Iuliu Hațieganu Cluj -Napoca Facultatea [625523]

1
Universitatea de Medicină și Farmacie
“Iuliu Hațieganu” Cluj -Napoca Facultatea
de Medicină

Lucrare de licență

Efectul reparator cutanat al biosticlelor pe
baza de bor si fosfor dopate cu argint ș i
cupru

Îndrum ător: Absolvent: [anonimizat]. univ. Dr. Gabriela Adriana FILIP Paula SUCIU

2019

2

Cuprins
Partea general ă
Istoria utilizării biosticlelor in medicină ………………………….. ……………………. 6
Noțiuni despre biosticle si utilizarea lor în medicină ………………………….. ….. 8
Prepara rea soluției de biosticle ………………………….. ……………………… 8
Proprietăți selective ale biosticlelor ………………………….. ……………….. 10
Compoziții alternative ale biosticlelor ………………………….. …………….. 10
Efectele pozitive ale ionilor terapeutici eliberați din BGs ……………….. 11
Efecte biologice ale ionilor de argint – activitate antibacteriană ………. 11
Suprafața bioactivă a sticlei ………………………….. …………………………. 13
Aplicații ale biosticlelor in practica medicală ………………………….. …… 14
Prop rietățile mecanice ale biosticlelor ………………………….. …………… 15
Anatomia si fiziologia pielii ………………………….. ………………………….. ……… 17
Embriologie cutanată ………………………….. ………………………….. ……… 17
Structura pielii ………………………….. ………………………….. ………………. 17
Vascularizația pielii ………………………….. ………………………….. ………… 19
Inervația pielii ………………………….. ………………………….. ……………….. 19
Funcțiile pielii ………………………….. ………………………….. ……………….. 20
Mecanisme cu rol in epitelizarea cutanată ………………………….. ……… 23

3
Rolul fibroblastelor in epitelizare ………………………….. …………………… 25
Rolul angiogenezei în epitelizarea cutanată ………………………….. …… 26
Partea special ă
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. 29
Materiale si metode ………………………….. ………………………….. ………………. 31
Animale de experiență si designul experimental ………………………….. 31
Reactivi ………………………….. ………………………….. ……………………….. 33
Obținerea preparatelor dermatologice pe bază de biosticle (BS) ……. 33
Măsurarea pH -ului și a potențialului Zeta ………………………….. ………. 34
Cedar ea in vitro a ionilor de calciu ………………………….. ………………… 34
Dozarea ionilor de calciu ………………………….. ………………………….. … 34
Evaluarea stresului oxidativ si a nivelului metaloproteazelor matric iale35
Examinare histopatologică ………………………….. ………………………….. 37
Analiza statistică ………………………….. ………………………….. …………… 38
Rezultate ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 39
Evalua rea Ph -ului in probe ………………………….. ………………………….. 39
Evaluarea potențialului zeta ………………………….. ………………………… 40
Cedarea ionilor de calciu in mediu ………………………….. ………………… 41
Măsurarea diametrelor plăgilor cutanate ………………………….. ……….. 42
Markerii de stres oxidativ ………………………….. ………………………….. … 43
Evaluarea nivelului de peroxidare l ipidică (MDA) ………………………….. 43
Nivelul metaloproteinazelor matriceale (MMP) ………………………….. …. 44
Nivelul TIMP ………………………….. ………………………….. ………………….. 45
Nivelul oxidului nitric ………………………….. ………………………….. ……….. 46
Activitatea SOD ………………………….. ………………………….. ……………… 47

4
Analiza histopatologică ………………………….. ………………………….. …… 47
Discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 53
Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 58
Perspective viitoa re ………………………….. ………………………….. ………………. 59
Referin țe ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 60

5

Parte a generală

6
Istori a utilizării biosticlelor in medicin ă
“Dacă puteți face un material care va supraviețui expunerii la radiații
de energie înaltă, puteți face un material care să supraviețuiască expunerii la
corpul um an?”. [1]
Istoria bisticlelor a început în anul 1967, la finalul războiului din
Vietnam, când colonelul Klinker al armatei americane, într -o conversație
amicală cu Lary Hench i -a adresat această întrebare, întrebare care, ulteri or,
l-a făcut pe Hench, să devină directorul centrului de ce rcetare la universitatea
din Florida. Răspunsul colonelului a fost la fel de grandios „Putem salva vieți,
dar nu putem salva membre. Avem nevoie de materiale noi care să nu fie
respin se de organis m.” [1]
Odată ce războiul din Vietnam s -a încheiat, nevoia de materiale care
să înlocuiască membrele amputate și țesuturile compromise, fără a fi
respinse, a fost o chestiune de importan ță considerabilă, din nevoia mai ales
a reintegrării sociale a supraviețuitorilor. [1]
Doctorul Larry Hench, fondatorul biosticlelor , s-a născut în anul 1938
în Shelby, Ohio, unde a și absolvit universitatea de stat în anul 1961. În anul
1964 a deveni t doctor în ingin eria chimică. Dragostea lui pentru cercetare a
început în laboratoru l pentru inginerie ceramică la U niversitatea de stat din
Ohio (OSU ) în perioada 1957 – 1958 , când alături de profesorii săi J.O.
Everhart, Ralston Russel, Maynord King și Henr y Blau, a pus bazele primelor
formule pentru sti clă, glazuri, smal țuri și vopsele . [2]
În vara anului 1959, pe vremea când lucra ca și inginer, a avut loc
prima lui expunere, referitoare la fabricarea unui nou material ceramic.
Această experi ență de vară l -a determinat în 1961 să devină absolvent de
inginerie ceramică. Mai târziu a participat la evaluarea efectului aditivilor
ceramici în sinteza oxidului de beriliu, compus utilizat ca și neutron moderator

7
în primul motor al rachet ei atomice de zvoltat la Lawren ce Livermore
Laboratory (LLL) din Livermore, California [2] alături de supervizorul s ău
Doctor Ray Cooperstein. Rezultatele lor au fost prezentate la întâlnirea
anuală a Societății Americane de C eramică, fiind ș i prima lui lucrare.
Ca proaspăt asistent universitar (1964) la universitatea din Florida a
continuat să studieze mecanismele moleculare implicate în nuclearea
cristalului în faza de sticlă ceramică. Această cercetare fructuoasă este
crucială pentru invest igațiile ult erioare ale complexului SIO2 -CaO-Na2O –
P2O5 numit și Bioglass.1 Marea descoperire legată de sticlele ceramice este
că ele prezintă o bioconductibilitate electrică ridicată care rezistă la
expunerea radiațiilor cu energie înaltă. Astfel 45S5 Biog lass (45% SIO 2,
24,5%CaO, 24,5%Na2O, 6%P2O5) începe o nouă eră în acest domeniu.
Hench defineste conceptul de biomaterial ca fiind materialul "Care
generează un răspuns biologic specific la interfața materialului care are ca
rezultat formarea unei legături între țesutu ri și materi al". 2
Biomaterial ul ideal este acel m aterial care odata aplicat nu trebuie să
aibă reacție locală în țesuturi , care să fie biocompatibil iar la implantarea în
țesuturile umane nu trebuie să determine un răspuns toxic sau inflamator.
Biomaterialul are o funcție arhitecturală limitată în timp și prin urmare are o
durată de valabilitate.Ti mpul de degradare al biomaterialului se potrivește cu
procesul de regenerare sau de vindecare a țesuturilor deteriorate. Odată ce
scopul biomaterialului este îndeplinit, acesta dispare lăsând în urmă un
produs pur, biologic viabil , non canc erigen, non alergic, non pirogen si
netoxic.

8
Noțiuni despre biosticle si utilizarea lor in
medicin ă

Prepararea s oluției de biosticl e
De obicei biostic lele sunt sintetizate folosind două tehnici: prima, cea
tradiționala este tehnica de topire -stingere iar cea modernă este tehnica sol –
gel. Ambele procese duc la formarea de porozități, proprietăți mecanice
uniforme dar și proprietăți diferite, în special cele bioactive .3
În metoda tradițională de topire, oxizii se top esc împreună la
temperaturi ridicate de peste 1300° C într-un creuzet și se sting într-o matriță
sau în apă. Procesul sol -gel este o cale de procesare la temperaturi scăzute
în care o soluție care co nține componentele compoziției sol, este supusă
reacțiilor de tip polimer la temperatur a camerei pentru a putea f orma un gel.
Gelul este o rețea inertă, umedă, asemănătoare unui polimer anorganic care
uscat și încălzit, de exemplu, la o temperatură de 600 °C, devine sticlă.
Procesul la temperatură joasă permite realizarea schelelor poroase,
incorporarea medicamentelor și a factorilor de creștere și d ă posibilitatea
incorporării p olimerilor în materiale hibride . 4
Biosticlele pot fi mezoporoase sau sub forma de nanoparticule.
Diferența în prelucrarea sol -gel pentru a produce cele două materiale este
dată de catalizatorul utilizat în realizarea solului . 5.
Biosticlele se formează utilizând ca și precursori nitr atul de calciu
tetrahidrat (C a (NO3)2 * 4H2O), tetraetil ortosilicat (TEOS), clorhidratul de
sodiu (NaCl) și acidul ortofosforic (H3Po4) iar eta nolul și apa dublă distilată
sunt folosiți ca și solvenți. Acidul clorhidric (HCl) în concentrație 1N este

9
folos it ca și catalizator [3]. Precursorii au fost adăugați cu strictețe la
amestecul de solvenți în următoarea ordine C a (NO3)2 *4H2O, H3PO4,
TEOS, NaCl, rezultând o soluție transparen tă de Bioglass.
Inițial, Bioglass -ul cu compoziție 45% SIO2, 24,5% CaO 24,5%Na2O
6%P2O5 se topea la temperaturi mai mari de 1300 °C și apoi urm a o etapă
de stingere ceea ce ducea la formarea de macroparticule. Pentru sinteza
microparticul elor a fost utilizată sinteza pulverizării cu flacără. Precursorii
metalici organici rezultați au fost amestecați și alimentați într -un reactor cu
flacăra unde nanoparticulele se colectau pe un filtru deasupra flăcării.
Această temperatură a permis formarea de particule amorfe cu dimensiuni
de 20 -80 nm. [4]
După anul 1990 au apărut alte strategii de obținere a biosticlelor în
special procesul sol -gel, utilizat și astăzi, oferind o m etodă mai versatil ă
pentru a proiecta nanopaticulele de biosticl ă. Spre deosebire de metoda
anterioar ă, tehnologia sol -gel permite sinteza de biosticle cu compoziție
echivalentă dar la o temperatură mult mai scăzută, proces ce se bazează pe
hidroliza și co ndensarea moleculară a precursorilor care duc la formarea unei
rețele polimerice anor ganice. Solventul prins în rețea explica textura de tip
gel. Nanopatriculele derivate prezintă o porozitate mai mare față de cele
derivate din topitur ă.
Dacă facem o compa rație între supraf ața specifică și porozitatea
particulelor de dimensiuni similare obținute prin topire tradițională și prin
metoda sol gel, particulele derivate din sol gel prezintă un volum de pori și o
suprafață superioară cel or obtinute prin topitura r espectiv se formeaz ă mult
mai repede hidroxiapatita [5]. Acest proces sol gel foarte versatil depinde de
raportul apa/alcool, de natura alcoolului, de tipul de precursor, de
concentrația și natura catalizatorului.

10
45S5 Biolgas s a fost părintele multor alte biosticle fiind capabilă de formarea
în situ a hidrox iapatitei . [5]
Propriet ăți selective ale biosticlelor

TABEL 1.PROPRIET ĂȚILE SELECTIVE ALE BI OSTICLELOR
Densitate 2,7 g/ 𝑐𝑚2
Temperatura de tranziție 538 ℃
Temperatura de cristalizare 577℃
Temperatura de topire 1224 ℃ si 1264℃
Coeficientul de expansiune termală 15,1 ×10−6
Indicele de refrac ție 1,59
Rezisten ța la trac țiune 42Mpa
Fragmentul de durit ate 0,6MPa 𝑚1/2
Modulul young sau rigiditatea 3,5M pa
Duritatea lui Vickers 5,75M pa
5
Compozi ții alternative ale biosticlelor
Biosticla originală este o sticlă cuaternară de sodiu fosfosilicat ă. De-
a lungul timpului, din formula să principală 45S5 s -au dezvoltat numeroase
biosticle. Deoarece sticla este un aranjament aleatoriu de unități, există
spațiu pentru un număr mare de ioni cu efect terapeutic. Ionii terapeutici pot
fi incorporați fără alterarea semnificativă a proprietăților. Ionii cum ar fi zincul,
magneziul și borul pot fi adăugați in structura sticlei pentru a stabiliza
intervalul de lu cru, pentru a permite sintetizarea în flux vâscos și a modifi ca
TEC sau coeficientul de dilatare termic astfel inc ât să se potriveasc ă cu cele
ale aliajelor metalice. Pot fi adăugate potasiu și fluor pentru aplicabilitate în
medicină dentară. Argintul poat e fi adăugat pentru ca racterul său bactericid

11
iar stronțiul s -a dovedit a fi benefic in creșterea oaselor. Magneziul este
deosebit de eficient pentru lărgirea ferestrei de sinteză dar afectează
bioactivitatea, el fiind considerat un modificator de rețea la nivelul biosticlei
de silica, dar poate acționa p arțial ca și un oxid intermediar datorită raportului
încărcare -dimensiune .5

Efectele pozitive ale ionilor terapeutici eliberați din BGs

Efecte biologice ale ionilor de argint – activitate antibacteriană
Mecanism de acțiune:
• Blochează respirația mitocondrială și trans ferul de electroni ș i
diminuă forța motrice a protonilor în bacterii .
• Determină scurgeri masive de protoni prin membrana celulelor
bacteriene . 6
Efecte biologice ale ionilor de cupru (Cu): Osteogeneza, Angiogeneza,
Activitate antibacteriană
Mecanism de acțiune:
• Osteogeneza: – activează metabolismul osos prin acțiunea ca și
cofactor pentru lizil oxidaza .
– Inhibă resorbția osoasă prin acțiunea ca și cofactor
pentru superoxid dismuta za.
• Angiogeneza – stabilizează HIF -1a nuclear și simulează hipoxia,
activând astfel factorii proangiogenici VEGF, bFGF, TNF -a și IL -1.

12
• Activi tate antibacteriană: atașarea la membrana plasmatică a
bacteriilor și inducerea unor modificări letale în membrana celulară,
cum ar fi întreruper ea integrității membranei. 6
Efectele biologice ale fosforului (P): osteogeneza, angiogeneza
Mecanism de acțiune:
• Osteogeneza: stimulează expresia proteinei matrix gla (MGP) .
• Activitatea angiogenică: stimulează FOXC2 pro -angiogenice,
osteopontina și VEGFa . 6
Efectele biologice ale borului (b): osteogeneza, angiogeneza
Mecanism de actiune:
• activarea caii de semnal izare MAPK .
• suprareglarea genelor VEGF si TGF -β1. 6
Biosticlele, în special cele dopate cu oxizi met alici antibacterieni cum
sunt Ga2O3, Ag2O și CuO, reprezintă materiale importante pentru aplicații în
epitelizare a cutanată.
Biosticlele solubile pot impiedica , prin eliberarea controlată a anumitor
ioni antimicrobieni și antibacterieni , atașarea bacterii lor și declanșarea astfel
a infecției. Deși nu se cunosc prea multe despre efectele angiogenice ale
ionilor specifici eliberaț i de biosticle, se pare că siliciu, zincul, borul,
magneziul și stronțiul pot juca un rol important în acest proces.
Cuprul este u n element promițător datorită potențialului angiogenic
bine cunoscut, precum și efectului său asupra sintezei matricei extrace lulare.
Prin urmare, încorporarea cuprului în sticle bioactive poate constitui un pas
important în dezvoltarea efectului epit elizant cutanat al biosticlelor . 5

13
Suprafa ța bioactiv ă a sticlei

În realizarea unei suprafe țe bioactive a biosticlelor sunt necesa re mai multe
etape:
1. Schimbarea ionilor alcalini de Na+,Ca2+ cu ioni de H+ si HCO 3 din
fluidele corporale
2. Dizolvarea re țelei si formarea legaturii de SIO 2
3. Polimerizarea pe gel de siliciu SIO 2+SIO 2-> SI-O-SI + H 2O
4. Absorb ția de amorf Ca2++PO 4+CO 3-> HCA
5. Abso rbția biochimic ă a factorului de cre ștere pe stratul HCA
6. Acționarea macrofagelor
7. Atașarea celulelor stem
8. Diferen țierea celulelor stem in osteoblaste
9. Generarea matricei
10. Cristalizarea matricei anorganice de fosfat de calciu
11. Proliferearea si cre șterea osului [6]
Reacțiile chimice pe suprafața sticlei se bazează pe percolare,
dizolvare și precipitare. După ce a fost implantată, biosticla prezintă prima sa
reacție rapidă pe suprafața și constă în schimbarea Na + sau K +cu H + sau
H3O+ din soluție. Această reacție produce un mediu alcalin în care
alcalinitatea soluției rezultă din ruperea legăturilor Si-O-Si, în principal de
către ionii de hidroxil. Această dizolvare are loc numai local la suprafața sticlei
și are ca rezultat formarea grupărilor silanol (SiOH) la interfaț ă. 7
Grupurile de silice hidratate condensează și repolimerizează cu
grupările si lanolice formând un strat bogat în SiO 2 pe suprafață. Această
precipitare este facilitată de migrarea grupurilor Ca2+ și PO 4-3 la suprafață prin
stratul bogat în SiO 2 și există înc orporarea în c ontinuare a Ca2+ și PO4 3- din
soluție în acest strat. Acest pas are loc în câteva minute după implantarea

14
biosticlelor. S -a observat o nucleare a unui film îmbogățit cu CaO -P205 pe
stratul de SiO 2 și formarea unui apatit de carbonat de calciu de tipul osos pe
suprafața sticlei în 10 ore de la implantare. Reacțiile descrise mai sus au ca
rezultat un strat cu grosime de 100 până la 120 μm, bogat în SiO 2 și un strat
de aproximativ 30 μm grosime de hidroxicarbo nat de apatită (HCA ). 7

Aplica ții ale biosticlelor in practica medical ă

TABEL 2.APLICAȚIILE BIOSTICL ELOR
1969 Invenția compoziți ei de sticlă 45S5 (45S5 Bioglass®)
1977 Tratamentul unor afecțiuni ale urechii prin utilizarea ceramicii Ceravital®
(înlocuirea oaselor mici din urechea medie)
1978 Implant ocular (bioc ompatibilitate cu țesutul cornean)
1985 Aprobarea de către Food and Drug Administration (FDA) a primului implant 45S5
Bioglass® (implantul MEP® pentru reparația oaselor urechii medii)
1987 Tratamentul tumorilor maligne hepatice (biosticle radioactive)
1988 Utilizarea clinică a implantului de întreținere Ridge Endosseous Ridge (ERMI) 45S5
Bioglass® la pacienții umani
1993 Aprobarea Fda PerioGlas (45S5 Bioglass®particulate ) pentru reparația oaselor și dinților
1998 Repararea nervului periferic
1999 Aprobarea de către FDA a biosticlelor radioactive (TheraSphere®) pentru tratamentul
cancerului
2000 Epitelizare cutanata
2002
Aprobarea FDA a Medpor® – PlusTM (polietilenă/45S5 Bioglass® pentru implantur i
poroase orbitale).
2003 Cimenturi dentare antibacteriene (care conțin Zn)
2004 Ingineria țesutului pulmonar
2004 Utilizarea sticlei bioactive mezoporoase (MBG) ca sistem de administrare a
medicamentelor
2005 Repararea muschiilor scheletici si a ligam entelor
2005 Tratamentul ulcerelor gastro -intestinale
2010 Ingineria țesutului cardiac
2011 Comercializarea unei sticle bioactive de borat pentru vindecarea ranilor în medicina
veterinară. Aprobarea FDA este în așteptare.

15
2012 Embolizarea fibromului ut erin
2012
Repararea măduvei spinării
1018 Utilizarea sticlelor radioactive (TheraSphere®) la pacienții cu carcinom colorectal cu
metastaze hepatice
[1]

Propriet ățile mecanice ale biosticlelor
Vâscozitate
Vâscozitatea bio sticlelor variază în funcție de temperatură. La o
vâscozitate de 106,6 Pa, materialul topit atinge vâscozitatea care poate
preveni deformarea sub propria greutate. Pentru temperatura de topire
vâscozitatea <10 Pa este obținută pentru majoritatea biosticlel or. Materialul
topit trebuie să fie suficient de vâscos pentru a curge sub tensiuni acceptabile
dar și pentru a menține forma lichidului .3
Elasticitate
În condițiile aplicării unui stres extern, biosticlele pot suferi deformări
elastice iar ace st parametr u trebuie să fie controla t pentru a obține calitățile
mecanice dorite. Pentru biosticlele obținute prin topire, modul elastic nu poate
fi considerat constant, deoarece este dependent de timp. Astfel, biosticlele
lichide sunt considerate vasco -elastice/ anelastice . 3
Fragilitate
Biosticle le sunt materiale fragile dispuse la fracturi și fisuri. De obicei,
fractura reprezintă separarea sub stres a materialului în două sau mai multe

16
componente. Stresul poate fi reprezentat de compresie, tracțiune, forfecare
sau torsiune .3
Teoria lui Griffith
Griffith spune că o creștere a fisurii are loc atunci când energia
necesară pentru formarea unei noi suprafețe de fisură este egală cu scăderea
energiei tensiunii elastice .3
Rezisten ța la fractur ă
Griffith a definit rezisten ța la rupere ca fiind rezisten ța materialului în
prezența fisurilor . Un alt parametru mecanic importa nt este duritatea care
indică reziste nța materialului la modificarea formei, la aplicarea forței de
compresie. Măsurarea durității poate fi efectuată prin testarea zgârieturilor.
Duritatea este cea care conferă rezistent ă probei la compresia data de un
obiect ascuțit .3
Biosticle dure și biosticle moi
Dacă componentele anorganice bioactive cum sunt silica și titan ul
sunt combinate cu componente organice flexibile se pot obține biosticle cu
elasticitate scăzuta folosite în special în ortop edie. Prin pregătirea titanului și
a aliajelor sale prin tratare cu NaOH și încălzire crește rigiditatea și
maleabilitatea la rupere. Biosticlele imp lantate în vederea utilizării în clinică
trebuie să prezinte o legătură puternică cu țesuturile dure și moi. Ele au, de
obicei, fragilitate ridicată și rezistență mecanică slabă. Condițiile de
procesare, compoziția, precursorii și dimensiunea particulelor afectează în
mare măsură proprietățile mecanice și bioactivitatea biosticlelor 3.

17
Anatomia si fiziologia pielii

Embriolog ie cutanat ă
Pielea, numit și cel mai mare organ al corpului se întinde pe o
suprafață de 1,8 m2 și măsoară aproximativ 4 kg . [7]
Pielea are o dublă origine embrionară respectiv din ectoderm și
mezoderm . La dezvoltarea ei particip ă ectoder mul de acoperire din care se
dezvolt ă epidermul și anexele cutanate, mezodermul, un precursor al
dermului și neuroectodermul din care își au originea melanobla știi și celulele
Merkel . [8]
Structura pielii
Pielea, n umit și cel mai mare organ, deoarece reprezint ă aproximativ
15 % din greutatea corpului are rol important in protec ția țesuturil or interne
fiind un înveliș cutanat neîntrerupt conjuctivo -epitelial. Pielea prin dispunerea
la suprafața corpului asigură protecție împotri va expunerii la traum atisme ,
radiații ultraviolete (UV), temperaturi, toxine și bacterii.
Practic d e la suprafață spre profunzime, tegumentul este format din
următoarele straturi: epidermul cu structurile sale anexe, membrana bazală,
dermul și hip odermul , numit și țesutul subcutanat . [9].
Primul strat, epidermul este format dintr -un epiteliu scuamos
stratificat cheratinizat care se reînnoiește continuu, si cuprinde mai multe
straturi, începând cu stratul bazal chiar deasupra d ermului și continuă în sus
cu straturile spinos și granular și la final stratul cornos. Are ca funcție
principală protecția împotriva agresiunilor , potențial periculoase pentru

18
mediu, oferind imunitate fizică, chimică, biochimică ( imunitate antimicrobiană,
înnăscută) și imunologic ă adaptativ ă. 8.Funcția de barier ă depind e in cea mai
mare masura de epiderm .9 În epidermul sănătos există un echilibru între
procesele de proliferare și descuamare cu o reînnoire complet ă care durează
între 15 și 30 de zile . 8 În aproape fiecare parte a epidermei, inclusiv
epidermul interfolicular, în zona rădăcin ii exterioar e a foliculului de păr, în
foliculul de păr, glandele sebacee și glandele sudoripare se gasesc celule
stem sau celule progenitoare epidermale 10.
Dermul, al doilea strat, este un țesut bogat în fibre de colagen și
elastice care găzduiește vase, nervi, și receptori senzoriali. Este un țesut
conjunctiv fibro -elastic de susținere destul de dur ce susține epidermul, și
asigură fixarea acestuia la țesutul subcutanat, adică la hipoder m [10].Dermul
beneficiază de o inervație bogată dar lipsită de fibre parasimpatice. Fibrele
nervoase aferente sunt reprezentate de un plex superficial ce conține
terminații nervoase libere, de miniplexuri care inervează foliculii piloși și de
receptorii senzitivi încapsulați . [10]
Ultimul strat, hipodermul este format din țesut adipos, fiind atașat
de fascia profundă sau periost. Este un țesut conjunctiv lax în care predomin ă
celulele grasoase, adipocit ele, cu rol izolator și în stocarea de energie termică
fiind un bun amortizor în șocuri. Prezintă o rețea capilară extinsă ce permite
absorbția rapidă a preparatelor injectate în această zonă.
La limita de contact dintre țesut ul epitelial și conjunctiv, se găsește
membrana bazală. Me mbrana bazală deține mai multe funcții și anume,
asigur ă polaritatea celulelor epiteliale, are rol de susținere și ajuta la fixarea
epiteliului la țesutul conjunctiv . [11]

19
Vasculariza ția pielii
Țesutul conjun ctiv conține o rețea bogată de vase sangvine și
limfatice. Arterele care asigura nutriția sunt împărțite în două plexuri arteriale:
primul este localizat între stratul papilar și stratul reticular iar cel de al doilea
între derm și țesutul subcutana t. [10]. Din aceste două plexuri se desprind
arteriol e subțiri care vascularizează papilele dermice. O papilă conține o
arteriolă și o venul ă.
Venele țesutului conjunctiv sunt împărțite în trei plexuri: rețeaua
hipodermic ă supraa ponevrotică ,re țeaua dermic ă profundă si plexul capilar
papilar . [12]
Circulația limfatică a tegumentului începe prin vase în deget de
mănuș ă aflate la nivelul papilelor dermice care se unesc și formează două
plexuri corespunzăto are localizării plexurilor arteriale. [10]
Sistemul circulator cutanat are un rol important în schimburile
metabolice și în termoreglare (vasodilatație arterială a plexurilor dermice și
vasoconstricție a vaselor hipodermice în co ndiții de căldură excesivă, iar în
condiții de frig reacție vasomotorie inversă, însoțită și de o încetinire a
debitului sanguin în circulația venoasă). [8]
Inerva ția pielii
La nivelul tegumentul întâlnim o multitudine de fib re nervoase
senzitive cu o suprafață întinsă. Pe lângă funcția sa principală de a recapta
diverși stimuli ambientali, putem afirma că tegumentul poate fi numit cel mai
întins receptor senzitiv al organismului. [10]
Inervația piel ii se realizea ză prin nervi cerebrospinali centripeți
(senzitivi) și prin filete simpatice, centrifuge, cu o acțiune vasomotorie și

20
secretorie, care au terminațiile în mușchii netezi cutanați, în pereții vaselor și
în glandele sudoripare dar nu și în cele sebacee.Venind din profunzi mea
hipodermului, ele urcă sinuos spre derm, însoțind pachetul vascular și luând
parte la formarea plexurilor dermice și subpapilare; mici ramificații urcă spre
epiderm, iar unele neurofibrile ajung până în apropierea stratului g ranulos . [8]
La nivelul dermului sunt terminații nervoase libere și încapsulate iar la
nivelul dermului papilar se găsesc corpusculii Meissner și Krause. La nivelul
dermului profund și la nivelul hipodermului se găsesc corpuscu lii Vater Pacini
și corpusculii Golgi Mazzoni pentru simțul tactil si de presiune și corpusculii
Ruffini pentru sensibilitatea termică la cald . [12]
Terminațiile nervoase libere sunt sensibile la presiunea tactilă,
temperaturi scăzute sau crescute , prurit, durere și diferite tipuri de senzații.
Terminațiile ramificate au ca reprezentant receptorii Ruffini pentru cald iar
terminațiile încapsulate prezintă ca reprezentanți corpusculii Vater -Pacini
pentru sensibilitatea tactil ă și de presiune, Meissne r și Krause pentru frig. [10]
Terminațiile ramificate și cele încapsulate, la fel ca și mecanoreceptorii sunt
sensibil i la stimulii tactili. [10]
Impulsurile sensibilității cutanate pornesc ca excitații de la nivelul
extero receptorilor amintiți care le înregistrează și le transmit sistemului
nervos central, și se transform ă la nivelul scoarței cerebrale în senzații
corespunzătoare de frig, căldură, presiune, tact . [8]

Func țiile pielii
▪ Keratinogeneza : Procesul începe de la nivelul celulelor stratului bazal
înspre celulele straturilor superioare fiind o funcție continuă a celulelor
epidermului. Keratina este o proteină fibroasă, de structură a

21
epidermu lui care oferă rezistență.La nivelul epidermului vom întâlni o
keratina moale. [9]
▪ Melanogeneza : Procesul începe la nivelul melanocitelor aflate în
stratul bazal plecând de la fenilalanina . Ea ajunge la nivelul
keratinocitelor v ecine prin transfer din dendritele melanocitului. Ajuns
în kerat inocite, se dispersează colorând citoplasmă. Keratinocitele
împreună cu melanocitele formează unitatea melano -epidermic ă.
Melanogeneza depinde într -o mare măsură de radiațiil e ultraviolete,
glutation, hormonul melanostimulator, estrogeni și progesteron și de
factorul genetic. [9]
▪ Funcția secretorie : Este reprezentată de secreția respectiv excreția
de sebum la nivelul grandelor sebacee și prin secreția și excreția de
sudoare la nivelul gla ndelor sudoripare. Glandele sebacee , stimulate
de hormonii androgeni produc sebum cu un important rol în lubrifierea
tegumentului, protejându -l și totodată împiedicând uscarea lui.
Glandele sudoripare sunt de două feluri, ecrine și apocrine. Cele
ecrine s e găsesc la nivelul dermului profund pe suprafața întregului
tegument. Prezintă o secreție acidă. Ele sunt inervata de fibrele
colinergice fiind stimulate de emoții și temperaturi ridicate. Glandele
apocrine se găsesc doar în anumite regiuni, cum ar fi zon ele axilare,
perimamelonare, genitale, pubiene și prezintă o inervație
adrenergică. Secreția lor este puternic mirositoare datorită acțiunii
bacteriilor. [9]
▪ Funcția de protecție : Țesutul cutanat se prezin tă ca o veritabilă
barier ă bidirecțională, având funcția principală de protecție mecanică
datorită keratinei. Pielea prezintă la rândul său câteva caracteristici:
la suprafața pielii, se găsește o peliculă realizată din combinarea
secreției sudorale și seb acee, numită mantaua acidă a pielii c u un pH
acid ce variază de la 4 la 7. O altă caracteristică a ei este dată de

22
protecția chimică, realizată de keratina și de capacitatea de
neutralizare a pielii față de substanțe al caline și acizi. Pielea prezintă
și o protecție antimicrobiană datorată pe liculei acide și descuamării
continue a celulelor cornoase. [9]
▪ Rolul în termoreglare : Tegumetul intermediază schimburile de
căldură dintre mediu și organism. Pierderile de căldură se realize ază
prin iradiere, convecție și conducție ș i în mai mică măsură prin
evaporare și vaporizarea apei din sudoare . La nivelul tegumentului
întâlnim corpusculii Ruffini pentru cald și corpusculii Krause pentru
rece ca re, transmit stimuli la nivelul hipotalamus ului, de unde pleacă
fibrele eferente care determină vasodilatație și secreție sudorală. [9]
▪ Sinteza vitaminei D : Are loc la nivelul keratinocitelor, unde sub
acțiunea razelor solare are loc transformare 7 -dehidrocolesterolului în
colecalciferol inactiv, care la nivel renal, prin hidoxilare se activează
în vitamina D. [9]
▪ Funcții fizico -mecanice : Tegumentul prezintă și câteva funcții fizico –
mecanice. Dintre ele enumer ăm tensiunea cutanată care se
caracterizează prin rezistență pe car e pielea o opune forțelor
exterioare mecanice,deformându -se temporar. O altă funcție este cea
dată de elasticitatea pielii. Aceasta este proprietatea tegumentului de
a rev eni la forma inițială după ce înlăturăm forțele exte rne și nu în
ultimul rând plasticitatea pielii, defi nită prin capacitatea pielii de a se
deprima sub acțiunea unei forțe externe datorită structurii dermului și
hipodermului. [9]

23

Mecanisme cu rol in epitelizare a cutanată
Re-epite lizarea este un proces complex și dinamic, care depinde într
o mare măsură de starea de sănătate a individului. Este totodată și expresia
unei secvențe complicate de răspunsuri celulare și biochimice înd reptate spre
restaurarea integrității țesutului și a capacității funcționale.
Orice modificare în continuitatea pielii se numese plagă sau rană. Aceast a a
fost definită ca "o întrerupere a structurilor și funcțiilor anatomice normale"
[13]. Epitelizarea este o componentă esenți ală a vindecării rănilor și este
folosi tă ca parametru definitoriu al închideri i rapide a plăgii. O rană nu poate
fi considerată vindecată în absența reepitelizării . [14].Procesul de
reepitelizare necesită celule noi care să înlocuiasc ă keratinocitele pierdute
prin rănire. [15]
Atunci când există o pierdere mai mare a celulelor sau se creează
defecte mari, procesul reparativ este mai complicat. Țesutul de granulație
crește de la margini pentru a finaliza repararea. Aceste plăgi se vindecă cu o
cicatrice inestetică. Aceasta se numește vindecare prin intenție secundară.
Diferă de vindecarea primară prin:
•Reacția inflamatorie este mai intensă .
• Sunt formate cantități mult mai mari de țesut de granu lație.
• Contracția rănilor este mult mai mare . [13]

Un pansament ideal pentru vindecarea r ănilor trebuie:
• să fie biocompatibil;
• să fie elastic

24
• să fie confortabil de aplicat la rană
• să mențină un mediu umed sau să furnizez e ume zeală într -un mediu
deshidratat, în timp ce absoarbe fluidul
• Să stimuleze vindec area rănilor și reepitelizării pentru a reduce
necroza suprafeței r ănilor
• să prevină sau să protejeze de infecție2

Etapele epitelizării cutanate

FIGURA 1. ETAPELE EPITELIZ ĂRII
Epitelizarea presupune o serie complexă de procese biologice care
sunt în mod tipic descrise ca succesiunea a trei faze: inflamația, formarea
țesutului sau faza de proliferare și remodelarea ti sulară. [15]
Mecanismele celulare pivot pentru progresia vindecării rănilor arată
astfel. P rimele etape de vindecare includ hemostaza și activarea
keratinocitelor și a celulelor inflamatorii. Stadiul intermediar implică
prolif erarea și migrarea keratinocitelor, proliferarea fibroblastelor, depunerea
componentelor matrici ale și angiogeneza. În continuare apare remodelarea
ECM, având ca rezultat formarea cicatricilor și restabilirea barierei . [16]
Prima fază, de inflamație, este subdivizată în răspuns vascular
(hemostază) și răspuns celular ( inflamație). În general aceasta faz ă const ă în

25
activarea trombocitelor care conduc la formarea unui cheag de fibrină și la
secreția agenților chemotactici, urmată de recrutarea de neutrofile. Are loc
activarea celulelor T cu rol în susținerea inflamației ș i recrutarea mon ocitelor
și activarea macrofagelor cu rol în eliminarea resturilor. Astfel, acest ă primă
etapă a epitelizării are un important rol în curățarea pl ăgii de celulele străine .
[15]
Faza de formare a țesuturilor constă în repararea plăgii prin
refacerea diferitelor părți ale pielii ca re au fost deteriorate: epiderm (printr -un
proces numit reepitelizare ), derm și alte structu ri (vasele de sâ nge, nervii,
unitățile pilosebace e și glandele sudoripare ecrine). Astfel natura plăgii va
dicta nu numai mecanismele celulare prin care se va realiza faza de formare
a țesutului dar și timpul necesar pentru finalizarea aces tuia. [15]
Drintre factorii de creștere, pielea sintetică, colagenul, insulina,
antioxidanții topici, oxigenul hiperbaric, terapia cu laser, stimulare electrică,
terapia cu presiune negativă, pasta de parafină cu iodoform și bismut (BIPP),
terapia cu ozon, oxidul de zinc , utilizați în epitelizarea precoce a plăgilor , un
loc aprate îl ocup ă biosticlele.

Rolul fibroblastelor in epitelizare
Țesutul de granulație este format di ntr-o populație densă de
macrofage, fibroblaste și vase de sânge înco rporate într -o matrice liberă de
fibre de cola gen, f ibronectină și acid hialuronic .11
Prima etapă a diferențierii fibroblastelor este transformarea lor în
proto -miofibroblaste. Proto -miofibroblastele formează complexe de aderență
mai m ature cu matricea extracelulară decât fibroblastele și formează primele
fascicule de colagen. Protomiofibro blastele pre -organizează matricea

26
extracelulară prin exercitarea unor forțe de contracție mici pr in intermediul
fibrelor de stres. Achiziția ulterioară a actinei mușchiului neted alfa în asociere
cu fibrele de stres contrac țile actin ă/miozin ă completează d iferențierea î n
miofibroblaste . 11
La 2-3 zile după producerea leziunii, fibroblastele încep procesul de
proliferare și migrare și accelerează astfel procesul de vindecare al plăgii.
Procesul de vindecare al rănilor e accelerat și de faptul că fibroblastele se pot
diferenția în miofibroblas te care au rolul de a stimula contracț ia rănii. Într -un
studiu realizat de Hongfei Yu și colaboratorii s -a demonstrat că biosticlele au
stimulat în mod semnificativ migrarea fibroblastelor în vitro . În vivo , s-a
confirmat faptul că, odată ce s -a accelerat viteza de migrare a fibroblastelor
în straturile de celule sub acțiunea BG, mai multe fibroblaste au migrat în
zona plăgii comparativ cu fibroblastele netratate . 12
Particulele BGS 90S pot inhiba sinteza col agenului și diferențierea
fibroblastelor la miofibroblaste prin blocarea semnalizării TGF -b1-Smad2 în
fibroblaste. Este clar că particulele 90S BG au promovat migrarea
fibroblastelo r, au modulat sinteza de noi molecule ECM și au inhibat
diferențierea fibro blastelor -miofibroblaste. 13
Se poate presupune că odată ce fibroblaste tratate cu BG sunt
aplicate la suprafața rănilor, fibroblastele migrează în patul plăgii și vor
produce bFGF și VEGF suplimentar pentru a stimula formar ea de noi vase
de sânge pe ntru epitelizarea țesuturilor 12.

Rolul angiogenezei în epitelizarea cutanată
Angiogeneza este mecanismul de formare a vaselor sanguine noi și
reprezintă o fază crucială în vindecarea rănilor și are ca efect invazia capilară.

27
Este vitală pen tru formarea țesutului de granulație și pentru vindecare a
plăgilor. Angiogeneza este reglată de diferiți factori de creștere, cum sunt
factorul de creștere vascular endotelial (VEGF),TGF -b și factorul de creștere
fibroblastic (FGF) .3 Angiogeneza constituie baza ingineriei țesuturilor . 3
Vascularizarea este un element esențial în procesul de regenerare
deoarece celulele tinere în procesul creșterii lor au nevoie de nutienti și
oxigen. Datorită creșterii fluxului de sânge la nivelul zonei afectate, VEGF
determină creșterea producției de mRN A a receptorilor VEG F. 3. Pornind de
la aceste date potențialul angiogen al biostic lelor a căpătat o atenție sporită
în ingineria tisulară .
S-au desfășurat studii multiple privind potențialul biosticlelor de a
stimula angiogeneza, unele dintre ele concentrându -se pe com poziția
biologică de 45S5 și rolul său în angiogeneza clinică.
Leu și colegii au descoperit un răspuns proliferativ dependent de doză
al celulelor endoteliale cultivate pe colagen încărcat cu Bioglass . 3
Andrade și colaboratorii au evalu at răspunsul angiogen și inflamator
al fibrelor de colagen acoperite cu BG după implantare subcutanată la
șoareci. Se observă că proportia de hemoglobină (Hb) extras a din implanturi
este mai mare în implanturile de colagen acoperite cu biosticlă, comparati v
cu grupul fără biosticlă, după 14 zile de implantare . 3

28

Parte a specială

29
Introducere

În ultimul deceniu s -a înregistrat o creștere impresionantă a noilor
aplicații pentru biosticle (BG) în medicina regenerativă.
Dacă până acum, au fost utilizate îndeosebi pentru refacerea oaselor
lezate, în ultima vreme și -au găsit aplicații în epitelizarea țesuturil or moi, cum
este pielea, tractul gastro -intestinal și plămânul .14
Biosticla este un exemplu de ceramică non -cristalină compus ă din
SiO2, Na2O, CaO și P2O5 în diferite proporți i; fie un raport scăzut de silice
într-un produs cu raporturi mari de sodiu/calciu fie cu un conținut mare de
calciu/ fosfor în alte produse .15
Primul BG, aparținând sistemului quate rnar SiO2 -Na2O -CaO-P2O5 a
fost dezvoltat de Prof. Larry Hench la sfârșitul anilor 1960 și este în uz clinic
din 1985 sub denumirea de 45S5 Bioglass® .14
Biosticlele pot promova proliferarea și activarea fibroblastelor și pot accelera
procesul de vascularizare, ceea ce duce la creșterea țesutului de granulați e.
De asemenea, pr oduc factori de creștere, VEGF și FGF2 ben efici pe ntru
vindecarea rănilor, promov ând astfel vindecarea țesuturilor mai rapid și mai
eficient. 16
Stoor și colab oratorii, la fel si Yliurpo și colaboratorii au constatat că
S53P4 Bioglass posedă un efect antibacterian împotriva a patru
microorganisme clasice. Recent, Munukka și colab oratorii au raportat că
biosticlele derivate din procesul sol -gel au exercitat un efect anti bacterian pe
bacteriile patogene clinice clasice .17
Pornind de la aceste date studiul de fa ță și-a propus evaluarea
efectului epitelizant a unor pre parate farmaceutice cu biosticle pe un model
experimental de arsur ă cutanat ă. S-au creat plagi de dimensiuni standard si
s-au aplicat unguente cu două din biosticlele studiate în vitro c omparativ cu

30
unguentul simplu fara biosticle si cu Dermazinul care est e gold standard in
promovarea epitelizarii cutanate. Evaluarea s -a realizat la 7 si 14 zile prin
aprecierea țesutul ui de granulație , a stresului oxidativ, a nivelului
metaloproteazelor m atriciale și a inhibitorului acestuia TIMP1 și prin analiza
histopatol ogică a vasculariza ției, infiltratului celular, a gradului de fibroz ă, a
distribuirii colagenului și a grosimii țesutului de gr anulație. În plus, tot la 2 zile
s-au măsurat diametrele plăgilor.

31
Materiale si metode

Studiul a fost realizat la Biobaza Ca tedrei de Fiziologie din cadrul
Universitãții de Medicinã și Farmacie ‚Iuliu Hațieganu’ din Cluj Napoca. S -a
utilizat un model experimental pe șobolani, pentru care s -a primit aprobarea
comisiei de etică a universității noastre și a Direcției Sanitar Veter inară și
pentru Siguranța Alimentelor Cluj .

Animale de experien ță si design ul experimental

Pentru studiu s -au utiliza t 40 șobolani rasa Wistar cu plăgi
experimentale create prin arsur ă. Animalele au fost furnizate de Centrul de
Medicină Experimentală ș i Aptitudini Practice – Biobaza U.M.F. Cluj -Napo ca.
Studiul pe model animal, respectiv pe șobolani rasa Wistar, este
opțiunea ideală pentru a determina efectul reparator cutanat al biosticlelor.
Accesibilita tea, corespondența morfologică și patologică per mite posibilitatea
obținerii unor date relevante într-un timp scurt, pe un număr redus de animale
de experiența și cu efecte adverse minime.
S-au folosit 4 loturi de anima le cu plăgi cutanate standard ( 8 mm
diametru) realizate prin arsur ă cu ajutorul elect rocauterului. Plăgile s -au
realizat la nivelul toracelui dorsal , după o prealabilă radere. Peste arsurile
create experimental s -au aplicat topic unguente preparate cu
biosticle. Comparația s-a făcut cu un unguent simplu ca martor negativ și cu
Dermazin ca martor pozitiv.
Plaga chirurgicală a fost realizată în anestezie generală cu xilazină
(10 mg/kg corp greutate) și ketamină (100 mg/kg greutate corporală)
administrate intraperitoneal.
Animalele au fost randomizate în patru loturi după cum urmează:

32
– Lotul 1 – tratat cu unguent simplu
– Lotul 2 – tratat cu biosticla 1 înglobată în unguent simplu
(0.5V 2O5.99.5[4B 203.CaF 2] )
– Lotul 3 – tratat cu biosticla 2 înglob ată în unguent simplu
(1V 2O5.99[4B 203.CaF 2])
– Lotul 4 – tratat cu Dermazin
Biomaterialele sub formă de pulbere înglobate în unguent s -au aplicat
în strat subțire la nivelul plăgii după dezinfecția prealabilă cu etanol diluat
(70%).
Cremele au fost preparate de către colegii de la Catedra de
Tehnologie Farmaceutică . Plagile au rămas descoperite iar anima lelor li s -a
permis să se miște liber, fără restricții .

Animalele au fost menținute în cuști cu 5 animale/cușc ă, în condiții de
umiditate 65%, temperatură 21°C, cicluri noapte/zi a câte 12h, hrana a fost
standardizată și ap a s-a administrat ad libit um.

În intervalul de timp care a trecut de la crearea plăgilor până la
epitelizarea completă s-au măsurat tot la 2 zile dimensiun ea plăgilor iar în
zilele 7 și 14 la jumătate din animalele fiecărui lot s-au recolta t probe de țesut
cutanat de granulație pentru determinări biochimice de stres oxidativ
(malondialdehida , oxid nitric și superoxiddismutaza ) și pentru cuantificarea
nivelului metaloproteinaz elor matriciale 2 și 9 și a inhibitorului lor TIMP 1. De
asemenea , s-au recoltat probe pentru investigații histo patologice.

Dimensiunea plăgilor a fost apreciată prin măsurarea diametrul ui cu
ajutorul unei rigle, tot la 2 zile respectiv în zilele 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 și ziua 14.
La 7 și la 14 zile, de la ½ din numărul de animale din fiecare lot s -au recoltat
probe de țesut cutanat pentru determinări biochimice de stres oxidativ și
pentru evaluarea nivelului metaloproteazelor ma triciale și pentru investigații

33
histopatologice. După recoltare animale le au fost eutanasiate în anestezie cu
ketamină/xylazină (90 mg/kg b .w. keta mină și 10 mg/kg b.w. xylazină).

Reactivi

Biosticle : BS 1, xV 2O5[100-x][4B 203.CaF 2]
BS 2, 0.5V 2O5.99.5[4B 203.CaF 2]
BS 3, 1V 2O5.99[4B 203.CaF 2]
sită farmaceutică 50 µm (Retsch, Germania), vaselină albă (Sigma -Aldrich),
baie de apă (Raypa , Spania), pHmetru (Mettler Toledo, SUA), Zetasizer Nano
– ZS90 (Malvern, Marea Britanie).

Preparatul dermatologic este o pastă (50% pulbere BS în suspensie
într-o bază lipofilă hidrofobă), de culoare albă, cu consistență crescut ă, ce
aderă bine la suprafața pielii.

Obținerea preparatelor dermatologice pe bază de
biosticle (BS)

Au fost obținute preparate dermatogice de tip pastă, prin încorporarea
pulberilor de BS în vaselină în proporție de 50% (m/m). 18. BS a fost
pulverizată la mojar și selectată fracțiunea cu diametrul particulelor mai mic
de 50 µm, cu ajutorul sitei farmaceutice coresp unzătoare17.Prepararea
propriu -zisă a constat în adăugarea peste pulberea de BS a vaselinei topite
pe baia de apă și amestec area până la răcire și omogenizarea pastei
rezultate. [17] S-a procedat la fel pentru toate cele trei BS studiate. V aselina
ca atare s -a folosit pentru tratarea lotului control.

34
Măsurarea pH -ului și a potențialului Zeta

Probele de BS s -au suspendat în tampon fosfat salin (PBS), în raport
de 0,2 g pulbere la 100 ml PBS, pH -ul inițial fiind de 7,35 la 37oC.

Cedarea in vitro a ionilor de calciu

Probe de BS de 0,2 g s -au dispersat în 100 ml PBS și s -au menținut
la 37oC. La anumite intervale de timp, dispersiile au fost centrifugate la 5000
rpm, iar în supernatant s -au dozat ionii de calciu. S-a urmărit variația
concentr ației de Ca2+ în timp: 30 minute, 1,3,7 respectiv 14 zile. Toate probele
au fost realizate în triplic at.

Dozarea ionilor de calciu

Determinarea Ca2+ s-a efectuat printr -o metodă potențiometrică
folosind u n electrod ion selectiv (ISE) ( Ca2+ selectiv), Ca 500 de la WTW
GmbH, Germania și un potentiometru Consort C830, Belgia. Celula
electrochimică a fost alcătuită din electrodul Ca2+ selectiv și un electrod de
referință de tip Ag/AgCl, produs de BASi, USA. Testările s -au efectuat în
volume de 10 mL sub cont inuă agitare folosind un agitator magnetic FALC
(Falc instruments, Italia).
Soluțiile probă au fost diluate 1:1 cu o soluție de 0.2 M KCl obținând
în final soluții de probă în 0.1M KCl, păstrând astfel forța ionică a soluțiilor
standard cu care s -a trasat dreapta de calibrare. S -au analizat potențiometric
probele astfel diluate, s -a calculat concentrația de Ca2+ din fiecare probă,
media probelor identice și deviația standard. Toate testele au fost efectuate
în aceeași zi la temperatura camer ei.

35

FIGUR A 2.ELETRODUL CA2+ SELECTIV

FIGUR A 3.CELULA ELECTROCHIMICĂ ALCĂTUITĂ DIN ELECT RODUL DE LUCRU (ISE CA2+) ȘI
ELECTRODUL DE REFERI NȚĂ AG/AGCL

FIGUR A 4. SISTEMUL DE TESTARE ALCĂTUIT DIN CELULA ELECTROCHIMICĂ,
POTENȚIOMETRUL CONSORT C830 ȘI AGITATORUL MAGNET IC FALC

Evaluarea stresului oxidativ si a nivelului metaloproteazelor
matriciale

Pentru evaluarea parametrilor de stres oxidativ și a statusului
antioxidant s -au determinat în omogenatul de tesut cutanat nivelul
malondialdehidei (MDA) ca marker al efect ului radicalilor liberi asupra
lipidelor si oxidul nitric ca marker de stress nitrozativ precum si activitatea

36
superoxide dismutazei ca m arker al apararii antioxidante . Pentru prepararea
omogenatului de tesut cutanat probele au fost omogenizate iar conținu tul
proteic a fost mãsurat prin metoda Bradford 19. Fragmentele de țesut tumoral
au fost omogenizate cu un omogenizator Polytron timp de 3 minute, pe
gheață, în tampon Tris, 50 mM, pH 7,4 cu un conținut de EDTA 10 mM
adăugat în raport de 1:4 (greutate/volum). Suspensia obținută a fost
centrif ugată timp de 5 min, la 5000 -rpm și la rece.
Determinarea malondialdehidei (MDA) s -a făcut după meto da
descrisă de Conti (64). Determinarea peroxidării lipidice în fluorescență se
bazează pe faptul ca malondialdehida rezultată formează cu acidul
tiobarbitu ric un aduct care poate fi măsurat fluorometric. Dozarea constă în
fierberea probei de plasmă sau om ogenat tisular (50µl) cu o soluție de acid
tiobarbituric 10mM în K 2HPO 4 75 mM pH=3 (1ml) timp de 1 h, pe baie de
apă. După răcirea bruscă, produsul de reacț ie se extrage în n-butanol.
Concentrația sa se determină în faza organică după separarea acesteia pr in
centrifugare.
Măsurarea intensității emisiei se face la 534 nm cu spectrofotometru,
în sistemul de fluorescență sincronă, la o diferență de lungime de un dă (Δλ)
între excitație și emisie de 14nm. Se utilizează o curbă de etalonare cu
concentrații cunosc ute de MDA prelucrate în același mod. Valorile de
concentrații sunt exprimate în nmol/ml pentru plasmă și nmol/mg pentru
omogenatul tisular. Pentru aprecier ea activitati i superoxide dismutazei .
Nivelul de oxid nitric in omogenatul de tesut cutanat a fost determinat
prin reactia Griess sub forma cantitatii totale de nitrit si nitrat din prob a.
Practic, nitratul a fost redus cu ajutorul nitrat reductazei la n itrit dupa ca re
proteinele au fost precipitate. Dupa centrifugare supernatatntul a fost tratat
cu reactive Griess. Conc entratia a fost calculata in comparative cu o curba
standard si rezultatele au fost exprimate ca nanomoli de proteina/mg de
proteina .20

37
Activitatea superoxid dismutazei a fost evaluat ă utilizând metoda
reducerii citocromului c (Beauchamp and Frido vich, 1971). Pe scurt,
omogenatul de țesut a fost introdus in soluția cu citocrom c (2 μM in 50 mM
tampon fosfat , pH 7.8) cu un con ținut de xantina (5 μM). Reac ția a fost
declansat prin adau ăgarea de xantin oxidaza (0.2 U/ml in 0.1 mM EDTA). S-
a înregistra t timp de 5 m inute cre șterea absorbantei la 550 nm ca indicato r al
reducerii citocromului c. O unitate de SOD reprezint ă inhibi ția ratei cre șterii
absorbantei la 550 nm cu 50% din cea produs ă de catre proba de control fara
SOD, in acelea și condi ții experim entale. Rezul tatele au fost exprimate sub
forma de U/mg protein a. 21
Nivelul metaloproteinazelor matriciale, MMP -2 si MMP -9 precum si a
inhibitorului lor a fost apreciat prin trehnica ELISA cu ajutorul kiturilor obtinute
de la R&D Systems.

Examinare histopatologică

După prelevarea țesutului, probele au fost fixate în formalină
tamponată cu fosfat 10% timp de 18 -24 ore, la 4°C. Probele au fost apoi
deshidratate î n concentrații crescute de etanol (80%, 95%, și 100%), curățate
în xil en și încorpo rate în Histowax (Histo -Lab. Ltd., Gothenburg, Sweden).
Secțiuni seriate de 5 µm au fos t tăiate, deparafinate, rehidratate cu apă și
colorate cu hematoxilină -eozină.
S-a folosit colorația specială Verhoeff van Gieson pentru a cuantifica
mai u șor țesutul de granulație, fibroza și colagenul normal.
Software -ul folosit a fost cel de analiza de imagine Leica, folosind
technicile de bază de morfometri e.

38

Analiza statistică

Datele obținute au fost analizate statistic utilizând softul Graphpad Pad
Prism 6. Toate valorile obtinute au fost exprimate ca media± deviația standard,
fiind considerat semnificativ statistic p<0.05.

39
Rezultate

Evaluarea Ph-ului in probe

FIGUR A 5.VALOAREA P H-ULUI ÎN DISPERSIILE PULBERILOR DE BS ÎN PBS,
LA 37°C, ÎN FUNCȚIE DE TIMP

Evoluția pH -lui a fost urmărită pe durata a 14 zile, dar deoarece după o zi
valorile au rămas constante, acestea nu au mai fost incluse în grafic. După
cum se poate obser va, în cazul celor trei sticle studiate (BS 1, BS 2 și BS 3 )
valorile pH -lui au crescut rapid în primele 2 -3 ore, urmând apoi o creștere
lentă, până la valori situate între 7,92 și 8,06 .

7,27,47,67,888,2
0 4 8 12 16 20 24pH
Timp (ore)BS 1
BS 2
BS 3

40
Evaluarea p otențialului zeta

FIGUR A 6. POTENȚIALUL ZETA ÎN DISPERSIILE PULBERILO R DE BS ÎN PBS
LA 37OC ÎN FUNCȚIE DE TIMP (BS 1, XV2O5[100 -X][4B203.C AF2]; BS 2,
0.5V2O5.99.5[4B203.C AF2]; BS 3, 1V2O5. 99[4B203.C AF2])

FIGUR A 7. POTENȚIALUL ZETA ÎN DISPERSIILE PULBERILOR DE BS ÎN PBS
LA 37OC ÎN FUNCȚIE DE TIMP (BS 1, XV2O5[100 -X][4B203.C AF2]; BS 2,
0.5V2O5.99.5[4B203.C AF2]; BS 3, 1V2O5. 99[4B203.C AF2])

Potențialul Zeta în dispersiile BS în PBS la 37oC a fost monitorizat, de
asemenea, pe durata a 14 zile, iar rezultatele sunt prezentate în Figura 6 si
Figura 7. 0481216
0 1 2 3potețialul Zeta
Timp (ore)BS 1
BS 2
BS 3
0481216
0 2 4 6 8 10 12 14 16Pote țialul Zeta
Timp (zile)BS
1
BS
2-
–
–
–

41
Deoarece potențialul z eta a evoluat foarte rapid în primele 2 ore,
rezultatele s -au prezentat în două grafice: Figura 6, pentru intervalul 0 -2 ore,
și Figura 7, pentru intervalul 0 -14 zile. Conform figur ii 6, potențialul z eta a
crescut foarte mult în primel e 10 minute, în special în cazul BS 2 și BS 3, ca
după 30 d e minute să se înregistreze valori apropiate de maxim pentr u toate
cele trei BS ( – 14,2 mV pentru BS 1, – 10,7 mV pentru BS 2 și – 13,4 mV
pentru BS 3). Din Figura 7 se poate observa că la momentul 2 zile are loc o
scădere import antă a valorilor potențialu lui zeta, pentru ca apoi să continue
să crească lent, după 14 zile depășind valorile maxime din perioada de
început.

Cedarea ionilor de calciu in mediu

FIGUR A 8.CONCENTRAȚIA IONILOR DE CA2+ CEDAȚI DIN BS ÎN TAMPON
PBS LA 37OC ÎN FUNCȚIE DE TIMP
Pentru dozarea Ca2+ în probele de la cedarea in vitro , s-a trasat drepta
de calibrare folosind soluții standard de Ca2+ în domeniul 0.5 – 20 µg mL-1 în
0.1M KCl pornind de la o soluție standard de 10 g/L (Fluka, Germania),
obținându -se dreapta de calibrare consi derând potenți alul soluției în funcție 0246810121416
0,02 1 3 7 14Concentratia ionilor de calciu
(µg/ml )
Timp (zile)BS 1
BS 2
BS 3

42
de -log concentrația de Ca2+: y = 22,246x( -log[Ca2+]) + 28,908, cu un
coefficient de corelare R2 = 0.9976.
Conform Figurii 8, cedarea ionilor Ca2+ s-a desfăș urat foarte rapid, la
30 de minute întregistrându -se cele m ai ridicate valori pentru toate cele trei
BS, în special pentru BS 2 și 3. După această etapă inițială, se observă o
scădere continuă până la 7 zile, după care urmează o nouă creștere ușoară
a nive lului de calciu .

Măsurarea diametrelor plăgilor cutanate

Masurarea diametrelor p lagilor la 2 zile interval , timp de 7 si 14 zile sunt
prezentate in tabelul de mai jos.

TABEL 3.MASUR ĂTORILE PL ĂGII EFECTUATE LA 7 SI 14 ZILE
veh veh veh BS1 BS1 la 7 BS1 la 14 BS2 BS2 la 7 BS2 la 14 dermazin dermazin2 dermazin3
0 714 0 714 0 714 0 714
8,6 8,3 6,2 8,3 4,6 4,2 8,6 9,4 6,2 8,6 14 6,2
8,6 5,5 5,2 8,6 6,7 5,4 8,6 8,3 5,4 8,5 9,3 6,3
8,4 5,4 5,2 8,7 7,2 6,2 8,6 9,3 6,1 8,5 8,7 5,8
8,4 6,5 58,5 5,8 5,5 8,6 8,5 5,2 8,6 7,7 5,2
8,7 6,4 4,5 8,6 4,3 4,2 8,7 6,2 4,5 8,6 7,6 6,2
8,5 5,4 8,6 9 8,7 5,2 8,6 9,9
8,5 5,4 8,6 7,6 8,6 7,9 8,5 8,4
8,5 5,5 8,3 6,3 8,6 5,5 8,5 9,4

Calculand mediile și deviațiile stand ard am constatat că nu sunt diferențe
semnificative între loturi (p>0,05).

43
Marker ii de stres oxidativ

Din omogenatul tisular s -au determinat la 7 și la 14 zile următorii parametrii
de stres ox idativ: nivelul malondialdehidei (MDA), oxid ului nitric (NO ) și
activitatea superoxiddismutazei (SOD), nivelul metaloproteinazel or
matriceale 2 (MMP2) și 9 (MMP9) si inhibitorului acestora, TIMP 1.

Evaluarea nivelului de peroxidare lipidică (MDA)

MDA 7 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin01234nmoli/mg P
MDA 14 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin01234
** ****nmoli/mg P

Rezultatele studiului nostru au ar ătat ca n ivelul malond ildehid ei
determinate la 7 zile de la inducerea plagii au fost nemodificate comparative
cu lotul martor (p>0,05) . Astfel , s-a demonstrat c ă nu exista di ferente
semnificative statistice intre loturi dup ă 7 zile. La 14 zile, at ât lotul care a primit
BS1, BS2 respectiv lotul care a primit Dermazin au prezentat niveluri scazute
ale malondialdehidei compara tiv cu lotul tratat cu v ehicul. Acest lucru a
indicat o reducere a stresului oxidativ la o difere nță semnificativ ă statistic .

44
Nivelul m etaloproteinaze lor matriceale (MMP)

MMP-2 7 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin050010001500pg/mg protein
MMP-2 14 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin050010001500
*pg/mg protein

MMP-9 7 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin0200400600800pg/mg protein
MMP-9 14 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin02004006008001000
**pg/mg protein

Nivelu l metaloproteinaz ei 2 determinate la 7 zile postinterventie a fost
nemodificat comparativ cu lotul martor (p>0,05) , demonstr ându-se astfel că
nu au existat diferen țe semnificativ statistice intre loturi. La 14 zile, lotul care
a primit Dermazin a preze ntat nivele scăzute ale metaloproteinazei
matriceale 2 in compara ție cu lotul trat at cu v ehicul , semnifica ția statistic ă
intre loturi fiind p<0,05. Loturile tratate cu BS1 respectiv BS2 au prezentat o
tendin ță descresc atoare compara tiv cu lotul tratat cu vehicul, dar fără
difere nțe semnificative statistic intre loturi ( p>0,05 ).
La 7 zil e, atat lotul care a primit vehicul cat si celelalte loturi ce au
primit BS1, BS2 respectiv Dermazin , au prezentat valori aproape egale ale
metaloproteinaz ei matriceale 9 . Astfel s-a demonstrat c ă nu există diferente

45
semnificativ e statistic intre loturi du pa 7 zile (p>0,05) . La 14 zile, at ât lotul
care a primit BS2 c ât si lotul care a primit Dermazin au prezentat nivele
scăzute ale metaloproteinazei matriceale 9 in compara ție cu lotul vehicu l
(p<0,05 ). La fel si lotul tratat cu BS1 prezint ă o tendin ță la sc adere in
compara ție cu lotul vehicul, dar nesemnificativ statistic avand un p>0,05 .

Nivelul TIMP

TIMP 1 7 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin02004006008001000
*pg/mg protein
TIMP1 14 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin0200400600800pg/mg protein

La 7 zile, lotul tratat cu Dermazin a prezentat un nivel sc ăzut al TIMP
1 in compara ție cu lotul tratat cu vehicul (p<0,05 ). La 14 zile, at ât lotul care a
primit BS1 cât si lotul tratat cu BS2 prezint ă valori crescute ale TIMP 1 însă
nesemnificativ statistic, diferen țele intre loturi fiind nes emni ficative statistic
(p>0,05 ).

46

Nivelul o xidului nitric

Oxid nitric 7 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin050100150
******
***nmoli/mg P
Oxid nitric 14 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin0102030nmoli/mg P
La 7 zile, at ât lotul care a primit BS , cât si lotul care a primit BS2
respectiv lotul care a primit Dermazin prezint ă niveluri cre scute ale oxidului
nitric in compara ție cu lotul tratat cu vehicul (p<0,05 ). Dac ă compar ăm lotul
tratat cu BS1 si cel tratat cu BS2, g ăsim niveluri crescute semnificativ statistic
(p<0,05) ale oxidului nitric la nivelul lotului tratat cu BS2. O alt ă compa rație
se poate face intre nivelul oxidului nitric la lotul tratat cu BS2 si cel tratat cu
Dermazin put ându-se observa c oncentra ții crescute semnificativ e statistic
dupa administrarea de BS2. Acest lucru indic ă o cre ștere a oxidului nitric la
nivelul lotulu i tratat cu BS2 fa ța de celelalte loturi (p<0,05) .
La 14 zile, se observ ă o tendin ță de cre ștere a oxidului nitric la nivelul
loturilor tratate cu BS1, BS2 si Dermazin însă fără diferente semnificativ e
statistic intre loturi (p>0,05).

47
Activitatea SOD
SOD 7 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin020406080inh%/mg P
SOD 14 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin0204060inh%/mg P

La 7 zile, at ât lotul care a primit vehicul cât si loturi le care au primit
BS1, BS2 , respectiv Dermazin , prezint ă valori aproape egale ale SOD .
Diferen țele între loturi au fost nesemnificative statisti c (p>0,05) . Activitatea
SOD evaluat ă la 14 zile a fost nemodificat ă intre loturi (p>0,05) , ceea ce
sugereaz ă că desi a existat o tendin ță cresc ătoare la BS1 nu au fost diferen țe
semnificative statistic intre loturi (p>0,05).

Analiza h istopatologi că

Anali za h istopatologic ă a evaluat următorii parametrii: grosime a
epidermului, numărul de vase, grosimea țesutului de granulație, preze nța
colagenului normal și gradul de fibroză. Toate acestea s -au analizat la 7 și
respectiv la 14 zile.

48

FIGUR A 9.LOT 1 LA 7 ZILE TRATAT CU UNGUENT FIGUR A 10.LOT 1 LA 7 ZILE TRATAT CU
UNGUEN

FIGUR A 11.LOTUL 2 LA 7 ZILE TRATAT CU BS1 FIGUR A 12.LOTUL 2 LA 14 ZILE TRATAT CU BS1

FIGUR A 13.LOTUL 3 LA 7 ZILE TRATAT CU BS3 FIGUR A 14.LOTU L 3 LA 14 ZILE TRATAT CU BS3

49

FIGUR A 15.LOTU L 4 LA 7 ZILE TRATAT CU DERM AZIN FIGUR A 16.LOT 4 LA 14 ZILE CU DERMAZIN
După 7 zile, la nivelul primului lot , se observ ă la nivelul țesutului
recoltat o medie a ulcera ției epidermului de 42,4% iar congestia este
moderat ă spre minim ă. Alte modific ări inta lnite la 2 dintre țesuturile recoltate
au fost abcedarea si paracheratoz a. Dupa 14 zile, la primul lot s -a observat
in țesutul recoltat o medie a ulcera ției epidermului de 5% cu o c ongesti e
moderat ă spre usoar ă. Alte modificari intalnite la unul dintre țesuturile
recoltate au fost hemoragia si paracheratoza.
După 7 zile, la al doilea lot s -a observat o medie a ulcera ției
epidermului de 60% cu o congestie marcat ă spre moderat ă. Alte modificari
intalnite la 4 dintre țesuturile recoltate au fost abcedarea si d oar un țesut a
prezent at si abcedare si pa racheratoz ă. Dupa 14 zile se obser vă o medie a
ulcera ției epidermului de 4% iar congestia la nivelul lotului tratat cu BS1 a fost
usoar ă, doar un țesut a preze ntat o congestie moderat ă. Alte modific ări
întâlnite la unul dintre țesuturile recoltate au fost paracheratoza .
Dupa 7 zile, la nivelul lotului al treilea s-a observat o medie a ulcera ției
epidermului de 92 % cu o congestive ușoară spre abundentă . Alte modi ficări
întâlnite la toate cele 5 dintre țesuturile reco ltate au fost abcedarea iar unul
dintre țesuturi a prezint at abcedare si paracheratoz ă. Dupa 14 zile s -a
observ at o medie a ulcera ției epidermului de 20% . Congestia la nivelul lotului

50
tratat cu BS2 dup ă 14 zile a fost minim ă spre absent ă la majoritatea plagilor
studiate . Nu s-au găsit alte modific ări la nivelul țesuturilor prelevate.
Dupa 7 zile, la lotul 4 s-a observ at o medie a ulcera ției epidermului de
36%. Congestia la nivelul lotului tratat cu Derma zin dupa 7 zile a fost marcat ă
spre u șoară si s-a obse rvat apari ția unei abcedari. Dupa 14 zile s -a observ at
o medi e a ulcera ției epidermului de 7 % cu o conges tie ușoară si abcedare .

Grosimea epidermului 7 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin0.00.51.01.52.0mm
Grosimea epidermului 14 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin0.00.51.01.5 ***mm

Grosimea epiderm ului determinat ă la 7 zile a fost neschim bată pentru
toate loturile (p>0,05) , demonstr ându-se astfel c ă nu au existat diferen țe
semnificativ e statistic intre loturi. Totu și se observ ă o tendin ță de cre ștere a
epiteliz ării la lotul tratat cu Dermazin în com parație cu lotul tratat cu v ehicul
însă nesemnificativ a statistic (p>0,05). La 14 zile, lotul tratat cu Dermazin a
prezentat nivele crescute ale epiteliz ării comparativ cu celelalte loturi ,
diferen țele între loturi fiind înalt semnificative statistic.

51

numar vase 7 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin0102030nr/mm2
numar vase 14 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin0102030nr/mm2
Numarul de vase determinat la 7 zile nu s -a modificat semnificativ
între loturi (p>0,05) în timp ce la 14 zile, s-a observat o tendin ță de cre ștere
a vasculariza ției la lotul tratat cu BS1 în compara ție cu celelalte loturi, însă
nesemnificativ a statistic (p >0,05).

tesut granulatie 7 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin020406080%
tesut granulatie 14 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin020406080%

Țesutul de granula ție evaluat la 7 zile nu a variat intre loturi diferentele
fiind nesemnificative statistic (p>0,05) . Totuși se poate observ a o tendin ță de
creștere a țesutului de granula ție la lotul tratat cu BS1 în compara ție cu lotul
tratat cu vehicul însă nesemnificativ statistic (p>0,05). La 14 zile s-a observat
o tendin ță de cre ștere a țesutului de granula ție la lotul tratat c u BS 2 în
compara ție cu lotul tratat cu v ehicul însă diferenta a fost nesemnificativ a
statistic (p>0,05).

52

Colagen normal 7 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin020406080
*%
Colagen normal 14 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin020406080
*%
La 7 si 14 zile lotul tratat cu BS2 a pr ezentat nivele crescute ale
colagenului normal în com parație cu lotul trat at cu BS1, diferen ța între loturi
fiind se mnificativ ă statistic (p <0,05 ).
Fibroza 7 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin01020304050%
Fibroza 14 zile
Veh BS1 BS2
Dermazin020406080%

Fibroz a evaluat ă la 7 si la 14 zile nu a variat intre loturi (p>0,05)
diferentele fiind nesemnificative st atistic. Totuși se poate observ a o tendință
de creștere a fib rozei la 7 zile la lotul tratat cu BS1 în comparație cu celelalte
loturi si o tendin ță de cre ștere a fibrozei la 14 zile la lotul tratat cu BS2 însă
nesemnificativ ă statistic (p>0,05).

53
Discu ții

Pentru a evalua modificările induse de biosticle aplicate asupra
țesutului cutanat s-a investigat procesul de bio degradare al acestor material
in mediu fiziologic, evaluarea facandu -se prin masurarea pH -ului,
potențialul ui zeta și prin aprecierea cedari i ionilor de calciu. De asemenea , s-
au investigat parametrii de stres oxidativ, nivelul metaloproteazelor matriciale
și a inhibitorului acestora TIMP1 și s-a efectuat analiza histopatologic ă
urmarindu -se vascularizația, infiltratul celular, gradul de fibro ză, distribuirea
colagenului și grosimea țesutului de granula ție.
Biosticlele imersate în lichide biologice suferă un proces de
biodegradare ce se manifestă printr -un schimb ionic cu mediul și formarea
unui strat de hidroxiapatită (HA) [Ca 11(PO 4)6(OH) 2]. Acest schimb ionic ar
putea fi benefic pentru repararea țesutu rilor moi prin activarea și inducere a
exprimării unor factori care întervin în cicatrizare. Celulele implicate în
cicatrizarea rănilor ar putea fi stimulate de acești factori să prolifereze, să
crească și să se adune în jurul stratului de hidroxiapatita , ceea ce ar conduce
la formarea de țes ut nou. De asemenea, HA ar putea îmbunătăți și potențialul
antimicrobian al procesului de vindecare.22
Schimbul ionic ce are loc în urma imersării BS în lichidele biologice
determină modificarea pH -ului și a potențialului zeta. Schimbarea pH -ului în
timpul imersiei probelor de BS în PBS este un parametru care exprimă
degradarea acestor materiale. De asemenea, evalu area potențialului zeta,
parametru dependent de schimbul de i oni între BS și mediu, indică extind erea
transformării acestora.
Explicația acestei evoluții a potentialului zeta poate fi pusă pe seama
schimbului ionic, formării HA și reducerea concentrației i onilor liberi.22
Atât pH -ul, cât și potențialul z eta s -au măsurat la diferite intervale de
timp până la 14 zile, direct în probele conținând particulele de BS. 22

54

Ținând cont de compoziția ace stor BS, este posibil ca dif erențele
înregistrate să se datoreze prezenței oxidului de vanadiu. Comparând BS 2
cu BS 3, am putea concluziona că un conținut mai ridicat în oxid de vanadiu
determină o biodegradare mai rapidă a BS .
Comparativ cu alte s tudii, s -au înregistrat valori m ai mici ale pH -ului.
În cazul unei sticle borice, sub formă de vată, s -a ajuns pâna la valori de 9,25,
iar pentru o sticlă silicică pâna la 8,65.22 Această diferență ar putea f i explicată
de lipsa ionilor de sod iu din BS studiate, sodiu care cedat în mediu poate
determina o creștere importantă a pH -ului.
Cele trei BS studiate având în compoziție ioni de Ca2+, am considerat
pe lângă măsurarea pH -ului și a potențialului Zeta ca m etoda pentru
evaluarea biodegradări i masurarea cedar ii ionilor de Ca2+.
Pe baza datelor din literatur ă 22 cedarea rapidă de la început este
atribuită degradării particulelor de BS și atingerii rapide a stării de saturație,
pentru ca apoi, în p rezența ionilor fosfat din PBS, să aibă loc formarea HA și
consumarea ionilor de calciu , ceea ce determină scăderea concentrației
acestora. Datorită solubilității fixe a HA, concentrația de satur ație a ionilor de
Ca2+ crește determinând, la final, o ușoară creștere a concentrației ionilor de
Ca2+.
Malondialdehida este cel mai folosi t indicator pentru estima rea
efectele stresului oxidativ asupra peroxid ării lipidelor. În urma unei leziuni
celulare are loc peroxidarea lipidelor cu oxidarea acizilor grași poli nesatura ți
rezultând formarea a noi sp ecii reactive și produși toxici . L. Milko vic si
colaboratorii au susținut in studiul lor faptul c ă peroxidarea lipidic ă poate fi
implicată în creșterea osteo blastelor umane pe BG. Cuprul (Cu), cofactor
esențial al mai multor enzime, precum și agent proangiogen și antimicrobian,
este cunoscut că i nduce peroxidarea lipidelor. Prin urmare, îmbogățirea BG
cu Cu are efecte benefice asupra creșterii celulelor osoas e.23

55
Rezultatele studiului nostru au arătat că aplicarea biostic lelor la nivelul
țesutului cutanat determin ă modificări ale balanței oxidanți -antioxidanți, prin
scăderea nivelelor de MDA la loturile tratate cu BS1, BS2 si Dermazin si prin
cresterea oxidului n itric post aplicare. Stresul oxidativ a fost mai intens la 7
zile, comparativ cu rezultatele obținute la 14 zile. Administrarea bi osticlelor a
redus stresul oxidativ asigurând o protecție antioxidantă eficientă.
Un parametru al remodelarii matricei etxrac elulare investigat in acest
studiu a fost aprecierea niveluri lor metaloproteinaz elor matriceal e 2 si 9 .
Metaloproteinazele matrici ale (MMP) sunt endopeptidaze identificate în
1962, formate dintr -un singur polipeptid. Ele pot degrada majoritatea
componentel or m atricei extracelulare, având roluri importante în timpul
dezvoltării și a procesului de apoptoz ă. Sunt proteinaze difuzibile c apabile să
distrugă colagenul fibrillar. MMP mediază funcții importante în timpul
remodelării fiziologice normale sau al dezvo ltării tisulare și în procesul de
apoptoz ă. MMP sunt foarte e ficiente în degradarea gelatinei, ce aparține
tipului IV de colagen .24 Din marea familie a metaloproteinaz elor matriceale,
in studiul nostrum am evaluat nivelurile MMP -2 și -9. Prezența lor are ca și
consecință o reacție inflamatorie cronică cu efect distructiv asupra țesutului .
Secvența evenimentelor care inițiază reepitelizarea și controlul
ulterior al proce sului este mediată de metaloproteinazele matriceale (MMP).
La tratamentul rănilor cu argint nanocristalin, nivelurile de inflamație au fost
reduse; acest lucru se datorează efectului scăderii MMP. Aceasta a redus
ulterior numărul citokinelor inflamatorii p rezente în plăgi, a determinat
apoptoza indusă de neutrofile și astfel a scăzut nivelul TGF -β .25
S. Jun si colaboratorii , în studiul lor au demonstr at dezactivarea MMP prin
intermediul ionilor (Cu2+) elibera ți dintr -o nano -bioglas dopată cu Cu2+
încorporată într -un sistem a deziv. Mai mult, acest studiu a demonstrat c ă
prezența CuBGn este direct proportional ă cu inhibarea MMP s.26
Rezultatele studiului nostru au aratat niveluri sc ăzute ale MMP -2 la 7 zile
datorate aplic ării de Dermazin. La 14 zile post aplicare , BS2 si Dermazin au

56
scăzut nivelul MMP -9 ceea ce demonstreaz ă prezența unei reac ții inflamatorii
mai scăzute cu un efect mai pu țin distructiv asupra țesutului fa ță de lotul
martor.
Liu și colab. au folosit un model chirurgical pentru a investiga efectul argintu lui
asupra vindecării rănilor evitând astfel efectele secunda re ale arsurilor sau
infectiilor . Rănile tratate cu argint au fost închise semnificativ mai rapid în
comparație cu rănile de control. Acest timp redus până la închiderea plăgilor
sugerează că pre zența argintului sporește procesul de reepitelizare prin
inducerea migrării și proliferării kera tinocitelor. Acest lucru a fost observat
alături de o reducere a formării țesutului cicatriceal hipertrofic și cheloid,
sugerând că AGNP -urile reduc formarea fi broblastelor sau sporesc
diferențierea fibroblastelor în miof ibroblaste .2
In studiul realizat de K.Dashnyam si colaboratorii s-a arătat faptul c ă
eliberarea unor nivele adecvate de ioni silicat , poate imita condițiile hipoxice
și stimul eaza angiogeneză prin creșterea expresiei factorilor proangiogenici,
cum sunt VEGF, FGF și receptorii celulelor endoteliale, care, la rândul lor,
reglează angiogeneza, inclusiv stimul ează formarea NO.27 În studiul nostru,
prin aplica rea de biosticle con ținând ioni de silica, se observ ă o creștere
important ă a oxidului nitric la 7 zile post aplicare de BS1, BS2 si Dermazin.
Astfel se poate concluziona ca ace ști compu și reduc st resul oxidativ si
asigur ă o protecție antioxidantă eficient ă.
Datele obținute de Lin si colaboratorii au arătat că toate compozițiile
studiate pot accelera vindecarea rănilor prin îmbunătă tirea proliferării
fibroblastelor și prin crește rea țesutului de granula ție și inducerii
angiogenezei.16
Day și colaborator ii au arătat r olul stimulator al angiogenezei
biosticlei 45S5 . S-a observat că 45S5 Bioglass® stimulează secreția
factorilor de cre ștere fibroblastici ce induc o creșter e semnificativă a
angiogen ezei.3 Celul ele endoteliale cutanate uma ne cultivate în mediu

57
colectat din c ulturi de fibroblaste au prezentat o proliferare crescută și au
format structuri tubulare sugerând că celulele endoteliale răspund direct la
factorii de creștere secretați din fibroblaste .5
Sulfadiazina argentic ă (SSD) numit ă si Dermazin este un agent
antibacterian eficient aprobat de US FDA, care este considerat tra tame nt
standard de aur în plagile produse prin arsură. Ea a fost sintetizată de Charles
Fox, în anii 1960 .28 In stud iul realizat de Lee AR , Moon H K s-a urmărit efectul
sulfadiazinei argentice (SSD) asupra proli ferării fibroblastelor dermice umane
(HDF) pentru a determina impactul medicamentului asupra procesului de
vindecare al plagilor și asupra rezistenței mecanice dermice. Prezența
celule lor inf lama torii și gradul de reepitelizare au fost investigate direct în
plagă. SSD a fost puternic citotoxic pe celulele HDF cultivate. Aplicarea
topică a SSD poate controla infecția, așa cum reiese din lipsa de acumulare
a celulelor inflamatorii în eva luarea histologică.29 Rezultatele studiului nostru
au ar ătat că aplicarea topica de Dermazin la nivelul pl ăgii a determin at o
creștere semnificativ ă a epiteliz ării.

58
Concluzii

1. Punând alătur i rezultatele obținute, se poate concluziona că cele trei
BS în prezența PBS suferă un proces de degradare rapid, ce se
manifestă prin cedarea ionilor de Ca2+, crește rea pH -ului și a
potenția lului zeta. Indirect, prin scăderea ionilor de Ca2+, s-a
demonstr at formarea HA.
2. Dintre cele trei BS studiate, BS 2 și 3 se degradează mai repede, în
special BS 3, caracteristică ce poate fi legată de prezența oxidului de
vanadiu într -o proporție mai mare .
3. BS1 și BS2 a scăzut nivelul peroxid ării lipidice (MDA) la 14 z ile la nivel
comp arabil cu Dermazinul .
4. În paralel cu sc ăderea nivelului de MDA, crește nivelul de NO, în
special la nivelul lotului tratat cu BS1.
5. Nivelul MMP2 a scăzut la 14 zile după aplicarea de Dermazin
suger ând efectul superior al biosticlei studiate in epitelizarea
cutanată.
6. Tratamentul cu D ermazin crește semnificativ grosimea epidermului în
timp ce BS2 intensific ă producția de colagen in plag ă.
7. Biosticlele înglobate în unguent reduc stresu l oxidativ și cresc
formarea locală de oxid nitric cu efect vasodilatator în paralel cu
creșterea formării de colagen.
8. Utilizarea lor în practică clinica poate fi o opțiune terapeutică ce merită
luată în considerare .

59
Perspective viitoare

O mul titudine de inv estigații privind biosticlele pe baza modelului 45S5
s-au efectuat în ultimii 40 de ani. În studiile recente au fost explorate
biosticlele pe bază de borat și borosilicat cu aplicabilitate în ingineria tisulară
unde se demonstrează efectul l or proangiogen. Biosticlele sunt destul de
fragile în natur ă și prezintă capacitate de degradare controlată
transform ându-se într -un material asemănător cu hidroxiapatita, ceea ce le
ajuta să se îmbine perfect cu țesuturile tari și moi.5
Cercetările viitoare se axează pe găsirea de noi mecanisme pentru a
limita fragilitatea biosticleleor prin îmbunătățirea parametrilor de proiectare și
prelucrar e cu posibilitatea obțin erii unor benef icii maxime. O problemă a
biosticlelor a fost întotdeauna limit ele in ceea ce priveste proprietățile lor
mecanice. Din acest motiv materialele hibride organo -anorganice care
prezintă comportame nt bioactiv sunt explora te în încercare a de a de păși
acest deza vantaj.5
Viitorul poate fi găsit și în folosirea de proteine recombinante umane,
dar est e nevoie de multă cercet are pentru a crește randamentul acestora.5

Mulțumiri
Această lucra re a fost susținută de Disciplina de Fiziologie, Laboratorul de
Stres Oxidativ si Biobaza disciplinei, Universitatea de Medicină și Farmacie
Iuliu Hațieganu Cluj-Napoca, Departamentul de Stiințe Morfologice,
Universitatea de Medicină și Farmacie "Iuliu Haț ieganu" Cluj Napoca și
Catedra de Tehnologie Farm aceutica a Facu ltatii de Farmacie, UMG Iuliu
Hatieganu Cluj Napoca si Catedra de Biofizica a USAMV Cluj Napoca.

60
Referințe
1. Hench, L. L. The story of Bioglass ®. J. Mater. Sci. Mater. Med. 17, 967–978 (2006).
2. Bramhill, J ., Ross, S. & Ross, G. Bioactive Nanocomposites for Tissue Repair and
Regeneration  : A Review. (2017). doi:10.3390/ijerph14010066
3. Erol, M. & Boccaccini, A. R. Bioactive Glasses . Bioactive G lasses (2011).
doi:10.1533/978085 7093318.2.129
4. Clare, A. G. T he Unique Nature of Glass. 1 –12 (2009).
5. Alexis G. Clare. Bio-Glasses .
6. Baino, F., Hamzehlou, S. & Kargozar, S. Bioactive glasses: Where are we and where
are we going? J. Funct. Biomater. 9, (2018).
7. Heimo O. Ylanen. Bioactive glasses . (20 11).
8. Baroni, A. et al. Structure and function of the epidermis related to barrier
properties. Clin. Dermatol. 30, 257 –262 (2012).
9. Ishii, K. et al. Functional tight junction barrier localizes in the second layer of the
stratum gran ulosum of human epid ermis. J. Dermatol. Sci. 71, 89–99 (2013).
10. Li, J., Zhen, G., Tsai, S. & Jia, X. Epidermal Stem Cells in Orthopaedic Regenerative
Medicine. 11626 –11642 (2013). doi:10.3390/ijms140611626
11. Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repa ir in humans and oth er mammals. J. Cell
Commun. Signal. 10, 103 –120 (2016).
12. Yu, H., Peng, J., Xu, Y., Chang, J. & Li, H. Bioglass Activated Skin Tissue Engineering
Constructs for Wound Healing. ACS Appl. Mater. Interfac es 8, 703 –715 (2016).
13. Xie, W. , Chen, X., Miao, G. , Tang, J. & Fu, X. Regulation of cellular behaviors of
fibroblasts related to wound healing by sol –gel derived bioactive glass particles. J.
Biomed. Mater. Res. – Part A 104, 2420 –2429 (2016).
14. Kargo zar, S., Hamzehlou, S. & Baino, F . Can bioactive glas ses be usef ul to accelerate
the healing of epithelial tissues? Materials Science & Engineering C (Elsevier B.V,
2019). doi:10.1016/j.msec.2019.01.028
15. Sm, M. et al. Chemical Stability of Bioglass in S imulated Oral Environment. 3, 261 –
268 (2016).
16. Lin, C., Mao, C., Zhang, J. & Li, Y. Healing effect of bioactive glass ointment on full –
thickness skin wounds. 045017 , (2012).
17. Hu, S., Chang, J., Liu, M. & Ning, C. Study on antibacterial effect of 45S5 Bioglass ®.
J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 281 –286 (2 009).
18. Gu, W. et al. Systematic investigation of a new nanoscale bioactive glass on wound
healing in vivo in comparison with the clinically applied 45S5 Bioglass @. 1 –8
(2018). doi:10.31487/j.RGM.2018 .10.001
19. Hammond, J. B. & Krug er, N. J. The bradfo rd method f or protein quantitation.
Methods Mol. Biol. 3, 25–32 (1988).

61
20. Titheradge, M. A. The Enzymatic Measurement of Nitrate and Nitrite. 100, 83–91
21. Gels, A. & Applicable, A. Irwin fridovich. 287, 276 –287 (1971).
22. Zhou, J. et al. In vivo and i n vitro stu dies of borate based glass micro -fibers for
dermal repairing. Mater. Sci. Eng. C 60, 437 –445 (2016).
23. Milkovic, L., Hoppe, A., Detsch, R., Boccaccini, A. R. & Zarkovic, N. Effects of Cu –
doped 45S5 bioactive glass on the li pid peroxidation -associated gro wth of human
osteoblast -like cells in vitro. 3556 –3561 (2013). doi:10.1002/jbm.a.35032
24. Popa, U. M. F. G. T., M ârtu, S. & Cotrutz, C. METALOPROTEINAZELE MATRICIALE SI
BOALA PARODONTALA / MA TRIX METALLOPROTEINASES AND. 9, 13–18 (2005).
25. Widgerow, A. D . Nanocrystalline silver , gelatinases and the clinical implications.
Burns 36, 965 –974 (2010).
26. Jun, S. et al. releasing therapeutic ions for MMP – deactivation and remineralization.
Sci. R ep. 1–10 (2018). doi:10.1038/s415 98-018-23939 -6
27. Dashnyam, K. et al. A mini review focused on the proangiogenic role of silicate ions
released from silicon -containing biomateria ls. (2017).
doi:10.1177/2041731417707339
28. Razavi, S., Partoazar, A., Takz aree, N. & Fasihi -ramandi, M. Sil ver sulfadiazine
nanoethogel fo r burn healing  : characterization and investigation of its in vivo
effects. 13, 1319 –1331 (2018).
29. Lee, A. C. & M oon, H. K. Effect of Topically Applied Silver Sulfadiazine on Fibroblast
Cell Proliferation and Biomechanical Properties of the Wound. 26, 855–860 (2003).

62

[1] S. H. S. K. Francesco Baino, “bioactive glasses: where are we and where are we
going,” p. 2, 19 march 2018.
[2] L. L. Hench, “the story of bioglass ,” p. 1, 10 february 2006.
[3] S. B. D.Durgalakshmi, “Analys of solvent induced porous PMMA -Bioglass monoliths
by the phase separation method -mechanical and in vitro biocompatible studies,” p.
2, 5 november 2014.
[4] j. m. n. charlotte Vichery, “Bio active glass Nanopatricles from s ynthesis to materials
design fo r biomedical applications,” p. 2, 14 april 2016.
[5] e. rezabeigi, “synthesis of 45S5 bioglass via straightforward organic, nitrate free sol
gel proces,” p. 1, 26 march 2014.
[6] H. A. V .-V. VALIMAKI, “molecular basis f or action of bioactive glasses as bone graft
substitute,” 2006.
[7] r. cosgarea.
[8] m. betiu, dermatovenerologie, chisinau : pag 6, 2013.
[9] r. cosgarea, compendiu de dermatovenerologie clinica.
[10] J. C. Lui z Carlos JUNQUEIRA, Histologie tr atat& atlas.
[11] P. anthony L.Mescher, junqueira Histologie.
[12] a. s. m. c. m. m. c. m. b. b. a. -m. c. carmen mihu, histologie.
[13] s. chha bra, “wound healing concepts in clinical practice of OMFS,” 2016.
[14] o. s. irena pastar, “epitheliz ation in wound healing A compre hensive review,” 2013.
[15] l. rittie, “cellular mechanism of skin repair in humans and other mammals,” 2016.
[16] p. m. sabine a. eming, “wound repair and regeneration mechanism, signal ing and
translation,” 2015.
[17] A. M. D. E. Leucuta SE, prep ararea medicamentelor.
[18] I. T. a. L. L. Hench, “Mechanical properties of bioactive glasses, glass -ceramics and
composites,” 01 FEBRUARY 1998.

63