de Matematic a s,i Informatic a Metoda pentru vector viral dual mediat de gena CRISPR-Cas9 in celule umane endoteliale primare Student: Rusu… [627808]

Universitatea din Bucures ,ti
Facultatea
de Matematic a s,i Informatic a
Metoda pentru vector viral dual mediat de gena
CRISPR-Cas9 in celule umane endoteliale primare
Student: [anonimizat] 508
Bucures ,ti
2018

Cuprins
Pagina
1 Obiecte identicate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1 Celule umane endoteliale primare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Metoda vectorului viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.3 Metoda CRISPR { Cas9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
2 Experimentul . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.1 Cateva denitii ajutatoare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.2 Experimentul in sine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.3 Mai multe rezultate ale experimentului . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.4 Concluzii asupra experimentului . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Capitolul 1. Obiecte identicate
Capitolul 1
Obiecte identicate
Pentru a putea intelege despre ce au lucrat cercetatorii din lucrarea " Metoda pentru
vector viral dual mediat de gena CRISPR-Cas9 in celule umane endoteliale primare ",
trebuie sa stim mai intai cateva elemente de baza, de biologie, pentru aceasta lucrare.
Dupa cum se vede, din titlul lucrarii se pot identica trei obiecte individuale:
1. Celule umane endoteliale primare
2. Metoda vectorului viral
3. Metoda CRISPR { Cas9
1.1 Celule umane endoteliale primare
Celulele endoteliale sunt celule imbinate, ce seamana cu niste solzi de peste. Acestea
formeaza un strat ce se numeste Endoteliu . Endoteliul reprezinta stratul interior de la
peretele vasului de sange sau a vasului limfatic. Proprietatea lui principala este de a forma
o interfata de legatura dintre sange sau limfa, care circula in interiorul vasului (numit si
lumen), cu restul peretului vasului.
O functie de baza a celulelor endoteliale primare este sa mentina permeabilitatea
peretului vasului de sange sau limfatic, precum si de a regla
uxul sanguin, ce este alcatuit
din diversi nutrienti, molecule biologice si celule sanguine, binenteles. Suprafata generata
de celulele endoteliale este o suprafata antitrombotica care usureaza trecerea de plasma si
diverse "obiecte" celulare in timpul vascularizarii. Mai exact, permite trecerea enzimelor,
hormonilor si oxigenului. Tot odata, suprafata antitrombotica, restrictioneaza trecerea
celulelor de dimensiuni mari, a substantelor toxice si a bacteriilor in alte zone ale corpului
uman.
Pe langa aceasta functie principala, celulele endoteliale primare au o multitudine de
functii auziliare, caracteristice lor:
(a)Producerea de oxid nitric !Oxidul nitric ajuta la dilatarea vaselor de sange
pentru a creste
uxul sanguin. Astfel se previne atasarea trombocitelor de
peretele vasului de sange. De asemenea, ajuta si la reducerea in
amatiei.
(b)Formarea vaselor de sage !Ajuta la repararea si producerea de noi vase de
sange
(c)In
amare !Cum ziceam mai sus, ajuta la cresterea
uxului sanguin. Astfel
le permite celulelor albe sa ajunga la zona afectata sau ranita.
De mentionat ca exista astfel de celule endoteliale si la nivelul plamanilor, ce se nu-
mesc Human Lung Microvascular Endothelial Cells (HLMVEC) . Aceste celule
speciale au un rol important in a regla corespunzator functia pulmonara. Cu ajutorul
lor se pot face diverse studii pe aspecte variate ale patologiei pulmonare si a biologiei
microvasculare pulmonare in vitro.
Curiozitate: Daca am intinde tesutul de endoteliu din corpul unui adult, am acoperi
suprafata a 8 terenuri de tenis.
1

Capitolul 1. Obiecte identicate 1.2. Metoda vectorului viral
1.2 Metoda vectorului viral
Pentru a putea intelege aceasta metoda trebuie mai intai sa stim ce este ADN-ul si
ARN-ul, precum si diferenta dintre aceste doua.
ADN -ul sau acidul dezoxiribonucleic, reprezinta o molecula foarte importanta ce se
gaseste in toate celulele umane si este identica in ecare celula a unei persoane. Acesta
stocheaza toata informatia genetica codata.
ARN -ul sau acidul ribonucleic, este implicat in decodicarea informatiei ereditare
stocata de catre ADN, folosit pentru sinteza proteinelor. Mai exact, ARN-ul este un
catalizator de proteine.
Unvector este reprezentat de o multime formata din molecule speciale de ADN, care
transfera informatie genetica dintr-o celula la o alta celula. Acestia sunt in partiti in
patru mari clase:
1.Bacteriofagi !In aceasta clasa se incadreaza aceia care infecteaza bacteriile.
2.Retrovirusuri !In aceasta clasa se incadreaza aceia care se integreaza in
genom si se replica o data cu celula gazda.
3.Lentivirusuri !Asta reprezinta defapt o subclasa a retrovisurilor.
4.Adenovirusuri !In aceasta clasa se incadreaza aceia care NU se integreaza
in genom si NU se pot replica o data cu celula gazda. Au o utilizare relativ
limitata, deoarece genereaza un raspuns imun puternic. Datorita acestui lucru
se folosesc in crearea de vaccinuri.
5.Plasmide !Acestea sunt molecule inelare de ADN, fragmente de ADN dublu
spiralat.
La transferul genelor de la un organism la altul se utilizeaza vectori formati din plas-
mide, virusuri, ADN mitocondrial si ADN cloroplastic. Un astfel de transfer indeplinit
de vectori virali se numeste transfectie . Asa cum era de asteptat, un sistem vectorial,
folosit pentru a tranfera informatie de la un organism la altul, trebuie sa respecte cateva
cerinte obligatorii:
1. Vectorul trebuie sa e inofensiv.
2. Vectorul trebuie sa se poata multiplica intr-un mod alert in celula gazda. Tot
odata, trebuie sa nu se poata multiplica in alte celule, ale altor organisme.
3. Prezenta asa zisilor markeri pentru selectarea de clone dupa moleculele recom-
binate de ADN.
4. Vectorul trebuie sa se poata izola si clona usor.
Metoda vectorului viral consta in plasarea plasmidei intr-un container plin cu enzime
speciale, care vor segmenta macromolecula in zona aleasa inainte. Dupa aceea se pun cele
doua segmente de ADN in acelasi container, diferit de cel initial, si se foloseste un virus
pentru a le integra in genom. Metoda este folosita si la tratarea unor maladii genetice.
Curiozitate: Primul plasmid baterian, folosit ca vector pentru tranferul de gene, a
fost descoperit si realizat de catre S. Cohen in 1973. Acesta este notat cu pSC 101.
1.3 Metoda CRISPR { Cas9
CRISPR { Cas9 a fost descoperit mai intai in domeniul microorganismelor unicelulare
si abia apoi la bacterii. A fost descoperit de catre cercetatorul Francisco Mojica, de
2

Capitolul 1. Obiecte identicate 1.3. Metoda CRISPR { Cas9
la Universitatea din Alicante. El credea ca CRISPR-ul serveste ca parte a sistemului
imunitar, aparand impotriva virusilor invadatori. Insa, nu a putut demonstra acest lucru.
Teoria lui a fost demonstrata abia in anul 2007, iar in 2015 s-a publicat prima metoda
CRISPR de editare a genomului uman, de catre Feng Zhang de la Institutul Broad si
MIT.
CRISPR { Cas9 reprezinta defapt o unealta de editare a genomului uman prin eli-
minarea, adaugarea sau modicarea unei sectiuni dintr-o secventa de ADN. Metoda de
actionare a CRISPR { Cas9 este impartita in doi pasi, alcatuiti de elementele ce formeaza
CRISPR { Cas9:
1.Enzima Cas9 !Actioneaza ca o foarfeca moleculara asupra genomului, taind
ambele randuri/spirale de ADN si creaza o gaura de ADN dublu catenar.
2.Ghidul ARN !Este reprezentat de o bucata de ARN, formata din apro-
ximativ 20 de baze complementare secventei ADN tintita. Aceasta ghideaza
enzima Cas9 catre portiunea de ADN ce trebuie schimbata, ca apoi sa se lege
de ADN-ul taiat.
Deci, rolul CRISPR este de a localiza zona afectata de ADN si a incerca sa o trateze
pentru a o vindeca. In prezent, exista o sumedenie de experimente care folosesc CRISPR
pentru vindecarea de diferite boli: Boala Huntigton (aceasta face ca persoana bolnava sa
isi piarda functiile motorii), Fibroza, Cancerul.
Ca benecii a utilizarii acestei metode, am putea mentiona ca este o metoda simpla,
versatila si precisa de a manipula materialul genetic. De asemenea, are avantajul de a
putea viza mai multe gene in acelasi timp. Acest avantaj major, reprezinta motivul care
il face sa se diferentieze de alte instrumente de editare de gene.
3

Capitolul 2. Experimentul
Capitolul 2
Experimentul
2.1 Cateva denitii ajutatoare
In acest capitol vor  enumerate cateva denitii biologice, precum si/sau a unor ca-
racteristici, a diferitelor elemente (celule, micro organisme, procese) intalnite in articolul
stiintic ales.
Denitie: Proteinele ce se a
a la incrucisarea a doua celule in tesuturile endoteliale
se numesc adherens junction-uri .
Denitie: Tripsiniza reprezinta procesul de de descompunere celulara, folosind o
enzima proteica care sparge proteinele, pentru a desface celulele Adherens din vasul ^ n
care acestea sunt ^ n culese.
Denitie: Procesul de numarare sau masurare a celulelor din sange se numeste cito-
metrie .
Denitie: Site-ul reprezinta o scurta secventa de ADN. intre 200 si 500 perechi de
baze. Aceasta apare o singura data in genom si se stie unde se a
a.
Denitie: Multimea de trasaturi si caracteristici ale unui organism se numeste fenotip .
Acesta rezulta din in
uenta factorilor externi, precum si din exprimarea genelor ale
organismului. De remarcat ca fenotipul este total independent de genotip, nu toate orga-
nismele cu acelasi genotip arata sau se comporta la fel. Comportamentul acestora depinde
e factorii externi si de conditiile de dezvoltare.
2.2 Experimentul in sine
In articolul ales de mine, se descrie o abordare CRISPR – Cas9 de a se sterge genele
in celulele endoteliale umane primare fara a  nevoie de clonare.
Oamenii de stinta, din Universitatea din Chicago, au folosit doua tipuri de virusuri:
1.EGFP – Cas9 !Pentru crearea/exprimarea acestuia s-a folosit un vector
de adenovirus. Astfel, s-a evitat posibilitatea de a se integra nucleoza Cas9 cu
genomul.
2.sgRNA !Pentru crearea/exprimarea acestuia s-a folosit un vector de lenti-
virus.
Pentru a observa cat de fezabila este noua metoda, cercetatorii au incercat sa stearga
gena receptor Tie2, gena ce ajuta la reglarea integritatii barierei vasculare la nivel de
adherens junction-uri a celulelor endoteliale umane.
Astfel, s-au sters genele Tie2 cu ajutorul CRIPR-Cas9 in celulele endoteliale umane.
Cu aceasta ocazie s-a observat o inbunatatire a permeabilitatii endoteliale.
In continuare, oamenii de stiinta au incercat sa vada cand mutatia cu Tie2 va recidiva,
mai exact dupa a cata generatie va aparea din nou gena Tie2. Acestia au reusit sa
demonestreze ca secventierea cu gena Tie2 a fost retinuta pana la 5 generatii de clonari.
2.3 Mai multe rezultate ale experimentului
La 48-72 de ore dupa separarea genei, celulele endoteliale au fost tripsinizate si impar-
tite intr-un raport de 1:3, ca apoi sa se foloseasca al doilea set de lentivurus si adenovirus.
4

Capitolul 2. Experimentul 2.4. Concluzii asupra experimentului
Cu ajutorul citometriei, cercetatorii au masurat o ecienta a transducerii de 93% in
expresia celulelor endoteliale pulmonare (HLMVEC) prin lentivirus si de 95% prin EGFP
– Cas9.
Oamenii de stiinta au constatat ca celulele transduse expun insert ,ii si stergeri, numite
indel-uri. Cum era de asteptat, aceste indel-uri variaza ca marime. Dar, s-a constat si ca
celulele de control nu au prezentat de nici un fel inserari sau stergeri. Un indel are cel
putin 50 de bp (unitate de masura pentru marimea indel-ului).
Majoritatea mutatiilor induse de CRISPR-Cas9 au fost localizate la 10bp de site-ul
tinta. In urma actiunii indel-ilor, mai exact, in urma inserarilor si stergerilor secventei de
ADN, s-au compromis un numar de nucleotide ce nu este divizibil cu 3. Asadar, au aparut
asa zisele mutatii frameshit, mutatii in-frame si noncodate. Dupa cum era de asteptat,
mutatiile in-frame au avut loc la o treime de mutatii, mutatiile noncodate au avut loc la
mai putin de 10%, iar cele de tip frameshit au avut cea mai mare proportie (50-75%).
De asemenea, oamenii de stiinta au gasit mutatii si la site-urile divizate de 3-6%.
Divizarea alternata poate in
uenta negativ nivelurile de proteine.
2.4 Concluzii asupra experimentului
In articolul ales, se descrie un experiment in care oamenii de stiinta de la Universitatea
din Chicago au examinat o metoda de stergere a genei Tie2 in celule umane endoteliale
primare. Acestia au determinat daca gena este indispensabila pentru integritatea barierei
endoteliale la nivelul adherens junctions-urilor.
S-a observat ca stergerea genei Tie2, folosind oricare din cele doua tipuri de vectori,
a dus la o crestere substantiala in permeabilitatea endoteliala in comparatie cu celulele
de control. Astfel, s-a demonstrat ca lipsa acestei gene duce la o dereglare a funtiilor si a
integritatii barierei endoteliale.
Ce este important este ca s-a reusit salvarea proprietatii de permeabilitate a celulelor
endoteliale pulmonare si s-a reusit recuperarea berierei endoteliale dupa ce s-a tratat cu
trombina. Refacerea celulelor adherens junctions s-a nalizat dupa aproximativ doua ore.
5