Agenti Biologici Utilizati In Biotehnologiile Farmaceutice

2. AGENȚI BIOLOGICI UTILIZAȚI ÎN BIOTEHNOLOGIILE FARMACEUTICE

Cea mai importantă grupă de agenți biologici utilizați în biotehnologiile farmaceutice o reprezintă grupa microorganismelor reprezentate de bacterii, drojdii, fungi, viruși. În secolul al XX-lea , au fost realizate ample cercetări pentru cunoașterea structurii și metabolismului acestor microorganisme utile, precum și a geneticii lor. Prin mutații induse artificial cu radiații X, cu radiații ultraviolete sau cu unele substanțe chimice de tipul nitrozoguanidinei, s-au obținut tulpini mutante cu potențial productiv ridicat. Un exemplu în acest sens este genul Penicillium sp., la care sușele sălbatice produceau circa 60 mg de penicilină, pe când tulpinile mutante obținute prin mutații induse artificial produceau circa 20 g de penicilină.

Dezvoltarea ingineriei genetice și a tehnologiei ADN recombinat a permis manipularea informației genetice a microorganismelor industriale, prin transferul de gene de la o specie la alta, în vederea obținerii de agenți biologici recombinați, capabili să mărească foarte mult eficiența proceselor biotehnologice de obținere a unor substanțe cu rol terapeutic.

Într-un proces biotehnologic farmacoceutic trebuie respectat un principiu fundamental și anume concordanța dintre alegerea agentului biologic și principiul tehnologic. Dacă agentul biologic este o tulpină microbiană, aceasta trebuie să manifeste stabilitate genetică în toate ciclurile de producție, pentru a nu fi afectat potențialul productiv și declarat astfel ca fiind netehnologic.

2.1 Drojdiile

Cuprind peste 500 de specii, fiind organisme de tip eucoriot, având nucleu prevăzut cu membrană nucleară, diviziune celulară de tip mitotic și meiotic și un anumit număr de cromozomi, în funcție de specie. Ele aparțin la trei clase de fungi: Ascomycetis, Bazidiomycetes și Denteromycetes. Cele mai importante specii de drojdii utilizate în procesele biotehnologice farmaceutice sunt: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Candida lipolytica.

Drojdia Saccharomyces cerevisiae este microorganismul eucariot cel mai studiat, fiind cel mai utilizat în procesele biotehnologice din industria farmaceutică datorită modificărilor genetice realizate prin tehnologia ADN recombinat și datorită accesului la secvența genomică completă, publicată în anul 1996.

În urma utilizării tehnologiei ADN recombinat, multe proteine heteroloage au fost produse de Saccharomyces cerevisiae . Interferonul uman reprezintă prima proteină recombinată produsă de Saccharomyces cerevisiae, în anul 1981, fiind urmată de producția de insulină recombinată. Drojdia are o cale secretorie multiplă și este capabilă de a produce modificări posttranslaționale ale proteinelor heterogene, ca maturarea proteolitică a prohormonilor și formarea legăturilor bisulfidice.

Îmbunătățirea proprietăților celulei de drojdie bazate pe studiile biochimice și pe aplicațiile ingineriei genetice este dată de ingineria metabolică cu cele 2 aspecte importante:

partea analitică, ce se ocupă cu analiza metabolismului celulelor pentru identificarea celor mai potrivite ținte;

partea sintetică, ce se referă la ingineria genetică a celulelor.

Cele mai importante ținte pentru ingineria metabolică ar fi:

extensia categoriei substratului;

îmbunătățiri ale productivității și producției;

îmbunătățirea performanței procesului biotehnologic;

îmbunătățirea proprietăților celulei de drojdie;

Partea sintetică presupune utilizarea tehnologiei ADN recombinatpentru introducerea unei gene heterogene care activează, de exemplu, metabolismul unui substrat de interes.

Partea analitică utilizează tehnici avansate pentru o analiză aprofundată a fiziologiei celulare. Se utilizează tehnici ale ADN pentru analiza transcriptoamelor ( cuantificarea simultană a tuturor genelor transmise într-o celulă, de electroforeza în gel bidimensional pentru analiza proteoamelor), ( cuantificarea simultană a unui număr mare de proteine dintr-o celulă, de cromatografie de caz, cu spectrometrie de masă și cromatografie de lichid cu spectrometrie de masă pentru analiza nivelurilor metabolice intracelulare, de experimente cu C13 pentru analiza rețelei metabolice, de experimente avansate de fermentație cu monitorizare on-line a variabilelor de cultivare importante și de aplicații bioinformaticepentru utilizarea modelelor matematice pentru analiza structurii căilor și fluxurilor metabolice.

2.2 Bacteriile

Reprezintă o altă clasă de microorganisme cu utilizări foarte importante in biotehnologiile farmaceutice. Sunt organisme de tip precariot, deoarece nu posedă nucleu, membrană nucleară și diviziune celulară de tipul mitozei și meiozei. Sunt microorganisme unicelulare sporulate sau nesporulate. Caracterizarea morfologică se poate face în funcție de forma celulei (coci, bacili, vibrioni), de afinitatea față de coloranții de anilină (bacili acido-rezistenți, germeni Gram pozitivi sau Gram negativi), de proprietățile biologice (rezistența la temperatură ridicată, tipul de nutriție, respirație și patogenitate). Rezistența la temperatură ridicată a celulei bacteriene vegetative este mult mai mică decât a sporilor bacterieni, care este dată de acidul dipicolinic, în special de o sare a acestuia, dipicolinatul de calciu. Printre cele mai utilizate tulpini bacteriene, în procesele biotehnologice farmaceutice se numără: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Micrococcus glutamieus, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium lactofermentum, Bacillus brevis, Bacillus licheniformis, Bacillus polymixa, Strptomyces vevezuele, Streptomyces Erithreus, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces griseus, Strptomyces frodiae, Streptomyces noursei, Streptomyces Kanamyceticus, Streptomyces clavugerus.

Proteinele eucariotelor superioare de real interes terapeutic se găsesc în natură, în cantități reduse, însă, pentru obținerea lor în cantități mari, s-au utilizat tehnici și metode ale ingineriei genetice, care oferă posibilitatea de a introduce genele respective, producătoare de proteine în microorganisme.

Cele mai bune rezultate s-au obținut prin folosirea în calitatea de celulă gazdă a bacteriei Escherichia coli, în care a fost realizată exprimarea a peste 70 de proteine ale eucariotelor superioare. Cantitatea cea mai mare de produs apare la elaborarea insulinei, a hormonului de creștere uman (somatotropina), a interferonului și a virusului febrei aftoase. La ora actuală, aceste proteine sunt produse la nivel industrial. Astfel, dintr-un litru de cultură de țesut, se pot produce 10 8 unități de interferon, în timp ce dintr-un litru de mediu de cultură de Escherichia coli se produc 10 10 unități de interferon recombinat.

În afară de bacteria Escherichia coli, care prin tehnologia ADN recombinat produce o gamă largă de substanțe cu rol terapeutic, alte tulpini bacteriene enumerate mai sus produc substanțe biologic active utilizate în industria farmaceutică drept enzime, aminoacizi, biomasă probiotică, vitamine, antibiotice, bacteriocine, polizaharide.

2. 3 Mucegaiurile

Sunt un grup de fungi filamentoși și cuprind organisme de tip eucariot, formând, împreună cu drojdiile, o grupare de microorganisme intitulat Mycota. Se prezintă sub formă de filamente de dimensiuni diferite, ce formează un miceliu care provoacă degradarea mediului în care se dezvoltă.

Importanța pentru biotehnologiile farmaceutice au tulpinile care produc antibiotice și enzime cu rol terapeutic, ca Penicillium notatum, Peniicillium crysogenum, Penicillium griseofulvum, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Cephalosporium acremonium.

Microorganismele utilizate în industria farmaceutică necesită, pentru creștere și dezvoltare, medii de cultură complexe și de multe substanțe organice, pe care le sintetizează prin variate căi metabolice. În funcție de necesitățile față de mediile de cultură, ele se clasifică în aerobe, anaerobe și facultative.

Microorganismele aerobe sunt capabile să se dezvolte numai în prezența oxigenului. Din această clasă fac parte speciile genului Streptomyces producătoare de antibiotice.

Microorganismele anaerobe au un metabolism care nu se poate manifesta decât în absența oxigenului liber, cum sunt, de exemplu, specii ale genurilor Lactobacillus si Bifidobacterium producătoare de acid lactic și de biomasă probiotică.

Microorganismele facultative își pot modifica metabolismul, ele putând realiza atât unul de tip respirator (aerob), cât și unul anaerob (fermentativ). În această categorie de microorganisme intră drojdiile, care necesită oxigen atunci când sunt utilizate pentru obținerea de proteine heterogene sau pentru biomasă probiotică. Pentru obținerea alcoolului, acestea necesită un metabolism fermentativ.

În cazul metabolismului fermentativ, se poate obține un singur produs principal și atunci microorganismul este denumit homofermentativ, așa cum este cazul bacteriilor lactice producătoare de acid lactic sau se pot obține două sau mai multe produse și atunci microorganismele se numesc heterofermentative.