Actualitatea temei:

Introducere
Actualitatea temei:
Infertilitatea constituie o problemă medico-socială de importanță majoră pentru toate țările lumii, inclusiv pentru Republica Moldova. Conform datelor OMS 10-15% din cupluri suferă de infertilitate. Studii recente arată o creștere considerabilă a ratei infertilității în ultimii ani. Se consideră că actualmente mai mult de 25% din cupluri suferă de infertilitate. Principalii factori ce condiționează această creștere a infertilității sunt: sporirea incidenței bolilor cu transmitere sexuală, avortul efectuat în condiții nesigure, planificarea tardivă a sarcinii (după 30 ani), fumatul, consumul abuziv de alcool și înrăutățirea situației ecologice.[1]
Femeile cu vârsta peste 35 de ani au rate mai mari de infertilitate, în mare parte datorită deteriorării calității ovocitelor, caracterizată prin fragmentare, anomalii complexe de cilindri meiotici-cromozomi și stres oxidativ.  Spirulina o sursă bogată de antioxidanți, protejează organismul de stresul oxidativ la nivelul ADN-ului, dar și la nivel celular. Efectul nontoxic al biomasei de spirulină face să fie folosită în tot mai multe afecțiuni ale corpului uman cât și la regenerarea anumitor organe lezate de efectele anumitor substanțe toxice. Efectele fiziologice pozitive ale Spirulinei se datorează și conținutului ridicat de vitamine, minerale și acizi grași esențiali, îmbunătățind răspunsul imun și fertilitatea, greutatea corporală, aspectul exterior (Certik și Shimizu, 1999)[2].Multe dintre vitaminele și mineralele care se regăsesc în spirulină sunt antioxidante, care s-au dovedit a proteja organismul de deteriorarea radicalilor liberi. S-a demonstrat că daunele oxidante datorate radicalilor liberi contribuie la problemele legate de fertilitate, cum ar fi defectul de fază luteală, sănătatea săracă a ovulelor și a spermei, precum și scăderea imunității generale și a sănătății.
Deși pare surprinzător, în reproducerea umană, în mod natural, există mai mult insucces decât succes, atât din cauze naturale cât și din cauza unor influențe exogene. Fecundația în vitro (FIV), deși are o rată de succes, la prima vedere modestă, (25/30%) este totuși o modalitate de rezolvare pentru multe dintre astfel de cupluri. Populația Republicii Moldova, ca și în multe alte țări, trece prin schimbări demografice importante. Acestea se caracterizează prin rata scăzută a natalității, infertilitate înaltă și o populație care îmbătrânește. https://www.md.undp.org/content/dam/moldova/img/issuebriefs/Schimbari_demografice_importante_in_populatia_Moldovei.pdfDin studiile internaționale rezultă că infertilitatea primară în Republica Moldova constituie 2,5%, iar cea secundară – 3,8%, nivelurile similare fiind observate și în alte țări din regiune
https://moldova.unfpa.org/sites/default/files/pub-pdf/PSA_RO.pdf
Pentru embriolog ținta majoră o reprezintă obținerea unor embrioni de o foarte bună calitate, cu șanse mari de implantare și de instalare a unei sarcini. Obținerea unor astfel de embrioni ține atât de cauze cunoscute cât și de cauze necunoscute.
Pornind de la aceste premize am considerat că noi investigații cu privire la ultrastructura ovocitelor recoltate, ar putea aduce date noi cu privire la calitatea lor, date care să ofere sugestii pentru îmbunătățirea calității ovocitelor în urma folosirii spirulinei ca adjuvant la protocoalele de stimulare ovarian.
Materialul pe care lam avut la dispoziție (ovocite, embrioni), a fost folosit pentru investigații numai după acordul cuplurilor, acord care de multe ori a fost greu de obținut
Scopul: studiul influenței spirulinei, administrate ca adjuvant în stimularea hormonală asupra calității ovocitelor.
Obiective:
Evidențierea modificărilor indicilor biochimici în urma administrări spirulinei ca adjuvant în stimularea hormonală.
Aprecierea acțiunii spirulinei administrate ca adjuvant în stimularea hormonală asupra calității ovocitelor.
MATERIAL ȘI METODE: Cercetarea de față își propune să facă o analiză a variabilelor biochimici ce reprezintă principalii factori de influență asupra șanselor de obținere a ovocitelor de calitate în reproducerea umană asistată folosind un eșantion de 24 de paciente, dintre care XXX au primit spirulină, iar XXX – nu
Teste biochimice:
Toți parametrii și metoda aplicată (pentru setul de parametric ori pentru fiecare parametru în parte după caz)
Testele microscopic – descrierea metodei
Metoda de analiză statistică
Capitolul I
Reviul literaturii
1.1 Istoria și reflectarea modernă:
Infertilitatea este definită ca o boală a sistemului reproductiv ce are ca efect eșecul conceperii unui copil după 12 luni de activitate sexuală neprotejată (1). Afectează 10-15% din cuplurile aflate la vârsta reproductivă și poate avea consecințe grave de ordin medical, emoțional, familial și socio-eco nomic. În peste 15% din cazuri infertilitatea determină simptome depresive severe și un grad înalt de anxietate, mai ales dacă se asociază cu eșecul tratamentelor. (2-4) Cauzele infertilității sunt multiple și distribuite relativ egal între partenerul feminin și cel masculin; în aproximativ 30% din cazuri infertilitatea se datorează unei cauze exclusiv feminine, 30% unei cauze masculine, 20% din cazuri au o etiologie mixtă, datorată ambilor parteneri; în aproximativ 15-20% din cazurile de infertilitate cauza nu este depistată. Aceste procente pot varia ușor de la o țară la alta, în funcție de prevalența anumitor factori de risc sau aspecte culturale diferite (5). Studiile arată că rata infertilității crește de la 6% la femeile sub 24 de ani la peste 30% la femeile din grupul de vârstă de 35-44 de ani (6,7). Fertilitatea este considerată optimă până la 30 de ani, apoi se reduce progresiv. La 35 de ani scade la jumătate față de o femeie de 30 de ani, iar la 38 de ani, la un sfert (8,9). Declinul fecundității (abilității de a procrea) la femei este în primul rând asociat cu reducerea numărului și calității ovocitelor, factori ce nu pot fi controlați sau modificați, nici cu ajutorul tratamentelor (10,11). Scăderea odată cu înaintarea în vârstă a fecundității la femei se asociază cu o creștere a duratei de timp necesare concepției (Olsen, 1990). Durata infertilității până la momentul adresării către un specialist este considerată unul dintre factorii agravanți majori în estimarea prognosticului unui tratament (12-14). Actualmente una din cele mai efective metode de tratament al cuplului infertil este reproducerea asistată. După cum se știe, primele experimente de Fertilizare In Vitro (FIV) au fost efectuate în Marea Britanie sub conducerea profesorilor Patrick Steptoe și Robert Edwards încă 30 ani în urmă. Ca rezultat, în 1978 s-a născut Louise Brown, primul copil conceput “în eprubetă”. De atunci, metoda FIV de tratament a infertillității a căpătat o răspândire largă în multe țări europene, iar numărul copiilor născuți prin metoda FIV crește de la un an la altul, fiind deja de ordinul milioanelor. În SUA prima reușită a metodei FIV a fost raportată în 1981. În fosta URSS primul copil conceput prin metoda FIV s-a născut în anul 1986, în Ucraina – în 1991. România a raportat despre nașterea primului copil obținut prin reproducerea asistată în 1996. Anual în Europa se efectuează aproximativ 400000, iar în SUA peste 100000 proceduri FIV. În țările din Europa de Vest se efectuează peste 2000, iar în Istrael peste 3000 de proceduri FIV la 1 mln de locuitori. Se estimează că cel puțin 3 mln de copii s-au născut până în prezent datorită metodei FIV. Experimentele pentru implementarea metodei FIV în Republica Moldova au început în anul 1995 în secția de reproducere umană și genetică medicală a ICȘOSMC, odată cu procurarea aparatajului necesar. La început prelevarea oocitelor se efectua prin laparoscopie, fapt ce împiedica folosirea mai largă a metodei. Prima sarcină obținută prin metoda FIV a fost la finele anului 1995 și s-a soldat cu sarcină ectopică. Sarcina ulterioară a fost obținută la o femeie de 36 ani din suburbia orașului Chișinău, care timp de 10 ani nu avea copii. Evoluția sarcinii a fost fără particularități deosebite și femeia în decembrie 2006 a născut un băiat cu greutate 3500 g
Reproducerea umană asistată (RUA) este o realitate tot mai prezentă în societate. RUA reprezintă ansamblul tehnicilor și practicilor clinice sau biologice care permit procreerea în afara procesului natural, prin intervenția și la indicația medicului. Tehnicile de RUA sunt folosite atunci când, prin tratamentele obișnuite, hormonale, medicamentoase sau chirurgicale, nu se obține sarcina. Progresele înregistrate în cercetarea științifică clinică din domeniul sănătății reproducerii, în tratarea infertilității, ca și extinderea serviciilor de reproducere umană asistată medical, prin clinici specializate, se circumscriu obiectivului general de găsire a soluțiilor pentru sporirea fertilității în țările afectate de reducerea serioasă a populației și de amplificare a fenomenului de îmbătrânire demografică (15-18). Din punctul de vedere al embriologului clinician, embrionul sau preembrionul este privit ca un potențial „pacient“, ceea ce poate părea un paradox pentru restul lumii medicale. Este foarte clar acum că perioada periconceptuală determină nu numai evoluția în perioada perinatală, dar și un impact de lungă durată asupra sănătății vii torului copil (19). Factorii care îi afectează în dezvoltare pe acești mici „pacienți“ pot avea influențe asupra obținerii unei sarcini, dar și asupra evoluției acesteia și asupra sănătății viitorului copil. A înțelege modul în care intervențiile și factorii periconcepționali pot afecta sau pot fi folosiți pentru a îmbunătăți rezultatele în procedurile RUA reprezintă un factor foarte important în cunoaștere (19). Succesul tratamentului de infertilitate utilizând tehnici RUA este rezultatul unui complex de factori în care fiecare variabilă implicată în proces este importantă în creșterea șansei de a obține un copil. https://rmj.com.ro/articles/2015.3/RMR_Nr-3_2015_Art-3.pdf
Infertilitatea afectează atât femeile, cât și bărbații, constituind o problemă medico-socială importantă și pentru Republica Moldova. Amânarea perioadei de concepere este o tendință europeană, urmată și de către femeile din Republica Moldova. Din studiile internaționale rezultă că infertilitatea primară în Republica Moldova constituie 2,5%, iar cea secundară – 3,8%, nivelurile similare fiind observate și în alte țări din regiune (Fig. 3.8.1).
Fig. 3.8.1. Prevalența infertilității primare și secundare în unele țari, femeile în vârstă de 20-44 ani, Sursă: Mascarenhas M.N., Flaxman S.R., Boerma T., Vanderpoel S., Stevens G.A. (2012) Nalonal, Regional, and Global Trends în Inferllity Prevalence Since 1990: A Systematic Analysis of 277 Health Surveys. PLoS Med 9
Majoritatea publicațiilor în domeniul reproducerii asistate menționează că vârsta avansată a pacientei este un factor destul de important ce micșorează șansele la procreare, inclusiv prin metoda FIV. Acest lucru este confirmat și de rezultatele obținute de noi. La pacientele din grupa de vârstă de până la 29 ani rata succesului programului FIV a fost de 46,9%, indice cu mult mai înalt, comparativ cu grupa după 40 ani (15,4%). Acest fenomen e explicat prin aceea că cu vârsta scade rezerva ovariană, micșorându-se atât numărul cât și calitatea oocitelor căpătate, ce influențează capacitatea de fertilizare a oocitelor și rezultatele embrio transferului. Se consideră, de asemenea, că vârsta înaintată a pacientei reduce receptivitatea endometrială și micșorează rata implantării embrionilor.
1.2Infertilitatea și stresul oxidativ
În toată lumea medicală este binecunoscută informația că stresul oxidativ afectează metabolismul și calitatea celulelor în general și mai ales a celulelor reproductive, deopotrivă ovocite și spermatozoizi. Antioxidanții sunt utilizați frecvent în ultima perioadă în infertilitatea/subfertilitatea și susțin semnificativ, teoria conform căreia tratamentul cu antioxidanți ar îmbunătății potențialul reproductiv în general, precum și rezultatele procedurilor de RUA (Fertilizare în Vitro sau Inseminare Intrauterină) https://www.alinabolintineanu.ro/antioxidantii-si-rolul-lor-in-infertilitate/
Condițiile standard de cultură în vitro (IVC) cresc de obicei speciile reactive de oxigen (ROS), care au fost implicate ca una dintre cauzele majore ale dezvoltării embrionare reduse. Este binecunoscut faptul că nivelurile mai mari decât fiziologice ale ROS declanșează apoptoza celulelor granuloase și reduc astfel transferul de nutrienți și factorii de supraviețuire către ovocite, ceea ce duce la apoptoză. ROS sunt neutralizate printr-un sistem elaborat de apărare care constă din antioxidanți enzimatici și non-enzimatici. Echilibrul dintre nivelurile ROS și antioxidanții din mediul IVM este important pentru menținerea ovocitelor care se dezvoltă până la stadiul de blastocist. Efectele suplimentării cu antioxidanți ai mediilor de IVM au fost studiate la diferite specii de mamifere. Pubmed
 Factorii multipli pot contribui probabil la calitatea generală slabă a ovocitelor maturizate în vitro. Unul dintre factorii importanți poate fi stresul oxidativ (OS). Generarea de pro-oxidanți, cum ar fi speciile de oxigen reactiv (ROS) este un fenomen invariabil în starea de cultură. Este posibil ca sistemul de operare să influențeze și dezvoltarea ovocitelor în vitro. Pe de altă parte, ROS sunt considerate molecule semnal în fiziologia ovocitelor, iar impactul lor asupra destabilizării factorului de promovare a maturării (MPF) a fost raportat recent (9 – 11).
Stresul oxidativ este termenul folosit pentru afecțiunile produse de moleculele de oxigen distrugătoare numite radicali liberi. Stresul oxidativ se definește ca dezechilibrul dintre oxidanți și antioxidanți, în favoarea oxidanților, având potențial distructiv și patogenetic. În funcție de intensitatea lor, stresurile oxidative se pot desfășura în interiorul sau exteriorul celulei. Stresul intracelular poate conduce la necroza celulară sau la o dezorganizare mai mult sau mai puțin marcată a celulei, putând fi catastrofala în cazul unei celule care nu se poate reproduce. De asemenea, stresul oxidativ extracelular este citotoxic.
Radicalii liberi sunt substanțe care derivă din compuși oxidați incomplet, care au trecut prin arderi parțiale, având în structura lor grupări de oxigen capabile să inițieze la suprafața membranelor celulare sau chiar în interiorul celulelor reacții agresive de oxidare. Radicalii liberi provin din procesele ce se petrec în organism (fagocitoza, catabolismul incomplet, producerea de energie, detoxifiere hepatică), cât și din mediul exterior (fum de țigară, aer poluat, anumite alimente și medicamente, apa de fântână sau de robinet). Radicalii liberi cei mai activi sunt ionii: superoxid (O22-), peroxid (O2-), hidroxid (OH¯), oxid nitric (NO¯). Peroxizii și superoxizii, anionii care exercită o acțiune oxidantă energică provin din apa oxigenată (H2O2) precum și din alte surse sau procese, așa cum sunt cei rezultați în urma râncezirii alimentelor bogate în lipide (peroxizii lipidici). Radicalii liberi provin din 2 surse majore:
– Endogenă (radicalii liberi care se formează în organism pe parcursul fenomenelor metabolice sau fiziologice). Dacă, cel puțin dintr-o anumită măsură, impactul cu radicalii liberi exogeni poate fi limitat prin abordarea unui mod de viață adecvat și echilibrat, nu se poate spune același lucru și despre radicalii liberi endogeni.
– Exogenă (radicalii liberi pătrund în organism din mediul extern).
’’Un paradox al vieții terestre este că molecula esențială pentru traiul aerob, oxigenul, nu numai că stă la baza metabolismului energetic și a respirației, dar este implicată și în multe afecțiuni și maladii degenerative ’’ (L. Marx 1985). În acestea intervin forme parțial reduse ale oxigenului, denumite specii reactive de oxigen, care sunt molecule relativ mici, organice sau anorganice: oxigenul singlet, anionul superoxid, peroxidul de hidrogen, radicalul hidroxil, radicalii alcoxil și peroxil. Toate aceste molecule sunt înalt reactive datorită electronilor nepereche și joacă în condiții fiziologice roluri importante în procesele metabolice normale (mobilizarea sistemelor de transport ale ionilor, cicatrizarea leziunilor, homeostazia sanguină, sistemele redox de semnalizare, procesele imune). În condiții de mediu anormale (expunerea excesivă la căldură, radiații ultraviolete, poluanți), nivelul speciilor de oxigen crește dramatic, rezultând grave leziuni celulare.
1.3Spirulina:
Spirulina arthrospira platensis caractere distinctive și morfologie
– La genul arthrospira platensis în tipul taxonomic spiral (helicoidal) în distribuția porilor în:
– Membrana celulară tilacoizi, diametrul (30 – 70 µm), fragmentația filamentului trichom (Trichomes), vacuole de gaze transparente din proteina de formă cilindrică și regularitatea capsulei.
– Trichomul de o lungime de (500 µm) și un diametru de (30-70 µm)
– Cromatina și ribozomi sunt așezate central.
– Biosinteza proteinelor are loc în ribozomi.
– Codul genetic livrează forma mARN (messenger-RNA) transmisă transcripția (RNA transcription) informației ADN la molecula mesager mARN.
– La procariote transcripția are loc în plasma celulară.
– Informația ADN este inpachetata în cromatină.).
Cianobacteriile genului Spirulina sunt de multă vreme utilizate ca adaosuri în hrana populațiilor umane, ca și supliment în hrana animalelor, datorită conținutului lor ridicat de proteine, vitamine, aminoacizi esențiali, minerale, acizi grași esențiali (că acidul γ-linolenic, un precursor al eicosanoizilor) și agenți antioxidanți din gama carotenoizilor (Belay și colab., 1996). Studierea cianobacteriilor capătă o importanță din ce în ce mai mare în legătură cu obținerea și selectarea de noi materiale cu rol nutritiv său tehnic (Hills, 1985, Belay și colab., 1993, cât. de Rudic și colab., 1995). În centrul atenției specialiștilor din domeniu este cianobacteria Arthrospira (Spirulina) platensis, care prin valoarea compușilor biochimici depășește toate speciile de plante studiate (Hendrickson, 1989).
Evaluări toxicologice și nutriționale atestă că biomasa de Arthrospira (Spirulina) poate fi utilizată ca supliment nutritiv. Efectele fiziologice pozitive ale cianobacteriilor se datorează și conținutului ridicat de vitamine, minerale și acizi grași esențiali, îmbunătățind răspunsul imun și fertilitatea, greutatea corporală, aspectul exterior (Certik și Shimizu, 1999).
Proprietățile antioxidante ale Arthrospirei (Spirulina) și extractelor sale au atras atenția cercetătorilor. Într-unul dintre studiile lor, Manoj și colab. (1992) arată că extractul alcoolic de Arthrospira (Spirulina) inhibă peroxidarea lipidelor într-o măsură mai mare (65%) decât antioxidanții chimici, cum ar fi: α-tocoferolul (35%) și β-carotenul (45%). Extractul apos de Arthrospira (Spirulina) a avut de asemenea un efect antioxidant mai mare (76%) decât cel al acidului galic (54%) și cel al acidului clorogenic. Un aspect interesant al concluziilor acestora a fost că extractul apos are un efect antioxidant semnificativ chiar și după îndepărtarea polifenolilor. Proprietatea antioxidantă și antiinflamatoare a Arthrospirei (Spirulina) a fost studiată și deDartsch (2008), care a utilizat patru preparate pe bază de Spirulina platensis: (1) BioSpirulina, (2) SpiruComplex, un preparat cu seleniu (0,006%), crom (0,003%) și zinc (0,115%), (3) SpiruZink, un preparat cu zinc natural (0,25%), (4) Zinkspirulina + Acerola (vișină de Barbados sau vișină tropicală) un preparat cu zinc (0,125%) și pulbere de Acerola (conține 5,5% acid ascorbic). Toate preparatele cu. Spirulina au fost capabile să inactiveze radicalii liberi de oxigen generați de superoxidul de potasiu într-o manieră dependentă de doză. Cel mai puternic inactivator al radicalilor liberi de oxigen a fost ZinkSpirulina + Acerola, cu o inhibare semnificativă la concentrații de 100 μg/ml. Este bine cunoscut faptul că limfocitele T răspund la stimularea activatorilor policlonali nespecifici – mitogeni cum sunt fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A și intră în diviziune celulară. În consecință, mitogenul acționează mai întâi prin legarea de receptori la suprafața celulelor, care la rândul lor inițiază o cascadă de reacții biochimice care să conducă la proliferarea celulelor. În studiul de față s-a observat că Spirulina inhibă proliferarea celulelor stimulate de PHA
Spirulina este o specie de cianobacterii filamentoase care a fost folosită de mult timp ca supliment alimentar. În special, Spirulina platensis și Spirulina maxima sunt cele mai importante. Datorită unui conținut ridicat de proteine ​​și vitamine, Spirulina este utilizată ca supliment alimentar farmaceutic, deși celelalte beneficii potențiale ale acesteia asupra sănătății au atras multă atenție. Stresul oxidativ și imunitatea disfuncțională provoacă numeroase boli la om, inclusiv ateroscleroză, hipertrofie cardiacă, insuficiență cardiacă și hipertensiune. Astfel, activitățile antioxidante, imuno modulatoare și antiinflamatoare ale acestor microalge pot juca un rol important în sănătatea umană. Spirulina activează enzimele antioxidante celulare, inhibă peroxidarea lipidelor și deteriorarea ADN-ului, elimină radicalii liberi și crește activitatea superoxidului dismutaza și a catalazei. În mod deosebit, se pare că există un nivel de prag peste care Spirulina va reduce activitatea antioxidantă. Studiile clinice arată că Spirulina previne deteriorarea mușchiului scheletului în condiții de stres oxidativ indus de exercițiu și poate stimula producerea de anticorpi și poate regla sau exprima expresia genelor care codifică citokine pentru a induce răspunsuri imunomodulatoare și antiinflamatorii. Mecanismul (moleculele) molecular (e) prin care Spirulina induce aceste activități este neclar, dar fitocianina și β-carotenul sunt molecule importante. Mai mult, Spirulina reglementează eficient căile ERK1/2, JNK, p38 și IκB. Această revizuire oferă o perspectivă nouă asupra potențialelor aplicații terapeutice ale Spirulinei și poate oferi idei noi pentru studiile viitoare.
Spirulina este un obiect biotehnologic de perspectivă pentru obținerea preparatelor cu efect antioxidant și antiradicalic, fiind caracterizat printr-o componență biochimică variată și valoroasă. Biomasa de porfiridium conține cantități biotehnologic importante de ficobiliproteine, polizaharide sulfatate, carotenoizi, tocoferol, glutation, înregistrează o activitate semnificativă a enzimelor antioxidante primare și secundare, posedă mecanisme ce asigură chelărea metalelor cu valență variabilă.
Activitatea antioxidantă a componentelor biomasei microalgele este realizată în celulă prin mai multe căi: acestea acționează ca antioxidanți preventivi, care inhibă reacțiile de oxidare cu formare de radicali; ca antioxidanți ce previn formarea radicalilor lipidici; ca antioxidanți ce rup lanțul reacțiilor de autooxidare; ca stingători ai oxigenului singlet; prin sinergism cu alți antioxidanți celulari; că agenți de reducere, care convertesc hidroperoxizii în compuși stabili; ca factori de chelare a metalelor prooxidante în forme stabile și nu în cele din urmă, ca inhibitori ai enzimelor prooxidante [46, 90, 157].
Componentele celulare cu efect antioxidant la microalge formează două grupuri mari: antioxidanți enzimatici și antioxidanți non-enzimatici. Aceste grupuri mari sunt divizate în numeroase subgrupuri. Astfel, antioxidanții enzimatici se clasifică în antioxidanți de protecție primară (ori de prima linie de protecție) și antioxidanți secundari (ori de linia a doua de protecție). Antioxidanții enzimatici primari sunt reprezentați prin trei enzime care previn formarea sau neutralizează radicalii liberi: peroxidazele, în special glutation peroxidaza; catalaza și superoxid dismutaza. Enzimele antioxidante secundare fac parte din grupurile reductazelor și dehidrogenazelor [46, 158]. Acestea nu neutralizează direct radicalii liberi, ci asistă enzimele antioxidante primare asigurând reactivarea lor.
Sistemul de protecție antioxidantă nonenzimatică la microalge este compus din diverse grupuri de substanțe, dintre care cele mai reprezentative sunt grupurile proteinelor de chelare a metalelor, carotenoizilor, clorofilelor, ficobilinelor, compușilor fenolici, aminoacizilor și peptidelor antioxidante (de exemplu glutationul), precum și acidul ascorbic, vitaminele (A, E, C), cofactorii enzimelor (Q10), mineralele (zincul și seleniul), compușii azotați (de exemplu, acidul uric) ș.a. [46, 60, 173]. Ca și toate organismele fotosintetizante, spirulina a format evolutiv mecanisme eficiente de protecție antioxidantă de diferit nivel, care asigură supraviețuirea în condițiile ostile de exces al radicalilor liberi. În cazul microalgelor, la care toate procesele metabolice și fiziologice sunt concentrate într-o singură celulă, flexibilitatea mecanismelor de asigurare a activității normale și de înlăturare a stresului oxidativ și consecințelor lui, este un factor determinant. În prezența unei concentrații sporite de oxigen și a reducerii lui incomplete datorită scurgerii de electroni are loc formarea speciilor reactive ale oxigenului, așa că anionul superoxid și peroxidul de hidrogen. În prezența sensibilizatorilor (de exemplu a clorofilei), lumina solară, provoacă formarea hidroperoxizilor care dezintegrează în compuși cu un potențial energetic enorm, cum sunt peroxi- și alcoxiradicalii. În cazul cantităților insuficiente de antioxidanți în celulă se declanșează un proces activ de autooxidare a acizilor grași polinesaturați, în primul rând a celor din componența membranelor tilacoidale. Pentru a se proteja de aceste efecte nocive, celulele microalgale intensifică sinteza componentelor enzimatice, care asigură protecția antiradicalică, dar și a compușilor macromoleculari neenzimatici și micromoleculari, care de asemenea manifestă o activitate antioxidantă pronunțată [52, 72, 84, 91, 113, 117, 128, 132, 164, 184].
În același timp interesul cercetătorilor față de compușii chimici izolați din biomasa microalgelor este foarte mare și este axat pe trei direcții de bază: studiul toxinelor din microalge, obținerea produselor biologice, studii în domeniul chimiei ecologice. În ultimii 30 de ani au fost depistați și descriși peste 15 000 compuși chimici, care sunt parte componentă a biomasei diferitor specii de microalge și cianobacterii, ceea ce oferă posibilități enorme în elaborarea preparatelor naturale destinate uzului uman atât în hrană, cât și în formă de preparate farmaceutice eficiente [38, 45, 50, 1,72, 174, 176]. Aceste componente ale biomasei microalgelor și cianobacteriilor, inclusiv cele cu efect antioxidant, ce posedă activitate biologică în mai multe maladii, pot fi izolate și extrase prin aplicarea unor procedee necostisitoare. (teza Daniela)
Spirulina are valori nutritive#
Paralelă comparativă între conținutul AA esențiali (în g%) din Spirulină, Soia și Albumina din ou
Proteinele din Spirulina
Cel mai înalt nivel proteic întâlnit la vreun aliment (69-71%)
Proteină bazică (și nu acidă, ca și cea din produsele de origine animală!), care nu suprasolicită rinichii și nici nu are efect diuretic pentru unele minerale (cum au proteinele animale)
Conține toți AA esențiali, într-o proporție optimă pentru absorbția acestora, dar într-o cantitate net mai mare decât în soia, sau albumină (v. grafic anterior)
Spirulina conține și AA neesențiali, dar și aceștia într-o cantitate semnificativă
Spirulina conține și ADN (3,5%) și ARN (1%)
Azot neproteic 11,3%, azot proteic 13,3%
Glucidele din Spirulină
Constituie 16,5% din biomasa de Spirulină
Este singurul aliment-medicament de origine vegetală care stochează glucidele ca depozit sub formă de glicogen!!!
Cea mai mare parte din glucide este sub formă de monozaharide
Celuloza este într-o cantitate mică – 0,9%
Alte glucide: ramnoza (9%), compuși ciclici fosforilați (2,5%), glicani (1,5%),
Glicozamine și acid muranic (2%), glicogen (1-1,5%)
Lipidele din Spirulină
Spirulina conține 7% lipide, fiind în cea mai mare parte reprezentate de acizii grași, saturați și nesaturați
Conține AG w 3,9 și 6, cu predominanța primelor 2 clase
Este singurul aliment de origine vegetală care conține colesterol, dar într-o cantitate extrem de mică, de-a dreptul neglijabilă (19 mg/100 g produs)
Din 1980 se știe că Spirulina conține și prostaglandine cu acțiune antiinflamatoare, antialergică, cât și de reglare a funcțiilor sexuale
Studiile cromatografice au pus în evidență existența sitosterolului și a stigmasterolului, care pre întâmpină anchilozele7-dehidro-colesterolul (precursorul vitaminei D3) este și el într-o cantitate semnificativă
Spirulina conține și CAROTEOIZI, substanțe anti-oxidante, anticancerigene și tonice/trofice retiniene
SPIRULINA deține recordul în vitamina B12
Este unul dintre puținele alimente de origine vegetală, care conține această vitamină
Conținut 2 mg/kg
Efectele cobalaminei (vitaminei B12):
Constituie un factor de măturare al globulelor de sânge
Stimulează pofta de mâncare
Stimulează sinteza proteică
Scade nivelul seric al homocisteinei, prevenind ateroscleroza și cardiopatia ischemică
Are proprietăți hepato-protectoare
Esențială pentru replicarea ADN-ului, fiind implicată în creșterea și maturarea celulară
Participă la integritatea fibrei nervoase și a neuronului, cât și la sinteza tecii de mielină
SPIRULINA deține recordul în potasiu
Conținut: 1540 mg
Efectele potasiului în organism:
Asigură diferența de potențial trans-membranar a tuturor celulelor, alături de Sodiu
Contribuie la conducerea influxului (curentului) nervos
Menține tensiunea arterială la valori cât mai apropiate de normal
Participă la bună contracție a inimii (și a mușchilor scheletici), regularizând ritmul cardiac
SPIRULINA deține recordul în hormoni fitoestrogeni
Fito-estrogeni mai conțin și următoarele alimente de origine vegetală: soia, semințele de mărar, polenul granule, pătrunjelul
Efectele hormonilor fito-estrogeni:
Protecție vasculară anti-aterosclerotică excepțională (fumatul distruge estrogenul!)
Rol anti-cancerigen (sân, col uterin, prostată)
Vindecă tulburările de post-menopauză (bufeuri de căldură, nervozitate, iritabilitate etc.) și menstrele dureroase
Cresc absorbția Calciului din intestin, scad numărul de osteoclaste (celulele care distrug osul), cresc numărul de osteoblaste (celule care formează osul) și cresc producția de colagen tip I; astfel este prevenită, dacă nu mult întârziată, apariția osteoporozei la ambele sexe. După exercițiu fizic, hormonii fito-estrogeni sunt cei mai importanți factori de fixare/reținere a Calciului în oase
SPIRULINA deține recordul în clorofilă
Clorofila are o structură extrem de asemănătoare cu hemoglobină umană, fiind numită în acest sens “hemoglobina vegetală”
Rol anti-anemic extrem de important. Se absoarbe în mare parte ne-” feliată” (nedigerată) din intestinul subțire al omului, nefiind toxică pentru rinichi, așa cum este hemoglobină
Sursă excelentă de Magneziu pentru organism
Sursă proteică de cea mai bună calitate
Factor anti-cancerigen și anti-leucemic excepțional
SPIRULINA deține recordul în triptofan
Amino-acid esențial
Conținut în spirulină între 1-1,6g% (tofu din soia, al II-lea clasat, conține 0,7 g%)
Precursorul direct al serotoninei, una dintre “moleculele de plăcere” sintetizate de creierul nostrum
Câteva dintre efectele serotoninei:
Previne depresia și o combate eficient (același efect îl au AG w 3 și acidul folic)
Dă o stare permanentă de confort psihic și de bună dispoziție
Efect vaso-dilatator, hipotensor
Stimulator al contracției musculaturii netede
Neurotransmițător al sistemului nervos central
Spirulina are valori nutritive ridicate datorită conținutului său în proteine, aminoacizi esențiali, minerale, acizi grași esențiali, vitamine și antioxidanți liposolubili (vitamina E și carotenoizi) [28 – 38] (Tabelul 1)
Valorile nutritive și compușii funcționali ai Spirulinei.
Conținut în 100 g|
Valori nutritive|Compuși funcționali|
Proteine ​​35,4–70,0 g
Aminoacizi Glutamat 7,0–7,3 g
Leucine 5,9–8,4 g
Aspartat 5,2–6,0 g
Lizină 2,6–4,6 g
Tirozina 2,6-3,4 g
Fenilalanină 2,6–4,1 g
Metionină 1,3-2,7 g
Grăsime 4,0–16,0 g
% din totalul acizilor grași Palmitic 25.8–44.9%
Gamma-linoleic 17,1–40,1%
Linoleic 11,1–12,0%
Oleic 10,1–16,6%
Palmitoleic 2,3–3,8%
Stearic 1,7-2,2%
Carbohidrați 14.0–19.0 ​​g
Fibră brută 3,0–7,0 g
Minerale
Potasiu 2,0-2,6 g
Sodiu 1,5-2,2 g
Fosfor total 1,3-2,2 g
Fier 273,2–787,0 mg
Magneziu 330
Calciu 120–900 mg
Vitamine
B12 5,7–38,5 μ g
B2 3,0–4,6 mg
B6 0,5–0,8 mg
Niacină (B3) 13-15 mg
Acid folic 0,05–9,92 mg
Carotenoizi 0,3-2,6 g
Tocoferol 0,4–9,8 g|Fenol total 0,20–1,73 g
Flavonoide 0,1–0,9 g
Phycocyanins
C-Ficocianină 13,5–14,8 g
Aloficocianină 2,3 g
Phibobiliproteine ​​1,1 g
Polizaharide 0,2–12,5 g|antioxidant
Anti-inflamator
Antioxidant
Anti-inflamator
Imunostimulare|
Enzimele antioxidante la spirulina.
Printre enzimele antioxidante supeoxid dismutaza (SOD) este prima barieră de protecție contra stresului oxidativ în celulele organismelor aerobe. SOD realizează reacția de dismutație, transformând radicalii superoxid în dioxigen și peroxid de hidrogen, care este mai puțin activ și este scindat de alte enzime. A fost demonstrat, că celulele reacționează rapid la stresul oxidativ prin sporirea activității SOD și sinteza glutationului [23]. În dependență de cofactorul metalic prezent în moleculă sunt cunoscute trei izoforme de SOD. Cu/Zn SOD este caracteristică pentru citoplasmă, iar Mn SOD este localizată în mitocondriile formelor eucariote de alge. În formele procariote a fost depistată Fe SOD și Mn SOD. Sinteza activă a SOD și mărirea activității ei este un element crucial în asigurarea supraviețuirii organismului în condiții de stres oxidativ [71, 92, 102, 118, 165, 166, 185]. Nivelul sporit de SOD, în special în cloroplaste oferă un grad înalt de toleranță organismelor aerobe în diferite condiții de existență, care deviază de la limitele optimale pentru organismul dat [64, 67, 78].
Peroxidul de hidrogen care se formează în rezultatul reacției de dismutație este precursorul celui mai periculos radical liber – radicalul hidroxil. Enzima catalaza (CÂT) blochează acest proces prin scindarea H2O2 cu formarea oxigenului. Pentru realizarea acestei reacții este necesară prezența a două molecule de peroxid de hidrogen, una dintre ele acționând ca donor, iar altă ca acceptor de electroni. În celulele eucariote catalaza este concentrată preponderent în peroxizomi, unde sunt concentrate enzimele flavoproteice și SOD, care formează peroxidul în calitate de parte componentă a sistemului imun, care asigură imunitatea nespecifică. Catalaza este o enzimă bicomponentă fiero-porfirinică, ce constă din apoproteină și grupa activă, care conține hematină. În prezent se cunosc 5 izoforme ale catalazei, care se deosebesc între ele prin structura părții proteice. Activitatea normală a catalazei asigură funcționarea sistemului citocromic celular. La acțiunea combinată a catalazei cu citocromul C mitocondriile capătă o abilitate sporită în sinteza ATP-ului în condiții de creștere moderată a nivelului de oxigen în celule. Aceasta permite de a afirma, că CÂT este implicată și în procesul de fosforilare oxidativă, care are loc în mitocondrii.
Spre deosebire de alte enzime antioxidante, care sunt active doar la concentrații limitate ale substratului specific, catalaza își manifestă activitatea și la concentrații sporite de peroxid. Eficiența enzimei este extrem de înaltă, o moleculă de catalază fiind capabilă să scindeze 44 000 molecule de peroxid de hidrogen pe secundă. În mod normal catalaza este destul de stabilă, păstrându-și activitatea un timp îndelungat. Enzima nu necesită energie de activare, de aceea viteza de acțiune a ei este limitată doar de viteză de difuziune a substratului spre centrul activ. În cazul unor acțiuni deterioratoare asupra celulelor, ca urmare a instalării stresului oxidativ se înregistrează o creștere semnificativă a acțiunii catalazei (de zeci de ori) [91, 165, 184, 185].
Un rol separat în celulele spirulinei îi revine glutation peroxidazei (GPX). Comparativ cu superoxid dismutaza și catalaza, care se găsesc în celule în cantități relativ mari dar constante, glutation peroxidaza este de asemenea prezentă în toate țesuturile, dar în cantitate variabilă, deoarece este indusă enzimatic. GPX este o enzimă selen – dependentă, ce se găsește în citozol (70% din conținutul total al enzimei), dar și în mitocondrii (30%). Este de neînlocuit în arsenalul antioxidant, în special acolo unde lipsește catalaza pentru metabolizarea peroxidului. GPX asigură, de asemenea, protecție față de hidroperoxizii organici și ajută la regenerarea formei reduse a vitaminei C. Până în prezent, prin analiza selenoproteinelor cu rol enzimatic, au fost identificate 8 izoforme ale glutation peroxidazei. Funcția GPX constă în menținerea stării active a mai multor enzime, oxidarea spontană a cărora este asociată cu formarea legăturii disulfidice [68, 189].
Glutationul (GSH) este cofactorul glutation peroxidazei, glutation transferazei, dehidroascorbat reductazei – enzime cu acțiune antioxidantă pronunțată. Independent acest compus de asemenea are proprietăți antioxidante fiind o capcană directă pentru radicalul hidroxil și oxigenul singlet. În componența enzimei glutation peroxidaza participă la neutralizarea peroxizilor, inclusiv a celor lipidici. Efectul direct al glutationului în calitate de antioxidant mai este exprimat și prin regenerarea radicalului tocoferil în tocoferol, acționând astfel în mod sinergist cu acest component și asigurând protecție antioxidantă eficientă în primul rând membranelor, în care se localizează vitamina E [60]. În situații experimentale un nivel sporit al GSH este înregistrat atunci, când organismul este supus acțiunii factorilor de stres, iar în celule survine starea de stres oxidativ. Mărirea cantității de GSH în aceste condiții este o reacție de răspuns orientată spre anihilarea acțiunii radicalilor liberi și altor SRO [185, 251].
O altă peroxidază care realizează reducerea peroxidului de hidrogen este ascorbatperoxidaza (APX), care utilizează ascorbatul (AșA) în calitate de donor de electroni. Ascorbatul oxidat este redus de către ferredoxină, monodehidroascorbat reductază și dehidroascorbat reductază [82]. APX este o enzimă din grupul peroxidazelor hemice.
Acidul ascorbic sau vitamina C este un cunoscut antioxidant care în vitro are capacitatea de a neutraliza majoritatea radicalilor liberi și SRO. În vivo efectul antioxidant al acidului ascorbic este determinată de sinergismul acțiunii lui în tandem cu tocoferolul și glutationul, participând la reacțiile de transformări reciproce a formelor radical în forme stabile și invers. [60]. Ca și în cazul tocoferolului, hotarul între acțiunea antioxidantă și cea prooxidantă este destul de efemeră, acest echilibru fiind sub un constant pericol de prăbușire. În cazul acidului ascorbic factorul destabilizator este prezența metalelor cu valență variabilă în forma lor ionică. În aceste condiții ascorbatul devine prooxidant generând formarea metaboliților toxici, inclusiv a radicalului hidroxil. Un alt pericol, ce vine de la vitamina C pentru celulele vii provine din capacitatea acesteia de a se autooxida cu formarea dehidroascorbatului, care afectează grav transducția de semnal și întreaga activitate vitală a celulelor [29, 117].
Coenzima Q (CoQ) sau ubichinona face parte din sistemul succinat-dehidrogenazic. Activitate antioxidantă posedă formă redusă a coenzimei numită ubichinol (CoQH2) care reacționează cu radicalul superoxid și radicalii lipidici asigurând stingerea lor eficientă [129]. În rezultatul acestor reacții se formează semichinona – un radical liber primar cu funcție biologică determinată, fiind un element structural și funcțional al lanțului respirator transportor de electroni. Acționează sinergist cu vitamina E, asigurând regenerarea radicalului tocoferil în forma stabilă a vitaminei.
Prezența fenolilor – compuși în care grupa funcțională -OH este legată de un atom de carbon ce aparține unui nucleu aromatic – a fost demonstrată pentru biomasa majorității speciilor biotehnologic importante de cianobacterii și microalge [96, 103, 104, 127, 132, 133, 152]. Datorită proprietăților chimice specifice, fenolii sunt în esența lor substanțe cu efect antioxidant pronunțat. Efectul de anihilare a radicalilor liberi de către compușii fenolici are loc în primul rând, datorită capacității lor de a forma radicali fenoxil caracterizați prin grad înalt de stabilitate – deci, acționând în calitate de spărgători ai lanțului oxidativ. Pe lângă această au mai fost depistate două mecanisme specifice, prin care compușii fenolici se realizează că antioxidanți eficienți în celulă. Primul constă în chelărea ionilor metalici, iar cel de-al doilea constă în pătrunderea acestor compuși în bistratul lipidic al membranelor și modificarea fluidității acestora. Pentru unii fenoli așa că cvercitina, miricetina, fuzetina este caracteristică și acțiunea sinergistă în tandem cu alți antioxidanți recunoscuți, așa că glutationul ori enzima glutation – S – transferaza. Varietatea mecanismelor protecției antioxidante prin care se pot implica compușii fenolici în protecția celulelor determină și gradul înalt de corelare între cantitatea de fenoli în biomasă și activitatea antioxidantă a acesteia [84, 96, 140]. Cantitatea fenolilor în biomasa microalgelor și cianobacteriilor poate fi modificată prin acțiunea diferitor procedee biotehnologice, cum sunt acțiunea factorilor chimici, modificarea intensității luminii, modificarea raportului dintre principalii nutrienți, acțiunea temperaturilor mai înalte ori mai joase decât cele optimale ș.a. [127].
Din gamă largă de produse antioxidante ale cianobacteriilor cele mai cunoscute pentru efectele lor benefice sunt compușii fenolici, vitaminele C și E, carotenoizii și ficobiliproteinele [37, 47]. Ficobiliproteinele (ficoeritrina, ficocianina și aloficocianina) din componența biomasei cianobacteriilor, în primul rând a spirulinei, se utilizează pe larg datorită proprietăților remarcabile ca coloranți și marcheri fluorescenți [184]. Datorită acțiunii antioxidante ficobiliproteinele se manifestă că agenți antiinflamatori, care reduc edemul, scad nivelul histaminelor, activitatea mieloperoxidului, precum și nivelul prostaglandinei PGE2 și leucotrienei LTB4 în țesuturile inflamate [117]. În sistemele vii acești pigmenți au acțiune de inhibiție a radicalilor hidroxil, alcoxil și peroxil. Ficocianina reduce de asemenea și nivelul factorului necrozei tumorilor (TNF-α) și are efect neuroprotector. În prezent acești compuși sunt propuși pentru utilizarea în terapia fotodinamică a tumorilor [216]. Aceste substanțe își au efectul lor benefic și în prevenirea stărilor canceroase în calitate de remediu profilactic [126, 131].
Β-carotenul este indispensabil în asigurarea unui nivel normal al vederii, dar și a statutului imun la om, este un remediu profilactic eficient în cazul cancerului, aterosclerozei, maladiilor coronariene ș.a. Plasma sangvină a omului în mod obligatoriu conține caroten, în timp ce celulele corpului sunt incapabile de a realiza sinteza acestui compus. Deci, fiind un element esențial, aportul lui cu alimentele este strict necesar. De aici reiese cerința înaltă față de acești compuși pe piața mondială
Majoritatea obiectelor ficologice, care au fost introduse în procesul de producere industrială prezintă un grad înalt de siguranță atât pentru organismul uman, cât și pentru mediul ambiant. În anul 2011, Comitetul de Experți în domeniul Informării despre Suplimentele Dietice (DSI-EC Dietary Supplements Information Expert Committee) al Convenției Farmacopeice a SUA a apreciat spirulina pentru cel mai înalt posibil grad de siguranță și a declarat consumul de spirulină absolut sigur pentru om, ceea ce este un argument suplimentar în utilizarea resurselor acvatice preferențial celor terestre în procesul de obținere a antioxidanților pentru uzul uman ori animal [15].
Din cele relatate mai sus este evident, că spirulina se caracterizează prin prezența și activitatea înaltă a enzimelor antioxidante, care asigură protecția celulelor de acțiunea nefastă a speciilor reactive de oxigen prin înlăturarea lor eficientă.
1.4 Rolul antioxidanților în infertilitate
Sistemul reproductiv feminin uman se îmbătrânește mai repede decât majoritatea sistemelor corporale, iar capacitatea de reproducere este corelată negativ cu vârsta [1, 2]. Din diverse motive, multe femei amână amânarea și o proporție considerabilă de femei în vârstă devin infertile [3]. O reducere a cantității și deteriorarea calității ovocitelor este universală la femeile peste 40 de ani. Calitatea slabă a ovocitelor este caracterizată de anomalii meiotice ale axului, dezechilibrare cromozomială, stres oxidativ, modificări ale expresiei genei, telomeres scurtat și pierderea coeziunii [1, 4-6]. Stresul oxidativ apare datorită acumulării treptate a daunelor cauzate de radicalii liberi care sunt generați în timpul metabolizării normale și este considerată unul dintre mecanismele majore care stau la baza îmbătrânirii [7, 8]. Celulele germinative inițiază meioza și se opresc la stadiul de dictat al profazei I în ovarul fetal; aceste celule germane postnatale rămân arestate timp de săptămâni până la luni la șoareci și de 10-50 de ani la om [9]. În acest interval prelungit, speciile reactive de oxigen (ROS) acumulează și scad calitatea și cantitatea ovocitelor [10]. ROS afectează negativ procesele de maturizare a ovocitelor până la fertilizare, dezvoltare embrionară și sarcină și sunt asociate cu declinul de reproducere în vârstă [3, 11, 12]. Rapoartele anterioare au demonstrat că acumularea ROS în celule poate duce la derangerea citoscheletului [13], la reducerea telomerilor [14], la afectarea activității telomerazei [15], la disfuncția sistemului antioxidant [16,17], la tulburările de ATP [18] și la distribuția mitocondrială [19] și apoptoza celulelor [20].
C-galactoza (D-gal) este un zahăr reducător care poate forma produse finale de glicozilare avansată (AGE) în vivo. Îmbătrânirea este accelerată după ce șoarecii primesc D-gal orală sau subcutanată [21-23]. Unele studii s-au axat pe efectul D-gal asupra stresului oxidativ și s-a constatat că AGE pot provoca acumularea de ROS, în special radicalii de superoxid și peroxidul de hidrogen [21].
Reducerea stresului oxidativ prin suplimentarea cu antioxidanți ar putea reduce daunele induse de ROS, menținând astfel numărul și calitatea ovocitelor și foliculilor [24-27].
Producția de specii reactive de oxigen și generarea de stres oxidativ
Sistemul de operare este cauzat de un dezechilibru între pro-oxidanți și antioxidanți (17). Acest raport s-ar putea schimba odată cu creșterea nivelului de pro-oxidanți, cum ar fi ROS, sau o scădere a mecanismelor de apărare a antioxidanților (18 – 20). ROS reprezintă o clasă largă de molecule care indică colectarea radicalilor liberi (ion hidroxil, superoxid etc.), non-radicali (ozon, oxigen unic, peroxizi lipidici, peroxid de hidrogen) și derivați de oxigen (21). Sunt foarte reactivi și instabili. Prin urmare, ROS poate reacționa cu acizi nucleici, lipide, proteine ​​și carbohidrați pentru a dobândi un electron și a deveni stabil. Aceste reacții induc o cascadă de reacții în lanț ulterioare, care în cele din urmă duc la deteriorarea celulelor (22 – 24). ROS poate difuză și trece prin membranele celulare și poate modifica cele mai multe tipuri de molecule celulare (acizi nucleici, proteine ​​și lipide), ceea ce duce la modificări mitocondriale (25), oprire meiotică în ovocite (26), bloc embrionar și moarte celulară (27)). Pe de altă parte, sistemul de operare apare atunci când nivelurile ROS crescute care perturbă circuitele redox celulare, duc la tulburări ale proceselor celulare reglementate redox și/sau deteriorează oxidativ macromoleculele celulare (28). În condiții fiziologice, ovocitele sunt surse majore de ROS, deoarece folosesc oxigenul pentru a produce energie prin fosforilarea oxidativă mitocondrială. Producția de ROS este crescută în timpul IVM în comparație cu maturizarea în vitro (13, 29). Nivelurile crescute de ROS dincolo de domeniul fiziologic care poate duce la sistemul de operare poate duce la deteriorarea calității ovocitelor și, prin urmare, să afecteze rezultatele de reproducere (30). O mai bună înțelegere a stării sistemului de operare și a reglementării sale în timpul MV. Cu toate acestea, trebuie să se analizeze, de asemenea, dacă și modul în care sistemul de operare poate influența procesul IVM. Această secțiune se concentrează asupra rapoartelor care se referă la rolurile mecanice ale sistemului de operare în maturizarea ovocitelor, în special în ceea ce privește caracteristicile cheie ale evenimentelor nucleare și citoplasmatice din oocit.
Specii reactive de oxigen și maturizare nucleară și citoplasmică
Niveluri crescute de ROS asociate cu inducerea stopului ciclului celular în ovocite umane, precum și în embrioni de șoarece (31). O multitudine de factori cheie reglează generarea de ROS în media și include diverse reacții metabolice celulare, concentrație de oxigen, lumină, manipularea ovocitelor și parametri fizico-chimici generali care pot avea un impact negativ asupra fiziologiei ovocitelor prin inducerea apoptozei (Fig. 1). Unul dintre componentele majore care poate modifica răspunsurile dezvoltării în ovocit este relevant pentru OS, deoarece se știe că lumina are ca rezultat un dezechilibru al pro- și antioxidanților din celulele somatice și embrioni. În mod similar, s-a arătat o relație într-un model de șoarece între un tip de lumină utilizat frecvent în laborator, cu concentrații crescute de ROS și dezvoltarea embrionară și fetală compromisă (32). Tensiunea de oxigen este o altă diferență importantă între mediile în vivo și în vitro pentru cultura ovocitelor. Efectele toxice ale concentrației de oxigen atmosferic în condiții de cultură standard și efectele benefice ale concentrațiilor mai mici de O2 (5-7%) asupra competenței de dezvoltare a ovocitelor în vitro au fost raportate la șoareci (33, 34), hamsteri (35, 36), șobolani (37), oi și bovine (38 – 40) și oameni (41 – 43).
Factorii posibili care induc generarea de specii reactive de oxigen (ROS) în ovocit. Dezechilibrul dintre ROS și antioxidanți, impactul nivelurilor ridicate de ROS și stresul oxidativ rezultat (OS) asupra stopului meiotic și apoptozei la ovocite.
Condițiile unui IVC generează ROS, care ar putea exercita unele efecte benefice dacă nivelurile ROS rămân sub niveluri fiziologice (44). Generația tonică de ROS declanșează reluarea meiotică din diploten, precum și stadiul de arestare a MII la mai multe specii de mamifere (44, 45). S-a raportat că nivelurile de ROS dincolo de domeniul fiziologic ar putea induce destabilizarea MPF de măturare, reduce factorii de supraviețuire și poate declanșa apoptoza mediată de mitocondrie a ovocitelor (15, 46). Rolul bifazic al ROS trebuie discutat suficient pentru a actualiza sistemul de operare și impactul său asupra calității ovocitelor (15). Rolul benefic al ROS provine din observațiile potrivit cărora antioxidanții non-enzimatici, cum ar fi acidul ascorbic și 3-terț-butil-4-hidroxianisol (BHA), inhibă reluarea meiotică spontană din stopul de diplotene (47). Aceste rezultate sugerează un nivel de prag benefic pentru ROS
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5347452/
1.5 SISTEME ENZIMATICE DE APĂRARE ÎMPOTRIVA RADICALILOR LIBERI
Celulele se pot apăra de atacul speciilor reactive prin numeroase mecanisme. În primul rând există o serie de enzime antioxidante: superoxid dismutazele (tipurile 1,2 și 3), catalazele, lactoperoxidaza, glutation peroxidaza și peroxiredoxina. Acestora li se adaugă prezența unui număr mic de molecule antioxidante: acidul ascorbic (vitamina C), tocoferolul (vitamina E), acidul uric, bilirubina, glutationul. Dintre ele glutationul este extrem de activ și important, fiind regenerat de glutation reductaza și NADPH. Poate fi regenerat și de acidul lipoic în asociere cu alți oxidanți. Când rețelele endogene de antioxidanți eșuează în restabilirea balanței redox celulare, nivelurile de glutation scad și apare stresul oxidativ. Un antioxidant adesea trecut cu vederea este acidul uric, a cărui formarea poate asigura chiar un mijloc semnificativ de apărare față de reacțiile de nitrozare date de peroxinitrit în miocardul afectat de hipoxie. De aceea, se consideră că nivelul de acid uric seric este un marker important de stres oxidativ. Substanțele care neutralizează efectul potențial negativ al radicalilor liberi sunt grupate în general în sistemul de apărare antioxidantă. Acest sistem cuprinde un număr mare de elemente, fiind la fel de divers cum sunt și radicalii liberi, celulele conținând o varietate de substanțe capabile de scavenging pentru multiple specii radicalice tocmai pentru a putea asigura o protecție maximă. Deși s-au realizat progrese considerabile în identificarea și înțelegerea modului de acțiune al unor enzime și al altor componenți ai apărării antioxidante, varietatea și complexitatea antioxidanților intracelulari face încă imposibilă explicarea acestui proces de apărare.
1.6 MECANISME DE APĂRARE ÎMPOTRIVA RADICALILOR LIBERI În Vivo
În vivo, ovocita și embrionul sunt protejați împotriva radicalilor liberi de către antioxidanți prezenți în fluidul folicular și oviductal. Antioxidanții au fost definiți de către Halliwell și Gutteridge (2007) ca fiind “orice substanță, care prezentă în concentrații mici în comparație cu un substrat ce poate fi oxidat este capabilă s ă întârzie semnificativ sau să împiedice oxidarea acelui substrat”. Ei pot fi de origine endogenă sau exogenă. În prima grupă se înscriu enzimele cu rol antioxidant (superoxid dismutaza, catalaza și glutation peroxidaza) dar și substanțe fără funcție enzimatică precum glutationul, cisteamina și hipotaurina. Din a doua categorie fac parte substanțe precum αtocoferolul, acidul ascorbic sau carotenoidele (luteina). Aceștia sunt principalii antioxidanți prezenți în sistemele biologice, cu activitate în compartimentul celular liposolubil (α-tocoferolul, luteina) sau în cel hidrosolubil (acidul ascorbic). În vitro activitatea lor a fost testată în cazul a numeroase tipuri celulare, evidențiindu-se un efect pozitiv mai mult sau mai puțin pronunțat.
Antioxidanții scapă ROS, care ajută la menținerea echilibrului oxidant/antioxidant celular. Pe de altă parte, antioxidanții sunt compușii care fie suprimă formarea de ROS, fie se opun acțiunilor lor. Există două tipuri de antioxidanți: enzimatic și non-enzimatic (tabelul 1).
Antioxidanții enzimatici neutralizează excesul de ROS și împiedică deteriorarea structurii celulare. Antioxidanții enzimatici sunt compuși din superoxid dismutaza (SOD), catalază (CÂT), diverse peroxidase și peroxiredoxine (PRDX), inclusiv peroxidasele de glutation (GPX), care pot converti peroxizii în apă și alcool (48). Enzimele SOD catalizează dismutarea anionului superoxid (O2-) în O2 și HO 2O 2 întimp ce CÂT transformă HO2O2 în O2 și H2O. Enzima SOD există sub formă de trei izoenzime (49): SOD1, SOD2 și SOD3. SOD1 conține Cu și zinc (Zn) ca co-factori metalici în citosol. SOD2 este o izoformă mitocondrială care conține mangan (Mn), în timp ce SOD3 codifică forma extracelulară. Nutrienți precum Se, Cu și Zn sunt necesari pentru activitățile unor enzime antioxidante, deși nu au acțiuni antioxidante. Antioxidanții non-enzimatici sunt compuși din glutation (GSH), vitamina C, taurina, hipotaurina, vitamina E, Zn, seleniu (Se), beta-caroten și caroten (47). GSH este un compus tripeptid tiol, cu multe funcții importante în fiziologia și metabolismul intracelular. Unul dintre cele mai importante roluri ale GSH este menținerea stării redox în celule, care le protejează împotriva efectelor dăunătoare cauzate de leziunile oxidative. Acțiunea de protecție a GSH împotriva ROS este facilitată de interacțiunile cu enzimele sale asociate, cum ar fi GPx și GSH reductază (Fig. 2).
Fig.2
Prezența enzimelor antioxidante, cum ar fi superoxid dismutaza (SOD), peroxidazele de glutation (GPx) și catalază (CÂT), precum și antioxidanți non-enzimatici, cum ar fi vitamina E și C (acid ascorbic), glutation (GSH), acid uric și albumină în ovocite. Cantitățile în exces de specii reactive de oxigen (ROS) pot fi implicate în stresul oxidativ (OS) al ovocitelor și celulelor granuloase.
Vitamina C (acid ascorbic) este un catalizator redox cunoscut care poate reduce și neutraliza ROS (50). Pe baza structurii sale chimice, acidul ascorbic este un donator de electroni și, prin urmare, un agent reducător. Are două roluri biochimice diferite: antioxidant și cofactor enzimatic. Acidul ascorbic este menținut prin reacții cu GSH și poate fi catalizat prin proteină disulfură izomerază și glutaredoxine. Cisteamina este un aminoacid cu greutate moleculară mică care conține tiol (51). Adăugarea de cisteamină nu numai că îmbunătățește conținutul de GSH în ovocitele MII, dar protejează și lipidele și proteinele membranei datorită proprietăților indirecte de eliminare a radicalilor (52). Concentrațiile multor aminoacizi, inclusiv taurina și hipotaurina sunt antioxidanți non-enzimatici care ajută la menținerea statutului redox în ovocite (53).
Vitamina E (α-tocoferol) este o vitamină solubilă în lipide cu activitate antioxidantă. Este format din opt tocoferoli și tocotrienoli. Vitamina E poate distruge direct radicalii liberi, cum ar fi peroxilul și alcoxilul (ROO ••), generate în timpul peroxidării lipidelor induse de ascorbat feroase (LPO), astfel încât este sugerat ca un antioxidant principal care rupe lanțul (54). Hialuronanul, melatonină, ceaiul și sericina sunt cunoscute ca acționând ca antioxidanți indispensabili în IVEP. Acestea pot bloca eliberarea factorilor pro-oxidanți eliberați ca urmare a OS (12, 55, 56).
Hialuronanul, o componentă esențială a matricei extracelulare și glicozaminoglicanul non-sulfat poate juca un rol important în reluarea meiotică a ovocitelor (57). Hormon melatonină (N-acetil-5-metoxi tryptamina) este un antioxidant care, spre deosebire de GSH și vitaminele C și E, este produs de mamifere. Spre deosebire de alți antioxidanți, melatonină nu poate fi supusă ciclului redox. Odată oxidat, acesta nu este în stare să revină la starea redusă din cauza formării de produse finale stabile după reacție (14). Ca antioxidant, s-a dovedit că ceaiul verde îmbunătățește IVM și dezvoltarea embrionului de COC de oaie până la stadiul de blastocist în mediu IVM (58). Sericina o proteină globulară solubilă în apă (hidrolizat de proteină) este derivată din viermele de mătase Bombyx mori. Această proteină reprezintă o familie de proteine ​​a căror masă moleculară variază între 10 și 310 kDa (59). Dash și colab. (60) au raportat că sericina poate oferi un efect protector asupra fibroblastelor prin promovarea enzimelor antioxidante endogene în vitro.
1.6Suplimente de antioxidanți și îmbunătățirea dezvoltarea în vitro
Adăugarea de antioxidanți enzimatici, cum ar fi SOD, CÂT și tioredoxină, sunt eficiente pentru dezvoltarea preembrionară ca epatatoare de ROS și servesc embrionii cu o stare scăzută de OS la șoareci (61, 62), porci (63) și bovine (64). Sericina, o proteină antioxidantă, îmbunătățește dezvoltarea embrionului (60, 65) și este un supliment critic pentru maturarea ovocitelor (12, 56).
O serie de antioxidanți non-enzimatici protejează ovocitele împotriva afectării ROS în timpul maturării ovocitelor. GSH este unul dintre antioxidanții sintetizați natural, care protejează celulele de toxicitatea ROS și reglează echilibrul redox intracelular (66). Nivelul intracelular de GSH crește în timpul maturării ovocitelor la hamsteri (67), porci (68), ovini (69), bovine (70) și ecvidei (71). Rapoarte recente au arătat că adăugarea de compuși tioli cu greutate moleculară mică, cum ar fi cisteamina și b-mercaptoetanolul la mijloacele IVM a îmbunătățit maturizarea citoplasmatică a ovocitelor și dezvoltarea embrionului prin creșterea sintezei GSH (66, 72, 73).
Suplimentarea cu cisteamină în timpul IVM ar putea îmbunătăți ratele de măturare nucleară la canine (74), șoareci (75), caprine (76) și porcine (77). Deși, alte studii la caprine (78), porci (79), cai (13), bivoli (80) și bovine (81) nu au arătat nicio creștere a ratelor de măturare nucleară. Adăugarea cisteaminei la mediul IVM a îmbunătățit dezvoltarea embrionului la stadiul de blastocist la ovocitele de mamifere (82).
Ascorbatul este concentrat în celulele granuloase, celule teca, celule luteale și ovocite (28). Choi și colab. (83) a raportat un rol benefic pentru vitamina C în protejarea structurilor fusului de ovocite de șoarece MII și alinierea cromozomială împotriva daunelor provocate de oxidant (peroxid de hidrogen). Se sugerează că efectul vitaminei C este asociat în principal cu capacitatea sa de a promova maturizarea ooplasmică în timpul IVM. Rolul benefic al ROS provine din observațiile potrivit cărora antioxidanții non-enzimatici, cum ar fi acidul ascorbic, inhibă reluarea meiotică spontană din stopul cu diploten. Am prezentat o serie de observații. Tatemoto și colab. (84), Kere și colab. (85), iar Córdova el al. (86) a constatat că adăugarea de vitamina C la mediul de măturare a ovocitelor nu a exercitat niciun efect asupra ratelor de măturare a ovocitelor. În mod similar, antioxidanții precum vitamina E și trolox nu au avut niciun efect asupra maturizării ovocitelor, dar alți antioxidanți, cum ar fi galatul de propil și 2,4,5-trihidroxibutrofenona, au inhibat reluarea spontană a meiozei Împreună, aceste studii au accentuat rolurile benefice ale ROS în timpul IVM la anumite concentrații (nivel scăzut (87).
Capitolul II
Material și metode de studiu
2.1 Obiectul de studiu și etapele cercetării.
Cercetările date au avut loc în cadrul laboratorului de embriologie umna în cadrul instituției medicale, Clinica Familia”
Prin cercetările experimentale prezentate în această teză de masterat am urmărit obținerea unor rezultate în ceea ce privește efectele induse de administrarea Spirulina platensis. Problemele propuse spre rezolvare vizează următoarele aspecte studiul influenței spirulinei, administrate ca adjuvant în stimularea hormonală asupra calității ovocitelor. Testarea efectelor protectoare, antioxidante ale Spirulina asupra pacienților care urmat protocolul de fertilizare în vitro; studierea proprietăților imunologice și morfologice a ovocitelor a pacientelor cu subinfertilitate. Evidențierea modificărilor indicilor biochimici în urma administrări spirulinei ca adjuvant în stimularea hormonală Deși se cunosc proprietățile antioxidante ale Spirulinei, nu s-a abordat până în prezent valoarea ei profilactică și curativă în patologia infertilității feminine și mai exact în obținerea ovocitelor de calitate. Modelul experimental presupune investigarea a doua loturi de paciente.În fiecare lot au fost câte 12 paciente. Toate 24 de paciente au avut eșec la prima încercare de fertilizare în vitro. Astfel au apelat repetat la regimul de stimulare standart.La fiecare lot să urmărit și studiat indicii endocrinologici de bază în zilele 1-3 ale ciclului menstrual: au fost măsurați hormonul de stimulare a foliculului (FSH) și hormonul luteinizant (LH) pentru a evalua funcția ovariană. A măsurat progesteronul la nivel mediu luteal (cu șapte zile înainte de menstruația preconizată) pentru a confirma ovulația. Dacă ciclul menstrual este neregulat este evaluate prolactina, concentrațiile mari de prolactină inhibă steroidogeneza ovariană precum producția și secreția gonadotropilor hipofizari. Hiperprolactinemia (la femei și la bărbați) este cea mai frecventă cauză a tulburărilor de fertilitate. Deasemenea este examinat și estradiolul, nivelul de estradiol crește de-a lungul fazei foliculare a ciclului menstrual în strânsă dependență cu creșterea și dezvoltarea foliculului ovarian. De asemenea, datele endocrinologice sunt sprijinite de rezultate imagistice (microscopie inversată) ceea ce conferă siguranța că rezultatele obținute reflectă realitatea. Studiile experimentale efectuate și prezentate în capitolele următoare ale tezei, au fost realizate pentru descifrarea efectelor induse de acțiunea (Spirulina) asupra calității ovocitelor. În urma acestor investigații experimentale, considerăm că avem suficiente dovezi experimentale pentru o potențială activitate a enzimelor antioxidante, care asigură protecția celulelor de acțiunea nefastă a speciilor reactive de oxigen prin înlăturarea lor eficientă.
Studiile experimentale s-au efectuat pe șobolanii albi de laborator de ambele sexe.