Polymerase -Chain -Reaction Assay for Cytomegalovirus Screening in Newborns . N Engl J [630366]

217
Polymerase -Chain -Reaction Assay for Cytomegalovirus Screening in Newborns . N Engl J
Med. 2011 Jun 2;364(22):2111 -8.
10. Vladimir Nahaba : Metodele molecular genetice de cercetare (PCR) în diagnosticul de
laborator al infec țiilor , Chi șinău 2009 , 7-14 p.
web site : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed .

TESTUL HPV – DETECTAREA ȘI GENOTI PAREA TULPINILOR CU RISC
ONCOGEN ÎNALT / SCĂZ UT
Natalia Gheciu, Aliona Chirca , Anatol Viș nevschi
Catedra Diagno stic de Laborator clinic USMF ‘’Nicolae Testemițanu’’

Summary
HPV test – detection and genotyping of the strains with high / low oncogenic risk
Human Papillomavirus (HPV) is the most common cause of cervical cancer. Cervical
cancer represents the second m ost common cause of death after breast cancer, affecting women
of different age groups; with a prevalence of over than about 20% in young sexually active
women. Among different types of HPV, type HPV16 -18 represents major strains causing this
cancer and be ing sexually transmitted it had been unnoticed for decades. Elaboration and
implementation of various diagnostic methods prove to be an effective way in eradicating the
oncogenic potential of HPV.

Rezumat
Papilomavirus uman ( HPV) este cea mai frecventă cauză a cancerului de col uterin .
Cancerul cervical reprezintă a doua cauză de deces la femei dupa cancerul mamar care
afectează femeile de diferite vârste cu o prevalență mai inaltă de aproximativ 20% la cele tinere
active sexual. Printre diferite tipuri de HPV , tipul 16 -18 sunt tulpini majore care cauzează acest
tip de cancer . Elaborarea și implimentarea diverselor procedee de diagnosticare se dovedesc a fi
o modalitate eficient a în eradicarea potențialului oncogenic de HPV .

Actu alitatea
Cancerul cervical este una din cauzele de bază a mortalității femeilor, îndeosebi a celor
tinere. Raportul variază peste tot in lume , dar o rată semnificativ de mare a fost stabilită în țările
occidentale [11]. În urma unor analize statistice și geografice s -a demonstrat ca nivelul HPV e
mai mare la femeile americane decât la cele caucaziene.[8]
Conform statisticilor a Organizației Mondiale a Sănătății (OMS) sunt înregistrate
aproximativ 500.000 de cazuri noi anual din care 250.000 cazuri sunt fatale. Conform celor mai
recente rapoarte , femeile sunt predispuse la această infecție de două ori mai mult decât bărbații
[9].
Prevalența globală a HPV în rândul femeilor indiferent de rasă constituie o rată de 17,9%
în timp ce barbații au o rată de 8%. Persoanele cu multipli parteneri sexuali sunt predispuși la un
risc mai mare de infectare cu HPV de 20,1% față de persoanele care au un singur partener
sexual pe intreaga durată a vieții sexuale, la care riscul de infectare cu HPV e de 7% [8].
Virusul Papiloma Uman este un virus frecvent intâlnit care cauzează leziuni celulare sau
tumori la nivelul pielii; deasemenea poate determina modificări ale țesuturilor de la nivelul
membrelor superioare și inferioare, corzilor vocale, gurii și organelor g enitale [13].

218
Tipurile HPV
Actualmente sunt identificate mai mult de 100 tipuri de HPV, fiecare tip având tropism
către anumite țesuturi. Modificările tisulare determinate de anumite tipuri de HPV pot servi ca
substrat pentru dezvoltarea cancerelor o rganelor genitale feminine.
În funcție de asocierea lor cu cancerul și gradul de patogenitate diferite genotipuri de
HPV sunt clasificate în tipuri cu risc oncogen scăzut și risc oncogen inalt. Genotipurile "cu risc
scăzut" sunt rareori asociate cu can cer în timp ce genotipurile "cu risc ridicat" sunt mult mai
susceptibile de a conduce la dezvoltarea cancerului.
 Genotipuri cu risc crescut (oncogene sau cancer asociate) sunt: 16, 18, 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 și 82
– Posibile genotipur i cu risc ridicat includ: 26, 30, 34, 53, 66, 67, 69, 70, 73, 82, 85 și 97.
– HPV 16 este tipul predominant , provocând mai mult de 50 % din cazurile de cancer ;
urmează HPV 18 provocând 14%; și HPV 45 cu 2,8% cazuri. Aceste genotipuri sunt
foarte răspândite în toate regiunile din lume și sunt responsabile în aproximativ 70 % de
dezvoltarea cancerului de col uterin [11,15]. HPV tipurile 52 și 58 sunt rare în țările
occidentale , cu toate acestea , ele sunt predominante în populația din Asia în special în
Chin a (5, 14, 15, 28, 29).
 Genotipuri cu risc scăzut (non-oncogene) sunt: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 73 și 81.
– Genotipurile 6 și 11 determină aproximativ 90% dintre cazurile de negi anogenitali. Cu
toate acestea, genotipurile care cauzează condiloame anogenitale, de obicei, nu produc
cancer[11,15].

Cauzele si factorii de risc in dezvoltarea HPV
În ceea ce privește cauzele dezvoltării infecției cu HPV sunt implicați o multitudine de
factori. Comportamentul sexual este cel mai important factor pentru tulpinile cu risc oncogen
înalt [9]. În ciuda comportamentului sexual alți factori ar putea fi, de asemenea implicați în
dezvoltarea acestei infecții . Este important de menționat că nu toate infecțiile cu HPV duc la o
boală malignă, cu toate acestea , cele două tulpini de HPV care sunt HPV 16 si HPV 18
contribuie la dezvoltarea în principal al cancerului de col uterin [9].
Alți factori includ fumatul , utilizarea extinsa de contraceptive orale ș i prezența bolilor cu
transmitere sexuală. Factorii care dease menea sporesc incidența cancerul de col uterin includ
imunosupresia , persistența virusului , și administrarea de hormoni steroizi [8,9].

Proteinele structurale
Există două proteine, L1 si L2, care formează structura icosaedrică a virionului. L1 este
proteină majoră a capsidei, in timp ce L2 reprezintă componența minoră. L1 singură poate forma
structura icosaedrică în celulele eucariocite. Microscopia electronica a demonstrat că L1
formează particule aproximativ de mărimea unui virion complet, motiv pentru care sunt numite
particule virus -like (VLPs). Proteina L2 poate și ea sa aibă expresie la nivelul celulelor unde va
forma o structură capsidica similară cu L1. Expresia comună a L1 și L2 determină creșterea
nivelului de VLPs, sugerând că L2 ajută astfel l a stabilizarea capsidei. L2 poate funcționa la
nivelul virionilor pentru a lega genomul.
Importanța sistemului VLPs o reprezintă faptul ca s -a arătat pentru prima dată că există
diferențe serologice între tipurile de HPV, chiar și între acelea foarte aprop iate. De exemplu,
proteina L1 a tipurilor virale HPV16 și –31 care împart 76% din identitate la nivelul
aminoacizilor, are reactivitate serologică incrucișată foarte scăzută, iar tipurile HPV6 si –11 care
au 92% omologie, prezintă patru diferențe în reacti vitatea reciprocă.
Astfel, studiile serologice pentru depistarea infecțiilor specifice HPV pot fi deosebite
doar prin folosirea VLPs. O consecință a acestei descoperiri este aceea că dacă s -ar produce un

219
vaccin, ar trebui incluse mai multe tipuri virale di n moment ce un singur tip nu induce protecție
incrucișată.

Infecția HPV la nivelul cervixului normal
ADN -ul HPV poate fi depistat in celulele cervicale la femeile la care cervixul apare
normal la colposcopie. Incidența depistării variază dramatic în funcț ie de metoda utilizată, de
vârstă și de grupul demografic studiat. Cea mai sensibilă tehnică este PCR care a inregistrat
niveluri de pozitivitate de 80% pentru HPV16 la femeile cu cervix normal [4,13].
Este dificil de comparat multe din rezultatele acesto r studii la femeile normale pentru că
subiecții aveau vârste diferite, metoda de depistare a fost diferită, femeile au avut niveluri socio –
economice diferite, iar definiția clinică a “normalului” a variat; unele studii s -au bazat numai pe
rapoartele citolo gice, fără sa fie efectuată colposcopia.
Incidența cea mai mare a depistării se întâlneste la femeile tinere. Într -un studiu efectuat
la studentele din Berkeley s -au obținut 33% rezultate pozitive pentru HPV prin tehnica PCR.
Rata prevalenței la nivelul ce rvixului si vulvei a fost de 46%. Este una dintre cele mai mari
incidențe raportate [4,13].
HPV tipurile 16 și 18 care sunt frecvent întâlnite în bolile maligne, reprezintă
aproximativ o treime din virusurile detectate, ceea ce înseamnă că o mare parte d in femeile tinere
pot fi infectate cu aceste virusuri care determină cancerul [8]. Este evident că numai un număr
mic vor dezvolta boala, dar recunoașterea celor cu risc nu este posibilă în prezent. La grupele de
vârstă mai mari (>35 de ani) rata depistări i scade și, în timp ce la 20 de ani majoritatea femeilor
sunt negative pentru boală, femeile peste 35 de ani infectate cu un tip oncogenic sunt mai
predispuse la boală. Astfel, la grupa de vârstă mai mare, infecția cu HPV este predictivă pentru
boală și po ate indica un grup la care testarea ADN are valoare diagnostică [2,8].
Este clar ca există o incidență mai mare a infecției la grupele de vârstă mai tinere, cu
valori de pană la 46% la femeile de 20 de ani, dar acestea scad la <10% la cele peste 40 de ani și
< 5% la femeile peste 55 de ani [8]. Este posibil că dacă toate femeile din grupul de vârstă < 25
de ani ar fi testate prin screening ADN la intervale regulate pe o perioadă de 5 ani, toate cele
active sexual ar fi HPV pozitive la un moment dat, deși i nfecția și boala ar fi tranzitorii la
majoritatea.
Deși cervixul este descris ca fiind normal la aceste femei pe criteriul “absenței de celule
anormale” la examenul citologic și pe aspectul normal la colposcopie, este aproape sigur că aria
în care are loc replicarea virală este anormală din punct de vedere histopatologic. Până acum
nimeni nu a arătat replicare a HPV în țesuturile normale. Există probabil microleziuni prezente la
nivelul cervixului când o femeie prezintă infecție subclinică cu HPV.
Studiile serologice au arătat rezultate pozitive la grupele de vârstă care nu sunt în mod
normal asociate cu bolile cu transmitere sexuală [5]. Folosind în special proteine bacteriene
fuzionate care conțin proteine HPV, s -au obținut rezultate pozitive pentru HPV ge nital la diferite
grupe de vârstă, inclusiv la copii. Datorită faptului ca proteinele fuzionate nu conțin epitopi nu
este clar în prezent dacă rezultatele reprezintă infecții cu diferite tipuri de herpes genital cum ar
fi HPV6 sau 16 sau reactivitate incru cișată cu tipurile cutanate de HPV, din moment ce multe
proteine au niveluri crescute de conservare.

HPV si cervixul anormal
Cea mai frecventă leziune genitală produsă de infecția cu HPV este veruca genitală
benignă condyloma acuminatum, determinată predo minant de HPV6 și 11. Cu toate acestea, cum
s-a discutat înainte, anumite papilomavirusuri determina de asemenea boli premaligne și maligne
la nivelul cervixului. Verucile sunt distribuite la nivelul cervixului, pe pereții vaginului, vulvă și
în regiunea p erianală. La bărbați leziunile apar pe penis, in regiunea perianală, in special la
homosexuali, și mai puțin frecvent pe scrot.

220
Leziunile premaligne asociate cu HPV pot să apară pe aceleași zone ca și verucile, deși
cervixul reprezintă zonă în care transfo rmarea malignă apare cel mai frecvent. Leziunile
premaligne de la nivelul cervixului, neoplazia intraepitelială cervicală (CIN), sunt gradate de la I
la III în ordinea crescătoare a severitații cu CIN III care include carcinomul în situ, care precede
cance rul invaziv.
De la introducerea noului sistem Bethesda, clasificarea s -a schimbat : leziuni scuamoase
intraepiteliale (LSI) cu grad scăzut ( LSI grad scăzut, atipii si CIN I ) și LSI cu grad crescut
( CIN II si CIN III) [11]. HPV6 și 11 și noile izolate 42, 43 și 44 au LSI cu grad scăzut, în timp
ce tipurile oncogenice HPV 16 și 18 și cele mai puțin frecvente HPV 31, 33, 45 și 56 au toate
gradele de LSI. Există un număr de tipuri HPV adiționale, dar genomul întreg nu a fost clonat.
Asa cum s -a men ționat, leziunile intraepiteliale de la nivelul cervixului apar in totalitate
la nivelul zonei de transformare, care este reprezentată de o arie de epiteliu metaplastic între
exocervixul matur și epiteliul columnar al canalului endocervical [11]. Cancerul invaziv apare în
aceste arii de LSI și celule maligne, apoi migrează la nivelul stromei uterine și în ganglionii
limfatici locali. HPV 16 este cel mai frecvent virus la nivelul LSI și a fost depistat în 70% din
cazurile de CIN III în Germania și UK, fiind izolat în 80% din cazurile de cancer invaziv de
cervix [11]. În SUA, HPV 16 și 18 reprezintă 55% din LSI cu grad înalt și peste 70% din bolile
maligne ale cervixului. Studiile epidemiologice au arătat că depistarea HPV este asociată cu un
risc de 10 ori ma i mare al CIN [8,11].
În timp ce HPV6 și 11 nu s -au intâlnit în bolile maligne ale cervixului, ele au fost izolate
de la nivelul leziunilor locale invadate ale vulvei, cum ar fi carcinomul verucos și tumorile
Buschke -Lowenstein . Genomurile de la nivelul a cestor leziuni au fost secvențializate, găsindu –
se deleții și duplicații în regiunea reglatoare, ceea ce a sugerat că aceste rearanjamente genetice
au alterat patogenitatea.
Boala maligna a penisului, rară în țările industrializate, este mult mai frecvent ă în zonele
sărace ale lumii cum ar fi America de Sud și Africa. Virusurile asociate în mod frecvent cu
cancerul cervical, ca HPV16 și 18 sunt depistate în peste 50% din cazurile de cancer penian [8].
Atât în cancerul cervical, cât și în cel penian, ADN -ul HPV este integrat în genomul
celulei gazdă, în timp ce în leziunile premaligne ADN -ul viral este liber și capabil să producă
particule virale infecțioase. Faptul că cele mai multe cancere invazive (90%) conțin secvențe
integrate, acestea se pare că sunt p remaligne [12]. Această stare particulară se pare că selectează
celulele pentru conversia maligna, din moment ce numai acele celule cu ADN integrat in E1 și
E2 se găsesc la nivelul țesutului canceros.
Există dovezi că integrarea în regiunile E1 și E2 ale genomului determină un reglaj al E6
și E7 rezultând astfel o mai mare stabilitate în codul ARNm pentru aceste proteine cînd se
folosește o altă celulă decât cea virală. S -a stabilit că integrarea poate avea loc în câteva celule în
faza premalignă a bolii și este probabil că acestea să capete potențial invadant. Cu toate acestea,
există modificări moleculare care nu sunt încă cunoscute [10].

Transmiterea
Se cunoaște de la începutul anilor 1950 că verucile genitale sunt transmise prin contact
sexual. Aceste rezultate au fost confirmate de studiile ulterioare, când s -a demonstrat că
transmiterea sexuală a virusurilor determină malignizarea. În plus, studiile efectuate la partenerii
femeilor cu CIN ( neoplazia intraepitelială cervicală) au arătat ca ei au incid ență crescută a
infecției care determină boli benigne sau premaligne, în funcție de tipul virusului [11].
Astfel, calea sexuală de transmitere este bine stabilită la adulți. Transmiterea la nou –
născuți în timpul nașterii vaginale se crede că reprezintă ca uza papiloamelor laringiene și poate
să contribuie la unele din cazurile de infecție genitală întâlnite la copiii mai mari. Deși copiii pot
să fie bine în ultima parte din prima decadă de viața când apar pentru prima dată semnele clinice

221
de infecție HPV, l a nivelul laringelui sau zonei genitale, transmiterea la naștere reprezintă o
posibilitate din moment ce se stie ce ADN -ul viral poate persista.
Astfel, pentru apariția infecției este necesar contactul intim și frecvent. Cu toate acestea,
se cunoaște foar te puțin despre căi alternative de transmitere, cum ar fi infecția transmisă prin
obiecte.

Persistența HPV
Peste 90% din infecțiile cu HPV par a se vindeca pe cont propriu în termen de 2 ani.
Timpul necesar pentru curățare pare să varieze cu diferite g enotipuri HPV, variind de la cinci –
șase luni pentru genotipurile cu risc scăzut și opt la 14 luni pentru genotipurilor cu risc ridicat.
Eliminarea virusului de HPV a fost determinată de incapacitatea de prelevare de probe pentru a
detecta infecția cu HPV . Nu este clar dacă virusul este complet eliminat sau dacă aceasta rămâne
latentă în celulele bazale și poate reactiva în condiții imunocompromise [6,7].

Detectarea și genotiparea tulpinilor cu HPV
A fost creată o metodă rapidă, sensibilă, de calitate, c olorimetrică de amplificare izotermă
a buclei (LAMP) cu colorant albastru (HNB) de hydroxynaphthol pentru a detecta papilomavirus
uman deosebit de riscant (HPV) a genotipurilor 16, 18, 45, 52, și 58 [4]. Toate studiile de
validare inițiale cu ADN -ul de co ntrol s -au dovedit a fi de tip specific. Testul colorimetric
LAMP specifice acestui tip ar putea realiza o sensibilitate de la 10 până la 100 de exemplare, la
63 ° C timp de 65 min, comparabilă cu cea a PCR în timp real. În scopul de a evalua fiabilitatea
HPV de tip specifice, testul LAMP a fost evaluat în continuare cu ADN HPV de la un grup de
294 de specimene clinice ale căror statutul HPV a fost anterior determinat cu o metodă nouă de
dactilografiere cu o singură etapă cu PCR multiplex [13].
Astfel, scr eening -ul de col uterin ar putea fi îmbunătățit prin testarea pentru ADN al
tipurilor cu risc ridicat de HPV ca un instrument de screening primar.
Tehnologiile disponibile pentru genotiparea HPV variază în funcție de metodă și
platformă și poate oferi car acterizări specifice de tip pentru o multitudine de diferite tipuri de
HPV cu risc oncogen înalt si scăzut. De exemplu, testul Qiagen Hybrid Capture 2 HPV ADN
(HC2) și testul Roche Amplicor HPV (Amplicor) detecta ADN a 13 tipuri de HPV cu risc
ridicat. Testul de genotipare în linie a HPV permite discriminarea a 37 de genotipuri de HPV.
Testul de screening PapilloCheck HPV (Greiner Bio -One GmbH, Frickenhausen,
Germania) este un sistem de detectare și identificare a 24 de genotipuri de HPV pe baza de
microaranjare în linie a ADN PCR. Totuși, aceste metode nu ar putea fi adecvate în situații
clinice primare în țările în curs de dezvoltare sau pentru utilizare pe teren, din cauza
instrumentelor sofisticate necesare, elaborare și procedurile complicate de t estare și reactivi
scumpi [6].
Prin urmare, există o cerere tot mai mare pentru teste moleculare simple și economice.
Amplificarea izotermică a buclei (LAMP) este o amplificare a acidului nucleic, metodă
dezvoltată de Notomi și a apărut ca un instrument p uternic de amplificare a genei datorită
simplități sale, vitezei, specificității, și costurilor eficiente [4].
Această tehnică este utilizată din ce în ce mai mult pentru rapiditate și detectare vizuală și
tipizarea de viruși în curs de dezvoltare. Una di ntre caracteristicile cele mai atractive ale acestui
test este că rezultatele LAMP pot fi observate si determinate de colorant mediat HNB și
vizualizate cu ochiul liber și fără a deschide tuburile după amplificare.

Concluzii
Identificarea precoce a HPV cu risc înalt de dezvoltare a cancerului este importantă
deoarece prezența acestui virus poate servi ca indicator a infecției și ca marker tumoral. În

222
plus, tehnicile de identificare virală pot servi ca bază pentru stabilirea strategiei terapeutice
individuale și dezvoltarea noilor principii terapeutice axate spre eradicarea infecției HPV.

Bibliografie
1. Asato T, Maehama T, Nagai Y, Kanazawa K, Uezato H, Kariya K: A large case -control
study of cervical cancer risk associated with human papillomavirus in fection in Japan, by
nucleotide sequencing -based genotyping. J Infect Dis 2004, 189:1829 -32.
2. Baay MF, Quint WG, Koudstaal J, Hollema H, Duk JM, Burger MP, Stolz E, Herbrink P:
Comprehensive study of several general and type specific primer pairs for detect ion of
human papillomavirus DNA by PCR in paraffin embedded cervical carcinomas. J Clin
Microbiol 1996, 34:745 -747.
3. Canadian Consensus Guidelines on Human Papillomavirus, Journal of Obstetrics and
Gynecology Canada 2007:29 (8, supplement 3):S1 -S56.
4. Castle, P. E., et al. 2008. A comparison of two PCR -based human papillomavirus
genotyping methods. J. Clin. Microbiol. 46:3437 –3445.
5. Cobo F, Concha A, Ortiz M: Human papillomavirus (HPV) type distribution in females
with abnormal cervical cytology. A correlation with histological study. Open Virol J
2009, 3:60 –66.
6. Dalstein, V., et al. 2009. Analytical evaluation of the PapilloCheck test, a new
commercial DNA chip for detection and genotyping of human papillomavirus. J. Virol.
Methods 156:77–83.
7. Dobec, M., F. Bannw art, F. Kaeppeli, and P. Cassinotti. 2009. Automation of the linear
array HPV genotyping test and its application for routine typing of human
papillomaviruses in cervical specimens of women without cytological abnormalities in
Switzerland. J. Clin. Virol. 45:23–27.
8. Dunne, E.F., Unger, E.R., Sternberg, M., McQuillan, G., Swan, D.C., Patel, S.S. &
Markowitz, L.E. (2007). Prevalence of HPV infection among females in the Unisted
States. JAMA, 297(8):813 -819.
9. Faridi et al.: Oncogenic potential of Human Papilloma virus (HPV) and its relation with
cervical cancer. Virology Journal 2011 8:269.
10. Gao P, Zheng J: High -risk HPV E5 – induced cell fusion a critical initiating event in the
early stage of HPV -associated cervical cancer. J Virol 2010, 7:238.
11. García -Espinosa et al.: Genotype distribution of human papillomavirus (HPV) in
histological sections of cervical intraepithelial neoplasia and invasive cervical carcinoma
in Madrid, Spain. BMC Cancer 2012 12:533.
12. Herbert J, Coffin J: Reducing patient risk for human papilloma virus infection and
cervical cancer. J Am Osteopathic Assoc 2008, 108:65 -70.
13. Nishiwaki, M., et al. 2008. Genotyping of human papillomaviruses by a novel one -step
typing method with multiplex PCR and clinical applications. J. Clin. Microbiol. 46:1161 –
1168.
14. Travasso, C., M. Anand, M. Samarth, A. Deshpande, and C. Kumar -Sinha. 2008. Human
papillomavirus genotyping by multiplex pyrosequencing in cervical cancer patients from
India. J. Biosci. 33:73–80.
15. Venuti A, Badaracco G, Sedati A, Carbini R, Marcante ML: De terminants of HPV
types 16,18 infections in the lower female genital tract in an Italian population. Eur J
Gynaecol Oncol 2004, 15:205 -10.