pulmonare, diabetul zaharat tip II, tromboflebite, edeme cronice.

Posibilități de tratament, îngrijire și urmărire

În copilărie, terapia cu hormon de crestere 1mg/ m2 normalizează greutatea și duce la creșterea masei corporale.

Se recomandă monitorizarea apariției sau accentuării scoliozei.

Monitorizarea greutății, instituirea unei diete și a unui program de exerciții fizice sunt absolut necesare în contextul hiperfagiei care se poate solda cu obezitate.

Deficiențele de vorbire trebuie evaluate iar instituirea unui program educațional îmbunătățește statusul comportamental.

Tulburările de comportament se pot accentua la pubertate și vârstă adultă, terapia medicamentoasă cu inhibitori de serotonină fiind necesară.

Posibilități de tratament, îngrijire și urmărire

Terapia cu calciu este eficientă pentru prevenirea osteoporozei.

Tulburările de somn pot beneficia de terapie medicamentoasă.

Evitarea obezității prin dietă, exerciții și programe instituite precoce în prima copilărie se soldează cu o longevitate normală.

Hiperfagia nu poate fi controlată medicamentos.

Manifestările psihotice maniaco depresive pot apare la adult și necesită evaluare și terapie psihiatrică individualizată.

Sindromul Angelman

Sindromul Angelman este o tulburare genetică complexă care afectează în primul rând sistemul nervos. Caracteristicile acestei condiții includ întârzierea dezvoltării, dizabilitatea intelectuală, deteriorarea severă a vorbirii și probleme cu mișcarea și echilibrul (ataxia).

Cei mai mulți copiii afectați prezintă leziuni recurente (epilepsie) și microcefalie (malformație a oaselor craniului caracterizată printr-o micșorare excesivă a capului în raport cu perimetrul cranian). Întârzierea în dezvoltare devine observabilă la bebelușii între 6 și 12 luni și alte semne și simptome comune care apar de obicei în copilărie.

Copiii cu sindromul Angelman au un comportament care se manifestă prin veselie, zâmbet permanent și mișcări de fluturare ale mâinilor. Hiperactivitatea și atenția diminuată sunt semne comune ale bolii. Cei mai mulți copii au dificultăți cu perioadele de odihnă în sensul că au nevoie de mai puține ore de somn decât copiii normali. Unii indivizi care prezintă sindromul Angelman au tenul alb și părul deschis la culoare.

Odată cu vârsta, pacienții cu sindromul Angelman devin din ce în ce mai puțin nervoși iar problemele cu somnul tind să se amelioreze. Oricum, indivizii afectați continuă să aibă, pe parcursul vieții, dizabilități intelectuale, afecțiuni severe în ceea ce privește vorbitul dar și alte leziuni. Adulții care prezintă sindromul Angelman prezintă caracteristici faciale distincte care sunt descriși drept “rugoase”. Alți pacienți pot dezvolta scolioză (afecțiune în care coloana vertebrală este deviată în plan frontal). Speranța de viață a pacienților care prezintă sindromul Angelman pare să fie normală. Acesta afectează un pacient din circa 12.000 – 20.000 de persoane.

Multe dintre caracteristicile sindromului Angelman apar ca urmare a pierderii capacității de funcționare a genei UBE3A. Oamenii moștenesc în mod normal o copie a genei UBE3A de la fiecare părinte. Ambele copii ale genei devin active în multe din țesuturile corpului. În unele zone ale creierului doar copia moștenită de la mamă (copia maternă) este activă. Această activare specifică a genei parentale este cauzată de un fenomen care poartă numele de întipărire genomică. Dacă copia maternă a genei UBE3A se pierde din cauza unei schimbări cromozomiale sau a unei mutații genetice, persoana respectivă nu va avea copii active ale genei în anumite părți ale creierului.

Câteva mecanisme genetice diferite pot contribui la inactivarea sau ștergerea copiei maternale a genei UBE3A. Multe cazuri de sindrom Angelman (circa 70%) apar când un segment al cromozomului maternal 15, care conține această genă, este șters. În alte cazuri (circa 11%), sindromul Angelman este cauzat de o mutație în copia maternală a genei UBE3A.

În puține cazuri, o persoană cu sindromul Angelman moștenește două copii ale cromozomului 15 de la mamă sau de la tată, în loc de o singură copie de la fiecare părinte. Acest fenomen poartă numele de disomie uniparentală. Rar, sindromul Angelman poate fi cauzat, de asemenea, de o rearanjare cromozomială ce poartă numele de translocație sau de o mutație sau alt defect din regiunea ADN care controlează activarea genei UBE3A sau a altor gene din cromozomul maternal 15.

O ștergere a genei OCA2 este asociată cu nuanța deschisă a părului și cu pielea albă la persoanele care suferă de sindromul Angelman. Gena OCA2 este localizată pe segmentul cromozomului 15 care este șters de obicei la persoanele care prezintă această tulburare genetică. Proteina produsă din această genă ajută la determinarea pigmentării pielii, a părului și a ochilor. Cauzele apariției sindromului Angelman sunt necunoscute pentru 10-15% din indivizii afectați. Schimbările care includ alte gene sau cromozomi pot fi responsabile pentru tulburarea genetică de la acești indivizi.

În cele mai multe cazuri sindromul Angelman nu este moștenit, mai ales la persoanele care prezintă o ștergere a genei din cromozomul maternal 15 sau care au disomie uniparentală. Aceste schimbări geentice apar la întâmplare în timpul formării celulelor reproductive (ouă și spermă) sau în timpul dezvoltării timpurii a embrionului. Nu există un istoric medical al familiei pentru acestă afecțiune

Foarte rar, o schimbare genetică responsbilă pentru apariția sindromului Angelman poate fi moștenită. Este posibil, de exemplu, ca o mutație în gena UBE3A sau în regiunea din apropierea ADN-ului care controlează activarea genei, să fie transmisă de la o generație la alta.

Sfaturi genetice pentur viitori părinți

Majoritatea cazurilor cu sindrom Prader-Willi și Angelman sunt sporadice, părinții pacienților cu astfel de sindroame sunt sănătoși. Riscut de recurență depinde de mecanismul cauzal al sindroamelor și datorită complexității cauzale a acestor sindroame sunt necesare sfaturile genetice.

Acestea au ca scop asigurarea sanătății genetice a populației umane viitoare.

Se acordă părinților sau tinerilor care vor să-și întemeieze o familie și vor să știe dacă se supun riscului de a avea copii afectați de o boală ereditară mai ales dacă s-au întâlnit cu una din situații:

-unul din părinți suferă de o maladie ereditară sau au avut în ascendență asemenea cazuri;

-părinții au deja un copil afectat;

-între părinți există un anumit grad de rudenie.

Prin diagnoza prenatală/amniocenteză/ecografie se poate preîntâmpina apariția nou-născuților cu maladii genetice.

Majoritatea pacienților cu astfel de sindroame nu se reproduc, dar riscul de a avea un copil afectat cu sindrom Prader-Willi (dacă tatăl este afectat) sau cu sindrom Angelman (dacă mama este afectată) este de 50%.

Este bine de știut faptul că aceste maladii ereditare pot apărea din cauze naturale, hazardul spunându-și cuvântul., sau mai rar din cauza unui partener care se supune conștient /inconștient acțiunii factorilor mutageni.

Capitolul 3

METODE DE INVESTIGARE A SINDROAMELOR

Aceste metode pot fi clasice (FISH) sau cu ajutorul microsateliților STR (amprente ADN).

3.1 Citogenetica

Genetica apare ca știință in anul 1865 când Gregor Mendel introduce conceptul de factor ereditar și formulează legile mendeliene ale eredității.

La începutul secolului XX, Thomas Hunt Morgan (premiul Nobel pentru genetică) formulează teoria cromozomială a eredității. În anul 1902 Archibald Garrod începe studiul primelor “erori înnăscute de metabolism” (albinismul, cistinuria, pentozouria) transmise ereditar conform legilor mendeliene.

Apariția geneticii medicale a fost corelată cu stabilirea de către de Linus Pauling a faptului că anemia hemolitică cu hematii în seceră (drepanocitoză) este o boală ereditară și este produsă de un tip de hemoglobină anormală (Hb S), diferită de cea normală (Hb A) prin înlocuirea unui singur aminoacid. Jerome Lejune descoperă în 1959 prima anomalie cromozomală la om, respectiv trisomia 21 și stabilește că aceasta este cauza sindromului Down.

Citogenetica este o ramură a geneticii care se ocupă cu studiul cromozomilor, analizând:

modul de organizare;

compoziția chimică;

rolul cromozomilor în timpul ciclului celular;

localizarea genelor pe cromozomi;

corelarea aspectelor morfologice și structurale ale cromozomilor cu diverse boli cu transmitere genetică, inclusiv în cancerogeneză.

Citogenetica a cunoscut în decursul timpului o evidentă dezvoltare. Astfel, a apărut citogenetica umană, clinică, obstetricală etc.

Citogenetica umană este destinată cunoașterii structurii, morfologiei și comportamentului normal al cromozomilor pentru înțelegerea mecanismelor care stau la baza eredității. Citogenetica clinică studiază aspectele legate de determinismul cromozomial. Citogenetica obstreticală este o ramură a citogeneticii ce studiază cariotipul fetal și stabilirea dignosticului prenatal (Maximilian, 1996) .

Citogenetica este extrem de importanta în descoperirea structurii, numărului și morfologiei normale a cromozomilor.

Testarea citogenetică este foarte importantă deoarece prin intermediul ei se pot identifica o mare varietate de aberații cromozomale care stau la baza anomaliilor fenotipice. Astfel, determinarea variantelor ce diferă de pattern-ul standard al cromozomilor umani este absolut neccesar.

De-a lungul timpului citogenetica a trecut prin mai multe etape, după cum urmează:

Era neagră (1923-1952)

Începe în secolul XX, la vremea când cromozomii erau studiați pe secțiuni histologice;

Painter a declarat un număr de 48 de cromozomi la om, în anul 1923;

În anul 1952, cu ajutorul tehnicii „squash” Levan și Hauschkaau evidențiat cromozomii din tumora ascitică de la șoareci (Simionescu, 2005).

Era hipotoniei (1952-1958)

Se separă cromozomii și se mărește volumul celular prin folosirea soluțiilor hipotone;

În anul 1956, Levan si Tjio studiază celulele din țesutul de plămân embrionar si stabilesc numărul de 46 de cromozomi. De asemenea, Ford si Hamerton au evidențiat cromozomii din celulele spermatocite umane (Simionescu, 2005).

Era trisomiei (1958-1960)

În 1958 Rothfels și Siminovitch au uscat cromozomii direct pe lame de microscop;

În anul 1959 au loc mai multe descoperiri: Lejeune a observat 3 copii ale cromozomului 21 in sindromul Down; Ford descoperă relația dintre sindromul Turner si monosomia X; Jacobs și Strong descoperă sindromul Klinefelter. Se stabilește că sexul masculin este dat de cromozomul Y indiferent de numărul de cromozomi X;

Un an mai târziu este descoperă trisomia 13 de către Patau, iar Edwards descrie trisomia 18. Tot în acest an, Nowell si Moorhead crează tehnica cultivării celulare folosind limfocite din sângele periferic (Simionescu, 2005).

Era bandării

În 1970 Caspersson aplică microscopia fluorescentă pentru bandarea Q;

În anul 1971 Drets și Show utilizează colorantul Giemsa pentru bandare;

1974 – bandează prometafaze;

În 1976 Latt folosește bromodeoxiuridina pentru evidențierea replicării târzii și pune bazele studierii exschimburile dintre cromatidele surori. Tot în acest an, Yunis introduce bandarea de inalta rezolutie (Simionescu, 2005).

Era hibridizării fluorescente in situ (FISH)

FISH este o tehnică ce permite vizualizarea simultană a naturii chimice, structurii si funcției cromozomilor prin îmbinarea tehnicilor moleculare cu cele ale citogeneticii. Aceasta reprezintă cea mai avansată tehnice de dignostic a anomaliilor cromozomale. În a doua jumătate a decadei anilor 1980, citogenetica a beneficiat de aplicarea relativ uzuală a hibridizării fluorescente in situ (FISH) cu probe de ADN α-satelit, sau centromeric (CEP), cu probe cosmidice locus-specifice de inserție (LSI) și cu sonde de numerotate a cromozomilor;

Tot la sfârșitul anilor 1980 s-au introdus sonde de colorare specifică pentru cromozomi întregi denumite paint, care au devenit extrem de importante în laboratoarele de citogenetică. S-au realizat astfel sonde pentru fiecare telomeră umană, pentru diferite benzi cromozomiale, pentru secvențe specifice genelor, pentru microdeleții, etc. Sondele de ADN marcate fluorescent pentru cromozomi întregi au fost definite prescurtat WCP (Whole Chromosome Paint = WCPs). Folosirea FISH cu WCPs este utilă în special pentru elucidarea anomaliilor cromozomiale structurale complexe. Tehnica FISH combinată WCP are multiple aplicații;

Între timp au fost create biblioteci de ADN pentru cromozomi individuali, din clone ale fragmentelor de restricție rezultate prin digestie completă cu endonucleaze;

Se poate afirma că rapiditatea progresului în citogenetică moleculară este invers proporțional cu potențialul de cuprindere documentară a celor care lucrează în acest domeniu (Human Cytogenetics , 2001) (Simionescu, 2005).

În mod sigur persoanele neavizate în acest domeniu se întreabă de ce în ultimii ani cunosțințele privind citogenetica medicală au devenit tot mai variate și din ce în ce mai importante.

În primul rând, trebuiesc cunoscute rolurile factorilor genetici ce participă la edificarea și funcționarea normală a fiecărui organism în parte. Deoarece se cunosc peste 10.000 de boli determinate sau condiționate genetic, este neapărată nevoie de tehnici speciale pentru indentificarea cu mare finețe a fiecaruia dintre ele, fapt care a dus la apariția geneticii medicale.

Citogenetica medicală are drept scop diagnosticarea și îngrijirea pacienților cu boli genetice, dar și a familiilor acestora prin indermediul sfaturilor genetice de specialitate. Numai în România se nasc anual aproximativ 7.200 de copii cu anomalii cogenitale, 12.000 de oameni sunt afectați de boli genetice înainte de 25 de ani, de aceea nevoia de informare a polulație, de apariție a noilor tehnici și a aparaturii de detecție a anomaliilor, dar și a personalului specializat a crescut considerabil în ultimii ani (Covic, 2011).

Testele genetice moleculare, metabolice sau cromozomiale pun un dignostic cert într-un număr din ce în ce mai mare de boli. Deoarece mutațiile pot fi transmise și descendenților, rolul citogeneticii crește în cunoașterea exactă a anomaliei și în probabilitatea acesteia de a fi transmisă sau nu moștenitorilor.

Profilaxia bolilor se poate realiza prin screening genetic prenatal, postnatal sau populațional, scopul find acela de a recunoaște din timp aceste afecțiuni și de a informa persoanele implicate.

În ciuda tuturor tehnicilor moderne de citologie medicală și a cunoștințelor avansate în acest domeniu, bolile genetice nu pot fi tratate deoarece ele sunt produse de modificări ale cromozomilor prezenți în fiecare celulă, totuși există posibilitatea de a trata simptomele, recent dezvoltându-se terapia de modulare a expresiei genice sau terapia genică. Această terapie presupune introducerea unei gene normale în celulele somatice ale pacienților, genă care poate ameliora efectul genelor mutante.

3.2 Tehnici/Metode folosite în citogenetică

Pentru evidențierea anomaliilor structurale sau numerice sunt necesare unele tehnici de prelucrare a cromozomilor, precum bandările: G, R, Q, Nor, etc., dar și tehnici mai moderne, precum tehnica FISH, microsateliți STR (amprente ADN).

3.2.1 Tehnici de bandare

Bandarea G

Bandarea G sau bandarea Giemsa este o tehnică utilizată in citogenetică pentru a vizualiza cromozomii prin colorarea acestora cu colorantul Giemsa. Este o tehnică utililă pentru vizualizarea anomaliilor genetice prin intermediul reprezentării grafice.

Tehnica constă în digerarea parțială a cromozomilor metafazici cu ajutorul tripsinei si colorarea imediată cu Giemsa. Cu ajutorul microscopiei optice se pot observa benzi intunecate heterocromatice, regiuni bogate in adenină și timină, alternând cu cele mai luminate sau eucromatice (vezi Figura 17).

Bandarea este folosită pentru a evidenția anormalitățile cromozomale precum translocațiile, delețiile, duplicațiile sau inversii deoarece fiecare cromozom are o dispoziție unică a benzilor (Covic, 2011).

Figura 17. Cromozomi metafazici în bandarea G

Sursa:http://web.udl.es/usuaris/e4650869/docencia/practiques_online/cariotips/nous_cariotips/metodes/giemsaStain1.html, accesat în data de 25.04.2014

Bandarea R

Numele de bandare R provine de la „Reverse” deoarece benzile Q sau G au o dispoziție inversă. Această tehnică se obține prin denaturarea termică controlată (85oC) a preparatelor în soluție salină, după care se vor colora cu soluție Giemsa sau cu coloranți specifici pentru regiunile bogate in GC. Benzile astfel rezultate se numesc benzi pozitive, ele corespunzând benzilor G sau Q negative (Covic, 2011). (vezi Figura 18)

Figura 18. Cromozomi metafazici în bandarea R

Sursa: http://www.chromoresearch.co.jp/e/chromosome/index.html, accesat în data de 25.04.2014

Bandarea Q

Bandarea Q este o tehnică ce utilizează un flourocrom pentru a colora regiunile bogate în AT ale cromozomilor. Benzile astfel obținute au aceeași distribuție ca și Benzile din cadrul bandării G. Tehnica este foarte utilă în analiza cromozomului Y deoarece evidențiază zona heterocromatinică a brațului lung.

Această tehnică prezintă unele dezavantaje, precum: necesitatea unui echipament microscopic special pentru vizualizarea benzilor și timpul scurt de păstrare a probelor datorită fluorocromilor (Covic, 2011). (vezi Figura 19)

Figura 19. Cromozomi metafazici și cariotip în bandarea Q

Sursa: http://www.chromoresearch.co.jp/e/chromosome/index.html, accesat în data de 24.04.2014

3.2.2 Tehnica NOR

Tehnica NOR este o tehnică specială folosită în studiul modificărilor apărute în structura cromozomilor, pentru a evidenția regiunile organizator nucleolare, pentru a defini mai bine unele subseturi de benzi care nu apar în alte tehnici de bandare. Această tehnică se realizează cu ajutorul bromdeoxiuridinei care este un analog sintetic al timinei (Covic, 2011). (vezi Figura 20)

Figura 20. Cromozomi metafazici în bandarea NOR

Sursa: http://www.chromoresearch.co.jp/e/chromosome/index.html, accesat în data de 24.04.2014

3.2.3 Hibridizarea flouorescentă in situ (FISH)

Tehnica FISH a fost pusă la punct de Pardue si Gall în anul 1969. Ei utilizau sonde ce conțineau nucleotide marcate radioactiv, semnalul obtinut dupa hibridizare fiind detectat cu ajutorul autoradiografierii. Deoarece în acea perioada clonarea pozițională nu era posibilă, hibridizarea in situ era limitată la secvente care puteau fi purificate si izolate prin tehnici convenționale (ex. se identifica ADN satelit de soarece, ADN viral, ARNr).

După cercetarile desfășurate de Gall si Pardue, sondele fluorescente le-au înlocuit pe cele radioactive in realizarea tehnicii FISH deoarece prezentau o mare siguranță a manipulării, earu mai mult mai stabile și puteau fi detectate mai ușor (Rudkin GT.,1977).

Hibridizarea fluorescenta în situ (FISH) este o tehnică de citogenetica moleculară prin care se urmărește detectarea unor anomalii cromozomiale, care nu pot fi identificate cu precizie prin cariotipul convențional. Este utilizată în cazul suspiciunii clinice sau citogenetice (prin cariotip) a anomaliilor de structură ale cromozomilor: microdeletii sau microduplicatii, translocații, sau pentru identificarea cromozomilor marker. FISH-ul pe nuclei interfazici (utilizat mai ales în diagnosticul prenatal) stabilește sexul genetic și poate detecta anomalii numerice (aneuploidii) cromozomiale.

Acestă metodă se bazează pe capacitatea unei sonde de a se lega complementar la o secvență de interes de pe cromozomul țintă. Sonda este marcată cu un agent florocrom capabil să devină vizibil la microscopul de fluorescent (vezi Figura 21).

Această metodă permite indentificarea secvenței de interes , numărul de copii sau poziția acesteia pe cromozom (Covic, 2011).

Figura 21. Etapele tehnicii FISH

Sursa: http://www.google.ro/imgres?q=fluorescence+in+situ+hibridization, accesat în data de 25.04.2014

Marcarea sondelor se poate realiza atât pe care directă dar și prin utilizarea reacțiilor imunologice.

În cazul marcării directe, sonda conține florocromul ce poate fi detectat la microscop, alte etape de marcare nemaifiind necesare.

Moteda de marcare indirectă presupune folosirea unor sonde marcate cu un receptor ce poate fi recunoscut specific de un anticorp. Pentru această metodă se folosește marcarea cu DIG/biotină.

Sondele folosite în tehnica FISH diferă in funcție de rezultatul dorit, astfel:

Sonde specifice unui cromozom (multicolor) – permit marcarea unui cromozom sau doar a unei regiuni din acesta. Prin colorarea mai multor cromozomi, se pot identifica foarte ușor dacă aceștia sunt implicați in rearanjări. Inițial, sondele specifice ficărui cromozom sunt marcate cu un florocrom care va genera o culoare specifică unui singur cromozom. Ulterior, cromozomii sunt marcați cu aceste sonde putându-se astfel identifica cromozomii normali, colorați uniform (vezi Figura 22) și cromozomii ce prezintă rearanjări strucuturale intre ei, prezentând un aspect multicolor.

Figura 22. FISH multicolor

Sursa: www.lumc.nl/con/1050/85468/812090046152537/, accesat în data de 25.04.2014

Sonde specifice unui locus, pentru identificarea deletiilor sau duplicatiilor submicroscopice (care nu sunt vizibile utilizând cariotipul convențional). Absența semnalului fluorescent corespunzător sondei pe un anumit cromozom, înseamnă deletia (absența) zonei respective. Apariția a doua semnale diferite corespunzătoare sondei, indică o microduplicatie. Aceste sonde sunt folosite și pentru identificarea punctelor de ruptură cromozomiale în cazul translocațiilor (anomalii de structură care presupun un schimb de fragmente între doi sau mai mulți cromozomi).

Sonde centromerice – sunt utilizate în identificarea rapidă a unui cromozom sau în identificarea anomaliilor numerice ale acestuia.

Sondele telomerice permit diagnosticarea microdeletiilor sau altor rearanjamente criptice.

Sonde subtelomerice

Astfel de sonde pot fi utile în diagnosticarea sindroamelor produse prin microdeletii sau microduplicatii cromozomiale: Williams, Beckwith-Wiedemann, Prader-Willi, Angelman, velo-cardio-facial (Di George), cat-eye etc. Fenotipul acestor sindroame include dismorfie facială, retard mental și diverse malformații.

În concluzie, FISH-ul metafazic aduce în plus față de cariotip sau de FISH-ul interfazic detalii despre anomaliile de structura ale cromozomilor. Întrucât aceasta metodă presupune că prima etapă de lucru, obținerea unor culturi celulare (limfocite din sânge periferic sau amniocite recoltate prin amniocenteza în săptămânile 15-17 de sarcină), intervalul minim pentru diagnostic este de două săptămâni.

Hibridizarea fluorescenta în situ (FISH) este o tehnică de citogenetică moleculară utilizată în scopul identificării anomaliilor cromozomiale, numerice și structurale (care nu pot fi detectate prin cariotipare).

Principiul acestei metode constă în atașarea la secvența-țintă a unei sonde de ADN monocatenar (de circa 40 kb), marcată fluorescent, pe baza complementarității, de o secvență-țintă a unui cromozom. Hibridizarea sondei cu ADN-ul celular este vizualizată la microscopul cu fluorescență echipat cu filtre de excitație și emisie, ceea ce permite citirea semnalelor specifice zonei-țintă. Se numără și se analizează semnalele prezente în o sută de celule (de ex., trei semnale fluorescente specifice pentru cromozomul 21 indică sindromul Down).

Tehnica FISH permite detectarea mozaicismelor, identificarea rearanjărilor cromozomiale complexe.

Mai multe sindroame dismorfice (sindromul Williams, Prader Willi, Angelman, Di George) produse de microdeleții sau microduplicații, suspectate clinic, imposibil de observat prin tehnicile citogenetice convenționale, pot fi evidențiate prin FISH metafazic (vezi Figura 23). Întrucât această metodă presupune că primă etapă de lucru obținerea unor culturi celulare (limfocite din sânge periferic sau amniocite recoltate prin amniocenteză în săptămânile 15-17 de sarcină), rezultatul investigației este obținut în două săptămâni.

FISH-ul interfazic (vezi Figura 24) permite punerea în evidență a anomaliilor numerice, detecția sexului genetic într-un timp scurt (48-72 h). Se realizează pe nuclei interfazici fără să fie nevoie de efectuarea de culturi celulare. Se folosesc sonde de ADN corespunzătoare regiunilor centromerice ale cromozomilor 18, X, Y (CEP18, CEPX, CEPY), respectiv sonde locus specifice pentru cromozomii 13 și 21 (LSI13, LSI21). Metodă este mai puțin informativă în cazul contaminării cu celule materne (comparativ cu alte tehnici).

Analiza FISH este o metodă specifică, performantă, dar laborioasă, care necesită celule intacte; nu se substituie celorlalte metode de analiză cromozomială și are indicații foarte precise. FISH-ul interfazic este indicat a fi folosit ca test de screening rapid atunci când există semne de alertă ecografică sau biochimică (dublu test, triplu test), iar ulterior se recomandă o evaluare citogenetică completă.

Figura 23. FISH metafizic Figura 24. FISH interfazic

Prader Willi del (15) (q11-q13) Trei semnale roșii indică trisomia 21 (Down)

2.1.4 Amprenta genetică/microsateliți STR

Ideea de a identifica oamenii pe baza caracteristicilor genetice nu este nouă. Grupele sanguine ABO, descoperite în 1900 de Karl Landsteinerr, au constituit primul marker genetic folosit în criminalistică, la care s-au adăugat grupele sanguine MN (1927) și factorul Rhesus (1937).

În anii 1970 și ‘80 s-au făcut progrese, analizându-se diferitele forme ale unor enzime (izoenzime) din hematii și ser sanguin. Certitudinea că proba provenea întradevăr de la suspect depindea de numărul de proteine analizate (de obicei patru); această certitudine se numește capacitate de discriminare. Capacitatea de discriminare oferită de aceste tehnici combinate este de numai 1:1000, mai bună decât capacitatea de 1:10 a analizei grupelor sanguine, dar încă nu suficient de bună. Pentru a obține o discriminare mai bună, era nevoie să ne analizăm mai amănunțit structura genetică.

Genomul uman este constituit din 46 perechi de cromozomi: 23 de la mamă, 23 de la tată. Avem, așadar, câte doi din fiecare cromozom (excepție – în cazul bărbaților – cromozomii sexuali) și, astfel, două copii ale fiecărei gene.

Componentul principal al cromozomilor este acidul deoxiribonucleic (ADN), care conține informații pentru producerea proteinelor necesare vieții. Totuși, din cele 3 miliarde de perechi de baze (pb), numai aproximativ 4% codifică proteine, restul sunt adesea doar de „umplutură” constând din secvențe repetitive organizate în aglomerări (clusters). Dacă se compară ADN-ul a două persoane, el este identic în cea mai mare parte, variabilitatea găsindu-se mai ales în aceste secvențe repetitive.

La persoane diferite aceste secvențe sunt repetate de un număr diferit de ori: o persoană poate avea cinci repetiții într-un locus (situs) ADN specific, altă persoană poate avea șapte. Folosind probe, de ex. din sânge sau spermă, putem analiza secvențele repetitive din mai mulți loci ADN; această analiză se numește amprentă genetică. La fel ca amprentele digitale, amprentele genetice pot fi folosite pentru identificarea persoanelor.

Deși termenul ‚amprentare genetică’ (sau identificarea profilului genetic) este folosit curent, nu toată lumea știe că el cuprinde două tehnici foarte diferite, dintre care numai una este folosită curent în practica criminalistă. Amprentarea genetică timpurie: polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție.

Prima metodă de amprentare genetică a fost inventată în 1984 de Alec Jeffreys, are a folosit secvențele ADN cunoscute ca ‘număr variabil de repetiții în tandem’ (VNTR – variable number tandem repeats; de ex. Secvența D1S80, (AGGACCACCAGGAAGG)n). Aceste secvențe, cu 10-100 pb per repetiție, pot fi analizate folosind enzime de restricțiec, care funcționează ca foarfeci moleculare și taie ADN-ul la nivelul unor secvențe specifice (secvențe de recunoaștere). În întregul genom, o secvență de recunoaștere de 6 pb apare de circa 730 000 de ori.

Asta înseamnă că, dacă se taie genomul cu o anumită enzimă de restricție, se obțin aproximativ 730 000 fragmente de restricție de lungimi diferite. Și aici devin importante VNTR-urile: numărul de repetiții într-o aglomerare VNTR particulară poate varia între indivizi, ceea ce înseamnă că și lungimea fragmentelor respective de restricție este diferită între indivizi (vezi Figura 25). Numim acest fenomen polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție (RFLP – restriction fragment length polymorphism).

Figura 25. Prezentarea a două VNTR de la două persoane diferite

Situsurile tăiate de enzimele de restricție (foarfeci moleculare) sunt indicate de o săgeată. În funcție de numărul de repetiții VNTR, sunt generate fragmente de ADN de mărimi diferite.

Dintre cele 730 000 fragmente de restricție, numai câteva vor fi diferite între indivizi – prea puține ca să fie văzute cu ochiul liber. În loc de asta, cercetătorii folosesc o tehnică numită Southern blotting, care permite să fie vizualizate numai secvențele de interes. Pentru asta, ei separă fragmentele de restricție în funcție de mărime, prin electroforeză în gel, folosind curentul electric ca să facă fragmentele de ADN încărcate electric să se deplaseze în gel. Distanța parcursă este determinată de mărimea fragmentului (vezi Figura 26). În continuare, ei transferă ADN-ul pe o membrană și utilizează o sondă marcată radioactiv care este complementară cu VNTR-urile de interest. Are loc procesul de hibridizare (atașare) a sondei cu secvențele corespunzătoare și, punând membrana peste un film radiografic, se obține o imagine a benzilor marcate radioactiv, fiecare reprezentând un fragment de lungime diferită. Această imagine este amprenta genetică.

Câte VNTR-uri trebuie comparate pentru a identifica cu certitudine o persoană? Dacă cercetătorii aleg VNTR-uri cu suficiente variante (de ex. D1S80, care poate fi repetat de 15 până la 41 de ori), ei trebuie să compare doar patru VNTR-uri diferite pentru a ajunge la o capacitate de discriminare de 1:1 milion – mult mai bună decât discriminarea de 1:10 oferită de tiparea ABO.

Figura 26. Analiză RFLP după digestia ADN cu enzime de restricție

Tehnica actuală: amprentarea genetică prin PCR.

Descoperirea, la sfârșitul anilor 1980, a ‚repetițiilor de secvențe scurte în tandem’ (STR – short tandem repeats) – secvențe de 2-9 pb repetate, numite și microsateliți -, împreună cu inventarea PCR, au deschis drumul pentru tehnica rapidă de amprentare genetică folosită astăzi de criminaliști.

Prin PCR, un locus ADN de interes (de ex. STR-ul de 4 pb cunoscut ca D18S51, (AGAA)n) este amplificat exponențial, generându-se un miliard de copii ale unei singure molecule de ADN în câteva ore (vezi Figura 27). Pentru criminaliști, avantajul este că se poate analiza astfel chiar și cea mai mică probă – începând cu 30 de celule (vezi Tabelul 1).

Figura 27. Amprentarea genetică prin PCR

Pentru analiza PCR, avem nevoie de STR-uri flancate de secvențe comune tuturor ființelor umane (numim aceste secvențe conservate). Atunci putem folosi primeri (amorse) – molecule scurte complementare secvențelor marginale conservate (genele 1134 și 1135 în Figura 28) – pentru a iniția PCR. Odată ADN-ul amplificat, îl putem separa fie prin electroforeză în gel (vezi Figura 29) fie, în medicină legală modernă, prin secvențiere electroforetică automată (vezi Figura 30), and visualise it aș a genetic fingerprint.

Figura 28. Imagine schematică a STR D1S80

Există două copii ale fiecărui cromozom, deci vom avea câte două copii pentru fiecare STR. Dacă o persoană are același număr de repetiții (adică aceleași alele) pentru fiecare copie a STR, din analiza PCR vor rezulta fragmente de ADN de aceeași mărime: individul este homozigot pentru alela STR respectivă (săgeata verde în Figura 29, corespunzând individului 2 din Figura 28). Dacă cei doi cromozomi conțin alele diferite pentru acel STR, vom obține fragmente de două mărimi și spunem că individul este heterozigot (săgeata roșie în Figura 29, corespunzând individului 1 din Figura 28).

Figura 29. Amprenta genetică a locusului D1S80

Individul indicat cu săgeata verde este homozigot pentru locusul D1S80 (o singură bandă este vizibilă). Individul indicat cu săgeata roșie este heterozigot (două benzi). Săgețile albastre indică doi elevi care sunt heterozigoți și au același număr de repetări pentru fiecare alelă din locusul D1S80; asta înseamnă că ei nu pot fi deosebiți prin amprentare. S-ar putea să fie gemeni, dar este la fel de posibil ca două persoane neînrudite să aibă același număr de repetări, dacă se analizează un singur STR.

Dacă analizăm un singur STR, șansele ca două persoane neînrudite să aibă aceeași amprentă genetică obținută prin PCR sunt mari – între 1:2 și 1:100 (săgeți albastre în Figura 29). Motivul este că STR-urile au mai puține alele și heterozigozitate mai scăzută decât VNTR-urile folosite pentru amprentarea genetică bazată pe RFLP. Pentru a depăși acest dezavantaj, analizăm simultan mai multe STR-uri; cu 16 STR, așa cum este uzual în criminalistică din Germania, putem obține o capacitate de discriminare de 1:1 miliard (echivalent cu o persoană din populația lumii; Figura 30).

Figura 30. Electroferograma unei femei

Au fost analizate opt STR-uri (D3, TH01, D21, D18, SE33, vWA, D8 și FGA) și amelogenina (care indică sexul). Curbele albastră, verde și neagră reprezintă STR-uri amplificate (cu numărul de repetări sub maxime). Curba roșie este markerul (dimensiunile fragmentelor de ADN exprimate în pb).

Tabelul 1. Comparație între amprentarea ADN prin RFLP și PCR

Știm acum ce este amprentarea genetică, dar cum se folosește ea? Amprentarea genetică prin PCR are o largă aplicare în criminalistică: ea permite poliției să elimine sau să identifice suspecți pe baza materialelor genetice cum ar fi foliculi de păr, piele, spermă, salivă său sânge (citiți povestirea care poate fi descărcată mai jos). Totuși, amprenta genetică singură nu este o dovadă suficientă pentru condamnare, întrucât rudele apropiate pot avea amprente foarte asemănătoare (iar gemenii monozigoți le au identice).Gemenii identici ar trebui să aibă amprente genetice identice.

În plus, pentru a complica investigațiile criminalistice internaționale, deși există o recomandare Europeană de a analiza 16 STR-uri, fiecare țară decide care STR-uri vor fi analizate, ceea ce face ca rezultatele să fie dificil de comparat.

Metoda bazată pe PCR este folosită, la oameni, și pentru testarea paternității, diagnosticarea maladiilor genetice (de ex. Maladia Huntingdon), identificarea victimelor catastrofelor, trasarea arborelui genealogic, căutarea persoanelor dispărute și studierea personajelor istorice (de ex. Ultimul țar al Rusiei și familia sa). În cazul altor organisme, poate fi folosită în scopul protecției mediului (de ex. pentru analiza fildeșului confiscat), în investigațiile privind drogurile (de ex. pentru analiza plantelor de canabis capturate), pentru controlul calității apei și alimentelor (de ex. prin identificarea microbilor contaminanți), în medicină (de ex. pentru detectarea infecțiilor virale cum ar fi HIV, hepatita sau gripă) și în investigațiile privind bioterorismul (de ex. pentru identificarea tulpinilor microbiene).

Amprentarea genetică prin RFLP, deși considerată depășită din cauza avantajelor evidente oferite de metoda PCR (vezi Tabelul 1), este încă folosită pentru clasificarea plantelor și animalelor în cercetarea fundamentală. Ea este utilă în special atunci când nu există suficiente informații despre genomul unor specii – amintiți-vă că, pentru metoda PCR, avem nevoie de regiuni cu variații mari între indivizi și care sunt flancate de regiuni conservate cu secvențe cunoscute.

Izolarea ADN în clasă le va provoca elevilor un moment de uimire atunci când vor realiza că, în cele câteva filamente de ADN precipitat cu alcool, care seamănă cu niște șuvițe de vată, au în fața ochilor informația genetică completă care codifică un organism. Este un experiment ușor de făcut la școală folosind salivă (sau celule epiteliale dintr-un kit comercial), mazăre (Madden, 2006), roșii, ceapă sau timus de vițel (deși trebuie verificate restricțiile locale privind utilizarea timusului de vițel la școală).

PCR-ul unui STR specific din ADN-ul uman, de exemplu D1S80 sau TH01, se poate realiza la școală, folosind la nevoie kit-uri disponibile comercial. Dacă școala nu are acces la un termociclu, ciclul termic poate fi realizat folosind trei băi de apă, deși este incomod și foarte laborios.

Dacă acest echipament nu este disponibil, există kit-uri care simulează și, în același timp, simplifică întregul proces de amprentare genetică. Aceste kit-uri conțin fragmente de ADN care simulează amplificarea diferitelor alele ale unui singur STR sau VNTR. (De fapt, sunt fragmente de restricție din ADN-ul unui plasmid sau fag lambda). ADN-ul are nevoie de electroforeză și colorare ulterioară pentru ca elevii să poată compara secvențele de ADN amplificate dintr-o probă biologică cu cele ale mai multor suspecți. Bineînțeles, asta este foarte diferit de detectarea STR-urilor amplificate prin secvențiere electroforetică automată (și nu ilustrează corect nici vizualizarea VNTR-urilor în Southern blotting, pentru că ADN-ul este colorat direct în gel), dar demonstrează, totuși, principiile procesului analitic. Când se folosesc aceste kit-uri de simulare, elevilor trebuie să li se atragă atenția că experimentele dau impresia că diferențele dintre indivizi sunt ușor de identificat, ceea ce nu este adevărat.

Capitolul 4

MATERIALE ȘI METODE

Pacienți

Pentru stabilirea cu ajutorul tehnicilor pe bază de PCR a cauzelor care determină apariția manifestărilor fenotipice caracteristice sindroamelor de microdeleție a fost analizat un lot de pacienți diagnosticați cu sindroamele Williams, Prader-Willi și Angelman. Lotului inițial, care cuprindea patru pacienti diagnosticati cu sindrom Williams, patru pacienti cu sindrom Prader – Willi si 1 pacient cu sindrom Anghelman i s-au adăugat 2 cazuri cu PWS și 2 cazuri cu AS.

De asemenea, pentru determinarea originii parentale a microdeletiilor sau a defectului de imprinting, in studiu a fost inclus, atunci când a fost posibil, cel putin unul dintre parintii probandului.

În Figura 31 sunt prezentate pedigree-urile familiilor cu copii afectati de PWS/AS, precum și pacienții pentru care nu există date provenite de la părinții biologici.

Figura 31. Pedigreeurile familiilor cu copii afectați de sindroamele Prader-Willi și Angelman

Izolarea ADN genomic

ADN–ul genomic total a fost extras din sânge venos periferic cu ajutorul kitului Wizard Genomic DNA Purification (Promega), conform metodei optimizate in etapele anterioare. Calitatea și cantitatea de ADN genomic total a fost verificată spectrofotometric și electroforetic.

Amplificarea prin PCR a unor markeri microsatelitici

Diagnosticarea pe bază de PCR a sindroamelor de microdeleție s-a bazat amplificarea unor markeri microsatelitici situați în regiunile critice, predispuse la microdeleții. Localizarea acestor markeri microsatelitici este prezentată în Figurile 32-33.

Figura 32. Harta fizică a cromozomului 7, cu localizarea markerilor STR utilizati pentru diagnosticarea moleculara a Sindromului Williams (în casete sunt evidențiați markerii microsatelitici folosiți în studiul

Figura 33. Harta fizică a cromozomului 15, cu localizarea markerilor STR utilizati pentru diagnosticarea moleculara a Sindroamelor Prader-Willi si Anghelman (în casete sunt evidențiați markerii microsatelitici folosiți în studiul de față)

Secvențele primerilor folosiți pentru diagnosticul molecular al pacienților cu WBS sunt prezentate în Tabelul 2. Față de faza anterioară a proiectului, în această etapă au fost analizați încă 4 markeri microsatelitici, dintre care ELN și ELNi1 sunt intragenici. Acești noi markeri au fost amplificați și cu ajutorul unor primeri marcați fluorescent.

Tabel 2. Secventele primerilor utilizati pentru amplificarea fiecarui marker STR folosit in detectarea microdeletiei care determina sindromul Williams. /5Cy5/ indica marcarea cu fluorocromul Cybergreen, la capatul al primerului, marcare necesara pentru analiza prin electroforeza capilara a lungimii alelelor STR. Cu rosu sunt evidentiati perechile de primeri pentru markerii nou introdusi in analiza.

Condițiile de amplificare pentru primii markeri sunt cele optimizate în faza anterioară a proiectului, respectiv: 1 ciclu de 2 min. denaturare inițială la , 30 cicluri: denaturare 1 min. la , atașare primeri 1 min. la 55- (temperatura de annealing variază în funcție de primer), elongare 1 min. la și 1 ciclu extensie finală 1 min. la .

Pentru markerii noi inclusi in studiu conditiile de amplificare au fost urmatoarele: 1 ciclu de 10 min. denaturare inițială la , 30 cicluri: denaturare 1 min. la , atașare primeri 1 min. la 57,50C, elongare 1 min. la și 1 ciclu extensie finală 7 min. la .

Pentru diagnosticarea cu ajutorul microsateliților a pacienților cu PWS și AS s-au folosit primerii ai căror secvență se regăsește în Tabelul 3. Similar cu diagnosticarea moleculară a WBS, unii dintre markeri au fost amplificați și cu ajutorul unor primeri marcați cu fluorocrom Cybergreen, ceea ce a permis naliza lor în sistem de electroforeză capilară.

Tabel 3. Secventele primerilor utilizati pentru amplificarea fiecarui marker STR folosit in detectarea microdeletiei care determina PWS și AS. Cu rosu sunt evidentiati perechile de primeri marcați fluorescent.

Condițiile de amplificare folosite pentru primerii nemarcați au fost cele stabilite în etapa anterioară a proiectului, și anume: 1 ciclu de 2 min. denaturare inițială la , 30 cicluri: denaturare 1 min. la , atașare primeri 1 min. la 55-55,50C, elongare 1 min. la și 1 ciclu extensie finală 1 min. la .

Pentru primerii marcați, condițiile de amplificare sunt: 1 ciclu de 10 min. denaturare inițială la , 30 cicluri: denaturare 1 min. la , atașare primeri 1 min. la 57,50C, elongare 1 min. la și 1 ciclu extensie finală 7 min. la .

Vizualizarea ampliconilor și determinarea dimensiunilor alelelor

Verificarea ampliconilor s-a realizat inițial prin electroforeză submersă în gel de agaroză 2% pe placă orizontală. Pentru analiza alelelor și determinarea mărimii acestora, în vederea identificării precise a genotipurilor atât la pacienți cât și la părinții acestora, produșii de amplificare au fost migrați atât în gel denaturat de poliacrilamidă, cât și folosind sistemul de analiza Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System, bazat pe electroforeză capilară.

Pentru analiza în sistem de electroforeză capilară, produșii de PCR obținuți cu ajutorul primerilor marcați cu fluorocrom au fost inițial purificați cu kitul Wizard SV gel and PCR Clean-Up System, conform urmatorului protocol :

Produsii de PCR au fost migrati intr-un gel de agaroza de 2%, conform protocolului standard. Vizualizarea s-a efectuat in lumina UV, la 302nm.

Pentru fiecare proba, care urma a fi purificată, s-a cantarit un tub de 1.5ml gol, greutatea lui fiind notata separat.

Fragmentul de agaroză, care conținea produsul de PCR dorit, a fost excizat din gel folosind o lama sterila și introdus in tubul de 1,5ml.

Tubul, impreuna cu fragmentul de gel au fost cantarite, iar diferenta dintre cele doua greutati a fost notata separat.

Peste fragmentul de gel a fost adaugata Solutie de legare la membrana, in proportie de 10µl pentru fiecare 10mg de gel.

Amestecul a fost vortexat si apoi incubat la pentru 10min., sau pana cand toata agaroza s-a topit.

Amestecul de agaroza cu Solutie de legare la membrana a fost apoi trecut pe colonițe de purificare (cate 350µl o data), care au fost introduse in tuburile de colectare.

Ansamblul (coloana de purificare + tub colector) a fost incubat 1min la temp. camerei, centrifugat 1min. la 14.000rpm. si lichidul din tubul de colectare aruncat.

Coloana de purificare a fost spalata apoi cu 700µl Membrane Wash Solution (diluata in prealabil cu 95% etanol), iar ansamblul centrifugat 1min la 14.000rpm.

Dupa ce lichidul din tubul de colectare a fost aruncat, peste coloana de purificare au fost adaugati 500µl Membrane Wash Solution, iar ansamblul centrifugat 1min la 14.000rpm.

Coloana a fost introdusa intr-un tub steril de 1,5ml, iar peste membrana au fost adaugati 25µl Nuclease free water. Ansamblul se incubeaza 1min la temp. camerei, iar apoi se centrifugheaza 5min. la 14.000rpm.

Tubul de centrifuga care contine produsul de PCR purificat poate fi stocat la .

Dimensiunile alelelor au fost stabilite cu ajutorul programului BioEdit in cazul în care ampliconii au fost vizualizați în electroforeză capilară și cu programul Gel Pro Analyser ver. 3.1 când s-a folosit electroforeza verticală în gel de poliacrilamida.

REZULTATE

Diagnostic molecular cu ajutorul unor markeri nicrosatelitici la pacienți cu sindroame de microdeleție

Utilizarea markerilor microsatelitici în stabilirea diagnosticului molecular al asindroamelor de microdeleție nu este foarte recentă și a apărut din necesitatea de a evita, atunci când este posibil, utilizarea unor tehnici laborioase și costisitoare, precum este tehnica FISH (Pena 1998). Tehnicile pe bază de PCR depind, în principiu de primeri accesibili, sunt simple, automatizate parțial și furnizează rezultate în timp relativ scurt.

Utilitatea și informativitatea microsateliților variază în funcție de sindromul analizat, de aceea se va prezenta separat, pe sindroame, optimizarea markerii microsatelitici introduși nou în studiu, modalitațile de vizualizare a alelelor și cuantificare a dimensiunilor acestora și, la final, stabilirea diagnosticului molecular prin intermediul microsateliților.

A. OPTIMIZAREA REACȚIILOR DE AMPLIFICARE ALE UNOR MARKERI MICROSATELITICI NOI INTRODUȘI ÎN STUDIU

a. Noi markeri microsatelitici utili în studiul sindromului Williams-Beuren (WBS)

Pentru o determinare mai precisa a eventualei microdeletii prezente la pacienti au fost introdusi in studiu alti patru markeri microsatelitici: D7S1870, ELN, ELNi1 si D7S2518, a căror localizare este prezentata in Figura 34.

Figura 34. Harta fizică parțială a cromozomului 7, cu localizarea markerilor microsatelitici nou introduși în studiu pentru diagnosticarea moleculara a Sindromului Williams: ELN, ELNi1, D7S1870 și D7S2518

Microsatelitii ELN si ELNi1 sunt situati in interiorul genei elastinei (ELN), iar D7S1870 si D7S2518 (repetitii dinucleotidice CA) sunt situați in aval de aceasta gena.

O primă etapă de lucru a fost reprezentată de optimizarea condițiilor de amplificare pentru acești noi markeri microsatelitici. Astfel, pentru stabilirea condițiilor optime de amplificare pentru fiecare marker în parte, au fost utilizate mai multe protocoale de lucru în care a fost tatonată temperatura de legare a primerilor (Tabel 3).

Tabel 4. Diferite variante de protocoale pentru amplificarea prin PCR a unor markeri microsatelitici nou introdusi in analiza moleculara a WBS

Pentru protocoalele P1, P2, si P3 nu s-au obtinut produsi de amplificare pentru nici unul dintre markeri.

Analizând Figura 35 se observă că, în cazul protocolului P4, pentru nici unul dintre markeri nu s-a obtinut o bandă clară, care să reprezinte produs unic de amplificare. Numeroasele amplificări nespecifice care se pot observa sunt cel mai probabil generate de o temperatură de annealing prea scazută.

Figura 35. Amplificarea prin PCR a unor markeri microsatelitici utilizați în diagnosticul molecular al sindromului Williams cu ajutorul protocolului 4.

Ulterior, optimizarea protocoalelor de amplificare s-a realizat pentru fiecare marker în parte, crescând temperatura de atașare a primerilor.

In Figurile 36-38 sunt prezentate imaginile electroforezelor în gel de agaroză 2% pentru markerii ELN, ELNi1 si D7S1870 obtinuti in urma optimizarii reactiei PCR, prin creșterea temperaturii de annealing la 57,50C.

Figura 36. Amplificarea prin PCR a markerului microsatelitic ELN utilizat în diagnosticul molecular al sindromului Williams cu ajutorul protocolului numarul 5.

Figura 37. Amplificarea prin PCR a markerului microsatelitic ELNi1 utilizat în diagnosticul molecular al sindromului Williams cu ajutorul protocolului numarul 5.

Figura 38. Amplificarea prin PCR a markerului microsatelitic D7S1870 utilizat în diagnosticul molecular al sindromului Williams cu ajutorul protocolului numarul 5.

b. Noi markeri microsatelitici utili în studiul sindroamelor Prader-Willi și Angelman

In etapa anterioara a studiului au fost optimizate condiile de amplificare pentru markerii D15S113, D15S165 si D15S1019, de aceea in aceasta etapa am continuat cu optimizarea conditiilor pentru ceilalti markeri luati in studiu: D15S11, D15S541, D15S542 si D15S1002.

Temperatura optimă de annealing, care a permis obținerea unor ampliconi bine individualizați, fără amplificări nespecifice, a fost pentru toți markerii de (Figura 39).

Figura 39. Amplificarea prin PCR markerilor microsatelitici D15S11 (a.), D15S542 (b.), D15S541 (c.) si D15S1002 (d) utilizati pentru diagnosticarea moleculara a sindroamelor Prader-Willi si Anghelman. D15S11 are alele cuprinse intre 246-264pb, D15S542 are alele cuprinse intre 140-160pb, D15S541 are alele cuprinse intre 150-160pb si D15S1002 are alele cuprinse intre 105-129pb

B. VIZUALIZAREA ȘI CUANTIFICAREA DIMENSIUNII ALELELOR MARKERILOR MICROSATELITICI FOLOSIȚI ÎN STUDIUL SINDROAMELOR DE MICRODELEȚIE

Pentru stabilirea cu precizie a genotipurilor probandului și a părinților acestuia este esențială stabilirea dimensiunilor alelelor. Întrucât există mai multe modalități de determinare a dimensiunii alelelor, s-a ales ca pentru acest studiu să se utilizeze în paralel electroforeza capilară și sistemul Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System și respectiv electroforeza în gel de poliacrilamidă și programul GelPro Analyzer ver. 3.1.

Determinarea lungimii alelelor la fiecare individ analizat utilizand sistemul Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System necesită folosirea unor primeri marcați cu fluorocrom. Astfel, pentru acest tip de studiu au fost selectați markerii D15S11 si D15S113 (pentru determinarea BP2), D15D1019 si D15S165 (pentru determinarea punctului de rupere distal) pentru amplificarea cărora s-au folosit primeri marcați cu Cybergreen.

Amplificările prin PCR, realizate pentru toți indivizii luați în studiu, folosind primeri marcați nu au permis obținerea unor rezultate pe deplin satisfăcătoare. Astfel, analiza electroforezelor in gel de agaroza a arătat că pentru toți cei 4 markeri microsatelitici nou introduși în studiul molecular al sindroamelor PWS/AS nu s-a obtinut un produs de amplificare vizibil ca o banda unica in gel. Încercarile ulterioare de optimizare a reactiilor nu a permis reducerea amplificarilor nespecifice (Figurile 40-42).

Figura 40. Amplificarea prin PCR markerului D15S11 folosind primerul Fw marcat cu flurocromul Cybergreen la toti indivizii luati in studiu. Se observă la unii indivizi prezenta a numeroase amplificari nespecifice, de aceea din gel s-a extras produsul de amplificare dorit, produs incercuit în imagine.

Figura 41. Amplificarea prin PCR a markerului D15S113 folosind primerul Fw marcat cu flurocromul Cybergreen la toti indivizii luati in studiu. Se observa la unii indivizi prezenta a numeroase amplificari nespecifice, de aceea din gel s-a extras produsul de amplificare dorit, produs incercuit în imagine.

Figura 42. Amplificarea prin PCR a markerului D15S1019 folosind primerul Fw marcat cu flurocromul Cybergreen la toti indivizii luati in studiu. Se observa la unii indivizi prezenta de amplificari nespecifice, de aceea din gel s-a extras produsul de amplificare dorit, produs incercuit în imagine.

Prezența amplificărilor nespecifice a generat necesitatea purificării produșilor de PCR, prin excizarea din gel a benzii corespunzatoare ca dimensiune cu markerul analizat. Purificarea s-a realizat cu kitul Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System, iar produșii PCR purificați au fost vizualizați în gel de garoză 2% (Figura 43). Ulterior, acești produși au fost reamplificați prin PCR, iar produsul final a fost vizualizat în gelul de agaroză ca un amplicon unic (Figura 44).

Figura 43. Verificarea electroforetica a produsilor de PCR purificati din gel de agaroza pentru markerul D15S11.

Figura 44. Reamplificarea markerilor D15S1019 si D15S113 folosind ca matrita produsii de PCR extrasi din gel. Se observa prezenta unei benzi unice, de dimensiune corespunzatoare: pentru D15S1019 aproximativ 220pb, iar pentru D15S113 de aproximativ 140pb.

Ulterior, produșii de PCR purificați au fost analizați cu ajutorul sistemului Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System, sistem care realizează separarea prin electroforeză capilară a alelelor în funcție de dimensiuni și permite reprezentarea grafică a acestora sub forma unor peak-uri de înălțimi diferite, proporționale cu greutatea lor moleculară. Dimensiunea alelelor este stabilita prin migrarea concomitenta a probei de analizat cu un marker de greutate. Dacă un individ este heterozigot pentru locusul analizat în electroforegramă se obtin doua peak-uri, iar dacă este homozigot, unul singur.

In Figurile 45-46 sunt prezentate electroforegramele obtinute pentru markerii D15S11, D15S1019 si D15S113 la doi membri ai familiei Balan, indivizii notati cu 008 si 009.

Pentru unii dintre markeri, vizualizarea alelelor s-a realizat prin electroforeză verticală în gel de poliacrilamidă (PAGE) denaturant 6% (19:1 acrilamidă:bis-acrilamidă), în tampon TBE 1X. Gelurile de poliacrilamida au pori cu dimensiune mult mai mica si mai constanta decât gelurile de agaroza, de aceea, acest tip de electroforeză este preferat pentru separarea fragmentelor de ADN de mici dimensiuni, având o rezoluție ridicată.. Denaturarea initiala a probelor, asigura formarea de ADNmc, ceea ce permite separea fragmentelor ce se deosebesc chiar și printr-o singură pereche de baze. În Figura 47 se observă în gelul de poliacrilamida cu colorație argentică alelele corespunzătoare markerilor microsatelitici D15S542 si D15S541 la pacienți cu PWS/AS și la părinții acestora.

Pentru o interpretare corectă a gelurilor de poliacrilamida s-a folosit programul GelPro Analyzer ver. 3.1 (Figura 48), folosind ca marker de greutate ladderul “low range DNA size marker” de

Figura 45. Electroferograma obtinuta in urma analizei markerilor D15S11, D15S113 si D15S1019 cu sistemul Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis la individul 008, afectat de Sindromul Anghelman. Se observa ca pentru doi dintre markerii analizati acest individ prezinta un singur peak, ceea ce corespunde cu o stare de homozigotie la nivelul acestor loci.

Figura 46. Electroforegrama obtinuta in urma analizei markerilor D15S11, D15S113 si D15S1019 cu sistemul Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis la individul 009, mama pacientului 008. Se observa ca pentru toti markerii analizati acest individ prezinta doua peak-uri, de lungimi diferite, ceea ce corespunde cu o stare de heterozigotie la nivelul tuturor locilor.

Figura 47. Gel nativ de poliacrilamida cu coloratie argentica pentru vizualizarea alelelor markerilor microsatelitici D15S542 si D15S541

Figura 48. Gel de poliacrilamida analizat cu ajutorul programului GelPro analizer ver. 3.1 (a) si tabelul cu lungimile alelelor pentru fiecare individ (b)

In cazul unora dintre markerii analizati prin tehnica PAGE silver staining s-a observat ca patternul generat este format din doua sau trei benzi, acest lucru fiind probabil datorat unor erori în activitatea polimerazei termostabile, care adaugă una sau doua unitati de repetitie în plus. În această situație, pentru identificarea genotipurilor individuale, a fost luata in considerare banda mai intens colorata.

Datele privind dimensiunile alelelor obtinute prin cele două metode au fost sumarizate in Tabelul 5.

Tabel 5. Genotipurile indivizilor din lotul PWS/AS identificate prin intermediul unor markeri microsatelitici. Dimensiunile alelelor sunt exprimate in pb.

C. STABILIREA DIAGNOSTICULUI MOLECULAR PENTRU SINDROAMELE DE MICRODELEȚIE PRADER–WILLI ȘI ANGELMAN FOLOSIND MARKERI MICROSATELITICI

Utilizand datele inscrise in Tabelul 5, respectiv lungimile alelelor pentru fiecare marker microsatelitic, s-au identificat haplotipurile si modul lor de transmitere de la parinti la copiii afectați de PWS/AS.

În continuare, sunt prezentate diagnosticele moleculare așa cum rezultă din analiza haplotipurilor din pedigree-ul corespunzător fiecărui pacient în parte. În general, diagnosticul pentru PWS/AS prin intermediul markerilor microsatelitici urmărește stabilirea naturii sindromului, respectiv microdeleție, disomie uniparentală (UPD) sau defecte de imprinting. Dezavantajul acestei metode este legat de faptul că sunt necesare probe de sânge de la ambii părinți și, chiar atunci când acestea sunt disponibile, rezultatele pot fi neinformative (Varela).

În studiul de față au fost disponibile probe de la ambii părinți doar pentru 3 cazuri de PWS. Cu toate acestea, întrucât unul din obiectivele studiului a fost demonstrarea avantajelor folosirii markerilor microsatelitici în studiul sindroamelor de microdeleție și optimizarea protocolului de lucru, vom prezenta diagnosticul molecular prezumtiv pentru toți pacienții incluși în lot.

Pacienți cu sindrom Pader-Willi

1. Pentru familia Bumbacea, a fost posibila analiza intregii familii, atat a copilului Bumbacea Maria, afectat de sindromul Prader – Willi, cat si a parintilor acestuia (Figura 49). Cu ajutorul markerilor microsatelitici au fost determinate haplotipurile tatălui( 153 / 244 128 / 205 200 si 153 / 250 130 / 205 184) și ale mamei (147 146 244 124 / 205 184 si 153 153/ 242 128 / 214 184)

Figura 49. Pedigree-ul familiei Bumbacea si haplotipurile individuale identificate la mama, tata si copil pentru markerii STR folositi in diagnosticarea moleculara a sindromului Prader – Willi. Valorile înscrise în chenar reprezintă greutatea moleculară a alelei, exprimată în pb.

În acest caz, din analiza haplotipurilor rezultă faptul că pacientul cu PWS este caracterizat prin pierderea heterozigoției pentru toți microsateliții luați în studiu. Haplotipul pacientului este (147 146 244 124 / 205 184), fiind moștenit de la mamă. Este așadar posibil ca, aparitia manifestarilor clinice caracteristice sindromului Prader– Willi la aceasta fetita să se datoreze microdeleției extinse a regiunii 15q11-q13 de pe cromozomul patern (BP1-BP3), având în vedere că, pentru ambii markeri din regiunea proximală (D15S541 și D15S542) pacientul prezintă o singură alelă, la fel ca și pentru markerul distal D15S165. Nu poate fi exclusă însă nici posibilitatea unei disomii uniparentale, având în vedere faptul că, pentru a distinge între microdeleție și UPD ar trebui genotipați și alți loci din afara regiunii critice PWS. Transmiterea uniparentală în afara acestei regiuni, corelată cu ereditatea biparentală în afara acestei regiuni identifică o deleție; prezența eredității uniparentale atât între, cât și în afara regiunii critice evidențiază UPD (Varela 2002).

Așadar, pentru această familie, ca și pentru celelalte cazuri analizate, ar trebui să avem pe lânga genotipurile cazurilor index și ale părinților, confirmarea microdeleției prin tehnica FISH pentru a certifica diagnosticul molecular de microdeleție sau UPD. În mod cert, însă, cu ajutorul markerilor microsatelitici se poate stabili originea maternă a alelelor de pe cromozomul 15 la pacientul cu PWS.

2. De la familia Comăniță s-a recoltat material biologic de la toti membrii familiei, însă, ADN-ul extras s-a degradat rapid, astfel incat nu a fost posibila analiza decat a 4 din cei 7 markeri microsatelitici. Incercarile de reextractie ale ADN-ului din sangele congelat s-au soldat cu un esec, probabil datorita conditiilor necorespunzatoare de recoltare si prezervare. Cu toate acestea, analiza haplotipurilor obtinute pentru markerii analizati indica faptul ca baiatul prezinta o microdeletie pe cromozomul de origine paternă (Figura 50), microdeletie care ar putea explica fenotipul caracteristic sindromului Prader–Willi identificat la copil. Totuși, având în vedere că pentru markerul situat cel mai distal față de regiunea BP3 (respectiv D15S165) pacientul este heterozigot, se poate exclude UPD maternă.

Figura 50. Pedigree-ul familiei Comanita si haplotipurile individuale identificate la mama, tata si copil pentru patru markerii STR folositi in diagnosticarea moleculara a sindromului Prader – Willi. Valorile înscrise în chenar reprezintă greutatea moleculară a alelei, exprimată în pb.

3. In familia Boariu, cazul index este reprezentat de Boariu Andreea, copilul fiind diagnosticat clinic cu sindrom Prader–Willi. In cazul acestei familii am avut material biologic doar de la pacient si de la mama acesteia (Figura 51).

Figura 51. Pedigree-ul familiei Boariu si haplotipurile individuale ale mamei si fiicei pentru markerii STR folositi in diagnosticarea moleculara a sindromului Prader-Willi. Valorile înscrise în chenar reprezintă greutatea moleculară a alelei exprimată în pb.

Pentru aceasta familie au fost identificate doua haplotipuri, (157 135 253 128 121 205 si 162 132 251 128 121 205), care reprezinta alelele mamei pentru fiecare marker in parte. La fetita bolnava se observa ca, pentru cinci dintre markerii analizati, exista un singur haplotip (162 132 251 128 121 205), sau, altfel spus, pentru toti acesti markeri fetita este homozigota. Deoarece nu a existat posibilitatea analizarii materialului genetic de la tata, iar haplotipul prezent la fetita a fost identificat si la mama, consideram ca acesta este mostenit de pacienta pe linie materna.

Starea de homozigotie pentru cinci markeri ne confirma faptul ca, fragmentul cromozomal pe care acestia sunt situati este deletat la fetita, si ca deletia s-a produs pe cromozomul de origine paterna. În acest caz, similar cu situația anterioară, se poate exclude disomia uniparentală maternă, fetița fiind heterozigotă pentru markerul D15S165 (genotip 200/184).

4. O situație particulară se întâlnește în cazul pacientei Bălan Diana, diagnosticată cu sindrom Prader-Willi (Figura 52). Dacă se iau în considerare șase dintre cei șapte markeri microsatelitici, diagnosticul molecular confirmă diagnosticul clinic, pacienta prezentând o deleție a cromozomului patern în regiunea 15q11-q13, evidențiată de pierderea heterozigoției pentru alelele markerilor D15S541, D15S542, D15S11, D15S1002. De asemenea, starea de heterozigoție pentru D15S1019 și D15S165 exclude UPD matern. Însă, în mod surprinzător, pentru markerul D15S113 pacientul este heterozigot. Studiind literatura de specialitate am constatat că în cazul acestui marker microsatelitic este menționată prezența așa numitelor alele nule, ce pot apare datorită rejectării acestui marker în favoarea altor repetiții dinucleotidice CA din această regiune (Harvey 2002).

Figura 52. Pedigree-ul familiei Bălan si haplotipurile individuale identificate la mama, tată si copil pentru markerii STR folositi in diagnosticarea moleculara a sindromului Prader-Willi. Valorile înscrise în chenar reprezintă greutatea moleculară a alelei exprimată în pb.

Pentru clarificarea diagnosticului molecular pentru acest pacient se impun unele investigații suplimentare, care să elimine aparentul polimorfism de la nivelul situsului de atașare a primerului pentru markerul D15S113.

Pacienți cu sindrom Angelman

1. In cazul familiei Bălan, cazul index este reprezentat de Bălan George, copilul fiind afectat de sindromul Angelman, si, la fel ca la familia anterioara, am avut material biologic de la pacient si de la mama acesteia (Figura 53).

Figura 53. Pedigree-ul familiei Balan si haplotipurile individuale identificate la mama si baiat pentru markerii STR folositi in diagnosticarea moleculara a sindromului Angelman. x marcheaza haplotipul dedus al tatalui pentru cinci dintre markerii analizați.. Valorile înscrise în chenar reprezintă greutatea moleculară a alelei exprimată în pb.

La aceasta familia au fost identificate doua haplotipuri la mama (/ 149 244 128 121 203 și / 149 244 128 119 205) si unul la baiat (157 153 260 130 119 203). Avand in vedere ca acest haplotip nu este prezent la mama, consideram ca el provine de la tata.

Starea de homozigotie pentru cinci dintre markerii analizati confirma faptul ca, fragmentul cromozomal pe care acestia sunt situati este deletat la baiat, si ca deleția s-a produs pe cromozomul de origine materna. Întrucât pentru markerii D15S1019 și D15S165 pacientul este heterozigot, poate fi exclusă disomia uniparentală paternă.

In lotul de studiu au mai fost inclusi si alti trei pacienti, doi dintre ei fiind diagnosticati clinic cu sindrom Angelman si unul cu sindrom Prader–Willi (Figura 54).

Figura 54. Haplotipurile identificate la trei pacienti analizati. 018 – sindrom Prader – Willi. 020 si 019 – sindrom Angelman.

La toti trei pacientii analiza haplotipurilor indica faptul ca sunt homozigoti pentru toti locii luati in studiu, ceea ce ar fi o indicatie pentru prezența unei microdeletii sau a unei disomii uniparentale, dar, întrucât nu a fost posibila si analiza genitorilor, nu se poate pune un diagnostic molecular clar.

CONCLUZII

Markerii microsatelitici oferă informații cu privire la cauza apariției fenotipurilor clinice asociate sindroamelor de microdoeleție, permițând genotiparea cu precizie a probanzilor și a familiilor lor. Dezavantajul major este legat de faptul că pentru un diagnostic molecular pe bază de microsateliți este absolut necesară prelevarea de material biologic de la ambii părinți.

Tehnicile bazate pe amplificarea prin PCR a unor markeri microsatelitici sunt ușor de aplicat, relativ rapide și puțin costisitoare în raport cu alte tehnici de diagnosticare, iar rezultatele pot fi înalt informative cu condiția ca markerii utilizați să fie selectați corespunzător.

Pentru diagnosticul molecular al pacienților cu sindrom Williams au fost stabilite condițiile de amplificare ale următorilor markeri microsatelitici D7S502, D7S1861, D7S2415, D7S653, D7S2476, D7S2518, D7S1870, ELN, ELNi1. Acești markeri sunt utili pentru stabilirea originiiparentale a microdeleției și a dimensiunilor acesteia, stiut fiind că severitatea simptomelor depinde de mărimea fragmentului lipsă. Datorită faptului că la lotul analizat nu s-a mai adăugat nici un pacient cu WBS în această etapă ne-am axat pe lărgirea numărului de markeri microsatelitici utili în diagnosticul molecular al acestei maladii.

Pentru diagnosticul molecular al PWS/AS s-au dovedit utili markerii D15S541, D15S542, D15S11, D15S113, D15S1002, D15S1019, D15S165. Cu ajutorul lor s-a realizat diagnosticarea a încă 8 pacienți (5 cu PWS și 3 cu AS). Markerii microsatelitici permit în acest caz evidențierea originii microdeleției sau prezența/absența disomiei uniparentale. Deși, în mod curent pentru confirmarea diagnosticului clinic de PWS/AS se folosesc PCR-ul de metilare și FISH, aceste tehnici nu pot furniza informații utile pentru sfatul genetic.

În paralel cu celelalte activități desfășurate s-a completat și colecția de acizi nucleici, scopul final fiind extinderea și implementarea diagnosticului molecular pe bază de microsateliți ca metodă curentă de diagnosticare în laboratoarele medicale.