Abrevieri……pag 3 [302821]

Cuprins

Abrevieri………………………………………………………………………………………pag 3

Introducere……………………………………………………………………………………pag 4

Partea I. Noțiuni teoretice…………………………………………………………………………………………pag 6

Capitolul 1. Quantum dots: aspecte generale…………………………………………………pag 7

1.1 Nanotehnologia și quantum dots……………………………..……………………pag 7

1.2 [anonimizat] ……………………………………………………………..pag 10

1.3 Toxicitatea ……………………………………………………………………….pag 15

1.4 Aplicații biomedicale …………………………………………………………….pag 18

Capitolul 2. Noțiuni de fiziologie renală…………………………………………………….pag 21

2.1 Homeostazie……………………………………………………………………….pag 21

2.2 Ultrafiltrare glomerulară…………………………………………………………..pag 23

2.3 Reabsorbția la nivelul nefronului………………………………………………….pag 26

2.4 Secreția la nivelul nefronului………………………………………………………pag 27

Capitolul 3. Aspecte esențiale privind stresul oxidativ……………………………………pag 28

3.1 Noțiuni generale……………………………………………………………………pag 28

3.2 Radicali liberi………………………………………………………………………pag 29

3.3 Enzime antioxidante………………………………………………………………..pag 32

3.3.1 Catalaza…………………………………………………………………………pag 34

3.3.2 Glutation S-transferaza…………………………………………………………pag 35

3.3.3 Glucozo 6-fosfat dehidrogenaza……………………………………………….pag 35

3.3.4 Glutation peroxidaza…………………………………………………………….pag 36

3.3.5 Glutation reductaza…………………………………………………………….pag.36

Partea a II-a. Studiul experimental……………………………………………………….pag 37

Capitolul 1. Scopul și obiectivele studiului.…………………………………………………pag 38

Capitolul 2. Materiale și metode…………………………………………………………….pag 39

2.1 Design-ul experimentului……………………………………………………………..pag 39

2.2 Determinări biochimice……………………………………………………………….pag 41

2.2.1 Obținerea lizatului celular pentru determinări enzimatice………………………pag 41

2.2.2 Determinarea concentrației proteice prin metoda Lowry……………………….pag 41

2.2.3 Dozarea activității glutation 6-fosfat dehidrogenaza……………………………pag 42

2.2.4 Dozarea catalazei……………………………………………………………….pag 43

2.2.5 Dozarea glutation peroxidazei………………………………………………….pag 44

2.2.6 Dozarea glutation reductazei……………………………………………………pag 46

2.2.7 Dozarea glutation S-transferazei………………………………………………….pag 47

Capitolul 3. Rezultate si discuții…………………………………………………………….pag 48

3.1 Analiza efectului indus de QD la nivelul enzimelor dependente de glutation…………pag 48

3.2 Evaluarea efectului indus de QD la nivelul catalazei………………………………….pag 52

3.3 Evaluarea efectului QD la nivelul glutation 6-fosfat dehidrogenazei…………………pag 53

Capitolul 4. Concluzii…………………………………………………………………….pag 54

Bibliografie……………………………………………………………………………….pag 57

[anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – coenzima Q

Cp – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] a apoptozei

G6PDH – glucozo 6-[anonimizat] – [anonimizat] S-[anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat]- tampon fosfat salin

PGE – prostaglandina E

PGI – prostaglandina I

PKA – protein kinaza A

QD – quantum dots

RMN – rezonanță magnetică nucleară

SRO – specii reactive de oxigen

tBHP – terțbutil hidroxiperoxid

Introducere

Evoluția este o succesiune de evenimente irepetabile, ireversibile și continue, și are o finalitate care poate fi reprezentată de apariția de noi structuri într-un plan de organizare vechi, noi planuri de organizare sau transformarea adaptativă a formelor existente în condițiile schimbătoare ale societății. Trăim într-o societatate informațională în care tehnologia este prezentă peste tot în viața noastră, fiind un element care are atât avantaje, cât si dezavantaje asupra omenirii.

De-a lungul timpului, oamenii de știință s-au preocupat de găsirea și promovarea de noi tehnologii și aplicații pentru îmbunătățirea calității vieții oamenilor, dar și pentru a împiedica distrugerea mediului înconjurător. Astfel, a luat naștere nanotehnologia, care este definită ca fiind tehnica modernă ce permite fabricarea de dispozitive de talie moleculară, capabile să manipuleze materia atom cu atom. Nanoparticulele au devenit centrul atenției pentru mulți cercetători, fiind ultilizate in numeroase domenii de interes, precum medicina, electronica, și industria cosmetică. Ideea cu privire la apariția nanotehnologiei a fost pentru prima dată discutată de către renumitul fizician și laureat al premiului Nobel, Richard Feynman, în 1959. Într-o conferință intitulată "There’s Plenty of Room of the Bottom", el a discutat posibilitatea producerii materialelor prin inginerie pe o scară nanometrică și potențialul aplicării în tehnologie a acestor nanomateriale.

Cea mai importantă utilizare a nanotehnologiei este în medicină, luând naștere nanomedicina care vizează folosirea nanoparticulelor în vederea diagnosticării timpurii a maladiilor umane, livrării țintite și orientate a medicamentelor în organism, îmbunătățirea proprietăților farmaceutice a moleculelor terapeutice, crearea de vaccinuri sintetice.

Quantum dots (QD) sunt particule cristaline cu dimensiuni nanometrice care posedă proprietăți optice și spectroscopice unice, în comparație cu coloranții organici, cum ar fi emisia de lumină cu dimensiuni reduse, luminozitatea superioară a semnalului, rezistența superioară la fotopolimerizare și excitarea simultană a mai multor culori de fluorescență (Miguel, 2012). În pofida acestor proprietăți, mulți cercetători sunt îngrijorați cu privire la posibila toxicitate a particulelor de QD din cauza faptului că prezintă în constituția lor metale grele care au efecte nocive asupra organismului uman, precum nervozitate, instabilitate emoțională, insomnie și letargie.

Metalele grele pot determina o creștere a producției de specii reactive de oxigen (SRO), cum ar fi radicalul hidroxilic, radicalul superoxid sau peroxidul de hidrogen. Producerea generalizată de SRO poate copleși apărările antioxidante intrinseci ale celulelor și poate duce la o stare cunoscută sub denumirea de stres oxidativ (Ercal și colab., 2001). Stresul oxidativ presupune apariția unui dezechilibru între cantitatea de oxigen reactiv ce se produce în organism și capacitatea organismului de a elimina aceste substanțe și de a repara pagubele produse. Glutationul redus (GSH) reprezintă cheia reglării homeostaziei redox, orice perturbare a acesteia fiind asociată cu diverse patologii. Legătura dintre QD și GSH este reprezentată de stresul oxidativ, GSH fiind implicat în neutralizarea radicalilor liberi și reducerea hidroperoxizilor și a peroxizilor lipidici (Meyer și Hell, 2005).

În prezent se urmărește creșerea biocompatibilității QD, iar acest lucru se poate realiza prin substituția metalelor grele din structura nanoparticulelor cu siliciul, QD de siliciu fiind considerate mai puțin daunătoare decât cele care conțin metale toxice (Bertin și Averbeck, 2006; Vinceti și colab., 2001).

În această lucrare, s-a urmărit întelegerea proprietăților optice și electrice ale nanoparticulelor de tip QD și efectele lor asupra organismului uman, în special asupra sistemului renal, prezentându-se în prealabil anatomia și fiziologia sistemului renal. Principalele efecte sunt legate de inducerea stresului oxidativ definit ca fiind dezechilibrul dintre speciile reactive de oxigen și acțiunea enzimelor antioxidante. Partea experimentală a lucrării vizează o serie de determinări biochimice în vederea caracterizării efectelor induse de QD de siliciu la nivelul enzimelor dependente de glutation (glutation peroxidazei, glutation reductazei și glutation S-transferazei), la nivelul catalazei (CAT) și la nivelul glutation 6-fosfat dehidrogenazei (G6PDH).

Partea I-a

Noțiuni teoretice

Capitolul 1. Quantum dots: aspecte generale

Nanotehnologia și quantum dots

În ultimii ani, nanotehnologia a urmat o creștere rapidă și a contribuit la dezvoltarea științei și tehnicilor in vitro, prin aplicarea cunoștințelor științifice în scopuri practice, în special în industrie și medicină. Nanotehnologia se concretizează prin proiectarea de echipamente de laborator, prin creearea de produse, precum și prin imaginarea de noi procedee experimentale. La baza nanotehnologiei stau nanomaterialele, însă utilizarea nanomaterialelor poate fi asociată cu efecte negative încă neelucidate în ceea ce privește sănătatea umană și sănătatea mediului înconjurător. În prezent, cercetătorii fac studii în legătură cu efectele nocive pe care le-ar putea avea nanomaterialele atunci când devin deșeuri si interacționează cu plantele si animalele din mediul natural.

Nanotehnologia presupune manipularea materiei pe scări atomice și moleculare și este considerată o ramură relativ nouă a științei. Manipularea materialelor și a proceselor la scară nanometrică deschide o lume a posibilităților creative și se așteaptă ca beneficiile tehnologiilor nanometrice să aibă un impact substanțial asupra aproape tuturor sectoarelor și domeniilor societății (Hardman, 2005).

Ideea a fost pentru prima dată discutată de către renumitul fizician și laureat al premiului Nobel, Richard Feynman, în 1959. Într-o conferință intitulată "There’s Plenty of Room of the Bottom", el a discutat posibilitatea producerii materialelor prin inginerie pe o scară nanometrică și potențialul aplicării în tehnologie a acestor nanomateriale. Termenul de "nanotehnologie” nu a devenit cunoscut până în anii 1980. În ciuda faptului că au fost doar patru decenii, timp în care s-au făcut numeroase studii de specialitate, nanotehnologia a făcut progrese rapide și este evidentă într-o gamă largă de aplicații, de la fabricarea industrială până la cosmeticele de consum. Astăzi, se estimează că există mai mult de 1.600 de produse de consum bazate pe nanotehnologie (Wang și colab., 2014).

Nanotehnologia poate fi definită drept știința implicată în proiectarea, sinteza, caracterizarea și aplicarea materialelor și dispozitivelor a căror organizare funcțională, se află pe scara nanometrică sau pe o miliardime de metru (Saini și colab., 2010). Cele mai cunoscute aplicații ale electronicii sunt legate de utilizarea nanotehnologiei pentru fabricarea echipamentelor de comunicare, precum telefoanele mobile si computerele. Pe parcursul timpului și în urma experimentelor efectuate, s-a ajuns la concluzia că nanotehnologia este o stiință interdisciplinară pentru că se utilizează noțiuni elementare din fizică cuantică, biologie, chimie, matematică și devine o stiință esențială în rezolvarea problemelor cu care omenirea se confruntă, remarcându-se printr-o serie de progrese, inclusiv terapiile nanomale, biosenzorii, dispozitivele implantabile, sistemele de administrare a medicamentelor și tehnologiile imagistice, aplicate în special în medicină (Kairdolf și colab., 2013). Nanoparticulele (NPs) funcționează ca un mijloc eficient de a furniza medicamente terapeutice pentru tratamentul cancerului, deoarece acestea se pot acumula preferențial la locul tumorii, datorită caracteristicilor lor remarcabile (Zhang și colab.,2018)

Nanoparticulele (NPs) au o dimensiune cuprinsă între 1 și 100 nm. Nanomaterialele au cel puțin o dimensiune cuprinsă între sub-nanometru și 10 nm. Moleculele mici și anumite materiale biologice care apar în mod natural nu sunt de obicei menționate ca nanomateriale, chiar dacă acestea pot fi în intervalul de la 1 la 100 nm. Cercetările privind nanomaterialele fabricate de către om, care se află din punct de vedere dimensional în intervalul cuprins între 1 până la 100 nm, au acumulat un impuls datorită potențialului lor pentru o gamă variată de aplicații în știință, tehnologie și medicină. Câteva exemple de nanomateriale includ lipozomi, dendrimeri, nanotuburi de carbon, fulerene, derivați de grafen, oxizi de titan, NPs de argint, NPs de aur, NPs de platină, NPs magnetice și quantum dots (QD) (Figura 1) (Lin și colab., 2013), având diferite utilizări:

nanotuburile, pentru manipularea fizică a unor nanostructuri;

dendrimerii, nanostructuri sintetice utilizate în cadrul terapiei genice sau în imagistică (boli cardiovasculare);

liposomii, folosiți în momentul actual în terapia țintită a cancerului;

nanocristale quantum dots, utilizate în medicină în scop de diagnostic;

fulerene, utilizate ca antioxidanți în boli neurodegenerative și cardiovasculare;

nanodispozitivele, precum nanoroboții, folosiți în imagistică medicală sau în terapia genică pentru reconstrucția unor structuri biologice moleculare afectate (Ciutan și colab., 2010).

Figura 1. Reprezentarea diferitelor clase de nanomateriale (după Markman, 2013)

Nanomaterialele sunt caracterizate printr-o suprafață relativ mare pe unitatea de masă. Deoarece suprafața unui solid depinde de forma sa, de exemplu o sferă are cea mai mică suprafață per unitate de masă, suprafața nanomaterialelor depinde atât de mărime, cât și de formă. Modificările dimensiunii sau formei nanomaterialelor pot afecta proprietățile lor fizico-chimice și fiziologice.

În ceea ce priveste obiectul de interes al acestui studiu, QD sunt nanoparticulele care se utilizează în imagistică, detecție și direcționare. Din punct de vedere chimic și fizic, QD sunt cristale semiconductoare luminoase cu dimensiuni nanometrice și proprietăți chimice și fizice unice, datorită dimensiunii și structurii lor foarte complexe. QD emit diferite lungimi de undă pe o gamă largă de spectru luminos, de la vizibil la infraroșu, în funcție de mărimea și compoziția lor chimică (Ghasemi și colab., 2009). Aceste materiale și dispozitive pot fi concepute pentru a interacționa cu celulele și țesuturile la un nivel molecular pentru aplicații în medicină și fiziologie, cu un grad ridicat de specificitate funcțională, permițând astfel un model de integrare între tehnologie și sisteme biologice (Saini și colab., 2010). Cea mai importantă utilizare a nanoparticulelor este medicina, în special pentru tratamentul cancerului, precum:

introducerea în sistemul circulator a unor medicamente ce pot fi activate și controlate din exteriorul corpului uman; acestea ar putea colecta date și le-ar putea transmite medicului pentru a modifica tratamentul (teranostică);

dispozitive cu dimensiuni nanometrice pentru transportarea medicamentelor și vizarea celulelor canceroase.

Controlul exact și manipularea nanomaterialelor în celule pot conduce la o mai bună înțelegere a mecanismelor celulare in vivo și la dezvoltarea tehnologiilor avansate pentru diagnosticarea și tratamentul precoce al diferitelor boli. Semnificația acestei cercetări constă în dezvoltarea unei tehnologii de platformă care va influența abordările imagistice la scară nanometrică concepute pentru a cerceta mecanismele moleculare în celulele vii. Imagistica moleculară a apărut ca un instrument puternic pentru a vizualiza evenimentele moleculare ale unei boli, uneori înainte de manifestarea acesteia. Nanotehnologia sau fabricarea sistemelor/ dispozitivelor la nivel molecular, este un domeniu științific multidisciplinar supus unei dezvoltări explozive (Saini și colab., 2010).

Atunci când sunt conjugate cu agenți bimoleculari, cum ar fi anticorpi, peptide sau alte molecule mici, probele pe bază de QD pot fi utilizate pentru a vizualiza celulele canceroase cu specificitate și sensibilitate ridicată, oferind un avantaj tehnicilor îmbunătațite de detectare si imagistică (Fang și colab., 2012). QD sunt nanoparticule considerate o nouă clasă de flurofori anorganici care câștigă recunoaștere pe scală largă ca urmare a proprietăților lor excepționale. Nanoparticulele metalice și semiconductoare care fac parte din gama de mărimi 2-6 nanometri au declanșat, în urma experimentelor efectuate de către cercetătorii în nanotehnologie, un interes considerabil, în special datorită asemănărilor dimensionale cu macromoleculele biologice, ca de exemplu acizii nucleici si proteinele (Jamieson și colab., 2007). Aceste nanoparticulele au de asemenea caracteristici care permit diagnosticarea utilizând mai multe metode, ca de exemplu: optice, radioizotopice sau magnetice și agenți terapeutici. Recent, studiile avansate au dus la dezvoltarea de nanostructuri biodegradabile pentru administrarea de medicamente. (Yang și colab., 2011)

Proprietăți fizico-chimice

Sinteza QD a fost descrisă pentru prima dată în 1982 de Efros și Ekimov care au dezvoltat nanocristale și microcriști de semiconductori în matrice de sticlă. După această etapă, o mare varietate de metode sintetice au fost concepute pentru pregătirea QD în diferite medii, inclusiv în soluție apoasă, solvenți organici la temperatură înaltă și substraturi solide. Suspensiile de QD sunt sintetizate de obicei prin introducerea semiconductorului precursor, în condiții care favorizează termodinamic creșterea cristalului, în prezența unor agenți de legare a semiconductorilor, care au rol în controlul cinetic al creșterii și în menținerea dimensiunii în cadrul intervalului dimensiunilor cuantice (Smith și colab., 2008).

Ca de exemplu, într-o sinteză tipică de QD CdSe (Figura 2), un precursor de seleniu la temperatura camerei (tributilfosfină-selenidă) este injectat rapid într-o soluție fierbinte (~300 °C) care conține un precursor de cadmiu (oleat de cadmiu) și un ligand de coordonare (hexadecilamină). Precursorii de cadmiu și seleniu reacționează rapid la această temperatură ridicată, formând nuclei de nanocristale CdSe. Liganzii coordinativi se leagă de atomii de metal de pe suprafețele nanocristalelor în creștere, stabilizându-le în soluție coloidală și controlând rata lor de creștere. Odata ce QD au atins dimensiunea dorită și lungimea de undă de emisie dorită, amestecul de reacție se răcește la temperatura camerei pentru a opri creșterea. QD rezultate sunt purificate prin precipitare într-un solvent polar (Smith și colab., 2008).

Figura 2. Pașii pentru sinteza QD pentru aplicații biologice (după Banerjee și colab., 2016).

QD sunt studiate intens ca o sondă nouă pentru imagistica biomedicală atât in vitro, cât și in vivo, datorită caracteristicilor lor optice și electronice unice. Pentru a depăși obstacolele în calea utilizării QD pentru imagistica biomedicală, proprietățile fizico-chimice ale QD, cum ar fi dimensiunea, forma, compoziția și caracteristicile suprafeței, au fost investigate pe larg. Astfel, s-a observat că QD oferă avantaje deosebite față de coloranții fluorescenți organici tradiționali (Tabelul 1), exemplu rodamina 6G (Figura 3), și prezintă o serie de caracteristici benefice pentru spectroscopie, cum ar fi intensitatea înaltă a fluorescentei, durata de viață îndelungată și rezistența bună la fotopolimerizare (Fang și colab., 2012).

Figura 3. Structura chimică a rodaminei 6G.

Una dintre cele mai atractive proprietăți ale QD este potențialul acestora de a extinde oportunitățile de imagistică fluorescentă și multimodală in vivo. Randamentul cuantic ridicat (peste 50%) și intervalele mari ale lunigimilor de undă de excitație/emisie (până la 300 nm) permit minimalizarea autofluorescenței țesuturilor, în special atunci când se utilizează puncte cuantice cu emisii în roșu (Bakalova și colab., 2011).

Tabelul 1. Comparație între coloranții fluorescenți organici și QD (după Fang și colab., 2012).

Fotoluminescența QD apare atunci când electronul excitat se relaxează la starea de bază, eliberând energia electromagnetică cu o frecvență îngustă și simetrică în cadrul spectrului UV până la infraroșu. Cu spectre largi de excitație și spectre de emisie înguste și simetrice, QD au o diferență de lungime de undă foarte mare între vârfurile lor de absorbție și emisie. În general, lungimea de undă a emisiei QD este proporțională cu dimensiunea acestora. Cu cât QD este mai mic, cu atât culoarea lui tinde către roșu (Figura 4). Această proprietate unică permite excitarea populațiilor de QD mixte la o singură lungime de undă (Figura 5), cum ar fi în domeniul UV (Pisanic și colab., 2014).

Alte proprietăți optice ale QD fac referire la:

randamentul cuantic ridicat;

fotostabilitate mai bună comparativ cu fluoroforii standard obișnuiți;

coeficienți de extincție molari înalți care sunt de 10 până la 100 de ori mai mari decât cei ai coloranților organici obișnuiți;

rezistență excepțională la degradare chimică;

Figura 4. Spectrul de absorbție și emisie a șase tipuri diferite de QD (după Pisanic și colab., 2014).

Figura 5. Sensibilitatea și compararea spectrală între celulele cancerigene (A) transfectate cu proteină fluorescentă verde (GFP), și imagistica simultană in vivo a nanoparticulelor QD (B) (după Maureen și colab., 2009).

Punctele cuantice sunt adesea denumite "atomi artificiali", deoarece purtătorii lor de sarcină ocupă stări de energie la fel ca electronii unui singur atom. Dacă se furnizează suficientă energie, electronii vor fi excitați de la banda de valență la banda de conducție, lăsând o stare goală în banda de valență. Această stare goală, sau "gaură", poate fi considerată o încărcătură mobilă pozitivă în banda de valență. După excitație, electronii și găurile își pierd rapid energia. Pe măsură ce electronii se recombină cu găurile, prin procesul de recombinare de electroni, energia este eliberată (Figura 6) (Pisanic și colab., 2014).

Figura 6. Ilustrarea recombinării electron-gaură (după Pisanic și colab., 2014).

QD sunt foarte sensibile la prezența încărcărilor suplimentare (electroni sau găuri), fie pe suprafețele lor, fie în mediul înconjurător, ceea ce poate altera absorbția nanocristalului. Ca urmare, prezența încărcărilor suplimentare poate duce la stingerea fluorescenței QD datorită recombinării Auger, care se referă la faptul că daca energia eliberată la capturarea electronului de către QD se regăsește sub formă de energie de excitare a aceluiași QD, atunci acesta devine dublu excitat și se poate dezexcita prin emisia unei cuante luminoase (Pisanic și colab., 2014).

Toxicitatea

Omul este supus în permanență unui număr foarte mare de substanțe din mediul înconjurător, aceste substanțe fiind reprezentate de amestecuri chimice din fumul de țigară, din aer, din apă, din sol, alimente și medicamente, care pătrund în organism pe diferite căi: tegument, calea respiratorie, calea digestive (Loghin,2002). Este cunoscut faptul că gradul ridicat de toxicitate al medicamentelor se manifestă în cazul administrării simultane și a interacțiunii dintre diferite medicamente. Apariția efectelor toxice ale unei substanțe este indusă de către interacțiunea dintre această substanță și o moleculă țintă din organism (Loghin,2002). Parcursul unui compus toxic în organism este următorul (Figura 7) :

Figura 7. Parcursul unui compus toxic în organism (după Loghin, 2002).

Până în prezent, majoritatea investigațiilor au indicat că toxicitatea QD depinde de factori multipli care au apărut din proprietățile fizico-chimice ale nanoparticulelor, cum ar fi dimensiunea, stabilitatea, dispersabilitatea, încărcarea de suprafață, acoperirea suprafeței, oxidarea, concentrația, speciile și timpul de expunere. Astfel, atunci când se evaluează toxicitatea QD, trebuie luate în considerare atât natura intrinsecă a acestora, cât și condițiile externe de mediu (Figura 8) (Li și colab., 2008). Deși substanțele toxice pot leza orice parte a nefronului, s-a demonstrat experimental că în cele mai multe cazuri, este lezat segmentul cel mai activ din punct de vedere metabolic, adică tubul renal, în care se produce urina definitivă, pornind de la urina primară (Loghin, 2002). De asemenea, pot apărea leziuni și la nivelul glomerulului renal.(Figura 9).

Figura 9. Procesele nefrotoxice majore și segmentul din nefron implicat(după Loghin,2002)

Stresul oxidativ este capabil să inducă modificări ale concentrației libere intracelulare de calciu sau să perturbă compartimentarea Ca2+, cu potențialul de a conduce la toxicitate celulară (Xia și colab., 2006). Citotoxicitatea indusă de QD presupune supraexpresia receptorului Fas, un receptor al „morții” care poate activa caspazele și alți factori pro-apoptotici în urma legării ligandului Fas care se găsește pe suprafața limfocitelor T killer, inițiind moartea celulară prin apoptoză. Caspazele sunt enzime de tip cistein proteaze care clivează substratele proteice după un rest de acid aspartic. Acestea sunt secretate în forma inactivă de procaspaze și activate prin procesare proteolitică (Choi și colab., 2007).

În timpul proceselor celulare normale, cum ar fi respirația mitocondrială, se generează și SRO, dar acestea sunt imediat neutralizate de către enzimele antioxidante ale celulei. Cu toate acestea, atunci când generarea depășește capacitatea antioxidantă a celulei, o stare de stres oxidativ este indusă în celulă. Mărimea QD și chimia suprafeței (adică grupările reactive) se presupune că joacă un rol în generarea SRO. În afară de efectele dăunătoare asupra proteinelor celulare, lipidelor și ADN, un nivel în creștere al SRO determină celula să răspundă prin inducerea cascadelor de semnalizare pro-inflamatoare și, în cele din urmă, induce moartea celulară programată (Nel și colab., 2006).

SRO generate de către QD de siliciu pot induce deteriorarea membranei celulare prin peroxidarea lipidelor, care poate determina ulterior creșterea permeabilității celulare, perturbarea homeostazei intracelulare de calciu și alterări ale căilor de semnalizare. Schins și colab. (2002) și Fanizza și colab. (2007) au demonstrat că particulele de cuarț respirabil induc leziunea oxidantă a ADN în celulele epiteliale pulmonare umane.

Majoritatea studiilor in vitro ale QD de siliciu raportează absorbția lor celulară, citotoxicitatea dependentă de dimensiune și doză, creșterea nivelului de SRO și stimularea pro-inflamatorie (Napierska și colab., 2010).

Imunogenitatea nanoparticulelor este importantă pentru că s-a demonstrat experimental că acestea îmbunătățesc proprietățile antigenelor slabe conjugate și astfel pot avea rol de adjuvanți și de asemenea, studiile arată că unele nanoparticule funcționează ele însele ca antigene. Antigenele sunt molecule care pătrunse într-un organism imunocompetent determină un răaspuns imun care presupune proliferarea celulelor limfoide și sinteza de molecule de recunoaștere de tipul anticorpilor si receptorilor celulari pentru antigene care au proprietatea de a se combina in vivo și in vitro cu antigenul inductor al răspunsului imun (Lazăr și colab., 2009). Imunogenitatea nanoparticulelor depinde de dimensiunea particulelor și de încărcătura de suprafață (Zolnik și colab., 2010).

Studiile au arătat că rinichii care prezintă anumite afecțiuni pot modifica efectele toxice ale substanțelor xenobiotice , printr-un mecanism direct de alterare a funcțiilor de excreție și de metabolizare ale rinichiului, dar și printr-un mecanism indirect ,din cauza influenței insuficienței renale asupra metabolismului hepatic (Loghin,2002). Ca de exemplu, la pacienții care suferă de afecțiuni renale, s-a observat că timpii de înjumătățire ai cloramfenicolului și hexobarbitalului sunt prelungiți (Loghin,2002).

Figura 8. Posibile interacțiuni ale QD cu structurile celulare și subcelulare. Mecanismele sugerate care stau la baza răspunsurilor induse de nanoparticule la nivel celular, la niveluri suficient de ridicate sau persistente, pot duce la modificarea funcției țesutului și deteriorării acestuia (Park, 2012).

Aplicații biomedicale

Populația umană este permanent afectată de numeroase maladii și de aceea s-au căutat soluții pentru îmbunătățirea stării de sănătate a organismului uman și reducerea numărului de persoane afectate, prin utilizarea tehnologiilor aplicate la nivel molecular. Astfel, a luat naștere nanomedicina definită de către cercetători ca fiind o stiință interdisciplinară pentru diagnosticarea, prevenirea și tratamentul bolilor, având capacitatea de a permite depistarea precoce și prevenirea bolilor, de a conduce o moleculă bioactivă la locația dorită de acțiune și de a controla eliberarea acesteia pentru a asigura o concentrație optimă la ținta terapeutică într-un interval de timp dorit (Fornaguera și colab., 2017). Aplicațiile în nanomedicină ale nanoparticulelor (Saini și colab., 2010) sunt reprezentate de:

etichete biologice fluorescente,

administrarea de medicamente,

bio-detectarea agenților patogeni,

detectarea proteinelor,

analizarea structurii ADN,

ingineria tisulară,

detectarea tumorii,

separarea și purificarea moleculelor biologice și diferitelor celule,

îmbunătățirea contrastului RMN,

studiile fagocinetice.

Cancerul reprezintă o amenințare majoră pentru sănătate în secolul 21, reprezentând cauza a aproximativ 20% dintre decesele la nivel mondial, afectând o treime din populația globului. Cancerul este un grup complex de maladii care afectează diferite țesuturi, fiind cea mai răspândită formă de neoplazie.

Sistemul imunitar are capacitatea de a recunoaște și de a neutraliza celulele pre-canceroase și canceroase.Cu toate acestea, celulele tumorale au dezvoltat tehnici de supraviețuire împotriva sistemului imunitar. Imunoterapia în cancer dezvoltă strategii pentru depășirea acestor probleme.Aplicațiile nanomedicale în imunoterapia cancerului includ nanodiagnosticul și utilizarea produselor de tip nanobiofarmaceutic. Domeniul nanobiofarmaceutic permite studierea agenților terapeutici bazați pe nanotehnologie și a purtătorilor de medicamente. ADN, ARN, peptidele, proteinele și moleculele mici pot fi utilizate în terapia cancerului atunci când sunt înglobate în nano-purtători (Sheng și colab., 2011).

Mecanismele carcinogenezei, invaziei cancerului și metastazelor sunt încă incomplet elucidate. Astfel, dezvoltarea unei abordări noi pentru detectarea cancerului este urgentă, iar monitorizarea în timp real este crucială în dezvăluirea mecanismelor biologice care stau la baza acesteia. Cu avantajele optice și chimice ale QD, nanotehnologia bazată pe acestea este utilă în construirea unei platforme de imagistică biomedicală pentru studiul comportamentului la cancer. Această revizuire se axează în principal pe aplicarea nanotehnologiei pe bază de QD în studiile de imagistică a celulelor canceroase și micro-mediul tumoral, atât in vivo, cât și in vitro (Fang și colab., 2012). Dezvoltarea nanomedicinei prin studiile efectuate a permis identificarea rolurilor nanoparticulelor de tip QD în terapia cancerului. Aceste aplicații în domeniul oncologiei includ (Shi și colab., 2016):

îmbunătățirea indicelui terapeutic,

furnizarea orientată a medicamentelor într-o manieră specifică țesutului, celulei sau organelor,

îmbunătățirea proprietăților farmaceutice a moleculelor terapeutice,

activarea eliberării susținute a medicamentului,

facilitarea livrării de medicamente biomacromoleculare (de exemplu: ADN, ARN de interferență mic – ARNsi, ARNm și proteine) la locurile de acțiune intracelulare,

co-livrarea de medicamente multiple pentru îmbunătățirea eficacității terapeutice,

transcitoza medicamentelor prin barierele etanșe și endoteliale strânse (de exemplu, tractul gastrointestinal și bariera hemato-encefalică),

diagnosticul și imagistica a cancerului,

vizualizarea livrării medicamentelor prin combinarea acestora cu modalitățile imagistice în timp real,

furnizarea de noi abordări pentru dezvoltarea vaccinurilor sintetice,

dispozitive miniaturizate pentru diagnosticarea cancerului, screeningul și livrarea medicamentelor.

Nanoparticulele sunt folosite din ce în ce mai mult ca o alternativă la antibiotice. Nanotehnologia poate fi deosebit de avantajoasă în tratarea infecțiilor bacteriene. Exemplele includ utilizarea QD pentru prevenirea infecțiilor, în sistemele de administrare a antibioticelor pentru tratarea bolilor, în sistemele de detectare bacteriană pentru a genera diagnosticarea microbiană și în vaccinurile antibacteriene pentru controlul infecțiilor bacteriene. Motivul principal pentru care nanoparticulele sunt considerate ca o alternativă la antibiotice este că acestea pot preveni în mod eficient rezistența la medicamente microbiene în anumite cazuri. Utilizarea excesivă a antibioticelor a dus la apariția a numeroase pericole pentru sănătatea umană, cum ar fi fenomenul de multirezistența la antibiotice (Wang și colab., 2017).

Osteomielita este cauzată în principal de bacterii piogene, dar există și cazuri de infecții cauzate de fungi. Osul este în mod tipic protejat de agenții patogeni externi, astfel încât incidența osteomielitei este scăzută. Dezavantajele majore ale abordărilor convenționale cu antibiotice includ toxicitatea sistemică a antibioticelor și incapacitatea antibioticelor de a ajunge la o concentrație eficientă la locul infecției (Wang și colab., 2017). Utilizarea nanoparticulelor poate fi considerată o soluție în căutarea proprietăților simultane bactericide și osteogene. Eficiența adsorbției medicamentului este direct proporțională cu suprafața specifică a adsorbantului și invers proporțională cu dimensiunea particulelor. Datorită suprafeței lor mari și funcționalității, nanoparticulele pot fi folosite ca transportatori pentru a obține livrarea orientată de medicamente (Wang și colab., 2017).

Capitolul 2. Noțiuni de fiziologie renală

2.1 Homeostazie

Homeostazia presupune menținerea relativ constantă a parametrilor mediului intern. În cazul în care apare o deviere a unui parametru funcțional de la valoarea programată, se declanșează mecanisme de compensare care tind să refacă nivelul inițial. Printre parametrii reglați homeostatic, se numără temperatura, presiunea sangvină, glicemia, sideremia, concentrația ionilor în diferitele compartimente ale organismului.

Sistemul renal (Figura 10) reprezintă principalul sistem excretor, având rolul de a elimina din organism, sub formă de soluție, cea mai mare parte din substanțele care rezultă din dezasimilație (Voiculescu, 1971), dar și xenobioticele polare și metaboliții hidrofili ai xenobioticelor lipofile (Loghin, 2002). Procesul se desfașoară în două faze:

faza de elaborare a soluției – are loc la nivelul rinichilor, constituind funcția de excreție a acestora,

faza de transport – are loc la nivelul căilor urinare.

Figura 10. Schema sistemului renal (după Netter,2005)

La nivelul rinichilor are loc filtrarea plasmei sanguine, eliminarea selectivă prin urină a substanțelor inutile și toxice și păstrarea celor utile în organism. În paralel cu procesul de formare a urinei, sistemul renal reglează volumul plasmatic – contribuind indirect la reglarea presiunii sanguine, concentrația produșilor de catabolism din sânge, concentrația de electroliți (Na+, K+ , HCO și alți ioni) din plasmă și pH-ul plasmatic.Substanțele toxice pot interfera cu aceste funcții. Rinichii îndeplinesc aceaste funcții prin intermediul a trei mecanisme esențiale:

filtrarea glomerulară,

reabsorbția tubulară,

secreția tubulară.

Sensibilitatea rinichilor la substanțelele toxice este atribuită fiziologiei și anatomiei acestora (Loghin,2002):

rinichiul primește 20-25% din fluxul cardiac, de aceea toate substanțele din circulația sistemică ajung la nivelul rinichilor

procesele care intervin în concentrarea urinei, participă și la concentrarea substanțelor xenobiotice în lichidul tubular, putând duce la concentrații renale toxice

compușii insolubili pot precipita în lumenul nefronilor, producând insuficiență renală (Loghin, 2002)

Rinichii (Figura 11) au și funcție endocrină, secretând anumite substanțe biologic active cu rol de hormoni, precum: renina, eritropoietina, calcitriolul. Renina clivează angiotensinogenul în angiotensină I, iar aceasta este convertită în angiotensină II de către enzima de conversie a angiotensinei care se găsește în principal în capilarele pulmonare. Sistemul renină-angiotensină-aldosteron poate fi activat când volumul sângelui scade (ex. hemoragii), sau când scade concentrația serică a NaCl care determină intervenția prostaglandinelor E2 și I2. Eritropoietina reglează eritropoieza din măduva osoasă hematogenă, fiind foarte sensibilă la nivelul scăzut al oxigenului din sângele renal. Calcitriolul este un hormom implicat în metabolismul calciului.

Figura 11. Secțiune frontală prin rinichi (după Țibea, 2002).

2.2 Filtrarea glomerulară

La adult, prin artera renală trec aproximativ 1800 l de sânge/zi. Sângele suferă un proces de filtrare cu o viteză de 130ml/minut, adică 190 l/zi., care constituie urina primară. (Loghin,2002). În corpusculul renal Malpighi al nefronului (Figura 12) are loc filtrarea plasmei sanguine din sângele adus de către arteriola aferentă, procesul fiind favorizat de structura perforată a endoteliului capilar și a foiței viscerale a capsule, cât și de calitățile filtrante ale membranei bazale a endoteliului. Endoteliul capilarelor glomerulare prezintă pori de 200-500 Å prin care apa cu substanțele dizolvate poate părăsi capilarele; acești pori nu permit trecerea elementelor figurate ale sângelui (Flonta și colab., 2007), moleculele cu masă moleculară mare, peste 60000 de daltoni și moleculele legate de proteinele plasmatice (Loghin, 2002).

Figura 12. Structura nefronului (după Netter, 2005).

Ultrafiltratul glomerular, numit și urină primară, este rezultatul unei forțe capabile să separe proteinele de apă și substanțele solvite în plasmă și, în același timp, capabile să forțeze faza lichidă să traverseze membrana filtrantă, semipermeabilă.

Membrana filtrantă are o foarte mare selectivitate în ceea ce privește greutatea moleculelor care o traversează. Astfel, studiile arată că substanțele cu masa moleculară de 5200 Da, ca de exemplu inulina, se filtrează la fel de ușor ca apa, dar din proteinele cu masa moleculară de 69 kDa, cum este albumina, se filtrează doar 0,5% din numărul de molecule. Putem să spunem că membrana glomerulară este aproape impermeabilă pentru proteinele plasmatice, dar are o permeabilitate foarte mare pentru toate celelalte substanțe dizolvate în plasmă (Guyton, 1997). Reținerea proteinelor în plasma sanguină este determinată de către sarcinile lor negative care opresc migrarea printre glicoproteinele încărcate negativ de la nivelul membranei bazale a capilarelor glomerulare.

Dinamica filtrării glomerulare depinde de următoarele forțe :

presiunea de filtrare glomerulară,

presiunea hidrostatică glomerulară,

presiunea hidrostatică a ultrafiltratului glomerular,

presiunea osmotică glomerulară.

Presiunea de filtrare glomerulară este rezultatul diferenței dintre forțele care acționează în sens opus. Presiunea hidrostatică glomerulară determină pătrunderea plasmei sanguine prin membrana filtrantă în capsula Bowman. Acestei forțe i se opun presiunea hidrostatică a ultrafiltratului glomerular și presiunea osmotică glomerulară. Dacă aceste forțe care se opun filtrării se scad din presiunea hidrostatică glomerulară care favorizează filtrarea, rezultă în final o presiune de filtrare glomerulară de aproximativ 10 mmHg (Figura 13).

Figura 13. Forțele care influențează ultrafiltrarea glomerulară (după Marieb, 1998).

Presiunea de filtrare este egală cu diferența dintre presiunea hidrostatică glomerulară, presiunea hidrostatică a ultrafiltratului glomerular și presiunea osmotică glomerulară.

Viteza de filtrare glomerulară depinde de diametrul arteriolelor aferente, ceea ce modifică fluxul sanguin în capilarele glomerulare și presiunea de filtrare. Acest proces se numește autoreglare și sunt implicate două mecanisme intrinseci: mecanismul miogenic și mecanismul renină-angiotensină.

Mecanismul miogenic se referă la capacitatea mușchilor netezi de a se contracta după alungire. Când presiunea arterială medie crește, baroreceptorii arteriolari răspund la tensiunea crescută a peretelui vascular sau la destinderea acestuia și determină constricția arteriolelor aferente, ceea ce induce scăderea fluxului sanguin, cu reducerea presiunii de filtrare. Când presiunea arterială medie scade, se produce dilatarea arteriolelor aferente, care permite un flux crescut al sângelui și menținerea unei presiuni adecvate în capilarele glomerulare.

Mecanismul renină-angiotensină este consecința funcționării aparatului juxta-glomerular (Figura 14), situat între arteriola aferentă și tubul contort distal, fiind alcătuit din celule juxtaglomerulare și celulele maculei densa. Macula densa este o zonă de celule specializate strâns împachetate ce delimitează regiunea tubilor contorți distali de polul vascular glomerular. Celulele juxtaglomerulare funcționează ca baroreceptori intrarenali, detectând variațiile de presiune sanguină, în timp ce, celulele maculei densa acționează ca chemoreceptori ce detectează schimbările de presiune osmotică din urină (Flonta, 2007). Activarea celulelor maculei densa de către o presiune osmotică scăzută a urinei activează dupa sine celulele juxtaglomerulare care eliberează renină. Renina eliberată în sânge determină convertirea angiotensinogenului produs în ficat în angiotensină I care devine apoi angiotensină II sub acțiunea unei enzime localizată în membrana vaselor de sânge, care determină creșterea presiunii arteriale prin stimularea secreției de aldosteron de către corticosuprarenală (Flonta, 2007). Aldosteronul reduce eliminarea ionilor de sodiu din organism prin creșterea reabsorbției sale din sudoare, salivă, suc gastric și de la nivel renal. Cel mai important sistem care influențează eliberarea de aldosteron este sistemul renină-angiotensină (Flonta, 2007).

Figura 14. Aparatul juxtaglomerular-schemă și imagine la microscopul electronic

(după Palmer,2014)

2.3 Reabsorbția la nivelul nefronului

Reabsorbția este un proces de recuperare din ultrafiltratul glomerular a substanțelor necesare organismului. Reabsorbția se desfășoară în două faze: într-o primă etapă are loc extracția activă sau pasivă a substanțelor din filtratul glomerular ajuns la nivelul tubulilor în interstițiul renal, iar în a doua fază, se realizează transportul acestor substanțe din spațiul interstițial în sângele circulant. Cea mai mare parte a reabsorbției are loc la nivelul tubilor proximali, reprezentând 80% din întregul proces. Mecanismul de reabsorbție a ionilor de sodiu presupune acțiunea Na/K ATP-azei din membrana bazală a celulelor epiteliale care elimină activ ionii de sodiu în lichidul interstițial. Se formează un gradient electrochimic ce permite difuzia pasivă a sodiului din filtratul glomerular în celulele epiteliale ale tubului contort proximal (Flonta, 2007). Procesul poartă numele de electroosmoză și este un proces selectiv, efectuat prin activitatea celulelor epiteliale tubulare. Glucoza, aminoacizii, vitaminele și majoritatea cationilor sunt reabsorbiți prin cotransport cu ionii de sodiu, apoi ei trec prin difuzie din celulele epiteliale în lichidul interstițial și capilarele peritubulare (Figura 15).

Figura 15. Reabsorbția la nivelul tubului contort proximal (după Marieb, 1998).

În unele cazuri, reabsorbția este indirectă. De exemplu, ionul HCO nu are un transportor al lui, reabsorbția sa implicând o serie de reacții în lumenul tubului și în epiteliul tubular. Această serie de reacții începe cu secreția ionului de H+ în lichidul tubular printr-un schimb Na+/ H+ si se finalizează cu disocierea H2CO3 în H+ și HCO și apoi HCO iese din celulă în spațiul interstițial prin membrana bazolaterală.

2.4 Secreția tubulară

Toxinele care au trecut din filtratul glomerular, rămân în arteriola eferentă, trec în capilarele peritubulare, apoi în lichidiul interstițial pentru ca în final să ajungă în urină, alăturându-se toxinelor deja existente.

Secreția tubulară se realizează în principal prin transport activ, dar pentru anumiți ioni se desfășoară prin difuzie pasivă. Secreția activă se bazează pe acțiunea a două sisteme de transport: unul pentru acizi(anioni) și unul pentru baze(cationi). Aceste sisteme au specificitate redusă, astfel încât un număr mare de compuși pot fi transportați activ în tubii renali (Loghin,2002). Principalele substante care se secretă sunt: ionii de H+ si ionii de K+. Ionii de hidrogen sunt secretați în lumenul tubului renal împreună cu diferiți compuși organici. Secreția tubulară a H+ este foarte importantă în menținerea controlului pH-ului sanguin. Dacă sângele tinde să devină alcalin, secreția de H+ este redusă. Ionii de K+ sunt secretați atât activ, cât și pasiv în tubul contort distal și colector. În segmentul distal al nefronilor, K+ este secretat prin canalele Ca2+-K+.

Gradul de eliminare a unei substanțe toxice poate fi calculat prin intermediul valorii de clearance renal (Cl) care reprezintă cantitatea de sânge sau plasmă filtrată total de xenobiotic în unitatea de timp (Loghin,2002):

Cl=(Cu*V)/Cp,

unde Cu este concentrația substanței în urină, Cp este concentrația substanței în plasmă, iar V este debitul urinar(ml/min).

Capitolul 3. Aspecte esențiale privind stresul oxidativ

Noțiuni generale

Stresul oxidativ este definit ca fiind dezechilibrul dintre oxidanți și antioxidanți, în favoarea oxidanților, având potențial distructiv și patogenetic, fiind un factor implicat in mecanismul de aparitie a unor afecțiuni și maladii degenerative. Principalul efect al stresului oxidativ asupra celulelor se manifestă prin peroxidarea lipidelor de la nivelul membranei plasmatice, datorită prezenței dublelor legături din structura acizilor grași polinesaturați. Peroxidarea lipidelor membranare afectează structura și funcțiile membranei plasmatice și a membranelor organitelor celulare. Printre efectele cauzate se numără: modificarea potențialele transmembranare, fluxurilor ionice și transportului transmembranar, sunt inactivați receptorii de membrană și sunt dereglate căile de semnalizare. În prezent, cercetătorii în domeniu susțin ipoteza conform căreia stresul oxidativ este implicat în apariția unor maladii neurodegenerative, moartea celulară având loc prin apoptoză, sub influența speciilor reactive de oxigen (Loghin, 2002).

Oxidanții se formează ca un produs normal al metabolismului aerobic, dar pot fi produși la viteze ridicate în condiții patofiziologice (Sies, 1997). Ca de exemplu, în cazul diabetului zaharat de tip 2, SRO pot induce inactivarea mecanismelor de semnalizare dintre receptorii insulinici și sistemul de transport al glucozei, ceea ce duce la insulinorezistență.

O altă condiție patologică determinată de către stresul oxidativ este în cazul pacienților cu probleme cardiovasculare asociate cu boală renală cronică. Stresul oxidativ a fost legat din ce în ce mai mult de incidența crescută a problemelor cardiovasculare la pacienții cu boală renală cronică, mai ales că factorii de risc cardiovasculari tipici precum sedentarismul, obezitatea, fumatul, starea fiziologică imunodepresivă, par să nu poată explica morbiditatea și mortalitatea cardiovasculară uriașă la acest grup de populație. În ceea ce privește stresul oxidativ ca factor de risc pentru apariția problemelor cardiovasculare la pacienții cu boală cronică renală, acesta este crescut la pacienții cu insuficiență renală ca urmare a creșterii activității oxidante și a capacității antioxidante reduse. Inflamația, care este prezentă și în boala cronica renală, amplifică procesul de generare a oxidanților (Kao și colab., 2010).

3.2. Radicali liberi

SRO sunt produse de către organismele vii ca rezultat al metabolismului celular normal. La concentrații ridicate, acestea produc modificări grave ale componentelor celulare, cum ar fi lipidele și proteinele din structura membranei plasmatice, dar și modificări la nivelul materialului genetic (Birben și colab., 2012). Din punct de vedere chimic, SRO pot fi împărțite în două grupe: radicalii liberi și non-radicalii.

Radicalii liberi sunt substanțe care derivă din compuși oxidați incomplet, care au trecut prin arderi parțiale, având în structura lor grupări de oxigen capabile să inițieze la suprafața membranelor celulare sau chiar în interiorul celulelor reacții agresive de oxidare (Foia, 2012).

Radicalii liberi sunt produși în mod natural in vivo, atât prin reacțiile normale de metabolism celular ,cât și ca rezultat al procesului unor boli sau prin activități xenobiotice, în urma acceptării sau pierderii unui electron. Radicalii liberi au potențialul de a provoca numeroase modificări ale țesuturilor, degradări ce sunt asociate cu toxicitatea și procesele de boală,. Astfel, relația cauză-efect între radicali și boală a fost dificil de stabilit. În ultimii ani, îmbunătățirea metodelor analitice de laborator, precum și întelegerea faptului că efectele subtile induse de către radicalii liberi la nivel molecular sunt implicate în modularea semnalizării celulare, au condus la creșterea capacității de întelegere a rolului acestor specii reactive în mecanismele toxice și în procesele de îmbolnăvire.( Kehrer,2010)

Radicalii liberi pot fi de două tipuri:

endogeni – sunt radicali liberi care se formează în organism pe parcursul fenomenelor metabolice sau fiziologice, precum fagocitoza, catabolismul incomplet, producerea de energie, detoxifiera hepatica,

exogeni – sunt radicali liberi care pătrund în organism din mediul exterior: fum de țigară, aer poluat cu diferite substanțe chimice, medicamente, alimente, apă de robinet

Cei mai cunoscuți radicali liberi de origine endogenă sunt prezentați în tabelul 2.

Tabelul 2. Oxidanții endogeni majori (Birben și colab., 2012).

Mitocondria reprezintă cea mai importantă sursă endogenă de radicali liberi prin reacțiile care se desfășoară la nivelul lanțului respirator mitocondrial. Mitocondria este un organit complex, specializat în respirația celulară și fosforilarea oxidativă, cu rol important în energetica celulară și care prezintă un sistem genetic propriu și, implicit, mecanisme specifice de sinteză proteică. Principala funcție biologică a mitocondriilor este fosforilarea oxidativă, procesele oxidative și de fosforilare fiind catalizate de cinci complexe enzimatice, patru complexe respiratorii și un complex ATP-azic:

I – NADH-CoQ-reductaza: oxidează NADH și reduce CoQ; constituit din FMN, Fe neheminic, acid sulfuric, CoQ, fosfolipide;

II – succinat CoQ-reductaza: oxidează succinatul reducându-l la fumarat și reduce CoQ; constituit din FAD (flavin adenin dinucleotid), Fe neheminic, citocrom b, fosfolipide;

III – CoQ H2-citocrom c-reductaza: reoxidează CoQ și reduce citocromul c; format din citocromul b, c1, Fe neheminic, acid sulfuric, coenzima Q, fosfolipide;

IV – citocrom oxidaza: transferă electronul la oxigen, reducând citocromul c, rezultatul fiind formarea apei; din punct de vedere chimic este format din citocrom a, a3, Cu și fosfolipide.

V – ATP-aza mitocondrială: intervine în etapele finale ale fosforilării oxidative, este oligomicinsensibilă și în stare cuplată funcționează ca o ATP-sintază sau kinază.

La nivelul mitocondriei, în urma reacției de reducere a oxigenului molecular de către citocromii respiratori celulari se produce în jur de 2% din cantitatea totală de ioni superoxid, peroxid de hidrogen și radical hidroxil (Foia, 2012). Pe lângă mitocondrii, care reprezintă principala sursă de producere a radicalilor liberi de origine endogenă, exista și alte surse de producere a radicalilor liberi, cum ar fi: fagocitele și peroxizomii.

Celulele fagocitare ale sistemului imunitar sunt reprezentate predominant de către macrofage și neutrofile. Aceste celule reprezintă efectoarele celulare majore nespecifice ale apărării și inflamației oraganismului. Prin capacitatea lor de a fagocita substanțe străine și de a elibera mediatori citotoxici și proinflamatori, neutrofilele și macrofagele protejează organismul de o gamă largă de agenți patogeni și xenobiotici și joacă un rol central în răspunsul gazdei la leziuni tisulare. Totuși, fagocitele prezintă si un potențial citotoxic semnificativ. Mulți dintre mediatorii eliberați de către fagocite pentru a proteja gazda au efecte distrugătoare asupra țesutului normal. Astfel încât, producerea de concentrații peste limita normală sau eliberarea neregulată a mediatorilor citotoxici poate conduce la apariția de leziuni de țesut (Laskin și colab., 2010).

Peroxizomii sunt organite celulare de dimensiuni mici, care conțin enzime implicate într-o varietate de reacții metabolice, inclusiv in metabolismul energetic. Peroxizomii inițial au fost definiți ca organite care participă la reacții de oxidare care conduc în final la producerea de peroxid de hidrogen. Deoarece peroxidul de hidrogen este dăunător celulei, peroxizomii conțin de asemenea enzima antioxidantă catalază, care descompune peroxidul de hidrogen fie prin transformarea sa în apă, fie prin utilizarea acestuia pentru a oxida un alt compus organic. O varietate de substraturi sunt descompuse prin astfel de reacții oxidative în peroxizomi, incluzând acid uric, aminoacizi și acizi grași (Cooper, 2000). Ca de exemplu, oxidarea unui acid gras este însoțită de producerea peroxidului de hidrogen (H₂O₂) din oxigen. Peroxidul de hidrogen este descompus de către catalază, fie prin conversie în apă, fie prin oxidarea unui alt compus organic (desemnat AH₂) (Cooper, 2000):

O O

|| ||

R-CH₂-CH₂-C-S-CoA +O₂ R-CH=CH-C-S-CoA + H₂O₂

2H₂O₂ 2H₂O + O₂

H₂O₂ +AH₂ 2H₂O + A

Enzime antioxidante

Substanțele care neutralizează efectul negativ al radicalilor liberi sunt grupate în general în sistemul de apărare antioxidantă. Acest sistem cuprinde un număr mare de elemente, celulele conținând o varietate de substanțe capabile să neutralizeze multiple SRO pentru a putea asigura o protecție maximă a țesuturilor normale (Foia, 2012).

Aceste substanțe pot fi grupate în două categorii:

cu acțiune enzimatică (enzime antioxidante),

cu acțiune non-enzimatică.

Din categoria substanțelor cu acțiune non-enzimatică cu rol în apărarea împotriva radicalilor liberi fac parte: vitaminele A și C, glutationul (GSH) și acidul ascorbic (Figura 16).

Figura 16. Structura chimică a substanțelor cu acțiune non-enzimatică cu rol antioxidant (după Birben și colab., 2012).

Enzimele antioxidante sunt considerate o componentă extrem de importantă a sistemului ntural de apărare antioxidantă. Enzimele antioxidante sunt capabile să stabilizeze sau să neutralizeze radicalii liberi înainte ca aceștia să atace componentele celulare (Krishnamurthy și Wadhwani, 2012).

Studiile recente au demonstrat existența unei strânse legături între radicalii liberi și numeroase afecțiuni umane, printre care se numără cancerul, diabetul, accidentele vasculare cerebrale, infarctul miocardic, ateroscleroză. Prin diminuarea timpului de expunere la radicalii liberi și prin creșterea consumului de alimente bogate în enzime antioxidante sau suplimente de enzime antioxidante, potențialul organismului uman de a reduce problemele de sănătate legate de efectele toxice ale radicalilor liberi. Enzimele antioxidante sunt, prin urmare, absolut esențiale pentru păstrarea sănătății și bunăstării celulare, dar și pentru menținerea integrității organismului uman (Krishnamurthy și Wadhwani, 2012).

Catalaza

Catalaza (CAT) este o enzimă universal întalnită în toate microorganismele aerobe, în celulele animale și vegetale. Catalaza are rolul fiziologic major de a determina descompunerea peroxidului de hidrogen și are un rol protector față de radiațiile ionizante (Dumitru și Iordachescu, 1974).

În celulă, enzima este localizată aproape exclusiv în peroxizomii majorității celulelor, fiind utilizată ca marker al acestui compartiment celular (M. Hampel,2016) și într-o cantitate mult mai redusă în mitocondrii și reticulul endoplasmic, reducând nivelul peroxidului de hidrogen. De aceea, in vivo, H2O2 generat nu poate fi substrat al catalazei decât dacă acesta difuzează în peroxizomi. CAT descompune peroxidul de hidrogen fie prin transformarea sa în apă, fie prin utilizarea acestuia pentru a oxida un alt compus organic. O varietate de substraturi sunt descompuse prin astfel de reacții oxidative în peroxizomi, incluzând acid uric, aminoacizi și acizi grași (Cooper, 2000).

Catalaza acționează în conversia peroxidului de hidrogen care este un agent oxidant puternic, cu caracter toxic pentru celule, fiind răspunzător pentru inhibarea enzimelor din ciclul Calvin la nivelul celulelor vegetale care realizează fotosinteză.

2H₂O₂ O₂ +2H₂O

Din punct de vedere chimic, catalaza este alcătuită din patru subunități proteice, fiecare dintre ele conținând o moleculă de hem (care conține Fe2+) si o moleculă de NADPH (Chelikani și colab., 2004). Mecanismul de acțiune al catalazei cuprinde două etape (Birben și colab., 2012):

H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E(.+)

H2O2 + O=Fe(IV)-E(.+) → H2O + Fe(III)-E + O2

Glutation S-transferaza

Glutation S-transferazele (GST) reprezintă un grup important de enzime care catalizează o diversitate de reacții implicate în detoxifierea organismului, prin îndepărtarea compușilor xenobiotici, cum ar fi produsele farmaceutice și poluanții de mediu. Deși au apărut numeroase recenzii despre această familie de enzime importante, continuă să existe o confuzie considerabilă în domeniu în ceea ce privește denumirea și clasificarea acestor gene și a derivaților (Nebert și colab., 2004).

Baza fundamentală pentru toate activitățile catalitice ale GST este capacitatea acestor enzime de a scădea pKa din grupul sulfhidril al glutationului redus (GSH) de la 9,0 în soluție apoasă la aproximativ 6,5 când GSH este legat la situsul activ. GSH există ca anion tiolat la pH neutru când este complexat cu enzima GST (Nebert și colab., 2004). Aldehidele reprezintă compușii finali ai evoluției radicalilor liberi și peroxizilor în organism, dar acești compuși foarte reactivi, sunt descompuși de GST, conform reacției (Leaver și colab., 1998).

GSH + R-CH=CH-CO-R R-CH(SG)-CH2-CO-R

Glucozo 6-fosfat dehidrogenaza

Glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (G6PDH) este prima enzimă citosolică din calea metabolică a pentozo-fosfaților care este implicată în menținerea nivelului factorului coenzimatic NADPH.

glucozo-6-fosfat + NADP+ + H2O 6-fosfoglucono-δ-lactona + NADPH + H+

Deficitul de glucoză-6-fosfat dehidrogenază este cea mai obișnuită deficiență enzimatică la om, afectând 400 de milioane de oameni din întreaga lume. Are o frecvență ridicată la persoanele de origine africană, asiatică și mediteraneană (Schick și colab., 2017). Este o tulburare genetică care apare aproape exclusiv la bărbați. Această afecțiune afectează în principal eritrocitele din sânge, care au rolul de a transporta oxigen din plămâni în țesuturile din organism. La persoanele afectate, un defect genetic al acestei enzime determină hemoliza, adică distrugerea prematură a hematiilor. Cea mai frecventă problemă medicală asociată cu deficiența de glucoză-6-fosfat dehidrogenază este anemia hemolitică. Totuși, se pare că aceasta deficiență conferă protecție împotriva agentului malariei – Plasmodium falciparum (Wajcman și colab., 2004.)

Glutation peroxidaza

Glutation peroxidaza (GPx) face parte dintr-o familie de enzime ce catalizează degradarea hidroxiperoxizilor organici rezultați din procesele metabolice normale și asigură protecția proteinelor, lipidelor și acizilor nucleici fața de acțiunea moleculelor oxidante, utilizând ca donator de electroni glutationul sau, în anumite cazuri, tioredoxina sau glutaredoxina. (Foia, 2012). Această enzimă este mai activă decât catalaza în descompunerea H2O2 in hematii. Funcția biologică principală a GPx, de a reduce hidroperoxizii lipidici la alcoolii lor corespondenți și a peroxidului de hidrogen la apă, se desfășoară conform reacțiilor (Muller și colab., 2007).

R-OOH + 2GSH R-OH + GSSG + H2O2

2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O,

în care R-OOH pot fi H2O2 sau orice peroxid derivat din acizi nucleici, acizi grași polinesaturați, steroizi.

GPx este o enzimă seleniu dependent, ce se găsește in citosol. La mamifere, seleniul își exercită funcțiile fiziologice ca selenocisteină încorporată în lanțul polipeptidic al seleno-proteinelor. Din cele 30 de selenoproteine ​​prezente la om, enzimologia familiei de glutation peroxidase a fost studiată cel mai mult (Banning și colab., 2008).

3.3.5 Glutation reductaza

Glutation reductaza (GRed) este o flavoproteină homodimerică oxidoreductoare cu rol in transferul atomilor de hidrogen de la donor la acceptor, fiind implicată în respirația tisulară. Este o enzimă centrală a apărării antioxidante celulare și determină reducerea glutationului din forma disulfid (GSSG) la cea sulfihidril (GSH), glutationul redus fiind un important antioxidant celular (Meister, 1993).

GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+

Partea a II-a

Studiul experimental

Capitolul 1. Scopul și obiectivele studiului

Dezvoltarea nanotehnologiei și a diferitelor nanomateriale a deschis posibilitatea utilizării nanoparticulelor de tip quantum dots în diferite aplicații biomedicale, însă efectele citotoxice induse de către acestea nu sunt pe deplin elucidate, cu toate că s-au efectuat numeroase studii de specialitate. În momentul de față se cunosc destul de puține lucruri despre reacțiile fiziologice pe care le produce administrarea de QD de siliciu la nivelul rinichilor, și pentru evaluarea acestei toxicități se realizează studii in vitro, rezultatele fiind apoi extrapolate in vivo. În prezent se urmărește creșterea biocompatibilității QD, iar acest lucru se poate realiza prin substituția metalelor grele din structura nanoparticulelor cu siliciul, QD de siliciu fiind considerate mai puțin daunătoare decât cele care conțin metale toxice (Bertin și Averbeck, 2006; Vinceti și colab., 2001).

Omul este supus în permanență agresiunii factorilor exogeni, precum și agresiunii induse de către dezechilibre ale propriului metabolism. Rinichiul reprezintă o țintă principală pentru numeroși factori externi de agresiune, printre care se numără medicamente cu efect citotoxic la nivel renal, agenți patogeni de tipul microorganismelor care produc diferite tipuri de infecții, dezechilibrele hidroelectrolitice, de aceea este necesară realizarea de fiecare dată a unui studiu care să vizeze elucidarea mecanismelor care induc efecte dăunătoare la nivelul rinichilor.

În acestă lucrare de cercetare, s-a urmărit înțelegerea efectelor stresului oxidativ indus de QD de siliciu, la nivel renal. Este cunoscut faptul că nanoparticulele de tip QD de siliciu au o toxicitate redusă și sunt mult mai biocompatibile, și de aceea, această lucrare de cercetare vizează evaluarea acestor nanoparticule de siliciu in vivo în vederea utilizării lor fără a cauza modificări fiziologice care pot produce afecțiuni grave.

Studiul de față urmărește investigarea efectelor generate la nivel renal cu posibilitatea ulterioară de a utiliza aceste nanoparticule de tip QD de siliciu în nanomedicină, în special pentru tratarea diferitelor forme de cancer prin administrarea țintită a medicamentelor, astfel să se evite distrugerea celulelor normale, precum și utilizarea acestora în bioimagistică, datorită proprietăților lor optice remarcabile.

Capitolul 2. Materiale și metode

2.1 Design-ul experimentului

Quantum dots de siliciu (Si/SiO2 QD) folosite în acest studiu au fost obținute în cadrul Institutului Național de Fizica Laserilor, Plasmei și Radiațiilor, București-Măgurele, România.

Proprietățile optice ale QD de siliciu pot varia semnificativ în funcție de tehnica de sinteză și de condițiile de preparare. Printre metodele de sinteză, tehnica ablației laser este o metodă versatilă pentru pregătirea și în mare măsură adecvată pentru sinteza nanoparticulelor de Si funcționale, de înaltă puritate (Grigoriu și colab., 2005). Metoda ablației laser se caracterizează prin utilizarea unui fascicul laser ce acționează în regim pulsat asupra unei ținte. Pentru o energie incidentă mai mare decât o valoare de prag specifică fiecărei substanțe, rezultatul constă în evaporarea locală (ablație) a materialului iradiat. Se formează o plasmă de ablație care conține specii precum atomi, ioni și eventual molecule. Plasma se extinde în direcție perpendiculară pe țintă realizând, în acest mod, transferul de material spre un suport plasat corespunzător (Coman, 2013).

Nanoparticulele utilizate în studiul de față au fost sintetizate prin metoda ablației laser descrise de studiile precedente (Grigoriu și colab., 2004, 2005) utilizând o cameră de oțel inoxidabil. Heliu de înaltă puritate (99,99%) a fost pompat în continuu cu o rată de 1 L/minut, menținându-se presiunea în interiorul camerei la 550 mbar. Fasciculul laser a fost concentrat asupra unei ținte de siliciu din interiorul camerei, folosindu-se o densitate a energiei de 8 J/cm2. Setările laserului Nd:YAG au fost următoarele: lungimea de undă – 355 nm, durata pulsului – 5 nanosecunde, rata de repetiție – 10 Hz, și energia/puls – 60 mJ. Apoi, nanoparticulele au fost conduse de fluxul de gaz către un filtru Millipore cu dimensiunea porilor de 100 nm plasat la o distanță de 5 cm față de ținta de siliciu. Nanoparticulele colectate au reacționat cu oxigenul din aer și un strat de dioxid de siliciu s-a format pe suprafața acestora, rezultând Si/SiO2 QD (Figura 17).

Figura 17. Imaginea tipică de microscopie electronica de transmisie a unui cluster de QD de siliciu (Grigoriu, 2005).

În cadrul studiului experimental, s-au utilizat șoareci din linia Swiss. Masculi adulți cu o greutate de 25 ± 3 g, crescuți în cadrul Laboratorului de Animale al Universității de Vest „Vasile Goldiș” din Arad, au fost lăsați două zile pentru a se adapta la condițiile impuse, menținându-se o dietă standard de pelete și apă ad libitum la o temperatură de 20-25°C în prezența unui ciclu de lumină/întuneric de 12 ore pe tot parcusul experimentului. Hrana a fost retrasă cu o zi înainte de a avea loc sacrificarea șoarecilor. Modul de operare asupra animalelor a fost adaptat în funcție de Ghidul Etic Internațional pentru îngrijirea animalelor de laborator.

În cadrul acestui experiment s-au folosit 20 de animale, care au fost împărțite în 4 grupuri, în funcție de cantitatea de QD de siliciu folosită, și anume:

V1 – reprezintă grupul control care a primit ser fiziologic;

V2 – reprezintă grupul în cadrul căruia s-a administrat 1 mg QD de siliciu/kg corp;

V3 – reprezintă grupul în cadrul căruia s-au administrat 10 mg QD de siliciu/kg corp;

V4 – reprezintă grupul în cadrul căruia s-au administrat 100 mg QD de siliciu/kg corp.

După 24 de ore de la injectarea nanoparticulelor, șoarecii au fost sacrificați prin dislocare cervicală, iar probele de țesut renal au fost preluate și utilizate pentru analize biochimice.

2.2 Determinări biochimice

2.2.1 Obținerea lizatului celular pentru determinări enzimatice

Țesuturile conservate la -80oC au fost lăsate să se dezghețe pe gheață. S-au cântărit 0,1 mg țesut renal la 1 ml soluție tampon TRIS-HCl 0,1 M, EDTA 5 nM (pH=7,4), realizându-se în omogenat în raport de 1:10 (m/V). După ce au fost introduse în tuburile Eppendorf câte 2 bile metalice s-a vortexat și s-a realizat ruperea membranelor celulare cu ajutorul omogenizatorului cu bile RETHSCH MM301 pe parcusul a două omogenizări de câte 2 minute desfășurate la o frecvență de 30 vibrații/secundă, cu repaus pe gheață de 5 minute între cele două mixări. Omogenatul obținut s-a transferat într-un nou tub pentru a putea îndepărta bilele. S-a incubat o oră la 4oC și s-a centrifugat la 10000 rpm/20 minute/4oC. Supernatantul rezultat a fost transferat în tuburi noi și alicotat, fiind folosit imediat pentru determinări biochimce sau a fost conservat la -80oC pentru determinări ulterioare.

2.2.2 Determinarea concentrației proteice prin metoda Lowry

Metoda folosită este o variantă a metodei clasice a lui Lowry. Grupările peptidice formează cu ionii de cupru (Cu2+), în mediu alcalin, un complex colorat albastru care are un maxim de absorbție la λ=650nm.

Reactivi și soluții necesare:

1. reactivul alcalin de cupru preparat din 10 părți reactiv A si o parte B, unde reactivul A este o soluție Na2CO3 anhidru 10% preparată în soluție NaOH 0,5 N, iar reactivul B este o soluție de CuSO4x5H2O 0,5% preparată în soluție citrat de sodiu 1%.

2. reactiv Folin-Ciocâlteu; reactivul de lucru s-a obținut prin diluția acestuia 1:10 în apă distilată

3. soluție albumină serică bovină (BSA) 0,01%

4. extract proteic total

Un volum de 200 μl din fiecare extract proteic total (EPT) (diluat 1/100) a fost amestecat cu un volum egal de reactiv alcalin de cupru. Amestecul astfel rezultat a fost apoi lăsat în repaus 10 minute la temperatura camerei. Dupa expirarea timpului s-au adăugat 600 μl de reactiv de lucru Folin-Ciocâlteu, amestecul lăsându-se 10 minute la 50˚C. După răcirea probelor la temperatura camerei s-a citit absorbanța acestora la 660 nm față de apă.

Pentru determinarea concentrației proteice este necesară trasarea unei curbe de etalonare. Se folosesc soluții BSA de diferite concentrații cunoscute care au fost supuse aceluiași tratament (reactiv alcalin de cupru, reactiv Folin-Ciocâlteu), a căror absorbanță a fost citită la 660nm. În tabelul următor (Tabelul 3) este prezentată schema de lucru:

Tabelul 3. Schema volumelor utilizate pentru obținerea curbei de etalonare cu BSA.

Se trasează grafic variația densității optice (D.O.) la 660 nm (pe ordonată) în funcție de concentrația proteică (pe abscisă). Se determină ecuația dreptei care trece la distanțe egale între cele 6 puncte și R2.

2.2.3 Dozarea activității glutation 6-fosfat dehidrogenazei

Reacția catalizată de către glutation 6-fosfat dehidrogenaza este următoarea:

glucozo-6-fosfat + NADP+ + H2O 6-fosfoglucono-δ-lactona + NADPH + H+

Reactivi și soluții necesare:

soluție tampon HEPES 50 mM, pH 7.5

soluție glucozo-6-fosfat 40mM

NADP 30 mM preparat în soluție Na2CO31%

extractul proteic cu activitate glucozo 6 fosfat dehidrogenazică

În cele două cuve s-au pipetat următoarele soluții, conform tabelului următor(Tabel 4)

Tabel 4. Schema volumelor utilizate pentru obținerea soluției finale.

Citirea densității optice la 340 nm s-a făcut la 25C, timp de 5 minute la un interval de 30 secunde de la adăugarea soluției de NADP 30 mM. Pentru calcularea rezultatelor s-a trasat grafic variația D.O. la 340 nm (pe ordonată) în funcție de timp (pe abscisă). S-a determinat porțiunea de curbă în care viteza crește proporțional în timp. S-a calculat ΔD.O.340nm/min de pe această porțiune a curbei. Activitatea enzimatică se calculează astfel:

AE (U/ml) = dA/min x 2,411 x diluția; unde 2,411 este un factor specific acestei metode.

Activitatea specifică a tuturor enzimelor determinate s-a obținut împărțind numărul U/ml la valoarea concentrației proteice, fiind exprimată în final în U/mg. Pentru realizarea determinărilor activităților enzimatice s-a folosit un spectrofotometru Specord 200 Plus.

2.2.4 Dozarea activității catalazei

Catalaza (peroxid de hidrogen: peroxid de hidrogen oxidoreductaza) are o funcție dublă, deoarece catalizează reacțiile:

2 H2O2 → 2 H2O + O2

ROOH + DH2 → ROH + D + H2O

Mersul reacției enzimatice este urmarit spectrofotometric la 240 nm prin dispariția H2O2 din mediu. O unitate enzimatică descompune 1 μmol de H2O2 într-un minut la 25˚C si pH 7.

Reactivi și soluții necesare:

soluție tampon K2HPO4/KH2PO4 0,1 M, pH 7.

soluție H2O2 0,059M

extract proteic cu activitate catalazică

În cuvele de cuartz ale spectrofotometrului “proba” și, respectiv, “martor” s-au pipetat următorii reactivi, omogenizându-se bine înainte de introducerea în spectrofotometru(Tabel 5)

Tabel 5. Schema volumelor utilizate pentru obținerea soluției finale

Absorbanța probei la 240 nm s-a citit în funcție de martor timp de 1 minut de la adăugarea peroxidului de hidrogen, intervalul de citire fiind de 25 secunde.

Pentru calcularea rezultatelor s-a reprezentat grafic variația D.O. la 240 nm (pe ordonată) în funcție de timp (pe abscisă). S-a determinat porțiunea de curbă în care viteza crește proporțional în timp. S-a calculat ΔD.O. 240 nm/minut de pe această porțiune a curbei. Activitatea enzimatică s-a calculat astfel:

A.S. (Kat/ mg) = x log x ,

unde E1 este valoarea absorbanței inițiale și E2 este valoarea absorbanței finale.

Activitatea specifică este exprimată în K/mg proteină și s-a calculat împărțind valoarea activității enzimatice (K) la concentrația proteică determinată prin metoda Lowry.

2.2.5 Dozarea activității glutation peroxidazei

Glutation peroxidazele sunt enzime ce catalizează reacția de tipul:

H2O2 + 2GSH GSSG + 2 H2O,

precum și reacția în care glutationul reduce și alți peroxizi în afara peroxidului de hidrogen:

R-OOH + 2GSH R-OH +GSSG

Metoda aleasă pentru determinarea activității enzimei se bazează pe monitorizarea formării GSSG, care este redus continuu prin adăugarea unui exces de glutation reductază, generând un nivel constant de GSH. Determinarea cantitativă a GSSG format se face indirect prin măsurarea oxidării concomitente a NADPH la λ=340 nm, în conformitate cu reacția catalizată de glutation reductază:

GSSG + 2NADPH 2GSH + 2 NADP+

Reactivi și soluții:

1. soluție tampon TRIS-HCl 1M, EDTA 5mM, pH 8

2. soluție GSH 0,1M

3. soluție NADPH 2mM

4. soluție de terbutil hidroxiperoxid (tBHP), 7mM

5. soluție glutation reductazică (Sigma, G3664)

6. extract proteic cu activitate glutation peroxidazică

Reacția s-a desfășurat în cuva spectrofotometrului. În cuvele “probă” și “martor” s-au pipetat următoarele soluții, după care s-a realizat o bună omogenizare(Tabel 6):

Tabel 6. Schema volumelor utilizate pentru obținerea soluției finale

După adăugarea EPT se omogenizează bine și se lasă în repaus la temperatura camerei timp de 5 minute. Apoi se adaugă doar în amestecul “probă” soluția de terțbutil hidroxiperoxid 7 mM. Citirea densității optice la 340nm s-a făcut la 25˚C timp de 5 minute de la adăugarea soluției de tBHP, la un interval de citire de 15 secunde. D.O. la 340nm caracteristică NADPH scade în timpul reacției pe măsură ce coenzima se oxidează.

Pentru calcularea rezultatelor obținute în urma reacției de dozare a activității glutation peroxidazei, a fost trasată grafic variația D.O. la 340nm (pe ordonată) în funcție de timp (pe abscisă). S-a determinat porțiunea de curbă în care viteza crește proporțional în timp, iar apoi s-a calculat ΔD.O.340nm/min de pe această porțiune a curbei. Activitatea enzimatică a fost calculată astfel:

A.S. (U/mg) =

unde 16,077 reprezintă un factor specific acestei metode.

2.2.6 Dozarea activității glutation reductazei

Glutation reductaza este enzima care catalizează reacția de reducere a glutationului oxidat, cu participarea NADPH:

GSSG + 2NADPH → 2GSH + 2NADP+

Viteza de reacție este determinată de scăderea D.O. la 340 nm ca urmare a oxidării NADPH, compusul care absoarbe la 340 nm. O unitate enzimatică oxidează 1 μmol de NADPH într-un minut la 25șC, în condiții definite.

Reactivii și soluțiile folosite au fost următoarele:

1. tampon K2HPO4/KH2PO4 0,1M, pH 7.7

2. soluție NADPH 2mM

3. soluție GSSG 33mM

4. extract proteic cu activitate glutation reductazică

Reacția s-a desfășurat în cuva spectrofotometrului. In cuvele “probă” și “martor” s-au pipetat următoarele soluții, după care s-a realizat o bună omogenizare(Tabel 7)

Tabel 7. Schema volumelor utilizate pentru obținerea soluției finale

Citirea densității optice la 340 nm s-a făcut la 25˚C timp de 5 minute, la un interval de 15 secunde, de la adăugarea soluției de NADPH.

Pentru calcularea rezultatelor obținute în reacția de dozarea a activității glutation reductazei, s-a trasat grafic variația D.O. la 340 nm (pe ordonată) în funcție de timp (pe abscisă). S-a determinat porțiunea de curbă în care viteza crește proporțional în timp. S-a calculat ΔD.O.340 nm/minut de pe această porțiune a curbei.

Activitatea specifică s-a calculat conform următoarei formule:

A.S. (U/mg) = ,

unde 6,430 este un factor specific acestei metode.

2.2.7 Dozarea activității glutation S-transferazei

Glutation S-transferaza (GST) este o enzimă ce se întalnește la toate organismele și care catalizează reacția în care este implicat GSH și un substrat electrofil:

GSH + R-X → G-S-R + HX

Mersul reacției enzimatice a fost urmărit spectrofotometric prin creșterea absorbanței la 340 nm. Metoda folosește un substrat electrofil de tipul clor dinitrobenzenului, reacția catalizată de GST fiind:

C6H3Cl (NO2)2 + GSH GS- C6H3 (NO2)2 + HCl

Reactivi și soluții:

1.tampon K2HPO4/KH2PO4, pH 7,1

2.soluție acoolică de 1-clor, 2,4- dinitrobenzen (CDNB) 25mM

3.soluție de glutation redus (GSH) 20mM

4.extract proteic cu activitate glutation S-tranferazică

Reacția s-a desfășurat în cuva spectrofotometrului. In cuvele “probă” și “martor” s-au pipetat următoarele soluții, după care s-a realizat o bună omogenizare(Tabel 8)

Tabel 8. Schema volumelor utilizate pentru obținerea soluției finale

Citirea densității optice la 340 nm s-a făcut la 25˚C timp de 5 minute, la un interval de 10 secunde, de la adăugarea soluției de EPT.

Pentru calcularea rezultatelor obținute în reacția de dozarea a activității glutation S-transferazei, s-a trasat grafic variația D.O. la 340 nm (pe ordonată) în funcție de timp (pe abscisă). S-a determinat porțiunea de curbă în care viteza crește proporțional în timp. S-a calculat ΔD.O. 340 nm/min de pe această porțiune a curbei.

Activitatea specifică a fost calculată după următoarea relație:

A.S. (U/mg) = ,

unde 2,083 reprezintă un factor specific acestei metode.

Capitolul 3. Rezultate si discuții

3.1 Analiza efectului indus de QD la nivelul enzimelor dependente de glutation

Glutationul este un tripeptid, fiind sintetizat din glutamat, cisteină și glicină prin intermediul enzimelor γ-glutamil-cistein sintetaza și glutation transferaza. Glutationul este cel mai abundent compus antioxidant existent la nivel celular, având o mare capacitate de protecție bazată pe oxidarea grupărilor tiol din structura resturilor de cisteină (Meister, 1983). Statutul redox al glutationului este reglat, parțial, de către glutation peroxidaza și printr-o reacție catalizată de glutation reductază, obținându-se glutation oxidat (GSSG). Glutationul este conjugat la substraturi atât prin acțiunea glutation S-transferazei, cât și prin reacții non-enzimatice. Glutationul conjugat este excretat din celule cu ajutorul familiei de transportatori ABC (ATP binding cassette) (Figura 18) (Moyer, 2010).

Toate organismele vii depind de transportul primar și secundar prin membrană pentru obținerea de elemente esențiale pentru supraviețuire, precum și pentru eliminarea compușilor toxici pentru celule. Transportul primar se bazează pe energia furnizată de ATP și cuprinde o familie de proteine de membrană cunoscute sub numele de transportori ABC (Wilkens, 2015). Proteinele ABC sunt alcătuite dintr-un domeniu transmembranar format din șase helixuri transmembranare și dintr-un domeniu de legare a nucleotidelor. Cei mai cunoscuți transportori ABC sunt P-glicoproteina și proteina MRP (multidrug resistance-associated protein) (Loghin, 2002).

Figura 18. Calea de producere și de transport a glutationului (după Moyer, 2010)

Rolurile fiziologice ale glutationului au fost mult studiate de către cercetători și au fost descrise ca fiind esențiale pentru organismele mamaliene. Aceste funcții ale tripeptidului sunt prezentate în următorul tabel (Tabelul 9).

Tabel 9. Rolurile fiziologice ale glutationului (după Wu, 2004)

În cadrul acestei lucrării de cercetare, s-au realizat o serie de determinări biochimice pentru a urmări nivelul enzimelor antioxidante dependente de glutation și modul în care acestea își modifică concentrația sub influența administrării nanoparticulelor de tip QD de siliciu, pentru fiecare dintre cele patru probe cu care s-a lucrat. Aceste enzime antioxidante dependente de glutation sunt: glutation S-transferaza, glutation peroxidaza și glutation reductaza.

Glutation S-transferaza catalizează reacții implicate în detoxifierea organismului și în eliminarea compușilor străini. Aldehidele reprezintă compușii finali ai evoluției radicalilor liberi și peroxizilor în organism, dar acești compuși foarte reactivi, sunt descompuși de GST, conform reacției (Leaver, 1998):

GSH + R-CH=CH-CO-R R-CH(SG)-CH2-CO-R

În urma determinărilor efectuate s-a observat o ușoară creștere a nivelului enzimei GST în cazul injectării dozei de 1 mg/kg corp QD de siliciu față de control, urmată de o creștere semnificativă (p<0,01) în cazul administrării concentrațiilor de 10 mg/kg, respectiv 100 mg/kg QD de siliciu (Figura 19). Prin urmare, se poate afirma că doza cea mai mică nu induce activarea enzimei GST, aceasta înregistrând o creștere de aproape 25% față de control doar în cazul celei mai mari concentrații administrate.

Figura 19. Activitatea specifică a glutation S-transferazei la nivelul celulelor renale expuse la acțiunea celor trei concentrații diferite de QD de siliciu.

2). Glutation peroxidaza face parte dintr-o familie de enzime ce catalizează degradarea hidroxiperoxizilor organici rezultați din procesele metabolice normale și asigură protecția proteinelor, lipidelor și acizilor nucleici fața de acțiunea moleculelor oxidante, utilizând ca donator de electroni glutationul sau, în anumite cazuri, tioredoxina sau glutaredoxina (Foia, 2012). Funcția biologică principală a GPx, de a reduce hidroperoxizii lipidici la alcoolii lor corespondenți și a peroxidului de hidrogen la apă, se desfășoară conform reacțiilor (Muller și colab., 2007).

R-OOH + 2GSH R-OH + GSSG + H2O2

2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O,

în care R-OOH pot fi H2O2 sau orice peroxid derivat din acizi nucleici, acizi grași polinesaturați, steroizi.

În urma analizelor biochimice s-a observat o scădere a activității specifice GPx după 24 ore de la administrarea suspensiei de nanoparticule față de control. Trebuie specificat că această scădere se pastrează aproximativ la toate cele 3 grupuri care au primit diferite concentrații de nanoparticule, ajungând la aproape 82% în cazul dozei mici și de 78% la doza mare față de grupul control. Practic, se poate sugera faptul că aceste QD de siliciu induc o scădere de aprox. 20% din control a activității GPx care nu este dependent de doză (Figura 20).

Figura 20. Activitatea specifică a glutation peroxidazei la nivelul celulelor renale

expuse la acțiunea celor trei concentrații diferite de QD siliciu.

3. Glutation reductaza este o flavoproteină homodimerică, fiind o enzimă centrală a apărării antioxidante celulare și determină reducerea glutationului din forma disulfid (GSSG) la cea sulfihidril (GSH), glutationul redus fiind un important antioxidant celular (Meister, 1993). În același timp, glutation reductaza este implicată în regenerarea glutationului redus:

GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+

Dozarea activității specifice GRED a arătat că administrarea suspensiei de QD de siliciu a indus o scădere semnificativă a acesteia, dependent de concentrație, cu 20% și 30% față de control on cazul dozei de 1 si respective 100 mg QD/kg corp (Figura 21). Aceste rezultate se corelează foarte bine cu scăderea activității GPx (de aprox. 20% față de control) și creșterea activității GST (25% față de control în cazul dozei mari), sugerând o toxicitate redusă la nivel renal, chiar după administrarea unei concentrații crescute de QD (100 mg/kg). Cel mai probabil GST se activează în urma injectării QD, reușind să neutralize eficient toxicitatea nanoparticulelor. De asemenea, trebuie subliniat că augumentarea dozei de particule nu sporește efectele dăunătoare la nivel renal, ceea ce arată că generarea radicalilor liber ajunge să atingă un platou în apropierea dozei maxime testate.

Figura 21. Activitatea specifică a glutation reductazei la nivelul celulelor renale

expuse la acțiunea a trei concentrații diferite de QD siliciu.

3.2 Evaluarea efectului indus de QD la nivelul catalazei

Catalaza acționează în conversia peroxidului de hidrogen care este un agent oxidant puternic, cu caracter toxic pentru celule. De asemenea, catalaza are și acțiune peroxidazică.

2H₂O₂ O₂ +2H₂O

În urma determinării spectrofotometrice, se remarcă o scădere semnificativă a nivelului activității catalazice după administrarea concentrațiilor diferite de QD de siliciu (Figura 22). Valoarea diminuării activității este de 10%, 23% și 45% din control în cazul concentrației de 1, 10 și respectiv 100 mg QD/kg corp. Astfel, se poate deduce faptul că acest tip de nanoparticule este capabil de a inhiba activitatea catalazei într-o manieră dependentă de concentrație. Având în vedere că această enzimă acționează în primul front de apărare antioxidantă, se poate sugera faptul că activitatea catalazei devine mult mai susceptibilă la atacul radicalilor liberi generați de QD, iar GPx și celelalte enzime dependente de glutation sunt cele care reușesc să neutralizeze aproape complet toxicitatea acestor particule ajunse la nivel renal în vederea excreției.

Figura 22. Activitatea specifică a catalazei la nivelul celulelor renale

expuse la acțiunea a trei concentrații diferite de QD siliciu.

3.3 Evaluarea efectului QD la nivelul glutation 6-fosfat dehidrogenazei

Glucozo-6-fosfat dehidrogenaza catalizează etapa oxidativă a ciclului pentozo-fosfaților, generând NADPH, care este donor de electroni în biosintezele reductive și este folosit pentru generarea de GSH(Shin și colab., 2004).

glucozo-6-fosfat + NADP+ + H2O 6-fosfoglucono-δ-lactona + NADPH + H+

Determinările spectrofotometrice au arătat o ușoară scădere a activității glucozo-6-fosfat dehidrogenazei față de proba control în cazul șoarecilor care au primit 1 mg/kg nanoparticule, așa cum se poate observa în Figura 23. În cazul celorlalte două grupuri de animale, care au fost injectate cu 10, respectiv 100 mg/kg QD, se remarcă o revenire la nivelul observat în cazul grupului control. Astfel, se poate deduce faptul că celulele renale își dezvoltă un comportament adaptativ față de stresul oxidativ declanșat la nivel celular în urma administrării nanoparticulelor. Fiind enzima reglatoare a procesului metabolic numit șuntul pentozo-fosfaților, se poate sugera că acesta nu este perturbat de către concentrațiile crescătoare de QD.

Figura 23. Activitatea specifică a glucozo-6-fosfat dehidrogenazei la nivelul celulelor renale

expuse la acțiunea a trei concentrații diferite de QD siliciu.

Capitolul 4. Concluzii

În cadrul acestui studiu experimental, s-au utilizat rinichi recoltați de la șoarecii Swiss masculi adulți care au primit diferite doze de QD de siliciu, și s-a urmărit înțelegerea efectelor induse de QD de siliciu, la nivel renal, în principal asupra stresului oxidativ. Rezultatele obținute au demonstrat faptul că efectele toxice care apar în urma tratamentului cu diferite concentrații de nanoparticule de tip QD de siliciu se bazează pe inducerea stresului oxidativ la nivel renal. Studiul efectuat in vitro a presupus dozarea experimentală a concentrației de enzime antioxidante CAT, GPx, GRed, G6PDH și GST, și a arătat faptul că expunerea celulelor renale la QD de siliciu se finalizează cu modificări ale activităților enzimelor antioxidante.

În urma studiului literaturii de specialitate și a prelucrării datelor rezultate în cadrul cercetării experimentale, se pot extrage și evidenția următoarele concluzii:

Factorul determinant care influențează toxicitatea nanoparticulelor de siliciu este reprezentat de către proprietățile fizico-chimice ale stratului de suprafață ale QD. Studiile arată că structura fizico-chimică a QD de siliciu nu induce un grad de toxicitate ridicat, aceste tip de nanoparticule fiind considerat cel mai puțin toxic din cele utilizate în nanomedicină.

Generarea de specii reactive de oxigen (SRO) și leziuni oxidative este considerată un efect semnificativ în multe dintre răspunsurile biologice, în cazul celulelor asupra cărora se administrează un tratament cu concentrații diferite de QD de siliciu. Radicalii liberi au capacitatea de a distruge membranele celulare, de a cauza denaturararea ADN, dar și a proteinelor, de a induce alterarea ciclului celular, modificări structurale și fiziologice ale celulelor afectate, și în final pot determina apoptoza.

Cu toate că celulele se caracterizează printr-un mecanism eficient de neutralizare a speciilor reactive oxigen rezultate în urma proceselor biologice normale (respirația mitocondrială), în momentul în care se depășește valoarea limită nivelului de SRO, se instalează stresul oxidativ.

Administrarea unei doze de 1 mg QD siliciu/kg corp la șoareci Swiss de laborator nu a determinat efecte semnificative asupra activității enzimelor antioxidante de la nivel renal, nemanifestându-se o toxicitate la această concentrație. Creșterea dozei de QD la 100 mg/kg a condus la diminuarea semnificativă a activității catalazei și glutation reductazei, concomitant cu creșterea activității glutation S-transferazei, sugerând faptul că sistemul renal reușește să activeze apărarea antioxidantă pentru a contracara efectele negative ale QD.

În acest moment, testarea toxicității nanoparticulelor a devenit o direcție de cercetare semnificativă din punct de vedere biomedical, datorită intenției de a utiliza nanoparticulele în nanomedicină prin detectarea tumorilor, administrarea țintită de medicamente biomacromoleculare la locurile de acțiune intracelulară (Shi și colab., 2016), dezvoltarea vaccinurilor sintetice, precum și din cauza creșterii nivelului de NPs în mediul înconjurător (apă, aer, sol).

Quantum dots prezintă o serie de caracteristici fizico-chimice (randamentul cuantic ridicat, fotostabilitate mai bună comparativ cu fluoroforii standard obișnuiți, rezistență mare la degradarea chimică) care au dezvoltat capacitatea utilizării drept noi instrumente cu aplicabilitate ridicată în domeniul nanomedical.

Cele mai importante studii se fac în privința detectării și distrugerii celulelor canceroase, prin atașarea anticorpilor specifici la suprafața unor nanoparticule de mici dimensiuni care să recunoască și să neutralizeze celulele anormale prin diferite mecanisme. Cu avantajele optice și chimice ale QD, nanotehnologia bazată pe acestea este utilă în construirea unei platforme de imagistică biomedicală pentru studiul comportamentului la cancer. Această revizuire se axează în principal pe aplicarea nanotehnologiei pe bază de QD în studiile de imagistică a celulelor canceroase și micro-mediul tumoral, atât in vivo, cât și in vitro (Fang și colab., 2012).

În pofida acestor proprietăți remarcabile ale nanoparticulelor, cei mai mulți cercetători în domeniu sunt îngrijorați cu privire la posibila citotoxicitate a particulelor de QD din cauza faptului că prezintă în constituția lor metale grele care au efecte nocive asupra organismului uman, precum nervozitate, instabilitate emoțională, insomnie și letargie. Aceste metalele grele sunt cunoscute pentru posibilitatea de a induce o creștere a producției de specii reactive de oxigen, cum ar fi radicalul hidroxilic, radicalul superoxid sau peroxidul de hidrogen. Producerea exagerată și generalizată de SRO poate depăși mecanismele naturale ale apărării antioxidante intrinseci ale celulelor și poate determina o stare celulară cunoscută sub denumirea de stres oxidativ (Ercal și colab., 2001), adică apariția dezechilibrului dintre oxidanți și antioxidanți, cu efecte puternice asupra celulelor afectate, conducând în final la moarte celulară.

De aceea, în acest studiu experimental, s-a urmărit înțelegerea efectelor cauzate de stresul oxidativ la nivelul rinichilor de șoarece, cu posibilitatea ulterioară a extrapolării rezultatelor obținute la organismal uman. Utilizarea organismelor model este esențială pentru descoperirea mecanismelor de apariție a efectelor toxice ale QD de siliciu in vitro, pentru a permite administrarea quantum dots in vivo, fara a afecta starea de sănătate a omului.

În acest context, datele obținute în urma acestui studiu in vitro, pot contribui la depistarea modului în care nanoparticulele de tip quantum dots de siliciu interacționează cu sistemele biologice umane, a modificărilor biochimice care apar la nivel celular, precum și a efectelor pe care această interacțiune le induce, permițând în final utilizarea acestora in vivo.

BIBLIOGRAFIE

Bakalova R.,  Zhelev Z., Kokuryo D., Spasov L., Aoki I., Saga T., 2011. Chemical nature and structure of organic coating of quantum dots is crucial for their application in imaging diagnostics. Int J Nanomedicine . 6: 1719–1732.

Banerjee A., Pons T., Lequeux N., Dubertret B., 2016. Quantum dots-DNA bioconjugates: synthesis to applications. Interface Focus . 6(6):20160064.

Banning A., Kipp A., Schmitmeier S., Löwinger M., Florian S., Krehl S., Thalmann S., Thierbach R., Steinberg P., Flohé B.R., 2008. Glutathione Peroxidase 2 Inhibits Cyclooxygenase-2–Mediated Migration and Invasion of HT-29 Adenocarcinoma Cells but Supports Their Growth as Tumors in Nude Mice. 0.1158/0008-5472.CAN-08-1321.

Bertin G., Averbeck D.,2006. Cadmium: cellular effects, modifications of biomolecules, modulation of DNA repair and genotoxic consequences (a review). Biochimie. 88:1549-1559.

Birben E., Sahiner M.U., Sackesen C., Erzurum S., Kalayci O., 2012. Oxidative Stress and Antioxidant Defense. World Allergy Organ J. 5(1): 9–19.

Chang L.P., Lin S., Wang.P.C., Lin S.R.,2014. Techniques for physicochemical characterization of nanomaterials. Biotechnol Adv. 32(4):711-726.

Chelikani P., Fita I., Loewen PC.,2004. Diversity of structures and properties among catalases. Cell Mol Life Sci. 61(2): 192–208.

Choi AO., Cho SJ., Desbarats J., Lovrić J., Maysinger D.,2007.Quantum dot-induced cell death involves Fas upregulation and lipid peroxidation in human neuroblastoma cells. J Nanobiotechnology. 5:1.

Ciutan M., Sasu C., Skiba M.,2010. Nanomedicina-medicina viitorului. Management în sănătate. pp. 19-24.

Coman T.B., 2013. Studiul straturilor subțiri de oxid de zinc dopat depuse prin ablație laser secvențială. Universitatea „Alexandru Ioan Cuza”, Iași ,Școala Doctorală a Facultății de Fizică.

Cooper G.M.,2000. The cell-A molecular approach. Boston University. 2nd ed., , pp 462-467.

Dumitru I.F., Iordăchescu D., 1974. Enzime-structură și mecanisme de acțiune. Editura Medicală, București. pp 301-304.

Ercal N., Gurer-Orhan H., Aykin-Burns N., 2001.Toxic metals and oxidative stress part I: mechanisms involved in metal-induced oxidative damage. Curr Top Med Chem. 1(6):529-39.

Fang M., Peng C.W., Peng D.W., Yan L., 2012. Quantum dots for Cancer Research:Current Status, Remaining Issues and Future Perspectives. Cancer Biol Med.  9(3): 151–163.

Fanizza C, Ursini CL, Paba E, Ciervo A, Di FA, Maiello R, De SP, Cavallo D., 2007. Cytotoxicity and DNA-damage in human lung epithelial cells exposed to respirable alpha-quartz. Toxicol In Vitro. 21:586–594.

Flonta M.L., Marcu-Lapadat M., Ristoiu V., 2007. Sistemul excretor. În:Noțiuni de anatomie și fiziologie. Editura Universității din București , pp 179-194.

Foia L.,2012.Implicațiile fiziopatologice ale degradării echilibrului redox în cancer, diabet zaharat și boli inflamatorii .

Fornaguera C., García-Celma MJ., 2017. Personalized Nanomedicine: A Revolution at the Nanoscale. J Pers Med. 7(4).

Ghasemi Y., Peymani P., Afifi S., 2009.Quantum dot:magic nanoparticle for imaging,detection and targeting. Acta Biomed. 80: 156-165.

Grigoriu C., Nicolae I., Ciupina V., Prodana G., Suematsub H., Yatsui K.,2004. Influence of the experimental parameters on silicon nanoparticles produced by laser ablation . Journal of Optoelectronics and Advanced Materials .Vol. 6, No. 3. pp 825 – 830.

Grigoriu C., Kurokia Y., Nicolae I., Zhua X., Hiraia M., Suematsua H., Takata M., Yatsuia K., 2005. Photo and cathodoluminescence of Si/SiO2 nanoparticles produced by laser ablation. Journal of Optoelectronics and Advanced Materials .Vol. 7, No.6. pp 2979 – 2984.

Guyton A.C.,1998. Fiziologie umană și mecanismele bolilor. Ed.Medicală Amaltea, W.B.Saunders. Ediția în limba romană sub redacția Dr. Radu Cârmaciu. pp 190-191.

Hampel M., BlascoJ., Martín Díaz M.L.,2016. Biomarkers and Effects. Academic Press. . pp 121.

Hardman R.,2006. A toxicologic review of quantum dots: toxicity depends on physicochemical and environmental factors. Environ Health Perspect. 114:165-172.

Jamieson T., Bakhsi R., Petrova D., Pocock R., Imani M., Seifalian A.M.,2007. Biological applications of quantum dots. Elsevier. Vol. 28, Issue 31 . pp 4717-4732.

Kairdolf B.A., Smith A.M., Stokes T.H., Wang M.D., Young A.N., Nie S., 2013. Semiconductor Quantum Dots for Bioimaging and Biodiagnostic Applications. Annu Rev Anal Chem. 6(1):143-162.

Kao M.P., Ang D.S., Pall A., Struthers A.D., 2010. Oxidative stress in renal dysfunction mechanisms, clinical sequlae and therapeutic options. J Hum Hypertens.. 24(1):1-8.

Kehrer J.P., Robertson J.D., Smith C.V., 2010. Free Radicals and Reactive Oxygen Species. Comprehensive Toxicology. 2nd ed. pp 277-307.

Krishnamurthy P., Wadhwani A., 2012. Antioxidant Enzymes and Human Health. Intech Open Access Publisher

Laskin D.L., Laskin J.D., 2010. Immune System Toxicology. Comprehensive Toxicology. Vol5, pp 133-153.

Lazăr V., Cernat R., Chifiriuc C., Bulai D., Sterwart-Tull D.,2009. Imunobiologie. Editura Universității din București. pp 21.

Leaver M.J., George S.G., 1998. A piscine glutathione S-transferase which efficiently conjugates the end-products of lipid peroxidation. Marine Environmental Research ..46(1-5): 71–74.

Li H.C., Zhou Q., Liu W., Yan B., Zhao Y., Jiang G., 2008. Progress in toxicological researches for quantum dots. Science in China Series B: Chemistry. Vol. 51, Issue 5. pp 393–400.

Loghin F., 2002. Toxicologie generală. Editura Medicală Universitară „Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca. pp 43-200.

Marieb E., Hoehn K., 2007. Human Anatomy & Physiology. 7th Edition, Person Education.

Markman J.L., Rekechenetskiy A., Holler E., Ljubimova J.Y., 2013. Nanomedicine therapeutic approaches to overcome cancer drug resistance. Adv Drug Deliv Rev.65(13-14):1866-79.

Meister A.,1983. Selective modification of glutathione metabolism. Science. 220(4596): 472–477.

Meyer A.J., Hell R., 2005. Glutathione homeostasis and redox-regulation by sulfhydryl groups. Photosynth Res . ;86(3):435-57.

Miguel AS.,2012. Quantum Dots: Synthesis, Functionalization and Bioconjugation for Biological Applications. Teză de doctorat. Instituto de Tecnologia Química e Biológica | Universidade Nova de Lisboa.

Moyer A.M., Sun Z., Batzler A.J., Li L., Schaid D., Yang P., Weinshilboum R.M.,2010. Glutathione Pathway Genetic Polymorphisms and Lung Cancer Survival After Platinum-Based Chemotherapy. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19(3):811-21.

Muller F.L., Lustgarten M.S., Jang Y., Richardson A., Van Remmen H., 2007. Trends in oxidative aging theories. Free Radic Biol Med. 43(4): 477–503.

Napierska D., Thomassen L.C.J., Lison D., Martens J., Hoet P.H.,2010. The nanosilica hazard: another variable entity. Particle and Fibre Toxicology.

Nebert D.W., Vasiliou V.,2004. Analysis of the glutathione S-transferase(GST) gene family. Hum Genomics. 1(6):460-464.

Nel A., Xia T., Madler L., Li N., 2006. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science. . 33(5761):622-7.

Netter F.H., 2005. Rinichii și glandele suprarenale. În: Atlas de Anatomie Umană. Editura Medicală Calisto. Ediția a treia. pp 319-334.

Park M., 2012. Nanotoxicology-an in vitro approach. Thesis .

Palmer L.G., Schnermann J., 2015. Integrated Control of Na Transport along the Nephron. Clin J Am Soc Nephrol. 10(4): 676–687.

Pisanic T.R., Zhang Y., Wang T.H.,2014. Quantum dots in Diagnostics and Detection:Principles and Paradigms. Analyst. 139(12)2968-2981.

Saini R., Saini S., Sharma S., 2010. Nanotechnology:The Future Medicine. Journal of Cutaneous and Aesthetic Surgery. 3(1):32-33.

Schick. P.,2017. Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase(G6PD) Deficiency.

Schins RP, Duffin R, Hohr D, Knaapen AM, Shi T, Weishaupt C, Stone V, Donaldson K, Borm PJ.,2002.Surface modification of quartz inhibits toxicity, particle uptake, and oxidative DNA damage in human lung epithelial cells. Chem Res Toxicol. 15:1166–1173.

Sheng W.Y., Huang L., 2011.Cancer immunotherapy and nanomedicine. Pharm Res. . 28(2):200-14.

Shi J., Kantoff P.W., Wooster R., Farokhzad O.C.,2016. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nat Rev Cancer. 17(1):20-37.

Sies H., 1997. Oxidative stress:oxidants and antioxidants. Exp Physiol.82(2):291-5.

Smith A., Duan H., Mohs AM., Nie S., 2008. Bioconjugated Quantum Dots For In Vivo Molecular and Cellular Imaging . Adv Drug Deliv Rev.60(11):1226-1240.

Tyler D.D., 1975. Polarographic assay and intracellular distribution of superoxide dismutase in rat liver. Biochem J. 147:493-504.

Țibea F., 2002. Atlas Anatomia omului. Editura Corint. pp 35.

Voiculescu I.C., Petrescu I.C., 1971. Anatomia și fiziologia omului. Editura Medicală. Ediția a 4-a. Pp 75-81.

Vinceti M, Wei ET, Malagoli C, Bergomi M, Vivoli G., 2001. Adverse health effects of selenium in humans. Rev Environ Health. 16:233-251.

Wajcman H., Galacteros F., 2004. Glucose 6-phosphate dehydrogenase deficiency: a protection against malaria and a risk for hemolytic accidents. C R Biol. 327(8):711-20.

Walling M., Novak J., Shepard J.R.E., 2009. Quantum dots for Live Cell and In Vivo Imaging. Int J Mol Sci. 10(2): 441–491.

Wang L., Hu C., Shao L., 2017. The antimicrobial activity and nanoparticles:present situation and prospects for the future. Int J Nanomedicine. .12:1227-1249.

Wang A., Tepper J.E.,2014.Nanotechnology in Radiation Oncology. Linerberg Comprehensive Cancer Center. 190.1200.

Wilkens S., 2015. Structure and mechanism of ABC transpoters. F1000Prime Rep). 7:14.

Wu G., Zhong Y., Sheng F., Lupton J.R., Turner N.D.,2004. Glutathione Metabolism and Its Implications for Health. J Nutr. 134(3):489-92.

Xia T., Kovochich M., Brant J., Hotze M., Sempf J., Oberley T., Sioutas C., Yeh J., Wiesner M.R., Nel A. E., 2006. Comparasion of the Abilities of Ambient and Manufactured Nanoparticles To Induce Cellular Toxicity According to an Oxidative Stress Paradigm. Nano Lett.  6(8):1794-807.

Yang X.Q., Chen C., Peng C.W., Hou JX., Liu S.P., Qi Y.P., Zhu X.B., Pang D.W., Li Y.,2011. Quantum dot-based quantitative immunofluorescence detection and spectrum analysis of epidermal growth factor receptor in breast cancer tissue arrays. International Journal Of Nanomedicine. 62265-2273.

Zhang Y.R., LinR., Li H.J., He W.L., Du J.Z., Wang J., 2018. Strategies to improve tumor penetration of nanomedicines through nanoparticle design. Wiley Interdisciplinar Rev Nanomedicine Nanobiotechnology. e1519.

Zolnik B.S., Gonzalez-Fernandez A., Sadrieh N., Dobrovolskaia M.A., 2010. Nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151(2):458.