Analiza Cromatografica a Unor Produse Vegetale cu Continut de Galantaminadocx

=== Analiza cromatografica a unor produse vegetale cu continut de galantamina ===

Universitatea de Medicină și Farmacie

„Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca

Facultatea de Farmacie

Disciplina de Chimie Analitică și Analiză Instrumentală

LUCRARE DE LICENȚĂ

Analiza cromatografică a unor produse vegetale cu conținut de galantamină

Coordonator științific

Conf. dr. Ede BODOKI

Absolvent

Annamária KOZMA-IMRE

2015

Cuprins

I. Partea teoretică 5

Boala Alzheimer 5

Date epidemiologice 6

Factori de risc 6

Ipoteze etiopatogenetice 7

Factorii neurologici 7

Factori non-neurologici 9

Manifestări clinice 10

Tratament 12

Tratamentul non-farmacologic 12

Tratamentul farmacologic 13

Galantamina 16

Metode de obținere 17

Obținerea racemicului 18

Obținerea (-)-galantaminei 19

Metode de analiză 20

Metode de extracție 24

Proprietăți farmacologice 28

Plante cu conținut de galantamină 29

Galanthus nivalis 30

Leucojum vernum 30

Narcissus poeticus 30

Narcissus pseudonarcissus 30

Cromatografia în strat subțire 31

Faze staționare 31

Faze mobile 34

Aplicații 35

Aplicații în industria farmaceutică 35

II. Partea experimentală 37

Materiale și metode 37

Reactivi și solvenți 37

Produse vegetale 37

Aparatură 37

Descrierea metodei 38

Rezultate și discuții 41

Determinarea calitativă 41

Determinare cantitativă 42

Validarea metodei 43

Specificitatea 43

Linearitatea 43

Exactitatea 44

Fidelitatea 45

Limita de detecție și cuantificare 47

Bibliografie 49

INTRODUCERE

Boala Alzheimer este una dintre bolile cele mai des întâlnite ale secolului XX. în rândul populației vârstnice, dar nu numai (1). Boala are simptome bine definite, însă apar diferențe între pacienți. Cele mai frecvente sunt tulburările mnezice, vagabondajul, schimbarea personalității. Până în prezent nu a fost găsit un remediu care să vindece boala, pe piața farmaceutică găsindu-se medicamente care întârzie sau încetinesc evoluția bolii. Medicamentele cele mai prescrise în acest sens sunt fie inhibitorii de acetilcolinesterază la nivel central, fie memantina, care este un antagonist al receptorilor NMDA (2).

În clasa inhibitorilor de acetilcolinesterază se numără trei compuși: fizostigmina, galantamina și donepezilulul. Între aceste substanțe medicamentoase nu este o diferență semnificativă din punct de vedere al mecanismului de acțiune, alegerea unuia sau altuia are loc după preferințele pacientului din considerente economice, sau al modului de administrare, fiindcă unii au timp de acțiune mai lung (2).

Prezenta lucrare și-a propus prezentarea mai pe larg a galantaminei, din punct de vedere analitic și determinarea ei calitativă și cantitativă din extracte vegetale. Metoda de dozare propusă în acest scop este una cromatografică în strat subțire. Metoda a fost validată având în vedere următorii parametrii: specificitate, liniaritate, exactitate, repetabilitate, limită de detecție și de cuantificare (3).

Extractele vegetale analizate au provenit de la specii din familia Amaryllidaceae, respectiv Galanthus nivalis, Leucojum verum, Narcissus poeticus și Narcissus pseudonarcissus.

Metodele de extracție utilizate pentru a extrage galantamina din produsele vegetale au fost de asemenea optimizate pentru ca procesul de extracție să fie cât mai reproductibil și cât mai precis.

Partea teoretică

Boala Alzheimer

Boala Alzheimer (BA) este o boală neurodegenerativă progresivă, care afectează viața milioanelor de persoane în vârstă la nivel mondial, și produce o deteriorare din ce în ce mai accentuată a funcțiilor de cunoaștere ale creierului. De asemenea duce la pierderea capacităților intelectuale ale individului asociate cu tulburări de comportament, în totalitate starea se numește demență (din latina: demens) (4).

Michael R. D’Andrea descrie BA ca și boala care ”lasă pacientul neajutorat, societatea înfricoșată și cercetătorii pe această temă frustrați”.

O deteriorare a capacității mintale la persoanele în vârstă a fost observată și descrisă încă din trecut, dar în 1906 Dr. Alois Alzheimer a fost cel care a definit aspectele grave ale acestei boli, în urma unei autopsii făcute pe unul dintre pacienții lui care în 4-5 ani a ajuns la demență profundă. Medicul a descoperit plăci de amiloid, respectiv aglomerări neurofibrilare agregate de proteine tau construite anormal. Studiind în continuare boala a mai descries aspectul specific neuopatologic al bolii: atrofii cerebrale generalizate, aberații citoscheletice și neuritice și vase sanguine dismorfe.

Clinic, de asemenea există simptome bine definite. La început apare demența, simptomele includ probleme de memorie, dificultate în exprimare, percepție, gândire și judecată, stadiu, care se poate numi tulburare cognitivă ușoară. Se mai poate adăuga dificultatea de a rezolva unele sarcini cotidiene, precum și uitarea unor conversații sau întâmplări recente,dar acest stadiu al bolii nu duce întotdeauna la BA. Stadiile incipiente ale BA apar dacă aceste simptome se agravează la rătăcirea individului pe traseele cunoscute, probleme de exprimare, pierderea interesului în activități care înainte îi plăceau și cel mai tragic este schimbarea personalității și pierderea abilităților de integrare socială. În timp ce boala înaintează apar halucinații, inconștiență de propria persoană și imposibilitatea de a fi independent, stare care necesită îngrijire dea-lungul zilei. BA este fatală, după 8-10 ani după diagnosticare duce la moartea pacientului prin boli diverse, cea mai frecventă este pneumonia(4).

Date epidemiologice

Demența este o boală care afectează o mare parte din populația vârstnică, apare la 1 din 15 persoane peste 65 de ani, și la 1 din 4 persoane peste 85 de ani. Însă nu toți acești pacienți suferă de BA. Demența poate fi de mai multe tipuri: de tip Alzheimer, vasculară, fronto-temporală, cea legată de consumul abuziv de alcool, cea cu corpi Lewy.

În lume aproape 44 de milioane de oameni suferă de BA sau alt tip de demență. Numai 1 din 4 persoane cu Alzheimer au fost diagnosticați. BA este cel mai comună în Europa de Vest.

În SUA, statisticile arată că 1 din 9 persoane peste 65 de ani, respectiv o treime dintre cei peste 85 este afectată de BA. Dacă nu se va găsi un tratament 16 milioane de americani vor suferi de această boală până în 2050. Aici, BA este al șaselea cauză de deces.

Costurile pentru îngrijirea pacienților cu Alzheimer în SUA în 2015 se estimează ca fiind 226 de miliare de dolari, față de costurile globale, care sunt aproximativ 605 miliarde de dolari, anual, reprezentând 1% din produsul intern brut global(5).

1 din 8 oameni peste vârsta de 55 de ani suferă de BA. Jumătate din aceștia sunt peste 85 de ani. În România 80% dintre bolnavi rămân nediagnosticați, însă cu cât mai repede se face diagnosticarea, cu atât mai ușor poate fi încetinită progresia bolii (1, 5).

În România în 2014 erau aproximativ 300 000 de persoane care sufereau de BA, și având în vedere tendințele alarmante ale evoluției demografice se poate prezice că acest număr se va tripla până în 2025. Dintre cei diagnosticați (20%) majoritatea primesc diagnosticul în fazele tardive. Cu cât boala este depistată mai târziu, costul total de îngrijire este mai mare, iar suferința pacientului și a familiei devine un fenomen tot mai puțin neglijabil (1).

Factori de risc

Până în prezent nu se cunoaște cu certitudine cauza BA, dar este clar că sunt mai mulți factori care contribuie la apariția ei:

Vârsta: La vârstnici apare o modificare, o dezorganizare a sistemelor reglatoare care ajută la funcționarea normală a sistemului neuro-endocrin, iar aceste modificări vor atrage după sine o deteriorare în plan psihic;

Istoricul familial de demență: mutațiile la nivelul unor gene care codifică proteine, precum: presenilina 1, proteina precursoare a amiloidului au o componentă importantă în predispoziția la boală sau apariția ei;

Traumatismele craniene (și contuziile) sunt considerate potențial factori de risc, deoarece se presupune o asemănare între BA și ”demența boxerilor” fiindcă în ambele situații apar depozitele amiloidice și degenerescența neurofibrilară;

Factori nocivi pentru aparatul cardio-vascular: diabetul zaharat, hipertensiunea arterială, nivelul crescut al colesterolului sangvin, fumatul (2).

Ipoteze etiopatogenetice

Modificările patologice din BA au fost observate inițial la nivelul neocortexului, dar acestea apar și în alte zone ale creierului. Această atrofie corticală este însoțită de pierderea neuronilor și a sinapselor. Afectarea hipocampului poate explica problemele majore din BA. Degenerarea care afecteză nucleii bazali, ai căror proiecții se extind asupra sistemului limbic și cortexului cerebral asociativ explică afectarea generalizată a comportamentului, cogniției, sensibilității și senzorialității bolnavului.

Cauza distrugerii neuronilor din creier este necunoscută, dar descoperiri recente au dezvăluit noutăți despre aspectele patologice ale BA. Aceste descoperiri spun că la apariția BA contribuie atât factori neurologici cât și factori non-neurologici: vasculari, genetici, proteice (amiloidul).

Factorii neurologici

Dr. Alzheimer, în 1906, a descoperit că în creierul afectat de BA există placi de amiloid și fibre anormale de proteine tau (4).

În anii 1970 una dintre descoperirile majore în cunoașterea fiziopatologiei morții neuronale a fost deficitul de enzima, numită acetil transferază, care participă la formarea acetilcolinei în neocortex din creierul afectat de BA. Studiile următoare au arătat o reducere a recaptării colinei, și o eliberare crescută de acetilcolină, precum și o degenerare a neuronilor colinergici (care utilizează acetilcolina ca și neuromediator) în zone specifice ale creierului cu BA. Aceste descoperiri stau la baza ipotezei colinergice, care spune că pierderea de neuroni colinergici, și a transmisiei colinergice în zone critice ale creierului duce la deteriorarea funcției cognitive ale pacienților cu BA (6). Descoperirea rolului acetilcolinei în învățare și memorie de asemenea susține această ipoteză. Medicamantele cele mai accesibile pentru tratamentul BA au ca și bază ipoteza colinergică, astfel că acestea inhibă colinesteraza, enzimă care degradează acetilcolina. Până în zilele noastre aceste medicamente însă au un succes redus.

O altă descoperire majoră din anii 1980 o reprezintă neuroinflamația ca și cauză a distrugerii neuronale în creier (7). S-a găsit o serie de antigene în creierul afectat de BA, care a dus la ideea că există un sistem de imunoapărare în sistemul nervos central. Pe lângă acestea, în creierul afectat de BA, microglia este reactivă, declanșând o reacție în lanț în urma căreia se formează citochine și chemochine proinflamatorii. Aceste descoperiri dau naștere unei ipoteze inflamatorii. Conform acestei ipoteze, o creștere în secreția acestor substanțe, care au potențial neurotoxic, distrug neuronii și duc la dezvoltarea simptomelor bolii.

Este clar că proteinele tau hiperfosforilate au un rol important în patogeneza BA. O mutație genetică modifică funcția și expresia izoformei proteinei tau, fiind un filament neuronal stabilizator (8). Astfel proteina tau nu își mai poate exercita funcția fiziologică de a ajuta asamblarea microtubulilor. Se acumuleză proteinele tau, este inițiată o transformare amplă care declanșează BA. Astfel că, o hiperfosforilare excesivă și necontrolată a unei proteine tau adultă normală dă naștere unei proteine deformate, care începe să interacționeze cu alte filamente de proteine, și pot forma filamente helicoidale împerecheate, creând în interiorul neuronilor aglomerări neurofibrilare. Consecințele acestor formațiuni sunt dezastruoase, care pot duce de la distrugerea sistemului transportor în interiorul neuronilor, până la moarte celulară (9). Aceste descoperiri stau la baza ipotezei care vizează proteina tau. Un tratament potențial ar fi administrarea albastrului de metilen, care întârzie senescența celulelor, îmbunătățind activitatea mitocondrială a acestora (10). Alte terapii care sunt în curs de dezvoltare sunt medicamente care împiedică fosforilarea proteinelor tau (11) sau anticorpi împotriva acesteia (12).

Factori non-neurologici

Este o relație clară între apariția BA și factori de risc vasculari (13). De fapt, ipoteza vasculară sugerează că o hipofuncție vasculară, o scădere a fluxului sanguin în creier duce la debutul bolii. Patologia microvasculară și fluxul sanguin scăzut din creier sunt considerați principalii factori declanșatori ai disfuncției neuronale care cauzează schimbările cognitive și degenerative în BA. Înaintarea în vârstă și prezența factorilor de risc vasculari creează o reducere a fluxului sanguin cerebral (14). Astfel, are lor distrugerea neuronală, din cauza reducerii aportului de oxigen, gucoză și nutrienți, cu simptomele cognitive și degenerative în BA.

BA are de asemenea o bază genetică. Cei care au părinți sau frați cu BA sunt mai predispuși la boală, iar probabilitatea este mai mare cu creșterea numărului de rude care au sau au avut boala (4). Înseamnă că BA are componentă genetică, riscul genetic cunoscut este de 0.1% în BA. Factorul de risc majoritar este gena care codifică apolipoproteina E (APOE4). Genele APOE2 și APOE3 sunt cele mai frecvente în populația generală, însă APOE4 este asociată cu riscul individului de a dezvolta BA cu debut tardiv.

Rolul colesterolului în patologia bolii Alzheimer este de asemenea susținut de faptul că statinele (medicamente care reduc nivelele de colesterol) au capacitatea de a reduce prevalența bolii cu până la 70 %. Colesterolul intracelular poate regla prelucrarea amiloidului prin modularea directă a activității sercretazei, enzima care degradează proteina amiloid în particule mai mici. Nivelul crescut de colesterol intracelular duce la intensificarea activității γ-secretazei și a căilor amiloidogenice, însă nivelul scăzut de colesterol intracelular favorizează căile non-amiloidogenice.

Gena ApoE este o genă cu justificare replicabilă în dezvoltarea BA (4). În mod similar, inhibarea biosinezei colesterolului cu statine a redus dezvoltarea de BA (15). Nu a fost observată o diferență semnificativă între efectul statinelor lipofile sau hidrofile.

Cascada amiloidă stă la baza unei alte ipoteze, celei care spune că depozitele sau agregatele de amiloid β sunt cauza fundamentală a morții neuronale din BA (16). Amiloidul este numele comun pentru o familie de porțiuni de mărime redusă a proteinei amiloid, care sunt considerate toxice . Amiloidul β este toxic pentru că este o metaloproteină, de care se leagă metale bivalente (Fe, Cu, Zn), astfel metalele se reduc și pot reacționa cu oxigenul molecular. În urma reacției se formează peroxid de hidrogen și specii reactive de oxigen, care reprezintă stresul oxidativ pentru celule. Această degradare oxidativă a celulelor neuronale are un rol major în apariția bolii Alzheimer.

În 1990 a fost creat un ghid pentru clasificarea și denumirea amiloidului și amiloidozei, care cuprinde denumiri în funcție de origine și asocierea clinică a moleculei (4). Amiloidul care este asociat cu BA este denumit amiloid β (Aβ) (16). Această formă provine din proteina precursor pentru amiloid (APP) care face parte dintr-o familie de proteine membranare celulare. Funcția normală a Aβ este variat: s-a obsevat că are rol în formarea sinapselor și memoriei, fiind necesară pentru activitatea sinaptică (17). La vârste tinere, dacă nivelul lui este unul fiziologic, Aβ este un produs normal și solubil al metabolismului neuronal care reglează supraviețuirea neuronală în sinapsă. Totuși, cu înaintarea în vârstă din motive necunoscute Aβ este asociată cu declin al sinapselor și moarte neuronală. Prezența lui în plăcile extracelulare, susține ipoteza amiloidului. Această ipoteză afirmă că depozitele Aβ, generate de degradarea proteolitică a proteinei precursor pentru amiloid, sunt principala cauză a BA. Prezența Aβ40 și Aβ42 în plăci a fost observată, totuși forma Aβ42 are capacitatea mai mare de a forma agregate de fibrili ai amiloidului în creierul pacienților cu boala Alzheimer. Stadiile de asamblare ale Aβ sunt: monomeri, oligomeri, protofibrili și fibrili (4). Monomerii nu sunt toxici ca atare, toxicitatea Aβ este atribuită formării fibrililor, fenomen asociat cu plierea greșită a proteinelor. Oligomerii și speciile protofibrilice pot facilita hiperfosforilarea proteinelor tau, dereglarea homeostaziei calciului, probleme în funcția mitocondrială și proteozomală, dereglare sinaptică și disfuncție cognitivă. Depozitele sau plăcile de amiloid cresc în dimensiuni și devin mai toxice, distrugând neuronii învecinați(4).

Manifestări clinice

Formele de debut în BA sunt studiate intens, fiindcă au o importanță majoră. Uneori debutul bolii se poate situa cu 20 de ani înaintea primelor semne manifeste, dar pot apărea stări precoce, care nu permit un diagnostic clinic, doar după 2-4 ani. BA poate debuta prin tulburări mnezice, ce se poate numi și ”uitare malignă” și în aceste situații pacientul uită evenimente cotidiene de dată recentă. Nu trebuie confundată cu tulburările de memorie datorate vârstei, ”uitarea benignă”, și se referă la evocarea detaliilor. Debutul prin tulburări psihice și de comportament este de obicei dominat de modificarea personalității individului, de tulburări depresive sau manifestări psihotice. Poate apărea pasivitatea pacientului care își pierde interesul în activitățile preferate, apare un declin în relațiile interpersonale. De asemenea, poate apărea o agitație, hiperactivitate și iritabilitate sau un comportament egocentric grosier, care duce la pierderea responsabilităților familiale și profesionale. Semnele neurologice pot constitui o formă de debut al BA, și se concretizează prin fenomene de vagabondaj și dezorientare în spațiu, diminuarea abilităților manuale, sau afazie.

Perioada de stare a bolii Alzheimer are trei componente: simptomele cognitive, non-cognitive și neurologice. Printre simptomele cognitive se numără tulburările de memorie, de atenție, de orientare în timp și spațiu și tulburările ale gândirii abstracte și judecății.. În timp ce boala evoluează apar mai frecvent ecmnezia, anecforia și acestea favorizează dezorientarea pacientului. Tulburările de limbaj se corelează cu gradul de severitate a bolii, dar de obicei scrisul și cititul sunt mai sever afectate decât limbajul oral. Simptomatologia non-cognitivă se referă la modificări afective, motivaționale, în mobilizare, în comunicare, comportamentale. Pot apărea idei delirante, halucinații, tulburări depresive, tulburări de somn. Modificările comportamentale sunt cele mai frecvente și mai timpurii: dezinhibiție, limbaj vulgar, părăsirea domiciliului, vagabondajul, agresivitate fizică. Simptomele neurologice au la bază substratul organic, dar sunt dificil de corelat atât cu stadiul bolii, cât și cu vreo formă de afecțiune degenerativă. De aceea, biopsia cerebrală este necesară doar pentru diferențierea BA de demența frontotemporară și boala Creutzfeldt-Jakob. Din simptomele cognitive și non-cognitive rezultă unele simptome funcționale, care sunt reprezentate de incapacitate pacientului de a se autoîngriji. Pacientul are nevoie de ajutor pentru activități de bază: pentru a se îmbrăca, a se spăla, a merge la toaletă sau pentru a se hrăni (2, 18).

Tratament

Tratamentul în BA vizează, în primul rând, reducerea simptomelor cognitive și evitarea degradării stării pacientului. Printre celelalte obiective terapeutice se numără ameliorarea sechelelor psihice și comportamentale. Totodată, tratamentul acestei afecțiuni nu a fost dovedit că ar prelungi viața pacienților, ar trata boala sau ar opri sau inversa procesele fiziopatologice prezente în organismul pacienților.

Studiile clinice au demonstrat că tratamentul timpuriu și continuu cu inhibitorii de colinesterază aduc un beneficiu modest. Asocierea memantinei în formele moderate spre severe poate aduce un beneficiu. De aceea inhibitorii de colinesterază și angtagoniștii receptorilor NMDA colinergici (memantina) reprezintă tratamentul de elecție în boala Alzheimer. Aceste medicamente ajută la menținere a funcției cognitive, precum și păstrarea capacității de a continua activitățile cotidiene. Pe măsură ce apar simptomele comportamentale, se asociază și un tratament simptomatic.

Tratamentul non-farmacologic

Tratamentul non-farmacologic este considerat de primă linie în cazul simptomelor psihice și comportamentale ușoare. Datorită simptomelor psihice și comportamentale ce apar, care sunt dezolante și greu de gestionat, BA afectează puternic atât pacientul, cât și familia, și de cele mai multe ori determină familia să caute un ajutor instituțional. Însă simptomele precum incontinență urinară, insomnie, agitație, vagabondajul pot fi cel mai bine gestionate cu ajutorul intervențiilor comportamentale.

Odată diagnosticat, pacientul, dar și familia, trebuie să fie educat despre boală, prognostic, posibilitățile de tratament existente, aspecte legale și probleme legate de calitatea vieții pacientului. Familia este consiliată despre strategiile de îngrijire, despre tehnici pentru managementul stresului, sau despre grupuri de suport. Este foarte important ca îngrijitorul să identifice simptomul pacientului, apoi să identifice factorul declanșator și să poată realiza modificările necesare pentru remedierea situației în mediul în care trăiește bolnavul. Deseori pacienții au nevoie de un mediu liniștit, mese regulate, temperatura mediului ambiant plăcut, evitarea situațiilor frustrante sau înfricoșătoare. Asigurarea unui mediu de viață liniștit, fără factori de stres este obiectivul cheie. Meloterapia reduce anxietatea, neliniștea și ostilitatea, de asemenea are efecte benefice în inducerea somnului. Acompaniamentul muzical, mișcări sau dans pe muzică sau psihoterapia individuală se indică în cazul pacienților cu demență ușoară care sunt conștienți de declinul lor cognitiv (2).

Tratamentul farmacologic

Ghidul de diagnostic și tratament în demențe din România revizuit în 2009, prevede în forme ușoare de BA inhibitori de colinesteraze: donepezil zilnic 5-10 mg, rivastigmină zilnic 6-12 mg, sau galantamină zilnic 16-24 mg. În cazurile incipiente, dacă inhibitorul de colinesterază nu este tolerat poate fi recomandată memantina. Pentru formele moderate se recomandă inhibitori de colinesterază în asociere sau nu cu memantina, sau memantină (doză zilnică 10-20 mg) în monoterapie ca și alternativă la biterapie, în cazul în care bola are o evoluție rapid progresivă. În formele grave de BA memantina (10-20 mg/zi) reprezintă medicația de primă alegere, donepezilul este medicamentul de linia a doua, în caz de intoleranță sau lipsă de răspuns la memantină. Dacă răspunsul clinic la memantină nu este satisfăcător, se recomandă combinația cu memantină și inhibitor de colinesteraze (19).

Ghidul de farmacoterapie din SUA, din 2014, recomandă în formele ușoare spre moderate inhibitori de colinesterază, dar în formele severe trebuie considerată asocierea memantinei în doze recomandate. Totodată se pot indica ca monoterapie. Simptomele comportamentale necesită medicație complementară (2).

Nu este clar, datorită informațiilor restrânse, dacă există o relație doză-răspuns în cazul inhibitorilor de colinesterază, sau dacă se poate atinge un nivel mai crescut de îmbunătățire cognitivă cu doze maxime tolerate, față de dozele recomandate, administrate zilnic. Este foarte importantă determinare duratei terapiei. Faptul că un pacient imediat după întreruperea terapiei va resimți simptomele prezente înaintea inițierii terapiei este îngrijorătoare. Studiile deschise, au arătat că lipsa complianței, ce se manifestă prin întreruperi repetate ale inhibitorului de colinesterază, cauzeză o înrăutățire a stării pacientului, dar un studiu observațional a concluzionat că nu există o diferență semnificativă între pacienții care au prezentat lacune în terapie față de ceilalți privind gradul de transfer în instituții specializate sau moartea pacienților (20).

Pentru determinarea gradului de afectare a pacientului se folosește testul MMSE (Mini-Mental Status Examination), rezultatul fiind un număr. La un pacient fără tratament acest scor poate scădea cu 2-4 unități pe an, însă în cazul unui tratament cu succes această scădere trebuie să fie sub 2 puncte. Iar, dacă în urma unui tratament timp de un an cu un inhibitor de colinesterază scăderea este mai mare de 2-4 puncte este necesară schimbarea medicamentului cu un alt inhibitor.

Inhibitorii de colinesterază includ donepezilul, rivastigmina și galantamina. Aceste substanțe medicamentoase prezintă o capacitate asemănătoare în îmbunătățirea funcției cognitive și funcționalității pacientului care suferă de formă ușoară spre moderată de BA. Durata beneficiilor variază de la 3 la 12 luni. Mecanismul de acțiune diferă foarte puțin între cei trei reprezentanți ai clasei, donepezil inhibă specific și reversibil acetilcolinesteraza, rivastigmina inhibă atât butirilcolinesteraza, cât și acetilcolinesteraza, iar galantamina este un inhibitor selectiv, competitiv și reversibil ai acetilcolinei, și intensifică activitatea acetilcolinei pe receptorii nicotinici (21)(art 2013 singh). Alegerea agentului terapeutic depinde de ușurința de administrare, preferințele pacientului, costul terapiei, problemele de siguranță sau posibilitatea de interacțiuni cu alte medicamente. Trebuie luate în considerare și proprietățile farmacocinetice, pentru că rivastigmina și galantamina au un timp de înjumătățire scurt de 1,5 ore, respectiv 7 ore, față de donepezil, care are t1/2=70 de ore. În cazul celor cu timp de înjumătățire scurt, dacă pacientul întrerupe tratamentul câteva zile, reluarea acestuia se va realiza cu dozele minime, treptat crescute la doza unde a fost întreruptă. Doza pentru donepezil este de 10 mg/zi și este recomandat și eficient în stadiile incipiente ale demenței Alzheimer. Tratamentul se începe cu 5 mg/zi seara, timp de 6 săptămâni, apoi se mărește doza la 10 mg/zi, seara, doză unică. Rivastigmina se administrează de două ori pe zi, doza inițială este 1,5 mg pentru forme farmaceutice orale (capsule, soluție) sau 4,6 mg/zi pentru sistemul transdermic(2). Dozele pot fi crescute la 3-6 mg de două ori pe zi, respectiv la 9,5-13,3 mg/zi. Galantamina se administrează de două ori pe zi, doza inițială fiind 4 mg, dar există capsulă cu eliberare prelungită care se administrează o dată pe zi (8 mg). Doza uzuală poate fi crescută până la 8-12 mg, de două ori pe zi, pentru forme farmaceutice cu cedare imediată sau 16-24 mg pentru capsulele cu eliberare prelungită. Memantina se administrează utilizând o doză inițială de 5 mg/zi din formă farmaceutică cu eliberare imediată, sau 7 mg/zi pentru capsula cu eliberare prelungită, iar doza se poate crește până la 10 mg, de două ori pe zi, sau 28 mg o dată pe zi, pentru capsula cu eliberare prelungită.

Pentru simptomele comportamentale, precum tulburări depresive, tulburări psihotice, anxietate, insomnii și agitație psihomotorie este necesară instituirea unui tratament simptomatic. Tratamentul depresiei se face în primul rând cu antidepresive din grupa inhibitorilor selectivi ai recaptării serotoninei (ISRS) sau cu timostabilizatoare (carbamazepina, valproat de sodiu). În cazul apariției reacțiilor adverse severe o alternativă terapeutică o reprezintă antidepresivele atipice. În tulburările psihotice se recomandă tratament doar dacă este absolut nevoie, cel mai utilizat fiind haloperidolul sau antipsihoticele atipice. Aceste medicamente prezintă un risc pentru pacienții în vârstă, deoarece pot produce efecte secundare extrapiramidale, anticolinergice sau hipotensiune arterială. Pentru tratamentul anxietății se recomandă anxiolitice benzodiazepinice cu timp de înjumătățire scurt. Insomniile reprezintă simptome foarte greu de rezolvat. Cauzele în rândul persoanelor în vârstă sunt diverse, dar datorită riscului afectării cognitive se evită barbituricele și hipnoticele benzodiazepinice. Se opteză pentru hipnotice nonbenzodiazepinice (Zolpidem, Zopiclon, Zaleplon) sau pentru melatonină. Agitația psihomotorie în BA reprezintă o urgență și se va interveni cu preparate administrate parenteral, deoarece pacientul este necompliant. Se poate administra antipsihotice cu efect rapid (olanzapină, haloperidol), benzodiazepine sau ambele (2).

Susținătorii ipotezei inflamatorii al BA recomandă antiinflamatoare nesteroidiene, care se presupune că au efect benefic, administrate cel puțin doi ani, asupra riscului apariției bolii, fiind capabile să reducă declinul cognitiv și afectarea neuronală. Utilizarea acestor agenți terapeutici în acest sens însă este restrâns datorită tolerabilității reduse și a efectelor nesigure (18).

Cerebrolysin se poate utiliza în forme ușoare sau moderate de BA, în monoterapie dacă celelalte medicamente nu pot fi utilizate sau nu s-a obținut un răspuns favorabil. Studiile au arătat că tratamentul de 6 luni cu o doză de 10 mL/zi a ameliorat tulburările cognitive și s-au observat îmbunătățiri clinice globale la pacienți cu BA ușoară sau moderată (19).

Extractul standardizat de Ginkgo biloba Egb761 poate fi utilizat în forme ușoare, ca medicație de linia a doua, și în formele moderate de linia a treia. Studiile dublu-orb, placebo controlate, au arătat că o ameliorare a simptomelor cognitive se poate obține în BA ușoară sau moderată(19).

Vitamina E (2000 U.I./zi) și selegilina 10 mg/zi au fost sugerate pentru a îmbunătăți afectarea cognitivă, amână declinul funcțional, încetinesc evoluția progresivă a simptomelor cognitive, contribuind la amânarea instituționalizării (18). Mai recent însă s-a demonstrat că vitamina E nu este benefică ca și adjuvant în tratamentul BA, fiind considerat util doar pentru prevenția BA (2).

Tratamentul factorilor de risc vasculari este recomandată la pacienții cu BA, acesta cuprinde antiagregante plachetare, antihipertensive, statine și altele (2, 19).

Vaccinarea împotriva demenței Alzheimer își propune imunizarea populației împotriva beta amiloidului. Eficiența vaccinului a fost dovedită în studiile pe șoareci, însă la om au apărut efecte secundare de tip inflamator la nivelul creierului și măduvei spinării (18).

Alte medicamente în curs de validare sunt: inhibitorii beta-secretazelor, agoniști dopaminergici, terapie imunologică bazată pe vaccin anti-beta-amiloid (22).

Galantamina

Galantamina, cunoscută și sub denumirile licoremină, Reminyl, (-)-galantamină sau (4aS,6R,8aS)-(4a,5,9,10,11,12-hexahidro)-3-metoxi-11-methil-6H-benzofuro[3a,3,2-ef]-[2]-benzazepin-6-ol este un inhibitor al acetilcolinesterazei de la nivel central, totodată este un modulator alosteric al receptorilor nicotinici neuronali pentru acetilcolină. Este un alcaloid terțiar, de tip dibenzofuran, și se găsește în mai multe specii din familia Amaryllidaceae. Este un alcaloid care derivă de la N-benzil-N-β-fenetilamină, acceastă structură fiind precursor pentru opt tipuri de alcaloizi, dintre care doar galantamina este utilizată în terapie în stare pură(23). În general conținutul în alcaloizi din masa uscată a produselor vegetale este redusă, între 0.1-0.3% în Leucojum aestivum, 0.1-0.15% în Narcissus sau până la 0.52% în Ungernia victoria (24), dar s-a identificat o specie în Peru, Phaedranassa negistrophylla (Amaryllidaceae) din care s-a izolat un procent de 7.4% galantamină (25). Datorită atomului de azot terțiar din structură poate forma săruri cu acizii. În Fig. 1. este prezentată structura bromhidratului de galantamină.

Fig.1. Bromhidrat de galantamina

Metode de obținere

Galantamina se poate izola din ghiocel (Galanthus nivalis, G. woronowii, G. elwesii), din ghiocelul bogat sau de baltă (Leucojum aestivum, L. vernum), din narcise (Narcissus poeticus, N. pseudonarcissus, N. confusus). Alcaloizii se formează în urma reacțiilor din metabolismul secundar al plantelor (23).

Biosinteza (-)-galantaminei începe printr-o transformare enzimatică a L-fenilalaninei și a L-tirozinei sub acțiunea enzimelor fenilalaninamonia-ligază (PAL), respectiv tirozin-decarboxilază (26). În continuare compușii formați pot suferi cuplări oxidative.Intermediarul cheie în biosinteza galanthaminei este 4’-O-metilnorbeladina. N-demetilnarvedina, un intermediar format din precedentul, se reduce steroselectiv, dând naștere norgalantaminei. După reacția de N-metilare se obține galantamina în etapa finală a biosintezei. Galantamina se află în reacție de echilibru cu narvedina, datorită unei enzime care catalizează această reacție. În urma acestor căi de biosinteză se mai formează și alți alcaloizi, precum maritidină, crinină, licorină, tridferidină (27).

Obținerea racemicului

Datorită utilizării pe scară largă a galantaminei, s-a căutat modul de obținere a acesteia prin sinteză chimică. Prima sinteză chimică a galantaminei și a epi-galantaminei sub formă de racemic a fost publicată în 1957 de Barton și Kirby (28), utilizând acid para-hidroxi-fenilacetic și orto-benzilizovanilină ca și materii prime. După numeroase transformări și o metodă consumatoare de timp a fost realizată sinteza narvedinei cu un randament de 1,4%, care mai apoi a fost redusă cu hidrură de litiu și aluminiu la amestec racemic de galantamină și epi-galantamină.

Numeroși cercetători, având în vedere reperul care mimează biosinteza galantaminei, au îmbunătățit sinteza lui Barton (28). Schimbările majore s-au orientat către:

Protecția poziției para a intermediarului

Introducerea al treilea grupări fenolice care să reducă problemele legate de stereoselectivitate în timpul reacției

Utilizarea altor agenți oxidanți: bis-trifluoroacetat de feniliodură (PIFA) sau triacetat de mangan, caresă permită randamente mai mari și condiții mai blânde de reacție.

În 1969, Kametani a reușit să crească randamentul de producție a compusului de tip narvedină la 40%, prin folosirea unui difenol substituit în para (29). De asemenea, reacția are loc în condiții mai blânde și timp mai scurt. După obținerea acestui compus, prin reducere cu hidrură de litiu și aluminiu s-a obținut un amestec 50%, respectiv 40%, de galantamină și epi-galantamină.

În 1998, Kita și colaboratorii au adus o contribuție importantă pentru sinteza galantaminei raportând utilizarea PIFA (feniliodură-bis-trifluoracetat) ca și agent oxidant care promovează cuplarea difenolică cu un randament de 36% (30). Solventul utilizat pentru această sinteză a fost obligatoriu triflouroetanolul. Beneficiul major al metodei este că după alte transformări se obține doar galantamină, fără epi-galantamină, cu un randament bun. Eficiența agentului oxidant PIFA a fost demonstrat și de către Krikorian, care l-a folosit cu succes atingând randamentul de 60% (31).

Node, în 2001, a raportat o metodă eficientă pentru sinteza galantaminei (32). El a folosit un precursor metoxibenzaldehidic, agentul de oxidare pentru cuplarea fenolică folosit a fost PIFA în trifluoroetanol, iar după transformări succesive s-a obținut un derivat de narvedină (97%) care a fost redus la galantamină. Randamentul reacției este una ridicată, 61%, chiar dacă precursorul nu avea poziția para blocată, iar pentru a dirija reacția spre produșii doriți s-au legat de nucleul benzenic grupări O-benziloxi în poziția orto față de gruparea metoxi, astfel singura cale de cuplare fenolică au rămas pozițiile para-orto.

Obținerea (-)-galantaminei

Metodele amintite mai sus descriu sinteza amestecului racemic de galantamină. Prima sinteză publicată de Barton și Kirby descrie sinteza (-)-galantaminei, dar după prealabila separare enantiomerilor (±)-narveinei. Cristalizarea din soluția de enantiomeri a (-)-narvedinei a fost realizată prin adăugarea unei soluții de (+)-galantamină 0,5 N. Dezavantajul major al metodei este disponibilitatea redusă a (+)-galantaminei pentru separări pe scară largă.

Schieh și Carlson au găsit o soluție pentru această limitare (33), și au realizat separarea (-)-narvedinei prin metoda cristalizării preferențiale din soluția suprasaturată de (±)-narvedină (16 mg/L) în amestec 9:1 etanol:trietilamină. Acestei soluții i s-a adăugat cristale de (-)-narvedină (2,5%) la o temperatură de 68°C, suspensia formată a fost răcită la 40°C și menținută în aceste condiții în timpul nopții. La final s-a izolat enantiomerul pur de (-)-narvedină cu un randament de 84%. Această metodă se poate folosi cu un randament bun și dacă în loc de (-)-narvedină se adaugă (+)-galantamină într-o cantitate catalitică de 1%, obținându-se (-)-narvedină cu un randament de 75%. Dacă este necesară obținerea (+)-narvedinei în soluția racemicului se adaugă (-)-galantamină. Astfel dacă s-au obținut cantități importante de (-)-narvedină printr-o reacție de reducere se poate sintetiza(-)-galantamina. Randamente bune se obțin cu L-Selectride, care este un borat organic, cu capacitate crescută de a reduce narvedina la galantamină sub formă de racemic sau sub formă de enantiomer pur (33).

Aceste metode însă tot nu sunt fezabile pentru producția galantaminei pe scară largă, de aceea au fost investigate alte metode. Johnson a folosit acid di-p-toluil-D-tartaric pentru separarea enantiomerilor de narvedina, care apoi a fost redusă (34). Carroll, prin tratarea galantaminei racemic cu clorură de acid (-)-camfanic a observat formarea unui amestec de esteri ai galantamil-camfanatului sub formă de diastereoizomeri (35). Acești esteri pot fi separați prin HPLC sau prin recristalizare fracționată, apoi diastereoizomerii puri pot fi reduși la enantiomeri puri.

Prima sinteză de enantiomeri puri ai galantaminei a fost realizat de către Koga și colaboratori, care după o succesiune de reacții au reușit să sintetizeze (+)-galantamina. Pentru a sintetiza alcaloidul natural, (-)-galantamina, s-a modificat precursorul cu rest de pirocatechol în structură, prin adăugarea unui rest de pirogalol. Intermediarul a fost redus cu borohidrură de sodiu, a suferit o reacție de trifluoroacetilare, a fost selectiv hidrolizat și epimerizat până când s-a obținut compusul cu configurația identică la carbonii 4a și 12a ca și cei din produsul natural (36).

Metode de analiză

Încă de la început s-a dorit determinarea cantitativă a galantaminei din produsele vegetale. Primele metode utilizate în acest scop au fost cele imunologice și cele radioimunologice (37). Aceste metode au avut ca și avantaj major faptul că nu era necesară purificarea extractelor vegetale destinate analizei. Erau de asemenea foarte sensibile și precise, dar s-au dovedit laborioase și scumpe pentru că necesitau anticorpi specifici și utilizau substanțe radioactive. Utilizarea metodelor cromatografice a câștigat tot mai multă atenție, precum cromatografia în strat subțire (CSS), cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) cu detecție UV (38) sau prin spectrometrie de masă (MS), sau cromatografia de gaze cu detectori de ionizare în flacără, de nitrogen și fosfor sau MS (39). Cromatografia pe strat subțire de înaltă performanță (HPTLC) precum și electroforeza capilară (CE) în mediu neapos (40) au fost raportate mai recent pentru aceste determinări cantitative (41). Aceste metode de analiză utilizează cantități reduse de probă de material vegetal, de obicei între 50-500 mg, însă fiecare în parte prezintă anumite dezavantaje. Metodele cromatografice, cu excepția HPTLC, nu sunt întotdeauna întru-totul transferabile de la un laborator la celălalt și necesită anumite adaptări sau optimizări suplimentare. Necesitatea purificării avansate a extractelor încă în etapa de preprocesare a probelor, durata lungă de analiză și consumul crescut de solvenți organici pot face aceste metode scumpe și consumatoare de timp. Pe lângă aceste considerente, toate aceste metode de analiză necesită un standard analitic pentru determinări cantitative(42).

Galantamina a fost analizată de numeroși cercetători prin cromatografie în strat subțire (CSS). Berkov et al, în 2004 au adaptat o metodă cromatografică pentru plante cu conținut redus de alcaloizi, cum sunt și speciile de Galanthus (43).După realizarea extractului metanolic, acesta alături de standarde a fost aplicat pe plăci de silicagel 60 F254 (10×20 cm) cu un strat de adsorbant de 0,2 mm. Faza mobilă utilizată pentru separare a fost amestecul de cloroform/metanol/amoniac 25% în proporție de 12:1:0,5 v/v. Developarea s-a realizat pe o distanță de 80 mm. După developare, spoturile au fost vizualizate prin pulverizare triplă cu reactiv Dragendorff. S-a mai dezvoltat o metodă preparativă pentru separarea alcaloizilor, apoi aceștia să fie identificați prin tandemul GC/MS. În acest scop s-a utilizat o placă cromatografică de mărimea celei amintite anterior, însă grosimea stratului absorbant a fost de 2 mm. Faza mobilă a fost amestecul acelorași solvenți în proporție 11:1:0,6 v/v. Folosind developare simplă, distanța de migrare a fost de 160 mm. Fracțiile vizibile în UV la 254 nm au fost eluate cu metanol și au fost supuse analizei prin GC/MS pentru identificare. În urma acestor studii s-au raportat pentru prima dată noi alcaloizi, precum trisferidină, norlicoramină, crinină și maritidină(43). ***

În 2008, același grup de cercetători au analizat activitatea inhibitoare a galantaminei pe strat subțire. Ca și fază staționară au folosit plăci de silicagel pe aluminiu de tip F254 (10 x 20 cm x 0,1 mm). Faza mobilă A a fost amestec de acetat de etil/metanol/amoniac 25% (3:1:0,1 v/v), iar faza mobilă B a fost n-hexan/acetat de etil/metanol/amoniac 25% (3:3:1:0,1). Faza mobilă B a realizat o separare mai bună a compușilor nepolari din extract. Extractele de Galanthus nivalis, G. elwesii și Leucojum aestivum au arătat o activitate inhibitoare crescută asupra acetilcolinesterazei și la concentrații scăzute de 0,1 µg/mL. Într-un alt studiu s-a urmărit diferențierea speciilor Galanthus nivalis și G. elwesii prin combinarea CSS și GC/MS. Numeroși alcaloizi (37 la număr) din plante aparținând familiei Amaryllidaceae au fost eficient separați și rapid identificați prin metoda GC/MS. Douăzeci și cinci au fost găsiți în G. nivalis, iar șaptesprezece în G. elwesii. Aceste diferențe permit diferențierea celor două specii. Doar cinci alcaloizi s-au regăsit în ambele specii: hordeină, trisferidină, anhidrolicorină, licorină și incartină(44).

Galantamina, respectiv extractele din produse vegetale aparținând speciilor din familia Amaryllidaceae, au fost studiate de numeroși cercetători prin HPLC. Un exemplu, este articolul publicat de Lopez și colegii în 2002, prin care a fost realizată analiza extractelor de Narcissus confusus. Extractele metanolice au fost purificate prin extracție în fază solidă. Pentru separarea compușilor a fost utilizată o coloană cromatografică Kromasil 100 C18 (150 x 4 mm, d.i.:5 µm), faza mobilă a fost alcătuită din solvent A (apă : acetonitril 33:67 cu un conținut de 7 mM dodecilsulfat de sodiu, 25 mM fosfat de sodiu și 1 mM acetat de amoniu) și solvent B (metanol). Analizele au fost realizate în gradient, iar gradientul optim pentru separarea completă a picurilor a fost descoperit prin experimente. Debitul a fost cuprins între 0,7-0,9 mL/min. S-a testat liniaritatea curbei de calibrare, reproductibilitatea metodei, limita de detecție și cea de cuantificare. S-au identificat cinci alcaloizi: galantamina, N-formilnorgalantamina, hemantamina, homolicorina și tazetina. În extractul metanolic nu s-a putut identifica tazetina, de aceea, s-a tras concluzia, că acest compus nu este prezent în mod normal în extract, este doar un artefact al extracției, formânduse din transformarea pretazetinei. Chiar dacă metoda de extracție este una îngrijorătoare, metoda este convenabilă pentru determinarea galantaminei, care se regăsește în extract în procent de 91,3%. Metoda necesită cantități reduse de produs vegetal, cost relativ redus de solvenți, iar utilizarea extracției în fază solidă este benefică pentru eliminarea compușilor neutrii, care interferă derminarea cantitativă a alcaloizilor prin HPLC și pot afecta coloana cromatografică (45).

Cromatografia de gaze cu capilară (CGC), cuplată cu spectrometru de masă este foarte specifică și se poate utiliza pentru identificarea alcaloizilor din speciile din familia Amaryllidaceae. Prin această metodă a fost realizată separarea galantaminei de epigalantamină, chiar dacă diferența între timpii de retenție a celor doi compuși este foarte redus, de doar 44 s, și între indicii Kováts este de doar 49 de unități. Specificitatea metodei a permis identificarea și cuantificarea compușilor, fără suprapuneri de picuri, pentru că CGC are un avantaj major față de HPLC în separarea amestecurilor complexe de alcaloizi. Chiar și în CG apar suprapuneri de picuri între alcaloizi, ceea ce nu este de dorit, fiindcă afectează acuratețea determinării, dar detectorul MS a rezolvat această problemă, prezentând avantaj față de detectorul UV, cel cu ionizare in flacără (FID) sau detectorul cu nitrogen și fosfor. Indicii Kovats, respectiv timpul de retenție a galantaminei s-au observat să crească odată cu creșterea concentrației. Conținutul în galantamină diferă în diverse orgene, diverse specii, de aceea este necesară liniaritate pe un domeniu larg de concentrații. Sensibilitatea metodei permite și detectarea urmelor de galantamină din probe biologice, dacă este necesar. În urma utilizării metodei rezultatul obținut a fost că: galantamina este alcaloidul majoritar din Galanthus elwesii, cu un conținut de 0,213% din masa produsului vegetal uscat, dar și în frunzele de Z concolor (0,098%). S-a mai obervat că speciile de Leucojum crescute în sere au acumulat alcaloizi de tipul galantaminei, dar nu galantamină, cel puțin conținutul acesteia se află sub limita de detecție (46).

În 2010, Lubbe et al. au utilizat metabolomica de rezonanță nucleară magnetică (NMR) pentru a determina diferența metabolică, dacă există, între bulbii acelorași specii de Narcissus, crescute în diferite locuri, și pentru a identifica metaboliții care sunt resposnsabili pentru această diferență. Metabolomul reprezintă profilul unui metabolit care poate fi observat într-un organism, iar metabolomica este analiza calitativă și cantitativă a unui metabolom. Avantajul major al acestei tehnici este ușurința determinării cantitative a unui compus individual dintr-un extract brut. De asemenea, analiza este rapidă și non-distructivă, necesitând doar o cantitate redusă de produs vegetal. Rezonanța magnetică nucleară cantitativă (qNMR) nu necesită standard analitic pur pentru determinarea cantitativă. În plus, această metodă este fezabil pentru determinarea cantitativă a metabolitului care este al doilea ca și abundență, tot fără standard. În urma experimentelor realizate pe bulbii de Narcissus pseudonarcissus din Olanda (2 locuri diferite) și Marea Britanie s-a obținut rezultate asemănătoare între cuantificarea cu NMR și HPLC. S-a aplicat testul-t pentru rezultate și prin acesta a fost demonstrat că nu există diferență semnificativă între compoziția bulbilor de Narcissus. Totuși, conform rezultatelor HPLC și NMR cea mai mică concentrație de galantamină s-a obținut pentru bulbii din Noordwijk, Olanda(42).

Galantamina are activitate biologică de inhibiție a acetilcolinesterazei (AchE), de aceea se poate determina și prin metoda microplăcilor cu godeuri. Astfel, s-a introdus în godeuri acetilcolinesterează în soluție de tampon fosfat împreună cu extractul dizolvat în același tampon. S-a incubat 30 de minute la temperatura camerei, înaintea adăugării soluției substrat. Acesta a avut un conținut de fosfat disodic, DTNB și iodură de acetiltiocolină (ATCI). După ce s-a adăugat și soluția substrat s-a introdus placa în cititor de plăci și citirea s-a realizat la 405 nm după 3 minute. Activitatea enzimei s-a calculat în procent față de valoarea de referință obținută prin incubarea unui amestec fără inhibitor(47).

Metode de extracție

Galantamina se poate extrage în numeroase moduri din produsul vegetal.

O metodă de extracție convențională de alcaloizi presupune eliminarea succesivă a unor substanțe care nu prezintă interes și apoi a alcaloizilor dintr-un extract etanolic cu ajutorul solvenților organici după ce pH-ul a fost ajustat cu soluții acide sau bazice. Totuși aplicarea acestei metode pentru extracția alcaloizilor din bulbi proaspeți are două limitări. În primul rând, conținutul crescut de apă și de polizaharide îngreunează evaporarea etanolului. Pe de altă parte pot apărea variații în conținutul de apă în funcție de anotimp, vârstă, loc de păstrare, și astfel o comparație a conținutului de galantamină între diferite eșantioane de plante proaspete este dificilă. De aceea, de obicei se determină conținutul de galantamină din prodului vegetal uscat și se exprimă față de masa de produs vegetal uscat. Produsul vegetal (PV) uscat și mărunțit se tratează cu soluție diluată de acid, astfel evaporarea extractului primar a fost împiedicată, precum astfel se extrag o cantitate redusă de compuși lipofilici. Pentru a grăbi extracția se agită 2 ore pe un agitator. Polizaharidele care se extrag și formează o emulsie, pot fi eliminați prin centrifugare. Dacă se consideră că este necesară degresarea extractului acid, se degreseză cu solventul organic optim, dar dacă nu, se poate trece la etapa următoare, la alcalinizarea extractului și după etape succesive de extracție cu un solvent organic se obțin fragmente de alcaloizi care se analizează direct sau se evaporă solventul organic și se reia cu altul(48).

În 2004, Berkov și colaboratorii au utilizat metoda mai sus amintită, agitând produsul vegetal cu o soluție de 3% de acid sulfuric timp de 2 ore. După care au centrifugat amestecul, iar supernatantul a fost alcalinizat cu amoniac concentrat la pH 10-11. Soluția apoasă a fost pusă pe o coloană de extracție, pentru a evita formarea de emulsie și galantamina a fost eluată cu diclormetan. Extractul, pentru eventualele urme de apă, a fost tratat cu Na2SO4 anhidru, apoi evaporat la sec, și reziduul a fost dizolvat în metanol (43). O altă metodă de extracție a fost testată de acești cercetători, care presupune punerea în contact a produsului vegetal uscat și mărunțit cu un volum de metanol, timp de 12 ore. După aceea se evaporă extractul la sec și reziduul se dizolvă în soluție diluată (2%) de acid sulfuric. Soluția acidă se degresează de trei ori cu eter etilic. Soluția apoasă rămasă se alcalinizează cu amoniac concentrat și apoi se extrage galantamina cu acetat de etil de trei ori. În acest caz se păstrează faza organică, se colectează fragmentele și se evaporă la sec. Apoi extractul se dizolvă în metanol pentru a fi analizat(49). Tot acest grup de cercetători au utilizat o metodă asemănătoare cu mici modificări. Au utilizat produs vegetal proaspăt și l-au pus în contact cu etanol timp de 72 de ore. Solventul a fost evaporat sub vid și reziduul a fost dizolvat în soluție diluată de acid sulfuric. Degresarea extractului a fost realizat tot cu eter etilic, la fel și alcalinizarea cu amoniac 25%, însă pentru extracția galantaminei a fost utilizat cloroform. De asemenea, după evaporarea solventului organic, rezuduul a fost dizolvat în metanol(44). Într-un alt articol apare o altă metodă, care nu mai presupune extracția compușilor totali și apoi degresare și extracția alcaloidului. Conform acestei metode, produsul vegetal uscat și pulverizat a fost macerat cu acid sulfuric 2% timp de 6 ore într-o baie cu ultrasunete la 40°C. Extractul a fost alcalinizat cu amoniac 20%, centrifugat și purificat cu coloane Isolute HM-N(50) (coloane de polipropilenă cu diatomită modificată). Aceste coloane s-au utilizat pentru extracție lichid-lichid, fiind mai ușor de automatizat, față de extracția lichid-lichid convențională. Alcaloizii au fost eluați cu acetat de etil. Solventul organic s-a evaporat sub vapori de azot. Extractul uscat obținut, ca și în celelalte cazuri, a fost dizolvat în metanol, pentru analize(51).

Lopez et al. au extras galantamina din produsul vegetal de Narcissus, prin macerare cu metanol timp de 24 de ore, la temperatura camerei în baia cu ultrasunete, unde amestecul a fost sonicat 30 minute la fiecare 8 ore. Extractul primar a fost centrifugat, apoi a fost depus pe coloană umplută cu octadecil, condiționat în prealabil cu metanol și apă. Astfel pe coloană au fost reținute compușii nepolari. Galantamina a fost eluată cu metanol și folosit ca atare pentru analize sau evaporat la sec sub presiune scăzută și reluată cu tampon fosfat (47, 52).

Torras-Claveria et al. au folosit metoda de extracție cu macerare cu metanol a produsului vegetal uscat și mărunțit, dar au redus timpul de contact între cele două faze la 2 ore. O altă modificare este aducerea amestecului la pH=8. Extractul se acidulează cu acid sulfuric 2% și se degresează cu diclormetan, după care faza apoasă se alcalinizează și se extrage galantamina cu cloroform. Evaporarea la sec a extractului primar a fost realizat sub atmosferă de azot. Ca și noutate s-a folosit un standard intern, codeina, astfel se poate evalua randamentul extracției alcaloidului de interes, și se poate realiza o corecție în determinarea lui cantitativă (38).

Extracția cu fluide supercritice (EFS) este o metodă de extracție modernă cu tot mai multe aplicații atât în industria farmaceutică, cât și în industria alimentară. Procesul se bazează pe utilizarea unui fluid supercritic cu proprități fizico-chimice între lichid și gaz. Starea supercritică apare la o temperatură și presiune peste punctul critic vapori-lichid. Fluidul supercritic are putere crescută de pătrundere în materia primă, vâscozitate și tensiune superficială redusă, iar analitul posedă o rată de difuzie mare în acest tip de fluid. În prezent cel mai frecvent se utilizează CO2 pentru EFS. Avantajele dioxidului de carbon sunt: se găsește din abundență în natură, nu este toxic, nu este inflamabil, are parametrii critici ușor de obținut (Tc=31,1 °C, Pc=72 bar), este ecologic și ieftin. Cu aceste proprietăți dioxidul de carbon se poate folosi și pentru extracția subtanțelor termolabile.

Datorită faptului că sinteza galantaminei este lungă și cuprinde multe etape, ar fi foarte util să se dezvolte o metodă alternativă care să fie ecologică, ieftină și sigură pentru a putea acoperi nevoile pieței cu un produs de calitate la preț convenabil. Extracția cu fluide supercritice este un proces selectiv și eficient pentru extracția compușilor naturali din matrice.

Rachmaniah și colaboratorii au dezvoltat o metodă de extracție din bulbii de Narcissus pseudonarcissus. Au utilizat bulbi uscați prin liofilizare și produsul vegetal mărunțit a fost separat în trei grupuri în funcție de mărimea particulelor: >1000 µm, 53-1000 µm și 25-53 µm. Extracția galantaminei a fost realizat la valori ale temperaturii și presiunii diferite: 40°C, 50°C și 70°C, respectiv 150 bar, 200 bar și 220 bar, asfel a rezultat nouă valori ale densității. Aproximativ 5 g de produs vegetal a fost utilizat pentru fiecare experiment, și fiecare extracție a fost repetată de 3 ori. Extracția a durat 3 ore.

Pregătirea materialului vegetal pentru extracție a fost realizat în mai multe feluri. Această pregătire este necesară pentru că galantamina, fiind un alcaloid bazic, se găsește în materialul vegetal sub formă de săruri. Pentru a o putea extrage în dioxid de carbon este necesară deplasarea ei din săruri, aducerea ei în starea pură de bază. A fost testat un pretratament care consta în umectarea pulberii cu 0%, 10%, 30% sau 40% apă față de masa materialului uscat. Pe lângă apă sau folosit soluții alcaline: soluție de bicarbonat de sodiu, amestec de dietilamină-apă, dietilamină-metanol, dietilamină sau amoniac 25%. Acestea au fost aplicate pe pulberi și materialul obținut după umectare cu orice soluție a fost menținut 12 ore în congelator în saci de plastic. Înainte de extracție materialul a fost păstrat la temperatura camerei pentru a ajunge la acea temperatură.

Polaritatea dioxidului de carbon este asemănătoare cu cea al hexanului, de aceea pentru a crește tăria solventului și pentru a favoriza solubilizarea unor substanțe în acesta este necesară adăugarea unor cantități reduse de solvent polar, denumit și modificator. Acesta modifică puțin și densitatea ”solventului de extracție”. De asemenea în funcție de solventul polar ales se modifică constanta dielectrică, posibilitatea de a forma legături de hidrogen sau vâscozitatea lichidului de extracție (53). Astfel că pentru extracție s-a utilizat ca modificator metanolul. Acesta a fost introdus în extractor împreună cu dioxidul de carbon printr-o valvă care a permis reglarea debitului.

După extracție și cuantificarea rezultatelor s-a ajuns la concluzia că din bulbii liofilizați nu se poate extrage cantitatea de galantamină care se poate extrage din bulbii proaspeți. În toate condițiile testate de Rachmaniah și colaboratori cantitatea de galantamină extrasă cu dioxid de carbon supercritic este mai redusă decât în cazul extracției cu etanol. S-a mai observat că umectarea cu soluție alcalină apoasă ajută mai mult la extracție decăt amestecurile între metanol și baze. Umectarea dublă cu soluții alcaline nu a adus un beneficiu major în randamentul de extracție, dar s-a observat apariția în extract a altor alcaloizi, precum epinorgalantamină sau hemantamină. Tratarea produsului vegetal cu soluție apoasă de bicarbonat de sodiu a dus la extracția galantaminei și O-metillicoreninei, nu și a celorlalți alcaloizi. Totodată cel mai bun randament a fost obținut la extracția galantaminei din produsul vegetal mărunțit la dimensiunile 53-1000 µm, fiindcă o mărime mai redusă a particulelor duce la o suprafață de contact mai extins, totuși particulele cu mărime foarte mică nu sunt favorabile fiindcă se pot agrega și înfunda vasul de extracție sau pot fi eliminați din patul de extracție, datorită presiunii crescute a solventului. Între particulele mari și solvent, se formează interacțiuni ineficiente pentru extracție, cantitatea de galantamină extrasă fiind 1-19 µg/g, față de 8-24 µg/g (mărimea particulelor 53-1000 µm) sau 6-19 µg/g pentru particule cu mărimea 25-53 µm. De asemenea în articolul citat a fost observat o creștere a randamentului de extracție a galantaminei cu creșterea densității fluidului supercritic consecutiv cu creșterea presiunii de la 200 la 220 bari la temperatura de 40 °C. Cea mai bună extracție a fost realizată la presiune de 220 bar, 70°C și din materialul umectat cu amoniac 25%, ceea ce arată importanța alcalinizării înainte de extracția galantaminei din matrix vegetal(54).

Datorită faptului că există o cantitate limitată de material vegetal s-au realizat culturi in vivo de Leucojum aestivum. În urma obținerii acestor culturi cantitatea de galantamină a fost extrasă prin metode asemănătoare cu cele pentru produsul vegetal. Pentru extracția alcaloidului intracelular s-a utilizat o cantitate de biomasă liofilizată, pusă în contact cu metanol în baia cu ultrasunete timp de 15 minute. Extractul metanolic a fost evaporat la sec sub vid, reziduul a fost dizolvat în acid sulfuric 3%, soluția degresată cu eter etilic, iar după alcalinizare cu amoniac 25% alcaloizii au fost extrași cu cloroform. Alcaloizii extracelulari au fost extrași după prealabila concentrare a mediului de cultură. Reziduul obținut a fost dizolvat în metanol, iar după centrifugare și separarea granulelor supernatantul a fost evaporat la sec. Reziduul astfel obținut a fost dizolvat în acid sulfuric 3% și prelucrat în modul precizat anterior (55).

Proprietăți farmacologice

Mecanismul de acțiune: Galantamina inhibă reversibil și neselectiv acetilcolinesteraza. Pe lângă acesta modulează alosteric receptorii nicotinici pre- și postsinaptici în sens pozitiv.

Proprietăți farmacocinetice: Absorbția, după administrarea orală este una aproape completă, iar după 1-2 ore de la administrare se atinge concentrația plasmatică maximă. Timpul de înjumățire este de 6 ore. Galantamina nu se leagă de proteinele plasmatice, prin această proprietate se diferențiază cel mai bine de ceilalți reprezentanți ai clasei inhibitorilor de acetilcolinesterază. Metabolizarea galantaminei se realizează la nivel hepatic sub acțiunea enzimelor din complexul CYP450, rezultă metabolitul O-demetilat care este de trei ori mai activ decât compusul părinte. Excreția renală este cel majoritară la această substanță medicamentoasă.

Indicația terapeutică este tratamentul formelor ușoare și moderate de Alzheimer.

Reacțiile adverse: După administrarea galantaminei pot apărea reacții adverse gastrointestinale (greață, vomă, diaree, crampe abdominale) sau la nivelul sistemului nervos central (stări confuzionale, depresie, agitație).

Interacțiuni medicamentoase: În primul rănd medicația anticolinergică interferă cu mecanismul galantaminei, deoarece aceste medicamente blochează transmisia colinergică, în timp ce galantamina blochează enzima care degradează acetilcolina, mediatorul transmisiei colinergice, astfel că este stimulată transmisia colinergică. O altă interacțiune poate apărea cu antiinflamatoarele nesteroidiene care irită mucoasa gastro-intestinală, de aceea pacienții care pe lângă tratamentul cu galantamină folosesc și medicamente din această clasă trebuie să fie atent monitorizați, astfel vor fi evitate hemoragiile digestive. Succinilcolina, un relaxant muscular, va prezenta un timp de acțiune mai lungă dacă se asociază cu galantamina, pentru că este inhibată enzima care o metabolizează.

Posologia: începerea tratamentului se realizează cu o doză de 8 mg/zi, iar după 4 săptămâni această doză poate fi crescută la 16 mg/zi. După alte 4 săptămâni se poate ajunge și la 24 mg/zi, dacă este nevoie (56).

Plante cu conținut de galantamină

Familia Amaryllidaceae, face parte din ordinul Liliales, subclasa Liliidae, clasa Liliatae (Monocotyledonatae). Reprezentanții clasei sunt răspândite în zona temperată până în cele subtropicale și tropicale. La noi cele mai întâlnite sunt: Galanthus nivalis L., Leucojum vernum L., Leucojum aestivum L., Narcissus poeticus L. și N. psudonarcissus L. Toate sunt plante cu bulbi (23). Tulpinile aeriene sunt erbacee și nefoliate, scapoide, frunzele sunt liniare bazale. Florile sunt pe tipul 3, hermafrodite, actinomorfe, rar zigomorfe. La bază, florile sunt protejate de hipsofile. Fructul este reprezentat de o capsulă. Endospermul semințelor este bine dezvoltat(23).

Galanthus nivalis, ghiocelul, este o specie perenă, cu bulbul al cărui frunze protectoare se acoperă complet (57), vernală și criofilă (înflorește chiar sub zăpadă), prezinte două frunze liniare, care cresc direct din rădăcină, tulpina este dreaptă, prezintă o singură frunză și floare. Floarea este nutantă, cu perigon alb, tepalele externe sunt mai mari și în număr de trei, iar cele interne sunt mai mici și tot în număr de trei. Ovarul trilocular (57) prezintă o așezare inferioară, fructul este o capsulă. Pădurile de foioase reprezintă locul de răspândire a speciei, iar timpul de înflorire este primăvara de timpuriu (57). Partea aeriană, Nivalis herba, conține alcaloizi, în procent de 0,05-0,08 %, unde predomină galantamina, dar și alți alcaloizi precum tazetina, licorina, hemantamina și nivalidina (23). Bulbii sunt utilizați predominant, pentru conținutul lor de galantamină, un alcaloid care este indicat în sechelele poliomielitei, în hemiplegii și hemipareze sau în hemoragii cerebrale (58), dar mai nou se utilizează în boala Alzheimer (2, 19).

Leucojum vernum, cu denumirea populară de ghiocei bogați sau luște, prezintă flori mari, ceea ce îl deosebește de ghiocel (57). Se găsește frecvent prin tufișuri, pajiști, lunci. Este de înălțime de 10-15 cm. Floarea are formă de clopot de culoare albă, marginea având culoare verde. Tepalele externe sunt concrescute. În compoziția bulbului se găsește galantamină, homolicorină și licorină (23).

Narcissus poeticus, narcisă, este o plantă ornamentală, perenă. Tulpina este scapiformă, frunzele bazale, în număr de 2-4 sunt liniare. Florile sunt odorate, albe, dar pe margine prezintă o coronulă portocalie, se mai numește și paracorolă. Conțin glicozide ale izoramnetolului și alcaloizi de tip narcisină (23). Ovarul este înconjurat de o spată membranoasă. În bulbii plantei se regăsește alcaloidul galantamină alături de fiancină, hemantamină, homolicorină, licorenină, licorină, nercisamină, narcisidină, pluviină, tazetină (23).

Narcissus pseudonarcissus, narcisa galbenă, este tot o plantă ornamentală, perenă. Se deosebește de N. poeticus prin culoarea florii, în acest caz florile sunt galbene (58).

Cromatografia în strat subțire

Cromatografia reprezintă o metodă de analiză în care o fază mobilă trece printr-o fază staționară pe care se aplică un amestec, astfel că se separă componentele amestecului. Termenul de ”cromatografie în strat subțire”, ce a fost introdusă în 1956 de către E. Stahl, înseamnă că procesul de separare are loc pe un strat supțire aplicat pe un suport solid. Face parte din tehnica cromatografiei planare, alături de cromatografia pe hârtie, care este tot mai rar utilizată.

Rezultatul separării se exprimă prin valoarea Rf (factor de reținere).aceasta se obține prin împărțirea distanței parcursă de substanța de interes cu distanța parcursă de faza mobilă. Distanța se măsoară de la linia de start, marcat de obicei la 1 cm de la baza plăcii, până la mijlocul spotului care conține substanța de interes, respectiv până la 1-1,5 cm de la vârful plăcii, numit și linia de front.

Rf= a/b

Unde,

a-distanța de la linia de start până în centrul zonei cu substanța de interes

b-distanța de la linia de start până la linia de front

Valoarea Rf-ului este întotdeuna un număr subunitar (≤1), dar a fost considerat a fi deranjant în laboratoarele de rutină scrisul unui zero, urmat de virgulă, de aceea s-a introdus hRf-ul, care este valoarea Rf-ului înmulțit cu 100, astfel se obține un număr întreg. Pentru determinarea unor impurități se exprimă hRf-ul printr-un interval, unde prima valoare se obține din valoarea distanței la începutul zonei cu impuritatea de interes, iar a doua din cea de la partea superioară a zonei cu impuritate.

Faze staționare

Demult, fazele staționare erau confecționate în laboratoarele în care se realiza și separarea cromatografică, după proceduri de lucru. Trebuia pregătită o pastă de fază staționară, depusă apoi pe un suport solid, și după uscare placa se folosea pentru analize.

În prezent, pregătirea ”acasă” a fazei staționare numai este o opțiune pentru laboratoarele farmaceutice, oficinale sau celor din industrie. Toate acestea folosesc plăci cromatografice care se găsesc pe piață, pentru a obține rezultate de înaltă calitate și pentru a nu pierde mult timp cu pregătirea plăcilor.

Conținutul fazei staționare s-a schimbat de-a lungul anilor. La început s-a încercat folosirea oxizilor de aluminiu, silicat de aluminiu, carbonat de calciu, caolin, oxid de magneziu, amidon, zahăr mărunțit. Însă după ce s-a obținut silicagelul poros fin divizat a crescut mult utilizarea cromatografiei în strat subțire. Silicagelul 60 este și în prezent des folosit, cifra care urmează în denumirea fazei staționare reprezintă mărimea medie a diametrului porilor în Angstromi (10 A= 1 nm). Eficiența separării este determinată de mărimea medie a particulelor, a distribuției lor în faza staționară, precum și de agentul de adsorbție folosit pentru prepararea stratului adsorbant. Pentru o calitate crescută în cazul cromatografie în strat subțire (TLC, CSS) mărimea medie a particulelor este 11 µm, pentru cromatografia în strat subțire de înaltă performanță (HPTLC) mărimea medie a particulelor este bine să fie de 5 µm, iar pentru cromatografia preparativă această valoare este undeva peste 20 µm. Forma particulelor este de asemenea importantă. Obținerea unor straturi alcătuite din particule sferice îmbunătățest eficiența separării, față de particulele cu formă neregulată. Utilizarea agenților de adsorbție noi cu notațiile RP-8, RP-18 sau NH2 indică adsorbanți modificați, dar se bazează pe un matrice de silicagel. RP- înseamnă fază inversă și cifra indică lungimea lanțului de hidrocarbură folosită pentru modificare, iar indică faptul că s-a introdus un rest amino la sfârșitul lanțului, care oferă fazei staționare o funcție slabă alcalină. CHIR reprezintă o fază staționară care are grupări chirale și se pretează pentru separarea compușilor optic activi.

Straturile de adsorbanți pot fi depuse pe suport de sticlă, folie de aluminiu, film de tereftalat, sau fibră de sticlă. În cazul în care se dorește supunerea fazei staționare la o serie de etape succesive, precum prespălare, activare, developare, vizualizarea spoturilor și/sau încălzire, suportul cel mai robust s-a dovedit a fi cel de sticlă, fiind indicat în determinări cantitative. Foliile de aluminiu sunt utilizate pentru determinări calitative la preț redus, acestea ocupă puțin spațiu, se pot tăia repede și cu ușurință la dimensiunea dorită și sunt ușoare. Acestea însă nu tolerează fazele mobile cu conținut de acizi tari sau nu se pot menține ore în șir la vapori de iod.

Aditivii adăugați la stratul adsorbant au roluri diferite. În primul rând pentru a menține stratul absorbant pe suportul solid se adaugă cantități mici de lipici, dar acesta nu are influență asupra cromatografiei. În plăcile dezvoltate de Merck pentru cromatografie în strat ultrasubțire (UTLC)acest aditiv lipsește. Un alt aditiv poate fi indicatorul de fluorescență. Dimensiunea acestor particule nu poate depăși dimensiunea particulelor adsorbantului. Aceste substanțe prezintă fluorescență galben-verzuie la iradiere cu lumină UV de lungime de undă joasă (λ=254 nm), sau cele cu stabilitate ridicată la acizi emit radiații albastre slabe. Astfel de plăci, care conțin acești indicatori după separare vor apărea fluorescente, iar componenții amestecului separat vor apărea ca și puncte opace.

Cromatografia în strat subțire poate fi utilizată pentru determinarea identității unei substanțe, determinarea purității ei sau pentru determinarea ei cantitativă sau combinație între aceste trei. O placă poate fi developat unidimensional, sau cu un cost scăzut, separarea se poate realiza bi- sau multidimensional cu ajutorul unor faze mobile diferite.

Alegerea fazei staționare este o etapă dificilă mai alest pentru utilizatorii noi, fără experiență. Este necesară cercetarea literaturii înainte de efectuarea unor analize propriu-zise, și în funcție de informațiile găsite în literatura de specialitate se încearcă o fază staționară, de obicei silicagel 60 pe folie de aluminiu la început. În funcție de ce se obține se pot încerca alte faze staționare.

Dacă se compară o placă de silicagel 60 pentru utilizare TLC și una pentru HPTLC, cu același fază mobilă, diferența majoră este reducerea importantă a timpului de analiză. Pentru carbamazepină timpul de migrare pe o distanță de 10 cm pe placa TLC a fost de 21 de minute, iar de distanță de 7,5 cm pe placa HPTLC a fost de 16 minute. Pentru valoarea Rf s-a obținut o valoare mai mare pentru placa HPTLC. Pentru această placă timpul de migrare a fazei mobile pe o distanță egală a fost mai mare față de placa TLC, aceasta explică și valoarea crescută a Rf-ului. Pe placa HPTLC componentele amestecului apar ca și zone compacte, bine separate, pe placa TLC nu s-a realizat o separare la fel de bună. Acest exemplu confirmă îmbunătățirea eficienței separării prin trecerea de la plăci pentru TLC la cele HPTLC (59).

Faze mobile

Alegerea fazei mobile este foarte importantă pentru separările cromatografice. De obicei faza mobilă este alcătuită din mai mulți solvenți , foarte rar dintr-unul singur, de aceea mai poartă numele de sistem de solvenți. Amestecul de solvenți trebuie să fie omogen, solvenții să fie miscibili între ei. Rolul fazei mobile este unul multiplu: dizolvă componentele amestecului, transportă acestea dea-lungul fazei staționare pentru a fi separate, determină valoarea Rf-ului și selectivitatea ei este importantă față de componentele din amestec, pentru realizarea separării. Faza mobilă trebuie să îndeplinească unele condiții: să aibă puritate avansată, stabilitate adecvată, vâscozitate scăzută, partiție izotermică liniară, presiunea vaporilor să nu fie nici prea mică, dar nici prea mare, toxicitatea să fie redusă. În acest amestec de solvenți pot fi solvenți cu polaritate diferită, iar în cazul fazei staționare polare, compușii polari vor fi concentrați în apropierea liniei de start, cei nepolari vor fi concentrați lângă linia de front.

Înainte de a încerca utilizarea numeroaselor amestecuri de solvenți este bine să se facă o cercetare bibliografică. Uneori farmacopeile sugerează un sistem de solvenți, sau se pot găsi informații în publicațiile de specialitate. Totuși uneori aceste informații nu se pot folosi pentru că solvenții sugerați sunt foarte toxici, ex. benzenul. În TLC se pot folosi în amestecul de solvenți substanțe cu caracter bazic, cu obținerea rezultatelor reproductibile. Stratul adsorbant este afectat de pH-ul mediului, însă nu are o importanță majoră, deoarece acesta este utilizat doar o singură dată, față de HPLC, unde coloana cu faza staționară este de multe ori reutilizată. În cazul alegerii între două sisteme de solvenți cu putere de eluție asemănătoare, se va alege aceea care are vâscozitatea mai mică.

După ce se determină polaritatea substanței se poate orienta și tipul de sistem de solvenți care se va alege. Pentru substanțele nepolare se va utiliza sistem de solvenți nepolari, iar metoda va fi cromatografie de absorbție, și pentru substanțele polare se alege un amestec de solvenți polari, metoda fiind cromatografie de partiție.

Dacă în literatură se recomandă utilizarea solvenților carcinogenici sau foarte toxici (benzen, piridină) se caută alternative la acestea după consultarea cu îndrumătorul.

Este foarte important faptul că un sistem de solvenți nu se reutilizează după păstrarea îndelungată în recipiente din sticlă. Experimentele în conformitate cu RBP de laborator trebuie să respecte că sistemele de solvenți se folosesc o singură dată, nu se ermite reutilizarea pentru mai multe analize. Excepția de la regulă este sistemul monocomponent, care este foarte rar utilizat în TLC. Pentru descurajarea reutilizării sistemului de solvenți s-a realizat un experiment cu clorhidratul metoclopramid. Sistemul de solvenți a fost: cloroform:metanol:amoniac concentrat (56:14:1 V/V). S-a utilizat același amestec de solvenți pentru patru plăci succesive. S-a observat la placa a doua, a treia și a patra că s-a redus semnificativ valoarea hRf-ului față de valoarea pe placa anterioară, totodată zonele cu metoclopramid au fost tot mai sterse, cu o coadă tot mai vizibilă. Aceste rezultate se datorau reducerii cantității de amoniac din amestecul de solvenți.

Amestecul de solvenți se introduce în camea de developare. Acestea sunt foarte variate și în funcție de modul de developare, care poate fi ascendentă, descendentă sau circulară. Mai diferă și prin materialul din care sunt fabricate, preț și rezultatul obținut în aplicații din diverse domenii. Camerele de developare ascedente sunt confecționate din sticlă, iar capacul este din sticlă sau oțel inoxidabil, iar cele descendente sunt din politetraflouroetilenă (Teflon) cu capac din sticlă (59).

Aplicații

Cromatografia în strat subțire poate fi utilizată în industria farmaceutică, în biochimie, în diverse ramuri ale chimiei, în cosmetologie, în analiza alimentelor, mediului, substanțelor anorganice, dar acest interes a scăzut semnificativ după apariția și dezvoltarea HPLC-ului. Totuși CSS-ul, fiind metodă rapidă, ieftină, accesibilă și nu necesită o aparatură complicată a rămas o metodă utilizată. Separarea cromatografică pe strat subțire se poate utiliza pentru molecule diverse: aminoacizi, peptide, proteine, antibiotice, carbohidrați, lipide, pigmenți naturali, pesticide, medicamente, acizi nucleici și derivații, steroizi, vitamine hidrosolubile și liposolubile, toxine (60).

Aplicații în industria farmaceutică

În industria farmaceutică metodele cromatografice sunt intens folosite, chiar dacă interesul a scăzut semnificativ pentru crosmatografia în strat subțire, se utilizează frecvent cromatograia de lichide de înaltă performanță. Însă în laboratoarele mici, este foarte ușor de realizat o separare CSS, dacă există un echipament de bază. Însă pentru a crește precizia, reproductibilitatea separării este nevoie de o aparatură mai avansată, iar pentru determinare cantitativă este necesară evaluarea densitomentrică.

Cromatografia în strat subțire are o utilizare largă în analiza farmaceutică ca și tehnică standard, pentru identificarea rapidă și precisă a materiilor prime, produșiilor finali, sau pentru controlul purității a materiilor prime sau produselor. În cazul determinărilor cantitative a pierdut mult din utilizarea sa, un număr redus de metode oficinale se găsesc în farmacopei, și acelea se bazează pe tehnica de eluarea a spotului.

În industrie, situație este diferită, pentru că aparatura s-a dezvoltat și se utilizează plăci HPTLC, evaluarea este densitometrică. Se utilizează ca și metodă complementară la HPLC în fază inversă, pentru analiza purității materiilor prime sau pentru testarea stabilității (60).

Partea experimentală

Materiale și metode

Reactivi și solvenți

Reactivii folosiți au fost de puritate analitică. Bromhidratul de galantamină, de puritate 0.997 mg/mg a fost achiziționat de la USP Rockville, MD, USA. Solvenții utilizați au fost achiziționați de la diverși furnizori, după cum urmează: metanolul de la Promochem, India; cloroform de la Merck, Germania; amoniac 25% de la Silal Trading S.R.L., România. Pentru extracția galantaminei din produsele vegetale s-a utilizat metanol de puritate 99,8% de la Sigma Aldrich, France; cloroform de la Chimreactiv SRL, România; acidul sulfuric 2N și amoniac 25% de la Chimopar, România. Reactivul Dragendorff a fost preparat conform rețetei de preparare nr. 131 (61). Reactivii folosiți pentru preparare: nitrat bazic de bismut (III) și iodură de potasiu de la Merck, Germania și acid L(+)tartric de la Reactivul, România. La prepararea soluției apoase s-a folosit apă deionizată (18 mΩ) produsă de un sistem de purificare al apei Barnstead EasyPure RoDi, (Barnstead, Thermolyne, SUA).

Produse vegetale

Produsele vegetale utilizate sunt bulbii de la speciile: Galanthus nivalis, Leucojum vernum, Narcissus poeticus și N. pseudonarcissus. Acestea au provenit din culturi de pe câmpurile experimentale ale Universității de Științe Agricole și Medicină Veterinară din Cluj Napoca (USAMV). Am mai utilizat bulbi de Galathus nivalis din culturi dintr-o grădină din Bicalatu, jud. Cluj. Bulbii recoltați au fost uscați la temperatura camerei și au fost mărunțiți.

Aparatură

Pentru a realiza separarea extractelor s-au utilizat plăci pentru CSS comerciale Kieselgel 60 (Merck) de două dimensiuni : 20×10 cm și 5×10 cm.

Aplicarea eșantioanelor a fost realizată cu aplicatorul automat Desaga AS30, la 1 cm de la baza plăcii, în bandă de 5 mm și cu distanța între benzi de 9 mm. Instrumentului i-a fost montată o seringă Hamilton de 10 µL. Echipamentul folosește metoda ”spray-on”, prin care un jet de aer comprimat transportă soluția de aplicat de pe vârful acului de injectare pe placa cromatografică fără niciun contact direct între ei. Aplicatorul este conectat la un autosampler, unde se așează vial-urile cu soluțiile care se doresc a fi aplicate și solvenții pentru spălare. Aplicarea devine complet automată, se concepe o metodă prin care se stabilesc toți parametrii încă de la început, iar după apăsarea butonului EXE, se începe printr-o spălare, după care începe derularea metodei. Turnul în care este fixată seringa Hamilton se mișcă dea-lungul plăcii cromatografice și aplică soluțiile (59).

Developarea plăcilor a avut loc în camere de developat DESAGA verticale, duble, după 15 minute de presaturare.

Pulverizarea cu reactiv Dragendorff s-a realizat cu ajutorul unui pulverizator Desaga Sprayer SG1 (Germania). Acesta generează un jet de aerosol ultrafin, cu diametru picăturii de 15-20 μm.

Imaginea plăcilor s-a realizat cu un aparat de fotografiat Nikon COOLPIX S220.

Descrierea metodei

Extracția galantaminei din produsele vegetale s-a realizat utilizând în principal două metode. În primul rând, am utilizat o metodă de extracție selectivă pentru galantamină (43). Metoda 1 de extracție: 50 mg din materialul vegetal, uscat și mărunțit, a fost extras cu 3 mL de acid sulfuric 3%, prin agitare timp de 2 ore la temperatura camerei, cu un agitator automat. După agitare și centrifugare, supernatantul a fost separat. A urmat alcalinizarea extractului brut cu amoniac concentrat până la pH=10-11. După alcalinizare s-a realizat o extracție lichid-lichid obișnuită cu diclormetan, iar după separarea celor două faze, faza organică a fost anhidrificată cu ajutorul sulfatului de sodiu anhidru, apoi evaporată la sec. Reziduul a fost redizolvat în 100 µL de metanol și a servit ca și extract pentru analize. Această metodă a avut ca și punct critic spargerea emulsiei formate în timpul extracției soluției de acid sulfuric cu diclormetan. Pentru spargerea emulsiei s-a încercat adăugarea de fază organică, dar nu a dus la rezultatul scontat. Am mai încercat creșterea cantității de material vegetal folosit pentru extracție la 500 mg, și am utilizat o cantitate de metanol necesar să acopere cantitatea de substanță uscată, de 10 mL. Am încercat preconcetrarea extractului, și aplicarea extractului concentrat.

O altă metodă pentru obținerea extractelor a fost una generală care utilizează metanol (62). Tehnica a fost puțin modificată, s-au crescut cantitățile pentru extracție, astfel metoda 2 de extracție: 500 mg de produs vegetal a fost extras cu 10 mL metanol timp de 12 ore la temperatura camerei. După ce a trecut timpul necesar amestecul a fost centrifugat, iar supernatantul a fost separat și evaporat la sec. Reziduul a fost reluat cu 3 mL de acid sulfuric 1%. Acest extract brut a fost supus procesului de purificare și degresare cu câte 3 mL de cloroform de trei ori, faza apoasă păstrându-se. Alcalinizarea cu amoniac concentrat a fost următoarea etapă, după care s-a realizat extracția alcaloizilor cu câte 3 mL de cloroform de trei ori. Fracțiunile obținute s-au amestecat și tot solventul organic s-a evaporat la sec. Extractul uscat a fost dizolvat în 200 µL metanol, și folosit pentru analiza cromatografică.

După ce extractele au fost pregătite, acestea au fost testate din punct de vedere calitativ pe plăci de 5×10 cm. După ce acestea s-au dovedit a fi bune a fost realizată determinarea cantitativă pe plăci de 20×10 cm, unde au fost aplicate 2 seturi de standarde între 750 ng/spot și 4000 ng/spot și cele patru extracte din Galanthus nivalis, Leucojum vernum, Narcissus poeticus, N. psudonarcissus. Standardele au fost aplicate în volume crescânde din soluție metanolică de bromhidrat de galantamină de concentrație 0,5 mg/mL. Extractul de Galanthus nivalis a fost aplicat în volum de 5 µL, iar celelalte extracte, datorită conținutului mai redus de galantamină, în volum de 10 µL.

Pentru developare, dintre multitudinea de faze mobile amintite la metodele de analiză a galantaminei am ales cea care este alcătuită din: cloroform:metanol:amoniac conc.=11:1:0,6. S-a menținut amestecul în camera cromatografică 15 minute, pentru a satura aceasta cu vaporii amestecului de eluenți, după care prin înclinarea camerei s-a transferat o parte din amestecul de solvenți în zona unde a fost poziționată placa. Separarea a durat aproximativ 13 minute. La developare s-a observat că la reutilizarea amestecului de solvenți spoturile au fost mult mai aproape de linia de start, nu mai migrau până la locul unde apăreau în cazul developării cu fază mobilă proapăt preparată. Am considerat, de aceea, că pregătirea unei faze mobile proaspete este obligatorie pentru fiecare analiză.

După ce a avut loc separarea, placa a fost uscată în flux de aer cald. Apoi a fost pulverizată de două ori cu reactiv Dragendorff pentru vizualizarea spoturilor de alcaloizi, în acest caz, a galantaminei. Între cele două pulverizări placa a fost uscată în flux de aer cald.

Aprecierea cantitativă a galantaminei ȋn extracte s-a făcut prin convertirea imaginilor de înaltă rezoluție ale plăcilor cromatografice obținute, în densitate optică (de pixeli) și ulterior în cromatograme. Cromatogramele astfel obținute au fost integrate în vederea determinării ariilor spoturilor corespunzătoare galantaminei separate și cuantificării acesteia din probele vegetale luate în studiu.

Imaginea plăcilor cromatografice după derivatizare și uscare (Figura 1.) au servit la obținerea cromatogramelor. Softul UN-SCAN-IT gel (Silk Scientific Inc., SUA), a fost folosit pentru prelucrarea datelor. Ariile spoturilor de galantamină standard au servit la realizarea dreptei de calibrare (Figura 2.) cu un coeficient de corelație de 0,995.

Figura 1. Cromatograma standardului și a extractelor

Figura 2. Curba de calibrare a galantaminei

Rezultate și discuții

Determinarea calitativă

Extractele realizate după metoda 1 au fost testate pe o placă cromatografică, au fost aplicate 5 µL/bandă alături de soluția standard de galantamină, dar nu s-au observat spoturile galantaminei după developare și pulverizare cu reactiv Dragendorff. Am preconcentrat extractele pentru a verifica, crezând că extractele au un conținut de galantamină sub limita de detecție. Spoturile alcaloizilor din extract nu au fost vizibile nici după această preconcentrare. Considerând că alcaloizii se regăsesc în produsul vegetal în concentrație redusă am încercat să extragem o cantitate mai mare de produs vegetal. Produsul vegetal supus extracției prin metoda 1 a fost de 1 g. Această metodă a fost aplicată inițial pentru Narcissus pseudonarcissus. Astfel rezultatul a fost unul mai bun. La aplicare de 5µL, am primit confirmarea că produsul vegetal de N. pseudonarcissus conține galantamină, dar spotul a fost de intensitate foarte redusă. Spotul corespunător galantaminei după pulveriare a fost de culoare portocalie și valoarea Rf=0,72. Considerând că metoda de extracție este una bună pentru extragerea galantaminei am supus și celelalte produse vegetele extracției. După extracție am aplicat fiecare extract în volum de 5 µL/bandă, pe o placă, dar nu a apărut spotul corespunzător galantaminei. După creșterea volumului aplicat la 10 µL/bandă a apărut spotul corespunzător galantaminei în extractele din N. poeticus și N. pseudonarcissus. Oricât am repetat aplicarea extractelor de Galanthus nivalis și Leucojum vernum și am crescut și volumul aplicat la 15, respectiv 20 µL/bandă alături de soluția standard de galantamină, nu a apărut spotul galantaminei. Au fost vizibile alți alcaloizi, dar nu cel căutat.

Datorită punctului critic din metoda 1 de extracție, cel de spargerea emulsiei formate, și datorită unor rezultate diferite de cele așteptate am căutat altă metodă de extracție pentru galantamină, și am găsit metoda 2. Această metodă a fost întâi utilizată pentru N. poeticus. Din extractul aplicat pe placă cromatografică în volum de 5 µL/bandă a apărut spotul galantaminei, dar spotul nu a fost intens, a fost greu vizibil. De aceea am modificat cantitatea produsului vegetal uscat pentru extracție la 500 mg. Extracția a fost cu succes. Spotul din N. poeticus a fost vizibilă după aplicare de 5 µL/bandă. Au fost extrase și celelalte produse vegetale cu metoda 2. După aplicare în bandă, 5 µL/bandă, spoturile pentru galantamină au fost vizibile doar pentru speciile de Narcissus. Pentru Galanthus nivalis și Leucojum vernum spoturile corespunzătoare galantaminei nu au fost prezente.

Am căutat alte produse vegetale de Galanthus și Leucojum cultivate în scop ornamental din satul meu de proveniență. Am găsit specii de Galanthus nivalis și le-am recoltat în perioada de după înflorire. Le-am uscat și după curățare, și mărunțire le-am supus extracției cu metoda 2. Acest extract după aplicare, developare și pulverizare cu reactiv Dragendorff a prezentat spotul corespunzător galantaminei.

Determinare cantitativă

Pentru determinarea cantitativă am construit o curbă de calibrare. Soluția standardului de galantamină de concentrație 0,5 mg/mL a fost aplicat cu aplicatorul automat în volume crescânde, astfel concentrațiile pe spot au fost: 750 ng, 1000 ng, 1250 ng, 1500 ng, 1750 ng, 2500 ng, 3000 ng, 3500 ng, 4000 ng.

În Galanthus nivalis cantitatea de galantamină găsită a fost de 14,13 mg % produs vegetal uscat. Pentru speciile de Narcissus poeticus, respectiv N. pseudonarcissus a fost de 4,10 mg și 1,85 mg % produs vegetal uscat. Din lipsă de material vegetal nou, din Leucojum vernum nu am reușit cuantificarea galantaminei.

Validarea metodei

Validarea unei metode de analiză este de fapt metodologia de verificare, de confirmare sau acreditare a validității științifice a unei metode de analiză, având drept scop demonstrarea faptului că o metodă sau un procedeu corespunde utilizării pentru care a fost elaborată.

Parametrii principali care sunt testați în timpul validării unei metode analitice sunt: Specificitatea, linearitatea, exactitatea (acuratețea), fidelitatea (precizia), repetabilitatea, reproductibilitatea, sensibilitatea și robustețea (3).

Am încercat validarea metodei propuse de noi pentru determinarea cantitativă a galantaminei prin metoda cromatografiei pe strat subțire.

Specificitatea

Metoda analitică este specifică, dacă aceasta permite detecția, sau determinarea compusului de interes (analit), dintr-un amestec multicomponent, fără ca semnalul analitic măsurat să provină și de la alți compuși din amestec (3).

Metoda dezvoltată de noi este specifică pentru determinarea galantaminei din extracte, pentru că procedeul cromatografic permite separarea componentelor extractului, și spoturile obținute în urma prelucrării au aceeași culoare, distanță de migrare ca și spotul standardului de galantamină.

Linearitatea

Metoda analitică este liniară, dacă aceasta este capabilă să conducă, într-un interval dat, la rezultate direct proporțională cu concentrația analitului (3).

Pentru a realiza curba de regresie s-au preparat trei serii de a câte șapte nivele de concentrații crescânde de colchicină standard, în trei zile diferite. În fiecare zi s-a preparat o soluție stoc proaspătă de 0,5 mg/mL prin cântărirea de 1,28 mg de bromhidrat de galantamină într-un balon cotat de 2 mL dizolvat în metanol. Cantitățile aplicate au fost de 750 ng, 1250 ng, 1500 ng, 1750 ng, 2500 ng, 3000 ng și 3500 ng, iar analizele au fost realizate după metoda prezentată.

După prelurarea datelor obținute din cromatograme, s-au reprezentat ariile picurilor în funcție de concentrația soluțiilor de galantamină standard. Analiza statistică a datelor a fost sumarizată în Tabelul 1.

Tabelul 1. Datele regresiei liniare

Exactitatea

Exactitatatea este definită ca și concordanța dintre valoarea adevărată și rezultatul obținut în urma aplicării metodei, cu alte cuvinte exprimă diferența între valoarea adevărată și cea măsurată. Oferă informații asupra erorilor sistematice.

Intervalul de concentrație validată este de o serie de minimum 5 concentrații echidistante, de exemplu 60, 80, 100, 120, 140 % în raport cu concentrația teoretică. Se efectuează cel puțin 3 serii independente pentru fiecare din cele 5 concentrații (3).

Interpretarea rezultatelor și datele analizei lor statistice sunt prezentate în testele următoare, pentru 3 serii a câte 5 concentrații de bromhidrat de galantamină pură.

Testul de omogenitate a varianțelor intra-grup: test Cochran

Test de validitate a mediilor: test Fisher

Intervalul de incredere a mediei regasite

Valorile obținute se regăsesc în intervalul 100±5%, acest interval este considerat acceptabil din punct de vedere analitic a erorilor instrumentale.

Fidelitatea

Fidelitatea unei metode de analiză este caracterizată prin intermediul a doi parametri: repetabilitatea și reproductibilitatea. Repetabilitatea urmărește obținerea de rezultate cât mai apropiate în condiții experimentale cât mai asemănătoare, de aceea se testarea acestui parametru se realizează de către același analist, pe același instrument, printr-o metodă unică într-un interval scurt de timp (3).

Pentru testarea repetabilității au fost aplicate 3 soluții de concentrații diferite, diluate dintr-o soluție stoc, astfel că pe placa cromatografică s-au aplicat 1000 ng, 2500 ng, respectiv 3500 ng pe spot. Testele au fost efectuate de același cercetător, pe aceleași instrumente, în trei zile consecutive. În Tabelul 2. au fost prezentate regăsirile obținute pentru nivelul de concentrație de 1000 ng/spot, căte două aplicări pe zi, trei zile consecutiv. A fost aplicat testul Cohran, care a arătat că varianțele sunt omogene (Ccalc<Cteor). Coeficientul de variație a repetabilității este 14,61977%. Tabelul 3. conține datele pentru nivelul de concentrație 2500 ng/spot. Conform testului Cohran varianța este omogenă. Tabelul 4. prezintă datele pentru nivelul de concentrație 3500 ng/spot. În acest caz testul Cohran aplicat arată că nu este o omogenitate între varianțele rezultatelor.

Tabelul 2. Nivel de concentrație 1000 ng/spot

Tabelul 3. Nivel de concentrație 2500 ng/spot

Limita de detecție și cuantificare

Limita de detecție (LOD) este un parametru de cercetare și stabilire a limitelor de impurități, și reprezintă cea mai mică cantitate dintr-o substanță de interes, care poate fi detectată într-o probă, cu o exactitate și fidelitate acceptabilă, în condițile experimentale stabilite.

Limita de cuantificare (LOQ) este cea mai mică cantitate dintr-o substanță de interes, ce poate fi dozată dintr-o probă, cu o exactitate și fidelitate acceptabile, în condițiile experimentale stabilite și descrise (3).

Cei doi parametrii au fost calculați cu ajutorul formulei LOD=3,3*σ/S, respectiv LOQ=10*σ/S , σ fiind deviația standard a interceptelor și S media pantelor de regresie. Limita de detecție calculată a fost de 158,36 ng/spot, iar cea de cuantificare 479,87 ng/spot.

Concluzii

Boala Alzheimer este o boală neurodegenerativă, care progresează repede, dar cu cât este mai repede diagnosticat cu atât încetinirea evoluției ei este mai ușoară și mai vizibilă. Din păcate însă, diagnosticarea de cele mai multe ori este întârziată și de aceea costurile terapiei sunt mult mai mari, de asemenea suferința pacienților și a aparținătorilor este importantă.

Această afecțiune având o componentă atât fizică cât și psihică, tratamentul nefarmacologic este de primă linie. Terapia prin muzică, lumină sau alte metode noi ajută pacientul să se relaxeze și agitația este diminuată. Pe lângă aceste metode terapeutice este foarte importantă tratamentul farmacologic. Pacienții și aparținătorii trebuie informați că este în beneficiul pacientului o aderență bună la tratament, astfel că se evită întreruperile bruște și nejustificate.

Galantamina este una dintre agenții terapeutici utilizați. Această substanță medicamentoasă poate fi extrasă din plante, însă datorită cererilor tot mai crescute a fost nevoie de dezvoltarea unei metode chimice de sinteză. Numeroase metode de obținere au fost dezvoltate cu randamente diferite. Unele au ca și produși de reacție amestecul racemic de galantamină, altele includ o tehnică de separare a enantiomerilor precursorului (narvedinei) apoi se obține (-)-galantamina.

Metodele de analiză a galantaminei sunt variate însă fiecare prezintă unele dezavantaje. Metodele cromatografice au nevoie de un standard de puritate analitică pentru determinări cantitative, tandemul GC/MS are un cost crescut și pregătirea probelor este consumatoare de timp. Metodele cele mai vechi, imunonologice și cele radioimunologice sunt laborioase și scumpe pentru că utilizează anticorpi și substanțe radioactive.

Plantele cu conținut de galantamină fac parte din familia Amaryllidaceae și sunt răspândite în zonele temperate.

Partea experimentală a avut ca și scop determinarea calitativă și cantitativă a galantaminei din extracte vegetale de Galanthus nivalis, Leucojum verum, Narcissus poeticus și Narcissus pseudonarcissus. Pentru început s-a ales metoda și parametrii optimi pentru extracție, după ce am dezvoltat o metodă cromatografică de determinarea galantaminei cu ajutorul standardului pur de bromhidrat de galantamină. Mai apoi metoda dezvoltată a fost validată având în vedere următorii parametrii: specificitate, liniaritate, exactitate, repetabilitate, limită de detecție și de cuantificare.

Bibliografie

1. Societatea Romana Alzheimer [Internet]. [cited 22.05.2015]. Available from: http://www.alz.ro.

2. ***. Pharmacotherapy A Pathophysiologic Approach: McGraw-Hill Education; 2014.

3. Roman Liviu, Bojiță Marius, Robert S. Validarea metodelor de analiză și control – Bazele teoretice și practice. București: Editura Medicală; 1998.

4. D'Andrea M. Bursting Neurons and Fading Memories. 2015. p. 1-11.

5. Alzheimers.net [Internet]. [cited 22.05.2015]. Available from: www.alzheimers.net.

6. Rafii M, Aisen P. Advances in Alzheimer’s Disease Drug Development. BMC Medicine. 2015;13(62).

7. Zelcer N, Khanlou N, Clare R, Jiang Q, Reed-Geaghan EG, Landreth GE, et al. Attenuation of neuroinflammation and Alzheimer's disease pathology by liver x receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2007;104(25):10601-6.

8. Goedert M. Tau gene mutations and their effects. Movement Disorders. 2005;20.

9. Murray M, Kouri N, Lin W-L, Jack Jr C, Dickson D, Vermuri P. Clinicopathologic assessment and imaging of tauopathies in neurodegenerative dementias. Alzheimer's Research & Therapy. 2014;6(1).

10. Atamna H, Nguyen A, Schultz C, Boyle K, Newberry J, Kato H, et al. Methylene blue delays cellular senescence and enhances key mitochondrial biochemical pathways. The FASEB Journal. 2008;22(3):703-12.

11. Brunden KR, Trojanowski JQ, Lee VMY. Advances in tau-focused drug discovery for Alzheimer's disease and related tauopathies. Nature Reviews Drug Discovery. 2009;8(10).

12. Yanamandra K, Jiang H, Mahan TE, Maloney SE, Wozniak DF, Diamond MI, et al. Anti-tau antibody reduces insoluble tau and decreases brain atrophy. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2015;2(3).

13. Milionis HJ, Florentin M, Giannopoulos S. Metabolic syndrome and Alzheimer's disease: a link to a vascular hypothesis? CNS Spectr. 2008;13(7):606-13.

14. Mazza M, Marano G, Traversi G, Bria P, Mazza S. Primary cerebral blood flow deficiency and Alzheimer's disease: shadows and lights. J Alzheimers Dis. 2011;23(3):375-89.

15. Haag MDM, Hofman A, Koudstaal PJ, Stricker BHC, Breteler MMB. Statins are associated with a reduced risk of Alzheimer disease regardless of lipophilicity. The Rotterdam Study. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 2009;80(1):13-7.

16. Roberts BR, Ryan TM, Bush AI, Masters CL, Duce JA. The role of metallobiology and amyloid-β peptides in Alzheimer’s disease. Journal of Neurochemistry. 2012;120.

17. Parihar MS, Brewer GJ. Amyloid-beta as a modulator of synaptic plasticity. J Alzheimers Dis. 2010;22(3):741-63.

18. Fodoreanu L. Elemente de diagnostic și tratament în psihiatrie. Cluj Napoca: Editura Medicală Universitară ”Iuliu Hațieganu”; 2006.

19. Ghid de diagnostic și tratament în demențe din România. 2009.

20. Pariente A, Fourrier-Réglat A, Bazin F, Ducruet T, Dartigues JF, Dragomir A, et al. Effect of treatment gaps in elderly patients with dementia treated with cholinesterase inhibitors. Neurology. 2012;78(13):957-63.

21. Singh M, Kaur M, Kukreja H, Chugh R, Silakari O, Singh D. Acetylcholinesterase inhibitors as Alzheimer therapy: from nerve toxins to neuroprotection. Eur J Med Chem. 2013;70:165-88.

22. ***. Psihiatrie clinică. București: Editura Medicală; 2013.

23. Ciulei I, Grigorescu E, Stănescu U. Plante medicinale, fitochimie și fitoterapie. Tratat de farmacognozie. București: Editura Medicală; 1993.

24. Berkov S, Ivanov I, Georgiev V, Codina C, Pavlov A. Galanthamine biosynthesis in plant in vitro systems.

25. Harvey AL. The pharmacology of galanthamine and its analogues. Pharmacology and Therapeutics. 1995;68(1):113-28.

26. Berkov S, Ivanov I, Georgiev V, Codina C, Pavlov A. Galanthamine biosynthesis in plant in vitro systems. Engineering in Life Sciences. 2014;14(6):643-50.

27. El Tahchy A, Boisbrun M, Ptak A, Dupire F, Chretien F, Henry M, et al. New method for the study of Amaryllidaceae alkaloid biosynthesis using biotransformation of deuterium-labeled precursor in tissue cultures. Acta Biochim Pol. 2010;57(1):75-82.

28. Barton DHR, Kirby GW. 153. Phenol oxidation and biosynthesis. Part V. The synthesis of galanthamine. Journal of the Chemical Society (Resumed). 1962(0):806-17.

29. Kametani T, Yamaki K, Yagi H, Fokumoto K. Modified total synthesis of (±)-galanthamine through phenol oxidation. Journal of Chemical Society D. 1969;8:425-6.

30. Kita Y, Arisawa M, Gyoten M, Nakajima M, Hamada R, Tohma H, et al. Oxidative Intramolecular Phenolic Coupling Reaction Induced by a Hypervalent Iodine(III) Reagent:  Leading to Galanthamine-Type Amaryllidaceae Alkaloids. The Journal of Organic Chemistry. 1998;63(19):6625-33.

31. Krikorian D, Tarpanov V, Parushev S, Mechkarova P. Synthesis of (-)-Galanthamine and Comparison of Its Haemodynamic Effects with the Natural Product. Comptes Rendus de l'Academie Bulgare des Sciences. 2000;54:5-39.

32. Node M, Kodama S, Hamashima Y, Baba T, Hamamichi N, Nishide K. An Efficient Synthesis of (±)-Narwedine and (±)-Galanthamine by an Improved Phenolic Oxidative Coupling. Angewandte Chemie International Edition. 2001;40(16):3060-2.

33. Shieh W-C, Carlson JA. Asymmetric Transformation of Either Enantiomer of Narwedine via Total Spontaneous Resolution Process, a Concise Solution to the Synthesis of (-)-Galanthamine. The Journal of Organic Chemistry. 1994;59(18):5463-5.

34. Chaplin DA, Johnson NB, Paul JM, Potter GA. Dynamic diastereomeric salt resolution of narwedine and its transformation to (−)-galanthamine. Tetrahedron Letters. 1998;39(37):6777-80.

35. Szewczyk J, Lewin AH, Carroll FI. An improved synthesis of galanthamine. Journal of Heterocyclic Chemistry. 1988;25(6):1809-11.

36. Marco-Contelles J, do Carmo Carreiras M, Rodríguez C, Villarroya M, García AG. Synthesis and pharmacology of Galanthamine. Chemical Reviews. 2006.

37. Poulev A, Deus-Neumann B, Zenk MH. Enzyme immunoassay for the quantitative determination of galanthamine. Planta medica. 1993;59(5):442-6.

38. Torras-Claveria L, Berkov S, Codina C, Viladomat F, Bastida J. Daffodils as potential crops of galanthamine. Assessment of more than 100 ornamental varieties for their alkaloid content and acetylcholinesterase inhibitory activity. Industrial Crops and Products. 2013;43:237-44.

39. Berkov S, Bastida J, Nikolova M, Viladomat F, Codina C. Rapid TLC/GC-MS identification of acetylcholinesterase inhibitors in alkaloid extracts. Phytochemical Analysis. 2008;19(5):411-9.

40. Gotti R, Fiori J, Bartolini M, Cavrini V. Analysis of Amaryllidaceae alkaloids from Narcissus by GC–MS and capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2006;42(1):17-24.

41. Abou-Donia AH, Toaima SM, Hammoda HM, Shawky E. New rapid validated HPTLC method for the determination of galanthamine in Amaryllidaceae plant extracts. Phytochemical Analysis. 2008;19(4):353-8.

42. Lubbe A, Pomahačová B, Choi YH, Verpoorte R. Analysis of metabolic variation and galanthamine content in Narcissus bulbs by 1H NMR.

43. Berkov S, Sidjimova B, Evstatieva L, Popov S. Intraspecific variability in the alkaloid metabolism of Galanthus elwesii. Phytochemistry. 2004;65(5):579-86.

44. Berkov S, Bastida J, Sidjimova B, Viladomat F, Codina C. Phytochemical differentiation of Galanthus nivalis and Galanthus elwesii (Amaryllidaceae): A case study. Biochemical Systematics and Ecology. 2008;36:638-45.

45. López S, Bastida J, Viladomat F, Codina C. Solid-phase extraction and reversed-phase high-performance liquid chromatography of the five major alkaloids in Narcissus confusus. Phytochemical Analysis. 2002;13:311-5.

46. Berkov S, Bastida J, Viladomat F, Codina C. Analysis of galanthamine-type alkaloids by capillary gas chromatography–mass spectrometry in plants. Phytochemical Analysis. 2008;19:285-93.

47. López S, Bastida J, Viladomat F, C C. Acetylcholinesteraze inhibitory activity of some Amaryllidaceae alkaloids and Narcissus extracts. Life Sciences. 2002;71:2521-9.

48. Bastos JK, Xu L, Dhammika Nanayakkara NP, Burandt CL, Moraes-Cerdeira RM, McChesney JD. A Rapid Quantitative Method for the Analysis of Galanthamine and Other Amaryllidaceae Alkaloids by Capillary Column Gas Chromatography. J Nat Prod. 1996;59:638-40.

49. Berkov S, Bastida J, Nikolova M, Viladomat F, Codina C. Rapid TLC/GC-MS identification of acetylcholinesterase inhibitors in alkaloid extracts.

50. http://www.johnmorris.com.au. Available from: http://www.johnmorris.com.au/ISOLUTE-HM-N-Bulk-1kg.aspx?pd=150639.

51. Berkov S, Bastida J, Viladomat F, Codina C. Analysis of galanthamine-type alkaloids by capillary gas chromatography–mass spectrometry in plants.

52. López S, Bastida J, Viladomat F, Codina C. Solid-phase extraction and reversed-phase high-performance liquid chromatography of the five major alkaloids in Narcissus confusus.

53. Nováková L, Grand-Guillaume Perrenoud A, Francois I, West C, Lesellier E, Guillarme D. Modern analytical supercritical fluid chromatography using columns packed with sub-2 μm particles: A tutorial. Analytica Chimica Acta. 2014;824(0):18-35.

54. Rachmaniah O, Choi YH, Arruabarrena I, Vermeulen B, van Spronsen J, Verpoorte R, et al. Environmentally benign supercritical CO2 extraction of galanthamine from floricultural crop waste of Narcissus pseudonarcissus. The Journal of Supercritical Fluids. 2014;93:7-19.

55. Ivanov I, Georgiev V, Pavlov A. Elicitation of galanthamine biosynthesis by Leucojum aestivum liquid shoot cultures. Journal of Plant Physiology. 2013;170(12):1122-9.

56. Palage M, Ana M. Medicația afecțiunilor sistemului nervos central. Cluj Napoca: Editura Medicală Universitară ”Iuliu Hațieganu”; 2006.

57. Tiță I. Botanică farmaceutică. București: Editura Pedagogică R.A.; 2003.

58. Tămaș M. Botanică farmaceutică, vol. III, Sistematică-cormobionta. Cluj Napoca: Editura Medicală Universitară ”Iuliu Hațieganu”; 1999.

59. Hahn-Deinstrop E. Applied Thin-Layer Chromatography. II ed. Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA; 2007.

60. Handbook of Thin-Layer Chromatography. II ed. New York: Marcel Dekker, INC.; 1996.

61. ***. Dyeing Reagents for Thin Layer and Paper Chromatography.

62. Berkov S, Georgieva L, Kondakova V, Viladomat F, Bastida J, Atanassov A, et al. The geographic isolation of Leucojum aestivum populations leads to divergation of alkaloid biosynthesis. Biochemical Systematics and Ecology. 2013;46:152-61.