Activitatea Enzimatica A Ureazei DIN Sol

CUPRINS

Pag.

[NUME_REDACTAT] introducere este necesară ca prim cuvânt pentru o bună înțelegere a lucrării de față pentru că la originea oricărui studiu stă o motivație, un scop și bineînțeles o serie de etape ce au fost parcurse pe măsură ce acesta a luat contur, iar în acest caz expunerea lor este utilă.

În toate țările lumii, intensificarea activităților economice, a celor

industriale și agricole în special, generatoare a unor imense cantități de substanțe poluante, are un efect tot mai mare asupra calității apei, aceasta fiind atât victimă cât și participant la poluarea celorlalte produse.

Exploatările miniere lasă prăpăd în urma lor. Închiderea exploatărilor miniere reprezintă o adevărată provocare pentru autorități, din cauza riscurilor foarte mari existente din punctul de vedere al protecției mediului. Este nevoie de fonduri foarte mari și de o supraveghere

continuă, realizată de specialiști, pentru a evita un adevarat dezastru

ecologic. Monitorizarea iazurilor de decantare va dura cel puțin 15 ani, timp în care oamenii trebuie să se roage să nu plouă torențial.

În consecință, trebuie întrepriși pași corespunzători pentru a ne asigura că activitățile noastre nu afectează calitatea apei, astfel încât să fie posibilă reutilizarea acesteia.

Principalele surse de poluare sunt legate de o serie de activități tradiționale (minerit, exploatarea lemnului), dar și de unele recente (diferite alte ramuri industriale). Principalele surse de poluare ale mediului provenite din activitățile miniere sunt: minele, haldele de steril, iazurile de decantare, conductele care transportă materialul, flotațiile, uzinele de prelucrare . Acestea produc deteriorarea tuturor factorilor de mediu, în special a apelor, dar și a solului, aerului si vegetației.

Haldele și iazurile de decantare sunt forme pozitive de relief, de mari dimensiuni, care modifică total morfologia terenului. Ele pot fi afectate de procese de deplasare în masă (alunecări), precum și de eroziune în suprafață și în adâncime.

Un semnal de alarmă și, totodată, un potențial factor de risc pentru cetățeni și pentru mediu, îl reprezintă iazurile de decantare aparținătoare fostelor uzine de preparare a minereurilor. Acestea sunt localizate pe cursurile unor văi. În momentul de față, dacă aceste iazuri de decantare nu vor fi supravegheate și nu se vor executa lucrări de intreținere a digurilor și de supraînălțare a acestora, dacă nu vor fi efectuate activități de monitorizare a nivelului apei în iazuri, ne vom confrunta cu probleme care pot fi foarte grave.

Sunt recunoscătoare tuturor celor care mi-au făcut munca mai ușoară, profesorului coordinator și celor ce mi-au furnizat informații de valoare, precum și celor care vor lectura această lucrare.

CAPITOLUL 1

ENZIME

CONSIDERAȚII GENERALE, PROPRIETǍȚI ȘI

MOD DE ACȚIUNE

Încă din antichitate se cunosteau diferite procese de transformare realizate de către organismele vii, în special microorganisme (obținerea vinului, oțetului, pâinii etc.). Mult timp însă, mecanismele moleculare care stau la baza acestor procese, locul și rolul enzimelor în desfășurarea lor, au rămas total necunoscute. Chiar și astăzi, multe mecanisme de acțiune ale enzimelor precum și unele procese biochimice rămân încă neelucidate.

În 1713, Reamur a observat dizolvarea cărnii în sucul stomacal al ciorii. De asemenea, fiziologul Spallanzani (1783) a hrănit animale cu bucăți de carne învelite în rețele de sârmă și a observat dizolvarea lor în stomac.

Primele date științifice de enzimologie apar la începutul secolului XIX, însă dezvoltarea rapidă a acestei ramuri a biochimiei s-a realizat abia în ultimele decenii.

La sfarșitul secolului XIX apare și prima teorie asupra mecanismului de acțiune a enzimelor și anume teoria lacătului și a cheii elaborate de Fischer, conform căreia, în procesul catalitic, enzima recunoaste substratul datorită unei similitudini structurale între molecula substratului și centrul activ al enzimei, această asemanare fiind comparată cu existența între un lacăt și cheia lui.

Chiar și după elaborarea acestei teorii, structura chimică a enzimelor a rămas foarte mult timp neelucidată. Astfel, ediția din 1929 a [NUME_REDACTAT] arăta că “enzimele par a fi proteine, dar aceasta nu este sigur”.

În organismul viu, reacțiile chimice au loc în condiții mult mai blânde decât “in vitro”. De exemplu, hidroliza proteinelor “in vitro” se poate realiza numai prin fierbere îndelungată cu acizi sau baze tari. În aparatul digestiv, în soluții slab acide și la temperatură în jur de 36,5C, proteinele sunt hidrolizate rapid la aminoacizi.

Organismul viu realizează aceste procese cu ajutorul unor biocatalizatori, secretați în concentrații foarte mici de celula vie. Multe reacții biocatalitice, numite reacții fermentative ca, de exemplu, fermentarea mustului, obținerea vinului, dospirea pâinii, acrirea laptelui, etc., au fost utilizate în scopuri practice din cele mai vechi timpuri.

Încă din secolul al XVII-lea, van Helmont a presupus că fermentația alcoolică este produsă de o “substanță excitantă” pe care a numit-o ferment. În timp, s-au descoperit o serie întreagă de reacții enzimatice și au fost izolați numeroși fermenți: amilaza (Dubrunfaut, 1830; Payen și Persoz, 1833), pepsina sucului gastric (Schwann, 1836), tripsina din sucul pancreatic (Kuhne, 1848), lipaza ([NUME_REDACTAT], 1849) etc.

Berzelius a recunoscut că reacțiile enzimatice sunt reacții catalitice.

Majoritatea reacțiilor din organismul uman sunt catalizate de către enzime. Această denumire dată, în 1870 de către Kuhne, catalizatorilor din corpul uman, se utilizează și azi, alături de cea de “biocatalizatori”.

O denumire mai veche a fost cea de “fermenți” – legată de procesele fermentative, iar pentru enzimele individuale s-au utilizat denumiri specifice, cum ar fi diastaza pentru α-amilaza, etc.

Azi, în locul denumirii de fermenți, se folosește mai mult aceea de enzime. Enzimele constituie principalul factor care participă la realizarea transformărilor metabolice din celule. Ele sunt substanțe care catalizează reacțiile biochimice din organism având un rol esențial în biosinteza și degradarea substanțelor din material vie, deci un rol fundamental în reglarea proceselor metabolice din organism.

În primii ani ai secolului XX-lea se pun bazele cineticii enzimatice prin cercetările lui Henri și Brown, iar în 1913 se realizează prima exprimare matematică a cineticii reacțiilor enzimatice cu un singur substrat de către Michaelis și Menten.

Studiul structurii chimice a enzimelor a fost posibil abia după elaborarea metodelor de izolare și purificare a proteinelor în general și a enzimelor în special, din sursele biologice.

Din acest punct de vedere, o importanță deosebită o prezintă separarea, purificarea și cristalizarea ureazei de către Sumner în 1926 și demonstrarea structurii ei proteice. A urmat o perioadă de intense cercetări când au fost cristalizate pepsina, tripsina, chimotripsina, etc.

Sub aspect chimic, enzimele sunt proteine sau proteide, unele fiind holoproteide, majoritatea însă heteroproteide, dispunând de grupări catalitic active. Ele sunt produse numai în organismele vii și își pot manifesta activitatea enzimatică atât în interior cât și în afara organismului.

Substanța asupra căreia acționează enzimele poartă numele de substrat.

Enzimele se găsesc în toate organismele vegetale, animale și în microorganisme.

În celulă enzimele nu se găsesc isolate de componenții celulari (nucleu, citoplasmă etc.). Ele se găsesc fie absorbite sau adsorbite pe anumite formațiuni subcelulare (plastide, mitocondrii, etc.), fie dizolvate în protoplasmă sau în sucul cellular. Prin această distribuire, enzimele din celule vin în contact cu o mare cantitate de substanțe.

Enzimele, fiind substanțe proteice își pierd puterea catalitică sub acțiunea căldurii, a acizilor sau bazelor tari, a solvenților organici sau a altor substanțe ce denaturează structura proteinelor.

Îndeosebi semințele, fructele și frunzele tinere ale plantelor sunt mai bogate în enzime. În timpul germinației semințelor, conținutul în enzime crește repede și se sintetizează noi ergoni.

Uneori se constată un paralelism între conținutul în enzime și cel al substanțelor asupra cărora acționează enzimele. De exemplu, enzimele numite lipase, care acționează asupra lipidelor, se găsesc în cantitate mare în semințele bogate în uleiuri (G. V. Novițkaia, 1960). În alte cazuri situația este inversă, de exemplu, în semințele de Graminaeae și Leguminosae cu conținut mai mic în amidon s-a găsit un conținut mai mare în amilază (M. I. Smirnova și I. Konnikova, 1961). Din aceste exemple, dar și din altele, rezultă că nu există o corelație între cantitatea de substrat și de enzimă existentă în plante.

Puterea catalitică a enzimelor din organismele în creștere este mai mare decât a celor din organismele bătrâne.

Locul de acțiune a celor mai multe enzime este interiorul celulelor, unele însă acționează și în afara acestora (de exemplu, unele enzime din plasma sanguină – cele responsabile de coagularea sângelui).

După locul de manifestare al activității lor, enzimele se pot clasifica în exoenzime și endoenzime.

Exoenzimele după formarea lor în celule sunt eliminate în lichidele din organism, unde își exercită acțiunea.

Endoenzimele își exercită acțiunea în celulele în care s-au format. Ele sunt lioenzime, legate mai slab în celulă și desmoenzime, legate mai puternic în celule.

Enzimele au toate proprietățile specifice catalizatorilor din reacțiile chimice din sistemele “in vitro”, dar sunt superioare acestora în multe privințe:

asigură viteze de reacție superioare cu câteva ordine de mărime;

reacțiile pe care le catalizează au loc în condiții blânde: temperatură sub 50 C, presiune atmosferică, pH în jur de 7, cu unele excepții;

au specificitate foarte mare, ceea ce asigură ca în reacțiile pe care le catalizează să nu se formeze produși secundari.

Alte însușiri pe care nu le întâlnim la catalizatorii chimici sunt:

capacitatea de reglare a producerii lor în celule și/sau de reglare a activității lor;

posibilitatea catalizării unor reacții endergonice (endoenergetice) prin cuplarea acestora cu reacții exergonice (exoenergetice).

În domeniul enzimologiei, cu o vechime de peste 200 de ani, și-au adus contribuția diverși chimiști organicieni, fiziologi, microbiologi ca: [NUME_REDACTAT], Liebig, Berzelius, Kuhne, [NUME_REDACTAT], Pasteur, etc.

Cunoștințele de enzimologie sunt extrem de utile pentru interpretarea multor fenomene din biologia celulară, genetică și alte științe biologice. Ingineria genetică se bazează aproape exclusive pe acțiunile specifice ale unor enzime.

1.1. NATURA PROTEICĂ A ENZIMELOR

Prin diferite operații de purificare, s-a reușit să se obțină preparate de câteva mii de ori mai active decât extractele de la care se pornise. S-a dovedit astfel că enzimele sunt catalizatori extrem de activi chiar în concentrații foarte mici.

Prima enzimă izolată în stare pură, cristalizată, a fost ureeaza (Sumner, 1962). Aceasta a fost obținută dintr-o varietate de fasole prin extragere cu apă și precipitarea extractului cu acetonă.

Au fost izolate apoi în stare cristalizată, prin salifiere din soluție apoasă cu sulfat de amoniu și sulfat de magneziu la un aumit pH, pepsina și tripsina (Northrop și Künitz, 1929) fermentul galben de oxidare, papaina, carboxipeptidaza, tirosinaza, catalaza, câteva dehidrogenaze și multe alte enzime.

Metodele pentru obținerea enzimelor pure și măsurarea greutăților lor moleculare sunt identice cu cele folosite la purificarea proteinelor. De fapt, toate enzimele cristalizate obținute până astăzi s-au dovedit a fi fie proteine simple, fie proteide cu o grupă prostetică definită.

Încă înainte de izolarea enzimelor în stare pură era cunoscută natura lor proteică. Se știe de mult că enzimele nu sunt dializabile, și deci sunt substanțe macromoleculare, și că ele sunt inactivate prin încălzire în aceleași condiții în care sunt denaturate proteinele. Acei reactivi care denaturează sau precipită proteinele inactivează fără excepție enzimele. Uneori, denaturarea însoțită de inactivarea enzimelor este reversibilă. Prin hidroliza enzimelor se formează aminoacizi care se obțin și din proteine.

S-au măsurat grăutățile moleculare ale multor enzime și s-a determinat succesiunea completă a aminoacizilor din ribonuclează și din alte enzime.

Solubilitatea enzimelor este asemănătoare cu a globulinelor. Este posibil ca în multe celule întreaga sau aproape întreaga plasmă să fie constituită din enzime.

Ca toate proteinele, enzimele sunt antigeni specifici, provocând, atunci când sunt introduse în sângele unui animal, formarea de anticorpi.

Se cunosc diferite metode pentru determinarea activității enzimatice, ca de exemplu:

măsurarea gazului degajat (CO2) sau consumat (O2), când este cazul;

urmărirea spectrofotometrică a dispariției substratului sau acumulării produsului de reacție;

consumarea unui colorant.

1.2. PROPRIETĂȚI GENERALE ALE ENZIMELOR

Toate enzimele cunoscute până în prezent sunt substanțe de natură proteică și îndeplinesc rol de catalizatori ai transformărilor biochimice din celula vie.

Fiind biocatalizatori, enzimele prezintă toate proprietățile generale ale catalizatorilor chimici:

acționează în cantități extreme de mici, dar manifestă o activitate extrem de intensă;

nu se consumă și nu se transformă în reacțiile catalizate;

catalizează reacții termodinamic posibile, adică reacții care corespund unei diminuări a energiei libere;

orientează și măresc viteza reacțiilor biochimice, determinând scăderea energiei de activare a moleculelor de substrat asupra cărora acționează;

constituie cei mai eficienți catalizatori determinând reacții extreme de rapide;

nu modifică starea finală de echilibru a reacțiilor ci numai viteza cu care se realizează acest echilibru;

într-o reacție reversibilă care conduce la o stare de echilibru enzima accelerează numai cele doua viteze de reacție (1 și 2) care evoluează simultan și în sens invers, determinând astfel atingerea mai rapidă a stării de echilibru:

A + B C + D (1)

2

sunt caracterizate de o mare specificitate de acțiune (conversia unui substrat într-un produs ori produși de reacție sau biosinteza unei substanțe din componentele constitutive sunt catalizate de un anumit tip de enzime);

asigură coordonarea, reglarea și controlul proceselor biochimice la care participă, modelând activitatea metabolismului celular;

la sfârșitul transformării se regăsesc în mediu nemodificați din punct de vedere cantitativ și calitativ.

1.3. PROPRIETĂȚI SPECIALE ALE ENZIMELOR

Enzimele endocelulare se găsesc în celule asociate de cele mai multe ori cu alți coloizi, în majoritatea lor de natură proteică, formând sisteme care au fost numite de R. Willstatter și M. Rohdewald (1934) “simplexe”.

Există indicații că și enzimele exocelulare s-ar găsi în țesuturi de multe ori asociate cu alte substanțe. Prin extragere, aceste asociații se desfac parțial sau total. Din celule enzimele sunt eliberate prin autoliză.

Enzimele purificate se prezintă de obicei ca pulbere sau paiete albe sau gălbui. În stare perfect pură multe enzime sunt cristaline. Cu puține excepții ele sunt solubile în apă și solvenți organici puternic polari, ca glicol și glicerol, puține solubile în etanol, acetonă și dioxină, ceea ce permite separarea de lipide.

În ceea ce privește solubilitatea enzimelor există în general analogie cu aceea a proteinelor. Solubilitatea în apă este mult influențată de alte substanțe asociate sau prezente. În celule unele enzime, numite lizoenzime, se găsesc sub formă solubilă în apă, altele, numite desmoenzime, sub formă greu solubilă.

În soluții enzimele au caracterul unor coloizi liofili, amfoteri, cu sarcină electrică care variază în funcție de pH. De exemplu, amilaza și catalaza prezintă sarcină pozitivă în mediu acid și negativă în mediu alcalin (L. Michaelis, 1909). Viteza de migrare în câmpul electric este o caracteristică a diferitelor enzime care poate servi la separarea lor. pH-urile izoelectrice sunt de asemenea diferite, de exemplu al ureazei la pH 5,05; al catalazei la pH 5,58; al zaharazei la pH 8,25 etc.

pH-ul izoelectric (pH) este o caracteristică a fiecărui aminoacid sau proteină și reprezintă pH-ul la care disociația acidă este egală cu disociația bazică (suma sarcinilor negative este egală cu suma sarcinilor pozitive), prin urmare încărcarea electrică netă este egală cu zero.

Electroliții, îndeosebi sulfatul de amoniu, Na și Hg, precipită enzimele din soluțiile apoase. Acțiune coagulantă au și sărurile metalelor grele, acidul fosfowolframic, acidul tanic, etc. Concentrația agentului de precipitare necesară producerii precipitării nu este aceeași pentru toate enzimele.

Greutățile moleculare ale enzimelor sunt în general de aceeași ordine de mărime ca ale proteidelor. Ele variază între limite largi, de la 14.000 până la 500.000. Astfel, de exemplu pentru citocromul c au fost găsite valori între 13.000 și 16.500, pentru papaină 21.000, fermentul galben 75.000 – 80.000, catalază amorfă 248.000 etc.

Pentru stabilirea greutăților moleculare se face de obicei uz de metodele folosite la proteide. Separarea enzimelor de substanțele însoțitoare, cu greutate moleculară mică, se face prin dializă sau ultrafiltrare.

În unele cazuri s-au folosit metode speciale pentru determinări de greutăți moleculare. De exemplu, în cazul unor fosfolipaze foarte răspândite în diferite organe vegetale, care participă la hidroliza și sinteza fosfatidelor (S. Belfanti și colaboratorii, 1936; D. J. Hanahan și J. L. Chaikoff, 1947/48; G. Ducet, 1948; L. Acker și colaboratorii, 1962), a fost aplicată o metodă care folosește radiațiile ale Co, calculându-se pentru fosfolipaza c valoarea de 106.000 (M. S. [NUME_REDACTAT] Volkova, 1957).

1.4. NOMENCLATURA ȘI CLASIFICAREA ENZIMELOR

Enzimele se clasifică în:

ectofermenți, care în mod normal își desfășoră activitatea în afara celulei care i-a secretat;

endofermenți, care lucrează în celulă.

Endofermenții pot fi grupați în:

liofermenți, care se pot extrage ușor cu diferiți solvenți din substanța celulară;

dezmofermenți, care se extrag mai greu sau nu pot fi extrași din celule.

După numărul lanțurilor polipeptidice constitutive, enzimele se subdivid în:

monomere, cu un singur lanț proteic

oligomere, cu două sau mai multe catene polipeptidice în structură unitară, compactă.

În denumirea enzimelor se folosește atât termenul de enzimă, cât și de ferment care au înțelesuri sinonime.

Substanța care se transformă în urma unui proces enzimatic se numește subtrat.

Numele enzimei s-a formulat din numele substratului prin adăugarea sufixului –aza. De exemplu, urează pentru enzima ce catalizează hidroliza ureei la CO2 și NH3; arginază pentru cea care catalizează hidroliza argininei la ornitină și uree etc.

Enzimele care catalizează reacțiile de hidroliză se numesc hidrolaze, cele de carboxilare, carboxilaze sau cele de oxidare, oxidaze, dându-li-se deci denumiri și după natura procesului chimic.

Deoarece asupra aceluiași substrat pot acționa mai multe enzime, alături de numele substratului se menționează și tipul de reacție, adăugându-se apoi sufixul. De exemplu, enzima care catalizează reacția de dehidrogenare a acidului lactic se numește lactatdehidrogenază, iar cea care intervine în dehidrogenarea alcoolilor, alcooldehidrogenază

Odată cu creșterea numărului de enzime descoperite și studiate sub aspectele structurii lor chimice și ale mecanismelor reacțiilor catalizate, a apărut necesitatea unei clasificări științifice a acestora. Astăzi este valabilă clasificarea propusă în 1964 de către Comisia de Enzimologie a [NUME_REDACTAT] de Biochimie care are la bază tipul și mecanismul reacției catalizate.

Conform acestui criteriu, enzimele se clasifică în șase clase principale, enzimele cuprinse în aceeași clasă catalizând același tip de reacție:

hidrolazele – enzime ce catalizează scindarea diferitelor legături covalente din molecula substratului cu participarea moleculelor de apă;

transferazele – enzime ce catalizează reacții de transfer ale unor grupe de atomi ce pot fi și grupe funcționale de la un substrat la altul, fără ca aceste grupări să existe libere în timpul procesului;

oxido-reductazele – enzime ce catalizează reacții de oxido-reducere ce au loc în organismele vii;

liazele – enzime ce catalizează reacții de adiție a unor grupe de atomi la molecula substratului sau clivarea acestor grupări cu rearanjarea ulterioară a valențelor;

ligazele sau sintetazele – enzime ce catalizează formarea unor noi legături chimice C–C sau carbon – heteroatom, în majoritatea cazurilor utilizându-se energia stocată în legăturile macroergice ale moleculelor de ATP.

Izomerazele – enzime care catalizează diferite reacții de izomerizare a substratelor.

La rândul lor enzimele din fiecare clasă se impart în subclase și subsubclase, în funcție de mecanismul de reacție, de natura cofactorului, tipul de legătură chimică din substrat asupra căreia acționează, etc.

În baza acestei clasificări, la denumirea enzimelor, fie se păstrează denumirea cu sufixul -ază (urează, glucozidază, zaharază, lipază), fie se păstrează denumirile specifice (pepsină, tripepsină), fie se dă denumirea după acțiunea specifică (lactatdehidrogenază, alcooldehidrogenază, etc.).

Alături de cele trei modalități se utilizează și “modalitatea sistematică”, care este corelată cu numele clasei, subclasei și subsubclasei. Aceasta cuprinde denumirea substratului, tipul reacției enzimatice, coenzima, eventual alte caracteristici. În acest caz enzima are un cod specific. Utilizarea denumirii sistematice se face atunci când trebuie evitate anumite ambiguități (în publicații, la manifestări științifice, etc.). Curent se utilizează denumirile recomandate.

Exemplu de secvențe din clasificarea și denumirile sistematice, conform IUBMB:

[NUME_REDACTAT] acționează asupra grupării CH-OH:

Cu coenzima NAD sau NADP;

Alcool: NAD – oxidoreductază:

…………………………………………………..

1.1.1.27. L- lactat: NAD – oxidoreductază;

1.2. Care acționează asupra grupării carbonilice (C=O):

1.2.1. Cu coenzima NAD sau NADP;

1.2.1.12. D-gliceraldehid-3-fosfat: NAD-oxireductază;

…………………………………………………………..

1.2.3. Cu oxigen ca acceptor

1.2.3.2. Xantina: oxigen-oxidoreductază;

1.3. Care acționează asupra legăturii CH-CH:

1.3.2. Cu citocrom ca acceptor;

1.4. Care acționează asupra legăturii CH-NH;

…………………………………………………………………

Clasificarea enzimelor

1.5. MECANISMUL DE ACȚIUNE AL ENZIMELOR

CENTRII ACTIVI

Se știe că într-un sistem chimic nu toate moleculele reacționează cu aceeași viteză. Moleculele care reacționează se găsesc pe un nivel energetic superior celui pe care se găsesc moleculele obișnuite. Diferența de energie dintre moleculele active și cele pasive poartă numele de energie de activare.

Un catalizator este o substanță care, prin prezența ei, determină într-o substanță sau un amestec de substanțe o reacție ce nu are loc în absența ei (definiție după Berzelius, 1836) sau care mărește viteza unei reacții, ce are loc și în absența ei, dar cu viteză mai mică, eventual imperceptibilă (definiție după Ostwald, 1894). Catalizatorul se regăsește neschimbat, calitativ și cantitativ, după reacție. Aparent catalizatorul nu ia parte la reacție.

Este necesar să se accentueze caracterul de substanțe al catalizatorilor. Ar fi greșit să se vorbească de acțiunea catalitică a unei forme de energie, căldură, lumină sau electricitate.

Se numește substrat substanța sau amestecul de substanțe asupra cărora acționează un catalizator.

Catalizatorii determină sau accelerează numai reacții termodinamic posibile, adică reacții care decurg spontan, cu creșterea entalpiei libere de reacție, în sensul stabilirii unui echilibru. Există catalizatori (MnO, NaOH), care accelerează transformarea ozonului în oxigen (O în O), dar nu există un catalizator care să producă ozon din oxigen.

Scăderea energiei de activare se datorează formării unui “complex activat” între catalizator și reactant, pentru care energia de activare este mult mai mică.

În cazul catalazei enzimatice, între enzimă și substratul care se transformă, se formează un complex activat enzimă-substrat, care apoi se transformă cu viteză mare în produșii finali de reacție.

La formarea complexului activate enzimă-substrat, substratul se fixează pe regiuni bine determinate de pe suprafața enzimei, care poartă numele de centrii activi. Între centrii activi și molecula substratului, există complementarități conformaționale și chimice care permit asamblarea lor.

În orice reacție catalizată enzymatic, formarea intermediară a complexului enzimă-substrat este obligatorie:

E + S ↔ ES → E + P (2)

În prezent există numerose dovezi experimentale, directe sau indirecte referitoare la formarea complexului activate ES.

Într-un număr redus de cazuri enzima este legată de substrat prin legături puternice (covalente); astfel de complexe ES stabile au fost izolate și analizate prin difracția razelor X și alte metode.

Complexele activate în care legăturile dintre E și S sunt slabe s-au studiat pe căi indirecte saturând enzima cu substratul când s-au obținut modificări în spectrul de absorție, ale solubilității și privind stabilitatea termică etc. Mai nou, formarea complexelor activate ES este studiată prin metoda marcajului chimic; ea constă în tratarea enzimelor izolate cu compuși chimici care reacționează în mod specific cu anumite grupări (aparținând unor resturi aminoacide) la care se atașează prin legături puternice (care nu se scindează la hidroliza enzimei). Dacă enzima marcată nu mai fixează S, înseamnă că aminoacidul la care s-a atașat compusul chimic este implicat în formarea complexului activat ES. Acest aminoacid poate fi recunoscut dacă se hidrolizează enzimă, în hidrolizat apărând și complexul aminoacid-compusul chimic. La anumite enzime îndepărtarea prin proteoliză a unor porțiuni din macromoleculele lor nu afectează activitatea sau o afectează foarte puțin.

Datele experimentale corelate cu faptul că de regulă, substratul este foarte mic în raport cu enzima, s-a concluzionat că numai o zonă restrânsă din enzimă participă la fixarea și transformarea chimică a lui S; această zonă se numește “centrul activ” al enzimei.

Centrul activ al unei enzimei este construit dintr-un număr redus de aminoacizi situați în vecinătate sau la distanță. În aceste centre s-au evidențiat grupări chimice de tip carboxil, amino, hidroxil și tio; acestea aparțin unor resturi de aminoacizi cu caracter acid sau bazic (glutamic, aspartic, serina, tirozina, cisteina etc.) dar și heterociclii, în special ai histidinei.

În general se admite că pentru o reacție chimică obișnuită, enzima participă cu doi centrii activi. Pentru enzimele cu structură binară unul dintre centrii activi este, în general situat în fragmentul proteic, iar al doilea în fragmentul prostetic.

Pentru reacțiile care prezintă specificitate stereochimică se admite că fixarea substratului pe enzimă se face prin intremediul a trei centrii activi.

Fixarea substratului pe enzimă îi imprimă acestuia o stare de tensiune moleculară care facilitează reacția biochimică, sau orientează favorabil una în raport cu cealaltă, moleculele ce urmează să reacționeze.

Deși acțiunea enzimelor este catalitică, enzimele prezintă unele caractere care le diferențiază de catalizatorii tipici. Astfel, cataliza enzimatică are caractere comune cu cataliza homogenă deoarece enzima este adeseori repartizată uniform în sistemul chimic al cărui transformare o asigură. Cataliza enzimatică are caracter și de cataliză eterogenă, reacția biochimică desfășurându-se în regiuni bine determinate de pe suprafața enzimei, situate la limita de separare dintre sistemul reactant și macromolecula catalizatorului.

Un alt caracter tipic este marea eficiență catalitică a enzimelor. O reacție decurge, în prezența enzimei, de 10 până la 10 ori mai repede decât în absența ei. Numărul de molecule de substrat transformate sub acțiunea enzimei într-un minut (număr de transfer, turnover) variază între 1000 – 1.000.000.

Cataliza enzimatică are loc în condiții blânde. Reacții care necatalizate nu au loc decât la temperature înalte, presiuni mari, valori extreme de pH, sub influența enzimelor evoluează cu mare viteză la temperature în jurul lui 37C, la presiunea atmosferică și la pH aproape neutru.

Enzimele se caracterizează printr-o remarcabilă specificitate în raport cu tipul de reacție catalizat și cu natura substratului transformat. Sunt unele enzime (urează, arginază) care nu catalizează decât o singură reacție bine determinată.

Este remarcabilă, de asemenea, multitudinea reacțiilor catalizate de enzime. Astfel, enzimele intervin în reacții de hidroliză, de polimerizare și policondensare, de oxido-reducere, de transfer de grupări funcționale (formil, metil, amino, acil, carboxil), de formare și scindare de legături covalente, de reacții prin radicali liberi etc.

Unele caracteristici ale enzimelor sunt imprimate de structura lor proteică. Astfel, activitatea lor în cursul metabolismului intermediar este limitată în timp. Ele se degradează relativ rapid sub influența altora. Activitatea, degradarea și biosinteza enzimelor sunt reglate de factori și mecanisme de control, de complexitate deosebită și situate la nivele variate de organizare a sistemelor biologice.

1.6. CINETICA PROCESELOR ENZIMATICE

Acționând în celula vie și fiind proteine, enzimele prezintă unele proprietăți fizico-chimice și funcționale care le delimitează net de catalizatorii chimici. Complexitatea structurii biocatalizatorilor precum și complexitatea mecanismului intim de reacție fac ca studiul cineticii reacțiilor enzimatice să fie mult mai dificil comparativ cu cinetica reacțiilor chimice în general.

Studiul cineticii enzimatice, ca și în cinetica chimică se bazează pe măsuararea vitezei de reacție în condiții standard (care se asigură în așa fel încât să fie cât mai aproape posibil de condițiile existente in vitro) și în diferite condiții particulare create într-un anumit scop. Cum însă numărul variabilelor ce corespund tuturor parametrilor transformării biochimice date este extrem de mare, prelucrarea matematică a datelor obținute este atât de complexă încât este absolute necesar să se facă unele aproximări în vederea reducerii la maximum a numărului acestor variabile.

Concepția unanim admisă în enzimologie, că formarea din substrat a produsului de reacție implică obligatoriu existența complexului enzimă-substrat (ES) redată prin ecuația:

E + S ↔ ES → E + P (3)

a fost statuată în primul rând în legătură cu cinetica reacțiilor catalizate de enzime; de aceea, în interpretarea fiecăruia dintre aspectele cuprinse în acest capitol punctul de plecare îl reprezintă ecuația de mai sus.

1.6.1. VITEZA DE REACȚIE ȘI ENERGIA DE ACTIVARE

Conform teoriei complexului activat și principiului stării staționare, pentru o reacție enzimatică generală se poate scrie următoarea ecuație:

S + E [Intermediar]P + E (4)

În ecuația (4) substratul reprezintă compusul organic care reacționează la nivelul legăturilor covalente. Enzima (E) intermediază ruperea legăturilor vechi din substrat și formarea de covalențe noi în produși, regăsindu-se complet după reacție.

Reactanții micromoleculari (H2O, NH, O, HPO, etc), reacționează cu complecșii activați (intermediari instabili și activi). Aceștia se formează în etape și pot apărea în structuri multiple: enzimă-substrat ([ES]*), enzimă-produși ([EP]*) sau micști ([ES-EP]*).

În figura (1), este prezentată evoluția în timp a profilului energetic într-o reacție necatalitică (I) și aceeași reacție catalizată enzimatic (II). Ambele procese au loc la valori proprii ale energiei de activare (E din ecuația lui Arrhenius), respectiv ale entalpiei libere de activare (ΔG* din ecuația lui Polanyi). E se deosebește de ΔG*, care include un termen entropic (ΔS*) și altul entalpic (ΔH*).

După diferențierea ecuațiilor lui Arrhenius și respectiv, Polanyi, rezultă:

= și respectiv = + (I)

Din această egalitate se deduce: E= + RT, ceea ce înseamnă că Eeste mai mare ca cu echivalentul caloric molar RT.

Determinarea lui E în practică se realizează mai simplu și de aceea pentru compararea energiei de activare a celor mai multe reacții se folosește E(tabelul 1).

Factorul motrice al reacției (4), având constanta de echilibru k=k/ k, îl reprezintă variația entalpiei libere de reacție (G<0), conform relației termodinamice:

G=G+ RTlnk (II)

În condiții de echilibru, G=0 și relația (3) devine:

G= -RTlnk (III)

unde Geste entalpia liberă standard (C=1mol/1; p=1atm; T=25sau 35).

În celula vie au loc reacții endergonice (ΔH>0) și exergomice (ΔH<0). Procesele endergonice nu se produc spontan și nici prin cataliză enzimatică, ci doar prin cuplaj cu reacții exergonice furnizoare de energie, corespunzător condiției termodinamice fundamentale, ΔG ≤ 0.

Enzimele au următoarele proprietăți:

iau parte efectivă la proces, dar se regăsesc nemodificate la sfârșitul reacției;

reduce energia de activare față de procesul necatalitic;

măresc viteza de reacție dar nu modifică valoarea constantei de echilibru;

nu modifică parametrii termodinamici ai procesului chimic global;

intervin în mecanismul reacției modificând succesiunea etapelor elementare.

În principiu, enzimele se aseamănă cu catalizatorii chimici, dar se deosebesc de aceștia prin origine, structura proteică, eficacitate și autoreglare.

Constanta de viteză relativă, k din tabelul 1, este factor de multiplicare a vitezei reacțiilor enzimatice față de cele catalizate chimic sau necatalitice.

Tabel 1. Energii de activare și constante de viteză relative la 25C

ACTIVITATEA GENERALĂ A ENZIMELOR

Enzimele catalizează, ca și catalizatorii neenzimatici, numai reații chimice termodinamic posibile. Acțiunea lor se supune legilor generale ale catalizei studiate de chimia generală (W. Ostwald, 1894; A. Mittash, 1933). Există însă numeroase și, în unele privințe, importante deosebiri între catalizatorii neenzimatici și enzime.

Activitatea enzimelor : În majoritatea cazurilor reacțiile enzimatice decurg în absența enzimelor cu viteză atât de mică încât aceasta nu poate fi practic determinată. Se poate chiar afirma că, cel puțin unele enzime nu au numai proprietatea generală a catalizatorilor de a modifica viteza unei reacții chimice, ci și aceea de a declanșa reacții care nu au loc în absență de enzime (J. B. Summer și G. F. Somers, 1947).

În cazul reacțiilor reversibile, enzimele catalizează reacția în ambele direcții. Catalizarea reacției într-un sens sau altul depinde de factori puțin cunoscuți. În cazul hidrolazelor s-a putut arăta că ele acționează în sensul hidrolizei atunci când se găsesc asociate cu proteine solubile, iar în direcția sintezei când sunt asociate cu proteine insolubile (A. Oparin, 1934).

Reversibilitatea reacțiilor enzimatice a mai fost dovedită la numeroase alte sisteme în echilibru, ca de exemplu următoarele:

Transformarea reversibilă a acidului fumaric în acid succinic (T. Thumberg, 1925; J. Lehmann, 1930; H. Borsok și N. Schott, 1931).

HOOC – CH HC – COOH

+ 2 H

HC – COOH HC – COOH

acid fumaric acid succinic (5)

Transformarea reversibilă a acidului fumaric în acid malic (T. P. Iacobson și colaboratorii, 1934; H. A. Krebs și colaboratorii, 1940; P. Ohlmeyer, 1946).

HOOC – CH HO – HC – COOH

+ HO

HC – COOH HC – COOH (6)

acid fumaric acid malic

Transformarea reversibilă a acidului fumaric în acid aspartic (B. Woolf și colaboratorii, 1928/29; M. Borsook și H. M. Haffmann, 1934).

HOOC – CH HN – HC – COOH

+ NH

HC – COOH HC – COOH (7)

acid fumaric acid asparagic

Temperatura optimă a reacțiilor enzimatice. Viteza reacțiilor enzimatice crește ca a celor mai multe reacții între molecule covalente, cu temperatura, potrivit cunoscutei reguli a lui van’t Hoff, și anume o urcare a temperaturii cu 10˚ produce o creștere a vitezei de reacție cu un coeficient 1.5 – 3. Creșterea aceasta se observă însă numai la temperaturi joase. Odată depășită o anumită temperatură optimă, la care viteza este maximă, aceasta scade, iar la temperaturi mai înalte, reacția încetează.

Fenomenul se explică prin faptul, semnalat mai sus, că la temperaturi mai înalte, enzimele sunt inactivate prin denaturarea componentei proteice. Cele mai multe enzime devin complet inactive între 50-80˚. Temperatura optimă nu poate fi însă exact definită, căci ea variază în limite largi, cu concentrația enzimei, cu concentrația ionilor de hidrogen și cu prezența diferitelor impurități ale preparatului enzimatic sau ale substratului.

Influența pH-ului. După cum a arătat Sörensen (1909), activitatea enzimelor depinde, într-o foarte mare măsură de concentrația ionilor de hidrogen din soluție. Curbele reprezentând variația vitezei de reacție cu pH-ul prezintă de obicei un maxim pronunțat la un anumit pH, în timp ce la valori ale pH-ului diferind cu 1 față de acest maxim, viteza de reacție prezintă valori considerabil mai mici. Din cauza acestei particularități este necesar ca în cursul reacțiilor enzimatice să se mențină pH-ul optim constant, prin folosirea de soluții tampoane.

SPECIFICITATEA ENZIMELOR

Cea mai importantă proprietate a enzimelor, total neîntâlnită în cataliza chimică, o constituie înalta specificitate de acțiune a acestora, ceea ce înseamnă că o enzimă catalizează transformarea unui singur substrat și doar în cazuri rare a unui grup restrâns de substanțe înrudite structural.

În funcție de modul de manifestare, specificitatea de acțiune a enzimelor poate fi de mai multe tipuri:

specificitate de reacție;

specificitate de substrat;

specificitate stereochimică.

Specificitatea de reacție este tipul de specificitate cel mai des întâlnit și constă în capacitatea enzimelor de a cataliza numai un singur tip particular de reacție (cu rare excepții).

Tipul particular se încadrează în unul din tipurile fundamentale de reacții care au loc în lumea vie:

oxido-reducerea;

hidroliza;

formarea de legături covalente;

scindarea de legături covalente utilizând energia eliberată prin scindarea unor legături macroergice.

Exemple de tipuri particulare de reacții:

hidroliza proteinelor în prezența proteazelor;

fosforilări ale unor compuși diverși cu acid fosforic provenit din ATP, în prezența kinazelor;

schimburi de grupări amino contra grupării carbonil între aminoacizi și cetoacizi catalizate de transaminaze.

O situație aparte se întâlnește în cazul proteazelor care prezintă concomitant activitate peptidazică, amidazică și esterazică. Aceste enzime catalizează însă reacții de scindare hidrolitică a peptidelor, a polipeptidelor, amidelor și esterilor, aceste reacții diferite având loc în același centru activ, după același mecanism de acțiune.

Din punctul de vedere al specificității de reacție, există și unele excepții, când una și aceeași enzimă poate prezenta activități catalitice diferite. De exemplu, din mușchiul cardiac de porc, din bumbac, precum și din celule de Neurospora crassa s-a obținut un preparat enzimatic cu activitate malatdehidrogenazică.

Există situații când aceeași enzimă prezintă specificitate dublă sau chiar triplă, adică participă la reacții asemănătoare din punct de vedere chimic. Acest tip de specificitate dublă sau triplă se întâlnește, în general, la enzimele oligomere când subunitățile componente pot avea specificități diferite.

Specificitatea de reacție reprezintă o caracteristică esențială a enzimelor, fiind datorată componentei proteice a acestora (apoenzimelor).

Specificitatea de substrat este o altă proprietate a enzimelor care le diferențiază net de catalizatorii chimici; ea constă în capacitatea de a cataliza transformarea unui singur substrat, fiind total indiferente față de alte substanțe, chiar dacă sunt înrudite structural cu substratul. În procesul catalitic, la formarea complexului enzimă-substrat, enzima recunoaște conformația structurală a întregii molecule de substrat, a unei grupări funcționale din aceasta sau o anumită legătură chimică ce urmează a fi scindată. Acest tip de specificitate este condiționat de complementaritatea structurală (spațială și/sau electronică) dintre molecula substratului și a centrului active al enzimei.

În funcție de mecanismul de formare a complexului enzimă-substrat, acest tip de specificitate poate fi de mai multe feluri: specificitate absolută de substrat, specificitate relativă de substrat, stereospecificitate, etc.

Specificitate absolută de substrat este întâlnită la acele enzime care sunt capabile să recunoască structura chimică a unei singure specii moleculare, aceasta reprezentând unicul substrat.

De exemplu, ureaza prezintă o specificitate absolută de substrat, catalizând reacția de scindare a ureei:

HN – CO – NH + HO → CO + 2 NH (8)

Ureaza este însă total inactivă față de alte substanțe asemănătoare structural cu urea, sau chiar față de derivații ei.

Cercetări recente atestă faptul că ureaza ar putea totuși cataliza și alte transformări, aceste aspecte nefiind însă complet elucidate.

Există un număr relative mare de enzime implicate în reacții biomoleculare care prezintă specificitate absolută față de un singur substrat sau față de ambele substrate.

Există, de asemenea, enzime care prezintă grade diferite de specificitate în funcție de sursa biologică din care au fost izolate.

Specificitatea relativă de substrat se întâlnește atunci când enzima manifestă specificitate față de o anumită grupă funcțională din molecula substratului, sau față de anumite legături chimice din structura acestuia, fiind indiferentă față de restul moleculei.

Un exemplu elocvent în acest sens îl reprezintă fosfomonoesterazele. Aceste enzime recunosc legătura fosfoesterică, catalizând hidroliza esterilor acidului ortofosforic cu alcoolii primari, secundari și ciclici, precum și unii fosfoesteri ai glucidelor, mono-nucleotidelor ș.a.

În cazul acestei specificități nu s-au constatat deosebiri mari în viteza de hidroliză a unor glicozizi diferiți de către emulsină (tabelul 2).

Tabel 2. Valorile vitezei de hidroliză a unor glicozizi

Stereospecificitatea enzimelor se referă la capacitatea acestora de a recunoaște un anumit izomer geometric sau optic. Acest tip de specificitate este foarte des întâlnit, dat fiind faptul că majoritatea compușilor bioorganici conțin atomi de carbon asimetrici, putând deci exista sub forma celor doi antipozi optici.

De exemplu, la hidratarea acidului fumaric sub acțiunea fumarazei se formează acidul (-) malic.

1.7. FACTORII CARE INFLUENȚEAZĂ ACTIVITATEA ENZIMELOR

Acționând în organismele vii, enzimele se comportă total diferit față de catalizatorii chimici la acțiunea unor factori de mediu. Astfel, enzimele își manifestă activitatea catalitică maximă în condiții fiziologic normale de pH, temperatură, presiune osmotică etc. Pe de altă parte, dinamica activității enzimatice la concentrații diferite ale substratului, enzimei, modulatorilor, etc., este de asemenea diferită.

1.7.1. INFLUENȚA CONCENTRAȚIEI ENZIMEI

În reacțiile chimice ce au loc sub acțiunea unor catalizatori există o dependență liniară (de tipul y = ax + b) între viteza de reacție și concentrația catalizatorului. În cazul reacțiilor enzimatice, această linearitate este respectată doar pentru un domeniu al concentrației enzimei, în domeniul concentrațiilor mici. La concentrații mai mari de o valoare dată viteza de reacție se modifică neliniar (fig. 2).

Această abatere de la linearitate nu reflectă întotdeauna comportamentul real al enzimelor, porțiunea curbă ce corespunde abaterii de la proporționalitatea liniară, putând fi datorată și altor fenomene ce apar în mediul de incubare în prezența unor concentrații mari ale enzimei. Din aceste motive, în determinarea experimentală a activității catalitice pentru fiecare enzimă există un domeniu de valabilitate în care rezultatele sunt reale și reproductibile.

Mai mulți autori au încercat să găsească ecuații empirice care să definească dependența vitezei de reacție de concentrația enzimelor proteolitice. Cea mai acceptată a fost ecuația elaborată de Schültz conform căreia viteza reacțiilor de proteoliză este proporțională cu rădăcina pătrată a concentrației enzimei:

v = k[E]½ (IV)

Utilizarea acestei ecuații este însă limitată, ea fiind valabilă doar în anumite condiții experimentale. Din aceste motive, de cele mai multe ori se procedează mai întâi la tresarea unei curbe de etalonare prin folosirea diluțiilor succesive ale unei soluții de enzimă pură (fig. 3). Aceste curbe de etalonare convertesc unitățile de densitate optică în unități de activitate catalitică.

Fig.1. Influența concentrației catalizatorului asupra vitezei reacțiilor chimice (1) și enzimatice(2).

Fig. 2. Dependența vitezei de reacție de concentrația enzimelor proteolitice

1.7.2. INFLUENȚA CONCENTRAȚIEI SUBSTRATULUI

ECUAȚIA MICHAELIS – MENTEN

Acest aspect al cineticii enzimatice a fost studiat de către L. Michaelis, M. L. Menten și J. B. Haldane. Autorii au plecat de la premiza existenței complexului intermediar enzimă-substrat (ES) și au studiat acest aspect cinetic pentru reacțiile enzimatice cu un singur substrat:

E + S ES E + P (9)

unde: E – enzima;

S – substratul reacției;

ES – complexul enzimă-substrat;

P – produsul de reacție.

Reacțiile enzimatice decurg deci cel puțin în două faze, uneori separabile, alteori nu. În prima etapă are loc interacțiunea substratului cu enzima la nivelul situsului catalitic al acesteia ca urmare a complementarității stereochimice a acestora. În această fază se formează complexul intermediar enzimă-substrat (ES) care se mai numește complex Michaelis.

În etapa următoare, acest complex bogat în energie se poate scinda pe calea inversă (regenerând substratul și enzima) sau poate realiza transformarea propriu-zisă a substratului când se formează produsul de reacție și se regenerează catalizatorul.

În marea majoritate a cazurilor însă, reacțiile enzimatice sunt cu doua sau mai multe substrate. Pentru aceste transformări, enzima formează mai mulți complecși, adevăratul complex Michaelis fiind considerat cel care determină viteza reacției totale în cel mai înalt grad. De exemplu pentru reacțiile enzimatice cu doua substrate se formează trei astfel de complecși (ES, ES și respectiv complexul ternar ESS).

Dacă concentrația majorității enzimelor din organismul uman este constantă în timp, exceptând enzimele “inductibile” și cele plasmatice nefuncționale, a căror concentrație crește sau scade în anumite stări patologice, concentrația substratelor de reacție pentru cele mai multe procese metabolice variază în limite foarte largi, în funcție de natura țesutului și alți factori. În aceste condiții dependența vitezei de reacție de concentrația substratului constituie aspectul cel mai important al cineticii enzimatice.

Reprezentarea grafică a lui v în funcție de [S], la [E], T și pH constant este o curbă sub formă de hiperbolă (fig. 4), cu toate că sunt unele sisteme enzimatice al căror mecanismare loc după o curbă sigmoidală.

Fig. 3. Variația vitezei reacției enzimatice în funcție de concentrația substratului

Din analiza curbei din fig. 4 reiese că v crește proporțional cu creșterea [S], numai pentru valori mici ale lui S. După punctul B, creșterea are loc tot mai lent (viteza reacției rămâne constantă și atinge valoarea maximă, notată vmax).

Plecând de la ecuația care descrie influența concentrației asupra vitezei de reacție și ținând cont și de prima secvență a schemei generale de reacție, se obține pentru raportul constantelor (care este tot o constantă, notată K) următoarea reacție:

K= k + = (V)

din care [ES] va fi:

[ES] = (VI)

Deoarece atât determinarea lui K cât și a [E] și [ES] are o deosebită importanță în enzimologie, dar determinările deseori sunt dificile, cei doi autori au elaborat o ecuație în care K să fie corelat cu parametrii mai ușor măsurabili:

K= (VII)

În baza acestei relații se obține ecuația Michaelis-Menten:

v= v (VIII)

sau ecuația de viteză a reacțiilor enzimatice cu un singur substrat.

Această ecuație este în concordanță cu linia curbei AB din figura 4.

Determinarea experimentală a lui K în laborator se realizează pe o serie de 6-10 probe ce conțin soluție tampon potrivită, în care se găsește aceeași cantitate de enzimă și un gradient crescător al substratului. Reacția, declanșată în momentul amestecării enzimei cu substratul, este lăsată să se desfășoare un anumit timp (secunde, minute, după caz), apoi se întrerupe prin adausul unui inhibitor potrivit. Se măsoară în fiecare probă cantitatea de produs format. În baza acestor date se calculează valorile v, care se reprezintă grafic în funcție de [S] crescător, când se obține o hiperbolă asemănătoare fig. 4. Se prelungește porțiunea dreaptă paralelă cu abscisa (corespunzătoare saturării E cu S) până la intersecția cu ordonata, când se obține v. Se ia valoarea v/2, se duce o dreaptă paralelă cu abscisa până la intersecția cu curba și de aici se duce o dreaptă paralelă cu ordonata, până la intersecția cu abscisa, când se obține valoarea lui K. Deci, K reprezintă constanta la jumătatea vitezei de reacție maximă, exprimată în moli/l.

În afară de constanta K, în unele procese enzimatice se operează și cu constanta catalitică K, definite prin ecuația:

K= (IX)

Această constantă ne redă numărul de transformări SP pe care fiecare centru activ le catalizează într-o unitate de timp. Cunoscând valorile și semnificațiie lui K și K se poate evalua K/ K, care redă eficiența catalitică a enzimei.

Valorile K și K sunt tabelate pentru diverse enzime, cu raportare la un anumit substrat (tabelul 3).

Tabelul 3. Valorile K, K și K/ K ale câtorva enzime în raport cu substratele lor

1.7.3. INFLUENȚA TEMPERATURII MEDIULUI ASUPRA

VITEZEI REACȚIILOR ENZIMATICE

Spre deosebire de catalizatorii chimici, enzimele catalizează procesele biochimice în care sunt implicate în condiții fiziologic normalede temperatură.

Activitatea enzimelor este foarte mult influențată de temperatură. Temperatura la care activitatea enzimarică este maximă se numește temperatură optimă. Pentru majoritatea enzimelor, temperatura optimă este cuprinsă între 20 și 40C. Modificarea temperaturii mediului de incubare modifică puternic viteza reacțiilor enzimatice prin modificarea stabilității enzimei, a afinității acesteia pentru substrat, a afinității enzimei față de diferiți modulatori etc. Până la realizarea temperaturii optime, activitatea enzimatică crește proporțional cu creșterea temperaturii, aproximativ de două ori pentru fiecare 10C. Dacă temperatura mediului crește peste temperatura optimă, activitatea enzimatică scade treptat și în final se oprește datorită denaturării ireversibile a proteinei (apoenzimei).

Temperaturile de inactivare ale majorității enzimelor sunt cuprinse în general între 60 și 80C. Ribonucleaza rezistă timp de trei minute și la 100C.

Temperatura critică a unei enzime este temperatura la care enzima pierde jumătate din activitatea sa în timp de o oră. Enzimele purificate sunt mai sensibile la variațiile de temperatură decât cele impure. Temperatura optimă a enzimelor variază cu durata de expunere a acestora la o anumită temperatură.

Pentru o durată de timp mai scurtă temperatura optimă are valori mai mari decât pentru o durată de timp mai lungă. Această comportare este importantă deoarece reprezintă un mod de adaptare al enzimelor la condițiile de mediu. Legarea enzimei de substrat mărește rezistența acesteia la temperaturi ridicate. Enzimele în stare uscată rezistă prin încălzire la temperaturi în jur de 100C. Bobul uscat suportă temperaturi mult mai ridicate decât în stare umedă.

Temperaturile joase nu distrug activitatea enzimelor, ci numai o micșorează sau o opresc în mod reversibil. Soluțiile enzimatice diluate (în jur de 1% enzimă), prin congelare și decongelare își măresc activitatea enzimatică, deoarece, datorită înghețului și dezghețului, se eliberează noi centrii activi din molecula enzimelor. În cazul soluțiilor mai concentrate, activitatea enzimatică se micșorează după îngheț, datorită formării unor agregate moleculare care blochează unii centrii activi.

Fiecare enzimă are o temperatură minimă (începând de la 0C) la care începe activitatea enzimatică, una optimă la care activitatea este maximă și o temperatură maximă la care activitatea încetează.

1.7.4. INFLUENȚA pH-ULUI MEDIULUI ASUPRA VITEZEI REACȚIILOR ENZIMATICE

Ca și în cazul temperaturii, reacția mediului manifestă o acțiune extrem de puternică asupra activității catalitice a enzimelor. Astfel, pH-ul mediului de reacție poate afecta activitatea enzimelor fie ireversibil (când are loc denaturarea lor la valori extreme ale acestui parametru fizico-chimic), fie reversibil (când este influențat gradul de ionizare al enzimei, substratului, complexului ES sau al tuturor acestor specii moleculare).

Enzimele își manifestă activitatea numai între anumite limite de pH (limite inferioare și limite superioare). În interiorul acestor limite, enzimele au un optim la care activitatea lor este maximă. pH-ul optim coincide în general cu pH-ul lichidelor din organism, unde enzimele își exercită activitatea de biocatalizatori (pH-ul optim al pepsinei din stomac este între 1,4-1,6; al tripsinei din pancreas între 7,8-8,7).

Majoritatea țesuturilor din organismul uman au pH-ul în jur de 7 și enzimele au activitate optimă aproape de această valoare. La pH-uri mai mici sau mai mari viteza reacției enzimatice se micșorează, specific pentru fiecare enzimă.

Valoarea pH-ului optim este influențată de temperatură, de ionii din soluție, de natura și concentrația substratului, de originea enzimei, de factorii biologici etc. Ionii de hidroniu și de hidroxid au efect denaturant asupra enzimelor, astfel se rup legături de tip electrovalent. Enzimele care au centru activ în grupări ionizabile, acide sau bazice, vor interacționa direct cu ionii de hidroniu și de hidroxid, rezultând o creștere sau o scădere a gradului lor de disociere. În acest caz, acești ioni acționează ca inhibitori (un exemplu este inactivarea la nivelul stomacului, unde pH-ul este mai mic de 2, a amilazei salivare, cu pH-ul optim între 6,6 și 6,8).

Există enzime care au activitatea enzimatică maximă sub formă nedisociată, iar altele sub formă disociată.

1.7.5. INFLUENȚA EFECTORILOR ASUPRA VITEZEI REACȚIILOR ENZIMATICE

Se numesc efectori sau modulatori, compușii chimici care, adăugați în mediul de incubare, modifică viteza reacțiilor enzimatice.

Efectorii care accelerează reacțiile enzimatice se numesc modulatori pozitivi sau activatori, iar cei care diminuează viteza reacției se numesc modulatori negativi sau inhibitori.

Se cunosc trei tipuri de activatori:

Activatori care acționează prin deblocarea centrilor activi din molecula enzimelor. Unele enzime sunt secretate sub formă inactivă numite proenzime, care au grupările active blocate de polipeptide sau de alte substanțe. Sub influența unor enzime (kinaze), se îndepărtează polipeptidele inhibitoare și proenzimele se transformă în enzime active (de exemplu, trombokinaza transformă protrombina în trombină, ce produce coagularea sângelui; acidul clorhidric determină transformarea pepsinogenului în pepsină, etc.).

Activatori care acționeauă asupra enzimei prin înlăturarea din sistem a unor inhibitori ai enzimei. Proteinele activează ureaza prin captarea ionilor inhibitori din sistem. Aceștia au rol de a apăra enzima împotriva factorilor care o inactivează sau o denaturează.

Activatori care sunt componente ale enzimelor sau care stimulează direct activitatea acestora. Astfel, amilaza salivară este activată numai în prezența ionilor de clor, fosfatazele sunt activate de ionii de magneziu, lipazele de ionii de calciu, arginaza de ionii de mangan, cobalt sau nichel, proteazele vegetale sunt activate de glutationul redus etc.

Inhibitorii: unii acționează numai asupra anumitor enzime și se numesc inhibitori specifici, alții acționează asupra mai multor enzime și se numesc inhibitori nespecifici.

După mecanismul prin care se realizează inhibarea enzimatică există: o inhibare competitivă și una necompetitivă.

Inhibarea competitivă: atunci când în mediul de reacție există substanțe înrudite structural cu substratul natural al enzimei respective, acestea se pot lega la centrul activ al enzimei. Astfel, inhibitorul și substratul se află în competiție pentru situsul catalitic enzimatic. Exemple de inhibitori structurali: acidul malonic pentru succiniccodehidrogenază, ornitina și lizina pentru arginază etc. Această inhibiție se produce și în cazul vitaminelor de către antivitamine, hormoni-antihormoni, enzime-antienzime.

Inhibarea necompetitivă: are loc atunci când între inhibitor și substrat nu există nici o analogie structurală, inhibitorul legându-se la situsuri specifice, altele decât situsul catalitic. Astfel nu există nici o concurență între inhibitor și substrat.

Inhibarea unei reacții depinde de cantitatea inhibitorului și de cea a enzimei. Această inhibare se poate realiza prin următoarele modalități:

inhibarea prin bocarea sau transformarea grupărilor sulfhidrice (-SH) care sunt cele mai importante din centrii activi ai enzimelor. Grupările sulfhidrice pot fi blocate prin reacții cu metalele grele (Ag, Mg, Pb, As etc.) formându-se mercaptide. Ele pot fi de asemenea oxidate sau blocate prin agenți de alchilare ca acidul iodacetic;

inhibarea prin blocarea metalului în componența enzimei sau a activatorilor din mediul de reacție. Florurile și oxidanții extrag ionii de Mg și de Cadin molecula enzimei, iar cianurile, hidrogenul sulfurat, oxidul de carbon scot fierul din enzimele feroporfirinice;

inhibarea prin combinarea inhibitorului cu substratul. Viteza de reacție scade datorită scăderii concentrației substratului.

Inhibarea enzimelor se produce și prin agitare îndelungată, sub acțiunea radiațiilor ultraviolete, la presiuni ridicateși sub acțiunea substanțelor care determină precipitarea proteinelor (acid tricloracetic, tanin etc).

1.8. UREEA

Ureea este compusul organic cu formula moleculară CHON. Ureea este, de fapt, diamida acidului carbonic, deci o amidă. Se numește așa deoarece se obține din acidul carbonic (sifon), printr-o dublă reacție a acidului cu amoniacul:

(10)

acid carbonic amoniac monoamidă

Structura rezultată este instabilă, deci reacția se repetă la produs:

(11)

monoamidă amoniac uree

Ureea este prima substanță de tip organic obținută artificial, în laborator, din substanțe anorganice (cianatul de amoniu – NHNCO), creatorul ei fiind Friedrich Wöhler, în 1828. Ecuația reacției lui Wöhler este:

(12)

dioxid de amoniac uree apă

carbon

la o temperatură de 1500°C și presiune înaltă.

Ureea este o substanță solidă, cristalizată, solubilă în HO. Chimic vorbind, ea se comportă ca amidele. Se folosește, de obicei, ca îngrășământ agricol, alături de N, în industria medicamentelor și la obținerea de produși macromoleculari de policondensare cu aldehida formică.

1.8.1. ÎNTREBUINȚĂRI ALE UREEI

Ureea – CO(NH) se folosește la fertilizarea culturilor de păioase și la prăsila intâi a culturilor de prăsitoare (floarea soarelui, porumb, cartof) în perioadele Ianuarie-Februarie, respectiv Aprilie-Mai.

Ureea se obține prin sinteză, din amoniac și bioxid de carbon, în condiții de temperatură și presiune înalte. Produsul este utilizat, în special , ca îngrășământ de suprafață, aplicat fie separat, fie în combinație cu alte îngrășăminte.

Dozarea este în strânsă dependență cu tipul culturii, al solului si condițiile climatice. Produsul se poate trata cu antiaglomerant. Se ambalează în saci de polietilenă sau saci dubli (polietilenă și polipropilenă) de 50 kg sau poate fi livrat în vrac. Depozitarea si transportul se fac în stive de maxim 20 rânduri pentru sacii de 50 kg, în magazii închise curate si uscate, la temperaturi cuprinse între – 10 °C si +30 °C.

Are aplicație și în zootehnie, intrând în compoziția furajelor complexe, produsul asigurând astfel necesarul de proteine pentru animale.

În industria farmaceutică, ureea se utilizează, deoarece are proprietăți keratolitice, ușurează curățirea materialului proteic neviabil și a cheagurilor la suprafața leziunilor, inhibă proliferarea fibroblaștilor împiedicând formarea excesivă de țesut conjunctiv, favorizează epitelizarea.

1.9. UTILIZAREA ENZIMELOR ÎN INDUSTRIE

Enzimele se utilizează de multă vreme cu succes în diferite procese de biosinteză. Cele dintâi fermentații valorificate în slujba omului sunt fermentația alcoolică, lactică și acetică. În organismul viu au loc zeci de mii de reacții enzimatice diferite. Problema obținerii anumitor produși ai acestor reacții in vitro este pe deplin realizabilă.

Astăzi, enzimele sunt cunoscute drept substanțele care produc cele mai variate alimente, materii prime și auxiliari chimici, solvenți sau plastifianți, acizi organici și medicamente, începând de la vitamine și încheind cu ultimele antibiotice.

1.9.1. UTILIZAREA ENZIMELOR ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ

Toate ramurile industriei alimentare reprezintă domenii importante de aplicabilitate pentru enzimologie. Exemple de procese utlizate în industria alimentară și care sunt realizate de către microorganisme prin echipamentele lor enzimatice: fermentarea mustului în vinificație, oțetirea vinului, fermentarea aluatului în panificație, obținerea brânzeturilor prin fermentația lactică.

Industria alimentară modernă are la bază procesele clasice, unele încă din antichitate, fiind modernizate prin diferite modificări. Multe firme din industria de panificație de exemplu, folosesc diferite preparate enzimatice, în special amilaze și unele proteinaze, introduse în cocă în concentrații determinate în vederea îmbunătățirii caracteristicilor fizice și organoleptice ale pâinii, iar lipaza este folosită ca emulgator natural.

În industria de cofetărie se utilizează cu succes invertaza care hidrolizează zaharoza cu formare de zahăr invertit mult mai dulce, nefermentescibil și cu o solubilitate crescută. Aceeași enzimă se utilizează și la fabricarea mierii artificiale ca înlocuitor al mierii de albine.

La fabricarea berii, se folosește ca materie primă amidonul, îmbogățind mediul de fermentație cu -amilază sub formă de malț.

Coagularea laptelui în industria brânzeturilor se realizează cu ajutorul reninei datorită acțiunii sale proteolitice. Marea diversitate a brânzeturilor obținute de diferite firme din industria laptelui este datorată nu numai utilizării diferitelor tulpini microbiene, ci și a unor prelucrări enzimatice specifice.

Și alte domenii ale industriei alimentare beneficiază de aportul enzimelor pentru îmbunătățirea calității produselor: industria cărnii, industria furajelor sub forma concentratelor vitamino-proteice, industria băuturilor răcoritoare, etc.

1.9.2. UTILIZAREA ENZIMELOR ÎN MEDICINĂ

Un rol important îl au enzimele digestive, ele participă activ in digestia alimentelor fiind produse de glandele salivare, stomac, intestin, pancreas, ficat.

Cercetările făcute au demonstrat că organismul nostru are o capacitate limitată de a produce enzime, atât digestive cât și alte tipuri.

Enzimele digestive permit organismului să digere alimentele pe care le mâncăm prin scindarea zahărului, amidonului, grăsimilor și fibrelor, în compuși mai mici, care pot fi absorbiți până la nivel celular.

Enzimele alimentare sunt vitale pentru menținerea sănătății optime. Lipsa lor poate conduce la ieșirea din normalitate, adică îmbolnăvire. Adevărata problemă este faptul că alimentele sunt lipsite aproape complet de enzime. După cum se știe, orice formă de prelucrare sau preparare: pasteurizare, iradiere, gătitul la microunde sau fierberea, distrug enzimele existente în mod natural în alimente.

De asemenea, agricultura cu pesticide, fungicide, fertilizatori anorganici reduce conținutul în enzime al solului. Acestea conduc la sărăcirea solului în micro și macroelemente necesare viitoarelor plante pentru dezvoltare.

Numeroase studii arată că alimentele naturale (organice) sunt mult mai bogate în substanțe nutritive decât cele „comerciale”. Astăzi este o certitudine că enzimele au rol determinant în sănătatea noastră. Astfel enzimele din hrană nu își pot face datoria dacă nu mestecăm suficent de bine pentru a rupe pereții celulelor și fibrele care protejează enzimele. Organismul nostru este foarte solicitat și în cazul în care consumăm frecvent carne plină de hormoni, produse de patiserie obținute din făină rafinată și zahăr sau îndulcitori artificiali și grăsimi artificiale, făra a-i oferi partea de enzime și substanțe nutritive. Dacă nu avem o dietă bogată în enzime organismul iși epuizează rapid rezervele, nefiind capabil să stocheze surplusul pentru utilizare ulterioară. Așa se explică recomandările experților de a ne fortifia enzimatic regimul alimentar. Mai mult, dr. [NUME_REDACTAT] spune într-o carte că: “cu cât facem mai multe cercetări, cu atât suntem mai convinși că tulburările digestive joacă un rol în multe, dacă nu în toate bolile cronice predominante în zilele noastre”. Aici putem adăuga și faptul, susținut de alte studii, că aproape toate tulburările sunt rezultatul stresului digestiv persistent.

Enzimoterapia furnizează un sprijin esențial procesului de însănătoșire, uneori surprinzător pentru cei mai mulți. Un exemplu sunt bolile de piele, care adesea sunt urmare a unor boli digestive, a procesului accentuat de imbătrânire, sau chiar a tulburărilor mentale.

În ultimul timp, tot mai multe dovezi științifice vorbesc despre rolul enzimelor; apar noi științe zise complementare dar care de fapt sunt fundamentale în cunoașterea proceselor metabolice și deci, în buna funcționare a organismului.

Suplimentarea cu enzime, deși nu este acceptată ca eficiență de întreaga comunitate științifică este lipsită de riscuri majore aducând în același timp beneficii multiple și importante: sistem imunitar mai puternic, refacere mai rapidă după accidentări și antrenamente, ajutorul în lupta cu tumorile, un sistem digestiv mai eficient, prevenirea îmbătrânirii și a multor boli.

1.9.3. UTILIZAREA ENZIMELOR ÎN INDUSTRIA FARMACEUTICĂ

Industria chimico-farmaceutică poate folosi diferite preparate enzimatice în două scopuri:

obținerea de preparate farmaceutice sub formă de tablete, unguente, etc., conținând diferite enzime „medicament” utilizate în tratament;

utilizarea enzimelor în diferite procese de sinteză în vederea obținerii de noi medicamente (un exemplu este utilizarea penicilinazei).

Utilizarea repetată a penicilinei determină apariția fenomenului de rezistență care constă în inducerea biosintezei penicilinazelor de către flora microbiană din tubul digestiv. Pentru a evita apariția acestui fenomen este necesară înlocuirea periodică a tratamentului clasic prin utilizarea altor peniciline.

1.9.4. UTILIZAREA ENZIMELOR ÎN ALTE DOMENII

În industria chimică s-au făcut pași importanți în obținerea așa numiților biodetergenți cu calități de înmuiere și spălare superioare. Aceștia conțin atât substanțe tensioactive cât și unele enzime (lipaza, proteinaze, amilaze) care, prin acțiunea lor hidrolitică asupra impurităților de natură lipidică, proteică și glucidică, măresc capacitatea de spălare.

Prin utilizarea transferazelor s-au obținut noi substanțe organice care se obțin greu prin sinteză organică și în stare impură. Similar s-au separat antipozii optici din amestecurile racemice sub acțiunea izomerazelor specifice.

Utilizarea enzimelor în industria pielăriei se bazează pe faptul că pieile de animale folosite ca materii prime sunt produse biologice, iar diferitele tratamente enzimatice pot completa procesele chimice de prelucrare astfel încât să se obțină produse finale cu calități superioare.

Enzimele au rol și în procesele de epurare a apelor reziduale, epurarea biologică fiind tot mai mult preferată.

Enzimele se întâlnesc și în domeniul microbiologiei. Microorganismele se cultivă pe diferite medii de cultură pentru a obține o gamă variată de substanțe organice. Introducerea în mediul de cultură a unui substrat induce biointeza enzimei ce catalizează transformarea acestuia.

CAPITOLUL 2

PARTEA EXPERIMENTALĂ

2.1. IAZUL DE DECANTARE BOZÂNTA

Fig.4. [NUME_REDACTAT] – vedere din satelit

2008 [NUME_REDACTAT]

2008 [NUME_REDACTAT]

Image 2008 GeoEye

unde:

NE/B – partea de NE a sterilului, la baza lui

NE/M – partea de NE a sterilului, la mijlocul lui

NE/S – partea de NE a sterilului, la partea superioară a lui

Fig.5. [NUME_REDACTAT] de decantare [NUME_REDACTAT] de decantare Bozânta este amplasat în bazinul hidrografic Someș, aval confluenței râului Săsar cu râul Lăpuș, limitrof localității Bozânta.

Stația de epurare Bozânta este situată în aval de iazul de decantare, pe malul drept al râului Lăpuș, la cca. 1000 metri de confluența acestuia cu râul Săsar.

Rețeaua hidrografică a regiunii este reprezentată de râul Săsar, care străbate municipiul [NUME_REDACTAT] de la est la vest, respectiv râul Lăpuș.

Cele mai apropiate localități sunt: Bozânta și Săsar.

Din punct de vedere geologic, bazinul băimărean face parte dintr-un golf de sedimentare terțiară care se dezvoltă între cristalinul [NUME_REDACTAT] și cel al [NUME_REDACTAT].

[NUME_REDACTAT] Mare se află în zona de contact dintre [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT], pe latura sudică a munților vulcanici Țibleș și Gutâi.

Sub acțiunea agenților externi, rocile adezitice au fost alterate și erodate, formându-se depozite aluviale și deluviale care fac trecerea la depozitele de terasa superioară ale râului Săsar. Sedimentarul din zonă este reprezentat prin marne cenușii-vinete, argile marnoase și nisipuri cu orizonturi gresificate. Ca vârstă , aceste formațiuni aparțin pontianului.

Deasupra acestui sedimentar apare pachetul de bolovănișuri și pietrișuri, cu interspații umplute cu nisip (argile pe alocuri) cu o grosime de 4-6 metri. Peste acest pachet aluvionar, macro-granular, urmează straturi de argilă prăfoasă și argilă grasă galben-cenușie slab nisipoasă, vârtoasă sau plastică, provenite din spălarea și depunerea materialului rezultat din alterarea masivelor andezitice.

Fig.6. Partea de mijloc a [NUME_REDACTAT]

Din punct de vedere hidrologic, pânza de apă freatică este cantonată în formațiunile macrogranulare de terasă ale râului Săsar (bolovăniș cu pietriș și nisip) și este în legătură directă cu râul Săsar, având fluctuații de nivel funcție de nivelul râului, care la rândul lui depinde de nivelul precipitațiilor. Pânza de apă freatică are un caracter ascensional, ajungând în anumite condiții până la suprafața terenului.

[NUME_REDACTAT] are o suprafață de 105 ha – la nivelul digului de amorsare, respectiv 71,5 ha – la nivelul coronamentului.

Sterilul de flotație precum și apele industriale uzate din procesul de prelucrare a minereurilor la U.P. [NUME_REDACTAT] – scurgeri din instalații, ape limpezite sau filtrate (colectate în bazinul de lângă stația de pompare uzinală și vehiculate cu o pompă la bazinul de aspirație al stației), precum și nămolul metalurgic de la S.C. CUPROM S.A. [NUME_REDACTAT] (introdus din stația proprie printr-o conductă de aducțiune) sunt evacuate prin intermediul stației de pompare steril din incinta U.P.[NUME_REDACTAT] și dirijate la stația de repompare și apoi la iazul de decantare Bozânta prin rețeaua de hidrotransport a [NUME_REDACTAT].

Fig.7. [NUME_REDACTAT] de decantare [NUME_REDACTAT] de mină de la E.M.Aurum sunt vehiculate cu stația de pompe Săsar și rețeaua de hidrotransport de la stația de repompare și apoi la iazul de decantare. Nămolul de la stația de epurare a S.C. VITAL S.A. este injectat în conducta de steril a U.P.[NUME_REDACTAT], pe teren, prin intermediul unei stații de pompare proprii.

Apele de proces de la S.C. TRANSGOLD ajung în iazul de decantare Bozânta în următoarele situații:

– apele preepurate cu NaOCl – din instalația de tratare TRANSGOLD sunt pompate în bazinul stației Săsar și apoi , la iazul de decantare Bozânta prin rețeaua de hidrotransport descrisă mai sus;

– în cazul unor precipitații abundente apele din iazul TRANSGOLD sunt tratate cu NaOCl local și pompate direct pe iazul de decantare Bozânta prin conducta de rezervă.

2.2 UREAZA

Ureaza este o enzimă (catalizator de proteine), care catalizează hidroliza ureei ( NH- CO- NH) până la NH și CO în următoarea reacție:

NH- CO- NH + HO NH + NH- COOH NH + CO (13)

uree carbonat de amoniu

Ureaza este importantă pentru că:

Pune în libertate amoniac din uree în îngrășământ, descompune plantele și deșeuri animale.

Când îngrășământul cu uree e prezent în sol, enzima poate cauza local mărirea pH-ului ceea ce duce la apariția ei la suprafața solului și punerea în libertate a amoniacului precum un gaz.

De asemenea, enzima ajută agenții patogeni să supraviețuiască în interiorul stomacului și cauzează apariția ulcerului digestiv.

Practic toate tipurile de sol conțin o anumită cantitate de urează. Această enzimă se întâlnește în multe plante, în special în fasole și în soia.

Această enzimă nu este doar de un singur fel. Există mai multe tipuri de urează: microbiană, vegetală, animală, extracelulară. Acestea au greutatea moleculară diferită, iar subunitățile proteice constitutive sunt dispuse în mod diferit.

În ceea ce privește cantitatea de urează prezentă în sol, aceasta nu a putut fi determinată, dar s-a putut măsura activitatea acesteia în sol. Există soluri în care activitatea acestei enzime este intensă, dar și soluri în care este scăzută. Temperatura, umiditatea solului, conținutul de materie organică, compoziția solului influențează cantitatea ureazei în sol.

În ceea ce privește viteza cu care acționează enzima în sol, aceasta este foarte rapidă de îndată ce ureea a fost introdusă în sol, poate fi dizolvată extracelular de către urează care este întotdeauna activă. În ceea ce privește potențialul activității enzimei, procentele sunt cuprinse între 50 și 100 mg kghr.

Mediul înconjurător influențează activitatea ureazei.

În condiții de umiditate sau secetă, activitatea ureazică în sol este stabilă. Atât solurile secetoase cât și cele umede au efect redus asupra activității ureazei.

Creșterea temperaturii determină creșterea activității ureazei. Între 50 și 86C procentul hidrolizării ureei se va dubla în sol, în cea mai mare parte. Activitatea ureazei poate fi detectată și în solul înghețat (-4C). Această activitate a enzimei nu va înceta să crească până când temperatura solului va fi mai mare de 160C. Activitatea ureazică se poate modifica brusc în perioada în care temperatura solului este foarte scăzută. Activitatea ureazică și hidroliza ureei vor crește foarte mult în această perioadă care este scurtă, dar importantă.

În ceea ce privește materia organică existentă în sol, activitatea ureazică este corelată cu aceasta. Cu cât este mai mare cantitatea de materie organică, cu atât va crește și activitatea ureazică în sol.

Îngrășămintele cu un conținut de uree peste 1000 ppm au efect redus asupra activității ureazice parțiale și nici un efect asupra activității ureazice totale.

Ureaza se găsește în cea mai mare parte la suprafața solului. De obicei în solurile de pășune activitatea ureazei este mai mare decât cea din solurile cultivate unde, ca urmare a activității de plugătit, solul cu conținut mare de urează este dislocat de la suprafață și plasat mai la adâncime.

Îmbunătățirea cu materie organică prin adăugarea unor materiale care se descompun ușor (zahăr, amidon, gunoi de grajd și a reziduurilor de recoltă), va determina creșterea activității ureazei.

Pesticidele ca: fungicide, erbicide, nematocide, insecticide și altele au impact redus asupra activității ureazice atunci când sunt folosite în proporții rezonabile.

În urma unor studii cu gazon s-a arătat că activitatea ureazei este mai intensă deasupra solului decât la baza acestuia. Pentru că activitatea ureazei este mai intensă la suprafața solului se pune în libertate mai ușor amoniac.

Ureaza se găsește în principal în semințe, în microorganisme și în nevertebrate.

În plante, ureaza este un hexamer, fiind alcătuită din șase lanțuri identice și este situată în citoplasmă. În bacterii, ureaza este alcătuită din două sau trei subunități diferite. Pentru activare, ureaza trebuie să lege câte doi ioni de nichel pe fiecare subunitate.

Fig.8. [NUME_REDACTAT] o întâlnim și în semințele de soia. Rolul ureazei din semințele de soia nu este pe deplin cunoscut, dar se poate specula. Frunzele de soia conțin, de asemenea urează. Această enzimă este de o mie de ori mai activă în frunze decât în bobul de fasole. Este cunoscut faptul că enzima din frunză ajută la reciclarea azotului pentru proteine (proteinele sunt defalcate în funcție de uree). În bob, ureaza diferă atunci când acesta germinează. Amoniacul care rezultă din reacție are rol în protecția celulelor plantelor de agenții patogeni. Se pare că această enzimă din plante este de fapt un insecticid.

Fig. 9. Plante de soia

Multe specii de bacterii produc urează, de exemplu, Helicobacter pylori este o bacterie responsabilă de ulcerele stomacale. Astfel, această bacteri ridică pH-ul sucului gastric de la pH-ul 3 până la pH-ul 7, pH-ul optim pentru creșterea economică. Un test comercial disponibil pentru Helicobacter pylori a verificat prezența ureazei în aer, și este folosit ca un instrument pentru diagnosticarea ulcerelor stomacale.

Fig. 10. Helicobacter pylori

Ureaza este importantă și în ciclul azotului în atmosferă. Azotul este un element crucial pentru creșterea plantelor, dar majoritatea plantelor pot să-l utilizeze sub formă de azotat de amoniu sau nitrați. Numai leguminoasele (datorită bacteriilor cu care trăiesc în simbioza) și cianobacteriile pot folosi azotul elementar din aer.

2.3 AMONIFICAREA ACIDULUI URIC ȘI HIPURIC

Urobacteriile iau parte însemnată la hidroliza produselor de descompunere a acidului uric ce se găsește în cantități mici (0,04%) în urina animalelor și care pătrunde în sol odată cu ureea.acidul uric este descompus de o serie de bacterii aerobe și anaerobe care îl utilizează ca sursă de carbon și azot, sau numai de azot. După unele date, acidul uric se descompune la început în uree și acid tartronic, după ecuația:

HN = CO

NH

OC C — NH

CO + 4 HO → 2 CO + HOOC = CHOH = COOH

HN = C — NH

NH acid tartronic (14)

acid uric uree

Din grupul de bacterii care descompun acidul uric, în condiții anaerobe, se cunosc Clostridium acidi urici ( Bacillus acidi urici), iar dinter bacteriile care descompun acidul uric în condiții aerobe se pot cita Proteus vulgare, Bacterium fluorescens. Ureea rezultată precum și acidul tartronic obținut servesc acestor bacterii atât ca sursă de carbon cât și ca sursă de azot. Înafară de acestea, ureea care se formează în cursul acestei hidrolize este utilizată de o serie de alte bacterii din sol ca sursă de azot, de aceea probabil acidul uric nu se acumulează în sol în cantități sesizabile. Oxidarea completă a acidului uric decurge după următoarea formulă:

CHNO + 8 HO + 1 O → 4 NH= HCO + CO (15)

Fenomenele analogice au loc și la oxidarea acidului hipuric de către bacterii și ciuperci. În cursul scindării hidrolitice se formează acid benzoic și glicocol, după ecuația:

CHCO = NH=CH=COOH + HO → CH=COOH + NH=CH-COOH

acid hipuric acid benzoic glicocol (16)

Acidul benzoic este descompus mai departe după schema indicată la descompunerea hidrocarburilor aromatice și a derivaților lor, folosind aceste microorganisme ca sursă de azot. Glicocolul rezultat în cursul acestor oxidări este utilizat de numeroase microorganisme fie ca atare, fie după dezaminarea lui hidrolitică, când se formează acidul glicocolic:

HN=CH=COOH + HO → CHOH=COOH + NH (17)

glicocol acid glicolic

Acidul rezultat din această dezaminare poate servi diferitelor microorganisme în procesul de proteosinteză primară. În amonificarea acizilor uric și hipuric participă urobacterii, ca Micrococcus ureae și alte bacterii, ca Bacterium mesentericus.

2.4 HIDROLIZA UREEI

Microorganismele specifice care descompun ureea aparțin la diferite forme de bacterii: coci, sarcini, bacili. Dintre aceste microorganisme, cele mai importante sunt următoarele forme: Bacillus probatus, bacil ciliat peritrih, sporulat, foarte răspândit în natură. Descompune într-un litru de soluție până la 140 g de uree. Asemănător cu acesta mai sunt încă două forme: Urobacterium leubii și Urobacterium miquelli care manifestă activitate mai redusă. Planosarcina ureae sunt celule sferice din grupul sarcinilor mobile care în cursul procesului de diviziune se dispun în pachete mici. Această formă este mai puțin activă, descompune totuși la un litru de soluție nutritivă până la 30 g de uree. Micrococcus ureae este o formă sferică care descompune relativ încet ureea. În bazine și mlaștini există, de asemenea, microorganisme care descompun destul de energic ureea. Dintre acestea se poate cita Urobacillus hesmogenes. În general, urobacteriile trăiesc în medii puternic alcaline, pH-ul minim necesar vieții lor fiind 7, iar cel optim aproape 9. Această caracteristică este legată probabil de faptul că în mediul în care activează , se acumulează în mod constant amoniac ce produce o puternică reacție alcalină la care aceste bacterii s-au adaptat în cursul evoluției lor filogenetice. Aceste condiții au făcut ca bacteriile amintite să devină rezistente și la cantități mici de amoniac liber, pa când alte bacterii încetează să se dezvolte chiar în prezența unor cantități infime de amoniac liber. Urobacteriile se pot înmulți descompunând activ ureea atât în condiții aerobe cât și în condiții anaerobe. Ele utilizează ca surse de carbon mai ales sărurile acizilor organici cu carboni neoxidați (cum ar fi acidul succinic, acetic) și nu pot folosi carbonul din uree deoarece se găsește într-o formă prea oxidată care se transformă prin hidroliză în CO. În afară de aceasta, urobacteriile mai utilizează ca sursă de carbon zaharurile simple și complexe (monozaharide, dizaharide, dextrine și amidon). Ca sursă de azot urobacteriile utilizează numai sărurile amoniacale și amoniacul liber format prin propria lor activitate de descompunere a ureei.

Hidroliza ureei se înfăptuiește sub acțiunea unei enzime, numită urează.

După părerea unor autori, ureaza este un exoferment, iar descompunerea ureei ar avea numai importanță ecologică pentru bacterii, după alți autori, ureaza ar fi un endoferment și în acest caz, hidroliza ureei ar avea pentru bacterii și o importanță fiziologică.

2.5 DETERMINAREA ACTIVITĂȚII UREAZICE A SOLULUI

Principiul metodei:

La sol se adaugă toluen (pentru a preveni proliferarea microorganismelor) și soluția apoasă a substratului enzimatic (uree).

În cursul incubării, ureea se scindează hidrolitic sub acțiunea ureazei conform reacției:

C==O(NH)+ 2HO (NH)CO 2NH+ CO+ HO (18)

Amoniul format se extrage cu soluție de KCl și se determină cantitativ cu reactivul Nessler și colorimetrare:

KCl + NH NHCl (19)

NHCl + 2K[HgI] + 4KOH I-Hg-O-Hg-NH+ 7KI + KCl + 3HO

iodomercuriat de iodură

potasiu amidomercurică (20)

Cu cât este mai mare concentrația iodurii amidomercurice, cu atât este mai ridicată activitatea ureazică.

Reactivi necesari:

– toluen;

– soluție tampon fosfat pH=6,7 (7,66 g NaHPO· 2HO + 7,76 g KHPO se dizolvă în apă distilată fiartă și răcită și se completează la 100 ml);

– soluție de uree (3 g/100 ml) – 3 g uree se dizolvă în cca. 80 ml apă distilată și se fierbe timp de câteva minute, apoi se răcește și se completează la 100 ml cu apă distilată fiartă și răcită;

– soluție de KCl (2 M) – 74,56 g KCl se dizolvă în apă distilată fiartă și răcită și se completează la 500 ml;

– soluție de sare Seignette (tartrat dublu de Na și K – KNa(CHO)· 4HO), 50 g/100 ml – 50 g sare Seignette se dizolvă în apă distilată fiartă și răcită și se completează la 100 ml;

– soluția Nessler – se mojarează 10 g HgI cu 3-4 ml de apă distilată, până când se obține o pastă, se adaugă 5 g KI și, după amestecare, se toarnă în doze succesive în total de 100 ml KOH soluție 20 g/100 ml, rece. Pasta se amestecă continuu cu soluție de KOH. Se obține o soluție opalescentă. Soluția se păstrează în sticlă brună, iar după câteva zile se centrifughează (4000 rotații/min., timp de 30’). Supernatantul clar se decantează într-o sticlă brună și reprezintă reactivul Nessler.

– soluția etalon – 2,968 g NHCl se dizolvă în apă distilată fiartă și răcită și se completează la 1000 ml. Din soluția etalon astfel preparată se iau 5 ml și se diluează cu apă distilată fiartă și răcită până la 500 ml. 1 ml din această soluție conține 10 μg NH.

Tehnica de lucru:

În baloane de 100 ml cu fund plat, se cântăresc 5 g sol din fiecare tip de sol. In cazul unei incubări mai mari de 2 ore, la sol se adaugă 2 ml de toluen. După umectare, se așteaptă 15 minute și se introduc în fiecare balon câte 5 ml soluție tampon și 5 ml soluție de uree.

Drept martor servesc :

1 probă cu sol, dar fără substrat enzimatic (cu 5 ml apă distilată în locul celor 5 ml soluție de uree) ;

1 probă fără sol, numai cu substrat enzimatic (soluție de ure) ;

1 probă numai cu apă, fără sol și uree (a se vedea tabelele A.1.,A.2. și A.3.)

Tabel A.1. Compoziția amestecurilor de reacție pentru determinarea activității ureazice a solului.

Legendă: proba nr.1- I A- sol suprafață cu substrat enzimatic de pe prima

terasă;

proba nr.2- I A- sol suprafață fără substrat enzimatic de pe prima

terasă;

proa nr.3- I B- sol adâncime cu substrat enzimatic de pe prima

terasă;

proba nr.4- I B- sol adâncime fără substrat enzimatic de pe prima

terasă;

proba nr.5- II A- sol suprafață cu substrat enzimatic de pe a doua

terasă;

proba nr.6- II A- sol suprafață fără substrat enzimatic de pe a doua

terasă;

proba nr.7- II B- sol adâncime cu substrat enzimatic de pe a doua

terasă;

proba nr.8- II B- sol adâncime fără substrat enzimatic de pe a doua

terasă;

proba nr.9- 5- probă fără sol, numai cu substrat enzimatic;

proba nr.10- 6- probă numai cu apă, fără sol și uree.

Tabel A.2. Compoziția amestecurilor de reacție pentru determinarea activității ureazice a solului.

Legendă: proba nr.1- II A'- sol suprafață cu substrat enzimatic tot de pe a doua

terasă;

proba nr.2- II A'- sol suprafață fără substrat enzimatic tot de pe a

doua terasă;

proba nr.3- II B'- sol adâncime cu substrat enzimatic tot de pe a doua

terasă;

proba nr.4- II B'- sol adâncime fără substrat enzimatic tot de pe a

doua terasă;

proba nr.5- III A- sol suprafață cu substrat enzimatic de pe a treia

terasă;

proba nr.6- III A- sol suprafață fără substrat enzimatic de pe a treia

terasă;

proba nr.7- III B- sol adâncime cu substrat enzimatic de pe a treia

terasă;

proba nr.8- III B- sol adâncime fără substrat enzimatic de pe a treia

terasă;

proba nr.9- IV A- sol suprafață cu substrat enzimatic de pe platou;

proba nr.10- IV A- sol suprafață fără substrat enzimatic de pe platou;

proba nr.11- IV B1- – sol adâncime cu substrat enzimatic de pe platou;

proba nr.12- IV B- sol adâncime fără substrat enzimatic de pe platou;

proba nr.13- 5- probă fără sol, numai cu substrat enzimatic;

proba nr.14- 6- probă numai cu apă, fără sol și uree;

Tabel A.3. Compoziția amestecurilor de reacție pentru determinarea activității ureazice a solului

Legendă: proba nr.1- P- sol pădure cu substrat enzimatic;

proba nr.2- P- sol pădure fără substrat enzimatic.

După incubare, în fiecare balon se adaugă 25 ml soluție de KCl 2M. Se agită și se filtrează prin hârtie de filtru. Filtratele obținute se prelucrează conform tabelului B.

Tabel B.1. Prelucrarea filtratelor

Tabel B.2. Prelucrarea filtratelor

Tabel B.3. Prelucrarea filtratelor pentru solul de pădure

Soluția colorată în galben-portocaliu se fotometrează imediat, lucrând cu filtru albastru (445 nm). Etalonarea aparatului se face față de apă distilată. Pentru obținerea curbei de etalonare, din soluția etalon diluată (conținând 10 μg NH/ml) se prepară 8 probe care se prelucrează conform tabelului C.

Tabel C. Prelucrarea filtratelor

După prepararea probelor etalon se face citirea extincțiilor la spectrofotometru T60U ca și în cazul probelor. Pe baza extincțiilor și a concentrației NH se construiește curba etalon de pe care se citesc valorile pentru fiecare probă experimentală.

Exprimarea activității ureazice: Activitatea ureazică se exprimă în mg NH/100 g sol sau în procente de hidroliză.

Fig. Curba etalon pentru determinarea activității enzimatice

2.6 REZULTATE ȘI DISCUȚII

Fig. Variația conținutului de urează în terase

Interpretare:

Probele au fost luate de pe terasele iazului cu expunere N-NE.

S-au prelevat probe de pe trei terase: prima terasă coincide cu baza iazului, a doua și a treia terasă coincide cu zona de mijloc a iazului și de pe platou, zona superioară a iazului.

Pe primele două terase vegetația este bine închegată, iar pe a treia terasă, pe platoul iazului covorul vegetal este absent.

În această figură am urmărit variația conținutului de urează în diferitele terase ale iazului.

Se observă că în solul de pe prima și a doua terasă, unde vegetația este prezentă, activitatea enzimatică este intensă, iar în solul de pe a teria terasă, unde vegetația lipsește activitatea enzimatică este absentă.

Pentru a evidenția activitatea enzimatică a ureei am ales ca martor proba cu solul de pădure.

Am prelevat probe de sol dintr-o pădure de conifere.

Se observă că în solul de pădure activitatea enzimatică este mult mai intensă decât în solul de pe iazul de decantare. Solul de pădure de conifere este brun, de culoare închisă și ștearsă, bogat în substanțe minerale, cu un conținut ridicat de azot.

Solul de pădure este bogat în materie organică și prin urmare activitatea ureazică crește. Prezența covorului vegetal, a frunzelor uscate de la suprafața solului și a micilor viețuitoare fac ca activitatea ureazică să fie mai intensă pentru că ureaza pune în libertate amoniac din uree în îngrășământ, descompune plantele și deșeuri animale.

Solul brun, bazic prezintă toate însușirile pentru o troficitate potențială ridicată pentru vegetația forestieră.

Mediul relativ lipsit de poluare al pădurii de conifere încurajează creșterea abundentă a lichenilor pe copaci și pe sol, iar umiditatea pădurilor de conifere favorizează creșterea și dezvoltarea a numeroase ciuperci.

Fig. Variația conținutului de urează cu adâncimea

Interpretare:

Probele au fost prelevate atât de la suprafața solului cât și de la o adâncime de 30 cm.

În această figură am evidențiat modul cum variază conținutul de urează cu adâncimea pe diferitele terase ale iazului.

Ureaza se găsește în cea mai mare parte la suprafața solului și prin urmare activitatea ureazică este mai intensă la suprafață, excepție în solul de pe platoul iazului.

Pe platou lipsa vegetației influențează activitatea ureazei. Amoniacul format de aceasta, nefiind consumat de către plante inhibă activitatea ureei.

Fig. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] vegetației alături de expunerea la condițiile meteo (lumină, oxigen, temperatură, vânt, precipitații etc) influențează de asemenea activitatea ureazică și prin urmare ea este redusă în adâncime și este absentă la suprafață.

2.7 CONCLUZII

Metodele enzimatice pot fi folosite la caracterizarea solurilor.

Pentru partea experimentală am prelevat probe de sol de pe iazul de decantare din localitatea [NUME_REDACTAT] și am determinat activitatea ureazică a acestuia.

Probele au fost luate de pe terasele iazului cu expunere N-NE.

În urma determinărilor am constatat că activitatea ureazică este mai intensă la baza iazului și în zona de mijloc, iar pe platou aceasta este absentă datorită lipsei vegetației și a condițiilor meteo.

Ureaza este prezentă în cea mai mare parte la suprafața solului și prin urmare activitatea ureazică este mai intensă la suprafață decât la adâncime.

Ureaza pune în libertate amoniac, descompune plantele și deșeuri animale.

Am prelevat și probe cu sol de pădure și am constatat că activitatea ureazică este mult mai intensă decât în solulul iazului. Acest fapt se datorează prezenței vegetației care este bine închegată.

Activitatea ureazică este influențată de materia organică. Cu cât este mai mare cantitatea de materie organică în sol cu atât crește activitatea ureazică.

Consider că în limita mijloacelor de investigație de care am dispus, scopul studiului a fost realizat.

BIBLIOGRAFIE

D. C. Cojocaru, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], – Enzimologie generală, [NUME_REDACTAT], Iași, 2007;

[NUME_REDACTAT], – Tratat de Biotehnologie, [NUME_REDACTAT], volum I, [NUME_REDACTAT];

C. D. Nenițescu, – Chimie organică, volum II, București, 1998;

Bodea C., – Tratat de biochimie vegetală, volum I, Fitochimie, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] Române, București, 1964;

Burnea I., Popescu I., Neamțiu G., Stancu E., [NUME_REDACTAT]., – Chimie și biologie vegetală, [NUME_REDACTAT] și Pedagogică, București, 1997;

[NUME_REDACTAT], – Tehnologia și aplicațiile industriale ale enzimelor, [NUME_REDACTAT], București, 1963;

Sandu I., [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], – Complemente de biochimie discriptivă, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], 2002;

[NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], – Biochimia, [NUME_REDACTAT] și Enciclopedică, București, 1979;

[NUME_REDACTAT], – Chimia alimentelor, volum II, [NUME_REDACTAT], Galați, 2001;

[NUME_REDACTAT], – Analiza chimică prin metoda cinetică, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] România, București, 1974;

[NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], – Biochimie, [NUME_REDACTAT] și Pedagogică, București, 1965;

I. F. Dumitru, – Lucrări practice de biochimie, [NUME_REDACTAT] și Pedagogică, București, 1967;

P. W. Atkins, – Tratat de chimie fizică, Traducere din limba engleză Prof. dr. [NUME_REDACTAT], Prof. dr. Ing. [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], București, 1996;

Cristofer I. Simionescu, [NUME_REDACTAT], – Enzime, [NUME_REDACTAT] și Enciclopedică, București, 1980;

M. Gruia, S. Vasu, – Cataliza și biocataliza în chimia modernă, [NUME_REDACTAT], București, 1980;

I. F. Dumitru, S. Mager, A. Turcu, – Biochimie generală, [NUME_REDACTAT] și Pedagogică, București, 1973;

I. F. Dumitru, [NUME_REDACTAT], – Enzimele, [NUME_REDACTAT], București, 1974;

I. Manta, – Biochimie medicală, [NUME_REDACTAT] și Pedagogică, București, 1968;

[NUME_REDACTAT], – Biochimie și tehnici de laborator în chimie – Manual pentru licee și științe ale naturii cu profiluri de chimie – biologie și fizică – chimie, [NUME_REDACTAT] și Pedagogică, București, 1980;

www.educativ.ro;

www.nature.com;

www.referat.ro;

www.cas.vanderbilt.edu;

www.eurasnet.info;

www.medicalnewstodau.com;

www.exploratorium.edu.

CUPRINS

Pag.