A. MOLDOVAN: Materiale compozite pe bază de deşeuri poliolefinice şi fibre naturale [304399]
Universitatea Transilvania din Brașov
Facultatea: Design de produs și mediu
TEZĂ DE DOCTORAT
BRAȘOV
2018
Universitatea Transilvania din Brașov
Facultatea: Design de produs și mediu
Fiz. Chim. Laura Nicoleta DAMIAN
CERCETĂRI ÎN DOMENIUL MATERIALELOR POLIMERICE ANTIMICROBIENE
Conducător științific
Prof. dr. chim. Florica Silvia Cristina PAȚACHIA
”Stadiul evolutiv al unei civilizații se poate stabili foarte facil prin aprecierea materialelor utilizate de către aceasta”
[anonimizat] a [anonimizat] – Polimeri care mimează peptidele naturale (mimic naturali)
ATCC – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat], polimeri, [anonimizat] – [anonimizat] –N,N-dietilfenilen-1,4 [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – Hazard Analysis & [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – engl. [anonimizat] – [anonimizat] a [anonimizat](etilenă tereftalat)
PO – [anonimizat] – [anonimizat]– poli(fenilen etinilen) – [anonimizat] – [anonimizat](clorură de vinil)
RV – [anonimizat] (determinată prin metoda unghiului de contact)
SEM – [anonimizat] – [anonimizat]
U – [anonimizat] – [anonimizat] –polietilenă cu densitate foarte mică (very low density polyethylene)
XRD – difracție de raze X
Motivația și obiectivele tezei
Utilizarea materialelor antimicrobiene reprezintă o soluție preventivă în lupta neterminată cu microorganismele patogene.
Într-[anonimizat] o populație în continuă creștere [1s], [anonimizat], dar și cu mari oportunități de migrare dintr-o [anonimizat], [anonimizat] o reală amenințare asupra sănătății umane. Crearea și utilizarea de materiale antimicrobienecare să limiteze sau să elimine dezvoltarea microbiană s-a impus în aceste condiții ca o necesitate [5].
[anonimizat], utilizarea de materiale cu efect antimicrobian în diverse domenii de activitate: în sănătate (instrumentar medical, dispozitive medicale, implanturi dentare, mobilier și pardoseli pentru sălile de intervenții chirurgicale [6,59,159,161,163,164,179,207]), în spațiile publice (mijloace de transport în comun, grupuri sanitare [7,8]), în industria alimentară (ambalaje, membrane antimicrobiene comestibile, recipiente [9,10,174,175,176,177,178,211,212]), în industria textilă [11-14,167,181,205,206,209], în aeronautică [15], în distribuția apei potabile [16].Problema contaminării microbiologice i-a preocupat și pe angajații NASA, atunci când au început să trimită oameni în spațiu, ceea ce i-a determinat să elaboreze proceduri de apărare împotriva germenilor, astăzi preluate și implementate de către toți producătorii din industria alimentară sub forma sistemului de management HACCP (Hazard Analysis & Critical Control Poits). Oportunitatea utilizării materialelor antimicrobiene în aceste puncte critice ar reprezenta o soluție excelentă.
Obiectivul prezentei teze de doctorat este de a testa din perspectiva caracterului antimicrobian unele materiale polimerice existente și de a obține noi materiale polimerice antimicrobiene, în scopulcreșterii calității vieții și protejării mediului înconjurător.
Scopul acestei teze de doctorat este conceperea unor materiale polimerice antimicrobiene cu aplicații specifice și testarea lor din punct de vedere antimicrobian în vederea introducerii acestei caracteristici a materialelor în fișele de produs, astfel încât siguranța sanitară să nu mai reprezinte un aspect neglijabil.
Obiectivele practice subordonate acestui scop sunt:
Ierarhizarea materialelor polimerice utilizate actual în stocarea și transportul apei potabile pe baza proprietăților lor antimicrobiene
Selectarea metodelor optime de determinare a caracterului antimicrobian al polimerilor utilizați la stocarea și transportul apei potabile
Evaluarea caracterului antimicrobian al unor materiale compozite noi pe bază de poliolefine virgine și filleri naturali sau artificiali cu caracter antimicrobian (fibre de banan, fibre de banan mercerizate, fibre celulozice modificate cu chitină)
Evaluarea caracterului antimicrobian al unor noi materiale obținute din deșeuri polimerice reciclate cu aceeași filleri ca și în cazul poliolefinelor virgine în vederea extinderii domeniilor lor de aplicație
Obținerea și caracterizarea unor noi materiale antimicrobiene hidrogelice pe bază de PVA și diverși agenți antimicrobieni ca lichidele ionice, ionii metalici, coloranții sau alți polimeri naturali ca zeina, scleroglucanul sau chitosanul.
Obiectivele teoreticeale tezei vizează:
Stabilirea corelației dintre caracteristicile compoziționale, structurale și morfologice ale materialelor polimerice obținuteși caracterul lor antimicrobian;
Stabilirea mecanismului bacteriostatic sau bactericid dominant al materialelor studiate;
Stabilirea modelului cinetic de eliberare controlată a lichidelor ionice (LI) utilizate ca agenți antimicrobieni din matricea hidrogelică de PVA și corelarea acestuia cu caracteristicile structurale ale LI.
Scopul și obiectivele tezei se încadrează în prioritățile mondiale de cercetare științifică și implicit în prioritățile STRATEGIEI NAȚIONALE DE CERCETARE, DEZVOLTARE ȘI INOVARE 2014-2020, SUSȚINEREA SPECIALIZĂRII INTELIGENTE, DOMENIUL ECO-NANO-TEHNOLOGII ȘI MATERIALE AVANSATE.
Teza este structurată pe șapte capitole, urmărind o tratare progresivă, și logică a problematicii abordate, după cum urmează:
Capitolul 1intitulat ‟Stadiul actual al dezvoltării materialelor antimicrobiene‟ are un caracter introductiv, pe parcursul acestuiafiind prezentat stadiul actual al cunoașterii privind dezvoltarea de materiale antimicrobiene, punându-se accentul pe contribuția lor la îmbunătățirea sănătății publice, la îmbunătățirea situației mediului înconjurător, dar și la scăderea cheltuielilor privind sănătatea. Tot pe parcursul acestui capitol, se prezintă germenii cu care materialele pot lua contact, condițiile în care celulele bacteriene se dezvoltă la suprafața sau în interiorul materialelor, dar și modul de dezvoltare al acestora la nivelul materialelor. De asemenea, în cadrul acestui capitol sunt prezentate și explicate mecanismele de acțiune ale materialelor antimicrobiene. Mai mult, prin centralizarea și corelarea informațiilor raportate în literatură până în prezent, s-a realizat profilul unui material antimicrobian, prezentându-se în detaliu ce caracteristici morfologice și funcționale influențează într-un mod pozitiv sau negativ comportamentul antimicrobian al materialelor polimerice.
Capitolul se încheie cu concluziile extrase din stadiul actual al cercetărilor legate de materialele antimicrobiene, în urma cărora s-au formulat scopul și obiectivele tezei.
Capitolul 2prezintă instrumentele și metodele de analiză utilizate pe parcursul activității experimentale, dar și motivația selectării acestora, făcându-se dovada adecvării lor la scop.
Capitolul 3intitulat ‟Materialele utilizate în rețelele de distribuție a apei potabile și influența acestora asupra calității apei potabile‟ scoate în evidență impactul negativ al materialelor polimerice uzuale asupra alimentului de bază al omului, anume apa. Conform metodologiei HACCP (Hazard analysis and critical control points, în traducere Analiza pericolelor și punctele critice de control) se identifică ca pericol materialele rețelelor de distribuție. În plus, SR EN ISO 22000:2005 (Sisteme de management ale siguranței alimentului. Cerințe pentru orice organizație din cadrul lanțului alimentar) obligă la identificarea, evaluarea și eliminarea tuturor pericolelor. Prezentul capitol, identifică, centralizează rezultatele din teren, apoi evaluează acest risc. Se dovedește astfel necesitatea utilizării de materiale antimicrobiene ca soluție preventivă. Capitolul cuprinde și un sondaj de opinie care are ca scop aflarea nivelului de informare al consumatorilor asupra materialelor pe care le utilizează la proiectarea rețelei domestice de apă potabilă și asupra impactului pe care aceasta îl are asupra calității apei pe care o consumă. Urmează un studiu care ține cont de dimensiunile rețelelor, de vechimea lor, dar și de materialele consituente, studiu care are ca scop evidențierea impactului negativ al materialelor utilizate la confecționarea conductelor asupra calității apei potabile. În urma centralizării tuturor datelor se stabilește tendința utilizării țevilor pe bază de poliolefine, dar și necesitatea rezolvării problemelor legate de contaminarea lor microbiologică. Prin urmare, s-a recurs la un alt studiu, comparativ, între cele mai utilizate țevi pe bază de poliolefine, în vederea stabilirii celei mai indicate variante de material polimeric în acest domeniu. În urma tuturor problemelor identificate, capitolul propune și soluții pentru rezolvarea acestor probleme, prin studii pe conducte de polipropilenă cu nanoparticule de Ag. De asemenea, prezentul capitol ține seama și de problemele apărute la stocarea apei, nu numai la distribuție. Astfel sunt derulate studii pentru stabilirea materialului optim de stocare, dar și studii pentru îndepărtarea biofilmului de la suprafața materialelor rezervoarelor de stocare cu ajutorul ultrasunetelor, dar și prin agitarea mecanică a masei de apă stocată.
Capitolul 4intitulat ‟Materiale compozite antimicrobiene pe bază de poliolefine virgine și fibre celulozice‟se ocupă custudiul eficacității antimicrobiene amaterialelor cu matrice detip poliolefină virgină, mai precis PP, LDPE și HDPE și având ca agent antimicrobianfibre celulozice modificate cu chitină, fibre de banan și fibre de banan mercerizate.
Capitolul 5intitulat ‟Potențialul antimicrobian al materialelor reciclate din deșeuri polimerice‟ se ocupă cu testarea materialelor obținute din fracții diferite de deșeuri plastice (PP, PE, PS, PA, PVC, Nylon), separate după densitate, în scopul extinderii domeniului de aplicare a maselor plastice reciclate, dată fiind gravitatea problematicii mediului. Datorită barierelor ridicate de statutul de deșeu, aceste materiale au limitări conform legislației în vigoare în ceea ce privește utilizarea lor, fără a avea la bază vreun studiu în acest sens, prin urmare în mod nefondat. Astfel, acest capitol se ocupă cu studiul comportamentului acestei categorii de materiale și completează lipsa unor asemenea studii din tabloul materialelor polimerice antimicrobiene.
Capitolul6‟Materiale hidrogelice cu caracter antimicrobian‟ este dedicat studiului hidrogelurilor cu aplicabilitate în diverse domenii de activitate. Hidrogelurile reprezintă clasa de polimeri cu cea mai mare cerință din domeniul materialelor antimicrobiene, dată fiind utilizarea lor în domeniul farmaciei și în medicină, astfel că ele nu puteau lipsi din acest studiu. Ca și matrice polimerică a fost ales PVA-ul, poli(alcoolul vinilic), având ca și agenți cu potențial antimicrobian compuși mic moleculari (lichide ionice, ioni metalici, coloranți) încorporați prin sorbție sau polimeri naturali (scleroglucan, zeină și celuloză) încorporați prin înglobare.
Concluziile finale ale tezei, aspectele originale alături de direcțiile viitoare ce s-au desprins în urma procesului de cercetare sunt prezentate și sistematizate la finalul lucrării, în Capitolul 7. Tot aici sunt propuse și domeniile de aplicabilitate ale materialelor studiate.
Metodologia de cercetare, validarea metodelor de încercare utilizate, estimarea incertitudinii de măsurare și asigurarea calității/validității rezultatelor obținute în prezenta teză, s-au realizat în lumina standardului 17025 din 2005 (și mai recent în lumina noii sale ediții din anul 2018) referitor la ‟Competența laboratoarelor de încercări și etalonări‟. Pentru a nu supraîncărca capitolul dedicat părții experimentale, rapoartele de validare ale metodelor utilizate și rezultatele privind asigurarea calității/ validității rezultatelor se regăsesc în Anexelede la finalul tezei.
Activitățile legate de partea de caracterizare structurală și morfologică a materialelor prezentate în teză au fost realizate în cadrul laboratoarelorUniversității Transilvania din Brașov. Determinările microbiologice și fizico-chimice derulate cu scopul de a caracteriza materialele din perspectiva comportamentului lor antimicrobian, au fost executate în cadrul Laboratorului Apă Potabilă al Companiei Apa S.A. Brașov, cu mențiunea că metodele utilizate, validate, au fost sistematic verificate cu materiale de referință certificate (MRC), dar și de tip MR ‟in house‟. Asigurarea calității/validității rezultatelor s-a realizat prin metode statistice variate, inclusiv prin scheme intercomparări laboratoare (Proficiency Testing Schemes), care determină performanțele laboratoarelor. Incertitudinea de măsurare a fost estimată pentru toate nivelurile de concentrații conform ghidurilor internaționale specifice în vigoare.
Programul de doctorat a fost susținut prin Programul Operațional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane (POSDRU), ID137070, finanțat din Fondul Social European și de Guvernul României.
STADIUL ACTUAL AL DEZVOLTĂRII MATERIALELOR ANTIMICROBIENE
1
STADIUL ACTUAL AL DEZVOLTĂRII MATERIALELOR ANTIMICROBIENE
Materiale antimicrobiene raportate până în prezent
Tipuri de germeni care pot contamina materialele
Materialele și nutriția bacteriană
Clasificarea materialelor antimicrobiene funcție de mecanismul lor de acțiune
Concluzii
Materiale antimicrobiene raportate până în prezent
Domeniul materialelor antimicrobiene reprezintă un domeniu de interes în momentul de față, în continuă expansiune și puternic dezbătut,în ultimul timp fiind raportate tot mai multe lucrări despre materiale de acest tip (figura 1.1). Trăind în ‟era plasticului‟ se înțelege că cele mai multe cercetări se derulează pe polimeri [208,213], în prezent fiind cele mai utilizate materiale datorită costurilor reduse și a flexibilității de obținere. O sinteză a polimerilor antimicrobieni raportați până în prezent în literatura de specialitate și microorganismele afectate de către aceștia este prezentată în tabelul 1.4.
Fig. 1.1.Dinamica articolelor publicate în domeniul materialelor antimicrobiene în ultimii 10 ani [www.sciencedirect.com]
Dată fiind intensitatea cu care se raportează studii privind materialele antimicrobiene, viitorul materialelor de acest tip a reprezentat recent tema unui sondaj de opinie realizat de către membrii Omnexus. Rezultatele au arătat că materialele antimicrobiene au un viitor promițător, date fiind numeroasele lor utilizări.
Fig. 1.2.Viitorul materialelor antimicrobiene ilustrat de către Omnexus Community pe baza a 159 de voturi[203]
De asemenea, HAIs (Healthcare Associated Infections), a salutat utilizarea materialelor antimicrobiene, deoarece cheltuielile pentru îngrijirea persoanelor afectate de infecții ar scădea considerabil [204].
În ultimul timp, ca urmare a dezvoltării unei noi ramuri medicale, implantologia, este de mare interes dezvoltarea de materiale biocompatibile cu caracter antimicrobian, astfelriscul infecțiilor fiind mult redus [214]. De asemenea, în domeniul oftalmologiei, lentilele de contact din materiale ‟moi‟ de tip gel, care să nu irite suprafața oculară reprezintă actualmente un standard de calitate. Dacă acestea ar avea și caracter antimicrobian, se înțelege superioritatea lor calitativă.
Dezvoltarea a noi materiale, atât pentru obținerea de țevi, conducte pentru transportul apei menajere (reziduale) sau potabile, a rezervoarelor, cât și a mobilierului, obiectelor sanitare, ambalajelor, dispozitivelor medicale au concentrat atenția cercetătorilor asupra domeniului materialelor antimicrobiene [487, 488].
Rolul suprafeței de contact asupra adeziunii bacteriene este asociat sau ar trebui asociat în general cu:
-morfologia suprafeței (în particular cu rugozitatea ei; s-a determinat faptul că neregularitățile suprafeței de 5 ori mai mari decât dimensiunea bacteriilor favorizează atașamentul bacterian [489], în timp ce suprafețele lise rezultate prin tratamente speciale precum electrolustruirea sau depunerea de straturi nerugoase, reduc/elimină posibilitatea de formare a biofilmului. De asemenea, suprafețele “cu auto-curățire” conținând fotocatalizatori ca TiO2 sau ZnO, sub influența radiațiilor ultraviolete distrug biofilmul, minimizând adeziunea noilor bacterii)
-compoziția chimică a acesteia (în particular prin tensiunea superficială minimă – proprie de exemplu polimerilor fluorurați [486], dar și prin posibilul efect toxic exercitat de diferite grupe funcționale sau prin simpla repulsie electrostatică) [490].
Designul suprafețelor industriale, a ambalajelor, a mobilierului, obiectelor sanitare sau dispozitivelor medicale trebuie să țină cont de caracteristicile inițiale ale suprafețelor, de tipurile de bacterii care pot coloniza suprafața și răspunsul lor specific la metodele biocide aplicate, dar și de ușurința de curățare a acestora prin îndepărtarea biofilmului.
Substanțele biocide utilizate actual pentru menținerea suprafețelor la un nivel sporit de sanitație pot fi clasificate în 2 categorii: oxidante și neoxidante.
Substanțele biocide oxidante pot fi utilizate în toate stările de agregare (solide, lichide sau gazoase), sunt în general agresive, omoară bacteriile rapid, dar presupun un grad de toxicitate crescut și implică costuri ridicate. Se utilizează compuși pe bază de clor, brom, apă oxigenată, acid peracetic, ozon etc.
Substanțele biocide neoxidante sunt în general lichide, se dispersează sau se dizolvă ușor în apă și sunt stabile pentru perioade lungi de timp de un an sau mai mult. Totuși unele sunt toxice pentru mediu (substanțe biocide cationice), iar prețul este ridicat. Spre deosebire de substanțele biocide oxidante, acestea omoară bacteriile lent (ore față de minute în primul caz), sunt semnificativ mai puțin persistente în mediu, mai puțin corozive și conțin elemente organice cu molecule mai complexe. Acestea interacționează cu metabolismul celular, afectând integritatea celulară. Dintre substanțelebiocide neoxidante (tabelul 1.1) se pot aminti: aldehidele, ditiocarbamații, izotiazolonele, bromurile organice, compușii cuaternari (sărurile de amoniu, fosfoniu, diazoniu), guanidinele, izocianații, hidrazinele, tiazolii, aminele, etc.
Tabelul 1.1Principalele substanțe biocide neoxidante: selecție și aplicabilitate [216]
Legendă: + grad ridicat de aplicabilitate
+/- aplicații minore
– aplicabilitate nesemnificativă
Tabelul 1.2Eficacitatea substanțelor biocide neoxidante împotriva principalelor tipuri de contaminanți [216]
Legendă: + eficacitate înaltă
– eficacitate redusă SRBs: bacterii sulfo-reducătoare
+/- eficacitate variabilă Midii: moluște bivalve
? caracteristică necunoscută
Aceste substanțe biocide prin produșii reacțiilor pe care le produc trebuie să fie riguros controlate pentru a nu se depăși limita de toxicitate admisă.Realizarea unor materiale antimicrobiene care să prezinte chiar ele aceste proprietăți, să fixeze componentele biocide pe suprafață sau să le elibereze controlat pentru a diminua riscul de toxicitate reprezintă unul dintre dezideratele actuale ale cercetării științifice.
Cu toate că gama materialelor antimicrobiene cuprinde atât materialele metalice, ceramice, cât și polimerii, scopul actualei teze este de a cerceta câteva sisteme polimerice noi sau îmbunătățite care pot prezenta caracter antimicrobian și care pot să fie utilizate în contexte practice diferite: conducte sau recipiente pentru transportul/stocarea apei potabile, polimeri modificați pentru realizarea bunurilor de larg consum, polimeri reciclați și sisteme de hidrogeluri cu agenți antimicrobieni încorporați în vederea eliberării lor controlate în mediu.
Din studiul literaturii de specialitate (tabelul 1.3) se poate observa gama extrem de largă de polimeri antimicrobieni care au fost sintetizați și care acționează independent ca antimicrobieni sau ca matrice pentru încastrarea unor agenți antimicrobieni care să se elibereze controlat. Polimerii antimicrobieni pot fi:
I. Polimeri care conțin atomi de azotcuaternar:
I. 1 Polimeri care conțin structuri aromatice heterociclice
I. 2 Polimeri acrilici și metacrilici
I. 3 Polielectroliți cationici conjugați (CPEs)
I. 4 Polisiloxani
I. 5 Polimeri dendritici și hiperamificați
I. 6 Polimeri cu grupări terminale de amoniu cuaternar
I. 7 Polimeri cu atomi de azot cuaternar în catenele principale
II. Polimeri cu conținut de guanidine
III. Polimeri care mimează peptidele naturale (mimic naturali) (AMP)
III. 1 Peptide sintetice (AMPs)
III. 2 Arilamide și polimeri fenilen etinilen naturali
III. 3 Derivatele polinorborbenă
IV. Polimeri cu halogen
IV. 1 Polimeri cu fluor
IV. 2 Polimeri cu clor
IV. 3 Polimeri N-halamine
V. Polimeri care conțin fosfo și sulfo derivați
VI. Polimeri cu derivați acizi fenol și derivați acizi benzoici
VII. Polimeri organometalici
VIII. Alte structuri moleculare
VIII. 1 Polielectroliți cu grupări cuaternare de amoniu
VIII. 2 Dendrimeri antimicrobieni
VIII. 3 Polimeri acrilici și metacrilici
IX. Polimeri modificați chimic pentru a obține activitate antimicrobiană
IX. 1 Polimeri cu încorporarea covalentă de componente antimicrobiene cu masă moleculară mică
IX. 2 Polimeri antimicrobieni obținuți prin cuplarea de peptide antimicrobiene
IX. 3 Grefarea de alți polimeri cunoscuți ca antimicrobieni
X. Polimeri cu componente antimicrobiene organice
X. 1 Adiție de componente antimicrobiene cu masă moleculară mică
X. 2 Amestecuri cu polimeri antimicrobieni
XI. Polimeri cu componente antimicrobiene anorganice
XI. 1 Adăugare de particule metalice
XI. 2 Inserție de oxizi
În tabelul 1.3 pot fi observate exemple din categoriile expuse anterior. Tot aici sunt redate proprietățile cu impact asupra comportamentului lor antimicrobian, microorganismele afectate de către respectivele materiale antimicrobiene alături de mecanismul de acțiune antimicrobian specific.
Tabelul 1.3Tipuri de polimeri antimicrobieni funcție de agentul antimicrobian folosit și microorganismele afectatede aceste materiale alături de mecanismul lor de acțiune antimicrobiană (o reclasificareși completare a selecției de materiale antimicrobiene culese deMunoz-Bonilla cu noi variante)[15]
După cum se poate observa din tabelul 1.3domeniul materialelor antimicrobiene a devenit deosebit de complex în ultimii ani. Această situație a survenit ca urmare a dezvoltării medicinei, a farmaciei, dar și datorită atenției mai sporite a publicului larg asupra igienei și implicit asupra calității vieții.Datorită abundenței raportărilor de diverse variante polimerice din domeniul materialelor antimicrobiene este absolut necesară o clasificare a acestora pentru o mai bună orientare în domeniu. Munoz-Bonilla a sesizat această necesitate și a realizat o clasificare a acestora, fără a explica în toate cazurile mecanismele de acțiune ale acestor materiale. Prezentul capitol a revizuit prin completare acest aspect și a realizat actualizarea domeniului materialelor antimicrobiene. Totodată a fost realizată o reclasificare a sistemelor polimerice antimicrobiene, astfel încât orientarea în domeniu să fie mai eficace.
În plus, după diseminarea propriilor rezultate, au mai fost raportate încă două categorii de materiale, iar unele dintre celelalte categorii de materiale polimerice au fost completate cu variante noi. Astfel, în momentul de față tabloul de ansamblu al materialelor polimerice antimicrobiene a devenit incomplet și îmbogățirea paleteiacestor materiale impune o reclasificare. Aceasta a fost realizată și poate fi observată în reprezentarea schematică din fig. 1.3 unde sunt evidențiate cu roșu categoriile polimerice și variantele corespunzătoare adăugate prin contribuția proprie, iar cu gri sunt evidențiate categoriile de materiale polimerice deja existente până în momentul de față.
Parametrii structurali și morfologici ai polimerilor cu caracter antibacterian pot fi deduși pe baza mecanismelor de distrugere a celulelor microbiene.Distrugerea celulelor microbiene poate decurge fie prin acțiunea materialelor antimicrobiene asupra membranei celulare, fie prin mecanismul electrofil.
Oxidanții sunt considerați electrofili extremi, antimicrobienii neoxidanți pot fi electrofili moderați: agenți litici (care acționază asupra membranei) și agenți protonofori care afectează procesele energetice ale membranei.
Cele mai multe substanțe biocide industriale afecteză grupele funcționale tiolice sau aminice din diferite tipuri de proteine sau enzime conținute de celulele bacteriene.
Accesul agenților antimicrobieni la locurile critice este importantă pentru stabilirea domeniului și tipurilor de microorganisme afectate. Astfel, diferența de structură între bacteriile Gram-negative si Gram-pozitive este factorul cheie în interacțiunea lor cu substanțele biocide. În general, din cauza prezenței unei membrane exterioare de lipopolizaharide la bacteriile Gram-negative, există o accesibilitate mai redusă pentru antimicrobienele cu moleculă mare, hidrofobice pentru a ajunge în locurile critice din interiorul celulei, pentru a-și exercita acțiunea [491, 492, 493].
De exemplu izotiazolonele, interacționează inițial cu grupele tiolice din proteinele și enzimele din membrana celulară a bacteriei, inhibă enzima dehidrogenază care controlează procesul respirator al bacteriei, fapt care afectează atât metabolismul cât și creșterea. Respirația fiind întreruptă, celulele vor muri în câteva ore. În acest timp, tiolii intracelulari sunt distruși, se formează radicali liberi care contribuie suplimentar la omorârea bacteriilor [494].
Aldehida formică, glutaraldehida, sitemele eliberatoare de aldehidă formică și condensatele de formaldehidă sunt electrofili moderați care reacționează nespecific cu nucleofilele celulare, de exemplu cu grupele amino din proteine, cauzând reticularea acestora [495].
Alți antimicrobieni, de exemplu MBT și carbamații reacționează cu unele coenzime conținând Fe, distrugând funcționalitatea lor în celulă.
Membrana celulară este o țintă atractivă pentru substanțele biocide. Substanțele biocide litice includ polimerii cuaternari, sărurile cuaternare de amoniu și guanidinele. Aceștia schimbă permeabilitatea membranei celulare, permitând scurgerea lichidului celular, liza osmotică și inhibarea metabolismului asociat membranei celulare. Concentrațiile mici pot cauza scurgerea lichidului celular și întreruperea funcțiilor metabolice iar concentrațiile mari de substanțe biocide provoacă liza întregii mebrane [494,496]. Substanțele biocide activ membranare își datorează activitatea structurii lor amfifilice. Prezența grupelor funcționale hidrofobe și a încărcării pozitive permite acestor substanțe biocide să treacă prin peretele celular și să interacționeze cu membrana celulară. După penetrarea peretelui celular, substanțele biocide activ membranare, se asociază cu fosfolipidele încărcate negativ din peretele celular și își inserează partea hidrofobă. Astfel, membrana se distruge treptat până la pierderea completă a integrității.
Protonoforii pot interacționa și ei cu membrana celulară, dar acționează mai lent față de substanțele biocide litice. Ei acționează ca și conducători de protoni, afectând gradientul de protoni de la nivelul membranei, care este forța motrice a generării energiei celulare. Astfel, celula nu mai poate produce suficientă energie pentru a-și susține funcțiile vitale și organismul începe să moară [494,496]. Aceste substanțe biocide sunt puțin utilizate din cauza vitezei mici de acțiune, necesarului de concentrații ridicate, pH-ului scăzut la care acționează,dar și datorită activității scăzute față de bacteriile Gram-negative (ex.: acidul benzoic, acidul citric, acidul sorbic).
În urma investigării stadiului actual al cercetării este evident că domeniul materialelor antimicrobiene presupune cunoștințe interdisciplinare (microbiologie, chimie, fizică, epidemiologie). Pentru derularea unei cercetări temeinice și solide în ceea ce privește materialele antimicrobiene, aceste aspecte sunt expuse în cele ce urmează.
1.2Tipuri de germeni patogeni care pot contamina materialele
Germenii patogeni cu care materialele pot lua contact, se împart în cinci categorii: bacterii, virusuri, fungi,levuri și protozoare. La rândul lor, bacteriile, funcție de structura peretelui celular, sunt subclasificate în bacterii Gram-pozitive și bacterii Gram-negative. Acest aspect este deosebit de important, deoarece pe baza specificului bacteriei se selectează mediile de cultură și metodele de analiză ale materialelor antimicrobiene.
1.3Materialele și nutriția bacteriilor
Nutriția bacteriilor presupune ansamblul proceselor prin care acestea își procură nutrienții necesarisusținerii funcțiilor vitale, dar și creșterii și înmulțirii lor.Respirația bacteriană este procesul prin care segenerează energia necesară pentru susținerea proceselor metabolice. De multe ori, aceste procese sunt facilitate chiar de materialele cu care bacteriile vin în contact. De exemplu unele materiale polimerice pot reprezenta un bun substrat nutritiv pentru bacterii, prin asigurarea aportului de substanță organică și a altor bioelemente majore ca: O, C, H, N, S, P. Aceste 6 elemente reprezintă 95% din masa uscată a bacteriilor și dețin roluri esențiale în funcționalitatea bacteriilor. Astfel, se explică de ce unele materiale stimulează dezvoltarea microbiană, iarprin modificări de structură și compoziție aleacestora se pot obține materiale antimicrobiene [481].
Funcție deresursa de azot și carbon bacteriile care pot contamina materialele se împart în:
• autotrofe, clasă care este capabilă să crească în absența oricărui compus organic. Astfel ele sunt obligate să sintetizeze compușii organici prin folosirea ca și resursă de Cdioxidul de carbon și ca resursă de N amoniacul, forma mai oxidată nitriții ori nitrații care reprezintă forma cea mai oxidată a azotului.
• heterotrofe sau organotrofe, care folosesc ca și resursă de C numai compușii organici. Din acest motiv unele materiale polimerice pot fi suport nutritiv pentru bacterii, ele fiind sursă de C, dar și energie. Bacteriile care prezintă interes în domeniul medical sunt, în general, heterotrofe. Pentru multiplicare,pe lângă substanțe organice, bacteriile heterotofe mai au nevoie de oligoelemente, ioni și elemente de creștere cum sunt acidul folic, acidul pantotenic,vitamine ca B1, B2, lactoflavina, biotina etc.). Nevoile nutritive ale bacteriilor sunt diferite chiar și în cazul în care ele se încadrează în aceeași specie. Prin urmare, materialelepolimerice, prin natura lor organică, potconstituisubstrat nutritiv pentru bacterii.
1.4 Respirația bacteriană funcție de mediul de amplasare al materialelor
Materialele pot fi amplasate în locuri cu atmosferă normală, pot fi amplasate în interiorul organismelor vii (implanturi), pot fi amplasate în locuri cu atmosferă lipsită de oxigen, etc. Prin urmare, domeniul de aplicabilitate al materialului este un criteriu care trebuie luat în considerare atunci când se dorește efect antimicrobian, pentru că bacteriile se împart după necesarul de O2, în:
• bacterii exclusiv aerobe, care trăiescnumai în prezența oxigenului din aer pe care îlutilizează ca acceptor final de hidrogen.
• bacterii exclusiv anaerobe, care nu trăiescîn lipsa oxigenului, prezența acestuia fiind deosebit de toxică asupra unei culturi bacteriene de acest tip chiar și în cazul unei presiuni de numai 10-5 atm. În acet caz bacteriile folosescexclusiv fermentațiaanaerobă ca reacție energogenetică. În situația în care fermentația se realizează în prezența oxigenului, se generează radicali de superoxid deosebit de toxici pentru celula bacteriană. Comparativ cu bacteriile aerobe, bacteriile exclusiv anaerobe, nu prezintăsuperoxiddismutaza care convertește radicalul superoxid în apă oxigenată. De asemenea, nu prezintăcatalaza care este responsabilă cu descompunerea apei oxigenate. Exemple de astfel de bacterii sunt cele din genurile Clostridium(fig. 1.4), Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium etc. [1s].
→→Fig. 1.4Identificarea coloniilor de Clostridium Perfringensîn atmosferă cu hidroxid de amoniu
• bacterii facultativ anaerobe, care se pot dezvolta atât în prezența cât și în absența oxigenului atmosferic. Ele utilizează ca reacții energogenetice respirația aerobă și fermentația. Majoritatea speciilor de interes medical sunt facultativ anaerobe (de pildă, enterobacteriile).
• bacterii anaerobeaerotolerante, care utilizează numai fermentația în contact cu aerul atmosferic, fără ca oxigenul să participela reacțiile energogenetice. Ele tolerează oxigenul,deoarece au în echipamentul enzimatic superoxiddismutaza și catalaza. Există și situația în care enzimele pot fi procurate din mediul de cultură. De exemplu, bacteriile din genul Streptococcusnu prezintăcatalază, însăse pot dezvolta în condiții de aerobioză pe medii de cultură pe bază de sânge, care asigură suplinirea catalazei.
• bacteriile microaerofile folosesc respirația și fermentația, însăau nevoie de o concentrație mult mai mare de dioxid de carbon decât cea din atmosfera normală pentru reacțiile de carboxilare. De exemplu, unele specii, ca cele din genurile Brucella sauNeisseria au nevoie de concentrații de dioxid de carbon cuprinse între 6 și 10%.
Trebuie amintit că și alți parametri fizici aferenți mediului înconjurător influențează într-un mod decisiv creșterea și multiplicarea bacteriilor.
Temperatura mediului în care este amplasat materialul
Temperarura optimă la care se dezvoltă bacteriile este cea corespunzătoare habitatului lor natural. Din nou amplasarea materialului reprezintă un aspect care trebuie luat în considerare.
În funcție de temperatura agreată, bacteriile se clasifică în psihrofile, care se dezvoltă optim la 20°C, mezofile care se dezvoltă la o temperatură cuprinsă între 20 și 40°C, dar pot fi și termofile, care se dezvoltă optim la temperaturi de peste 45°C. Bacteriile patogene sunt cele mezofile deoarece se dezvoltă la temperatura de 37°C a organismului uman, fiind denumite și bacterii homeoterme.
Trebuie luat în considerare că limitele de temperatură în care bacteriile patogene pot să se dezvolte sunt însă destul de mari și ale variază de la o specie la alta. De exemplu, meningococul și gonococul nu suportă variații de temperatură mai mari de 1-2°C. În schimb, alte specii ca enterobacteriilese pot dezvolta în limite foarte largi.
Deoarece microorganismele sunt sensibile la temperaturi mari,s-a desprinsca șiaplicație practică sterilizarea. Este evident că nu orice material polimeric poate suporta temperaturi ridicate, așadar sterilizarea termică nu poate fi aplicată oricărui polimer. Din acest motiv ideal ar fi ca polimerul însuși să prezinte caracteristica antimicrobiană.
Temperaturile relativ scăzute, ca, de exemplu, cea de +4oC din frigidere, nu omoară bacteriile însăsistează, în general, înmulțirea acestora, viabilitatea lor fiind menținută.
În situația în care o suspensie bacteriană este înghețată la temperaturi nu prea mici față de valoarea de 0oC, structurile bacteriene vor fi lezate de cristalizarea apei. Prin supunerea bacteriilor la îngheț nu vor fi distruse toate celulele suspensiei bacteriene, însă alternanța îngheț/dezgheț repetatăconduce la scădereanumărului de bacterii viabile.Temperatura optimă pentru celulele bacteriene se poate obține cugheață carbonică, deoarece CO2sublimă la -78°C sau cu azotul lichid care vaporizează la -180°C.
pH-ul mediului în care este utilizat materialul
Materialele pot fi amplasate în numeroase medii de diverse consistențe (lichide, semisolide) sau în aer liber, ceea ce presupune diferite condiții de pH. Prin urmare, este important a se lua în considerare toate particularitățile privind domeniul de aplicabilitate. Bacteriile se pot dezvolta în limite destul de largi de pH.Bacteriile patogene pentru om se dezvoltă optim la un pH cuprins între 7,2 și 7,4. Există însă și unele excepții ca, de exemplu, bacteriile din genul Brucella care se pot dezvolta chiar și la un pH acid de 6,0, iar lactobacilii din în flora vaginală suportă chiar și un pH de 3,9.Pe de altă parte, vibrionul holeric agrează condiții depH bazic de până la 9,0 unități. În plus, la determinarea caracterului antimicrobian al materialelor este foarte importantă menținerea unui pH optim pentru a nu obține rezultate fals pozitive. pH-ul este un parametru important care poate stopa cu succes dezvoltarea bacteriilor. Pentru evidențierea importanței pH-ului s-a aplicat o felie de lămâie pe un mediu agarizat inoculat cu bacteria E. coli (fig.1.5).
Fig. 1.5Influența pH-ului asupra dezvoltăriibacteriilor de E. coli
Concentrația de dioxid de carbon din atmosfera în care este utilizat materialul
Necesarul de dioxid de carbon al bacteriilor diferă de la o specie la alta. Astfel, unele specii caN. gonorrhoeaesauNeisseria meningitidis sunt dependente de prezența CO2care poate fi chiar și de concentrații maride până la 10%, pe când alte specii ca, de pildă, S.aureus se înmulțesc la concentrații obișnuite de CO2în atmosferă, anume 0,03%, în timp ce o atmosferă complet lipsită de CO2va conduce la moartea acestora.
Umiditateamediului în care este utilizat materialul
Prezența apei liberereprezintă condiția absolut necesară creșterii și multiplicării microbiene. Din acest motiv hidrofobia materialelor reprezintă un criteriu deosebit de important în ceea ce privește nivelul lor de sanitație. În plus, mediul în care urmează a fi utilizat materialul reprezintă un criteriu care trebuie luat în considerare. Necesarul de apă diferă în funcție de specia bacteriană cu care materialul este contaminat.
Presiunea osmotică exercitată asupra microorganismelor care populează materialul
Celulele bacteriene se dezvoltă optim pe medii izotonice, rezistența lor la variațiile de presiune osmotică fiind incomparabil mai mare comparativ cu cea a celulelor din constituția organismelor superioare. Această rezistență este asigurată de peretele celular bacterian. Prin urmare dacă un material este destinat confecționării de oale sub presiune, atunci aspectul rezistenței microbiologice nu ridică probleme, presiunea distrugând peretele celular foarte subțire. Dacă însă materialele antimicrobiene sunt destinate utilizării în domeniul astronauticii, atunci lipsa presiunii osmotice ar putea crea probleme serioase.
Radiațiile mediului în care este amplasat materialul
● Razele neionizante (UV)
Razelor luminoase devin puternic bactericidede la o lungime de undă de 330nm, crescând pe măsurăce lungimea de undă a luminii UV scade. Mecanismul prin care razele UV afectează bacteriile constă în stimularea formării în celula bacteriană a unor dimeri de timină, datorită cărora apare interferența cu replicarea ADN-ului, ceea ce este fatal pentru celula bacteriană, în timp ce alterările altor elemente din structura bacteriei sunt neglijabile. Pe baza acestui principiu, aplicația practică este reprezentată de lămpile cu vapori de mercur care se folosesc frecvent pentru a asigura un nivel sporit de sanitație în aeruldin sălile de operație, în laboratoarele de microbiologie sau în încăperile în care se derulează cercetări pe animale de expriență etc.
Și razele solareau efect bactericid datorită conținutului acestora în raze UV aferente domeniului 300-400nm. Efectul bactericid al luminii solare este mai mare în țările sudice, deoarece conținutul în raze UV este mare în aceste zone.
● Radiațiile ionizante
Mecanismul de acțiune antibacteriană a acestor raze se bazeazăpe formarea de protoni în celulă, dar și pe formareape termen scurt a unor radicali toxici. Acești produși asigură alterarea bazelor azotate și a legăturilor dintre ele. Este important de specificat că sporii sunt în multe cazuri mai rezistenți comparativ cu formele vegetative ale bacteriilor.
Toate aceste aspecte au fost luate în considerare în derularea părții experimentale a prezentei teze, sistemele polimerice caracterizate fiind analizate prin mai multe metode, astfel încât comportamentul lor în condițiile viitoare de amplasare să fie previzibil.
1.4 Clasificarea materialelor antimicrobiene funcție de mecanismul lor de acțiune
Materialele antimicrobiene acționează asupra celulelor bacterieneîn două moduri: fie prin acțiunea de menținere la distanță a bacteriilor, fie prin omorârea directă acestora. Așadar, în funcție de mecanismul de eliminare al contaminării microbiologice, materialele antibacteriene se clasifică în materiale biopasive și materiale bioactive [215].
Materialele biopasive previn adeziunea bacteriană prin asigurarea unei adsorbții minime de proteine. Acest efect se obține prin acoperirea suprafeței materialului cu filme hidrofile.
Filmele hidrofile formează un strat de interfață care previne contactul dintre suprafața materialului și celulele bacteriene, așa cum este prezentat în figura 1.6.
Dezavantajul acestor materiale este că acoperirea cu filme hidrofile este dificilă, iar execuția se impune a fi realizată perfect, deoarece defectele sunt nedorite. Existența defectelor de acoperire duce la contaminare microbiologică.
Materialele bioactive se clasifică la rândul lor în două categorii: materiale cu eliberare biocidă și materiale contact-active. Prima categorie de materiale omoară bacteriileprin eliberarea de substanțe biocide cu masă moleculară mică, iar cea de-a doua categorie conține materialece depozitează pe termen lung agenții antimicrobieniactivi care sunt eliberați încet în mediu așa cum este prezentat în figura 1.7.
Fig. 1.6 Material biopasiv Fig. 1.7 Material bioactiv
Natura peretelui celular al bacteriei este foarte importantă în ceea ce privește mecanismul de acțiune al materialului antimicrobian. Colorația Gram permite clasificarea bacteriilor în Gram-negative și Gram-pozitive, exemple fiind redate în tabelul 1.5.
Tabelul 1.5 Exemple de bacterii Gram-pozitive și Gram-negative care pot contamina materialele polimerice
Este cunoscut faptul că majoritatea celulelor bacteriene prezintă încărcătură negativă la suprafață, fosfatidiletanolamina fiind componenta majoritară (cazul bacteriilor Gram-pozitive). În cazul bacteriilor Gram-negative existăfosfolipide între cele două membrane pe care le prezintă la suprafață membrana celulară. Datorită acestor aspecte, la nivelul membranei celulare, are loc un fenomen ionic responsabil cu degradarea bacteriilor, așa cum este prezentat în figura 1.8.
Fig. 1.8Reprezentare schematică a mecanismelor de acțiune antibacteriană a materialelor funcție de agentul biocid utilizat
O adaptare după : Luis F. Melo and Hans-Curt Flemming [216]
Activitatea antimicrobiană a materialelor se realizează pe principii funcționale diferite impuse de substanțele biocide utilizate [219]. Astfel, în funcție de organitele celulare afectate și de mecanismul de acțiune al agenților activi utilizați se disting patru categorii de agenți antimicrobieni: a) Moderat Elecrofili, b) Extrem Electrofili (Oxidanți), c) Substanțe Biocide Litice, d) Substanțe Biocide Protonoforezatoare (tabelul 1.6) [216].
Tabelul 1.6Clasificarea agenților antimicrobieni în funcție de mecanismul lor de acțiune[216].
Agenți antimicrobieni Moderat Electrofili
Din această categorie fac parte cele mai multe substanțe biocide neoxidante, ca de exemplu isotiazolonele. Mecanismul de acțiune al acestora constă în reacția cu grupările de tip tiol din proteinele și enzimele critice, eliberându-se radicali liberi toxici pentru celulă. Mai mult, izotiazolonele inhibăenzimele dehidrogenază, afectând metabolismul celular. Inhibarea respirației duce în câteva ore la moartea bacteriei.
Aldehida glutarică conține două grupări aldehidice care pot interacționa cu grupările amino din proteine, instalându-se reticularea între proteine.
Agenții moderat electrofili cu conținut metalic (ex. Fe, Ag) reacționează specific cu macromoleculele intracelulare, astfel încât funcționalitatea coenzimelor celulare este anulată.
Agenți antimicrobieni Extrem Electrofili (Oxidanți)
Agenții antimicrobieni din această categorie, ca de exemplu Cl2, Br2sau alți compuși halogenați, au o natură extrem de reactivă. Mecanismul de acțiune al acestor substanțe biocide constă în halogenarea macromoleculelor din celula bacteriană. Există și oxidanți care nu eliberează halogeni activi, ca de exemplu dioxidul de clor, peroxidul de hidrogen, acidul peracetic, mecanismul de acțiune al acestora constând în generarea de radicali liberi toxici în interiorul celulei bacteriene.
Oxidanții sunt specii agresive, astfel că de la concentrații moderate până la concentrații mari materialele biologice ale celulei bacteriene sunt "arse", reacționând nespecific cu grupele funcționale nucleofile (azot și sulf) din componentele celulare critice: proteine, lipide, adenozin trifosfat (ATP), carbohidrați și acizi nucleici.
Deși aceste specii biocide sunt eficiente în perturbarea metabolică a celulei bacteriene, natura lor extrem de reactivă poate fi un dezavantaj. Pentru a ajunge în interiorul celulei oxidantul trebuie să treacăprin stratul exterior de exopolizaharide (EPS), de peretele celular și de membrana citoplasmatică. Reacția imediată a oxidantului cu aceste straturi externe duce uneori la formarea unei bariere de reacție, ceea ce împiedică pătrunderea substanțelor biocide în interiorul celulei.
Agenți antimicrobieni pe bază de substanțe Biocide Litice – Activ-membranare
Cel mai cunoscut și mai utilizat agent biocid din această categorie este alcoolul. Alte exemple de produse biocide litice sunt compușii cuaternari de amoniu, guadinina, fosfo-derivații. Ținta acestor produse biocide este membrana celulară sau membrana citoplasmatică. Mecanismul de acțiune al substanțelor biocide litice constă în trecerea sarcinilor electrice pozitive prin peretele celular,urmată de interacțiunea cu membrana citoplasmatică. Această interacțiune constă în asocierea cu fosfolipidele încărcate negativ. Astfel integritatea structurii membranare este distrusă. Concentrații mici de agent antimicrobian determină scurgeri de material celular, astfel că funcțiile metabolice sunt alterate, iar concentrații mari cauzează liza celulei.
Agenți antimicrobieni Membranar Activi – protonoforezatori
Agenții antimicrobieni din această categorie țintesc, de asemenea, învelișul extern al bacteriei și sunt conductori de protoni (ex. parabeni și acizi slabi, acid benzoic, acid citric, acid sorbic). Din acest motiv, este foarte importantă cunoașterea polarității peretelui celular al bacteriilor, aceasta fiind diferită funcție de structura internă a peretelui celular.
Mecanismul de acțiune alsubstanțelor biocide protonoforezatoare este reprezentat de fenomenul ionic care începe să se producă la nivelul membranei celulare în prezența agenților antimicrobieni încărcați pozitiv [217]. Acțiunea acestor agenți nu este catastrofală asupra celulei bacteriene. Caracterul biocid al acestor substanțe se bazează pe forța "proton-motive" distribuită transmembranar, astfel că gradientul protonilor (H+) afectează sistemul energetic celular (ATP). În această situație celula bacteriană nu poate produce suficientă energie pentru a-și menține funcțiile, apelând la propriile rezerve, iar când acestea se epuizează celula moare [218]. Acest mecanism antimicrobian se desfășoară lent.
Trebuie menționat căaceastă clasă de agenți antimicrobieni este eficientădoarîmpotriva bacteriilor Gram-negative, la pH mic.
1.6Concluzii
În urma documentării asupra stadiului actual al cunoașterii în domeniul materialelor antimicrobiene se poate concluziona că acestea sunt într-un plin proces de expansiune și că reprezintă un domeniu de actualitate. Pe de altă parte, domeniile largi de aplicabilitate ale materialelor antimicrobiene motivează cercetarea și dezvoltarea de noi variante.
Analizând caracteristicile structurale și morfologice ale polimerilor care pot prezenta caracter antimicrobian raportați până în prezent în literatura de specialitate,s-au putut evidenția următoarele:
-Ținând cont că în condiții fiziologice normale bacteriile prezintă în general o încărcătură electrică negativă, prezența sarcinilor pozitive pe lanțul polimeric, conferă acestuia caracter antimicrobian. Astfel, compuși conținând azot cuaternizat sau grupe fosfoniu vor avea caracter antimicrobian. Ele se atașează prin interacțiuni electrostatice peretelui celular exterior împiedicând metabolismul normal al celulei.
-Cu cât numărul de sarcini pozitive este mai ridicat cu atât perturbarea echilibrului membranar este mai puternică, deci caracterul antimicrobian va crește.
-Deoarece accesibilitatea grupelor încărcate pozitiv la centrii celulari sensibili este importantă, repartizarea grupelor încărcate pozitiv în catena laterală a polimerului și nu în lanțul principal, determină o creștere a caracterului antimicrobian. De asemenea, grefarea lanțurilor cu încărcatură pozitivă pe suprafața polimerului, are același efect, îmbunătățind caracterul antimicrobian.
Sărurile cuaternare de amoniu, cele de diazoniu și fosfoniu, au atașate grupări alchilice, arilice sau heterociclice substituite. Acestea interacționează hidrofob cu membrana celulară, permeabilizând-o. Cu cât aceste grupări sunt mai lungi sau mai ramificate, chiar cu structură dendritică, cu atât caracterul antimicrobian va crește, deoarece distrugerea membranei bacteriene este mai puternică.
Datorită impactului major al grupelor hidrofobe în mecanismul de distrugere al membranei, dacă acestea nu sunt prezente în catena laterală a polimerului, ci în lanțul principal, atunci separarea sarcinilor poate crește caracterul antimicrobian, partea de catenă hidrofobă care le desparte interacționând cu membrana celulară după atacul electrofil al sarcinii pozitive. Pentru a se putea realiza acest lucru, este necesar ca polimerul să aibă o catenă flexibilă, care să permită plierea lanțului și să favorizeze interacțiunea hidrofobă. Acest aspect este evidențiat și în cazul polipeptidelor care adoptă o structură elicoidală, evidențiind o parte exterioară hidrofilă și un interior hidrofob al helixului.
Fig. 1.9Amfificitatea peptidelor – imagine 3D obținută prin RMN (verde – partea hidrofobă, roșu – partea cationică) [215]
-Reticularea polimerilor, rigidizează catena, diminuând posibilitatea fragmentelor de lanț să penetreze membrana celulară, iar dacă reticularea s-a produs prin intermediul grupelor funcționale generatoare de sarcini electrice, atunci caracterul antimicrobian scade suplimentar și prin diminuarea numărului de grupe încărcate electric.
-Creșterea cristalinității polimerului determină creșterea rigidității lui, a compactității structurii și generează suprafețe mai rugoase. Toti acești parametri acționează în sensul diminuării caracterului antimicrobian.
Sarcina pozitivă a unui polimer este totdeauna atașată unui contraion, cu încărcătură negativă.
Atunci când contraionul nu ecranează complet sarcina pozitivă a polimerului, caracterul antimicrobian se manifestă.
În general anionul joacă un rol secundar în imprimarea caracterului antimicrobian unui polimer. Polianionii sunt în general inactivi antimicrobian. Ei pot fi activați doar cu ajutorul unor alte substanțe ca de exemplu a porfirinelor, cu care interacționează și care la iluminare pot genera oxigen singlet care este un antimicrobian oxidativ eficient. Pot fi activați și prin modificarea pH-ului mediului (scăderea acestuia), condiții în care fosfolipidele din membrana celulară se protonează și pot interacționa cu polianionii conducând la distrugerea membranei celulare.
Cationul rămâne în general cel care dictează caracterul antibacterian al unui polimer.
Impactul asupra bacteriilor este diferit funcție de caracteristicile lor. Astfel, bacteriile Gram-pozitive sunt distruse de sarcinile pozitive mai evidente ale polimerilor, în timp ce bacteriile Gram-negative sunt afectate mai puternic de sarcinile mai mici și de un caracter hidrofob mai puternic al agentului antimicrobian.
-Prezența ionilor metalici chelați pe catena polimerică poate conduce la eliberarea lor controlată, evidențiind caracter antimicrobian. Astfel, ionii de cupru chelați s-au dovedit a fi antimicrobienifoarte activi.
-Masa molară a polimerului influențează în general negativ caracterul antimicrobian deoarece capacitatea de penetrare a membranei scade cu scăderea dimensiunii moleculare și implicit a mobilității. De asemenea, masa molară mare favorizează creșterea gradului de cristalinitate care diminuează și el caracterul antimicrobian. Totuși, dacă masa molară mai mare este însoțită de creșterea numărului de grupe polare sau chiar a părților hidrofobe de lanț flexibil, atunci aceasta favorizează caracterul antimicrobian.
În concluzie, polimerii, prin multitudinea de parametri structurali, compozitionali și morfologici care pot fi modificați, oferă posibilități multiple de inducere a caracterului antimicrobian și de adaptare pentru eliminarea specifică a unor microorganisme sau lărgirea spectrului antimicrobian, în funcție de aplicația urmărită.
S-a mai concluzionat că accesul componentelor active din polimer la locurile critice este importantă pentru stabilirea domeniului de aplicabilitate. Deopotrivă este important a se cunoaște și tipurile de microorganisme afectate, deoarece este foarte posibil ca un material să fie eficient împotriva bacteriilor și în același timp ineficient împotriva fungilor.
De asemenea condițiile de mediu în care sunt amplasate și utilizate materialele au o contribuție semnificativă la eficacitatea materialului antimicrobian.
Sintetizarea informațiilor privind domeniul materialelor antimicrobiene, a reprezentat și deschiderea de noi oportunități de cercetare. Astfel, s-a constatat că până în prezent materialele polimerice utilizate în transportul apei potabile au preocupat prea puțin mediul științific, care a derulat cercetări doar din perspectiva substanțelor chimice migrate din materiale, în timp ce aspectele microbiologice sunt neglijate.
Tot pe baza informațiilor acumulate în acest capitol se concretizează lipsa de studii în ceea ce privește posibilitatea obținerii de materiale antimicrobiene utilizând ca materie primă deșeurile polimerice, în condițiile în care actualmente se pune accent pe conceptul de reciclabilitate.
De asemenea, s-a mai constatat că odată cu dezvoltarea domeniilor farmaceutic și medical, clasa hidrogelurilor polimerice antimicrobiene este în momentul de față de mare interes și în continuă dezvoltare. Actualitatea acestor materiale este dictată de evoluția extraordinară a industriei farmaceutice care sintetizează noi tipuri de medicamente cu eliberare controlată. Efectul este posibil prin modularea de matrici polimerice adaptate. Mai mult, dezvoltarea implantologiei ca ramură a medicinii impune dezvoltarea de materiale sigure care să nu afecteze sănătatea umană prin dezvoltarea de infecții nedorite.
PARTEA EXPERIMENTALĂ
2
INSTRUMENTE ȘI METODE DE ANALIZĂ UTILIZATE PENTRU CARACTERIZAREA MATERIALELOR
2.1 Motivația selecției metodelor utilizate și argumentația adecvării lor la scop
2.1.1Metode de caracterizare a materialelor din punct de vedere morfologic și structural
2.1.2Determinări fizico-chimice
2.1.3Determinări microbiologice
Pentru a pune în evidență comportamentul materialelor în prezența microorganismelor și pentru a stabili ce caracteristici ale materialului influențează rezistența microbiologică, au fost utilizate mai multe tipuri de determinări:
fizice: conductivitate electrică,determinarea densității materialelor, absorbții de apă, turbidimetrie, unghi de contact; din această categorie fac parte și determinările optice: microscopie optică, SEM și AFM;spectroscopie FTIR, spectroscopie UV-VIS, potențiometrie, analize DSC, XRD;
fizico-chimice: analiză elementală;
chimice: determinări volumetrice de indentificare a unor specii chimice rezultate în urma activității microbiene;
microbiologice: determinare nivel creștere/inhibare bacterii, fungi și levuri.
Fig.2.1Metode de caracterizare ale materialelor polimerice studiate
Datorită diversității tehnicilor de caracterizare abordate, o clasificare a metodelor utilizate este reprezentată schematic funcție de domeniul uzual de aplicabilitate în figura 2.2
2.1 Motivația selecției metodelor utilizate și argumentația adecvării lor la scop
Domeniul interdisciplinar al materialelor antimicrobiene impune o abordare mai complexă în ceea ce privește metodologia de laborator. Motivația care stă la baza acestei metodologii pe categorii de încercări este următoarea:
I. Determinările de morfologie și structură sunt esențiale atunci când intră în discuțiematerialele antimicrobiene. Unele caracteristici morfologice, ca porozitatea sau rugozitatea suprafeței materialului, sunt factori importanți atunci când se urmărește obținerea de materiale antimicrobiene. În aceeași măsură structura chimică a materialului este esențială atunci când intră în discuție eficacitatea antimicrobiană. Spre exemplu, în general, concentrația de agent antimicrobian din matricea polimerică este decisivă în ceea ce privește eficacitatea materialului pe termen lung. De asemenea modul de dispunere a speciilor antimicrobiene active pe catenele polimerice principale pot influența comportamentul antimicrobian al unui material. Se înțelege astfel că determinările de caracterizare morfologică și structurală sunt vectorii pe baza cărora se poate stabili mecanismul de acțiune al materialului antimicrobian obținut, abordat printr-o viziune de ansamblu, care ia în considerare toate aspectele legate de material și nu în mod sumar, luând în considerare doar aspectele legate strict de agentul antimicrobian utilizat.
II. Determinările fizico-chimice sunt foarte utile, deoarece oferă rezultate preliminare rapide comparativ cu determinările microbiologice care pot dura până la 4 zile. Este cunoscut faptul că prezența ori intensificarea activității microbiene determină modificări chimice în mediul în care materialul se află. În plus corelarea rezultatelor microbiologice cu rezultatele fizico-chimice obținute poate conduce la o strategie în conceperea unui material cu proprietăți controlate.
III. Determinările microbiologice reprezintă modalitatea de bază prin care se evidențiază caracterul antimicrobian al materialului de analizat. Dacă în determinările microbiologice materialul de analizat este adus în contact direct cu mediul de cultură ori cu o suspensie bacteriană de concentrație cunoscută și se determină efectul materialului asupra concentrației de bacterii din mediul nutritiv/ suspensia bacteriană, metoda de analiză este considerată directă.
Chiar dacă principiile de metodă sunt identice, comune pentru toate determinările executate, s-a recurs totuși la o clasificare a metodelor de analiză funcție de entitateasupusă analizei:
Directe – sunt analizele la care probade material este în contact cuun mediu nutritiv de suspensie lichid ori cu un mediu nutritiv solid însămânțat/ inoculat cu tulpini microbiene cunoscute.
Indirecte – sunt analizele la care probade material este în contact cu un mediu natural și nu unul de sinteză. Tehnica este des utilizată în testarea materialelor utilizate în industria alimentară și se bazează pe utilizarea unui stimulator. Stimulatorul cel mai utilizat, cel mai ieftin și la îndemâna tuturor analitiștilor în acest tip de determinări este apa.
2.1.1. Metode de caracterizare a materialelor din punct de vedere morfologic și structural
1. Microscopie optică
Microscopia optică acoperă domeniul de mărire 5X -1000X și este utilizată în general la studiul obiectelor subțiri, ca filme, fibre sau secțiuni tăiate din probe mai groase, care să permită pătrunderea luminii – microscopia optică folosindu-se de lumina transmisă prin probă. De asemenea se utilizează și la studiul texturii suprafețelor, sau formei granulelor, folosind lumina reflectată [373]. Microscopul optic IOR seria 0585-96 echipat cu obiective de 160x….1440x (fig. 2.3), a fost folosit atât pentru a vizualiza compozitele obținute, cât și pentru a determina dimensiunile fibrelor celulozice înainte și după introducerea lor în matricea polimerică. Pentru că metoda este aplicabilă doar la filme transparente, s-au putut vizualiza doar compozitele cu matrice poliolefinică virgină cu un grad ridicat de transparență, excepție făcând compozitele cu matrice HDPE, unde s-a putut observa doar suprafața materialului. Pentru fiecare tip de material compozit s-au preluat imagini, care s-au prelucrat cu ajutorul softului aparatului.
În cazul fibrelor, acestea au fost fixate între două lame de microscop. Pentru fiecare tip de fibră în parte s-au analizat între 10 și 20 de fibre, al căror diametru a fost măsurat în diferite puncte de-a lungul fibrei, tocmai datorită variabilității dimensiunilor fibrelor (în special în cazul fibrelor de banan). S-au realizat cel puțin 100 de determinări pentru fiecare tip de fibră în parte (cu ajutorul softului aparatului – figura 2.4).
2. Imagistică AFM și SEM
Microscopia de forță atomică (Atomic Force Microscopy – AFM) și microscopia electronică de baleiaj (Scanning Electron Microscopy – SEM) sunt tehnici recomandate pentru evaluarea morfologiei materialelor polimerice [374].
Caracterizarea morfologică a suprafeței materialelor compozite s-a realizat deoarece morfologia materialelor compozite influențează în mod pregnant aderarea și proliferarea bacteriilor, după cum este ilustrat de către J. A. Lichter în figura 2.5:
Fig. 2.5Mecanismul de aderare și proliferare a bacteriilor la suprafața materialelor (o adaptare după [375])
Microscopie de forța atomică (AFM)
Tehnica microscopiei AFM permite o bună caracterizare a suprafeței materialelor, în urma analizei obținându-se imagini ale topografiei. Ele oferă posibilitatea determinării diferiților parametri precum: dimensiunea porilor, rugozitatea suprafeței materialului. Topografia materialului reprezintă un criteriu important în ceea ce privește contaminarea sa microbiologică viitoare. La suprafața materialelor se manifesă diferite forțe funcție de mediul în care sunt amplasate (ex. curenți de aer, curenți de apă cum este în cazul conductelor sau piscinelor). O topografie rugoasă a materialului oferă adevărate ‟adăposturi‟ pentru microorganisme (fig. 2.6), în timp ce o suprafață lisă de material împiedică colonizarea cu celule microbiene. De asemenea gradul de rugozitate al suprafeței materialului este important, deoarece o dimensiune a porilor mai mică decât diametrul unei celule bacteriene va reduce semnificativ nivelul de colonizare cu bacterii a respectivei suprafețe, în timp ce o suprafață cu diametrul porilor mai mare decât diametrul unei celule bacteriene va fi foarte expusă pericolului de colonizare bacteriană (fig. 2.6).
celule bacteriene protejate de acțiunea forțelor din mediu
Fig. 2.6 Influența morfologiei suprafeței materialului asupra populării cu celule bacteriene
În funcție de interacțiunea vârfului senzorului de scanare și suprafața probei de analizat s-au identificat trei moduri de analiză AFM, acestea fiind prezentate pe scurt în figura 2.7 [376].
Fig. 2.7 Prezentarea modurilor de analiză AFM
În cadrul acestei teze morfologia suprafețelor s-a studiat în modul semi-contact utilizând microscopul de forță atomică Scanning Probe Microscope Solver PRO-M, NTMDT (Fig. 2.8), cu senzorul de scanare: cantilever de tip NSG 10-Au (caracteristici: 3,4X1, 6X0, 3 mm, de formă paralelipipedică, corpul senzorului având vârf de (L) 95 x (W) 30 x (T) 2 μm, cu o frecvență de rezonanță de 240 kHz și cu constantă de forță de 11,8 N/m). Analiza s-a realizat în condiții de laborator 25˚C, în aer, iar imaginile obținute au fost prelucrate cu ajutorul softului aparatului, urmărindu-se determinarea rugozității suprafețelor studiate.
3. Caracterizarea capacității de udare a materialelor: metoda unghiului de contact
Capacitatea de udare a materialelor reprezintă un un factor deosebit de important în ceea ce privește comportamentul antimicrobian al materialului, datorită dependenței bacteriilor de apă atunci când se află în proces de proliferare. Pentru determinarea capacității de udare a materialelor s-a utilizat metoda unghiului de contact. Principiul metodei constă în aplicarea unei picături de lichid de volum cunoscut (cu tensiune superficială cunoscută) pe suprafața materialului de analizat, urmată de analizarea comportamentului acesteia prin intermediul echipamentului și a softului aferent. Unghiul format de lichid la granița celor trei faze: lichidă, solidă și gazoasă va fi măsurat și monitorizat (figura 2.9), iar interacțiunea dintre cele trei faze este descrisă de ecuația Young (2.1), prin intermediul celor trei componenți a tensiunii de suprafață , ce descriu interacțiunea fazelor solidă / gazoasă (), solidă / lichidă () și lichidă / gazoasă () [416]:
Capacitatea de umectare a suprafeței solidului este evaluată funcție de valoarea determinată a unghiului de contact (vezi tabel 2.1). Interpretarea rezultatelor se realizează astfel:
la valori ale unghiului de contact ɵ < 90˚ se poate aprecia că suprafața materialului analizat ca este una hidrofilă – (dacă lichidul test utilizat este apa), aceasta având capacitate mare de umectare.
la valori ale unghiului de contact ɵ > 90˚, suprafațaeste hidrofobă –(dacă lichidul folosit la analiză este apa) aceasta având capacitate scăzută de umectare.
există două cazuri speciale în cazul în care lichidul de udare este apa, anume:
material super-hidrofil, cazul în care materialele prezintă valori ale unghiului de contact ɵ < 5˚;
material super-hidrofob, cazul în care materialele prezintă valori ale unghiului de contact ɵ > 110˚.
Prin metoda unghiului de contact s-a determinat atât valoarea inițială a unghiului de contact, cât și variația în timp a unghiului de contact (cinetica), ambele analize realizându-se la temperatura camerei.
Determinările s-au realizat cu ajutorul echipamentului de tip SCA20 (Data Physics Instruments) și a softului acestuia. Softul oferă posibilitatea de calcul a unghiului de contact format între tangenta dusă la cercul ce descrie conturul picăturii și suprafața materialului de analizat, determinând astfel capacitatea de udare a lichidului folosit la analiză.
Tabel 2.1Moduri de udare a suprafeței materialelor
Tensiunea superficială a materialelor cu rezistență microbiologică reprezintă un criteriu de influență asupra efectului antimicrobian final. Materialele cu tensiune superficială scăzută țin la distanță praful și germenii din mediul încojurător, cu alte cuvinte sunt rezistente la murdărire, în ultima perioadă de timp punându-se mare accent pe această proprietate a materialelor.
Lichidul test folosit a fost apa, iar valorile tensiunilor superficiale și a componentelor polară și dispersivă a lichidului test se regăsesc în tabelul 2.2. Datele au fost preluate din baza de date a softului aparatului.
Tab. 2.2Parametrii lichidului test (apa) pentru calculul energiei de suprafață acompozitelor
Volumul picăturii a fost menținut constant la 10 μl, în timp ce unghiul de contact a fost măsurat imediat după căderea picăturii pe suprafața de analizat.
De asemenea s-a determinat și energia liberă de suprafață a materialelor obținute, calculată pe baza relației dezvoltată de Owens, Wendt, Rabel and Kaelble (ecuația 2.2), ce au luat în considerare componentele dispersivă (d) și polară (p) (ecuația 2.3) a tensiunii superficiale[417, 418, 16s].
unde, reprezintă tensiunea superficială lichid solid (solid /vapori sau lichid /vapori). Acesta are două componente: reprezintă componenta dispersivă a tensiunii superficiale și care reprezintă componenta polară a tensiunii superficiale.
4. Determinarea absorbțiilor de apă a materialelor
Materialele poliolefinice, în special PE și PP absorb cantități foarte mici de apă. Necesitatea acestui studiu se datorează introducerii fibrelor antimicrobiene în matricea polimerică, a introducerii polimerilor naturali (celuloză, zeină, scleroglucan etc), dar și oxidării polimerilor în timpul ciclului de viață și a reprelucrării lor când sunt reciclați. Toate aceste procedee tehnice de sinteză modifică absorbția de apă a compozitului final.
Din fiecare tip de material compozit s-au tăiat probe egale de formă cilindrică (d x h: 10 x1 mm) cu ajutorul unei preducele, înainte de a fi supuse diferitelor metode de testare. Aceste probe au fost condiționate la etuvă la temperatura de 80˚C pentru 24h, după care s-au cântărit (m0), considerându-se masa probei la timpul t0 (la aceasta valoare se vor raporta toate calculele de absorbții de apă). Fiecare probă în parte a fost imersată în 20 ml apă distilată și cântărită cu ajutorul balanței analitice la perioade de timp bine determinate după ce s-a îndepărtat apa în exces de la suprafața probei. Folosind datele înregistrate s-a calculat mai departe conținutul procentual de apă reținută (S) de către fiecare probă în parte conform relației numărul 2.4:
unde: ms – reprezintă masa probei la un anumit interval de timp (g); m – reprezintă masa inițială a probei înainte de a fi imersată în apă distilată (g).
Determinările s-au executat cu ajutorul unei balanțe analitice (tip Mettler Tolledo AG 204, etalonată și verificată metrologic), balanța indicând masele cu o acuratețe de 10-4 g și cu o precizie (fidelitate) de 10-5 g.
5. Determinarea densității materialelor studiate
Cu cât concentrația de fibre antimicrobiene este mai mare în matricea polimerică cu atât caracterul antimicrobian al materialelor ar trebui să fie mai intens. Adaosul de fibre antimicrobiene și aditivi în matricea polimerică va modifica densitatea finală a materialului obținut, astfel că determinarea densității materialelor compozite este introdusă în acest studiu ca și metodă de analiză, deoarece oferă informații asupra concentrației de agent antimicrobian încorporat în compozit sau informații asupra gradului de acoperire a fibrelor de către matricea polimerică.S-a realizat atât determinarea experimentală cât și cuantificarea acestui parametru. Densitatea materialului este un parametru important ce caracterizează materialul, acesta putând să fie unul dintre factorii decisivi în ceea ce privește aplicabilitatea materialelor în diferite domenii.
Dată fiind densitatea mică a probelor de analizat (în cele mai multe cazuri subunitară), densitatea a fost determinată experimental prin metoda gravimetrică combinată cu determinarea volumului probei. Pentru calculul densității probelor, s-au urmat pași de lucru după cum urmează:
prelevarea probelor din fiecare tip de material (probele având forma cilindrică cu ϕ 10 mm – s-a ales o formă geometrică simplă, pentru a ușura calculul și a elimina influențele colțurilor);
determinarea masei fiecărei probe în parte cu ajutorul unei balanțe analitice (tip Mettler Tolledo AG 204, etalonată și verificată metrologicbalanța indicând masele cu o acuratețe de 10-4 g și o precizie (fidelitate) de 10-5 g.
Fig. 2.10Balanța analitică tip AG 204 MetlerTolledo
determinarea grosimii și diametrului fiecărei probe cu ajutorul micrometrului (acești parametri s-au determinat în mai multe puncte, valoarea utilizată reprezentând media a minim trei măsurători);
calculul densității fiecărei probe în parte cu ajutorul formulei:
unde:ρ – reprezintă densitatea materialului (g/cm3);m – reprezintă masa probei de analizat (g);
V – reprezintă volumul probei (cm3).
Considerând că proba este de formă cilindrică, volumul probei se poate determina folosind formula 2.6.
unde:π –reprezintă constanta matematică a cărei valoare este 3,14;r – reprezintă raza cercului ce constituie baza cilindrului (cm);h – reprezintă înălțimea cilindrului (cm);
medierea rezultatelor obținute pentru cele 3 probe prelevate din materialele compozite analizate.
Pentru determinarea teoretică s-au luat în considerare toți componenții amestecului, densitățile și proporția în care aceștia au fost adăugați, astfel că densitatea materialului obținut s-a calculat pe baza următoarei formule:
unde, este densitatea componentului k, este fracția volumetrică a componentului k, și n este numărul de componenți ai materialului compozit.
6. Caracterizarea structurală prin spectroscopie FTIR
Spectroscopia în infraroșu a fost adoptată deoarece oferă informații importante de compoziție, informații pe baza cărora se poate elucida mecanismul de acțiune antimicrobiană al materialului obținut. Prin analiza FTIR a fost posibilă identificarea substanțelor active implicate și a structurii acestora prin cuantificarea interacțiunii radiației electromagnetice cu substanța, mai exact cu momentul de dipol al legăturilor chimice din moleculele constituente. Nu toate moleculele sunt active în domeniul IR. Condiția principală ce trebuie îndeplinită de o moleculă pentru ca aceasta să poată fi considerată activă în IR, este ca molecula să aibă moment de dipol sau să conțină legături polare.
Interacțiunea radiației electromagnetice cu molecula, va induce modificări ale vibrațiilor atomilor constituenți. Cele mai importante tipuri de vibrații ale atomilor din molecule sunt:
֎ vibrațiile de schelet caracterizează întreaga moleculă (la care participă toți atomii din moleculă);
֎ vibrațiile de legătură caracterizează o legătură (participă doi sau trei atomi), acestea putând fi la rândul lor:
vibrații de întindere (stretching), numite și vibrații de valență (afectează distanțele interatomice de-a lungul legăturilor, deoarece se întind sau se comprimă). Aceste vibrații pot fi:simetrice sau antisimetrice;
vibrații de deformare (afectează unghiurile de legătură dintre atomii implicați) și pot fi orientate:
în plan: forfecare (scissoring), legănare (waging)
în afara planului: legănare (rocking), torsiune (twisting)
În urma analizei s-au înregistrat benzi de absorbție la diferite lungimi de undă, datorate modificării mișcărilor de vibrație ale atomilor în moleculă. Unei benzi de absorbție îi sunt caracteristice lungimea de undă și intensitatea benzii (absorbția intensă este notată cu s – strong; medie –m-medium și slabă –w-weak). În figura 2.11 sunt prezentate cele mai des întâlnite legături ce dau benzi de absorbție în domeniul IR, repartizate în funcție de frecvența vibrațiilor de întindere a acestora. Această reprezentare schematică poate fi utilizată pentru a identifica diferite tipuri de legături, acestea regăsindu-se întotdeauna în zona de frecvență indicată în schemă (±100 cm-1).
Spectrul în infraroșu este o proprietate fizică unică și caracteristică moleculei. Această metodă de caracterizare este aplicabilă în general pentru compușii organici. Este o metodă foarte sensibilă de analiză, cu ajutorul căreia se pot identifica diferiți compuși din proba de analizat pe baza structurii acestora și, de asemenea, se pot determina și modificări structurale ale diferiților compuși sub influența unor factori externi [378,340].
Fig. 2.11 Cele mai comune legături (repartizarea aproximativă a vibrațiilor de întindere) – reproducere după [377]
În cadrul prezentei teze de doctorat, această tehnică de analiză a fost utilizată pentru înregistrarea modificărilor structurale și corelarea lor cu activitatea antimicrobiană în cazul:
fibrelor, după modificarea acestora cu chitină sau prin procesul de mercerizare,
matricii:
la adăugarea diferitelor tipuri de fibre antimicrobiene în diferite concentrații
la folosirea diferitelor tipuri de agenți de cuplare
la evidențierea grupelor polare în polimerii reciclați
la determinarea gradului de cristalinitate a gelurilor de PVA
Toți acești parametri se impun a fi corelați cu activitatea antimicrobiană a materialelor studiate pentru a realiza o caracterizare completă și concisă.
Probele au fost caracterizate utilizând un spectrometru Perkin Elmer BXII prevăzut cu dispozitiv ATR. Domeniul de scanare este cuprins în intervalul 600-4000 cm-1, la rezoluție de 2 cm-1, spectrele înregistrate reprezentând media aritmetică a 4 scanări realizate succesiv. Cu ajutorul soft-ului aparatuluispectrele obținute au fost procesate (netezirea și realizarea liniei de bază).
Pentru că benzile de absorbție din spectrul FTIR obținut corespund fiecare unui tip de legătură prezentă în probele de analizat, acestea s-au identificat cu ajutorul datelor prezente în literatură. Astfel că în tabelele 2.4 și 2.5 sunt sistematizate datele din literatură referitoare la grupele funcționale existente în polimeri, și care s-ar putea forma fie în urma oxidărilor din cadrul ciclului de viață, fie în urma amestecării polimerilor în topitură în vederea obținerii materialelor antimicrobiene.
În tabelul 2.4 sunt prezentate numerele de undă care se absorb în general pentru modificarea diferitelor tipuri de vibrație manifestate în clasele de substanțe ce pot fi întâlnite în constituția materialului de analizat.Acestea pot fi evidențiate în literatură [989].și particularizate pe tip de material component (PE, PP, celuloză).
Tabel 2.4Numere de undă caracteristice tipurilor de vibrație
Tabel 2.5Numere de undă particularizate pe tip de material component
7. Caracterizarea termică a materialului: calorimetrie diferențială
Ca și metodă de caracterizare termică a materialelor folosite în acest studiu, s-a utilizat calorimetria diferențială (DSC). Metoda a fost utilizată deoarece permite determinarea gradului de cristalinitate al materialelor. Cristalinitatea materialului este o caracteristică ceinfluențează rezistența microbiologică a materialelor polimerice. Această metodă de analiză se bazează pe măsurarea cantității de energie absorbită sau cedată de proba de analizat în timpul încălzirii, răcirii sau menținerii la o temperatură constantă a acesteia. În urma analizei se înregistrează modificările fluxului de căldură în funcție de temperatură și timp, modificări ce se asociază cu tranziții ce au loc în material.
Principiul DSC (fig. 2.12) constă în măsurarea fluxului de căldură corespunzător probei de analizat și o referință supuse aceluiași program de temperatură izoterm sau dinamic. Semnalul este direct proporțional cu capacitatea calorică aferentă probei. În cazul în care proba de analizat nu a trecut printr-o transformare fizico-chimică sau printr-o tranziție termică, semnalul DSC va fi liniar. Intensitatea proceselor termice de la nivelul probei, dar și temperatura la care au loc acestea, se evalueaza față de această linie cu rol de referință.
Fig. 2.12 Schema de principiu DSC [10s]
Tehnica DSC oferă informații legate de comportarea termică a unui polimer sau a matricii polimerice dintr-un compozit. Astfel că în urma analizei se pot obține informații directe legate de:
comportarea termică generală;
domeniile de temperatură la care au loc tranzițiile de fază (tranziția sticloasă-Tg, topirea – Tm, cristalizareaTc)
căldura specifică a materialului;
entalpiile specifice tranzițiilor de fază;
stabilitatea în condiții oxidative (OIT);
stabilitatea termică a materialului;
evaluarea compatibilizării în amestecurile de polimeri;
evaluarea efectelor umpluturii introduse în matrici polimere;
evaluarea gradului de cristalinitate a materialului.
Dat fiind faptul că unele dintre materialele analizate sunt sisteme multicomponente, și că fiecare componentă polimerică are gradul ei de contribuție la cristalinitatea totală a sistemului, gradul de cristalinitate al materialului va fi calculat utilizând formula:
unde:reprezintă entalpia de topire caracteristică componentei i polimerice analizate; este entalpia de topire specifică componentei polimerice i, 100 % cristalină (mărime teoretică din literatura de specialitate obținută prin extrapolare): reprezintă procentul în care se găsește componenta polimerică [241].
Toate determinările s-au efectuat cu ajutorul echipamentului Diamond DSC de la Perkin Elmer, în atmosferă inertă (N2) , de la 0 șC la 300 șC, cu o viteză de încălzire de 10 ș C / min, 10-15 mg de probă au fost închise într-o capsulă de aluminiu. În toate cazurile s-au realizat două cicluri de încălzire, primul ciclu având scopul de a înlătura influența tratamentelor termice asupra materialelor și implicit asupra proprietăților acestora.
Determinarea cristalinității prin XRD
Deoarece cristalinitatea reprezintă o caracteristică de influență în cazul materialelor antimicrobiene, structura cristalină a materialelor a mai fost determinată și prin difracție de raze X, utilizând difractometrul Bruker-AXS D8 Advance, cu radiație Cukα1, λ = 1,54016 Å, viteză de baleiere de 0,03 ș s-1, în domeniul 2ϴ = 10 ÷ 60 ș.
În tabelul 2.6 sunt date valorile 2ϴprezentate în literatură pentru principalele tipuri de polimeri utilizați în acest studiu.
Tabel 2.6Picuri de cristalinitate specifice principalelor materiale polimerice
Prin intermediul analizei XRD s-a putut determina cristalinitatea totală a materialelor analizate. Acesta s-a realizat luând contabilizândtoate picurile cristaline 2ϴ semnificative, utilizând relația (2.9):
unde: – cristalinitatea totală a probei determinată prin XRD; Ac – aria picului cristalin; Aa – aria picului amorf.
Analiza elementală
Prin intermediul acestui tip de analiză s-au analizat atât compozitele cu potențial antimicrobian, cât și fibrele celulozice utilizate ca agent antimicrobian. Scopul utilizării acestei metode este determinarea compoziției elementale a acestor componente de bază pentru identificarea elementelor care generează caracterul antimicrobian. Instrumentul folosit este un analizor CHNS-O model EuroEA3000 produs de către Euro Vector Italia. Schema de principiu a instrumentului este prezentată în figura 2.13.
Sistemul folosit includeanalizorul CHNS-O dotat cu autosampler. Echipamentul este prevăzut cu software-ul Callidus. De asemenea, la acest sistem este conectată și o microbalanță Sartorius CP2P.
Ca și principiu general de funcționare, sistemul realizează combustia probei într-un amestec de heliu și oxigen la temperaturi de peste 1000oC (ecuațiile de reacție 2.10-2.13), iar gazele rezultate (CO2, H2O, SO2, NO) sunt trecute printr-o coloană cromatografică, unde are loc separarea lor și apoi sunt analizate de detectorul TCD (detector de conductivitate termică) termostatat (40 – 190oC), astfel că la finalul analizei sunt identificate și cuantificate. Cuantificarea se realizează cu ajutorul unei curbe de calibrare [13s].Pentru analiză este necesară o cantitate mică de probă (≈ 1mg), care este introdusă într-o capsulă de staniu. Rezultatele obținute reprezintă media a minim trei determinări.
Parametrii metodei de analiză utilizați pentru caracterizarea probelor sunt:
presiunea gazului purtător: 100 kPa
debitul de Heliu: 80 ml/min
cantitatea de oxigen folosită pentru combustie pentru o analiză: 15 ml
timpul de combustie: 6,6 secunde
timpul total al analizei: 300 secunde
temperatura în cuptorul unde este amplasată coloana cromatografică: 100 °C
temperatura de combustie: 980 °C
Determinări fizico-chimice
1. Determinarea oxidabilității apei de contact cu materialul de analizat
Determinarea conținutului de substanță organică din apa de contact cu materialul de analizat (lichidul test utilizat ca stimulator) s-arealizat prin determinarea oxidabilității. Determinarea conținutului de substanță organică din apa de contact cu materialul a fost utilizată din mai multe considerente după cum urmează. Înseși microorganismele sunt constituite din substanță organică. Prezența acestora în apa de contact cu materialul, intensificarea activității microbiologice, dar și prezența produșilor rezultați în urma proceselor metabolice, sunt aspecte ce se pot detecta rapid prin determinarea oxidabilității. În plus, pentru a detecta dacă din polimerii utilizați migrează substanță organică după contactul prelungit cu apa, determinarea oxidabilității reprezintă metoda cea mai adecvată scopului. Determinarea oxidabilității s-a realizat prin metoda standardizată ‟SR EN ISO 8467 / 2001: Apa potabilă. Determinarea indicelui de permanganat‟. Aceasta este o metodă volumetrică.
Indicele de permanganat reprezintă concentrația masică de oxigen echivalentă cu cantitatea ionilor permanganat consumați atunci când proba este tratată cu permanganat de potasiu în mediu de acid sulfuric. Principiul acestei metode constă în faptul că proba se tratează cu o cantitate cunoscută de permanganat de potasiu în mediu acid, timp de 10 minute, pe o baie de apă la fierbere (fig. 2.14), perioadă în care o parte din cantitatea de permanganat este redusă de substanțele oxidabile din probă, iar permanganatul nereacționat (neredus) se determină cu soluție oxalat de sodiu adăugată în exces; la final se măsoară prin titrare cu permanganat excesul de oxalat de sodiu.
Echipamentul utilizat pentru aducerea probelor la temperatura optimă de reacție a fost o baie de apă de tip Julabo TW12, iar echipamentul utilizat pentru măsurarea volumelora fost o biuretă automată Hirshman etalonată anual, deoarece în cadrul acestei analize ea reprezintă echipamentul critic de măsurare.
Fig. 2.14Baia de apă Julabo
2. Determinarea spectrofotometrică a concentrației ionilor de amoniu din apa de contact cu materialul
Cunoscând faptul că descompunerea bacteriilor implică formarea de ioni amoniu, dar și că celulele bacteriene viabile în urma proceselor metabolice eliberează compuși ai azotului, s-a recurs la determinarea conținutului de amoniu din lichidul cu rol de stimulator – apa de contact cu materialul. Acest tip de testare oferă informații rapide asupra activității microbiene desfășurate în apa de contact cu materialul. Un material care stimulează creșterea microbiană va conduce la valori mai crescute ale parametrului amoniu. Prin această metodă poate fi realizată și o comparație între eficacitatea antimicrobiană a mai multor materiale care au luat contact cu apă de aceeași calitate inițială ori cu aceeași suspensie bacteriană de concentrație inițială în amoniu cunoscută. În plus compușii azotului, anume amoniul, nitriții și nitrații oferă informații importante legate de perioada de timp scursă de la momentul contaminării. Astfel,prezența ionului amoniu în apa de contact cu materialul indică un prim stadiu al proceselor de descompunere biologică a substanțelor organice, așadar o poluare recentă. Amoniacul se produce prin degradarea incompletă a substanțelor organice.
Principiul metodei constă în măsurarea spectrofotometrică, la 650 nm, a intensității culorii unui compus rezultat din reacția amoniului cu ionii acidului salicilic și hipoclorit în prezența nitroprusiatului de sodiu, colorația (fig. 2.15) fiind direct proporțională cu concentrația de amoniu a probei respective. Ionul hipoclorit rezultat prin hidroliza alcalină a dicloroizocianuratului de sodiu generează cu amoniacul prezent în probă cloramină; aceasta, la pH =12.6, reacționează cu salicilatul de sodiu în prezența nitroprusiatului de sodiu cu formarea complexului a cărui intensitate de culoare se măsoară spectrometric. Citratul trisodic adăugat în proba de analizat elimină interferența cauzată în special de cationii Ca2+/Mg2+.
Fig. 2.15 Colorația ionului amoniu în prezența acidului salicilic
Spectrofotometria UV-VIS este o metodă fizico-chimică prin care se măsoară intensitatea luminii transmise de o soluție colorată atunci când aceasta este străbătută (traversată) de un flux luminos. Lumina albă este compusă din radiații diferit colorate, la fiecare culoare corespunzând o anumită lungime de undă.
Echipamentul utilizat este dotat cu filtre optice care pot selecta din lumina albă numai o anumită lungime de undă (”lumina” de o anumită culoare a spectrului) care va traversa soluția colorată. ”Lumina” filtrată este incidentă pe soluția colorată supusă analizei și aceasta absoarbe o anumită cantitate de ”lumină”. Absorbția este proporțională cu intensitatea colorației soluției analizate, respectiv cu concentrația acesteia. O soluție colorată absoarbe, în general, radiația (lumina) corespunzătoare culorii complementare, conform schemei din figura 2.16.
Lumina incidentă, I0Lumina transmisă, I
Fig. 2.16 Reprezentarea schematică a principiului spectrofotometriei UV VIS
Pentru domeniul ”vizibil” –VIS – sursa de lumină este o lampă cu filament din wolfram, iar cuva în care se pune soluția este din sticlă optică.
Pentru domeniul ”ultraviolet” –UV – sursa de lumină este o lampă cu deuteriu sau cu halogen, iar cuva în care se pune soluția este din cuarț.
Echipamentul utilizat a fost un spectrofotometru de tip UV–VIS T60 de la PG INSTRUMENTS (fig. 2.17), etalonat anual și verificat metrologic semestrial pe următoarele domenii de lungimi de undă:
Violet: λ = 400 – 420 nm
Indigo: λ = 420 – 440 nm
Albastru: λ = 440 – 490 nm
Verde: λ = 490 – 570 nm ; λ ( UV ) = 100 ÷ 400 nm
Galben: λ = 570 – 585 nm
Orange: λ = 585 – 620 nm
Roșu: λ = 620 – 780 nm
Atunci când se efectuează determinări se compară defapt soluția de analizat cu o soluție etalon. De aceea se construiește o curbă de etalonare care permite citirea directă a concentrației cu ajutorul soft-ului UV WIN de la PG INSTRUMENTS.
Curba de etalonare se construiește cu ajutorul a 8-10 soluții de concentrații cunoscute – soluții etalon.Pentru fiecare etalon (concentrație) corespunde o anumită absorbanță datorită absorbției diferite a luminii incidente de către soluția respectivă. Coroborând cele două date – concentrația etalonului și absorbanța corespunzătoare – se trasează graficul de etalonare.
Fig. 2.17Spectrofotometru UV–VIS T60 PG INSTRUMENTS
3. Determinarea spectrofotometrică a conținutului de nitriți din apa de contact cu materialul de analizat
Așa cum s-a specificat și anterior compușii azotului reprezintă indicii ce denotă o posibilă activitate microbiană. Dacă amoniul prezent în probă indică o contaminare recentă, prezența nitriților indică un stadiu mai avansat al proceselor de descompunere biologică a substanțelor organice, așadar o contaminare mai veche a probei și mai puțin periculoasă pentru sănătatea umană.
Nitriții apar în probă ca urmare aoxidării incomplete a amoniacului în prezența bacteriilor nitrificatoare. Prin descompunerea biologică a compușilor organici care conțin azot se produc nitriți, ceea ce determină prezența sau creșterea concentrației normale a acestor anioni în proba de analizat.
Metoda aplicată este una standardizată anume "SR EN 26777 / 02/C91 / 06. Determinarea conținutului de nitriți"și este o metodăde absorbție moleculară care verifică prezența ionului NO2-în apa de contact cu materialul cu rol de stimulator.
Principiul metodei se bazează pe faptul că în mediu acid, pH = 1.9±0.1, ionii nitrit din apă formează cu 4-aminobenzensulfonamida o sare de diazoniu care cuplează cu N(1naftil)etilendiamina, un complex de culoare roșie care poate fi măsurat spectrofotometric. Cantitatea de lumină absorbită de compusul azoic colorat este direct proporțională cu concentrația acestuia, respectiv cu a ionilor NO-2, măsurarea efectuându-se la lungimea de undă de 540 nm.
Eventuale interferențe se pot datora :
– Prezenței de materii solide în suspensie, situație în care se recomandă filtrarea probei prin membrană filtrantă cu porozitate 0,45μ.
– Alcalinitate crescută: dacă volumul de apă luat în lucru tratat cu rectivul de culoare nu asigură pH-ul de reacție (pH=1.9±0.1), proba se acidulează ușor cu sol.1,5m H3PO4, astfel încât să se ajungă, după tratare, la pH-ul de reacție.
– Colorație a probei netratate cu reactiv: se tratează o a doua probă cu 1 ml sol.1,5m H3PO4 în loc de reactiv de culoare care se măsoara spectrofotometric; absorbanța acesteia se va scădea din absorbanța probei respective.
Echipamentul utilizat este un spectrofotometru Spectrofotometru T92+ de la PG Instruments(fig. 2.18) etalonat și verificat metrologic semestrial. Spectrofotometrul T92+ este conectat la un PC care are instalat soft-ul UVWin 5.0.
Fig. 2.18Spectrofotometru T92+ PG Instruments
Spectrofotometrul T92+ lucrează în domeniul UV-VIZIBIL, având domeniul de lungimi de undă cuprins între 190nm și 1100nm, elementele constructive principale fiind:
# Monocromatorul cu rețea de difracție: domeniul de lungimi de undă: 190-1100nm, acuratețe: ± 0,3 nm, lățimea benzii spectrale: 0,1nm – 5nm cu incremente de 0,1nm;
# Suportul cuvei: stativ cu 2 poziții pentru cuve de 10/40 mm (poziția față pentru proba de analizat/ poziția spate pentru blank).
Detaliile legate de prepararea soluțiilor necesare etalonării, detaliile legate de performanțele curbei de etalonare, raportul de validare și cel de asigurarea calității rezultatelor sunt anexate prezentei teze.
4. Determinarea spectrofotometrică a conținutului de nitrați din apa de contact cu materialul supus studiului
Nitratul reprezintă o altă formă în care se poate regăsi azotul. Nitratul reprezintă cea mai oxidată forma chimică a azotului întâlnită în sistemele în care au avut loc procese biologice de descompunere a substanței organice. Ionul nitrat ( NO-3) este unul dintre cei mai solubili anioni în apă.Prezența nitraților în probă se datorează metabolismului bacterian, indicând dezvoltarea bacteriilor în mediul de contact cu materialul.
Metoda utilizată este una standardizată, anume SR ISO 7890-3 / 2000: Apa potabilă. Determinarea conținutului de nitrați, acesta fiind o analiză spectrofotometrică, mai precis spectrometrie de absorbție moleculară.
Principiul metodei de analiză se bazează pe adăugarea la probă a salicilatului de sodiu și a acidului sulfuric obținându-se acidul sulfosalicilic. Acesta reacționează cu azotatul din apa de contact cu materialul. Ulterior, prin tratare cu soluție alcalină rezultă un compus de culoare galbenă. Intensitatea colorației soluției se masoară spectrofotometric la lungimea de undă de 415nm.Cantitatea de lumină absorbită de compusul colorat este direct proporțională cu masa de azot (mN) din azotați.Sarea disodică a acidului etilendiaminotetraacetic (EDTANa2) din soluția alcalină previne precipitarea sărurilor de calciu și de magneziu. Azida de sodiu adăugată are rolul de a înlătura interferența cu azotiții.Daca proba de apă prezintă materii în suspensie, aceasta se filtrează prin membrană filtrantă de fibră de sticlă.Probele care au un pH mai mare de 8 se neutralizează cu acid acetic.Potențialele substanțe interferente din probă sunt clorurile, ortofosfații, magneziul și manganul.
Echipamentul utilizat este spectrofotomentrul folosit și la determinarea nitriților (fig. 2.18). În plus, a fost necesară utilizarea unei băi de nisip de tip RAYPA BS-3920 (fig. 2.19), pentru evaporarea apei din probă. Domeniul de temperatură al băii utilizate este: 50˚C ÷ 400˚C.
Fig. 2.19Baia de nisip RAYPA BS-3920
Conținutul de azotați din probă, exprimat în mg/ L, se calculează cu relația:
Concentrația de NO-3= · 4,427[mg/ L] , unde: m(N): masa de azot (μg)
V: volumul de probă luat în lucru (ml)
5. Nefelometrie
Turbiditatea a fost determinată pentru a observa dacă activitatea microbiologică din stimulator – apa care a luat contact cu materialul de analizat se intensifică. Turbidimetria este ades utilizată pentru determinarea concentrației de celule bacteriene aflate în suspensie (fig. 2.20). Suspensiile bacteriene au ca echivalenți nivele de turbiditate prestabilite [253,254]. Din acest motiv, creșterea turbidității după contactul prelungit al apei cu materialul polimeric oferă certitudinea că bacteriile s-au multiplicat. Un alt avantaj al acestei metode este reprezentat de timpul foarte scurt de depistare a intensificării activității microbiene, în comparație cu metodele microbiologice clasice care durează până la 4 zile.
Fig. 2.20 Împrăștierea razei incidente de către bacteriile aflate în suspensie (schemă originală)
Turbiditatea inițială a probei poate fi de natură chimică (substanțe coloidale, nedizolvate în suspensie) sau de natură bacteriană (bacterii în suspensie sau produșii lor de metabolism).
Celulele bacteriene aflate în suspensie determină împrăștierea unui flux luminos incident. Turbidimetrul optic măsoară tocmai intensitatea aceastei raze împrăștiate – difuzate – la un unghi de 90˚ față de raza incidentă, măsurare care exprimă turbiditatea probei respective. Principiul metodei este ilustrat în fig. 2.21.
Fig. 2.21 Principiul de măsurare al turbidității (conform manual de utilizare HACH TU5200)
Avantajul măsurătorilor la un unghi de 90˚ față de raza incidentă este dat de minimizarea erorilor care pot să apară atunci când particulele în suspensie au mărimi diferite (fig. 2.22). Acesta este și motivul pentru care s-a utilizat nefelometria și nu altă metodă. În microbiologie se folosesc adesea densitometre, însă acestea se pretează doar pentru suspensiile bacteriene pure, nu și la amestecuri de entități de mărimi diferite aflate în suspensie.
Fig. 2.22Evaluarea corectă a particulelor de dimensiuni diferite oferită de nefelometrie (conform manual de utilizare HACH TU5200)
Pentru determinarea turbidității au fost utilizate două turbidimetre, anume un turbidimetru WTW 430 IR, Germania (fig. 2.23) și un turbidimetru HACH TU5200 (fig. 2.24).Determinarea turbidității s-a realizat în conformitate cu SR EN ISO 7027 / 2001. În decembrie 2016 Asociația Română de Standardizare a revizuit această variantă și a înlocuit-o cu SR EN ISO 7027 / 2016.
Turbidimetrele au fost calibrate cu soluții standard certificate de formazină pentru care este cunoscută valoarea turbidității exprimată în unitățile de măsură specifice – unități nefelometrice de turbiditate. Domeniul posibil de etalonare al turbidimetrelor este 0,02 NTU – 10 NTU – 1000 NTU, acest domeniu răspunzând oricărei concentrații de celule bacteriene care ar putea apărea în
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: A. MOLDOVAN: Materiale compozite pe bază de deşeuri poliolefinice şi fibre naturale [304399] (ID: 304399)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.