Utilizările Escherichiei coli în industria medicamentelor … … 5 [627368]

3
Cuprins
Utilizările Escherichiei coli în industria medicamentelor ………………………….. …….. 5
Partea GENERALĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 5
1. Generalități ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 5
1.1. Definiție si încadrare ………………………….. ………………………….. …………………. 6
1.2. Habitat ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 7
1.3 Caractere morfotinctoriale ………………………….. ………………………….. ………….. 7
1.4. Caractere de cultură ………………………….. ………………………….. ………………….. 7
1.5. Caractere biochimice și de metabolism ………………………….. ……………………. 7
1.6. Structura antigenică ………………………….. ………………………….. ………………….. 7
1.7. Caractere de patogenitate ………………………….. ………………………….. …………… 8
2. Genul Escherichia ………………………….. ………………………….. …………………………. 12
2.1. Caractere generale: ………………………….. ………………………….. ………………….. 12
Partea SPECIALĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 18
1. Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 18
2. Escherichia coli utilizat la producerea de insulină ………………………….. …………. 19
2.1. P rezentare generală ………………………….. ………………………….. …………………. 19
2.3. Structura și funcția insulinei ………………………….. ………………………….. …….. 22
2.4. Obținerea de insulină ………………………….. ………………………….. ………………. 22
2.4.1 Utilizarea N -glicozilării ………………………….. ………………………….. …….. 22
2.4.2. Utilizarea codonului proteinei heterologice ………………………….. …….. 23
2.4.3. Utilizarea tulpinilor de E. coli cu deficit de prote ază …………………….. 25
2.5. Preparate industriale cu insulina provenită din tulpini de E. coli ……………. 26
2.5.1. Insulina umană – Humulin R 100 UI/ml so luție injectabilă în flacon . 26
2.5.2. Insulina Lispro ………………………….. ………………………….. ………………… 27

4
2.5.3. Insulina glulizin ………………………….. ………………………….. ………………… 28
2.5.4. Insulina glargin ………………………….. ………………………….. ………………… 28
3. Obținerea Hormonului de crestere cu ajutorul E. coli ………………………….. …….. 30
3.1. Sistemul de exp resie al E. coli folosit la producerea hormonului uman de
creștere (hGH) ………………………………………………………………………………………………….. 30
3.2. Utilizarea analogului de protează Ubp1 pentru a produce hormon de creștere
uman recombinant în Escherichia coli ………………………….. ………………………….. ………….. 30
3.3.Hormonul de creștere uman (hGH) ………………………….. …………………………. 31
4. Inginerie genetică bacteriană ………………………….. ………………………….. ………….. 35
4.1. Vectori utilizați în clonarea genetică la Escherichia coli ………………………. 35
4.1.1. Vectori de clonare plasmidiali ………………………….. …………………………. 35
4.1.2 . Vectori derivați din fagi filamentoși ………………………….. ………………… 36
4.1.3. Vectori de clonare hibrizi de tip fagimide ………………………….. ………… 36
4.1.4. Vectori derivați din gen omul bacteriofagului λ ………………………….. …. 36
4.1.5. Vectori de clonare hibrizi de tip cosmide ………………………….. ………….. 37
5. Utilizarea E.coli în obținerea vaccinurilor ………………………….. …………………….. 38
6. E.coli utilizat în tratamentul malariei ………………………….. ………………………….. . 45
7. E. coli utilizat la obținerea de medicamente cu acțiune țintită ……………………… 46
8. Probiotice obținute din E.coli ………………………….. ………………………….. …………. 47
9. Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 48
10. Bibliografie: ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 50

5
Utilizările Escherichiei coli în industria medicamentelor
Partea GENERALĂ
1. Generalități
Ramura biologiei care se ocupă cu studiul microorganismelor unicelulare,
invizibile cu ochiul liber se numește microbiologie. Micro biologia studiază procesele
fizice, chimice și biologice, legate de activitatea microorganismelor, pentru a le putea folosi
pe cele utile și pentru a contracara procesele dăunătoare omului. [ 1]
Microorganismele sunt cele mai vechi, numeroase și diversificate forme de viață
pe pământ fiind utilizate în diferite ramuri ale industriei dar sunt deosebit de utile pentru
industria medicamentelor, biosinteza microbiană a vitaminelor (B1, B2, B12, C, A, D2),
biosinteza s ubstanțelor antibiotice, biosinteza insulinei, hormonului uman de creștere,
somatostatinei sau interferonului.
După domeniul de activitate în care se aplică noțiunile de microbiologie se disting
diferite ramuri aplicative ale acesteia: microbiologia indist rială, microbiologia solului,
microbiologia marină, microbiologia medicală, microbiologia veterinară, etc. .
Microorganismele studiate cuprind fungi, alge, bacterii, paraziți și virusuri.
Majoritatea acestora sunt utile, iar o parte din ele sunt implicate, în diferite grade, în
patologie.
La începutul secolului oamenii decedau datorită unor cauze infecțioase (rujeolă,
rubeolă, varicelă, oreion, variolă, ciumă, tuberculoză, tifos exantematic, difterie, sifilis etc)
care azi, datorită microbiologiei, au o evo luție letală numai în anumite situații.
În prezent, microbiologia trebuie să facă față provocărilor viitorului. Dezvoltarea
tehnologiei ADN, a început în 1973 și este bazată pe cunoștințele acumulate în ultimii 44
de ani de genetică microbiană. În zilele n oastre există posibilitatea inserării de material
genetic, provenit de la orice organism viu, în bacterii selecționate și adaptate astfel, încât să
poată realiza sarcini speciale, ajungându -se până la posibilitatea ca tulpini de E. coli
modificate genetic, să sintetizeze structuri de tipul anticorpilor.[1]
Polimorfismul bacteriilor este limitat deoarece f orma bacteriilor este codificată
genetic, ceea ce face ca morfologia bacteriilor să reprezinte un important criteriu
taxonomic.[2]

6
Cele trei forme fundame ntale în care se prezintă, în condiț ii favorabile, bacteriile
tinere sunt:
 forma sferică,
 forma cilindrică,
 forma încurbată (spiralată).
Cocii, au formă sferică, cu diametre egale sau inegale iar în urma diviziunii pot
avea diferite configura ții spațiale c aracteristice î n funcție de numărul de planuri în care se
divid.[2]
Bacilii au form ă cilindrică, având lungimea mai mare decât lățimea. Corpul
bacililor poate fi deformat dacă diametrul transversal al sporului este mai mare decât cel al
corpului bacterian. Se divid de obicei în același plan si sunt solitari dar se pot combina
pentru a forma diplobacili, streptobacili, așezări cu forma literelor Y, T, V, sau bețe de
chibrit împrăștiate. [2,3]
Formele spiralate se numesc vibrioni, spirili sau spirochete, în f uncție de
încurbarea axului longitudinal într-un singur plan sau in mai multe planuri. Vibrionii au
forma de virgulă. Spirilii au forma de spirală iar spirochetele sunt bacterii spiralate foarte
fine și flexibile, cu spire strânse și regulate.
Pe lângă ace ste trei forme fundamentale mai există și cocobacili (cu formă
intermediară între coci și bacili) si mycoplasme (prezintă un polimorfism marcat în lipsa
peretelui celular). [2]
1.1. Definiție si încadrare
E. coli este un baci l gram negativ ș i face parte di n familia Enterobacteriaceae .
Aceasta este o familie largă de bacterii și include mulți dintre agenții patogeni sau
condiționat patogeni, cei mai familiari. Multe bacterii ale acestei familii fac parte din
microbiota intestinului uman sau animal iar altele sunt prezente în apă , pe sol, pe plante etc.
[4]
Enterobacteriile sunt clasificate științific după cum urmează:
– Regn: Bacteria
– Phylum: Proteobacteria
– Clasa: Gamma Proteobacteria

7
– Genul
– Specia
Familia Enterobacteriaceae are peste 30 de genuri și 120 de spe cii.[4]
Din genul Escherichia face parte specia: E. coli, care poate fi E. coli enterotoxic
(ECET), E. coli enteroinvaziv, E.coli enteropatogen (ECEP), E. coli enterohemoragic
(ECEH), E. coli enteroagregativ (ECEagg), E. coli uropatogenic (ECUP), E.coli meningita
neonatala (ECMN), E. coli difuz -aderent (ECDA). [5]
1.2. Habitat
Enterobacteriile sunt responsabile pentru o mare parte a infecțiilor nosocomiale.
Pe lângă flora tractului respirator superior, ele au fost evidențiate și în flora intestinală
normală , în apă, pe sol, pe plante. Acestea se pot împărții în două mari categorii: saprofite
sau condiționat patogene și patogene.
1.3 Caractere morfotinctoriale
Au dimensiuni cuprinse între 0,3 -1,0 x 1,0 -6,0 µm, fiind bacili Gram -negativi, cu
sau fără capsulă, ciliați sau neciliați, nesporulați. [4]
1.4. Caractere de cultură
Enterobacteriile cresc pe medii simple deoarece sunt germeni nepretențioși. Pentru
o creștere optimă au nevoie de temperaturi cuprinse între 22 -37C fiind germeni aerobi și
facultativ anaero bi. [4]
1.5. Caractere biochimice și de metabolism
Sunt catalazo -pozitive și oxidazo -negative. Au metabolism atât respirator cât și
fermentativ fiind bacteriii chemoautotrofe. Ulterior fermentării glucozei se formează acid
cu gaz sau fără gaz. [4]
1.6. Str uctura antigenică
Membrii Familiei Enterobacteriaceae au o structură antigenică complexă.
Antigenul somatic O (endotoxina) reprezintă unitățile terminale repetitive
polizaharidice ale lipopolizaharidului (LPZ) din peretele bacteriilor Gram -negative. LPZ
mai este format dintr -un miez (core), similar la toate bacteriile Gram negative, și lipidul A,

8
prezent la toate enterobacteriile, care este responsabil de activitatea toxică a acestora în
organismul gazdă. Antigenul somatic „O” este termostabil, rezistent la alcool. Poate fi
detectat prin reacții de aglutinare. Determină, în organismul gazdă, formare de anticorpi tip
IgM.
Antigenul H (flagelar) este de natură proteică determinând, în organismul gazdă,
formarea de anticorpi tip IgG care imobilizează bacteri a, ceea ce duce la atenuarea
virulenței acesteia. Se găsește la nivelul flagelilor. Este denaturat de alcool 50° și
temperatură de 70°C. Poate fi evidențiat prin reacții de aglutinare.
Antigenul K (capsular) este de natură polizaharidică și este prezent l a bacteriile
capsulate. Asigură bacteriilor rezistența la fagocitoză și caracterul de invazivitate. Prezența
acestuia duce la inaglutinabilitate în reacțiile de evidențiere ale antigenului somatic O.
Antigenul Vi (de virulență), de natură polizaharidică, îl întâlnim la Salmonella
serovar Typhi. Este un antigen de înveliș, mascând antigenul somatic O. Este implicat în
scăderea complementului seric, apariția leucopeniei și asigură tulpinilor de Salmonella
capacitatea de a se multiplica în macrofag. Poate fi evidențiat prin reacții de aglutinare.
Enterobacteriile pot fi identificate datorită prezenței antigenelor O, H, K și Vi,
clasificate în serogrupe și în cadrul acestora în serotipuri. Pe lângă aceste antigene mai
amintim și exotoxina care este reprezenta tă de toxina Shiga.
1.7. Caractere de patogenitate
Enterobacteriile sunt microorganisme care se găsesc în mediul înconjurător și/sau
au evoluat pentru a alcătui flora normală intestinală. Totuși, unii membrii au necesitat în
plus informație genetică asigu rată prin intermediul plasmidelor, transpozonilor și
bacteriofagilor, ceea ce a dus la apariția unor factori de patogenitate, aceste tulpini
devenind patogene. Informația genetică adițională poate fi codată cromozomial sau
extracromozomial.
Factorii de pa togenitate pot fi grupați după cum urmează:
1. Adezine. Enterobacteriile prezintă pili (fimbrii) care asigură aderarea la
mucoase, permițând bacteriilor colonizarea și multiplicarea. Acești pili se împart în 4 tipuri.
Tipul 1 de pili sunt manozo -sensibili . Ei se leagă de celula gazdă în același locus
ca și D -manoza. Sunt importanți în colonizarea normală a tractului gastro -intestinal. Alți
pili sunt manozo -rezistenți și nu se leagă de celula gazdă în același locus cu D -manoza.

9
Tipul 2 de pili sunt importan ți factori de virulență, ajutând microorganismele să
determine afecțiuni în afara zonei lor normale de acțiune. Există câteva tipuri de fimbrii,
printre care amintim pilii P, adezinele X, ambele fiind asociate cu E.coli uropatogene, și
BFP („bundle -forming pili”), care participă la atașarea de celula gazdă a unei tulpini
patogene de E.coli .
2. Invazinele sunt proteine care acționează local distrugând sau invadând celula
gazdă și/sau facilitând creșterea și răspândirea agentului patogen. Yersinia enterocoli tica
posedă o astfel de proteină de suprafață, numită invazină.
3. Toxinele produse de unele Enterobacterii se împart în două categorii: exotoxine
și endotoxine.
Exotoxinele sunt, după cum urmează:
– toxina Shiga (Shigella), codificată cromozomial, inhibă sinteza de proteine în
celula gazdă ducând la moartea acesteia;
– toxina Shiga -like (Shigella și unele tulpini de E. coli ), codificată bacteriofagic,
are același mecanism ca și toxina Shiga;
– toxina LT – termic labilă ( E.coli ), codificată plasmidic, are efect similar cu
exotoxina vibrionului holeric, determinând o secreție crescută de Cl -, Na+, H 2O;
– toxina ST – termic stabilă (ETEC), peptidă codificată plasmidic, este analoagă
unei proteine hormonale (guanylina) legându -se de același receptor ca aceasta (guanylat –
ciclaza C), determinând secreție de Cl -;
– alfa-hemolizinele, sunt citotoxine ( E.coli );
– beta-hemolizinele, legate de celulă, inhibă fagocitoza și chemotaxia leucocitelor.
Endotoxinele (antigenul O) sunt de natură lipopolizaharidică. Sunt respo nsabile de
instalarea:
– febrei,
– activării căii alternative a sistemului complement (C3a, C5a),
– efectelor asupra sistemului circulator; leucopenia, vasodilatația, scăderea
circulației periferice,
microhemoragii, peteșii, hipotensiune,
– efectelor de c oagulare sangvină (CID, tromboze, trombocitopenie),
– afectării metabolismului și a funcțiilor hepatice,

10
– scăderii sideremiei,
– hipoglicemiei,
– citotoxicității,
– necrozei de organ,
– șocului endotoxic.
4. Achiziția de fier. În organismul uman fierul nu se găsește liber, în formă
nelegată. Gazda umană produce o serie de proteine cu afinitate mare de legare a fierului,
acestea găsindu -se în țesuturi și pe suprafața mucoaselor (transferina, lactoferina, feritine,
mioglobina și hemoglobina). Acest mecanism de legare a fierului reprezintă și o cale de
control a creșterii bacteriene. Enterobacteriile, având nevoie de fier pentru creștere și
dezvoltare, au mai multe mecanisme de a -l acapara, cele mai importante dintre acestea
fiind:
– capturarea fierului de la transferină/lactoferină;
– folosirea Hem -ului rezultat în urma distrucției tisulare;
– producerea de siderofori speciali (enterobactin, aerobactin) care acționează
competitiv cu proteinele de legare a fierului. Acești siderofori chelează fierul, formând
complexul siderofor -fier care este apoi transportat în celula bacteriană prin receptori
specifici din membrana externă.
Acești transportori servesc, de asemenea, ca receptori pentru bacteriofagi și loc de
legare pentru colicin.
5. Structurile capsulare . Pri ncipala funcție a capsulei este să apere
microorganismul de fagocitoză. Dintre structurile capsulare amintim:
– antigenul K la E.coli , de natură proteică, cu rol în colonizare, diminuă
opsonizarea și fagocitoza. Antigenul K1, este similar structurilor self , slab imunogen.
Capsula de tip K1 a E.coli previne activarea căii alternative a sistemului complement;
– antigenul K la Klebsiella este un antigen capsular;
– antigenul Vi la Salmonella typhi.
6. Plasmidele codifică rezistența la antibiotice și caracterel e de virulență ale
enterobacteriilor.

11
7. Antioxidanții sunt compuși care protejează microorganismul de distrugerile ce
pot apare în prezența radicalilor liberi de oxigen. Este important de reținut că o
enterobacterie patogenă poate să nu prezinte toți fac torii de virulență.

12
2. Genul Escherichia
În cadrul genului Escherichia se reunesc specii prezente în intestinul uman,
descoperite pentru prima dată de către germanul Theodor Escherich in anul 1885. Abia în
anul 1935 s -a demonstrat rolul etiologic al unei tulpini de Escherichia coli (E. coli )
implicată intr -un episod de diaree la nou -născuți.
Din genul Escherichia fac parte 5 specii:
– Ecoli cu 2 biovaruri: normal și inactiv;
– E. blattae;
– E. fergusonii;
– E. hermanii
– E. vulneris . [4]
2.1. Caractere generale:
Habitatul natural al E. coli este tractul gastro intestinal al oamenilor și al
animalelor cu sânge cald. E. coli reprezintă la om, flora dominantă a intestinului gros,
având rolul de a menține o fiziologie normală a acestuia, fiind implicat și în sinteza uno r
proteine din grupul B și K. Este eliminat în mediul extern împreună cu materiile fecale și
poate contamina apa, solul, alimentele, plantele etc. .
E. coli este un bacil Gram negativ care poate prezenta uneori forme filamentoase.
Majoritatea speciilor sun t necapsulate și prezintă cili peritrichi, însă există și tulpini
imobile, iar unele prezentând capsulă, figura 1.1. [4,5]

Figura 2 .1.1. Structura E.coli [6]
Este un germen nepretențios, rezistent la mediul extern, cu o capacitate deosebită
de adaptare l a modificările de mediu cum ar fi modificări de pH, osmolaritate, temperatură

13
sau prezența unor minerale și poate crește pe medii simple (geloza simplă, geloză sânge și
geloză lactozată) unde glucoza este singurul constituent organic, figurile 1.2 -1.7.

Figura 2.1.2 Geloză simplă [7] Figura 2.1.3 Geloză sânge [8 ]

Figura 2.1.4 Geloză lactozată [9]

Figura 2.1.5 E.coli pe Geloză simplă [10 ] Figura 2.1.6 E. coli pe Geloză sânge
[11]

14

Figura 2.1.7 E.coli pe Geloză lactozată [12]
Diferențierea lor de alte enterobacterii se face folosind medii selective precum:
Mediul Levine, mediul Leifson și mediul Istrati -Meitert, figur ile 1.8 -1.14.

Figura 2.1.8 Mediu Levine [13] Figura 2.1.9 Mediu Leifson [14]

Figura 2.1.10 Istrati -Meitert [15]

15

Figura 2.1.11 E.coli pe mediu Levine (luciu metalic) [16]

Figura 2.1.12 E. coli (colonii mov ) pe mediu Levine [1 7]

Figura 2.1.13 E.coli pe mediu Leifson [18]

Figura 2.1.14 E.coli (colonii lactozo pozitive) pe mediu Leifson [19]

16

Figura 2.1.15 E. coli pe mediu Istrati -Meitert [20]
E.coli poate detecta cu ajutorul cililor, prezența sau absența unor substanțe chimice
și se poate apropia sau îndepărta de acestea. Prin producerea de fimbrii de adeziune, această
bacterie poate deveni imobilă și poate adera la substratul specific.
Poate acumula molecule mari de nutrienți sau poate elimina substanțe inhibitoare
prin mărirea dimensiunii porilor ca răspuns la modificările de osmolaritate sau temperatură.
E. coli este un germen aerob si facultativ anaerob având deopotrivă metabolism
respirator sau f ermentativ. În mediul lichid determina tulburare uniformă si inel aderent pe
peretele tubului, iar pe medii solide formeaza colonii de tip “S”.
Având un mecanism complex de reglare a metabolismului celulei bacteriene, E.
coli sintetizează doar acele enzim e de care are nevoie pentru a utiliza compușii de mediu și
poate opri sinteza enzimelor necesare obținerii unor metaboliți, atunci când aceștia sunt
prezenți în mediu și pot fi folosiți ca atare.
Datorită faptului că elaborează enzime care hidrolizează be talactaminele
(penicilinaze, cefalosporinaze) sau că prin mutații care afectează porinele produce
rezistență față de aminoglicozide, E.coli este un microorganism care dezvoltă rezistență față
de substanțele antibacteriene.
Este distrus de antiseptice si d ezinfectante uzuale dar și de coloranți ca verde de
malachit și c ristal violet.
E.coli produce acid și gaz prin fermentarea glucozei și a altor carbohidrați.
Majo ritatea tulpinilor sunt oxidazo -negative și sunt capabile să reducă nitriții în
nitrați. Desco mpun proteinele cu formare de indol și nu cu formare de H 2S. Nu produc
urează, nu cresc pe mediul cu citrat. Descompun lactoza cu eliberare de acid și dau reacția

17
roșu-metil pozitivă. Reacția Voges -Proskauer, utilizată pentru diferențierea între E.coli și
grupurile Klebsiella -Enterobacter, este negativă, rezultând o colorație galben maronie.
Tulpinile implicate de obicei în infecții urinare, determină hemoliză beta pe geloza
sânge.
Unele tulpini de E.coli, care posedă plasmidul “col”, eliberează substanțe t oxice
pentru alte tulpini bacteriene. Aceste substanțe se numesc colicine.
În funcție de colicinele produse se poate realiza o tipizare care permite distingerea
tulpinilor în cazul unui lizotip. Lizotipia are o aplicare largă din punct de vedere
epidemiolo gic deoarece furnizează informații despre răspândirea geografică a
serogrupurilor de E. coli încă din anii 1950. Aceasta este folosită și în cazul infecțiilor date
de ECEH pentru a determina alimentul care stă la baza infecției.[4,5]
Pentru tratamentul inf ecțiilor cu E. coli este necesară o antibiogramă deoarece sunt
prezente multe tulpini antibioticorezistente. Penicilinaza este codificată în cromozomul
bacteriei iar din acest motiv, E. coli este rezistent față de penicilină, chiar dinaintea folosirii
medi camentului. În ultimii ani suntem martorii apariției a peste 150 de tulpini cu β –
lactamază cu spectru larg ( ESBL – extended spectrum beta lactamase ) [5]
Având în vedere faptul ca sursa infecției poate fi atât endogenă cât și exogenă și că
majoritatea inf ecțiilor nosocomiale provin din flora endogenă, riscul crește direct
proporțional cu durata spitalizării. Infecțiile intraspitalicești pot fi datorate instrumentelor
contaminate sau personalului medico -sanitar.
Tulpinile de E. coli care provoacă infecții e nterale, provin din intestinul gros al
omului și al animalelor domestice. Infecțiile sunt transmise direct sau prin intermediul
alimentelor și apei contaminate cu tulpini patogene.[5]
În urma infecțiilor cu E. coli nu rămâne imunitate de durată.
Prevenția infecțiilor cu E. coli este dificilă și se poate realiza prin purificarea apei,
prevenirea contaminării mediului, igiena individuală corespunzătoare și procesarea corectă
a alimentelor. În momentul de față nu există seruri si vaccinuri împotriva colibacil ului [5]

18
Partea SPECIALĂ
1. Introducere
În zilele noastre este nevoie de o continuă evolu ție a metodelor de obținere a
medicamentelor pentru a face față numărului crescător de persoane care suferă de boli
acute, cronice , boli pentru care tratamentul est e foarte costisitor sau poate chiar inexistent.
De-a lungul anilor, Escherichia coli (E.coli) a fost un microorganism preferat
pentru producerea de prote ine recombinate, la scară largă oferind astfel o alternativă mai
usor de manipulat și de cele mai multe ori eficient ă din punct de vedere al costurilor
implicate.
Obiectivul acestei lucrări bibliografice reprezintă aducerea în actualitate a
utilizărilor Escherichiei coli în industria medicamentelor , luând în considerare progres ele
tehnologice din ultimii an i.
Având în vedere că E. coli poate fi folosit ca și organism gazdă adecvat, cu
sisteme eficiente, capabile de modificări pentru studierea sau ob ținerea altor produși , acest
bacil poate reprezenta o piatră de temelie pentru descoperirile ce urmeaz ă a fi re alizate în
urmatorii ani.
În cele ce urmeaz ă se vor prezenta principalele utiliz ări ale E.coli din ultimii 5-10
ani dar și poten țialul pe care acest bacil gram negativ îl are pentru viitor respectiv tratarea
bolilor al căror tratament este dificil sau chi ar inexistent în zilele noastre .

19
2. Escherichia coli utilizat la producerea de insulină
2.1. Prezentare generală
În ultimii ani , la nivel mondial, ne confruntăm cu o creștere alarmantă a incidenței
diabetului zaharat. În literatura de specialitate s -a speculat că numărul pacienților care
suferă de această afecțiune ar crește până la aproximativ 300 de milioane până în anul 2025
[21].
În consecință, cerința privind insulina va crește variat (aproximativ peste 16000 kg
/ an), iar productivitatea sistemului actual de expresie a insulinei nu ar fi suficientă pentru a
satisface viitoarele cerințe ale pieței.
Având în vedere că tehnologiile actuale de fabricație nu ar putea să răspundă
cererii tot mai mari de insulină accesibilă, datorită limitării capacității de producție și a
costului de producție ridicat , sunt necesare, de asemenea, sisteme de expresie eficiente
pentru producerea de insulină și trebuie dezvoltate noi metode alternative de administrare a
insulinei, cum ar fi administrarea orală sau inhalarea. Aceste căi de administrare , presupun
administrarea unor doze mai mari, fapt ce impune găsirea unor noi metode prin care să
crească producția de insulină recombinată în viitorul apropiat.
De la începutul anilor 1920, pacienții diabetici au fost tratați c u insulină, care a
fost purificată din pancreasul bovin sau porcin. Dezvoltarea în domeniul ingineriei genetice
a permis producția de insulină în E. coli și drojdie, care au fost aprobate pentru aplicații
terapeutice la om de către FDA [22, 23].
Structura de aminoacizi a insulinei porcine a fost determinată la începutul anilor
1950 de Frederick Sanger [24, 25, 26]. Ulterior, a urmat elucidarea structurii chimice a
insulinei umane de către Nicol și Smith [27].
Prima insulină umană biosintetică a fost concepu tă genetic și produsă în E. coli în
anii 1970 de Arthur Riggs și Keiichi Itakura la Institutul de Cercetare Beckman din Orașul
Hope în colaborare cu Herbert Boyer de la Genentech [28,29].
De-a lungul anilor, au fost descrise cele mai răspândite metode de e xprimare a
proteinelor recombinante în citoplasmă sau periplasma bacteriei E. coli , precum și strategii
pentru obținerea produsului în mediul de creștere.
Fabricarea de proteine recombinate terapeutice necesită un organism gazdă
adecvat cu sisteme efici ente pentru modificări posttranslaționale și refolosirea proteinelor.

20
Expresia recombinantă în E. coli influențează fiziologia celulară și declanșează un
răspuns la stres, care trebuie luat în considerare în dezvoltarea procesului. Creșterea
expresiei unei proteine funcționale poate fi realizată prin optimizarea genei, a plasmei, a
celulei gazdă și a procesului de fermentație [30].
Așadar, pentru utilizarea terapeutică la om, insulina umană recombinantă a fost
produsă predominant utilizând E. coli și Sacc haromyces cerevisiae. În acest review, mă voi
concentra asupra diferitelor abordări care pot fi exploatate pentru a crește producția unei
insuline biologic active și a analogilor acesteia în E. coli [31]
Activitatea de pionierat a lui Stanley Cohen și a lu i Herbert Boyer, care a inventat
tehnica clonării ADN -ului, a condus la nașterea ingineriei genetice, care a permis ca genele
să se transfere cu ușurință între diferite specii biologice [32]
Dezvoltarea în domeniul ingineriei genetice a permis producția de insulină în E.
coli și drojdie, care au fost aprobate pentru aplicații terapeutice la om de către FDA, p rimul
medicament licențiat produs folosind tehnologia ADN recombinant fiind insulina umană.
Insulina umană este o polipeptidă cu o masă moleculară de 5 808 Da. Acest
hormon este constituit din două lanțuri: lanțul A (alcatuit din 21 de aminoacizi) și lanțul B
(alcatuit din 30 de aminoacizi), conectate între ele prin două punți disulfidice. În plus,
lanțul A conține o legătură disulfidică în interiorul lan țului.
Pe piața farmaceutică, există peste 300 de produse biofarmaceutice, inclusiv
proteine terapeutice și anticorpi. Anticorpii monoclonali terapeutici au captat cota majoră
de piață, urmată de hormoni și factori de creștere.
Conform studiilor, exist ă produse biofarmaceutice aprobate care au fost produse
într-unul din cele trei sisteme gazdă mai importante: bacteria Escherichia coli , drojdiile
(Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) și celulele mamiferelor.
Așadar, produsele biofarmaceutice aprob ate în SUA de Administrația pentru
Alimente și Medicamente (FDA) și Agenția Europeană pentru Medicamente (EMA) din
2004 până în 2013 sunt în mare parte derivate din:
 Celula de mamifere (56%);
 E. coli (24%);
 S. Cerevisiae (13%);
 Animalele și plantele transg enice (3%)

21
 Celulele insectelor (4%)
Însă în prezent, insulina folosită pentru tratamentul pacienților diabetici este
produsă predominant în E. coli și Saccharomyces cerevisiae.
Folosind sistemul de expresie pe bază de E. coli , precursorii de insulină ( IP) sunt
produși ca niște corpuri de incluziune, iar în cele din urmă sunt obținute, prin procedee de
solubilizare și refolosire, polipep tide pe deplin funcționale [31]
2.2. Avantaje și dezavantaje ale folosirii E. coli în obținerea insulinei
Din categor ia organismelor procariote, Escherichia coli a fost întotdeauna unul
din modelele cel mai bine studiat și preferată pentru producerea de proteine recombinante,
datorită multiplelor avantaje :
 rata de creștere ridicată
 mediu de cultură nepretențios
 ușor de manevrat
 randament ridicat
 foarte rentabil din punct de vedere finaciar
Cu toate acestea, există unele dezavantaje folosind sistemul de expresie E. coli ,
cum ar fi:
 pierderea plasmidei
 pierderea proprietății antibiotice,
 inductorii nesolicitați pentr u exprimarea genelor,
 acumularea intracelulară de proteine heterologice ca și corpi de incluziune.
 refolosirea inadecvată a proteinelor,
 lipsa modificărilor post -translaționale (inclusiv incapacitatea de a forma
legături disulfurice),
 sarcina metaboli că mediată de proteine și stresul,
 contaminarea cu endotoxine
 secreția slabă
 digestia proteolitică [33,34]

22
2.3. Structura și funcția insulinei
Insulina umană este compusă din 51 de aminoacizi și are o greutate moleculară de
5808 Da. Este produsă de cel ulele beta ale pancreasului și joacă un rol -cheie în reglarea
metabolismului carbohidraților și a grăsimilor din organism. Insulina este sintetizată ca o
singură polipeptidă cunoscută sub numele de preproinsulină în celulele beta pancreatice.
Preproinsul ina cuprinde o peptidă semnal de 24 de resturi, care direcționează
polipeptida născândă spre reticulul endoplasmatic.
Peptida semnal este scindată deoarece polipeptida este translocată în corpul
reticulului endoplasmatic care are ca rezultat formarea de pr oinsulină. În reticulul
endoplasmic, proinsulina este pliată în confirmare corectă cu formarea a 3 legături de
disulfură.
Proinsulina plată este apoi transportată în rețeaua trans -Golgi, unde este
transformată în insulină activă prin endopeptidaze celula re numite convertaze
prohormonice (PC1 și PC2) și exoprotează carboxipeptidază E.
Endopeptidazele se scindează în două poziții, rezultând eliberarea unui fragment
denumit peptidă C. [31], [35,36].
2.4. Obținerea de insulină
E. coli este un microorganism pr eferat pentru producerea pe scară largă a
proteinelor recombinante. Cu toate acestea, mai multe dezavantaje îi limitează utilizarea
pentru producerea de substanțe biofarmaceutice recombinante.
Diferitele modificări post -translaționale (PTM), cum ar fi glic ozilarea, fosforilarea,
procesarea proteolitică și formarea legăturilor disulfidice, care sunt foarte importante pentru
activitatea biologică, nu apar în E. coli [31], [37, 38].
2.4.1 Utilizarea N -glicozilării
Glicozilarea este modificarea predominantă a protein ei pentru a diversifica
funcționalitatea proteinelor. În particular, glicozilarea proteinei N -legată poate crește
proprietățile biofizice și farmacocinetice ale proteinelor terapeutice.
Cu toate acestea, provocările majore în studierea consecințelor glicoz ilării proteice
la nivel molecular sunt cauzate de heterogenitățile glicanelor ale sistemelor de expresie
eucariote utilizate în prezent, dar descoperirea sistemului de glicozilare a proteinelor N –

23
legat în Campylobacter jejuni și proteomicul ei la Escheric hia coli a deschis posibilitatea
producerii de glicoproteine în bacterii [39].
Glicozilarea N -legată este cea mai obișnuită modificare posttranslațională a
proteinelor din eucariote. S -a descoperit că bacteria Campylobacter jejuni posedă
capacitatea de a glicozila proteinele și s -a arătat, de asemenea, că o cale funcțional activă de
N-glicozilare poate fi transferată în E. coli [40].
Deși structura N -glicanului bacterian este diferită de cea observată în eucariote,
ingineria căii de glicozilare a Campyl obacter N -legat în E. coli oferă o oportunitate de a
exprima proteine heterologice în formă glicozilată în E. coli .
Expresia oligozahariltransferazei Pglb sau (OTasei) din C. jejuni în E. coli a arătat
o creștere semnificativă a randamentului glicoprot einei [41].
Studiile recente au arătat că s -au făcut eforturi pentru a produce proteine
glicozilate cu substraturi, altele decât native și non -native la E. coli și C.jejuni [42, 43].
Vaccinurile cele mai eficiente și mai sigure împotriva agenților pato geni bacterieni
sunt vaccinurile conjugate, în care antigenii polizaharidici sunt legați covalent de proteinele
transportoare.
O metodă mai simplă pentru producerea de vaccinuri conjugate a fost cuplarea
enzimatică in vivo utilizând calea generală de gli cozilare a Campylobacter jejuni în
Escherichia coli recombinată Deoarece producția vaccinurilor conjugate utilizând metode
chimice este un proces laborios, în mai multe etape [44].
2.4.2. Utilizarea codonului proteinei heterologice
De asemenea, un rol major în de terminarea nivelului de exprimare a proteinei
recombinante îl joacă utilizarea codonului proteinei heterologice. Dacă utilizarea codonului
proteinei heteroloage diferă semnificativ de utilizarea medie a codonului gazdei E. coli ,
aceasta ar putea avea ca re zultat o exprimare foarte scăzută.
În mod obișnuit, frecvența utilizării codonului reflectă abundența ARNt
corespunzătoare.
Prin urmare, diferențele semnificative în utilizarea codonului ar putea conduce la
terminarea prematură a translației, la neincorpor area aminoacizilor și la inhibarea sintezei
proteinelor.

24
Exprimarea proteinelor heteroloage în E. coli poate fi îmbunătățită prin înlocuirea
codonilor care sunt rar găsiți în genele E. coli cu exprimare foarte înaltă cu codoni majori
mai favorabili.
În m od similar, co -exprimarea genelor care codifică un număr de ARNt pentru
codonul rar, poate spori expresia proteinelor heterologice în E. coli . Există câteva tulpini
comerciale de E. coli disponibile care codifică ARNt pentru codoni rari, cum ar fi BL -21
(DE3) CodonPlus -RIL(figura 2.1) , BL -21 (DE3) CodonPlus -RP (Stratagene, SUA) și
Rosetta (DE3).
BL-21 (DE3) CodonPlus -RIL conține genele ARNt pentru codoni rari cum ar fi
AGG, AGA (arginină), AUA (izoleucină) și CUA (leucină).

Figura 2.1 BL-21 codon plus ri l [45]
În mod similar, tulpina Rosetta (DE3) conține genele ARNt pentru codoni rari cum
ar fi AGG, AGA (arginină), CGG (arginină), AUA (izoleucină), CUA (leucină), CCC
(prolină) și GGA (glicină).
Acești codoni rari au fost asociați cu expresia scăzută a p roteinelor în E. coli , prin
urmare aplicarea acestor tulpini gazdă de E. coli modificat genetic poate îmbunătăți nivelul
de exprimare a proteinelor heterologice și astfel poate conduce la un randament mai ridicat
al proteinei dorite [46, 47, 48].

25
2.4.3. Utiliza rea tulpinilor de E. coli cu deficit de protează
Utilizarea tulpinilor de E. coli cu deficit de protează, care conțin mutații ce elimină
producerea proteazelor, poate, de asemenea, îmbunătăți randamentul proteinei recombinate
prin reducerea degradării prot eolitice.
Tulpina E. coli BL-21 este deficitară în două proteaze codificate de genele lon
(citoplasmatic) și ompT (periplasmice) [49].
În tulpinile de E. coli , proteinele terapeutice complexe și mari pot fi secretate în
periplasmă deoarece asigură un medi u de oxidare și ajută la formarea legăturilor disulfidice
care facilitează plierea corectă a proteinelor recombinante și care pot produce N -terminal
fiabil al proteinei exprimate [ 50]
Periplasma prezintă avantaje față de citoplasmă:
 concentrația scăzu tă a proteinei
 activitate proteolitică,
 îmbunătățește titrul de producție
 crește solubilitatea proteinei recombinate [51]
Având în vedere aceste modificări și evoluții avansate, are loc o facilitare a
procesului de producție a proteinei țintă, accelerâ nd astfel dezvoltarea medicamentului [52].
Insulina umană recombinată a fost produsă inițial din E. coli de către Genentech în
1978, folosind o abordare care a necesitat exprimarea ADNc chimic sintetizat care codifică
lanțurile de insulină A și B separat î n E. coli .
După exprimarea independentă, cele două lanțuri sunt purificate și co -incubate în
condiții de reacție optime, conducând la generarea de insulină intactă și bioactivă prin
formarea legăturii disulfidice.
Prima insulină recombinată comercială a f ost dezvoltată pentru utilizare
terapeutică la om prin această procedură combinată cu două lanțuri [53].
O altă abordare implică exprimarea unui ADNcomplementar singur sintetizat
chimic care codifică pro -insulină umană în E. coli , urmat de purificarea și e xcizia ulterioară
a peptidei C prin digestie proteolitică.
Această abordare a fost mai eficientă și convenabilă pentru producerea la scară
largă a insulinei terapeutice în comparație cu abordarea celor două lanțuri combinate și a
fost utilizată comercial î ncepând din 1986.

26
Cu toate acestea, avansarea în domeniul ingineriei genetice și dezvoltarea
tehnologiei pentru sintetizarea chimică a genelor cu secvențe nucleotidice modificate a
facilitat dezvoltarea analogilor de insulină cu secvența de aminoacizi modi ficată.
Din literatura de specialitate, s -a constatat că insulina nativă există, de obicei, în
preparatele comerciale în formă oligomerică, ca hexamer conținând zinc datorită
concentrației foarte mari, dar în sânge, insulina biologic activă este în formă monomerică.
Prin urmare, acest complex oligomeric trebuie să disocieze astfel încât insulina să poată fi
absorbită din locul injectării în sânge [31].
Datorită acestui fapt, insulina recombinată injectată subcutanat are de obicei un
debut lent în corelație cu concentrația plasmatică maximă înregistrată la 2 ore de la
injectare și o durată mai lungă de acțiune care durează 6 -8 ore.
Prin urmare, pentru a dezvolta un analog de insulină cu acțiune rapidă, a fost
necesară modificarea resturilor de aminoacizi ale căror lanțuri laterale sunt implicate în
formarea dimerului sau a oligomerului. S -a demonstrat că resturile de aminoacizi din lanțul
B al insulinei, în special B 8, 9,12, 13, 16 și 23 -28, joacă un rol critic în pr ocesul de
oligomerizare [54,55]
2.5. Prepa rate industriale cu insulina provenită din tulpini de E. coli
2.5.1. Insulina umană – Humulin R 100 UI/ml soluție injectabilă în flacon
Insulina umană (Figura 2.5.1.2. ) este un hormon produs în insulele β ale celulelor
pancreatice [56], fiind responsabile de reg larea metabolismului glucozei.
Structura de aminoacizi a insulinei porcine a fost determinată la începutul anilor
1950 de Frederick Sanger. Ulterior, a urmat elucidarea structurii chimice a insulinei umane
de către Nicol și Smith [57].

Fig. 2.5.1.1 Insul ina umană [58].

27
Humulin, produsă de către Eli Lilly, a fost prima insulină recombinată aprobată în
1982 pentru tratamentul pacienților diabetici.
Medicamentele Humulin (Figura 2.3) conțin insulină umană de biosinteză obținută
pe Escherichia coli prin tehn ica ADN -ului recombinant.
Această insulină recombinată, de primă generație, are o secvență de aminoacizi
identică cu insulina umană nativă și este preferată față de produsele de insulină derivate din
animale [59].

Figura 2.5.1.2 Insulina umană [60].
2.5.2. Insulina Lispro – Humalog 100 unități/ml, soluție injectabilă în flacon
Lispro, dezvoltat de Eli Lilly, a fost primul analog de insulină cu acțiune rapidă care a
dobândit aprobarea de reglementare pentru utilizare terapeutică în 1996 [61].
Insulina Lispro (Figura 2.5.2.1 ) prezintă o secvență de aminoacizi similară cu cea
a insulinei native, dar are o inversare a secvenței prolină -lizină în pozițiile 28 și 29 a
lanțului B, ceea ce a dus la interacțiuni hidrofobe reduse și astfel a împiedicat formarea
dimerilor .
Pentru producția comercială a insulinei Lispro, ADN -ul complementar sintetic
care codifică proinsulina umană a secvenței prolină -lizină în pozițiile 28 și 29 a lanțului B,
a fost obținută în E. coli și insulina Lispro a fost extirpată proteolitic din pro insulină prin
tratarea cu tripsină și carboxipeptidază.

28

Figura 2.5.2.1 Insulina lispro [62]
2.5.3. Insulina glulizin
Apidra 100 Unități/ml soluție injectabilă în flacon
Apidra 100 Unități/ml soluție injectabilă în cartuș
Apidra SoloStar 100 Un ități/ml soluție injectabilă în stilou injector
(pen) preumplut (Figura 2.5 .3.1)
Un alt analog de insulină cu acțiune rapidă produsă în E. coli este glulizina
(Apidra), care a fost dezvoltat de Aventis Pharmaceuticals și aprobat de autoritățile de
reglemen tare din SUA în 2004.
Insulina glulizină este produsă din Escherichia coli , folosind tehnica ADN -ului
recombinant. Astfel, insulina glulizină a fost obținută prin înlocuirea asparaginei din poziția
3 a lanțului B cu o lizină și lizina din poziția 29 a lan țului B înlocuită cu acid glutamic [63]

Figura 2.5.3.1 Insulina glulizin . [64]
2.5.4. Insulina glargin – Lantus 100 unități/ml soluție injectabilă în flacon (Figura
2.5.4.2 )
– Lantus 100 unități/ml soluție injectabilă în cartuș

29
– Lantus SoloStar 100 unități/ml soluție injectabilă în
stilou injector (pen) preumplut (Figura 2.5.4.1 )

Fig. 2.5.4.1 Insulina lantus SoloStar [65] Fig. 2.5.4.2 Insulina lantus [66]
Insulina glargin este un analog de insulină umană cu d urată lungă de acțiune
produs prin tehnologia ADN -ului recombinant pe tulpini de Escherichia coli [67].
Pentru a evita injectarea multiplă, au fost astfel creați analogii de insulină cu
durată lungă de acțiune. Insulina Glargin este unul dintre astfel de a nalogi de insulină cu
durată lungă de acțiune, dezvoltat de Aventis Pharmaceuticals și aprobat de autoritățile de
reglementare din SUA și UE în 2000.
Insulina glargin a fost obținută prin înlocuirea asparaginei C -terminale a catenei A
cu un rest de glicină , iar C -terminalul lanțului B a fost modificat prin adăugarea a două
resturi de arginină.
Aceste modificări au dus la creșterea punctului izoelectric (pI) de la 5,4 la valorile
neutre. Glargina a fost produsă ca pro -insulină și exprimată folosind tulpini d e E. coli și a
fost în final formulată la pH 4 în formă solubilă. Cu toate acestea, după administrarea
subcutanată, a precipitat datorită pH -ului neutru în țesutul subcutanat. Resolubilizarea
insulinei apare lent, ducând la o durată mai lungă de eliberare în sânge [68].

30
3. Obținerea Hormonului de crestere cu ajutorul E. coli
3.1.Sistemul de expresie al E. coli folosit la producerea hormonului uman de
creștere (hGH)
Hormonul uman de creștere (hGH) a fost una dintre primele proteine recombinante
aprobate pentru tratamentul tulburărilor de creștere la oameni.
Printre avantajele Escherichiei coli , folosit ca sistem de expresie la producerea la
orice scară a hormonului uman de creștere (hGH), se numără:
 dimensiunile sale mici (191 de aminoacizi)
 deținerea a numai 2 legături disulfură
 absența modificărilor posttranslaționale [69]
3.2. Utilizarea analogului de protează Ubp1 pentru a produce hormon de
creștere uman recombinant în Escherichia coli
În literatura de specialitate, au fost descrise numeroase metode de exprimare a
hormonilor de creștere umană (hGH) în condițiile convenționale de fermentație și de
inducție.
În ciuda progreselor semnificative înregistrate în acest domeniu în ultimii ani,
producția de hGH recombinant prin utilizarea sistemelor de expresie c elulară necesită încă
o optimizare suplimentară.
Fuziunea ubiquitinei (Ub) cu proteina hGH a permis creșterea eficienței globale a
biosintezei și îmbunătățirea stabilității proteinei. Ub este o proteină compusă din 76 de
resturi de aminoacizi cu o masă mo leculară de 8,6 kDa, fiind prezeentă în toate eucariotele.
Ubiquitina este o molecula mică, care servește în semnalizarea mecanismului de
transport al proteinelor către proteozomi, pentru degradare.
Această proteină este un element sistemului universal de modificare a proteinei,
care nu apare în bacterii și este un transportor util pentru proteinele heterologice obținute
prin exprimare în Escherichia coli . Purificarea proteinelor de fuziune Ub este mai ușoară
decât cea a proteinelor recombinante neconjugate , iar Ub poate fi îndepărtată prin proteaze
de deubiquitinare (DUB sau UBP) [70].
Proteaza UBP1 este o protează de cisteină din drojdie, formată din 809 aminoacizi,
care desprinde ubiquitina de proteinele fuzionate la capătul C -terminal și se leagă la Ub
printr-o legătură esterică în timpul reacției.

31
Activitatea proteazei depinde de capacitatea sa de a ceda peptida Ub fuzionată prin
capătul C -terminal la alte polipeptide, indiferent de secvența de aminoacizi a fragmentului
fuzionat [71].
În unele sisteme d e expresie, proteinele de interes sunt exprimate mai întâi ca
fuziuni cu Ub sau derivații săi și apoi recuperați utilizând o enzimă de eliminare a Ub (de
exemplu, UBP1) [72] .
Această abordare are multe avantaje, inclusiv îmbunătățirea calității și eficien ței
expresiei proteinei, precum și simplificarea procesului de purificare, care au o importanță
deosebită în producția industrială de proteine recombinante [70, 73].
În procesele tehnologice, pentru o activitate catalitică maximă, sunt necesare
cantități m ari de enzime de deubiquitină (DUB). Cu toate acestea, majoritatea protocoalelor
de expresie disponibile în prezent nu conduc la o expresie eficientă a DUB, ceea ce le
limitează foarte mult aplicabilitatea, în special în procesele industriale.
În producer ea unei proteine specifice pentru aplicare terapeutică, în special a
hormonului de creștere uman (hGH), puritatea și activitatea enzimelor utilizate sunt factori
importanți.
Așadar, conform studiilor de specialitate sunt descrise diferite soluții pentru a
satisface aceste cerințe. Cu toate acestea, există încă o necesitate pentru o metodă de
obținere a unei enzime DUB foarte activă la nivel de gram pentru producerea de peptide
bioactive [74] .
Astfel, în ultimii ani, au fost dezvoltate metode eficiente d e obținere a hGH din
celulele bacteriene, în special de la Escherichia coli . Această metodă ar putea genera
cantități de proteină la nivel de gram cu activitate adecvată pentru aplicare în producția de
preparate farmaceutice [70].
3.3.Hormonul de creștere uman (hGH)
Hormonul de creștere uman (hGH), cunoscut și sub denumirea de somatotropină,
este o polipeptidă cu catenă unică formată din 191 aminoacizi în total. Acesta este sintetizat
și secretat de celulele cunoscute sub numele de somatotrofe în hipofiza a nterioară.
În timpul vieții unui individ, cele mai mari cantități de hormon de creștere sunt
produse în timpul pubertății în lobul anterior sau în porțiunea glandulară a hipofizei. hGH
este sintetizat ca precursor și eliberat în sânge în urma modificăril or post -translaționale.

32
Hormonul este utilizat în tratamentul anumitor forme de afecțiuni genetice cauzate
de deficiențe de hGH, în terapia obezității și în tratamentul rănilor și arsurilor. Studiile
clinice indică faptul că hGH ajută la diminuarea efectel or devastatoare ale răspunsului
hipermetabolic la arsură, în special la copii. Acestea sunt motivele pentru care cererea
pentru acest hormon este foarte mare [75, 76] .
Conform studiilor anterioare, ubiquitina (Ub), cea mai scurtă proteină cunoscută, a
fost folosită pentru a spori nivelul expresiei proteinei [70].
Astfel, într -un studiu realizat în anul 2014, s -a obținut expresia eficientă a genei
de fuziune Ub -hGH în tulpini de E. coli și a fost utilizat analogul UBPD2C al proteazei
UBP1 pentru a scinda f ragmentul Ub de la capătul N -terminal al hGH. Gena polipeptidului
hibrid a fost clonată în mai mulți vectori de expresie, iar plasmidele rezultate au fost
utilizate pentru a transforma tulpinile de E. coli DH5a și NM522.
Celulele E. coli DH5a au fost găsit e a fi cele mai potrivite în ceea ce privește
nivelul de expresie al acestei gene de fuziune și procesul de purificare a proteinei.
În multe cazuri, randamentul global al proteinei biologic active este foarte scăzut,
iar metodele de purificare a hGH nu sun t adesea eficiente sau consumatoare de timp.
O abordare alternativă, care a fost dezvoltată, implică solubilizarea completă și
purificarea rhGH produsă în E. coli . Astfel, s -au descris modalități de obținerea a expresiei
hGH și His -hGH prin inducerea IPTG (Isopropil -β-D-galactozide) și purificarea acestora pe
coloana Ni -NTA.
Exprimarea la nivel înalt a hGH în E. coli conduce la agregate de proteine
insolubile ca organisme de includere adesea observate cu multe alte proteine eucariote.
Prin urmare, hGH -ul agregat necesită etape de solubilizare și re -înfășurare înainte
de purificare prin cromatografie, iar recuperarea globală a proteinei este semnificativ
afectată de eficiența acestor etape de pre -purificare.
În general, proteinele agregate trebuie să fi e solubilizate utilizând concentrații mari
de denaturați cum ar fi ureea sau clorhidratul de guanidină (GnHCI), urmată de
îndepărtarea denaturanților pentru re -coagularea proteinelor.
În multe cazuri, totuși, r andamentul global al proteinei biologic active din
corpurile de incluziune este foarte scăzut, iar aceste proceduri de purificare sunt adesea
costisitoare și consumatoare de timp.

33
De aceea, s -au făcut eforturi considerabile pentru creșterea eficienței sol ubilizării
și re-conservării ca mijloc de îmbunătățire a recuperării globale a hGH activ din punct de
vedere biologic de la corpurile de incluziune.
O abordare alternativă care a fost dezvoltată pentru a preveni formarea corpurilor
de incluziune se bazeaz ă pe secreția hGH în spațiul periplasmic bacterian folosind o peptidă
semnal. Randamentele asociate cu expresia periplasmică utilizând diferite construcții de
expresie au fost investigate pe scară largă în diferite condiții.
E. coli a fost utilizat în mod eficient pentru producerea cu randament ridicat a
multor proteine recombinante. Cu toate acestea, expresia la nivel înalt conduce deseori la
agregate de proteine insolubile, cum ar fi corpurile de incluziune, și necesită astfel etape
suplimentare, incl uzând solubilizarea și refolosirea înainte de purificare. Deși formarea
corpurilor de incluziune are anumite avantaje, cum ar fi izolarea convenabilă și protecția
față de proteoliză, recuperarea activității biologice a fost adesea nesatisfăcătoare. În plus ,
resolubilizarea agregatelor de proteine poate fi problematică, necesită utilizarea unor
concentrații mari de denaturați și, în general, procesul de reîncărcare necesită o optimizare
extensivă.
Exprimarea la nivel înalt a hormonului de creștere uman rec ombinant (hGH) în
Escherichia coli (E. coli ) conduce la formarea de agregate insolubile ca corpuri de
incluziune lipsite de activitate biologică.
Până de curând, s -au făcut eforturi semnificative pentru a îmbunătăți recuperarea
hGH activ de la organismele de incluziune.
Kim și colaboratorii săi au demonstrat prepararea eficientă a hGH solubil direct
din spațiul citoplasmatic al tulpinilor de E. coli , în condiții optimizate, în care agregarea
proteinelor a fost minimizată. Astfel, în cadrul acestui studiu, s -a dezvoltat o procedură
eficientă pentru producerea de hGH complet solubil prin minimizarea formării corpurilor
de incluziune și optimizarea condițiilor de purificare a proteinelor. În condițiile nou create,
s-a reușit obținerea unei mari cantități de hGH total în fracția solubilă.
Așadar, Kim și colaboratorii săi au arătat că proteina solubilă poate fi purificată
eficient cu randament ridicat, printr -o serie de proceduri cromatografice. S -a analizat hGH –
ul rezultat utilizând diferite tehnici analitice, cu m ar fi cromatografia lichidă de înaltă
performanță în fază inversă (RP -HPLC), cromatografia de excludere a mărimii (SEC),

34
masa matricei de ionizare a desorbției cu laser (MALDI -TOF) spectrometrie și dicroism
circular (CD).
Aceste analize multiple sprijină concluzia că am obținut hGH foarte pur cu masa
moleculară preconizată și structura secundară intactă. Activitatea biologică a hGH purificat
a fost, de asemenea, confirmată prin evaluarea efectului său de promovare a creșterii
utilizând un test de prolifer are celulară. Luate împreună, vom descrie o strategie directă
pentru producerea de hGH complet solubil și activ din punct de vedere biologic în E. coli .
Deși s -a descoperit că o scădere a temperaturii de inducție scade semnificativ
formarea corpurilor de i ncluziune, cantități considerabile de hGH recombinant s -au găsit
încă în fracția de pelete insolubile.
Spre deosebire de corpurile de incluziune produse prin inducție la temperaturi
ridicate, s -a reușit solubilizarea majoritatății hGH -ului granulat, sub c ondițiile optimizate
de extracție a proteinei. Această observație sugerează că acestea sunt agregate de proteine
reversibile sau clustere, mai degrabă, decât corpuri de incluziune, probabil rezultând din
interacțiuni ne -covalente cu proteine. [77].
În literatura de specialitate, este cunoscut faptul că hGH conține două legături
disulfidice intramoleculare, una între Cys -53 și Cys -165 și cealaltă între Cys -182 și Cys –
189 [78].
Deși pentru unele proteine legăturile disulfurice sunt cruciale pentru plierea l or,
deoarece reducerea legăturilor disulfidice poate conduce la proteine inactive, studiile
anterioare arată că legăturile disulfidice din hGH nu par a fi necesare pentru activitatea
biologică.
Deși hGH a fost exprimat ca o formă redusă în spațiul citoplas matic E. coli , s-a
constatat că resturile de cisteină ale hGH au fost oxidate spontan și s -au format legături
disulfidice intramoleculare.
Prin urmare, efectele combinate ale condițiilor optimizate de exprimare, de
extracție și de purificare a proteinei au crescut semnificativ recuperarea globală a hGH
solubil, care este intact structural și biologic activ.
Concluzionând studiul lui Kim, procedurile stabilite de acesta și colaboratorii săi,
pot fi utilizate în industria biofarmaceutică pentru a purifica efi cient hGH recombinant din
E. coli [77].

35
4. Inginerie genetică bacteriană
Ingineria genetică cuprinde tehnici efectuate în vitro cu gene, cromozomi sau
celule întregi în scopul construirii unor structuri reprogramate genetic. Ingineria genetica
poate fi împăr țiă în doua mari categorii
 inginerie genetică celulară reprezentată de fuziunea de protoplaști
 inginerie genetică moleculară reprezentată de tehnologia de ADN
recombinat
Clonarea unor gene de origini diferite, atât în celula eucariotă cît și în celula
procariotă, din molecule de ADN recombinate, se realizează in vitro printr -ul ansamblu de
metode ce reprezintă tehnologia ADN recombinat.
Pentru realizarea acestei tehnologii este nevoie de construirea unor vectori de
clonare, izolarea unor gene de interes (d enumite inițial ADN pasager, în prezent, ADN
heterolog) și utilizarea unui echipament enzimatic corespunzător: endonucleaze de
restricție, polimeraze, ADN ligaze, fosfataze alcaline, exonucleaze, terminaltransfe raze,
revertranscriptaze, etc.
4.1. Vectori utilizați în clonarea genetică la Escherichia coli
Vectorii reprezintă molecule de ADN în interiorul cărora se introduc fragmentele
de ADN de studiat (ADN pasager, heterolog), ce poate fi de origine procariotă sau
eucariotă. Vectorii pot fi clasificați în funcție de diferite criterii:
a) posibilitatea studierii exprimării fragmentelor de ADN pasager, vectorii se
împart în:
 vectori de clonare – permit doar clonarea unor fragmente de ADN pasager,
dar nu și analiza exprimării acestora
 vectori de exprimare (implicit și de clonare) – au în structură secvențe de tip
promotor, permițănd atât clonarea, cât și analiza exprimarii fragmentului clonat.
4.1.1 . Vectori de clonare plasmidiali
Primul plasmid natural care a fost folosit în experimente de clonare genetică este
plasmidul Col E1 de la Escherichia coli (Figura 2.8) . Este neconjugativ, produce colicina
E1 și conferă gazdei imunitate la această colicină [79].

36

Figura 4.1.1 .1 Plasmidul ColE1 [79]

Au fost folosite ulterior si alte plasmide naturale -pSC101 ș i pRS2124 care permit
o selecție mai ușoară a transformanților datorită genei de rezistență la ampicilină și,
respectiv, rezistență la tetraciclină.
Dupa finalizarea unor asemenea testări a plasmidelor naturale, s -a concluzionat că
este necesară construcț ia unor plasmide artificiale, destinate exclusiv experimentelor de
clonare. Voi prezenta în cele ce urmează câteva astfel de plasmide artificiale ce pot fi
utilizate ca vectori de clonare.
4.1.2 . Vectori derivați din fagi filamentoși
AND -ul fagic pătrunde în celula bacteriană după care inițiază ciclul de replicare cu
ajutorul unei fome intermediare de replicare dublu catenare.
4.1.3 . Vectori de clonare hibrizi de tip fagimide
Fagimidele sunt vectori hibrizi ce combină caractere de plasmide cu caractere de
fagi filamentoși.
4.1.4 . Vectori derivați din genomul bacteriofagului λ
Bacteriofagul λ a ocupat un rol central în experimentele de clonare încă de când a
fost folosit pentru prima dată ca vector de clonare(Murray și Murray 1974).
În prezent, au fost const ruiți și sunt comercializați o serie de vectori suficient de
sofisticați, realizați pe baza analizelor de genetică și fiziologie a acestui virus.

37
4.1.5 . Vectori de clonare hibrizi de tip cosmide
Cosmidele sunt vectori hibrizi ce conțin ADN plasmidial și situsul cos din
genomul fagului λ [ 79].

38
5. Utilizare a E.coli în obținerea vaccinurilor
Există o nevoie urgentă de a dezvolta vaccinuri eficiente împotriva bolilor
infecțioase care continuă să fie cauze majore de morbiditate și mortalitate la nivel mondial.
Producerea vaccinurilor eficiente necesită selectarea unui adjuvant pentru a întări un
răspuns imun adecvat și protector
Moleculele au fost analizate în cultura celulară pentru capacitatea lor de a iniția
activitate stimulatoare imunitară.
În urma realizăr ii mai multor teste, a fost prezentată o producție promițătoare de
citokine in vitro. Citokinele sunt molecule de natură proteică ce transmit informații între
diferite celule. Au rolul important de a transmite informații între celulele sistemului imun –
leucocitele. Citokinele intervin și în mecanismele inflamației și în apărarea contra agenților
infecțioși, în apărarea antitumorală și în șocul septic.
Generațiile următoare de vaccinuri necesită adjuvanți eficienți, cu potențialul de a
regla echilibrul într e activarea unui răspuns imun adecvat și evitarea reacțiilor adverse
excesive pentru gazdă, cum ar fi inflamația [ 80].
S-a demonstrat că proteinele glicozilate pot fi produse în E. coli recombinant la o
scară mai mare, astfel realizîndu -se un pas important către o producție eficientă in vivo a
vaccinurilor conjugate, care în viitor pot fi utilizate pentru combaterea bolilor infecțioase
severe, în special în țările în curs de dezvoltare [ 81]
Dezvoltarea vaccinurilor întâmpină adesea provocarea de heterogenit ate a
virulenței.
Bacteria enterotoxigenica Escherichia coli (ETEC) care produce factori de
virulență imunologică heterogenă sunt principala cauză a diareei copiilor și a diareei
călătorilor.
În prezent, nu avem vaccinuri licențiate împotriva bacteriei ET EC. În timp ce
metodele convenționale continuă să facă progrese, dar întâmpină dificultăți, sunt explorate
noi abordări computaționale și abordări bazate pe structuri pentru a accelera dezvoltarea
vaccinului ETEC [ 82]
Colonizarea intestinală cu ETEC prin antigeni de suprafață coli (CSs) este
crucială pentru patogenitate și CS21 este una dintre cele mai răspândite CS în rândul
ETEC -urilor la nivel mondial.

39
Izolatele ETEC ajung la tractul gastrointestinal prin transmisie orală, se leagă de
celulele epitelia le intestinale prin CS și colonizează suprafața mucoasei intestinale
Vaccinurile bazate pe CSs pot determina răspunsuri imunitare specifice care, prin
blocarea aderenței ETEC mediate de CS la celulele intestinale, pot inhiba colonizarea
intestinului cu ET EC și pot preveni diareea.
Din păcate, cunoștințele privind imunogenitatea și imunoprotecția CS21 sunt
limitate și nici unul dintre vaccinurile ETEC descrise anterior nu a inclus antigeni CS21. În
consecință, este imperativ să se investigheze potențialul d e vaccin al CS21 în ceea ce
privește imunogenitatea și protecția împotriva colonizării intestinale ETEC. Noi
presupunem că CS21 și LngA sunt foarte imunogeni și capabili să inducă anticorpi anti –
CS21 specifici. Legarea anticorpilor anti -LngA la CS21 inhibă aderarea ETEC mediată de
CS21 la celulele epiteliale intestinale și protejează împotriva colonizării intestinale ETEC.
CS ale ETEC au fost testate ca vaccinuri pentru a proteja împotriva colonizării
ETEC și a bolilor diareice în diferite forme, inclusiv b acterii vii atenuate, bacterii inactivate
și subunități de proteine. Într -un studiu de vaccin pe animale, tulpinile ETEC atenuate care
exprimă CFA / I și o enterotoxină detoxificată labilă la căldură (LThK63) au îmbunătățit
clearance -ul ETEC din plămânii ș oarecilor și au protejat șoarecii de colonizarea cu ETEC
intestinal și acumularea fluidului indusă de LT Într -un studiu de voluntariat la om, a fost
creat un vaccin combinat din trei tulpini de ETEC, cunoscut ca ACE527. Acest vaccin a
fost bine tolerat și cel puțin 50% din subiecții din grupul cu doză mare au răspuns la LTB,
CFA / I, CS3 și CS6.
CS21 pili de Escherichia coli enterotoxigenic (ETEC) este unul dintre factorii de
colonizare ETEC cei mai răspândiți. Subunitatea majoră CS21, LngA, mediază aderenț a
ETEC la celulele intestinale și contribuie la patogeneza ETEC într -un model de infectare cu
șoarece neonatal. Obiectivele acestei lucrări au fost de a evalua proteina purificată
subunitate LngA majoră și p21 purificată CS21 asupra imunogenității și prote cției
împotriva colonizării ETEC a intestinului de șoareci. Proteina purificată LngA recombinată
sau CS21 pili purificată din tulpina ETEC E9034A au fost evaluate pentru imunogenitate
după imunizarea șoarecilor C57BL / 6. Anticorpi anti -LngA specifici au f ost detectați din
probe de ser, fecale și lichide intestinale prin teste ELISA.

40
CS ai ETEC sunt foarte imunogeni și sunt componente promițătoare ale unui
vaccin multiplu ETEC [ 83, 84, 85, 86].
În concluzie, atât proteina purificată LngA cât și pilii CS21 d in ETEC sunt foarte
imunogene și pot inhiba deversarea intestinală a ETEC. Datele noastre privind
imunogenitatea și imunoprotecția indică faptul că CS21 este un candidat vaccin adecvat
pentru un viitor vaccin multivalent împotriva diareei ETEC [ 83].
Recent ele descoperiri despre genomica ETEC folosind tehnici noi de secvențiere
vor ajuta la găsirea de noi antigeni de protecție care pot fi utilizați în abordările vaccinului
[87]
Mecanismele patogene cheie care contribuie la patogeneza ETEC sunt producția
de factori de colonizare și enterotoxină (LT) labilă la cald și / sau enterotoxină stabilă la
temperatură înaltă. Pentru a asigura protecția cu spectru larg, un vaccin ETEC ar trebui să
conțină, cel mai probabil, cei mai răspândiți antigeni fimbriali, respecti v antigenul CF I și
CS1-CS6 și / sau un toxoid LT. Au fost incercate diferite strategii pentru a furniza antigene
fimbriale ETEC și antigene pentru toxine ale sistemul imunitar uman pentru a determina
reacții imune puternice ale mucoaselor, în special, int estinale, care sunt considerate a fi de
primă importanță pentru protecția împotriva bolii ETEC. S -au obtinut niste rezultate
promitatoare atunci când au fost testate diferite vaccinuri candidate la ETEC pentru
protecția împotriva diareei la călătorii adulț i. Cu toate acestea, pentru nici un vaccin ETEC
candidat nu a demonstrat că ar fi eficient în cel mai important grup țintă, care este nou –
născuții și copiii mici din zonele endemice. În acest context, eforturile intense sunt în
desfășurare pentru a încerc a să îmbunătățească imunogenitatea diferitelor vaccinuri
candidate disponibile, precum și să dezvolte noi tipuri de vaccinuri ETEC [ 88].
A fost evaluată capacitatea unui vaccin enterotoxigenic multiplu (MEV) pentru
Escherichia coli enterotoxigenă (ETEC) de a induce memoria imunologică mucoasă. MEV
constă din patru tulpini de E. coli inactivate supraexprimând principalii factori de
colonizare (CF) CFA / I, CS3, CS5 și CS6 și toxoidul LCTBA. În urma testelor efectuate s –
a demonstrat că MEV induce memoria imun ologică mucoasă funcțională care rămâne cel
puțin 1 -2 ani. Mai mult, rezultatele susțin că analiza răspunsurilor celulelor secretoare de
anticorpi după administrarea rapelului poate fi o abordare utilă pentru evaluarea memoriei
imunologice mucoase pe terme n lung la om [ 89].

41
Peste 200 de produse biofarmaceutice aprobate au fost produse într -unul din cele
trei sisteme gazdă: bacteria Escherichia coli , drojdiile (Saccharomyces cerevisiae, Pichia
pastoris) și celulele de mamifere. Luând în considerare cele mai răspândite metode de
exprimare a proteinelor recombinante în citoplasmă sau periplasmul E. coli , precum și
strategiile pentru secreția produsului în mediul de creștere, se poate observa că expresia
recombinantă în E. coli influențează fiziologia celulară ș i declanșează un răspuns la stres,
care trebuie luat în considerare în procesul de dezvoltare. Creșterea expresiei unei proteine
funcționale poate fi realizată prin optimizarea genei, a plasmei, a celulei gazdă și a
procesului de fermentație [ 90].
În regiu nile lumii în care sanitizarea și aprovizionarea cu apă curată sunt
inadecvate, E. coli enterotoxic (ECET) este o cauză comună a diareei și este o cauză
importantă a decesului și a malnutriției la copiii cu vârsta sub cinci ani, după
pneumonie. (Figura 2.9)

Figura 5.1. Distribuția morților cauzate de diaree la copii sub 5 ani în anul 2000 [91]
S-au observat din ce în ce mai mult greutăți suplimentare atât pentru indivizi, cât și
pentru familiile lor, datorită efectelor episoadelor multiple de diaree la în ceputul vieții, care
cauzează deteriorarea dezvoltării fizice, intelectuale și economice [ 92, 93, 94].
ECET care infectează oamenii sunt definiți prin secreția a cel puțin unuia dintre
următoarele enterotoxine:
• toxina labilă la căldură (LT)
• toxine st abile din punct de vedere termic (ST): uman (STh) și porcin (STp)

42
ST sunt toxine secretoare ce induc diareea.
ECET este transmis prin calea fecal -orală și colonizează intestinul subțire [4].
Factorii de colonizare, care sunt structuri de proteine filament oase pe suprafața bacteriană,
mediază atașarea la epiteliul intestinal.
E.coli enterotoxic ST -secretor (fie doar ST sau ST/LT), cuprinde majoritatea
tulpinilor ETEC și pare să provoace cele mai grave cazuri de deshidratare a diareei ETEC.
Prin urmare, ST este o țintă propice pentru a fi inclusă într -un vaccin ETEC [ 95].
Patogenia diareei ETEC a fost bine studiată, iar factorii cheie ai virulenței sunt
antigenii factorului de colonizare bacteriană și enterotoxinele produse de tulpinile ETEC.
Antigenii facto rului de colonizare mediază atașarea bacteriilor pentru a găzdui celulele
epiteliale intestinale mici și colonizarea ulterioară, în timp ce enterotoxinele, incluzând
toxinele labile la căldură și cele stabile la căldură, perturbă homeostazia fluidă în celu lele
epiteliale gazdă, ceea ce duce la hipersecreția fluidelor, electroliților și provoacă diaree.
Vaccinurile care stimulează imunitatea anti -adezinelor gazdă pentru a bloca atașarea și
colonizarea ETEC și, de asemenea, imunitatea antitoxinelor pentru a n eutraliza
enterotoxicitatea, sunt considerate optime pentru prevenirea diareei ETEC. Vaccinurile în
curs de dezvoltare au fost concepute pentru a stimula imunitatea intestinală locală și sunt fie
vaccinuri orale, fie vaccinuri transcutanate. Un vaccin împo triva holerei (Dukoral®)
(Figura 2.10) stimulează imunitate la toxine anti -termo -labilă și este licențiat pentru
protecția pe termen scurt împotriva diareei ETEC la călători, în unele țări [ 96]

Figura 5.2 Dukoral ®- vaccin împotriva Holerei [97]
Sunt în c urs de dezvoltare noi candidați experimentali pentru vaccinul ETEC,
sperând să ofere o protecție mai largă și pe termen mai lung împotriva ETEC. Unii au
demonstrat rezultate promițătoare în studiile privind siguranța și imunogenitatea și se
apropie de stud iile de teren pentru eficacitate. O problemă -cheie este dezvoltarea unui

43
vaccin atât practic, cât și ieftin, astfel încât acesta să poată fi accesibil în țările sărace în
care este nevoie de el [ 96]
Originea și evoluția E. coli sunt importante pentru a d efini care a fost dezvoltat
mai întâi, factorul de virulență bacteriană sau peptidele evolutive și receptorii lor prezenți în
sistemul guanilil ciclază (GC) în mai multe alte specii. De exemplu, E. coli și Salmonella
enterica au un strămoș comun de acum ap roximativ 100 milioane de ani (8). E. coli este
similar cu speciile genomice și fenotipice ale Yersinia pestis și Vibrio cholerae; totuși, au
un gen înrudit îndepărtat. Genomii acestor bacterii au un grad ridicat de plasticitate, adică
conțin mai multe seg mente care au fost achiziționate de la diferite specii. Această concluzie
se bazează pe compararea celulelor E. coli nepatogene (tulpina K -12) cu tulpinile din
diferite laboratoare.
După mai mult de treizeci de ani de la identificarea mecanismului enteroto xinei ST
de E. coli și de la prima descoperire a efectelor sale natriuretice și diuretice asupra
funcțiilor tubulare renale, studiile efectuate asupra ST, guanilinei și uroguanilinei prezintă
încă noi căi de semnalizare a guanil ciclazei -C (GC -C) care suge rează noi potențiale
strategii terapeutice și preventive. Aceste studii în curs de dezvoltare privind enterotoxina
ST ilustrează succesul în cercetarea abordărilor preventive și terapeutice ale multor boli
[98, 99].
Există cel puțin două direcții specific e pentru viitoarele cercetări care ar trebui
abordate în anii următori:
a) mecanismele corecției de semnalizare a GC -C a axei cript -villus intestinale și
evoluțiile preventive și terapeutice pentru enteropatie, tumorigeneză colorectală și
metastază.
b) studiul experimental și clinic al căilor de semnalizare GC -C pentru diagnosticul
și evaluarea stadiului cancerului colorectal
c) noi medicamente preventive și terapeutice pentru controlul stărilor și proceselor
asociate cu caile de semnalizare GC -C, cum ar fi sațietatea, preferința consumului de
alimente, sindromul metabolic, disfuncția erectilă, ADHD, schizofrenia, boala Parkinson,
dependența și hipertensiunea
Izolarea enterotoxinei (ST) stabilă la cald din Escherichia coli și toxina holerică de
la Vibrio cholerae au mărit cunoștințele despre mecanisme specifice de acțiune care ar

44
putea fi utilizate ca instrumente farmacologice pentru a înțelege sistemele enzimatice de
guanilil ciclază -C (GC -C) și adenililciclază. Aceste descoperiri au contribuit, de aseme nea,
la creșterea înțelegerii mecanismelor de bază care controlează echilibrul electrolitic și al
apei în intestine, rinichi și tractul urinare în condiții normale și în boli. A fost analizată
evoluția genelor familiei de guanilină și a genelor ST de la ba cterii la pești și mamifere. De
asemenea, au fost descrise noi evoluții și perspective privind acești compuși bacterieni noi
și hormoni peptidici care acționează în echilibrul electrolitic și al apei. Datele disponibile
indică noi perspective terapeutice p entru caracteristicile patologice cum ar fi tulburările
gastrointestinale funcționale asociate cu constipația, fibroza chistică, cancerul colorectal,
astmul, afectarea funcției barieră gastrointestinală asociată cu enteropatia, obezitatea,
malnutriția, pre ferințele alimentare, infecția enterică, sindromul metabolic și efectele asupra
comportamentului și tulburărilor cerebrale, cum ar fi deficitul de atenție
Izolarea enterotoxinei (ST) stabilă la cald din Escherichia coli și toxina holerică de
la Vibrio chol erae ne -a mărit cunoștințele despre mecanisme specifice de acțiune care ar
putea fi utilizate ca instrumente farmacologice pentru a înțelege sistemele enzimatice de
guanilil ciclază -C (GCc) și adenililciclază. Aceste descoperiri au contribuit, de asemenea, la
creșterea înțelegerii mecanismelor de bază care controlează echilibrul electrolitic și al apei
în intestine, rinichi și tractul urinare în condiții normale și în boli. Aici analizăm evoluția
genelor familiei de guanilină și a genelor ST de la bacterii la pești și mamifere. De
asemenea, descriem noi evoluții și perspective privind acești compuși bacterieni noi și
hormoni peptidici care acționează în echilibrul electrolitic și al apei. Datele disponibile
indică noi perspective terapeutice pentru caracteri sticile patologice cum ar fi tulburările
gastrointestinale funcționale asociate cu constipația, cancerul colorectal, fibroza chistică,
astmul, hipertensiunea, afectarea funcției barieră gastrointestinală asociată cu enteropatia,
infecția enterică, malnutri ția, sațietatea, preferințele alimentare, obezitatea, sindromul
metabolic și efectele asupra comportamentului și tulburărilor cerebrale, cum ar fi deficitul
de atenție, tulburarea de hiperactivitate și schizophrenia [100].

45
6. E.coli utilizat în tratamentul malariei
Plasmodium vivax este un parazit protozoar și un agent patogen uman. Acest
parazit este cea mai frecventă și mai răspândită cauză a malariei recurente (terțiene
benigne), Plasmodium vivax este una dintre cele cinci specii de paraziți ai malariei care
infectează oamenii în mod obișnuit. Deși este mai puțin virulent decât Plasmodium
falciparum, cea mai periculoasă dintre cei cinci paraziți ai malariei umane, infecțiile cu
malaria P. vivax pot duce la boală gravă și moarte, adesea datorate splenomega liei (splină
patologică mărită)
P. vivax este purtat de țânțarul Anopheles de sex feminin, deoarece doar femela
speciei mușcă [ 101].
Plasmodium vivax predomină în Asia de Sud -Est și pe continentul american,
provocînd o morbiditate semnificativă dar si o p ovară socio -economică imensă.
Completarea secvențială a genomului și transcriptomului Plasmodium vivax oferă șansa de
a identifica antigeni. Enolaza este a opta enzimă din calea glicolitică, care, în afară de
funcția glicolitică, posedă, de asemenea, propr ietăți antigenice și este prezentă pe peretele
celular al multor organisme invazive, cum ar fi Candida albicans. Pentru a evalua dacă
enolaza de Plasmodium vivax este, de asemenea, antigenică (antigenul provoaca aparitia
anticorpului), s -a raportat mai înt âi expresia și purificarea recombinantului Plasmodium
vivax enolase (r -Pven) în Escherichia coli , folosind vectorul de expresie procariot. R -Pven
a fost exprimat în formă solubilă în E. coli și expresia a fost verificată prin analiză SDS –
PAGE și Western bl otting. R -Pven s -a purificat la puritate de 90%.
Anticorpii anti -r-Pven de șoarece au inhibat creșterea culturilor in vitro de
Plasmodium falciparum. Șoarecii imunizați cu r -Pven au prezentat protecție împotriva unei
provocări cu parazitul malaric de șoar ece Plasmodium berghei. Anticorpii crescuți
împotriva lui r -Pven au fost specifici pentru Plasmodium și nu au reacționat la țesuturile
gazdă. Aceste observații au stabilit că enolaza Plasmodium vivax este un potențial antigen
de protecție [ 102].

46
7. E. coli utilizat la obținerea de medicamente cu acțiune țintită
Medicamentele cu acțiune țintită au fost studiate ca fiind una dintre principalele
metode în medicină pentru a asigura tratamente de succes ale bolilor. Științele farmaceutice
utilizează purtători mic ro sau nano pentru a obține o livrare controlată a medicamentelor,
capabile să interacționeze selectiv cu agenți patogeni, celule sau țesuturi.
S-au sintetizat glicconanoparticulele (NPBSA -Lac) cu premisa că ar fi recunoscută
de lectinele specifice de gala ctoză microbiană. NPBSA -Lac au fost testate pentru bio –
recunoaștere cu adezine de E. coli K88
Recunoașterea specifică a NPBSA -Lac de către E. coli K88 a fost prezentată prin
agregarea nanoparticulelor analizate prin dispersie dinamică a luminii și prin mic roscopie
de forță atomică. Rezultatele indică faptul că nanovectorii lactozilați direcționați spre
adezina de E. coli K88 au arătat o interacțiune clară cu aceasta și drept urmare ar putea fi
folosiți ca un transportor pentru un medicament antibacterian [ 103].

47
8. Probiotice ob ținute din E.coli
Escherichia coli (E. coli ) sunt bacterii care se găsesc în mod normal în intestinele
și fecalele oamenilor și animalelor.Majoritatea tipurilor de E. coli sunt inofensive, dar
unele, cum ar fi toxina Shiga producătoare de E. coli (STEC), produc toxine (otrăvuri) care
pot deteriora tractul digestiv.Copiii sub 5 ani și vârstnicii prezintă cel mai mare risc de a
dezvolta această afecțiune [ 104].
Toxina Shiga (Stx) care produce E. coli (STEC), cum ar fi E. coli
enterohemor agic (EHEC), este cauza principala a bolii alimentare la om. Studiile in vitro au
arătat că tulpina probiotică Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) inhibă în mod eficient
producția de Stx. Tulpinile EHEC ce pun viața în pericol, cum ar fi de exemplu, serotip ul
O104: H4, responsabil pentru marele focar din 2011 în Germania, s -a dezvoltat evolutiv din
anumite tulpini E. coli care s -au infectat cu fagi lambdoizi codați stx2 și au transformat E.
coli în lizogen și ulterior în tulpini producătoare de Stx. Deoarece antibioticele induc genele
Stx și producția de Stx, persoanelor infectate cu EHEC nu le este recomandat sa se trateze
cu antibiotice. Prin urmare, EcN ar putea fi un medicament alternativ.
S-a demonstrat că EcN este rezistent nu numai față de fagii -Stx da r si față de fagii
lambda.
Mai mult, am observat că EcN inactivează fagii și prin urmare protejează tulpinile
de E. coli K-12 împotriva infecției cu Stx și fagii lambda.
Aceste proprietăți, împreună cu capacitatea sa de a inhiba producția Stx, fac din
EcN un candidat bun pentru prevenirea bolilor cauzate de EHEC și probabil pentru
tratamentul persoanelor deja infectate [ 105].

48
9. Concluzii
E. coli a fost utilizat în mod eficient pentru producerea cu randament ridicat a
multor proteine recombinante. Utili zarea E.coli în cadrul recombinărilor genetice este o
alegere propice deoarece acesta este un mediu de cultură nepretențios, ușor de manevrat și
foarte rentabil din punct de vedere financiar.
Organizația Mondială a Sănătății estimează că în următorii 20 d e ani, vânzarea de
insulină va crește cu circa patru ori la nivel global. Modificările dietetice și ale stilului de
viață cauzează o creștere dramatică a incidenței diabetului în întreaga lume.
Atât pacienții cu diabet zaharat de tip I, cât și cei cu diabe t zaharat tip II folosesc
insulină, însă, cu toate acestea, pacienții cu diabet zaharat de tip II necesită doze mari de
insulină pe măsură ce dezvoltă rezistență la insulină.
Creșterea dramatică a numărului de pacienți cu diabet zaharat la nivel global și
explorarea metodelor alternative de administrare a insulinei, cum ar fi inhalarea sau calea
orală, devine obligatorie pentru a crește cererea de insulină recombinantă în viitorul
apropiat.
Tehnologiile actuale de fabricație nu vor putea satisface cererea c rescândă de
insulină datorită limitării capacității de producție și a costului ridicat al producției. Insulina
umană recombinantă este produsă predominant folosind E. coli pentru utilizare terapeutică
la om.
Cu toate acestea, există o necesitate maximă de a mări producția de câteva ori a
unei insuline biologic active și a analogilor săi din E. coli , folosind cele mai recente și
eficiente tehnologii.
Cu alte cuvinte, în biotehnologie și inginerie genetică E. coli servește ca model
experimental, în mod as emănător cu cobaii în cercetările de fiziologie și medicină.
Experimental s -a constatat că tehnologiile de biosinteză care utilizează
microorganisme manipulate genetic au probleme cu stabilitatea mutantului, deoarece toți
mutanții sunt instabili, iar după un anumit număr de multiplicări revin la forma parenterală.
Se pune astfel, problema stabilității, care devine esențială atunci când se lucrează în flux
continuu sau cu volume mari.
Producția de hGH recombinat prin utilizarea sistemelor de expresie celular ă
necesită o îmbunătățire, în ciuda progreselor semnificative din ultimii ani. Din acest motiv

49
a fost necesară fuziunea ubiquitinei cu proteina hGH. Această fuziune a facilitat creșterea
eficienței globale a biosintezei și îmbunătățirea stabilității protei nei.
Datorită faptului că există o nevoie urgentă de a dezvolta vaccinuri eficiente
împotriva bolilor infecțioase este necesară selectarea unui adjuvant pentru a întări un
raspuns adecvat și protector . Prin intermediul E. Coli s -a dovedit că se pot produc e proteine
glicozilate la o scară mare, astfel realizându -se un pas important către o producție eficientă
in vivo a vaccinurilor conjugate.
În urma celor prezentate anterior se poate afirma faptul că acest bacil gram negativ
are un potențial imens pentru v iitorul industriei medicamentelor.

50
10. Bibliografie :
1. Dr. Felicia Toma – Bacteriologie generală, Tîrgu Mureș, 2005, 2 -4.
2. Dr. Felicia Toma – Bacteriologie generală, Tîrgu Mureș, 2005, 9-10.
3. https://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_cellular_morphologies#Bacillus
4. Dr. Felicia Toma Săcărea – Bacteriologie medicală, Tîrgu Mureș, 2006, 249 -251,
257-271.
5. https://en.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli
6. http://www.scritub.com/files/biologie/185_poze/image002.jpg
7. https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/bacteriologie/bactgen/medii/thumbs/gs.JPG
8. https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/bacteriologie/bac tgen/medii/thumbs/gsg.JPG
9. https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/bacteriologie/bactgen/medii/thumbs/gl.JPG
10. http://www.canyons.edu/Faculty/takedad/PublishingImages/Plates/E.coli_na_6 –
03_640x587.jpg
11. https://d2gne97vdumgn3.cloudfr ont.net/api/file/6qWCPyv3QQOdn4BFZTjz
12. https://www.microbiologyinpictures.com/bacteria -photos/escherichia -coli-
photos/e.coli -salmonella -cled.jpg
13. https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/bacteriologie/bactgen/medii/thumbs/lev.JPG
14. https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/bacteriologie/bactgen/medii/pic/lf.JPG
15. http://www.tgw1916.net/images/IM.jpg
16. https://i.pinimg.com/originals/1e/47/5d/1e475db87af98067621fa82368921bd7.jpg
17. https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/bacte riologie/bactsp/coli/medii/thumbs/coli_l
ev4.JPG
18. https://sites.google.com/site/jordanbiol250/_/rsrc/1351045 820276/home/growth –
media/macconkey -agar/1473_escherichia_coli_fig5_med.jpeg
19. https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/bacteriologie/bactsp/coli/medii/thu mbs/coli_lf
_1.JPG
20. http://www.tgw1916.net/images/CIMG_cled_ec.jpg
21. Wild S, Roglic G, Green A et al – Global prevalence of diabetes: estimates for the
year 2000 and projections for 2030 , Diabetes Care, 2004, 27:1047 –1053.
22. Walsh G – Therapeutic insulins and their large -scale manufacture, Appl Microbiol
Biotechnol, 2005, 67:151 –159.

51
23. Ferrer -Miralles N, Domingo -Espin J, Corchero JL et al – Microbial factories for
recombinant pharmaceuticals, Microb Ce ll Fact, 2009, 8:17.
24. Nielsen J. – Production of biopharmaceutical proteins by yeast , Landes Biosci
Bioengineered, 2013, 4(4):207 –211.
25. Goodman M – Market watch Sales of biologics to show robust growth through to
2013, Nat Rev Drug Discov, 2009, 8:837.
26. Aggarwal S. – What’s fueling the biotech engine 2010 to 2011, Nat Biotechnol.
2011, 29:1083 –1089.
27. Walsh G. – Biopharmaceuticals: approvals and approval trends in 2004 , Biopharm
Int, 2005, 18:58 –65.
28. Walsh G. – Biopharmaceuticals: approval trends in 2005 , BioPharm Int, 2006,
9:58–68.
29. Walsh G. – Biopharmaceuticals: approval trends in 2006 , BioPharm Int, 2007,
20:40 –48.
30. Berlec A, Strukelj B – Current state and recent advances in biopharmaceutical
production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells , J Ind Microbiol Biotechnol,
2013, 40(3 -4):257 -74.
31. Nabih A Baeshen, Mohammed N Baeshen – Cell factories for insulin production ,
Microb Cell Fact, 2014, 13: 141.
32. Cohen SN, Chang ACY, Boyer HW et al – Construction of biologically functional
bacterial plasmids in vitro , Proc Natl Acad Sci U S A, 1973, 70:3240 –3244.
33. Sahdev S, Khattar SK, Saini KS – Production of active eukaryotic proteins through
bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies , Mol Cell
Biochem, 2008, 307:249 –264.
34. Ferrer -Miralles N, Villaverde A – Bacterial cell factories for recombinant protein
production, expanding the catalogue , Microb Cell Fact, 2013, 12:113.
35. Vajo Z, Fawcett J, Duckworth WC – Recombinant DNA technology in the treatment
of diabetes: insulin analogs , Endocr Rev, 2001, 22(5):706 -17.
36. Bushra Ahmad – Review: Pharmacology of insulin , The British Journal of Diabetes
& Vascular Disease, 2004, (4):10 -14.

52
37. Jenkins N – Modifications of therapeutic proteins: challenges and prospects , Send
to Cytotechnolog y, 2007, 53(1 -3):121 -5.
38. Walsh G, Jefferis R – Post-translational modifications in the context of therapeutic
proteins , Nat Biotechnol, 2006, 24(10):1241 -52.
39. Lizak C, Yao -Yun Fan, Weber TC – N-Linked Glycosylation of Antibody Fragments
in Escherichia coli , Bioconjugate Chem, 2011, 22 (3):488 –496.
40. Wacker M, Linton D, Hitchen PG et al – N-linked glycosylation in Campylobacter
jejuni and its functional transfer into E. coli , Science, 2002, 298:1790 –1793.
41. Feldman MF, Wacker M, Hernandez M et al – Engineering N -linked protein
glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli ,
Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(8):3016 -21.
42. Fisher AC, Haitjema CH, Guarino C et al – Production of secretory and
extracellular N -linked glycoprotein s in Escherichia coli, Appl Environ Microbiol, 2011,
77(3):871 -81.
43. Chen R – Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli
and beyond, Biotechnol Adv., 2012, 30(5):1102 -7.
44. Ihssen J1, Kowarik M, Dilettoso S et al – Production of gl ycoprotein vaccines in
Escherichia coli, Microb Cell Fact, 2010, 11, 9:61.
45. http://www.integratedsci.com.au/ShowImage/bl21 -codonplusde3 –ril-competent –
cells/cross/231 -186-f4a1b6768a3015f0.png
46. Sørensen HP, Sperling -Petersen HU, Mortensen KK – Production of recombinant
thermostable proteins expressed in Escherichia coli: completion of protein synthesis is the
bottleneck, Biomed L ife Sci, 2003, 25, 786(1 -2):207 -14.
47. Trundova M, Celer V – Expression of porcine circovirus 2 ORF2 gene rquires
codon optimized E.coli cells, Virus Genes, 2007, 34:199 –204.
48. Kane JF – Effects of rare codon clusters on high -level expression of heterologous
proteins in Escherichia coli, Curr Opin Biotechnol, 1995, 6(5):494 -500.
49. Bill RM, Henderson PJ, Iwata S – Overcoming barriers to membrane protein
structure determination, Nat Biotechnol, 2011, 29(4):335 -40.

53
50. Huang CJ, Lin H, Yang X – Industrial production of r ecombinant therapeutics in
Escherichia coli and its recent advancements, J Ind Microbiol Biotechnol. 2012, 39:383 –
399.
51. Reilly DE, Yansura DG – Production of monoclonal antibodies in E. coli. In: Shire
SJ, Gombotz W, Bechtold -Peters K, Andya J, editors. Cu rrent Trends in Monoclonal
Antibodies Development and Manufacturing, New York: Springer, 2010, 295 –308.
52. Overton TW – Recombinant protein production in bacterial hosts, Drug Discov
Today, 2014, 19(5):590 –601.
53. Chance R, Glazer N, Wishner K – Insulin Lispro (Humalog) In: Walsh G, Murphy
B, editors. Biopharmaceuticals, an Industrial Perspective, Kluwer: Dordrecht, 1999,. 149 –
172.
54. Brange J, Ribel J, Hansen JF et al – Monomeric insulins obtained by protein
engineering and their medical implications, Nature, 198 8, 333:679 –682.
55. Brange J, Owens DR, Kang S – Monomeric insulins and their experimental and
clinical implications, Diabetes Care, 1990, 13(9):923 –954.
56. Wang P, Fiaschi -Taesch NM, Vasavada RC et al – Diabetes mellitus –advances and
challenges in human β -cell proliferation, Nat Rev Endocrinol, 2015, 11(4):201 –12.
57. Diana Mikiewicz, Anna Bierczyńska -Krzysik, Agnieszka Sobolewska et al –
Soluble insulin analogs combining rapid – and long -acting hypoglycemic properties – From
an efficient E. coli expression system t o a pharmaceutical formulation , PLoS One. 2017,
12(3): 172.
58. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/corecgi/tileshop/tileshop.fcgi?p=PMC3&id=602479
&s=66&r=1&c=1
59. Walsh G – Therapeutic insulins and their large -scale manufacture, Appl Microbiol
Biotechnol, 2005, 67:151 –159.
60. https://images.yaoota.com/4JJuTGbCTkfbj41KYgAqZyIa3Bk=/trim/yaootaweb –
production/media/crawledproductimages/deb588a83e97069bcfc5e28d38939496c8302ff3.jp
g
61. Chance R, Glazer N, Wishner K – Insulin Lispro (Humalog) In: Walsh G, Murphy
B, editors. Biopharmaceuticals, an Industrial Perspective , Kluwer: Dordrecht, 1999, 149 –
172.

54
62. http://www.integratedsci.com.au /ShowImage/bl21 -codonplusde3 –ril-competent –
cells/cross/231 -186-f4a1b6768a3015f0.png
63. Walsh G – Therapeutic insulins and their large -scale manufacture, Appl Microbiol
Biotechnol, 2005, 67:151 –159.
64. https://www.canadianinsulin.com/shop_image/news_pics/443.jpg
65. https://www.google.ro/search?rlz=1C1HLDY_roRO726RO726&biw=1280&bih=6
94&tbm=isch&sa=1&ei=dpoW6KVIcOesAHhtYDIDw&q=lantus+solostar&oq=lantus+&
gs_l=img.3.0.0j0i30k1l9.8147.8147.0.9904.1.1.0.0.0.0.83.83.1.1.0….0…1c.1.64.img..0.1.83
….0.k7fCgBY -8Yo#imgrc=N74 -spq-LA6-vM:
66. http://www.allivet.com/images/product/large/7491.jpg
67. https://mediately.co/ro/drugs/7FsaENW4kZekjCT6PPgHwr8D2ql/lantus -100u -ml-
sol-inj-in-cartus#packagings
68. Walsh G – Therapeutic insulins and their large -scale manufacture, Appl Microbiol
Biotechnol, 2005, 67:151 –159.
69. Zdenko Levarski, Andrea Šoltýsová et al – High -level expression and purification
of recombinant human growth hormone produced in soluble form in Escherichia coli,
Protein Expres sion and Purification, 2014, 100 : 40 -47.
70. Anna Wojtowicz -Krawiec, Iwona Sokolowska, Maria Smorawinska et al – Use of
Ubp1 protease analog to produce recombinant human growth hormone in Escherichia coli,
Microbial Cell Factories, 2014, 13:113.
71. Yu HA, Kim S G, Kim EJ et al – Characterization of ubiquitin C -terminal hydrolase
1 (YUH1) from Saccharomyces cerevisiae expressed in recombinant Escherichia coli,
Protein Expr Purif., 2007, 56 (1): 20 -26.
72. Costa SJ, Almeida A, Castro A et al – The novel Fh8 and H fusi on partners for
soluble protein expression in Escherichia coli: A comparison with the traditional gene
fusion technology, Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97 (15): 6779 -6791.
73. Xu X, Jin F, Yu X, et al – High -level expression of the recombinant hybrid peptid e
cecropinA(1 -8)-magainin2(1 -12) with an ubiquitin fusion partner in Escherichia coli,
Protein Expr Purif. 2007, 55 (1): 175 -182.
74. Wojtowicz A, Mazurkiewicz -Pisarek A, Plucienniczak G et al – Expression of yeast
deubiquitination enzyme UBP1 analogues in E. coli, Microb Cell Fact., 2005, 4 (1): 17 -10.

55
75. Breederveld RS, Tuinebreijer WE – Recombinant human growth hormone for
treating burns and donor sites, Cochrane Database Syst Rev. 2012, 12:7.
76. Persson J, Andersen DC, Lester PM – Evaluation of different primary recovery
methods for E. coli -derived recombinant human growth hormone and compatibility with
further down -stream purification, Biotechnol Bioeng, 2005, 90 (4): 442 -451.
77. Kim MJ, Park HS, Seo KH et al – Complete solubilization and purification of
recombina nt human growth hormone produced in Escherichia coli, PLoS One, 2013, 8 (2).
78. de Vos AM, Ultsch M, Kossiakoff AA (1992) – Human growth hormone and
extracellular domain of its receptor: crystal structure of the complex, Science. 1992, 17:
255(5042):306 -12.
79. T VASSU, I STOICA, O CSUTAK et al – Genetica Microorganismelor și Inginerie
Genetică Microbiană. Note de curs și tehnici de laborator , Ed. Petrion, București, anul
2001, 99 -130.
80. Gregg KA1, Harberts E1, Gardner FM – Rationally Designed TLR4 Ligands for
Vacci ne Adjuvant Discovery, MBio. 2017, 9, 8(3).
81. Ihssen J1, Kowarik M, Dilettoso S et al – Production of glycoprotein vaccines in
Escherichia coli , Microb Cell Fact., 2010, 11, 9:61.
82. Duan Q, Lee KH, Nandre RM et al – MEFA (multiepitope fusion antigen) -Novel
Technology for Structural Vaccinology, Proof from Computational and Empirical
Immunogenicity Characterization of an Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) Adhesin
MEFA, J Vaccines Vaccin, 2017, 8(4).
83. Zhang C, Iqbal J, Gómez -Duarte OG – Murine immunization w ith CS21 pili or LngA
major subunit of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) elicits systemic and mucosal
immune responses and inhibits ETEC gut colonization, Vet Microbiol, 2017, 202:90 -100.
84. Sjöling Å, von Mentzer A, Svennerholm AM – Implications of ent erotoxigenic
Escherichia coli genomics for vaccine development, Expert Rev Vaccines, 2015, 14(4):551 –
60.
85. Svennerholm AM, Tobias J – Vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli,
Vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli, Expert Rev Vaccines, 2 008, 7(6):795 –
804.

56
86. Zhang W, Sack DA – Progress and hurdles in the development of vaccines against
enterotoxigenic Escherichia coli in humans , Expert Rev Vaccines, 2012, 11(6):677 -94.
87. Sjöling Å, von Mentzer A, Svennerholm AM – Implications of enterotoxigeni c
Escherichia coli genomics for vaccine development, Expert Rev Vaccines, 2015, 14(4):551 –
60.
88. Svennerholm AM, Tobias J – Vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli,
Expert Rev Vaccines, 2008, 7(6):795 -804.
89. Lundgren A, Jertborn M, Svennerholm AM – Induction of long term mucosal
immunological memory in humans by an oral inactivated multivalent enterotoxigenic
Escherichia coli vaccine , Vaccine, 2016, 34(27):3132 -3140.
90. Berlec A, Strukelj B – Current state and recent advances in biopharmaceutical
producti on in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells, J Ind Microbiol Biotechnol.
2013, 40(3 -4):257 -74.
91. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2276781/figure/F1/
92. Rebecca D illingham, Richard L Guerran – Childhood stunting: measuring and
stemming the staggering costs of inadequate water and sanitation , The Lancet, 2004,
363:94 –95.
93. Moore SR, Lima NL, Soares AM et al – Prolonged episodes of acute diarrhea ,
2010, 139(4):1156 -64.
94. Petri WA Jr, Miller M, Binder HJ et al – Enteric infections, diarrhea, and their
impact on function and development , J Clin Invest, 2008, 118(4):1277 -90.
95. Morten L. Govasli, Yuleima Diaz, Ephrem Debebe Zegeye et al – Purification and
Characterization of N ative and Vaccine Candidate Mutant Enterotoxigenic Escherichia
coli Heat -Stable Toxins, Open Access Toxins 2018, 10(7), 274.
96. Zhang W, Sack DA – Progress and hurdles in the development of vaccines against
enterotoxigenic Escherichia coli in humans, Expert R ev Vaccines. 2012 Jun, 11(6):677 -94.
97. https://dynamicmedia.zuza.com/zz/m/original_/b/7/b75b0f6a -31d4 -49f4-8dce –
96c56cde2fa7/YR -A-Dukoral -ss_web___Gallery.jpg
98. Bryant AP1, Busby RW, Bartolini WP – Linaclotide is a potent and selective
guanylate cyclase C agon ist that elicits pharmacological effects locally in the
gastrointestinal tract, Life Sci. 2010 8, 86(19 -20):760 -5.

57
99. Busby RW, Bryant AP, Bartolini WP et al – Linaclotide, through activation of
guanylate cyclase C, acts locally in the gastrointestinal tract to elicit enhanced intestinal
secretion and tranzit, Eur J Pharmacol . 2010 15, 649(1 -3):328 -35.
100. A.A.M. Lima, M.C. Fonteles – From Escherichia coli heat -stable enterotoxin to
mammalian endogenous guanylin hormones , Braz J Med Biol Res. 2014, 47(3): 179 –191.
101. https://en.wikipedia.org/wiki/Plasmodium_vivax
102. Zhang C, Gu Y, Tang J et al – Production of Plasmodium vivax enolase in
Escherichia coli and its protective properties, Hum Vaccin Immunother., 2016,
12(11):2855 -2861.
103. Gallegos -Tabanico A, Sarabia -Sainz JA, Sarabia -Sainz HM – Molecular recognition
of glyconanoparticles by RCA and E. coli K88 – designing transports for targeted therapy ,
Acta Biochim Pol. 2017, 64(4):671 -677.
104. http://healthywa.wa.gov.au/Articles/S_T/Shiga -toxin -producing -E-coli-STEC -and-
haemolytic -uraemic -syndrome -HUS
105. Bury S, Soundararajan M, Bharti R – The P robiotic Escherichia coli Strain Nissle
1917 Combats Lambdoid Bacteriophages stx and λ , Front Microbiol, 2018, 29:9 -929.