Analiza Peptidelor Si Proteinelor Prin Spectrometria de Masa. Aplicatii Biomedicale

LUCRARE DE LICENȚĂ

Analiza peptidelor și proteinelor prin spectrometria de masă. Aplicații biomedicale.

CUPRINS

Capitolul 1. Consideratii teoretice

Noțiuni introductive. Aminoacizi.

Nomenclatură

Tipuri de aminoacizi naturali

Proprietăți fizice și chimice

Structura proteinelor și peptidelor

Proteinele

Structura proteinelor

Peptidele

Rolul biologic al proteinelor și peptidelor

Sinteza proteinelor

Peptidele în biologia medicală

Capitolul 2. Metode fizice moderne de analiză a peptidelor și proteinelor

2.1 Cristalografia cu raze X

2.1.1 Scurt istoric

2.2 Imagistica prin rezonanță magnetică-RMN

2.2.1 Cum funcționează RMN

2.3 Spectrometria de masă

2.3.1 Ionizarea prin electropulverizare (ESI)

Capitolul 3. Rezultate experimentale propri și discuții

Capitolul 4. Concluzii

Capitolul 5. Bibliografie

1. CONSIDERAȚII TEORETICE

Noțiuni introductive. Aminoacizi.

Douăzeci la sută din corpul uman este format din proteine. Proteină joacă un rol crucial în aproape toate procesele biologice și aminoacizi sunt elementele constitutive ale acesteia.[1]

Aminoacizii sunt unități fundamentale ale proteinelor. Acești compuși conțin în molecula lor grupării funcționale mixte de –NH2 si –COOH.

Formula generala a aminoacizilor este:

1.1.1 Nomenclatură

Aminoacizii se denumesc folosind cuvântul „acid“, urmat de „amino“ și numele acidului corespunzător.[2] Prin prefixele „di“, „tri“ etc., se arată numărul de grupe amino și carboxil, iar poziția relativă a două grupe funcționale se precizează cu literele grecești „α“, „β“, „γ“, „δ“, „ε“, în care acidul este α dacă grupările amino și carboxil se leagă de același carbon, β dacă grupările amino și carboxil se leagă la carboni alăturați, iar, pe măsură ce crește distanța, se vor numi γ, δ, ε. În cazul compușilor aromatici, se folosesc prefixele „orto“, „meta“, „para“.

acid α amino-propanoic

acid β amino-propanoic

1.1.2 Tipuri de aminoacizi naturali

Exista 20 de aminoacizi ce intră în componența proteinelor. Aceștia sunt: alanina, valina, leucina, izoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, glicocol, serina, treonina, tirozina, triptofanul, asparagina, glutamina, cisteina, acid asparatic, acid glutamic, arginina, lisina, histidina (acesta este esentiala copiilor sub un an). Dintre aceștia, 8 sunt esențiali, adică nu pot fi produși de organismul uman (valina, leucina, izoleucina, triptofanul, fenilalanina, metionina, lizina și treonina).[1]

Figura 1.1.2.1 Tabele de aminoacizi naturali [2]

1.1.3 Proprietăți fizice și chimice

Aminoacizii sunt substanțe solide, cristalizate. Au puncte de topire foarte ridicate datorită legăturilor de H ce se stabilesc între grupările -COOH la moleculele vecine și sunt solubili în H2O, dar insolubili in compuși organici.[2] Aminoacizii inferiori au gust dulce iar cei superiori amar.

Amfionii sunt structuri chimice care, în cadrul aceleeași molecule, conțin ambele tipuri de sarcini.[3]

, în prezența H2O

Soluții tampon

Aminoacizii se folosesc la prepararea soluțiilor tampon. În acestea se adaugă o cantitate mică de acid sau de bază, ele ajung să fie neurtalizate și în cele din urmă se poate constata că ajung să nu producă nici o modificare la nivelul pH-ului soluției, acesta rămânând neschimbat.

Reacția de condensare

În timpul acestei reacții se formează legături noi între atomi, aceștia aparținând diferitelor molecule, iar rezultatul duce la formarea  legăturilor peptidice. În urma reacțiilor între legăturile peptidice rezultă peptidele. [3]

Structura proteinelor și peptidelor

Proteinele

Proteinele sunt molecule mari, complexe, care joaca un rol critic în corp. Ele fac cele mai multe lucrării în celule și sunt necesare pentru structura, funcții, reglarea țesuturilor si organelor corpului.[4] Elucidarea structurii proteinelor a reprezentat ți continuă să reprezinte una din problemele principale ale biochimiei aplicate.[5] 

Imaginați-vă proteine ca niște mașini. Mașini care fac toate lucrurile vii, de la virusuri, bacterii, fluturi, meduze, plante și funcțiile oamenești. Corpul uman este format din aproximativ 100 de trilioane de celule – fiecare are o funcție specifică. Fiecare celula are mii de proteine diferite, care împreună determină celula să își facă treaba – proteinele sunt mașini mici aflate în interiorul celulei.[6]

Prima menționare a cuvântului proteină a fost făcută de către Jakob Berzelius, descoperitorul acestora, în scrisoarea sa către Gerhardus Johannes Mulder din 10 iulie 1838, scrisoare în care menționează:

"The name protein that I propose for the organic oxide of fibrin and albumin, I wanted to derive from [the Greek word] πρωτειος, because it appears to be the primitive or principal substance of animal nutrition".

1.2.1.1 Structura proteinelor

Structura substanțelor proteice este încă insuficient cunoscută datorită dinamicității structurii proteinelor, deoarece ele sunt în permanență supuse unor procese de sinteză și de degradare. Pentru evidențierea succesiunii aminoacizilor în structura proteinelor se folosesc 2 metode:

Degradarea Edman folosește ca reactiv izotiocianatul de fenil care evidențiază selectiv aminoacidul. Grupa amino terminală se adiționează la izotiocianat trecând printr-un derivat de tiouree. După ce se tratează cu un acid slab, aminoacidul marcat sub formă de feniltiohidantoină se detașează de restul polipeptidei. Aceasta cu noul său aminoacid terminal poate fi supusă la un nou ciclu de tratări pentru identificarea următoarei grupe amino.[6]

Degradarea Sanger are la bază tratarea polipetidei cu fluoro-2,4-dinitrobenzen, având loc atacul reactivului asupra grupării amino a aminoacidului N-terminal. Metoda Sanger are dezavantajul degradării complete a polipeptidei.

Comparativ cu celelalte biomoleculare, proteinele prezintă o structură chimică mult mai complexă de care depind în mod direct functiile lor biologice și care se caracterizează prin existenta a patru nivele de organizare numite structura primară, secundară, terțiară si respectiv cuaternară.[5]

Structura primară

Structura primară este dată de numarul, natura si succesiunea resturilor de aminoacizi în catenele polipeptidice ce intra în structura acestora. Mai exact de aminoacizii care intră în lanțul proteic prin formarea legăturilor peptidice.

Figura. 1.2.1.1.1. În structura primară se poate observa lanțul de aminoacizi[4]

Legătura peptidică -CO-NH- se găsește în același plan, iar carbonul -CH- se poate roti, putând să apară în planuri diferite. Datorită lungimii relative mici a catenelor laterale, ele se pot aranja de o parte și de alta a lanțului proteic, astfel că lanțul proteic nu este ramificat.[7]

Figura 1.2.1.1.2 Reprezentarea schematică a structurii primare a insulinei umane (Kucerenko, N.E. – 1988)[5]

Prima proteina căreia i s-a determinat structura primară (în 1955) a fost insulina care are o masa moleculara de 6.000 Da. Câtiva ani mai târziu s-a stabilit structura primară a ribonucleazei (M = 13.000 Da), iar în prezent sunt cunoscute structurile primare ale multor proteine cu mase moleculare mult mai mari si care sunt formate din sute sau chiar mii de resturi de aminoacizi.[5] Valorile mari ale maselor a dus la concluzia că o parte din aminoacizi se repetă de mai multe ori în cadrul unei molecule.[4] Ipoteza că proteinele sunt formate din lanțuri lineare de aminoacizi a fost fomulată pentru prima dată în anul 1902 [8], la a 74-a reuniune a Societății Oamenilor de Stiință din Germania, ținută în orașul Karlsbad, de către Franz Hofmeister  și Emil Fischer. Ipoteza că în molecula proteinelor există legături amidice fusese elaborată de chimistul francez E. Grimaux încă din anul 1882.[9] În ciuda evidențelor care demonstrau faptul că proteinele supuse acțiunii proteolitice se scindează în oligopeptide, ideea că lanțul proteic este liniar, au fost idei greu de "digerat". În perioada respectivă, numeroși savanți (William Astbury, Hermann Staudinger), punând la îndoială acest lucru, prin argumentarea că legăturile amidice nu sunt îndeajuns de puternice pentru a susține o moleculă proteică lungă. Cu timpul au apărut diverse ipoteze:[6]

Ipoteza coloidală care susținea ca proteinele sunt ansambluri moleculare coloidal formate din molecule mai mici – ipoteză contrazisă de măsurarea ultracentrifugării de către Svedberg care arată faptul că proteinele sunt molecule bine definite, au greutate moleculară, iar prin electroforeză Arne Tiselius demonstrează că proteinele sunt molecule unice.

Ipoteza a 2-a, numită ipoteza ciclol, avansată de Dorothy Wrinch, are la bază 3 elemente:

Ciclol reaction în care gruparea carbonil și gruparea amino a 2 peptide se incrucișează C=O + HN → C(OH)-N (așa numita legătură în cruce); aceste legături sunt de tip covalent, similare cu legăturile covalente de hidrogen propuse de William Astbury, pentru a explica stabilitatea structurii proteice.

Lanțurile beta vecine au la bază o serie de reacții de tip ciclol.

Structura proteinelor mici corespund așa numitelor "solid de tip Platon", fără ca să existe colțuri libere.

Alte ipoteze au fost lansate de către Emil Abderhalden (modelul dicetopiperazinic), sau Troesengaard în anul 1942 (modelul pirol/piperidină). Toate aceste modele au fost infirmate de Frederick Sanger care reușește să identifice secvența aminoacizilor din insulină, dar și de determinările cristalografice efectuate de Max Perutz și John Kendrew asupra mioglobinei și hemoglobinei.[4]

Structura secundară

MODELUL HELICOIDAL

Studiul proteinelor fibrilare din clasa scleroproteinelor prin metoda difractiei razelor X a evidențiat faptul că acestea se caracterizează prin prezența unor regularități structurale ale moleculei, prin unități care se repeta si care sunt dispuse de-a lungul unui ax imaginar al moleculei.

Aceste regularitati în structura moleculei au fost numite perioade de identitate si ele difera de la o proteina la alta.

În functie de marimea perioadelor lor de identitate, proteinele se împart în 3 grupe:

grupa α-keratinei, miozinei si fibrinogenului

grupa α-keratinei si fibroinei

grupa colagenului

Efectuând experimente pe cristale peptidice, Pauling și Corey au stabilit cu rigurozitate condițiile formării catenelor polipeptidice și au constituit modele experimentale care să ilustreze modul în care catenele polipeptidice sunt orientate în spațiu în funcție de natura si numarul legăturilor peptidice, precum și de dimensiunile lor. Autorii au stabilit de asemenea, urmatoarele criterii care stau la baza formarii catenelor polipeptidice:

aminoacizii constituenti trebuie sa prezinte configuratie L si au în structura proteinelor aceeasi valoare, deoarece catenele lor laterale nu influenteaza structura secundara;

distantele interatomice si unghiurile de valenta trebuie sa prezinte aceleasi valori, indiferent de marimea catenei polipeptidice;

atomii participanti la legatura peptidica trebuie sa fie coplanari, aceasta asezare fiind favorizata energetic;

modelul experimental elaborat pe baza datelor de laborator trebuie sa permita formarea unui numar maxim posibil de legaturi de hidrogen.

Pe baza acestor postulate, Pauling și Corey găsesc ca cel mai simplu aranjament corespunzator acestor cerinte este modelul helicoidal sau spiralat, denumit α-helix. Acesta rezulta prin spiralizarea catenei polipeptidice în jurul unui cilindru imaginar.

În functie de directia de spiralizare, α-helixul poate sa apara teoretic sub doua forme:

α-helixul de dreapta are sensul unui surub cu pasul spre dreapta;

α-helixul de stânga are sensul unui surub cu pasul spre stânga.

Aceasta structura helicoidala a macromoleculelor proteice a fost postulata cu 16 ani înaintea lui Pauling si Corey de catre biochimistul român Haralamb Vasiliu.

Aceasta așezare spațială, care confera moleculei o arhitectura structurală specială, este menținută datorita formării unui mare numar de punți de hidrogen intracatenare la care participă oxigenul carbonilic din vecinatatea unei legături peptidice si hidrogenul din vecinătatea alteia, situată la o distanta de 4 resturi de aminoacizi. Aceste punți de hidrogen sunt aproape paralele cu axul moleculei, iar într-o spiră intră 3,6 resturi de aminoacizi.

Distanța dintre două spire succesive este de 5,41 Å, iar diametrul lor este de 0,101 Å. Dupa un interval al α-helixului care cuprinde 18 resturi de aminoacizi, adica 27 Å, α-helixul este superpozabil, adică se repetă identic dupa fiecare 5 spire. Acest interval reprezintă asa-numita perioada mare de.

Modelul helicoidal a fost apoi confirmat experimental si reprezintă una din variantele structurii secundare a proteinelor. Multe date experimentale demonstreaza însa faptul că proteinele native nu prezintă o structură secundară totală sau perfect spiralată. Cele mai multe proteine prezintă o organizare structurală parțial helicoidală. Procentul de α-helix în structura proteinelor oscilează între 0 – 10% în cazeina, actina si α-globulină, între 10 – 20% în ribonucleaza, între 20 – 30% la pepsină si histone, între 30 – 45% la ovalbumină, muramidază si fibrinogen, între 60 – 80% la mioglobină si hemoglobină si respectiv între 80 – 100% în tropomiozina.

MODELUL STRATURILOR PLIATE

Datorită structurii lor chimice, prolina si hidroxiprolina nu se înscriu în structura α-helicoidală. Acesti doi aminoacizi heterociclici, dar si glicocolul, tind să confere catenelor polipeptidice un alt tip de structură secundară, denumita α-conformație, care corespunde modelului straturilor pliate.

Conform acestui model, două sau mai multe catene polipeptidice sau fragmente ale aceleiași catene se orientează spațial sub formă pliata, în zig-zag.

Modelul straturilor pliate se poate prezenta în doua variante:

modelul straturilor pliate paralele (caracteristic de exemplu pentru β-keratina);

Modelul straturilor pliate antiparalele (întâlnit de exemplu la fibroină).

Structura β-pliata este stabilizată de punți de hidrogen care se formează în mod similar ca în cazul structurii helicoidale, dar care sunt intercatenare si perpendiculare pe axul moleculei. Daca la α-helix radicalii laterali ai resturilor de aminoacizi sunt orientati spre exterior, în structura β-pliată ei se orientează de o parte și de alta a planului legaturii peptidice, perpendicular pe acesta.

De regulă, punctele de trecere de la fragmentele helicoidale la cele pliate și invers sunt reprezentate de resturile de prolină si hidroxiprolină si uneori de cele de glicină

.

MODELUL TROPOCOLAGENULUI

Structurile α-helicoidale și β-pliate sunt caracteristice marii majorități a proteinelor. Exista însa unele proteine, dintre care cea mai importantă este colagenul, care prezintă o structură secundară caracteristică ce a fost denumită modelul structural al colagenului. Studiile de difractie a razelor X indică în colagen o structură secundară cu o perioadă de identitate de 2,86 Å, paralelă cu axul fibrei.

Ponderea mare a resturilor de prolină si hidroxiprolină (pâna la 25%) din molecula colagenului, fac imposibila structura helicoidală sau pliată, acești aminoacizi formând un număr mic de punți de hidrogen. Molecula colagenului este alcătuită din 3 catene polipeptidice, fiecare având o masa moleculara de 95.000 Da si câte 1.000 resturi de aminoacizi. Cele 3 catene ale colagenului sunt strâns legate între ele prin punti de hidrogen, dând nastere tropocolagenului.

Structura terțiară

Majoritatea proteinelor native au o structură spațială determinată de dimensiunile si polaritatea resturilor de aminoacizi precum si de succesiunea acestora în catenele polipeptidice componente. Acest nivel de organizare structurală reprezintă deci rezultatul interactiunilor dintre resturile aminoacizilor din catenele polipeptidice. Structura terțiară este definită ca fiind forma structurala ce rezultă prin superspiralizarea a două sau mai multe catene polipeptidice ce conțin fragmente α-helicoidale si β-pliate într-o arhitectura spațială complexă sub formă de ghem sau globulă. Formarea unei structuri globulare native, caracteristică pentru o proteină dată este un proces complex ce are la baza formarea unei multitudini de legaturi slabe, necovalente. Principalele proteine ale căror structuri terțiare au fost bine studiate sunt hemoglobina, mioglobina, muramidaza, ribonucleaza, papaina, chimotripsinogenul, carboxipeptidaza A, subtilizina si altele. Mentinerea si stabilizarea structurii terțiare se realizeaza prin forțele de atracție ce apar între radicalii aminoacizilor componenți care se pot orienta în așa fel încât să ajunga în poziții favorabile formării diferitelor tipuri de legaturi. Dintre acestea, cele mai importante sunt urmatoarele:[5]

Legături de hidrogen, sunt legături coordinativ heteropolare care se stabilesc cu ușurință între gruparea carbonil C=O (electronegativă) și gruparea NH- (electropozitivă), din 2 lanțuri polipeptidice alăturate, sau în cazul formelor lactam-lactimă între gruparea -OH și azotul iminic =NH.

Helixul este foarte îngust, în el nu poate pătrunde molecula solventului. Legăturile peptidice sunt plane, iar 2 planuri consecutive -CO-NH- formează un unghi de 1800, rotirea lanțului se face la carbonul α (metinic).[3]

Figura 1.2.1.1.3 Legăturile de hidrogen au lungimea cuprinsă între 2,7-3,1 A și energia de 3-7 Kcal/mol la eptide, iar la apă 2-3Kcal/mol.[8]

Legăturile de hidrogen se pot stabii și între catenele laterale care au grupări carboxil, hidroxil, amino au tiolice. Din punct de vedere energetic legătura de hidrogen nu este puternică dar datorită răspândirii relativ uniforme de-a lungul scheletului proteic oferă proteinei stabilitatea necesară.[9]

Legături disulfidice.

Legătura este rezistentă la hidroliză, însă se poate desface, iar prin reducere formează tioli (SH), iar prin oxidare formează acizi. În general legătura sulfidică se întâlnește la proteinele transformate, care au o rezistență mecanică mare.

În afară de aceste legături se mai pot stabili alte tipuri de legături: legături ionice (stabilite de obicei între grupările aminice și cele carboxilice ionizate), legături de tip van der Waals (legături electrostatice slabe care se stabilesc între radicalii hidrofobi), legături fosfodiesterice (între 2 resturi de serină și acid fosforic), legături eterice (stabilite la nivelul aminoacizilor cu grupări hidroxilice).[8]

Structura cuaternară

Aceasta reprezintă nivelul de organizare cel mai înalt al proteinelor și este rezultatul interactiunilor dintre catenele polipeptidice independente, fiecare cu structura sa primară, secundară și terțiară caracteristică.[5]

Enzimele care catalizează asamblarea acestor subunități poartă denumirea de holoenzime, în care o parte poartă denumirea de subunități reglatoare și subunități catalitice.

Figura 1.2.1.1.4 Vedere 3 D a hemoglobinei cele 4 subunități roșu și galben, iar unitatea hemică verde. Numele de hemoglobină este formată din hem și globină, denumire ce denotă faptul că hemoglobina are la bazăproteine globulare cuplate cu o grupare hem.[5]

Proteine care au structură cuaternară: hemoglobina, ADN polimeraza și canalele ionice, dar și nucleozomi și nanotubuli, care sunt complexe multiproteice. Fragmentele proteice pot suferi transformări în structura cuaternară, transformări care se reflectă fie în structurile individuale fie în reorientările fiecărei subunități proteice. Numărul subunităților din oligomerice sunt denumite prin adăugarea sufix-ului -mer (grecescul pentru subunitate), precedat de numele subunității.[9]

1.2.2 peptidele

Peptidele (de la Gr. Πεπτός, "digerat", derivat din πέσσειν, "a digera") sunt prezente în mod natural în moleculele biologice. Acestea sunt lanțuri scurte de monomeri legate între ele prin întermediul legăturilor peptidice. Legăturile chimice covalente se formeaza atunci când gruparea carboxil a unui aminoacid se reacționează cu gruparea amino a altui. Cele mai scurte peptidele sunt dipeptide, care constă din 2 aminoacizi uniți printr-o singură legătură peptidică, urmată de tripeptide, tetrapeptide, etc. O polipeptidă este un lanț lung, continuu, și fără ramificați peptidice. Prin urmare, peptidele intră în clasele chimice generale ale oligomerilor și polimerilor biologicii, alături de acizi nucleici, oligozaharide și polizaharide, etc.

Peptidele se deosebesc de proteine ​​pe baza dimensiunii. Acestea au în componență aproximativ 50 sau mai puțini aminoacizi. [10] Proteine ​​cuprinde una sau mai multe polipeptide aranjate într-un mod biologic functional. În cele din urmă, în timp ce aspectele legate de tehnicile de laborator aplicate peptidelor față de polipeptide și proteine ​​diferă, limitele de mărime care disting peptidele de polipeptide și proteine ​​nu sunt absolute: peptide lungi, cum ar fi β-amiloid au fost denumite proteine ​​și proteine ​​mai mici, ca insulina au fost luate în considerare peptide.

Aminoacizii care au fost încorporate în peptide sunt denumite "resturi" din cauza eliberării fie a unui ion de hidrogen din capătul amină sau a unui ion hidroxil din capătul carboxil, sau ambele, rezultând eliberarea unei molecule de apă în timpul formării fiecărei legături amidice .[11] Toate peptidele cu excepția peptidelor ciclice au un rest N-terminal și C-terminal, la sfârșitul peptidei (așa cum se arată în tetrapeptida în imagine).

Figura 1.2.2.1 O tetrapeptidă ( exemplu Val – Gly – Ser – Ala ) in care cu

verde este marcat capătul amino ( L -valină ) și

albastru capătul carboxil ( L – alanină)[11]

CLASE DE PEPTIDE

Peptidele sunt împărțite în mai multe clase, în funcție de modul în care sunt produse:

Peptide lactice

Apar în mod natural două peptide lactice formate din cazeina proteine din lapte, atunci când enzimele digestive se rup; ele pot apărea, de asemenea din proteinaze formate de lactobacili în timpul fermentației laptelui. [12]

Peptide ribozomale

Peptidele ribozomale sunt sintetizate prin translația ARNm (ARN mesager). Ele sunt adesea supuse la proteoliză pentru a genera forma matură. Aceste funcții, de obicei în organismelor superioare, ca hormoni si molecule de semnalizare. Unele organisme produc peptide ca antibiotice, cum ar fi microcins. [13] Din moment ce ele vor fi convertite, resturile de aminoacizi împlicați sunt limitate la cele utilizate de către ribozomi.

Cu toate acestea, aceste peptide suferă frecvent modificări post translaționale, cum ar fi de fosforilare, hidroxilare, sulfonare, palmitoylation, glicozilarea și disulfură de formare. In general, acestea sunt liniare, deși s-au observat structuri LARIAT. [14] Se produc manipulări mai exotice, cum ar fi racemizării L-aminoacizi la D-aminoacizi în venin Platypus .[15]

Peptide Non-ribozomale

Peptide non-ribozomale sunt asambluri de enzime, care sunt specifice pentru fiecare peptidă. Cele mai frecvente peptida non-ribozomale sunt glutaminele, care sunt componente de apărare antioxidante ale majoritatea organismelor aerobe. [16] Alte peptide non-ribozomale sunt cele mai frecvente la organisme unicelulare, plante și fungi și sunt sintetizate prin enzime complexe modulare care portă denuumirea de peptide non-ribozomale sintetaze. [17]

Aceste complexe sunt adesea stabilite într-un mod similar, iar acestea pot conține mai multe module diferite pentru a efectua un set divers de manipulari chimice.18] Aceste peptide sunt adesea ciclice și pot avea structuri ciclice extrem de complexe, deși non-ribozomale liniare, peptidele sunt de asemenea comune. Deoarece sistemul este în strânsă legătură cu mașinile pentru construirea acizilor grași și polyketides, compuși hibrizi sunt adesea găsiți. Prezența de oxazoli sau tiazoli indică adesea că compusul a fost sintetizat în acest mod. [19]

Peptone

Peptonele sunt derivate din laptele animal sau carnea digerată prin proteoliză. [20] Pe lângă conținutul mic de peptide, rezultând materialul obținut prin pulverizare include grăsimi, metale, săruri, vitamine și mulți alți compuși biologici. Peptonele sunt utilizate în mediu nutritiv pentru bacterii și ciuperci în creștere. [21]

Fragmentele peptidice

Fragmentele peptidice se referă la fragmente de proteine care sunt utilizate pentru a identifica sau cuantifica proteina sursă. [22] De obicei, acestea sunt produse de degradare enzimatică efectuate în laborator pe o probă controlată, dar poate fi, de asemenea, probe criminalistice sau paleontologice care au fost degradate prin efectele fizice. [23] [24].

SINTEZA DE PEPTIDE

Figura 1.2.2.1 Sinteza peptidică în fază solidă pe o rășină amidică, folosind aminoacidul protejat Fmoc-α-amină.[25]

Rolul biologic al proteinelor și peptidelor

1.3.1 Sinteza proteinelor

ROL

Datorită compoziției, fiind formate exclusiv din aminoacizi se întâlnesc alături de alți compuși importanți de tipul polizaharidelor, lipidelor și acizilor nucleici începând cu structura virusurilor, a organismelor procariote, eucariote și terminînd cu omul. Practic nu se concepe viață fără proteine.

Meirion Jones, un jurnalist BBC bine-cunoscut, a raportat că mulți medici au confirmat acum că o sursă de aminoacizi (de asemenea, prin intermediul suplimentelor nutritive) poate avea efecte positive asupra corpului.

Jones și Erdmann explică schimbările în aviz medical în felul următor: "Din păcate, în lumea reală nenumărații factori înpiedică corpurile noastre de la primirea, aprovizionare completă și echilibrată cu substanțe importante nouă. Printre acești factori sunt poluarea cauzată de arderea combustibililor fosili, hormonii hrăniți la bovine, utilizarea intensivă a îngrășămintelor în agricultură și chiar obiceiurile cum ar fi fumatul ți băutul, toate acestea pot preveni corpurile noastre de a-și complete , folosind ceea ce mâncăm. Mai rău încă este cantitatea de nutriție, care se pierde din alimente, prin prelucrarea acestora cu diferite substanțe. Prin asigurarea organismului cu nutritie optima, aminoacizi ajuta pentru a înlocui ceea ce este pierdut și, în acest sens, să promoveze și vitalitate. "[26][27]

BIOSINTEZA

Biosinteza proteinelor este un proces prin care fiecare celulă își sintetizează proteinele proprii, prin intermediul unui proces care include multe etape, sinteza începe cu procesul de transcripție și se termină cu procesul de translație. Procese deși similare, diferă în funcție de celulă: eucariotă sau procariotă.[6]

TRANSCRIPȚIA

Procesul de transcripție necesită prezența unei singure molecule de ADN dublu catenar, numit ADN „șablon”, moleculă care intră în procesul de „inițiere”. Aici acționează enzima polimerază, enzimă care se leagă de o anumită regiune din molecula de ADN, regiune (denumită promoter), de unde va începe transcripția. Pe măsură ce ARN polimeraza se leagă de promoter, lanțurile de ADN vor începe sa se desfacă. Următorul proces în care intră ADN este procesul de elongație (alungire a catenei). Pe măsură ce ARN polimerază se mișcă de-a lungul catenei de ADN, are loc sinteza ribonucleotidelor complementare (ARNm).[26] Acest ARN, după cum îi arată și numele, se poate deplasa și în alte părți ale celulei cum ar fi reticulul endoplasmatic sau citoplasmatic.

Figura 1.3.1.1 Gruparea 5' se găsește în capătul 5' final al moleculei de ARNm, și este format din guanosină grefată printr-o legătură de tip 5'- 5' de molecula de ARN prin intermediul unei legături trifosfat.[6]

Are loc adiția unei grupări 5', grupare dinucleotidică care are rolul de a asigura stabilitatea ARN și de a-l transforma în ARN matur. O secvență de aminoacizi este grefată în poziția 3' terminală pentru protecție dar și pentru a sluji drept șablon pentru procesele următoare.Mai departe are loc formarea ARN, care este apoi utilizat în ribozomi pentru sinteza proteinelor. La procariote legarea ARN de ribosomi are loc după ce acesta este îndepărtat de nucleoid; în contrast la procariote acest proces are loc chiar în membrana nucleară și apoi translocat în citoplasmă. Rata sintezei proteică poate ajunge la circa 20 aminoacizi la procariote, mult mai puțin la eucariote.[27]

TRANSLAȚIA

În timpul translației ARNm transcris din ADN este decodat de ribozomi pentru sinteza proteinelor.Acest proces este divizat în 3 etape:

Inițierea

Elongarea

Fază terminală.

Ribozomul este cel care permite legare moleculei de ARNt (ARN de transfer), la molecula de ARn m, proces însoțit de prezența unui anticodon. Pe măsură ce ribozomul migrează de-a lungul moleculei de ARNm (un codon o dată) o altă moleculă de ARNt este atașată ARNm. Are loc eliberarea ARNt primar, iar aminoacidul care este atașat de acesta este legat de ARNt secundar, care îl leagă de o altă moleculă de aminoacid. Translația continuă pe măsură ce lanțul de aminoacid este format. La un moment dat apare un codon de stop, o secvență formată din 3 nucleotide (UAG, UAA), care semnalează sfîrșitul lanțului proteic. Chiar după termminarea translației lanțurile proteice pot suferi modificări post-translaționale și plierea lanțului proteic, responsabilă de structura secundară și cea terțiară. Modificările post-translaționale se referă la posibilitatea formării de legături disulfidice, sau de atașarea la scheletul proteic a diferite grupări ca rol biochimic: acetat, fosfat etc.[26]

SINTEZA CHIMICĂ

Procesul de sinteză chimică poate avea loc în laborator, dar pentru lanțuri mici de proteine. O serie de reacții chimice cunoscute sub denumirea de sinteza peptidelor, permit producerea de cantități mari de proteine. Prin sinteza chimică se permite introducerea în lanțul proteic a aminoacizilor ne-naturali, atașarea de exemplu a unor grupări fluorescente. Metodele sunt utilizate în biochimie și în biologia celulei. Sinteza are la bază cuplarea grupării carboxil -COOH cu gruparea -amino -NH2 (segmentul N terminus). Se cunosc 2 metode de sinteză pe cale chimică:[6]

Sinteza în fază lichidă, metoda clasică, care a fost înlocuită cu sinteza în fază solidă.

Sinteza în fază solidă (Solid-phase peptide synthesis SPPS), a cărei baze a fost pusă de Robert Bruce Merrifield. Prin aceată metodă, se pot sintetiza proteine D, cu aminoacizi D. În prima fază Merrifield a folosit metoda tBoc (terț-butil-oxi-carbonil). Pentru înlăturarea acestuia din lanțul peptidic se folosește acidul fluorhidric (HF), care este foarte nociv, iar din acest motiv, metoda nu a mai fost utilizează. Atunci când este vorba de sinteza analogilor peptidici non-naturali de tip bază (depsi-peptidele) este necesară o altă metodă cea introdusă de R.C. Sheppard în anul 1971, și are la bază folosirea Fmoc (fluorenil metoxi carbonil), iar pentru înepărtarea acesteia se folosește de obicei mediu bazic asigurat de o soluție de circa 20% piperidină DMF (dimetil formamidă). Îndepărtarea grupării din lanțul proteic se face prin incubare în acid trifluoracetic (TFA).

Această grupă de protejare cu simetrie ortogonală se folosește în multe sinteze chimice.

Protejarea grupării prin intermediul Fmoc este de obicei lentă, deoarece anionul nitro produs la sfîrșitul reacției nu este un produs tocmai favorabil bunei desfășurării a reacției.[9]

Figura 1.3.1.2 Gruparea de protejare cu simetrie ortogonală.[9]

NUTRIȚIA

Majoritatea microorganismelor și plantelor pot sintetiza toți cei 20 aminoacizi standard, în timp ce organismele animale obțin anumiți aminoacizi din dietă (aminoacizii esențiali). Enzime cheie, cum ar fi de exemplu aspartat kinaza, enzimă care catalizează prima etapă în sinteza aminoacizilor lisină, metionină și treonină din acidul aspartic, nu sunt prezente în organismele de tip animal.[6] La aceste organisme aminoacizii se obțin prin consumul hranei conținînd proteine. Proteinele ingerate sunt supuse acțiunii acidului clorhidric din stomac și acțiunii enzimelor numite proteaze, proces în urma căruia lanțurile proteice sunt scindate (denaturate). Ingestia aminoacizilor esențiali este foarte importantă pentru sănătatea organismului, deoarece fără acești aminoacizi nu se poate desfășura sinteza proteinelor necesare organismului. De asemenea, aminoacizii sunt o sursă importantă de azot; unii aminoacizi nu sunt utilizați direct în sinteza proteică, ci sunt introduși în procesul de gluconeogeneză, proces prin care organismul asigură necesarul de glucoză în perioadele de înfometare (mai ales proteienele aflate în mușchi).[26]

TIPURI DE PROTEINE

În funcție de compoziția lor chimică ele pot fi clasificate în:

Holoproteine cu următoarele clase de proteine

Proteine globulare (sferoproteine) sunt de regulă substanțe solubile în apă sau în soluții saline: protaminele, histonele, prolaminele, gluteinele, globulinele, albuminele.

Proteinele fibrilare (scleroproteinele) caracteristice regnului animal, cu rol de susținere, protecție și rezistență mecanică: colagenul, cheratina și elastina.[27]

Heteroproteinele sunt proteine complexe care sunt constituite din o parte proteică și o parte prostetică; în funcție de această grupare se pot clasifica astfel:

Glicoproteine

Lipoproteine

Nucleoproteine

1.3.2 peptidele în biologia medicală

Peptidele au primit importanță în biologia moleculară din mai multe motive. Primul este acela că peptidele permit crearea de anticorpi peptidici la animale fără a fi nevoie de purificarea proteinei de interes. [29] Aceasta implică sintetizarea peptidelor antigenice ale secțiunilor de interes.

Un alt motiv este faptul că peptidele au devenit esential în spectrometrie de masa, care să permită identificarea proteinelor de interes, bazate pe mase de peptide și succesiunea lor.

Peptidele au fost recent folosite în studiul structurii si funcței de proteinei. De exemplu, peptidele sintetice pot fi folosite ca probe pentru a vedea interacțiunea proteină-peptidă.

Peptide inhibitorii sunt de asemenea folosite în cercetarea clinică pentru a examina efectele peptidelor asupra inhibarea proteinelor cancerului și a altor boli. [30] De exemplu, una dintre cele mai promițătoare sunt peptidele care țintesc LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone).[31] Aceste peptide particulare acționează ca un agonist, în sensul că acestea se leagă de o celulă într-un mod care reglează receptorii LHRH. Procesul de inhibare al receptorii celulari sugerează că peptidele ar putea fi benefice în tratarea cancerului de prostată. Cu toate acestea, sunt necesare investigații și experimente suplimentare înainte de lupta împotriva cancerului, expunerea la tratamente pe baza de peptide, pot fi considerate definitive. [32]

FAMILII DE PEPTIDE BINE-CUNOSCUTE

Familiile peptidelor din această secțiune sunt peptide ribozomale, de obicei, cu activitate hormonală. Toate aceste peptide sunt sintetizate de celule ca "pro-peptide" sau "pro-proteine" și trunchiate înainte de a ieși celula. Ele sunt eliberate în sange, unde își îndeplinesc funcțiile de semnalizare.

Peptide tahikinice

Substanța P

Kassinină

Neurokinina A

Eledoisină

Neurokinina B

Peptide intestinale vasoactive

VIP (Vasoactive Intestinal Peptide; PHM27)

PACAP Pituitary Adenylate Cyclase Activating Peptide

Peptide PHI 27 (Peptide Histidine Isoleucine 27)

GHRH 1-24 (Growth Hormone Releasing Hormone 1-24)

Glucagonul

Secretin

Peptide legate de polipeptide pancreatice

NPY (NeuroPeptide Y)

PYY (Peptide YY)

APP (Avian Pancreatic Polypeptide)

PPY (Pancreatic PolYpeptide)

Peptide opioide

Proopiomelanocortinei (POMC) peptide

Pentapeptidă encefalină

Peptidă prodynorphină

Peptide calcitonice

Calcitonina

Amilin

AGG01

Alte peptide

B-tip natriuretic Peptide (BNP) – produs în miocard si utile in diagnostic medical

Lactotripeptidelor – lactotripeptidelor ar putea reduce tensiunea arterială [33][34][35][36]

2. Metode fizice moderne de analiză a peptidelor și proteinelor

2.1 Cristalografia cu raze X

Cristalografia cu raze X este o metodă de determinare a aranjamentului atomilor într-un cristal, care poate fi și o moleculă biologică – proteină, ribozom ori acid nucleic. Laureații din acest an ai Premiului Nobel pentru Chimie au descifrat structura ribozomului folosind această tehnică.[36]

Prin cristalografia cu raze X se determină aranjamentul atomilor dintr-o structură cristalină. În esență avem de-a face cu un fascicul de raze X care lovește cristalul studiat, iar pe baza unghiurilor de difracție și a intensităților razelor împrăștiate se obține o imagine tridimensională a densității electronilor din interiorul cristalului. Pe baza valorilor asociate acestei densități de electroni pot fi determinate pozițiile atomilor în cristal, precum și legăturile chimice dintre aceștia.

Deoarece multe materiale pot forma în anumite condiții structuri cristaline (de pildă sărurile, metalele, minereurile, semiconductorii), asemenea multor molecule anorganice, organice și biologice, cristalografia cu raze X s-a dovedit o tehnică utilă în mai mai multe domenii.[37]

2.1.1 SCURT ISTORIC

La începuturile sale ca metodă de cercetare științifică, cristalografia cu raze X a fost folosită pentru determinarea dimensiunii atomilor, lungimii și tipurilor legăturilor chimice ori a diferențelor la scară atomică între diferite materiale, în mod special minereuri și aliaje. Metoda a fost folosită și pentru descifrarea structurii și modului de funcționare a multor molecule biologice, inclusiv vitaminele, proteinele și alte macromolecule biologice. [37]
Istoria cristalografiei cu raze X începe odată cu cercetările privind difracția razelor X pe cristale efectuate de savantul neamț Max von Laue, laureat al Premiului Nobel pentru Fizică în anul 1912 pentru descoperirea acestui fenomen. Studiile lui von Laue s-au orientat către lămurirea unor aspecte legate de proprietățile radiațiilor electromagnetice, astfel că a fost nevoie de intervenția lui William Lawrence Bragg care, după ce în 1912 a luat contact cu munca de pionierat a lui Max von Laue, a reușit în 1914 alături de tatăl său, William Henry Bragg, descifrarea structurii sării geme.[36] Au urmat diamantul, pirita și spinelul.

Prima structură a unui compus organic, hexametilentetramina, o substanță chimică folosită ca antiseptic în infecțiile renale și intestinale și în industria rășinilor sintetice și cunoscută mai ales sub denumirea de urotropină, a fost descifrată în anul 1923. Cercetarea s-a mutat și în zona moleculelor biologice o dată cu realizările lui Dorothy Hodgkin, care a descoperit structura colesterolului (1937), pe cea a vitaminei B12 (1945) și pe cea a penicilinei (1954), primind Premiul Nobel pentru Chimie în 1964. În 1969, a reușit după o muncă de 30 de ani să descifreze și structura insulinei.[5][37]

Figura 2.1.1.1 Structura tridimensională a penicilinei, pentru care
Dorothy Hodgkin a primit în 1964 Premiul Nobel pentru Chimie.[36]

Structurile macromoleculelor biologice ale proteinelor, unele neregulate și de sute de ori mai mari decât colesterolul, au reprezentat următorul obiectiv. La finele anilor '50, în 1958, un model tridimensional al mioglobinei era pus la punct de către Max Perutz și Sir John Cowdery Kendrew, iar în 1959 Max Perutz determina structura moleculară a hemoglobinei, după 22 de ani de cercetări. În 1962, Max Perutz și Sir J.C. Kendrew primeau Premiul Nobel pentru Chimie.

CRISTALOGRAFIA CU RAZE X ȘI PREMIUL NOBEL PENTRU CHIMIE 2009

De asemenea, cei trei laureați ai Premiului Nobel pentru Chimie din acest an, Ada E. Yonath, Venkatraman Ramakrishna și Thomas A. Steit, premiați pentru descifrarea structurii și funcționării ribozomului, "fabrica de proteine" a fiecărei celule, nu ar fi reușit în cercetările lor fără a folosi tehnica cristalografiei cu raze X.
În prezent, cercetătorii creează fascicule foarte intense de raze X folosind acceleratoare de particule numite sincrotroane – tuneluri circulare de-a lungul cărora electronii sunt accelerați până la viteze apropiate de viteza luminii. Când radiația X ia contact cu structura cristalină studiată, undele electromagnetice sunt împrăștiate în diferite direcții în urma fenomenului de difracție, generând milioane de "puncte" la nivelul unui senzor digital de imagine de tip CCD. În trecut, așa cum se poate vedea și în clipul prezentat anterior, acest lucru se realiza folosind un film fotografic care se înnegrea sub acțiunea razelor X. Prin analiza tiparului de difracție oamenii de știință pot determina poziția fiecărui atom din componența cristalului studiat. În final, programe software specializate sunt utilizate pentru a genera o imagine a structurii studiate (de pildă, imaginea de mai jos este cea a ribozomului).

Figura 2.1.1.2 Imaginea ribozomului obținută prin tehnici moderne de cristalografie cu raze X[37]

Una dintre provocările majore pe care cristalografii le au de înfruntat o reprezintă obținerea unor cristale aproape perfecte, cu un grad foarte mare de puritate, în care moleculele să fie dispuse în mod organizat și repetitiv. Obținerea unor structuri cristaline de calitate din proteine este o sarcină foarte dificilă, mai ales în cazul proteinelor cu o structură foarte complexă. În cazul ribozomilor, structuri complicate formate din proteine și molecule de ARN, obținerea cristalului s-a dovedit atât de dificilă, încât realizarea sa cu succes a atras după sine, ulterior descifrării aranjamentului atomic al ribozomului, chiar acordarea Premiului Nobel.[36][37]

2.2 imagistica prin rezonanță magnetică-rmn

Rezonanța magnetică este o metodă de cercetare care se ocupă cu studiul interacție momentelor magnetice nucleare și electronice cu câmpuri electrice și magnetice și cu tranzițiile care au loc între nivelele de energie rezultate din aceste interacții.[38]

RMN-ul este una dintre cele mai moderne tehnici imagistice folosite în prezent în spitale. Este o tehnică neinvazivă și neiradiantă, cu ajutorul căreia se pot obține imagini de rezoluție și claritate superioare ale interiorului organismului uman.

Rezonanța magnetică nucleară, titulatură înlocuită în ultimii ani cu cea de imagistică prin rezonanță magnetică, din cauza conotației negative a cuvântului "nuclear" (procedura nu implică folosirea de substanțe radioactive), este o procedură de a obține imagini ale diferitelor părți ale organismului fără utilizarea razelor X, așa cum se întâmplă în cazul radiografiei tradiționale și a tomografiei computerizate. Un scaner RMN constă, în mare, dintr-un magnet de mari dimensiuni în interiorul căruia este așezat pacientul. O antenă radio este folosită pentru a transmite semnale spre organism, dar și pentru a recepționa ceea ce se întoarce dinspre corpul pacientului. Aceste semnale recepționate sunt transformate în imagini de către un calculator atașat scanerului. Pot fi obținute imagini din aproape orice zonă a organismului, sub orice unghi. Semnalele radio folosite sunt, în fapt, câmpuri magnetice variabile mult mai slabe decât câmpul static foarte puternic generat de magnetul scanerului.[39]

2.2.1 CUM FUNCȚIONEAZĂ RMN

Imagistica prin rezonanță magnetică (mai cunoscută sub numele de RMN – rezonanța magnetică nucleară) este una dintre cele mai noi tehnologii imagistice disponibile în spitale pentru diagnoză. RMN-ul reprezintă o tehnică tomografică (în sensul că sunt analizate secțiuni ale corpului uman) care are la bază fenomenul rezonanței magnetice nucleare. Din punct de vedere tehnic vorbim despre o tehnică destul de complexă, dar a cărei prezentare pe înțelesul tuturor este posibilă, totuși, într-o oarecare măsură.[39]

Nu sunt folosite raze X, așa cum este cazul cu radiografia tradițională ori cu tomografia computerizată, în acest caz pacientul fiind plasat în interiorul unui câmp magnetic foarte puternic (în jur de 30000 de ori mai puternic decât câmpul magnetic al Pământului). Nucleele atomilor de hidrogen sunt caracterizate de o proprietate specială cunoscută sub numele de spin.[40] Asta înseamnă că anumite proprietăți ale protonilor sunt similare celor ale unor minusculi magneți bară, care într-un câmp magnetic static au doar două orientări posibile; fie aliniate, fie opuse câmpului magnetic (a se vedea figurile de mai jos). Sunt mai numeroși protonii care se aliniază cu câmpul magnetic, deoarece pentru acest lucru este nevoie de o cantitate mai mică de energie. Astfel că, în interiorul corpului pacientului, magnetizarea netă la nivelul țesuturilor este caracterizată de o aliniere paralelă cu câmpul magnetic aplicat.

Protoni orientați aleatoriu

Alinierea protonilor în prezența câmpului magnetic

Figura 2.2.1.1 Alinierea protonilor în camp.[40]

Depășirea acestei stări a protonilor poate fi realizată prin aplicarea unui câmp electromagnetic în spectrul radio, în mod obișnuit în regiunea 20 la 100 de MHz în cazul celor mai multe scanere RMN. Frecvența necesară, cunoscută sub numele de frecvență de rezonanță ori frecvență Larmor, variază liniar cu intensitatea câmpului magnetic static aplicat. Câmpul electromagnetic este aplicat sub forma unui foarte scurt puls radio, cu o durată de câteva microsecunde. Semnalul detectat de scaner reprezintă componenta vectorului câmpului magnetic net rezultat la nivelul diferitelor țesuturi perpendiculară pe câmpul magnetic aplicat.

Semnalele sunt detectate folosind dispozitive speciale (un soi de bobine, ori antene), de anumite forme, de pildă pentru cap, genunchi, etc.[38] Faptul că aceste dispozitive pot fi montate în imediata vecinătate a zonei investigate contribuie la calitatea imaginilor obținute.

Principalele diferențe dintre tomografia computerizată și RMN sunt următoarele: RMN-ul poate fi folosit pentru a obține imagini prin secțiuni ale organismului orientate în orice direcție, spre deosebire de tomografia computerizată, în cazul căreia secțiunile erau doar transversale. Cu RMN-ul se pot produce și secțiuni sagitale (plan vertical de simetrie), ori secțiuni orientate în orice plan. Contrastul imaginilor obținute cu un scaner RMN poate fi modificat, obținându-se așa-numitele imagini ponderate în funcție de timpii de relaxare T1 (timp de relaxare spin-spin) și T2 (timp de relaxare spin-rețea) sau în funcție de densitatea protonilor. În cazul tomografiei computerizate contratul este fix, depinzând de coeficientul de atenuare al țesuturilor.

Câteva detalii despre acești coeficienți de ponderare a contrastului. Odată pulsul de radiofrecvență aplicat și magnetizarea netă definitivă, este nevoie de anumiți timpi până când protonii revin la pozițiile originale, timpi guvernați de constantele T1 și T2, care diferă de la un tip de țesut la altul. Imaginile obținute prin rezonanță magnetică iau naștere folosind o serie de pulsuri de radiofrecvență atent calibrate. Prin modificarea acestor secvențe la care sunt emise pulsurile se pot evidenția diferențele în funcție de T1 ori T2. Este de asemeni posibilă setarea intervalului între pulsuri astfel încât contrastul să nu depindă de T1 și T2 ci doar de densitatea de protoni a zonei investigate. Imaginile ponderate în funcție de T1 înfățișează țesuturile caracterizate de o valoare mai mare a lui T1 (de pildă apa) cu nuanțe întunecate. În cazul imaginilor ponderate în funcție de T2, țesuturile caracterizate de o valoare mare a lui T2 apar mai strălucitoare. Această caracteristică poate fi folosită pentru a depista țesuturi afectate de anumite maladii. Iată mai jos două secțiuni la nivelul capului obținute cu tehnologie RMN, una axială – ponderată T2, care prezintă un creier normal, și una sagitală, ponderată T1, a unui cap de copil.

RMN – secțiune axială ponderată T2 la nivelul creierului

RMN – secțiune sagitală ponderată T1 a capului unui copil

Figura 2.2.1.2 Imaginii obținute la nivelul capului prin intermediul celor 2 secțiuni.[32]

AVANTAJE ȘI DEZAVANTAJE

RMN-ul nu este o procedură 100% sigură, deși nu implică utilizarea de radiație ionizantă. Câmpurile magnetice puternice și pulsurile de radiofrecvență pot afecta buna funcționare a pacemaker-elor sau pot încălzi anumite implanturi metalice. Un alt pericol major constă în așa-numitul "efect proiectil". Materialele feromagnetice sunt supuse unor forțe puternice în interiorul câmpului magnetic static, astfel că obiecte precum legăturile de chei pot deveni arme mortale. Puterea câmpului magnetic și a radiației electromagnetice sunt mult sub nivelurile dăunătoare. Totuși, ca o precauție, în mod normal nu se efectuează scanări RMN pe perioada sarcinii.

Ca o concluzie, avantajele imagisticii prin rezonanță magnetică sunt o rezoluție spațială excelentă a imaginilor, o diferențiere excelentă între diferitele tipuri de țesuturi (de pildă, materia cenușie poate fi deosebită de materia albă la nivelul creierului), absența radiației ionizante, posibilitatea de a obține imagini de-a lungul unor secțiuni orientate în orice plan. Printre dezavantaje se numără costul ridicat al echipamentelor și cel aferent întreținerii acestora, viteza mică de desfășurare a procedurilor de scanare, dar și faptul că anumite categorii de pacienți (de exemplu cei care au montat un pacemaker) nu sunt eligibili pentru acest tip de investigație.[32]

2.3 SPECTROMETRIA DE MASĂ

Spectrometria de masă (MS) este o metodă ce permite obținerea ionilor moleculari în fază gazoasă, separarea acestora în funcție de raportul dintre masă și sarcină (m/z) precum și înregistrarea lor.

Obținerea, separarea și înregistrarea ionilor se realizează cu aparate numite spectrometre de masă, iar în urma înregistrării rezultatelor se obține un spectru de masă.

Sursa de ioni are rolul de a transforma moleculele neutre ale probei de analizat în ioni moleculari:

în cazul în care se formează ioni pozitivi care vor fi accelerați, spectrometrul de masă operează în modul ionilor pozitivi

în cazul în care se vor forma și accelera ioni negativi, spectrometrul de masă operează în modul ionilor negative.

Ionii în fază gazoasă formați în sursă sunt separați în analizator sub acțiunea unor câmpuri electrice/magnetice în funcție de raportul m/z și vor da naștere unui curent de ioni proporțional cu numărul moleculelor neutre care au fost ionizate. Valoarea curentului ionic este extrem de mică (de ordinul 10-9 – 10-15 A) și de aceea el trebuie amplificat. Acest lucru este realizat de către detector care are rolul de a amplifica și înregistra curenții ionici formați în ordinea creșterii valorii m/z. Ca și detectori în spectrometrele de masă se utilizează: multiplicatorul de electroni (utilizat pentru analizoarele quadrupolare și cu capcană ionică), fotomultiplicatorul cu dinode (pentru analizoarele quadrupolare) și placa microcanal (pentru analizoarele TOF).

Rezultatul este trimis la înregistrator care înregistrează spectrul probei fie pe o placă fotografică (spectrografe) fie direct pe hârtie (spectrometre).

Spectrul de masă (MS) prezintă dependența intensităților ionilor formați ca urmare a procesului de ionizare de valoarea raportului m/z. În reprezentarea grafică a spectrelor de masă, semnalele perpendiculare pe abscisă din formele grafice se numesc picuri. Într-un spectru grafic se disting 2 tipuri de picuri importante :

a) picul de bază – semnalul ce corespunde celui mai abundent ion

b) picul molecular – semnalul ionului molecular (radicalul cationic sau anionic al moleculei intacte) ce are masa moleculară egală cu cea a substanței (de multe ori acesta lipsește din spectru, atunci când ionul molecular este extrem de instabil și se fragmentează ușor).

Picurile ce însoțesc picul molecular și diferă printr-o unitate (datorită compoziției izotopice a elementelor se numec picuri izotopice.

2.3.1 IONIZAREA PRIN ELECTROPULVERIZARE (ESI)

Ionizarea prin electrospray a fost demonstrată ca și tehnică de ionizare în spectrometria de masă în 1984 de către Yamashita și Fenn [33], tehnică pentru care Fenn a obținut Premiul Nobel în Chimie în 2002.

ESI este o tehnică ușoară de ionizare (produce o fragmentare slabă în sursă în condiții normale de funcționare), utilizată pentru analiza moleculelor nevolatile, polare, ionice/neionice: compuși organici (carbohidrați, peptide, proteine, oligonucleotide, medicamente) și anorganici, complecși anorganici, etc., dizolvate într-un solvent corespunzător.

În această tehnică ionii moleculelor greu volatile se obțin prin electropulverizare, fenomen ce are loc la capătul unui tub capilar metalic prin care este infuzată soluția probei de analizat (proba este dizolvată într-un solvent polar) în imediata vecinătate a contraelectrodului (între vârful capilarului și contraelectrod există o distanță de 1-3 cm). Între capilar și contraelectrod se aplică o diferență de potențial de 3-4 kV. La vârful capilarului se acumulează picături încărcate electric ale soluției analitului care formează așa-numitul con Taylor. Pe măsură ce diferența de potențial dintre capilar și contraelectrod crește, picătura multiplu încărcată de la vârful capilarului se alungește în direcția contraelectrodului și după desprindere de capilar (când forța coulombiană de repulsie dintre ioni și suprafața capilarului de aceeași polaritate depășește forța de tensiune superficială a lichidului), traiectoria devine aproape orizontală în direcția contraelectrodului.

Figura 2.3.1 Schema de funcționare a sursei cu electrospray (ESI)[33]

Figura 2.3.2 Formarea conului Taylor la capătul capilarului metalic al sursei cu electrospray. Producerea exploziei Coulombiene când este depășită limita Rayleigh[33]

Când sursa funcționează în mod ion pozitiv, ionii pozitivi vor fi dirijați spre vârful capilarului, în timp ce ionii negativi se vor îndepărta de acesta. În modul ion negativ, capilarului i se aplică un potențial negativ iar spre vârful acestuia se vor îndrepta ionii negativi, în timp ce ionii pozitivi se vor deplasa în sens contrar. Datorită fluxului coaxial al N2 (gaz de pulverizare) și câmpului electric puternic se formează un aerosol fin de “picături” încărcate electric ale soluției analitului (Fig. 26). Pe măsură ce particulele sunt accelerate față de vârful capilarului, solventul se evaporă până când, la un anumit moment, concentrația sarcinilor este așa de mare încât forța coulombiană de repulsie electrostatică depășește forța de tensiune superficială a picăturii (este depășită limita de stabilitate Rayleigh), având drept rezultat dispersia picăturii într-un spray de picături mai mici, fenomen denumit explozie Coulombiană. Aceste picături continuă să se evapore și se vor dispersa în sprayuri și mai fine, iar când solventul s-a evaporat complet se obțin macroioni ai analitului care vor fi direcționați spre analizorul de masă.[33]

3. REZULTATE EXPERIMENTALE PROPRI ȘI DISCUȚII

În partea experimentală a acestei lucrări am analizat și optimizat spectometria de masă cu ionizare prin electosprey și analizorii quadro polari hibrid cu timp de zbor (Q-TOF quadrupole time-of-flight ) pentru analiza aminaoacizilor peptidelor si proteinelor. În acest scop am utilizat o peptidă standard relativ mare ea este formata din 15 animoacizi, care a fost comercializată de la firma Sigma. Aceasta are un grad mare de puritate, ne mai fiind necesare alte metode de puritate, întrucât produsela comercial disponibile de la această firmă prezinta puritate de 90-99%.

Scopul analizei prin spectrometrie de masă și optimizării metodei pentru analica peptidelor, proba a fost dizolvată în metanol pur la o concentratie de aproximativ 10 pmol/µL calculată penrtu o masă moleculară de 1600 g/mol. Pentru analiza peptidei s-a folosit tehnica de detecție a ionilor pozitivi întrucât toate peptidele se ionizează mult mai bine în tehnica ionilor pozitivi, adică în soluție formează ioni pozitivi.

Spectul de masă a fost înregistrat pe un domeniu de masa de la 200-1600 m/z. Funcțiile experimentale pentru obținerea acestui spectru sunt prezentate în legenda figurii. În scopul analizei proba a fost încarcată într-un capilar de siliciu, confecționat în laborator cu ajutorul unui tragator vertical de capilare și în capilar a fost introdus un fir de oțel inoxidabil aparținând surdei de ioni cu electrospray. Firul de oțel inoxidabil este conectat la sursa de elecrtospray care la rândul ei este conctată la înaltă tensiune. Pentru a iniția procesul de electrospray s-au aplicat 1350 de V pe firul de oțel inoxidabil, deci inplicit pe capilarul electro pulverizator și în soluție, iar pentru a se determina elecro pulverizarea a fost menținuta o tensiune de 50 de V.

Specreul a fost generat imediat dupa aplicarea acestei valorii și el este presentat în figura 3.1. Acest spectru a fost obtinut prin acumularea de semnal timp de 10 minute. Din analiza acestui spectru se poate observa apariția picului corespunzători peptidei la masa de 1611 ceea ce înseamnă că este vorba de o peptidă protonată și de mai pot observa cateva semnale la masa 1082, 1059, 530 și 340. Aceste sunt cele mai intense semnale din specru și ele corespund unor fragmentări în sursă ale peptidei inițiale. Din analiza acestui spectru s-a putut observa și aceste fragmentări în sursă pe care noi am încercat să le eliminăm pe cât posibil astfel încat să se poată obține specrul de masă, în special picurile corespunzătoare peptidei și nu cele ale fragmentelor generate prin ruperea în sursă. În acest scop s-a reluat experimentul pentru a optimiza condițile de analiză.

Figura 3.1 Spectrul de screening nanoESI QTOF MS în tehnica de detecție a ionilor pozitivi pentru peptida standard conținand 15 aminoacizi, achiziționată de la firma Sigma. Intervalul m/z (200-1600). Condiții experimentale: tensiune nanoESI 1350 V; tensiune contraelectrod: 50 V. Solvent: metanol; concentrația probei 10 pmol/μL. Timpul achiziție 10 min.

Rezultatul acestor optimizării este prezentat în figura 3.2 care reprezintă spectrul pentru aceeași peptidă standard care conține cei 15 aminoacizi de la firma Sigma, dar in cadrul unor condiții experimentale de tensiune 1100 de V și o tensiune de contra electrod de 30 de V. Aceasta determina o valoare mai redusă a câmpului electric dintre capilar si contra electrod și în consecință se observă o reducere a fragmentărilor în sursă. Se poate observa o scadere a intensități semnalului corespunzător masei m/z 1082 și o creștere a semnalului aferent peptidei intacte. După aceste optimizării s-a trecut la o analiză structurală detaliată prin fragmentarea ionului precursor de la masa m/z 552 cu ajutorul tehnici nano-electrospray.

Figura 3.2 Spectrul de screening nanoESI QTOF MS în tehnica de detecție a ionilor pozitivi pentru peptida standard conținând 15 aminoacizi, achiziționată de la firma Sigma. Intervalul m/z (200-1600). Condiții experimentale: tensiune nanoESI 1100 V; tensiune contraelectrod: 30 V. Solvent: metanol; concentrație proba 10 pmol/μL. Timp achiziție semnal 10 min.

Pentru a realiza o analiză structurală detaliată ionul detectat la 552 a fost izolat într-o fereastra de izolare de aproximativ 2 daltoni și supus disocierilor prin ciocnire, în acest sens ionul a fost accelerat până a dobândit energia de ciocnire de 30 eV dirijat în spre celula de ciocnire unde a fost supus coliziunilor cu un gaz inert, în cazul nostru gazul inert a fost argonul. Semnalele obținute reprezintă, semnalele aferente ionilor fragment rezultați din urma ciognirilor cu atomi moleculelor de gaz inert (Figura 3.3)

.

Figura 3.3 Spectrul de fragmentare nanoESI QTOF MS/MS în tehnica disocierilor induse prin ciocnire (CID) pentru ionul precursor de la m/z 552 detectat în spectrul de screening. Intervalul m/z (100-560). Condiții experimentale: tensiune nanoESI 1500 V; tensiune contraelectrod: 70 V. Solvent: metanol; concentrație proba 10 pmol/μL. Timp achiziție semnal 10 min. Energie de ciocnire 30 eV.

De asemenea un al doilea experiment de fragmentare a vizat ionul precursor 312,66, care de asemenea a fost accelerat sub o tensiune de accelerare care ia indus o energie de 30 eV, supus disocierilor induse prin ciocnirea cu atomi de gaz inert în camera de ciocnire (Figura 3.4).

Figura 3.4 Spectrul de fragmentare nanoESI QTOF MS/MS în tehnica CID pentru ionul precursor de la m/z 312 detectat in spectrul de screening. Intervalul m/z (80-320). Condiții experimentale: tensiune nanoESI 1500 V; tensiune contraelectrod: 70 V. Sol vent: metanol; concentrație proba 10 pmol/μL. Timp achiziție semnal 10 min. Energie de ciocnire 30 eV.

Ambele spectre de fragmentare continand semnalele afernte ionilor precursori 552 și respectiv 312,66 au condus la identificarea structurii peptidei. Structura peptidei este prezentată în figura 3.5, unde Tyr- Tirozină, Ala- Alanină, Glu- Acid Glutamic, Gly- Glicină, Asp- Asparagină, Val- Valină, His- Histidină, Thr- Treonină, Ser- Serină, Lys- Lizină, Pro- Prolinnă, Arg- Arginină, aceștia sunt aminoacizii care constituie peptida pe care noi am analizat-o. De remarcat este faptul că timpul de achiziție a fost de 10 minute în cazul spectrelor de fragmentare, dar și în cazul spectrlor de screening (de identificare a peptidei și a masei acesteia).

Figura 3.5 Structura peptidei și compoziția în aminoacizi împreuna cu masele aferente aminoacizilor constituenți determinate prin masuratorile de spectrometrie de masa.

Toate acestea arată că metoda este extreme de rapidă, în doar 10 minute se poate obține un spectru complet, având în vedere că debitul de electrospray este de 250 de nL/min, înseamnă că cantitatea de probă consumată este foarte mică mai exact de câțiva µL. Tote acestea dovedesc că metoda este extreme de sensibilă cu un consum de probă foarte scăzut și cu o acuratete de determinare a masei și analizei structural foarte ridicată.

4. CONCLUZII

În cadrul acestei lucari de licență am dezvoltat și optimizat o metodă bazată pe spectometrie de masă de înaltă rezoluție și acuratețe în determinarea masei în tehnica ionilor pozzitivi bazată pe ionizare prin elctro pulverizare. Acestă metodă de spectrometrie de masă a fost aplicată pentru analiza unei peptide complexe formată din 15 aminoacizi de puritate ridicată obținută de la firma Sigma. Analiza compozițională și structurală a demonstrat că prin intermediul acestei metode se pot identifica compuși de tip peptidă cu o acuratețe foarte ridicată în determinarea masei, cu o precizie și o rezoluție foarte mare.

De asemenea, reproductibilitatea experimentelor a fost de 100%, mai exact pentru mai multe experimente efectuate în aceeași zi am putut obține spectre identice. Reproductibilitatea de la o zi la alta a fost situată la un procentaj de 98%, iar de la o probă la alta de 95%. Gradul de sinsibilitate fiind foarte ridicat, face ca această metodă să fie foarte protrivită pentru analize medicale pentru care sunt disponibile doar cantitați mici de probă.

În final, aceste rezultate experimentale ne îndreptățesc să continuăm acest studiu și să-l aprofundăm pentru peptide și mai lungii de ordinul a câtorva zeci de aminoacizi și să putem optimiza în continuare pentru analiza proteinelor care conțin foarte mulți aminoacizi și peptide, care au și structură terțiară și cuaternară.

5. BIBLIOGRAFIE

R. Jones, Erdmann, M., (1987) The Amino Revolution, First Fireside Edition, p2.

https://ro.wikipedia.org/wiki/Aminoacid

P. Trumbo, S. Schlicker, A.A. Yates, M. Poos; Food and Nutrition Board of the Institute of Medicine, The National Academies. Dietary reference intakes for energy, carbohydrate, fiber, fat, fatty acids, cholesterol, protein and amino acids.J Am Diet Assoc

"Protein" U.S. Centers for Disease Control and Prevention. Accessed October 18th 2013.

http://www.scritub.com/biologie/Structura-proteinelor175134821.php

D. Zieve, M.D, M.H.A., and D.R. Eltz."Protein in diet" U.S. National Library of Medicine, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health. Accessed October 18th 2013

A. Lehninger, Biochimie vol I-II, Editura Tehnică, București 1987-1992

C.D. Nenițescu. Tratat elementar de chimie organică vol II Editura Tehnică , București 1958

B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, and P. Walter. "Protein Function" Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Accessed October 18th 2013.

Z. Pharma "What are peptides". A/S. Archived from the original on 2014-07-14.

IUPAC, Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the "Gold Book") (1997). Online corrected version: (2006–) "amino-acid residue in a polypeptide".

H. Emily; C. Rattan. "Milk protein derived bioactive peptides". Dairy Science. Retrieved 28 July 2014.

S. Duquesne, D. Destoumieux-Garzón, J. Peduzzi, S. Rebuffat; Destoumieux-Garzón; Peduzzi; Rebuffat (August 2007). "Microcins, gene-encoded antibacterial peptides from enterobacteria". Natural Product Reports 24 (4): 708–34. doi:10.1039/b516237h. PMID 17653356.

Pons M, Feliz M, Antònia Molins M, Giralt E; Feliz; Antònia Molins; Giralt (May 1991). "Conformational analysis of bacitracin A, a naturally occurring lariat". Biopolymers 31 (6): 605–12. doi:10.1002/bip.360310604. PMID 1932561.

A.M. Torres, I. Menz, P.F. Alewood et al. (July 2002). "D-Amino acid residue in the C-type natriuretic peptide from the venom of the mammal, Ornithorhynchus anatinus, the Australian platypus". FEBS Letters 524 (1–3): 172–6. doi:10.1016/S0014-5793(02)03050-8. PMID 12135762.

A. Meister, M.E. Anderson; Anderson (1983). "Glutathione". Annual Review of Biochemistry 52 (1): 711–60. doi:10.1146/annurev.bi.52.070183.003431. PMID 6137189.

M. Hahn, T. Stachelhaus; Stachelhaus (November 2004). "Selective interaction between nonribosomal peptide synthetases is facilitated by short communication-mediating domains". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101 (44): 15585–90. Bibcode:2004PNAS..10115585H. doi:10.1073/pnas.0404932101. PMC 524835. PMID 15498872.

R. Finking, M.A. Marahiel; Marahiel (2004). "Biosynthesis of nonribosomal peptides". Annual Review of Microbiology 58 (1): 453–88. doi:10.1146/annurev.micro.58.030603.123615. PMID 15487945.

L. Du, B. Shen; Shen (March 2001). "Biosynthesis of hybrid peptide-polyketide natural products". Current Opinion in Drug Discovery & Development 4 (2): 215–28. PMID 11378961.

http://www.usvpeptides.com

J.W. Payne (1976). "Peptides and micro-organisms". Advances in Microbial Physiology. Advances in Microbial Physiology 13: 55–113. doi:10.1016/S0065-2911(08)60038-7. ISBN 9780120277131. PMID 775944.

J. Hummel, M. Niemann, S. Wienkoop et al. (2007). "ProMEX: a mass spectral reference database for proteins and protein phosphorylation sites". BMC Bioinformatics 8 (1): 216. doi:10.1186/1471-2105-8-216. PMC 1920535. PMID 17587460.

J. Webster , D. Oxley; Oxley (2005). "Peptide mass fingerprinting: protein identification using MALDI-TOF mass spectrometry". Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology™ 310: 227–40. doi:10.1007/978-1-59259-948-6_16. ISBN 978-1-58829-399-2. PMID 16350956.

P. Marquet, G. Lachâtre; Lachâtre (October 1999). "Liquid chromatography-mass spectrometry: potential in forensic and clinical toxicology". Journal of Chromatography B 733 (1–2): 93–118. doi:10.1016/S0378-4347(99)00147-4. PMID 10572976

Main article: Peptide synthesis

"Dietary Reference Intakes: Macronutrients" The Institute of Medicine. Accessed October 18th 2013.

M.C. Latham. "Human nutrition in the developing world" Food and Nutrition, Series – No. 29. Accessed October 18th 2013

Instructor_Resources/Chapter_24

Bulinski JC (1986). "Peptide antibodies: new tools for cell biology". International Review of Cytology. International Review of Cytology 103: 281–302. doi:10.1016/S0074-7696(08)60838-4. ISBN 9780123645036. PMID 2427468.

D. Henry. Herce; D. Wen; H. Jonas; L. Heinrich; M.C. Cardoso. (24 October 2013). "Visualization and targeted disruption of protein interactions in living cells". Nature Communications 4. doi:10.1038/ncomms3660. PMC 3826628. PMID 24154492.

"Hormone (androgen deprivation) therapy for prostate cancer". cancer.org. Retrieved 3 October 2013.

K. Ravi; A. Barqawi ; Crawford, ED (2005). "Adverse Events Associated with Hormonal Therapy for Prostate Cancer". Reviews in Urology 7 (5): 37–43. PMC 1477613. PMID 16985883.

E. Boelsma, J. Kloek ; Kloek (March 2009). "Lactotripeptides and antihypertensive effects: a critical review". The British Journal of Nutrition 101 (6): 776–86. doi:10.1017/S0007114508137722. PMID 19061526.

J.M. Xu, J.M. Qin, J.M. Wang, W. Li, C. Chang ; Qin; Wang; Li; Chang (October 2008). "Effect of milk tripeptides on blood pressure: a meta-analysis of randomized controlled trials". Nutrition 24 (10): 933–40. doi:10.1016/j.nut.2008.04.004. PMID 18562172.

J.M. Pripp (2008). "Effect of peptides derived from food proteins on blood pressure: a meta-analysis of randomized controlled trials". Food & Nutrition Research 52: 10.3402/fnr.v52i0.1641. doi:10.3402/fnr.v52i0.1641. PMC 2596738. PMID 19109662.

M.F. Engberink, E.G. Schouten, F.J. Kok, L.A. van Mierlo, I.A. Brouwer, J.M. Geleijnse; Schouten; Kok; V. Mierlo; Brouwer; Geleijnse (February 2008). "Lactotripeptides show no effect on human blood pressure: results from a double-blind randomized controlled trial". Hypertension 51 (2): 399–405. doi:10.1161/HYPERTENSIONAHA.107.098988. PMID 18086944.

http://nobelprize.org/ nobel_prizes/chemistry/laureates/2009/info_publ_che_09_en.pdf

V. Grancea, Bazele radiologiei si imagisticii medicale, Edit. Amalteea, 1996

http://www.wellcomecollection.org/exhibitionsandevents/pastexhibitionsandevents /fromatomstopatterns/

http://www.scientia.ro/tehnologie/39-cum-functioneaza-lucrurile/932-imagistica-prin-rezonanta-magnetica-rmn-cum-functioneaza.html

Y.M. Fenn, J.B, Electrospray Ion Source. Another Variation on the Free-Jet Theme, J.Phys.Chem., 1984: 88, 4451-4459

A. Zamfir, J. Peter-Katalinic. Glycoscreening by on-line sheathless capillary electrophoresis/electrospray ionization-quadrupole time of flight-tandem mass spectrometry