Analiza bioinformatică a secvențelor de acizi nucleici generate prin [605337]

Universitatea Babeș -Bolyai Cluj -Napoca
Școala Doctorală de Biologie Integrativă

Analiza bioinformatică a secvențelor de acizi nucleici generate prin
studii genomice structurale și funcționale în evaluarea dezvoltării
tumorilor maligne
Rezumatul tezei

Coordonatori științifici:
Prof. Dr. Nicolae Dragoș
Prof. Dr. Dan Dumitraș cu
Doctorand: [anonimizat], 2015

Summary
Cuprins
1. INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. …………………….. 4
2. STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII ………………………….. ……………………… 5
Statisticile din domeniul cancerului ………………………….. ………………………….. . 5
Terapii convenționale în cancer ………………………….. ………………………….. ….. 6
Terapii țintite ………………………….. ………………………….. ………………………. 6
Cunoștințe curente despre cancer ………………………….. ………………………….. …. 6
Tehnologii de tip ”high throughput” ………………………….. ………………………….. 7
Analizele bioinformatice a datelor de tip ”high throughput” ………………………….. … 7
Importanța “Big Data” ………………………….. ………………………….. ……………. 8
3. CONTRIBUȚIE PERSONALĂ: Managementul datelor pentru numeroase aplicații “omics”
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 9
3.1. STUDIUL NGS: Analizele de bioinformatică pentru secvențierea de nouă generație în
cancerul de sân triplu negativ ………………………….. ………………………….. ……….. 9
Cancerul de sân și TNBC – caracterizare, nevoie de management mai bun …………….. 9
Materiale, metode și protocoale ………………………….. ………………………….. ….10
Aspecte Etice ………………………….. ………………………….. ………………….. 10
Pacienții ………………………….. ………………………….. ………………………… 10
Tehnologia Ion Torrent ………………………….. ………………………….. ……….. 10
Extracția ADN ………………………….. ………………………….. …………………. 11
Cuantificarea ADN ………………………….. ………………………….. ……………. 11
Prepararea bibliotecii de ampliconi ………………………….. ……………………….. 11
Amplificarea ADN genomic cu amorse specifice ………………………….. ………… 12
Purificarea ampliconilor ………………………….. ………………………….. ………. 12
Dige stia parțială a amorselor ………………………….. ………………………….. …..12
Marcarea ampliconilor ………………………….. ………………………….. ………… 12
Cuantificarea bibliotecii de ampliconi ………………………….. …………………….. 12
Amplificarea bibliotecii ISP (Ion Sphere Particles) ………………………….. ………. 13
Îmbogătirea ISP ………………………….. ………………………….. ……………….. 13
Încărcarea chip -urilor “316” ………………………….. ………………………….. …..13
Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………. 15
Validarea mutațiilor identificate ………………………….. ………………………….. ….17
Limitări și considerări ulterioare ………………………….. ………………………….. …18
Concluzii ………………………….. ………………………….. …………………………. 18
3.2. STUDIU MICROARRAY: Analiza bioinformatică a datelor microarray și extrapolarea
porc-om în relație cu expunerea la Zearalenone și Escherichia coli ………………………. 20
Modele animale – când și de ce le folosim? ………………………….. …………………. 20
Introducerea și motivația acestui studiu ………………………….. ……………………… 20

Roxana M. Cojocneanu
3
Tehnologia Microarray – Privire de ansamblu ………………………….. ………………. 21
Materiale, metode și protocoale ………………………….. ………………………….. ….21
Extracția de ARN total cu TRI Reagent (Sigma -Aldrich) ………………………….. ..21
Purificarea ARN folosind RNeasy Mini Kit (Qiagen) ………………………….. …….21
Cuantificarea ARN ………………………….. ………………………….. ……………. 22
Sinteza sondelor ………………………….. ………………………….. ……………….. 22
Purificarea sondelor ………………………….. ………………………….. …………… 22
Cuantificarea sondelor și diluția ………………………….. ………………………….. .22
Hibridizarea sondelor ………………………….. ………………………….. …………. 22
Procesarea datelor ………………………….. ………………………….. ………………… 22
Analiza datelor ………………………….. ………………………….. …………………… 23
Raționamentul pentru metoda de extrapolare ………………………….. ……………….. 24
Succesiunea de metode pentru extrapolare ………………………….. ………………….. 24
Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………. 24
Concluzii parțiale pentru metoda de extrapolare ………………………….. ……………. 24
Efectul extrapolării co -contaminării la oameni ………………………….. ……………… 25
Modelul de evaluare a expresiei genice în experimentul pe duoden ……………………. 25
Analiza rețelelor de semnalizare ………………………….. ………………………….. ….25
Concluzii ………………………….. ………………………….. …………………………. 26
4. CONCLUZII GENERALE ………………………….. ………………………….. …………. 27
Lista publicațiilor ………………………….. ………………………….. ………………………. 29
Bibliografie selectivă ………………………….. ………………………….. ………………….. 31

Cuvinte cheie : bioinformatică, analiză date, terapie personalizată, secvențiere de nouă
generație, microarray, modele animale, extrapolare

Summary
1. INTRODUCERE

Atunci când știința întâlnește tehnologia de înaltă performanță, pot avea loc progrese
majore, ca dovadă fiind cantitatea mare de date generate de progresele tehnologice recente
din domeniul biologiei moleculare, mai precis în genomica funcțională și structurală . Printre
aceste tehnologii cu impact major asupra cercetării medicale se numără secvențierea de nouă
generație și tehnica microarray, ce au potențialul de a îmbunătăți metodele clinice de
diagnostic și terapie țintită (1-4). Acest e progres e au facilitat studierea profil ului molecular
pentru numeroase patologii , cu potențialul de a conduce la descoperirea unor terapii țintite
eficiente, dar și a biomarkerilor pentru diagnostic timpuriu, stratificare și prognostic .
Cantitatea mare de informații generate de aceste instrumente poate varia de la
numero ase giga-perechi de baze (gpb) de date brute de secvențiere, până la tabele extinse
structurate în fișiere, conținând sute, uneori chiar mii de rânduri, așa cum se întâmplă în
cazul datelor expresiei genice sau a miARN obținute în urma tehnologiei microarray (5-7).
Ca și în cazul oricărui test, valoarea rezultatelor constă în abilitatea cercetătorului de a
interpreta și integra informațiile obținute într -o manieră cu semnificație biologică . Așadar,
în încercarea de a transforma datele tip high throughput în date accesibile este necesară
organizarea și descifrarea lor cu aj utorul metodelor bioinformatice. Pe scurt, domeniul
bioinformaticii reprezintă un sistem de management a informațiilor pentru biologia
molecular ă și are numeroase aplicații practice (8).
În ultimii ani, atenția medicilor și a cercetătorilor clinici a început să se mute de la
tratarea pacinților deja afectați de diverse boli spre predicție, prevenire și medicina
personalizată (PPMP) sau medicină de precizie, acest trend fiind foarte bine il ustrat în
momentul de față în domeniul oncologiei (9). În încercarea de a asocia fiecare pacient cu cel
mai bun plan terapeutic, medicii au început să se bazeze pe mai multe informații decât cele
oferite de stratificarea histopato logică a bolii. Progresele recente din cercetarea din domeniul
biomedicine și a geneticii oferă clinicienilor informații mai precise, precum expresia genică
și moleculară în tumori, starea mutațională a genelor implicate în anumite boli, gradul de
polimorf ism și variație a numărului de copii . O bună congruență între profilul molecular a
pacientului și răspunsul terapeutic nu reprezintă doar o îmbunătățire a rezultatului final , dar
și un pas înainte în ceea ce privește medicina personalizată și precisă.

Roxana M. Cojocneanu
5
Motivația din spatele acestei teze a fost de a sublinia modul în care analizele ”big
data” pot contribui la personalizarea diagnosticului și a terapiei, prin folosirea
tehnologiilor pentru profilarea bio -moleculară tip ”high throughput” , cu scopul de a
analiza semnătura moleculară a condițiilor fizice și patologice. Alături de costuri
minimalizate și dezvoltare de paneluri biologice specializate – dar și cu posibilitate de a
adapta aceste paneluri pentru diverse teste microarray sau de secvențiere de nouă generație
– aceste tehnologii pot îndeplini o varietate largă de cerințe clinice pentru numeroase
patologii. Prin folosirea bioinformaticii și a metodelor de analiză, interpretara și integrare a
cantităților mari de date generate de aceste tehnologii, va face posibilă dezvoltarea de metode
rapide și eficiente aplicabile în special în domeniul oncologiei. În primul rând, un diagnostic
rapid și eficient va asigura tratamentul ce l mai potrivit pentru situația pat ologic ă a fiecărui
pacient . Biomarkerii preciși, nou descoperiți, vor contribui la dezvolatarea de metode de
screening mai eficiente și minim invasive, ce vor stratifica potențialii pacienți și oferi
posibilitatea unui tratament precis și rapid . Cu toate că nu promite să devină Sfântul Graal
al medicinei, bioinformatica va schimba cel mai probabil fața diagnosticului și tratamentului
oncologic, conducând fără îndoială la o viață și rată de supraviețuire îmbunătățită pentru
pacienți.

2. STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII

Statisticile din domeniul cancerului

Cancerul se încadrează printre principalele cauze ale decesului la nivel global, cu o
medie a mortalității de 8 milioane cazuri anual, conform statisticilor furnizate de World
Health Organization (10). Conform site-ului GLOBOCAN 2012 , s-au estimat aproximativ
14.1 milioane de cazuri noi de cancer la ultima evaluare la nivel mondial, dintre care 7.4
milioane de cazuri la barbați și 6.7 milioane la femei . Se preconizează că acest număr va
crește la 24 de milioane până în 2035 (11, 12) . Aceeași sursă prezintă și num ărul de cazuri
apărute în 2013 pentru fiecare tip de cancer în parte, dar și rata de mortalitate cauzată de
aceste stări maligne în timpul aceluiași an.
Luând în considerare aceste cifre mari, devine clară nevoia urgentă de a găsi
medicamente mai precise și eficiente, primul pas fiind înțelegerea mai amănunțită a
genomului cancerului și a profilelor moleculare specifice pentru fiecare tumoră.

Summary
Terapii convenționale în cancer

În momentul de față, atunci când se face referire la oncologie, terapiile convenționale
pot fi descrise ca și un tratament ce este acceptat și folosit de majoritatea medicilor
specialiști, implicând proceduri chirurgicale, administrarea de medi camente
chemoterapeutice sau folosirea radiațiilor .
Pe lângă posibila dobândire a rezistenței la terapie, un alt aspect important ce îi
implică atât pe medici, cât și pe pacienți, este reprezentat de managementul efectelor
secundare negative a le acestor medicamente, ce sunt determinate în mare parte de activitatea
lor nespecifică și administrarea sistemică.

Terapii țintite

Datorită dezavantajelor chemoterapiei tradiționale, noi metode țintite sunt în curs de
dezvoltare , constând în medicamente ce sunt capabile să atace mecanisme celulare și
moleculare specifice ce diferențiază celulele transformate de cele sănătoase (13). În funcție
de particularitățile lor, aceste medicamente noi se clasifică în câteva grupuri, precum enzime
sau inhibitori ai angiogenezei, anticorpi monoclonali și terapii genice.
Cu toate că numărul de studii efectuate pe subiecți umani este limitat, aceste noi
medicamente țintite dețin așteptări majore pentru găsirea de terapii oncologice mai eficiente,
încercările curente fiind susținute de cantita tea în continuă creștere de cunoștințe despre
cancer.

Cunoștințe curente despre cancer

În general, tumorile maligne sunt descrise ca și un grup de boli ce sunt caracterizate
prin diviziune monoclonală intensă a unui tip particular de celul e, ce invadează țesutul
înconjurător și dobândește capacitatea de a coloniza țesuturi și organe (14, 15) . În anii
recenți, cancerul a fost descri s ca și o boală poligenica, cu multiple fațete, caracterizată prin
dezvoltarea de tumori generate de modificări genetice și /sau epigenetice, ce contracarează
mecanismele de reparare a ADN și alte sisteme moleculare de protecție, concizând cu
expre sia fenotipului malign.
Alter ările pot avea loc în orice pas descris de către dogma clasică a biologiei
moleculare . Astfel, genele po t achiziționa mutații cu potențialul de a afecta procesul de
traducere , rezultând proteine modificate , fapt ce poate avea efecte devastatoare în cazul

Roxana M. Cojocneanu
7
genelorsupresoare de tumori (16, 17) . Analiza datelor generate de secvențierea de nouă
generație poate aduce lumină asupra tipurilor de mutații ce au loc, asupra fr ecvenței lor sau
asupra posibilului rezultat (18-20). În alte situații, alter ările pot avea loc la nivelul ARN
mesager și apar ca și modificări la nivelul de expresie , sub forma unor sub – sau
supraexprimări . Cu ajutorul tehnologiei microarray , produșii de transcriere pot fi
monitorizați în ceea ce privește gradul de exprimare , fie atunci când se studiază
particularitățile țesutului tumoral comparat cu omologul său normal sau atunci când, spre
exemplu, se evaluează efectul unui tratament . Astfe l, este posibilă capturarea expresiei unui
număr mare de transcripți și, prin aplicarea unor algoritmi bioinformatici, generarea de liste
de gene exprimate diferențiat, semnificative din punct de vedere statistic, ce pot fi
interpretate apoi sub formă de t ermeni cu semnificație biologică (21, 22) .

Tehnologii de tip ”high throughput”

Dezvoltarea de noi tehnologii de tip ”high throughput” reprezintă atât o cauză, cât și
un efect a l acestei acțiuni . Pe de -o parte, noile instrumente de studiu molecular, precum
secvențierea de nouă generație și platformele microarray, au facut posibilă descoperirea și
caracterizarea profilelor moleculare atât ale tipurilor de tumori, cât și a le pacienților. Pe de
altă parte, aceste descoperiri au obligat rafinarea ulterioară a acestor tehnici, pentru a se
potrivi nevoilor în creștere generate de medicina personalizată.
NGS, sau ”secvențierea de a doua generație” atunci când este comparată cu metoda
Sanger de terminare a lanțului, oferă posibilitatea de a realiza secvențieri masive paralel e de
genomuri complete, transcriptom , miRnom , secvențiere țintită de ampliconi sau interacțiuni
ADN -protei ne, cu costuri ce continuă să scadă, în timp ce performanța crește.
În timp ce NGS este în mare parte direcționat spre identificarea și caracterizarea
variațiilor structurale, tehnologia microarray este folosită în principal pentru a efectua studii
funcționale, precum expresia genică sau cuatificarea microARN . Astfel, este posibilă
identificarea de anomalii moleculare de la nivelul întregului genom ce sunt conectate cu
dezvoltarea și progresia tumorilor.

Analizele bioinformatice a datelor de tip ”high throughput”

Dezvoltarea tehnicilor menționate anterior a făcut posibilă acumularea de cunoștințe
de către c ercetători din domenii diferite, cunoștințe despre modul în care alterările de la

Summary
diferite nivel uri pot influența fiziopatologia, cu importanță semnificativă în domeniul
oncologic . În timp ce PCR și alte tehnici comune de biologie moleculară oferă rezultate
rapid e și ușor de interpretat, metodele de tip “high throughput” generează cantități mari de
date ce trebuie sa t reacă prin numeroase stadii de pre -procesare, analiză și integrare. Așadar
este necesară folosirea de metode de bioinformatică și algoritmi pentru a manipula aceste
date, de la stocare până la interpretare. Acest domeniu multidisciplinar combină cunoștințe
din biologia moleculară, genetică, biochimie, biologie sistemică și informatică, devenind
obligator iu pentru descifrarea “big data” (23, 24) .

Importanța “Big Data”

Datele de tipul ”high throughput” , produse fie prin experimente proprii sau descărcate
din baze de date publice, pot deveni o unealtă valoroasă în mâinile cercetătorilor . Aceste
date, d e la mutații în genele supresoare de tumori, până la reglarea post -transcripțională,
expresia genică și inhibiția ARNm via microARN , au potențialul de a produce îmbunătățiri
în ceea ce privește managementul terapeutic al pacienților oncologici . Așa cum s -a menționat
anterior și va fi evidențiat în continuare, rezultatele acestor analize moleculare pot ajunge în
domeniul clini c prin numeroase căi (25, 26) .
Pe de -o parte, tehnologiile moderne duc la dezvoltarea de noi medicamente țintite,
specific e, concepute pentru fiecare tip particular de cancer. În același timp, abilitatea de a
determina profilul molecular pentru fiecare pacient va oferi clinicienilor posibilitatea de a
alege tratamentul ce țintește cel mai eficient particularitățile fiecărei tumori în parte, cu
eficiență maximă și efecte secundare reduse (27, 28) .
Altă arie de interes pentru potențialul translational de interpretare al datelor de tipu
“high throughput” este prevenția, mai exact prin dezvoltarea de metode de screening mai
sensibile. Studii recente au demonstrat potențialul biomarkerilor, inclusiv microARN, ce pot
deve ni baza dezvolt ării testelor de screening capabile de a reduce în final ratele de incide nță,
și implicit mortalitate, provocate de tumorile maligne (29, 30) .

Roxana M. Cojocneanu
9
3. CONTRIBUȚIE PERSONALĂ : Managementul datelor pentru numeroase
aplicații “omic s”

3.1. STUDIUL NGS: Analizele de bioinformatică pentru secvențierea de nouă
generație în cancerul de sân triplu negativ
(Părți din acest capitol au fost publicate în Clujul Medical )(31)

Cancerul de sân și TNBC – caracterizare, nevoie de management mai bun

Conform ultimelor rapoarte despre incidența cancerului centralizate de
GLOBOCAN, în anul 2012 malignitățile de sân se situau pe locul doi în topul celor mai
comune tipuri de cancer la nivel global, cu aproximativ 1.67 milioane de cazuri noi
diagnosticate î n cazul femeilor, plasând cancerul de sân pe primul loc în lista celor mai
comune cazuri oncologice la femei, atât în țările dezvoltate, cât și în cele în curs de
dezvoltare . În România, cancerul de sân reprezintă cea mai comună malignitate din rândul
feme ilor, având în 2012 o incidență de 25.22%. De asemenea, reprezintă principala cauză de
deces în femeile diagnosticate cu cancer, cu o rată de mortalitate de 16.74%. Cu privire la
prevalența acestui tip de cancer, EUCAN prezintă următoarele valori: 12.58% pentru un an ,
34.54% pentru 3 ani și o prevalență de 5 ani de 52.88% (11).
Cancerul de sân triplu negativ cuprinde tumori ce nu exprimă receptorul pentru
estrogen , receptorul pentru progesteron și receptorul pentru factorul uman de creștere
epidermal 2 (HER2) și reprezintă aproximativ 15 -20% din totalul de cazuri de cancer de sân
diagnosticate (32). Prin lipsa exprimării receptorilor pentru hormoni, tu morilor cancerului
de sân triplu negativ le lipsește principal a țintă terapeutică folosită în terapiile hormonale, ce
se adaugă faptului că aceste subtipuri de tumori mamare sunt mai agresive, prezintă șanse
mai scăzute de supraviețuire a pacientului și ap ar la vârste mai tinere (33-35).
Fiecare tip de cancer afișează mutații somatice specifice ce pot influența oncogeneza,
iar diferitele subtipuri de cancer de sân nu fac exce pție (36). Anumite studii prezintă
importanța folosirii secvențierii de nouă generație pentru evaluarea mutațiilor din diferite
gene și tipuri de ca ncer, datorită sensibilității mai crescute a acestei metode și capacității de
a identifica mai multe mutații decât metoda secvențierii Sanger, fiind de asemenea capabilă
să genereze date de tip “high throughput” (37-40).
Scopul acestui studi u constă în aplicarea bioinformaticii în analiza mutațiilor
somatice din 46 de gene implicate în 31 de tumori de cancer de sân triplu negativ, evalu ate
cu ajutorul secvențierii de nouă generație, și anume platform a de secvențiere Ion Torrent
PGM (Life Technologies).

Summary

Materiale, metode și protocoale

Aspecte Etice

Toate protocoalele experimentale au fost supervizate și aprobate de către Comitetul
de Etică a l Institutului Oncologic “Prof. Dr. I Chiricut a” și al Universit ății de Medicină și
Farmacie “Iuliu Haț ieganu” Cluj-Napoca . Toți pacienții incluși în stud iu au citit și semnat
formularul de consimțământ, ce se supune cerințelor legale naționale și e uropene.

Pacienții

Acest studiu include 31 de pacienți ce au fost diagnosticați cu cancer de sân triplu
negativ , diagnostic ce a fost stabilit folosind criterii universale. Toți pacienții prezintă o
urmărire de 5-6 ani.

Tehnologia Ion Torrent

Ion Torrent, numit și “Personal Genome Machine” (PGMTM) distribuit de Life
Technologies din 2011, aduce o abordare unică în ceea ce privește secvențierea de nouă
generație. Cu toate că tehnologia se bazează în continuare pe secvențierea prin sinteză, nu
necesi tă dNTP marcate fluorescent sau chemiluminiscente, sau o detecție bazată pe imagine
a nucleotidelor incorporate. În loc de depistarea pirofosfatului eliberat în timpul incorporării
nucleotidelor, chip -ul construit pe baza tehnologiei semiconductoare detect ează protonul ce
este de asemenea eliberat în timpul acestui proces. Cu alte cuvinte, chip -ul Ion Torrent
funcționează ca și un p H-metru, sesizând schimbările subtile de pH ce pot să apară la
formarea unei legături fosfodiesterice din timpul elongării catenei de secvențiere (41).
Fluxul de lucru pornește odată cu efectuarea de librării de ADN. ADNc sau genomic
este în primă fază fragmentat în catene de 200 -400 pb, capetele sunt reparate, iar librăria este
amplificată și purifi cată; apoi se atașează adaptor i specifici la capetele fragmentelor, iar
golurile sunt completate . Atunci când se efectuează secvențiere multiplex, precum
secvențierea ADN pentru mai mult de un pacient, fiecărui fragment i se adaugă un cod
specific . Apoi biblioteca este selectată pe bază de mărime și verificată calitativ, fie prin
folosirea unui Bioanalizator Agilent sau prin metoda tradițională de PCR cantitativ (PCRc) .
Următorul pas constă în amplificarea via PCR în emulsie (1). După amplificare, biblio teca

Roxana M. Cojocneanu
11
de ampliconi este supusă unui proces de îmbogățire . Amplificarea PCR și îmbogățirea
biblioteci i sunt conduse folosind sistemul “Ion OneTouch” , ce automatizează procesul și
reduce erorile cauzate de manipularea manuală (42). După acest pas, librăria ADN este
încărcată pe chip și supusă centrifugării pentru a asigura ocuparea eficientă a chip -ului de
către matriță, iar procesul de secvențiere este apoi inițiat (43).

Extracția ADN

ADN a fost extras din țesutul incorporat în parafină (FFPE) folosind kitul PureLink
Genomi c DNA Mini Kit produs de Invitrogen , conform protocolului a ferent kit -ului. Acesta
permite izolarea și purificarea ADN genomic într-o manieră rapidă și eficientă, începând de
la o varietate de probe biologice, precum celule, țesut din parafină sau înghețat, sânge
integral, etc.. Principiul pe care se bazează acest kit constă în abilitatea ADN de a se lega
selectiv de me mbrana de silicagel din coloane , în prezența de săruri chaotropic e. Un alt
avantaj prezentat de acest kit îl constituie faptul că folosește soluție de tampon puternică,
capabilă de liza celulelor și țesuturilor prin simpla incubare la 55°C în prezența enzimei
protei nază K, fără a fi nevoie de folosirea unei metode mecanice pentru ruperea membranelor
celulare.

Cuantificare a ADN
Cantitatea de ADN obținută în timpul extracției și purificării a fost cuantificată cu
ajutorul spectrofotometrului NanoDrop -1000 (Thermo Scientific). Avantajul folosirii
acestui instrument pentru cuantificarea acizilor nucleici constă în timpul scurt de efectuare
a determinării și cantitatea mică de ADN nediluat ( 1 μl), așadar acest ti p de analiză poate
avea loc imediat după extracție și pu rificare.

Prepararea biblioteci i de ampliconi
Pentru fiecare probă, biblioteca de ampliconi a fost preparată urmând strict pașii din
protocolul producătorului, folosind o serie de kit -uri Ion AmpliSeq Kits de la Applied
Bioscience. Aceste kit -uri și amor sele aferen te au fost concepu te cu scopul folosirii lor în
reacția PCR multiplex utilizată pentru un număr mare de ținte genomice, asigurând în același
timp specificitate ridicată și acoperire uniformă.

Summary
Amplificarea ADN genomic cu amorse specific e
Amplificarea ADN genomic a fost efectuată folosind kit -ul “Ion Ampliseq Cancer
Panel” de la Applied Bioscience, ce conține amorse pentru 46 de gene ce sunt cunoscute
pentru faptul că prezintă mutații legate de cancer (AKT1, BRAF, FGFR1, GNAS, IDH1,
FGFR2, KRAS, NRAS, PIK3CA, MET, RET, EGFR, JAK2, MPL, PDGFRA, PTEN, TP53,
FGFR3, FLT3, KIT, ERBB2, ABL1, HNF1A, HRAS, ATM, RB1, CDH1, SMAD4, STK11,
ALK, SRC, SMARCB1, VHL1, CTNNB1, KDR, FBXW7, APC, CSF1R, NMP1, SMO,
ERBB4, CDKN2A, NOTCH1, JAK3, PTPN11). Prin folo sirea a doar 10 ng de ADN
genomic, acest kit oferă acoperire de 97% a genelor țintă, acoperind 739 de mutații cunoscute
înregistrate în baza de date COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer).

Purificarea ampliconilor
Pasul de purificare este necesar pentru a înlătura orice resturi rămase de ADN
genomic și amorse și pentru a asigura calitatea înaltă a ampliconilor. Procesul are loc
folosind un suport magnetic DynaMag -2 și reactivul “Agencourt AMPure XP” de la
Beckman Coulter ce conține particule magnetice ce leagă fie ADN genomic sau ampliconii,
în funcție de rata volumetrică dintre particulele magnetice și probă.

Digestia parțială a amorselor

Pentru a putea continua cu pasul de secvențiere a ampliconilor, amorsele folosi te
pentru amplificarea țintită prin PCR trebuie îndepărta te.

Marcarea ampliconilor
După pasul de purificare, ampliconii trebuie marcați cu un cod specific, ce permite
desfășurarea reacțiilor multiplex posibile pe secvenți atorul Ion Torrent.

Amplificarea și Nick -translation a bibliotec ii marcate are loc conform protocolului
producătorului, folosind reactivul Platinum PC R SuperMix High Fidelity și Library
Amplification Primer Mix .

Cuantificarea biblioteci i de ampliconi

Cuantificarea bibliotec ii are loc folosind kit -ul “Ion Library Quantification Kit” (Life
Technologies) și platforma ViiA7 RT -PCR (Life Technologies) , urmărind în același timp
instrucțiunile producătorului. Acest pas include prepararea unor serii de diluții pentru

Roxana M. Cojocneanu
13
biblio teca de control E coli DH10B, fiind cunoscută concentrația inițială, diluții ce sunt
folosite pentru efectuarea unei curbe standard pentru determinarea concentrației probelor de
ampliconi.
După ce toate bibliotecile de ampliconi au fost diluate la o concentrație uniformă,
probele au fost repartizate în grupe de 4 într -o manieră echimolară, în vederea procesării
ulterioare și a secvențierii . Acest pas a fost posibil datorită capacităților multiplex oferite de
folosirea codurilor u nice.

Amplificarea biblioteci i ISP (Ion Sphere Particles)

“Ion Sphere Particles” (ISPs) reprezintă particule mici de polistiren de care sunt
atașați ampliconii via adaptorilor AP ce au fost legați anterior de biblioteci . Cu ajutorul
tehnologiei, librăriile sunt supuse unei amplificări clonale în sistemul Ion OneTouch, sistem
ce face parte din platforma Ion Torrent PGM.

Îmbogătirea ISP

Acest pas din procesul de preparare a bibliotecilor asigură o încărcare eficientă a
chip-ului de secvențiere și o calitate superioară a secvențierii în sine. Scopul îmbogățirii ISP
constă în eliminarea particulelor ISP ce nu au librării de ampliconi atașate, iar acest pas este
obținut cu ajutorul complexului biotină -streptavidină.

Încărcarea chip -urilor “316”

Înainte de încărcarea ISP pe chip -urile de secvențiere, anumiți reactivi trebuie
adăugați bibliotecilor , precum particule de control, amorse și enzima polimerază ce va
adăuga nucleotidele prin formarea unei legături fosfodiest erice. Apoi, fiecare grup de 4
librării codate a fost încărcat pe chip -urile “316”, ce sunt foloste pentru obțierea a 100 Mb
de date. Chip -ul este plasat pe platforma Ion Torrent PGM, ce a trecut anterior printr -o serie
de etape de spălare și inițiere . Tor rent Server , ce este conectat la aparatul PGM , permite
utilizatorului să monitorizeze online procesul de secvențiere, inclusiv parametrii de încărcare
pe chip, procentul de ISP cu matrițe, și particulele de clonare, cantitatea de complexe primer –
dimer, etc
Programul Torrent Suite V4.4 preinstalat pe server -ul conectat la platforma de
secvențiere a fost folosit pentru a realiza primii pași ai analizei datelor, în principal

Summary
procesarea semnalului și identificarea bazelor . Toate secvențele obținute au fost ali niate la
Genomul Uman 19 (hg19), iar variantele au fost identificate folosind Variant Caller 4.4.0.6
cu scopul de a detecta mutațiile somatice, setând parametrii regiunilor țintă pentru panelul
AmpliSeq CP.20131001 .
Tabelul 3.1.6 arată anumite date statis tice pentru fiecare chip folosit pentru
secvențierea celor 31 de probe tisulare de cancer de sân triplu negative, informații obținute
din raportul generat de programul Torrent Suite la sfâr șitul fiecărei ture de secvențiere .

Tabel 3.1.6 Date statistice pentru cele 9 chip -uri folosite pentru secvențierea probelor

Tura
(numărul
chip-
ului) Numărul
total de
baze (Mbp) Numărul total
de baze Q20
(Mbp) Numărul
total de
citiri Lungime
medie
(bp) Cea mai
lungă
citire
(bp) Cea mai
lungă
aliniere
AQ20 (bp)
1 142.59 123.68 1,661,227 85 197 167
2 180.07 153.88 2,125,563 84 195 170
3 78.93 65.52 983,722 80 202 166
4 14.65 13 173,907 84 195 169
5 27 24.2 327,619 82 190 165
6 208.91 191.85 2,731,127 76 368 270
7 217.34 195.63 2,878,130 75 389 241
8 50.8 47.26 666,223 76 340 252
9 201.16 175.6 2,728,373 73 377 265

Odată ce variantele prezentate în proba de secvențiere au fost identificate prin
aplicarea unor „plug -in”-uri prezente în programul Torrent Suite, a ceste modificări de
nucleotide au trebuit caracterizate. În acest sens, fișiere le .vcf generate pentru fiecare din cele
31 de probe au fost descărcate și transferate pe un calculator pe care rulează Ubuntu 10.04,
iar pentru a analiza datel or și adnota rea variantele lor a fost folosit p rogramul ANNOVAR în
linie de comandă (44). Aceste unelte folosesc informații din diferite baze de date precum
COSMIC, 1000genomes, refGene, dbSNP, sau ClinVar, pentru a adnota mutațiile
descoperite în experimentul de secvențiere , dar și pentru a atribui un scor PolyPhen -2
(Polymorphism Phenotyping version2) mutațiilor nonsinonime, estimând astfel posibilele
daune și statusul benign.

Roxana M. Cojocneanu
15
Rezultate și discuții

Experimentul de secvențiere condus pe cele 31 de probe de țesut la parafină de la
pacienți diagnosticați cu cancer de sân triplu negativ a evaluat mutațiile din 46 de oncogene
și gene supresoare de tumori, din care s -au evidențiat mutații în 37 de gene . După filtrarea
variantelor cu parametri de calitate reduși , numărul t otal de mutații găsite în cele 37 de gene
a ajuns la 165. Variantele sinonime au fost de asemenea excluse, datorită faptului că aceste
tipuri de substituții nucleotidice nu determină nicio modificare a aminoacizilor .
Evaluarea clinică a acestor mutații a fost făcută conform scorului PolyPhen -2, ce
prezice modificările funcționale de la nivelul proteinelor ca rezultat a l mutațiilor punctiforme
non-sinonime (nsSNP). Din cele 165 de mutații identificate în probele TNBC, 70 au fost
clasificate ca și dăunătoare , 22 posibil dăunătoare și 27 au fost considerate benigne, conform
scorului PolyPhen -2 pentru mutații somatice . Celelalte 46 de mutații nu au avut semnificație
clinică conform acestui algoritm (Figura 3.1.8).

Figure 3.1.8 Semnificația clinică a mutații lor identificate conform scorului
PolyPhen -2

Din numărul total de variante, 25 erau cunoscute – din care 16 au fost de ja descrise
în baza de date COSMIC – în timp ce celelalte 140 erau mutații noi. Cele 138 de mutații
exonice au fost grupate în patru categorii: mutații missens e – ce de obicei sunt mutații
punctiforme ce cauzează schimbarea unui aminoacid; mutații nonsense – unde schimbul de
nucleotidă conduce la ap ariția unui codon stop prematur , ducând la apariția unui ARNm
nefuncțional; mutații de decalare a cadrului de citire (frameshift) – unde se modifică codonul
și se schimbă cadrul de citire, generând un model translational diferit , și deleții fără
schimbare a cadrului de citire (no frameshift deletions) – ce reprezintă deleții de multipli de
trei nucleotide, ce nu modifică citirea codonilor, dar conduc la deleții în numărul
corespunzător de aminoacizi, generând astfel o proteină modificată . 27227046
benignposible damagingdamagingno clinical assesment
0 10 20 30 40 50 60 70 80

Summary
Majoritatea mutațiilor ce nu au avut niciun impact clinic ca rezultat al analize i datelor
au fost observate în proba 14. Dintre aceste mutații, cea cu cea mai mare frecvență în grupul
studiat s -a regăsit în gena AKT1, o mutații intronică G > A, deja prezentă în baza de date
dbSNP, ce a fost identificată în 9 probe.
Mutațiile posibil dăunătoare, cărora li s -a atribuit un scor PolyPhen -2 ce variază între
0.505 și 0.956, au fost observate în 13 gene, dintre care cele mai frecvent mutante au fost
KDR, cu mutații observate în 12 probe . Celelalte mutații au fost observate în mare parte doa r
într-o singură probă, cu excepția unora – una în ATM și una în SMAD4, ce au fost observate
în două probe din 31. Mutațiile cu cel mai mare scor PolyPhen -2, încadrat între 0.965 și 1.0,
au fost observate în 29 dintre gene, majoritatea fiind g ăsite doar în tr-o probă.
Din totalul de 37 de gene ce au fost gasite mutante în acest experiment, genele ce au
prezentat cele mai frecvent e mutații au fost TP53 (mutant în 19 probe), KDR (în 13 probe) ,
PIK3CA (în 12 probe), AKT și ATM (fiecare mutante în 11 probe), JAK3 (în 5 probe), MET,
SMAD4, FGFR2 și FGFR3 (fiecare mutante în 4 probe), PTEN, ABL1 și ERBB4 (fiecare
găsite mutante în 3 pro be). Aceste gene prezintă un interes nu doar prin faptul că sunt cel
mai frecvent mutante în probele noastre și fiecare având cel mai mare număr de mutații
individuale, dar și prin faptul că au fost caracterizate în numeroase studii ca gene cu mutații
legate de cancer. Fiind implicate în multe căi de semnalizare și procese celulare precum
ciclul celular, reparare a ADN, creștere și proliferare, orice modificare ce apare în aceste gene
are potențialul de a genera sau de a fi implicate în modificări conectate cu tumorigeneza,
progresia sau răspunsul la terapie (45, 46) .
Aplicarea metodelor de bioinformatică cu scopul de a descoperi mutații prezente în
oncogene sau gene supresoare de tumori de la pacienți cu cancer de sân și cu accent asupra
sub-tipului mai agresiv triplu negativ, prezintă chiar mai multă importanț ă atunci când sunt
corelate rezultatele cu informațiile clinice ale pacienților, precum existența unor posibile
metastaze. Genele ce au prezentat cele mai multe mutații în probele de la pacienți cu
metastaze au fost TP53, KDR, AKT1 și PIK3CA , ce de asemenea coin cid cu cele mai
mutante gene din din toate cele 31 de probe.
Rezultatele generate de studiul present au fost în concordanță cu activitatea de
cercetare condusă de alte echipe de cercetare. Analizând probe tisulare de cancer de sân sau
plasma de la pacienț i cu malignități mamare și folosind acee ași platformă de secvențiere, Ion
Torrent Personal Genome Machine, și aceleași kituri de preparare a librăriilor – reactivi
AmpliSeq, alte echipe au descoperit de asemenea că numărul cel mai mare de mutații

Roxana M. Cojocneanu
17
somatice se regăsesc în genele PIK3CA, PTEN, AKT1, TP53, SMAD4 , oferind un prim grad
de validare acestui studiu (47, 48) .

Validarea mutațiilor identificate

Pentru a lua în considerare inițierea posibilității de a traduce analiza bioinformatică
a datelor SNG în date cu semnificație clinică pentru diagnostic , prognostic sau cu scop de
biomarkeri, este obligatoriu să se valideze mutațiile obținute cu ajutorul unei tehnici bazate
pe alte principi i moleculare decât secvențierea. În această situație, metoda aleasă a fost
validarea TaqMan SNP Genotyping de la Life Technologies. Activitatea acestui test este
bazată pe două sonde ce sunt complementare cu alelele sălbatice și respective cu cele
mutante. Prin folosirea unor coloranți fluorescenți diferiți pentru fiecare probă, testul
dezvăluie prezența celei mai f recvente a lele, validând sau infirmând mutațiile identificate în
timpul analizei bioinformatice a datelor.
Am ales un număr total de 9 mutații diferite găsite în mai mult de o probă, din top 13
cele mai frecvent mutate gene. Validarea prin genotipare SNP a fost efectuată pentru toate
cele 31 de probe supuse secvențierii de nouă generație. O comparație între frecvența
mutațiilor, exprimată în procente, obținută după efectuarea celor două metode este prezentată
în figura 3.1.11.

Figur a 3.1.11. Frecvența mutațiilor identificate în analizele de secvențiere și
validare

Mutațiile obsevate după analiza datelor NGS au fost validate folosind testul de
genotipare SNP, cu excepția genei JAK3. Pentru aceasta, mutația ce a fost identificată cu
tehnologia NGS în câteva din probele analizate, nu a fost găsită în timpul procesului de
validare, cel mai probabil din cauza lipsei amplificării în etapa de PCR a studiului . Acest 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45KDR rs1870377AKT rs3730358ATM rs1800056KDR rs342231037JAK3 rs3213409MET rs56391007TP53 rs11540652TP53 rs28934576KIT rs 3822214AC
validation sequencing

Summary
fapt se poate datora cantității și/sau calității insuficiente a probei de ADN folosită, ținând
cont că acizii nucleici au fost extrași direct din secțiuni obținute din blocuri de parafină , fără
a mai trece printr -o microdisecție preliminară.
Cu toate acestea, faptul că o bună majoritate a mutațiilor punctiforme ce au fost
identificate în timpul secvențierii au fost validate cu testul de genotipare, demonstrează că
datele obținute în urma Secvențierii de Nouă Generație , analizate cu instrumente
bioinfo rmatice potrivite și interpretate correct, au potențialul de a deveni un instrument clinic
folositor, ducând în final la un management mai bun a l bunăstării pacienților.

Limitări și considerări ulterioare

Ca și o limitare pentru acest studiu – ce repre zintă în același timp o motivare în a
continua – este amintit faptul că a fost condus pe un număr relativ mic de pacienți, mărimea
cohortei fiind constrânsă de nevoia de a avea, pe lângă material biologic potrivit, rezultate
semnificative ce pot fi urmărit e și informații recente despre starea vitală a subiecților. O altă
limiatare a fost reprezentată de informațiile relativ incomplete despre pacienți, ce a îngreunat
realizarea de corelații semnificative dintre mutațiile ob servate în probe, datele clinice și
rezultatul final . Aceste limitări trebuie depășite de studii ulterioare pe grupuri mai mari de
pacienți, cu rezultate ulterioare și informații clinice suficiente, pentru a fi posibilă corelarea
semnificativă între mutații și fenotipurile pe care le -ar put ea determina.

Concluzii

Prin secvențierea a 31 de probe tisulare de cancer de sân triplu negativ provenit e din
blocuri de parafină, folosind platforma Ion Torrent PGM pentru secvențierea de nouă
generație, am obținut atât mutații cunoscute cât și necuno scute în 34 de gene implicate în
numeroase căi de semnalizare ce au loc în timpul dezvoltării și progresiei tumorale . Prin
folosirea metodelor de bioinformatică pentru analiza datelor cu ajutorul unor alinieri
succesive cu diferite baze de date, am reușit să identificăm o serie de mutații, o parte
regăsindu -se în literatură ca fiind implicate în cancerul de sân, fapt ce demonstrează, până la
un anumit punct, eficiența acestei metode. Prin folosirea metodei de genotipare SNP bazată
pe tehnologia PCR, am val idat o parte din mutații le prezente în mai mult de o probă, în opt
dintre cele 13 cele mai frecvent mutate gene, demonstrând eficiența analizelor de
bioinformatică aplicate datelor obținute în urma Secvențierii de Nouă Generație . Aceste
rezultate preliminare generate de studiul ce se situează printre primele desfășurate asupra

Roxana M. Cojocneanu
19
populației din România , demonstrează că bioinformatica reprezintă o unealtă puternică ce
poate completa golul dintre cantitatea mare de date obținută în urm a efectuării secvențierii
de nouă generație și interpretarea și integrarea informației semnificative ce poate fi folosită
în final în beneficiul pacienților.

Summary
3.2. STUDIU MICROARRAY : Analiza bioinformatică a datelor microarray și
extrapolarea porc -om în relație cu expunerea la Zearalenone și Escherichia coli
(Părți din acest capitol au fost submise spre publicare în PLOS ONE )
Modele animale – când și de ce le folosim?

Modelele animale au ajutat la întelegerea unui număr mare de boli, precum cancerul,
diabetul, boli cardiovasculare, osteoporoza, HIV, dar și a unor diferite tulburări a le
sistemului nervos . Multe studii comparative au condu s nu numai la progresul medicinei
umane, dar și la acumularea rapidă de cunoștințe referitoare la medicina veterinară, ajutându –
ne astfel să diagnosticăm mai precis și să ingrijim animalele noastre de companie și cele ce
impart habitatul cu noi. În același timp, multe specii de animale su nt crescute de către oameni
ca hrană sau pentru a fi folosite în procese biotehnologice farmaceutice. Acest e efective de
animale trebuie ținut e în condiții optime de sănătate, iar rezultatele studiilor comparative pot
fi de asemenea folositoare și pentru a ceste tipuri de întreprinderi (49-51).
Pe lângă animale tradiționale de laborato r pentru precum șoareci sau șobolani , și alte
specii au devenit folositoare pentru diferite studii preclinice, cum ar fi primatele, porcii,
vacile și alte animale domestice . În primul rând, multe dintre ele împart aceleași boli și
același tip de răspuns la tratamente corespunzătoare cu oamenii. Aceste similarități
avansează și mai profund, la nivel celular și subcelular, împărțind căi moleculare și procese
biochimice echivalente (52-54). Dar aceste similarități există și la scară mai largă, ținând
cont de faptul că oamenii și animalele locui esc în același habitat, fiind expuși la ace iași
factori ecologici și la acele ași condiții de trai.
În consecință, folosirea modelelor de animale pentru cercetări preclinice, în special
în cazul studiilor de tip ”proof of concept” , este necesară și deține pro misiuni pentru viitoare
dezvolt ări interdisciplinar e. Dar, așa cum vom demonstra în continuare, rezultatele generate
de aceste studii pot fi analizate ș i interpretate folosind unelte de bioinformatică cu scopul de
a le extrapola la oameni.

Introducerea și motivația acestui studiu

Zealarenon a (ZEA) este un metabolit secundar produs de anumite specii ce aparțin
genului Fusarium , un grup comun de fungi (55, 56) . Acestea sunt toxine comune prezente
în aproape toate tipurile de recolte, inclusiv cele folosite pentru hrana animalelor de fermă,
dar și cereale consumate de către oameni (57-59). Altă sursă de contaminare pentru ambele

Roxana M. Cojocneanu
21
specii este bacteria Escherichia coli , un bacil Gram negativ ce include numeroase tulpini ce
populează majoritar intestinele multor specii de animale . Intestinul reprezintă o barieră
importantă între organism și mediul inconjurător, așadar interacționează extins atât cu
microflora existent ă, dar și cu eventualii agenți patogeni ce pot să apară (60-62).
Modelul animal folosit în acest studiu este porcul, datorită asemănărilor
histopatologice amintite mai devreme dintre Sus scrofa și Homo sapiens . De asemenea,
porcii consumă cantități mari de porumb, cereală ce este predispusă la infecția micotoxică
cu Fusarium (63) și care este și un aliment de bază în alimentația oamenilor.

Tehnologia Microarray – Privire de ansamblu

Tehnologia microarray poate fi folosită pentru caracterizarea profilului expresiei
genice a tumorilor, luând în considerare faptul că expresia gene lor – în special a celor
implicate în oncogeneză, precum oncogenele și genele supresoare de tumori – este direct
responsabilă de comportamentul celulelor transformate (22, 64) . Prin analiza simultană a
unui număr mare de transcripți și producerea conse cutivă a unei cantități mari de date,
această tehnologie deține abilitatea de a captura modificările relaționate cu tumorigeneza la
nivel de genom complet.

Materiale, metode și protocoale

Probele biologice ce constau în 15 probe tisulare de splină și 15 de duoden au fost
colectate de la porci nou -născuți. Animalele au fost expuse anterior unei contaminări
experimentale de 100 ppb cu zearalenone (ZEA) și Escherichia coli , fie ca și agenți de
contaminare singulari, fie în combinație.

Extracția de ARN total cu TRI Reagent (Sigma -Aldrich)

Probele tisulare au fost omogenizate în prezența TRI Reagent -ului folosind mixer -ul
Polytron . Apoi, cantitatea totală de ARN a fost extrasă folosind metoda fenol -cloroform.

Purificare a ARN folosind RNeasy Mini Kit (Q iagen)

Purificarea cantității totale de ARN a fost condusă în concordanță cu protocolul
recomandat de producătorul kitului de extracție.

Summary
Cuantificarea ARN

Evaluarea cantitativă a ARN extras și purificat este realizată prin folosirea
spectrofotometrului NanoDrop -1000 (Thermo Scientific), în timp ce calitatea probelor ARN
a evaluată folosind Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) ce practică o tehnică bazată pe
electroforeză, miniaturizată la nivel de chip – tehnologia în sine fiind patentată sub numele
de “Lab -on-a-Chip”. Prepararea sondelor pentru microarray, hibridizarea, scanarea și pre –
procesarea datelor au fost conduse urmărind protocolul recomandat furn izat de către
producător (Agilent).
Sinteza sondelor

Sondele folosite pentru evaluarea expresiei genice prin microarray, ARNc -Cy3, au
fost generate folosind metoda unei singure culori, metodă realizată cu ajutorul Agilent Low
Input Quick Amp Labeling Kit (5190 -2305).

Purificarea sondelor

Kit-ul folosit pentru purificarea sondelor de microarray a fost RNeasy Mini Kit de la
Qiagen.

Cuantificarea sondelor și diluția

Cu scopul de a asigura parametri i potriviți pentru probele ARNc , a fost condus un
control de calitate folosind aparatul NanoDrop -1000 , prin selectarea secțiunii Măsurare
Microarray , iar apoi randamentul și diluțiile au fost calculate folosind drept orientare datele
furnizate de către producător în protocolul original (Agilent manual: G4140 -90040).

Hibridizarea sondelor

Sondele au fost hibridizate pe lame Agilent 8 x 60k , conținând un panel personalizat
(AMADID 056850) compus din 60 de oligomeri pentru mai mult de 59,000 de sonde
repre zentative pentru un număr mare de transcripți de Sus scrofa , folosind Gene Expression
Hybridization Kit de la Agilent, conform protocolului.

Procesarea datelor

Scanarea lamelor microarray generează un fișier de tip .tiff pentru fiecare probă, fișier
ce poate fi încărcat în programul Feature Extraction, versiunea 11.0.1.1. Acest program

Roxana M. Cojocneanu
23
citește, interpretează și integrează fișierele microarray tip imagine prin introducerea în mod
automat a grilei potrivite, marcare și excluderea pixelilor ce se gasesc ca fiind aberanți și
prin calcularea intensității și ratei fiecărei trăsături. După generarea parametrilor pentru
raportul de control al calități i, programul generează apoi un fișier de ieșire tip . txt ce conține
date numerice pentru analiza datelor.

Analiza datelor

Analiza bioinformatică a datelor de microarray din probele porcine de duoden și
splină a fost condusă cu ajutorul programului Gene Spring GX , versiunea 13.0, dezvoltat de
Agilent Technologies. Fișierul .txt ce corespune fiecărei probe a fost încărcat în program, iar
fiecare probă a fost identificată și adnotată conform tipului de tratament/expunere la
contaminare . Abordarea din studiul pre zent a constat în tratarea probelor din fiecare tip de
țesut diferit, fapt ce creează în consecință două experimente diferite: unul pentru țesutul
duodenal și unul pentru cel splenic. Analiza diferențială a fost efectuată după ce s -au aplicat
filter și teste statistice.
Un factor de expresie (fold change) de 2.0 a fost aplicat întregilor liste pentru cele
trei perechi de condiții din fiecare experiment: ZEA vs control, E coli vs control, și ZEA+ E
coli vs control , atât pentru duoden cât și pentru splină, iar transcripții au fost considerați
semnificativi atunci când aveau o valoare p mai mica de 0. 05.

Table 3.2.5. Numărul de transcripți exprimați diferențial și semnificativi din punct de
vedere statistic în toate perechile de condiții
Tip de țesut Perechi de condiții FC Valoare
p Nr de gene
semnificative statistic Număr de gene
semnificative
statistic cu FDR
Duoden E coli_vs_ctrl 2.0 0.05 3,058 2,875
Zea_vs_ctrl 2.0 0.05 4,023 0
Zea_E coli_vs_ctrl 2.0 0.05 804 316
Splină E coli_vs_ctrl 2.0 0.05 3,677 3,446
Zea_vs_ctrl 2.0 0.05 467 23
Zea_E coli_vs_ctrl 2.0 0.05 570 141

Summary
Dintre acești transcripți a căror expresie a fost considerat ă modificată ca rezultat la
expunerea la contaminanți , unii sunt suprexprimați , în timp ce pentru unii transcrierea este
semnificativ redusă.

Raționamentul pentru metod a de extrapolare

În experimentul nostru de genomică funcțională și structurală am folosit paneluri de
gene personalizate, fapt ce prezintă numeroase avantaje, dar și dezavantaje, datorită lipsei
caracteristicilor comerciale, precum adnot ări extinse și posibilități de extrapolare complete.
Astfel, d oar o parte din secvențele sondelor conținea un nume de genă corespunzător
nomenclaturii cunoscute, iar unele dintre sonde conțineau nume de identificare ce variau din
punct de vedere taxonomic, multe din ele nefiind incluse în bazele de date comune.

Succesiunea de metode pentru extrapolare

Pentru a putea extrapola rezultatele obținute, cu scopul de a identifica echivalentul la
om al transcripților exprimați diferit față de gr upul de control din experiment , a fost necesară
efectuarea unor etape succe sive de alinieri și conversii, folosind programe ca și Galaxy Suite
și Linux .

Rezultate și discuții

Ca rezultat al acestei metode, am obținut un fișier ce contine lista de ID -uri pentru
probele originale într -o coloană, iar în cealaltă, numele genei corespunzătoare la om. Cu
ajutorul programului Excel, am adnotat în continuare fiecare din transcripții original i porcini
exprimați diferențiat ce au fost generați de c ătre analiza GeneSpring , cu ortologul său uman .

Concluzii parțiale pentru metoda de extrapolare

Am reușit să identificăm echivalentul genelor umane ce sunt exprimate diferențiat
într-o manieră semnificativă din punct de vedere statistic, întelegând astfel mai bine
modalitatea prin care co -contaminare a poate afecta atât porcii, cât și oamenii, două specii ce
împart multe similarități anatomice, fiziologice, de dietă și de mediu. În această er ă “omic s”,
unde situații similare pot fi întâlnite de către cercetători ce folosesc diverse modele animale,

Roxana M. Cojocneanu
25
noua noastră metodă de extrapolare de la animal la om a numelor de gene oferă o soluție
inovativă pentru analiza eficientă și interpretare a datelor.

Efectul extrapolării co -contaminării la oameni

După ce procesul de extrapolare s -a finalizat, a fost posibilă deducerea potențialelor
efecte a le micotoxinei zearalenone, singulare sau atunci când întâlnește tulpini patogene de
E coli, asupra unor părți importante a le tractului digestiv uman. Genele au fost ordonate
conform status -ului lor, sub- sau supraexprimate , și ținând de asemenea cont de valoarea p.

Modelul de evaluare a expresiei genice în experiment ul pe duoden

Din cauza numărului mare de gene al e căror alte rări influențează un număr la fel de
mare de căi de semnalizare, precum și din cauza constrângerilor de spațiu , interpretarea
rezultatelor a fost concentrată pe efectul zearalenonei asupra probelor de duoden.
Raționamentul din spatele alegerii acestui organ se regăsește în faptul că duodenul este
primul segment al intestinului subțire, reprezentând una din interfețele dintre organism și
potențialii patogeni, prima barieră intestinală ce protejează corpul.
Uitându -ne la transcripții ce prezintă alter ări semnifi cative, modelul ce reiese constă
în implicarea acestor transcripți în căi de semnalizare ce includ procese moleculare conectate
cu evenimente celulare ca și apoptoza, ciclu l celular, replicare și diferențiere . Corelarea cu
anumite semne distinctive a le cancerului confirm ă ipoteza noastră conform căreia efectele
zearalenone i contribuie la transformarea malign ă, atât singură, cât și în co -contaminare cu E
coli.

Analiza rețelelor de semnalizare

Folosind programul Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Qiagen), am reușit să
investigăm în continuare implicațiile moleculare și celulare a acestor gene a căror expresoe
a fost semnificativ alterată ca și răspuns la expunerea la ZEA la nivelul duodenului. Așadar,
am identificat cele mai importante căi canonice de semn alizare, la fel ca și topul funcțiilor
biologice și patologice a le celor mai afectate gene, prin introducere în programul IPA a listei
de gene generate după aplicarea unui fold change de 2.0 .

Summary
Tabel 3.2.7. Top 5 căi canonice modulate de ZEA la nivelul duodenului
Căi canonice Valoare -p Suprapunere
1 Rolul macrofagelor, fibroblaștilor și celulelor
endoteliale în artrita reumatoidă 0.0000000181 18.1 % 54/298
2 Semnalizarea TREM1 0.00000145 26.7 % 20/75
3 Semnalizarea kinazei proteice A 0.00000163 15.3% 59/385
4 Reglarea cancerului de sân de către Stathmin1 0.00000429 18.3 % 35/191
5 Feedback -ul Dopamine -DARPP32 în
semnalizarea cAMP 0.00000522 19.3 % 31/161

Precum se poate observa, majoritatea moleculelor cu un pattern de expresie alterat
aparțin căilor de semnalizare implicate în inflamație, creștere celulară și diferențiere,
apoptoză, formarea citoscheletului, etc., procese ce sunt conectate cu transformare a malign ă
(65-67).

Concluzii

Mulți dintre transcripții ce au prezentat nivel uri de expresie alterate fac parte din căi
de semnalizare implicate în procese celulare și moleculare cheie, dar și în promovarea
inflamației, ce, după cum a fost demonstrat de numeroase studii, este conectată direct cu
dezvoltarea și progresia tumorilor maligne. Așadar, se poate concluziona că expunerea
prelungită la zearalenon ă, o micotoxină comună găsită ca și contaminant în cereale, e posibil
să fie corelată cu activarea unor procese moleculare inflamatorii de promovare a dezvoltării
tumorilor (68).
Cu toate că informația în sine este importantă, valoarea studiului se poate regăsi în
metoda nouă de bioinformatică ce a fost dezvoltată pentru acest experiment, fiind astfel
posibilă extrapolarea rezultatelor la oameni, având în vedere faptul că aceste do uă specii
împart numeroase caracteristici, de la anatomie, fiziologie, patologie, până la factori de
mediu și contaminanți. Așadar, folosirea bioinformaticii pentru descifrarea informațiilor de
tip “high throughput” generate de tehnologiile moleculare mod erne și studiile pe model e de
animale, pot contribui în final la îmbunătățirea vieții umane.

Roxana M. Cojocneanu
27
4. CONCLUZII GENERALE

Scopul prezente i teze a fost de a evidenția modalitatea în care analizele
bioinformatice pot să contribuie la personalizarea diagnosticului și terapiilor, prin folosirea
de tehnologii bio -molecular e de tip ”high throughput” cu scopul de a analiza profilul
molecular a l condițiilor fiziologice și patologice. Prin folosirea uneltelor și metodelo r de
analiză bioinformatice pentru interpretarea și integrarea cantității mari de date generate de
aceste tehnologii , va fi în curând posibilă developarea de metode rapide și eficiente aplicabile
în special în domeniul oncologiei.
Analiza, integrarea și i nterpretarea rezultatelor obținute în urma acest or experiment e
de cercetare duc la formularea următoarelor concluzii generale:
Pentru experimentul ce conține secvențierea de nouă generație , prin folosirea
metodelor de bioinformatică pentru analiza datelor cu ajutorul alinierilor succesive cu
diferite baze de date, am reușit să identificăm o serie de mutații, o parte din ele fiind deja
descrise în literatură ca fiind implicate în cancerul de sân, fapt ce dovedește până la un
anumit punct, eficiența metodei f olosite . Unele mutații găsite nu au putut fi corelate în mod
direct cu cancerul de sân, bazându -ne explusiv pe literature, însă au fost descrise ca fiind
implicate în afectarea unor căi de semnalizare tumorigenice. Metoda de genotipare SNP
bazată pe tehnologia PCR a contribuit la validarea unor mutații identificate, demonstrând
eficiența analizelor bioinformatice a datelor obținute în urma Secvențierii de Nouă
Generație. Mutațiile noi ce au fost descoperite sunt supuse nevoii de caracteriza re ulterioară,
dar aceste rezultate preliminare , printre primele de acest gen din România, demonstrează că
bioinformatica reprezintă o unealtă puternică, capabilă să completeze golul dintre
cantitatea mare de date generate de secvențierea de nouă generație și interpretarea și
integrarea lor sub forma unor informații semnificative ce pot fi folosite apoi în beneficiul
pacienților .
În ceea ce privește studiul microarray, mulți dintre transcripți i ce au prezentat
nivel uri de expresie alterate sunt implicați în căi de semnalicare cruciale pentru anumite
procese celulare și moleculare, corelate cu dezvoltarea și progresia tumorilor maligne.
Așadar, se poate susț ine că expunerea prelungită la zearalenonă , o micotoxină comună găsită
ca și contaminant în cereale, poate fi conectată cu activarea proceselor moleculare
inflamatorii de promovare a tumorilor. Cu toate că informația în sine este importantă,
valoarea studiului se poate regăsi și în metoda nouă de bioinformatică ce a fo st dezvoltată

Summary
pentru acest experiment, fiind astfel posibilă extrapolarea rezultatelor la oameni, având în
vedere că aceste două specii împart numeroase caracteristici, de la anatomie, fiziologie,
patologie, până la factori de mediu și contaminanți. Așadar , folosirea bioinformaticii pentru
descifrarea informațiilor de tipul “high throughput” generate de tehnologiile moleculare
moderne și studiile pe modele animale, pot contribui în final la îmbunătățirea vieții umane .
În era “omic s”, atunci când situații similar pot fi des întâlnite de către cercetători ce folosesc
diferite modele animale, metoda noastră nouă de extrapolare a genelor de la animal la om
oferă o soluție inovativă pentru analiza și interpretarea efici entă a datelor.

Roxana M. Cojocneanu
29
Lista publicațiilor

Jurnale ISI
1. Cojocneanu Petric R , Braicu C, Raduly L, Zanoaga O, Dragos N, Monroig P,
Dumitrascu D, Berindan -Neagoe I. Phytochemicals modulate carcinogenic signaling
pathways in breast and hormone -related cancers. Onco Targets Ther. 2015 Aug
6;8:2053 -66. doi: 10.2147/OTT.S83597
2. Roxana Cojocneanu Petric , Cornelia Braicu, Cristian Bassi, Laura Pop, Ionelia
Taranu, Nicolae Dragos, Dan Dumitrascu, Massimo Negrini, Ioana Berindan –
Neagoe. Interspecies Gene Name E xtrapolation – A New Approach. Acceptat spre
publicare în PLOS ONE
3. Zaharie F*, Cojocneanu -Petric R* , Muresan M, Frinc I, Dima D, Petrushev B,
Tanase A, Berce C, Chitic M, Berindan -Neagoe I, Pileczki V, Irimie A, Tomuleasa
C. Small molecules against B -RAF (BRAF) Val600Glu (V600E) single mutation.
Int J Nanomedicine. 2015 Jul 31;10:4897 -9. doi: 10.2147/IJN.S87405
4. Tudoran O, Soritau O, Balacescu L, Visan S, Barbos O, Cojocneanu -Petric R ,
Balacescu O, Berindan -Neagoe I. Regulation of stem cells -related signaling
pathways in response to doxorubicin treatment in Hs578T triple -negative breast
cancer cells. Mol Cell Biochem. 2015 Jul 18
5. Cornelia Braicu, Valentina Pileczki, Laura Pop, Roxana Cojocneanu Petric , Sergiu
Chira, Eve Pointiere, Patriciu Achimas -Cadariu, Ioana Berindan -Neagoe, Dual
targeted therapy with p53 siRNA and epigallocatechingallate in a triple negative
breast cancer cell model, PLoS ONE 04/2015; 10(4).
DOI:10.1371/journal.pone.0120936
6. Cornelia Braicu, Roxana Cojocneanu -Petric , Sergiu Chira, Anamaria Truta,
Alexandru Floares, Patriciu Achimas -Cadariu, Ioana Berindan -Neagoe. Clinical and
pathological implications of miRNA in bladder cancer. International Journal of
Nanomedicine 2015:10 1 –10
7. Muresan M, Zaharie F, Bojan A, Frinc I, Dima D, Selice an S, Gafencu GA, Petrushev
B, Cojocneanu -Petric R , Tefas C, Cioca A, Irimie A, Berce C, Berindan -Neagoe I,
Tomuleasa C, Achimas -Cadariu P. MicroRNAs in liver malignancies. Basic science
applied in surgery. J BUON. 2015 Mar -Apr;20(2):361 -75
8. Claudia Gherman , Matea Cristian Tudor, Bele Constantin, Tabaran Flaviu, Razvan
Stefan, Bindea Maria, Sergiu Chira, Cornelia Braicu, Laura Pop, Roxana

Summary
Cojocneanu Petric , and Ioana Berindan -Neagoe Pharmacokinetics Evaluation of
Carbon Nanotubes Using FTIR Analysis and Hist ological Analysis. J. Nanosci.
Nanotechnol. 15, 2865 -2869 (2015)
9. Calin Ionescu, Cornelia Braicu, Roxana Chiorean, Roxana Cojocneanu Petric ,
Emilian Neagoe, Laura Pop, Sergiu Chira, Ioana Berindan -Neagoe. TIMP -1
expression in human colorectal cancer is asso ciated with SMAD3 gene expression
levels: a pilot study. J Gastrointestin Liver Dis 2014 Dec;23(4):413 -8
10. Laura -Ancuța Pop, Emil Puscas, Valentina Pileczki, Roxana Cojocneanu -Petric ,
Cornelia Braicu, Patriciu Achimas -Cadariu, Ioana Berindan -Neagoe. Quality control
of ion torrent sequencing library. Cancer Biomark 2014 ;14(2 -3):93 -101
11. Cornelia Braicu, Ioana Berindan -Neagoe, Valentina Pileczki, Roxana Cojocneanu –
Petric , Laura -Ancuța Pop, Emil Puscas, Alexandru Irimie, Rares Buiga. Breast
tumor bank: an importa nt resource for developing translational cancer research in
Romania. Cancer Biomark 2014 ;14(2 -3):119 -27
12. A Irimie, C Braicu, R Cojocneanu Petric , I Berindan Neagoe, RS Campian , Novel
technologies for oral squamous carcinoma biomarkers in diagnostics and
prognostics. Acta Odontologica Scandinavica. 2014;73(3):161 -8.
13. Berindan -Neagoe I, Braicu C, Pileczki V, Cojocneanu Petric R , Miron N,
Balacescu O, Iancu D, Ciuleanu T. 5 -Fluorouracil potentiates the anti -cancer effect
of oxaliplatin on Colo320 colorectal adenocarcinoma cells. J Gastrointestin Liver
Dis. 2013 Mar;22(1):37 -43

Jurnale BDI
1. Roxana Cojocneanu Petric , Laura -Ancuta Pop, Ancuta Jurj, Lajos Raduly, Dan
Dumitrascu, Nicolae Dragos, Ioana Berindan Neagoe. Next Generation Sequencing
Application for Breast Cancer Research. Clujul Medical, [S.l.], v. 88, n. 3, p. 278 –
287, jul. 2015. ISSN 2066 -8872
2. C. Gherman, V. Pileczki, R. Cojocneanu Petric , S. Rapuntean, S. Gherman, I.
Berindan Neagoe, Molecular mechanisms of action and prediction of response to
oxaliplatin in colorectal cancer cells. Annals of the Romanian Society for Cell
Biology 2012; 17(1):194 -200.
3. Gherman C, Pileczki V, Cojocneanu Petric R , Braicu C, Răpuntean S, Berindan
Neagoe I. In vitro studies for evaluation the antitumoral and immunomodul ator effect
of EGCG on Ehrlich Ascites. Archiva Zootechnica 15:2, 79 -87, 2012

Roxana M. Cojocneanu
31

Bibliografie select ivă

1. Casey G, Conti D, Haile R, Duggan D. Next generation sequencing and a new era of
medicine. Gut. 2013;62(6):920 -32.
2. Metzker ML. Sequencing technologies – the next generation. Nature reviews
Genetics. 2010;11(1):31 -46.
3. Shoemaker DD, Schadt EE, Armour CD, He YD, Garrett -Engele P, McDonagh PD,
et al. Experimental annotation of the human genome using microarray technology. Nature.
2001;409(6822):922 -7.
4. Trevino V, Falciani F, Barrera -Saldana HA. DNA microarrays: a powerful genomic
tool for biomedical and clinical research. Molecular medicine. 2007;13(9 -10):527 -41.
5. Hsi-Yang Fritz M, Leinonen R, Cochrane G, Birney E. Efficient sto rage of high
throughput DNA sequencing data using reference -based compression. Genome research.
2011;21(5):734 -40.
6. Batley J, Edwards D. Genome sequence data: management, storage, and
visualization. BioTechniques. 2009;46(5):333 -4, 6.
7. Zhang J, Chiodin i R, Badr A, Zhang G. The impact of next -generation sequencing
on genomics. Journal of genetics and genomics = Yi chuan xue bao. 2011;38(3):95 -109.
8. Luscombe NM, Greenbaum D, Gerstein M. What is bioinformatics? A proposed
definition and overview of the f ield. Methods of information in medicine. 2001;40(4):346 –
58.
9. Bodrova TA, Kostyushev DS, Antonova EN, Slavin S, Gnatenko DA, Bocharova
MO, et al. Introduction into PPPM as a new paradigm of public health service: an integrative
view. The EPMA journal. 20 12;3(1):16.
10. de Martel C, Ferlay J, Franceschi S, Vignat J, Bray F, Forman D, et al. Global burden
of cancers attributable to infections in 2008: a review and synthetic analysis. The Lancet
Oncology. 2012;13(6):607 -15.
11. Ferlay J, Soerjomataram I, Dik shit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al. Cancer
incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN
2012. International journal of cancer Journal international du cancer. 2015;136(5):E359 -86.
12. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. Estimates of
worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. International journal of cancer
Journal international du cancer. 2010;127(12):2893 -917.
13. Slavicek L, Pavlik T, Tomasek J, Bortlicek Z, Buchler T, Melichar B , et al. Efficacy
and safety of bevacizumab in elderly patients with metastatic colorectal cancer: results from
the Czech population -based registry. BMC gastroenterology. 2014;14:53.
14. Valastyan S, Weinberg RA. Tumor metastasis: molecular insights and ev olving
paradigms. Cell. 2011;147(2):275 -92.
15. Guise T. Examining the metastatic niche: targeting the microenvironment. Seminars
in oncology. 2010;37 Suppl 2:S2 -14.

Summary
16. Studer RA, Dessailly BH, Orengo CA. Residue mutations and their impact on protein
structure and function: detecting beneficial and pathogenic changes. The Biochemical
journal. 2013;449(3):581 -94.
17. Hochman J, Insel PA, Bourne HR, Coffino P, Tomkins GM. A structural gene
mutation affecting the regulatory subunit of cyclic AMP -dependent pro tein kinase in mouse
lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 1975;72(12):5051 -5.
18. Adzhubei IA, Schmidt S, Peshkin L, Ramensky VE, Gerasimova A, Bork P, et al. A
method and server for predicting da maging missense mutations. Nature methods.
2010;7(4):248 -9.
19. Kumar S, Suleski MP, Markov GJ, Lawrence S, Marco A, Filipski AJ. Positional
conservation and amino acids shape the correct diagnosis and population frequencies of
benign and damaging personal amino acid mutations. Genome research. 2009;19(9):1562 –
9.
20. Kumar P, Henikoff S, Ng PC. Predicting the effects of coding non -synonymous
variants on protein function using the SIFT algorithm. Nature protocols. 2009;4(7):1073 -81.
21. Tarca AL, Romero R, D raghici S. Analysis of microarray experiments of gene
expression profiling. American journal of obstetrics and gynecology. 2006;195(2):373 -88.
22. Slonim DK, Yanai I. Getting started in gene expression microarray analysis. PLoS
computational biology. 2009; 5(10):e1000543.
23. Altobelli G. Bioinformatics applied to gene transcription regulation. Journal of
molecular endocrinology. 2012;49(2):R51 -9.
24. Viceconti M, Hunter P, Hose R. Big Data, Big Knowledge: Big Data for Personalized
Healthcare. IEEE journal o f biomedical and health informatics. 2015;19(4):1209 -15.
25. Idris SF, Ahmad SS, Scott MA, Vassiliou GS, Hadfield J. The role of high –
throughput technologies in clinical cancer genomics. Expert review of molecular
diagnostics. 2013;13(2):167 -81.
26. Tran B , Dancey JE, Kamel -Reid S, McPherson JD, Bedard PL, Brown AM, et al.
Cancer genomics: technology, discovery, and translation. Journal of clinical oncology :
official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2012;30(6):647 -60.
27. Hansen AR, Be dard PL. Clinical application of high -throughput genomic
technologies for treatment selection in breast cancer. Breast cancer research : BCR.
2013;15(5):R97.
28. Hoelder S, Clarke PA, Workman P. Discovery of small molecule cancer drugs:
successes, challeng es and opportunities. Molecular oncology. 2012;6(2):155 -76.
29. Ren A, Dong Y, Tsoi H, Yu J. Detection of miRNA as non -invasive biomarkers of
colorectal cancer. International journal of molecular sciences. 2015;16(2):2810 -23.
30. Sozzi G, Boeri M, Rossi M, Verri C, Suatoni P, Bravi F, et al. Clinical utility of a
plasma -based miRNA signature classifier within computed tomography lung cancer
screening: a correlative MILD trial study. Journal of clinical oncology : official journal of
the American Society of Clinical Oncology. 2014;32(8):768 -73.
31. Cojocneanu Petric R, Pop LA, Jurj A, Raduly L, Dumitrascu D, Dragos N, et al. Next
Generation Sequencing Applications for Breast Cancer Research. Clujul Medical.
2015;88(3):278 -87.

Roxana M. Cojocneanu
33
32. Cleere DW. Triple negative br east cancer: a clinical update. Community Oncology.
2010;7(5):8.
33. Lawrence RT, Perez EM, Hernandez D, Miller CP, Haas KM, Irie HY, et al. The
proteomic landscape of triple -negative breast cancer. Cell reports. 2015;11(4):630 -44.
34. Lehmann BD, Pietenpo l JA. Identification and use of biomarkers in treatment
strategies for triple -negative breast cancer subtypes. The Journal of pathology.
2014;232(2):142 -50.
35. Boyle P. Triple -negative breast cancer: epidemiological considerations and
recommendations. Ann als of oncology : official journal of the European Society for Medical
Oncology / ESMO. 2012;23 Suppl 6:vi7 -12.
36. Stratton MR. Exploring the genomes of cancer cells: progress and promise. Science
(New York, NY). 2011;331(6024):1553 -8.
37. Buttitta F, Fel icioni L, Del Grammastro M, Filice G, Di Lorito A, Malatesta S, et al.
Effective assessment of egfr mutation status in bronchoalveolar lavage and pleural fluids by
next-generation sequencing. Clinical cancer research : an official journal of the American
Association for Cancer Research. 2013;19(3):691 -8.
38. Tripathy D, Harnden K, Blackwell K, Robson M. Next generation sequencing and
tumor mutation profiling: are we ready for routine use in the oncology clinic? BMC
medicine. 2014;12:140.
39. Tattini L, D'Aurizio R, Magi A. Detection of Genomic Structural Variants from
Next -Generation Sequencing Data. Frontiers in bioengineering and biotechnology.
2015;3:92.
40. Shen T, Pajaro -Van de Stadt SH, Yeat NC, Lin JC. Clinical applications of next
generation sequ encing in cancer: from panels, to exomes, to genomes. Frontiers in genetics.
2015;6:215.
41. Niedringhaus TP, Milanova D, Kerby MB, Snyder MP, Barron AE. Landscape of
next-generation sequencing technologies. Analytical chemistry. 2011;83(12):4327 -41.
42. Loman NJ, Misra RV, Dallman TJ, Constantinidou C, Gharbia SE, Wain J, et al.
Performance comparison of benchtop high -throughput sequencing platforms. Nature
biotechnology. 2012;30(5):434 -9.
43. Stranneheim H, Lundeberg J. Stepping stones in DNA sequencing. Biotechnology
journal. 2012;7(9):1063 -73.
44. Wang K, Li M, Hakonarson H. ANNOVAR: functional annotation of genetic
variants from high -throughput sequencing data. Nucleic acids research. 2010;38(16):e164.
45. Balko JM, Giltnane JM, Wang K, Schwarz LJ, Youn g CD, Cook RS, et al. Molecular
profiling of the residual disease of triple -negative breast cancers after neoadjuvant
chemotherapy identifies actionable therapeutic targets. Cancer discovery. 2014;4(2):232 -45.
46. Zhong X, Yang H, Zhao S, Shyr Y, Li B. Net work -based stratification analysis of 13
major cancer types using mutations in panels of cancer genes. BMC genomics. 2015;16
Suppl 7:S7.
47. Bai X, Zhang E, Ye H, Nandakumar V, Wang Z, Chen L, et al. PIK3CA and TP53
gene mutations in human breast cancer tu mors frequently detected by ion torrent DNA
sequencing. PloS one. 2014;9(6):e99306.

Summary
48. Liu S, Wang H, Zhang L, Tang C, Jones L, Ye H, et al. Rapid detection of genetic
mutations in individual breast cancer patients by next -generation DNA sequencing. Human
genomics. 2015;9:2.
49. Gauthier C, Griffin G. Using animals in research, testing and teaching. Revue
scientifique et technique. 2005;24(2):735 -45.
50. Festing S, Wilkinson R. The ethics of animal research. Talking Point on the use of
animals in scientifi c research. EMBO reports. 2007;8(6):526 -30.
51. Eliasof S, Lazarus D, Peters CG, Case RI, Cole RO, Hwang J, et al. Correlating
preclinical animal studies and human clinical trials of a multifunctional, polymeric
nanoparticle. Proceedings of the National Ac ademy of Sciences of the United States of
America. 2013;110(37):15127 -32.
52. Frazer KA, Elnitski L, Church DM, Dubchak I, Hardison RC. Cross -species
sequence comparisons: a review of methods and available resources. Genome research.
2003;13(1):1 -12.
53. Yang CS, Wang X, Lu G, Picinich SC. Cancer prevention by tea: animal studies,
molecular mechanisms and human relevance. Nature reviews Cancer. 2009;9(6):429 -39.
54. Cui X, Vinar T, Brejova B, Shasha D, Li M. Homology search for genes.
Bioinformatics. 2007;2 3(13):i97 -103.
55. Caldwell RW, Tuite J, Stob M, Baldwin R. Zearalenone production by Fusarium
species. Applied microbiology. 1970;20(1):31 -4.
56. Hidy PH, Baldwin RS, Greasham RL, Keith CL, McMullen JR. Zearalenone and
some derivatives: production and bio logical activities. Advances in applied microbiology.
1977;22:59 -82.
57. Yazar S, Omurtag GZ. Fumonisins, trichothecenes and zearalenone in cereals.
International journal of molecular sciences. 2008;9(11):2062 -90.
58. Fazekas B, Tar A. Determination of zearalenone content in cereals and feedstuffs by
immunoaffinity column coupled with liquid chromatography. Journal of AOAC
International. 2001;84(5):1453 -9.
59. Iqbal SZ, Rabbani T, Asi MR, Jinap S. Assessment of aflatoxins, ochratoxin A and
zearalenone in breakfast cereals. Food chemistry. 2014;157:257 -62.
60. Tenaillon O, Skurnik D, Picard B, Denamur E. The population genetics of
commensal Escherichia coli. Nature reviews Microbiology. 2010;8(3):207 -17.
61. Sekirov I, Russell SL, Antunes LC, Finlay BB. Gu t microbiota in health and disease.
Physiological reviews. 2010;90(3):859 -904.
62. Huffnagle G, Noverr MC. GI microbiota and regulation of the immune system.
Preface. Advances in experimental medicine and biology. 2008;635:v -vi.
63. Oswald IP, Desautels C, Laffitte J, Fournout S, Peres SY, Odin M, et al. Mycotoxin
fumonisin B1 increases intestinal colonization by pathogenic Escherichia coli in pigs.
Applied and environmental microbiology. 2003;69(10):5870 -4.
64. Berretta R, Moscato P. Cancer biomarker disco very: the entropic hallmark. PloS one.
2010;5(8):e12262.
65. Rakoff -Nahoum S. Why cancer and inflammation? The Yale journal of biology and
medicine. 2006;79(3 -4):123 -30.

Roxana M. Cojocneanu
35
66. Lu H, Ouyang W, Huang C. Inflammation, a key event in cancer development.
Molecula r cancer research : MCR. 2006;4(4):221 -33.
67. Kiraly O, Gong G, Olipitz W, Muthupalani S, Engelward BP. Inflammation -induced
cell proliferation potentiates DNA damage -induced mutations in vivo. PLoS genetics.
2015;11(2):e1004901.
68. West AC, Jenkins BJ. Inflammatory and Non -Inflammatory Roles for Toll -Like
Receptors in Gastrointestinal Cancer. Current pharmaceutical design. 2015;21(21):2968 -77.