Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. [627577]

CUPRINS

Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 3
A. PARTEA GENERALĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 5
CAPITOLUL I ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 6
METODE DE DETERMINARE A ACTIVITAȚII ANTIOXIDANTE TOTALE …………………. 6
I.1. Beneficiile pentru sănătate ale antioxidanților ………………………….. ………………………….. …. 6
I.2. Mecanismul de acțiune al antioxidanților ………………………….. ………………………….. ……….. 8
I.3. Metode de evaluare totală a capacității antioxidante ………………………….. …………………….. 9
I.4. Tehnici spectrometrice ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 12
I.5. Tehnici electrochimi ce ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 16
I.6. Metoda biosenzorilor ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 19
I.7. Metode cromatografice ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 20
CAPITOLUL II ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 25
ANTIOXIDANȚI -COMPARAȚIE A DIFERITELOR MET ODE DE TESTARE
A ACTIVITAȚII ANTIOXIDANTE ………………………….. ………………………….. …………………….. 25
II.1. Sistemele de testare ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 27
II.2. Rezultate si discutii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 28
CAPITOLUL III ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 32
POLIFENOLI, SURSE ȘI BIODISPONIBILITATE ………………………….. ………………………….. . 32
III.1. Polifenolii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 32
III.2. Clasificarea polifenolilor si distribuția acestora in alimente ………………………….. ………. 33
III.3. Conținutul polifenolilor in dieta umană ………………………….. ………………………….. ……… 39
III.4. Biodisponibilitatea polifenolilor ………………………….. ………………………….. ……………….. 40
CAPITOLUL IV: ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 47
EVALUARE METODE ANTIOXIDANTE IN VITRO ………………………….. ………………………. 47
IV.1.Metode in vitro ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 47
B. PARTEA SPECIALĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 59
CAPITOLUL V ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 60
INVESTIGAȚII PRIVIND CORELAȚIILE DINTRE CONȚINUTUL DE POLIFENOLI DIN
VINURILE ROȘII ȘI CAPACITATEA ANTIOXIDANTĂ A ACESTORA ………………………. 60
V.1. Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 60
V.2. Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 62

CAPITOLUL VI ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 66
METODE DE TESTARE A ACTIVITATII ANTIOXIDA NTE ………………………….. …………… 66
VI.1. Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 66
VI.2. Procese de oxidare a lipidelor ………………………….. ………………………….. …………………… 68
VI.3. Antioxidanți ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 71
VI.4. Măsurarea activității antioxidante ………………………….. ………………………….. ……………… 72
VI.5. Proceduri individuale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 78
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………………. 84
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 86

Introducere

Antioxidanții sunt compuși capabili să amâne sau să inhibe procesele de
oxidare care apar sub influența oxigenului atmosferic sau a speciilor reac tive de oxigen.
Ei sunt utiliza ți pentru stabilizarea produselor polimerice, petrochimice, alimente,
cosmetice și farmaceutice. Ace știa sunt implicați în mecanismul de apărare al
organismului împotriva patologiilor asociate atacului radicalilor liberi. Antioxidanții
endogeni sunt enzime, cum ar fi superoxid dismutaz ă, catalază, glutation peroxidază sau
compuși non -enzimatici , cum ar fi acidul uric, bilirubina, albumina, metalotioneina.
Când factorii endogeni nu pot asigura un control riguros și o protecție completă a
organismului împotriva speciilor reactive de oxigen, apare necesit atea unor antioxidanți
exogeni, precum suplimentele nutritive sau produse farmaceutice, care conțin ca
principiu acti v un compus antioxidant. C ei mai importanți antioxidanți exogeni sunt
vitamina E, vitam ina C, β -caroten ul, flavonoidele și mineralele.
Antioxidanții exogeni pot proveni din surse naturale (vitamine, flavonoide,
antociani, anumiți compuși minerali), dar pot fi și compuși sintetici, cum ar fi
butilhidroxi anisol ul, butilhidroxitoluen ul, galat ul etc [1].
Există un interes sporit față de antioxid anți, în special în ceea ce privește
prevenirea efectelor noc ive a radicalilor liberi prezen ți în organismul uman, precum și
deteriorarea grăsimilor și a altor constituen te ale produselor alimentare [2].
Polifenolii sunt cei mai abundenț i antioxidanți din dietă și sunt constituenți
generali ai fructelor, legumelor, cerealelor, măslinelor, legumelor uscate, ciocolatei și
băuturilor, cum ar fi ceaiul, cafeaua și vinul. Ca antioxidanți, polifenolii pot proteja
constituenții celulei împotriva daunelor oxidativ e și, prin urmare, pot limita riscul
diferitelor boli degenerative asociate stresului oxidativ.
Fructele și băuturile, cum ar fi ceaiul și vinul roșu reprezintă principalele surse
de polifenoli. Pentru a stabili dovezi privind efectele consumului de polife noli asupra
sănătății umane și pentru a identifica mai bine care polifenoli asigură cea mai mare
eficacitate în prevenirea bolilor, este în primul rând esențial să se determine natura și
distribuția acestor compuși în alimentația noastră și, în al doilea r ând, sa se cunoasca
biodisponibilitatea acestora.

Corpul uman are un sistem complex de aparare antioxida ntă enzimatică
naturală si anti oxidantă non -enzimatică care contracarează efectele dăunătoare ale
radicalilor liberi și ai altor oxidanți. Radicalii lib eri sunt responsabili de provocarea unui
număr mare de boli inclusiv cancerul, boli cardiovasculare, tulburări neuronale, boala
Alzheimer, boala Parkinson, boala hepatică indusă de alcool, colica ulcerativă,
îmbătrânirea și arteroscleroza. Protecția împotr iva radicalilor liberi poate fi îmbunătățită
prin aportul suficient de antioxidanți din dieta. Dovezi substanțiale indică faptul că
produsele alimentare conținând antioxidanți și posibil, în special, nutrienții antioxidanț i
pot fi de o importanță majoră în prevenirea bolilor. Antioxidanții pot fi de un mare
beneficiu în îmbunătățirea calității vieții prin prevenirea sau amânarea apariției bolilor
degenerative.
Sunt utilizate diferite metode pentru investigarea proprietăților eșantioanelor de
antioxidanți ( diete, extracte de plante, antioxidanți comerciali etc). Obiectivul este de a
revizui metodele probabile care sunt utilizate pentru a evalua proprietatea diferitelor
probe de antioxidant privind evaluarea in vitro a activitatii antioxidantului.
Importanța unui consum moderat de vin în timp ul meselor justifică diminuarea
indicelui de mortalitate, prin afecțiuni coronariene. Această protecție cardiovasculară
este atribuită compușilor polifenolici prezenți în vinuri le roșii . Componentele
polifenolice protejeaz ă sistemele biologice împotriva radicalilor liberi, având
capacitatea de a chelata metalele cu caracter catalitic, cum ar fi fier ul și cuprul . Studiul
in vitro a arătat că mul ți polifenoli naturali sunt antioxidanți mai buni decât vitaminele
E și C. Printr e marea familie de polifenoli, flavonoidele joacă un rol important.
Bioflavonoidele sunt compuși biologici activi care, o dată intrați în interiorul corpului
uman, determină un răspun s biologic pozitiv . Bioflavonoidele sunt recomandate ca
supliment în prev enirea și tratarea acestor deficiențe care implică fragilitate capilară și
permeabilitatea [3].
Vinul a fost identificat ca produs potențial benefic pentru sănătate, datorită
efectului asupra bolilor coronariene, asupra întârzierii debutului tumorii și a a ctivității
antioxidante ridicate. Aceste beneficii au fost atribuite compușilor fenolici, care sunt
abundenți în vin roșu.

A. PARTEA GENERALĂ

CAPITOLUL I
METODE DE DETERMINARE A ACTIVITAȚII ANTIOXIDANTE
TOTALE
I.1. Beneficiile pentru sănătate ale antioxidanților

Au atras atenție considerabil în ceea ce privește radicalii și stresul oxidativ,
profilaxia și terapi a cancerului și longevitatea . Fenolii și polifenolii sunt analizele țintă
în multe astfel de cazuri; ele pot fi detectate de enzime cum ar fi tirozinaza, alte oxidaze
de fenol sau chiar de țesuturile vegetale care conțin aceste enzime [4 -5].
Recomandările bazate pe studii epidemiologice sunt astfel, încât fructele,
legumele și alimente de bază mai puțin prelucrate asigură cea ma i bună protecție
împotriva dezvoltării bolilor cauzate de stres oxidati v, cum ar fi cancerul, bolile
coronariene, obezitate a, diabet de tip 2, hipertensi une arterială și cataracta . Explicația
constă în efectul benefic asupra sănătății, datorat antioxidanț ilor prezenți în fructe ș i
legume. Există numeroș i antioxidanți în plante : carotenoizi, compuși fenolici, derivați
de acid benzoic, flavonoide, proantocianidine, stilbene, cumarine, lignani și lignine . Din
cele 50 de produse alimentare analizate cu un conț inut ridicat de antioxidanți , 13 au fost
mirodenii le, 8 au fost fructe și legume, 5 erau boabe, 5 au fost cele bazate pe cacao , 5 au
fost cereale pentru micul dejun, iar 4 au fost nuci sau semințe. Având în vedere
dimensiunile tipice de servire, mure, nuci , căpșuni, anghinare, afine, cafea preparată,
zmeură, nuci pecan, afine, cuișoare, suc de struguri si ciocolata neindulcită au fost la
partea de sus a clasificării, sucuri le de fructe, băuturi le și băuturi le calde contin cantita ți
mari de antioxidan ți, cum ar fi polifenoli, vitamina C, vitamina E, produse de reacție
Maillard, β -caroten și licopen [6].
S-a constatat c ă consumul de sucuri de fructe și băuturi calde reduce
mortalitatea cauzat ă de bolile degenerative . Se știe că antioxidanții joacă un rol -cheie în
influența protectivă exercitat ă de alimentele vegetale . Studiile epidemiologice care
analizează implicațiile asupra sănătății ale componentelor dietetice se bazează pe
estimarea aportului p opulațiilor p e eșantioane, care se găsesc în bazele de date c are
furnizează compușii găsiți în alimentele consumate în mod obișnuit. Astfel,
disponibilitatea datelor adecvate și complete privind compoziția alimentară este vitală.

Datorită diversității compușilor chimici cu activitate antioxidantă prezentă în produse le
alimentare, nu sunt încă disponibile baze de date complete cu conținut antioxidant. În
plus, nivelurile antioxidanților unici în produsele alimentare nu reflectă neapărat
potenția lul antioxidant total (TAP) ; potențialul antioxidant total depinde de
interacțiunea sinergică și redox între diferitele molec ule prezente în alimente .
Diferențele geografice în compoziția alimentară ar trebui, de asemenea, luate în
considerare atunci când se efectuează anchete regionale [7].
Potențialul antioxidant total este un instrument relevant pentru investigarea
relației dintre antioxidanții alimentari și patologiile induse de stresul oxidativ. Acest
lucru a fost confirmat de datele obținute dintr -un studiu de control recent bazat pe
populație, care demonstrează că dieta TA P a determinat un risc redus al canc erului
gastric . Câteva metode analitice au fost dezvoltate recent pentru măsurarea capacității
antioxidante totale a alimentelor și băuturilor: aceste analize diferă în mecanismul
generării diferitelor specii radicale ș i/sau a moleculelor țintă și în modul în care se
măsoară produsele finale [8].
Consumul de fructe și legume, precum și de cereale și nuci a fost asociat cu un
risc redus de boli cronice . Printre componentele alimentare care luptă împotriva bolilor
cronice , o mare atenție a fost acordată produselor fitochimice, moleculelor derivate din
plante dotate cu o putere antioxidantă constantă. Activitățile cumulatorii și sinergice ale
moleculelor bioactive prezente în alimentele din plante sunt responsabile de
propr ietățile lor antioxidante îmbunătățite. Prin urmare, o investigație adecvată a rolului
antioxidanților alimentari în prevenirea bolilor ar trebui să se bazeze pe o bază de date
completă a produselor alimen tare bogate în antioxidanți. Evaluarea capacității
antioxidante totale (TAC) poate fi o unealtă adecvată pentru a determina proprietățile
antioxidante aditi ve ale alimentelor vegetale . Importanța TAC ca instrument nou pentru
estimarea relației dintre dieta și bolile induse de stres oxidativ este prezen tată în studiile
recente care indică o asociere negativă între TAC -ul dietetic și incidența cancerul ui
gastric sau nivelurile de protein ă C reactivă. Pentru a evalua aportul total al TAC în
studiile populaționale, au fost analizate TAC cu 34 de legume, 30 de f ructe, 34 de
băuturi și 6 de uleiuri vegetale ale soiurilor cel mai adesea consumate în Italia, f olosind
trei teste diferite . Printre fructe, cele mai mari activități antioxidante au fost găsite în
boabe, printre băuturi, cafeaua a avut cel mai mare TAC, u rmată de sucurile de citrice,
care au prezentat cea mai mare valoare pr intre băuturile nealcoolice . TAC -ul de
condimente, fructe uscate, dulciuri, cereale, leguminoase și nuci a fost determinat cu

scopul de a complet a baza de date TAC italiană . În alimente bogate în fibre, în care
fenolii sunt prezenți în forme libere sau legate, cum ar fi cerealele, legumele și nucile, a
fost evaluată contribuția compușilor antioxid anți legați la valoarea TAC [9].
Diferite tipuri de fructe de padure și specii de fructe ma i puțin frecvente sunt
cunoscute in a conține antioxidanț i. Aportul mare de flavonoide, compuși dotați cu
activitate antioxidantă, antiproliferativă și antiinflamatorie, pot avea un impact pozitiv
asupra sănătății umane, în special în prevenirea cancerulu i și a bolilor inflamatorii [10].

I.2. Mecanismul de acțiune al antioxidanț ilor

Inițierea
LH + R ∙ → L ∙ + RH
unde LH reprezintă molecula substratului, de exemplu, o lipidă, cu R ∙ ca radical de
oxidare inițial. Oxidarea lipidelor generează un radical al il puternic reactiv (L ∙) care
poate reacționa rapid cu oxigenul p entru a forma un radical peroxil lipidic (LOO ∙).
Propagare
L∙ + O2 → LOO∙

LOO ∙ + LH → L∙ + LOOH
Radicalii peroxil sunt purtătorii în lanț ai reacț iei; ei pot oxida suplimentar lipidele,
producând hidroperoxizi de lipide (LOOH), care, la rândul lor, se descompun într-o
gamă largă de compuși [11 ], inclusiv alcooli, aldehide, formiate de alchil, cetone și
hidrocarburi, inclusiv radicalul alcoxil (L0).
Lipirea
LOOH → LO∙ + HO∙
2 LOOH → LO O ∙ + LO∙ + H2O
Defalcarea hidroperoxizilor lipidici implică adesea cataliză ionică de metal de tranziție,
în reacții similare cu cele care implică peroxid d e hidrogen, obținându -se radicali
peroxil lipidici și alcoxil lipidici.

Terminarea
Reacțiile de terminare implică combinarea radicalilor pentru a forma produse non –
radicale:
LO ∙+ LO ∙
LOO ∙ + LOO ∙
LO ∙ + LOO ∙
Antioxidanții primari, AH, atunci când sunt prezenți în cantități mici, pot întârzia sau
inhiba etapa de inițiere prin reacția cu un radical lipidic sau inhibă etapa de propagare
prin reacția cu ra dicalii peroxil sau alcoxil .
L · + AH → LH + A ·
LOO · + AH → LOOH + A ·
LO · + AH → LOH + A ·
Antioxidanții secundari sau preventivi sunt compuși care întârzie rata de oxidare. Acest
lucru poate fi realizat în mai multe moduri, inclusiv îndepărtarea substratului sau a
sting erii oxigenului singlet [12].
I.3. Metode de evaluare totală a capacității antioxidante

Diferite metode analitice de evaluare [13] a antioxidantului exista . Diferitele
metode analitice de evaluare a capacității antioxidante se încadrează în categorii
distincte:
Tabelul 1 . Metode de evaluare totală a capacității antioxidante
Capacitate antioxidant ă Principiul metodei Determinarea produsului
final
Spectometru
DPPD Reacți a antioxidantă cu un
radical organic Colorimetrie
ABTS Reacție antioxidantă cu un Colorimetrie

radical cationic organic
FRAP Reacție antioxidantă cu un
complex Fe (III) Colorimetrie
PFRAP Reducerea fericiananului
de potasiu prin antioxidanți
și reacția ulterioară a
ferocianurii de potasiu cu
Fe3 + Colorimetrie
CUPRAC Reducerea Cu (II) la Cu (I)
prin antioxidanți Colorimetrie
ORAC Reacția antioxidantă cu
radicali peroxil, indusă de
AAPH (2,2'-azobis -2-
amidino -propan)
Pierderea fluorescenței
fluorescein ei
HORAC Capacitatea antioxidantă de
a stinge radicalii OH
generați de un sistem
asemănător cu Fenton bazat
pe Co (II)
Pierderea fluorescenței
fluoresceinei
TRAP Capacitatea antioxidantă de
a elimina radica lii derivați
de luminol, genera ți de
descompune rea AAPH
Chemizare la stingerea
chimiluminescenței
Fluorimetru Emisia de lumină de către o
substanță care a absorbit
lumina sau altă radiație
electromagnetică cu o
lungime de undă diferită
Înregistrarea spectrelor de
excitație / emisie de
fluorescență
Voltametrie ciclica Potențialul unui electrod de Măsurarea intensității

lucru variază liniar de la o
valoare inițială la o valoare
finală și înapoi, iar
intensitatea curentului
respectiv este înregistrată
vârfului catodic / anodic
Amperometrie Potențialu l electrodului de
lucru este stabilit la o
valoare fixă față de un
electrod de referință
Măsurarea intensității
curentului generat de
oxidarea / reducerea unui
analit electroactiv
Biamperometrie Reacția analitului
(antioxidant) cu forma
oxidată indicâ nd un cuplu
redox
Măsurarea curentului care
curge între doi electrozi de
lucru identici, la o mică
diferență de potențial și
imersat într -o soluție care
conține proba analizată și
un cuplu redox reversibil
Cromatografie
Cromatografie pe gaz Separarea c ompușilor într –
un amestec se bazează pe
repartiția între o fază
staționară lichidă și o fază
mobilă de gaz
Ionizarea cu flacără sau
detectarea conductivității
termice
Cromatografie lichidă de
înaltă performanță Separarea compușilor într –
un amestec se baz ează pe
repartiția între o fază
staționară solidă și o fază
mobilă lichidă cu polarități
diferite, la debit și presiune
ridicată ale fazei mobile
Detectarea UV -VIS (de
exemplu, diodă),
fluorescență, spectrometrie
de masă sau detecție
electrochimică

I.4. Tehnici spectrometrice

Tehnicile spectrometrice se bazează pe reacția unui radical sau a unui cation
radical, cu o moleculă antioxidantă capabilă să doneze un atom de hidrogen.
A. Metoda DPPH: DPPH (2,2-difenil -1picrilhidrazil) este un radical liber st abil,
datorită delocalizării electronului de rezervă pe întreaga moleculă. Astfel, DPPH nu
dimerizează, așa cum se întâmplă cu majoritatea radicalilor liberi. Delocalizarea pe
molecula DPPH determ ină apariția unei culori violet , cu o bandă de absorbție cu un
maxim de aproximativ 520 nm.
Când DPPH • reacționează cu un donator de hidrogen, se formează forma
moleculară redusă (DPPH), însoțită de dispariția culorii violete. Prin urmare,
diminuarea absorbției depinde liniar de concentrația antioxidantă. Trolox este utilizat ca
antioxidant standard .
Metoda spectrofotometrică cu DPPH a fost aplicată determinării capacității
antioxidant e în sucurile de fructe și în fructe (guava) . Curba standard a fost liniară înt re
Trolox între 25 și 800mM . Rezultatele sunt exp rimate în echivalente μM Trolox/ g masă
proaspătă. Activitatea antioxidantă a extractelor de metanol din fructul de guava,
determinată prin metoda DPPH, este cuprinsă între 16,2 ± 1,0 și 32,0 ± 5,1 pM TE/masă
proaspătă [14].

B. Metoda ABTS: radical ul cationi c ABTS (ABTS • +) care absoarbe la 743 nm (dând o
culoare verde albastru ie) se formează prin pierderea unui electron de către atomul de
azot al ABTS (2,2' -azino -bis (acid 3 -etilbenztiazol -6-sulfonic)). În prezența troloxului
(sau a altui antioxidant care dă hidroge n), atomul de azot stinge atomul de hidrogen,
rezult ând decolorarea soluției.
ABTS poate fi oxidat p rin persulfat de potasiu sau dioxid de mangan , dând
naștere radicalului cationic ABTS (ABTS • +) a cărui absorbție a diminuării la 743 nm a
fost monitorizat ă în prezența Trolox , ales ca antioxidant standard.
Metoda spectrofotometrică bazată pe diminuarea absorbanței radicalului
cationic ABTS a fost aplicată pentru determinarea conținutului antioxidant în ex tractele
de fructe de guava , extracte de f ructe și legume, băuturi nealcoolice, băuturi alcoolice,
ceai și cafea. Standardul curb ei a fost liniar ă între 25 și 600 μM Trolox . Valorile

capacității antioxidante totale a extractelor de guava au variat între 22,3 ± 0,9 și 37,9 ±
3,4 μM TE/masă proaspăt ă [14].
Activitatea antioxidantă a băuturilor nonalcoolice , determinată prin metoda
ABTS, est e cuprinsă între 0,09 mM Trolox/ litru pentru Cola și 3,330 mM Trolox/ litru
pentru sucul de grapefruit .

C. Metoda FRAP (puterea antioxidantă reducătoare feric ă):
Metoda FRAP (puterea antioxidantă reducătoare ferică) se bazează pe
reducerea prin antioxidanți a ionului feric complex TP TZ (2,4,6 -tri (2 -piridil) 1,3, 5-
triazină). Legarea Fe2 + la ligand creează o culoare albastră foarte intensă. Absorbanța
poate fi măs urată pentru a testa cantitatea de fier redusă și poate fi corelată cu canti tatea
de antioxidanți. Trolox sau acidul ascorbic au fost utilizate ca referințe.
Activitatea antioxidantă totală a nectarinelor alb e și galbene [15] a fost
evaluată prin metoda FR AP, rezultatele fiind exprimate drept Capacitate Antioxidantă
Echivalentă cu Acidul Ascorbic, (AEAC). Aceste valori a u variat între 14,4 și 104,5
mg/100 de fructe.

D. Testul ORAC (capacitatea de absorbție a radicalilor de oxigen) [14,16] : metoda
măsoară activitatea anti oxidantă împotriva radicalului peroxil indus de dihidroclorura de
2,2'-azobis (2 -amidino -propan) (AAPH) la 37 ° C.
Fluoresceina a fost utilizată ca sondă fluorescentă. Pierderea fluorescenței a
fost un indicator al gradului de descompunere, din reacția cu radicalul peroxil.
Activitatea antioxidantă a extractelor de metanol din fructul de guava a fost determinată
prin metoda ORAC. Curba standard a fost liniară între 0 și 50mM Trolox. Rezultatele
obținute au variat între 18,2 ± 2,3 și 25,5 ± 1,6 μM TE/ masa proaspătă [14].

E. Testul HORAC (capacitatea de evitare a radicalilor de hidroxil) [17]: această
tehnică se bazează pe măsurarea activității de chelatare a metalului antioxidanților, în
condițiile reacțiilor de tip Fenton. Metoda utilizează un complex Co (II) și, prin urmare,
evaluează capacitatea de protecție împotriva formării radicalului hidroxil. Fluoresceina
este incubată cu proba de analizat, apoi se adaugă amestecul Fenton (generatoare de
radicali hidroxil). Fluorescența inițială a fos t măsurată, după care citirile au fost luate la

fiecare minut după agitare. Soluțiile de acid gal ic au fost utilizate pentru construirea
curbei standard.
F. Parametrul TRAP (parametrul total de peroxid de captare a antioxidanților): a
fost exploatată chemi luminescența cu luminol (CL) [18] pentru a monitoriza reacțiile
care implică radicalul peroxil. Semnalul CL este condus de producția de radicali derivați
de luminol, care rezultă din descompunerea termică a AAPH. Valoarea TRAP a fost
determinată din durata perioadei în care proba a stins semnalul de chemiluminiscență,
datorită prezenței antioxidanților.
G. Testul de inhibare a peroxidării lipidelor:
Metoda de testare a inhibării peroxidării lipidice utilizează un sistem
asemănător cu Fenton (Co (II) + H 2O2), pentru a induce peroxidarea lipidelor ( de
exemplu, acidul gras) . Acidul α-linolenic a fost aruncat ca un substrat model. A fost
amestecat cu proba analizată, precum și cu amestecul de tip Fenton, pentru a induce
peroxidarea lipidică. După terminarea inc ubării, s -a măsurat concentrația substanțelor
reactive cu acid tiobarbituric (TBARS), ca indice de peroxidare a lipidelor. Peroxidarea
lipidică a fost exprimată în nmoli de TBARS per 1 ml de ame stec de acid α-
linolenic/ probă analizată.
H. Metoda PFRAP (pu terea de reducere a fericianului de potasiu) [19]:
O creștere a absorbției poate fi corelată cu capacitate a de reducere a
antioxidanților/ extractelor antioxidante. Compușii cu capacitate antioxidantă
reacționează cu fericianura de potasiu, pentru a forma ferocianură de potasiu. Acesta din
urmă reacționează cu triclorura ferică, obținându -se ferocianură ferică, complex
albastru, cu o absorbție maximă la 700 nm.
I. Testul CUPRAC (puterea antioxidantă reducând cuprul) [19]: antioxidanții sau
extractele stand ard sunt amestecate cu CuSO 4 și neocuproină. După 30 min, absorbția a
fost măsurată la 450 nm. În analiză, Cu (II) este redus la Cu (I) prin acțiunea
electronizării antioxidanților. Rezultatele sunt exprimate în miligrame de Trolox pe litru
de extract.
J. Fluorimetrie: fluorescența este emisia de lumină de către o substanță care a absorbit
lumină sau altă radiație electromagnetică cu o lungime de undă diferită. În majoritatea

cazurilor, lumina emisă are o lungime de undă mai lungă și, prin urmare, o energie mai
mică dec ât radiația absorbită. Emisia de fluorescență apare atunci când un electron
orbital al unei molecule se relaxează la starea sa de bază, emite un foton de lumină după
ce este excitat la o stare cuantică mai mare de un tip de energie. Analiza fl uorescenței a
fost utilizată pentru determinarea conținutului antioxidant .
Spectroscopia fluorescentă a fost aplicată pentru determinarea compușil or
fenolici în uleiuri [20]. Se propune o metodă bazată pe fluorescență pentru a cuantifica
concentrația a ntioxidantă a butilhidroxiananis olului (BHA) și a terț -butilhidrochinonei
(TBHQ) în biodieselul produs de uleiurile de floarea soare lui și de soia. Spectrele
fluorescenței și excitației soluțiilor au fost înregistrate la temperatura camerei utilizând
un spect rofluorimetru. Spectrele de emisie s -au obținut sub excitație la aproximativ 310
nm și s -a evaluat fluorescența în intervalul de 320 -800 nm. Probele de biodiesel fără
BHA și TBHQ au prezentat o bandă de fluorescență de aproximativ 420 nm, care poate
fi atr ibuită tocoferolilor, inerenți uleiurilor vegetale utilizate în producția de
biomotorină. Adăugarea de BHA și/ sau TBHQ este responsabilă pentru apa riția unei
benzi de fluorescență de aproximativ 330 nm. S -a verificat că intensitatea fluorescenței
în jur de 330 nm crește liniar ca funcție a concentrației antioxidante cu un coeficient de
corelație de aproximativ 1, indiferent de sursa de ulei și de antioxidanții.
Metodele fluorometrice de determinare a acidului ascorbic se bazează pe
reacția acidului dehidro ascorbic cu o -fenilendiamina . Această tehnică necesită un
control strict al pH -ului, deoarece intensitatea fluorescenței depinde puternic de
valoarea pH -ului. A fost dezvolta tă o metodă de fluorescență , pentru a examina modul
în care organizarea laterală a sterolului membranar afectează potența antioxidanților.
Această informație a fost utilizată pentru a evalua posibilele efecte adverse ale
antioxidanților lipidelor, care a fost raportat în studiile clinice recente. În prezența unui
antioxidant, timpul de întârziere produs în timpul oxidării sterol induse de radicalii
liberi în veziculele lipidice reflectă potența antioxidantului. Datele obținute sugerează
că, în timp ce palmitatul de ascorbil este un antioxidant mai eficient decât omologul său
solubil în a pă, așa cum este evaluat prin timpul de întârziere, acesta poate perturba cu
ușurință organizarea laterală a sterolului prin inserarea în straturi bilaterale cu
membrană, ceea ce ar putea avea efecte dăunătoare asupra celulelor. Un alt test de
fluorescență a măsurat rata și amploarea oxidării sterolului în stra turile bilaterale
lipidice. Dehi droergosterolul (DHE), un analog de colesterol fluorescent, este folosit ca
o probă și, în același timp, ca o componentă membranară.

Analiza poate fi de asemenea reali zată pe straturi bilaterale care conțin un
amestec de steroli incluzând DHE și steroli nefluorescenți, cum ar fi colesterolul și
ergosterolul. Intensi tatea fluorescenței DHE scade la oxidare, astfel încât viteza și
extinderea oxidării sterol induse de radi calii liberi sau enzime pot fi măsurate ca o
funcție a temperaturii și a compoziției membranei. În concordanță cu modelul de
distribuție regulată a sterolului, se constată că atât oxidarea sterolului indusă de radicalii
liberi cât și de enzime variază în f uncție de conținutul de membrane sterol într-o
manier ă alternativă bine definită [21].

I.5. Tehnici electrochimice

Tehnicile electrochimice au fost aplicate de asemenea pentru determinarea
conținutului antioxidant și a capacității antioxidante. Volta metria ciclică și
biam perometria sunt cele mai utilizate.
I.5.1. Voltametria ciclică:
Voltammetria ciclică este un tip de măsurare electrochimică potențio -dinam ică.
În experimentele de voltam etrie ciclică, potențialul electrodului de lucru este rampat
liniar față de timp. Î n voltam etria ciclică, potențialul unui electrod de lucru este scanat
liniar de la o valoare inițială la o valoare finală și înapoi, în timp ce se înregistrează
intensitatea curentului respectiv.
Când se atinge valoarea unui potențial stabi lit, rampa potențială a electrodului
de lucru este inversată. Această inversare se poate întâmpla de mai multe ori în timpul
unui singur experiment. Curentul de la electrodul de lucru este reprezentat grafic față de
tensiunea aplicată pentru a da voltamogr ama ciclică.
Parametrii importanți proveniți de la o voltamogramă ciclică sunt in tensitățile
vârfurilor catodice și anodice ( Ia, Ic ), potențialul de oxidare anodică (Ea) și potențialul
de oxidare catodică (Ec). Toate aceste valori pot fi obținute ușor din voltamogramă. În
cazul unui sistem reversibil, valorile intensităților vârfurilor catodice și anodice sunt
egale. Pentru sistemul ireversibil, doar o prezență a unui vârf este v izibilă pe
voltamogramă. Voltam etria ciclică (CV), dovedită a fi o metodologie convenabilă, a
fost validată pentru cuantificarea capacității antioxidante a masei moleculare scăzute a
plasmei sanguine, a omogenizărilor ț esuturilor și a extractelor de plante. Analiza

urmăririi CV dă valorile (i) potențialul ui biologic de oxidare, E și E1/2, care se referă la
natura moleculei (lor) specifice; (ii) intensitatea (Ia) a curentului anodic; și ( iii) zona
undei anodice (S) . Sensibilitatea metodei, dată de panta graficului de calibrare față de
vitamina C, a fost de 15,175μA/ mM acid ascorbic [22]. Capacitatea antioxidantă a
extractelor vegetale uscate [23] (exprimată în mg de echivalenți ai acidului ascorbic ) a
fost determinată prin volta metrie ciclică efectuată la un electrod de lucru cu carbon
sticlos. Ceaiul verde, ceaiul negru, rozmarinul și cafeaua au fost selectate și analizate
pentru a testa capacitatea totală antioxidantă a respectivelor extracte uscate. Pentru cele
trei extracte obținute din fiecare matrice, capacitatea antioxidantă a fost determinată prin
măsurarea ariei anodice a volta mogramei ciclice.
Dintre substanțele testate, cele în care extractele de metanol uscate prezintă cea
mai mare capacitate antioxidantă totală sunt: Ceai verde > Ceai negru > Rozmarin >
Cafea arabică > Ceai de plante > Acerola > Ceai de calitate > Acai. P e de altă parte, din
substanțele testate, cele pentru care extractele apoase uscate prezintă cea mai mare
capacitate antioxidantă totală sunt: Ceai verde > Ceai negru > Cafea arab ică > Ceai de
plante > Rozmarin > Acerola > Ceai de calitate > Acai. Aceast a implică faptul că acești
doi solvenți nu au întotdeauna aceeași capacitate extractivă pentru toate substanțele
antioxidante conținute în diferitele probe vegetale. Rezultatele volta metriei ciclice ale
determinării capacității antioxidante în produsele di n hrișcă au arătat o bună corelare cu
datele obți nute prin spectrofotometrie .
Voltamogramele ciclice ale extractelor de hrișcă analizate au fost utile pentru
evaluarea capacității antioxidante. Încărcarea totală sub forma undelor anodice a fost
corelată cu datele obținute prin metoda spectrofotome trică cu ABTS și DPPH .
Schimbările în capacitatea antioxidantă a hrișca i și a produselor sale au urmat
modificările compoziției flavonoide.

I.5.2. Metoda amperometrică:
Metoda amperometrică implică măsurarea int ensității curentului care curge
între un electrod de lucru și un electrod de referință, la o valoare fixă (potențială)
aplicată. Cu rentul este generat de oxidarea/ reducerea unui analit electroactiv. Valoarea
potențialului este menținută la o valoare stab ilită față de un electrod de referință .
Determinarea amperometrică a activității antioxidante s-a bazat pe reducerea 2,2 –
difenil-1-picrilhidrazilului (DPPH ) la electrodul de carbon sticlos. Toate experimentele

au fost efectuate într -o celulă electroch imică cu trei electrozi la 140 mV față de Hg 2Cl2 |
3M KCI utilizând soluție etanolică (40%) și 0,033M KCI în tampon fosfat 0,033 M, pH
= 7,4. Intervalul liniar obținut pentru Trolox în soluție de apă etanolică de 100 ppm
DPPH a fost de până la 30 pM, cu o limită de detectare de 0,05 pM. Metoda dezvoltată
a fost aplicată pentru evaluarea activității antioxidante a unor compuși antioxidanți puri,
solubili în apă sau etanol, și a mai multor probe de ceai, vin și alte băuturi. Corelația
bună a rezultatelor (R2 = 0.9993), exprimată ca echivalent Trolox, a fost obținută între
metoda amperometrică propusă și me toda spectroscopică clasică [24].
I.5.3. Metoda biamperometrică:
Metoda biamerometrică se bazează pe măsurarea curentului care curge între
doi electrozi de lucru identici polarizați la o diferență de potențial mică și imersați într -o
soluție care conține un cuplu redox reversibil. Măsurarea biamperometrică indirectă se
bazează pe reacția analitului cu cuplul redox indicând selectivitatea acestuia în funcție
de specificitatea reacției care implică forma oxidată sau redusă a perechii redox și a
analitului. Fe3 + / Fe2 +, I2 / I-, Fe (CN) 63- / Fe (CN) 64- sunt cupluri redox utilizate în
mod obișnuit în măsurătorile biam perometrice [25].
O pereche redox comună a leasă în studii biam perometrice a fost DPPH .
Antioxidanții reacționează cu DPPH (formă radicală) care generează DPPH (formă
redusă), intensitatea curentului rezultat fiind proporțională cu concentrația reziduală de
DPPH , după reacția sa cu analitul (antiox idant) . Au fost utilizați doi electrozi de carbon
Pt [26] sau de carbon sticlos , unde reducerea radicalului DPPH și oxidarea formei
reduse (DPPH) are loc după cum urmează:

Electrod 1: DPPH• + e- → DPPH
Electrod 2: DPPH → DPPH• + e-
Reducerea DPPH • la el ectrodul 1 dă naștere unui curent catodic, în timp ce
oxidarea DPPH la electrodul 2 generează un curent anodic. În biam perom etrie,
parametrul controlat reprezint ă diferența de potențial dintre cei doi electrozi de lucru
identici. Valorile potențiale ale ce lor doi electrozi nu sunt controlate în raport cu un
electrod de referință. Răspunsul detectorului biam perometric este liniar în raport cu
elementul constitutiv al cuplului redox care este prezent în concentrație mai mică.
Condițiile de muncă au fost alese pentru o concentrație DPPH • (formă oxidată) mai

mică decât concentrația DPPH. Fiecare adăugare de antioxidant într -o soluție care
conține cuplul redox DPPH • / DPPH scade concentrația formei (radicalului) oxidat și
mărește concentrația formei reduse, gen erând astfel un curent proporțional cu
concentrația de antioxidant. În cazul metodei propuse, curentul catodic este limitat de
concentrația mai scăzută de DPPH • (formă radicală) în amestecul indicat.
Metoda DPPH • / DPPH a fost aplicată la determinarea c apacității totale antioxi dante în
sucurile de fructe, ceai, vin și cafea . Sensibili tatea metodei a fost de 20,1 nA/ μM de
Trolox, în timp ce limita de detecție realizată de dispozitivul de măsurare utilizat a fost
de 0,05 μM .
Un alt cuplu redox folosit în capacitatea antioxidanta biam perometrica ABTS +
∙/ABTS a fost radicalul cationic ABTS obținut enzimatic de către peroxidază într -un
reactor tubular cu flux. Performanța bioreactorului a fost testată la concentrații diferite
de enzime imobilizate, ABTS și p eroxid de hidrogen. Microe lectrozi cu matrice
interdigitat ă au fost utilizați ca senzori electrochimici pentru determinarea
biamperometrică. Rezultatele activității antioxidante au fost determinate folosind Trolox
ca standard. Detectorul electrod interdigi tat aplicat (IDE) a avut o bună sensibilitate de
0,3 nA / μM Trolox și a oferit o gamă liniară între 20 și 500 μM Trolox. S -au analizat
probe reale cum ar f i sucurile, ceaiul și vinul .
Radicalul de cation ABTS a fost de asemenea produs bienzimatic, prin
utilizarea glucozoxidazei și peroxidazei. Linearitatea detectorului IDE a fost testată în
intervalul 20μM -2000μM și s -a obținut o bună sensibilitate de 0,165 nA /μM pentru
soluțiile Trolox . Electrozii de aur interdigiți au fost utilizați pentru determinarea
biamp erometrică a capacității antioxidante a băuturilor al coolice (vin și spirtoase) [27].

I.6. Metoda biosenzorilor

Oxidoreductazele sunt cel mai des utilizate în aplicațiile biosenzorilor datorită
proprietăților lor de transfer de electroni în timpul ca talizei. Aceste enzime oferă
avantajele de a fi stabile și, în anumite situații, nu necesită coenzime sau cofactori.
Aplicațiile potențiale ale biosenzorilor pentru evaluarea stării antioxidante
includ monitorizarea radicalului superoxid (O2 • -), monitor izarea oxidului nitric (NO),
monitorizarea glutationului, monitorizarea acidului uric, a acidului ascorbic sau a
compușilor fenolici .

A fost construit un biosenzor pe bază de ADN de pastă de carbon pentru
evaluarea electrocatalitică a capac ității totale a ntioxidante . Metoda s -a bazat pe
deterior area parțială a stratului ADN ab sorbit pe suprafața electrodului de radicali OH,
generați de reacția Fenton și oxidarea electrochimică ulterioară a bazelor adenine
intacte, pentru a genera un produs de oxidare care a fost capabil să catalizeze oxidarea
NADH. Prezența compușilor antioxidanți a eliminat radicalii hidroxilici, lăsând mai
multe molecule de adenină neoxidate și, prin urmare, creșterea curentului
electrocatalitic al NADH măsurat pr in voltametrie . Utilizare a acidului ascorbi c ca
specie antioxidantă, a facut posibilă detectarea unor cantități de acid ascorbic de 50 nM
în soluție apoasă [28].
Frecvent, polifenolii contribuie in principal la capacitatea antioxidantă a mai
multor plante care le conț in. Au fost elaborate mai mul ți biosenzori amperometrici
pentru detectarea compușilor fenolici, pe baza enzimelor, cum ar fi tirozinaza sau
peroxidaza . Biosenzorii pentru compușii fenolici au fost construiți prin imobilizarea
polifenol ilor oxidazei (PPO) în copolimeri conducători preparati prin electro –
polimerizarea pirolului cu politetrah idrofuran captat cu tiofen [29].
Acesti biosenzori bazați pe enzime permit evaluarea "conținutului total de
fenol". Deoarece tirozinaza acționează asupra grupărilor hidroxil ale compu șilor
fenolici, cantitatea totală de grupări -OH în vinurile roșii a fost obținută prin
determinarea activității prin electrozi enzimatici. Rezultatele sunt raportate în echivalent
de acid galic (GAE) în mg/ l [29]. Pentru determinarea polifenolului în extr actele
vegetale, a fost folosit un biosenzor bazat pe peroxidază de hrean amperometric.
Biosenzorii au fost utilizați pentru determinarea capacității antioxidante în vinuri,
rezultatele fiind în concordanță cu cele obținute prin spectrofotometrie sau în sucurile
de portocale, prin biosenzori bazați pe e lectrozi tipăriți pe ecran . Pentru an aliza
vinurilor roșii comercializate , a fost utilizat u n electrod ionic lichid cu nanotuburi cu
multi -pereți cu tirozinază imobilizată . Intervalele de detectare au fost de 0,01 -0,08 mM
într-o soluție tampon de fosfat.
I.7. Metode cromatografice

Procedurile cromatografice au fost adesea aplicate la separarea și detectarea
antioxidanților și au fost utilizate înainte de evaluarea spectrofotometrică sau
electrochimic ă a ca pacității antioxidante totale .

I.7.1. Cromatografie în fază gazoasă:
Cromatografia de gaz (GC) este un tip comun de cromatografie utilizat pentru
separarea și analizarea compușilor care pot fi vaporizați fără descompunere. Procedeul
de separare a compuș ilor într -un amestec se efectuează între o fază staționară lichidă și
o fază mobilă de gaz. Faza mobilă este, de obicei, un gaz inert, cum ar fi heliul sau un
gaz nereactiv, cum ar fi azotul. Faza staționară este un strat microscopic de lichid sau
polimer pe un suport solid inert. Comp arația timpilor de reținere reprezint ă ceea ce
conferă utilitatea analitică pentru GC . Detectorii cei mai obișnuiți sunt detectorul de
ionizare cu flacără și detectorul de conductivitate termică.
Capacitatea antioxidantă a ul eiului de turmeric (responsabilă de capacitatea sa
antimutagenică) a fost de asemenea determinată prin metode cromatografice . Uleiul de
turmeric și fracțiunile sale au fost analizate prin cromatografie în fază gazoasă cu
detector cu ionizare în flacără și cromatografie în fază gazoasă cuplată cu spectrometrie
de masă. Uleiul de turmeric și fracțiunile acestuia au fost apoi testate pentru activitate
antioxidantă folosind sistemul model caroten -linoleat și metoda fosfomolibdenului.
Capacitatea antioxidantă ca ntitativă a uleiului de turmeric și a fracțiilor sale au fost
măsurate spectrofotometric prin metoda fosfomolibdenului, care se bazează pe
reducerea Mo (VI) la Mo (V) de către analitul de probă și formare a ulterioară a
fosfatului verde/ Mo (V ) complex cu o absorbție maximă la 695 nm. Metoda folosind
modelul caroten -linoleat [30] s-a bazat pe măsurarea continuă a densității optice, până la
dispariția culorii β -carotenului. S -a utilizat butilhidroxianisolul (BHA) pentru martor.

I.7.2. HPLC (cromatografie lic hidă de înaltă performanță):
HPLC (cromatografie lichidă de înaltă performanță) utilizează de obicei
diferite tipuri de faze staționare, o pompă care deplasează faza mobilă și analit prin
coloană și un detector care asigură un timp de retenție caracterist ic pentru analit.
Detectorul (de obicei, un detector de diode cu matrice) poate furniza, de asemenea,
informații suplimentare referitoare la analit, (ad ică date spectroscopice UV/VIS pentru
analit dacă sunt echipate astfel).
O pompă asigură presiunea mai ridicată necesară pentru a deplasa faza mobilă
și pentru a analiza coloana . Densitatea crescută rezultă din dimensiunile mai mici ale
particulelor. Aceasta permite o mai bună separare pe coloane a unei lungimi mai scurte
și asigur ă o viteză mai mare. HPLC cu faz ă normal ă utilizează o fază staționară polară

și o fază mobilă nepolară, neapoasă și funcționează eficient pentru separarea analitilor
ușor solubili în solvenți nepolari. Faza HPLC cu fază inversă are o fază staționară
nepolară și o fază mobilă apoa să, moderată polară. O fază staționară obișnuită este
siliciul care a fost tratat cu RMe 2SiCI, în care R este o grupare alchil cu catenă liniară
cum ar fi C 18H37 sau C 8H17. Cu aceste faze staționare, timpul de retenție este mai lung
pentru moleculele care sunt mai puțin polare, în timp ce moleculele polare eluează mai
ușor.
Activitatea antioxidantă folosind un sistem HPLC cu detecție antioxidantă on –
line postcoloana , bazată pe activitatea de captare a radicalului acidului 2,2' -azinobis -3-
etilbenzotiazolină -6-sulfonic. Metoda a fost aplicată pentru determinarea conținutului de
antioxidanți din cafea . După separarea probelor de cafea pe coloana HPLC, eluatul a
fost direcționat către un detector PDA (fotodiodă) și apoi amestecat cu o soluție
stabilizată a radic alului cationic ABTS și soluția a fost direcționată către un detector
care monitorizează absorbanța la 720 nm. Soluția de cation ABTS are o culoare albastră
profundă, iar orice stopare a radicalului are ca rezultat o pierdere de culoare indicată de
un vârf negativ pe traseul HPLC. Au fost adăugate contribuțiile antioxidante ale
varfurilor HPLC ind ividuale pentru a da activita ți antioxidante derivate din totalul
HPLC. Capacitatea totală antioxidantă a cafelei verzi determinată cu sistemul HPLC on –
line a fost de 760 ± 2,5 pmol Trolox/l și Trolox/ l 984 ± 25,8 p mol pentru cafeaua
prăjită .
A fost elaborată o metodă HPL C cu detecție fluorescentă pentru determinarea
galatului de propil, a acidului nor dihidroguaiaretic, a butilhidroxianisolului , a terț –
butilhidroch inonei și a galatului de octil în ule iurile comestibile și alimente . Separarea
HPLC a fost efectuată pe o coloană C18 utilizând un amestec de acid acetic 5% –
acetonitril -metanol ca fază mobilă și monitorizat prin utilizarea unui detector de
fluorescență. V alorile de eșantionare au fost identificate prin compararea spectrelor de
fluorescență cu cele ale standardelor antioxidante. Recuperările medii ale antioxidanțil or
fortificați la 100 microgram/ g au fost 72,1 -99,6%. Coeficienții de va riație au fost de 0,7 –
7,2% [31].
Activitatea antioxidantă a ext ractelor din scoarța plantelor adulte și rădăci na
extractelor de răsaduri a fost evaluată prin HPLC cuplat la detecția electrochimică
(HPLC -ED).
Detectorul electrochimic EICD a fost compus dintr -un electrod de lucr u cu
carbon sticl os, un electrod de referință Ag/ AgCl și un electrod Pt. Separarea analiților a

fost efectuată pe o coloană Gemini C18, utilizând amestecul izo cratic și amestecul
acetonitril/ apă conținând acid acetic ca fază mobilă. Potențialul optim al st andardelor a
fost obținut pe o voltamogramă hidrodinamică, pornind de la evaluarea ariilor de vârf
față de potențialul aplicat față de Ag/ AgCl .
Metodele sunt alese ca o funcție a eșantionului și comparația este valabilă
numai pentru aceleași tipuri de eș antioane. Avantajele tehnicilor analitice se pot referi la
complexitatea instrumentelor necesare, la simplitatea procedurii aplicate, la durata
analizei, la relevanța biologică și la performanțele me todei (sensibilitate, precizie, limită
de detecție ).
Determinările bazate pe măsurătorile fotometrice (DPPH, ABTS și FRAP) sunt
simple și rapide și necesită doar un spectrofotometru UV -VIS, ceea ce explică probabil
utilizarea lor pe scară largă în screeningul antioxidant.
Cele mai multe metode pot fi automatiz ate rapid și unele pot fi aplicate in vivo
(de exemplu, testul ABTS). Cu toate acestea, semnalul analitic este uneori dificil de
măsurat și nu ia în considerare toți antioxidanții.
Testul TRAP a fost criticat ca fiind bazat pe un stres oxidativ nefiziologi c
(radicali peroxil solubili în apă), testul FRAP nu măsoară antioxidanții tiolici, cum ar fi
glutationul. Analiza DPPH a fost considerată ca nefiind bazată pe o reacție competitivă,
deoarece DPPH ∙ este atât o probă radicală, cât și un oxidant. Interpreta rea este
complicată atunci când compușii testați au spectre care se suprapun DPPH ∙ la 515nm.
Testul FRAP este caracterizat printr -o cinetică rapidă (4 -6 minute), dar de fapt acest
lucru nu este întotdeauna adevărat. Unele polifenoli i reacționează mai înce t și necesită
timpi de reacție mai mari pentru detectare, de exemplu, 30 de minute. Cuprul prezintă
avantaje față de fier pentru testul antioxidant, deoarece toate clasele de antioxidanți,
inclusiv tiolii, sunt detectați cu puțină interferență de radicalii reactivi, iar cinetica de
reacție a cuprului este mai rapidă decât în cazul fierului. Analiza CUPRAC este
completă în câteva minute pentru acid ul ascorbic, acid uric, acid galic și quercetin, dar
necesită 30 -60 de minute pentru molecule mai complexe. Me toda ORAC se bazează pe
o reacție sensibilă la temperatură. Prin urmare, controlul temperaturii este esențial.
În ceea ce privește complexitatea instrumentelor analitice, metodele
fotometrice sunt cele mai simple, urmate de metode volta metric e și cromatog rafice.
Voltammetria oferă limite scăzute de detectare, chiar și în comparație cu
tehnicile mai costisitoare. Ea necesită puțină pregătire a probelor. Această tehnică ne
oferă avantajul unei analize rapide, precum și al ușurinței și rapidității aplicării metodei

standard de adăugare. Datorită costului scăzut al echipamentului necesar, precum și a
simplităț ii procedurilor angajate, volta metria pare să ofere o alternativă atractivă la
metodele titrimetrice sau instrumentale, în special în controlul calității alimentelor. Nu
necesită echipament complicat, costisitor și personal calificat cum ar fi cromatografia,
nici nu este laborios sau consumator de timp, cum ar fi tehnica instru mentală
menționată anterior [32].

CAPITOLUL II
ANTIOXIDANȚI -COMPARAȚIE A DIFERI TELOR METODE DE
TESTARE A ACTIVITAȚII ANTIOXIDANTE

Studiile recente au demonstrat, in plus , că consumul de vin modifică
proprietățile redox a plasmei sângelui. Proprietățile antioxidante ale compușilor fenolici
au fost studiate pe larg, dar și efect ele pro oxidative ale vinului pe o oxidare cu densitate
scăzută a lipoproteinelor (LDL). Alți cercetători au constatat că polifenolii din vinul alb
au fost mai eficienți decât polifenii vinului roșu în inhibarea oxidării LDL in vitro
[33,35] .
Deși principalii cons tituenți polifenolici ai vinului sunt cunoscuț i, nu a existat o
căutare sistematică a constituenț ilor din vin pe baza activitaț ii antio xidante. Scopul
studiului a fost de a evalua activitatea antioxidant ă din componenta unui Riesling
comercializat drept vi n. Pentru constituenții necunoscuți cu activitate
antioxidantă este încercată elucidarea structurii. O condiție prealabilă pentru acest
studiu a fost disponibilitatea unor sisteme de testare adecvate pentru activitate a
antioxidantă. Aici, diferite metode d e testare pentru antioxidanți sunt evaluați pe baza
răspunsului lor la diferiți antioxidanți și a adecvării lor pentru screening. Metodele
adecvate sunt apoi utilizate pentru măsurarea activității antioxidante în fracțiunile de vin
Riesling obținute după s epararea prin extracție cu solvent și cromatografia ulterioară în
contracurent [34]

Vin Riesling (diluat cu ap ă 1:1)

absorb ție pe Amberlite clatire cu ap ă
XAD -2 deșeuri

eluare cu MeOH

Extract XAD -metanolic

extrac ție metanoli că lichid ă cu dietil eter

Fază apoas ă
Fază organic ă

MLCCC -separare

6 frac ții majore

Figura 1. Pregătirea fracțiunilor de vin pentru determinar ea activitatii lor
antioxidante

II.1. Sistemele de testare

a) Oxidarea LDL : Inhibarea oxidării LDL a fost i nvestigată utilizând metoda
"Frankel ", care măsoară formarea hexanalului, un produs secundar de oxidare al
Iipid elor. Pentru prepararea LDL sângele a fost colectat prin venipunctură în tuburi
EDTA de la voluntari sănătoși și centrifugat la 1500 g și 4 ° C pentru a obține plasma.
LDL -ul plasmatic a fost obținut prin ultracentrifugare cu de nsitate secvențială în
prezența a 0,1 g EDTA. Înainte de oxidare, LDL a fost complet dializat cu soluție salină
(10 mM, pH 7 ,4) des oxigenată (10 mM). Concentrația proteinei LDL a fost determinată
utilizând kitul de analiză pentru proteinele Lowry (Sigma) și LDL a fost diluat la o
concentratie de proteina de 1000 µg x ml-1 cu soluție salină tamponată cu fosfat. Soluția
LDL din nou dizolvată (250µl) a fost plasată în flacoane cu GC -capsulă conținând 10%
din soluția antioxidantă fie în apă, fie în DMSO. După ce s-a adaugat 5 µl de soluție la
3,88 mM (15,7 mg, 25 ml-1) de sulfat de cupru, flacoanele au fost sigilate, amesteca te și
incubate timp de exact 2 ore înt r-o baie de apă a gitată la 37 ° C. După incubare, s -a
determinat hexanul pr in cromatografie statică de gaz . Inhibarea relativă a oxidării LDL
obținută fie prin compus i de testat fie prin fracțiune de vin , a fost calculată după cum
urmează:
% Inhibarea = C-S/C x100
unde C este hexanul format în experimentul de control și S este hexanul format cu proba
[36].
b) Măsurarea statusului antioxidant total (TAS):
Statusul antioxidant total a fost determinat utilizând un kit de testare cumpărat de la
Randox Laboratories (lrlanda ). Incubarea cromogenului 2,2' -azobis
(etilbenzotiazolinsulfonat) (ABTS) cu metmioglobina si peroxidul de hidrogen produce
cationul radical ABTS +, care este de un verde relativ stabil si poate fi masurat la 600
nm. Antioxid antii unei probe adaugate inhib ă reacția și determină o suprimare a
producției de culoare într -o proporție proporțională cu capacitatea antioxidantă a probei.
Testul este calibrat folosind acid 6 -hidroxi -2,5,7,8 -tetrametilcroman -2-carboxilic
(Trolox) și rezultatele sunt expr imată în unită ți de status antioxidant total (TAS), unde o
unitate este echivalentă cu suprimarea culorii de 1 mM Trolox. Solutiile din compușii
de referință au fost inițial diluați la o concentrație de 1 mM. Pentru fracțiunile de vin,

conținutul total de fenol a fost d eterm inat în echivalenti de acid gal ic (GAE) prin
analiza Folin Ciocalteu și apoi soluțiile au fost diluate la un GAE. Probele care au dat
un rezultat > 2,5 mM TAS unități au fost diluate cu Hp la 0,5 mM și măsurate din nou
[37].
c) Înălbirea β -carotenului : S-a dizolvat β -caroten (5,0 mg) în 50 ml de acetonă. S -a
adăugat o alicotă (4 ml) din aceasta soluție într -un termos conținând 40 mg acid linoleic
și 400 mg Tween 40. Acetona s -a evaporat cu azot. Reziduul se amestecă cu H 20 și
emulsia se diluează cu apă până la un volum total de 100 ml. 100 µl din soluțiile de
probă s-au plasat în semimicrocuve și s-au adăugat 2 ml de emulsie de acid β –
caroten/ acid linoleic. După amestecare, a fost măsurată absorbanța inițială la 500 nm și
cuvele au fost p lasate într -o baie de apă (50 ° C). După 50 min, s -a citit absorbția finală.
Activitatea antioxidantă a fost exprimată in procent % de inhibare față de un control
(care conține apă în loc de soluție antioxidantă) folosind următoarea ecuație:
% inhibiț ie = Δcontrol – Δ eșa ntion/Δcontrol x 100
Δ control = absorbție (t = 0) – absorbție (t = 50);
Δ eșantion = absorbția (t = 0) – absorbția (t = 50).
Concentrația fenolilor totali în fracțiunile de vin a fost determinată prin metoda
Folin -Ciocalteu și exprimată în echivalenți de acid galic (GAE) per g de extract de vin.
Mai mult, răspunsul compușilor model la această metodă a fost investiga tă și calculată
ca mmol GAE pe mmol. 20 ml de soluție standard, soluție de probă sau apă au fost
pipetate în semimicrocuve , urmate de 1,58 ml apă. După amestecare, în fiecare cuvă s -a
adăugat reactivul Folin -Ciocalteu (100 ul) și soluțiile au fost amestecate din nou. După
30 de sec unde și înainte de 8 minute 300µl s -au adăugat dintr -o soluție apoasă de
carbonat de sodiu (20%). Soluțiile au fost lăsate la temperatura camerei timp de 2 ore.
Apoi, absorbția culorii albastru dez voltat ă a fost determinată la 765 nm, fiind
proporțională cu cantitatea de material fenolic (oxidabil) prezent în probă.

II.2. Rezultate si discutii
S-a fost selectat un set de 7 compuși model (figura 2): acidul ascorbic (1) și α-
tocoferolul (2) care sunt cunoscuți antioxidanți nutriționali; tocoferolul derivat din
Trolox solubil in apa (3) a fost inclus împreună cu 4 fenoli de vin cu diferite
caracteristici structurale: acid ul caftaric (4), catec hin (5), quercetin (6) și rutina (7). Cu

metoda de albire a β -carotenului și metoda Pryor, α-tocoferolul și derivatul său Trol ox
au avut cea mai mare activitate antioxidant ă, în timp ce oxidarea LDL in vitro și
măsurarea TAS au releva t compus ii fenolici polari ca fii nd cei mai puternici
antioxidan ți. Aceste diferențe pot fi cauzate de diferitele medii de reacție. Metoda de
oxidare a LDL și măsurarea TAS se efectuează în mediu apos, dar procedura de albire a
β-carotenului, așa cum a fo st folosită în metoda Pryor, utilizează detergenți (Tween 40,
SDS) pentru a dizolva un acid linoleic oxidabil.
Insa, in ultimul caz s -au folosit emulsii.

acid ascorbic α-tocoferol trolox

acid caftaric catechin

quercetin rutin
Figura 2. Structurile compușilor model utilizați în testele de activitate
antioxidantă (1.acid ascorbic, 2.a -tocof erol, 3.trolox, 4.acid caftaric, 5.catechin,
6.quercetin, 7.rutină).
unde reacțiile de oxidare importante au loc, de obicei în interiorul sa u la suprafața
particulelor de l ipide. Antioxidanții solubili în ulei, cum ar fi α-tocoferol, vor fi mai

eficienți î n curățarea radicalilor peroxidici li pidici în interiorul particulelor, în timp ce
compușii fenolici polari și acidul ascorbic solubil i în apă pot reacționa doar în faza
apoasă sau la sup rafața particulelor unde ace știa nu pot întrerupe reacțiile critice d e
oxidare. În schimb, în medii apoase, antioxidanții polari sunt mult mai probabil să
reacționeze cu ionii de metal , importanți în testul de oxidare a LDL și cu ionii de
tungsten și molibden în testul Folin -Ciocalteu. În plus, acești compuși polari sunt mai
predispuși să interacționeze cu radicalii liberi într -un mediu apos [38].
Dacă se compară efic iența antioxidantă a fenolilor , se constată doar diferențe
mici între metodele de screening. Totuși, metoda de albire a β -carotenului și măsurarea
TAS au dat quercetinul ca fiind antioxidant ul cel mai puternic urmat de catechină și
rutină. Metoda LDL a schimbat ordinea rangului pentru eficiența antioxidantă la
catechin ă > rutină > quercetin ă. Acidul caftaric, compusul cu nu mai două grupe fenolic e
hidroxil , a prezentat cea mai scăzută activitate antioxidantă în fiecare sistem de testare.
Metoda lui Pryor s -a dovedit a fi imposibilă pentru determinarea activității antioxidante,
deoarece nu a putut fi observat un punct final de reacție inhibat pentru compușii de
testare fenolici. Metoda Folin -Ciocalteu nu este de fapt un test antioxidant, ci un test
pentru cantitat ea de substanțe oxidabile, exemplu compuși fenolici. Ordinea de răspuns
a compușilor model a fost foarte asemănătoare cu măsurarea TAS, cu quercetinul av ând
cel mai mare răspuns și α-tocoferol cel mai mic. Astfel, în timp ce testul Polin nu este
un test antioxidant, cu siguranță poate fi util pentru detectarea antioxidanților.

Se poate concluziona că evaluarea activității antioxidante este problematică
deoarece – rezultatele sunt puternic dependente de metoda utilizată. Pe cealaltă parte,
dacă scopul este oarecum limitat, atunci cele mai multe teste vor indica compuși activi.
Este întotdeauna dificil să se tragă concluzii din rezultatele obținute prin sist emele de
testare in vitro privind eficiența antioxidantă in vivo. Factorii precum absorbția unui
compus în circulația sanguină, metabolismul și excreția nu pot fi simulate prin teste
simple de oxidare și acești factori adiționali joacă un rol major pentru eficacitatea
antioxidanților în vivo. Pentru studiul cu privire la vinul Riesling, au fost luați în
considerare factori suplimentari, adică practicabilitatea metodei, cerințele instrumentale
și timpul, expertiza și costul necesar pentru o analiză. Activita tea antioxidantă a
vinurilor albe: Pentru a determina în ce măsură sistemele de testare menționate au
rezultate comparabile, a fost tratat un vin comercial Riesling, așa cum se arată în figura

I. În fracțiunile obținute s -a măsurat activitatea antioxidantă . Rezultatele au fost
comparate cu conținutul fenolic total al fracțiunilor care au fost determinate prin
utilizarea reactivului Folin -Ciocalteu [39]. Astfel, pentru investigațiile ulterioare am
folosit metoda de albire a β -carotenului datorită practicabil ității sale simple. De
asemenea, este evident că eficiența antioxidantă este corelată cu cantitatea de GAE
obținută prin metoda Folin. Acest lucru nu este neașteptat, deoarece răspunsul la
reactivul Folin -Ciocalteu depinde de numărul de grupări hidroxil fe nolice sau de alte
elemente potențial oxidabile.

CAPITOLUL III
POLIFENOLI, SURSE ȘI BIODISPONIBILITATE

III.1. Polifenoli i

Polifenolii sunt cei mai abundenți antioxidanți din dieta noastră și sunt
constituenți generali ai fructelor, legumelor, cerealelor, măslinelor, legumelor uscate,
ciocolatei și băuturilor, cum ar fi ceaiul, cafeaua și vinul. În ciuda distribuției lor,
efectele sănătoase ale polifenolilor din dietă au ajuns în atenția nutriți oniștilor numai în
ultimii ani. Principalul factor responsabil pentru cercetarea întârziată a polifenolilor este
varietatea și complexitatea structurii lor chimice.
Ca antioxidanți, polifenolii pot proteja constituenții celulei împotriva daunelor
oxidative și, prin urmare, pot limita riscul diferitelor boli degenerat ive asociate stresului
oxidativ. Studiile experimentale susțin, de fapt, un rol important al polifenolilor în
prevenirea bolilor cardiovasculare, a cancerului, a osteoporozei, a diabetului zaharat și a
bolilor neurodegenerative . În special, s -a demonstrat că, consumul de polifenoli
limitează dezvoltarea leziunilor ateromatoase, inhibând oxidarea lipoprotei nelor cu
densitate scăzută , fiind considerat un mecanism -cheie în leziunile endote liale care apar
în ateroscleroz ă.
Cu toate acestea, constatările aparut e sugerează o varietate de potențiale
mecanisme de acțiune ale polifenolilor în prevenirea bolilor, care pot fi independente de
activitățile lor antioxidante convenționale. Mai mult, efectele prooxidante ale
polifenolilor sunt descrise, c ă au efecte opuse asupra proceselor fiziologice ale celulelor
de bază: dacă, ca antioxidanți, îmbunătățesc supraviețuirea celulelor, ca prooxidanți pot
induce apoptoz ă și blocheze proliferarea celulelor [40].
Pe de altă parte, acumularea de dovezi indic ă faptul că polifeno lii pot exercita
mai multe alte efecte biologice specifice cum ar fi inhibarea sau reducerea diferitelor
enzime, printre c are telomeraza , ciclooxigenaza, lipoxi genaza cu căi de transducție a
semnalului ș i receptorilor celulari . Mai mult, polifenolii pot af ecta căil e dependente de
caspază, reglarea ciclului celular și funcțiile tromboc itelor . În principal, datorită acestor
proprietăți, ei exercită efectele lor de protecție și primesc din ce în ce mai multă atenție
ca potențiali agenți terapeutici împotriva m ai multor bo li degenerative cronice .

O mare parte din dovezile privind efectele protectoare ale polifenolilor sunt
derivate din experimentele efectuate in vitro sau pe modele animale și, în plus, prin
utilizarea concentrațiilor mult mai mari decât cele c onținute în mod obișnuit în dieta
umană. Cu toate acestea, numărul studiilor la om care investighează efectele protectoare
ale polifenolilor a crescut rapid în ultimul deceniu.
Pentru a stabili dovezi concludente privind eficacitatea polifenolilor în
prevenirea bolilor și îmbunătățirea sănătății umane, este esențial să se determine natura
și distribuția acestor compuși în alimentația noastră și să se identifice mai bine care din
sutele de polifenoli existenți po t furniza cele mai bune efecte. Mai mult, est e esențial să
înțelegem factorii implicați în eliberarea polifenolului din alimentele în care sunt
conținute, gradul de absorbție și soarta lor în organism, într -un cuvânt
"biodisponibilitatea", termen folosit inițial în farmacologie pentru a defini concep tul de
"rată și măsura în care un medicament ajunge la locul său de acțiune" [41].
Este de remarcat faptul că biodisponibilitatea pare să difere foarte mult printre
diferiți polifenoli, iar cele mai abundente alimente care conțin polifenoli din dieta
noastră nu sunt neapărat cele care au cel mai bun profil de biodisponibilitate .
Cunoașt erea biodisponibilității diferi ților polifenoli din dietă ne ajuta să -i
identificăm pe cei care ar putea să aibă cel mai probabil efecte sănătoase de protecție și
vor permi te o evaluare mai corectă a aportului real de polifenoli.

III.2. Clasificarea poli fenolilor si distribuția acestor a in alimente

Polifenolii sunt constituenți obișnuiți ai alimentelor de origine vegetală; ei
cuprind o mare varietate de molecule care au o structură de polifenol (adică câteva
grupări hidroxil pe inele aromatice), dar și molecule cu un inel fenolic, cum ar fi acizii
fenolici și alcoolii fenolici. Polifenolii sunt împărțiți în mai multe clase în funcție de
numărul de inele de fenol pe care le conțin și de elementele structurale care leagă aceste
inele unul de altul. Principalele grupe de polifenoli sunt: flavonoide, acizi fenolici,
alcooli fenolici , stilben și lignani (figura 3).

1.Flavonoide
Flavonoli Flavone Flavanone

Quercetin ă Apigenin ă Naringenin ă
Izoflavone Antocianine Catechine

Daidzein ă Cianidin ă

2.Acizi fenolici

Acid cafeic Acid galic

3.Alcooli fenolici

Tirozol Hidroxitirozol

4.Stilben 5.Lignani

Resveratrol Secoizolaricirezinol

Figura 3. Structura chimică a polifenolilor

III.2.1.Flavonoidele
Flavonoidele au un schelet de carbon comun de propani difenil, două inele
benzenice (inelul A și B) unite printr -un lanț l iniar cu trei atomi de carbon. L anțul
central cu trei atomi de carbon poate f orma un inel piran închis (inelul C ) cu unul din
inelele benzenice.
Flavonoidele sunt ele în șele divizate în 6 subclase, în funcție de starea de
oxidare a inelului central de piran: flavonoli, flavone, flavanone, izoflavone,
antocianidine și flavanoli (ca techine și proantocianidine) . Mai mult de 4000 de
flavonoide au fost identificate în plante, iar list a este în continuă creștere. A cest lucru se
datorează apariției numeroaselor modele de substituție în care substituenții primari (ca
grupa hidroxil) pot fi înlocuiți (adică, în plus glicozilați sau acilați), uneori dând
structuri foarte complexe.
Flavonolii au o dublă le gătură între C 2 și C 3, cu o grupare hidr oxil în poziția
C3. Acestea reprezintă cele mai omniprezente flavonoide din alimente, cu quercetin ul
ca compus mai reprezentativ. P rincipalele surse de flav onoli sunt ceapa (până la 1,2
g/kg greutate proaspătă), șuncă, praz, broccoli și afine . Ceaiul și vinul roșu conțin, de
asemenea, până la 45 mg și 3 0 mg flavonoli/L . Este important de observat faptu l că
biosinteza flavonolilor este stimulată de lumină, astfel încât acestea se acumulează în
țesutul exterior și cel al anteturilor de fructe. Este interesant faptul că diferențele de
concentrare pot exista între fructele din același copac și chiar între d iferitele părți ale
unei singure bucăți de fructe, în funcție de e xpunerea la lumina soarelui [42].
Flavo nele au o legătură dublă între C 2 și C 3 și sunt cele mai puțin frecvente
flavonoide. Pătrunjelul și țelina reprezintă singurele surse comestibile de flavone.
Pielea fructelor conține cantităț i mari de flavone polimetoxilate : de exemplu, în pielea
mandarinei, conținutul a cestora este de până la 6,5 g/l de ulei esențial de mandarină.
Flavanonele se caracterizează prin prezența unui lanț saturat cu tre i atomi de
carbon ș i a unui atom de oxigen în C 4. Ele sunt în general glicozilate cu o dizaha ridă în
C7. Flavanonele sunt prezente în concentrații mari numai în citrice, dar se găsesc și în
tomate și în anumite plan te aromatice, cum ar fi menta. P rincipale le aglicone sunt
naringenin a în grapefruit, hesperetin a în portocale și eriodictil în lămâi. Sucuri le
portocalii conțin 470 -761 mg/ l de hesperidină și 20-86 mg/ l de narirutină . Părțile solide
ale citricelor, în special porțiunea albă spongioasă (albedo) și membranele care separă

segmentele, au un conținut foarte ridicat de flavanone; acesta este motivul pentru care
întregul fruct poate conține până la 5 ori mai mult decât un pahar de suc de portocale.
Izoflavonele au similarități structurale cu estrogenii, adică grupări hidroxil în
pozițiile C 7 și C 4, cum ar fi molecula de estradiol. Ele se pot lega de receptorii de
estrogen și sunt astfel clasificați ca fitoestrogeni. Izoflavonele sunt conținute aproape
exclusiv în plante leguminoase. Soia și produsele pre lucrate reprezintă principala sursă
de izoflavone și conțin cele trei molecule principale (genisteină, daidzeină și gliciteină)
care apar ca aglicone sau, mai des, ca forme de glucoză -conjugate. Soia conține între
140 și 1530 mg izoflavone / kg greutate pr oaspătă, iar laptele de soia poate conține între
12 și 130 mg/ l.
Izoflavonele sunt sensibile la căldură și sunt adesea hidrolizate la glicozide în
timpul procesării și depozitării industriale, cum ar fi producția de lapte de soia .
Antocianinele sunt pigme nți solubili în apă, responsabili pentru majoritatea
culorilor roșii, albastre și violet ale fructelor, legumelor, florilor și altor țe suturi sau
produse vegetale . Ele apar în primul rând ca glicozide ale formei respective de aglicon,
numite antocianidine, cu restul de zahăr atașat în princ ipal la poziția 3 de pe inelul C sau
în poziția 5, 7 pe inelul A . Glicozilarea la poziția 3' -, 4'-, 5' pe inelul B, deși foarte rară,
a fost de asemenea observată [43]. Porțiunile de zahăr pot fi, de asemenea, acilate cu o
serie de acizi aromatici sau alifatici; cei mai obișnuiți agenți de acilare sunt acizii
cinamici. Antocianii sunt larg răspândiți în dieta umană: se găsesc în vin roșu, anumite
soiuri de cereale și anumite legume (varză, fasole, ceapă, ridichi), dar sunt cele mai
abundente, în special în fructe. Conținutul de alimente este în general proporțional cu
intensitatea culorii și a tinge valori de până la 2 -4 g/kg în stare proaspătă în coacăze
negre sau mure; conținutul crește pe măsură ce fructul se coace. A ntocianinele se găsesc
în principal în piele, cu excepția unor fructe roșii (cireșe și căpșun i) în care se găsesc și
în pulp ă. Vinul conține până la 350 mg antociani /L, iar acesti antociani sunt
transformati în diverse structuri comple xe, ca vârstele vinului .
Flavanolii conțin un lanț saturat cu trei atomi de carbo n cu o grupare hidroxil
în C 3. Ele există atât în monomer, cât și în forma polimerului (catechine și, respectiv,
proantocianidine). Spre deosebire de alte clase de flavonoide, flavanolii nu sunt
glicozilați în alimente. P rincipalele flavanole reprez entative în fruct sunt catechina și
epicatechina, în timp ce galocatechina, epigalocatechina și galatul epigal ocatechin se
găsesc în special în ceai .

Catechinele se găsesc în multe fruc te, cum ar fi caise le (250 mg/ kg greutate
proaspătă) și cireșele (250 mg/ kg în stare proaspătă). Ceai ul verde (până la 800 mg/ l) și
ciocolata (până la 600 mg/ l) sunt de departe cele mai bogate surse de catechine prezent e
în vin roșu (până la 300 mg/ l).
Proantocianidinele, cunoscute și ca taninuri condensate, sunt dimeri, oligomeri
și polimeri ai catechinelor. Este foarte greu să valorizăm c onținutul de proantocianidină
a alimentelor, deoarece proantocianidinele au o gamă largă de st ructuri și greutăți
moleculare: de exemplu în merele de cidru, gradul de polimer izare variază de la 4 la 11 .
Singurele date disponibile se referă la dimeri și trimeri, care sunt la fel de abundente ca
și catechinele . Proantocianidinele sunt responsabile pentru caracterul astringent al
fructelor (s truguri, mere, fructe de padure etc.) și băuturi (vin, cidru, ceai, bere etc.) și
pentru amăreala ciocolatei [44]. Este important de observat că această astringență se
schimbă în cursul maturării și deseori dispare atunci când fructul ajunge la maturitate.

III.2.2.Acizii fenolici
Acești compuși pot fi împărțiți în două clase: derivații acidului benzoic și
deriv ații acidului cinamic (figura 3 ).
Acizii hidroxibenzoici, cum ar fi acidul galic și acidul protocatechic, se găsesc
în foarte puț ine plante consu mate de oameni; acesta este motivul pentru care acestea nu
sunt considerate în prezent ca având un interes nutrițional deosebit. Conținutul lor de
plante comestibile este, în general, foarte scăzut, cu excepția anumitor fructe roșii, adică
murele care conț in până la 270 mg/kg greutate proaspătă . Ceaiul este o sursă importantă
de acid galic: frunzele de ceai pot conține până la 4,5 g/ kg greut ate proaspătă de acid
galic [45]. Zmeura conține până la 100 mg/ kg greutate în stare proaspătă de acid
protocatechic, în timp ce în uleiul de măsline concentrația acestuia este de apr oximativ
0,22 mg/ kg. Cu toate acestea, ar trebui să se considere că concentrația acidului
protocatechic in vivo ar putea fi mai mare decât cantitatea simplă ingerată, deoarece
acest compus po ate reprezenta metabolitul uman principal al antocianilor, cum ar fi
cianidin -3-glucozidul . De fapt, acesta a fost recuperat recent în serul și fecalele umane
după ingerarea al imentelor bogate în cianură .
Acizii hidroxicinamici constau în principal din ac id cumaric, caf eic și ferulic,
care se găsesc rar în formă liberă. Formele legate sunt derivați glicozilați sau esteri ai
acidului chinic, shikimic sau tartric. C afeina și acidul chinic se combină pentru a forma

acidul clorogenic, care se găsește în multe tipuri de fructe și în concentrații mari în
cafea (o singură ceașcă poate conține până la 350 mg de acid cloroge nic). Afinele conțin
2 g acizi hidroxicinamic /kg greutate proaspătă .
Acidul cafeic este cel mai abundent acid fenolic, reprezentând între 75% și
100% din conținutul total de acizi hidroxicinamici în majoritatea fructelor: kiwi conțin
până la 1 g acid cafeic/ kg greutate proaspătă. Acizii hidroxicinamici sunt prezenți în
toate părțile fructelor, deși cele mai mari concentrații sunt observate în part ea ex terioară
a fructelor coapte. Scade concentrația pe parcursul maturării, dar cantitatea totală crește
pe măsura creșterii mărimii fructelor.
Acidul ferulic este cel mai abundent acid fenolic din cereale: conținutul de
boabe de g râu este de aproximativ 0,8-2 g/kg uscat, ceea ce poate reprezenta până la
90% d in totalul polifenolilor [46].

III.2.3.Alcoolii fenolici
Tirozol (4 -hidroxifeniletanolul) și hidroxitirozolul (3,4 -dihidroxifeniletanol)
sunt princ ipalii alcooli fenolici; ace știa sunt conținuți în principal în ulei de măsline
extra virgin (40, 2 și respectiv 3,8 mg/ kg). T irozolul este prezent și în vinurile roșii și
albe și bere , în timp ce hidroxitroz olul se găsește și în vin roșu și se produce în mod in
vivo d upă ingestia de vin roșu . Concentrația de fenoli to tali în uleiul de măsline
extra virgin are o valoare medie pentru uleiul de măsline comercial de aproximativ 180
mg /kg. Concentrația fenolului din uleiul de măsline depinde de sol , de climă, de zona
de creștere, de latitudine și de maturitate . În ciuda numărului mare de dovezi care leagă
proprietățile in vitro ale fenolilor de ulei ul de măsline cu rezultate po zitive asupra
sănătății , există date limitate privind absorbția și e xcreția acestor compuși [47]. În parte,
acest lucru ar putea fi datora t concentrațiilor scăzute ale unor astfel de constituenți și, în
consecință, dificultății de a detecta concentrațiile scăzute ale acestor compuși în
sistemele biologice.

III.2.4.Stilben
Cantități mici de stilben sunt prezente în dieta umană, iar princ ipalul
reprezenta nt este resveratrolul (figura 3 ), care există atât în formele cis, cât și în
izomerul trans, mai ales în f ormele glicozilate. Este produs de plante ca răspuns la

infecția cu agenți patogeni sau la o var ietate de condiții de stres . Acesta a fost detectat în
mai mult de 70 de specii de plante, inclusiv struguri , fructe de padure și arahide. P ielea
proaspătă de struguri roșii este deosebit de bogată în resveratrol (5 0-100 g/ kg greutate
netă) , ceea ce contribuie la o concentrație relativ ridi cată de resveratrol în vin roșu și suc
de struguri (până la 7 mg aglicone/ L și 15 mg glicoz ide/L în vin roșu). Date extinse
furnizează dovezi pentru efectele anticarci noge ne ale resveratrolului [48].
III.2.5.Lignani
Lignan ii sunt produși prin dimerizarea oxidativă a două u nități de fenilpropan
(figura 3 ); ele sunt în mare parte prezente în natură în formă liberă, în timp ce derivații
lor glicozidici sunt doar o formă minoră. Semințe le de in, reprezintă principala sursă de
aliment ație, conținând până la 3,7 g/kg de secoizolariciresinol usca t. Microflora
intestinală metabolizează lignanii l a enterodiol și enterolactonă. C antitățile mici de
lignani conținute în mod normal în dieta umană nu țin cont de concentrațiile
metabolit ului enterodiol și enterolacton ă măsurate în plasmă și urină. as tfel, există cu
siguranță al ți lignani de origine vegetală, precursori ai enterodiolului și enterolactonei,
care î ncă nu au fost identificați. I nteresul pentru lignani și derivații lor sintetici crește
din cauza utilizărilor po tențiale în chimioterapia cancerului și a difer itelor efecte
farmacologice [49].
III.3. Conținu tul polifenolilor in dieta umană

Așa cum sa menționat mai sus, fructele, ceaiul și vinul roșu constituie
principalele surse de polifenoli. Unii dintre ei s unt sp ecifici unor anumite manc ăruri
(citrice, plante leguminoase, ceai, vin, etc.), în timp ce altele, cum ar fi quercetinul, se
găsesc în toate produsele vegetale (fructe, legume, cereale, plante leguminoase ). În
general, alimentele conțin amestecuri complexe de polifenoli. De exemplu, merele, care
reprezintă un exemplu rar de alimente pentru care sunt disponibile date exacte privind
compoziția polifenolului, conțin e monomeri sau oligomeri flavanol, acid clorogenic și
cantități mici de alți acizi hidroxicinamic i, mai multe glicozide quercetinice, 2 glicozi de
de fluoretină și antociani. P rofilurile polifenolice ale tuturor soiurilor de mere sunt
practic identice, dar concentrațiile pot să difere semnificativ între diferite soiuri (de la
0,1 până la 10 g polifenol i totali /kg greutate proaspă tă ).

Pe de altă parte, pentru mul te produse vegetale, compoziția polifenolului este
mult mai puțin cunoscută. Mai mulți factori, cum ar fi maturitatea la momentul
recoltării, factorii de mediu și depozitarea, pot afecta conțin utul de polifenoli al
plantelor, factori de mediu cum ar fi expunerea la soare, precipitații sau activit ățile
agronomice a culturii, a produ cției de fructe pe arbore etc. joacă un rol cheie în
determinarea conținutului de polifenoli, în special expunerea l a lumină are un efect
considerabil asupra majorității flavonoidelor, gradul de maturitate afectează în mod
diferit concentrațiile și pro porțiile diferi ților polifenoli : în general, concentrațiile de acid
fenolic scad în timpul maturării, în timp ce concent rațiile de antocianină cresc.
Depozitarea poate, de asemenea, să afecteze conținutul de polifenoli care sunt esențiali
oxidându -se, conducând la formarea de substanțe polimerizate mai mult sau mai puțin,
care modifică în special culoarea și caracteristici le organoleptice ale fructelor.
Depozitarea la rece, dimpotrivă, nu a afectat c onținutul de polifenoli [50].
Conținutul de polifenoli din alimente este, de asemenea, influențat de metodele
de preparare culinară; curățarea simplă a fructelor și legumelor p oate reduce în mod
semnificativ conținutul de polifenoli, deoarece aceste substanțe sunt adesea prezente în
concentrații r idicate în părțile exterioare. D e exemplu, ceapa și roșiile își pierd
aproximativ 75% din conținutul inițial de quercetin după fierber e timp de 15 minute,
65% după gătit într -un cuptor cu microunde și 30% după prăjire. Cartofii conțin până la
190 mg acid clorogenic /kg în principal în piele ; astfel încât în timpul gătitului apare o
pierdere importantă și nu s -au găsit acizi fenolici în cartofi prăj iți.

III.4. Biodisponibilitatea polifenolilor

Biodisponibilitatea poate f i definită în moduri diferite. D efiniția general
acceptată a biodisponibilității este proporția nutrientului care este digerat, absorbit și
metabolizat prin căi normale. In consecință, nu este important doar să știm cât de mult
un nutrient este prezent în anumite alimente sau supliment alimentar, dar chiar mai
important este să știm cât de mult din a cesta este biodisponibil .
Metabolismul mai multor polifenoli este acum bi ne înțeles. În general,
agliconele pot fi absorbite din intestinul subțire; totuși cei mai m ulti polifenoli sunt
prezen ți în alimente sub formă de esteri, glicozide sau p olimeri care nu pot fi absorbi ți
în forma nativă. Înainte de absorbție, acești compuși trebuie să fie hidrolizați de

enzimele intestinale sau de microflora colonului. Pe parcursul absorbției, polifenolii
suferă modificări extensive; în fapt, ele sunt conjugate în celulele intestinale și mai
târziu în fica t prin metilare, sulfatare și/ sau glucuronidare . Ca o consecință, formele care
ajung la sânge și țesuturi sunt diferite de cele prezente în alimente și este foarte dificil să
se identifice toți metaboliții și să se evalueze acti vitatea lor biologic ă [51].
Scopul principal al studiilor de bi odisponibilitate este de a determina care sunt
polifenolii mai bine absorbiți, care sunt metaboliții activi și care polifenoli conduc la
formarea metaboliților activi. S tructura chimică a polifenolilor, mai mare decât
concentrația, determină rata și gradul de absorbție și natura metabol itului care circulă în
plasmă. C ei mai frecvenți polifenoli din dieta noastră nu sunt neapărat cei care duc la
cele mai mari concentrații de metaboliți activi în țesuturile țintă; în consecință,
proprietățile biologice ale po lifenolilor diferă mult de la un polifenol la altul.
Dovezile, de și indirecte, despre absorb ția lor prin barier a intestinului su nt date
de cre șterea capacit ății antioxidante a plasmei dup ă consumul de alimen te bogate în
polifenoli . Mai multe dovezi directe privind biodisponibilitatea compușilor fenolici au
fost obținute prin măsurarea concentrației acestora în plasmă și urină după ingerarea fie
a compușilor puri, fie a produselor alimentare cu conținut cuno scut al compușilor de
interes .
Au fost observate variații inter individuale , probabil datorită compoziției
diferite a microflorei colonului care poate afecta în mod diferit metabolismul acestora.
Identificarea și cuantificarea metaboliților reprezintă un domeniu important de
cercetare; de exemplu, metaboli ții activi specifici, cum ar fi ecule, enterolactona și
enterodiolul, sunt pr oduse de microflora colonului. E gal pare să aibă proprietăți
fitoestrogenice chiar mai mari decât cel e ale iz oflavonei originale ; enterolactona și
enterodiolul, produse din seminț e de in, au efecte agoniste sau antagoni ste asupra
estrogenilor .
În plus, trebuie subliniat că ex istă o mare variabilitate inter individuală în
producerea acestor metaboliți activi, în funcție de compoziți a florei intestinale . Flaverol
quercetinul este unu l dintre polifenolii cei mai studia ți. Acesta servește ca un bun
exemplu deoarece metabolismul său la om este bine înțeles; conjugatele de flavonol
care au fost identificate în plasmă și urină de la persoanele hrănite cu alimente care
conțin quercetin nu s unt cele găsite în alimente. De exemplu, probele plasmatice de la
voluntari care au primit quercetin pe cale orală (ca făină de ceapă, ceai de hrișcă sau

quercetin pur, quercetin -4'-glucozid, quercetin -3-glucozid ) glucozi de, quercetin
rutinosid sau quercet in aglicon [52].

III.4.1.Absorbția intestinală
În alimente, toate flavonoidele, cu excepția flavanolilor , există în forme
glicozilate. S oarta glicozidelor din stomac nu este încă clară. Majoritatea glicozidelor
rezistă, probabil, la hidroliza acidă în st omac și astfel ajung intacte în intestin unde se
pot absorbi numai aglicone și pu ține glucozide. S tudiile experimental e efectuate la
șobolani au arătat că absorbția la nivelul gastric este posibilă pentru unele flavonoide,
cum ar fi quercetinul, dar nu pe ntru glicozidele lor. Mai mult, s -a demonstrat recent că,
la șobolani și șoareci, antocianinele s unt absorbite din stomac .
Cu toate acestea, majoritatea polifenolilor sunt prezenți în alimente ca esteri,
glicozide sau polimeri, care nu pot fi absorbiți în forma nativă. D e aceea aceste
substanțe trebuie hidrolizate de enzimele intestinale, cum ar fi β -glucozidazele și
lactaza -florizin hidrolaza, sau de microflora colonului, înainte ca aceste a să poată fi
absorbite [53].
Glicozilarea influențează absorbția, dar, în general, nu influențează natura
metabolitului circulant. Glicozidele intacte de quercetin, daidzein și genistein nu au fost
recuperate în plasmă sau urină după ingestia lor ca compuși puri sau d in alimente
complexe . Antocianinele reprezintă o exce pție, de fapt, glicozidele intacte sunt cele mai
reprezentative forme circulante. E xplicația pentru aceasta ar putea fi în instabilitatea
formelor de aglicon sau în mecanismele specifice de absorbție sau meta bolism pentru
antociani . Cu toate acestea, recen t, s-au identificat glucuronurile și sulfații
antocianinelor în urina umană. Glicozilarea resveratrolului este cunoscută pentru a -l
proteja de degradarea oxidantă, prin urmare resveratrolul glicozilat este mai stabil și mai
solubil și ușor absorbit în tr actul gastrointestinal uman [54].
Pe de altă parte, glicoz ilarea quercetinului facilitează absorbția acestuia; în
fapt, eficiența absorbției de glicozid quercetin este mai mare decât cea a agliconei . S-a
sugerat că glucozidele pot fi transportate în enteroc ite de către transportorul de glucoză
dependentă de sodiu SGLT 1 și apoi hidrolizate de o β-glucozidază citosolică . Cu toate
acestea, efectul de glucozilare asupra absorbției este mai puțin clar pentru izofla vone
decât pentru quercetin .

Proantocianidi nele diferă de majoritatea polifenoli lor din plante datorită naturii
lor polimerice și a greutății moleculare înalte. Această caracteristică particulară ar trebui
să limiteze absorbția lor prin bariera intestinală, iar oligomerii mai mari decât trimerii
sunt pu țin probabil să fie absorbiți în intestinul subțire în formele lor n atale . Acizi
hidroxicinamici, atunci când sunt ingerati în formă liberă, sunt absorbiti rapid de
intestinul subțire și sunt conjugati (în special glucuronidate), asa cum sunt flavonoidele .
Cu toate acestea, acești compuși sunt în mod natural esterificați în produsele vegetale,
ceea ce le afectează absorbția deoarece mucoasa intestinală, ficatul și plasma nu posedă
esteraze capabile să hidrolizeze acidul clorogenic pentr u a elibera acidul ca feic și
hidroliza poate fi efectuată numai de microflora colonului .
Polifenolii care nu sunt absorbiți în intestinul subțire ating colonul, unde
microflora hidrolizează glicozidele în agliconi și metabolizează extensiv agliconii în
acizi aromatici diferiț i. Agliconele sunt împărțite prin deschiderea heterociclului în
diferite puncte, în funcție de structura lor chimică, și astfel produc acizi diferiți care sunt
în continuare metabolizați la derivații acidului benzoic.
Microflora intestinală afectează meta bolizarea gl icozidelor de izoflavone,
deoarece acestea sunt hidrolizate în agliconi sau transformați în metaboliți activi, cu m ar
fi eculele de la daidzein [55].

III.4.2. Mecanisme de conjugare și transport în plasmă
După absorbție, poli fenolii sunt supu și conjugării: acest proces, care include în
principal metilarea, sulfarea și glucuronidarea, reprezintă un proces de detoxificare
metabolică, comun pentru multe xenobiotice, care facilitează eliminarea lor biliară și
urinar ă prin creș terea hidrofilicitar ă.
Catechol -O-metil transferaza catalizează transferul unei grupări metil din S –
adenozil -L-metionină la polifenoli cum ar fi quercetin, luteolin, acid cafeic, catechine ș i
cianidină . Metilarea are loc în general în poziția C 3' a polifenolului, dar ar putea să apară
în poziția C 4': de fapt, o cantitate notabilă de 4' -metil epigigalocatechină a fost detectată
în plasma umană după ingerarea ceaiului . Activitatea catechol -O-metil transferazei este
cea mai ridicată în ficat și rinichi, deși este prezentă într -un număr de țesuturi .
Sulfotransferazele catalizează transferul unui fragment sulfat din 3' –
fosfoadenozin -5'-fosfosulfat la o grupare hidroxil pe diferite substra turi, printre care

polifenoli. S ulfarea apare în principal în ficat, dar poziția sulfării pentru polifenoli nu a
fost încă ide ntificată în mod clar .
UDP -glucuronoziltransferazel e sunt enzime legate de membrana localizat ă în
reticulul endoplasmatic în multe țesuturi, care catalizează transferul acidului glucuronic
din acidul UDP -glucuronic în polifen oli, precum și steroizilor, acizilor biliari și a multor
constituenți alimentari. Glucuronidarea apare în intestin și ficat, iar cea mai mare rată de
conjugare este obse rvată în poziția C 3 [56].
Importanța relativă a acestor trei tipuri de conjugare pare să varieze în funcție
de natura sub stratului și de doza ingerată. Sulfarea și glucuronidarea polifenolilor pare
să fie, de asemenea, afectată de specie și sexe .
Mecanismele de conjugare sunt foarte eficiente, iar agliconele libere sunt, în
general, fie ab sente, fie prezente în concentrații scăzute în plasmă după consumul de
doze nutriționale; o excepție sunt catechinele de ceai verde, ale căror aglicoane pot
constitui o proporție semnificativă din cantitatea totală din plasmă (până la 77% pentru
galatul ep igalocatechin) .
Este important să se identifice metaboliții circulanți, inclusiv natura și pozițiile
grupurilor de conjugare pe structura polifenolului, deoarece pozițiile pot afecta
proprietățile biologice ale conjugatelor . Cu toate acestea, există puțin e date privind
proporțiile diferitelor tipuri de conjugate și procentele formelor libere din plasmă .
Metaboli ții polifenolului circulă în sânge legat de proteine, în special albumina
reprezintă proteina p rimară responsabilă de legare. A finitatea polifenoli lor pentru
albumină variază în funcție de str uctura lor chimică . Legarea la albumină poate avea
consecințe asupra ratei de clearance al metaboliților și asupra eliberării lor în celule și
țesuturi. Este posibil ca absorbția celulară a metaboliților să fie proporțională cu
concentrația lor nelegată. În cele din urmă, este încă neclar dacă polifenolii trebuie să fie
în formă liberă pentru a -și exercita activitatea biologică sau polifenolii legați de
albumină pot exercita o activitate biologică, așa cum s -a de monstr at recent pentru
quercetin [57].

III.4.3.Concentrațiile plasmatice
Concentrațiile de polifenoli atinse după consumul lor variază în mare măsură în
funcție de natura polifenolului și a sursei alimentare . Concentrațiile plasmatice ale
flavonoidelor intacte rar depășesc 1 μM și menținerea unei concentrații ridicate de

polifenoli în plasmă necesită ingerare repetată în timp ; de fapt, concentrațiile maxime
sunt de cele mai multe ori atinse la 1-2 ore după ingestie , cu excepția acelor polifenoli
care nec esită degradare înain te de absorbție [58].
III.4.4.Recoltarea țesuturilor
Polifenolii sunt capabili să pătrundă in țesuturi , în special cele în care aceștia
sunt metabolizați, cum ar fi intestinul și ficatul. Determinarea biodisponibilității
metaboliților polifenolici în țesuturi poate fi mult mai importantă decât cunoașterea
concentrațiilor plasmatice ale acestora. Cu toate acestea, datele sunt încă foarte limitate,
nu numai la oameni, ci chiar la animale, deoarece puține studii au raportat date privind
concentrațiile de p olifenoli în țesuturile umane. D ouă studii au măsurat fitoestrogenii și
polifenolii din ceai în țesutul prostatic uman. P rimul studiu a arătat o concentrație
prostatică semnificativ mai mică a genisteinei la bărbații cu hiperplazie prosta tică
benignă decât la cei cu prostată normală, în timp ce concentrațiile plasmatice de
genisteină au fost mai mari la bărbații cu hiperpla zie benignă de prostată . Al doilea
studiu a arătat că polifenolii de ceai sunt biodisponibili în prostata umană: la sf ârșitul
consumului zilnic de 1,42 L de ceai verde sau ceai negru timp de 5 zile,
epigalocatechina, epicatechina, galactatul de epigalocatechin, galatul de epicatechin au
atins concentrații de 21 pân ă la 107 pmol/ g țesut [59].
Pentru a determina biodisponi bilitatea sistemică a curcuminei în țesutul
colorectal, doisprezece pacienți cu cancer colorectal confirmat au primit curcumină
orală la 0,45, 1,8 sau 3,6 g per mat timp de 7 zile înaint e de intervenția chirurgicală.
Concentrațiile de curcumină în țesutul colorectal normal și malign la pacienții care
consumă 3,9 g de curcumină zilnic au fost de 12,7 ± 5,7 și 7,7 ± 1,8 n mol/g țesut
respectiv . Un alt studiu a arătat că concentrațiile eg ale la femei, care au ingerat
izoflavone, au fost mai mari în țesutul mama r decât în ser, în timp ce genisteinul și
daidzeinul au fost mai concentrate în ser d ecât în țesutul mamar .
Aceste câteva studii subliniază faptul că concentrațiile plasmatice ale
polifenolilor nu sunt direct corelate cu concentrațiile din țesuturile țintă. În plus,
distribuția între sânge și țesuturi diferă între diferiți polifenoli.

III.4.5.Excreție
Polifenolii și derivații lor sunt eliminați în principal în urină și bilă. M etaboliții
conjugați extensivi sunt mai susceptibili de a fi eliminați în bilă, în timp ce conjugații
mici, cum ar fi monosulfații, sunt excretați preferențial în urină.
Cantitatea totală de metaboliți excretați în urină este corelată aproximativ cu
concentrațiile plasmatice maxime. Rata de excreție urinară este destul de ridi cată pentru
flavanonele de la citrice (4 -30% din consumul de admisi e) și pentru iz oflavone (16 -66%
pentru daidzein și 10 -24% pentru genistein) , în timp ce în cazul flavonolilor est e de 0,3 –
1,4% din doza ingerată de quercetin și glicozidele sale . Recuperare a urinară este de 0,5 –
6% pentru catechinele de ceai, 2-10% pen tru catechina vinului roșu și până la 30%
pentru epicatechinul de cacao , în timp ce acesta variază de la 5,9% la 27% cafea și acizi
ferulici .
Aceste procente pot fi foarte scăzute pentru alți p olifenoli, cum ar fi
antocianinele (0,005 -0,1% din consum) . Cu toate acestea, biodisponibilitatea scăzută a
antocianinelor ar putea fi evidentă deoarece acestea există doar într-o serie de structuri
moleculare diferite și există un număr de metaboliți pote nțiali care pot fi generați [60].
Mai mult, anumiți metaboliți pot fi încă neidentificați ca urmare a dificultăților
analitice. S -a demonstrat că toți metaboliții antocianinelor de căpșuni au fost foarte
instabili și degradați extensiv atunci când probele de urină au fost înghețate . O abordare
utilă ar putea fi utilizarea compușilor marcați izotopic.

CAPITOLUL IV:
EVALUARE METODE ANTIOXIDANTE IN VITRO

IV.1.Metode in vitro

Activitatea antioxidantă nu trebuie încheiată pe baza unui singur medicament
model de test antioxidant. Și în practică mai multe teste in vitro se efectuează ca
proceduri pentru evaluarea activităților antioxidante cu mostrele de interes. Un alt
aspect este acela că modelele de testare antioxidantă variază în diferite privințe. Prin
urmare, este dificil pentru a compara o metodă pe deplin cu alta. Cercetătorii trebuie să
verifice în mod critic metodele de analiză înainte de a adopta acest lucru pentru scopul
său de cercetare. În general, testele pentru antioxidanti in vitro folosind capc ane cu
radicali liberi sunt relativ simple de executat. Printre metodele de curățare a radicalilor
liberi, metoda DPPH este, de asemenea, rapidă, simplă (adică nu este implicată în multe
etape și reactivi) și ieftină în comparație cu alte modele de testare . Pe de altă parte
decolorarea analizei ABTS este aplicabilă atât pentru antioxidanții hidrofili, cât și
pentru cei lipofili.
A. Activitatea de examinare a DPPH
Molecula 1,1 -difenil -2-picrilhidrazil (α,α -difenil -β picrilhidrazil; DPPH) este
caracterizată ca un radical liber stabil în virtutea delocalizării electronului de rezervă
peste molecula ca întreg, astfel încât molecula să nu dimerizeze, cum ar fi cazul
majorității celorlalți radicali liberi. Delocalizarea de electron, de asemenea, dă naștere la
culoarea violet profund, caracterizat de o bandă de absorbție în soluția de etanol centrat
la aproximativ 517 nm. Când se amestecă o soluție cu DPPH a unui substrat (AH) care
poate dona un atom de hidrogen, atunci acesta dă naștere formei reduse prin pierdere a
acestei culori violete.
+ AH

Figura 4. Difenilpicrilhidrazil (radical liber)
+A
Figura 5. Difenilpicrilhidrazil

Pentru a evalua potențialul antioxidant prin utilizarea radicalilor liberi din
probele de testare, densitatea radicalilor DPPH este monit orizată. Extractul de probă
(0,2 ml) este diluat cu metanol și 2 ml de soluție DPPH (0,5 mM).
După 30 min, absorbția este măsurată la 517 nm. Procentajul din absorbția
radicalilor DPPH se calculează utilizând ecuația menționata mai jos:

% inhibare a radic alului DPPH= ([ Abr – Aar]/ Abr) x 100

unde A br este gradul de absorbtie înainte de reacție și A ar este absorbtia după ce reacția a
avut loc.

B. Examinarea peroxidului de hidrogen (H 2O2)

Ființele umane sunt expuse indirect la H 2O2 prin intermediul me diului
aproximativ 0,28 mg/kg/ zi, cu aport mai mare de la culturile cu frunze. Peroxidul de
hidrogen poate intra în corpul uman prin inhalare de vapori sau umezeala și prin ochi
sau piele. H 2O2 se descompune rapid în oxigen și apă și aceasta poate produce radicali
hidroxil (OH) care pot iniția peroxidarea lipidică și provoacă deteriorarea ADN -ului în
organism.
Capacitatea extractelor de plante de a elimina peroxidul de hidrogen poate fi
estimată conform metodei lui Ruch și colab. (1989). Se prepară o soluție de peroxid de
hidrogen (40 mM) în fosfat tampon (50 mM p H 7,4). Concentrația de peroxid de
hidrogen este determinată prin absorbție la 230 nm folosind un spectrofotometru.
Extractul este adau gat (20 -60 lg/ ml) în apă distilată la peroxidul de hidrogen și
se determină absorbanța la 230 nm după 10 minute, contra unei soluții martor conținând

fosfat tampon fără peroxid de hidrogen. Procentajul din peroxidul de hidrogen se
calculează după cum urme ază:

% analizat (H 2O2)= [( A i – At)/ A i] x 100

unde A i este absorbanța controlului și A t este absorbanța de încercare.

C. Activitatea de analizare a oxidului nitric

NO este generat în țesuturile biologice prin sinteza oxidului nitric specific, care
metabolizează arginina la citrulină cu formarea de NO printr -o reacție oxidativă de cinci
electroni. Compusul nitroprus iat de sodiu este cunoscut că se descompune în soluție
apoasă, soluție la pH fiziologic (7.2) care produce NO. Sub condițiile aerobe, NO
reacționează cu oxigenul pentru a produce produse stabile (nitrați și nitriți), ale că ror
cantități pot fi determinate folosind reactivul Griess. Doi (2) ml de nitroprusi at de sodiu
de 10 mM dizolvat în 0,5 ml solutie salina de fosfat (pH 7,4) se amestecă cu 0,5 ml de
probă la diferite concentrații (0,2 -0,8 mg/ml). Amestecul apoi se incubează la 25 °C.
După 150 min de incubare, 0,5 ml din soluția incubată este extrasă și a mestecată cu 0,5
ml de reactiv Griess [(1,0 ml reactiv acid sulfanilic(0,33% în 20% acid acetic glacial la
temperatura camerei pentru 5 minute cu 1 ml de diclorură de naftiletilendiamină (0,1%
w/v)]. Amestecul este apoi incubat la temperatura camerei timp de 30 de minute și
absorbanța sa, turnând într -o eprubetă, este măsurată la 546 nm [61]. Cantitatea de
inhibare a oxidului de azot se calculează după următoarea ecuație:

% inhibare a radicalului NO = [A 0 – A1 ] / A 0 x100

unde A 0 este absorbanța înainte de reacție și A 1 este absorbanța după ce reacția a avut
loc cu reactivul Griess.

D. Activ itatea de c urățare a radicalilor de peroxi nitrit
Peroxinitrit ul (ONOO) este un citotoxicant cu o proprietate de oxidare
puternică față de diverși constituenți celulari, inclusiv sulfhidrili, lipide, aminoacizi și
nucleotide și poate provoca moartea celulel or, peroxidarea lipidelor, carcinogeneza și

îmbătrânirea. Este generat in vivo de către celulele endoteliale, celule Kupffer,
neutrofile și macrofage. Radic alul de peroxi nitrit este relativ stabil, comparativ cu alți
radicali liberi, dar odată protonați dă reactiv itate mare acidului peroxinitro s (ONOOH),
descompunându -se foarte repede (1,9 s) la 37 °C pentru a forma diferiti citotoxicani și
care pot induce oxidarea tiolului (SH) pe proteine, nitrarea tirozinei, peroxidarea
lipidelor si, de asemenea, reacți i de nitrozare, care afectează metabolismul celular și
transducția semnalului. În cele din urmă, poate contribui la leziuni cu spargerea catenei
ADN și moartea celulelor apoptotice, de ex. în timocite, celulele corticale și celulele de
leucemie HL -60. Form area excesivă a acestuia poate fi implicată și în mai multe boli
umane cum ar fi boala Alzheimer, a rtrita reumatoidă , cancerul și ateroscleroza. Datorită
lipsei endogenului, enzime responsabile pentru inactivarea ONOO, în curs de dezvoltare
specifice anali zei ONOO este de o importanță considerabilă [62].
Metoda implică utilizarea unei soluții stoc de dihidroxirhodamină 123 (DHR
123, (5 mM) în dimetilformamidă care es te purjată cu azot și depozitată la 80°C. Soluția
de lucru cu DHR 123 (la final cu concentra ție de 5 uM) este diluat din soluția stoc și
este plasat pe gheață în întuneric imediat înainte de experiment.
Soluție tampon cu fosfat de sodiu 50 mM (pH 7,4), care conține 90 mM clorură
de sodiu și 5 mM clorură de potasiu cu 100 uM de acid dietilentriami nopentaacetic
(DTPA) sunt purjate cu azot și introduse pe gheață înainte de utilizare. Activitatea
ONOO prin oxidarea DHR 123 este măsurată pe un spectrofotometru de fluorescență cu
microplăci cu excitație și lungimi de undă de emisie de 485 nm și 530 nm l a
temperatura camerei. Fundalul și intensitățile finale sunt măsurate la 5 minute după
tratamentul fără 3 -morfolino -sidnonimină (SIN -1) sau autentic (ONOO).
Oxidarea DHR 123 prin descompunerea progresivă a SIN -1a crescut în timp ce
ONOO autentic a oxidat r apid DHR 123 cu intensitatea fluorescentă finală fiind stabilă
în timp.

E. Capacitatea antioxidantă Trolox (TEAC ) metodă / Analiza de decolorare a
cationilor radicali ABTS

Această metodă utilizează un spectrofotometru cu diodă pentru a măsura
pierderea de culoare atunci când un antioxidant este adăugat la cromoforul albastru –
verde ABTS + (2,2 -azino -bis (3 -etilbenztiazol -6-acid sulfonic)). Antioxidantul reduce
ABTSÆ + la ABTS și il decoloreaza. ABTS® + nu este un radical stabil găsit în corpul

uman. Acti vitatea antioxidantă poate fi măsurată.Catio nii radicali ABTS sunt preparați
prin adăugarea de dioxid de magneziu solid (80 mg) la o soluție apoasă de 5 mM de
ABTS (20 ml, utilizând 75 mM tampon Na / K cu pH 7). Trolox (6 -hidroxi -2,5,7,8 –
tetrametilcroman -2-carboxilic), un analog solubil în apă de vitamina E, poate fi folosit
ca un antioxidant standard. O curba standard de calibrare este construită pentru Trolox
la concentratiile de 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300 și 350 pm. Probele sunt diluate
corespunzăt or în funcție de activitatea antioxidantă din Na/K tampon pH 7. Probele
diluate sunt amestecate cu 200 l din ABTS + soluție cationică radicală în plăci cu 96 de
godeuri și absorbția este citită (la 750 nm) după 5 minute într -un cititor cu microplăci.
Valor ile TEAC pot fi calculate din curba standardul Trolox și exprimată in echivalente
Trolox (în mM).

F. Parametrul total de captare al antioxidantului (TRAP)/ metodă

Această metodă se bazează pe protecția oferită de antioxidanți asupra decăderii
fluoresce nte a R -fitoeritrinei (R -PE) în timpul unei reacții de peroxidare controlată.
Fluorescența din R -fitoeritrinul este stinsă prin ABAP (2,20 -azo-bis (2 -amidino -propan)
clorhidrat) ca generator radical. Aceasta reacție de stingere este măsurată în prezența
antioxidanților. Potențialul antioxidant este evaluat prin măsurarea gradului de
decolorare. Se adaugă 120 l de probă diluată la 2,4 ml de tampon fosfat (pH 7,4), 375
litri de apă distilată, 30 l R -PE diluat și 75 l de ABAP; se înregistrează cinetica de
reacție la 38 ° C timp de 45 de minute printr -un spectrometru de luminiscență. Valorile
TRAP sunt calculate din lungimea fazei de întârziere datorată eșantionului comparativ
cu standardul.

G. Testul de reducere a puterii ferice a antioxidantului (FRAP)

Aceas tă metodă măsoară capacitatea antioxidanților de a reduce fericitatea. Se
bazează pe reducerea complexului de fier și 2,3,5 -trifenil -1,3,4 -triaza -2-
azoniaciclopenta -1,4-clorură de dienă (TPTZ) la for ma feroasă la pH scăzut. Această
reducerea este monitoriz ată prin măsurarea modificării absorbției la 593 nm, utilizând

un spectrofotometru cu diodă. Trei mililitrii de reactiv FRAP este amestecat cu 100 l de
probă diluată; absorbția la 593 nm este înregistrată după o incubare de 30 min la 37 °C.
Valorile FRAP p ot fi obținute prin compararea absorbției, modificarea
amestecului de testare cu cele obținute în urma creșterii concentrațiile de Fe3+ și
exprimate în mM de Fe2+ echivalenți per kg (alimente solide) sau per L (băuturi) din
probă [63].

H. Activitatea de c urățare a radicalilor de superoxid (SOD)

Deși anionul superoxid este un oxidant slab, în cele din urmă produce radicali
puternici și periculoși de hidroxil ca oxigenul singur, ambele care contribuie la stresul
oxidativ .
Activitatea de curatare a superox idului poate fi măsurată. Se generează radicali
anionici de superoxi d din 3,0 ml de tampon Tris -HCI (16 mM, pH 8,0), conținând 0,5
ml tetrazoliu nitroblue (NBT) (0,3 mM), 0,5 ml soluția NADH (0,936 mM), extract de
1,0 ml și 0,5 ml Tris -HCI (16 mM, pH 8,0). Reacția este inițiată prin adăugarea a 0,5
ml de soluție de metosulfat de fenazină (PM S)(0,12 mM) la amestec, incubată la 25 °C
timp de 5 minute și apoi se măsoară absorbanța la 560 nm față de un semifabricat -probă
[64].

I. Activitatea de curățare a rad icalilor de hidroxil

Radicalul hidroxilic este una dintre cele mai puternice specii de oxigen reactiv
din sistemul biologic care reacționează cu grăsimile polinesaturate fragmente acide ale
fosfolipidelor membranei celulare și cauzează leziuni celulei. Am estecul de reacție (1,0
ml) constă in 100 ui de 2 -deoxiriboză(28 mM în tampon 20 mM KH 2PO 4-KOH, pH
7,4),500 l de extract, 200 l EDTA (1,04 mM) și 200 ui FeCl 3 (1: 1 v/v), 100 pl de H 2O2
(1,0 mM) și 100 l ascorbic acid (1,0 mM) care este incubat la 37 °C tim p de 1 oră. Un
mililitru de acid tiobarbituric (1%) și 1,0 ml de acid tricloracetic (2,8%) se incubează la
100 ° C timp de 20 min. După răcire, absorbția este măs urată la 532 nm, față de a prob ă
necompletată.

J. Metoda de eliminare a capacităț ii radicalil or hidroxil (HORAC)

Testul HORAC măsoară activi tatea de chelatare a antioxidanților in condiț iile
reacțiilor de tip Fenton care utilizează un complex Co (II) și prin marirea capacităț ii de
protecție împotriva formării radicalului hidroxil. Soluția de pe roxid de hidrogen de 0,55
M este preparată în apă distilata și 4,6 mM Co (II) care se prepara prin dizolvarea a 15,7
mg de CoF 2A4H2O și 20 mg de acid picolinic în 20 ml de apă distilată . Fluorescein –
170 l (60 nM, concentrație finală) și cei 10 I de probă sunt incuba ți la 37 °C timp de 10
minute, direct în cititorul de plăci. După incubare s -au adăugat 10 l H202 (27,5 mM, fi –
concentrație nal) și 10 l de Co (II) (concentrație finală 230 um) soluțiile sunt adăugate
ulteri or. Se măsoară fluorescența iniț iala după care se iau citirile de la fiecare minut,
după ameste care. Pentru proba martor, soluț ia tampon de fosfat este folosită . 100, 200,
600, 800 și 1000 lM de soluție antioxidanăt standard (în tampon fosf at 75 mM, pH 7,4)
este utilizată pentru construirea curbei standard. Valorile finale ale HORAC se
calculează folosind o ecuație de regresie între concentrația antioxidantă standard și
suprafața netă sub curba. O unitate HORAC este atribuită z onei de protecție netă
furnizată de un antioxidant standard de 1 μm și de activitatea antioxidantă standard a
eșantionului care este exprimat ca echivalent antioxidant lM standard per gram de
greutate proaspătă a probelor. Acidul galic poate fi utilizat ca antioxidant standard.

K. Metoda capacității de absorbție a radi calilor de oxigen (ORAC)

ORAC este o analiză captivantă și revoluționară în tubul d e testare care poate fi
folosit ă pentru a testa puterea antioxidantă a alimentelor. Acest test poate fi realizat fie
cu ajutorul bicrocoeritrinei ( β-PE) sau fluoresceinei c a moleculă țintă. In timp ce
revizuirea, β-PE nu este întâlnită mai târziu în publicații decât în 2005. Astfel, se pare
că fluoresceina înlocuiește β-PE ca țintă în analiza ORAC. Testul este efectuat folosind
Trolox (un analog solubil în apă al vitaminei E) ca standard pentru a determina
echivalentul trolox (TE). Valoarea ORAC este apoi calculată din echivalentul trolox și
exprimată ca unități sau valoare ORAC. Cu cât valoarea ORAC este mai mare, cu atât
mai mare e "puterea antioxidantă".
Această analiză se bazează pe generarea utilizării de radicali liberi AAPH
(2,2-azobis -2-amidopropan diclorhidrat) și măsurarea scăderii fluorescenței în prezența
unor radicali liberi. În această analiză β-fitoeritrina ( β-PE) a fost utilizată să deterioreze
radicali țintă liberi , AAPH ca un radical peroxigenerator și Trolox ca un control

standard. După adăugarea de AAPH la soluția de testat, se înregistrează fluorescența și
activitatea antioxidantă este exprimată ca echivalent trolox.
Analiza poate fi efectuată în plăci d e fluorescență din polipropilenă cu 96 de
godeuri cu un volum final de 200 l. Testele sunt efectuate la pH 7,0 cu Trolox (6,25,
12,5, 25 și 50 lmol/ L pentru teste lipofile; 12,5, 25, 50 și 100 lmol / l teste hidrofile) ca
standard și 75 mM/l tampon fosfat ca martor. După adăugarea din AAPH, placa este
plasată imediat într -un contor cu mai multe etichete preîncălzit la 37 °C. Plăcuța este
agitată în mod orbital timp de 10 s, iar fluorescența este citită la intervale de 1 min, 35
min la lungimea de undă de e xcitație de 485 nm și emisie cu lungime de undă de 520
nm. Suprafața sub -curbă se calculează pentru fiecare eșantion utilizând software -ul
Wallac Workout 1.5. Calculul finalal al rezultatelor se face luând diferența de zone sub-
curbe între martor și eșantio n și/sau (Trolox) și exprimându -l în lM echivalenți
Trolox(TE) per g de greutate uscată a probei (1 TE/g).

L. Metoda de reducere a puterii (RP)

Această metodă se bazează pe principiul creșterii absorbanței din amestecurile
de reacție. Creșterea absorb anței indică o creștere a activității antioxidante. În această
metodă, compusul antioxidant formează un complex colorat cu fericianura de potasiu,
acidul tricloroacetic și clorura ferică, care este măsurată la 700 nm. Creșterea
absorbanței amestecului de r eacție indică puterea de reducere a probelor. 2,5 ml de
tampon fosfat 0,2 M (pH 6,6) se adaugă la 2,5 ml de K3Fe (CN) 6 (1% greutate/ volum)
la 1,0 ml de soluție probă dizolvată în apă distilată. Amestecul rezultat este incubat la 50
°C timp de 20 min, urma tă de adăugarea de 2,5 ml de acid tricloroacetic (10% g/v).
Amestecul este centrifugat la 3000 rpm timp de 10 minute pentru a colecta stratul
superior de soluție (2,5 ml), amestecat cu apă distilată (2,5 ml) și 0,5 ml de FeCI 3
(0,1%, greut/vol). Absorbanța este apoi măsurată la 700 nm față de proba martor.

M. Metoda fosfomolibdenului

Analiza totală a capacității antioxidante este o metodă spectroscopică pentru
determinarea cantitativă a capacității antioxidante, prin formarea complexului

fosfomolibdenic . Analiza se bazează pe reducerea Mo (VI) la Mo (V) de către analitul
de probă și formarea ulterioară a unui fosfat Mo (V) verde la pH acid. Se combină 0,1
ml de soluție de probă (100 ug) cu 1 ml de reactiv (acid sulfuric 0,6 M, sodiu 28 mM
fosfat și 4 mM molibdat de amoniu). Tubul se acoperă și se incubează într -o baie de apă
fierbinte la 95 °C timp de 90 min. După răcirea probei la temperatura camerei, absorbția
soluției apoase este măsurată la 695 nm față de martorul în spectrofotometru UV. O
soluție tip ică martor conține 1 ml de soluție de reactiv și soluția corespunzătoare
volumului aceluiași solvent utilizat pentru probă și este incubat în aceleași condiții ca
restul eșantionului. Pentru eșantioane cu o compoziție necunoscută, capacitatea
antioxidantă poate fi exprimată ca echivalenți de α-tocoferol.

N. Metoda fero -tiocianat (FTC)

Această metodă poate fi exploatată pentru a determina activitatea
antioxidantului. Un amestec de 4 mg de probă (concentrație finală de 0,02% greutate/
volum) în 4 ml etano l, 4,1 ml de acid linoleic 2,51% în etanol, 8,0 ml de etanol, tampon
fosfat 0,02 M (pH 7,0) și 3,9 ml apă distilată conținută în flaconul cu capac cu șuru b,
este plasată într -un cuptor la 40 °C în întuneric. 0,1 ml din amestecul de reacție este
transferat la un tub test și, la el; 9,7 ml de etanol apos 75% (v/v) cu 0,1 ml de tiocianat
de amoniu apos 30% și 0,1 ml de clorură feroasă 0,02 M în acid clorhidric 3,5% sunt
adăugate. Trei minute după adăugarea de cloruri feroase la amestecul de reacție,
absorbția amestecului rezultat (culoarea roșie) este măsurată la 500 nm la fiecare 24 de
ore până cand absorbția controlului a atins maximum. Antioxidantul standard
(concentrația finală de 0,02% greutate/volum) este folosit ca si control pozitiv, iar
amestecul fără probă este folosit ca un controlul negativ.

O. Metoda acidului tiobarbituric (TBA)

In această metodă a fost utilizată concentrația probelor finale de 0,02% g/v.
Doi ml de acid tric loroacetic 20% și 2 ml de 0,67% din acidul tiobarbituric au fost
adăugat e la 1 ml de soluție de probă. Amestecul a fost plasat într -o baie de apă fierbinte
timp d e 10 minute și apoi centrifugată după răcire la 3000 rpm timp de 20 min.
Activitatea de absorbție a supernatantului a fost măsurată la 552 nm și înregistrat ă după
ce a atins maximum.

P. Metoda DMPD (N, N -dimetil -p-fenilendiamină diclorhidrat)

Metoda de decolorare a radicalilor cationilor DMPD a fost dezvoltată pentru
măsurarea activității antioxidante din alimente și probe biologice. Această analiză se
bazează pe reducerea sol uției tamponate de DMPD colorată în acetat tampon și clorură
de fier. Procedura implică măsurarea scăderii în absorbția DMPD în prezența unor
agenți de curățare la maximul său de absorbție de 505 nm. Activitatea a fost exprimată
ca procent de reducere a DMPD. S -a obținut radicalul prin amestecarea a 1 ml de soluție
DMPD (200 mM), 0,4 ml de clorură ferică (III) (0,05 M) și 100 ml de soluție tampon de
acetat de sodiu la 0,1 M, modificând pH -ul la 5,25. Amestecul reactiv trebuie sa fie
păstrat în întuneric, la rece și la o temperatură scăzută (4 -5 ° C). Reacția are loc atunci
când se adaugă 50 l de apă ca probă (o diluție de 1:10 în apă) se adaugă la 950 l DMPD
+ soluție. Absorbanța este măsurată după 10 min de amestecare continua, care este
timpu l necesar pentru a ajunge la o decolorare uniforma. Rezultatele sunt cuantificate în
mM Trolox pe curba de calibrare relevantă.

Q. Metoda cu acid linoleic al acidului β-caroten și testul dienelor conjugate

Aceasta este una dintre metodele rapide de scan are a antioxidanților, care este
bazat în principal pe principiul că acidul linoleic, care este un acid gras nesaturat, este
oxidat de "Speciile de oxigen re activ" (ROS) produsă de apa oxigenată. Produsele
formate vor iniția oxidarea b -carotenului, care va duce la decolorare. Antioxidanții
reduc amploarea decolorării, care este măsurată la 434 nm. b -carotenul (0,5 mg) în 1 ml
de cloroform se adaugă la 25 μL linoleic acid și 200 mg de amestec emulsionat Tween –
80. Cloroformul este evaporat la 40 °C, 100 ml de apă distilată saturată cu oxigen este
adăugat ă lent la reziduu și soluția este agitată viguros pentru a forma o emulsie stabilă.
Patru ml din acest amestec este adăugat în eprubetele conținând 200 l de probă
preparată în metanol la concentrații finale (25 , 50, 100, 200 și 400 ug / ml). Imediat
după emulsifiere se adaugă soluția la tuburi, se măsoară absorbția timpului zero la 470
nm. Tuburile sunt incubate timp de 2 ore la 50 ° C. Vitamina C poate fi utilizată ca
standard. Se calculează activitatea antioxi dantă ca procent de inhibare (I%) față de
martor folosind următoarea ecuație:

I% =[ 1 – (As- As120)/Ac – Ac120 )]

unde As a fost absorbanța inițială, As120 a fost absorbanța probei la 120 min, Ac a fost
absorbanța inițială a controlului negativ și Ac120 a fost absorbanța controlului negativ
la 120 min.

R. Metoda oxidazei Xantinei

Activitatea oxidazei xantinei cu xantină ca substrat poate fi măsurată
spectrofotometric. Extract ul (500 l de 0,1 mg/ml) și al opurinolul (100 ug/ml) (în
metanol) se amestecă c u 1,3 ml fosfat tampon (0,05 M, pH 7,5) și 0,2 ml de 0,2 unități/
ml soluție de xantin ă oxidază [65]. După 10 minute de incubare la temperatura camerei
(25 ° C), 1,5 ml de substrat de xantin ă 0,15 M soluția se adaugă la acest amestec.
Amestecul este din no u incubat timp de 30 de minute la temperatura camerei (25 °C) și
apoi absorbția este măsurată la 293 nm folosind un spectrofotometru față de martor (0,5
ml metanol, 1,3 ml tampon fosfat, 0,2 ml oxidaza xantin). Soluția de 0,5 ml metanol, 1,3
ml fosfat, 0,2 ml oxidază de xantin si 1,5 ml de substrat de xantin se utilizează sub
formă de control. Procentajul din inhibare se calculează folosind formula:

Procentul de inhibare = [ 1- (As/Ac)] x100

unde As și Ac sunt valorile de absorbție ale probei de testare ș i de control.

S. Metoda ionului cupric de reducere a capacitatii antioxidante (CUPRAC)

Reactivul cromogenic de oxidare al metodei CUPRAC , adică clorură de cupru (II) bis
(neocuproină) [Cu (II) -Nc], reacționează cu polifenoli [Ar (OH) n] în manieră.

2n Cu(Nc) 22+ + Ar (OH) n – 2n Cu (Nc)2+ +Ar ( -O)n + 2nH+

unde protonii eliberați pot fi tamponați cu soluția relativă concentrată de acetat de
amoniu.

În această reacție, grupările reactive de Ar -OH ale polifenolilor sunt oxidate la
chinonele corespunză toare și Cu (II) -Nc este redus la chelatul Cu (I) -Nc cu pigmenti
foarte colorati indicând maximum absorbție la 450 nm.
1 ml de 10 -2 mL de CuC l2, 1 ml de neocuproină 7,5 X 10 -3 M și soluție de 1M
NH 4CH 3COO se introduc în tubul de sticlă. Apoi, 400 μL de s oluție standard proaspăt
preparată este adaugată și se diluează până la volumul final de 4,1 μL cu apă deionizată.
Această procedură se repetă pentru 400 μl, 300 μl, 200 μl, 100 μL și 100 μl.
Se adaugă 50 ml de soluții proaspăt preparate din probă.
Soluții le preparate sunt amestecate și incubate la temperatura camerei timp de 30 de
minute. Se determină absorbanța la 450 nm pe un martor de reactiv prin spectrometru.
Calculul capacitatii antioxidante a compușilor ca echivalenți Trolox (Valorile TEAC)
prin met oda CUPRAC a u fost raportate .

T. Activitatea de chelatare a metalului

Ferozina poate forma un complex de o culoare roșie prin formarea de chelați cu
Fe2 +. Această reacție este restricționată în prezența altor agenți de chelare și duce la o
scădere a c ulorii roșii a complexelor de ferozină -Fe2+. Măsur area reducerii culorii
determină activitatea de chelare pentru a concura ferozină pentru ionii feroși. Chelarea
ionilor feroși este estimată. 0,1 ml din extract se adaugă la o soluție de 0,5 ml clorură
feroasă (0,2 mM). Reacția este începută prin adăugarea de 0,2 mL de ferozină (5 mM) și
incubată la temperatura camerei timp de 10 minute și apoi se măsoară absorbanța la 562
nm. EDTA sau acidul citric (Dinis și colab., 1994) poate fi folosit ca un control pozi tiv.

B. PARTEA SPECIAL Ă

CAPITOLUL V
INVESTIGAȚII PRIVIND CORELAȚIILE DINTRE CONȚINUT UL
DE POLIFENOL I DIN VINURILE RO ȘII ȘI CAPACITATEA
ANTIOXIDANTĂ A ACESTORA

In aceast ă parte a lucrarii am arătat relați a dintre capacitatea antioxidantă și
conținutul total de polifenoli al vinurilor roșii spaniole, din eșantionul din regiunea
Tierra del Arlanza din Spania. Au fost analizate vinurile pentru conținutul total de fenol i
prin metodele Folin -Ciocâlteu și Mazza. A fost cuantifica gă antocianina și pirocatechina
din vinurile roșii spaniole selectate. Capacitatea antioxidantă a vinurilor a fost
evidențiată de metodele FRAP și DPPH. Rezultatele metodelor FRAP și DPPH au fost
în concordanță cu un număr important de lu crări din acest domeniu de cercetare.
Relația dintre activitatea antioxidantă (sau potențialul antioxidant) și compușii
polifenolici în vinuri a fost studiată de mulți cercetă tori. Din aceste grupuri, am analizat
în laborator flavonoidele, mai exact piroc atechina. În cadrul aceluiași domeniu de
cercetare sunt circumscrise testele de laborator efectuate pe un eșantion reprezentativ de
43 de vinuri roșii din regiunea Arlanza (Spania), pentru care am analizat conținutul în
compuș i polifenolici, în pirocatechi nă și activitatea antioxidantă a acestor vinuri.

V.1. Materiale ș i metode

Probele de vin utilizate au fost vinurile comerciale din regiunea mai sus
menționată, din productia anului 2002, 2003 și 2004. Vinurile nu au fost preparate
anterior, s -a aplicat doar apă diluată. Materialele utilizate în experimentele noastre au
fost reactivul Folin (un amestec de acid fosfomolibdenic și acid fosfoforamic), acid
galic, malicidină 3 -glucozidă , etanol, HCI, D -pirocatechina și vanilină. Pentru a
determina cantitatea de compuși polifenolici, am utilizat următoarele metode
spectrofotometrice : Folin -Ciocâlteu, Paronetto și Mazza. Echipamentul folosit a fost un
spectrofotometru UV 6503 Beckman DU 650 [66].
A. Determinarea polifenolilor totali (TP) prin metoda Folin -Ciocâ lteu. Metoda se
bazează pe reacția de oxidare dintre compușii polifenolici cu reactivul Folin -Ciocâlteu.

Intensitatea culorii albastre a fost proporțională cu conținutul în compușii polifenolici.
Reacția dintre compușii polifenolici și reactivul Folin -Cioc âlteu a avut loc în pH bazic.
B. Determinarea polifenolilor totali (TP) prin metoda Mazza . Metoda Mazza este
utilizată pentru determinarea compușilor p olifenolici . Probele de vin au fost diluate 1:10
cu 10% etanol. Ca probă, s -a adăugat apoi etanol 95% cu HCI 0,1% și HCI 2%. După
omogenizare și dezvoltare a culorii, absorbția a fost citită la 280 nm. Acidul galic în
etanol 10% a fost utilizat ca soluție standard pentru curba standard.
C. Determinarea antocianilor totali. Pentru a cuantifica totalul antoci anilor, Paronetto a
aplicat metoda spec trofotometrică . Metoda se bazează pe determinarea antocia nilor prin
utilizarea variației pH -ului sistemului. Pentru curba de calibrare, am folosit malvidin -3-
glucozid. Absorbanța a fost citită la 525 nm. Absorbanța ci tită este interpolată pe o
curbă de calibrare [67].
D. Determinarea pirocate chinei . Conținutul de pirocate chină a fost estimat prin metoda
Swai n and Hills . Metoda se bazează pe proprietatea fenolică de a da reacții de
condensare cu grupe carbonilice, în me diu de pH acid. Pentru determinare, aldehida
vanilinică (vanilină) a fost utilizată pentru calibrare, ca un compus carbonil care a
reacționat cu grupări de benzen "activate" de catene, eliberând un cromofor roșu care
este citit la 500 nm. Pentru curba de c alibrare, D -pirocatechina a fost considerat
substanță standard.
E. Metode chimice de determinare a activității antioxidante . Pentru studiul activității
antioxidante a compușilor polifenolici prezenți în probele de vin roșu am utilizat
metodele chimice, me todele FRAP și DPPH. În general, activitatea antioxida ntă este
dată în milimol Trolox (acid 6 -hidroxi 2,5,7,8 -tetrametilcroman -2-carboxilic), care este
un analog hidrosolubil de vitamină E milimol, acid ascorbic sa u quercitină . În cazul
vinurilor, unii aut ori au exprimat activitatea antioxidantă în echivalenți ai acidu lui galic .
E.1. Metoda FRAP (Reducere ferică / Putere antioxidantă) [68]. Această metodă
măsoară puterea de reducere a probei cu complexul tripiridiltriazi nă (TPTZ) . FRAP se
bazează pe capaci tatea de reducere a Fe (III) la Fe (II), prin reacția:
Fe (III) -TPTZ +1e- →Fe (II) -TPTZ
incolor albastru

Cu ajutorul unui donor de electroni (antioxidant) se formează un compus de culoare
albastră, care prezintă o absorbție maximă la 593 nm.
E.2. Metoda DPPH . Metoda de sechestrare a radicalului DPPH, descrisă de Brand –
Williams , se bazează pe generarea de radicali liberi, pornind d e la o soluție metanolică
de 2, 2 difenil -1 picril -hidrazil (DPPH), care prezintă un maxim de absorbție la 517 nm.
În prezența unui agent antioxidant sau a unui radical, absorbția dispare. Reacțiile
chimice care au loc sunt următoarele:
DPPH • + AH → DPPH -H + A DPPH • + R • → DPPH -R
Vinurile roșii pentru care a fost studiata activitatea antioxidantă prin utilizarea acestei
metode, au fost diluate 1:50 cu apă distilata. Cu valorile obținute măsurate se calculează
diferența de absorbție ΔA:
ΔA = A 0 – (Af – Ablanc)
Curba de etalonare este dată de ecuația:
μg Trolox = 8,6166 (A 0 -Af) -0,095
Rezultatul este dat în μg proba Trolox/ ml.
F. Metode statistice utilizate . Analiza statistică a datelor experimentale reprezintă o
parte fundamentală a activității de cercetare și permite simplificarea rezultatelor
obținute, facilitarea înțelegerii și interpretarea în c ontinuare a rezultatelor obținute.
Acest lucru a fost făcut utilizând software -ul Statgraphics 4.0 pentru Windows. Pre –
tratarea statistică a fost efectuată prin analiza Box and Whisker Plot, pentru a identifica
datele anormale care sunt departe de valoarea medie pentru fiecare parametru analizat.
Programul statistic folosit permite difere nțierea între punctele posibil normale și cele
anormale. Regresia a fost utilizată ca metodă statistică în prelucrarea datelor
experimentale.
V.2. Rezultate și discuții

Pentru a măsura totalul polifenolilor, am utilizat reactivul Folin -Ciocâlteu care
reacționează cu substanțe reducătoare în prezența carbonatului de sodiu 75%.
Intensitatea culorii a fost citită la 750 nm. Pentru vinurile roșii, diluția operată a fost de

1:10. Ecuația curbei de calibrare Y = 2.1422 · 10-3 · X +0.0188; r2 = 0.9997 ne permite
să calculam cantitățile de polifenoli totali (X) din măsurătorile de absorbție (Y).
Rezultatele măsurătorilor de absorbție au fost prelucrate prin metoda regresiei.
Rezult atele obținute din po lifenolii totali au fost contrare față de rezultatele capacității
antioxidante obținute prin metodele FRAP și DPPH. Corelația dintre parametrii
analiz ați este prezen tată în tabelul 2 . Conform conținutului estimat de pirocatechina s -au
folosit două curbe de calibrare, dintre care unul arătând o concentrație de catechina de
0-500 mg / l, care este:
Y = 2,9353.10 -3 = X + 0.1484, r2 = 0.9913
Din această ecuație, a fost calculată concen trația de catechina, C catechină :
Ccatechina = (Abs -0.1484)/ 2.9353*10 -3 mg/L
În cazul v alorilor mai mici până la 50 mg/ L, se utilizează o curbă de etalonare:
Y = 6.3714 · 10-3 · X + 1.5908 · 10-3 r2 = 0.9991
Rezultatele obțin ute de catechin ă au fost contrare față de rezultatele capacității
antioxidante, ob ținute prin metodele FRAP și DPPH. Corelația dintre parametrii
analizați este prezentată ș i în tabe lul 2. Totalul antocia nilor se determină utilizând curba
de etalonare: Y = 4.668.10-3 X, r2 = 0.9988

Tabelul 2 . Corelații (r2) între variabilele studiate pe probele de vin

TP
(Folin)
TP
(Mazza)
Antocianina
(Paronetto)
Antocianina
(Mazza)
Pirocate –
china Antiox
activ.
DPPH Antiox
activ.
FRAP

TP
(Mazza) 0,974 1,000
Antocieni
Paronetto 0,546 0,636 1,000
Antocieni
(Mazza) 0,594 0,705 0,937 1,000
Pirocate –
china 0,966 0,945
0,481 0,521 1,000
Antiox.
activ.
DPPH ● 0,919 0,914 0,488 0,566 0,914 1,000
Antiox.
activ.
FRAP 0,959 0,965 0,569 0,615 0,956 0,934 1,000
TP – polifenoli totali
Rezultatele antocia nilor totali, obținuți prin metode Pa ronetto și Mazza, au fost
comparate cu capacitatea antioxidantă a vinurilor roșii. Coeficientul de corelați e este
prezentat în tabelul 2. In general, metodele de determinare a activității antioxidante se
bazează pe adăugarea artificială a unui radical libe r în probă și după aceea concentrația
acestuia din urmă se măsoară în funcție de re acția cu compușii antioxidanți prezen ți în
eșantion, compușii polifenolici în cazul nostru [69] . Măsurarea spectrofotometrică este
proporțională cu capacitatea de reducere a eșantionului. În metoda FRAP, absorbția
probelor este citită la 593 nm, utilizând tamponul acetat drept semifabricat. Cinetica de
reacție a fost studiată având în vedere că, după 30 de minute, s -a ajuns la finalitatea
reacției. Pentru fiecare probă se fac patru replici. Calculul puterii de reducere se face
după cum urmează: se obține o curbă de calibrare pornind de la reducerea soluțiilor de
sulfat de cupru (II). Ecuația curbei de calibrare este:

Y = 0.6445X +0.0189, unde r2 = 0.9942
Concentrația în sulf at de cupru este reprezentată pe abscisă și pe ordonată – diferența de
absorbție
Δ A = A Eșantion –A blank
Miezul este reprezentat de reactivul TPTZ fără eșantion.
Formula de calcul este:
mMCu (II) = (ΔA – 0,0189) / 0,6445.
În metoda DPPH, măsurătorile d e absorbție s -au efectuat la 517 nm, deoarece
reactivul utilizat, radicalul 2,2 difenilpicril -hidrazil prezintă un maxim de a bsorbție la
517 nm. Rezultatele obținute pentru toate vinurile au fost comparate prin metoda
regresiei și au fost corelate cu co nținutul de polifenoli, catech ină și antociani din vinuri
(Tabelul 2 ). Metoda statistică și, mai ales, metoda regresiei au fost extrem de utile în
aprecierea corelației dintre parametrii studiați și concluziile privind conținutul total de
polifenoli, antocian i, catech ină ai vinurile studiate, precum și activitatea antioxi dantă
determinată de cele două metode analizate. Găsirea unui coeficient de regresie bun (r2)
ne poate furniza informații despre relația dintre variabile. Conform valorii coeficientului
de reg resie, se pot trage concluzii asupra relației dintre variabile.
0,5 ≤ r2 ≤ 0,75 există conexiune de intensitate medie;
0,75 ≤ r2 ≤ 0,95 există o conexiune bună;
0.95 ≤ r2 ≤1 există o conexiune funcțională.
Eșantionul de vin a fost relevant, iar datele anormale incidentale au fost eliminate din
matricea de corelare.

CAPITOLUL VI
METODE DE TESTARE A ACTIVITATII ANTIOXIDANTE
VI.1. Introducere

Importanța oxidării în organism și în produsele alimentare a fost recunoscută
peste tot. Metabolismul oxi dant este esențial pentru supravie țuirea celulelor. Un efect
secundar al acestei dependențe este producția de radicali liberi și a altor specii reactive
de oxigen care provoacă modificări oxidative. Există dovezi tot mai mari pentru
implicarea unor astfel de specii într -o varietate de sisteme de reglare in vivo. Atunci
când se formează un exces de radicali liberi, acestia pot copleși enzimele protectoare,
cum ar fi superoxidul de dismutază, catalază și peroxidază și provoacă distrugeri și
efecte celulare le tale (de exemplu, apoptoza) prin membrana de oxidare a lipidelor ,
proteine lor celulare, ADN -ul și enzime le, închizând astfel respirație celulară. Mai mult,
speciile reactive de oxigen par a influența căile de semnalizare celulare în moduri care
sunt dezechilibrate. Oxidarea poate afecta, de asemenea, produsele alimentare, acolo
unde este una dintre cauzele majore de di strugere chimică, care rezultă în deteriorarea
calității nutriționale, a culorii, aromei, texturii și siguranței alimentelor. Se estimează că
jumătate din culturile de fru cte și legume din lume se pierd din cauza reacțiilor de
deteriorare de dupa recoltare. Mecanismele de apărare împotri va efectelor de oxidare
excesiv ă sunt asigurate de acțiunea diverș ilor antioxidan ți.
Metodele de evaluare a comportamentului antioxidant se încadrează în două
categorii largi care reflectă concentrarea asupra activității în alimente sau bioactivitatea
la om. În cazul sistemelor alimentare est e nevoie de evaluarea eficacita ții unui
antioxidant (antioxidanți) în furnizarea protecției alimentelor împotriva alterării
oxidative. O subcategorie implică măsurarea activității în alimente, în special pentru
fructe, legume și băuturi, dar cu scopul de a prezice sarcinile dietetice și activitatea in
vivo. Stresul oxidativ la oamenii apare din cauza unui dezechilibru al stării antioxidante
(specii reactive de oxigen contra mecanismelor de apărare și reparare). Printre
protecțiile endogene se numără enzimele cum ar fi superoxidul de dismutază, cata lază și
glutation peroxidază , plus vitamina E, acidul uric și albuminele serice . O deosebită

importan ță față de sistemele bazate pe alimente este absența unui substrat unic în multe
cazuri in vivo.
Această procedura examinează diferitele metode de mă surare a activita ții
antioxidante , în special în legătură cu oxidarea lipidelor. Acest lucru ar trebui să se
distingă de procesul asociat măsu ărrii concentrației unui antioxidant care nu este luat în
considerare aici. Cu toate acestea, ar trebui să fie recunoscut faptul că cele două sunt
înrudite, deoarece antioxidanții prezintă în general efecte pro oxidante la o concentrație
mai mare. Termenul "activitate" la care se aplică antioxidanții au nevoie de clarificare,
deoarece pot avea o varietate de sensuri. Aspectele relevante includ: interv enția
mecanică, de exemplu, agentul de curățare al radicalilor liberi, descompunerea
catalitică; rata de absor bție, de exemplu, aproape difuz ă sau controlată; mediu sau
selectivitatea de substrat (de exemplu, suprafață sau fază lipidică); e ficacitatea
conc entrației (moli de radicali liberi capturați pe mol de antioxidant); sinergică efect
pentru alți antioxidanți.
Cu toate acestea, termenul pare să fie aplicat în m od liber pentru identificarea
"activitatii" ca cea măsurată prin una sau mai multe metode comu ne sau teste standard,
cum a r fi cele enumerate în Tabelul 3 . În multe cazuri, nici implicarea intr -un substrat
specific, nici un aditiv specific, ci extractele pot fi examinate pentru a identifica ceea ce
prezintă activitate antioxidantă în conformitate c u metoda sau metodele de testare
utilizate. De exemplu, se poate utiliza screening TLC 10,11 pentru identificarea
componentelor din extracte care prezintă o astfel de activitate. Este, de asemenea posibil
să se utilizeze metode de screening pentru a identi fica clasa de antioxidant (de exemplu,
fenolic) sau chiar acțiunea sa [70] prin utilizarea agenților de pulverizare (de exemplu,
agentul de complexare, inhibitor de radicali, hidroxid de descompunere a
hidroperoxidului). În orice caz, astfel de "activități " au nevoie să fie susținute de testare
în substratul și condițiile actuale de interes. Acest lucru este deosebit de important
pentru testarea in vivo unde absorbția, transformările metabolice, excreția, prezența
enzimelor competitive și a anti oxidanților în plus față de pro oxidanții pot afecta profund
activitatea in vivo a testului antioxidanți lor.
În cazul antioxidanților naturali, acestea pot fi multifuncționale. Mecanismul
care este operativ sau dominant în situația particulară depinde de condiții și t otuși
aceasta va afecta cinetica și, prin urmare, activitatea antioxidantă. Aceste diferențe și în
special v ariația procedurilor analitice țin cont de rezultatele incoerente care au fost
raportate pentru un număr de antioxidanți recunoscuți.

O distincție importantă poate fi făcută între cea de termen scurt și protec ție
antioxidantă pe termen lung. Acest lucru este legat de reacțiile c inetice și rata la care un
antioxidant reacționează cu radicalul specific și cât de repede reacționează
antioxidantul. De e xemplu, dispar iția radicalului DPPH (Tabelul 3 ) a fost urmata de o
ecuatie dublă exponențială în prezența uleiurilor comestibile și a fractiunilor de ulei [71]
care sugera ză prezența unui grup de antioxidan ți rapizi și len ți.
După o scurtă prezentare a pr oceselor oxidative și a mecanismelor de acțiune
antioxidantă , un trecut istoric al activita ții antioxidante este furnizat. Relația dintre
testele concepute pentru sistemele alimentare și extinderea acestora la sistemele
fiziolog ice este prezentat ă. Acestea pot implica teste in vitro sau in vivo și în cazul
acesta din urmă pot fi implicate tehnici fie invazive, fie neinvazive. Metodele in vitro
oferă o indicație utilă activităților antioxidante, dar datele obținute prin aceste metode
sunt dificil de aplica t la sistemele biologice. Pe de altă parte, măsurătorile in vivo sunt
dificile din cauza problemelor legate de absorbția celulară a antioxidanților și a
proceselor de transport. Tehnici non -invazive, cum ar fi rezonanța magnetică nucleară
(RMN) pot fi uti le, dar necesită concentrații antioxidante mari. Literatu ra extensivă
privind antioxidan ții împiedica un tratament exhaustiv si mai degraba selectiv.
Exemple de teste diferite au fost alese pentru a ilustra diverse idei.

VI.2. Procese de oxidare a lip idelor

Un număr de fen omene chimice și fizice pot ini ția oxidarea care se desfășoară
în mod continuu în prezența unui substrat adecvat până ce un mecanism de apărare
blocheaza totul. Substanțele vizate includ oxigenul, grasimile polinesaturate,
fosfolipid ele, colesterolul și ADN -ul. Oxidarea lipidică este importanta în deteriorarea
alimentelor și modificarea oxidantă a acestor lipoproteine cu de nsitate scăzută (LDL)
(Tabelul 3 ). Oxidarea lipidelor continuă prin intermediul a trei căi diferite: (1) reacți a in
lant a radicalilor liber non -enzimatici, (2) non -enzimatică, foto -oxidarea non -radicală și
(3) reacție enzimatică. Un exemplu d e reactie (2) este oxidarea stoe chiometrică a
acidului oleic prin oxigenul singur pentru a produce doi hidroperoxizi a lilici prin
adăugare de oxigen la fiecare capăt al legăturii duble.

Tabelul 3 : Teste standard cu care se masoară identificarea activitații antioxidant e
TEST MASURI UNITATI

Valoare peroxid activ Peroxizi și hidroperoxizi mequiv. Kg -1of oxigen \
Conju garea dienelor 1,4-diene produse de etapele timpurii în
autooxidarea lipidelor Absorbanță / unitate de
masă Mg kg -1 echivalent
de acid linoleic mg kg -1
(ppm g / g) sub formă de
malondialdehidă

Acid tiobarbituric
substanțe reactive
(TBARS) Aciz ii tiobarbiturici ai malondialdehidei
absorbind la 532 -535 nm

Testul Kreis Derivații de floroglucinol ai malondialdehidei
și alte aldehide care se absoarb la 546 nm Culoare roșie pe scară
Lovibond (empirică); mg
kg-1 (ppm
g / g) sub formă de
malondialdehidă

Valoarea de anisidină Aldehide (în principal alchenale) de 100 de ori
absorbția corectată într -o
celul ă de 1 cm la 350 nm
conținând 1 g de ulei sau
grăsime per 100 ml
solventul izooctanacetic
Formarea hexanului,
formarea pentanului,
formarea de hexan, etc. Produsul final de oxidare specific format mg kg21 de produs format
Testul ABTS4 + Absorbția cationului radical în mediu apos
la 734 ° C nm sau altă lungime de undă
adecvată Timp de inhibare pentru
aparitia cationilor radicali
sub conditiile specifice
sau rata de diminuare
odata formata
Total capcane radicale
parametru antioxidant
(CAPCANĂ)
Analiza fitoceritinei Intensitatea fluorescenței Inhibarea degradării
fluorescenței în condiții
specificate de autoxidare
Rezonanța spinul ui electronilor
(ESR) test de capcana spin Intensitatea / ratele de modificare a
concentrației de antioxidanți sau de
radicalii derivați de spin -capcani mg L21 de specii
(conform standardului
stabil, cum ar fi fidi –
terț-butil nitroxid)
TG / DTA Timpul necesar pentru dezvoltarea
autoxidării în a atmosferă dinamică de
oxigen la o temperatură specificată DT (° C), schimbarea de
masa (mg)

Oxigenul singur este produs de sensibilizatori cum ar fi mi oglobina sau
clorofila. Calea ( 3) implică acțiunea lipoxigenazelor asupra diferitelor substraturi.
Calea 1 este ruta clasică a radicalilor liberi care duce la inițierea unor reacții cu
lanț distructiv progresiv rapid. Caracteristicile esențiale ale oxidării prin intermediul
unui lan ț de mediere a radicalilor liberi sunt inițierea, propagarea, ramificarea și etapele
de încheiere. Procesul poate fi inițiat de acțiunea agenților externi, cum ar fi căldură,
radiațiile luminoase sau ionizante sau prin inițierea chimică care implică ioni meta lici
sau metaloproteine [72].

Inițiere: LH + R• → L• + RH

unde LH reprezintă substratul molecular, de exemplu, o lipidă, cu R• ca radical inițiator
de oxidare. Oxidarea din lipide generează un radical alil puternic reactiv (L•) care poate
reacționează rapid cu oxigenul pentru a forma un radical peroxidic lipidic (LOO•)
Propagarea: L• + O2→ LOO•
LOO• + LH→ L• + LOOH

Radicalii peroxil sunt purtătorii de lanț ai reacției care poate oxida în
continuare lipidele, producând hidroperoxi zi de lipide (LOOH), care, la rândul său, se
descompun într -o gamă largă de compuși, incluzând alcooli, aldehide, formiat de alchil,
cetone și hidrocarburi și radicali incluzând radicalul alcoxil (LO•).

Succesiune: LOOH→ LO• + HO•
2LOOH→ LOO• + LO• + H2O
Defalcarea hidroperoxizilor lipidici implică adesea tranziția catalizei de ioni metalici, în
reacții analoge cu cele cu peroxid de hidrogen, producând peroxid de lipide și radicali
de alcoxil lipidic.

LOOH + Mn + + H +→ LO● + M (n + 1) + + H2O
LOOH + M (n + 1) + + OH¯ → LOO● + Mn + + H2O
Reacțiile de terminare im plică combinarea radicalilor pentru a forma produse non –
radicale.
Terminare: LO● + LO●→
LOO● + LOO●→ produse non -radicale
LO● + LOO●→
Există diferențe e vidente între reacțiile apărute in vivo și în alimentele care pot
fi expuse la creșterea temperaturilor în timpul depozitării și /sau prelucrării. De exemplu,
hidroperoxizii se desco mpun ușor și spontan la 160 ° C, iar concentrația radicalilor
perox i poate deveni relativ ridicată în astfel de cond iții, ducând astfel la formarea de
polimeri. În mod similar, mecanismul de reacție este diferit pentru lipide le emulsifi ate și
în vrac. Gama de efecte ale lipidelor radicalilor liberi presupune doar câț iva agresori, în
timp ce acțiunea peroxidul ui de hidrogen radi cal este de câțiva nanometri și peroxidul
de hidrogen poate trece liber de membranele biologice. Cu toate acestea, există trăsături
esențiale ale procesului care sunt similar e în toate cazurile. Măsurar ea activității
antioxidante din anumite componente in viv o necesită definirea tipului de formare a
radicalilor liberi. Pot exista cel puțin patru tipuri diferite identificate drept : fier liber și
reacția Fenton, leziuni mitocondriale și reacții d e pori care conduc la apoptoză;
formarea radicalilor liberi induși; si formarea d e peroxid de hidrogen in vivo [73].

VI.3. Antioxidanți

Un antioxidant poate fi definit ca "orice substanță care atunci când este prezent
in concentrații scă zute, în comparație cu cele ale substrat ului oxidabil, întârzie în mod
semnificativ sau inhibă oxidarea din acest substrat". Pentru confort, antioxidan ții au fost
în mod tradițional împărțită în două clase, primari sau cei de rupere de lanț, și
antioxidanți secundari sau prev entivi . Antioxidanții secund ari sau preventivi sunt
compuși care întârzie rata de oxidare. Acest lucru se poate realiza în o serie de metode,

inclusiv îndepărta rea substratului sau oxigen ului singur . Antioxidanții primari , AH,
atunci când sunt prezenți în cantități mici, pot întârzia sau inhiba etapa de inițiere prin
reacția cu un radical lipidic sau prin inh ibarea etapei de propagare prin reacția cu
radicali peroxil sau alcoxil [74]:

L● + AH→ LH + A●
LOO● + AH→ LOOH + A●
LO● + AH→ LOH + A●
Radicalul ant ioxidant liber poate interfera în continuare cu lanțul de propagare al
reacții lor prin formarea compușilor antioxidanți peroxizi ci:
A● + LOO●→ LOOA
A● + LO●→ LOA
Energia de activare a reacțiilor de mai sus crește cu creșterea energiei de
disociere a legăt urilor A -H și L -H. Prin urmare, eficiența antioxidantul ui crește odată cu
scăderea A -H a forței de aderență.
Lanțurile anti oxidante po t apărea în mod natural sau pot să fie produ și sintetic
ca în cazul BHT, BHA, TBHQ și galatului . Antioxidanții sintetici s unt utilizați pe scară
largă în industria alimentară și sunt inclusi în dieta umană. U tilizarea antioxidanților
naturali a fost promovată din cauza preocupărilor privind siguranța antioxidanților
sintetici, cu alternative naturale (de exemplu, biofenoli de plante) care au activitate
antioxidantă si milară sau chiar mai mare decât cea a antioxidanților sintetici.

VI.4. Măsurarea activității antioxidante

Activitatea antioxidantă nu poate fi măsur ată direct, ci mai degrabă prin
efectele antioxid antului în contr olul extinderii procesului de oxidare. Metodele prezintă
o diversitate extremă. Unele met ode implică o etapă de oxidare distinctă, urmată de
măsurarea rezultatul ui fiind urmat, de exemplu , de oxidarea acidului linoleic prin
determinarea conjugării dienelor . În alte cazuri, acolo unde nu există nicio distincție
clară între diferitele etape ale procedu rii.

Caracteristicile unei oxidări sunt substrat ul, oxidant ul și un produs inițiator,
intermediar și produsele finale. M ăsurare a oricarora dintre acestea poa te fi utilizat ă
pentru evaluarea activității antioxidante. De exemplu, în monitorizarea activității
antioxi dante într -un produs alimentar, măsurătorile potențiale includ valoarea PV,
valoarea acidului tiobarbituric , valoarea iodului, conținutul de acizi grași liberi,
conținutul de polimeri, vascozitatea, absorbție la 232 și 268 nm, cul oare, compoziție de
acizi grași și raportul acizilor grași nesaturați la cei saturați ( de exemplu, C18: 2/ C16:
0). Activitatea fiziol ogică poate fi evaluată prin măsurători in vi tro, cum ar fi
susceptibilitatea LDL izolată la oxidare. Cu toat e acestea, abordarea implică măsurători
in vivo a produselor de oxi dare LDL cum ar fi acizii gra și hidroxili sau oxiz iterolii sau
indicatori indirecți ai oxidării lipidelor (de exemplu, F -2-izoprostane) . Alternativ,
răspunsul imunologic la produsele de oxidare a lipidelor antigenice poate fi măsurat.
În studiul activit ății antioxidante, sursa ROS și substratul țintă trebuie să fie
întotdeauna luate în co nsiderare. Un antioxidant poate proteja lipidele împotriva
daunelor o xidative în timp ce accelerează afecta rea altor molecule biologice [75].
Astfel, Aruoma et al . a folosit mai multe măsuri de activitate antioxi dantă și a
reprezentat o serie de întrebări care servesc drept ghid în evaluarea eficacitatii
antioxidantului .
Majoritatea procedurilor de testare utilizează oxi darea accelerată care implică
folosirea unui inițiator pentru a manipula una sau mai multe variabile în sistemul de
testare. Inițiatorii includ creșterea temper aturii și presiune a parțială de oxigen, adaos de
catalizatori met alici de tranziție, expunere la lumină pentru a promova oxidarea
fotosensibi lizată prin oxigenul singur , scuturarea variabilă pentru a spori contactul
reactantului și surse de radicali liberi. Cu toate acestea , mecanisme le de oxidare se pot
schimba cand temperaturile sunt ridicate în timp ce efectele substratului și tehnica
analitic ă influențează de asemenea rezultatele. Activitatea unui antioxidant pe β-caroten
nu va fi la fel ca in cazul uleiului de legume. Efectul substratului poate fi atribuit
influenței puternice a tipului de nesaturare și a gradului de sistem lipidic privind cinetica
și mecanismul acțiunii antioxidantului . Accelerarea fotosens ibilizată subestimează
efectele de rupere a l anțului antioxida țnilor.
Ionii metalici, cum ar fi cuprul și f ierul, sunt cei mai frecven ți inițiatori atât în
sistemele alimentare, cât și în cele biologice. Acești ioni catalizează inițierea și
descompunerea hidroperoxidului rezultând un nivel ridicat de produse de desc ompunere

volatile. Eficacitatea antioxidantă într -un test in vitro de oxidare LDL62 a variat foarte
mult in functie de nivel ul ionilor de cupru utilizați drept catalizatori.
Utilizarea unui subst rat este considerată esențială și astfel testele de genul
testului ABTS care, în gener al, nu include un substrat sunt artificiale și nu imită în mod
adecvat proces ele din produsele alimentare și sisteme le biologice. După ce substratul
este oxid at sub condiții standard, fie extinderea, fie rata de oxidare ( ca punct f inal) se
măsoară prin metode chimic e, instrumentale sau senzoriale . Prin urmare, trăsăturile
esențiale ale oricărui test sunt inițiatorul de oxidare, un substrat adecvat și o măsură
adecvată a punctului final. În c azuri rare, a fost un inițiator omis și cu rățarea
hidroperoxizilor endogeni inainte forma ți a fost studiată. Combinațiile de inițiere,
substrat ul și punct ul final care au f ost utilizate sunt numeroase și chiar și cu aceiași
reactivi, exist ă mai multe strategii analitice posibil e. Acestea includ (1 ) măs urarea la un
punct de timp fix, (2) măsurarea ratei de reacție, (3) măsurarea fazelor de întârziere și
(4) măsurarea ratei integrate. În sistemele 1 și 2, reactivii sunt amestecați și punctul
final este măsurat după o perioadă predeterminată de timp la 1, în timp ce la 2, rata de
reacția este monitorizată. În ambele c azuri, prezența antioxidantului în amestecul de
reacție re duce schimbarea parametrului de la punctul final . În sistemul 3, lungimea
timpului de î ntârziere până la punctul final este măsur at; probe le cu a ctivitate
antioxidantă mai mare suprimă schimbarea intr-un timp mai lung decât cele cu activitate
mai redusă. Sistemul 4 implică integrarea punctului final versus timpul curbă și este
utilizat acolo unde cin etica de reacție nu este intr -o ordine simplă .
Substraturile lipidice au inclus diverse uleiuri și grăsimi, acid linoleic, esteri
metilici ai acizilor grași și LDL. În caz ul uleiurilor/ grăsimilor , materialele mai puțin
blânde su nt de obicei folosite de preferință numai după rafinare și d ezodorizare. ɣ-
tocoferol la o concentrație de 11 µg g-1 a scăzut formarea hidroperoxid ului și a
produse lor secundare la 46 și, re spectiv, 39%. Acest lucru are implicații importante de
vreme ce potențialul de sinergism cu materiale reziduale într -un ulei ra finat ex istă
întotdeauna și a condus la utilizarea substraturilor model. Au fost diferit descrise
substraturile model incluzând linoleatul de metil, acidul linoleic și acidul linoleic metil
linoleat în ulei de silicon. Citronelal a fost recent utilizat ca substrat în tr-un test
accelerat bazat pe măsurarea produsului de degradare prin cromatografie în fază
gazoasă. Cu toate acestea, substraturile model nu sunt fără probleme, nu în ultimul rând,
duplicarea condițiilor reale de utilizare. LDL reprezintă un sub strat evident și multe
teste in vitro au fost descrise exploatâ nd diferite puncte finale inclusiv măsurarea

diene lor conjugate și a hexanalului. În ciuda utilizării extensive, LDL este un s ubstrat
foarte dubios, deoarece nivelul vitaminei E în LDL poat e fi un factor important pentru
protecția peroxidării acidului gras nesaturat în LDL. Atenția este necesară atunci când
se extrag din testele in vitro componentele alimentare sau, în special, e xtractele
necorespunzătoare, la situația umană in vivo, deoarece ac tivitatea antioxidantă este un
complex de interacț iuni al mai multor factori lega ți. Mai mult decât atât, există distincția
între activitatea antioxidantă și capacitatea antioxidanta (adică suma tuturor activitățilo r
antioxidante ale unui amestec conținând mulți antioxidanți, de exemplu, se rul) pe care
aceasta le conferă plasma sanguină și efectul asupra susceptibilității oxidative, pentru de
exemplu, LDL. În acest context, morfologia LDL este importantă și pot exista difere nțe
în activitatea antioxidantă, de multe ori să fie raționalizată în termeni de coeficienți de
partiție și accesibilitatea la radicalii peroxil lipidici. Un factor considerabil este
cantitatea de dovezi care se acumule ază pentru a sugera sinergismul între sistemele
apoase și lipofile, ac esta este factorul important (și această schimbare de atitud ine se
reflectă într -o abordare a dietei mediteraneene ). Din acest motiv, în cazul în care
interesul este în bioactivitatea r elativă a unui test antioxidant, sistemele ar trebui să fie
realizate atât în faza apoasă cât și în cea lipofilă. Activitatea antioxidantă în faza l ipofilă
este un răspuns compozit la comportamentul de partiționare și ratele de reacție cu
speciile radicale relevante. Cinetica diverse lor reacții trebuie să fie considerata, d e
vreme ce majoritatea radicalilor sunt foarte reactivi și pot difuza doar pe foarte scur te
distanțe. Datele privind faza lipofilă derivă din studiile efectuate pe acizi grași,
lipozomi, care au fost folosiți extensiv ca modele in vitro celulare pentru inv estigarea
activității antioxidante și în special LDL. Mai multe studii au examinat relațiile dintre
structura de activitate și Rice-Evans et al. a prezentat o discuție detaliată a efectelor de
activitate de structură în ambele faze lipofila și apoasa , aces tea din urmă fiind bazate pe
măsurători din TEAC .
Este nevoie de precauție în interpr etarea datelor și pentru a măsura un număr
de parametri de oxidare pentru a evalua activitatea antioxidantă mai bună. Activitatea
carnosinei, a unei dipeptide, care este u n antioxidant util în sistemele alimentare, a fost
examinată cu atenție, cu diferențe mari în rezultatele obținute în sisteme model . În baza
eliberări i MDA într -un sistem lipozomic, carnosina a prezentat o bună activitate
antioxidantă în timpul oxidarii me tilenului albastru fotosensibilizat, activitate
antioxidantă slabă în timpul oxidării sensibilizate de r iboflavină 5A -fosfat și chiar a
avut un efect prooxidant în timpul oxidări i cu catalizator de cupru (II). E fectul

antioxidant în lipozomi a scăzut în con formitate cu catalizator ul în următoarea ordine:
cupru/ascorbat, fier/ ascorbat, peroxid ul de hidrogen a activat hemoglobina, riboflavina
și lipoxigenaza fotoactivate . În cazul extractelor de rozmarin, eficiența antioxidantă a
fost influențată în mod semni ficativ de tipul de sistem testat (uleiuri voluminoase față de
emulsiile ulei în apă), de substraturile de ulei, metodele util izate pentru a urma oxidarea
și concentrațiile de compuși de testat. Etanol ul a expus activitatea antiox idantă în
anumite circumst anțe și aceasta trebuie să fie luată în considerare la măsurarea
activității antioxidante a alcoolu lui din băuturi sau când trebu ie adăugați compuși
lipofilici ca soluții le etanol ice la un substrat de testare [77].
Rezultatele sunt exprimate într -o varieta te de moduri care fac comparațiile
dificile.

VI.4.1 Exprimarea rezultatelor
Metodele de exprimare a activității antioxidante par a fi la fel de variate
precum metodele de măsurare [78]. O practică de măsura re a activita ții trebuie să arate
cel puțin două lucruri : dacă substanța testată are un efect detecta bil antioxidant sau
prooxidant în condițiile de testare; și o comparație a raportului cantitativ – efect sau efect
probabil, concentr ațiilor specificate la diferitele materiale de testare pe substrat.
Cele mai multe metode pentru activitățile de rap ortare se bazează pe măsurători
folosind proceduri comune de test are, cum ar fi cele sintetizate în tabelul 4 . Acestea, la
rândul lor, implică măsurarea directă sau indirectă a ratei sau extinderii: (a) degradăr ii
substratului sau a sondei substanței sau a consumului d e oxigen; (b) formarea oxidării
produse lor; sau (c) formarea sau dezintegrarea radicalilor liberi ai probei.
În activitățile antioxidante (a) ș i (b), indiferent de mecanism, este demonstrat
că un ef ect inhibitor asupra extinderii sau ratei de consum de reactanți sau f ormarea de
produse. Măsurile calitative utilizate în testel e de screening vor fi raportate drept
"prezintă activitate antioxidantă", "prezin tă activi tate pro oxidantă" sau "Nu prezintă
nicio activitate" în conformitate cu procedura de testare. Pentru măsuri cantitative,
majoritatea autor ilor raportează activităț ile drept rezultate comparative , de exemplu,
valorile peroxidul ui, testele TBARS sau absorbția crește la 230 -235 nm după o perioa dă
de timp fixă, de exemplu, timpii de inducție. Cu toate acestea, se par e că nu există
unități standard pentru raportarea unei astfel de activități (e ficiență, eficacitate, analiză,
capacitate, acțiune etc.) independent de procedura de testare.

Activitate a antioxidantă (AA) este, b ineînțeles, o funcție a multor parametri:
AA = f (timp s au rată; t emperatură; substrat; concentra ția de antioxidant;
concentrația de alte substanțe, de exemplu, oxigen, peroxizi sau alți
antioxidanți/ prooxidanți etc .; partiționa rea comportament ului)
Pentru un set fix de condiții AA ar putea fi definit, "independent" din metoda de testare,
după cum urmează:

AA = ( t – tREF) / [AH] tREF

unde t = timpul pentru substratul tratat pentr u a ajunge la un nivel setat de oxidarea în
confo rmitate cu metoda de te stare
tREF = timpul pentru tratamentul netratat sau substrat ul de referință pentru a ajunge la
același nivel de oxidare și
[AH] = concentrația de antioxidanți în unități adecvate.
Consistent cu această definiție simplă, AA ar fi zero dacă tREF = t și ar deveni
mai mare dacă t c rește. De asemenea, AA nu ar fi dacă este direct pr oporțională cu
[AH]. Mai mult, un rezultatul negativ ar indica o a cțiune pro oxidantă. Asemănător pot fi
scrise expresii care implică rate de oxidare. O măsură m ai semnificativă în context ar
putea fi activitatea antioxidant a relativ a (RAA). Aceasta poate fi exprimată ca :
RAA 1 = AA 1 / AA REF
unde AA 1 și AA REF sunt act ivitățile testului și referința antioxidanți lor la aceeași
concentrație molară. Acesta este rearanj at la:
AA 1 = RAA 1 x AA REF
care dă echivalența activității un ei substanțe de testat relative la substanța de referinț ă, o
metodă comună de comparare a activita ților.
Avantajul acestei definiții este acel a că metodele comune de testare cum a r fi
cele enumer ate în Tabelul 3 , pot fi utilizate pen tru calcularea activităților în termeni
standard de concentr are bazați pe metodele generale descrise în Tabelul 4 .
A treia metodă de măsurare a activității antioxidante (c) presupune că oxidarea
este inhibat ă în mare p arte prin capturarea, inițierea sau propagarea r adicalilor liberi în
autooxidarea ei, prin urmare, să se concentreze asupra monit orizării capacității
aditivilor/ extractelor pentru captarea sau inhibarea radicală a formării radicalilor, mai
degrabă decât pe monitorizarea oxidării reale în sine. Ele formează baza noilor metode
de testare, cum ar fi radicalul ABTS/ TEAC, DPPH și teste le de fitoeritrină .

VI.5. Proceduri individuale

Se folosesc diferite proceduri chim ice și fizico -chimice pentru monitorizarea
procesele de oxidar e. O abordare este de a examina direct producția de radicali liberi și
inhibarea lor de către antioxidan ți.

Tabelul 4 : Metode de exprimare a rezultatelor testelor de activitate antioxidantă
Metoda Rezultate
Timpul de inducție h,d
Timpul să ajungeți la un nivel de
oxidare stabilit (perioada de pre –
inducție) H,d
Rata de oxidare (perioada de pre –
inducție) Mol kg -1 hr-1, gl-1 d-1
Concentrație pentru a produce un
echivalent efect pentru antioxidant ul de
referință ( perioada de preinducție )
Mol kg -1, gl-1
Concentrarea grupului funcțional după
setarea perioadei de timp Mequiv. kg -1
Concentrația produsului de oxidare
după setarea perioadei de timp
Mg kg -1 (ppm w/w)
Citirea scalei după perioada de timp
stabilită Grad de absorbtie, cond ictivitate etc.

În abordarea mai obișnuită , diferite măsurători indirecte sunt utilizate pentru a
evalua eficacitatea unui antioxidant pentru prevenirea deteriorării oxidative. A cestea se
bazează pe măsurători ai inhibării diferitelor stari intermediare sau a reacției finale
produse de oxidare. Mă surarea individuală a activitaț ii antioxidantului si a tuturor

componentelor este posibilă dintr -o probă, dar acest lucru poate fi costisitor ș i
consumator de timp. În plus, acolo poate fi un sinergism între ant ioxidanți și examinarea
unuia în mod izolat, astfel poate să nu reflecte cu a curatețe acțiunea lor combinată. P rin
urmare, este de interes măsurarea TAA, care poate fi cuantificat ă prin definirea valori i
unui standard adecvat necesar pentru a produce acela și punct f inal cu compusul sa u
materialul care este analizat .
Caracteristicile dorite ale unui test de activitate antioxidantă sunt utilizarea
unui substrat și a condițiilor din test care imită situația reală și capacitatea de a
cuantific a rezultatul prin referire la un standard adecvat. De exemplu, rezultă din
definiția unui antioxidant că concentrația sa de test are trebuie să fie semnificativ mai
mică decât cea a substratului.
Chimia fiecărei proceduri comune este descrisă, cu o scurtă pr ezentare istorică
a dezvoltării metodei și a aplicațiilor sale la produsele alimentare și/ sau sistemelor
biologice . În cele din u rmă, orice probleme asociate cu procedura sunt evidențiate .

VI.5.1. Măsurarea radicalilor liberi

Au fost elaborate strategii pentru măsurarea activita ții antioxidantului ca
abilitatea de a elimina radicalii liberi generați în fazele apoase și lipofile. Abilitatea de a
curăța radicalii specifici poate fi vizat ă ca, de exemplu, radicalul hidroxil, radicalul
superoxid sau radicalul de oxid nitric. O abordare implică generarea unei specii de
radicali liberi și măsurarea directa a inhibării sale datorată adăugării de antioxidanți.
Alternativ, generarea unui radical este cuplată la oxidare a unui substrat, caz în care
măsurarea efectului inhibitorului unui antioxidant se bazează pe detectarea fie a
radicalului sau pe produsele oxidării. De exemplu, producția de peroxil liber prin
descompunerea termică a AAPH poate fi cuplat ă la oxidarea 2,7 -diclorofluorescinului la
fluorescență 2,7 -diclorofluoresceină. În acest caz, efectul de antioxidant adăugat a fost
observat ca o creștere a fazei de decalaj .
Radicalul care este generat varia ză și sistemele au fost descrise utilizând
peroxidază de hrean -H2O2, o-fenilendiamină -H2O2, hidroperoxid de cupru (II),
radica lul peroxil triclorometil , 5DPPH și compușii azo ar fi indicatorii cromogen redox
ABTS. De asemenea, detecția finala variază și s -a bazat pe măsurarea inhib ării
fluorescenței, chemiluminescenței, absorbției oxigenului ș i absorbției [79].

VI.5.2. Alte măsu ri de activitate antioxidantă
VI.5.2.1 Testul FRAP

Puterea antioxidantă reducătoare a f ierului (FRAP ) se bazează pe reducerea
unui feroin analog, Fe3 + complex de tripiridil triazin ă Fe (TPTZ) 3+, la complexul de Fe
(TPTZ) 2+ de un albastru intens de catre antioxidanți în mediu acid. Rezultatele sunt
obținute de vreme ce absorbanța crește la 593 nm și poate fi exprimată ca micromolar
Fe2 + echivalenți sau relativ la un antioxid ant standard. Autorii pretind c ă metod ă este
simpl ă si rapid ă și au fost desc rise atât procedurile manual e cât și cele automatizate. C u
toate acestea, capacitatea de reducere măsurată nu reflectă în mod necesar activitatea
antioxidantă. În schi mb, oferă o foarte util ă concentrația antioxidantă "totală", fără
măsurare și sumare a co ncentrației tuturor antioxidanților implicat i. Metoda a fost
aplicată inițial la plasmă, dar a fost extinsa la alte fl uide biologice [80], alimente,
extracte, sucuri etc.

VI.5.2.2 Testul fitoceritrin
Proteinele puternic fluorescente β-fitoeritrină ș i R-fitoeritrină (PE), derivate din
numeroase specii de alge roșii, au fost utilizate ca țintă a distrugerii radicalilor liberi.
Radicalii generați de descompunerea termică a AAPH stinge fluorescența fitoceritina în
timp ce se adaugă un antioxidant care reacțio nează rapid cu radicali peroxil care inhibă
pierderea de fluorescență și această inhibare este proporțională cu activitate a
antioxidantului .
Fitocerinul este, de asemenea, utilizat pentru a evalua eficacitatea
antioxidanți lor împotriva radicalilor de hidroxil. Radicalii hidroxili sunt genera ți de un
sistem ascorbat -Cu2 + la locurile legării cuprului pe macromolecule. Locul deteriorarii
macromoleculelor rezultă din reacție :

Țintă-Cu2 + + HO●→ ținta afectata + Cu 2+

Această analiză este deosebit de util ă în screening -ul compușilor care
protejează împotriva daunelor prin chelarea ionilor metalici necesari pentru formarea
specifică locului speciilor radicale. Inhibarea de oxidare cu un antioxidant po ate fi
examinata de către întarzierea pierderii de fluore scență, inhibarea fiind proporțional a cu
activitatea antioxidantă. Rezultatel e finale pot fi calculate folosind diferențele în zonele

din cadrul curbele de decădere a fit oeritrinei între martor și o probă , și sunt exprimate în
echivalente trolox.
Activităț ile antioxidante ale mai multor sucuri și fructe au fost raportat e [81] ca
absorbanță a utomată a radicalului de oxigen (ORAC) în micromoli de echivalenț ă
Trolox. Acest e valoari combinate atât a timpului de inhibare , cât și a gradului de
inhibare într -o sin gură cantitate , în tim p ce alte metode utilizează fie timpul de inhibare
la un grad de inhibare fix sau inhibare a la un grad fix ca bază pentru cu antificarea
rezultatelor. Acolo a fost o variație semnificativă în TAA a mai multor fructe precum
căpșuni le având cea mai mare activitate ORAC pe baza atât pentru greutatea umedă cât
și cea uscată a fru ctelor. Contribuția vitaminei C la activitate a fost < 15%, cu excepția
fructelor de kiwi și a pepene lui galben dulce . Cea mai mare parte a capacității
antioxidant e a acestor fructe a fost de la fracțiunile de suc. Contribuți a fracțiunii de
pulpă de fructe (extras cu acetonă) la activitatea ORAC totală a unui fruct a fost de
obicei < 10%.
Valorile ORAC au arătat o corelație l iniară pozitivă semnificativă cu date le
electrochimice obținute prin HPLC cu detecția matricei coloriometrice. Acizii fenolici,
în general, au avut activități antioxidante mai mici împotriva radicalilor de peroxil decât
flavonoide le care conțin mai multe grupări hidroxil. In orice caz, glicozidel e flavonoide
(inclusiv ru tină, naringină și hesperidină) au avut, de obicei, activități r eduse ORAC. Un
număr de factori ce determină activitatea antioxidantă inclu zând reactivitatea ca
hidrogen – sau donator de electroni și acest aspect se referă la acest potențial de reducere.
Într-adevăr, există un larg acord între potențialul de reduce re la jumătate și TAA
măsurată prin TEAC. Acest lucru a fost raționalizat pe baza faptului că atât oxidarea
electrochimic ă și donarea de hidrogen pentr u colectarea radicali lor liberi implică
ruperea aceleiași legături fenolice.

VI.5.2.3. Parametrul total antioxidant captat de radicali

Analiza parame trului antioxidant total captat (TRAP) , a fost utilizat pe scară
largă pentru determinarea TAA privind măsurarea consumului de oxigen în timpul unei
reacții controlate de oxidare de lipide indusă prin descompunerea termică a AAPH.
TRAP exprimă rezultatele ca număr de mmol i de radicali peroxil captați la 1 I de
plasmă. Măsurarea serul ui TRAP s-a bazat pe determinarea lungimii lu i, timp in care
serul unui subiect a fost capabil sa reziste oxidarii indus e artificial . A urmat , apoi

oxidarea prin monitoriza rea consumului de oxigen într -o celula electrod cu oxigen
termostatat în timpul oxidării linoleatulu i de către radicalii liberi. O problema majoră cu
această metodă se afla i n electrodul de oxigen . Un electrod de oxigen nu -și va menține
stabilitatea pentru perioada de timp neces ară (până la 2 ore pe probă) și analiza TRAP a
fost modificată pentru a utiliza chemiluminescența îmbu nătățită cu luminol (CL) ca
punct final. Acest lucru a dus la îmbunătățirea precizie și o capacitate mai mare de
automati zare. În acest sistem, radicalul peroxil îmbunătățește reacția CL. Când un
antioxidant a fost adăugat, CL a fost stins ă, durata căreia era direct proporțional cu
capacitat ea radicală de capturare a probei antioxidante . Rezultatele pot fi standardizate
prin adăugarea lui Trolox după consumul de antioxidanți naturali pentru a produce o a
doua per ioadă de inducție. Factorii stoe chiometric i pentru puritatea antioxidanților sunt
diferiți (de exemplu, T rolox, 2,0; ascorbat, 1,5; urat , 1.7) și acestea trebuie luate în
considerare când extrapolă m rezultatele înapoi la concentrațiile moleculare din TRAP .
Metoda este consumatoare de timp și sufe ră un număr de probleme, deși conceptul a
fost foarte util pentru cuantificarea și compar area capacității antioxidante .
Activitatea antioxidantă a patru antioxidanți standard ( acidul galic, acid ul uric,
Trolox și acid ul ascorbic) a fost comparat folosind test ele TEAC și TRAP și oxidarea
LDL. Rezultatele nu au fost compa rabile prin aceea că acidul gal ic a fost cel mai
puternic antioxidant în toate cele trei sisteme, dar activitatea relativă a compușilor
rămași depind de sistem.
Au fost de asemenea ut ilizate [82] trei metode diferit e pentru cuantificarea
capacită ții antioxidante a LDL ex vivo la pacienții cu dislipidemie cu boală coronariană.
Acestea au implicat determinarea LDL TRAP în oxidarea și măsurarea indusă de
plasmă AMVN in timpul de extincție al chemil umines cenței, diena conjugată formată în
timpul oxidării și consumului indus de cupru de β-tocoferol redus și ubiquinol în
AMVN induc e oxidare. Suplimentarea cu tocoferol a produs schimbari semnificative în
toate variabilele antioxidante, cu excepția acelo ra legate de LDL ubiquinol. S -a
concluzionat că testul LDL TRAP poate completa celelalte metode folosite pentru
cuantificarea capacităț ii antioxidant e a LDL .
Deși fenolii exercită o activitate antioxidantă puternică, in vivo dovezile au
produs rezultate co ntradictorii. Când este ingerat de voluntari sănătoși, vinul roșu și
ceaiul verde au fost cele mai eficiente în protejarea LDL de oxidare determinată de
radicalii peroxil și feril. Cu to ate acestea, conținutul fenolic singur nu a fost un indice al
activit ății lor anti oxidante in vivo. Mai mult, anumiti fenoli, cum a r fi quercetinul, au un

efect bifazic în funcție de doză. Efectul benefic al antioxidanț ilor naturali și ai
antioxidanți lor sintetici pe mark erii surogaț i de boală vasculară, cum ar fi funcția
endotelială și oxidarea LDL, a fost demonstrat. Activitatea antioxid antă în diferite
substraturi și testele care includ LDL in vitro sunt legate de molaritatea vinul ui sau
fenolilor din suc. Datele su nt limitate, dar concentrațiile de fenoli alimentari princ ipali
pot fi sub stanțial m ai mici decât aceștia considerați a fi eficienț i în sistemele de testare
in vitro . Cu toate acestea, este foarte greu de extrapolat semnifica tiv la om in vivo
situație din cauza incertitudinilor privind absorbția și farmacocinetic a. Antioxidanții,
acidul uric și albuminele serice sunt prezente în concentrații molecul are considerabil
mai mari decât metaboliții fenolilor alimentari. În plus, niciun efectul benefic nu a fost
demonstrat pentru mortalitatea vasculară la persoanele în v ârstă cu riscuri mari.
Efect ele pro oxidante ale dozei mari de suplimente antioxidante, î n special la pacienții cu
probleme vasculare , poate să fi contribuit la aceste rezultate.

CONCLUZII

Creșterea interesului obținut de antioxidanți se datorea ză beneficiilor pentru
sănătate furnizate în principal de antioxidanții cu masă moleculară redusă, cu surse
naturale (exogene). Aceasta constă în prevenirea apariției bolilor asociate stresului
oxidativ, cauzate de atacul radicalilor liberi asupra unor bio componenți cheie, cum ar fi
lipidele sau acizii nucleici. Sunt utilizate diverse metode și instrumente analitice pentru
conținutul antioxidant și evaluarea totală a cap acității antioxidante: spectrometrie,
metode electroanalitice, cromatografie. Aceste teh nici sunt capabile să ofere un profil
complet al conținutului de antioxidanți din produsele alimentare.
Fructele și băuturile cum ar fi ceaiul și vinul roșu reprezintă principalele surse
de polifenoli, dar legumele, plantele leguminoase și cerealele sunt, de asemenea, surse
importante. Efectele sănătoase ale polifenolilor depind atât de aportul lor, cât și de
biodisponibilitatea acestora. Conceptul de biodisponibilitate integrează mai multe
variabile, cum ar fi absorbția intestina lă, metabolismul prin micro floră, metabolismul
intestinal și hepatic, natura metabolitului circulant, legarea la albumină, absorbția
celulară, acumularea în țesuturi și excreția biliară și urinară. Principala dificultate este
integrarea tuturor informațiilor și corelarea variabilelo r cu efectele asupra sănătății la
nivelul organelor. Din moment ce dovezile efectelor terapeutice ale polifenolilor
dietetici continuă să se acumuleze, devine din ce în ce mai important să se înțeleagă
natura absorbției și metabolismului in vivo. În plus, identificarea și măsurarea
metaboliților fiziologici de polifenoli reprezintă o condiție esențială pentru înțelegerea
rolului polifenolilor din dietă pentru sănătatea umană.
Metoda Mazza este o alternativă la metoda Folin -Ciocâlteu pentru
determinarea comp ușilor polifenolici totali (r2 = 0,97).
Metoda Mazza este o alternativă la metoda Paronetto pentru determinarea
antocianelor totale în vinurile roșii (r2 = 0,94). Există o legătură foarte bună între
activitatea antioxidantă, determinată prin utilizarea me todei FRAP, și conținutul în
totalul compușilor polifenolici (r2 = 0,96).
Există o legătură foarte bună între activitatea antioxidant ă determinată prin
metoda DPPH și conținutul în totalul compușilor polifenolici (r2 = 0,92). Printre
polifenolii studiați, catechina prezintă cea mai mare activitate antioxidantă (r2 = 0,91
pentru corelația dintre activitatea antioxidant ă determinată prin metoda DPPH și

conținutul de cate chină al vinurilor roșii analizate și r2 = 0,96 pentru corelația dintre
activitatea antio xidantă determinată prin metoda FRAP).
Pentru determinarea activității antioxidante a vinurilor roșii se poate utiliza atât
metoda FRAP, cât și metoda DPPH , obținând astfel rezultate foarte apropiate (corelația
statistică a parametrilor obținuți prin cele două metode este foarte bună r2 = 0,93).

BIBLIOGRAFIE

[1] Litescu SC, Sandra AV, Eremia SAV, Diaconu M, Tache A, et al. (2011) Biosensors
Applications on Assess ment of Reactive Oxygen Species and Antioxidants.
Environmental Biosensors. In Tech Rijeka Croatia.
[2] Molyneux P (2004) The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl
(DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol 26: 211-219.
[3] Arnous A, Makris D.P., 2002 – Correlation of pigment and flava nol content with
antioxidant properties in selected aged regional wines from Greece , Journal Food
Composition and Analysis, 15.
[4] Ly SY (2008) Voltammetric analysis of DL -α-tocopherol with a paste electrode. J
Sci Food Agric 88: 1272 -1276.
[5] Romani A, Minunni M, Mulinacci N, Pinelli P, Vincieri FF, et al. (2000)
Comparison among differential pulse voltammetry, amperometric biosensor, and
HPLC/DAD analysis for polyphenol determination. J Agric Food Chem 48: 1197 -1203.
[6] Halvorsen BL, Carlsen MH, Philli ps KM, Bohn SK, Holte K, et al. (2006) Content
of redox -active compounds (ie, antioxidants) in foods consumed in the United States.
Am J Clin Nutr 84: 95 -135.
[7] Ramadan -Hassanien MF (2008) Total antioxidant potential of juices, beverages and
hot drinks c onsumed in Egypt screened by DPPH in vitro assay. Grasas y aceites 59:
254-259.
[8] Serafini M, Bellocco R, Wolk A and Ekstrom AM (2002) Total antioxidant potential
of fruit and vegetables and risk of gastric cancer. Gastroenterology 123: 985 -999.
[9] Pellegrini N, Serafini S, Del Rio SD and Bianchi M (2006) Total antioxidant
capacity of spices, dried fruits, nuts, pulses, cereals and sweets consumed in Italy
assessed by three different in vitro assays. Mol Nutr Food Res 50: 1030 –1038.
[10] Gazdik Z, Krska B, Adam V, Saloun J, Pokorna T, et al. (2008) Electrochemical
determination of the antioxidant potential of some less common fruit species. Sensors 8:
7564 -7570.
[11] Cheeseman KH and Slater TF (1993) An introduction to free radical biochemistry.
Br Med Bu ll 49: 481 -493.
[12] Frankel EN and Meyer AS (2000) The problems of using one -dimensional methods
to evaluate multifunctional food and biological antioxidants. J Sci Food Agric 80: 1925 –
1941.

[13] Giardi MT, Rea G, Berra B (2010) Bio Farms for Nutraceutica ls: Functional Food
and Safety Control by Biosensors. Landes Bioscience and Springer Science+Business
Media.
[14] Thaipong K, Boonprakob U, Crosby K, Cisneros -Zevallos L and Byrne DH (2006)
Comparison of ABTS, DPPH, FRAP, and ORAC assays for estimating ant ioxidant
activity from guava fruit extracts. Journal of Food Composition and Analysis 19: 669 –
675.
[15] Gil MI, Tomas -Barberan FA, Hess -Pierce B and Kader AA (2002) Antioxidant
capacities, phenolic compounds, carotenoids and vitamin C contents of nectarine , peach
and plum cultivars from California. J Agric Food Chem 50: 4976 -4982.
[16] Ou B, Hampsch -Woodill M and Prior R L (2001) Development and validation of
an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the
fluorescence probe. J Agric Food Chem 49(10): 4619 -4626.
[17] Ou B, Hampsch -Woodill M, Flanagan J, Deemer EK, Prior RL, et al. (2002) Novel
fluorimetric assay for hydroxyl radical prevention capacity using fluorescein as the
probe. J Agric Food Chem 50(10): 2772 -2777.
[18] Cízová H, Lojek A, Kubala L and Cíz M (2004) The effect of intestinal ischemia
duration on changes in plasma antioxidant defense status in rats. Physiol Res 53: 523 –
531.
[19] Meng J, Fang Y, Zhang A, Chen S, Xu T, et al. (2011) Phenolic content and
antioxidan t capacity of Chinese raisins produced in Xinjiang Province. Food Res Int.
[20] Magalhaes KF, Caires ARL and Oliveira SL (2011) Determination of Antioxidant
Content in Biodiesel by Fluorescence Spectroscopy. Encontro de Fisica.
[21] Chong PL, Olsher M (200 7) Fluorometric assay for detection of sterol oxidation in
liposomal membranes. Methods Mol Biol 400: 145 -158.
[22] Chevion S, Roberts MA, Chevion M (2000) The use of cyclic voltammetry for the
evaluation of antioxidant capacity. Free Radic Biol Med 28: 86 0-870.
[23] Campanella L, Martini E, Rita E and Tomassetti M (2006) Antioxidant capacity of
dry vegetal extracts checked by voltammetric method. J Food Agric Environ 4: 135 –
144.
[24] Milardovic S, Ivekovic D and Grabaric BS (2006) A novel amperometric meth od
for antioxidant activity determination using DPPH free radical. Bioelectrochemistry 68:
175-180.

[25] Tougas TP, Jannetti JM, Collier WG (1985) Theoretical and experimental response
of a biamperometric detector for flow injection analysis. Anal Chem 57: 1377 -1381.
[26] Pisoschi AM, Cheregi MC and Danet AF (2009) Total antioxidant capacity of
some commercial fruit juices: electrochemical and spectrophotometrical approaches.
Molecules 14: 480 -493.
[27] Milardovic S, Kerekovic I, Rumenjak V (2007) A flow in jection biamperometric
method for determination of total antioxidant capacity of alcoholic beverages using
bienzymatically produced ABTS∙+. Food Chem 105: 1688 -1694 .
[28] Barroso MF, de -los-Santos -Álvareza N, Lobo -Castanón MJ, Miranda -Ordieres AJ,
Delerue -Matos C, et al. (2011) DNA -based biosensor for the electrocatalytic
determination of antioxidant capacity in beverages. Biosensors and Bioelectronics 26:
2396 -2401.
[29] Böyükbayram A, Kıralp S, Toppare L, Yağci Y (2006) Preparation of biosensors
by immobi lization of polyphenol oxidase in conducting copolymers and their use in
determination of phenolic compounds in red wine. Bioelectrochemistry 69: 164 -171.
[30] Jayaprakasha GK, Jena BS, Negi PS, Sakariah KK (2002) Evaluation of
Antioxidant Activities and A ntimutagenicity of Turmeric Oil: A Byproduct from
Curcumin Production. Z Naturforsch 57c: 828 -835.
[31] Oishi M, Matsuda T, Nojiri S, Saito K (2002) Simultaneous determination of five
antioxidants in food by HPLC with fluorescence detection. Food Hygiene and Safety
Science (Shokuhin Eiseigaku Zasshi) 43: 104 -109.
[32] Wawrzyniak J, Ryniecki A and Zembrzuski W (2005) Application of voltammetry
to determine vitamin C in apple juices. Acta Sci Pol Technol Aliment 42: 5 -16.
[33] AMERI NE, M. A .; ÜUGH, C. S.; 1988: M ethods for Ana lysis of Musts and
Wine s. John W iley & Son s, New York.
[34] CALo ü, P.; HuRTADO, 1.; FloL, C.; GoNZAL O, A.; MINGUEZ , S.; 199 6: White
wine redu ces the susceptib i lity of low-density -iipoprote in to oxidation. Amer. J. Clin.
Nutr. 63,403.
[35] CRJQUI, M. H.; RINr. EL, 8. L.; 1994: Does diet or alcohol explain the French
paradox? Lancet344,1719 -1723.
[36] TEISSEDRE, P. L.; FRAN KEL, E. N.; WATERHO USE, A. L.; P ELEG, H.;
ÜERMAN, J . . B.; 1996: Inhibition of in vitro human LDL oxidation by phenolic
antioxidants from grapes and wines. J. Sei. Food Agricult. 70, 55 -61.

[37] MILLER, N. J.; RICE -EVANS, C. A.; DAVIES, M. J.; ÜOPINATHAN, V.;
MILNER, A.; 1993: A novel method for measuring antioxidant capacity and its
application to monitaring the antioxid ant status in premature neonates. Clin. Sei. 84,
407-412.
[38] RlcE -EvANS, C. A.; MILLER, N. J.; PAGANGA, G.; 1996: Structure -antioxidant
activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Rad. Bio!. Med. 20, 933 –
956.
[39] VINSON, J. A.; HONTZ, 8. A.; 1995: Phenol antioxidant Index: Comparative
antioxidant effectivenes!l' of red and white wines. J. Agricult. Food Chem. 43, 401 -403.
[40] Lambert JD, Hong J, Yang GY, Liao J, Yang CS. Inhibition of carcinogenesis by
polyphenols: evidence from labora tory investigations. Am J Clin Nutr 2005;81:284S –
291S.
[41] Stahl W, van den Berg H, Arthur J, Bast A, Dainty J, Faulks RM, Gartner C,
Haenen G, Hollman P, Holst B, Kelly FJ, Polidori MC, Rice -Evans C, Southon S, van
Vliet T, Vina -Ribes J, Williamson G, As tley SB. Bioavailability and metabolism. Mol
Aspects Med 2002;23:39 -100.
[42] Cortell JM, Kennedy JA. Effect of shading on accumulation of flavonoid
compounds in ( Vitis vinifera L.) pinot noir fruit and extraction in a model system. J
Agric Food Chem 2006; 54:8510 -20.
[43] Mazza G, Miniati E. Anthocyanins in fruits, vegetables, and grains . Boca Raton:
CRC Press; 1991.
[44] Rasmussen SE, Frederiksen H, Struntze Krogholm K, Poulsen L. Dietary
proanthocyanidins: occurrence, dietary intake, bioavailability, and protection against
cardiovascular disease. Mol Nutr Food Res 2005; 49:159 -74.
[45] Tomas -Barberan FA, Clifford MN. Dietary hydroxybenzoic acid derivatives and
their possible role in health protection. J Sci Food Agric 2000; 80:1024 -32.
[46] Lempereur I, Ro uau X, Abecassis J. Genetic and agronomic variation in
arabinoxylan and ferulic acid contents of durum wheat ( Triticum durum L.) grain and its
milling fractions. J Cereal Sci 1997; 25:103 -10.
[47] Corona G, Tzounis X, Assunta Dessi M, Deiana M, Debnam ES, Visioli F, Spencer
JP. The fate of olive oil polyphenols in the gastrointestinal tract: implications of gastric
and colonic microflora -dependent biotransformation. Free Radic Res
2006; 40:647 -58.

[48] Atten MJ, Godoy -Romero E, Attar BM, Milson T, Zopel M, Holian O. Resveratrol
regulates cellular PKC alpha and delta to inhibit growth and induce apoptosis in gastric
cancer cells. Invest New Drugs 2005; 23:111 -9.
[49] Saleem M, Kim HJ, Ali MS, Lee YS. An update on bioactive plant lignans. Nat
Prod Rep 2005; 22:696-716.
[50] DuPont MS, Mondin Z, Williamson G, Price KR. Effect of variety, processing, and
storage on the flavonoid glycoside content and composition of lettuce and endive. J
Agric Food Chem 2000; 48:3957 -64.
[51] Zhang Y, Hendrich S, Murphy PA. Glucur onides are the main isoflavone
metabolites in women. J Nutr 2003; 133:399 -404.
[52] Sesink AL, O’Leary KA, Hollman PC. Quercetin glucuronides but not glucosides
are present in human plasma after consumption of quercetin -3-glucoside or quercetin –
4’-glucosi de. J Nutr 2001; 131:1938 -41.
[53] Day AJ, DuPont MS, Ridley S, Rhodes M, Rhodes MJ, Morgan MR, Williamson
G. Deglycosylation of flavonoid and isoflavonoid glycosides by human small intestine
and liver beta -glucosidase activity. FEBS Lett 1998; 436:71 -5.
[54] Regev -Shoshani G, Shoseyov O, Bilkis I, Kerem Z. Glycosylation of resveratrol
protects it from enzymic oxidation. Biochem J 2003; 374:157 -63.
[55] Franke AA, Custer LJ, Hundahl SA. Determinants for urinary and plasma
isoflavones in humans after soy int ake. Nutr Cancer 2004; 50:141 -54.
[56] Boersma MG, van der Woude H, Bogaards J, Boeren S, Vervoort J, Cnubben NH,
van Iersel ML, van Bladeren PJ, Rietjens IM. Regioselectivity of phase II metabolism
of luteolin and quercetin by UDP -glucuronosyl transferase s. Chem Res Toxicol 2002;
15:662 -70.
[57] Dufour C, Loonis M, Dangles O. Inhibition of the peroxidation of linoleic acid by
the flavonoid quercetin within their complex with human serum albumin. Free Radic
Biol Med 2007; 43:241 -52.
[58] Hollman PC, van Tri jp JM, Buysman MN, van der Gaag MS, Mengelers MJ, de
Vries JH, Katan MB. Relative bioavailability of the antioxidant flavonoid quercetin
from various foods in man. FEBS Lett 1997; 418:152 -6.
[59] Henning SM, Aronson W, Niu Y, Conde F, Lee NH, Seeram NP, Le e RP, Lu J,
Harris DM, Moro A, Hong J, Pak -Shan L, Barnard RJ, Ziaee HG, Csathy G, Go VL,
Wang H, Heber D. Tea polyphenols and theaflavins are present in prostate

tissue of humans and mice after green and black tea consumption. J Nutr 2006;
136:1839 -43.
[60] McGhie TK, Walton MC. The bioavailability and absorption of anthocyanins:
towards a better understanding. Mol Nutr Food Res 2007; 51:702 -13.
[61] David, S.B., 1999. Endogenous nitric oxide synthesis: biological functions and
pathophysiology. Free Radic. Res. 31 (6), 577 –596.
[62] Kooy, N.W., Royall, J.A., Ischiropoulos, H., Beckman, J.S., 1994. Peroxynitrite –
mediated oxidation of dihydrorhodamine 123. Free Radic. Biol. Med. 16, 149 –156.
[63] Benzie, I.F.F., Strain, J.J., 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a
measure of ‘antioxidant power’: The FRAP assay. Anal. Biochem. 239, 70 –76.
[64] Kinnula, V.L., Crapo, J.D., 2004. Superoxide dismutases in malignant cells and
human tumors. Free Radic. Biol. Med. 36, 718 –744.
[65] Noro, T., Oda, Y., Miyase, T., Ueno, A., Fukushima, S., 1983. Inhibitors of
xanthine oxidase from the flowers and buds of Daphne genkwa. Chem. Pharm. Bull. 31,
3984 –3987.
[66] Cano Lario A., Guerrero J.R., 1999 – Estudio comparativo de la actividad
antioxidante de varios tip os de vino – Viticultura/ Enología Profesional, 60, pp. 45 -52.
[67] Minussi R.C., Rossi M., Bologna L., 2003 – Phenolic compounds and total
antioxidant potential of commercial wines , Food Chemistry, 82.
[68] Benzie I.F.F., Strain J.J., 1996 – The ferric re ducing ability of plasma (FRAP) as a
measure of “antioxidant power” : The FRAP Assay -Analytical Biochemistry, 239.
[69] Burns J., Gardner P., O’Neil J., Crawford S., Morecroft I., McPhail D.,Lister C.,
Matthews D., MacLean M., Lean M., Duthie G., Crozier A. , 2000 – Relationship among
antioxidant activity, vasodilatation capacity and phenolic content of red wine . Journal
of Agricultural and Food Chemistry, 48, pp. 220 -230
[70] K. Sakata, in Food and Free Radicals , ed. M. Hiramatsu, T. Yoshikawa and M.
Inoue, Plenum Press, New York, 1997, pp. 85 –99.
[71] J. C. Espin, C. Soler -Rivas and H. J. Wichers, J. Agric. Food Chem. , 2000, 48, 648.
[72] J. Kanner, J. B. German and J. E. Kinsella, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. , 1987, 25,
317.
[73] R. Baliga, N. Ueda, P. D. Wa lker and S. V. Shah, Drug Metab. Dispos. Rev. , 1999,
31, 971.
[74] S. J. Jadhav, S. S. Nimbalkar, A. D. Kulkarni and D. L. Madhavi, in Food
Antioxidants: Technological, Toxicological and Health Perspectives , ed. D. L.

Madhavi, S. S. Deshpande and D. K. Sal unkhe, Marcel Dekker, New York, 1996, pp.
5–64.
[75] O. I. Aruoma, J. P. E. Spencer, D. Warren, P. Jenner, J. Butler and B. Halliwell,
Food Chem. , 1997, 60, 149.
[76] D. Bonnefont -Rousselot, A. Rouscilles, C. Bizard, J. Delattre, D. Jore and M.
Gardes -Albe rt, Radiat. Res. , 2001, 155, 279 .
[77] Y. Yamaguchi, S. Kagota, K. Nakamura, K. Shinozuka and M. Kunitomo,
Phytother. Res. , 2000, 14, 647.
[78] K. Robards, P. D. Prenzler, G. Tucker, P. Swatsitang and W. Glover, Food Chem. ,
1999, 66, 401.
[79] C. E. Rice -Evans and N. J. Miller, Methods Enzymol. , 1994, 234, 279.
[80] P. T. Gardner, T. A. C. White, D. B. McPhail and G. G. Duthie, Food Chem. , 2000,
68, 471.
[81] C. R. Caldwell, Anal. Biochem. , 2001, 293, 232.
[82] K. Malminiemi, A. Palomaki and O. Malminiemi, Free Rad. Res. , 2000, 33, 581.

Anexa 1
Tabelul 1 . Metode de evaluare totală a capacității antioxidante
Tabelul 2 . Corelații (r2) între variabilele studiate pe probele de vin
Tabelul 3 . Teste standard cu care se masoară identificarea activitații a ntioxidante
Tabelul 4 . Metode de exprimare a rezultatelor testelor de activitate antioxidantă (Giardi
MT, Rea G, Berra B (2010) Bio Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety
Control by Biosensors. Landes Bioscience and Springer Science+Business Media. )

Anexa 2
Figura 1. Pregătirea fracțiunilor de vin pentru determinarea activitatii lor antioxidante
Figura 2. Structurile compușilor model utilizați în testele de activitate antioxidantă
(1.acid ascorbic, 2.a -tocoferol, 3.trolox , 4.acid caftaric, 5.catechin, 6.quercetin,
7.rutină).
Figura 3. Structura chimică a polifenolilor
Figura 4. Difenilpicrilhidrazil (radical liber)
Figura 5. Difenilpicrilhidrazil

Abrevieri
AAPH – 2,2A -azobis (2 -amidinopropan) clorhidrat
ABTS – 2,2A -azinobis (3 -etilbenztiazolina) -6-sulfonic
AMVN – 2,2A -azobis (2,4 -dimetilvaleronitril)
BHA – butilhidroxianisol
BHT – butilhidroxitoluen
BNB – terț-butilnitroz obenzen
CL – chemiluminescen ța
CUPRAC – puterea antioxidant ă reducând cuprul
DBNBS – acid 3,5 -dibrom -4-nitrozobenzensulfonic
DMPO – 5,5-dimetilpirolină -N-oxid
DPPH – 2,2-Difenil -1-picrilhidrazil
FRAP – puterea antioxidantă ferică redus ă
GC ( -MS) – cromatografie în fază gazoasă (spectrometrie de masă)
HORAC – capacitatea de evitare a radic alilor de hidroxil
HPLC – cromatografie lichidă de înaltă performanță
LDL – lipoproteine cu densitate scăzută
MDA – malondialdehidă
ORAC – capacitatea de absorbanță a radicalilor de oxigen
POBN – a-(4-piridil -1-oxid) N -terț-butilnitron
PV – valoare p eroxid
RNS – specii de azot reactiv
ROS – specii de oxigen reactiv
TAC – activitate a antioxidantă totală
TBA – acid tiobarbituric
TBARS – substanțe reactive ale acidului tiobarbituric
TBHQ – terț-butilhidrochinonă
TE – echivalent Trolox
TEAC – Trolox activitat e antioxidantă echivalentă
TG/DTA – termogravimetrie/ analiză termică diferențială
TRAP – parametrul total de capturare radicală