Analiza statistică a celulelor cervicale, utilizând imagini de amplitudine și de fază [302098]

Universitatea POLITEHNICA din București

Facultatea de Inginerie Medicală

PROIECT DE DIPLOMĂ

Analiza statistică a [anonimizat]: Absolvent: [anonimizat]

2016

Cuprins

Abstract

1. – Introducere

2. – Celule cervicale. Recoltare și testare

2.1. Noțiuni generale despre celulele cervicale și testul Papanicolau

2.2. Epidemiologia cancerului cervical

3. – Tipuri de microscopie utilizate în analiza celulară

3.1. Noțiuni generale de microscopie

3.2. Microscopia în câmp luminos

3.3. Microscopia prin contrast diferențial de interferență

3.4. Microscopia holografică

3.4.1. Configurații utilizate în holografia digitală

3.4.2. Aplicații biomedicale ale microscopiei holografice digitale

4. – Achiziția de imagini folosind imagistica de fază

4.1. Instalația experimentală

4.2. Etapele algoritmului de reconstrucție

5. – [anonimizat]

5.1. Analiza și procesarea imaginilor holografice

5.2. Analiza și procesarea imaginilor cu celule cervicale colorate

5.3. Analiza statistică

5.3.1. Statistica imaginilor celulelor cervicale colorate

5.3.1. Statistica imaginilor holografice

6. – [anonimizat] o perspectivă în sprijinul laboratoarelor de analize medicale pentru detectarea celulelor potențial canceroase cât mai devreme cu putință. Acesta este un pas obligatoriu pentru rezolvarea problemelor provocate de cancerul de col uterin.

[anonimizat] a oferi imagini ale probelor biologice fără a mai fi nevoie de utilizarea markerilor cromatografici. [anonimizat]: se obțin imagini 3D [anonimizat] o [anonimizat], marker-free, [anonimizat]. [anonimizat], prin furnizarea unor date în timp redus față de metodele clasice.

[anonimizat] a caracteristicilor morfologice ale celulelor. [anonimizat], incluzând cât mai mulți pași efectuați prin decizii automate.

Această lucrare își propune să prezinte o abordare pe de-o parte a modului de achiziție a imaginilor biomedicale iar pe de altă parte a procedurilor pentru prelucrarea imaginilor care includ pași de segmentare și analiză statistică pentru a lua decizii în clasificarea diferitelor tipuri de celule cervicale. Un program automat de segmentare a fost dezvoltat pentru a oferi un instrument obiectiv și de încredere. [anonimizat], a [anonimizat], [anonimizat]r automate de segmentare, există șansa ca unele detalii marginale să se piardă ca urmare a formelor complexe ale celulelor cervicale, detalii care o dată neglijate pot afecta clasificarea cât și analiza statistică. Astfel, sunt utilizate tehnici speciale de analiză imagistică cât și un set de cunoștințe privind modul de achiziționare al imaginilor. Sistemul de segmentare automată utilizează o strategie care să minimizeze cantitatea de cunoștințe specifice domeniului, însă, pentru a putea realiza o clasificare corectă trebuiesc luate în considerare atât experiența în domeniul imagistic cât și criteriile biomedicale de specialitate.

Cuvinte cheie: celule cervicale, microscopie holografică digitală, segmentare automată și manuală, analiză statistică.

Capitolul 1- Introducere

În această lucrare vor fi descrise analizele efectuate pentru a studia caracteristicile celulelor cervicale cu scopul de a obține informații despre acestea în condiții care ar putea oferi specialiștilor medicali date care pot fi interpretate pentru a lua o decizie în cel mai scurt timp. S-au studiat celule cervicale recoltate în condițiile testului Papanicolau, dar analizele efectuate au fost de doua tipuri: pornind de la celule marcate cu substanțe cromatografice și pornind de la celule aflate în mediul de recoltare.

Datele rezultate în urma analizei celulelor cervicale cu ajutorul diferitelor tehnici de microscopie și prelucrării imaginilor achiziționate experimental, trebuie să conțină informații ușor de înțeles, intuitive, dar mai ales să ofere o vedere de ansamblu asupra tuturor celulelor prezente pe frotiu. Proiectarea programului de procesare a imaginilor obținute în urma analizei microscopice este făcută utilizând mediul de lucru MATLAB și urmărește tocmai aceste elemente menționate, datorită necesității existenței unui program care să înglobeze toate datele dorite.

Tehnicile de microscopie utilizate în acest studiu sunt de diferite tipuri: de la cele clasice în câmp luminos sau contrast diferențial interferențial, până la cele moderne, de microscopie holografică digitală. Prin microscopie în câmp luminos sunt analizate celule marcate cu substanțe cromatografice, ca în procedura convențională aferentă testului Papanicolau. Deoarece aceste substanțe chimice pot afecta starea celulei, în ultimul timp se urmărește înlocuirea acestora cu tehnici marker-free. Din acest ultim grup, fac parte microscopia în contrast diferențial interferențial și microscopia holografică digitală (DHM). Cu ajutorul acestora, celulele pot fi analizate în medii de cultură sau în mediile de recoltare. Avantajul DHM este faptul că acesta oferă informații cantitative și de-a lungul axei de propagare, nu doar în plan transversal precum tehnica de microscopie în contrast diferențial interferențial.

În această lucrare se discută astfel despre celulele cervicale și testul Papanicolau, epidemiologia cancerului cervical pe întreg mapamondul, tipurile de microscopie utilizate până în prezent în analiza acestui tip de celule, neajunsurile lor și găsirea unei soluții rapide și de interes care să suplineasca dezavantajele celorlalte clase microscopice. O soluție este utilizarea microscopiei holografice și procesarea imaginilor de fază corespunzătoare. Aceasta este direcția în care mi-am îndreptat studiul prin implementarea propriu-zisă a aplicației software de procesare a imaginilor în MATLAB.

În capitolul al doilea sunt prezentate celulele cervicale, adică caracteristicile acestora în diferite etape de evoluție a cancerului de col uterin. Accentul cade preponderent pe metodele de prevenție, dar și pe importanța unei recoltări adecvate a celulelor de la baza cervixului în vederea furnizării ulterioare a unui diagnostic verosimil.

În al treilea capitol sunt descrise diferite tipuri de microscopie optică existente la ora actuală, de interes pentru medic, importanța acestora și a imaginilor obținute. Odată cu parcurgerea acestei etape, se pot sorta categoriile de microscopie propice aplicației vizate în scopul obținerii unei cantități cât mai mari de informații legate de proba de analizat.

Montajul experimental corespunzător tehnicii DHM utilizat de mine este descris în capitolul al patrulea. Acesta se află în laboratorul de Holografie Digitală (BN139) al Departamentului de Fizică. Hologramele obiectelor de fază au fost înregistrate într-un montaj experimental bazat pe interferometrul Mach-Zehnder. Acesta este construit pentru configurația off-axis în transmisie și permite înregistrarea hologramelor obiectelor de fază. Aceste obiecte sunt transparente în domeniul vizibil, spre deosebire de obiectele de amplitudine care sunt reprezentate de obiectele colorate.

Astfel, ulterior imagisticii celulelor cervicale cu ajutorul microscopiei holografice digitale, se implementează o aplicație în MATLAB utilizând ca și intrare imaginile rezultate în urma acestei proceduri, aplicație care atestă importanța înțelegerii imaginii microscopice înainte de construirea unei aplicații utile personalului medical.

În cadrul celui de-al cincilea capitol sunt evidențiate cele mai importante metode de procesare folosite în analiza imaginilor microscopice. Ca și metodă de procesare a imaginilor holografice, a fost implementat un program de segmentare manuală în MATLAB. În schimb, pentru partea de analiză a imaginilor cu celule cervicale colorate s-a recurs la realizarea unui program de segmentare automată în spațiul caracteristicilor, folosind un algoritm general de clustering, mai exact k-means. Cu ajutorul programelor amintite mai sus, s-a dorit extragerea imaginii nucleului și a citoplasmei unei celule cervicale sănătoase, și respectiv bolnave în vederea determinării pe de-o parte a numărului total de celule anormale, prin raportare la numărul total de celule existente pe respectivul frotiu, iar pe de altă parte calcularea unor coeficienți statistici care să ilustreze cât mai bine cu putință schimbările survenite în populația de celule, prin furnizarea unor date numerice. În ultima parte a acestui capitol sunt prezentați coeficienții biostatistici calculați pentru imagini cu celule cervicale colorate și imagini holografice. În continuare, vom denumi aceste tipuri de imagini ca imagini de amplitudine și imagini de fază, respectând noțiunile de optică deoarece imaginile inițial achiziționate sunt imagini obținute în microscopia optică. Ulterior, pe baza rezultatelor obținute, s-au tras câteva concluzii valabile pentru lotul de celulele cervicale testate.

La final, mai exact în ultimul capitol, sunt ilustrate concluziile generale la care s-a ajuns în urma aprofundării tematicii enunțate.

Capitolul 2 – Celule cervicale. Recoltare și testare

2.1. Noțiuni generale despre celule cervicale și testul Papanicolau

Celulele epiteliale cervicale sunt interconectate prin intermediul zonelor specifice de atașare (nodurile lui Bizzozero) [ H. E. Karrer, 1960]. Acestea sunt prezente pe suprafața de la baza cervixului și au ca și funcții principale: producerea de mucus și protejarea uterului de bacterii sau agenți patogeni. Studiul lor a început din necesitatea de a depista cât mai timpuriu unele semne ale cancerului, observându-se faptul că modificările lor morfologice și structurale sunt astfel de indicatori.

Cervixul îndeplinește o serie de funcții care contribuie la starea generală de sănătate a reproducerii și bunăstării femeilor. Colul uterin este partea uterului care este conectată la canalul vaginal, și: permite trecerea fluidului menstrual, promovează fertilitatea, protejează uterul și tractul reproductiv superior de agenții patogeni [American Cancer Society, 2014].

Figura 2.2.1. – Localizarea cervixului și implicit a celulelor

cervicale prezente la nivelul acestuia 1

Cervixul conține mai puțin țesut muscular decât uterul și este tapetat cu doua tipuri diferite de celule epiteliale. Acestea sunt:

celule scuamoase – celule plate, subțiri aflate în stratul exterior al colului uterin care

se deschid in vagin (ectocervix);

1 http://www.romedic.ro/cauze-cervicale-ale-infertilitatii-la-femei-0P19110 (accesat la la 29.12.2015 )

celulele glandulare sau celule columnare – celule în forma de coloane care produc

mucus și se găsesc în canalul cervical (endocervix sau exocervix).

Epiteliul scuamos stratificat conține mai multe nivele celulare ce se aplatizează progresiv. Acoperă vaginul si cea mai mare parte a exocervixului. Stratul bazal, compus din celule rotunde, este atașat membranei bazale, care separă și fixează epiteliul de structurile conjunctive subadiacente.

Epiteliul columnar căptușește canalul cervical și se extinde în grade variabile pe suprafața exocervixului. Constă dintr-un singur strat de celule înalte atașate membranei bazale. Celulele glandulare din canalul cervical au tendința de a migra în mod constant în afara canalului. Când se întâmplă acest lucru, celulele suferă modificări ce le convertesc înapoi la celule scuamoase. Acest proces de schimbare este numit metaplazie scuamoasă iar zona în care are loc acest fenomen este cunoscută sub numele de zonă de transformare [Cancer Council Australia,2013].

Figura 2.1.2. – Anatomia sistemului reproducător feminin 2

Totodată, zona de transformare reprezintă locul principalelor tipuri de celule care căptușesc colul uterin. Locația exactă a zonei de transformare se schimbă odata cu înaintatea în vârstă și cu nașterea unui copil. Cele mai multe tipuri de cancere de col uterin debutează în celulele din zona de transformare. Celulele prezente la acest nivel nu cunosc modificări bruște ce ar putea conduce la instalarea cancerului. În schimb, celulele normale ale colului uterin pot parcurge o serie de etape de dezvoltare pană la apariția așa numitor celule anormale.

Figura 2.1.3. de mai jos ilustrează aceste transformări.

2 ESMO-ACF-Cancerul-Cervical-Ghid-Pentru-Pacienti.pdf (accesat la 29.12.2015)

Cu cât celule cervicale ajung la un stadiu mai avansat cu atât nucleul tinde să ocupe toată celula.

Figura 2.1.3. – Etapele de dezvoltare patologică ale celulelor cervicale 3

În mod normal, cavitatea cervicală apare sub formă de cilindru, butoiaș sau con, opacificată uniform și cu vizualizarea orificiului cervical intern bine delimitat.

Celulele cervicale cu un aspect fiziologic normal, prezente pe un frotiu vaginal, recoltate de la baza cervixului în urma unui examen Papanicolau anual, sunt bine diferențiate, în sensul că nucleul este relativ mic în raport cu volumul total al celulei.

Principala problemă în ceea ce privește cancerul de col uterin constă în depistarea celulelor maligne. Lipsa simptomatologiei în fazele incipiente ale infectării cu HPV aduce cu sine consecințe precum identificarea tardivă a celulelor anormale. Screening-ul capătă astfel o reală importanță, motiv pentru care ne dorim să investigăm o metodă eficientă ce nu implică repercursiuni cu caracter nefavorabil. Se cunoaște faptul că celulele recoltate din organism sunt transparente, iar procedurile folosite în prezent în laboratoarele de analize medicale, se bazează pe modificări de culoare introduse prin intermediul unor colorații al căror impact la nivel biochimic este încă necunoscut.

Este necesar de menționat faptul că până la momentul actual testele se împart în două categorii:

testul Papanicolau convențional (figura 2.1.4, a);

3 http://www.sfatulmedicului.ro/arhiva_medicala/stadiile-cancerului-de-col-uterin (accesat la 31.10.2015)

testul Papanicolau în mediu lichid (figura 2.1.4, b).

Testul convențional presupune ca proba, odată recoltată în cabinetul medical, să fie imediat plasată pe lamă si fixată.

În cazul examenului Papanicolau în mediu lichid, proba este introdusă într-un flacon care conține un mediu special și trimisă la laborator pentru procesare, fără pierderea sau deteriorarea celulelor recoltate. Astfel, unul din avantajele testului Papanicolau în mediu lichid este că reduce probabilitatea ca proba să fie considerată nesatisfăcătoare pentru interpretare și astfel să fie nevoie de o nouă recoltare. În plus, acesta permite testarea concomitentă, din aceeași probă, a prezenței tipurilor HPV cu grad ridicat de risc. În ambele cazuri, lama cu celule fixate și colorate este examinată de un operator uman. Abilitatea de a detecta celulele anormale este similară în ambele cazuri [Hutchinson ML,1994].

Test Papanicolau convențional b) Test papanicolau în mediu lichid

Figura 2.1.4. – Categoriile de teste Papanicolau 4

Cu toate acestea, metoda standard cea mai eficientă în detectarea leziunilor de col uterin este biopsia. Se propune efectuarea unei biopsii atunci când testul Papanicolau este anormal sau când la examenul ginecologic se vizualizează o zona anormală pe colul uterin [Mojgan Karimi-Zarchi,2013 Dec.]. Biopsia are scopul de a identifica problema existentă. Dacă testul Papanicolau evidențiază o anormalitate minoră, probabil nu se va efectua imediat o biopsie. De regulă, în această situatie se repetă testul Papanicolaou peste 6 luni.

Biopsia de col uterin sau biopsia cervicală se efectuează de regulă în ambulator, într-un cabinet de ginecologie, într-o clinică sau într-un spital, și nu necesită ca pacienta să fie

internată peste noapte.

4 http://patologiacolului.ro/testul-papanicolau/ (accesat la 05.01.2016)

Dacă se decide să se efectueze o biopsie, medicul va furniza pacientei informații privind cancerul de col uterin, va pune câteva întrebari legate de istoricul său reproductiv, cât și despre posibilitatea de a fi gravidă, iar în finalul consultației va examina colul uterin cu ajutorul unui colposcop, adică va efectua o colposcopie.

Sub ghidaj colposcopic, medicul va preleva o mică probă de țesut din col în scopul verificării ulterioare la microscop a diagnosticului. Această procedură se numeste biopsie de col uterin sau biopsie cervicală.

Există mai multe tipuri de biopsii cervicale. Aceste proceduri pot fi utilizate în scop

diagnostic sau terapeutic.

Principalele tipuri de biopsii cervicale sunt:

biopsia prin ciupire (punch biopsy) – reprezintă o procedură chirurgicală care îndepărtează o bucată mică de țesut de la nivelul colului;

excizia electrochirurgicală cu ansă (LEEP) – reprezintă o procedură chirurgicală prin care se îndepărtează o bucată medie de tesut, la nivelul colului;

conizația – reprezintă o procedură chirurgicală care utilizează laser-ul sau bisturiul pentru a îndeparta o bucată mare de țesut, în forma de con, de la nivelul colului;

chiuretajul endocervical (CEC) – reprezintă o procedură chirurgicală pentru a racla mucoasa canalului endocervical;

dilatația și chiuretajul (D&C) – reprezintă o procedură chirurgicală care se efectuează dacă medicul suspectează că celulele anormale se întind dincolo de colul uterin. Se extrag celule din canalul cervical și din cavitatea uterină [Robert D. Burk, May 1986, Pages 982–989].

Figura 2.1.5. – Tipuri de biopsii cervicale 5

5 http://www.contraboli.ro/colposcopia-si-biopsia-cervicala/(accesat la 05.01.2016)

Riscul de infecție cu HPV pe durata întregii vieți în rândul persoanelor active sexual

este de cel puțin 50%. Deși majoritatea infecțiilor se elimină cu ajutorul imunității proprii, persoanele infectate nu sunt conștiente de prezența HPV și pot răspândi virusul. În condițiile în care sistemul imunitar propriu nu poate elimina infecția, persistența tulpinilor oncogene virale la nivelul mucoasei cervicale poate duce la apariția leziunilor precanceroase și apoi a cancerului cervical [ Georgeta Din., 2011, pag. 76].

În vederea reducerii riscului de infectare cu virusul HPV, se recomandă vaccinarea

[Debbie Saslow, CA Cancer J Clin 2007;57:7–28].

2.2. Epidemiologia cancerului cervical

Cancerul de col uterin rămâne una dintre actualele probleme în oncoginecologie, pe plan mondial reprezentând una din principalele cauze de deces în rândul populației feminine, ocupând locul al doilea ca frecvență, după cancerul mamar, cu un număr de 493 000 cazuri nou apărute și circa 274 000 decese în anul 2002.

În statisticile Organizației Mondiale a Sănatății, România înregistrează cea mai înaltă rată a mortalității prin cancer de col din Europa (peste 13 per 100 000 femei).

Cancerul colului uterin este urmarea unei infecții transmisibile pe cale sexuală cu Virusul Papilloma Uman.

La nivel global, infecția genitală cu HPV este cea mai comună infecție cu transmitere

sexuală. Prevalența infecției cu HPV genital în populația aflată la vârsta reproductivă este de

aproximativ 10%.

Se estimează că aproximativ 80% din populația activă sexual, femei și bărbați, se poate infecta cu HPV pe parcursul vieții. Din fericire, în peste 90% din cazuri, infecția cu HPV este inofensivă, de scurtă durată. Ea dispare de la sine, fără consecințe.

Cu toată această incidență mare și rată înaltă de decese, cancerul de col uterin este una din bolile maligne, care poate fi prevenită și vindecată cel mai eficient dintre toate cancerele.

Cancerul de col uterin are particularitatea de a fi precedat de modificări precanceroase,

preinvazive, care au de obicei o durată lungă ce se întinde pe parcursul a câtorva ani. În această perioadă există posibilitatea să se identifice zonele cu risc și să fie tratate, astfel încât să nu se ajungă la cancer.

Posibilitățile actuale ale medicinei în ceea ce privește prevenția acestei boli se referă la două momente în care se poate interveni eficient pentru a împiedica dezvoltarea acestei forme de cancer și care definesc medical conceptul de prevenție primară și secundară. Prevenția primară constă în vaccinarea împotriva HPV, iar cea secundară în depistarea cât mai timpurie a modificărilor deja induse de virus la nivelul colului, atunci când acestea se află într-o etapă debutantă, precanceroasă, și când sunt asimptomatice.

Folosirea citologiei cervico-vaginale (testul Babeș Papanicolau) pentru depistarea cancerului de col rămâne modelul prin excelență al screening-ului populațional.

În ultimii 50 de ani, incidența și mortalitatea prin cancer cervical au scăzut foarte mult în țările dezvoltate, declin atribuit în primul rând introducerii intensive a screening-ului prin citologie cervico-vaginală. Cancerul cervical constituie însă o problemă importantă de sănatate publică mai ales în țările în curs de dezvoltare, în care nu se realizează o depistare activă a acestei boli și unde se înregistrează 83% dintre cazurile de cancer cervical [Balulescu Irina, 2012].

Regiunile cu risc ridicat sunt Africa de Est și de Vest (rata standard pe vârste ASR/ incidența la 100.000 de femei mai mare de 30 la 100.000), Africa de Sud (26,8 din 100.000), Asia Sud-Centrală (24,6 din 100 000), America de Sud și Africa Centrală (ASR 23,9, respectiv 23 la 100.000). Ratele sunt mai scăzute în Asia de Vest, America de Nord și Australia/Noua Zeelandă (ASR mai mici de 6 la 100.000) [ Jacques Ferlay,2008].

În România se face un screening oportunistic, însă programul național de screening urmează a fi lansat în scurt timp.

Din cele prezentate rezultă cu claritate că tema luată în studiu este de actualitate datorită multitudinii de probleme cu care se confruntă astăzi practica ginecologică, ținând cont de răspândirea și multitudinea de aspecte pe care le prezintă infecția cu HPV și de impactul asupra sănătății.

Figura 2.2.1. – Incidența cancerului cervical 6

6 http://iasifun.ziaruldeiasi.ro/programul-national-de-screening-pentru-cancerul-de-col-uterin/43881/ (accesat la 28.10.2015)

Celulele atipice de la baza cervixului sunt celule aflate la nivelul epiteliului colului uterin care și-au modificat aspectul. Aceste modificări sunt numite frecvent displazie cervicală și sunt depistate cu ajutorul testelor Papanicolau. Cu cât anormalitățile de la nivelul colului uterin sunt mai severe, cu atât este mai probabilă evoluția către cancer de col uterin în viitor. De cele mai multe ori, acest proces poate dura mai mulți ani, dar în cazuri rare se poate întâmpla pe parcursul unui singur an.

Testul Papanicolau face parte din examenul ginecologic. El ajută la detectarea celulelor anormale de la nivelul colului, înainte ca acestea să aibă ocazia de a deveni pre-canceroase sau de a avansa spre cancerul de col uterin. Rezultatele testului Papanicolau îi pot ajuta pe medici să decidă dacă sunt necesare teste suplimentare sau tratamente.

Figura 2.2.2. – Etapele premergătare unui test Papanicolau în cazul diagnosticării unui aspect anormal al celulelor cervicale 7

7 Adapted after “ European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening – Second edition”.

Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities, 2008. International Agency for Research on Cancer ( accesat la 28.12.2015)

Deși infecțiile persistente cu tipuri de risc crescut sunt considerate condiție necesară pentru dezvoltarea cancerului cervical, acestea nu sunt suficiente, căci majoritatea femeilor cu infecții HPV, cu risc crescut nu fac cancer.

Celulele anormale de la acest nivel pot fi cauzate de un număr de factori diferiți (cum ar fi infecția sau inflamația), dar, de obicei, se datorează anumitor tipuri ale unui virus frecvent întâlnit, Virusul Papiloma Uman. În general, celulele anormale de la nivelul cervixului, indiferent de stadiul dezvoltării sau de natura lor, au ca și trăsătură comună mărirea nuceului. Astfel, tipul celulei (sănătoase vs. bolnave) este stabilit în funcție de mărimea nucleului. Diferențele apar și la nivel de citoplasmă, nucleu, nucleoli și cromatină.

Figura 2.2.3. – Aspectul celulelor cervicale 8

Observatii: 1) La celulele bolnave/ canceroase, nucleul este foarte mare, ocupând aproape

toată celula.

2) Raportul dintre volumul ocupat de nucleu din întregul volum celular stabilește

caracterul acesteia de celulă sănătoasă sau bolnavă.

În concluzie, cancerului de col uterin rămâne o problemă gravă a sănătății publice din întreaga lume, în Europa și în România, problemă care se încearcă a fi rezolvată prin implementarea programelor de screening și de vaccinare împotriva virusului HPV – HR . Majoritatea carcinoamele cu celule scuamoase sunt determinate de grupuri preferențiale de factori de risc, prezentând un anumit tipar specific de evenimente în dezvoltarea lor. Riscul apariției carcinomului cu celule scuamoase este reprezentat în primul rând de factorii legați de transmiterea cu caracter sexual a bolilor ( în special infecția cu HPV – HR ), restul factorilor de risc fiind marcați de dieta nesănătoasă, fumatul sau consumul anumitor medicamente.

8 http://www.polimed-targoviste.ro/examen-citologic-babes-papanicolau/ (accesat la 28.12.2015)

Capitolul 3 – Tipuri de microscopie utilizate în analiza celulară

3.1. Noțiuni generale de microscopie

Un microscop este un instrument de mare precizie, care se folosește cu rolul de a produce imagini mult mărite ale unor specimene sau obiecte mici (prea mici pentru a le observa cu ochiul liber).

În funcție de principiul fizic utilizat, microscoapele pot fi de mai multe tipuri:

microscop optic, în care modurile de examinare pot fi: în câmp luminos, în câmp întunecat, în lumină polarizată, de fluorescență, cu contrast de fază, cu contrast prin interferență diferențială, cu lumină catodică, confocal cu laser (Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM), 4Pi-Microscop, de contrast și reflexie;

microscop Röentgen;

microscop electronic: prin transmisie, cu scanare prin reflexie, cu scanare și transmisie;

microscop cu neutroni;

microscop cu unde ultrascurte;

microscop cu forță atomică (Atomic Force Microscope, AFM).

Figura 3.1.1. – Microscop optic 9

9 http://www.opticshop.ro/kit-microscop-optic-de-laborator-1000x-celestron-44106.html (accesat la 08.11.2015)

Figura 3.1.2. – Microscop electronic Figura 3.1.3. – Microscop electronic

cu transmisie (TEM) 10 cu scanare (SEM) 11

Principalele părți componente ale unui microscop optic sunt:

Obiectivele

Obiectivele sunt cele mai importante componente ale microscopului, având ca principală funcție concentrarea luminii care traversează specimenul și proiectarea ulterioară a imaginii în corpul microscopului. Apoi, ocularul transmite imaginea mai departe, la ochiul observatorului. Microscoapele de calitate folosesc obiective din sticlă, nu din plastic. Obiectivele sunt lentilele cele mai apropiate de specimen sau de obiect.

La microscoapele stereo obiectivele sunt în pereche (câte un obiectiv pentru fiecare ocular) pentru a forma o imagine 3D.

Pe obiectivele microscoapelor optice sunt trecute următoarele informații: mărirea (puterea de mărire), lungimea tubului, N.A. (apertura numerică), grosimea optimă a lamelei (sticlei de protecție). Ele sunt prevăzute cu un inel în culoarea specifică puterii de mărire.

Obiectivele au puteri de mărire diferite, de la 1x la 160x, dar cele mai populare variază între 4x si 100x. Majoritatea microscoapelor optice folosite în biologie au 3 sau 4 (ocazional 5) obiective cu puteri de 4x, 10x, 40x si 100x care se rotesc pe un adaptor pentru a oferi diferite puteri de mărire. Obiectivele de 4x, 10x, 40x mai sunt denumite obiective “uscate” ceea ce înseamnă că operează cu aer între obiectiv și specimen. Obiectivele de 100x sunt numite obiective “umede” ceea ce înseamnă că operează cu ulei de imersie între lentilă și specimen.

10 http://chem.ubbcluj.ro/~diudea/proiecte/capacitati/ro/achizitii.html (accesat la 08.11.2015)

11 http://www.wdyl.com/#sem (accesat la 08.11.2015)

Microscoapele stereo au de obicei unul sau două tipuri de oculare cu măriri de 1x, 2x, 3x sau 4x. Mai există și obiective cu zoom care operează între 0.5x si 5x.

Capacitatea de a corecta aberațiile lentilei și planeitatea câmpului determină destinația de utilizare și prețul obiectivelor la microscoapele optice.

Planeitatea câmpului (sau curbura câmpului) se referă la cât de focalizat este specimenul pe întreaga suprafață a imaginii. La obiectivele acromate planeitatea se regăsește pe o suprafață de 50% – 70% din întreaga suprafață a imaginii. Obiectivele semi-apocromate oferă imagini plane pe 70% – 85% din suprafață. Obiectivele apocromate oferă imagini clare pe 90-100% din câmpul vizual.

Apertura numerică (N.A.) este un număr care exprimă o caracteristică a obiectivului de microscop și se referă la câmpul vizual care poate fi observat într-o singură imagine. Este egală cu produsul dintre indicele de refracție și sinusul jumătății unghiului sub care se vede specimenul prin obiectiv . Cu cât numărul N.A. este mai mare, rezoluția este mai bună. N.A poate varia de la 0.04 (putere mică) la 1.4 (putere mare, în cazul obiectivelor plane, “umede”). N.A. este trecut pe obiectiv și de obicei apare astfel: 4x→NA=0.10, 10x→NA=0.25, 40x→NA=0.65 și 100x→NA=1.25

Rezoluția (propriu-zisă, nu teoretică) reprezintă distanța minimă la care două puncte ale specimenului pot fi văzute tot separat când sunt observate prin microscop. Cu cât rezoluția este mai mare cu atât cele doua puncte pot fi mai apropiate și văzute distinct prin microscop în același timp. Rezoluția aparține obiectivelor și nu ocularelor, cele din urmă doar mărind rezoluția.

Uneori obiectivele au inele colorate (după un sistem de culori universal recunoscut) pentru a putea identifica mai ușor puterea de mărire: negru=1x, maro=2x, roșu=4x, galben=10x, verde=20x, turcoaz=25x, albastru deschis=40x, albastru închis=60x, alb=100x.

Alt număr care se poate afla înscris pe un obiectiv (cum ar fi 0.17) se referă la grosimea în mm a lamelei recomandată de producător pentru a îmbunătăți performanțele obiectivului.

Parfocal – se referă la posibilitatea de a schimba obiectivele de diferite puteri și de a păstra focalizarea (sau să fie necesară foarte puțină refocusare).

Paracentrat se referă la poziția centrată a specimenului care rămâne aceeași după schimbarea obiectivelor.

Uleiul de imersie concentrează lumina și mărește rezoluția. Un ulei special este folosit cu obiectivele de 100x atunci când se dorește obtinerea de măriri cuprinse între 1000x și 1500x. Tehnica este folosită pentru a face să dispară aerul aflat între obiectiv și specimen, astfel mărindu-se valoarea indicelui de refracție și odată cu acesta, se mărește valoarea aperturii numerice (vezi definiția N.A.). După ce obiectivul atinge uleiul, care trebuie sa aibă o reflectivitate specifică, cele doua elemente se comportă ca o singură unitate. Uleiul de imersie este singurul ulei potrivit pentru acest scop, asigură imagini mărite de calitate și înlătură pericolul distrugerii obiectivului. Există două tipuri de uleiuri de imersie – tipul A care are o vâscozitate scăzuta și tipul B cu o vâscozitate mai mare [Mortimer Abramowitz,Vol. 33, No. 4 (2002)].

Figura 3.1.4. – Obiective microscopice 12

Ocularele

Ocularele sunt formate dintr-o serie de lentile montate într-un tub și se află în partea superioară a unui microscop. Funcția principală a ocularelor este aceea de a permite utilizatorului să vadă imaginea focusată, proiectată de obiectiv și să mărească pentru a doua oară această imagine. Ca și în cazul obiectivelor, ocularele construite din plastic asigură o calitate scăzută. Ocularele pot fi de diferite design-uri: Huygens, Ramsden, Kellner, Plossl, etc. și toate sunt potrivite pentru microscoape.

Ocularele sunt de obicei de 10x dar există și oculare 5x, 12.5x, 15x si 20x. “x” se referă la puterea de multiplicare a măririi pe care o dă deja obiectivul. Pe oculare sunt înscrise puterea de mărire și diametrul aperturii. Apertura este cea care limitează câmpul vizual.

Ocularele pot fi și cu un câmp vizual larg (majoritatea fabricate pentru 10x dar se întâlnesc și de 15x sau 20x). În acest caz au un diametru mare.

12 http://latodis-med.com/aparatura-medicala/ustensile-aparate-medicale/obiective-microscoape-semiplan.html (accesat la 07.11.2015)

Relieful ocular este distanța (în milimetri) dintre ochiul observatorului (cornee) și suprafața cea mai apropiată a ocularului – cu cât este mai mare acest relief ocular cu atât mai bine pentru cei care poartă ochelari.

Punctul ocular este poziția ideală a ochiului față de ocular pentru obținerea celei mai bune imagini.

Observație: Un reticul (micrometru) este o bucată de sticlă care are o scăriță gradată ce permite efectuarea de măsurători în plan transversal asupra obiectelor văzute prin microscop.

Inelul de ajustare a dioptriilor face posibilă obținerea de imagini focalizate pentru persoanele care au dioptrii diferite la ochi. Inelul pentru ajustarea dioptriilor poate fi folosit și de cei care poartă ochelari pentru a vedea imagini clare și fără a purta

ochelari. În mod normal, inelul se află pe ocularul stâng.

Cupele de cauciuc ale ocularelor se întâlnesc mai ales la microscoapele stereo. Au rolul de a reduce lumina ambientală și oferă comfort – nu este recomandat să fie folosite de persoanele care poartă ochelari.

Figura 3.1.5. – Oculare microscop 13

Condensorul

Condensorul este o lentilă sau un sistem de lentile care se află imediat după sursa de iluminat și are rolul de a concentra fasciculul într-un con de lumină spre specimen. Obiectivele puternice au diametre foarte mici și au nevoie de o lumină corespunzătoare. Un condensor clasic este de obicei fix.

Observație: Un condensor ar trebui să aibă un N.A. egal sau mai mare cu N.A. al obiectivului folosit. Un condensor clasic care are N.A de 0.65 este bun pentru măriri de 400x sau mai mici.

13 http://latodis-med.com/aparatura-medicala/ustensile-aparate-medicale/microscoape-ocular-microscop.html (accesat la 07.11.2015)

Unele condensoare pot fi construite având accesorii speciale de control al fazei, de polarizare a luminii.

Figura 3.1.6. – Condensor de câmp întunecat 14

Diafragma

Diafragma mai este denumită și diafragma de sub platformă sau diafragma aperturii. De obicei se găsește sub platforma microscopului și ajustează cantitatea de lumină care trece spre specimen. Este foarte utilă la puteri mari de mărire. Majoritatea microscoapelor optice au una din cele două tipuri de diafragme:

Diafragma disc – cel mai simplu și mai ieftin tip de diafragmă. Este localizată între sursa de lumină și lamă sau specimen. Constă dintr-un disc rotativ și 5-10 orificii de diferite diametre care pot limita cantitatea de lumină care trece.

Diafragma iris – un tip de diafragmă mai simplu și mai scump. Au un diametru variabil (precum irisul unui ochi) care are rolul de a limita diametrul orificiului prin care trece lumina. Se poate astfel optimiza rezoluția, contrastul, claritatea. De obicei se controlează cu ajutorul unei mici manete. [Shinya Inoue, 1986] [Douglas B. Murphy, 2001]

Figura 3.1.7. – Diafragmă tip iris 15

14 http://www.daisy-medical.ro/microscopes/condensator-de-camp-intunecat-611 (accesat la 07.11.2015)

15 http://www.skywatcher.ro/SSpectrum/iris.htm (accesat la 07.11.2015)

3.2. Microscopia în câmp luminos

Alături de microscopia în câmp întunecat, microscopia de fază și microscopia de fluorescență, microscopia în câmp luminos face parte din așa numita categorie de microscoape optice.

Numele " luminos " este derivat din faptul că specimenul analizat este întunecat iar contrastul din jurul domeniului de vizualizare este luminos. Microscoapele cu lumină simplă sunt denumite uneori ca fiind microscoape în câmp luminos.

Celulele sunt aproape total transparente, lucru ce face contrastul foarte slab la analiza în câmp luminos. Chiar prin analiza vizuală a celulelor de către un operator, de cele mai multe ori este imposibil să se detecteze în mod cert frontierele dintre celule, mai ales în cazul în care celulele se află într-un amalgam celular. În plus, din moment ce nu se aplică nicio colorare specifică, nucleele sunt de multe ori doar slab vizibile. Cu toate acestea, au fost publicate recent un număr de studii care arată utilitatea modului de examinare în câmp luminos în detectarea celulelor cât și în analiza automată a imaginii cu populații de celule

[ Jyrki Selinummi, October 22, 2009].

Etapele ce trebuiesc parcurse atunci când se dorește investigarea unui specimen cu ajutorul unui microscop care funcționează în modul de examinare câmp luminos (bright field BF) sunt:

Așezarea specimenului ce se dorește a fi investigat pe o lamelă de sticlă foarte subțire numită coverslip.

Optimizarea luminii

O sursă de lumină trebuie să aibă un interval dinamic larg pentru a oferi o iluminare de mare intensitate la măriri mari și intensități mai mici astfel încât utilizatorul să poată vizualiza confortabil la măriri mici.

Reglarea condensorului

De regulă, se începe cu apertura diafragmei închisă pentru a vedea dacă se observă lumina care provine de la schimbarea luminozității specimenului.

Stabilirea obiectivelor potrivite pentru investigație și localizarea specimenului

Reglarea ocularelor

Alegerea unui obiectiv optim pentru aplicația dorită

Un obiectiv cu o putere de mărire mai mare nu este întotdeauna alegerea cea mai bună. Toate probele au trei dimensiuni și dacă un exemplar este extrem de subțire, va fi în imposibilitatea de a se concentra cu un obiectiv de mărire mare. Cu cât capacitatea de mărire a obiectivului este mai mare cu atât este mai greu de găsit un specimen în mișcare.

După parcurgerea etapelor amintite mai sus, utilizatorul ce folosește un microscop în câmp luminos trebuie să fie conștient de faptul că va putea investiga, în acest caz, numai exemplare colorate sau pigmentate natural. În cazul unor specimene lipsite de culoare, vizualizarea acestora se va face mult mai greu iar pericolul apariției distorsiunilor este destul de mare.

Printre avantajele oferite de acest tip de microscop se numără și:

Simplitatea de utilizare, necesitând puține ajustări ce trebuiesc efectuate pentru a vedea anumite specimene/celule.

Unele specimene pot fi vizualizate fără colorare iar optica utilizată în tehnica de câmp luminos nu modifică culoarea modelului celular.

Compatibilitatea cu noua tehnologie, piesele opționale de echipament fiind ușor de adăugat oferind astfel versatilitate în sarcinile ce trebuiesc efectuate.

Ca orice echipament, prezintă și anumite dezavantaje prin raportare la celelalte tehnici mai dezvoltate de microscopie, unele dintre aceste dezavantaje fiind inerente în orice tehnică optică de imagistică:

Prin utilizarea unei aperturi pentru contrast, după un anumit prag, contrastul mai puternic adaugă distorsiuni. Cu toate acestea, folosirea unei diafragme iris va ajuta la compensarea acestei probleme.

Prezintă un contrast foarte scăzut și prin urmare cele mai multe celule necesită colorare pentru a putea fi văzute, lucru nedorit întrucât colorarea poate introduce detalii inutile care nu ar trebui să fie prezente sau poate modifica starea celulelor. De asemenea, utilizatorul va trebui să cunoască tehnicile de colorare.

Necesită o sursă de lumină puternică pentru aplicații ce presupun măriri mari, lumina intensă producând căldură, încalzire ce poate deteriora specimenele sau ucide microorganismele vii de analizat.

Segmentarea obiectelor transparente de fază, cum ar fi celulele biologice din imagini achiziționate cu un microscopic în câmp luminos, este o problemă dificilă din cauza lipsei intensității de contrast observabil cât și datorită zgomotului. În lucrarea de față, s-a pornit de la achiziționarea de imagini ale celulelor cervicale cu ajutorul microscopului în câmp luminos.

Figura 3.2.1. – Imagine cu celule cervicale fără colorare obținută cu

ajutorul microscopiei bright field 16

Ca urmare a întâmpinării problemei amintite mai sus, cea a contrastului slab, celulele recoltate în cadrul testului Papanicolau au fost tratate cu anumiți coloranți. Lamela cu celule a fost analizată ulterior cu ajutoul unui microscop care lucrează în câmp luminos. Deși contastul este puternic îmbunătățit, putându-se astfel distinge atât nucleul celulelor cât și limita dintre acestea, proprietățile biochimice ale celulelor cervicale au fost puternic influențate.

Figura 3.2.2. – Imagine cu celule cervicale cu colorare obținută cu

ajutorul microscopiei bright field 17

3.3. Microscopia prin contrast diferențial de interferență (DIC)

DIC reprezintă o tehnică de microscopie optică prin iluminare, utilizată în scopul îmbunătățirii contrastului și obținerii de informații cu privire la densitatea optică precum și pentru evidențierea unor proprietăți altfel invizibile, în cazul unor substanțe transparente, fără culoare. Deși pot fi utilizați coloranți pentru a face aceste subiecte transparente vizibile, colorarea poate să le ucidă.

16 http://spie.org/newsroom/coming-into-focus?highlight=x2416&ArticleID=x17657 (accesat la 23.06.2016)

17 http://5minuteconsult.com/collectioncontent/1-151349/diseases-and-conditions/abnormal-pap-and-cervical-dysplasia (accesat la 23.06.2016)

Tehnica se mai numește și Nomarski Interference Contrast (NIC) sau Microscopie Nomarski. Imaginile astfel obținute sunt în mare măsură asemănătoare cu cele obținute prin microscopia în contrast de fază, obiectul apărând în tonuri de alb și negru pe un fundal gri, dar fără inelele de difracție. Prin urmare, microscopia prin contrast diferențial de interferență a fost dezvoltată pentru a permite observarea de specimene transparente în timp ce acestea sunt încă în viață.

Structura de bază a microscopului DIC este aceeași cu cea a unui microscop obișnuit (în câmp luminos), cu excepția faptului că include plăci polarizate și prisme Wollaston*. Aceste elemente optice schimbă imaginea unui specimen transparent în diferite niveluri de intensitate a luminii. Cu alte cuvinte, atunci când se privește printr-un microscop care are montat modulul DIC, obiectele analizate rămân în stare naturală, adică transparente pentru lungimile de undă din spectrul vizibil, fiind obiecte de fază. Imaginile corespunzătoare nu mai sunt colorate ci sunt imagini compuse din diferite niveluri de intensitate a luminii. (* Prismele Nomarski sunt, de asemenea, folosite în loc de prisme Wollaston)

Lumina se refractă deoarece trece printr-un specimen, chiar dacă acesta este incolor, transparent. În cazul în care indicele de refracție al specimenului de analizat este diferit de indicele mediului înconjurător, lumina care trece prin obiect va ajunge la un anumit punct de destinație mai repede (sau mai lent) decât lumina care trece prin materialul înconjurător. Pe scurt, atunci când lumina trece printr-un obiect, va exista o schimbare de fază.

Un specimen al cărui unic efect asupra luminii este o schimbare de fază este numit un obiect de fază (figura 3.3.1. ). Acesta are fie grosime diferită de la punct la punct, fie indice de refracție diferit. Datorită acestui fapt, o undă luminoasă va călători mai repede sau mai încet prin diferite puncte ale specimenului și frontul de undă plan este modificat în diferite puncte care trec prin specimen.

Figure 3.3.1. – Transformarea unui front de undă plan după

ce a trecut printr-un obiect de fază 18

18 http://www.techinst.com/pub_docs/manuals/Biological/TiDICAttachment.pdf (accesat la 28.11.2015)

Figura 3.3.2. ilustrează principiul de funcționare al unui microscop DIC. Sursa de lumină este situată pe partea stângă astfel încât lumina călătorește de la stânga la dreapta. Un polarizor și o prisma Wollaston sunt fiecare plasate pe partea condensorului și încă o prismă identică după obiectiv. Când lumina de la sursa de lumină trece prin polarizor, aceasta va fi polarizată (rămâne o singură direcție de oscilație a vectorului intensitate câmp electric). Când această lumină polarizată trece prin prisma Wollaston 1, este împărțită în două raze care au planuri reciproc perpendiculare ale polarizarii (direcția de vibrație); cele două raze călătoresc la o ușoară distanță una față de cealaltă.

Figura 3.3.2. – Principiul microscopului DIC 19

Deoarece prisma Wollaston 1 este în plan focal față de condensor, cele două raze trec prin specimen în paralel, la o ușoară distanță una de cealaltă. Distanța dintre raze se numește deviație. Cum deviația este stabilită prin puterea de rezoluție a obiectivului, specimenul nu apare ca o dublă imagine. După momentul în care două raze trec prin specimen, acestea sunt colectate de obiectiv, mai exact în planul focal din spatele obiectivului.

Prisma Wollaston 2 are rolul de a recombina cele două raze înapoi într-una singură. Cu toate acestea, razele nu interferă între ele întrucât au planuri perpendiculare de polarizare. Analizorul (2) este plasat astfel încât direcția de polarizare să fie perpendiculară pe polarizor (1). În cazul în care specimenul nu a schimbat faza undei luminoase incidente, cele două raze de lumină interferă unele cu altele, fapt ce transformă zona într-un plan întunecat. În cazul în care obiectele de fază din specimen schimbă faza fasciculului de lumină, cele doua raze de lumină nu interferă una cu alta, iar unele zone apar ca fiind strălucitoare. Această diferență de luminozitate explică cum microscopul DIC reușește să facă vizibile specimenele transparente [Nikon, Eclipse Ti Series, Differential Interference Contrast Attachement, Instructions].

19 http://www.edmundoptics.com/technical-resources-center/microscopy/optical-microscopy-application-differential-interference-contrast/ (accesat la 29.11.2015)

Pe scurt, principiul de funcționare presupune ca proba să fie traversată de cele două fascicule provenite de la prisma Wollaston, cu polarizări diferite. La recombinarea acestora, acolo unde lungimile drumurilor optice sunt diferite, intervine interferența, ceea ce conferă

imaginii obținute aspectul unui relief 3D corespunzător modificărilor de densitate optică (indice de refracție și grosime) a probei. Prin aceasta, liniile marginale, extremitățile sunt accentuate. Astfel, imaginea seamănă mai mult cu o umbră monocromatică în care este evidențiat gradientul de drumuri optice după frecvențele spațiale înalte și joase, prezente în probă. Gradientul diferenței de drum optic tinde să crească iar contrastul imaginii specimenului studiat crește cu rapiditate, deoarece regiunile acestuia, unde drumurile optice cresc de-a lungul unei direcții de referință apar luminoase (sau întunecate), în timp ce zonele în care diferențele de drumuri descresc apar în contrast invers.

Figura 3.3.3. – Imagini cu celule cervicale obținute cu ajutorul microscopiei

prin contrast diferențial de interferență

DIC beneficiază de următoarele avantaje:

Vizualizarea probelor transparente fără a fi nevoie de colorarea acestora;

Producerea de imagini cu înaltă rezoluție;

Afișarea unui contrast bun;

Permite a fi utilizat cu specimene groase;

Imaginile pot fi prelucrate în continuare (video îmbunătățit).

DIC este un instrument foarte util pentru vizualizarea exemplarelor necolorate. Acesta este în mod clar un avantaj atunci când se dorește respectarea vieții specimenelor, cum ar fi organismele mici, țesuturi sau celule. DIC mai pot fi utilizat în mod eficient în multe alte aplicații specializate cum ar fi:

DIC IR

O aplicație interesantă a DIC este imagistica de celule din interiorul țesuturilor, cum ar fi secțiuni ale țesuturilor din creier folosite în electrofiziologie. Aici, lumina în infraroșu (IR) este folosită întrucât aceasta pătrunde mai adânc în feliile de țesut decât lumina vizibilă. În acest caz, detectorul trebuie să fie sensibil la aceste lungimi de undă.

Microscopia cu lumină reflectată DIC

Există aplicații ale DIC în știința materialelor, utilizând lumină reflectată. În acest caz, principiile sunt aceleași dar configurația este mai simplistă [A. Lasslett, September2006].

Figura 3.3.4. – Detalii de suprafață obținute cu ajutorul microscopiei DIC 20

Cele mai multe microscoape moderne, la nivel de cercetare, atât în poziție normală cât și inversată, pot fi modificate pentru a include elementele necesare modului de examinare DIC. În multe cazuri, modificarea constă numai în adăugarea de polarizori, prisme și cursoare. Dezavantajele de complexitate și costuri sunt însă compensate de rezoluția impresionant de mare, de imaginile cu contrast ridicat, neexistând domeniu de aplicare care să nu permită combinarea DIC cu alte aplicații, cum ar fi fluorescența.

Spre deosebire de microscopia în câmp luminos, microscopia prin contrast diferențial de interferență este o bună alternativă pentru a obține imagini corecte ale specimenelor necolorate care de multe ori oferă numai o imagine slabă în câmp luminos.

3.4. Microscopia holografică

Observarea celulelor biologice cu ajutorul microscoapelor optice a fost mult timp un subiect dificil pentru oamenii de stiintă. Două probleme majore au făcut ca obținerea de imagini cu celule să fie extrem de dificilă. Prima dintre acestea este limita optică de difracție

20 http://www.gia.edu/gems-gemology/summer-2015-digital-photomicrography-gemologists (accesat la 28.11.2015)

care este de aproximativ jumătate din lungimea de undă a luminii folosite la microscop. Acest lucru face aproape imposibilă distingerea structurilor intracelulare care sunt mai mici decât limita de difracție. O altă problemă este diferența scăzută a indicelui de refracție între o celulă și mediul înconjurător, diferență ce în mod obișnuit este mai mică de 0,1. Deci, o singură celulă arată ca aproape transparentă, lucru ce determină ca obținerea de imagini cu contrast ridicat să fie dificilă atunci când sunt utilizate microscoape optice clasice.

În acest scop, diferite tehnici au fost dezvoltate pentru a depăși problema indicelui de refracție. Una dintre metodele bine dezvoltate este posibilitatea de a utiliza markeri ca agenți de contrast, cum ar fi coloranți de fluorescență și puncte cuantice, ce sunt capabile să fie atașate pe unele părți ale celulei. Dar aceste metode au probleme cauzate de agentul de contrast, cum ar fi foto-oxidarea sau toxicitatea pentru probele biologice, probleme amintite și la tipurile anterioare de microscoape discutate în prezenta lucrare. Cealaltă metodă bine cunoscută pentru a îmbunătăți contrastul imaginii este de a profita de schimbarea de fază a trecerii luminii prin proba transparentă. Descoperirea microscopului holografic a permis “investigarea” celulelor biologice în scopul observării morfologiei celulei sau grosimii acesteia în timp real, schimbarea volumului și asa mai departe [Yoonsung Bae, 2009].

Istoria holografiei a început în 1948, când Dennis Gabor a raportat o metodă de evitare a aberației de sferice și de îmbunătățire a calitații imaginii în microscopia electronică, metodă cu ajutorul căreia se economisesc lentile în instalația experimentală [Gabor, 1948]. În arhitectura de bază, Gabor definește o configurație în linie în cazul în care două fascicule intervin în planul de înregistrare: fasciculul de imagistică cauzat de difracția pe probă și fasciculul de referință datorat nondifracției de lumină ce trece prin eșantion. Deoarece ambele fascicule de lumină care interferă se propagă în aceeași direcție, reconstrucția obiectului complex a frontului de undă se suprapune cu imaginea obiectului ce corespunde frontului de undă conjugat și cu zero, termenul pentru hologramă (intensitatea undei de referință). Ca urmare, holografia Gabor suferă de zgomotul datorat suprapunerii între termeni în procesul de reconstrucție. Cea mai importanta limitare vine de la faptul că abordarea Gabor este aplicabilă numai atunci când se analizează probe de difracție slabe, sau cu alte cuvinte, procesul trebuie condus de holografie si nu prin difracție [V. Micó, 2010].

Pentru a elimina aceste deficiențe, fasciculul de referință poate fi introdus din exterior la planul de înregistrare, permitând astfel ca holografia să domine procesul de înregistrare, indiferent dacă proba trebuie sau nu să fie considerată ca si o difracție slabă. Suprapunerea la planul de înregistrare atât a unui fascicul de referință filtrat spațial cât și a unui fascicul de imagistică ce transportă informația despre probă, produce figura de interferență. Se poate distinge între diferite moduri de introducere a fasciculului de referință, dar, în esență, există două opțiuni: off-axis [Leith EN., 1964] si configurația on-axis [Gabor D., 1966]. Anteriorul evită distorsiunile cauzate de suprapunere, în direcția de observare, din cei trei termeni holografici primiți de la configurația în linie de la imagini reale și virtuale propagate la diferite unghiuri. Și aceasta din urmă are nevoie de înregistrarea mai multor holograme de obicei, prin varierea fazei fasciculului de referință, cu scopul de a evita denaturarea.

Actualmente, microscopia holografică digitală ( DHM ) se dezvoltă vertiginos și are drept scop depășirea multor obstacole pentru obținerea unor imagini de înalta calitate. Văzută ca o tehnologie modernă ce permite studii imagistice 3D, cantitative, de fază, în timp real, care nu distruge proba și nu folosește markeri și colorații, DHM capătă un rol important în ceea ce privește aplicațiile biomedicale.

Conceptul de bază în holografia digitală este înregistrarea figurii de interferență care se obține din suprapunerea undei de referință cu cea de obiect. Prin prelucrarea cu ajutorul unui calculator, este posibil să se recupereze informațiile complete ale formelor de undă complexe difractate de către obiect, adică amplitudinea și faza. Metoda de obținere a acestei informații include un proces de filtrare în spațiul Fourier în scopul de a selecta imaginea reală de cea virtuală care se obținea din cauza ordinelor +1 și -1 de difracție. După filtrare, holograma digitală rezultată este multiplicată cu o undă de referință numerică care se potrivește cu referința fizică utilizată pentru înregistrarea hologramei digitale. Apoi, se poate face o reconstrucție numerică bazată pe integrala Fresnel-Kirchhoff, permițând astfel să se calculeze amplitudinea și faza în planuri diferite și, în special, în vecinătatea planului focar unde se obține imaginea focalizată a obiectului.

Ca orice tehnică holografică, și microscopia holografică digitală respectă două ETAPE:

1. Înregistrarea hologramei;

2. Reconstrucția imaginii obiectului.

Prima etapă este experimentală și constă în realizarea unui montaj care să permită înregistrarea hologramei obținută prin suprapunerea dintre o undă de obiect (reflectată sau transmisă de obiect) și una de referință. Această figură de interferență se înregistrează pe senzorul unei camere video sau foto.

A doua etapă este numerică și pornește de la holograma înregistrată experimental sub forma unei imagini digitale, care, transmisă la computer, devine o matrice de numere care se poate prelucra folosind operații specifice. În această etapă se realizează reconstrucția imaginii 3D a obiectului prin simularea propagării pornind de la hologramă și utilizând un soft specializat bazat pe teoria scalară a difracției, în aproximația Fresnel în câmp apropiat.

3.4.1. Configurații holografice digitale

O privire de ansamblu asupra principalelor tipuri de configurații interferometrice utilizate în holografia digitală este importantă întrucât, înainte de începerea unui experiment practic trebuiesc puse în ordine toate aspectele legate de instalația experimentală în vederea obținerii ulterioare a celor mai bune rezultate. În primul rând, holografia Fresnel se referă la o configurație în care obiectul se află la o distanță finită față de planul hologramei iar referința este de obicei o undă plană. Imaginile se formeaza atunci când poziția obiectului și poziția sa în oglindă relativ la hologramă, respectă mărirea unitate, fapt ilustrat și în figura 3.4.1. Pentru a evita suprapunerea imaginilor reale și virtuale după reconstrucție, undele de referință si cele ale obiectului sunt shiftate cu un unghi, lucru încercat inițial de catre Leith și Upatnieks. Poziția imaginii și mărirea pot fi manipulate prin utilizarea unei alte referințe. Plasarea la o distanță suficient de mare și utilizarea transformatei Fresnel în etapa de reconstrucție permit imagistica unui obiect mai mare decât dimensiunea matricei CCD, lucru favorabil mai ales in aplicații metrologice macroscopice [Kim Myung K., 2010].

Figura 3.4.1 – Holografia Fresnel off-axis. Cu albastru sunt reprezentate fasciculele de

referință iar cu roșu modul de propagare al unui punct pe un obiect : ( a) de înregistrare și ( b ) de reconstrucție 21

Holografia off-axis este necesară pentru a evita suprapunerea dintre ordinul zero și imaginile holografice. Acest lucru reduce însă conținutul de informații al hologramei la un sfert din numărul de pixeli.

21 http://photonicsforenergy.spiedigitallibrary.org/article.aspx?articleid=1305556 (accesat la 27.12.2015)

Cu un alt tip de configurație holografică, mai exact prin intermediul configurației in-line, câmpul obiectului este aliniat perfect cu fasciculul de referință iar întregul număr de pixeli al hologramei este utilizat, fapt ce conduce la distanțe minime mai scurte pentru reconstrucția Fresnel și o rezoluție mai mare a imaginii rezultate. Au fost propuse și demonstrate mai multe metode pentru a reduce sau elimina efectul ordinului zero și efectul imaginilor duble. Termenul de ordinul zero (sau DC) poate fi parțial suprimat prin simpla

scădere a intensității medii a întregii holograme sau alternativ, prin aplicarea unui filtru trece-sus transformatei Fourier a hologramei în apropierea frecvenței de zero. Eficacitatea filtrului trece-sus depinde de conținutul spectral al obiectului. Expunerile separate ale referinței, obiectului și scăderea lor din hologramă înainte de filtrarea de ordin zero, îmbunătățesc rezultatul. Eliminarea așa numitor imagini duble este mai puțin simplă și necesită tehnici speciale. Totusi, metoda de aplicare a unui filtru trece-sus pot fi eficientă atunci când natura dinamică a obiectului se opune metodei de defazare [Kim Myung K., 2010].

Figura 3.4.2. – Holografia in-line: ( a) suprapunerea dintre obiect și referință; ( b )

reconstrucția imaginii obiectului (ordinul +1) cu dezavantajul că există atât ordinul zero cât și imaginea dublă/geamănă (ordinul -1) 22

Pe de altă parte, microscopia holografică digitală in-line sau on-axis constituie un instument potrivit pentru aplicații biologice fiind un model superior microscopiei convenționale cu lumină compusă. Avantajele holografiei digitale in-line întăresc ideea de mai sus:

Simplitatea microscopului: holografia in-line este un tip de microscopie fără

obiective. Hardware-ul necesar constă dintr-un laser, un orificiu și o cameră (CCD);

Simplitatea de pregătire a probelor: secționarea sau colorarea nu sunt necesare

astfel că pot fi vizualizate celulele în starea lor naturală;

22 http://photonicsforenergy.spiedigitallibrary.org/article.aspx?articleid=1305556 (accesat la 27.12.2015)

Viteza: modificările în specimen pot fi urmărite cu o viteză egală cu numărul de frame-uri ale camerei CCD;

Multitudinea de informații: o singură hologramă conține toate informațiile despre

structura tridimensională a obiectului;

Rezoluția maximă: rezoluția optimă, de ordinul lungimii de undă a laserului, poate fi obținută cu ușurință [Wenbo Xu, July 16, 2001].

Figura 3.4.3. – (A) Aranjamentul de bază al holografiei in-line;

(B) Schema aranjamentului experimental folosit pentru a

înregistra o imagine optică și o hologramă a aceluiași obiect 23

Un laser ( L ) iluminează un orificiu ( P ), care acționează ca o sursă punctiformă . Undele sferice care pornesc din orificiu ilumineaza obiectul ( O ), iar interferența la ecran ( C ) a undelor împrăștiate ( – – – ) cu unda de referință ( – ) constituie holograma.

Ocularul ( f ), camera ( g ), oglinda ( h ) și obiectivul ( b ) fac parte dintr-un microscop inversat. Pentru a înregistra holograma, lumina de la un laser ( a ) este reflectată pe o oglindă și mai apoi concentrată de obiectiv pe orificiu ( c ). Lumina care iese din orificiu trece prin obiect, prin substratul de sticlă ( d ) și formează o hologramă pe cipul CCD ( e ). Pentru a înregistra o imagine optică conventională a obiectului, oglinda este transformată pentru a permite ca lumina albă de la o lampă

( nu apare reprezentată în figura 16 ) care luminează obiectul, să ajungă la un al doilea cip CCD atașat la ocular.

23 http://www.pnas.org/content/98/20/11301.full.pdf (accesat la 26.12.2015 )

Având în vedere cele de mai sus, cât și urmarea principiului interferometric de bază, diferite stucturi clasice pot fi utilizate pentru a asambla o configurație DHM.

În acest sens, Mach-Zehnder [Zhang T., 1998], Michelson [Iwai H., 2004], Twyman-Green [Reichelt S., 2005] au fost propuse pe post de arhitecturi interferometrice de bază. Dintre acestea, configurația Mach-Zehnder este de departe cea mai utilizată în practica DHM [Wahba HH., 2009].

3.4.2. Comparație între microscopia holografică digitală și cea analogică

Există o serie de distincții semnificative între holografia digitală (DH) si cea analogică (AH). Cea mai evidentă dintre acestea este reprezentată de faptul că DH nu implică procesare fotochimică. Prin urmare, DH este mult mai rapidă și poate fi derulată la rate video. Echipamentele suplimentare necesare pentru DH constau dintr-o camera CCD și un calculator, iar utilizarea unei camere întunecate, obscure și a produselor chimice nu mai este necesară.

Mai mult decât atât, datorită sensibilitații mai ridicate a camerei CCD față de o emulsie fotografică, timpul de expunere este redus cu câteva ordine de mărime. Spre exemplu, un pixel CCD de suprafață egală cu 100 poate detecta câtiva fotoni în vreme ce o suprafață echivalentă de placă fotografică de sensibilitate înaltă poate depista câteva milioane de fotoni.

Timpii mici de expunere implică, de asemenea, și cerințe mult scăzute în ceea ce privește stabilitatea mecanică a aparatului. Adesea, mesele optice grele cu izolare a vibrațiilor nu constituie elementul critic.

Pe de altă parte, principala problemă o constituie faptul că rezoluția spațială a senzorului camerei CCD este mai mică decât a emulsiilor holografice de pe plăcile holografice pe care se înregistrau clasic hologramele. Un pixel CCD tipic are un diametru de câțiva microni, în vreme ce granularitatea unei emulsii fotografice poate fi cu 2 ordine de mărime mai fină. Acest element limitează frecvența spatială a marginilor și deci, mărimea unghiulară a obiectului la puține grade pentru DH, în vreme ce un unghi de 180° este posibil pentru AH.

Efectul de paralaxă, des întalnit în cazul afișajului de holograme AH, nu este fezabil în mod curent în cazul DH [Yu L. F., 2002]. Adevarata putere a DH este întreaga gamă de tehnici numerice performante ce pot fi aplicate odată ce holograma este introdusă într-un computer. Din momentul în care computerul a introdus holograma într-o matrice, utilizatorul nu mai trebuie decât să specifice dimensiunea câmpului de vedere și lungimea de undă, iar apoi să calculeze difracția numerică. În cazul AH, totuși, pentru a citi corect holograma mărită sau micșorată, lungimea de undă trebuie să fie modificată în mod proporțional, în acord cu valoarea lungimii de undă folosită la înregistrarea experimentală a hologramei.

Un alt exemplu îl constituie interferometria holografică folosind lungimi de undă multiple. În interferometria AH, multiple holograme sunt produse și repoziționate în mod exact, iar în mod ideal fiecare hologramă necesită să fie iluminată cu o lungime de undă diferită, scenariu ce poate fi uneori greu de realizat. Mai des întalnit, hologramele superpoziționate sunt iluminate cu o singură lungime de undă, iar rezultatul prezintă aberații ce nu pot fi prevenite. În DH, superpoziția constă într-o simplă adunare de mai multe matrici numerice. Nu există limitare asupra numărului de matrici. De aceea, există căi de preprocesare a matricilor în vederea compensării aberațiilor cromatice, sau de altă natură, dacă acestea sunt prezente.

Datorită sensibilității sale și a versatilității tehnice, microscopia cantitativă de fază este foarte importantă și constituie un domeniu activ de cercetare, cu numeroase aplicații în holografia digitală [Cuche E., 1999]. Aberațiile sau alte deformări are frontului de undă pot fi compensate cu ușurință prin folosirea unei unde de referință [De Nicola S., 2005]. În cadrul softului de reconstrucție, imaginea 3D a obiectului se obține inițial ” înfășurată ” adică valorile sunt toate menținute în intervalul 2π. Prin aplicarea unor algoritmi specifici de “despachetare”, se obține imaginea desfășurată a obiectului, cu valorile reale ale diferențelor de fază introduse de către obiect. Rezultatul este obținerea unei imagini cu rezoluție de ordinul nanometrilor de-a lungul axei și cu întindere transversală de ordinul sutelor de micrometri. Aceste lucruri, alături de rezoluția temporală foarte mare (nu necesită scanare în montajul experimental) constituie principalele avantaje ale microscopiei holografice digitale [Kuhn J., 2007].

3.4.3. Aplicații biomedicale ale microscopiei holografice digitale

Holografia digitală oferă o serie de noi deschideri microscopiei biomedicale. Microscopia holografica digitală, cantitativă de fază (DH – QPM) a fost aplicată în imagistica diferitelor tipuri de celule, inclusiv celule canceroase ovariene Skov- 3 [ Mann C. J., 2005], [Khmaladze A.,2008], celule fibroblaste [Mann C. J.,2006], schelete de diatomee [Debailleul M., 2008], și hematii [Rappaz B., 2009]. Acest tip de microscopie este, de asemenea, utilizat pentru a investiga diverse dinamici celulare, cum ar fi modificările induse de droguri în celulele tumorale pancreatice, [Kemper B., 2006], cât și pentru monitorizarea microchirurgiei cu laser a celulelor [Yu L. F., 2009].

Fluctuațiile membranare ale eritrocitelor au fost măsurate (37 nm) și comparate cu cele ale celulelor imobilizate în etanol. Astfel, s-a observat faptul că în etanol fluctuațiile celulelor roșii au fost mai mici cu aproximativ 5nm [Rappaz B., 2009]. Contribuțiile la grosimea optică din grosimea fizică și indicele de refracție sunt decuplate de cartografierea de fază cu ajutorul a două soluții de perfuzare cu diferiți indici de refracție. În urma măsurătorilor, indicele de refracție al hematiilor s-a dovedit a fi egal cu n=1.394±0.008. Deformarea veziculelor fosfolipidice într-un flux al unui microcanal a fost măsurat cu ajutorul DH-QPM, ca și un model de celule roșii din sânge într-un flux capilar [Minetti C., 2008].

Caracteristicile celulare și subcelulare variabile în timp se pot sonda cu rezoluții submicronice, la limita de difracție [ Mann C. J., 2006]. Imagini de fază cu microbi și celule vii, cum ar fi de exemplu Parameciul printre alti microbi și celule fibroblaste în procesul de migrare, sunt create dintr-o serie de holograme și reconstruite apoi cu mărire numeric reglabilă.

În concluzie, microscopia biomedicală este un domeniu ce poate beneficia în mod semnificativ de noile abilități ale holografiei digitale prin furnizarea de metode de imagistică fară etichete, cu invazivitate minimă și sensibile la modificările subtile în starea fizica și fiziologică a celulelor și a țesuturilor [ Mann C. J., 2006].

Figura 3.4.1.1. – Imagini cu celule cervicale obținute cu ajutorul microscopiei holografice

Capitolul 4- Achiziția de imagini folosind imagistica de fază

4.1. Instalația experimentală

Montajul experimental (figura 4.1.1.) este compus din următoarele elemente principale:

Sursa este un laser cu He-Ne cu lungimea de undă λ= 632.8nm, dublu stabilizat în amplitudine și frecvență pentru obținerea unor imagini la parametrii constanți, timp îndelungat;

De la laser prima dată avem un beam splitter care împarte fasciculul în două fascicule: fasciculul de referință și fasciculul obiect. Cu alte cuvinte, beam splitter-ul are rolul de a transmite o parte a radiației laser, iar cealaltă parte o reflectă;

Două oglinzi la 45ᵒ care reflectă fiecare unul dintre fasciculele obținute mai sus;

Un fascicul este de obiect și trece prin proba care se analizează;

Un obiectiv este plasat după probă pentru a-i mări detaliile micrometrice;

Compensatorul Soleil-Babinet este format din două prisme care alunecă una față de celaltă și permite introducerea unei diferențe de fază controlată în drumul optic;

Un fascicul este de referință și trece doar printr-un obiectiv identic cu cel din fasciculul de obiect, cu scopul de a asigura aceeași curbură a frontului de undă pe senzorul camerei video CCD;

Un ultim beam splitter care recombină cele două fascicule;

O cameră video CCD care înregistrează holograma, adică figura de intereferență obținută prin suprapunerea celor două fascicule: de obiect și de referință.

Figura 4.1.1. – Schema instalației experimentale

Dacă proba care se analizează are detalii micrometrice care se doresc a fi vizualizate, atunci se introduce un obiectiv de microscop între probă și beam-splitter. Pentru a asigura aceeași rază a frontului de undă pentru cele două fascicule, pe CCD, se așează simetric un obiectiv de microscop identic și în raza de referință.

Rezoluția minimă în planul transversal este puțin mai mică de 1μm în timp ce rezoluția axială este de ordinul nanometrilor din softul de construcție.

Exista două locuri în care se poate vedea imaginea. De aceea, într-unul dintre acestea se montează camera CCD.

Observații: 1) Obiectivele sunt identice pentru a putea exista interferență;

2) În afară de obiectiv, si camera oferă o mărire a imaginii, prin poziționarea ei

la o distanță mai mare față de al doilea beam splitter.

În configurația off-axis (cea folosita în cadrul prezentei lucrări ), între cele două fascicule care interferă exista un mic unghi.

Observații: 1) Figura de interferență care se înregistrează pe CCD reprezintă holograma. În

figura 4.1.2. de mai jos sunt prezentate câteva holograme ale unor celule

cervicale înregistrate în Laboratorul de Microscopie Holografică din

Departamentul de Fizică.

2) Într-o hologramă se văd franje de interferentă și franje de difracție pe

conturul obiectului.

Figura 4.1.2. – Holograme ale celulelor cervicale

Etapele algoritmului de reconstrucție

Orice tehnică holografică constă din două etape:

Înregistrarea hologramelor, etapă în care sunt folosite obiecte reale;

Reconstrucția imaginii obiectului se realizează printr-o procedură digitală, folosindu-se un soft specializat care se bazează pe teoria scalară a difracției cât și pe teoria Fresnel. Softul permite obținerea de imagini tridimensionale (3D) în care ne sunt oferite informații despre dimensiunile obiectului, cea de-a treia dimensiune fiind diferența de fază Δρ dintre celulă și mediul înconjurător. Valoarea diferenței de fază este proporțională atât cu înălțimea celulei cât și cu indicele ei de refracție.

Δρ = 2π/λ*()* (4.2.)

Etapele procesului de reconstrucție sunt:

Transformarea hologramei înregistrate în imagine cu nivele de gri;

Importare în soft-ul de reconstrucție;

Realizare transformată Fourier;

Selectare ordin +1;

Simularea propagării utilizând operatorul asociat difracției Fresnel în câmp apropiat;

Obținere matrice de numere complexe;

Aplicare filtre de corecție a aberațiilor de sfericitate, de înclinare, pentru îndepărtarea anumitor zgomote;

Obținere imagine de fază și reprezentare 3D.

Figura 4.2.1. Imagini 3D ale celulelor provenite din holograme reconstruite

Capitolul 5 – Prelucrarea imaginilor celulelor cervicale,

ca obiecte de amplitudine sau de fază

Recunoașterea, numărarea și măsurarea formei, mărimii, poziției, densității și a altor proprietăți similare ale unor obiecte dintr-o imagine poate fi făcută cu ajutorul calculatoarelor cu mai multă rapiditate și reproductibilitate decât o poate face un observator uman.

O mare varietate de instrumente de achiziție a imaginilor produc imagini, adecvate din punctul de vedere al caracteristicilor, pentru transmiterea lor la computer în vederea unor viitoare analize și măsurători. Sistemele de prelucrare a imaginilor biomedicale sunt folosite pentru a extrage informații specifice din acestea, cu o mai mare acuratețe și reproductibilitate decât o poate face omul. Procesul de măsurare a imaginilor implică o imensă reducere a volumului de date, prin selectarea din imaginea originală a obiectelor sau caracteristicilor de interes. Această operațiune poartă numele de segmentare.

Imaginea inițială conține milioane de pixeli, dar informația dorită poate fi mult mai simplă. Selecția și reducerea volumului de date, prin ignorarea informațiilor nesemnificative, constituie esența măsurării și analizei imaginilor biomedicale.

Procedeul de segmentare poate fi privit atât ca o operațiune automată, făcută în proporție de 95% de către un calculator, cât și ca un procedeu manual, în care utilizator ajută la alegerea zonei ce se dorește a fi extrasă din cadrul său inițial, urmând ca mai apoi calculatorul, pe baza unui program, să segmenteze imaginea. Această lucrarea își propune să evidențieze ambele metode de segmentare.

Diagnosticul clasic citologic este bazat pe observarea microscopică a celulelor specifice și interpretarea calitativă folosind criterii descriptive, care pot fi inconsistente din cauza variabilității subiective a diferiților observatori. La polul opus, diagnosticul modern se bazează pe informațiile cantitative oferite de tehnicile interferometrice, care analizează celulele ca obiecte de fază, fără a le mai colora, în mediul lor natural. Acestea furnizează informații suplimentare conținute în harta de fază și imaginea 3D (informații pe a treia axă), care pot fi folosite în aprecierea stării de sănătate a celulelor recoltate de la baza cervixului.

5.1. Analiza și procesarea imaginilor holografice

În cadrul laboratorului de Microscopie Holografică Digitală, cu ajutorul unui microscop care funcționează pe principiile tehnicii DHM, construit din componente separate, pe masă holografică, conform schemei prezentate în capitolul anterior, bazată pe interferometrul Mach-Zehnder, s-a reușit achiziționarea de imagini ale unor celule cervicale atât sănătoase cât și bolnave, aflate în diverse stadii de malignitate. Această metodă de achiziție a imaginilor celulelor cervicale, aflată la nivel de cercetare, folosește celulele recoltate standard, în cadrul examenului Babeș-Papanicolau, și este folositoare deoarece oferă informații suplimentare de-a lungul axei de propagare a fasciculului luminos, comparativ cu microscopia optică clasică, unde sunt disponibile informații doar în plan perpendicular pe axa de propagare.

a b

Figura 5.1.1. a,b – Celule cervicale sănătoase

La prima vedere celulele din figura 5.1.1. par a fi normale ca urmare a îndeplinirii criteriilor aminte mai sus în prezenta lucrare, și anume: nucleu relativ mic și bine definit în raport cu întreaga celulă. Pentru a pune în evidență avantajele oferite de acest tip de microscopie, în urma prelucrării în mediul de lucru MATLAB, putem trage diverse concluzii legate de suprafața celulei și înălțimea nucleului, fapt ilustrat în figura 5.1.2.

Figura 5.1.2. a,b – Reprezentarea 3D a celulelor cervicale sănătoase a. și respectiv bolnave b.

Interpretarea figurii 5.1.2.a de mai sus oferă informații prețioase cu privire la distribuția elementelor prezente în imagine. Se poate observa o distribuție bimodală în care maximul corespunzător nucleului celulei sănătoase are o dispersie mică și o înălțime mare, în timp ce partea corespunzătoare citoplasmei, prezente de-o parte și de alta a nucleului, are o densitate relativ diferită de la o porțiune la alta, fapt evidențiat prin diversele nivelele de gri prezente în imaginea 5.1.1. Este important de menționat faptul că pe axa verticală, valorile respective reprezintă valori ale diferenței de fază introduse de către celulă în drumul optic.

Dacă în schimb, ne propunem să analizăm o imagine în care se presupune că avem la o primă analiză vizuală o celulă cervicală anormală, ar trebui să constatăm tocmai o modificare a distibuției nucleului și respectiv citoplasmei.

a b

Figura 5.1.3. a,b – Celule cervicale anormale

Făcând o comparație între imaginile 5.1.1. și 5.1.3. putem deduce faptul că dimensiunea nucleului prin raportare la întreaga celulă este un criteriu foarte important în aprecierea stării unei celule cervicale.

În mod cert, în figura 5.1.2.b nu mai avem prezentă o distibuție bimodală. Dispersia valorilor diferenței de fază corespunzătoare nucleului a crescut foarte mult în comparației cu cazul unei celule sănătoase, fapt ce conduce în mod indirect la micșorarea volumului citoplasmei. Ne confruntăm în această situație cu o distribuție neuniformă, multimodală în care maximul corespunzător nucleului nu posedă în mod obligatoriu o înălțime mult mai mare decât citoplasma celulară.

Figura 5.1.4. – Distribuția nivelelor de gri pentru o imagine a unei celule sănătoase

Figura 5.1.4. întărește încă o data ideea că avem prezente două mari regiuni: nucleu și citoplasmă. Nucleul reprezentat cu galben, prezintă valori ale pixelilor mult diferite de restul celulei.

Pentru a reliefa și mai bine observațiile enumerate în paragrafele anterioare, într-un prim pas cu ajutorul microscopiei DHM și mai apoi în urma prelucrării în MATLAB, se va încerca utilizarea conceptului de segmentare manuală.

Folosirea segmentării (discriminarea pixelilor după valorile pe care aceștia le au atunci când imaginea este transformată într-o matrice de numere) pentru selectarea pixelilor ce aparțin anumitor structuri de interes din imagine, este o metodă convenabilă de conversie a scării de nivele de gri într-o scară binară.

Selecția prin segmentare este mult mai eficientă decât orice metodă de detecție de contur sau de regiune, deoarece se aplică asupra întregii imagini, iar imaginea binară rezultată este o reprezentare a caracteristicilor de interes pentru fiecare pixel, ceea ce este foarte important pentru majoritatea operațiunilor de măsurare care pornesc de la o imagine.

Secțiunea de cod din anexa 1 conține un cod scris de mine, care permite segmentarea manuală a structurilor anatomice necesare ulterior în cadrul programelor de analiză statistică. Prin modificări minore, acesta poate trasa atât contururi simple, necesare pentru a delimita nucleul celular, cât și contururi multiple pentru a putea extrage, spre exemplu, structuri asemeni citoplasmei. Cu ajutorul mouse-ului, utilizatorul poate trasa cu precizie contururile, iar odată obținute, programul calculează automat o serie de coeficienți precum aria, numărul de pixeli, media, abaterea standard, perimetrul și alții, coeficienți prezentați la finalul rulării într-o fereastră separată. Aceștia sunt stocați în variabile și pot fi bineînțeles utilizați ulterior în cadrul analizei statistice.

Importanța existenței unui program de segmentare manuală se poate identifica și în alt tip de situații. Ne putem imagina totodată cazul în care am beneficia de ajutorul unor cadre medicale, iar acestea ar putea utiliza acest program de segmentare manuală pentru a trasa o serie de contururi de referință, care ulterior ar constitui o bază de date de importanță majoră. Astfel de baze de date sunt utilizate în mai toate aplicațiile de natură medicală, iar printre posibilele utilizări ale acesteia, amintim cel puțin exemplul în care baza de date ar putea fi integrată într-o aplicație de verificare a performanțelor algoritmului de segmentare automată.

În urma rulării codului MALTLAB prezentat în anexa 1, se obțin ca și rezultate finale următoarele:

Figura 5.1.5. – Celula inițială de la care s-a pornit segmentarea

Figura 5.1.6. – Rezultatele segmentării manuale a nucleului unei celule sănătoase, informații

legate despre spațiul ocupat de nucleu în cadrul întregii celule

Figura 5.1.7. – Rezultatele segmentării manuale a citoplasmei unei celule sănătoase, informații

legate despre spațiul ocupat de nucleu în cadrul întregii celule

Calculele referitoare la citoplasma celulară se fac prin eliminarea regiunii nucleului din imaginea inițială. Media obținută este privită drept o medie ponderată la numărul de pixeli asociați zonei delimitate.

În cadrul unei celule cervicale bolnave, este de așteptat ca rezultatele din figura de mai sus să se modifice extrem de mult. Într-o histogramă s-ar putea pune în evidență în mod clar acest lucru, dar obținerea unor rezultate, în domeniul ingineresc, este mult mai reprezentativă.

Figura 5.1.8. – Celula bolnavă de la care s-a pornit segmentarea

Figura 5.1.9. – Rezultatele segmentării manuale a nucleului unei celule bolnave, informații

legate despre spațiul ocupat de nucleu în cadrul întregii celule

Figura 5.1.10. – Rezultatele segmentării manuale a citoplasmei unei celule bolnave, informații

legate despre spațiul ocupat de nucleu în cadrul întregii celule

Figura 5.1.11. – Ilustrarea modificărilor apărute la nivel de nucleu

Figura 5.1.12. – Ilustrarea modificărilor apărute la nivel de citoplasmă

Informațiile din figurile 5.1.11. și 5.1.12. sunt utile si sugestive atunci când se urmărește calcularea unor coeficienți statistici, coeficienți ce se dovedesc a fi de mare interes atunci când se urmărește obținerea unei imagini de ansamblu asupra unor rezultate numerice. În acest scop, mi-am propus să abordez în lucrarea de față, pentru început, calculul a doi dintre acești coeficienți, și anume coeficienții Ashmann și Bhattacharyya.

Pentru a putea recurge însă la calculul coeficienților enumerați în paragraful anterior, trebuie să vedem mai întâi în ce tip de distribuție se încadrează datele. Acest lucru se poate verifica prin afișarea histogramei imaginii, evidențierea distribuțiilor prezente rezultând de asemenea și din reprezentarea tridimensională a celulelor (a se vedea figura 5.1.2. ). Codul MATLAB folosit este prezentat în anexa 2.

Figura 5.1.13.– Histograma asociată imaginii unei celule cervicale normale

Figura 5.1.14. – Histograma asociată imaginii unei celule cervicale anormale

Histogramele asociate imaginilor cervicale ce se obțin sub formă grafică, sunt extrem de utile în statistica descriptivă și pun în evidență o distibuție de frecvență, în sensul numărului de evenimente statistice pe intervale de valori. În figurile 5.1.13 și 5.1.14 se pot observa rezultatele obținute în urma aplicării funcției necesare pentru a obține histogramele aferente. Histogramele ne permit să vedem "dintr-o privire" cum sunt distribuite evenimentele statistice analizate. Putem observa că în experimentul descris, majoritatea evenimentelor statistice se aglomerează în jurul valorilor aproximative de 30-120, valori ce corespund citoplasmei celulare. Pe axa orizontală sunt dispuse valorile de luminozitate ale pixelilor din imagine, într-un interval de la 0 (negru) la 255 (alb). Pe verticală sunt trasate linii cu o înalțime proporțională cu numărul de pixeli care se încadrează în respectivul nivel de luminozitate.

Coeficientul Bhattacharyya este o metodă populară care utilizează histograme de culoare pentru a corela imagini. Acest coeficient este considerat a fi o măsură suficient de bună pentru a indica similaritatea dintre două imagini. În cazul în care acest coeficient este aplicat unor imagini cu nuanțe de gri se obțin rezultate parțial eronate. Corespondența bazată pe această măsură nu este adecvată pentru imagini cu nivele de gri. Pentru a evita această problemă, în lucrarea de față s-a calculat coeficientul Bhattacharyya pe baza mediei și deviației standard.

B = * ln [ ] (5.1)

Rezultatul aplicării acestui coeficient conduce astfel la aprecierea gradului de apropiere dintre două imagini.

Un alt coeficient utilizat în statistică este coeficientul Ashman’s D., ce asigură prin formula sa de bază o legătură între medie și deviația standard. Acest tip de coeficient reprezintă o măsură a cât de bine sunt diferențiate două distribuții. În cazul în care cele două distribuții sunt identice, acest coeficient statistic este zero .

D = * , (5.2)

unde si sunt valorile medii iar σ1 și respectiv σ2 deviațiile standard.

Pentru situația în care ne confruntăm cu două distribuții normale, este necesar ca coeficientul D să fie mai mare sau egal cu 2 pentru a asigura o separare „curata” a distibuțiilor [Ashman KM, 1994].

Compararea celor două histograme se poate face, într-un mod mult mai rapid, prin calculul sumei pătratelor diferențelor. Această sumă conduce la reliefarea gradului de similaritate/disimilaritate dintre cele două histograme asociate imaginii. Înainte de începerea calculului, un lucru util îl reprezintă normalizarea histogramei.

Calculele efective ale coeficienților statistici amintiți mai sus, precum și alte mărimi caracteristice sunt detaliate în capitolul 5.3.

5.2. Analiza și procesarea imaginilor cu celule cervicale colorate

Pe lângă metoda manuală de segmentare mai există o alternativă uneori mai eficientă și precisă dar mai puțin interactivă, și anume, metoda automată de segmentare. Acest tip de segmentare se dovedește a fi util în cazul în care avem de analizat un frotiu pe care sunt prezente numeroase celule cervicale. Segmentarea automată este mult mai rapidă decât analiza vizuală și nu este afectată de subiectivitatea umană. Cu toate acestea, o analiză riguroasă a acestor rezultate trebuie realizată folosind criterii corespunzătoare. În cazul de față, avem un frotiu convențional, tratat cu coloranți ce au condus prin aplicarea lor la moartea celulelor cervicale. Astfel, la analiza microscopică vom obține imagini statice și pline de culoare.

Figura 5.2.1. – Imaginea de la care s-a pornit segmentarea automată

Extracția imaginii nucleelor din cadrul unor imagini în care există celule suprapuse reprezintă o problemă critică în sistemele automate de diagnostic. Datorită asemănărilor dintre nucleele suprapuse și cele maligne, clasificările greșite ale regiunilor suprapuse pot afecta decizia finală a sistemelor automatizate. În această lucrare, voi prezenta o metodă de clasificare a celulelor cervicale recoltate în cadrul testului Papanicolau, metodă ce se bazează pe metoda k-means clustering.

Multe studii au încercat să dezvolte metode de determinare cu exactitate a granițele dintre nucleele ce corespund suprapunerilor celulare. De exemplu, Jung și colaboratorii săi au raportat un sistem de clasificare Bayesiana nesupervizată pentru separarea regiunilor suprapuse [Lakshmi GK, 2013]. Într-un alt studiu, Li și colaboratorii au utilizat modificarea fluxului unui vector gradient [Li K, 2012], precum si metode nesupervizate de clasificare (k-means), pentru extragerea corectă a citoplasmei și a nucleelor. Aceste studii arată că a existat un mare interes în determinarea cu exactitate a granițele nucleelor celulare din interiorul regiunilor adiacente [Chen C, 2013]. Cu toate acestea, este foarte important ca înainte de alegerea procedeului de separare, fiecare nucleu să fie analizat din punct de vedere al existenței suprapunerii cu un alt nucleu sau celulă.

După cum se poate observa și în figura 5.2.1. avem prezente 3 mari clase: celule cervicale sănătoase colorate cu albastru, celule cervicale bolnave evidențiate cu roșu și lichid intracelular marcat cu alb.

În lucrul cu calculatorul, este necesar ca utilizatorul să găsească o metodă de verificare întrucât în programare se pot strecura foarte ușor mici greșeli ce vor conduce astfel la rezultate greșite. Întregul cod MATLAB folosit pentru segmentarea automată a nucleelor celulelor cervicale se regăsește în anexa 3 a acestei lucrări.

Metoda de segmentare automată prezentată se bazează pe utilizarea principiului k-means clustering. Înainte de aplicarea acestuia, s-a convertit imaginea de la spațiul de culoare RGB la spațiul L*a*b. Cu alte cuvinte are loc transformarea unui spațiu primar de reprezentare ( RGB ) într-un spațiu cu cromaticitate uniformă (L*a*b). Spațiul L*a*b* constă dintr-un nivel de luminozitate 'L*' , un nivel de cromaticitate 'a*', ce indică locul în care se încadrează culoarea de-a lungul axei roșu-verde, și un al doilea nivel de cromaticitate 'b*' care sugerează locul în care se încadrează culoarea de-a lungul axei albastru-galben . Toate informațiile de culoare se găsesc în nivelele 'a*' si 'b*'. Distanța dintre două culori poate fi măsurată cu ajutorul distanței euclidiene ce corespunde, în cadrul spațiului L*a*b, distanței perceptuale dintre două culori. În spațiul L*a*b, diferența dintre două culori abia perceptibile este definită de o distanță maximă de 2,3. Mai apoi, s-a recurs la clasificarea culorilor într-un spațiu 'a*b*' folosind k-means clustering. Clustering-ul este o modalitate de a separa grupurile de obiecte. K-means clustering tratează fiecare obiect ca având o anumită locație în spațiu. Se găsesc astfel partiții în care obiectele din fiecare cluster sunt la fel de apropiate unele de altele și depărtate de restul obiectelor care fac parte la rândul lor din alte clustere. Este important de menționat faptul că metoda k-means clustering cere sa fie specificat atât numărul de clustere în care urmează să fie partiționat spațiul cât și distanța la care să se găsească două obiecte. Astfel, s-a partiționat imaginea originală în trei mari grupuri: nuclee de celule cervicale sănătoase, nuclee de celule cervicale anormale si lichid intracelular.

Figura 5.2.2. – Evidențierea claselor prezente

Principala motivare pentru segmentarea nucleelor este de a oferi patologilor/ cercetătorilor informații cantitative despre aranjamentele și caracteristicile nucleelor celulelor. Analiza parametrilor citologici pentru fiecare celulă în ambientul său natural oferă o mai bună viziune asupra dezvoltării și evoluției țesuturilor [Baggett D., 2005].

Fiind prezente multe celule pe frotiu, eroarea umana își poate spune cuvântul întrucât este dificil de analizat fiecare celula în parte.

Figura 5.2.3. – Clasa corespunzătoare celulelor cervicale sănătoase obținută după aplicarea codului scris și anexat lucrării

Figura 5.2.4. – Clasa corespunzătoare celulelor cervicale bolnave obținută după aplicarea codului scris și anexat lucrării

Figura 5.2.5. – Clasa corespunzătoare lichidului intracelular obținută după aplicarea codului scris și anexat lucrării

Se pune accentul în mod special pe nucleul celular deoarece orice modificare apărută își pune amprenta pe nucleu, în sensul măririi volumului acestuia, fapt ilustrat și în figura 5.2.4.

Figura 5.2.6. – Extragerea nucleelor celulelor anormale obținută după aplicarea codului scris și anexat lucrării

Figura 5.2.7. – Îmbunătățirea contrastului pentru nucleele celulelor anormale, îmbunătățire obținută după aplicarea codului scris și anexat lucrării

Atunci când se dorește numărarea celulelor bolnave și mai apoi exprimarea procentuală a acestui număr prin raportare la numărul total de celule prezente pe frotiu, este important să aibă loc și segmentarea celulelor normale.

Figura 5.2.8. – Extragerea nucleelor celulelor normale obținută după aplicarea codului scris și anexat lucrării

Figura 5.2.9. – Îmbunătățirea contrastului pentru nucleele celulelor normale, îmbunătățire obținută după aplicarea codului scris și anexat lucrării

Datorita faptului că exista un anumit procent de celule suprapuse, fie el și mic ca valoare, se recurge la binarizarea imaginilor în care sunt prezente numai nucleele celulare.

Figura 5.2.10. – Binarizarea nucleelor celulelor normale obținută după aplicarea codului scris și anexat lucrării

Figura 5.2.11. – Binarizarea nucleelor celulelor bolnave obținută după aplicarea codului scris și anexat lucrării

În cazul de față, pentru celulele bolnave se obține un număr de 4 celule intreconectate și un număr total de 47. În schimb, pentru celulele sănătoase avem tot 4 celule interconecate și 261 ca și număr total de celule de acest tip. Se ajunge astfel la un număr final de 308 celule prezente în imaginea 5.2.1. Procentual, celulele bolnave reprezintă 18% din numărul total de celule. Se poate concluziona asupra faptului că avem de-a face cu un risc mediu și prin urmare trebuie intervenit în cel mai scurt timp deoarece celulele canceroase se multiplică rapid și necontrolat.

Spre deosebire de imaginile obținute cu ajutorul microscopiei holografice, în cazul imaginilor achiziționate prin metoda clasică, nu se mai pune atât de mult accentul pe dimensiuni întrucât, fiind vorba de multe celule, este mai importantă identificarea și analizarea globală a celulelor anormale. În urma analizei vizuale, se poate observa celula sau grupul de celule care au suferit cele mai mari modificări iar pentru acelea se pot face ulterior diverse măsurători automatizate. Pentru imaginile holografice, fiind vorba despre puține celule ce pot fi vizualizate simultan este mult mai ușor de făcut calcule comparative. Deoarece celulele nu mai sunt colorate, ele fiind în stare naturală în timpul analizei propriu-zise la microscop, este dificil sau poate chiar imposibil în unele cazuri de făcut un algoritm de segmentare automată. Nucleul anormal are o forma neregulată și prin urmare segmentarea manuală reprezintă un procedeu actual cu destul de mare acuratețe în cazul în care este realizată de către un personal calificat, neexcluzând însă segmentarea automată acolo unde este posibilă.

5.3. Analiza statistică

Analiza statistică este o componentă esențială a activității de cercetare biomedicală întrucât oferă o vedere de ansamblu asupra populației.

Pentru a putea ajunge însă la concluziile statistice finale aferente acestei lucrări, trebuiesc definite, pentru început, o serie de noțiuni teoretice de natură statistică, printre care se regăsesc și următoarele: legătura dintre o imagine și variabilele aleatoare, funcția de densitate de probabilitate, momente statistice, etc.

Din punct de vedere statistic, putem considera valoarea fiecărui pixel al imaginii ca fiind o realizare particulară a unei variabile aleatoare asociată nivelelor de gri.

Se numește variabilă aleatoare (întâmplătoare sau statistică) o funcție care asociază un număr real realizării unui eveniment; dacă Ω este mulțimea evenimentelor elementare, Ω = { ω1, ω2, …, ωn} atunci avem:

ξ : Ω −→ R, ξ(ωk) = x (5.3.1)

Practic vorbind, avem definită probabilitatea ca variabila să aibă valori mai mici decât orice număr dat a.

Observație: Se poate verifica ușor că variabilele aleatoare formează o algebră, adică suma și

produsul a două variabile aleatoare este tot o variabilă aleatoare; mai mult, compunerea a

două variabile aleatoare este tot o variabilă aleatoare.

Un exemplu de variabilă aleatoare este valoarea rezistenței unui rezistor; acest număr real este asociat evenimentului de alegere a unui rezistor de pe fluxul de fabricație; o realizare particulară a acestei variabile aleatoare înseamnă măsurarea unui anumit rezistor deja ales.

O variabilă aleatoare poate fi caracterizată de funcția de repartiție și de densitatea de probabilitate.

Funcția de repartiție este definită ca probabilitatea ca o valoare particulară a variabilei aleatoare ξ să fie mai mică decât x:

Fξ(x) = P{ξ x} (5.3.2)

Fiind definite ca probabilități, valorile funcției de repartiție vor fi, evident, numere reale din intervalul [0, 1], deci:

0 Fξ(x) 1 (5.3.3)

Valorile extreme ale funcției de repartiție se obțin pentru valori particulare ale lui x.

Dacă x = −∞, atunci

Fξ(−∞) = P{ξ −∞} = 0, (5.3.4)

(deoarece nici o valoare reală, așa cum este ξ, nu poate fi mai mică decât −∞).

Dacă x = ∞, atunci:

Fξ(∞) = P{ξ ∞} = 1, (5.3.5)

(deoarece orice valoare reală este mai mică decât ∞).

În plus, dacă avem x1 x2 două valori reale oarecari, atunci Fξ(x1) Fξ(x2), și deci

funcția de repartiție a unei variabile aleatoare este o funcție crescătoare, sau cel puțin

nedescrescătoare:

x1 ≤ x2 ⇒ Fξ(x1) Fξ(x2) (5.3.6)

Într-adevăr, Fξ(x2) = P{ξ x2} = P{ξ x1} + P{x1 < ξ x2} P{ξ ≤ x1}.

Funcția de densitate de probabilitate este derivata funcției de repartiție:

wξ(x)= . (5.3.7)

Fiind derivata unei funcții crescătoare (5.3.6), funcția de densitate de probabilitate va avea întotdeauna valori pozitive:

wξ(x) . (5.3.8)

Din definiția (5.3.7) rezultă că putem scrie funcția de repartiție ca primitivă a funcției de densitate de probabilitate:

Wξ(x) = (5.3.9)

Acestă formulă poate fi particularizată pentru diferite valori ale lui x; pentru x = ∞, se obține:

(5.3.10)

numită condiție de normare a funcției de densitate de probabilitate (geometric, acestă

condiție se interpretează prin faptul că aria subgraficului funcției de densitate de probabilitate

trebuie să fie unitară).

Condițiile esențiale ce trebuiesc verificate pentru orice funcție ce este o densitate de

probabilitate sunt (5.3.8) și (5.3.10).

Fie ξ o variabilă aleatoare a cărei funcție de densitate de probabilitate este wξ(x). Pe baza acesteia se pot defini momentele statistice [necentrate] ale variabilei aleatoare.

Momentul statistic [necentrat] de ordin k este:

= = (5.3.11)

Cazurile particulare de maxim interes sunt momentele de ordinul 1 (media statistică a variabilei aleatoare) și de ordinul 2 (media pătratică a variabilei aleatoare):

= (5.3.12)

=

Momentul statistic centrat de ordinul k al variabilei aleatoare ξ este:

= = (5.3.13)

Observație: Momentele statistice centrate de ordinul 0 și respectiv 1, sunt aceleași pentru toate variabilele aleatoare.

= = , (5.3.14)

= = . (5.3.15)

Cazul particular cel mai utilizat este momentul statistic centrat de ordinul 2, numit

varianța variabilei aleatoare:

= = (5.3.16)

Rădăcina de ordinul 2 a varianței se numește deviație standard sau dispersie:

. (5.3.17)

[C. Vertan, 2007].

Având în vedere scurta teorie statistică de mai sus, în cadrul acestei lucrări de cercetare, s-au calculat, pe baza metodelor de segmentare amintite în subcapitolele anterioare, momentele statistice de ordinul 1 și 2. Cu alte cuvinte, cu ajutorul MATLAB-ului s-au determinat media și deviația standard a nucleelor celulelor cervicale și mai apoi media și deviația standard a citoplasmei.

În vederea reliefării cât mai sugestive a modificărilor suferite de către o celulă cervicală, pe parcursul instalării cancerului de col uterin, am hotărât întocmirea unei mici baze de date în acest sens.

Pe baza măsurătorilor efectuate atât pe celulele sănătoase, cât și pe cele aflate în diferite stadii de boală, s-au calculat trei coeficienți statistici, Ashman, Bhattacharya și Sarle. ale căror valori pot furniza informații prețioase cu privire la starea globală de sănătate a pacientului întrucât, orice leziune la nivel celular atrage după sine o alterare a stării generale de sănătate.

Coeficientul Ashman, discutat și în subcapitolele anterioare, urmărește să pună în scenă gradul de separabilitate dintre două medii în timp ce distanța Bhattacharya dintre două gaussiene evidențiază disimilaritatea dintre acestea. Cel de-al treilea coeficient, introdus de către Warren Sarle, a fost calculat cu ajutorul următoarei formule:

, unde m3 este asimetria iar m4 aplatizarea/boltirea

Valori ale lui b > 0,555 pot indica o distibuție biomodală sau multimodală. Valoarea maximă de 1,0 (obținută pentru distribuția Bernoulli) poate fi atinsă numai în cazul în care avem de-a face cu două distribuții care diferă numai prin două valori. Distribuțiile foarte încărcate au valori reduse ale variabilei b.

Notația acestui coeficient este neconvențională, deoarece m reprezintă de regulă

momentul nestandardizat legat de medie. De aceea, există și cărți sau articole în care se substituie m3 cu b1 și m4 cu b2 [Thomas R. Knapp, 2007].

Coeficientul de boltire este definit ca fiind cel de-al patrulea moment standardizat din jurul mediei. Valoarea lui b se situează între 0 și 1 [Pearson K., 1916]. Logica din spatele acestui coeficient este că o distribuție bimodală va avea o asimetrie foarte scăzută.

Prin intermediul acestor coeficienți se urmărește punerea în evidență a diferențelor existente între o celulă cervicală bolnavă și una sănătoasă pe de-o parte, iar pe de altă parte a disimilarităților prezente între metodele microscopice utilizate pentru analiză.

5.3.1.1. Statistica imaginilor celulelor cervicale colorate

Ca orice tip de celulă afectată de cancer, si celulele cervicale tratate cu markeri cromatografici parcurg o serie progresivă de etape de la debutul cancerului. Pe parcursul acestor etape, celulele suferă numeroase modificări de structură, morfologie și rol. Modificările structurale și morfologice sunt evidențiate în tabelul 1 de mai jos.

Figura 5.3.1.1. – Celule cervicale colorate aflate în diferite stadii de malignizare

Tabelul 1: Modificările suferite de celulă ca urmare a avansării cancerului

Cu ajutorul rezultatelor obținute (a se vedea tabelul 1) se pot calcula o serie de parametrii statistici și biostatistici.

Tabelul 2: Coeficienți statistici calculați pentru celule cervicale colorate

Tabelul 3: Coeficienți biostatistici calculați pentru celule cervicale colorate

Având în vedere rezultatele de mai sus, se pot formula următoarele idei:

Aria nucleului celular crește pe măsură ce cancerul evoluează.

Aria citoplasmei scade ca urmare a progresului bolii, locul său fiind ocupat de nucleu.

Cu cât neoplazia cervicală intraepitelială este mai avansată, cu atât coeficientul Ashman tinde să aibă valori mai mari.

Coeficienții Bhattacharyya și Sarle prezintă de asemenea valori diferite prin raportare la cazul normal.

Momentele m(3) și respectiv m(4) își modifică valorile pe măsură ce evoluția bolii este mai semnificativă.

Prin urmare, parametrii calculați pentru acest tip de celule reflectă foarte bine schimbările intervenite la nivel celular. Este adevărat că un diagostic sigur nu poate fi pus numai pe baza acestor rezultatele însă ele pot crește gradul de verosimilitate al diagnosticului.

Tehnicile de procesare de imagini sunt folosite în patologie pentru a elimina posibila subiectivitate în analiza imaginilor, subiectivitate cauzată de diferite interpretări ale patologilor dar și pentru posibilitatea de a analiza/evalua seturi mari de date/imagini.

5.3.1.2. Statistica imaginilor holografice

Pentru categoria imaginilor holografice setul de celule pe care s-a realizat calculul coeficienților a fost puțin mai mare deoarece acest tip de imagini au fost achiziționate în mod propriu în cadrul laboratorului.

Tabelul 4: Lot de celule sănătoase

Tabelul 5: Coeficienți statistici calculați pentru celule cervicale sănătoase

Tabelul 6: Coeficienți biostatistici calculați pentru celule cervicale sănătoase

Pentru rezultatele obținute în tabelele 5 și 6 au fost necesari următorii pași:

extragerea imaginii nucleului și a citoplasmei cu ajutorul segmentării manuale;

reprezentarea histogramei asociate imaginii;

binarizarea imaginii nucleului și citoplasmei;

trasarea unui profil transversal de fază.

Evaluarea a fost realizată comparând rezultatele furnizate de segmentarea manuală cu cele de referință returnate de segmentarea automata sau prin analiza vizuală a unui expert. Funcția de comparare provine din necesitatea cunoașterii modificărilor intervenite în nivelul, structura sau dinamica fenomenelor.

Rezultatele confirmă faptul că metodele propuse reușesc să rezolve eficient problemele întâmpinate în cadrul metodelor de segmentare a imaginilor microscopice.

Celulă sănătoasă N3_mursa1f5

Figura 5.3.1.2.1. Celulă sănătoasă achiziționată cu DHM. Profilul transversal de fază

Nucleu

Citoplasmă

Celulă sănătoasă CN_andrei7f2

Figura 5.3.1.2.2. Celulă sănătoasă achiziționată cu DHM. Profilul transversal de fază

Nucleu

Citoplasmă

Celulă sănătoasă CN_andrei23f3

Figura 5.3.1.2.3. Celulă sănătoasă achiziționată cu DHM. Profilul transversal de fază

Nucleu

Citoplasmă

Celulă sănătoasă CN_andrei24f3

Figura 5.3.1.2.4. Celulă sănătoasă achiziționată cu DHM. Profilul transversal de fază

Nucleu

Citoplasmă

Celulă sănătoasă mursa37f2

Figura 5.3.1.2.5. Celulă sănătoasă achiziționată cu DHM. Profilul transversal de fază

Nucleu

Citoplasmă

Observatie: Operația de binarizare a secțiunii de interes a fost realizată în scopul calculării ulterioare a ariei și respectiv deviației standard.

Tabelul 7: Lot de celule anormale

Tabel 8: Coeficienți statistici calculați pentru celule cervicale bolnave

Tabel 9: Coeficienți biostatistici calculați pentru celule cervicale bolnave

Luând in calcul toate rezultatele numerice obținute pentru acest tip de imagini, se poate calcula o medie a valorilor, medie care să ofere o imagine de ansamblu asupra tuturor calculelor efectuate.

Tabelul 10: Media pe grupuri de coeficienți și tipuri de celule

Tabelul 10 de mai sus permite formularea următoarelor idei cheie ale acestei lucrări:

Cancerul de col uterin atrage după sine schimbări multiple: componentele intracelulare își modifică suprafața relativă ocupată în cadrul unei celule. Atât nucleul cât și citoplasma, componente celulare elementare, sunt supuse celor mai mari transformări. De aceea, majoritatea studiilor sunt concentrate asupra modificărilor intervenite la nivel de nucleu și citoplasmă.

Importanța indicatorilor statistici în procesul de cercetare este demonstrată de funcțiile pe care le îndeplinesc: măsurare, comparare, analiză, sinteză, estimare și verificare. Pentru cazul curent, toți coeficienții calculați (Ashman, Bhattacharya și Sarle) prezintă schimbări semnificative atunci când intervine în discuție cancerul, fie el și într-un stadiu incipient. Momentele statistice m(3) și m(4) ilustrează și ele o modificare a normalității. Deviația standard atât pentru nucleu cât și pentru citoplasmă, prezintă o majorare a valorii cu un ordin de mărime pornind de la o celulă normală și ajungând la o celulă bolnavă.

Diferențele dintre o celulă sănătoasă și una anormală din punct de vedere cervical sunt numeroase, majoritatea acestora fiind ușor de evidențiat cu ajutorul unei analize microscopice, precedate de un test Papanicolau.

Pe măsură ce gradul de severitate al bolii este mai mare, schimbările celulare sunt mai evidente. Proporția ocupată de nucleu în cadrul unei celule cervicale tinde să crească cu 4 ordine de mărime (arie nucleu celulă sănătoasă = 3,78e+03 * arie nucleu celulă anormală) iar cea a citoplasmei să descrească cu până la 6 ordine de mărime (arie citoplasmă celulă sănătoasă / arie citoplasmă celulă bolnavă= 5,95).

Dacă se dorește în schimb o analiză comparativă între imaginile cu celule cervicale colorate și imaginile holografice, cel mai important lucru de menționat este faptul că indiferent de tipul imaginii și de modul de achiziție al acesteia, coeficienții statistici și biostatistici abordați pentru calcul prezintă același trend de schimbare a valorilor numerice.

În consecință, apariția cancerului de col uterin perturbă întregul sistem funcțional a cărui unitate de bază este celula. Orice modificare la nivel celular, oricât de mică ar fi ea, are urmări asupra stării generale. Există însă cazuri, ca și cel al cancerului cervical, când transformările, uneori ireversibile, ale celulelor, nu produc simptome imediate. Acest lucru constituie pe de-o parte un avantaj întrucât persoana în cauză nu are dureri sau alte efecte nedorite, cât și un mare dezavantaj deoarece în acest mod, boala de cele mai multe ori nu este depistată la timp.

Celulă bolnavă M6_bacescu13f2

Figura 5.3.1.2.6. Celulă bolnavă achiziționată cu DHM. Profilul transversal de fază

Nucleu

Citoplasmă

Celulă bolnavă M1_mursa3f6

Figura 5.3.1.2.7. Celulă bolnavă achiziționată cu DHM. Profilul transversal de fază

Nucleu

Citoplasmă

Celulă bolnavă M4_mursa20f3

Figura 5.3.1.2.8. Celulă bolnavă achiziționată cu DHM. Profilul transversal de fază

Nucleu

Citoplasmă

Celulă bolnavă M8_mursa20f3

Figura 5.3.1.2.9. Celulă bolnavă achiziționată cu DHM. Profilul transversal de fază

Nucleu

Citoplasmă

Concluziile ce pot fi formulate din studiul prezentat în acest capitol sunt următoarele:

Îmbunătățirea imaginii sau preprocesarea este o etapă primordială în procesarea

imaginilor complexe biomedicale, deoarece o îmbunătățire adecvată a procesului de prelucrare mărește șansele de succes ale etapei de segmentare. Această etapă incipientă folosește algoritmi de filtrare liniari, neliniari, wavelets sau transformări Fourier.

Detaliile imaginilor sunt căutate în texturile acestora. Imagistica are de-a face cu două categorii de texturi, cele generate prin metode fractale, spectrale, statistice și sintetice ale căror șabloane de realizare sunt a-priori cunoscute, și texturi aleatoare care se doresc a fi înțelese prin parametri statistici sau geometrici. Înțelegerea texturii unei imagini conduce la extragerea de informații în orice domeniu unde imagistica și-a găsit utilitatea.

Segmentarea imaginilor este cea mai dificilă etapă de procesare, deoarece în cadrul ei are loc descompunerea unei scene (imagini) în componentele sale, iar în urma

procesului de segmentare vor fi extrase din imagine obiecte distincte, regiuni ce

satisfac anumite criterii de uniformitate sau alte caracteristici de formă. Obiectele sunt

interpretate ca regiuni compacte sau numai ca frontiere (contururi). După primitivele

de extras, tehnicile de segmentare se împart în trei categorii fundamentale: tehnicile de

segmentare orientate pe pixeli, tehnicile de segmentare orientate pe contur și tehnicile

de segmentare orientate pe regiuni.

Operațiile de descriere, recunoaștere, clasificare și selecție a caracteristicilor

obiectelor extrase în procesul de segmentare sunt realizate în etapa de analiză.

Spațiul L*a*b este utilizat în majoritatea aplicațiilor de analiză automată a imaginilor.

Analiza statistică reprezintă de regulă ultima etapă deoarece în cadrul acesteia se trag concluzii universal valabile pentru tot lotul urmărit.

Pe scurt, întreaga lucrare urmărește schema ilustrată in figura 5.3.1.2.10. :

Figura 5.3.1.2.10. – Etape fundamentale în prelucrarea digitală a imaginilor

Capitolul 6 – Concluzii generale

Cancerul de col uterin continuă să fie o problemă majoră în rândul femeilor de pe întreg mapamondul. Testul Papanicolau este o procedură de screening manual utilizat pentru a detecta cancerul de col uterin sau modificări precanceroase apărute la nivelul colului uterin, prin clasificarea celulelor cervicale pe baza culorii, formei și proprietăților de textură ale nucleelor și citoplasmei celulare. Cu alte cuvinte, scopul screening-ului de col uterin este de a identifica leziunile precanceroase semnificative. Screening-ul ce implică și examen citologic necesită resurse vaste și forță de muncă de înaltă calificare tehnică. Vaccinurile împotriva infecțiilor cu HPV sunt disponibile, dar sunt foarte scumpe. În ciuda costului foarte mare, aceste vaccinuri nu asigură imunitate totală împotriva tuturor tipurilor de cancere HPV. Prin urmare, examenul Papanicolau reprezintă în continuare o analiză necesară și importantă.

Testul Papanicolau implică analiza manuală a frotiurilor cervicale. Personalul specializat care execută această operațiune trebuie să analizeze microscopic fiecare porțiune a frotiului. O simplă imagine de ansamblu nu este suficientă întrucât pot să apară cazuri în care celulele anormale să fie prezente pe o margine a frotiului, situație în care neidentificarea precoce a acestora poate conduce la urmări deosebit de grave. O altă sursă de eroare care ar putea interveni în punerea corectă a unui diagnostic ar fi modul de recoltare al celulelor. Astfel, pentru examenul anual Babeș-Papanicolau este nevoie de personal medical calificat care să recolteze celulele cervicale de la baza cervixului și nu din altă zonă. Una dintre problemele rămase, cea de analiză a frotiurilor poate fi îmbunătățită în sensul automatizării sau semiautomatizării procedurii. Scopul acestei alternative de analiză ar fi reducerea semnificativă a erorii umane care este subiectivă în multe situații, unele dintre acestea fiind: lipsa unei pregătiri profesionale de înaltă calitate, oboseala, lipsa unei aparaturi performante, etc.

În acest sens, această lucrare de cercetare și-a propus să diminueze o parte din problemele existente în acest domeniul din mai multe perspective: pe de-o parte a evidențiat utilitatea microscopului holografic în analiza celulelor cervicale iar pe de altă parte a propus două metode de segmentare a celulelor cervicale, automată și manuală, metode care au ca scop să furnizeze rezultate numerice cu privire la numărul celulelor anormale/normale prezente pe frotiu, aria nucleului celular, coeficienți statistici și biostatistici corespunzători citoplasmei, nucleului etc. (a se revedea capitolul 5 pentru mai multe detalii).

Segmentarea celulară reprezintă o etapă critică în analiza celulară din cauza complexității structurilor celulare, contrastului slab și suprapunerilor de celule. Pentru imaginile cu celule cervicale colorate s-a implementat un algoritm k-means de segmentare în spațiul caracteristicilor. Acestui algoritm i s-au stabilit un număr de 3 clase: nucleu, citoplasmă și lichid intracelular iar mai apoi au fost urmați toți pașii specifici metodei alese. Algoritmul a fost proiectat pentru a livra în final, pe baza claselor extrase, numărul de celule anormale prin raportare la numărul total de celule prezente pe frotiul cervical. Astfel, având la dispoziție aceste informații, medicul poate să aibă o informație cantitativă prin care să-și întărească convingerea că este vorba despre un cancer cervical de gradul X.

Noutatea adusă în această lucrare a constat în mare partea în analiza și procesarea imaginilor holografice. Imaginile de acest fel oferă informații suplimentare comparativ cu tehnicile clasice de analiză. Astfel, pentru obținerea imaginilor de fază cu celule cervicale aflate în mediul propriu și fără utilizarea de markeri, s-a recurs la achiziția acestora cu ajutorul unui microscop ce funcționează pe principii holografice. Pentru poziționarea în montajul experimental al probei care conține lichidul cu celulele cervicale imersate a fost necesară proiectarea unei incinte cu ajutorul programului AutoCAD 3D. Mai apoi, respectiva incintă a fost fabricată cu ajutorul unei imprimante 3D. Având toate componentele necesare achiziției, s-au obținut hologramele care în cele din urmă au fost reconstruite și analizate cu ajutorului pachetului software MATLAB. Pentru această categorie de imagini s-a propus realizarea unui program interactiv de segmentare manuală care să permită delimitarea unei regiuni pe interes, regiune pe baza căreia algoritmul calculează o serie de parametrii: arie, perimetru, deviație standard, etc.

Rezultatele obținute în urma celor două tipuri de segmentări sunt comparate între ele ca și măsură de siguranță iar mai apoi, pentru ilustrarea cât mai sugestivă a modificărilor survenite la nivel de celulă odată cu instalarea treptată a cancerului, sunt calculați coeficienții Ashman, Bhattacharyya, Sarle și momentele statistice m(3) și m(4). Pe baza coeficienților amintiți anterior sunt formulate câteva concluzii general valabile pentru lotul testat de celule cervicale.

Acuratețea diagnosticului depinde într-o mare măsură de gradul de precizie al segmentării efectuate. De aceea, etapa de segmentare este considerată ca fiind crucială. Existența multiplelor metode de segmentare (segmentarea pe histogramă, creșterea și fuziunea regiunilor, etichetarea imaginilor binare, algoritmi generali de clustering, etc) întărește ideea formulată mai sus, conform căreia partiționarea imaginii digitizate în submulțimi este extrem de importantă și prin urmare necesită o atenție sporită. De asemenea, pentru a putea ajunge la realizarea segmentării, fie ea automată sau manuală, orientată pe regiuni sau pe contururi, trebuie cunoscut foarte bine scopul deoarece, în caz contrar, pot sa apară erori foarte mari și datorită acestui aspect.

Imaginile returnate de programul de reconstrucție a hologramelor aparțin spațiului de culoare RGB. În lucrarea de față, se realizează conversia la spațiul CIE L*a*b deoarece acest standard de redare reprezintă culorile într-un mod foarte apropiat de modul în care le percep oamenii și nu cum sunt reproduse de un anumit dispozitiv, de aceea spațiul CIE L*a*b se numește independent. Deși niciun dispozitiv nu poate afișa gamutul larg al spațiului CIE L*a*b, acesta este întotdeauna folosit în transferul și afișarea imaginilor.

Având în vedere cele de mai sus, sistemul de screening asistat de calculator pentru testele Papanicolau va fi foarte benefic pentru a preveni cancerul de col uterin, în cazul în care aceasta va crește fiabilitatea diagnosticului.

Abrevieri

BF – Bright Field Microscopy

N.A. – Apertura numerica

DIC – Differential Interference Constrast Microscopy

DHM – Digital Holographic Microscopy

DIH – Digital In-line Holographic

HPV- Human Papilloma Virus

Anexa 1

%*****************************************

%****************Nucleu*******************

%*****************************************

clc; % Sterge fereastra de comenzi.

clear; % Sterge toate variabilele.

close all; % Inchide toate graficele, cu exceptia celor create de imtool.

imtool close all; % Inchide toate graficele create cu imtool.

workspace; % Asigurare ca panoul spatiului de lucru este afisat.

fontSize = 16;

% Citire imagine de test in nuante de gri, intr-un standard MATLAB.

folder = fullfile(matlabroot, 'E:\Facultate\Licenta\Scris\Gray scale');

baseFileName = 'M8_mursa20f3.tif_out_only_cell.tif';

% Se ia numele intreg al fisierului, inclusiv calea catre acesta. fullFileName = fullfile(folder, baseFileName);

% Se verifica existenta fisierului.

if ~exist(fullFileName, 'file')

% Fisierul nu exista – nu a fost gasit in locul specificat. Se verifica calea de acces catre acesta.

fullFileName = baseFileName; % Nu este specificata calea.

if ~exist(fullFileName, 'file')

% Fisierul inca nu a fost gasit. Se alerteaza utilizatorul.

errorMessage = sprintf('Error: %s does not exist in the search path folders.', fullFileName);

uiwait(warndlg(errorMessage));

return;

end

end

grayImage = imread(fullFileName);

imshow(grayImage, []);

axis on;

title('Original Grayscale Image', 'FontSize', fontSize);

set(gcf, 'Position', get(0,'Screensize')); % Maximizare figura.

message = sprintf('Left click and hold to begin drawing.\nSimply lift the mouse button to finish');

uiwait(msgbox(message));

hFH = imfreehand();

% Se creeaza o imagine binara ("masca") de la obiectul ROI.

binaryImage = hFH.createMask();

xy = hFH.getPosition;

% Se micsoreaza imaginea pentru a afisa, in acest mod, mai multe imagini

% simultan pe exran.

subplot(2, 3, 1);

imshow(grayImage, []);

axis on;

drawnow;

title('Original Grayscale Image', 'FontSize', fontSize);

% Afisare masca libera.

subplot(2, 3, 2);

imshow(binaryImage);

axis on;

title('Binary mask of the region', 'FontSize', fontSize);

% Se eticheteaza imaginea binara si se calculeaza centroidul si centrul de masa.

labeledImage = bwlabel(binaryImage);

measurements = regionprops(binaryImage, grayImage, …

'area', 'Centroid', 'WeightedCentroid', 'Perimeter');

area = measurements.Area

centroid = measurements.Centroid

centerOfMass = measurements.WeightedCentroid

perimeter = measurements.Perimeter

% Se calculeaza aria desenata in pixeli.

numberOfPixels1 = sum(binaryImage(:))

% O alta metoda de calcula ce ia in considerare si fractiunile de pixeli.

numberOfPixels2 = bwarea(binaryImage)

% Se retin coordonatele marginii regiunii desenate liber.

structBoundaries = bwboundaries(binaryImage);

xy=structBoundaries{1};

% Se ia o matrice de dimensiune n pe 2 de coordonate x si y.

x = xy(:, 2); % Coloanele.

y = xy(:, 1); % Liniile.

subplot(2, 3, 1); % Plotare peste imaginea originala.

hold on; % Se pastreaza imaginea pe ecran.

plot(x, y, 'LineWidth', 2);

drawnow; % Se forteaza compilatorul sa deseneze instantaneu.

% Evidentiere margine in imagine prin setarea acesteia la 255 indiferent daca masca este adevarata sau nu.

burnedImage = grayImage;

burnedImage(binaryImage) = 255;

% Afisare imagine si masca suprapusa.

subplot(2, 3, 3);

imshow(burnedImage);

axis on;

caption = sprintf('New image with\nmask burned into image');

title(caption, 'FontSize', fontSize);

% Adaugare masca si afisare rezultat.

% Se pastreaza doar partea imaginii care este in masca si zero in afara acesteia.

blackMaskedImage = grayImage;

blackMaskedImage(~binaryImage) = 0;

subplot(2, 3, 4);

imshow(blackMaskedImage);

axis on;

title('Masked Outside Region', 'FontSize', fontSize);

% Calcul medie.

meanGL = mean(blackMaskedImage(binaryImage));

% Calcul deviatie standard.

stdGL = std2(blackMaskedImage(binaryImage));

% Marcare centroid si centru de masa.

hold on;

plot(centroid(1), centroid(2), 'r+', 'MarkerSize', 30, 'LineWidth', 2);

plot(centerOfMass(1), centerOfMass(2), 'g+', 'MarkerSize', 20, 'LineWidth', 2);

% Se procedeaza in acelasi mod dar se innegreste in regiune.

insideMasked = grayImage;

insideMasked(binaryImage) = 0;

subplot(2, 3, 5);

imshow(insideMasked);

axis on;

title('Masked Inside Region', 'FontSize', fontSize);

% Decupare imagine.

leftColumn = min(x);

rightColumn = max(x);

topLine = min(y);

bottomLine = max(y);

width = rightColumn – leftColumn + 1;

height = bottomLine – topLine + 1;

croppedImage = imcrop(blackMaskedImage, [leftColumn, topLine, width, height]);

% Afisare imagine decupata.

subplot(2, 3, 6);

imshow(croppedImage);

axis on;

title('Cropped Image', 'FontSize', fontSize);

% Marcare centroid si centru de masa.

hold on;

plot(centroid(1)-leftColumn, centroid(2)-topLine, 'r+', 'MarkerSize', 30, 'LineWidth', 2);

plot(centerOfMass(1)-leftColumn, centerOfMass(2)-topLine, 'g+', 'MarkerSize', 20, 'LineWidth', 2);

% Prezentare rezultate.

message = sprintf('Mean value within drawn area = %.3f\nStandard deviation = %.3f\nNumber of pixels = %d\nArea in pixels = %.2f\nPerimeter = %.2f\nCentroid at (x,y) = (%.1f, %.1f)\nCenter of Mass at (x,y) = (%.1f, %.1f)\nRed crosshairs at centroid.\nGreen crosshairs at center of mass.', …

meanGL, stdGL, numberOfPixels1, numberOfPixels2, perimeter, …

centroid(1), centroid(2), centerOfMass(1), centerOfMass(2));

msgbox(message);

%********************************************

%**************** Citoplasma*****************

%********************************************

bI_kernel=binaryImage;

clearvars -except bI_kernel

clc; % Sterge fereastra de comenzi.

clear; % Sterge toate variabilele.

close all; % Inchide toate graficele, cu exceptia celor create de imtool.

imtool close all; % Inchide toate graficele create cu imtool.

workspace; % Asigurare ca panoul spatiului de lucru este afisat.

fontSize = 16;

% Citire imagine de test in nuante de gri, intr-un standard MATLAB

folder = fullfile(matlabroot, 'E:\Facultate\Licenta\Scris\Gray scale');

baseFileName = 'M8_mursa20f3.tif_out_only_cell.tif';

% Se ia numele intreg al fisierului, inclusiv calea catre acesta.

fullFileName = fullfile(folder, baseFileName);

% Se verifica existenta fisierului.

if ~exist(fullFileName, 'file')

% Fisierul nu exista – nu a fost gasit in locul specificat. Se verifica calea de acces catre acesta.

fullFileName = baseFileName; % Nu este specificata calea de data asta.

if ~exist(fullFileName, 'file')

% Fisierul inca nu a fost gasit. Se alerteaza utilizatorul.

errorMessage = sprintf('Error: %s does not exist in the search path folders.', fullFileName);

uiwait(warndlg(errorMessage));

return;

end

end

grayImage = imread(fullFileName);

figure,imshow(grayImage, []);

axis on;

title('Original Grayscale Image', 'FontSize', fontSize);

set(gcf, 'Position', get(0,'Screensize')); % Maximizare figura.

message = sprintf('Left click and hold to begin drawing.\nSimply lift the mouse button to finish');

uiwait(msgbox(message));

hFH = imfreehand();

% Se creeaza o imagine binara ("masca") de la obiectul ROI.

binaryImage = hFH.createMask();

binaryImage = im2bw(binaryImage-bI_kernel,0.5); %%% adaugat

xy = hFH.getPosition;

% Se micsoreaza imaginea pentru a afisa, in acest mod, mai multe imagini

% simultan pe exran.

subplot(2, 3, 1);

imshow(grayImage, []);

axis on;

drawnow;

title('Original Grayscale Image', 'FontSize', fontSize);

% Afisare masca libera.

subplot(2, 3, 2);

imshow(binaryImage);

axis on;

title('Binary mask of the region', 'FontSize', fontSize);

% Se eticheteaza imaginea binara si se calculeaza centroidul si centrul de masa.

labeledImage = bwlabel(binaryImage);

measurements = regionprops(binaryImage, grayImage, …

'area', 'Centroid', 'WeightedCentroid', 'Perimeter');

area = measurements.Area

centroid = measurements.Centroid

centerOfMass = measurements.WeightedCentroid

perimeter = measurements.Perimeter

% Se calculeaza aria desenata in pixeli.

numberOfPixels1 = sum(binaryImage(:))

% O alta metoda de calcula ce ia in considerare si fractiunile de pixeli.

numberOfPixels2 = bwarea(binaryImage)

% Se retin coordonatele marginii regiunii desenate liber..

structBoundaries = bwboundaries(binaryImage);

xy=structBoundaries{1};

% Se ia o matrice de dimensiune n pe 2 de coordonate x si y.

x = xy(:, 2); % Coloane.

y = xy(:, 1); % Linii.

subplot(2, 3, 1); % Plotare peste imaginiea originala.

hold on; % Se pastreaza imaginea pe ecran.

plot(x, y, 'LineWidth', 2);

drawnow; % Se forteaza compilatorul sa deseneze instantaneu.

% Se evidentiaza marginea in imagine prin setarea acesteia la 255 indiferent daca masca este adevarata sau nu.

burnedImage = grayImage;

burnedImage(binaryImage) = 255;

% Afisare imagine si masca suprapusa.

subplot(2, 3, 3);

imshow(burnedImage);

axis on;

caption = sprintf('New image with\nmask burned into image');

title(caption, 'FontSize', fontSize);

% Adaugare masca si afisare rezultat.

% Se pastreaza doar partea imaginii care este in masca si zero in afara acesteia

blackMaskedImage = grayImage;

blackMaskedImage(~binaryImage) = 0;

subplot(2, 3, 4);

imshow(blackMaskedImage);

axis on;

title('Masked Outside Region', 'FontSize', fontSize);

% Calcul medie.

meanGL = mean(blackMaskedImage(binaryImage));

% Calcul deviatie standard.

stdGL = std2(blackMaskedImage(binaryImage));

% Marcare centroid si centru de masa.

hold on;

plot(centroid(1), centroid(2), 'r+', 'MarkerSize', 30, 'LineWidth', 2);

plot(centerOfMass(1), centerOfMass(2), 'g+', 'MarkerSize', 20, 'LineWidth', 2);

% Se procedeaza in acelasi mod dar se innegreste in regiune.

insideMasked = grayImage;

insideMasked(binaryImage) = 0;

subplot(2, 3, 5);

imshow(insideMasked);

axis on;

title('Masked Inside Region', 'FontSize', fontSize);

% Decupare imagine.

leftColumn = min(x);

rightColumn = max(x);

topLine = min(y);

bottomLine = max(y);

width = rightColumn – leftColumn + 1;

height = bottomLine – topLine + 1;

croppedImage = imcrop(blackMaskedImage, [leftColumn, topLine, width, height]);

% Afisare imagine decupata.

subplot(2, 3, 6);

imshow(croppedImage);

axis on;

title('Cropped Image', 'FontSize', fontSize);

% Marcare centroid si centru de masa.

hold on;

plot(centroid(1)-leftColumn, centroid(2)-topLine, 'r+', 'MarkerSize', 30, 'LineWidth', 2);

plot(centerOfMass(1)-leftColumn, centerOfMass(2)-topLine, 'g+', 'MarkerSize', 20, 'LineWidth', 2);

% Prezentare rezultate.

message = sprintf('Mean value within drawn area = %.3f\nStandard deviation = %.3f\nNumber of pixels = %d\nArea in pixels = %.2f\nPerimeter = %.2f\nCentroid at (x,y) = (%.1f, %.1f)\nCenter of Mass at (x,y) = (%.1f, %.1f)\nRed crosshairs at centroid.\nGreen crosshairs at center of mass.', …

meanGL, stdGL, numberOfPixels1, numberOfPixels2, perimeter, …

centroid(1), centroid(2), centerOfMass(1), centerOfMass(2));

msgbox(message);

Anexa 2

a=imread('N3_mursa1f5.tif_out_only_cell.tif');

b=zeros(1,256);

[l,c]=size(a);

for i=1:1:l

for j=1:1:c

if a(i,j)<1

continue;

else

t=a(i,j);

end

b(t)=b(t)+1;

end

end

% Rolul for-ului de mai sus este de a extrage celula din imagine, de a nu lua in considerare si fundalul negru ce are ca si index idx=0

subplot(1,2,1);

imshow(uint8(a));

title('Imaginea originala');

subplot(1,2,2);

imhist(a);

title('Histograma asociata imaginii');

figure

h1=bar(b);

title('Histograma celula normala');

%figure

%c=histfit(h1,[],'normal');

%title('histfit(h1)');

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%

aa=imread('mursa37f2.tif_out_only_cell.tif');

% M6_bacescu13f2.tif_out_only_cell.tif

bb=zeros(1,256);

[li,co]=size(aa);

for i=1:1:li

for j=1:1:co

if aa(i,j)<1

continue;

else

tt=aa(i,j);

end

bb(tt)=bb(tt)+1;

end

end

subplot(1,2,1);

imshow(uint8(aa));

title('Imaginea originala');

subplot(1,2,2);

bar(bb);

title('Histograma asociata imaginii');

figure

h2=bar(bb)

title('Histograma celula anormala');

%figure

%cc=histfit(h2);

%title('histfit(bb)');

% Convertirea imaginilor din uint8 in double

a=im2double(a);

aa=im2double(aa);

% Normalizarea histogramelor

hn1 = imhist(a)./numel(a);

hn2 = imhist(aa)./numel(aa);

% Calcularea erorii dintre cele doua histograme

f = sum((hn1 – hn2).^2);

f

% f =

% 0.0096

Anexa 3

% Program pe baza de clustering pentru identificarea celulelor cervicale anormale

a = imread('cells.jpg'); % Citire imagine

figure

imshow(a), title('Cervical cells');

text(size(a,2),size(a,1)+15, …

'http://www.soc.ucsb.edu/article/cervical-cancer', …

'FontSize',7,'HorizontalAlignment','right');

% Convertire imagine de la spatiul de culoare RGB la spatiul cu cromaticitate uniforma L*a*b*

% Spatiul L*a*b* constă dintr- un strat de luminozitate 'L*' ,

% un strat de cromaticitate 'a*' ce indica locul in care se incadreaza

% culoarea de-a lungul axei rosu-verde si un al doilea strat de

% cromaticitate 'b*' care indica locul in care se incadreaza culoarea de-a lungul axei albastru-galben

% Toate informatiile de culoare se gasesc in straturile 'a*' si 'b*'

% Distanta dintre doua culori poate fi masurata cu ajutorul distantei Euclidiene.

cform = makecform('srgb2lab'); % Convertirea imaginii la un spatiu de culoare L*a*b* cu ajutorul intructiunilor makecform si applycform

lab_a = applycform(a,cform);

% Clasificarea culorilor intr-un spatiu 'a*b*' folosind k-means clustering

% Clustering-ul este o modalitate de a separa grupurile de obiecte.

% K-means clustering trateaza fiecare obiect ca avand o anumita locatie in % spatiu.

% Se gasesc partitii in care obiectele din fiecare cluster sunt la fel de

% apropiate unele de altele si departate de restul obiectelor care fac

% parte la randul lor din alte clustere.

% K-means clustering cere sa fie specificat atat numarul de clustere in

% care sa fie partitionat spatiul cat si distanta la care sa se gaseasca

% doua obiecte.

% Deoarece exista informatiile de culoare in spatiul 'a*b*', obiectele au

% in acest moment valori ale pixelilor 'a*' sau 'b*'.

% Se utilizeaza k-means clustering pentru a partitiona obiectele in 3

% clustere/grupuri folosind distanta Euclidiana.

ab = double(lab_a(:,:,2:3));

nrows = size(ab,1);

ncols = size(ab,2);

ab = reshape(ab,nrows*ncols,2);

nColors = 3; % Pentru a evita cazul minimelor locale, se repeta clasificarea in 3 grupruri.

[cluster_idx, cluster_center] = kmeans(ab,nColors,'distance','sqEuclidean', …

'Replicates',3);

% Etichetarea fiecarui pixel din imagine folosind rezultatele de la k-means

pixel_labels = reshape(cluster_idx,nrows,ncols); % Pentru fiecare obiect de intrare, k-means returneaza un index ce corespunde unui cluster.

figure

imshow(pixel_labels,[]), title('Image labeled by cluster index');

% Crearea de imagini color pentru segmentarea celulelor cervicale.

% Prin utilizarea instructiunii pixel_labels, se pot separa obiectele in

% imagini color cu extensia .jpg, rezultatul fiind in cazul de fapta

% constituit din 3 imagini color ca urmare a clasificarii in 3 clase.

segmented_images = cell(1,3);

rgb_label = repmat(pixel_labels,[1 1 3]);

for k = 1:nColors

color = a;

color(rgb_label ~= k) = 0;

segmented_images{k} = color;

end

figure

imshow(segmented_images{1}), title('Objects in cluster 1');

figure

imshow(segmented_images{2}), title('Objects in cluster 2');

figure

imshow(segmented_images{3}), title('Objects in cluster 3');

% Segmentarea nucleelor in imagini separate. Scopul segmentarii nucleelor

% fiind de numarare ulterioare a celulelor anormale prezente pe frotiul

% endocervical.

mean_cluster_value = mean(cluster_center,2);

[tmp, idx] = sort(mean_cluster_value);

blue_cluster_num = idx(1);

L = lab_a(:,:,1);

blue_idx = find(pixel_labels == blue_cluster_num);

L_blue = L(blue_idx);

is_light_blue = im2bw(L_blue,graythresh(L_blue));

% Se utileaza eticheta is_light_blue pentru pixelii care apartin nucleelor albastre.

% Apoi, sunt afisate intr-o imagine separata nucleele evidentiate cu

% albastru.

nuclei_labels = repmat(uint8(0),[nrows ncols]);

nuclei_labels(blue_idx(is_light_blue==false)) = 1;

nuclei_labels = repmat(nuclei_labels,[1 1 3]);

blue_nuclei = a;

blue_nuclei(nuclei_labels ~= 1) = 0;

figure

imshow(blue_nuclei), title('Blue nuclei healthy cells');

% Numararea celulelor sanatoase.

I=blue_nuclei;

% Se utilizeaza instructiunea imadjust pentru a creste contrastul imaginii % I2 prelucrate prin saturarea cu 1% a datele de la intensitati atât mici

% cat si mari, prin extinderea valorilor intensitătii pentru a acoperi gama

% dinamica uint8.

I2=imadjust(I,stretchlim(I));

figure

imshow(I2),title('Contrast improvement');

level = graythresh(I2);

bw = im2bw(I2,level);

bw = bwareaopen(bw,2);

figure

imshow(bw),title('Thresholding cores');

% Analiza obiectelor din imagine.

cc = bwconncomp(bw,4)

cc.NumObjects

% Raspunsul afisat:

% cc =

% Connectivity: 4

% ImageSize: [285 450]

% NumObjects: 261

% PixelIdxList: {1×261 cell}

% ans =

% 261

% Segmentarea nucleelor celulelor anormale intr-o imagine separata, pe baza

% principiului de mai sus.

mean_cluster_value = mean(cluster_center,1);

[tmp, idx] = sort(mean_cluster_value);

blue_cluster_num = idx(1);

L = lab_a(:,:,1);

blue_idx = find(pixel_labels == blue_cluster_num);

L_blue = L(blue_idx);

is_light_blue = im2bw(L_blue,graythresh(L_blue));

% Se utilizeaza masca is_light_blue pentru a eticheta pixelii ce corespund % nucleelor albastre.

% Apoi, sunt afisate intr-o imagine separata nucleele ce corespund

% celulelor bolnave, evidentiate cu albastru.

nuclei_labels = repmat(uint8(0),[nrows ncols]);

nuclei_labels(blue_idx(is_light_blue==false)) = 1;

nuclei_labels = repmat(nuclei_labels,[1 3 1]);

blue_nuclei = a;

blue_nuclei(nuclei_labels ~= 1) = 0;

figure

imshow(blue_nuclei), title('Blue nuclei abnormal cells');

% Numarare celule bolnave.

I=blue_nuclei;

% Se utileaza instructiunea imadjust pentru a creste contrastul imaginii I2

% prelucrate prin saturarea cu 1% a datele de la intensitati atât mici cat

% si mari, prin extinderea valorilor intensitătii pentru a acoperi gama

% dinamica uint8.

I3=imadjust(I,stretchlim(I));

figure

imshow(I3),title('Contrast improvement');

level1 = graythresh(I3);

bw = im2bw(I3,level1);

bw = bwareaopen(bw,30);

figure

imshow(bw),title('Thresholding cores');

% Analiza obiectelor din imagine.

cccc = bwconncomp(bw,4)

cccc.NumObjects

% Raspunsul afisat:

% ccc =

% Connectivity: 4

% ImageSize: [285 450]

% NumObjects: 47

% PixelIdxList: {1×47 cell}

% ans =

% 47

% Afisarea numarului total de celule

a=cc.NumObjects+cccc.NumObjects

% Raspunsul afisat:

% a =

% 308

% Extragerea nucleului cu numarul 5

grain = false(size(bw));

grain(cccc.PixelIdxList{5}) = true;

figure

imshow(grain);

Anexa 4

% Coeficientul Sarle

a=imread('CN_andrei24f3.tif_out_only_cell.tif');

% Celula cervicala normala.

b=a(512,:);

figure

subplot(221),image(a), colormap(gray(256));% title('Imagine celula cervicala normala');

subplot(222),plot(b);% title('Profil de-a lungul sectiunii transversale pentru o celula cervicala normala')

b=double(b);

m1=mean(b) % momentul 1 = media

% m1 = 45.0400

m4=kurtosis(b) % momentul 4 = aplatizarea

% m4 = 3.2642

m3=skewness(b) % momentul 3 = asimetria

% m3 = 1.0115

c=imread('mursa37f2.tif_out_only_cell.tif');

% celula cervicala anormala

d=c(297,:);

figure

subplot(221),image(c), colormap(gray(256)); % title('Imagine celula cervicala anormala')

subplot(222),plot(d); % title('Profil de-a lungul sectiunii transversale pentru o celula cervicala anormala')

d=double(d);

m1_1=mean(d)

% m1_1 = 40.5620

m4_1=kurtosis(d)

% m4_1 = 1.2564

m3_1=skewness(d)

% m3_1 = 0.0233

Bibliografie

A.

American Cancer Society, Cervical Cancer Prevention and Early Detection, 2014

A. Lasslett, Microscopy Division, Olympus UK Ltd, Southall, Middlesex, UK , Principles and Applications of Differential Interference Contrast Light Microscopy, Microscopy and analysis light microscopy supplement, September2006

Ashman KM, Bird CM, Zepf SE, Astronomical J , 108: 2348, 1994

B

Balulescu Irina, Studii de biologie moleculara si citohistopatologie privind diagnosticul precoce al cancerului de col uterin, 2012

Baggett D., Nakaya M., McAuliffe M., Yamaguchi T.P., Lockett S., Whole cell segmentation in solid tissue sections, International Society for Advancement of Cytometry, vol. 67(2)-A, pp. 137– 143, 2005

C.

Cancer Council Australia, Understanding Cervical Cancer, A guide for women with cancer, their families and friends, 2013, ISBN 978 1 921619 40 3

Cuche E., Marquet P. and Depeursinge C., Simultaneous amplitude-contrast and quantitative phase-contrast microscopy by numerical reconstruction of Fresnel off-axis holograms, Appl. Opt., 38, 6994–7001, 1999

Chen C, Wang W, Ozolek JA, Rohde GK, A flexible and robust approach for segmenting cell nuclei from 2d microscopy images using supervised learning and template matching, Cytometry Part A, 83(5):495-507, 2013

C. Vertan, M. Ciuc, Tehnici fundamentale de Prelucrarea si Analiza Imaginilor, Ed. MatrixROM, Bucuresti, 2007

D.

Debbie Saslow, PhD; Philip E. Castle, PhD, MPH; J. Thomas Cox, MD; Diane D. Davey, MD; Mark H. Einstein, MD, MS; Daron G. Ferris, MD; Sue J. Goldie, MD, MPH; Diane M. Harper, MD, MPH, MS; Walter Kinney, MD; Anna-Barbara Moscicki, MD; Kenneth L. Noller, MD; Cosette M. Wheeler, PhD; Terri Ades, RN, MS, AOCN; Kimberly S. Andrews; Mary K. Doroshenk, MA; Kelly Green Kahn; Christy Schmidt; Omar Shafey, PhD, MPH; Robert A. Smith, PhD; Edward E. Partridge, MD (for the Gynecologic Cancer Advisory Group); Francisco Garcia, MD, MPH, American Cancer Society Guideline for Human Papillomavirus (HPV) Vaccine Use to Prevent Cervical Cancer and Its Precursors, CA Cancer J Clin 2007;57:7–28

Douglas B. Murphy, Fundamentul of Light Microscopy and Electronic Imaging, USA, 2001

De Nicola S., Finizio A., , Pierattini G., Alfieri D., Grilli S., Sansone L. and Ferraro P., Recovering correct phase information in multiwavelength digital holographic microscopy by compensation for chromatic aberrations, Opt. Lett., 30, 2706–2708, 2005

Debailleul M., Simon B., , Georges V., Haeberle O. and Lauer V., Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples, Meas. Sci. Technol. 19, 074009, 2008

Mona Mihailescu, Irina A. Paun, Eugenia Vasile, Roxana C. Popescu, Alexandra V. Baluta, Diana G. Rotaru, Digital Off-Axis Holographic Microscopy: from Cells Vizualization, to Phase Shift Values, Ending with Physiological Parameters Evolution, Romanian Journal of Physics – Volume 61, Numbers 5-6, November 24, 2015

E.

F.

G.

Georgeta Din., A. Stretean, Rolul etiologic al HPV in carcinogeneza cervicala, Universitatea “Lucian Blaga” din Sibiu, AMT, vol II, nr. 3, 2011, pag. 76

Gabor D., A new microscopic principle, Nature. 1948; 161: 777-778

Gabor D, Goss WP., Interference microscope with total wavefront reconstruction, J. Opt. Soc. Am., 1966; 56: 849-856

H.

H. E. KARRER with the assistance of Natasha Kent and R. Calame, Cell Interconnections in Normal Human Cervical Epithelium, February 1, 1960

Hutchinson ML, Isenstein LM, Goodman A, Hurley AA, Douglass KL, Mui KK, Patten FW, Zahniser DJ ,Homogeneous sampling accounts for the increased diagnostic accuracy using the ThinPrep® Processor, Department of Cytopathology, New England Medical Center, Tufts University, Boston, Massachusetts,American Journal of Clinical Pathology [1994, 101(2):215-219]

I.

Iwai H, Fang-Yen C, Popescu G, Wax A, Badizadegan K, Dasari RR, Feld MS., Quantitative phase imaging using actively stabilized phase-shifting low-coherence interferometry, Opt. Lett. 2004; 29: 2399-2401

J.

Jacques Ferlay, Hai-Rim Shin, Freddie Bray, David Forman, Colin Mathers and Donald Maxwell ParkinG. , Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008, International Journal of Cancer, 2008

Jyrki Selinummi, Pekka Ruusuvuori, Irina Podolsky, Adrian Ozinsky, Elizabeth Gold, Olli Yli-Harja, Alan Aderem, Ilya Shmulevich, Bright Field Microscopy as an Alternative to Whole Cell Fluorescence in Automated Analysis of Macrophage Images, October 22, 2009

K.

Khmaladze A., Kim M. and Lo C. M., Phase imaging of cells by simultaneous dual-wavelength reflection digital holography, Opt. Express 16, 10900–10911, 2008

Kuhn J., Colomb T., Montfort F., Charriere F., Emery Y., Cuche E., Marquet P. and Depeursinge C., Real-time dual-wavelength digital holographic microscopy with a single hologram acquisition, Opt. Express, 15, 7231–7242, 2007

Kim Myung K. Kim, Principles and techniques of digital holopraphic microscopy, SPIE Reviews, May 14, 2010

Kemper B., Carl D., , Schnekenburger J., Bredebusch I., Schafer M., , Domschke W. and von Bally G., Investigation of living pancreas tumor cells by digital holographic microscopy, J. Biomed. Opt., 11, :3, 033001, 2006

L.

Leith EN, Upatnieks J., Wavefront reconstruction with diffuse illumination and three-dimensional objects, J. Opt. Soc. Am., 1964; 54: 1295-1301

Lakshmi GK, Krishnaveni K, Automated extraction of cytoplasm and nuclei from cervical cytology images by fuzzy thresholding and active contours, Int J Comput Appl., 73:26-30, 2013

Li K, Lu Z, Liu W, Yin J, Cytoplasm and nucleus segmentation in cervical smear images using radiating gvf snake, Pattern Recognit, 45(4):1255-1264, 2012

M.

Mojgan Karimi-Zarchi, Fateme Peighmbari, Neda Karimi, Mitra Rohi, and Zohre Chiti, A Comparison of 3 Ways of Conventional Pap Smear, Liquid-Based Cytology and Colposcopy vs Cervical Biopsy for Early Diagnosis of Premalignant Lesions or Cervical Cancer in Women with Abnormal Conventional Pap Test, Int J Biomed Sci. 2013 Dec; 9(4): 205–210.

Mortimer Abramowitz, Kenneth R. Spring1, H. Ernst Keller2, and Michael W. Davidson3,Olympus America, Melville, NY, 1National Heart, Lung, and Blood Institute, 2National Institutes of Health, Bethesda, MD, Carl Zeiss, Thornwood, NY, and 3Florida State University, Tallahassee, FL, USA, Basic Principles of Microscope Objectives, BioImaging, Vol. 33, No. 4 (2002)

Mico V., Zalevsky Z., Garcia J., Common-path phase-shifting digital holographic microscopy: A way to quantitative phase imaging and superresolution, Opt. Commun. 2008; 281: 4273-4281

Mann C. J., Yu L. F., Lo C. M. and Kim M. K., High-resolution quantitative phase-contrast microscopy by digital holography , Opt. Express.13 , 8693–8698, 2005

Mann C. J., Yu L. F. and Kim M. K., Movies of cellular and sub-cellular motion by digital holographic microscopy, Biomed. Eng. Online 5, :21, 10, 2006

Minetti C., Callens N., Coupier G., Podgorski T. and Dubois F., Fast measurements of concentration profiles inside deformable objects in microflows with reduced spatial coherence digital holography , Appl. Opt., 47, 5305–5314, 2008

N.

Nikon, Eclipse Ti Series, Differential Interference Contrast Attachement, Instructions

O.

P.

Pearson K., Mathematical contributions to the theory of evolution, XIX: Second supplement to a memoir on skew variation. Phil Trans Roy Soc London. Series A 216 (538–548): 429–457. Bibcode 1916RSPTA.216..429P. doi:10.1098/rsta.1916.0009. JSTOR 91092, 1916

Q.

R.

Robert D. Burk, Anna S. Kadish, Servio Calderin, Seymour L. Romney, Human papillomavirus infection of the cervix detected by cervicovaginal lavage and molecular hybridization: Correlation with biopsy results and Papanicolaou smear, American Journal of Obstetrics and Gynecology,Volume 154, Issue 5, May 1986, Pages 982–989

Reichelt S., Zappe H., Combined Twyman-Green and Mach-Zehnder interferometer for microlens testing, Appl. Opt. 2005; 44:5786-5792

Rappaz B., Barbul A., Hoffmann A., Boss D., Korenstein R., Depeursinge C., Magistretti P. J., and Marquet P., Spatial analysis of erythrocyte membrane fluctuations by digital holographic microscopy , Blood Cells Mol. Dis. 42, 228–232, 2009

S.

Shinya Inoue, Robert J. Valter, Jr. Michael, W. Berns, Gordo W. Ellis, Video Microscopy, Springer Science + Businesss Media, LLC, 1986

T.

Thomas R. Knapp, Bimodality Revisited, University of Rochester; The Ohio State University, Journal of Modern Applied Statistical Methods, Volume 1, 2007

U.

V.

V. Micó, C. Ferreira, Z. Zalevsky and J. García, Basic principles and applications of digital holographic microscopy, Formatex, 2010

Violeta L. Calin, M. Mihailescu, Alexandra V. Baluta, Eugenia Kovacs, Tudor Savopol, Mihaela G. Moisescu, Characterisation of Adherent Cells Exposed to Electric Field Pulses Using Holographic Phase Microscopy , Conferinta Nationala de Biofizica, Cluj, 2-4 Iunie, 2016

W.

Wenbo Xu, M. H. Jericho, I. A. Meinertzhagen, and H. J. Kreuzer, Digital in-line holography for biological applications, Dalhousie University, Halifax, NS, Canada B3H 4J1, July 16, 2001

Wahba HH., Kreis T., Characterization of graded index optical fibers by digital holographic interferometry, Appl. Opt. 2009; 48: 1573-1582

X.

Y.

Yoonsung Bae, Quantitative Phase-Contrast Imaging using Digital Holographic Microscope, Department of Information and Communications, Gwangju Institute of Science and Technology, 261 Cheomdan-gwagiro, Buk-gu, Gwangju 500-712, 2009, Republic of Korea

Yu L. F., An Y. F. and Cai L. L., Numerical reconstruction of digital holograms with variable viewing angles, Opt. Express. 10, 1250–1257, 2002

Yu L. F., Mohanty S., Zhang J., Genc S., Kim M. K., Berns M. W. and Chen Z. P., Digital holographic microscopy for quantitative cell dynamic evaluation during laser microsurgery, Opt. Express, 17, 12031–12038, 2009

Z.

Zhang T., Yamaguchi I., Three-dimensional microscopy with phase-shifting digital holography, Opt. Lett. 1998; 23: 1221-1223

Site-uri:

http://www.geog.ucl.ac.uk/about-the-department/support-services/laboratory/light-microscopy/bright-field-microscopy

http://ieeexplore.ieee.org/xpl/articleDetails.jsp?tp=&arnumber=4540962&url=http%3A%2F%2Fieeexplore.ieee.org%2Fxpls%2Fabs_all.jsp%3Farnumber%3D4540962

http://link.springer.com/article/10.1007/s00138-011-0337-9

http://photonicsforenergy.spiedigitallibrary.org/article.aspx?articleid=1305556