Licentafinalamitranancamaria [628897]

UNIVERSITATEA DE MEDICIN Ă ȘI FARMACIE
DIN CRAIOVA
FACULTATEA DE FARMACIE

LUCRARE DE LICENȚĂ
Coordonator științific:
Șef-lucrări Univer sitar Dr. Costel -Valentin Manda

Absolvent: [anonimizat]

2018

2
UNIVERSITATEA DE MEDICIN Ă ȘI FARMACIE
DIN CRAIOVA
FACULTATEA DE FARMACIE
CHIMIE ANALITICĂ ȘI METODE FIZICO -CHIMICE DE
ANALIZĂ

"TEHNICI UTILIZA TE PENTRU
DETERMINAREA ANALITICĂ A TALIDOMIDEI
ȘI METABOLIȚ ILOR"
Coordonator științific :
Șef-lucrări Universitar Dr. Costel -Valentin Manda
Absolvent: [anonimizat]

2018

3 CUPRINS

INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 5
CAPITOLUL I. NOȚIUNI INTRODUCTIVE ………………………….. ………………………….. … 6
I.1. Proprietăți chimice ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 6
I.2. Metode de obținere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 6
I.3. Mecanism de acțiune ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 7
I.4. Farmacocinetică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 8
I.5. Indicații ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 9
I.6. Doze și mod de administrare ………………………….. ………………………….. …………………… 9
I.7. Interacțiuni cu alte medicamente ………………………….. ………………………….. ……………. 10
I.8. Contraindicații ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 11
I.9. Reacții adverse ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 12
CAPITOLU L II. METODE DE ANALIZĂ ………………………….. ………………………….. ….. 15
II.1. Descriere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 15
II.2. Istoric ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 16
II.3. HPLC – Cromatografia lichidă de înaltă performanță ………………………….. ……………. 19
II.4. Probe biologice ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 20
II.5. LC -MS ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 29

4 II.6. Metaboliți hidroxilați ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 29
II.7. Determinare analogi talidomidă: 2 -(2,6- dioxopiperidin -3il) ftalimidă (EM 12), 2 –
(2,6- dioxopiperidin -4il) ftalimidă (EM 16) și metaboliții lor ………………………….. …………………. 33
II.8. Determinare CC -5013 ………………………….. ………………………….. …………………………. 34
II.9. Determinare glutamină ………………………….. ………………………….. ………………………… 36
CAPITOLUL III.ALTE METODE ………………………….. ………………………….. ……………… 38
III.1. Cromatografia gazoasă (GC) ………………………….. ………………………….. ………………. 38
III.2. Electroforeza capilară ………………………….. ………………………….. ………………………… 38
III.3. Luminiscența ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 41
III.4. Voltametrie ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 42
III.5. Spectometrie de m asă ………………………….. ………………………….. ………………………… 43
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 44
REFERINȚE BIBLIOGRAFICE ………………………….. ………………………….. …………………. 45

5
INTRODUCERE

Talidomida este un medicament descoperit de o companie germană Grunenthal și
a fost utilizat î n anii 1957 -1961 ca sedativ și antiemetic în special la femeile gravide. Ca rezultat,
aproape o generaț ie întreagă de copii s -a născut cu malformaț ii congenitale cum ar fi focomelia ,o
anomalie caracterizată prin alipirea de trunchi a oaselor memb relor superioare sau prin absenț a
acestora.
În structura talidomidei se regăseș te un centru chiral, medicamentul găsindu -se într-un
amestec racemic form at din doi enantiomeri levogir și dextrogir cu proprietăț ii diferite.
Enantiomerul R este asociat cu efectul de calmare, iar efectul teratogen este atribuit
enantiomerului S. Î n ciuda t ragediei provocate de talidomidă, cercetă torii au contin uat studiile
legate de proprietăț iile ace stuia, talidomida fiind folosită î n prezent pentru afec țiunii precum
mielom ul multiplu și lepra, având acț iune imunomodulatoare, a ntitumorală ș i antiinflamatoare.
Lucrarea d e licență își propune să aducă elemente de noutate legate de tehnicile utilizate
pentru determinarea analitică a talidomidei și metaboliților ei, cât și informaț ii despre
proprietăț ile enantiomerilor.
Din punct de vedere structural , lucrarea este alcătuită din trei capitole. Î n primul capitol
sunt descrise câ teva aspe cte generale legate de p roprietăți le chimice, de farmacocinetică ,
mecanism de acțiune, indicaț ii, co ntraindicații, reacț ii adverse.
Capitolul doi se bazează pe metodele de analiză folosite î n identificarea, izolarea
medicamentului , a analogilor, cât și a metaboliților hidroxilaț i.
Capitolul trei se axează pe metodele noi de analiză cum ar fi cromatogra fia gazoasă ,
luminiscența, voltametria și spectometria de masă .
Lucrarea se î ncheie cu concluzi ile generale ș i bibliografia.

6 CAPITOLUL I. NOȚIUNI INTRODUCTIVE

I.1. Proprietăți chimice
Talidomida (α -ftalimidoglutarimidă) conține un centru chi ral, se prezintă sub forma
unui amestec racemic (1:1) de (S) talidomidă , enantiomerul logovir și (R) talidomidă,
enantiomerul dextrogir . Studiile inițiale pe animale indică faptul că enantio merii au proprietăți
biologice diferite . Efectul de calmare și de inducere a somnului este asociat cu enantiomerul R,
în timp ce efectele teratogene sunt mai strâns legate de enantiomerul S. În condiții fiziologice,
ambii enantiomeri suferă o interconversi e rapidă, ceea ce face imposibilă o separare totală a
efectelor lor clinice.
Prezintă un punct de topire ce se încadreaza între 269 -271°C. Este insolubilă în apă și
etanol, dar solubilă în dimetilsulfoxid1. Are aspect de pulpere albă.

I.2. Metode de ob ținere
Corporația Celgene a sintetizat inițial talidomida utilizând o secvență în trei etape
folosind ca reactiv acidul L-glutamic, dar acesta a fost înlocuit de atunci p rin utilizarea L –
glutaminei . Așa cum se arată în imaginea de mai jos, N-carbetoxiftalimida (1) poate reacționa cu
L-glutamina pentru a produce N -ftaloil -L-glutamina (2). Ciclizarea N -ftaloil -L-glutaminei are
loc fol osind carbonildiimidazol, care formează apoi talidomida (3). Metoda originală a
companiei Celegne a condus la u n randament de 31% de S -talidomidă, în timp ce sinte za în două
etape dă un produs în proporție de 85-93% cu o puritate de 99% .

Figura 1 Sinteză talidomidă

7 Talidomida se poate sintetiza pornind și de la anhidridă ftalică și acid glutamic, după cum
urmează:

Figura 2 Sinteză talidomidă

I.3. Mecanism de acț iune

Este un medicament imunomodulator, antiinflamator și antitumoral2. Aceste efecte au
fost studiate atât in vivo, cât și in vitro și sunt atribuite inhibării producerii în exces a factorului
de necroză tumorală alfa (TNF -α). De asemenea, talidomida este responsabilă de supresia
moleculelor de adeziune de la suprafața celulelor ce au rol în migrarea leucocitelor și în acțiunile
antiangiogenice. Este u n sedativ hipnotic nebarbituric cu acțiune centrală. Nu are efecte
antibacteriene.

8 I.4. Farmacocinetică

Absorbț ie
Absorbția este lentă după administrarea orală și este întârziată de administrarea în același
timp cu alimente, însa acest lucru nu afectează gradul total de absorbție. Concentrațile plasmatice
maxime sunt atinse la 1 -5 ore după administrare.
Distribuț ie
Nu este influențată semnificativ de vârstă, sex, funcție renală sau de parametrii chimici
sanguini. Se regăsește în sperma pacienților în conc entrații similare cu concentrațile plasmatice.
Enantiomerii talidomidei (+)R și ( -)S se leagă de proteinele plasmatice în raport de 55%,
respectiv 65%.
Metabolizare
Este metabolizată în mare parte prin hidroliză neenzimatică la metaboliții N -(o-
carboxiben zoil)-glutarimidă și ftaloil -izoglutamină, care se gasesc în plasmă și majoritar în urină.
Talidomida nemodificată se găsește într -o cantitate mică în urină (<3% din doză), aceasta
gasindu -se în principal în plasmă 80%. Metabolizarea oxidativă a talidomide i nu este
semnificativă cantitativ, iar metabolizarea hepatică este catalizată de citocromul P450.
Eliminare
Principala cale de eliminare este cea prin urină. Timpul de înjumătățire al talidomidei,
după administrarea unei doze unice cuprinse între 50 mg și 400 mg variază între 5,5 și 7,3 ore.
Cea mai mare parte din doza de medicament este excretată într -un interval de 48 de ore după
administrare3.

9 I.5. Indicaț ii

Stimulează sistemul imunitar al organismului, atacând celulele canceroase.
Contribuie la o prirea creșterii celulelor canceroase, previne creșterea vaselor de sânge din zona
afectată.
Talidomida în asociere cu prednison și melfalan este folosită ca tratament de primă linie
la bolnavii cu mielom multiplu netratat, care nu îndeplinesc condițiile necesare pentru
administrarea chimioterapicelor sau care au vârsta de peste 65 de ani.
Mielomul multiplu este un tip de cancer care afectează celulele albe din sânge. Acestea
încept să se dividă necontrolat și se adună în maduva osoasă, ducând la deteriora rea osului și a
rinichilor. În general, această boală nu poate fi vindecată, însa se pot reduce din semne și
simptome.
I.6. Doze ș i mod de administrare

Doza recomandată de talidomidă este de 200 mg, administrată oral, o dată pe zi. Maxim
se pot utiliza 12 cicluri a câte 6 săptămâni, în total 42 de zile. Dacă pacientul uită să iși
administreze o doză și iși amintește în mai puțin de 12 ore, acesta poate să ia doza uitată. Dacă,
însă, au trecut mai mult de 12 ore de la omiterea dozei de la ora normală, pacie ntul nu poate să
iși administreze priza de medicament și trebuie să aștepte până a doua zi, când va relua
administrarea medicamentului conform schemei de tratament.
Pentru a reduce somnolența, medicamentul trebuie administrat înainte de culcare, într -o
singură priză. Capsulele nu trebuie deschise sau zdrobite, iar cele nefolosite trebuie înapoiate
farmacistului.

10
Figura 3 Tratament în lepră

I.7. Interacț iuni cu alte medicamente

Poate potența efectele sedative ale altor medicamente cum ar fi : anxioliticele,
hipnoticele, antihistaminicele H 1, barbiturice, alcoolul etilic.
Doarece talidomida poate determina bradicardie, se utilizează cu precauție când se
administrează medicamente cu același efect: β -blocante, medicamente anticol inesterazice.
Deși nu înteracționează cu contraceptivele hormonale și cu warfarina, asocierea acestora
nu este recomandată din cauza riscului crescut de boală venoasă tromboembolică.

11 I.8. Contraindicații

Sarcină
Talidomida este contraindicată în sarcină și în perioada fertilă, cu excepția
cazurilor în care se îndeplinesc condițiile din Programul de Prevenire a Sarcinii.
Talidomida est e un teratogen puternic, cu o frecvență mare de apariție a
anomaliilor congenitale grave, unele incompatibile cu viata, precum: ectromelie (amelie,
focomelie, hemimelie) a membrelor superioare și/sau inferioare, malformații ale conductului
auditiv extern, leziuni ale urechii medii și interne, leziuni oculare, afecțiuni congenitale cardiace
și malformații renale. Nu se administrează talidomidă copiilor și adolescenților sub 18 ani.

Figura 4 Schema celor 3 tipuri de focomelie descrise de Frantz și O' Rahillly

12 Alăptarea
Excreția în lapte, a fost demonstrată prin studii pe animale de laborator. La oameni nu se
cunoaște dacă talidomida este prezentă în laptele matern. Astfel, alăptarea trebuie întreruptă în
timpul tratamentului c u talidomidă.
I.9. Reacții adverse

Talidomida poate determina foarte frecvent fatigabilitate, amețeli, somnolență și
vedere încețoșată, de aceea, pacienții trebuie atenționați să nu conducă vehicule, să nu folosească
utilaje sau să efectueze sarcini peri culoase în timpul tratamentului cu talidomidă4.
Tabel 1. Clasificare reacții adverse
Clasificare pe
aparate, sisteme și
organe
Frecvență Reacție adversă
Infecții și infestări
limfatice Frecvente Pneumonie
Cu frecvență necunoscută Infecții severe( de
exemplu, sepsis letal,
inclusiv șoc septic),
Infecții virale, inclusiv
reactivarea virusului
herpes zoster și a virusului
hepatitei B
Tumori benigne,
maligne și
nespecifice(incluzând Frecvente Leucemie acută mieloidă

13 chisturi și polipi) Mai puțin frecvente Sindrom mielodisplazic

Cu frecvență necunoscută Sindrom de liză tumorală
Tulburări
hematologice și
limfatice Foarte frecvente Neutropenie, Leucopenie,Anemie, Limfopenie, Trombocitopenie
Frecvente Neutropenie febrilă,
Pancitopenie
Tulburări ale
sistemului imunitar Cu frecvență necunoscută Reacții alergice (hipersensibilitate, angioedem, urticarie)
Tulburari endocrine Cu frecvență necunoscută Hipotiroidism
Tulburări psihice Frecvente Stare de confuzie, Depresie
Tulburări ale
sistemului nervos Foarte frecvente
Neuropatie
periferică, Tremor,
Amețeli,
Parestezie,
Disestezie, Somnolență

Frecvente

Convulsii†, Tulburări de
coordonare

14 Cu frecvemță necunoscută Sindromul encefalopatiei
posterioare reversibile
(PRES), Agravarea
simptomelor bolii

Parkinson

Tulburări acustice și
vestibulare
Frecvente Probleme cu auzul sau
surditate
Tulburări cardiace

Mai puțin frecvente Infarct miocardic ,
Fibrilație atrială, Bloc
atrioventricular
Tulburări vasculare Frecvente Tromboză venoasă
profundă
Tulburări
respiratorii,

toracice și
mediastinale Frecvente Embolism pulmonar,
Boală pulmonară
interstițială,
Bronhopneumopatie,
Dispnee

Cu frecvență necunoscută Hipertensiune pulmonară

Tulburări gastro –

intestinale
Foarte frecvente Constipație
Frecvente Vărsături, Xerostomie
Mai puțin frecvente Ocluzie intestinală

Cu frecvență necunoscută Perforație gastrointestinală,
Pancreatită,
Hemoragie
gastrointestinală

15 Tulburări hepatobiliare

Cu frecvență necunoscută Tulburări hepatice
Afecțiuni cutanate și ale

țesutului subcutanat Frecvente Erupții cutanate toxice,
Erupții cutanate
tranzitorii, Xerodermie

Cu frecvență necunoscută Sindrom Stevens -Johnson,
Necroliză
epidermică toxică
Tulburări renale și ale
căilor urinare
Frecvente Insuficiență renală
Tulburări ale aparatului
genital și sânului Cu frecvență necunoscută Disfuncție sexuală,
Tulburări menstruale,
inclusiv amenoree
Tulburări generale și la
nivelul locului de

administrare Foarte frecvente Edem periferic
Frecvente Pirexie, Astenie, Stare
generală de rău

CAPITOLUL II. METODE DE ANALIZĂ
II.1. Descriere

Talidomida este un compus rac emic folosit ca imunomodulator ș i antiinf lamator. Aceasta
a fost aprobată de FDA, î n iulie , anul 1998 ca medicament î n tratarea eritemului nodos lepros ș i a
leprei. Recent , s-a descoperit că talidomida poate fi un medicament folosit ca alternativă în

16 numeroase tipuri de cancer sau diferite boli inflamatorii , cum ar fi mielomul multiplu, boala
Crohn ș i HIV. Aceste e fecte su nt atribuite enantiomerului S, însă enantiomerii sunt
intercon vertiț i in vivo. Calea de a dministrare este cea per os, deși în unele situaț ii clinice
administrarea parenterală ar fi mai indicată .
Talidomida a fost dozată în diferit e formulări , în special , în lichidele biologice printr -o
varietate de metode cum ar fi cro matografia lichidă de înalta performanță cu detecție în
ultraviolet și cromatografia lichidă cuplată cu spectofotometria de masă .

Figura 5 Molecula talidomidei

II.2. Istoric

Talidomida 1,3 -dioxo -2[ 2´,6´-dioxopiperidin -3´-il]-izoindol este un medicament
antiinflamatoar și sedativ -hipnotic care a fos t descoperit de compan ia germană Grunenthal. A
fost vâ ndut din 1957 pâ nă în 1961 în aproxima tiv 50 de ță ri sub denumirea a cel putin 40 de
nume , printr e care amintim Distaval, Talimol, Nibrol, Sedimide, Quietoplex, Contergan,
Neuro sedyn și Softenon .

17
Figura 6 Denumiri comerciale talidomidă

La sfâ rșitul anilor 1950, î nceputul anilor 1960 talidomida a început să fie eliberată ca
antiemetic femeilo r gravide pentru a combate greața de dimineață și pentru a le ajuta să adoarmă.
Înainte de a fi pus pe piață, acest medicament a fost supus unor teste de con trol inadecvate, acest
lucru avâ nd efecte catastrofale pentru cop ii mamelor tratate cu talidomidă .
Din 1956 pană în 1962 aproximativ 10.000 de c opii au fost nascuți cu grave mal formații
congenitale printre care ș i focomelia, deoarece mamele copiilor au fost tra tate pe timpul sarcinii
cu talidomidă. În 1962 ca raspuns la această tragedie , Statele Unite a adoptat anum ite legi prin
care a fost cerută verificarea medicamentelor în ceea ce privește siguranța lor î n administrarea pe
timpul sarcinii î nainte de a fi pus e spre vanzare. Astfel de legi similar e au fost adoptate și în

18 restul ță rilor, iar ta lidomi da nu a mai fost prescrisă și vâ ndută pentru mulț i ani.

Figura 7 Enantiomerii talidomidei cu proprietăți diferite

Foarte puține subiecte au stârnit atâ t de mult interesul farm acologilor și biologilor, aș a
cum, se întamplă în cazul chiralității moleculelor. În ziua de azi, invest igațiile sistematice a
activităț ii biologice , farmacologic e și toxicologic e a enantiome rilor individuali este ca o nouă
regulă pentru medicamentele racemice noi.Talidomida are un atom de carbon chiral î n centrul
molecule i și este sintetizat ă ca amestec racemic. De cele mai mu lte ori , enantiomerii nu prezintă
aceleași proprietăț i, astfel sunt necesare diferite metode analitice pentru a putea fi diferenț iate și
separate cele doua biomolecule. Î n cazul talidomidei a fost mai târziu descoperit că efectele
teratogen e ale compusului erau datorate î n princ ipal enantiomerului S al acesteia .
Eriksson ș i echipa lui au contri buit semnificativ în analizarea, dozarea ș i
biotransformarea celor doi enantiomeri ai talidomidei.
În ciuda efectelor teratogene , cercetătorii au continuat să lucreze cu acest medicament și
în scurt timp după eliminarea acestuia, medicii au descoperit prop rietatea antiinflamatoare a
talidomidei și au început să caute d iferite întrebuințări ale aceste ia în ciuda reacțiilor adverse .

19 Aceștia au descoperit că în cazul pacienț ilor cu eritem nodos lepros, o boală a pielii durero asă, s –
a raport at o ameliorare a du rerilor după administrarea tal idomidei.
Sunt diferite studii în curs care încearcă să ateste eficacitatea medicamentului și î n boala
Crohn, sindromul Behcet și în arahnoidită , de asemenea și în durerile asoci ate cu HIV , inclusiv
ulcerul aftos, mielom ul multiplu și în diferite tipuri de ca ncer. Oricum, medicii și pacienț ii
trebuie să treacă printr -un proce s special de obținere a medicamentului pentru a se asigura că
niciun copil nu va mai fi născut cu malformaț ii congenitale din cauza talidomidei.
Acest in teres nou în talidomidă este datorat acțiunii antiinflamatoare ș i posibilitatea
folosirii acesteia în tratamentul leprei, câ t și în numeroase alte afecțiuni ale pielii ș i ale
mucoaselor. De aceea , este necesar dezvoltarea unor teste cantitative rapide și sensibile atât
pentru compusul inițial, cât și pentru metaboliții săi î n material ele biologice , cum ar fi serul de
sânge sau probele de ț esut.
În testele preliminare pentru determinarea teratogenităț ii talidom idei efectuate pe șoareci
și șobolani doar enantiomerul (-)S al talidomidei a fost teratogenic. Însă, este cunoscut faptul că
talidomida este sensibilă la reacția de descompunere hidrolitică și este supusă racemizării. S -a
raportat anterior că timpul de i njum atațire sau racemizarea î n tampon fosfat( 0,067M, pH 7,4) la
37°C este de 2,7 ore, o rată care crește dramatic cu creș terile pH-ului sau ale temperaturii. De
asemenea , studiile anterioare au arătat că talidomida reizolată din plasmă la 2 ore după
admin istrare a intravenoasă este compet amestecată. S -a sugerat, de asemenea, că enantiomerii
pot interconversa în organism, indicând faptul că utilizarea exlusivă a enanti omerului (+)R nu
este suficientă pentru a preveni aceste efecte secundare nedorite. Solub ilitatea ap oasă sau
racemică a fost r aportată a fi foarte scă zută î n jurul valorii de 50µg ml-1.

II.3. HPLC – Cromatografia lichidă de înaltă performanță

O metodă descoperită de Reepmeyer și Cox5 folosește o coloană de octadecilsilan
Novapac (150mm × 3,9mm , 4µm dimensiunea particulei), ca fază mobilă acetonitril -apa în

20 raport de 15:85, o rată de curgere de 1ml min-1, detecț ia la 237nm, iar ca standard intern
fenacetina. Acidul fosforic a fost folosit în prepararea soluț iilor pentru a inhib a hidroliza
talido midei. Această metodă a fost utilizată în analiza individuală a capsulelor ș i a comprimatelor
pentru a determina uniformitatea acestora.

II.4. Probe biologice

Czejka și Koch au reusit să separe și să cuantifice talidom ida și metaboliț ii acesteia ,
folosind extracț ia din lichide le biolo gice (ser uman). Pentru această metodă s-a utilizat
cromat ografia în fază izocratică și fază inversă, ca reactiv6 bromura de tetrametilamoniu, însă
fluiditatea acestui test este de 1 -20µg ml-1, pe când concentraț ia plasmei este de 0,2 -1,4 µg ml-1,
valoare atinsă î n primele 24 de ore dup ă o singură doză terapeutică7. Testul în cromatografia
lichidă de inaltă performanță, utilizat î n ultimele studii , a avut o gamă liniară suficient de scazută
și anume 0,1 -10 µg ml-1.
Pentru o a treia metodă HPLC8, date despre efectul talidomidei în bolile c ronice -grefă
versus boală -gazdă, precizia, acuratețea și faza liniară nu au fost raportate.
Într-un mod similar, alte metode prop use folosesc 0,5 ml de plasmă cu o liniaritate de 10
mgL-1 și cu o limită de detecție de 0,2 µg ml-19. Talidomida este instabilă în speciile de plasmă la
un pH biologic, însă a putut fi stabilizată pentru câteva săptămâ ni prin simpla acidifiere a
soluț iei.
Autorii au realizat un prot ocol pentru a monitoriza pacienții tratați cu talidomidă. În
acest mod s -au putut stoca, raporta și transporta provizoriu probele, ce prezintă o variație a
concentrației plasmatice între 1 -7µg ml-1. Acestea prezintă efect terapeutic în boala cronică -grefă
versus boala -gazdă fară a prezenta ef ecte adverse.

21
Figura 8. Structur ă talidomidă

Cercetătorii au colectat sânge în tuburi cu heparină ș i le-au centrifugat timp de 15 minute.
Eșantioanele de plasmă au fost apoi transferate în tuburi ce conținea o cantitate dublă de acid
clorhidric 1 M. Sub acest tratamen t, talidomida a fost stabilizată timp de mai multe saptămâ ni,
chiar ș i la temperatura camerei.
Delon10 a realizat o procedură pentru a analiza talidomida în plasmă care implică o
singură extracție li chid-solid în coloana Extra -Sep-C8 în prezența unui standard ș i anume
ciproflo xacina. Analiza a fost realizată într -un eluent izocratic cu o fază mobilă constituită din
0,01 M fosfat de dihidrogen de potasiu apos conț inand 21% acetonit ril și 4,5 mM acid
heptansulfonic, ajustat la un pH de 2,3 cu detecție UV la 295 nm. Limita de sensibili tate a
testului a fost 0,06 µg l-1. Această metodă a fost aplicată într -un studiu farmacocinetic pe
pacienț ii cu eritem nodos lepros.
Deasemene a, pentru analiza cromatograf ică s-a utilizat cromatograful de lichid Hewlett –
Packard 1090 seri a II cu un detector de fotodiodă11. S-a folosit o coloana de apă Nova -Pak
C18(3,9mm ×300mm). Talidomida ș i fenacetina( standardul intern) au fost detectați în UV la o
lungime de undă de 220 nm, respectiv de 248 nm într -un timp de funcț ionare de 16 min. Faza

22 mobilă apoasă, acetonitrilul ș i 0,5M de NaH 2PO 4 soluț ie tampon a fost condusă la o rată de 1ml l-
1, la un pH 3,0. Talidomida a fost izolată din ser prin e xtracție în fază solidă . Un procentaj de
10% din H 2SO 4 (7,5 µl) a fost adă ugat serului pentru a opr i degradarea.
Mai tarziu, a fost dezvoltată o metodă de cromatografie lichidă de înaltă performanță
pentru a găsii izomerii talidomidei în plasmă î ntr-o coloană ce prezintă un conținut de protein ă-
avidină, folosind o extracție solidă12. Enantiomerii au fost separați iz ocratic , folosind o fază
mobilă alcatuită din 2 -propanol și soluție tampon 0,1M în raport de 2 :98 la un pH 4 și un flux de
0,6 ml min-1 la o temperatură ambientală, cu o d etecție la 300nm. Timpul de funcț ionare a l
cromatografului a fost de mai puțin de 13 minute. Limita de detecție a fost 100 respectiv 50ng
ml-1 pentru fiecare enantiomer.

Figura 9 Hidroliză talidomidă

23
Talidomida a fost decelată din plasmă și sânge prin inversarea fazelor cu detecție în UV.
Astfel s -a realizat13un studiu despre prevenirea degradării hidrolitice a talidomidei în probe și în
soluții. Coeficientul de variație al testului a fost de 1 -2% comparativ cu fluctuația concentrației
de 0,25 -4,0 µg ml-1. Hidroliza talidomidei în timpul depozitării și manipulării mostrelor a fost
evitată prin adăugarea într -un volum egal de soluție tampon citrat cu un pH de 1,5.
În acest mod, Lyon și colaboratorii14 au realizat alte lucrăr i cu scopul de a evalua și
adapta această metodă, pentru a putea fi folosită în monitorizarea medicamentelor în timpul unui
studiu clinic. În plus, au propus ca probele de sânge să fie golite într -o ceașcă umplută cu gheață,
pentru a fi transportate într -un laborator clinic pentru centrifugare. Apoi, probele de plasmă sunt
transportate si depozitate la -25°C până la efectuarea analizei. Prin această procedură, fracția de
talidomidă rămasă după 30 de zile a fost calculată la 0,90. Huupponen si Pyykko15 au
recomandat sângele cu promptitudine, dar nu au abordat problema degradării talidomidei din
timpul stocării probelor.
Eriksson și Bjorkman16 au realizat o procedură simplă de gestionare a eșantionului:
(a) se adaugă 2,00 ml dintr -un tampon citrat de 25 mM la ph 1,5 în 10 ml tuburi de
extracție cu capăt de sticlă;
(b) se colectează sângele pe anticoagulant, heparină, în tuburi de evacuare;
(c) se transferă, fără întârziere 2,00 ml de sânge în fiecare tub de extracție și se
amestecă imediat;
(d) cât mai curând posibil, se îngheață și se păstrează la -25°C;
(e) se analizează toate probele în decurs de 75 de zile.
Deoarece, principalul loc de biotransformare a enantiomerilor talidomidei este aparent în
circulația plasmei sau a sângelui, o foarte bună întelegere a farmacocineticii talidomidei in vivo
necesită o cunoaștere aprofundată și a reacțiilor sale in vitro, în prezența constituențiilor din
plasmă și sânge. În acest sens, Eriksson și colaboratorii17 au realizat un studiu cu scopul de a

24 caracteriza distribuția în sânge, adică legarea de proteinele plasmatice, raportul concentrație
plasmatică/ plasmă și distribuția eritrocite/plasmă și enantiomerii talidomidei.
De interes au fost și influența pH -ului și a proteinelor plasmatice asupra i nversării
simultane și a hidrolizei, pentru a obține indicii despre mecanismul prin care albumina serică
umană catalizează inversarea enantiomerilor. Această reacție a fost studiată și cu adăugarea unor
inhibitori ipotetici.
Anterior18, a fost descrisă o me todă HPLC stereo -specifică pentru determinarea
concentrațiilor de enantiomeri separați, precum și o metodă specifică non -stereo pentru
determinarea concentrației totale de talidomidă. Pentru ambele metode, a fost utilizată detectarea
lungimilor de undă la 220 nm în UV. Pe scurt, concentrația totală de talidomidă a fost
determinată prin cromatografia lichidă de înaltă performanță, utilizând o coloană RP -18 și o fază
mobilă de acetonitril: apă în raport de 35:65.
În ultimul timp, același grup de cerc etători a realizat un studiu cu scopul de a
prepara din enantiomerii talidomidei o soluție,atât pentru administrarea intravenoasă, cât și
pentru a investiga farmacocinetica și efectele lor sedative după perfuzie la oameni. S -a
investigat, de asemenea, sol ubilitatea și stabilitatea enantiomerilor în soluție de glucoză de 5%.
Concentrațiile de enantiomeri din sânge au fost determinate prin HPLC stereo -specific, aceasta
fiind prima dată când talidomida s -a administrat intravenos19.
Enantiomerii talidomidei au fost separați prin HPLC cu faze staționare chirale, ce
constau într -o poliamidă chirală20, un derivat benzoic al celulozei – tribencel și un derivat de
metilbenzoil al celulozei – chiracel OJ21. În acest ultim caz, o simplă analiză izocratică și directă a
talidomidei racemizate a fost realizată fără nicio descompunere. Ca solvent a fost folosit hexan și
etanol în raport de 50:50, cu debitul de 1ml min-1 la 23°C. Factorul de capacitate (k’) pentru
primul eluat enantiomerul (+) R a fost 9,67, iar factorul de sep arare (α) obținut a fost 1,54.
Factorul de rezoluție stereochimic maxim (R) obținut a fost de 15,05.Această metodă a fost
aplicată pentru a determina puritățile optice ale medicamentului în diferite forme de dozare, cum
ar fi în vrac.
Knoche si Blaschke22 au realizat studiile de racemizare ale talidomidei după incubarea
enantiomerilor în medii apoase diferite . Raportul enantiomeric, după extracția din aceste medii,

25 a fost determinat prin HPLC chiral. Enantiomerii talidomidei au fost separați pe o fază staț ionară
de poli [(S) -(N)-(1-ciclohexiletil) metacrilamidă ] de 250mm× 4mm care a fost imobilizată pe o
silice modificată, echipată cu o coloană de protecție de 30mm × 4mm LiChrospher 60. Faza
mobilă folosită a fost n -hexan în dioxan în raport de 7:3, cu un d ebit de 1,0 ml min-1, iar
intensitatea de detecție a fost de 230nm.
Scopul lucrării realizate de Eriksson și colaboratorii a fost:
a) dezvoltarea unei analize HPLC pentru a studia enantiomerii talidomidei în sânge;
b) pentru a studia inter conversia și degradarea enantiomerilor în sângele uman;
c) studiul farmacocineticii enantiomerilor (+)R și ( -)S talidomidei după administrarea
orală separată a celor doi sau a amestecului racemic la barbați voluntari sanatoși.
De asemenea, a fost folosită și ciclodextrina în încercarea de separare a enantiomerilor
talidomidei prin metoda HPLC. A fost folosită fie ca legătură pentru faza staționară, fie utilizată
ca un aditiv adaugat în faza mobilă . Talidomida este foarte puțin solubilă în apă , dar după ce
gradul de solubilitat e a fost crescut, aceasta a putut fi stabilizată în soluț ii apoase , prin adăugarea
de hidroxipropil -β-ciclodextrină . Enant iomerii talidomidei sunt separați prin metoda HPLC pe o
coloană C18, utilizâ nd β -ciclodextrina ca aditiv de fază mobilă.
Această abordare oferă un mijloc de separare a enantiomerilor (+) R și (-)S talidomidei fără a
necesita o coloană chirală specială23.
Anterior s -a folosit coloana AGP de glicoproteină α1-acid pentru a separa alți
enantiomeri ai medicamentu lui cu timpi de retenție scurți. Acest fapt se bazează pe lucrările lui
Alvarez și colaboratorii24.Aceștia au reușit să realizeze o probă rapidă și enantioselectivă de
analiză HPLC pentru probele talidomidei, utilizând o coloană AGP imobilizată. Î n acest ca z, cea
mai bună fază mobilă s -a dovedit a fi acetat ul de amoniu 30 mM ce conține 0,3% nitrofuran, la
un pH egal cu 7.
Așa cum se descrie anterior, talidomida se degradează în mediul apos în
funcție de pH și temperatură. Astfel, recoltarea corespunzăt oare a probelor de sânge sau plasmă
este crucială.

26 Yang și colaboratorii25 au elaborat o metodă HPLC pentru determinarea
talidomidei în plasmă de șobolan și a aplicat -o la studiile farmacocinetice, folosind irinotecan.
Talidomida poate modula metabolismul și transportul irinotecanului chiar și după o modificare
farmacocinetică in vivo. Analiza a fost realizată cu o coloană Hypersil C 18 cu fază inversă. Faza
mobilă a fost alcatuită din acetonitril și soluție tampon de acetat de amnoiu 10 mM în raport de
28:72 la un pH de 5,5 și un debit de 0,8 ml min-1. Talidomida a fost monitorizată la 220 nm și a
dat un răspuns liniar în intervalul de 0,02 -50 µM.
În încercarea de a caracteriza transportul talidomidei de către linia celulară
de cancer de colon uman, metodă utilizată pe scară largă pentru a investiga permeabilitatea și
transportul medicamentului, Zhou și colab.26 au dezvoltat diferite metode analiti ce. Printre
acestea, se întalnesc diferite metode HPLC, utilizate pentru a identifica monostraturile celulare
prezente în colonul uman. Din amestec, o alicotă de 50 µl a fost injectată pe o coloană sferică C 18
(150mm×4,6mm; cu dimensiunea particulei 5µm) l a un debit de 0,5ml min-1 . Faza mobilă
utilizată a fost un amestec de acetonitril 10 mM și soluție tampon acetat de amoniu în raport de
24:76 la un pH de 5,5. Talidomida a fost detectată de detectorul UV la o lungime de undă de
220nm. Curbele de calibrare pentru talidomidă s -au încadrat în intervalul de concentrații de
0,025 -1,0, iar în transportul prin soluție tampon, curbele s -au regăsit în intervalul 1,0 -50µM.
Metodele validate au fost utilizate pentru a determina transportul talidomidei prin monostratu rile
celulare. Acesta a fost similară indiferent de sens: de la partea apicala (A) la partea bazala (B)
sau invers.
Pentru a evita degradarea hidrolitică a talidomidei în timpul preparării probelor, a fost
utilizat acidu l tricloroacetic pentru precipitarea proteinelor cu recuperare de 78 -81%27. Alicotul
a fost cromatografiat pe o coloană de octadecil, folosind un eluent compus din 250 ml 0,01M
fosfat de potasiu dihidrogen at, ajustat la un pH de 3,0 cu o soluție de acid fosforic de 43%,
amest ecat cu 750 ml metanol.Pentru standardul intern s -a folosit fenacetina.Citirea probelor s -a
realizat la 220 nm . Pentru ca degradarea hidrolitică să fie prevenită în timpul analizei , s-a
acidifiat proba cu reactivul precipitat. Talidomida și fenace tina au avut timpi de retenție diferiți
de 7,9 și, respectiv 15,0 minute. Această procedură , cât și alte metode HPLC, cuplate cu
metodele UV citate anterior, au fost folosite pentru a măsura conce ntrațiile totale de medicament
atât legat de proteine , cât și în forma liberă.

27 În contrast, obținerea fără proteine a analit ului medicamentos, ar putea fi realizat fie
prin ultrafiltrare , fie prin metoda microdializei. Însă, ultrafiltrarea are unele limitări , din cauza
unei bucle de membrană mai mare, care fac e dificilă aplicarea în unele studii de farmacocinetică
in vivo, medicamentelor nelegate în creier.
Microdializa prezintă numeroase avantaje , cum ar fi oferirea unor probe curate
pentru analiza d irectă, permite monitorizarea continuă a analiț ilor pentru o rezoluție mult mai
mare spațială și temporală , cât și studii mai bune privind farmacocinetica țesuturilor. În acest
mod, s -a utilizat un sistem de microdializă , cuplată cu detecția HPLC -UV în care au fost
analizate mai multe probe pentru a re aliza o eșantionare a formei libe re. Astfel, s -a putut
monitoriza simultan talidomida nelegat ă în sânge, creier și bilă pe ntru studiul farmacocinetic28.
Sondele de microdializă au fost inserate concomitent în vena jugulară către
atriul drept , talamusul creierului și conducta biliară . În acest studiu s -au folosit șobolani Sprague –
Dawley anesteziați, cărora li s -au prelevat probe biologice ,după administrarea de talidomidă .
Cantitatea administrată a fost de 5 mgkg-1 prin vena femurală. Talidomid a și dializatele au fost
separate ut ilizând o coloană Zorbax ODS C 18 cu dimensiunile 150 mm×4,6 mm și cu mărimea
particulei de 5µm, menținută la temperatura ambientală . Faza mobilă a fost compusă din
acetonitril, metanol și acidul 1 -octansulfonic 0,1 mM în raport de 32: 3: 65 la un ph 5,3. F luxul
de fază m obilă a fost setat la 1 ml min-1. Soluția tampon a fost filtrat ă printr -un filtru Millipore
0,45 și degaj ată înainte de utili zare. Detectorul UV a fost stabilit la 20nm.
După cum se poate o bserva, au fost dezvoltate diferite metode de analiză în
încercarea de a cuantifica talidomida și metaboliții acest eia dintr -o varietate de matrici biologice.
Majoritatea metodelor sunt achirale, fiind bazate pe HPLC , utilizând separarea
în fază inversă c u detectare UV, MS . Cu toate acestea, recunoașterea din ce în ce mai mare a
importanței stereoselectivită ții potențiale în farmacologia talidomidei a determinat , mai recent, ca
mulți cercetători să utilizeze metode de separare a enantiomerilor. Î n unele cazuri, aceștia, au
analizat și separat diferiți metaboliți ai enantiomerilor .
Astfel de abordări , se baz ează în mod obișnuit pe fază chirală staționară (CSP) –
HPLC, pe tehnica de electroforeză capilară (CE) sau pe electroc romatografie (CEC).

28 Vancomicina, un antibiotic macr ociclic, a fost utilizată ca fază chirală staționară pentru separarea
unui număr de medicamente racemice, inclusiv talidomida. Cu toate acestea, nu a fost încă
raportată utilizarea unu i vancomicin -CSP pentru analiza cantitativă a concentrațiilor de
talidomidă din probele biologice.
Din acest motiv, a fost necesară o metodă cantitativă, chirală HPLC pentru a
determina enantiomerii talidomidei din serul, țesuturile și tum orile animalelor tratate cu
talidomidă și cu combinații de talidomidă și chimioterapice. Aceleași metode se utilizează și
pentru identificarea talidomidei din serul pacienților tratați cu acest medicament.
Deoarece nu au fost disponibile m etode publicate de analiză de rutină, cu o
capacitate mare de detecție a enantiomerilor talidomidei în probele biologice relevant e, Murphy –
Poulton și colab.29 au elaborat și au validat o metodă HPLC -CSP, relativ simplă de extracție
lichid / lichid a talido midei, cu vancomicină, pentru separarea și determinarea enantiomerilor
prin detecție UV. Talidomida în probele serice și omogene de țesut a fost stabilizată prin
tamponare cu un volum egal de soluție tampon citrat -fosfat la un pH -2, de concentrație 0,2 M ș i
stocat la -80°C. Enantiomerii de talidomidă, extrași din probele cu eter dietilic, au fost bine
separați pe o coloană HPLC chirală de fază staționară de vancomicină, cu o fază mobilă de
acetonitril 14% în formiat de amoniu 20 mM, ajustat la pH de 5,4. Concentrațiile lor au fost
determinate cu fenacetină ca standard intern la o detecție de 220nm. Limita estimată de
cuantificare pentru ambii enantiomeri a fost de 0,05µg ml-1 cu 0,2 -0,6 ml probe de ser.
Talidomida din serul de șobolan și di n cel uman, acidifiată și depozitată așa cum
s-a descris mai sus, s -a dovedit a fi stabilă chimic și chiral timp de 1 an. Metoda a fost aplicată cu
succes pe probele serice de la pacienții supuși tratamentului cu talidomidă pentru mezoteliom.
De același su cces s -au bucurat și probele de ser, sânge și țesut de la un model de rozătoare de
laborator, la care s -a folosit transplant de glicosarcomul 9 L.
În alt studiu, câțiva compuși imidici ciclici, inclusiv talidomida, se separă
enantiomeric prin tr-o metodă HPLC cu un antibiotic macrociclic legat covalent la un suport de
silicagel. Coloana de fază chirală stationară Chirobiotic V, conține antibioticul vancomicină ca
selector chiral. Rezultatul analizei arată că poziția substituenților atomului de carbon chiral al
medicamentelor racemice afectează procesul de separare chirală30.

29
II.5. LC-MS

Svens son și colab.31 utilizează un sistem cromatografic similar celui descris într –
un articol anterior. O pompă ce funcționează în regim de presiune constantă care a fost conectată
la un injector echipat cu o buclă de fază mobilă de 2 ml, urmată de un injector de probă cu un
volum de buclă interioară de 0,2 µl. Coloanele au fost conectate la un detector UV , folosind un
tub de silice topită de 50 µm i.d. LC -MS și LC -MS / MS s -au efectuat cu un spec trometru de
masă triplu quadrupol Finnigan TSQ 700 echipat cu o sursă de ioni de electrospray. A fost
utilizat un emițător de pulverizare produs în casă , cu un debit de 3 -5 µl min-1, iar tensiunea de
pulveriza re a fost de 4,5 kV în toate experimentele. Capilarul încălzit a fost setat la o temperatură
de 200 ° C. Ca fază mobilă a fost utilizat a cetonitrilul amestecat cu o soluție tampon de acetat de
amoniu 5 mM sau cu acid acetic 0,1 M.
Teo și colab.32 descriu an alizele LC -MS / MS ca fiind foarte sensibile, rapide, selective și
de înaltă performanță . Interval ul de calibrare pentru talidomida din plasma umană și din
materialul seminal a fost de 2-250 ng ml-1. Matricele au fost stabilizate , mai întâi , cu o soluție
Sorensen de tampon citrat de 0,025 M la un pH de 1,5 pentru a preveni hidroliza spontană.
Soluția tampon a putut fi stabilizată și păstrată la temperatura camerei timp de 24 ore și până la
trei cicluri de îngheț -dezgheț. Probele au fost extrase utilizând cartușe SPE. Extractele au fost
apoi injectate în LC -MS / MS, echipate cu o coloană cu fază inversă și interfață APCI în modul
ion n egativ. Această metodă a fost utilizată cu succes, într -un studiu clinic, concentrațiile de
talidomidă fiind situate la un nivel cât mai mic : în plasmă 7 ng ml-1 și în spermă 8 ng ml-1 .
II.6. Metaboliți hidroxilați

Principala problemă care interzice folosirea clini că a talidomidei o reprezintă efectele
teratogene severe ale acestui compus. Aceste efecte toxice sunt reprezentate, în principal de
malformații ale membrelor și defecte ale urechilor, ochilor și organelor interne.

30

Figura 10. Reacții hidroxilare/hidroliză

31 Se cunoaște că, enantiomerii talidomidei prezintă o enantioselectivitate
semnificativă în farmacodinamică. Efectele imunomodulatoare pot fi exercitate de către
enantiomerul ( -) S- talidomidă, în timp ce sedarea a fost legată de concentrația sanguină a
enantiomerului (+) R. Aproximativ patru decenii după ce Lenz și McBride au asociat,
independent, utilizarea talidomidei la începutul sarcinii cu apariția focomeliei, mecanismul exact
al teratogenezei a rămas încă necunoscut.
S-au discutat mai multe ipoteze diferite, sugerând, de exemplu, bioactivarea talidomidei
de către sinteza de prostaglandină -H embrionară, care provoacă leziuni oxidante la nivelul ADN –
ului. Cele mai recente rezultate au sugerat faptul că medicamentul afecte ază calea factorului de
creștere asemănător insulinei 1 și stimularea factorului de creștere 2 al fibroblastelor în timpul
dezvoltării genelor subunității de integrină α -v și β -3 integrină.
O altă explicație plauzibilă a efectelor teratogene, se referă la formarea metabolică a
intermediarilor reactivi ai unui oxid de arenă, care se detoxifiază la fenoli mai puțin reactivi.
Metabolismul stereoselectiv al talidomidei și metabolizarea analogului său EM
12 au fost studiate in vitro folosind omogenate hepati ce33. Acest studiu se concentrează asupra
metaboliților nehidrolizați și hidroxilați ai talidomidei. A fost elaborată o metodă HPLC pentru a
determina direct acești metaboliți. Studiile au arătat o biotransformare extrem de stereoselectivă
a compusului 5 -hidroxitalidomidă. Acest metabolit a fost format preferențial din enantiomerul ( -)
S-talidomidă, în timp ce enantiomerul (+) R a fost metabolizat la doi compuși necunoscuți până
atunci și anume Met A și Met B. Spectrometria de masă a acestor metaboliți se p lasează în
fragmentul de glutarimidă. Studiile de biotransformare cu analogul mai stabil EM 12, al
talidomidei, au evidențiat patru metaboliți noi (Met C -F), ale căror cantități diferă în omogenatul
de ficat selectat.
Obiectivul unui studiu realizat de Mey ring și colab.34 a fost caracterizarea detaliată a
celor doi metaboliți diastereo izomerici ai enantiomerului (+) R al talidomidei . Obiectivul a fost
realizat prin utilizarea combin ată a metodelor HPLC, nano -HPLC, electrocromatograf iei capilare
(CEC) și a cu plării spectrometriei de masă prin ioniza re chimică cu presiune atmosferică on -line
(APCI / MS).

32 Avantajele folosirii nano -HPLC -ului și CEC -ului sunt caracterizate de o eficiență
maximă mai mare și o scădere drastică a timpului de analiză, care, împreună cu o diluție mai
scăzută a probelor în timpul analizelor, a permis obținerea unei sensibi lității de detecție care a
putut fi comparabilă cu cea obținută folosind coloane cu dimensiuni comune. De asemenea,
Meyring și cola b.35 au efectuat separarea talidomid ei și a metaboliților săi hidroxilați, incluzând
parțial enantioseparația lor folosind trei faze staționare chirale de tip polizaharidă. Trei tehnici
diferite, HPLC în coloane comune, LC capilară și electroc romatografie capilară neapoasă au fost
comparate în termeni de separare.
După cum arată acest studiu, fazele mobile polar organice reprezintă o adăugare
valoroasă pentru fazele mobile mai puțin polare și polar -apoase organice în combinație cu CSP –
urile polizaharidice. Chiralpa k AD format din 25% amiloză -tri-(3,5-dimetilfenilcarbamat)
acoperit cu aminopropilsilanii cu pori largi , prezintă o capacitate de rezoluție mai mare
comparativ cu derivatul de celuloză similar (chiralcel OD), precum și cu celuloză -tri-(4-
metilbenzoat ) (chiralcel OJ) pentru a cest set special de analiți chirali.
Folosirea talidomidei într -un sistem in vitro de testare a limfocitelor a furnizat dovezi
cum că medicamentul în sine nu este toxic, iar că toxicitatea necesită o sursă de enzime hepatice
și un sistem generator de NADPH .
S-a constatat că deși talidomida a fost un substrat slab pentru citocromul P -450, datorită
observațiilor menționate mai sus, Meyring și colaboratorii36 au realizat o lucrare asupra
biotransformării in vitro catalizate de către microzomii hepatici de șob olan.
Metaboliții detectați anterior în aceste extracte de incubație3738 au fost de asemenea găsiți
în probele de plasmă de la voluntarii masculi, care au primit talidomida pe cale orală39.
Utilizându -se, în unele studii, electroforeza capilară cu cicl odextrine ca selectori
chirali s -a putut separa enantioselectivitatea talidomidei și a trei derivați hidroxilați. Prin aceste
noutăți, s -a putut demonstra biotransformarea stereoselectivă in vitro. Astfel că, enantiomerul (+)
R este metabolizat preferenția l în fragmentul 2,6 -dioxopiperidin -3-il, în timp ce enantiomerul ( -)
S este în principal transformat prin hidroxilare în inelul ftalimidic.

33 Cercetătorii descriu detaliat caracteristicile stereochimice ale derivaților
hidroxilați ai talidomidei. Aceștia au folosit, în acest sens, spectroscopia experimentală a
dicroismului circular (CD) în combinație cu calculele CD -urilor chimice cuantice. Probele de
extracție ale enantiomerilor individuali au fost analizate prin HPLC pe o fază staționară achirală
combina tă cu detectarea CD -urilor. Au fost comparate datele CD ale eluațiilor metaboliților care
au fost aproape enantiopure, cu spectrul cvadrat de CD pentru structurile respective. (3R, 5R) –
trans -5-hidroxitalidomida este principalul metabolit al (+) R -talidomi dei, care epimerizează
spontan pentru a da izomerul (3S, 5R) -cis mai stabil. Contradictoriu, enantiomerul ( -)-S este
metabolizat preferențial prin hidroxilare în fragmentul ftalimidic, având ca rezultat formarea de
(-) S-5-hidroxi -talidomidă.

II.7. Det erminare analogi talidomidă: 2 -(2,6- dioxopiperidin -3il) ftalimidă
(EM 12), 2 -(2,6- dioxopiperidin -4il) ftalimidă (EM 16) și metaboliții lor

Deși exista asemănări structurale între talidomidă și cei doi analogi, EM 12 și EM 16
sunt prezente și dife rite distincții în ceea ce privește potențialul teratogenic al acestora, cât și în
numărul de metaboliți pe care aceste substanțe îl prezintă ( cel puțin 12 pentru talidomidă, 3
pentru EM 12 și doar 2 metaboliți pentru EM 16). Urmând un procedeu de extracț ie optional,
probele au fost analizate prin metoda HPLC cu fază inversă cu depresie ionică. După procedura
de extracție procentul de recuperare a fost între 65 -80%.
Această metodă a fost aplicată în studii farmacocinetice pe animale mici de laborator și
in vitro într -un model experimental40.

34
Figura 11 Analogi talidomidă -diferențe structurale

II.8. Determinare CC -5013

Așa cum am arătat anterior, talidomida a fost utilizată cu succes în diferite tipuri
de tumori, în plus, s -a constatat că inhibă creșterea tumorii , cel puțin parțial , prin mecanisme
antiangiogenice. Mai rece nt, s -au dezvoltat analogi ai talido midei care sunt inhibitori mai
puternici ai angiogenezei.
Lenalidomida, ( CC-5013 )[alfa -(3-aminoftal imido) glutarimidă ], un anal og
imunomodulator al talidomidei, a prezentat o potență mai mare decât talidomida în proliferarea
celulelor endotelia le ale venei ombilicale umane (HUVEC) și în testele de formare a tuburilor.
Aceste teste au indicat, de asemenea, o scădere , dependentă de doză , în proliferarea HUAVEC și
formarea tubului cu concentrație crescătoare de CC -5013.

35

Figura 12 Mecanism de acțiune lenalidomidă

Tohnya și alții41 au descris un test LC -MS pentru determinarea aces tui compus în
plasmă umană. Pre tratarea probelor a implicat extracția lichid -lichid cu soluție de acetonitril: 1-
clorobutan in rap ort de 4:1. S -a folosit standardul intern, umbel iferon ul (7 -hidroxicumarină) .
Separarea compușilor , de interes , a fost realizată pe o coloană ambalată cu m aterial Waters C18
Nova -Pak (4 µm dimensiune particule , 300× 3,9) folosind acetonitril, apă dei onizată și acid acetic
glacial in raport de 20:80: 0,1, la un ph 3,5 livrat la o rată de cu rgere izocratică de 1,0 ml min-1.
S-a realizat o detectare MS simultană efectuată la m / z 260,3 (CC -5013) și 163,1
(umbe liferonă).

36
Figura 13. Derivați lenalidomidă

II.9. Determinare glutamină

Molecula talidomidei , un derivat sintetic de glutami nă, poate suferi hidroliză la
pH-ul fiziologic , rezultând formarea glutaminei ca un degradant. În plus, L -glutamina este una
din materia prima folosit ă în sinteza de substanțe medicamentoase cum este talidomida. Prin
urmare, g lutamina este monitorizat ă atât în substanțele medicamentoase, cât și în forme le
farmaceutice de dozare.
Metoda utilizată în prezent, pentru a determina g lutamina în medicamente și
produse este cromatografia în strat subțire (TLC) cu pulverizare de ninhidrină spray42. Metoda
TLC nu a fost automatizată decât pe jumatate din cauza int roducerii manuale a probei și a
detectării vizuale. Prin urmare, s -a dorit să se exploreze tehnici noi alternative, cantitative
cromat ografice ca potențiali î nlocuitori ai TLC -ului pentru cuantificarea glutaminei în
talidomidă, analogi și produse. De asemenea HPLC -ul cu detecție de împrăștiere a lum inii
evaporatoare și LC/MS sunt posibile alternative pent ru determinarea glutaminei . Cu toate
acestea, aceste metode sunt limitate de disponibilitatea acestor instrumente în laborator.
Detectarea UV indirectă este atractivă, deoarece o astfel de metodă poate fi adaptată cu ușurință
la utilizarea instrumentelor H PLC existente.

37 Din aceste motive, se dezvoltă și se validează metode mai cantitative și mai
automatizate care utilizează detectarea UV indirectă, pentru determinarea glutaminei non -UV
absorbantă din talidomidă și analogi43. Fazele mobile HPLC folosite sun t acid fosforic, 2 –
naftalensulfonat de sodiu și metanol. 2 -Naftalensulfonatul a fost folosit ca o sondă de detecție
UV pentru glutamină.
Această metodă s -a dovedit a fi specifică pentru glutamină. Pentru eluarea
glutaminei și respectiv a talidomidei a fost utilizat un program de eluare izocratică segmentat. S-
a constatat că metoda este specifică pentru glutamină. Linearitatea a fost de 0,05 -1,25%
glutamină în raport cu o concentrație nominală de 8 mg ml-1a probei de talidomidă. Limitele de
detecție și d e cuantificare s -au dovedit a fi de 0,03%, respectiv de 0,05% pentru glutamină.

Figura 14. Mecanism teratogenitate

38
CAPITOLUL III.ALTE METODE

III.1. Cromatografia gazoasă (GC)

Studiile cu privire l a labilitatea stereochimică a talidomidei și efectele catalitice
care conduc la enantiomerizare , par a fi la fel de importante ca acum aproape 40 de ani.
Metode le cromatografic e enantioselective, reprezintă tehnicile cele mai
frecvent utilizate pentru evaluarea integrității ster eochimice. În acest fel, s -au utilizat două
metode cromatografice, GC dinamice și GC cu debit stop pentru a determina bariera de
enantiomerizare a talidomidei44. În prezența unei faze sta ționare chirale, enantiomerii talidomidei
sunt caracterizați de profiluri de elu are care prezintă platouri și/ sau lărgimi de vârf care au fost
observate între 190 și 220 ° C în GC dinamic ă. Pentru a obține bariera de enan tiomerizare a
talidomidei, din datele e xperimentale, a fost utilizat un program de simulare rap idă și eficientă,
ChromWin pentru a simula profilele de eluare și a obține parametrii de activare c inetică.

III.2. Electroforeza capilară

Electroforeza capila ră a fost inițial dezvoltată ca tehnică microanalitică pentru
analiza compușilor ionogeni. Cromatogra fia electrocin etică micelară ulterioară (MECC) a permis
analiza compușilor neutri. În 1989, enantioseparațiile de racemate încărcate au fost raportate
folosind ciclodextrine ca selectori chirali în modul de soluție liberă. S -au realizat, de asemenea,
separarea unor med icamente uzuale și a metaboliților acestora, cât și separarea enantiomerilor în
aceeași lucrare utilizând CE. În schimb, diferențierea enantiomerilor neutri, ai medicamentului

39 este posibilă prin utilizarea de selectori chirali, încărcați în CE. În acest fe l, Weinz și Blaschke
investighează biotransformarea talidomidei45.
Enantiosepararea simultană a talidomidei și a doi dintre metaboliții săi, potențiali
hidroxilați, a fost realizată utilizând CE cu carboximetil -β-ciclodextrină încărcată negativ.
Această m etodă a fost extinsă la un produs suplimentar obținut prin biotransformare46.

Figura 15 Tautomerie

Sistemul selector, dual chiral, ce folosește o β-ciclodextrină suplimentară
biotransformată (β -CD) și sulfobutil -β-CD, încărcat negativ, a fost ușor modificat până la o

40 concentrație de 12 mg ml-1a soluției tampon de rulare al fiecărui CD. Modul purtător în care
acești aditivi tampon transportă comp ușii neutri la detector, precum și utilizarea unui capilar
acoperit cu poliacrilamidă au fost necesari pentru a obține enantioseparațiile reproductibile ale
tuturor celor opt analiți.
Metodele le cromatografice enantioselectiv e, care reprezintă tehnicile cele mai
utilizate în mod obișnuit pentru determinarea raporturilor enantiomerice, pot fi de asemenea
utilizate și pentru evaluarea integrității stereochimice.
Într-un studiu realizat de Scho etz și colab.47, cro matografia capilară
electroc inetică dinamică (DEKC) a fost folosită pentru a determina bariera de enantiomerizare a
talidomidei . În prezența aditivului chiral de fază mobilă , carbox imetil -B-ciclodextrină ,profilurile
de eluareale enantiomerilor interconvert iți ai talidomidei, prezintă platouri și/ sau picuri
amplificate între 25 și 55 ° C la un pH 8. Pentru a obține bariera de enantiome rizare a talidomidei
din datele experimentale, s-a folosit programul de simulare rapidă și eficientă ChromWin .
Acesta a fost utilizat pentru a simula profilurile interconversionale experimentale și pentru a
obține constantele de rată aparentă.
Electrocromatografia capilară (CEC) este o tehnică relativ nouă de separare, care
combină selectivitatea LC cu rezoluția ș i eficiența ridicată a CE. Avantajele provin, în principal,
din transportul electroosmotic al fazei mobile prin coloană, ceea ce conduce la reducerea
înălțimii plăcii datorită debitului și a capacității de a folosi particule mai mici și coloane mai
lungi pentru o eficiență și mai mare. Aceste avantaje ale CEC -ului au contribuit la dezvoltarea sa
rapidă, care a dus la o gamă variată de aplicații , folosite atât la molecule mici, cât și la proteine
mari.
Valorile de selectivitate și de efici ență ale separării , care sunt posibile în CEC ,
fac din aceasta , o tehnică atractivă complementară cu cele disponibile pentru separarea
enantiomerilor. Din acest motiv, o fază staționară chirală de vancomicină (CSP) a fost , pe deplin
evaluată în CEC , în moduri de fază inversă și polar organic pentru un număr de compuși
farmaceutici racemici. Valorile ridicate de eficiență și de rezoluție au fost obținute pentru un
număr de clase de compuși, inclusiv talidomida, atât în modul organic polar, cât și în modul de
fază inversă48.

41 Același grup de cercetători, demonst rează fezabilitatea pregătirii i n situ a unui
CSP de vancomicină pentru CEC49. Coloanele capilare coloidale sunt ambalate cu silice diol
LiChrospher și evaluate într -un mod achiral , pentru a asigura o ambalare adecvată și pentru a
menține producția de frit. CSP este ulterior preparat folosind o reacție simplă în trei etape,
efectuată prin spălarea reactivilor pentru fiecare etapă prin col oana cu diol silica.
Abordarea in situ este preferată, în schimbul binei cunoscute abordări de
ambalare a fazei comerciale sau a celei de loturi de sinteză , astfel încât orice enantioselectiv
observat să poată fi comparat cu studiile anterioare similare realizate în LC și în cromatogr afia
cu fluide supercritice (SFC) ef ectuate în laboratoare . Faza de vancomicină rezultată este evaluată
în CEC , atât pentru modul organic fazic, cât și pentru modul polar cu un număr de analiți
racemici fie neutri, fie bazici, fie cu un pH acid .

III.3. Lu miniscența

Metodologia uzuală utilizează o metodă de înaltă separare (HPLC) cu detecție bazată
pe absorbția moleculară în regiunea UV.A fost dezvoltată o metodă fosforimetrică foarte
sensibilă, care prezintă potențialul analitic al proprietăților lumini scente ale talidomidei50.
Fosforescența acesteia a fost mult îmbunătățită utilizând Hg (II) ca un amplificator selectiv de
atomi de greutate într -un substrat de celuloză de fund scăzut.
Deși foarte sensibil ă (1,8 ng limită de detecție absolută ) și selectiv ă, această metodă
este consumatoar e de timp, deoarece probele trebuie uscate și purjate cu N 2 în suportul de probă
timp de 5 minute înainte de fiecare măsurătoare. Din acest motiv, a fost elaborată și evaluată o
metodă spectrofluorimetrică în ceea ce privește sensibilitatea și selec tivitatea pentru
determinarea talidomidei în formulările farmaceut ice, serul de sânge și urină51.
Au fost depuse eforturi pentru maximizar ea semnalului de fluorescență a talidomidei și
pentru a crește selectivitatea în analiza probelor complexe, în special , în probele care conțin

42 sulfanimidă, un concomitent puternic flu orescent care poa te fi utilizat în asociere cu talidomida.
După optimizarea sistemului de solvenți și a ph-ului, s -a obținut un semnal maxim .
Rezultate mai bune , s-au obținut , utilizând metoda combinată a mediului acid și
tratamentul cu UV. Pentru probele de ser de urină și de sânge, s -a dovedit a fi practică o extracție
în fază solidă pe un cartuș C 18. Limita de detecție a fost estimată la 1,2 ug l -1, de aproximativ
100 de ori mai mare decât cea raportată pentru metodele de rutină HPLC de absorbție în UV.

III.4. Voltametrie

Deși metodele bazate pe luminiscență sunt foarte sensibi le și selective,
determinarea talidomidei necesită adesea o sensibilitate mai mare , deoarece se hidrolizează
rapid. Astfel, se ajunge la scăderea concentrației de analit care trebuie măsurată din fluide le
biologice. Recent, Liu și cola boratorii au studiat în anul 2002 comportamentul electrochimic al
talidomidei pentru a înțelege natura procesului de reducere pe electrodul de mercur.
Deși raportează condiții experimentale prielnice pentru ac umularea analitului pe
HMDE, autorii nu au reusit sa dezvolte o metodă analitic ă. Cardoso și colaboratorii52 dezvoltă,
evalueaz ă și compară metodele de voltam etrie diferenți ală-impulsivă (DPV) și de volta metrie cu
valțuri pătrate (SWV) pentru det erminarea ultradimensională a talidomidei în formulările
farmaceutice și în fluide le biologice (ser și urină).
Cel mai sensibil vârf de reducere utilizat al talidomidei a fost la -804 mv pentru
SWV și -921 mv pentru DPV . Prin mărirea sensibilității determinăril or s-a putut obține o
preconcentrație selectivă a talidomidei pe electrod ul de picurare cu mercur static.
Limita de detecție absolută pentru proba de 100 µl a fost de 4,7 pg pentru DPV
și 0,5 pg pentru SWV.

43 III.5. Spectometrie de masă

S-au înregistrat progrese semnificative în ultimii ani în ceea ce privește
metodele de identificare și cuantificare chirală bazate exclusiv pe spectrometria de masă. În
comparație cu metodele cromatografice, care sun t utilizate de obicei în analiza cantitativă
chirală, abordarea metodei cinetice este mai rapidă și necesită, de asemene a, cantități mai mici de
probă. Augusti si colaboratorii53 explică aplicarea metodei cinetice la cuantificarea
enantiomerică a talidomide i. Toate experimentele s -au realizat utilizând un spectrometru de masă
cu captare de ioni comercial , echipat cu o sursă de ionizare prin electrospray (ESI) și operat în
modul ion pozitiv. Spectrele de masă raportate reprezintă o mediea aproximativ 40 de scanări,
fiecare necesitând 0,2 s. Probele au fost infuzate în sursa ESI printr -o pompă de serin gă la un
debit de 2,00 µl min-1.

Figura 16. Acțiune talidomidă

44
CONCLUZII
 Talidomida este utilizat ă ca un racemat , conține un centru chiral, ce prezintă un
potențial farmacocinetic și farmacodinamic diferit al enantiome rilor levogir și
dextrogir. Î n plus, aceștia sunt biotransformaț i la un număr de metaboliți chirali
și achirali potențial activi.
 Talidomida se poate sintetiza prin mai m ulte metode și este un medicament
imunomodulator, antiinflamator și antitumoral.
 Au fost dezvoltate mul te metode pentru a cuantifica talidomida și metaboliții săi
dintr -o varietate de matrice biologice.
 Majoritatea metode lor sunt achirale, fiind bazate pe HPLC utilizând separarea
fazei inverse cu detectarea UV, MS sau în tandem cu MS.
 Cu toate acestea, recunoașterea tot mai mare a importanței stereoselectivității în
determinarea proprietăț iilor farmacologiceale talidomidei, a condus, mai
recent, ca mulți cercetători sa recurga la separarea enantiomerilor, în unele
cazuri, chiar la separarea diferiților metaboliți.
 Astfel de abordări se bazează în mod obișnuit pe tehnologia chirală staționa ră
(CSP) -HPLC, CE sau electroc romatografie (CEC). De aseme nea, recent,
vancomicina a fost utilizată ca CSP pentru separarea unui număr de
medicamente racemice, inclusiv talidomida . Rezultatele au arătat că o coloană
de vancomicină HPLC -CSP este o alegere bună pentru separarea și
cuantificarea enantiomerilor tali domidei .

45
REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

1 http://www.chemspider.com/Chemical -Structure.5233.html
2 Meierhofer C, Dunzendorfer S, Wiedermann CJ. Theoretical basis for the activity of
thalidomide. BioDrugs 2001; 15: 681 –703
3 Chen TL, Vogelsang G B, Petty BG, et al. Plasma pharmacokinetics and urinary
excretion of thalidomide after oral dosing in healthy male volunteers. Drug Metab Dispos 1989;
17: 402 –5
4
https://www.medicines.org.uk/emc/product/6317/smpc#PHARMACODYNAMIC_PROPS
5 J.C. Reepmeyer, D. C Cox, J. AOAC Int. 80 (1997) 767 -773.
6 M.J. Czejka, H.P. Koch, J. Chromatogr. Biomed. Appl. 413 (1987) 181 -187.
7 T.L. Chen, G.B. Vogelsang, B.G. Petty, R.B. Brundrett, D.A. Noe, G.W. Santos, O.M.
Colvin, Drug Metabol. Dispos. 17 (1989) 402 -405.
8 D.Heney, D.R. Norfolk, J. Wheeldon, C.C. Bailey, I.J.Lewis, D.L.Barnard, Br.J.
Haematol. 78 (1991) 23 -27.
9 B.J.Boughton, T.M.T. Sheehan, J. Wood, D. O ’Brien, M.Butler, A.Simpson, K.A. Hale,
Ann, Clin. Biochem. 32 (1995) 79 -83.
10 A. Delon, S. Favreliere, W. Couet, P. Courtois, S. Bouquet, J. Liq. Chromatogr. 18
(1995) 297 -309.
11 B.R.Simmons, R.M.Lush, W.D.Figg, Anal. Chim. Acta 339 (1997) 91 -97.
12 A. Haque, J.T. Stewart, J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 21 (1998) 2151 -2163.
13 T. Eriksson, S. Bjorkman, A . Fyge, H. Ekberg, J. Chromatogr. Biomed. Appl. 582
(1992) 211 -216.
14 A.W. Lyon, G. Duran, V.A. Raisys, Clin. Biochem. 28 (1995) 467 -470.

46

15 R. Huupponen, K. Pyykko, Clin. Chem 41 (1995) 1199 -11199.
16 T. Eriksson, S. Bjorkman, A.W. Lyon, V.A. Raisys, Clin. Chem. 42 (1997) 1094 -1095.
17 T. Eriksson, S. Bjorkman, B. Roth, A. Fyge, P. Hoglund, Chirality 10 (1998) 223 -228.
18 T. Eriksson, S. Bjorkman, B. Roth, A. Fyge, P. Hoglund, Chirality 7 (1995) 44 -52.
19 T. Eriksson, S. Bjorkman, B. Roth, P. Hoglund, J. Pharm. Pharmacol. 52 (2000) 807 –
817.
20 G. Blaschke, H.P. Kraft, H. Markgraf, Chem. Ber. 113 (1980) 2318 -2322.
21 H.Y. Aboul -Enein, M.R. Islam. J. Liq. Chromatogr. 14 (1991) 667 -673.
22 B. Knoche, G. Blaschke, J. Chromatogr. A 666 (1994) 235 -240.
23 J.C. Reepmeyer, Chirality 8 (1996) 11 -17.
24 C. Álvarez, J.A. Sánchez -Brunete, S. Torrado -Santiago, R. Cadórniga, J.J. Torrado,
Chromatographia 52 (2000) 455 -458.
25 X. Yang, Z. Hu, Y.C.Sui, P.C. Ho, E. Chan, W. Duan, C.G. Boon, S. Zhou, J. Pharm.
Biomed. Anal. 39 (2005) 29 9-404.
26 S. Zhou, Y. Li, P. Kestell, J.W. Paxton, J. Chromatogr. B: Anal, Technol. Biomed. Life
Sci. 785 (2003) 165 -173.
27 J.S. Torańo, A. Verbon, H.J. Guchelaar, J. Chromatogr. B : Biomed. Sci. Appl. 734
(1999) 203 -210.
28Y.J. Huang, J.F. Liao, T.H. Tsai, B iomed. Chromatogr. 19 (2005) 488 -493.
29S.F. Murphy -Poulton, F. Boyle, X.Q. Gu, L.E. Mather, J. Chromatogr. B: Anal.
Technol. Biomed. Life Sci. 831 (2006) 48 -56.
30H.Y. Aboul -Enein, V. Serignese, Chirality 10 (1998) 358 -361.
31L.A. Svensson, J. Dӧnnecke, K.E. Karlsson, J. Vessman, Chirality 11 (1999) 121 -128.
32S.K. Teo, R.S. Chandula, J.L. Harden, D.I. Stirling, S.D. Thomas, J. Chromatogr. B:
Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 767 (2000) 145 -151.

47

33B. Knoche, G. Blaschke, Chirality 6 (1994) 221 -224.
34 M. Meyring, D. Strickmann, B. Chankveradze, G. Blaschke, C. Desiderio, S. Fanali, J.
Chromatogr. B : Biomed. Sci. Appl. 723 (1999) 255 -264.
35M. Meyring, B. Chankvetadze, G. Blaschke, J. Chromatogr. A 876 (2000) 157 -167.
36M. Meyring, J. Műhlbacher, K. Messer, N. Kastner -Pustet, G. Bringmann, A.
Mannschreck, G. Blaschke, Anal. Chem 74 (2002) 3726 -3735.
37M. Meyring, B. Chankvetadze, G. Blaschke, Electrophoresis 20 (1999) 2425 -2431.
38 M. Meyring C. Műhlenbrock, G. Blaschke, Electrophoresis 21 (2000) 3270 -3279.

39T. Eriksson, S. Bjorkman, B. Roth, H. Bjork, p. Hӧglund, J. Pharm. Pharmacol. 50
(1998) 1409 -1416.
40K. Winckler, K.D. Klinkmuller, H. -J. Schmahe, J. Chromatogr. Biomed. Appl. 488
(1989) 417 -425.
41T.M. Tohnya, K. Hwang, E.R. Lepper, H.A. Fine, W.L. Dahut, J. V enitz,A.
Sparreboom, W.D. Figg, J. chromatogr. B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 811 (2004) 135 –
141.
42US Pharmaceopericol forum, 25, (1999) 8067 -8069.
43J.Li, M.S. Jaworsky, D.I. Stirling, J. Pharm. Biomed.Anal. 31 (2003) 19 -27.
44O. Trapp, G. Schoetz, V. Schurig, J. Pharm. Biomed. Anal 27 (2002) 497 -505.
45C. Weinz, G. Blaschke, J. Chromatogr. B: Biomed. Appl 674 (1995) 287 -292.
46G. Blaschke, M. Meyring, C. Műhlenbrock, B. Chankvetadze, Il Farmaco 57 (2002)
551-554.
47G. Schoetz, O. Trapp, V. Schurig, Electr ophoresis 22 (2001) 3185 -3190.
48 C. Karlsson, L. Larlssson, D.W. Armstrog, P.K. Anal. Chem. 72 (2000) 4394 -4401.
49H. Wikstrӧm, L.A. Svensson, A. Torstensson, P.K. Owens, J. Chromatogr. A 869
(2000) 395 -409.

48

50R.Q. Auceilio, A.D. Campiglia, Mikrochim. Acta 1 17 (1994) 75 -85.
51C.E. Cardoso, R.O.R. Martins, R.Q. Aucelio, Microchem. J. 77 (2004) 1 -7.
52C.E. Cardoso, P.A.M. Farias, R.O.R. Martins, Anal. Lett. 38 (2005) 1259 -1274.
53D.V. Augusti, R. Augusti, F. Carazza, R.G. Cooks, Chem. Commun. (2002) 2242 -2243.