Rezumatul tezei de doctorat [625496]

Universitatea Babe s-Bolyai
Facultatea de Fizica

Rezumatul tezei de doctorat
NANOPARTICULE HIBRID E FOTOACTIVABILE PEN TRU
AMPLIFICAREA TERAPIE I FOTODI NAMICE SI IMAGISTICA
CELULARA MU LTIMODALA

Timea SIMON

Coordonator stiintific
Prof. Dr. Simion AȘTILEA N

CLUJ -NAPOCA
2013

CUPRINS

Prezentare generala ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 1

Partea I: Introducere si documentare bibliografica ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 2
1. Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………….. 2
2. Documentare bibliografica ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 2
2.1. Metode de diagnostic si tratament b azate pe nanoparticule ………………………….. ………………………….. ……. 2
2.1.1. Terapia fotodinamica a cancerului (PDT) ………………………….. ………………………….. ………………………. 2
2.2. Nanoparticule de aur in medicina si nanomedicina ………………………….. ………………………….. ………………. 4
2.2.1. Proprietile optice ale nanoparticulelor de aur ………………………….. ………………………….. …………………. 4
2.2.2. Microscopia in camp intunecat pe baza de nanoparticule de aur p entru imagistica celulara …………… 4
2.2.3. Raspunsul optic si activitatea fotodinamica a moleculelor in prezenta nanoparticulelor plasmonice .. 5
2.3. Nanoparticule hibride pentru aplicatii biomedicale ………………………….. ………………………….. ………………. 6
2.3.1. Nanoparticule hibride aur -polymer ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 6

Partea II: Rezultat e si discutii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 7
3. Nanoparticule aur -Pluronic: sinteza, caracterizare si evaluare biologica ………………………….. ………………… 7
3.1. Prepararea si caracterizarea nanoparticulelor aur -Pluronic ………………………….. ………………………….. …. 7
3.1.1. Prepararea nanoparticulelor aur -Pluronic ………………………….. ………………………….. ………………………. 7
3.1.2. Caracterizarea spectroscopica si morfol ogica ………………………….. ………………………….. …………………. 7
3.1.3. Stabilitatea nanoparticulelor aur -Pluronic ………………………….. ………………………….. ……………………… 8
3.2. Evaluarea biologica a nanoparticulelor aur -Pluronic ………………………….. ………………………….. …………… 8
3.2.1. Citotoxicitatea nanoparticulelor aur -Pluronic ………………………….. ………………………….. …………………. 8
3.2.2. Imagistica in camp intunecat a celulelor cancerigene ………………………….. ………………………….. ………. 9
4. Nanoparticule hibride Pluronic -aur incarcate cu albastru de metilen pentru imagistica celulara si
terapia celulelor cancerigene ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 10
4.1. Preparare a si caracterizarea nanoparticulelor de aur -Pluronic incarcate cu MB ………………………….. 10
4.1.1. Prepararea si caracterizarea Au -PF127 ………………………….. ………………………….. ………………………… 10
4.1.2. Prepararea si caracterizarea Au -F127 -MB ………………………….. ………………………….. ……………………. 11
4.2. Studii legate de robustetea si activitatea nanoparticulelor Au -PF127 -MB cu privire la aplicatiile
biomedicale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 12
4.2.1. Investigatii spectroscopice ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 12
4.2.2. Studiul activitatii fotodinamice a Au -PF127 -MB ………………………….. ………………………….. ………….. 14
4.3. Utilizarea Au-PF127 -MB in imagistica celulara si terapia fotodinamica a celulelor ……………………….. 15
4.3.1. Studiul internalizarii nanoparticulelor Au -PF127 -MB in celule prin microscopia in camp intuneca t15
4.3.2. Terapia fotodinamica a celulelor cancerigene marcate cu Au -PF127 -MB si activate cu LED ………. 16
5. Imagistica multimodala a celulelor vii utilizand nanoagregate fotoactivabile ………………………….. ………… 18
5.1. Prepararea probelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 18
5.1.1. Preparea agregatelor de nanoparticul e de aur ………………………….. ………………………….. ……………….. 18
5.1.2. Conjugarea agregatelor cu albastru de metilen ………………………….. ………………………….. ……………… 18
5.2. Caracterizarea nanoagregatelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 18
5.2.1. Caracterizarea morfologica si optica ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 18
5.3. Caracterizarea nanoconjugatelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 19
5.3.1. Caracterizarea UV -Vis ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 19
5.3.2. Masuratori de fluorescenta rezolvata temporal ………………………….. ………………………….. ……………… 20
5.3.3. Stabilitatea in diferite condit ii de mediu ………………………….. ………………………….. ………………………. 20
5.4. Detectia spectroscopica multimodala in celule vii ………………………….. ………………………….. ……………….. 20
5.4.1. Evaluarea internalizarii nanoparticulelor prin m icroscopie in camp luminos ………………………….. …. 20
5.4.2. Masuratori SERS intracelulare ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 20
5.4.3. Imagistica de fluorescenta rezolvata temporal a cel ulelor incubate GNPA -MB………………………….. 21
6. Concluzii finale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 22
Referinte ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 23
Lista lucrarilor publicate ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 25

1
PREZENT ARE GENERALA

Teza este structurata in doua parti majore continand in total 6 capitole. Partea I, intitulata
Introduc ere si Documentare Bibliografica , este compusa din doua capitole . Capitolul 1 prezinta
o scurta introducere in domeniul de cercetare si motivatia subiectului tezei. Capitolul 2 contine
o prezentare generala a aplicarii nanotehnologiei in sectorul medical, un domeniu in dezvoltare
continua, numit nanomedicina .
Partea II, intitulata Rezultate si discutii , prezinta de-a lungul a trei capitole rezultatele
experimentale obtinute in timpul cercetarii doctorale la Centrul de Nanobiofotonica din cadrul
Institutului de Cercetari Interdisciplinare in Bio -Nano -Stiinte al Universita tii Babes -Bolyai , in
colaborare cu Laboratoire interdisciplinaire de Physique from Joseph Fourier University,
Grenoble.
Capitolul 3 prezinta prepararea si carac terizarea nanoparticulelor de tip “core -shell”
Pluronic -aur, urmata de evaluarea aplicabilitatii biologice a acestora. Se evidentiaza importanta
etapelor de purificare in timpul procesului de prepa rare prin investigarea citotoxicitatii
nanoparticulelor. Mai mult , se arata ca nanoparticulele Pluronic -aur pot servi ca si agenti de
contrast in imagistic a celule lor cancerigene prin microscopia in camp intunecat.
Prima parte a Capitolului 4 prezinta fabricarea si caracterizarea unei no i clase de
nanoparticule hibride, in timp ce a doua parte investigheaza aplicabilitatea acestora in imagistica
si terapia c elule lor cancerigene. Nanoparticulel e hibride Pluronic -aur au fost preparat e intr-un
singur pas folosind polimerul Pluronic ca si agent reducator si stabiliza tor, dupa care
nanoparticulele au fost incarcate cu fotosensibilizatorul albastru de metilen (MB). Deoarece
performanta terapeutica a MB poate fi afectata semnificativ in diferite conditii de mediu , o atentie
speciala este dedicata investigarii proprietatilor acestuia dupa incarcare a pe nanoparticule. In
continuare, se evalu eaza internalizarea nanopart iculelor hibride in celule le cancerigene HTB
utilizand -se microspectropia de im prastiere in camp intunecat. Ulterior, se demonstr eaza eficienta
nanoparticulelor hibride in terapia fotodinamica a celule lor canc erigen e utilizand o dioda
emitatoare de lumina (LED ) pentru activare a fotosensibilizatorului incapsulat.
In Capitolul 5 este prezentata prepararea unor agenti pentru imagistica multimodala
bazati pe agregate mici de nanoparticule de aur invelite in Pluronic si conjugate cu MB . Metoda
formarii agregatel or se bazeaza pe destabiliz area sarcinii de pe suprafata nanoparticulelor
acoperite cu citrat de sodiu, urmata de stabilizarea imediata cu polimerul Pluronic, care mediaza
de asemenea conjuagarea nanoparticulelor cu MB. In continuare , se investigheaza posibilitatea
utilizarii cu succes a nanoconjug atelor obtinute in imagistica multimo dala a celulelor
cancerigene. In primul rand, s e demonstr eaza capacitatea nanoparticulelor de a fi utilizate ca
nano -reporteri in spectroscopia SERRS intr acelulara. Pe de alta parte, se arat a aplicabilitatea
acetora in imagistica de fluorescenta rezolvata temporal (FLIM) a celulelor cancerigene.
Concluziile finale si perspectivele studiilor sunt prezentate in Capitolul 6.

Cuvinte cheie : nanoparticule de aur, Pluronic, albastr u de metilen, imagistica in camp intunecat,
terapie fotodinamica, SERS, FLIM

2
PARTEA I : INTRODUCERE SI DOCUME NTARE BIBLIOGRAFICA

1. Introducere

Nanomedicina a aparut ca urmare a aplicarii nanotehnologiei in medicina, fiind axata pe
exploatarea materiale lor de dimensiuni nanometrice cu scopul de a dezvolta materiale si metode
noi pentru diagnostic si terapie [1].
Obiectivul principal al acestei teze este de a obtine nanoparticule hibride polimer -aur,
stabile si biocompatibile , capabile sa transporte medi camente fotosensibilizatoare. Strategia
abordata in aceasta teza, respectiv combina rea fotosensibilizatorul albastru de metilen cu
nanoparticulele hi bride Pluronic aur reprezinta o dezvoltare valoroasa in domeniul
nanomaterialelor multifunctionale. V ersati litatea acestor nanoparticule consta in capacitatea
detectiei si imagisticii spe ctroscopice multimodale combinata cu eficacitatea terapeutica ridicata
impotriva celulelor cancerigene.

2. Documentare bibliografica

2.1. Metode de diagnostic si tratament bazate pe nanoparticule
Dezvoltand nanoparticule tintite, fabricate cu inalta precizie, nanotehnolo gia isi propune
revolutionarea tratamentul cancerului, oferind strategii promitatoare pentru transportul selectiv si
tintit, in concentratii ridicate al diferitilo r agenti citotoxi ci sau markeri de imagistica . Pana in
prezent s-au dezvolatat divers e nanoplatforme pentru transpor tul proteinelor, genelor si
medicamentelor impotriva cancerului (chemoterapeuticele, fotosensibiizatoare ). Datorita
capacitatii de a ingloba cantitati mari de medi camente, nanoparticulele polimerice [2] si lipoz omii
[3] sunt cel mai intens utilizati in aplicatii de transport. De asemenea, nanoterapia include
tratamentul termic local al cancerului, utilizandu -se agenti fototermici, cum sunt nanoparticulele
de metal nobil sau nanomateriale pe baza de carbon, care in urma iradierii produc o crestere
semnificativa a temperaturii in regiunea in care sunt localizati .

2.1.1. Terapia fotodinamica a cancerului (PDT)
PDT este o tehnica terapeutica in doua e tape prin care o molecula fotosensibilizatoare
este livrata la celulele sau tes uturile cancerigene de interes , urmata de activarea acesteia prin
iradiere cu lumina vizibila [4].

3

2.1.1.1. Procesele fotofizi ce si fot ochimice implicate in PDT
In urma iradierii cu lumina la o lungima de unda adecvata, fotosensibilizatorul trece in
stare excitat a singlet de unde exista doua posibilitati : relaxarea in starea fundamentala emitand un
foton fluorescent, sau trecerea in starea excitata triplet. Din sta rea triplet exista doua mecanism e
posibile: relaxarea prin emite rea unui foton fosforescent sau transfer ul de energie unei alte
molecule prin tran zitie nonradiativa. Stingerea starii triplet a fotosen sibilizatorului se poate
realiza prin mecanism ul de tip I sau tip II . Primul implica interactiunea cu substratul biologic
rezultand formarea unor radicali sau ioni de radicali. Al doilea insa se refera la transferul de
energie intre starea triplet a fotosensibilizatoru lui si starea fundamantala a oxi genului molecular,
conducand la generarea starii excitate a acestuia, cunoscut sub numele oxigen singlet [5].

2.1.1.2. Fotosensibilizatori folositi in PDT
Fotosensibilizatorii folositi in PDT se pot clasifica in trei clase: prima, a doua si a treia
generatie. Pe s curt, fotosensibilizato rii de prima generatie includ derivativele de hematoporfirina
si Photofrin. Generati a a doua de fotosensibilizato ri a fost dezvoltata la sfarsitul anilor 1980 cu
scopul de a depasi dez avantajele fotosensibilizato rilor de prima ge neratie. Fotosensibilizatorii de
a treia generatie se refera la conjugatele fotosensibiliza torilor de a doua generatie , care prin
cuplarea cu diferite bio molecule sau incarcarea pe/in nanoparticule purtatoare , imbunatatesc
acumularea selectiva si tintita i n tesuturile tumorale.

2.1.1.3. Nanoparticule pentru terapia fotodinamica a cancerului
Inglobarea in diverse nanopla tforme a fotosensibilizatorilor prezinta mai multe avantaje,
si anume: interna lizare imbunatatita prin efectul numit "permeabilitate si retent ie ridicata " (EPR);
capacitate ridicata de incapsulare si de posibilitatea conjuga rii cu molecule de tintire cu scopul de
a imbunatati acumularea selectiva. Cele mai des utilizate nanocontainere sunt miceliile de
polimer si lipozomii.

2.1.1.4. Utilizarea albastrului de metilen in terapia fotodinamica
Albastrul de metilen (MB ) este un colorant histologic bine cunoscut facand parte din
clasa compusilor de fenotiazina [6]. MB prezinta banda de absorbtie in fereastra biologica a pielii
la 664 nm [7] si un randament cuantic ridicat de generare a oxigenului singlet. Aceste
caracteristici, i mpreuna cu toxicitatea redusa , fac ca MB sa fie un candidat adecvat pentru
utilizare a in PDT. Desi MB poate fi folosit in tratamentul unei mari varietati de b oli, utilizarea
clinica a acestuia este limitata din cauza faptului ca in mediu l biologic este redus de catre enzime

4
intr-o forma cu activitate fotodinamica neglija bila, numita albastru de leucometilen . Pentru
prevenirea acestei degradari, au fost dezvolta te numeroase nanoformulari , capabile de a
transporta MB si de a -l proteja de reducerea enzimatica [8,9,10].

2.2. Nanoparticule de aur in medicina si nanomedicina
Datorita proprietatilor atractive, cum ar fi biocompatibilitate a, proprietati le optice
distin ctive si metode le de preparare accesibile , in ultima vreme s -a dezvoltat o gama larga de
nanoparticulele de aur pentru apli catii in imagistica, diagnostic si terapie.

2.2.1. Proprietile optice ale nanoparticulelor de aur
In cazul nanoparticulelor cu dimensiuni mult mai mici decat lungimea de unda a luminii,
un camp electromagnetic incident de o frecventa data induce osciliatia coerenta rezonanta a
electronilor liberi din metal. Amplitudinea acestei oscilatii atinge maximul l a o frecventa
specifica, numita rezonanta plasmonica de suprafata (SPR), care determina aparitia unei benzi de
absorbtie intense in sprectrul vizibil [11].
In scopul de a urmari o anumita aplica tie, SPR nanoparticulelor de aur po ate fi deplasata
pe un dom eniu spectral larg [12]. In cazul nanoparticulelor de forma sferica SPR se poate deplasa
spre lungimi de unda mai mari prin creseterea dimensiunii acestora , insa aceasta este limitata pe
domeniul vizibil. Alte metode pentru deplasare benzii SPR spre domeni ul infrarosu apropiat
includ modificare a formei nanoparticulelor spre forme anizotrope cum ar fi bastonase,
triunghiuri, forme stelare sau agregarea nanoparticulelor sferice in structuri bine definite.

2.2.2. Microsco pia in camp intunecat pe baza de nanopartic ule de aur pentru imagistica
celulara
Microscopia in camp intunecat este una dintre cele mai populare metode de bioimagistica
pe baza de nanoparticule de aur [13]. In urma excitarii nanoparticulelor de aur cu lumina alba,
frecventele corespunzatoare frecv entei SPR a nanoparticulelor sunt puternic imprastiate, aceasta
lumina imprastiata putand fi colectat a utilizand o configuratie specifica de microscopie . Ca
urmare, nanoparticulele se vad ca niste puncte stralucitoare pe fundal negru, avand culoarea
coresp unzatoare frecventei SPR. Nanoparticule le de aur de diferite dimensiuni si forme au fost
utilizate cu succes in microscopia in camp intunecat pentru detectia celulele microbiale,
imagistica celule lor c ancerigene , identificarea receptori lor de pe suprafata acestora, studiul
endocitozei sau chiar imagistica unei tumori .

5
2.2.3. Raspunsul optic si activitatea fotodinamica a moleculelor in prezenta nanoparticulelor
plasmonice
Prezenta c ampul ui electromagnetic intens din jurul nanoparticulelor de aur are efecte
semn ificative asupra moleculelor organice aflate in apropiata vecinatate a acestora, dand nas tere la o
serie de fenomene remarcabile cu interes special in aplica tiile de imagisica si detectie.

2.2.3.1. Fluorescenta moleculara in prezenta nanoparticulelor plasmonice
Interactiunea starii excitate a fluoroforilor cu electronii liberi din metal poate modifica
emisia de fluorescenta a acestora , determinand stingerea sau amplificarea emisiei de fluorescenta.
Stingerea fluorescent ei se datoreaza transferului ne radiativ de e nergie din starea excitata a
fluoroforului la nanoparticule de aur , manifestandu -se de obicei la distan te mici fata de suprafata
metalica (~ 0–5 nm). La o distanta optima intre molecula fluorescenta si metal, se poate observa
fenomenul de fluoresce nta am plificata de metal (MEF), care se evidentiaza de obicei prin
cresterea intensitatii de fluorescenta si scaderea timpului de viata [14].

2.2.3.2. Imprastiere a Raman in prezenta nanoparticulelor plasmonice ( Imprastiere a Raman
amplificata de suprafata)
Imrastierea Raman amplificata de suprafata (SERS ) se bazeaza pe amplificare drastica a
semnalului Raman al moleculelor activ e Raman in vecinatatea unor sup rafete nanostructurate .
[15]. Energia fotonului pierduta in timpul procesului de imprastiere , denumita deplasar e Raman ,
furnizează informatii chimice s i structurale despre molecula, in particular despre structura
vibrationala a acesteia. SERS poate genera o amplificare de ordinul 109 – 1011, permitand chiar
si detectia unei singure molecule [16].

2.2.3.3. Activitate a fotodinami ca in prezenta nanoparticulelor plasmonice
Prima observatie a influentei pozitive a pre zentei nanoparticulelor plasmo nice asupra
procesel or fotodinamice a fost raportata de catre Zhang et al. [17]. Generarea oxigenului singlet
amplificata de metal (MESOG ) a fost atribuita ra tei ridicate de excitatie datori ta prezentei
metalului si cresterii implicite a transferului de energie catre sisteme alaturate (intersystem
crossing) si starii excitate de triplet. In prezent , s-au propus doua mecanisme care stau la baza
amplificarii randamentul cuantic al generarii oxigenului singlet: (1) cresterea eficientei de
absorbt ie a fotos ensibilizatorului pe ansamblu sau (2) transfer de energie de la nanoparticule la
molecul e fotosensibilizatoare.
In consecinta, conjugarea fotosensibilizatorilor de nanoparticule de metal nobil reprezinta
o abordare avantajoasa in vederea ut ilizarii acestora in terapiile bazate pe citotoxicitatea
oxigen ului singlet, cum este PDT.

6

2.3. Nanopartic ule hibride pentru aplicatii biomedicale
Nanoparticulele hibride, combina nd mai mult e componente functional e, ofera
posibilitatea detectiei si terapiei simultane a cancerului sau chiar combinarea diferitelor terapii
care pot imbunatati semnificativ eficie nta tratamentelor individuale. Aceste tipuri de
nanoparticule sunt numite si agenti teranostici.

2.3.1. Nanoparticule hibride aur -polymer
Pana in prezent au fost exploatate numeroase tipuri de polimeri in fabricarea
nanoparticulelor hibride aur -polime r cu difer ite morfologii , ca de exemplu structuri sferice de tip
"core -shell", particule asamblate incorporate in matrice polimerica sau micelii de polimer
decorate cu nanoparticule mici de aur [18]. Tehnicile de prepara re pot fi impartite in doua clase
majore: (1) conjugare covalenta, adica imobilizarea polimerului pe suprafata nanoparticulelor de
aur prin legaturi aur-sulf, si (2) adsorptie fizica, care include asocierea hidrofoba si interactiunile
electrostatice. Interfatarea nanoparticulelor de aur cu polimeri o fera stabilitate ridicata in mediul
biologic, imbunatatirea semnificativ a a biocompatibilita tii acestora , posibilitatea de a transporta
medicamente si permite functionalizarea cu molecule de tintire pentru recun oasterea specifica a
tumori lor.

2.3.1.1. Co-polimer ul bloc Pluronic
Pluronic este o clasa a copolimerilor bloc, o marca inregitrata a companiei BASF. Acesti
copolimer bloc sunt alcatuiti din unitati hidrofile de oxid de polietilena (PEO ) si unitati hidrofobe
de oxid de pol ipropilena (PPO), aranjate in structura PEO -PPO-PEO. Polimerii Pluronic in
conditii date, se autoasambleaza in mecelii, miezul acestora fiind alcatuit din PPO hidrofob, pe
cand lanturile PE O formeaza coroana. Miceliile pot fi utilizate pentru incorporarea diferitelor
agenti terapeutici si de diagnotic , in particular a acelora care nu se pot administra direct din cauza
insolubilitatii in mediu l biologic [19]. O alta proprietate atragatoare a clasei de copolimeri
Pluronic o reprezinta biocompatiilitatea ridic ata, capacitatea de a sensibiliza liniile de celule
canceroase rezistente la medicamente multiple (MDR) si tintirea p asiva a tumori lor prin efectul
EPR.

7
PARTEA II: REZUL T ATE SI DISCUTII

3. Nanoparticule aur -Pluronic: sinteza, caracterizare si evaluare b iologica

3.1. Prepararea si caracterizarea nanoparticulelo r aur-Pluronic
3.1.1. Prepararea nanoparticulelor aur -Pluronic
In prima etapa, nanoparticulele de aur au fost sintetizate in faza organica folosind
oleilamina ca agent reducator si stabilizator . Apoi, nanopar ticulele de aur stabilizate cu
oleilamina au fost tranferat e in faza apoasa cu ajutorul polimerului Pluronic F127. Pluronic se
leaga de suprafata nanoparticulelor de aur prin interactiune a hidrofoba dintre oleilamina si
segmentul PPO al Pluronic, iar h idrofilicitatea lanturilor PEO asigura solubilitatea
nanoparticulelor in apa, o cerinta cruciala pentru orice aplicatie biologica.

3.1.2. Caracterizare a spectro scopica si morfologica
Spectrele de absorbtie UV-Vis ale coloizilor obtinuti inainte si dupa invelire a cu Pluronic
sunt prezentate in Figura 3-1. Nanoparticulele acoperite cu oleilami na dispe rsate in hexan
prezinta rezonanta plasmonica de suprafata la 518 nm, c aracteristic a nanoparticulelor individuale
de forma sf erica (spectrul a). Deplasare a de 5 nm inspre lungimi de unda mai mari a benzii
plasmonice dupa transferul de faza se datoreaza modificarii indicelui de refractie din jurul
nanoparticulelor ca urmare a adsorbtiei Pluronic.

400 500 600 700 800 9000.00.51.01.52.02.53.0
a
b
Absorbance (a.u.)
Wavelength (nm)

Figura 3-1 Spectrele de abso rbtie UV-Vis ale nanoparticulelor de aur (a) si ale nanoparticulelor aur -Pluronic
(b). Inset : imaginea marita a maximelor de absorbtie normalizate .
510 520 5305 nm
Absorbance (a.u.)
Wavelength (nm)

8
Pe baza imginililor de microscopi e electronica in transmisie (TEM ) s-a confirmat ca
nanoparticulele preparate sunt individuale, uniforme si de forma sferica , diametrul mediu al
miezului de aur f iind de 9,4 ±1,8 nm (Figura 3-2).

5 6 7 8 910 11 12 13 140510152025
B
Counts
Diameter (nm)

Figura 3-2 Imagine TEM (A ) si hisograma de distributie dimensionala a n anoparticulelor de aur (B).
Conform masuratorilor de imprastiere dinamica a luminii (DLS), nanoparticulele de aur
acoperite cu oleilamina au un diametru hidrodinamic mediu de 13.48 nm. Dupa transfer ul de faza
diametrul nanoparticulelor a crescut la 34.75 nm, diferenta de ~ 10 nm fiind atr ibuita coajei
polimerice , corespunzand unui singur strat de Pluronic. Prezenta polimerului pe suprafata
nanoparticulelor de aur a fost confirmata de potentialul Zeta aproape neutru (4,48 mV) al
nanoparticulelor aur -Pluronic.

3.1.3. Stabilitatea nanoparticulelor aur-Pluronic
In continuare, s -a investigat stabilitatea nanoparticulelor aur -Pluronic in so lutie de NaCl
monitorizand evo lutia temporala a spectrului de absorbtie UV-vis. Rezultatele obtinute indica ca
nanoparticulele aur -Pluronic sunt foarte stabile in solutie salina, spectrul de abs orbtie fiind
aproape nemodif icat dupa 24 ore de incubare.

3.2. Evaluarea biologica a nanoparticulelor aur -Pluronic
3.2.1. Citotoxicitatea nanoparticulelor aur -Pluronic
Cu scopul de a evalua citotoxicitatea nanoparticulelor aur -Pluronic si de a scoate in
evidenta importanta purificarii corec te a acestora, celule de tip HTB 177 au fost incubate cu
diferite concentratii de nanoparticule purificate si nepurificate pentru diferite in tervale de timp.
Dupa aceea , starea celule lor a fost evaluata prin microscopia de fluorescenta utilizandu -se tehnica
de dubla colorare cu calcein a si iodura de propidium , care marcheaza celule vii, respectiv cele
moarte . Figura 3-3 prezinta imaginile in transmisie si de fluorescenta a celulelor incubate cu
particule aur -Pluronic nepurificate incubate timp de 1 h (0.5 nM), respectiv timp de 24 h cu A

9
particulele purificate (2 nM). Rezultatele indica ca nanoparticulele preprate omitand niste pasi de
spalare induc moarte celulara c hiar la concentratii foarte mic i, pe can d nanoparticulele purificate
de urmele de hexan s i oleilamina nelegata sunt biocompatibile chiar dupa 24 ore de incubare.

Figura 3-3 Imaginile in transmisie si de fluorescenta a celulelor incubate cu particule aur -Pluronic
nepurificate (a,b and c) si pur ificate (d, e and f). Scal a este de 50 m.

3.2.2. Imagistica in camp intunecat a celulelor cancerigene
In continuare, s -a investigat capacitatea nanoparticulelor aur -Pluronic de a servi ca si
agenti de imprastiere pentru imagistica celulara prin microscopie in camp intunecat . Figura 3-4
arata imaginile microscopice in camp intunecat si in camp luminos a le celule lor cancerigene
incubate cu nanoparticule aur -Pluronic (a, c) si fara nanopartic ule (b, d). Internalizarea cu succes
a nanoparticulelor in celule este demonstrata prin punctele stralucit oare de culoare galb en-
portocaliu din inte riorul celule lor, care se datoreaza imprastierii luminii de catre nanoparticule la
frecventa curespunzatoare rezonantei plasmonice a acestora.

Figura 3-4 Imaginile de microscopi e in camp intunecat si in camp luminos ale celule lor B16 -F10 incubate cu
nanoparticule aur -Pluronic (a, c) si imaginile de control fara nanopartic ule (b, d).

10
4. Nanoparticule hibride Pluronic -aur incarcate c u albastru de metilen pentru
imagistica celulara si terapia celulelor cancerigene

4.1. Prepara rea si caracteriza rea nanoparticulelor de aur -Pluronic incarcate cu MB

4.1.1. Prepararea si caracterizarea Au-PF127

4.1.1.1. Sinteza
Nanoparticulele de aur au fost preparate pri n simpla amestecare a solutiei apoase de sare de aur
cu diferite concentratii de Pluronic F127 ( 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM and 10 mM ), urmata de
purificarea acestora prin centrifugare si resuspendare in apa ultrapura .

4.1.1.2. Caracterizare a spectroscopica si morfo logica
Spectrele de absorbtie ale coloizilor obtinuti cu diferite concentratii de Pluronic sunt
prezentate in Figura 4-1 A. Toate spectrele prezinta o banda de absorbtie centrata la 540 nm
corespunzatoare rezonant ei plasmonice de suprafata a nanoparticulelor sferice individuale. Prin
analiza acestor spectre s -a determinat concentratia de Pluronic care asigura o buna stabilitate a
nanoparticulelor cu un exces minim de polimer in solutia coloidala (2 mM). Toate studi ile
urmatoare au fost efectuate cu nanoparticule sintetizate cu concentratia de 2 mM de Pluronic.

200 300 400 500 600 700 8000.00.20.40.60.81.01.2

Absorbance (a.u.)
Wavelength (nm)
5 10 15 20 25 30 35 40 45051015202530
Distribution ( % )
Diameter (nm)

Figura 4-1 (A) Spectrele de absorbtie ale nanoparti culelor de aur sintetizate cu concentratia crescatoare de
Pluronic F127. Inset : imaginea marita a benzi lor plasmonice . Linia punctata reprezinta spectrul de absorbtie
al solutiei HAuCl 4.3H 2O. (B) Hisograma de distributie dimensionala a nanoparticulelor Au -PF127fitata cu o
curba gausiana. I nset : Imagine TEM a nanoparticulelor Au-PF127.

400 500 600 700 8000.000.050.100.150.20

Absorbance (a.u.)
Wavelength (nm) 0 mM
0,5 mM
1 mM
2 mM
5 mM
10 mM
A B

11
Histogram a corespunzatoare distributiei dimensionale ale nanoparticulelor, fitata cu o
gausiana este prezentata in Figura 4-1 B, iar in inset se vede o imagine TEM reprezentativa.
Diametrul mediu al Au-PF127 este de 20±7 nm . Masuratorile DLS indica un diametru
hidrodinamic de 41.5 nm , valoare care include invelisul polimeric indicand un singur strat de
Pluronic. Datorita prezentei polimerului, potentialul Z eta masurat pe suprafata nanoparticulelor
este neutru (-0.23 mV).

4.1.2. Prepararea si caracterizarea Au -F127 -MB

4.1.2.1. Incarcare a nanoparticulelor cu MB
Incarcarea nanoparticulelor Au -PF127 cu MB s -a efectual prin coincubarea acestora la
temperatura camerei, urmata de purificarea solutiei de molecule nelegate prin centrifugare si
resuspendare in apa ultrapura .

4.1.2.2. Caracterizare a spectroscopica
In prima etapa i ncarcarea nanoparticulelor Au-PF127 cu MB a fost caracterizata prin
spectroscopia de absorbtie UV -Vis, spectrul Au-PF127 -MB prezentand atat caracteristici
spectrale corespunzatoare rezonantelor plasm onice ale nanoparticulelor de aur, cat si absorbtiei
electronice a MB (spectrul b in Figura 4-2).

400 500 600 700 8000.00.20.40.60.81.0
0.00.20.40.60.81.0
Normalized fluorescenceNormalized absorbance
d
cb
alaser

Wavelength (nm)

Figura 4-2 Spectrele de absorbtie normalizate ale Au-PF127 (a), Au -PF127 -MB (b), MB (c) si spectrul de
emisie normalizat al MB (d).

12
4.1.2.3. Stabilitatea nanoparticulelor Au-F127 -MB in me diul biologic
Stabilitatea Au-PF127 -MB in prezenta mediului celular a fost demonstrata prin semnalul
spectroscopic aproape neschimbat al acestora dupa 24 ore de incuba re. Este de remarcat faptul ca
nu exista deplasare in maximul absorbantei plasmonice, s ingura modificare fiind aceea de largire
a benzii datorita suprapunerii acesteia cu imprastirea proteinelor serice din mediu. Acest rezultat
indica ca Pluronic previne adsorptia proteinelor.

4.1.2.4. Eliberarea MB in diferite conditii de ionicitate
Pentru cuantifi carea eliberarii posibile a MB de catre Au-PF127 -MB din cauza
modificarii pol aritatii solventului si ionicit atii din jurul nanoparticulelor , nanoparticulele au fost
incubate in diferite solutii (NaCl, etanol, sodium dodecyl sulfate (SDS ) si mediu celular) .
Cantitatea de MB eliberat s -a determinat prin masurarea spectrului de absorptie al supernatantului
dupa centrifugare. Rezultatele indica ca 80 % din cantitatea initiala de MB a ramas legat de
nanoparticule in cazul incub arii in apa, NaCl si mediu celular, 75 % in cazul etanolului iar 92 %
in cazul SDS. Faptul ca mediul celular nu promoveaza eliberarea MB este un rezultat de mare
relevanta in ceea ce prive ste utiliz area ulterioara a Au-PF127 -MB in aplicati i biomedical e,.

4.2. Stud ii legate de robustetea si activitatea nanoparticulelor Au -PF127 -MB cu privire
la aplicatiile biomedicale

4.2.1. Investigatii spectroscopice

4.2.1.1. Semnal dual de fluorescenta -SERS
In acest studiu am investigat activitatea SERS a nanoparticulelor Au -PF127 -MB, cu
scopul de a obtine informatii privind localizarea moleculelor la suprafata nanoparticulelor de aur.
Spectrul SERS colectat din solutia Au-PF127 -MB (Figura 4-3, spectru l b) prezinta atat emisie
de fluorescenta a MB, cat si unele benzi Raman caracteristice ale acestuia. Masurand spectrul
SERS al aceluiasi coloid, dar pe picatura uscata prezinta benzi Raman bine definite (Figura 4-3,
spectrul c). Aceste rezultate confirma existenta MB in doua stari: legat de nanoparticule de aur
generand semnal SERS si izolat de acestea prin lanturile polimerice emitand semnal de
fluorescenta.

13

400 600 800 1000 1200 1400 1600 18000500100015002000
d
c
b
a

Raman intensity (a.u.)
Raman shift (cm-1)
Figura 4-3 Spectrul Raman al Au-PF127 (a), semnal d ual de SERS -fluorescenta al Au-PF127 -MB in solutie (b),
spectrul SERS al Au-PF127 -MB pe picatura uscata (c) si spectrul Raman al MB solid (d).

4.2.1.2. Studiul formei moleculare a MB incapsulat
Deoarece agregarea unui fotosensibilizato r ca urmare a incapsularii acestuia ii poate
modifica semnificativ proprietatile terapeutic e, in acest studiu am investigat starea de ag regare a
MB dupa inglobarea in Au-PF127 prin masurarea spectrelor de excitatie. Rezultatele obtinute
indica ca forma mon omerica a MB este mentinuta dupa incapsularea in Au-PF127 , oferind
beneficii semnificative in ceea ce prive ste detecta bilitatea nanoparticulelor Au-PF127 -MB prin
fluorescenta si aplicabilitatea acestora in PDT.

4.2.1.3. Studiul proprietatilor fotofizice ale MB incapsulat prin masuratori de fluorescenta
rezolvata temporal
Cu scopul de a elucida localizarea MB si de a determina efectele inc apsularii asupra
proprietatilor fotofizice ale aces tuia, am efectuat masuratori de timpi de viata in starea excitata
(vezi Table 4-1).
1 [ns] A1[%] 2 [ns] A2[%] 2
MB 0.4 100 – – 1.039
PF127 -MB 0.43 98 1.26 2 1.013
Au-PF127 -MB 0.54 88 1.26 12 1.046
Table 4-1 Parametrii de fluorescenta r ezolvata temporal ai MB, PF127 -MB si Au-PF127 -MB. 1, 2 – timpi de
viata in starea excitata ; A 1, A2 – distributia procentuala a componentelor de timp de viata ; -parametru
statistic indicand calitatea fitului exponential .
In primul rand, s -a observat ap aritia unei componente mai lungi de timp de viata, corespunzand
moleculelor localizate in segmentele hidrofobe ale Pluronic. Pe de alta parte, componenta mai

14
scurta, atribuita moleculelor MB aflate in mediu l hidrofil , prezinta o crestere fata de MB liber,
datorita modificarii microviscozitatii locale din jurul moleculelor. Modificarile favorabile ale
proprietatilor fotofizice ale MB observate in urma incapsularii reprezinta un avantaj efectiv in
ceea ce priveste utlizarea nanoparticulelor Au-PF127 -MB in PDT .

4.2.2. Studiul activitatii fotodinamice a Au -PF127 -MB
4.2.2.1. Protect ia MB impotriva degradarii enzimatice
In acest capitol, ne -am propus sa verificam daca Pluronic poate proteja MB impotriva
degradarii enzimatice . In acest experiment am folosit drojdia alimentara ca sursa de enzima,
glucoza ca donor de hidrogen, iar MB a avut rolul de acceptor de hidrogen. S -a monitorizat
descresterea benzii de emisie a MB la 683 nm timp de 30 min la 40 C sub agitare magnetica
continua (vezi Figura 4-4). Rezultatele obtinute indica ca invelisul Pluronic poate proteja MB
inglobat impotriva reducerii de care enzime in mediu biologic. In consecinta nanopartic elele Au-
PF127 -MB sunt potrivite pentru aplica tii biomedicale .

0 1000 2000 3000406080100120
ba
Fluorescence intensity at 683 nm (a.u.)
Time (s)

Figura 4-4 Dependenta temporala a emisiei de fluorescenta la 683 nm a Au-PF127 -MB (a) si MB liber (b)
masurate la 40 C in pre zenta drojdiei si a glucozei .

4.2.2.2. Masuratori d e generare a oxigenului singlet
In aceasta parte, am investigat potent ialul nanohibrizilor Au-PF127 -MB in PDT, si anume
capacitatea moleculelor MB inglobate de a genera specii citotoxice. Pentru aceasta am folosit 1,3-
Diphenylisobenzofuran (DPBF ) pentru a evalua eliberarea oxigenului singlet de catre Au-PF127 –
MB ca urmare a iradierii rezonante a MB . DPBF interactioneaza ireversibil cu oxigenul singlet ,
determinand scad erea in intensitate a benzii de absorptie a acestuia la 410 nm. Scaderea
semnificativa a absorbantei DPBF in prezenta Au-PF127 -MB in raport cu proba control indica

15
capacitatea nanoparticulelor de a genera oxigen singlet, o cerinta cruci ala pentru aplicabil itatea
PDT.
0 20 40 60 80 100 120ba
Irradiation time (s) Au-PF127-MB + DPBF
Absorbance at 411 nm (a.u.) DPBF

Figura 4-5 Dependenta temporala a absorbantei DPBF la 410 nm in et anol ( a) si in presenta nanoparticulelor
Au-PF127 -MB in etanol ( b).

4.3. Utilizarea Au-PF127 -MB in imagi stica celulara si terapia fotodinamica a celulelor

4.3.1. Studiul internalizarii nanoparticulelor Au-PF127 -MB in celule prin microscopia in
camp intunecat

In acest studiu, am folosit microscopia in camp intunecat pentru a monitoriza acumularea
nanoparticulel or Au-PF127 -MB in celule cancerigene HTB 177 in functie de timpul de incubare.

Figura 4-6 Imagini de microscopie in camp intunecat ale celulelor HTB 177 incubate cu Au-PF127 -MB timp
de 0, 6, 15 si 24 ore (A, B, C respectiv D).

16

Figura 4-6 A prezinta imagine de referinta in camp intunecat a celulelor HTB 177 fara
nanoparticule. Punctele albastrui in celule le nemarcate se datoreaza imprastierii caracteristice a
diferitelor organite celulare (inset Figura 4-6 A). Dupa incubare cu nanoparticule timp de 6 ore
se observa in cateva celule aparitia unor puncte galbui -portocaliu, indicand o acumulare slaba a
nanoparticulelor ( Figura 4-6 B). O imprasiere mult mai pronuntata se poate vedea in celulele
incubate pentru 15 ore ( Figura 4-6 C), iar incubarea pentru un timp de 24 ore rezulta intr-o
marcare complet a a celulelor ( Figura 4-6 D).
Faptul ca punctele stralucitoare v izibile in interiorul celulelor se atribuie amplificarii
luminii imprastiate de catre plasmonii de suprafata ai nanoparticulelor internalizate a fost
confirmat prin colectarea spectrelor de impras tiere din interiorul celulelor. Figura 4-7 arata
imaginile de microscopi e in camp intunecat ale celulelor analizate si spectrele corespunzatoare
colectate din zo na mar cata cu sageti .

500 550 600 650012
ba
Scattering intensity (a.u.)
Wavelength (nm)

Figura 4-7 Imagini de microscopie in camp intunecat ale celulelor HTB 177 incubate cu Au -PF127 -MB timp
24 h (A) si celula de referinta (B). Scala = 20 m. (C) Spectrele de imprastiere corectate (a, b) colectate din
celule de pe imaginile A respectiv B .

4.3.2. Terapia fotodi namica a celulelor cancerigene marcate cu Au-PF127 -MB si activate cu
LED

Strategia de a incapsula MB in nanoparticulele aur -Pluronic ofera avantaje considerabile
cu privire la activitatea fotodinamica a nanoparticulelor nu doar prin faptul ca protejeaza
fotosensibilizatorul impotriva factorilor de mediu si mentine forma monomerica a acestuia, ci si
prin cresterea probablitatatii de generarare a oxigenului singlet. In consecinta, ne permitem
utilizarea unei s urse de iradiere mai putin invaz ive decat laserii de mare performanta, si anume o
dioda emitatoare de lumina ( LED ). Celulele HTB 177 incubate cu Au-PF127 -MB au fost iradia te
cu diferite doz e controlate prin modificarea intensitatii luminii si a timpului de iradiere. C

17
Figura 4-8 Imaginile de microscopi e in camp luminos
(a-d) si de fluorescenta (A -D) ale celulelor HTB 177
incubate cu Au -PF127 -MB dupa iradiere la 660 nm cu
doze de 780 mW/c m2, 640 mW/cm2, 520 mW/cm2
respectiv 425 mW/cm2. Imaginile microscopice in camp
luminos (e) si de fluorescenta (E) ale celulelor HTB 177
incubate cu Au -PF127 dupa iradiere cu doza de 780
mW/cm2.
Starea celulelor supuse terapiei a fost evaluata la 3
ore dupa iradiere, utilizandu -se tehnica de dubla
colorare fluorescenta cu calceina si iodura de
propidium, marcand astfel celule le vii, res pectiv
cele moarte. Imaginile in camp luminos si de
fluorescenta ale celulelor incubate cu Au-PF127 –
MB si iradiate la doze de 780 mW/cm2, 640
mW/cm2, 520 mW/cm2 si 425 mW/cm2 sunt
prezentate in Figura 4-8 a-d respectiv Figura 4-8
A-D. Prelucrarea digitala a imaginilor de
fluorescenta indica viabilitatea descrescatoare in
functie de creseterea dozei de iradiere, ajungand
la o viablitate celulara de 13 % la cea mai mare
doza (780 mW/cm2).

18
5. Imagistica multimodala a celulelor vii utilizand nanoagregate fot oactivabile

5.1. Prepararea probelor

5.1.1. Prepar ea agregatelor de nanoparticule de aur
Nanoparticulele de aur de forma sferica acope rite c u citrat de sodiu cu un diametru mediu
de 14±1 nm au fost sintetiza te prin reducerea sarii de aur cu citrat de sodiu prin metoda
Turkevich -Frens [21]. Agregarea nanoparticulelor a fost realizata prin destabilizarea s arcinii de
pe suprafata acestora cu NaCl in prezenta etanolului . Agregatele formate au fost stabilizate cu
Pluronic F127 si purificate prin centrifugare .

5.1.2. Conjuga rea agregatelor cu albastru de metilen
Conjugarea agregatelor cu MB a fost realizata prin coincubarea acestora la temper atura
camerei, urmata de centrif ugarea si respundare a in apa ultrapura pentru a elimina moleculele
nelegate.

5.2. Caracteriza rea nano agregatelor

5.2.1. Caracterizare a morfologica si optica
In Figura 5-1 A este prezentata o imagine TEM reprezentativa a nano agregatelor formate
care pune in evidenta mai mult o organizare in lanturi a nanoparticulelor, decat o agregare
dezordonata. Majoritate a nanoparticulelor au ramas individuale (~ 32.5 %) , 18 % din agregatele
formate sunt de dimeri si 15 % trimeri , de asem enea s -a observat si formarea unor agregate mai
mari de nanoparticule (16 %). Spect rul de extinctie al nanoparticulelor sferice (a) si cel al
agregatelor formate din acestea (b) sunt prezentate in Figura 5-1 B. Agregarea nanoparticulelor
induce largire a benzii plasmonice si aparitia a doua benzi la lungimi de unda mai mari.
Deplasare a de 4 nm a maximului benzii blasmonice inspre lungimi de unda mai mari se atribuie
cresterii indicelui de refractie din jurul nanopar ticulelor ca urmare a adsorbtiei polimerului pe
suprafata acestora. Atasarea polimerului pe suprafata nanoagregatelor s -a confirmat prin
masurarea potentialului Zeta de pe suprafata acestora. Nanoparticulele de aur acoperite cu citrat
prezinta un potential Zeta de -44 mV , care a crescut la -23 mV dupa formarea nanoagregatelor si
stabilizarea acestora cu Pluronic .

19

300 400 500 600 700 800 900 10000.00.40.81.2
ba
Absorbance (a.u.)
Wavelength (nm)
Figura 5-1 (A) Imagine TEM a GNPA si (B)spectrele de extinctie ale nanoparticulelor de aur sferice (a) si
GNPA (b).

5.3. Caracterizarea nanoconjugatelor

5.3.1. Caracterizare a UV-Vis
Spectrul de absorbtie al nanoparticulelor GNPA -MB prezinta o caracteristica spectrala a
MB, manifestandu -se prin cresterea intensita tii benzii de ab sorbtie la lungimea de unda
corespunzatoare absorbtiei MB (Figura 5-2). Incarcarea nanoparticulelor cu MB este
demonstrata si prin deplasarea de 2 nm a maximului rezonantei plasmonice, atribuita modificarii
indicel ui de refractie din jurul nanoparticulelor ca urmara a conjugarii cu MB.

400 500 600 700 800 900 10000.00.20.40.60.81.0

c
b
aNormalized absorbance / extinction (a.u.)
Wavelength (nm)

Figura 5-2 Spectrul de absorbtie normalizat al MB (a), spectrele de extinctie normalizate ale GNPA (b) si
GNPA -MB (c).

515 520 525 5304 nm

Wavelength (nm)B

20
5.3.2. Masuratori de fluorescenta rezolvata temporal
Asa cum am demonstrat anterior in cazul Au -PF127 -MB, interactiunea cu Pluronic si
nanoparticule de aur modifica semnificativ proprietatile fotofizice ale MB. In mod analog, se
observa aparitia un ei componente mai lungi (1.27 ns) si lungirea componentei mai scurte (0.53
ns).

5.3.3. Stabilit atea in diferite conditii de mediu
Nanoparticulele GNPA -MB s-au dovedit a fi foarte stabile la modificarea ionicitatii
solventului, pozitia si largimea benzii plasmon ice ramanand aproape nemodificate ca urmare a
incubarii in solutie de NaCl timp de 24 h.

5.4. Detectia spectroscopica multimodala in celule vii

5.4.1. Evaluarea internalizarii nanoparticulelor prin microscopie in camp luminos
In prima etapa internalizarea nanopa rticulelor GNPA -MB in celulele cancerigene a fost
evaluata prin microscopi a in camp luminos . Celule incubate cu GNPA -MB prezinta niste puncte
negre distribuite in interiorul celulei, in regiunea citoplasmatica, atribuite nanoparticulelor
acumulate in endos omi (Figura 5-3).

Figura 5-3 Imaginile de microscopie in camp luminos ale celule lor A549 incubate cu nanoparticule GNPA -MB
(A) si fara nanoparticule (B).

5.4.2. Masu ratori SERS intracelular e
Cu scopul de a investiga activitatea SERS intracelulara a GNPA -MB, celulele
cancerigene A 549 au fost incubate cu nanoparticule timp de 24 ore . Pentru excitarea probelor a
fost utilizata linia laser la 633 nm care este in rezonanta cu absorbtia MB, masurandu -se de fapt
semnalul Raman rezonant amplificat de suprafata ( SERRS ). Figura 5-4 B prezinta imaginea in A B

21
camp luminos a celule lor incubate cu GNPA -MB, punctele stralucitoare fi ind atribuite
nanoparticulelo r de aur internalizate care imprastie puternic a lumina . Spectrul a din Figura 5-4
A repre zinta un spectru caracteristic SERRS colectat din zona indicata de sageata din Figura 5-4
B, asemanatoare cu spectrul masurat din solutia de GNPA -MB (spectrum b). Nu se observa benzi
Raman corespunzatoare componentelor celulare , ceea ce este in buna co ncordanta cu alte
rezultate din literatura, care demonstreaza ca Plur onic inhiba adsorbtia moleculelor largi, cum ar
fi proteinele si lipidele [22].

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800dcba
Intensity (a.u.)
Raman shift (cm-1)

Figura 5-4 (A) spectrul SER RS al GNPA -MB in interiorul celulelor (a), spectrul SERRS al GNPA -MB in solutie
(b), spectrul Raman al MB (c) imprastiare Raman din celula de control (d). (B) Imagine in camp luminos a
celulelor A549 marcate cu GNPA -MB si (C) Imagine in camp luminos a celulelor A549 fara nanoparticule .

5.4.3. Imagistica de fluorescenta rezo lvata temporal a celulelor incubate GNPA -MB

Figura 5-5 A prezinta imaginea FLIM a celulelor A549 fara nanoparticule . Se poate
observa o autofluorescenta moderata avand un timp de viata mediu de 2.5 ns. In cazul c elulelor
incubate cu MB liber, imaginea FLIM prezinta o acumulare a moleculelor MB in lizozomi avand
un timp de viata scazut la 0.27 ns (Figura 5-5 B). Scurtarea timului de viata se atribuie agregarii
moleculelor M B ca urmare a concentratie i locale mari.

A B
C

22

Figura 5-5 Imagine a FLIM a celulelor A549 (A), a celulelor A549 marcate cu MB (B) si a celulelor A549
marcate cu GNPA -MB (C )

Internalizare a GNPA -MB in celulele A549 este confirmata prin Figura 5-5 C, prezentand
o localizare mult mai uniforma a nanoparticulelor raspandite in regiunile citoplasmatice. O
descrestere exponentiala de ordinul doi se poate observa in aces t caz, avand timpi de viata 5 ns si
1.3 ns, provenind de la autofluorescen ta organitelor celulare respectiv GNPA -MB. Cateva puncte
asemenatoare acumularii MB liber se pot observa cu timp de 0.25 ns in cazul celulelor cu GNPA –
MB, atribuite eliberari i posib ile a MB de catre GNPA -MB ca urmare a interactiunii cu
biomolecule din celule.

6. Concluzii finale

 Am fabricat nanoparticule aur -Pluronic stabile si biocompatibile care pot servi ca agenti
de contrast in imagistica in camp intunecat a celulelor can cerigene.
 Am produs nanoparticule hibride Pluronic -aur incarcate cu albastru de metilen pentru
imagistica celulara in camp intunecat si terapie fotodinamica activata prin LED a celule lor
cancerigene.
 Am preparat nanoa gregate da aur conjugate cu albastru de metilen pentru detectie
multimodala prin SERS si FLIM.

A B C
A B E

23
REFER INTE

[1] Y.-C. Yeh, B. Creran, and V. M. Rotello, “Gold nanoparticles: preparation, properties, and
applications in bionanotechnology,” Nanoscale , vol. 4, no. 6, pp. 1871 –1880, Mar. 2012.
[2] T. Gallavardin, M. Maurin, S. Marotte, T. Simon, A. -M. Gabudean, Y. Bretonnière, M. Lindgren,
F. Lerouge, P. L. Baldeck, O. Stéphan, Y. Leverrier, J. Marvel, S. Parola, O. Maury, and C.
Andraud, “Photodynamic therapy and two -photon bio -imaging applica tions of hydrophobic
chromophores through amphiphilic polymer delivery,” Photochem. Photobiol. Sci. , vol. 10, no. 7,
pp. 1216 –1225, Jun. 2011.
[3] T. M. Allen and P. R. Cullis, “Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical
applications,” Adv. Drug Deliv. Rev. , vol. 65, no. 1, pp. 36 –48, Jan. 2013.
[4] P. Agostinis, K. Berg, K. A. Cengel, T. H. Foster, A. W. Girotti, S. O. Gollnick, S. M. Hahn, M. R.
Hamblin, A. Juzeniene, D. Kessel, M. Korbelik, J. Moan, P. Mroz, D. Nowis, J. Piette, B. C.
Wils on, and J. Golab, “Photodynamic therapy of cancer: An update,” CA. Cancer J. Clin. , vol. 61,
no. 4, pp. 250 –281, 2011.
[5] M. C. DeRosa and R. J. Crutchley, “Photosensitized singlet oxygen and its applications,” Coord.
Chem. Rev. , vol. 233 –234, pp. 351 –371, Nov. 2002.
[6] J. P. Tardivo, A. Del Giglio, D. Oliveira, C. Santos, D. S. Gabrielli, H. C. Junqueira, D. B. Tada, D.
Severino, R. de Fátima Turchiello, and M. S. Baptista, “Methylene blue in photodynamic therapy:
From basic mechanisms to clinical applic ations,” Photodiagnosis Photodyn. Ther. , vol. 2, no. 3, pp.
175–191, Sep. 2005.
[7] H. C. Junqueira, D. Severino, L. G. Dias, M. S. Gugliotti, and M. S. Baptista, “Modulation of
methylene blue photochemical properties based on adsorption at aqueous micelle interfaces,” Phys.
Chem. Chem. Phys. , vol. 4, no. 11, pp. 2320 –2328, May 2002.
[8] W. Tang, H. Xu, E. J. Park, M. A. Philbert, and R. Kopelman, “Encapsulation of methylene blue in
polyacrylamide nanoparticle platforms protects its photodynamic effectivene ss,” Biochem.
Biophys. Res. Commun. , vol. 369, no. 2, pp. 579 –583, May 2008.
[9] X. He, X. Wu, K. Wang, B. Shi, and L. Hai, “Methylene blue -encapsulated phosphonate –
terminated silica nanoparticles for simultaneous in vivo imaging and photodynamic therapy,”
Biomaterials , vol. 30, no. 29, pp. 5601 –5609, Oct. 2009.
[10] H. J. Hah, G. Kim, Y. -E. K. Lee, D. A. Orringer, O. Sagher, M. A. Philbert, and R. Kopelman,
“Methylene blue -conjugated hydrogel nanoparticles and tumor -cell targeted photodynamic
therapy,” Macromol. Biosci. , vol. 11, no. 1, pp. 90 –99, Jan. 2011.
[11] S. Link and M. A. El -Sayed, “Optical properties and ultrafast dynamics of metallic nanocrystals,”
Annu. Rev. Phys. Chem. , vol. 54, pp. 331 –366, 2003.
[12] Y. Sun and Y. Xia, “Gold and silver nanopa rticles: A class of chromophores with colors tunable in
the range from 400 to 750 nm,” Analyst , vol. 128, no. 6, pp. 686 –691, Jan. 2003.
[13] A. Wax and K. Sokolov, “Molecular imaging and darkfield microspectroscopy of live cells using
gold plasmonic nanop articles,” Laser Photonics Rev. , vol. 3, no. 1 –2, pp. 146 –158, 2009.

24
[14] K. Aslan, I. Gryczynski, J. Malicka, E. Matveeva, J. R. Lakowicz, and C. D. Geddes, “Metal –
enhanced fluorescence: an emerging tool in biotechnology,” Curr. Opin. Biotechnol. , vol. 16 , no. 1,
pp. 55 –62, Feb. 2005.
[15] J. R. Lombardi and R. L. Birke, “A Unified View of Surface -Enhanced Raman Scattering,”
Accounts Chem. Res. , vol. 42, no. 6, pp. 734 –742, Jun. 2009.
[16] Y. Wang and J. Irudayaraj, “Surface -enhanced Raman spectroscopy at single -molecule scale and
its implications in biology,” Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci. , vol. 368, no. 1611, Feb. 2013.
[17] Y. Zhang, K. Aslan, M. J. R. Previte, and C. D. Geddes, “Metal -enhanced Singlet Oxygen
Generation: A Consequence of Plasmon Enh anced Triplet Yields,” J. Fluoresc. , vol. 17, no. 4, pp.
345–349, Jul. 2007.
[18] K. H. Bae, S. H. Choi, S. Y. Park, Y. Lee, and T. G. Park, “Thermosensitive Pluronic Micelles
Stabilized by Shell Cross -Linking with Gold Nanoparticles,” Langmuir , vol. 22, n o. 14, pp. 6380 –
6384, Jul. 2006.
[19] M. Y. Kozlov, N. S. Melik -Nubarov, E. V. Batrakova, and A. V. Kabanov, “Relationship between
Pluronic Block Copolymer Structure, Critical Micellization Concentration and Partitioning
Coefficients of Low Molecular Mass Solutes,” Macromolecules , vol. 33, no. 9, pp. 3305 –3313,
May 2000.
[20] G. K. Sarma, S. SenGupta, and K. G. Bhattacharyya, “Methylene Blue Adsorption on Natural and
Modified Clays,” Sep. Sci. Technol. , vol. 46, no. 10, pp. 1602 –1614, 2011.
[21] G. Frens, “ Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold
Suspensions,” Nature , vol. 241, no. 105, pp. 20 –22, Jan. 1973.
[22] R. J. Green, M. C. Davies, C. J. Roberts, and S. J. B. Tendler, “A surface plasmon resonance study
of alb umin adsorption to PEO –PPO–PEO triblock copolymers,” J. Biomed. Mater. Res. , vol. 42,
no. 2, pp. 165 –171, 1998.

Multumire:

Această lucrare a fost posibilă prin sprijinul financiar oferit prin Programul Operațional
Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 -2013, cofinanțat prin Fondul Social European, în
cadrul proiectului POSDRU/107/1.5/S/76841, cu titlul „Studii doctorale moderne:
internaționalizare și interdisciplinaritate”.

25
LIST A LUCRARILOR PUBLICAT E

Articole publicate in reviste cotate ISI:

1) T. Simon , S. Boca -Farcau, A.M. Gabudean, P. Baldeck, S. Astilean, LED -activa ted
methylene blue -loaded Pluronic -nanogold hybrids for in vitro photodynamic therapy, J.
Biophotonics , 1-10 (2013) doi:10.1002/jbio.201300058, (IF=3.099, IS=0.993) ;
2) T. Simon , S. Boca, D. Biro, P. Baldeck, S. Astilean, Gold –Pluronic core –shell
nanoparticle s: synthesis, characterization and biological evaluation , J. Nanopart . Res. 15
(2013) 1578. (IF= 2.175, FRI=0.673) ;
3) T. Simon , S. Boca, S. Astilean, Pluronic -Nanogold hybrids: Synthesis and tagging with
photosensitizing molecules , Colloids Surf. B 97 (2012) 77-83. (IF= 3.554, IS=0.772) ;
4) M. Iliut, A.M. Gabudean , C. Leordean , T. Simon , C.-M. Teodorescu , S. Astilean,
Riboflavin enhanced fluorescence of highly reduced graphene oxide , Chem . Phys . Lett. (2013 ),
manuscris accepta t (IF=2.145, IS=0.687);
5) B. Marta, E. Jakab, M. Potara, T. Simon , F. Imre -Lucaci, L. Barbu -Tudoran, O. Popescu,
S. Astilean, Pluronic -coated silver nanoprisms: synthesis, characterization and their
antibacterial activity , Colloids Surf. A (2013 ), doi:10.1016/j.colsurfa.2013.08.076, (IF=2 .108,
IS=0.585) ;
6) T. Gallavardin, M. Maurin, S. Marotte, T. Simon , A. M. Gabudean, Y. Bretonnière, M.
Lindgren, F. Lerouge, P. L. Baldeck, O. Stéphan, Y. Leverrier, J. Marvel, S. Parola, O. Maury
and C. Andraud, Photodynamic therapy and two -photon bio -imagi ng applications of
hydrophobic chromophores through amphiphilic polymer delivery , Photochem. Photobiol. Sci.
10 (2011) 1216 -1225. ( IF= 2.584 , IS=0.746).

Articole publicate in alte reviste :

1) Z. Benyey, E. Vanea, T. Simon , S. Cavalu, V. Simon, Tetracycline loading and release from
bioactive glass microspheres, STUDIA UBB PHYSICA, LVI, 2, 2011