Aderența și Susceptibilitatea la Antibiotice a Tulpinilor Bacteriene Izolate din Infecții ale Tractului Urinar

Aderența și susceptibilitatea la antibiotice a tulpinilor bacteriene izolate din infecții ale tractului urinar

Cuprins

Introducere

Infecțiile de la nivelul tractului urinar reprezintă una din cele mai frecvente tipuri de infecții bacteriene ce afectează populația umană și necesită tratament medical. Etiologia bacteriană, aderența și susceptibilitatea la antibiotice reprezintă subiecte de interes în comunitatea medicală, pe baza acestora bazându-se diagnosticul clinic și tratamentul.

Aceste infecții se clasifică din punct de vedere clinic, în infecții necomplicate și complicate. Infecțiile necomplicate se manifestă la indivizi sănătoși, în timp ce persoanele ce prezintă anomalii structurale sau funcționale ale tractului urinar sunt predispuse la apariția infecțiilor urinare complicate. Agenții etiologici ai infecțiilor tractului urinar sunt reprezentați de bacterii Gram-negative, bacterii Gram-pozitive și fungi, cel mai frecvent întâlnit fiind Escherichia coli uropatogen.

Apariția acestor infecții se datorează interacțiunilor dintre agenții uropatogeni și gazdă, patogeneza acestora implicând mai multe procese. Etapa inițială ce declanșează infecția este reprezentată de aderarea uropatogenilor la suprafața epiteliilor, urmată de colonizarea și diseminarea la nivelul vezicii urinare, fapt ce are ca rezultat bacteriuria simptomatică sau asimptomatică. Agenții uropatogeni pot avansa la nivelul rinichilor, provocând pielonefrită sau insuficiență renală.

Metodele genetice și moleculare folosite în cadrul ultimilor ani în scopul studierii aderenței și a rezistenței la antibiotice au identificat factorii de virulență și căile moleculare ce afectează procesele și funcțiile celulelor gazdă precum transducția semnalelor, sinteza proteică, secreția de ioni, funcțiile citoscheletului, funcțiile mitocondriilor, , diviziunea celulară, transcripția și apoptoza.

Înțelegerea mecanismelor patogenezei, a factorilor de aderență și de virulență, a mecanismelor de rezistență la acțiunea agenților uropatogeni , a mecanismelor de rezistență la antibiotice și a importanței asigurării calității în cadrul testării susceptibilității la antibiotice poate duce la asigurarea furnizării unui diagnostic clinic corect și a unui tratament adecvat.

Scopul acestei lucrări a fost acela de a determina agenții etiologici responsabili de apariția infecțiilor de la nivelul tractului urinar și de a studia mecanismele de aderență și de rezistență la antibiotice a acestora, de o bună înțelegere a acestor mecanisme depinzând și descoperirea unor metode de prevenire și tratament a acestor infecții. Obiectivele acestui studiu sunt reprezentate de testarea calitativă a capacității de aderență la substrat inert și determinarea gradului de susceptibilitate la antibiotice a tulpinilor uropatogene.

1. Etiologia și patogeneza infecțiilor tractului urinar

Infecțiile tractului urinar (ITU) sunt caracterizate de pătrunderea și multiplicarea microorganismelor în tractul urinar, manifestate prin bacteriurie. Colonizarea bacteriană a urinii poate fi asimptomatică sau simptomatică. Ȋn condiții normale, tractul urinar este steril, exceptȃnd treimea externă a ureterei la femei. Germenii cei mai des întȃlniți în ITU sunt bacteriile, cu o frecvență redusă fiind implicate virusurile, levurile și ciupercile.

1.1 Clasificarea infecțiilor tractului urinar

Infecțiile tractului urinar pot fi clasificate în funcție de localizare în infecții urinare joase (cistite, uretrite, prostatite) și infecții urinare înalte (pielonefrite). Pe baza simptomatologiei, acestea se clasifică în simptomatice și asimptomatice. În funcție de durata bolii, ITU se clasifică în ITU acute sau ITU cronice.

Din punct de vedere clinic, infecțiile tractului urinar se mai pot clasifica în funcție de severitate în infecții necomplicate și infecții complicate (Fig. 1). ITU necomplicate afectează în general indivizi sănătoși ce nu prezintă anomalii structurale sau funcționale ale tractului urinar și cuprind cistita, pielonefrita și bacteriuria asimptomatică (Hooton, 2012; Nielubowicz și Mobley, 2010).

Fig. 1 Epidemiologia infecțiilor tractului urinar. ITU sunt cauzate de o mare varietate de patogeni, incluzând bacterii Gram-negative, Gram-pozitive și fungi. ITU necomplicate afectează în mod normal femei, copii și pacienți vârstnici sănătoși din punct de vedere clinic. UTI complicate sunt asociate cu prezența cateterelor permanente, anormalități ale tractului urinar, imunosupresie sau expunere la antibiotice. Cel mai frecvent agent patogen atât pentru ITU complicate cât și necomplicate este Escherichia coli uropatogen (UPEC). Pentru ITU necomplicate alți patogeni responsabili sunt, în ordinea prevalenței, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis, Streptococcus de grup B (GBS), Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus și Candida spp. Pentru ITU complicate, alți agenți patogeni responsabili sunt, în ordinea prevalenței, Enterococcus spp., K. pneumoniae, Candida spp., S. aureus, P. mirabilis, P. aeruginosa și GBS. (Adaptat după Flores și colab, 2015).

ITU complicate sunt asociate cu factori ce compromit integritatea tractului urinar sau sistemul imunitar al gazdei precum obstrucția urinară, retenție urinară provocată de boli nefrologice, imunosupresie, transplant de rinichi, sarcină și prezența corpilor străini precum calculi renali sau catetere permanente (Levison și Kaye, 2013).

1.2 Agenți uropatogeni

Infecțiile tractului urinar sunt provocate de bacterii Gram-negative și Gram-pozitive, precum și de anumiți fungi (Fig. 1, Tabel 1). Agentul patogen cel mai frecvent implicat în ITU complicate și necomplicate este Echerichia coli uropatogen (UPEC).

Tabel 1. Cei mai frecvenți patogeni întâlniți în ITU. (Adaptat după Grabe și colab., 2015)

Proteus spp este întâlnit destul de frecvent în ITU în special în ITU complicate în relație cu un factor favorizant al ITU (Tabel 2). Cel mai frecvent este întâlnit Proteus mirabilis și mult mai rar Proteus vulgaris. Proteus este o bacterie care produce ureaza. El se asociază cu litiaza urinară pe care o favorizează prin descompunerea ureei.

Klebsiella, respectiv diversele sale tulpini sunt semnalate atat în ITU complicate cat și în ITU necomplicate.

Alte bacterii Gram negative mai rar întâlnite în ITU sunt: Pseudomonas aeruginosa (întâlnită în ITU nosocomiale, în ITU secundare manevrelor urologice cât și în ITU asociate cu uropatii obstructive); Serratia marcescens, Enterobacter, Citrobacter, Providencia, Morganella. De asemenea acești agenți uropatogeni sunt frecvent rezultatul infecțiilor nosocomiale.

Staphylococcus spp. sunt bacterii întâlnite în ITU, cu o frecvență demn de semnalat. Cel mai frecvent este întâlnit Staphylococcus saprophyticus. Este întâlnit cel mai frecvent în ITU necomplicate. Acest germen ar sta la baza a 5 – 20% din ITU. Alte tulpini, mai rar întâlnite sunt Staphylococcus aureus și Staphylococcus epidermidis. În cazul identificării în urocultură a stafilococului, trebuie exclusă o contaminare a probei de urină recoltată. Staphylococcus aureus este observat mai frecvent în două situații: la cei la care s-au efectuat manevre instrumentale la nivelul tractului urinar și la cei cu litiază renală.

Tabel 2. Factorii favorizanți ai ITU (Adaptat după Gluhovschi, 2008; Sharma și colab., 2011 )

Alte bacterii Gram pozitive sunt reprezentate de Enterococcus și Streptococcus de grup B.

Bacteriile anaerobe (Bacillus anitratus, Bacteroides) sunt întâlnite la bolnavii imunodeprimați.

Neisseria gonorrheae este o bacterie care produce ITU joase. Uretrita gonococică este datorată infecției gonococice. Infecțiile gonococice afectează frecvent sfera genitală.

Chlamydiile sunt incriminate în producerea ITU joase. Infecția cu chlamydii este întâlnită frecvent în patologia genitală. Cel mai frecvent se întâlnește uretrita cauzată de chlamidii. Patogenul cel mai des semnalat este Chlamydia trachomatis.

Mycoplasmele, mai frecvent Mycoplasma hominis și Ureaplasma urealyticum sunt implicate în producerea ITU joase. Au fost izolate la pacienții cu prostatite acute, și rareori la pacinți cu pielonefrite acute.

Infecțiile cu candida, în principal cu Candida albicans sunt semnalate mai frecvent în ITU joase. Ele pot avea rareori și o localizare înaltă cand se manifestă sub forma unei pielonefrite focale. Ele pot apare la indivizi ce au urmat tratamente antibiotice de durată și la cei cu predispoziții pentru infecții candidozice. Infecțiile candidozice pot uneori recidiva. ITU candidozice se pot asocia cu infecții genitale cu candida. Candida este considerată cea de a doua cauză a ITU nosocomiale și trebuie suspicionată la pacienții care nu răspund corespunzător la tratament antibiotic (Mc Laughlin și colab., 2004).

Alți germeni bacterieni foarte rar întâlniți în cursul ITU sunt: Gardnerella vaginalis, Nocardia, Acinetobacter, Yersinia, Mycobacterium, Lactobacillus.

Virusurile pot produce ITU. Etiologia virală a ITU este mai rar identificată în practică. În etiologia cistitelor hemoragice au fost incriminate adenovirusurile. Alte virusuri semnalate în ITU sunt: virusul herpetic, virusurile ECHO, virusul polyoma, virusul cytomegalic.

În timp ce infecțiile urinare acute se manifestă o perioadă scurtă de timp și sunt ușor tratabile cu antibiotice, la un procent mare de persoane de sex feminin infecția poate reapare în decursul câtorva săptămâni sau luni. ITU recurente se definesc ca două sau mai multe infecții apărute in decursul câtorva luni, sau cel puțin trei infecții în decursul unui an. Infecția recurentă este deseori cauzată de aceeași tulpină bacteriană ce a provocat infecția precedentă, sugerând faptul că bacteria persistă în organism deși s-a urmat un tratament un un antibiotic corespunzător (Aberg și colab., 2008). Atât flora perianală cât și cea vaginală au rol de rezervoare pentru infecții ale tractului urinar, dar E.coli persistă și în vezica urinară (Nilesen și colab., 2014). În vezică E.coli aderă la nivelul epiteliului, un mic procent din bacterii invadând celulele. În această nișă protejată de răspunsul imun al gazdei, bacteriile se multiplică și formează comunități bacteriene intracelulare (Justice și colab., 2004). Ca și mecanism de apărare, celulele infectate sunt supuse apoptoyei, se desprind de celulele învecinate și sunt eliminate odată cu urina (Thumbikat și colab., 2009). Bacteriile eliberate din comunitățile bacteriene intracelulare pot invada astfel celule din straturi mai profunde ce devin expuse după exfolierea stratului extern de celule umbrelă (Thumbikat și colab., 2009). La nivelul acestor celule bacteriile nu se multiplică, dar formează colonii inactive, ce se vor reactiva și vor constitui sursa infecțiilor recurente (Mulvey și colab., 2001). Deși acest model este bazat pe studii asupra cobailor, există indicii că un ciclu de infecție similar are loc și la femei (Garofalo și colab., 2007). Prezența comunităților bacteriene intracelulare a fost semnnalată și în urina provenită de la copii ce prezentau ITU recurente (Robino și colab., 2014).

Persistența bacteriană intravezicală explică eficacitatea redusă a substanțelor antimicrobiene în prevenirea recurenței infecțiilor urinare, deoarece bacteriile intracelulare inactive din punct de vedere metabolic reprezintă o țintă greu de atins de către antibioticele convenționale și sistemul imunitar al gazdei. Aceste bacterii intracelulare formează colonii asemănătoare biofilmelor și exprimă numeroși factori asociați cu formarea de biofilme pe suprafețe abiotice in vitro. Componentele majore ale biofilmelor de E. coli, curli și celuloza, contribuie la persistența UPEC în vezica urinară. În cazul femeilor ce suferă de UTI recurente, tulpinile persistente au o probabilitate mai mare de a exprima ambele componente, spre deosebire de tulpinile ce provoacă infecții sporadice (Norinder și colab., 2011).

În timp ce tratamentul cu agenți antimicrobieni convenționali are efect în cazurile de ITU acute, acesta nu previne recurența infecției, deoarece bacteriile intracelulare inactivate nu sunt eradicate. Profilaxia pe termen lung cu doze de concentrații scăzute de antibiotice poate inhiba în mod eficient apariția bacteriilor la nivel intravezical pe perioada tratamentului (Eels și colab., 2014), dar există o probabilitate crescută ca infecțiile să reapară după încetarea tratamentului (Lorenzo-Gomez și colab., 2013; Beerepot și colab., 2011), fiind astfel nevoie de strategii profilactice și terapeutice (Geerlings și colab., 2014).

1.3 Mecanismele moleculare ale patogenezei

În condiții normale, tractul urinar nu prezintă germeni, exceptând uretra anterioară. În anumite condiții germenii pot coloniza și alte zone ale tractului urinar. Colonizarea tractului urinar se produce pe două căi principale: calea ascendentă și calea hematogenă. Altă cale posibilă de apariție a infecțiilor tractului urinar este reprezentată de calea limfatică (Fig. 2).

Fig. 2 Căile de apariție ale infecțiilor urinare

La pacienții clinic sănătoși majoritatea uropatogenilor provin din regiunea periuretrală, ajungând în tractul urinar prin uretră, și de aici în vezica urinară (Handley și colab., 2002) (Fig.3).

Cea mai mare parte de uropatogeni provine de la nivelul intestinului, fiind reprezentați în principal de enterobacteriaceae. La nivelul zonei perirenale se pot întâlni și stafilococi. Bacteriile de la nivelul perineului, precum și cele de la nivelul uretrei anterioare, în condiții propice pot ascensiona, colonizând uretra posterioară și pătrunzând în vezica urinară. În condițiile în care rezistența uroteliului de la nivelul uretrei și vezicii urinare este depășită, bacteriile ce au colonizat uretra posterioară și vezica pot determina un proces inflamator la acest nivel, declanșând uretrita, urmată de cistită. La 50% din pacienții cu cistită, infecția ajunge la tracturile urinare superioare, majoritatea episoadelor de pielonefrită datorându-se ascensiunii bacteriilor din vezică prin uretere spre pelvisul renal (Busch și Huland, 1984). Uropatogenii care ajung la nivelul pelvisului renal pot penetra parenchimul renal prin tuburile colectoare și pot afecta tubulii renali.

La indivizii sănătoși, afectarea rinichilor prin calea hematogenă este rar întâlnită. Ocazional, parenchimul renal poate fi traversat în cazul pacienților ce prezintă bacteriurie cu Staphylococcus aureus sau infecții cu Candida spp provenită pe cale orala la pacienții imunosuprimați (Smellie și colab., 1975).

Cu o frecvență redusă, bacteriile de la nivelul organelor adiacente pot penetra tractul urinar prin intermediul căilor limfatice. Afecțiunile asociate căii limfatice de apariție a ITU sunt abcesele retorperitoneale și infecțiile intestinale.

1.4 Mecanisme de rezistență la acțiunea agenților uropatogeni

După aderența uropatogenilor la nivelul epiteliilor, o serie de căi de apărare sunt activate la nivelul tractului urinar.

Răspunsul imun înnăscut al gazdei are un rol major în rezistența față de acțiunea agenților uropatogeni. Tipuri celulare precum neutrofile, macrofage, eozinofile și celule NK (natural killer) sunt activate în momentul apariției uropatogenilor.

Fig. 3 Patogeneza infecțiilor tractului urinar. a. ITU necomplicate încep în momentul în care uropatogenii din intestinul gros contaminează zona periuretrală (pasul 1) și pot coloniza uretra. Migrarea către vezică (pasul 2) și exprimarea pililor și a adezinelor au ca rezultat colonizarea și invazia celulelor umbrelă superficiale (pasul 3). Răspunsurile inflamatorii ale gazdei, inclusiv neutrofilelor (pasul 4) duc la distrugerea bacteriilor extracelulare. Anumite bacterii se sustrag acțiunii sistemului imunitar prin invazia celulelor gazdei sau prin schimbări morfologice ce duc la rezistența față de neutrofile. Aceste bacterii se multiplică (pasul 5), formează biofilme (pasul 6) și produc toxine ce facilitează supraviețuirea bacteriană și ascensiunea către rinichi (pasul 8). Colonizarea rinichilor (pasul 9) are ca rezultat producerea de toxine bacteriene și afectarea țesuturilor gazdă (pasul 10). Netratate, ITU pot duce la bacteriurie dacă patogenul traversează bariera epiteliului tubular în rinichi (pasul 11). b. Uropatogenii ce duc la apariția ITU complicate urmează aceeași pași inițiali ca și cei descriși pentru infecțiile necomplicate, inclusiv colinizarea periuretrală (pasul 1), ascensiunea către uretră și migrarea către vezică (pasul 2). Pentru provocarea infecției de către patogeni, vezica trebuie să fie afectată, cauza cea mai comună fiind cateterizarea. Datorită răspunsului imun puternic indus de cateterizare (pasul 3), are loc acumularea de fibrinogen pe cateter, asigurând un mediu propice pentru atașarea uropatogenilor ce prezintă proteine de legare la fibrinogen. Infecția provoacă infiltrarea neutrofilelor (pasul 4), dar după atașarea inițială a acestora de cateterele acoperite de fibrinogen, bacteriile se multiplică (pasul 5), formează biofilme (pasul 6), induc afectarea epiteliilor (pasul 10). Ȋn lipsa tratamentului, uropatogenii ce duc la apariția ITU complicate pot de asemenea să inducă apariția bacteriemiei prin traversarea barierei de celule epiteliale tubulare (pasul 11). (Adaptat după Flores și colab, 2015).

Leucocitele polimorfonuleare sintetizează oxid nitric prin creșterea transcripției sintetazei de oxid nitric, fapt ce duce la crearea unui efect toxic pentru agentul infecțios (Poljakovic și colab., 2001).

Celulele epiteliale de la nivelul tractului urinar reprezintă prima linie de apărare împotriva agenților uropatogeni. Aceste celule secretă o multitudine de compuși solubili, de la citokine proinflamatorii la agenți antibacterieni. Un număr mare de citokine și chemokine sunt reglate în urma infecției cu uropatogeni, majoritatea acestora atingând pragul maxim în prima zi post-infecție și revenind la normal în decursul a două săptămâni post-infecție, excepție făcând IL-17A (Sivick și colab., 2010). Interleukinele IL-1, IL-6 și IL-8 sunt primele citokine ce apar în urină în urma apariției infecției, având rol în fagocitoza de la nivelul vezicii sau a rinichiului infectat. Proteina Tamm-Horsfall, cunoscută și sub denumirea de uromodulină, este o glicoproteină cu masă moleculară mare prezentă în urina umană, ce se leagă de fimbriile de tip I, limitând interacția uropatogenilor cu receptorii de la nivelul țesuturilor gazdei și facilitând eliminarea acestora prin urină (Serafini-Cessi și colab., 2003). Peptidele antibacteriene sunt peptide scurte, încărcate pozitiv ce au rol în legarea la membranele bacteriene și distrugerea acestora. β-defensina 1 și catelicidina LL-37 sunt peptide implicate în răspunsul imun, cu rol în protejarea tractului urinar (Chromek și colab., 2006; Valore și colab., 1998).

Celulele epiteliale se exfoliază (Fig. 4) la un interval de câteva ore de la inițierea infecției, celulele uroteliale infectate sunt excretate în timpul acestui proces (Mysorekar și colab., 2002). Secreția și excreția celulelor uroteliale infectate sunt mediate de bacterii ce prezintă fimbrii de tip 1 ce duc la apoptoza celulară (Mulvey și colab., 1998).

În cazul pacienților sănătoși din punct de vedere clinic celulele superficiale ce acoperă epiteliul de la nivelul vezicii urinare se exfoliază și se regenerează în decursul a câteva luni. Aceste cascade de proliferare și diferențiere reprimate sunt activate în cazul apariției infecției. Acestea au posibilitatea de a produce regenerarea stratului de celule superficiale în decursul a 24 de ore de la începerea procesului de exfoliere, prevenind formarea de colonii bacteriene.

În timpul răspunsului inflamator primar neutrofilele migrează spre locul unde este prezent agentul patogen prin intermediul receptorilor PAMP (Pathogen-associated molecular pattern) și TLR (Toll-like receptors) (Anderson și colab., 2004). După ce lipopolizaharidele, peptidoglicanii și alți compuși bacterieni sunt detectați, TLR activează căi de semanlizare ce inițiază răspunsuri imune și inflamatorii ce au rol în eliminarea patogenilor (Anderson și colab., 2004).

Fig. 4. Patofiziologia infecției cu tulpini UPEC la nivelul celulelor epiteliale de la nivelul vezicii urinare. UPEC se aderă la receptorii de pe suprafața celulelor superficiale de la nivelul vezicii prin intermediul fimbriilor P sau a fimbriilor de tip I. După aderență, bacteriile sunt internalizate în celule, unde se multiplică intens. Aderența și invazia pot conduce la activarea căilor apoptotice la nivel celular, ducând la exfolierea și eliminarea celulelor infectate. În urma interacțiilor dintre celulele epiteliale și cele bacteriene se pot produce răspunsurile inflamatorii mediate de citokine ce duc la un influx de leucocite polimorfonucleare la nivelul epiteliului vezicii urinare. Tulpinile UPEC pot ajunge în straturile profunde ale epiteliului, fapt ce explică apariția infecțiilor recurente. (Adaptat după http://what-when-how.com/acp-medicine/urinary-tract-infections-part-1/)

TLR4 detectează lipopolizaharidele din structura bacteriilor Gram-negative și activează răspunsul imun înnăscut (Haraoka și colab., 1999), iar TLR11 este eliberat din rinichi pentru a preveni avansarea infecției la parenchimul renal (Zhang și colab., 2004). S-a demonstrat că agenții uropatogeni pot suprima NF-κB (factorul nuclear kappa al celulelor B), factorul de transcripție ce stă la baza cascadelor antiapoptotice și proinflamatoare (Klumpp și colab., 2001). În cazul celulelor nestimulate, NF-κB este reținut în citosol prin interacții cu o unitate inhibitoare, IκB. Stimulii proinflamatori precum lipopolizaharidele sau TNF-α (factorul de necroză tumorală) activează calea de semnalizare ce duce la degradarea IκB de către proteazomul 26S. Unitatea liberă NF-κB se translocă în nucleu, unde activează transcripția genelor proinflamatorii și antiapoptotice.

Deși răspunsul imun înnăscut de la nivelul tractului urinar prezintă multe mecanisme de apărare, răspunsul imun adaptativ are un caracter limitat. ITU care progresează la nivelul rinichilor pot duce la producerea de anticorpi specifici agentului uropatogen, dar în cazul pacienților care prezintă ITU la nivelul vezicii urinare nu se produce un răspuns anticorpic (Ratner și colab., 1981). Acest fapt poate constitui un motiv pentru apariția infecțiilor recurente.

Tractul urinar mai este protejat de acțiunea uropatogenilor printr-o serie de factori mecanici, fizici și chimici ce îngreunează aderența la acest nivel (Fig. 5).

Fig. 5. Factorii de apărare ai tractului urinar

2. Aderența și virulența

Capacitatea bacteriilor de a adera la suprafețe și de a forma biofilme prezintă un interes major în domeniul medical (Palmer și colab., 2007). Aderența reprezintă procesul cheie în inițierea patogenezei infecțiilor tractului urinar.

După contaminarea periuretrală, urmată de colonizarea uretrei și migrarea către vezica urinară, numeroase adezine bacteriene se leagă la receptorii de la nivelul uroepiteliului, mediind colonizarea și facilitând producerea de toxine și proteaze (Tabel 3). Prin multiplicare și slăbirea sistemului imunitar, agenții uropatogeni ajung la nivelul rinichilor, prin intermediul fimbriilor și a adezinelor colonizând epiteliul renal și afectând țesuturile prin intermediul producerii de toxine. Astfel, uropatogenii pot treversa bariera epiteliului tubular, ajungând în sânge și provocând bacteriurie.

Van Loosdrecht (citat de Zarnea, 1994) afirma în 1990 că fenomenele de aderență bacteriană și de formare de biofilme decurg în patru etape: etapa de transport, etapa de adeziune inițială, etapa de legare ireversibilă și etapa de colonizare.

Tabel 3. Factorii de virulență utilizați de principalii uropatogeni. AipA – Aderența și invazia mediată de autotransportorul aparținând Proteus-ului; CNF1 – factorul citotoxic necrotizant; Ebp – asociat cu endocardita și formarea de biofilme; Epa – antigenul polizaharidic enterococal; Esp – proteina de suprafață enterococală; ExoS – exoenzima S; Fimbrii F1C – fimbrii din grupul imunologic 1; HlyA – hemolizina α; HpmA – hemolizina; MR/P – manozo-rezistent Proteus-like; Msr – metionin-sulfoxid reductaza; NAF – fimbrii neaglutinante; PMF – fimbrii Proteus mirabilis-like; Fimbrii P – Fimbrii asociate pielonefritei; Pta – aglutinina toxică Proteus; TaaP – aglutinina autotransportoare trumerică a Proteus-ului; UPEC – Escherichia coli uropatogen. (Adaptat după Flores și colab, 2015)

Etapa de transport reprezintă o etapă esențială în cadrul procesului de aderență. Aceasta implică deplasarea microorganismelor din mediu la suprafața substratului. Această primă etapă poate avea loc prin trei mecanisme distincte: deplasarea prin difuziune, deplasarea prin curenți de convecție și mișcarea activă. Deplasarea prin difuziune reprezintă un efect al mișcării browniene a celulelor bacteriene, asigurând o deplasare lentă și contacte aleatorii cu diferite suprafețe. Deplasarea prin difuziune este activă în condiții de mediu liniștit, dar și în cursul proceselor de sedimentare, în care poate reprezenta singurul mod de contact al microorganismelor cu diferite substraturi. Deplasarea prin curenți de convecție este asociată cu circulația lichidului în care sunt suspendate celulele bacteriene și poate asigura un transport mai rapid decât deplasarea prin difuziune. Mișcarea activă este cea mai rapidă și poate duce la contacte întâmplătoare sau orientate chimiotactic, în cazul existenței unui gradient de concentrație între cele două interfețe.

Etapa de transport este facilitată de prezența flagelilor. Flagelii sunt apendice filamentoase dispuse pe suprafața bacteriilor. Aceste organite de locomoție sunt implicate și în chemotaxie, deci în deplasarea orientată preferențial, sub efectul unor gradientede concentrație ale diferitelor substanțe chimice aflate în mediul de viață al bacteriilor (Zarnea, 1983). Prezența flagelilor la bacteriile patogene constituie un factor de virulență, prin funcția de stimulare a adeziunii la diferite epitelii și prin capacitatea de a facilita pătrunderea prin stratul de mucus ce acoperă țesuturile epiteliale (Lazăr, 2003).

Etapa de adeziune inițială este reversibilă, în sensul unei depuneri pe suprafața-suport cu menținerea în continuare a mișcării browniene și flagelare și cu posibilitatea de îndepărtare prin agitare ușoară sau prin propria lor mobilitate. Această etapă reversibilă implică existența unor forțe slabe precum forțe atractive Van der Waals, forțe repulsive electrostatice, tensiunea interfacială, legături covalente și interacții hidrofobe ce apar între celulele bacteriene și substrat (Van Loosdrecht și colab., 1990). În mediile naturale, datorită structurii învelișului celular, bacteriile Gram-negative și cele Gram-pozitive sunt încărcate electronegativ. Comportarea bacteriilor în raport cu substratul este determinată de energia potențială rezultată în urma interacțiunii lor variabile și de concentrația electroliților.

Etapa de legare ireversibilă este o etapă permanentă și este caracterizată prin încetarea mișcării browniene și prin posibilitatea îndepărtării bacteriilor aderente numai sub acțiunea unor forțe puternice de natură fizică precum agitarea puternică sau chimică precum utilizarea dezinfectanților. În unele cazuri repulsia electrostatică poate fi mai puternică decât forțele atractive ce apar în cadrul etapei de adeziune inițială. Un exemplu de astfel de caz apare atunci când atât celula bacteriană cât și substratul sunt încărcate negativ. În aceste cazuri, structuri de pe suprafața celulară precum flageli și fimbrii și substanțe ca exopolizaharidele înving repulsia electrostatică și determină aderarea la substrat, rezultând aderența ireversibilă. În această etapă de legare ireversibilă sunt implicate și legături covalente, legături de hidrogen și interacții hidrofobe.

Etapa de colonizare presupune creșterea și multiplicarea rapidă a bacteriilor după legarea permanentă. Celulele legate ireversibil de substrat, dar nu și între celule, formează un monostrat continuu care acoperă toată suprafața substratului, iar cele legate și de substrat și între ele formează microcolonii și biofilme. Ulterior, biofilmele devin pluristratificate. Când biofilmul devine suficient de gros, straturile profunde devin anoxice și conțin preponderent specii anaerobe. Treptat, celulele bazale sunt înfometate și pot să moară sau să se lizeze. Fenomenele de anoxie și moarte celulară însoțite de producerea de gaze, pot destabiliza biofilmul, determinând detașarea și desprinderea lui de pe suprafețele solide. Creșterea poate fi reluată, având un caracter ciclic (Lazăr, 2003).

Aderența necesită prezența a cel puțin două suprafețe pentru a forma o joncțiune care poate fi reversibilă sau ireversibilă. Caracterul de aderență este corelat cu proprietățile chimice și fizice ale ambelor suprafețe.

2.1 Adezinele bacteriene

Aderența bacteriană specifică presupune existența unor fenomene de recunoaștere moleculară. Bacteriile prezintă pe suprafața lor adezine, structuri capabile să interacționeze cu receptorii de pe membranele celulelor gazdă.

Factorii de virulență bacteriană joacă un rol major în apariția și evoluția infecțiilor tractului urinar. Prin aceștia se pot combate și preveni mecanismele patogene ce stau la baza ITU (Kostakioti și colab., 2012).

Adezinele bacteriene reprezintă structuri proteice ce sunt compatibile cu o varietate mare de motive moleculare, asigurând aderarea bacteriilor la suprafața țesuturilor specifice organismului gazdă. În ciuda arhitecturii asemănătoare, adezinele diferă la nivel de secvențe și prezintă mecanisme diferite de legare la receptori, având funcții diverse la nivel de interacție cu organismul gazdă (Westerlund-Wikstrom și Korhonen, 2005).

Uropatogenii responsabili de apariția ITU necomplicate au capacitatea de a adera la uroepiteliul format din celule umbrelă (celule superficiale), celule intermediare și celule bazale (Khandelwal și colab., 2009). UPEC și Klebsiella pneumoniae se leagă de uroplakine, componentele proteice principale ale membranei apicale a celulelor bazale (Khandelwal și colab., 2009). Alți receptori pentru UPEC sunt reprezentați de integrinele α3β1 aflate la suprafața celulelor uroepiteliale (Eto și colab., 2007).

Agenții uropatogeni determinanți de ITU complicate aderă la catetere urinare, pietre de la nivelul rinichilor sau a vezicii urinare sau sunt reținuți la nivelul tractului urinar datorită anomaliilor obstructive. Anumiți uropatogeni, precum UPEC, pot provoca atât ITU necomplicate, cât și complicate, dar există și patogeni precum P. Mirabilis, P. Aeruginosa și Enterococcus spp., care se întâlnesc majoritar în cazuri de ITU complicate, și care deseori formează biofilme responsabile de colonizare și persistență (Niveditha și colab., 2012).

2.1.1 Fimbriile

Fimbriile reprezintă structuri de suprafață de natură proteică, mediind funcții precum aderența bacteriană la receptorii de la nivelul epiteliilor și formarea biofilmelor. Adezinele fimbrilare, care în mod normal sunt situate la nivelul extremității structurilor, recunosc receptorii țintă specifici într-un mod lacăt-cheie, asigurând o suprafață specifică și un tropism tisular.

Fimbriile F1C sunt polimeri de suprafață, cu lungimea de 1m și diametrul de 7nm, a căror structură este asemănătoare cu fimbriile de tip I. Acestea contribuie la proprietățile de aderență ale tulpinilor UPEC prin medierea aderenței specifice la canalele colectoare și la tubii contorți distali din structura rinichiului (Riegman și colab., 1990). Prezența fimbriilor F1C este corelată cu pielonefrita (Johnson și colab., 2005). Operonul genei foc este responsabil de sinteza fimbriilor F1C prin participarea a 7 gene. Determinantul genetic al fimbriilor F1C (foc) prezintă epitopi comuni pe proteinele fibrilare corespunzătoare și similarități în cadrul secvenței ADN cu determinantul genetic al fimbriilor S (sfa), dar antigenii Sfa și F1C prezintă diferențe prin specificitățile receptorilor (Ott și colab., 1988). Aceste fimbrii mediază aderența la endoteliu și la stratul muscular al vezicii, dar nu și la epiteliu (Virkola și colab., 1988). La nivelul rinichilor, F1C mediază aderența la tubulii distali și la canalele colectoare, dar și la glomeruli și endoteliu vascular (Virkola și colab., 1988). Structura receptoare a acestor fimbrii este reprezentată de secvența de glicolipide GalNAcβ1-4Galβ, reprezsentând un factor de virulență implicat în colonizarea tractului urinar (Khan și colab., 2000)

Fimbriile P (Fig.6) au reprezentat primul factor de virulență de la tulpinile UPEC care a fost caracterizat (Eden și colab., 1976). Există 11 gene care codifică aceste fimbrii și se numesc gene pap (Pyelonephritis associated pili), gena structurală a monomerilor de pili P fiind reprezentată de papA (Normark și colab., 1983). Aderența mediată de fimbriile P este manozo-rezistentă, spre deosebire de fimbriile de tip I, fiind specifică seriei de glicosfingolipide antigen-specifice de grup sangvin P ce conține secvența α-D-Gal-(1-4)-β-D-Gal (Hoschützky și colab, 1989). Adezina PapG se află la capătul distal al fimbriilor, mediind legarea la receptorul -D-galactopranozil-(1–4)–D-galactopiranozid și reprezentând un factor de virulență la tulpinile uropatogene de E. coli (Sauer și colab., 2000). Adezina PapG există în 3 variante moleculare: PapGI, PapGII și PapGIII. Studii moleculare au demonstrat că PapGIII este varianta moleculară cea mai întălnită în cazul cistitelor, în timp ce PapGII este varianta asociată cu pielonefrita și bacteriemia la oameni (Johnson și colab., 2000).

Fig. 6: Imagine de microscopie electronică a unei tulpini uropatogene de E. coli ce prezintă pili de tip P care pornesc de pe suprafața acesteia. Scara de mărime este de 0,5 m. (preluat după Thanassi și colab., 2012)

Fimbriile P măresc gradul de severitate al ITU prin aderența strânsă la endoteliul vascular, la stratul muscular și prin inflamarea mucoasei. Există o corelație între severitatea infecției și prezența fimbriilor P, anticorpii fimbriilor P fiind prezenți în serul pacienților infectați (Spurbeck și colab., 2011).

Fimbriile S sunt asociate cu apariția cistitei și pielonefritei datorată tulpinilor UPEC. Din punct de vedere morfologic, acestea au o structură asemănătoare cu fimbriile de tip I și fimbriile P, având o lungime de 1-2m și un diametru de 5-7nm, dar prezintă adezina SfaS ce se leagă de acidul sialic prezent la nivelul celulelor epiteliului rinichiului (Khronen și colab., 1984). În mod specific, fimbriile S aderă la endoteliul vascular al vaselor sanguine din rinichi, la endoteliul capilar al glomerulului, la epiteliul lumenului tubilor proximali și distali, la canalele colectoare și la epiteliul glomerular (Khronen și colab., 1984). La nivelul vezicii urinare, fimbriile S aderă la țesutul epitelial și muscular, reprezentând astfel un factor de virulență pentru UPEC (Virkola și colab., 1988).

Fimbriile de tip I reprezintă structuri filamentoase, care se extind pe suprafața uropatogenilor UPEC (Fig. 7) și Klebsiella pneumoniae. Acestea au fost asociate cu virulența bacteriană de la nivelul tractului urinar (Schembri, 2001). Aceste fimbrii sunt în legătură directă cu procesele de aderență și de formare a biofilmelor, procese inhibate de D-manoză (Clegg și Old, 1979). Sunt descrise ca polimeri alcătuiți din subunități formate din proteine ce prezintă un conținut ridicat de aminoacizi hidrofobici. O singură fimbrie este alcătuită din aproximativ 100 de subunități proteice cu aceeași structură. Tulpinile uropatogene ce prezintă fimbrii de tip I aderă la suprafețele și formează microcolonii înconjurate de glicocalix, spre deosebire de tulpinile care nu posedă aceste fimbrii și prezintă o aderență slabă, producând puțin material extracelular (Marrie și Costerton, 1983). Fimbriile de tip I prezintă o structură complexă cu o grosime de 7 m și o lungime de 1-2 m, fiind formate dintr-un cilindru lung și o formațiune fimbrială distală subțire. Pentru exprimarea fimbriilor de tip I este nevoie de cel puțin 9 gene grupate în clustere fim, care codifică produși asamblați într-un mod similar pililor P. Proteina Fim H constituie o adezină responsabilă de legarea la glicoproteinele manozilate, fiind situată la vârful distal al cilindrului heteropolimeric format din subunitățile Fim A, Fim G și Fim F. Fim H facilitează legarea uropatogenilor la receptorii glicoproteici care conțin manoză, situați la suprafața luminală a celulelor epiteliiilor. Fim H prezintă capacitatea de a adera la diferite tipuri de celule precum eritrocite și macrofage (Katouli, 2010). Deși această adezină prezintă o omologie ridicată la UPEC și K. pneumoniae,prezintă specificități de legare diferite (Stahlhut și colab., 2009). Formarea de biofilme mediată de Fim H la K. pneumoniae este inhibată de heptil-manoză, spre deosebire de metil-manoză la UPEC.

Fig. 7: Imagine de microscopie electronică de transmisie de înaltă rezoluție a unei tulpini uropatogene de E. coli ce prezintă fimbrii de tip I ce mediază aderența la uroepiteliu.. Scara de mărime este de 0,5 m.

(adaptat după http://hultgrenlab.wustl.edu/research/urinary-tract-infection/)

Fimbriile Dr reprezintă o familie de adezine specifică tulpinilor de E. coli. Au fost descrise ca fiind hemaglutinine manozo-rezistente prezente la tulpinile UPEC (Vaisanen-rhen și colab., 1984). Fimbriile Dr aderă la țesutul conector peritubular de la nivelul rinichilor, la țesutul conector dintre straturile de celule musculare de la nivelul rinichiului, la neutrofile și la celulele epiteliale (Virkola și colab., 1988). Acestea facilitează invazia celulară, facilitând evitarea răspunsului imun mediat umoral prin utilizarea spațiilor intracelulare. S-a dovedit că tulpinile de E. coli ce prezintă fimbrii Dr persistă în țesutul din rinichi și duce la apariția nefritei tubulointerstițiale, în timp ce tulpinile care nu prezintă fimbrii Dr sunt responsabile de mai puține patologii datorită faptului că acestea sunt eliminate mai rapid din rinichi (Goluszko și colab, 1997) . Fimbriile de tip I au fost cel mai bine studiate la E. coli, având o importanță majoră în patogeneza bacteriilor Gram negative în general (Antão și colab., 2009).

Fimbriile de tip 3 prezente la K. pneumoniae au un rol important în colonizare, formarea de biofilme și persistența la nivelul tractului urinar.

Fimbriile MR/P (manozo-rezistent Proteus-like) facilitează formarea de biofilme și colonizarea vezicii urinare și a rinichilor, fiind un factor esențial în formarea de biofilme asociate cateterelor urinare (Jacobsen și Shirtliff, 2011).

Fimbriile Proteus mirabilis-like (PMF) au rol important în colonizarea vezicii urinare și a rinichilor, iar fimbriile nonaglutinante (NAF) au capacitatea de a adera la celulele uroepiteliale (Armbruster și Mobley, 2012).

Fimbriile asociate cu endocardita și formarea de biofilme (Epb) prezente la Enterococcus contribuie la apariția infecțiilor tractului urinar asociate cu cateterele urinare (Guiton și colab., 2010).

2.2 Alți factori de virulență

Vezica urinară prezintă un mediu sărac în nutrienți, astfel, pentru a supraviețui și a se multiplica la nivelul tractului urinar, uropatogenii produc proteaze și toxine ce distrug țesuturile gazdei, asigurând astfel o nișă ce favorizează invazia bacteriană și diseminarea.

2.2.1 Proteaze și toxine

UPEC secretă hemolizina α (HlyA) cu rol în formarea porilor în celulele superficiale de la nivelul vezicii urinare și liza acestor celule. HlyA declanșează exfolierea acestor celule, facilitând colonizarea și multiplicarea bacteriană la nivelul straturilor profunde ale uroteliului.

Factorul citotoxic necrotizant (CNF1) este produs de o treime din tulpinile UPEC asociate pielonefritei și poate fi implicat și în invazia la nivelul rinichiului (Landraud și colab., 2000). Această proteină este secretată de E. coli și stimulează formarea de fibre de actină improprii din punct de vedere structural prin GTP-aze Rho. CNF1 interferă cu fagocitoza polimorfonicleară și determină apoptoza celulelor de la nivelul uroepiteliului (Mills și colab., 2000).

Cele două toxine produse de Proteus mirabilis, hemolizina (HpmA) și aglutinina toxică Proteus (Pta) sunt implicate în afectarea țesuturilor și diseminarea la nivelul rinichilor, inițiind declanșarea pielonefritei acute. HpmA este o citolizină responsabilă de destabilizarea celulelor gazdă prin inserarea la nivelul membranei celulare. Pta este o protează citotoxică ce afectează integritatea structurală a celulelor prin distrugerea membranelor celulare de la nivelul vezicii urinare și a rinichilor (Armbruster și Mobley, 2012).

Elastazele, exoenzima S (ExoS) și fosfolipaza hemolitică C sunt produse de Pseudomonas aeruginosa și sunt implicate în inițierea ITU, diseminarea bacteriană și apariția pielonefritei. Exprimarea acestori factori de virulență este dependentă de sistemul quorum-sensing. ExoS afectează morfologia celulelor gazdă. Elastaza determină distrugerea țesuturilor prin activitatea proteazică, facilitând creșterea și multiplicarea celulelor bacteriene. Fosfolipaza hemolitică C este o toxină ce hidrolizează fosfatidilcolina de la nivelul membranelor celulare, afectând integritatea celulară.

2.2.2 Ureaza

Ureaza este produsă de uropatogeni precum P. mirabilis, S. saprophyticus, K. pneumoniae și P. aeruginosa, având rol în colonizare și persistență. Această enzimă catalizează hidroliza ureei la dioxid de carbon și amoniac, rezultând un pH crescut al urinii și producerea de cristale de calciu și fosfat amoniaco-magnezian în urină și la nivelul cateterelor urinare (Armbruster și Mobley, 2012). Acumularea de amoniac are efect toxic asupra celulelor uroepiteliale, ducând la lezarea țesuturilor. Formarea de cristale de calciu datorată ureazei a fost cel mai bine studiată la Proteus mirabilis, deoarece la acest uropatogen această enzimă are o activitate foarte intensă; cristalele de calciu rămân blocate la nivelul matricei polizaharidice produsă de bacteriile aderate, formând biofilme cristaline la nivelul cateterelor urinare. Aceste biofilme cristaline conferă rezistență în fața sistemului imunitar al gazdei și la acțiunea antibioticelor. Aceste structuri împiedică trecerea urinii de la nivelul ureterelor, ducând la reflux urinar și pielonefrită (Armbruster și Mobley, 2012).

3. Mecanisme de rezistență la antibiotice

Conform EUCAST (Comitetul European pentru Testarea Sensibilității la Antibiotice) antibioticele sunt substanțe biologice sintetice sau semisintetice ce au efect exclusiv împotriva bacteriilor. Antibioticele sau antimicrobienele pot avea rol bacteriostatic prin împiedicarea proliferării bacteriene, sau rol bactericid prin distrugerea bacteriilor.

Fiecare clasă de antibiotice prezintă moduri de acțiune unice. Pentru a înțelege aceste moduri de acțiune este necesară cunoașterea structurii celulelor bacteriene și efectul pe care îl exercită substanțele antimicrobiene la nivel celular. Deși structura bacteriilor Gram negative este asemănătoare cu a celor Gram pozitive, există anumite diferențe ce permit substanțelor antimicrobiene să inhibibe creșterea acestora. Există și anumite antibiotice cu spectru extins, ce prezintă efect asupra ambelor tipuri de bacterii.

Rezistența microbiană absolută se întâlnește in vitro, în momentul în care un microorganism este rezistent la acțiunea unui anumit antibiotic, atunci când antibioticul utilizat nu este eficient în oprirea multiplicării acestuia, sau oprirea multiplicării se poate realiza numai în prezența unor concentrații foarte ridicate de antibiotic, care ar putea fi toxice pentru organismul gazdă. Organismele rezistente din punct de vedere microbiologic posedă gene de rezistență sau mecanisme de rezistență.

Rezistența clinică presupune un proces complex ce apare în momentul în care este foarte puțin probabil ca agenții patogeni să fie eliminați chiar și în cazul utilizării unor doze crescute de antibiotic care să nu aibă efect roxic asupra gazdei, presupunând probabilitatea unui răspuns la terapia antimicrobiană.

Prevalența crescută a rezistenței la antibiotice a a unui număr mare de agenți patogeni fost semnalată în numeroase regiuni de pe glob, inclusiv în țări dezvoltate de punct de vedere socio-economic (Byarugaba, 2005). Acest fapt se datorează caracteristicilor schimbătoare ale microorganismelor, folosirii în exces a antibioticelor și schimbărilor sociale și tehnologice ce duc la accelerarea dezvoltării și transmisiei patogenilor rezistenți la antibiotice.

Deși rezistența antimicrobiană este un fenomen biologic normal, de multe ori se datorează capacitării de adaptare a agenților infecțioși la substanțe antimicrobiene utilizate excesiv pentru tratarea bolilor la oameni și animale, în agricultură, și a utilizării dezinfectanților (Walsh, 2000). În concepția actuală este recunoscut faptul că utilizarea agenților antimicrobieni este factorul major responsabil de rezistență crescută la antibiotice (Aarestrup și colab., 2001; Byarugaba, 2004 ).

Mecanismele moleculare ale rezistenței la antibiotice au fost studiate intens de-a lungul timpului, presupunând evidențierea funcțiilor celulare din punct de vedere genetic și biochimic (Alekshun și Levy, 2007; Gale și colab., 1981; Walsh, 2003) (Tabel 4).

Apariția fenotipurilor rezistente la antibiotice depinde de factori ce țin de gazde: gradul de exprimare a rezistenței, capacitatea patogenilor de a tolera mecanismul de rezistență, locul de colonizare inițială și alți factori. În momentul în care determinanții de rezistență se află la nivelul plasmidelor, aceștia se vor răspândi în cadrul genului patogenului și chiar la genuri din alte categorii de microorganisme. Dacă rezistența este asociată cu gene de la nivelul cormozomilor, microorganismele rezistente se vor răspândi mai lent (Džidic și colab., 2008).

Tabel 4. Moduri de acțiune și mecanisme de rezistență la antibiotice utilizate frecvent

(Adaptat după Jayaraman, 2009; Morar și Wright, 2010)

3.1 Mecanisme genetice de rezistență

Rezistența la antibiotice a bacteriilor poate fi intrinsecă sau dobândită. Mecanismele rezistenței intrinseci reprezintă procese naturale datorate constituției genetice ale organismelor. Aceste proprietăți moștenite se datorează lipsei țintei antimicrobiene (Schwarz și colab., 1995). Rezistența dobândită este o caracteristică observabilă în momentul în care un microorganism inițial sensibil la un antibiotic, prezintă rezistență prin mutații și dobândire de ADN (Tomasz și Munaz, 1995). Metodele de dobândire a rezistenței la antibiotice sunt reprezentate de: mutații spontane, hipermutații, mutageneza adaptativă, transferul de material genetic pe orizontală.

Mutațiile spontane sau mutațiile dependente de creștere ce au loc datorită erorilor de replicare sau reparării incorecte a ADN-ului celulelor active din punct de vedere al diviziunii pot fi responsabile de apariția rezistenței la antibiotice (Krasovec și Jerman, 2003). Mutațiile punctiforme ce promovează creșterea bacteriană sunt de asemenea responsabile de apariția rezistenței la antibiotice (Woodford și Ellington, 2007). Fenotipul de rezistență la Escherichia coli se datorează mutațiilor a șapte zone de la nivelul genei gyrA și a trei zone de la nivelul genei parC (Hooper, 1999).

Hipermutațiile sunt caracterizate de o rată crescută de apariție a mutațiilor spontane datorată reparării defectuase a ADN-ului datorată inactivării genelor mutS și mutL, având un rol important în persistența bacteriană pe termen lung și în dezvoltarea multirezistenței antimicrobiene (Maciá și colab., 2005). Tulpini ce prezintă hipermutații s-au descoperit în populații de E. Coli, Salmonella enterica, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, Streptococcus pneumoniae și P. Aeruginosa cu o frecvență de 0.1%-60% (Denamur și colab., 2002).

Mutageneza adaptativă se întâlnește în cadrul celulelor care nu se divid sau care se divid lent în prezența unei presiuni selective. Acest proces a fost asociat cu evoluția bacteriilor mutante ce prezintă rezistență la antibiotice în condiții normale (Bjedov și colab., 2003). Mutageneza adaptativă este reglată de polimeraza V (umuCD) și IV (dinB) (Rosche și Foster, 2000). Anumite antibiotice precum quinolonele declanșează un raspuns mutagenic de tip ̏ SOS ̋, mărind rata de rezistență la E. coli (Piddock și Wise, 1997).

Transferul orizontal de gene este responsabil de răspândirea rezistenței la antibiotice la diverse specii bacteriene. Genele de rezistență constituite dintr-o singură mutație sau din mutații multiple pot fi transferate între bacterii prin conjugare, transformare sau transducție, fiind încorporate la nivelul cromozomului receptorului prin recombinare. Principalele mecanisme de transfer de material genetic pe orizontală la bacterii sunt reprezentate de transferul plasmidial, transferul viral și transferul de ADN liber (Fig. 8).

Fig. 8. Cele trei mecanisme principale de transfer de gene de rezistență la bacterii. a. transfer plasmidial; b. transfer viral; c. transfer de ADN liber. (Adaptat după Levy, 1998)

Genele pot fi transferate prin trei căi: transducție (prin bacteriofagi și integroni), conjugare (prin plasmide și transpozoni conjugativi) și prin transformare (prin încorporarea ADN-ului cromozomal – plasmidele, într-un cromozom).

3.2 Mecanisme biochimice de rezistență

Principalele mecanisme biochimice de rezistență la antibiotice utilizate de microorganisme sunt reprezentate de inactivarea enzimatică a antibioticelor și de modificări bacteriene.

Inactivarea enzimatică a antibioticelor se realizează prin intermediul enzimelor de inactivare a antibioticelor codificate de plasmide sau cromozomi. Există 3 categorii principale de enzime de inactivare: betalactamazele, enzimele de modificare a aminoglicozidelor și enzimele de modificare a aminoglicozidelor.

Betalactamezele sunt enzime ce prezintă capacitatea de a hidroliza inelul betalactam al antibioticelor betalactamice, fapt ce are ca rezultat inactivarea completă a antibioticului. Betalactamazele pot fi codificate la nivel cromozomial sau plasmidic. Genele pentru betalactamaze pot fi translocate de către transpozoni în cromozom sau în altă plasmidă. Transferul intra- și inter-specii determină răspândirea mediată de betalactamaze. Betalactamazele hidrolizează majoritatea antibioticelor betalactamice ce prezintă legături ester și amino precum peniciline, cefalosporine, monobactami și carbapeneme. Cefalosporinazele cromozomale ale bacteriilor Gram-negative hidrolizează preferențial cefalosporinele, dar pot hidroliza și betalactamine mai noi precum cefotaxim, cefuroxim, aztreonam, imipenem. Betalactamazele mediate plasmidic sunt mai frecvente la bacteriile Gram-negative și sunt reprezentate de penicilinaze cu spectru larg de tip TEM care hidrolizează penicilinele și cefalosporinele, oxacilinaze de tip OXA care hidrolizează oxacilina și cloxacilina și carbenicilinaze de tip CARB care hidrolizează carbenicilina. Metalo-lactamazele hidrolizează majoritatea betalactamilor, inclusiv carbapenemii.

Enzimele de modificare a aminoglicozidelor precum nucleotidiltransferaza, acetiltransferaza și fosfotransferaza sunt codificate de gene plasmidiale sau elemente transpozabile ce le conferă un nivel ridicat de rezistență. Aceste enzime modifică aminoglicozidele la nivelul grupărilor amino și hidroxil prin fosforilare, acetilare sau denilare, aceste modificări ducând la inactivarea antibioticelor.

Enzimele de inactivare a cloramfenicolului precum acetiltransferaza sunt codificate la nivel plasmidial. Aceste enzime determină acetilarea antibioticului , ducând la inactivarea lui.

Modificările bacteriene ce duc la rezistența la antibiotice sunt de mai multe tipuri: modificarea permeabilității învelișurilor bacteriene, alterarea sediului-țintă al activității inhibitorii a antibioticului, eflux activ al antibioticelor din celula bacteriană, modificare enzimatică, deficit de acțiune al anumitor enzime, achiziționarea de enzime, creșterea concentrației metabolitului ce competiționează cu agentul patogen.

Modificarea permeabilității învelișurilor bacteriene se realizează prin alterări structurale ale învelișurilor bacteriene sau prin modificări ale sistemului de transport activ al antibioticelor prin învelișurile bacteriene. Diminuarea permeabilității membranei externe prin scăderea sintezei porinelor duce la scăderea numărului de porine funcționale, bacteriile Gram-negative devenind astfel impermeabile pentru betalactamine și quinolone. Dezvoltarea impermeabilității pereților celulari prin îngustarea porinelor reprezintă exemplul clasic de rezistență al P. aeruginosa față de multe antibiotice. Diminuarea permeabilității bacteriene cu deficit în penetrarea intracelulară a antibioticelor se aplică în cazul trimetoprimului, a nitrofuranilor, a sulfamidelor și a nitroimidazolilor. Diminuarea permeabilității peretelui celular bacterian datorată pierderii unei proteine membranare externe duce la apariția rezistenței față de cloramfenicol. Întărirea funcției de barieră a membranei externe prin producerea unei proteine adiționale duce la apariția rezistenței la tetraciclină a tulpinilor de E. coli.

Alterarea sediului-țintă al activității inhibitorii a antibioticului se realizează prin modificarea structurală a ADN-girazei (duce la diminuarea afinității țintei de acțiune pentru quinolone), prin modificarea PBP (penicilin binding proteins) – proteine inserate pe fața externă a membranei celulare (duce la diminuarea afinității țintei de acțiune pentru betalactamine), prin modificarea proteinei țintă ribozomale (duce la diminuarea afinității țintei de acțiune pentru aminoglicozide, tetracicline).

Efluxul activ al antibioticelor din celula bacteriană împiedică acumularea în celulă a unor concentrații suficiente de antibiotice precum tetraciclina și eritromicina.

Modificarea unor enzime precum dihidrofolat reductaza (DHPS) în cazul trimetoprimului sau a dihidropterat sintetaza (DHPS) în cazul silfamidelor duce la inabilitatea realizării competiției cu enzime implicate în sinteza folaților de către agenții chemoterapeutici.

Un alt mecanism de rezistență la antibiotice îl reprezintă deficitul de acțiune al unor enzime precum nitrofuran-reductaza în cazul nitrofuranilor sau nitro-reductaza în cazul nitroimidazolilor.

Achiziționarea de către bacterii a unor enzime precum esteraza sau nucleotidiltransferaza modifică lincosamidele și macrolidele.

Creșterea concentrației metabolitului ce competiționează cu agentul patogen precum creșterea sintezei acidului para-amino-benzoic (APAB) anulează acțiunea de inhibare competitivă a antibioticelor precum sulfamidele.

4. Importanța asigurării calității rezultatelor în diagnosticul clinic al infecțiilor tractului urinar

Investigațiile microbiologice au un rol important în diagnosticul, tratamentul și supravegherea evoluției bolilor infecțioase, fiind esențial ca rezultatele să fie relevante, corecte, și interpretate corespunzător.

Programul de control al calității se bazează pe crearea, implementarea și asigurarea respectării procedurilor pentru monitorizarea performanțelor și pe identificarea, documentarea și rezolvarea eventualelor probleme ce pot apărea. Acesta are rolul de a duce la identificarea erorilor și a schimbărilor ce se petrec de-a lungul timpului pentru a asigura acuratețea și corectitudinea rezultatelor.

Controlul calității reprezintă acea parte din asigurarea calității ce se referă la controlul erorilor în performanța testelor efectuate și verificarea rezultatelor testelor. Controlul calității trebuie să acopere toate aspectele din procedurile departamentale. Trebuie să fie practic, realizabil, rapid și accesibil din punct de vedere financiar. Toate materialele utilizate, echipamentele și procedurile trebuie să fie supuse controlului calității.

În cadrul laboratoarelor de microbiologie clinică se folosesc mai multe proceduri și medii de cultură doar pentru obținerea unui rezultat. De exemplu pentru o suspiciune de ITU se poate realiza examen macroscopic, examen microscopic, utilizarea mai multor tipuri de medii pentru creștere, colorații Gram ale izolatelor bacteriene din cultură pentru identificare, teste pentru identificare rapidă sau preliminară, teste pentru confirmarea identificării, teste de susceptibilitate antimicrobiană și păstrarea izolatelor. Fiecare tip de mediu utilizat, fiecare test și procedură și chiar și raportarea rezultatelor trebuie supuse controlului calității la interval de timp regulate.

Factorii care influențează încrederea și reproductibilitatea rezultatelor (surse de eroare) sunt prezentate în Tabelul 5.

Tabel 5. Surse de eroare

Frecvența și tipul de control al calității diferă în funcție de test, mediu de cultură sau reactiv. În cazul anumitor teste, controlul calității trebuie efectuat odată cu fiecare test. Există și teste la care controlul calității trebuie efectuat în momentul schimbării lotului de reactiv. Pentru determinările automate controlul calității se efectuează zilnic, chiar și de mai multe ori pe zi, fiind mult mai extins față de cel efectuat pentru determinările care nu sunt automate.

Deși rezultatele complexe ale controlului de calitate nu sunt redate odată cu rezultatele testărilor, acestea sunt foarte importante pentru furnizorii de servicii medicale, ajutând specialiștii din laboratoare să furnizeze un rezultat corespunzător. O singură eroare poate duce la un rezultat incorect, un diagnostic greșit și un tratament necorespunzător.

Scopul procedurilor documentate pentru laboratoarele de analize microbiologice sunt prezentate în Fig. 9.

Fig. 9 Scopul procedurilor documentate pentru laboratoarele de analize microbiologice

Procedurile trebuie să fie concepute și implementate de către o persoană calificată, iar membrii personalului trebuie să respecte aceste proceduri. Fiecare procedură trebuie să aibă un titlu, un număr de identificare, trebuie datată și semnată.

Personalul laboratorului trebuie să fie instruit în legătură cu erorile ce pot apărea în stadiul pre-analitic, în stadiul analitic și în stadiul post-analitic.

4.1 Asigurarea calității testării susceptibilității la antibiotice a tulpinilor bacteriene izolate din infecții ale tractului urinar

Investigațiile microbiologice au un rol important în diagnosticul, tratamentul și supravegherea evoluției infecțiilor tractului urinar, fiind esențial ca rezultatele să fie relevante, corecte, și interpretate în mod corespunzător.

Asigurarea calității reprezintă procesul prin care corectitudinea rezultatelor testelor efectuate poate fi garantată. Presupune evaluarea și monitorizarea performanțelor laboratoarelor în toate cele trei etape ale testărilor: pre-analitice, analitice și post-analitice.

Controlul calității cuprinde monitorizarea etapei analitice de testare prin evaluarea preciziei și a acurateții testărilor, a performanței materialelor utilizate pentru testare și a performanței personalului responsabil de realizarea testărilor (King și Brown, 2001).

CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) a implementat standardizarea testării la antibiotice , permițând laboratoarelor clinice să efectueze teste de control al calității, să își evalueze rezultatele și să găsească recomandări de acțiuni corective pentru un spectru larg de erori posibile. Fiecare laborator trebuie să își stabilească propriile cerințe de calitate în cadrul proceselor de testare pentru identificarea rezultatelor eronate și înțelegerea limitărilor și a surselor de eroare din cadrul testării susceptibilității la antibiotice prin recunoașterea, rezolvarea și evitarea erorilor (King și Brown, 2001).

Componentele majore ale unui proces de asigurare a calității testării susceptibilității la antibiotice sunt reprezentate de: utilizarea tulpinilor de referință, competența tehnică, verificarea antibiogramei patogenului, strategii de testare relevante din punct de vedere clinic, verificarea rezultatelor de către un cadru superior, procedura de lucru, antibiograma cumulativă (Rankin 2005).

4.1.1 Standardizarea testării susceptibilității la antibiotice

Pentru a obține rezultate reproductibile, pașii procedurali ai fiecărei metode de testare trebuie urmați în mod corespunzător. Standardizarea testării susceptibilității la antibiotice duce la optimizarea condițiilor de creștere bacteriană astfel încât factori precum diferențele de temperatură sau limitările mediilor de cultură să nu conducă la un rezultat necorespunzător; inhibarea creșterii bacteriene trebuie să fie atribuită exclusiv agentului antimicrobian. Componentele standardizării sunt reprezentate de concentrația inoculului bacterian, mediul de creștere, condițiile de incubare și concentrațiile antibioticelor.

Concentrația inoculului bacterian reprezintă un factor foarte important în testarea susceptibilității la antibiotice. Suspensiile de inocul presupun selectarea de 4-5 colonii proaspăt crescute pentru a evita testarea unei colonii susceptibile fără a testa și tulpinile mutante existente în alte colonii. Standardele McFarland sunt utilizate pentru a standardiza încărcătura bacteriană din inocul, reprezentând o soluție de sulfat de bariu cu o densitate optică specifică. Cel mai frecvent utilizat este standardul McFarland 0.5 ce prezintă o turbiditate asemănătoare cu cea a unei suspensii bacteriene cu aptoximativ 1.5 108 UFC/mL. O suspensie bacteriană cu o concentrație scăzută duce la rezultate fals susceptibile, consecința unei suspensii bacteriene cu concentrație crescută fiind rezultate fals rezistente Suspensia inoculului standardizat trebuie utilizată în decursul a 15 minute după preparare.

Mediul de creștere cel mai frecvent utilizat pentru testarea susceptibilității la antibiotice este reprezentat de Mueller-Hinton agar. Acesta poate influența calitatea rezultatelor obținute, furnizând rezultate incerte sau false. În cazul mediilor gata preparate, variabilele standardizate precum pH-ul, concentrația de cationi și de timidine și grosimea stratului de agar trebuie regăsite în certificatul de calitate furnizate de producător.

Condițiile de incubare precum temperatură, timp și concentrații de oxigen diferă de la un agent patogen la altul. Anumiți agenți antimicrobieni necesită temperaturi și timpuri de incubare diferite față de alții utilizați pentru același agent patogen.

Concentrațiile antibioticelor utilizate în testarea susceptibilității la antibiotice reprezintă un factor reprezintă un factor standardizat important deoarece o concentrație scăzută poate duce la rezultate fals susceptibile.

4.1.2 Tulpinile de referință

Cea mai importantă etapă a controlului intern de calitate este reprezentată de utilizarea tulpinilor de referință. Tulpinile de referință reprezintă tulpini bacteriene cu mecanisme de susceptibilitate sau rezistență definite în prealabil. Testarea tulpinilor de referință contribuie la monitorizarea performanței testărilor și confirmă efectuarea corectă a acestora. Rezultatele obținute în urma testării tulpinilor de referință trebuie să se situeze în diametrele zonelor de inhibiție. Deviațiile de la limitele acceptate sugerează rezultate necorespunzătoare a căror sursă trebuie investigată. Lista tulpinilor de referință se regăsește în tabelele M100 din CLSI, acestea modificându-se anual datorită apariției unoi noi mecanisme de rezistență sau a apariției unor noi antibiotice.

Conform EAL (European cooperation for Accredidation of Laboratories) EAL- G18, cultura de referință poate fi subcultivată o dată pentru generarea culturii stoc. Cultura stoc poate fi prezervată printr-o tehnică corespunzătoare (liofilizată, congelată, menținută în azot lichid) care să asigure păstrarea caracterelor tulpinii. Cultura stoc este folosită pentru prepararea culturii de lucru. Dacă a fost decongelată cultura stoc, ea nu trebuie recongelată și refolosită. Cultura de lucru trebuie, în mod normal, să nu fie subcultivată. Totuși, cultura stoc poate fi subcultivată până la un număr definit de subcultivări, standard sau dacă laboratorul poate documenta faptul că tulpina nu și-a pierdut viabilitatea, nu și-a modificat caracterele biochimice și /sau morfologice.

Anumite organizații au recomandat, și ATCC este de acord, că o tulpină utilizată în metode de testare standard nu trebuie utilizată după pasajul 5 din cultura ATCC originală. ATCC definește primul pasaj ca fiind prima cultură în bulion sau în mediu agarizat, obținută din recipientul cu cultură furnizat de ATCC:

Cultura de lucru poate fi utilizată pentru monitorizarea preciziei (repetabilității) și a acurateții testării susceptibilității la antibiotice atâta timp cât nu se observă schimbări în diametrul zonei de interes. Subcultivările repetate pot provoca pierderea mecanismelor de rezistență și obținerea de rezultate nesatisfăcătoare.

Tulpinile de referință trebuie testate zilnic cu toți agenții antimicrobieni utilizați de către laborator pâna la obținerea de performanțe satisfăcătoare. CLSI definește performanțele satisfăcătoare ca obținerea de rezultate neacceptate la nu mai mult de 1 din 20 sau 3 din 30 de rezultate obținute în zile consecutive pentru fiecare agent antimicrobian. După obținerea performanțelor satisfăcătoare, testarea efectuată zilnic se poate efectua săptamânal pe perioada în care rezultatele se situează în limite acceptabile. Testarea zilnică trebuie efectuată din nou dacă se produc modificări în testările efectuate (Tabel 6).

În cazul utilizării unor agenți antimicrobieni noi, aceștia trebuie verificați zilnic timp de 20 sau 30 de zile consecutive de rezultate satisfăcătoare. Dacă se obțin rezultatele satisfăcătoare, testarea se poate face săptămânal.

Obținerea de diametre ale zonelor de inhibiție necorespunzătoare în urma testării tulpinii de referință poate indica o contaminare a culturii sau apariția unor mutații. În acest caz trebuie utilizată o cultură proaspătă din cultura stoc sau achiziționarea unor noi tulpini de referință.

Tabel 6. Frecvența efectuării controlului de calitate utilizând tulpini de referință dacă se produc modificări la nivelul testărilor efectuate (Adaptat după CLSI, 2014).

4.2 Acțiuni corective și erori sistematice

Acțiunile corective reprezintă acțiunile de eliminare a cauzei unei neconformități detectate sau a altei situații nedorite (SR EN ISO 9000/2000). Acestea se implementează în cadrul testării susceptibilității la antibiotice în momentul în care rezultatele săptămânale ale controlului calității nu se situeză în intervalul de valori acceptabile.

Factorii ce duc la rezultate situate în afara intervalelor de valori acceptate sunt diverși, rezultatele nesatisfăcătoare ale controlului intern putându-se datora unor erori identificabile sau unor erori neidentificabile (CLSI, 2012). Erorile identificabile, denumite și erori evidente, sunt ușor de detectat și de corectat. Factorii care duc la apariția de erori identificabile sunt reprezentați de utilizarea unor discuri greșite, utilizarea unei tulpini de referință greșită, contaminarea tulpinii de referință sau a mediului de cultură, utilizarea unei temperaturi de incubare sau a unor condiții greșite. În cazul erorilor identificabile, testarea trebuie repetată în momentul în care se observă apariția rezultatelor nesatisfăcătoare. Dacă rezultatele obținute în urma repetării testării sunt în limite acceptabile, nu mai este necesară implementarea unei alte acțiuni corective. Dacă eroarea ce cauzează obținerea rezultatelor nesatisfăcătoare este neidentificabilă, testarea trebuie repetată în momentul apariției erorii, utilizând o cultură sau o subcultură nouă, fiind necesară monitorizarea timp de 5 zile consecutive a rezultatelor testărilor. Dacă rezultatele sunt satisfăcătoare în decursul celor 5 zile de testări consecutive, nu este necesară implementarea altor acțiuni corective. Dacă în cele 5 zile consecutive de testări unul din rezultate se află în afara intervalului acceptabil, implementarea unei acțiuni corective suplimentare este necesară. În acest moment este sugerată apariția unei erori sistematice, fapt ce implică investigarea tuturor etapelor și materialelor utilizate pentru testarea susceptibilității la antibiotice. Motivele apariției unei erori sistematice pot fi: măsurători efectuate incorect, erori de redactare, ajustarea incorectă a turbidității, materiale expirate, condiții improprii de creștere (temperatură), depozitarea incorectă a discurilor, contaminarea tulpinilor de referință, denaturarea tulpinilor de referință (Tabel 7). După detectarea și corectarea erorii sistematice, trebuie efectuată testarea zilnică timp de 20 sau 30 de zile consecutive cu obținerea de rezultate satisfăcătoare (CLSI, 2014).

Tabel 7. Factorii ce pot determina apariția erorilor sistematice (Adaptat dupa CLSI, 2014)

Pentru monitorizarea rezultatelor controlului de calitate efectuat zilnic se poate folosi diagrama de tip Shewhart, unde rezultatele sunt trecute într-un grafic ce permite evaluarea vizuală a rezultatelor și aplicarea regulilor Westgard. Controlul de calitate pentru metoda difuzimetrică poate fi transpus astfel, limitele diametrului zonelor de inhibiție reprezintă limitele de control superioare și inferioare ± 2 SD (Fig. 10) (King și Brown, 2001).

Fig. 10 – Model de diagramă Shewhart. (a) câte un rezultat situat în afara intervalului (regula Westgard 12S); (b) 10 rezultate consecutive încadrate în interval, dar situate de-o parte a țintei (regula Westgard10); (c) două rezultate consecutive situate în afara intervalului, de aceeași parte a țintei (regula Westgard 22S). (Adaptat după King și Brown, 2001).

4.3 Controlul extern al calității

Controlul extern al calității reprezintă procesul prin care sunt apreciate performanțele unui laborator participant. Acesta permite compararea rezultatelor obținute cu cele ale altor laboratoare, ajutând la identificarea erorilor apărute în practica de rutină și oferind posibilitatea de a aplica acțiuni corective în scopul îmbunătățirii calității.

Programele de control extern de calitate, denumite și scheme de comparări interlaboratoare, reprezintă evaluarea calității prin comparație cu alte laboratoare în cadrul testării unei probe identice. Evaluarea se face de către un furnizor extern ce distribuie probele în cadrul laboratoarelor și prelucrează statistic toate rezultatele furnizate de laboratoare, rezultatele fiind furnizate sub forma unor rapoarte de evaluare. Deși furnizorul de control extern cunoaște rezultatele corecte ce trebuie obținute, acestea sunt confidențiale până în momentul primirii de catre laboratoare a rapoartelor de evaluare.

Schemele de comparări interlaboratoare au rolul de a compara performanțele unui număr mare de laboratoare prin verificarea întregului proces de testare, inclusiv a calității rezultatelor furnizate, măsurând acuratețea acestora. Acestea sunt organizate cu scopul de a atinge următoarele obiective:

Monitorizarea performanțelor laboratoarelor și evaluarea măsurilor de control al calității

Stabilirea comparabilității interlaboratoare

Asigurarea credibilității rezultatelor furnizate de laboratoare

Stimularea îmbunătățirii performanțelor

Promovarea standardelor înalte de lucru

Stabilirea eficienței și a comparabilității metodelor de lucru nou implementate și monitorizarea metodelor utilizate frecvent

Încurajarea utilizării reactivilor de calitate și a personalului calificat

Atribuirea valorilor materialelor de referință și evaluarea utilizării acestora în cadrul testărilor specifice sau a procedurilor de măsurare

Determinarea caracteristicilor de performanță pentru metodele utilizate

Frunizarea posibilității de remediere a erorilor identificate

Facilitarea schimbului de informații

Îmbunătățirea continuă

Deși participarea la scheme de comparări interlaboratoare presupune o implicare financiară mare, acestea au un rol important în asigurarea calității deoarece pot duce la identificarea erorilor apărute în cadrul controlului intern de calitate, totodată asigurând o evaluare regulată a performanțelor metodelor utilizate în laboratoare. Acest fapt ajută la aplicarea măsurilor corective în cadrul metodelor ce nu furnizează rezultate satisfăcătoare.

5. Studiul in vitro al aderenței și a susceptibilității la antibiotice a tulpinilor bacteriene izolate din infectii ale tractului urinar

Studiul aderenței și a susceptibilității la antibiotice reprezintă un subiect de actualitate în domeniul medical, cu implicații majore în tratarea și prevenirea infecțiilor de la nivelul tractului urinar. Studiile efectuate în ultimii ani asupra corelației dintre aderența bacteriană și susceptibilitatea la antibiotice au ajuns la concluzia că aderența și colonizarea tractului urinar sau a cateterelor de la nivelul tractului urinar de către agenții patogeni pot fi influențate într-o mare măsură de apariția fenomenului de rezistență la substanțe antimicrobiene. Studiul aprofundat al mecanismelor de virulență și patogenitate al agenților uropatogeni, a capacității de aderență la substraturi inerte utilizate în medicină, a mecanismelor de rezistență la substanțe antimicrobiene poate duce la descoperirea și aplicarea unor metode eficiente de contracarare a acestora și de tratare eficientă a infecțiilor determinate.

Scop și obiective

Scopul aceste lucrări a fost acela de a studia in vitro corelația dintre capacitatea de aderență la un substrat inert a unor tulpini izolate din urocultură și susceptibilitatea la antibiotice a acestor tulpini.

Obiective:

1. Izolarea și identificarea tulpinilor bacteriene din urină prin intermediul caracterelor de cultură și a testelor biochimice.

2. Testarea calitativă a capacității de aderență a unui număr semnificativ de izolate clinice de proveniență urinară la un substrat inert.

3. Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice ale tulpinilor izolate.

5.1 Materiale și metode

Pentru realizarea acestor obiective s-au utilizat următoarele materiale:

– probe de urină

– medii de cultură de uz bacteriologic

– coloranți: soluție alcoolică de safranină 1%

– discuri de antibiotice

5.1.1 Determinarea capacității de aderență la substratul inert – testul producerii de slime

Testul producerii de slime reprezintă o metodă calitativă de determinare a capacității de aderență a bacteriilor, fiind adaptată dupa metoda realizată de Christensen în 1982 (Christensen și colab.,1982) . Acest test presupune formarea unui inel colorat în tuburi de hemoliză la interfața aer-lichid în urma utilizării pe post de colorant safranina. În funcție de grosimea acestui inel, putem clasifica capacitatea tulpinilor bacteriene de a produce slime în: puternică (+++), moderată (++), slabă (+), absentă (0). Tulpinile se însămânțează pe agar cu sânge de oaie 5% și se incubează 24h la temperatura de 370C. După realizarea unui standard de 0,5 Mc Farland (care corespunde la 108 celule/ml), s-a realizat pasajul în tuburi sterile de hemoliză a câte 100 μl suspensie bacteriană 0,5 Mc Farland în câte 1 ml apă peptonată, tuburile fiind apoi incubate la 370C timp de 24h. Suspensiile bacteriene au fost aspirate, pereții tuburilor au fost spălați de 3 ori cu apă distilată (pH=7,2) și colorați cu soluție alcoolică de safranină 1% timp de 30 de minute. După colorare se spală tuburile de 3 ori cu apă distilată, se usucă la temperatura camerei și se citește inelul de pe fiecare tub pentru a determina capacitatea de aderență la substrat inert.

5.1.2. Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice

Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice s-a realizat în conformitate cu CLSI 2015 folosind metoda disc-diufuzimetrică Kirby-Bauer, metodă calitativă utilizată uzual în laboratoarele clinice. Se însămânțează în bulion nutritiv un inocul prelevat cu ansa din 4-5 colonii bine individualizate. Tuburile cu bulion nutritiv însămânțate fie se incubează la 37° C, 3-5 ore, fie se folosesc imediat după reglarea turbidității. Se diluează cultura pentru inocul la nivelul tubului etalon (0,5 McFarland), ceea ce corespunde cu 1,5 x 108 UFC/mL. Se scot din frigider plăcile cu mediu MHa și se lasă 60 de minute la temperatura camerei pentru uscare și echilibrarea temperaturii. Se scot din frigider discurile cu substanțe antimicrobiene. Din momentul etalonării inoculului, plăcile cu MHa vor fi însămânțate în cel mult 15 minute. Se imersează tamponul de vată steril în suspensia bacteriana etalonată. Se scurge excesul de lichid prin rotirea tamponului pe pereții eprubetei. Se descarcă tamponul în striuri paralele pe toată suprafața mediului, succesiv în trei direcții, prin rotirea plăcii cu 60°. Insămânțarea se poate realiza și prin inundare, urmată de eliminarea lichidului în exces. Se lasă plăcile timp de 3 -5 minute pentru absorbția inoculului. Plăcile însămânțate se lasă la uscat, prin menținerea la temperatura camerei 5-15 minute până la depunerea discurilor. Discurile se vor așeza în placă numai atunci când nu mai există lichid pe suprafața mediului. Se depun discurile cu substanțe antimicrobiene la distanța de minimum 15 mm de marginea plăcii și de 30 mm între centrele a două discuri vecine. După repartizarea discurilor, plăcile se incubează imediat, la 37° C, timp de 16-18 ore. După trecerea perioadei de incubație se măsoară cu rigla gradată în mm diametrul zonelor de inhibiție completă în lumina reflectată pe fond negru mat. Se urmărește inhibiția completă a creșterii, făcând abstracție de coloniile fine, periferice, vizibile numai la scrutare atentă prin transparență. Coloniile mari din zona de inhibiție trebuie identificate și retestate. Acestea pot fi constituite din variante rezistente sau contaminanți (inocul mixt). Se verifică dacă diametrele zonelor de inhibiție a fiecărei substanțe antimicrobiene sunt cuprinse în limitele variației admise (CLSI,2015).

5.2 Rezultate și discuții

5.2.1 Determinarea capacității de aderență la substratul inert – testul producerii de slime

5.2.2. Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice

5.3 Concluzii

Bibliografie

Aarestrup, F. M., Seyfarth, A. M., Emborg, H. D., Pedersen, K., Hendriksen, R. S., and Bager, F. 2001. Effect of abolishment of the use of antimicrobial agents for growth promotion on occurrence of antimicrobial resistance in fecal enterococci from food animals in Denmark. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 2054–2059.

Aberg, K.M.; Man, M.Q.; Gallo, R.L.; Ganz, T.; Crumrine, D.; Brown, B.E.; Choi, E.H.; Kim, D.K.; Schroder, J.M.; Feingold, K.R.; et al. Co-regulation and interdependence of the mammalian epidermal permeability and antimicrobial barriers. J. Investig. Dermatol. 2008, 128, 917–925.

Alekshun, M. N., and S. B. Levy. 2007. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell

Anderson, G. G., Martin, S. M. and Hultgren, S. J. (2004b) 'Host subversion by formation of intracellular bacterial communities in the urinary tract', Microbes Infect, 6(12), 1094- 101.

Antão, E.-M., Wieler, L. H., și Ewers, C. (2009). Adhesive threads of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. Gut Pathogens, 1(1), 22.

Armbruster, C. E. & Mobley, H. L. Merging mythology and morphology: the multifaceted lifestyle of Proteus mirabilis. Nature Rev. Microbiol. 10, 743–754 (2012).

Beerepoot, M.A.; ter Riet, G.; Nys, S.; van der Wal, W.M.; de Borgie, C.A.; de Reijke, T.M.; Prins, J.M.; Koeijers, J.; Verbon, A.; Stobberingh, E.; et al. Cranberries vs antibiotics to prevent urinary tract infections: A randomized double-blind noninferiority trial in premenopausal women. Arch. Intern. Med. 2011, 171, 1270–1278.

Bjedov I, Tenaillon O, Gerard B, Souza V, Denamur E, Radman M, Taddei F and Matic I (2003) Stress-induced mutagenesis in bacteria. Science. 300, 1404–1409.

Busch, R. and Huland, H. (1984) 'Correlation of symptoms and results of direct bacterial localization in patients with urinary tract infections', J Urol, 132(2), 282-5.

Byarugaba, D. K. 2004. A view on antmicrobial resistance in developing countries and responsible risk factors. Int. J. Antimicrob. Agents 24: 105–110.

Byarugaba, D. K. (2005). Antimicrobial resistance and its containment in developing countries. In Antibiotic Policies: Theory and Practice, ed. I. Gould and V. Meer, pp 617–646. New York: Springer

Christensen, G.D.; Simpson, W.A.; Bisno, A.L.; Beachey, E.H. Adherence of slime producing strains ofStaphylococcus epidermidis to smooth surfaces. Infect. Immun., 37: 318-326, 1982.

Chromek M, Slamova Z, Bergman P, Kovacs L, Podracka L, et al. (2006) The antimicrobial peptide cathelicidin protects the urinary tract against invasive bacterial infection. Nat Med 12: 636–641.

Clegg, S., și Old, D. C. (1979). Fimbriae of Escherichia coli K-12 strain AW405 and related bacteria. Journal of Bacteriology, 137(2), 1008–12.

Denamur E, Bonacorsi S, Giraud A, Duriez P, Hilali F, Amorin C, Bingen E, Andremont A, Picard B, Taddei F and Matic I (2002) High frequency of mutator strains among human uropathogenic Escherichia coli isolates. J. Bacteriol. 184, 605–609

Džidic S, Šuškovic J, Kos B. Antibiotic resistance mechanismsin bacteria: biochemical and genetic aspects. Food Technol Biotechnol 2008;46:11-21.

Eells, S.J.; Bharadwa, K.; McKinnell, J.A.; Miller, L.G. Recurrent urinary tract infections among women: Comparative effectiveness of 5 prevention and management strategies using a Markov chain Monte Carlo model. Clin. Infect. Dis. 2014, 58, 147–160.

Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L. & Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100 (2007).

Flores-Mireles AL, Walker JN, Caparon M, et al. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nat Rev Microbiol 2015

Gale, E. F., E. Cundliffe, P. E. Reynolds, M. H. Richmond, and M. J. Waring (ed.). 1981. The molecular basis of antibiotic action, 2nd ed. John Wiley, Chichester, United Kingdom

Hooton, T. M. Uncomplicated urinary tract infection. New Engl. J. Med. 366, 1028–1037 (2012)

Garofalo, C.K.; Hooton, T.M.; Martin, S.M.; Stamm, W.E.; Palermo, J.J.; Gordon, J.I.; Hultgren, S.J. Escherichia coli from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infect. Immun. 2007, 75, 52–60.

Geerlings, S.E.; Beerepoot, M.A.; Prins, J.M. Prevention of recurrent urinary tract infections in women: Antimicrobial and nonantimicrobial strategies. Infect. Dis. Clin. N. Am. 2014, 28, 135–147.

Gheorghe Gluhovschi, Manual de nefrologie clinică, Editura Mirton, Timișoara, 2008.

Goluszko, P., Moseley, S. L., Truong, L. D., Kaul, A., Williford, J. R., Selvarangan, R., Nowicki, B. (1997). Development of experimental model of chronic pyelonephritis with Escherichia coli O75:K5:H-bearing Dr fimbriae: mutation in the dra region prevented tubulointerstitial nephritis. The Journal of Clinical Investigation, 99(7), 1662–72

Grabe (Chair) M., R. Bartoletti, T.E. Bjerklund Johansen, T. Cai (Guidelines Associate), M. Çek, B. Köves (Guidelines Associate), K.G. Naber, R.S. Pickard, P. Tenke, F. Wagenlehner, B. Wullt, Guidelines on Urological Infections, European Association of Urology, 2015.

Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L. E., Caparon, M. G. & Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infect. Immun. 78, 4166–4175 (2010).

Handley, M. A., Reingold, A. L., Shiboski, S. and Padian, N. S. (2002) 'Incidence of acute

urinary tract infection in young women and use of male condoms with and without nonoxynol-9 spermicides', Epidemiology, 13(4), 431-6.

Haraoka, M., Hang, L., Frendeus, B., Godaly, G., Burdick, M., Strieter, R. and Svanborg, C. (1999) 'Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection', J Infect Dis, 180(4), 1220-9.

Hooper DC (1999) Mechanisms of fluoroquinolone resistance. Drug Resist. Update., 2, 38–55.

Jayaraman R. (2009) Antibiotic resitance: an overview of mechanisms and a paradigm shift. Current Science, 96(11): 1475 – 1484.

Hoschützky, H., Lottspeich, F., și Jann, K. (1989). Isolation and characterization of the alpha-galactosyl-1,4-beta-galactosyl-specific adhesin (P adhesin) from fimbriated Escherichia coli. Infection and Immunity, 57(1), 76–81.

Jacobsen, S. M. & Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence 2, 460–465 (2011).

Johnson, J. R., Bryan, T. T. O., Low, D. A., Ling, G., Delavari, P., Fasching, C., Russo, T. A. (2000). Evidence of Commonality between Canine and Human Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli Strains That Express papG Allele III. Infection and Immunity, 68(6), 3327–3336.

Johnson, J.R., Owens, K., Gajewski, A., Kuskowski, M.A., 2005b. Bacterial characteristics in relationto clinical source of Escherichia coli isolates from women with acute cystitis or pyelonephritisand uninfected women. J. Clin. Microbiol. 43 (12), 6064–6072.

Justice, S.S.; Hung, C.; Theriot, J.A.; Fletcher, D.A.; Anderson, G.G.; Footer, M.J.; Hultgren, S.J. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 1333–1338.

Katouli, M. (2010). Population structure of gut Escherichia coli and its role in development of extra-intestinal infections. Iranian Journal of Microbiology, 2(2), 59–72.

Khan, A.S., Kniep, B., Oelschlaeger, T.A., Van Die, I., Korhonen, T., Hacker, J., 2000. Receptor structure for F1C fimbriae of uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 68 (6), 3541–3547.

Khandelwal, P., Abraham, S. N. & Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 297, F1477–F1501 (2009).

King A., Brown D. F. J. (2001). Quality assurance of antimicrobial susceptibility testing by disc diffusion. Journal of Antimicrobial Chemotherapy ,48, Suppl. S1, 71-6.

Kist, M. L., Salit, I. E., și Hofmann, T. (1990). Purification and Characterization of the Dr Hemagglutinins Expressed by Two Uropathogenic Escherichia coli Strains. Infection and Immunity, 58(3), 695–702.

Klumpp, D. J., Weiser, A. C., Sengupta, S., Forrestal, S. G., Batler, R. A. and Schaeffer, A. J. (2001) 'Uropathogenic Escherichia coli potentiates type 1 pilus-induced apoptosis by suppressing NF-kappaB', Infect Immun, 69(11), 6689-95.

Korhonen, T. K., Parkkinen, L. J., Hacker, J., Finne, J., Pere, A., Rhen, M., și Holthofer, H. (1986). Binding of Escherichia coli S Fimbriae to Human. Infection and Immunity, 54(2), 322–327.

Korhonen, T. K., Väisänen-Rhen, V., Rhen, M., Pere, a, Parkkinen, J., și Finne, J. (1984). Escherichia coli fimbriae recognizing sialyl galactosides. Journal of Bacteriology, 159(2), 762–6.

Kostakioti, M., Hultgren, S. J. & Hadjifrangiskou, M. Molecular blueprint of uropathogenic Escherichia coli virulence provides clues toward the development of anti-virulence therapeutics. Virulence 3, 592–594 (2012).

Krasovec R and Jerman I (2003) Bacterial multicellularity as a possible source of antibiotic resistance. Med. Hypotheses. 60, 484–488.

L. Landraud, M. Gauthier, T. Fosse, and P. Boquet, “Frequency of Escherichia coli strains producing the cytotoxic necrotizing factor (CNF1) in nosocomial urinary tract infections,” Letters in Applied Microbiology, vol. 30, no. 3, pp. 213–216, 2000.

Lazăr, V., (2003), Aderența microbiană , Editura Academiei Române.

Levy SB. The challenge of antibiotic resistance. Sci Am 1998;46-53.

Levison, M. E. & Kaye, D. Treatment of complicated urinary tract infections with an emphasis on drugresistant Gram-negative uropathogens. Curr. Infect. Dis. Rep. 15, 109–115 (2013)

Lindberg, F., Tennent, J. M., Hultgren, S. J., Lund, B., și Normark, S. (1989). PapD, a periplasmic transport protein in P-pilus biogenesis. Journal of Bacteriology, 171(11), 6052–8.

Lorenzo-Gomez, M.F.; Padilla-Fernandez, B.; Garcia-Criado, F.J.; Miron-Canelo, J.A.; Gil-Vicente, A.; Nieto-Huertos, A.; Silva-Abuin, J.M. Evaluation of a therapeutic vaccine for the prevention of recurrent urinary tract infections versus prophylactic treatment with antibiotics. Int. Urogynecol. J. 2013, 24, 127–134.

Loy, C. P. Van, Sokurenko, E. V, Steve, L., și Moseley, S. L. (2002). The Major Structural Subunits of Dr and F1845 Fimbriae Are Adhesins The Major Structural Subunits of Dr and F1845 Fimbriae Are Adhesins. Infection and Immunity, 70(4), 1694–1702.

Lund, B., Lindberg, F., și Normark, S. (1988). Structure and antigenic properties of the tip-located P pilus proteins of uropathogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 170(4), 1887–94.

Maciá M.D., Blanquer D., Togores B., Salueda J., Perez J.L., Oliver A., Hypermutation Is a Key Factor in Development of Multiple-Antimicrobial Resistance in Pseudomonas aeruginosa Strains Causing Chronic Lung Infections, Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49, 83382-3386.

Marrie, T. J., și Costerton, J. W. (1983). Scanning electron microscopic study of uropathogen adherence to a Plastic Surface. Applied and Environmental Microbiology, 45(3), 1018–1024

Mc Laughlin S.P., Carson C.C.: Urinary tract infections in women. Med.Clin. N.Am. 2004, 88, 417-429.

M. Mills, K. C. Meysick, and A. D. O’Brien, “Cytotoxic necrotizing factor type 1 of uropathogenic Escherichia coli kills cultured human uroepithelial 5637 cells by an apoptotic mechanism,” Infection and Immunity, vol. 68, no. 10, pp. 5869–5880, 2000.

Morar M, Wright GD, The genomic enzymology of antibiotic resistance, Annu Rev Genet. 2010;44:25-51

Mulvey, M. A., Lopez-Boado, Y. S., Wilson, C. L., Roth, R., Parks, W. C., Heuser, J. and Hultgren, S. J. (1998) 'Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli', Science, 282(5393), 1494-7.

Mulvey, M.A.; Schilling, J.D.; Hultgren, S.J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infect. Immun. 2001, 69, 4572–4579.

Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J. and Gordon, J. I. (2002) 'Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli', J Biol Chem, 277(9), 7412-9.

Nielsen, K.L.; Dynesen, P.; Larsen, P.; Frimodt-Moller, N. Faecal Escherichia coli from patients with E. coli urinary tract infection and healthy controls who have never had a urinary tract infection. J. Med. Microbiol. 2014, 63, 582–589.

Nielubowicz, G. R. & Mobley, H. L. Host–pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Rev. Urol. 7, 430–441 (2010).

Niveditha, S., Pramodhini, S., Umadevi, S., Kumar, S. & Stephen, S. The isolation and the biofilm formation of uropathogens in the patients with catheter associated urinary tract infections (UTIs). J. Clin. Diagn. Res. 6, 1478–1482 (2012).

Norinder, B.S.; Lüthje, P.; Yadav, M.; Kadas, L.; Fang, H.; Nord, C.E.; Brauner, A. Cellulose and papg are important for Escherichia coli causing recurrent urinary tract infection in women. Infection 2011, 39, 571–574.

Normark, S., Lark, D., Hull, R., Norgren, M., Normark, S., Lark, D., Falkow, S. (1983). Genetics of Digalactoside-Binding Adhesin from a Uropathogenic Escherichia coli Strain. Infection and Immunity, 41(3), 942–49

Nowicki, B., Barrish, J. P., Korhonen, T., Hull, R. a, și Hull, S. I. (1987). Molecular cloning of the Escherichia coli O75X adhesin. Infection and Immunity, 55(12), 3168–73.

Nowicki, B., Moulds, J., Hull, R., și Hull, S. (1988). A Hemagglutinin of Uropathogenic Escherichia coli Recognizes the Dr Blood Group Antigen. Infection and Immunity, 56(5), 1057–1060.

Ott, M., Hoschützky, H., Jann, K., Van Die, I., și Hacker, J. (1988). Gene clusters for S fimbrial adhesin (sfa) and F1C fimbriae (foc) of Escherichia coli: comparative aspects of structure and function. Journal of Bacteriology, 170(9), 3983–90.

Poljakovic, M., Svensson, M. L., Svanborg, C., Johansson, K., Larsson, B. and Persson, K.(2001) 'Escherichia coli-induced inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase expression in the mouse bladder and kidney', Kidney Int, 59(3), 893-904.

Rankin I. D. (2005). Manual of Antimicrobial Susceptibility Testing. 1st ed, Washington, D.C.: American Society for Microbiology; 63-89.

Ratner, J. J., Thomas, V. L., Sanford, B. A. & Forland, M. Bacteria-specific antibody in the urine of patients with acute pyelonephritis and cystitis. J. Infect. Dis. 143,404–412 (1981)

Riegman, N., Kusters, R. O. N., Veggel, H. V. A. N., Bergmans, H., En, P. V. A. N. B., Hacker, J., și Dielt, I. V. A. N. (1990). F1C Fimbriae of a Uropathogenic Escherichia coli Strain : Genetic and Functional Organization of the foc Gene Cluster and Identification of Minor Subunits. Journal of Bacteriology, 172(2), 1114–1120.

Robino, L.; Scavone, P.; Araujo, L.; Algorta, G.; Zunino, P.; Pirez, M.C.; Vignoli, R. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clin. Infect. Dis. 2014, 59, e158–e164.

Rosche WA and Foster P (2000) Mutation under stress: Adaptive mutation in Escherichia coli. In: Bacterial stress responses, G. Storz, R. Hengge-Aronis (Eds.), ASM press, Washington DC, USA.

Sauer, F. G., Knight, S. D., Waksman and, G. J., și Hultgren, S. J. (2000). PapD-like chaperones and pilus biogenesis. Seminars in Cell și Developmental Biology, 11(1), 27–34.

Schembri, M. a, Dalsgaard, D., și Klemm, P. (2004). Capsule shields the function of short bacterial adhesins. Journal of Bacteriology, 186(5), 1249–1257.

Schmitz, S., Abe, C., Moser, I., Orskov, I., Orskov, F., Jann, B., și Jann, K. (1986). Monoclonal antibodies against the nonhemagglutinating fimbrial antigen 1C (pseudotype 1) of Escherichia coli. Infection and Immunity, 51(1), 54–9.

Schwarz, S., Werckenthin, C., Pinter, L. et al. (1995) Chloramphenicol resistance in Staphylococcus intermedius from a single veterinary centre: Evidence for plasmid and chromosomal location of the resistance genes. Veterinary Microbiology,, 43: 151- 159

Serafini-Cessi, F., Malagolini, N. & Cavallone, D. Tamm-Horsfall glycoprotein: biology and clinical relevance. Am. J. Kidney Dis. 42, 658–676 (2003).

Sharma BD, Rohit Bansal, B Gupta. JIACM 2011; 13(1): 55 – 59.

Sivick, K. e., Schaller, M. A., Smith, S. N. & Mobley, H. L. The innate immune response to uropathogenic Escherichia coli involves IL-17A in a murine model of urinary tract infection. J. Immunol. 184, 2065–2075 (2010).

Smellie, J., Edwards, D., Hunter, N., Normand, I. C. and Prescod, N. (1975) 'Vesico-ureteric reflux and renal scarring', Kidney Int Suppl, 4, S65-72.

Spurbeck, R.R., Stapleton, A.E., Johnson, J.R., Walk, S.T., Hooton, T.M., Mobley, H.L., 2011. Fimbrial profiles predict virulence of uropathogenic Escherichia coli strains: contribution of ygi and yad fimbriae. Infect. Immun. 79 (12), 4753–4763.

Stahlhut, S. G. et al. Comparative structure–function analysis of mannose-specific FimH adhesins from Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli.

Thanassi, D. G., Bliska, J. B. and Christie, P. J. (2012), Surface organelles assembled by secretion systems of Gram-negative bacteria: diversity in structure and function. FEMS Microbiology Reviews, 36: 1046–1082. 

Thumbikat, P.; Berry, R.E.; Schaeffer, A.J.; Klumpp, D.J. Differentiation-induced uroplakin iii expression promotes urothelial cell death in response to uropathogenic E. coli. Microbes Infect. 2009, 11, 57–65

Tomasz, A., Munaz, R. 1995. ß-lactam antibiotic resistance in Gram-positive bacteria pathogens of upper respiratory tract: a brief overview of mechanism. Microbial Drug Resistance; 1:103 – 109

Vaisanen-rhen, V. (1984). Fimbria-Like Hemagglutinin of Escherichia coli 075 Strains. Infection and Immunity, 46(2), 401–407.

Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, MCCray PB Jr, Ganz T. Human b-defensin-1: an antimicrobial peptide of urogenital tissues. J Clin Invest 1998;101:1633-1642.

Van Loosdrecht MC, Lyklema J, Norde W, Zehnder AJ (1990) Influence of interfaces on microbial activity. Microbiol Rev 54:75-87

Virkola, R., Westerlund, B., Holthofer, H., Parkkinen, J., Kekomaki, M., Korhonen, T.K., 1988. Binding characteristics of Escherichia coli adhesins in human urinary bladder. Infect. Immun. 56 (10), 2615–2622.

Walsh, C. 2000. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature 406: 775–781

Walsh, C. 2003. Antibiotics: actions, origins, resistance. ASM Press, Washington, DC.

Westerlund-Wikstrom B & Korhonen TK (2005) Molecularstructure of adhesin domains in Escherichia coli fimbriae. IntJ Med Microbiol 295: 479–486.

Woodford N and Ellington MJ (2007) The emergence of antibiotic resistance by mutation. Clin. Microbiol. Infect. 13, 5–18.

Zarnea, G., (1983). Tratat de Microbiologie generală. vol. I, Editura Academiei Române.

Zarnea, G., (1994). Tratat de Microbiologie generală. vol. V, Editura Academiei Române.

Zhang, D., Zhang, G., Hayden, M. S., Greenblatt, M. B., Bussey, C., Flavell, R. A. and Ghosh, S. (2004) 'A toll-like receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria', Science, 303(5663), 1522-6.

CLSI. (2012). Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard–Eleventh Edition. CLSI document M02-A11. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute.

CLSI.(2014). Performance standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fourth Informational Supplement. CLSI document M100-S24

CLSI (2015). Performance standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. CLSI document M100-S25

SR EN ISO 9000/2000 Sisteme de management al calității – Linii directoare pentru îmbunătățirea performanței