Programul de studii: LABORAOR CLINIC [623704]

Programul de studii: LABORAOR CLINIC

LUCRARE DE LICENȚĂ

AUTOR,
Diana NĂSTASE

COORDONATOR,
Prof. Dr. Chim. Mihaela BADEA

BRAȘOV, 2018

Programul de studii: LABORATOR CLINIC

STRATEGII INOVATIVE DE DETECȚIE
CROMATO GRAFICĂ PE STRAT SUBȚIRE
A MICOTOXINELOR

LUCRARE DE LICENȚĂ

Autor: Diana NĂSTASE

Coordonator: Prof. Dr. Chim. Mihaela BADEA

Brașov, 2018

Cuprins
PARTEA GENERALĂ
1. Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 2
2. Cromatografia ca metodă de separare ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 3
2.1. Generalități ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 3
2.2. Istoria cromatografiei ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 4
2.3. Schema unui cromatograf și elementele unei cromatograme ………………………….. ………………………. 6
2.4. Clasifi carea cromatografiei ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………….. 10
2.4.1. Clasificarea cromatografiei de lichide ………………………….. ………………………….. ………………………… 11
2.4.2. Cromatografia de schimb ionic (IEC) ………………………….. ………………………….. ………………………….. 13
2.4.3. Cromatografia de permeație prin gel (excludere sterică) (GPC) ………………………….. …………… 14
2.4.4. Cromatografia de afinitate ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 15
2.5. Aplicațiile cromatogr afiei ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 16
3. Cromatografia pe strat subțire (TLC – Thin Layer Chromatography) ………………………….. ………………….. 17
3.1. Generalități ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 17
3.2. Definiții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 17
3.3. Principiul cromatografiei pe strat subțire ………………………….. ………………………….. ………………………….. 19
3.4. Valoarea Rf (fact or de retenție) a substanțelor separate ………………………….. ………………………….. … 19
3.5. Faza staționară și faza mobilă ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 20
3.6. Aplicații ale cromatografiei pe strat sub țire………………………….. ………………………….. ………………………. 22
3.7. Avantajele cromatografiei pe strat subțire ………………………….. ………………………….. ……………………….. 22
4. Micotoxine ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .23
4.1. Noțiuni generale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 23
4.2. Tipuri de micotoxine ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……23

Partea specială
5. Studiu pr ivind nivelul de cunoștințe al studenților privind tehnicile cromatografice ……………………… 26
5.1. Scop ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….26
5.2. Selecția loturilor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 26
5.3. Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 27
5.4. Concluzii partiale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 52
6. Metoda cromat ografiei pe strat subțire pentru detecția micotoxinelor ………………………….. ……………… 53
6.1. Detecția de Aflatoxină B2 (AB2) și Ochratoxină A (OTA) prin cromatografia pe strat subțire ..53
6.1.1. Principiul metodei ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .53
6.1.2. Reactivi și materiale necesare ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 54
6.1.3. Mod de lucru ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 57
6.1.4. Interpretarea rezultatelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 61
6.1.5. Concluzii parțiale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …74
6.2. Metoda enzimatică ELISA pentru detecția Aflaoxinei B1 (AB1) ………………………….. …………………… 75
6.2.1. Principiul metodei ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .75
6.2.2. Reactivi și materiale neces are ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 75
6.2.3. Mod de lucru ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 76
6.2.4. Interpretarea rezultatelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 78
6.2.5. Concluzii parțiale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …80
7. Concluzii finale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………….. 81
Anexa 1 ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 82
Referinț e bibiliofice ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………………. 91

2
PARTEA GENERALĂ
1. Introducere
Cromatografia pe strat subț ire (CSS), sau Thin Layer Chromatography (TLC), este o tehnică
cromatografică utilizată pentru separarea amestecurilor non -volatile. Această tehnică este realizată pe o
placă cromatografică ce este confecționată din sticlă, plastic sau folie de aluminiu, care este acoperită cu
un strat subțire de material adsorbant, de obicei silicagel, oxid de aluminiu sau celuloză. Acest strat de
adsorbant este cunos cut ca faza staționară.
Această metodă de separare f uncționează pe același principiu ca toate celelalte tehnici ale
cromatografiei: un component va avea afinitate pentru faza mobilă sau staționară, iar acest fapt
influențează viteza de migrare. Scopul ace stei tehnici este de a obține spoturi bine definite, bine separate.
TLC este o metodă analitică pe scară largă, folosită datorită simplității, costului relativ scăzut,
sensibilității crescute și datorită timpului scăzut de separare a compușilor. Proceduri le cromatografiei pe
strat subțire sunt, prin urmare, preferate, fi ind capabile să ofere informații semi – cantitative și calitative.
Aplicațiile acestei metode sunt în variate domenii precum: detecția micotoxinelor, separarea
aminoacizilor, clasificarea f racțiilor lipidice și multe altele. Micotoxinele sunt metaboliți secundari produși
de fungi filamentoși precum Aspergillus sau Fusarium. Ace staea apar în cereale în condiții de umiditate,
dar pot contamina și alte alimenta precum: arahide, boabe de cafea, fasole, struguri, fructe uscate,
amenințând siguranța agroalimentară și sănătatea uma nă. Acestea au efecte teratogene , mutagene sau
cancerigena, provocând malformații, anomalii, modificări genetice sau apariția cancerului.
Lucrarea este structurată în dou ă părți. Prima parte, partea generală, ce are ca scop cercetarea
literaturii de specialitate cu privire la tehnicile cromatografice în general și cromatografia pe strat subțire
în mod special, dar și referitor la micotoxine și efectele lor asupra omului.
Cea de -a doua parte, partea specială, are ca scop determinarea limitelor de detecție ale
micotoxinelor prin analiza și optimizarea diferitelor metode de detecție : cromatografia pe strat subțire,
dar și metoda enzimatică (ELISA). Un alt scop al acestei lucră ri constă în evaluarea nivelului cunoștințelor
studenților cu privirea la cromatografie ca metodă de separare în general și aplicabilitatea ei în domeniul
analizei micotoxinelor.

3
2. Cromatografia ca metodă de separare

2.1. Generalități
Procesele de separare inclu d extracția metalelor din mi nereuri, parfumurilor din flori,
coloranți lor din plante, evaporarea apei din mare pentru a obține sare, și altele. În laborator, chimiștii
folosesc cromatografia pentru a separa amestecuri de hidrocarburi ușoare și pentru a det ermina
compozițiile amestecurilor complexe [1].
Cromatografia este o metodă fizico – chimică de separare, ce se bazează pe principiul în care
amestecul, al căror molecule vor fi separate, este distribuit între două faze nemiscibile , acestea fiind: faza
staționară (Fs ), denumită și sorbent, și faza mobilă (Fm). Separarea se datorează caracteristicilor
moleculare legate de adsorbție, partiție și afini tate sau datorită diferențelor dintre greutățile lor
moleculare. Datorită acestor diferențe, unele molecule al e amestecului rămân mai mult timp ancorate în
faza staționară și se mișcă lent în sistemul de cromatografie, în timp ce alte molecule părăsesc mai rapid
sistemul. Modul de interacțiune al diferitelor componente cu faza staționară și cea mobilă se poate
mod ifica în funcție de procesul cromato grafic utilizat [2, 3].
Rezultatele repartiției compușilor amestecului între cele două faze pot fi: părasirea coloanei
cromato grafice a compușilor la timpi diferiți sau deplasarea compușilor cu viteze diferite printre ce le
două faze. Procesul cromato grafic se desfășoară ca rezultat al acțiunilor repetate de sorbție / desorbție
în timpul deplasării componentelor amestecului de -a lungul fazei staționare. În aceste procese fizice
intervin difuzia liberă și transferul de mas ă, iar pentru acestea s -a inventat noțiunea de taler teoretic (H)
prin lungimea de coloană necesară pentru a stabili un singur echilibru sorbție – desorbție . Numărul
talerelor teoretice indică eficiența procesului cromato grafic . Înălțimea talerului teoreti c se definește ca
fiind: H = L / N, unde L reprezintă lungimea coloanei, iar N, numărul echivalent de talere teoretice. Se
definește un coeficient de distribuție sau de repartiție (K ), egal cu raportul concentrațiilor compusului în
faza staționar ă (Cs) și în cea mobilă (Cm) [4]:
K = Cs / Cm

4
Inițial, tehnicile cromatografice au fost utilizate pentru separarea substanțelor bazată pe
culoarea lor. În timp, aria lor de aplicare s -a extins considerabil, iar acum este considerată ca fiind o
metodă de separare foarte sensibilă și eficientă [2].

2.2. Istoria cromatografiei
Prima utilizare a cromatografiei a fost cea a chimiștilor de colorare, care au testat amestecurile
lor de coloranți, scufundând bucăți de hârtie de filtru într -o cuvă cu colorant. Prin capilaritat e, soluția de
colorant a migrat prin materialul inserat, iar componentele colorantului au produs benzi de culori diferite.
În secolul al XIX – lea, mai mulți chimiști germani au efectuat diferite experimente pentru a explora acest
fenomen, prin care s -a observat dezvoltarea unor inele colorate concentric (Figura 2.2.1.) , prin picurarea
unei soluții de compuși anorganici, în centrul unei hârtii de filtru. Pe această temă a fost publicat și un
tratat în anul 1861, de către Fr iedrich Goppelsröder, descriind ace astă metodă pe care o denumește
„analiză capilară ” [5].

Figura 2.2.1 Inele – Liesegang [6]

Descoperirea cromatografiei este atrib uită botanistului rus Mikhail Semyonovich Tsve t, ce în
anul 1906 , a separat ci nci pigmenți, carotenoizi și clorofile, dint r-un extract de pigmenți ai unei frunze
(Figura 2.2.2 .) [7]. Acesta a descris o metodă ce este utilizată și astăzi în aceeași formă esențială. A
împachetat o coloană de sticlă verticală cu un material adsorbant precum: alumina, silica sau zahăr pudră,
a ad ăugat o soluție de pigment din plante în partea superioară a coloanei și a spălat pigmenții prin
coloană cu un solvent organic. Pigmenții s -au separat înr -o serie de benzi colorate diferit pe coloană,

5
separate de regiuni complet depig mentate. Deoarece Mikh ail S. Tsve t utiliza substanțe colorate, a numit
această metodă „ cromatografie ”, termenul provenind din limba greacă („Kroma” de la culoare și
„graphian” de la scriere). Prin urmare, rezultatele acestei analize sunt scrise în culoare [5, 8, 9] .

Figura 2. 2.2. Ilustrații din hârtia lui Mikhail S. Tsvet 1906. (a) Aparatură pentru utilizarea simultană a cel
mult cinci coloane. Partea inferioară a pâlniilor de sticlă (2 -3 mm i.d. și 20 -30 mm lungime) simbolizează
coloana împachetată. (b) Aparatură pantru probe mai mari (1 -3 cm i.d., lungimea de împachetare: 5 -9
cm). (c) Separare cromato grafic ă a pigmenților plantei desenat de Mikhail S. Tsvet. Faza staționară:
carbonat de calciu (CaCO 3); eluent: sulfură de carbon (CS 2) [7]

În anul 1931, chimistul german Rich ard Kuhn și studentul său, chimistul francez Edgar Lederer,
au utilizat această metodă, pentru a analiza numeroase materiale biologice importante. În anul 1941, doi
chimiști britanici, Archer J. P. Martin și Richard L. M. Synge, au început un studiu referi tor la compoziția de
aminoacizi a firelor de lână. Tehnica inițială pe care au utilizat -o, numită distribuția lichid -lichid în
contracurent , nu a reușit să le ofere o separare adecvată, ulterior folosind o metodă alternativă. În cea
de-a doua metodă, primu l lichid a fost strâns legat de un solid fin granular, împachetat într -un tub de
sticlă; cel de -al doilea lichid fiind nemiscibil cu primul, a fost filtrat prin el. Faza solidă a fost reprezentată
de silica gel, iar cea mobilă, de cloroform. Cu toate că me toda lor era mecanic identică cu abordările lui
Mikhail S. Tsvet, a fost inovatoare prin faptul că a implicat conceptul de lichid staționar, apa, susținut de
un solid inert, silica, astfel încât moleculele dizolvate au fost împărțite între lichidul stațion ar și o fază
mobilă lichidă separată, cloroform. Această tehnică a primit denumirea de cromatografie de repartiție , iar
în anul 1952 , Archer J. P. Martin și Richard L. M. Synge primesc Premiul Nobel pentru munca lor. Aceștia

6
au sugerat faptul că faza mobil ă se poate afla și în stare gazoasă. La aproape zece ani de la descoperirea
celor doi oameni de știință, Archer J. P. Martin în colaborare cu chimistul britanic Anthony T. James au
inițiat un studiu referitor la cromatografia de repartiție gaz -lichid [5, 10, 11] .
Sistemul inițial de cromatografie de repartiț ie, a prezentat dificultăți deoarece silica gelul nu
avea proprietatea de reproductibilitate, iar coloanele nu erau uniforme. Din aceste motive, Archer J. P.
Martin și colegii săi, în anul 1940, au vru t să dezvolte o nouă tehnică, a cărei fază staționară a fost o foaie
de hârtie de filtru. Hârtia a fost considerată ca fiind apă legată de celuloză, furnizând încă o metodă de
repartiție, prin urmare această metodă a primit denumirea de cromatografie pe hâ rtie [5].

2.3. Schema unui cromatograf și e lementele unei cromatograme
În cazul cromatografiei pe coloană au loc procese specifice care permit s epararea compușilor, ca
exemplu: adsorbție, schimb ionic, permeație prin gel, iteracții receptor – recepta t [1]. Cu ajutorul unui
sistem de pompare (injectare) se introduc în coloana cromato grafic ă faza mobilă și componenții de
separat. La nivelul coloanei au loc procese specifice și compușii părăsesc, pe rând, coloana . Se utilizează
detectori specifici care a nalizează anumite proprietăți fizico – chimice ale compușilor, iar rezultatele sunt
afișate sub forma unor cromatograme (Figura 2.3.1 .) [4].

Figura 2.3.1. Schema bloc a cromatografiei de lichide [4]
Detector Eluent Injector Probă
Coloană Termostat
Înregistrator

7
Cu cât analitul posedă o structură mai apropiată de structura uneia din cele două faze, cu atât
acesta va rămâne mai mult timp în faza respectivă . Dacă faza staționară este fixată într-o coloană
cromato grafic ă, faza mobilă se deplasează prin aceasta și antrenează analiții din proba de analizat. Acest
proces de depl asare se numește eluție [11] .
Între cele două faze nu există interacții de natură fizică sau chimică, de aceea momentul în care
faza mobilă străbate faza staționară se numește timp mort (t M), iar timpul necesar unui analit pentru
traversarea f azei staționare, sau timpul scurs de la introducerea analitului în coloană pâna la ieșirea
acestuia din coloană, se numește timp de retenție (t R) ce va fi mai mare decăt timpul mort . Prin urmare,
timul de retenție este suma dintre timpul mort și timpul cât stă analitul în faza staționară (t R`) [3]:
tR = t M + t R`

Cu cât analitul este mai asemănător structural cu faza mobilă, cu atât va trece mai ușor prin
faza staționară și va avea timpi de retenție mici; cu cât analitul posedă structuri mai apropiate de faza
staționară, cu atât va rămâne mai mult timp fixat pe aceasta , se va deplasa mai greu prin coloana
cromato grafic ă și va avea timp de retenție mai mare [4].
În general faza staționară prezintă polaritate ridicată comparativ cu cea mobilă (FS > FM). Din
această cauză compușii nepolari vor rămâne mai mult timp în faza mobilă și vor părăsi coloana
cromato grafic ă mai repede, iar analiții mai hidrofili, sau puternic polari, vor interacționa mai mult cu faza
staționară, vor rămâne mai mult timp la nivelul aces teia și vor părăsi coloana cromato grafic ă mai greu
(vor ave a timp ul de retenție mai mare) [12] .
Semnalele analitice obț inute prin tehnicile cromato grafic e sunt picuri cromato grafic e de tip
Gauss, acestea indicând concentrația analitului într -un interval de timp (Figura 2.3.2. ) [4]. Valoarea
timpului de retenție corespunde valorii maxime a picului și pentru fiecare analit în parte are o valoare bine
determinată, tabelată. Din această cauză, valoarea timpului de retenție reprezintă exprimarea calitativă a
analitului. Cantitativ, analitul poate fi caracterizat fie de valoarea înălțimii picului (h) corespunzător, dacă
picul e simetric, fie de aria de sub curba acestuia (fiind direct proporțională cu concentrația).

8

Figura 2.3.2. Elementele unei c romatograme , unde t 0 – reprezintă timpul (momentul) în care se realizează
pătrunderea probei în coloana cromato grafic ă; t M – timpul mort, care reprezintă timpul necesar fazei
mobile să străbată întreaga coloană; t R – timpul de retenție, este specific fiecă rui analit dacă procesul
cromato grafic se desfășoară în condiții identice; h – înălțimea picului [4]

Când în proba ce urmează a fi analizată există mai mulți analiți, există posibilitatea ca picurile
cromato grafic e să se suprapună, fiind o rezoluție slab ă de separare . Pentru scăderea probabilității
suprapunerii picurilor cromato grafic e, este necesar ca lărgimea bazei picului să fie cât mai mică. Pentru
caracterizarea capacității de separare din procesele cromato grafic e s-a introdus noțiunea de rezoluție
(Rs), ca fiind un raport dintre diferența timpilor de retenție pe care le dețin două picuri alăturate și suma
deviațiilor standard corespunzătoare picurilor, multiplicată de două ori [4]:
Rs = ( tR2 – tR1 ) / 2 ( σ1 + σ2 )

Pentru ca rezoluția de separare s ă fie adecvată, valoarea a cestui raport trebuie să fie: Rs ≥ 1,2 .
Atunci când valoarea revoluției este mai mică de 1,2 , picurile cromato grafic e consecutive au un grad de
separar mic (Figura 2.3.3. (a)). Pentru creșterea rezoluției de separare se pot aplic a probei respective două
soluții: tR tM h
t0 Injectarea
probei
Timp (minute) Semnal

9
– prin modificările condițiilor cromatografie, precum: faza staționară, faza mobilă, temperatura, se
tinde micșorarea substanțială a deviației standard corespunzătoare fiecărui semnal analitic în așa
mod încât lărgimea bazei semnalului să scadă puternic și cele două picuri să nu se mai suprapună
(Figura 2.3.3. (b));
– prin modificări, ca și compoziție, în special a fazei mobile și a celei staționare, se realizează o
diferențiere foarte mare între timpii de retenție corespunzăt ori celor două picuri menținându -se
deviația standard și lărgimea bazei picului, îmbunătățindu -se rezoluția prin eliminarea
superpozabilității celor două semnale analitice (Figura 2.3.3. (c)) [4].

Figura 2.3.3 . Creșterea capacității de separar e cromato grafic ă: (a) picuri cromato grafic e cu grad de
separare mic, valoarea rezoluției mai mică de 1,2; (b) micșorarea deviației standard corespunzătoare
fiecărui analit, scade lărgimea bazei semnalului, iar cele două picuri nu se mai suprapun; (c) difer ențiere
mare între timpii de retenție corespunzători celor două picuri, se mențin deviația standard și lărgimea
bazei picului și se îmbunătățește rezoluția prin eliminarea suprapunerii celor două semna le analitice [4]

tR2 tR1
Timp (minute) Semnal
tR2 tR1 tR1 tR2
(b) (a)
(c)

10
2.4. Clasificarea cromatografiei
Tehnic ile cromato grafic e de separare se împart în două mari categorii:
– tehnici ce se bazează pe afinitatea diferită a componenților, printre care sunt amintite:
cromatografia de absorbție, de afinitate, de repartiție și de schimb ionic;
– tehnici ce se bazează pe mărimea diferită a componenților, printre care este amintită
cromatografia de excludere sterică [13] .
Faza mobilă este un fluid (lichid sau gaz) nemiscibil cu faza staționară și dependent de natura
fizică a acesteia [4]. O clasificare mai amanunțită, în fu ncție d e această fază este repreze ntată în Figura
2.4.1. [13] .

Figura 2.4 .1. Clasificarea cromatografiei în funcție de natura fazei mobile [13]

Pentru separarea cromato grafic ă a diferiților co mpuși, faza staționară se prezintă sub numeroase
forme și co mpoziții chimice. În Figura 2.4 .2., este reprezentată c lasificarea tehnicilor cromato grafic e în
funcție de natura fazei staționare [1].

11

Figura 2.4.2. Clasificarea sistemelor de analiză cromato grafic ă raportat la tipul fazei staționare, în care se
prezint ă: mecanismul de separare, tehnica și d enumirea metodei cromato grafic e [1, 14]

2.4.1. Clasificarea cromatografiei de lichide
 În funcție de tipul coloanei se cunosc trei tipuri de cromatografie de lichide:
o cromatografia planară , ce poate f i: pe strat subțire (TLC ) sau pe hârtie (PC) ;
o cromatografia capilară ;
o cromatografia pe coloană [4].

12
 În funcție de natura procesului fizico – chimic ce se produce în coloană :
o cromatografia prin schimb ionic, prin interacțiile de natură electrostatică se realizează
separarea compuș ilor amestecului ;
o cromatografia de excludere sterică, sau permeație prin gel , pe baza formelor și
dimensiunilor moleculare s e realizează separarea;
o cromatografia de afinitate, separarea se realizează datorită recunoașterii și legării
speciilor moleculare pe bază de complementaritate [4].
 În funcție de natura fazei staționare, se cunosc:
o cromatografia lichi d – solid ;
o cromatografia lichid – lichid cu fază normală , în care polaritatea fazei staționare este mai
mare decât polaritatea fazei mobile;
o cromatografi a lichid – lichid cu fază inversă , în care polaritatea fazei staționare este mai
mică decât polaritatea fazei mobile [4].
 În funcție de scopul analize i:
o cromatografia preparativă , cu scopul de a purifica un singur analit dintr -o probă
complexă ;
o cromatograf ia analitică , are scop calitativ și cantitativ și necesită volume mici de probe,
de ordinul µL – lor [4].
 În funcție de modul de eluție:
o cromatografia planară (TLC) , prin capilaritate, componenții probei de analizat sunt
antrenați de faza mobilă prin cea s taționară ;
o cromatografia de înaltă performanță (HPLC) , eluția se realizează la presiuni mari, până la
200 de atmosfere, iar diametrele particulelor fazei staționare fiind sub 10 µm ;
o cromatografia convențională pe coloană , în care eluția se realizează la pr esiune
atmosf erică de până la două atmosfere [4].

13
2.4.2. Cromatografia de schimb ionic (IEC)
Această tehnică se aplică pentru separarea compușilor încărcați electric , faza staționară fiind
confecționată dintr -un gel natural sau sintetic la nivelul căruia există grupări funcționa le încărcate electric
la valori ale pH -ului bine determinate . Grupările funcționale prezente pe macromoleculele fazei
staționare se pot încărca negativ la valori ale pH -ului mai mari decât valoarea punctului izoelectr ic (pI), iar
faza sta ționară se numește anionit (pH > pI), în timp ce alte grupări funcționale se pot încărca pozitiv la
valori ale pH -ului mai mici decât punctul izoelectric, faza staționară numindu -se cationit ( pH< pI) (Figura
2.4.2.1 .) [1, 2] .

Figura 2.4.2.1 . Variația sarcinii globale a analiților dependente de valoarea pH -ului mediului [4]

Dacă analiții se încarcă electric identic cu grupările funcționale ale fazei staționare, aceștia nu
vor interacționa cu faza staționară, se resping, și vor fi purtați de faz a mobilă pentru părăsirea coloanei.
Ceilalți componenți d in amestecul inițial care au sarcini electrice opuse sarcinilor electrice fazei
staționare, vor reacționa cu aceasta și vor fi reținuți prin intermediul interacțiilor de natură ionică
(electrostatică ) [15]. cationit +

0

– pH Sarcina netă
pI
anionit

14
Componenții fixați pe faza staționară prin intermediul forțelor electrostatice pot fi eliminați după
ce faza mobilă a eliminat întreaga cantitate de analiți încărcați electric asemănător cu faza staționară sau
neîncărcați electric. Eliminarea se po ate realiza prin două modalități:
 șoc de forță ionică , constă în introducerea în coloană a unei soluții concentrate de electrolit, sare,
care va determina diminuarea forței electrostatice dintre analitul fixat anterior și faza staționară,
astfel, analitul va fi preluat și eliminat din coloană;
 șoc de pH, constă în modificare bruscă a valorii pH -ului fazei mobile în așa fel încât sarcina
electrică a fazei staționare să se schimbe (din pozitiv în negativ și invers), prin urmare, între
analitul fixat anliterio r și faza staționară nu se mai desfășoară ineracții de natură electroststică și
componenții pot fi antrenați în faza mobilă în vederea elimin ării din coloana cromato grafic ă [16].

2.4.3. Cromatografia de permeație prin gel (excludere sterică) (GPC)
Se aplică pent ru separarea compușilor între care există diferențe de dimensiune, de aceea se
utilizează faze staționare cu dimensiuni ale ochiurilor de rețea cunoscute și controlabile [2].
Faza staționară este întotdeauna microporoasă constituită dintr -un polizaharid r eticulat ,
natural sau artificial. Polizaharidele dețin grupări funcționale hidroxil ( -OH) libere, acestea sunt
numeroase și sunt capabile să constituie legături de hidrogen cu apa. Prin acest proces se realizează
hidratarea, prin care o masă mică de poliza harid solid care ocupă un volum mic se îmbibă cu foarte multă
apă și astfel se transformă într -un gel voluminos care deține ochiuri de rețea bine delimitate. Volumul
godeului obținut prin gonflare poate să fie de câteva mii de ori mai mare decât volumul in ițial al
polizah aridului [4].
Gelurile utilizeta în GPC se bazează pe macromolecule de celuloză modificate chimic și sunt
denumite comercial: Sephadex, Sepharol, Sephacryl, Biogel [4].
În procesele de separare cromato grafic ă prin exludere sterică, analiții din proba de analizat sunt
angrenați prin ochiurile de rețea ale fazei staționare astfel:

15
– dacă dimensiunile analiților sunt mai mici decât dimensiunile ochiurilor de rețea, aceștia au un
parcurs sinuos prin faza staționară, vor fi reținuți mai mult timp î n aceasta și o vor părăsi după un
timp de retenție cu atât mai mare cu cât dimensiunile sunt mai mici;
– dacă dimensiunile moleculelor analiților sunt mai mari decât dimensiunile ochiurilor de rețea,
componenții nu vor putea pătrunde pri n acestea, vor fi tot al excluși și vor părăsi coloana
cromato grafic ă cu atât mai repede cu cât dimensiunea lor este mai mare, re zultând un timp de
retenție mic [2, 4] .
Cromatograma procesului de separare indică semnalele analitice ale componenților în ordinea
scăderi maselor l or mol eculare, iar aria picului arată concentrația analiților din proba inițială.
Cromatografia de excludere sterică prezintă aplicabilitate în laboratorul clinic atunci când analiții posedă
dimensiuni diferite ale moeculelor și atunci când aceștia nu sunt încărcați electric. Este posibilă utilizarea
cromatografiei de excludere sterică în determinarea masei moleculare a unui analit preze nt în probă, a
cărui masă nu se cunoaște. Pentru acaesta se trasează o curbă de calibrare cu ajutorul unor molecule cu
dimensiuni bine determinate pentru care în condițiile date se măsoară volumul de eluție necesar. Cu
ajutorul curbelor de calibrare, prin interpolare, se poate afla masa moleculară a analitului necunoscut pe
baza volumului de eluție utilizat [17].

2.4.4. Cromatogra fia de afinitate
În procesul de cromatografie de afinitate se efectuează interacțiile specificice de tip : enzimă –
ligand, enzimă – cofactor, receptor – agonist (antagonist), antigen – anticorp în urma căreia rezultă
complexele antigen – anticorp (Ag Ac) [1].
Ag + A c ↔ Ag Ac

Dacă faza staționară din coloana cromato grafic ă fixează covalent una dintre speciile
imunochimice, fie antigenul, fie anticorpul și în faza mobilă se introduce amestecul de separat în care este
prezentă cealaltă specie imunochimică decât cea fixată pe faza staționară, toți componenții amestecului
vor străbate faza staționară împreună cu faza mobilă , cu excepția componentei imunochimice care va

16
interacționa cu componenta imunochimică fixată anterior, iar complexul Ag Ac rezultat va răm âne fixat
pe faza staționară până la eliminarea totală a co mponenților din matricea probei [18, 19].
Ca și în cazul cromatografiei de schimb ionic, eliberarea complexului Ag Ac fixat pe faza
staționară se efectuează în două modalități: șocul de forță ionic ă sau șocul de pH [2] . În cazul șocului de
forță ionică, interacțiile slabe dintre speciile imunochimice sunt diminuate în prezența ionilor elect rolitului
introdus, iar componenta imunochimică părăsește complexul Ag Ac și poate fi antrenată de faza mobilă
pentru eliminarea din coloană. Prin variația puternică a pH -ului fazei mobile, legăturile de hidrogen sau
dipolare constituite între cele două specii imunochimice sunt distruse și astfel, componenta
imunochimică introdusă anterior este eliberată în faza mo bilă în vederea eliberării din coloană [19].

2.5. Aplicațiile cromatografiei
– metodele cromato grafic e bazate pe repartiție sunt foarte eficiente pentru separarea și
identificarea moleculelor mici precum aminoacizi, carbohidrați și acizi grași ;
– cromatografia de afinitate este mult mai eficientă în separarea macromoleculelor precum acizi
nucleici și proteine, este utilizată pentru purificarea enzimelor, anticorpilor, hormonilor, acizilor
nucleici și proteinelor specifice;
– cromatografia de permeație prin gel se uti lizează pentru a determina greutatea moleculară a
proteinelor și pentru a micșora concentrația de sare din soluțiile proteice;
– tehnica HPLC (High – Pressure Liquid Chromatography) este utilizată pentru separarea și
identificarea aminoacizilor, lipidelor, c arbohidraților, hidrocarburilo, acizilor nucleici, proteinelor,
steroizilor , antibioticelor și altor molecule biologic active ;
– cromatografia pe hârtie este utilizată : în separarea proteinelor și în studiile legate de sinteza
proteinelor , pentru a determi na anumite tipuri de zaharuri și aminoacizi în fluidele biologice ;
– cromatografia gaz – lichid este utilizată pentru sapararea de: alcool, ester, lipide, grupări amino și
pentru observarea interacțiilor enzimatice ;
– gaz – cromatografia este utilizată pentru separarea unor cantități foart mici de analiți precum:
steroizi, barbiturice sau lipide [2].

17
3. Cromatografia pe strat subțire (TLC – Thin Layer Chromatography)

3.1. Generalități
Deși a fost descoperită mai târziu decât cromatografia pe coloană și cromatografia p e hârtie,
cromatografia pe strat subțire s -a impus într -un timp foarte scurt ca o metodă de analiză fizico -chimică
de mare utilitate, atât î n cercetare cât și în producție [20].
Primele experimentări datează din anul 1938 și aparțin cercetătorul Nikolai A . Izmailov și a
studentei sale doctorand Maria S. Schreiber. A ceastă tehnică a fost concepută pentru a înlocui
cromatografia pe coloană ce se considera a fi de o durat ă prea mare în timp, prin această nouă metodă
obținându -se rezultatele mai rapid [21]. Prin urmare, au încercat să folosească straturi subțiri de
adsorbant pe plăci mici de sticlă, adăugând doar o picătură din probă și au developat -o prin adăugarea în
picături a solventului. Cromatograma obținută consta în cercuri concentrice a substanțelor s eparate.
Aceștia au numit această metodă cromatografia spot . La aproximativ 10 ani după această descoperire,
J.E. Meinhard și N.F. Hall de la Universitatea din Wisconsin, în Madison, de asemenea au efectuat
cromatografia pe plăci de stilă acoperite cu adso rbant și au fost primii cercetători care au utilizat liantul în
prepeararea stratului de adsorbant, aceștia numind această metodă cromatografie de suprafață .
Adevărata cromatografie pe strat subțire (TLC) a fost descoperită în anul1951 de Justus G. Kirchne r [11] .

3.2. Definiții
 Adsorbant – substanță chimică de natură organică sau anorganică ce constituie faza st aționară
ce se întinde în strat subțire pe plăci de sticlă;
 Cameră de developare sau vas cromato grafic – vas în care se introduce placa cromato grafic ă
pentru developare;
 Developant sau amestec de dizolvanțu – faza mobilă formată din unul sau mai mulți dizolvanți
amestecați în anumite proporții;
 Developarea – reprezintă procesul de deplasare a fazei mobile prin granulele ce constituie faza
staționară sau suportul acesteia;

18
 Durata developării – timpul necesar ca faza mobilă să parcurgă o anumită distanță de la linia de
start, măsurată î n mm sau cm, considerată suficientă pentru realizarea separării;
 Faza staționară – adsorbanții ca atare sau diferite substanțe lichide îmbibate într -un suport s olid
adsorbant;
 Faza mobilă – developantul sau amestecul de dizolvanți;
 Frontul developantului sau frontul amestecului de dizolvanți – linia de delimitare a zonei
străbătută de developant pe suprafața adsorbantu lui;
 Liant – substanța folosită pentru fixarea adsorbantului pe placa de sticlă (exemplu: sulfat de
calciu, amidon, etc.);
 Migrare – deplasarea substanțelor din amestecul de separat, împreună cu faza mobile, de -a
lungul fazei staționare;
 Pată (spot) sau zo na de substanță – poziția delimitată a unei subst anțe pe suprafața
adsorbantului;
 Placă – placă din sticlă de diferite dimensiuni pe care se aplică adsorbanții;
 Placă cromato grafic ă – placă din sticlă împreună cu stratul de adsorbant, înainte și după aplic area
substanțelor de separat;
 Plăci industriale – plăci cromato grafic e gata preparate cu o anumită fază staționară;
 Rezouție – gradul de separare a două sau mai multe substanțe dintr -un amestec, apreciat în
funcție de aspectul petelor o bținute;
 Start sau l inie de start – punctul de aplicare a substanțelor înainte de începerea developării , iar
toate punctele de aplicare a diferitelor probe se află pe aceeași linie;
 Valoarea Rf – valoarea numerică a raportului între distanța parcursă de o zonă de substanță și
distanța parcursă de developant, măsurarea se realizează în mm sau cm, de la start până în
centrul petei, respectiv până la frontul de developare;
 Viteza de migrare – distanța parcursă de faza mob ilă în unitate de timp (cm / min) [20].

19
3.3. Principiul cromat ografiei pe strat subțire
Această tehnică este o metodă atât calitativ ă, cât și semi -cantitativă [22]. Mecanismul de
separare se bazează pe distribuția diferită a componenților unui amestec între cele două faze: faza
staționară, ce poate fi un solid adsorb ant sau lichid depus pe suprafața unui adsorbant și faza mobilă, ce
este lich idă, străbătând faza staționară [23].
În funcție de natura fazei staționare se consideră două tipuri de cromatografie pe strat subțire:
– de adsorbție, solid – lichid
– de repartiție, lichid – lichid [20].
Componenții amestecului de separat sunt antrenați de către faza mobilă parcurgând astfel faza
staționară (Figura 3.3.1 .). Viteza lor de migrare este diferită, depinzând de modul în care componenții se
distribuie înrte cele două faze. Cu cât componentul este mai puțin adsorbit pe faza staționară, cu atât
viteza sa de migrare este mai apropiată de cea a fazei mobile, iar cu cât componentul este mai puterni c
adsorbit, cu atât moleculele sale vor sta un timp mai îndelungat imobile, adsorb ite pe suprafața fazei
staționare și durata antrenării de către faza mobilă va fi mai scurtă rezultând o distanță parcursă î n
unitate de timp mai mică [24].

Figura 3.3.1. Principiul cromatografie pe strat subțire: 1. reprezintă linia de start unde se apl ică spoturile
din mixul de analiți; 2. și 3. reprezintă distanța parcursă de analiții separați din proba inițială; 4. reprez intă
frontul de developare [25]

3.4. Valoarea Rf (factor de retenție) a substanțelor separate
Valoarea Rf se utilizează p entru determi narea poziției substanțelor pe cromatogramă , după
separare și identificare și pentru caracterizarea și diferențierea lor (Figura 3.4.1.) . Aceasta măsoară viteza
de deplasare a zonelor de substanță față de cea a frontului de devel opant [26].

20

Figura 3.4.1. Formula factorului de retenție (Rf), unde X s – reprezintă distanța de la start până la punctul
de concentrație maximă a unei zone de substanță; iar X D – reprezintă distanța parcursă de frontul
developantului în același timp [20]

3.5. Faza staționară și faza m obilă
În cromatografia pe strat subțire, separarea substanțelor este determinată de interacțiunile
dintre moleculele fazei staționare, substanței de separat și fazei mobile. În timp ce numărul adsorbanților
utilizați direct ca fază staționară, sau ca supor t pentru o fază stațonară lichidă este relativ redus, numărul
dizolvanților și amestecurilor de dizolvanți care se pot utiliza pentru developare este foarte mare. Pentru
un același adsorbant, se pot folosi mai mulți developanți potriviți . Pentru ca un adso rbant să poată fi
utilizat în cromatografia pe strat subțire , trebuie să îndeplinească anulmite condiții:
– să nu reacționeze cu substanțele de separat sau cu developantul;
– să reziste la temperaturi de 100șC și pest;
– să prezinte o suprafață activă, utilizată fie direct în TLC de adsorbție, fie indirect în TLC de
repartiție prin intermediul unei faze stașionare lichide;
– să aibă o supraf ață specifică mare, respectiv o granulație fină (sub 100 µm) și un număr mare de
pori de diametru mic, deoarece viteza de depl asare a developantului se realizează în funcție de
dimensiunea particulelor [20].

21
Adsorbanții anorganici cei m ai utilizați sunt: silicagelul (Figura 3.5.1.) , de diferite calități și tipuri
comerciale, oxidul de aluminiu, kieselgurul, oxidul de magneziu, si licatul de magneziu și talcul. Adsorbanții
organici, cei mai întrebuințați sunt: pulberea de celuloză de diferite tipuri comerciale, poliamida,
sephadexul și rășinile schimbătoare de ioni [27, 28].

Figura 3.5.1 . Structură silica [29]

Suporturile plăcilo r cromato grafic e au rolul de a menține intacte proprietățile stratului subțire și
de a conferi plăcilor rezistență mecanică. Acestea trebuie să fie inactive chimic la acțiunea fazei mobile
sau a reactivilor de vizualizare, să reziste la temperaturile la ca re se pulverizează uneori plăcile
cromato grafic e (100 – 180șC), să aibă suprafața lucioasă, uniformă și dreaptă fără abateri de la
planaritate. Stic la este suportul care îndeplinește cea mai mare parte din aceste cerințe, de aceea are cea
mai largă întrebu ințare. La realizarea unei bune separări trebuie să se țină cont de unele condiții pe ca re
fazele mobile trebuie să le î ndeplinească:
– solvenții care compun faza mobilă trebuie să fie cât mai puri, pentru a nu afecta
reproductibilitatea;
– faza mobilă nu treb uie să afecteze chimic sau să solu bilizeze supor tul cromatoplăcii, adsorbantul ,
liantul sau componenții separați ;
– faza mobilă multicomponentă nu se va întrebuința în mod repetat, deoarece raportul între
dizolvanții volatili și cei mai puțini vol atili este modificat continuu [30].

22
3.6. Aplicații ale cromatografiei pe strat subțire
Aplicațiile cromatografiei pe strat subțire sunt numeroase, printre care se află și:
– detecția micotoxinelor [ 31, 32];
– utilizare în cazul medicamentelor falsificate care conțin ingredi ente active diferite față de c ele
declarate [22, 33];
– separarea aminoacizilor [28];
– detectare a oligozaharidelor urinare [34];
– extracția nutraceuților (produs purificat s au izolat) din spirulină (alge albastre – verzi) [35];
– clasificarea fracțiilor și speci ficarea lipidielor [27];
– este utilizată din ce în ce mai mult pentru a determina originea botanică, puterea și potențialul de
aromă din materialele vegetale (ex. ierburi, condimente) [27];
– determinarea acizilor biliari indi viduali în lichidele biologice [36];
– determinarea pesticidelor [37];
– analiza extractelor de plante pentru identificarea compuș ilor antimicrobieni [38].

3.7. Avantajele cromatografiei pe strat subțire
În practica bioorganică, separarea substanțelor este o parte importantă și esențială a analiz ei
surselor organice. Dintre numeroasele metode de separare, cromatografia pe strat subțire este bine
cunoscută și folosită pe scară largă în tehnicile preparative și analitice. Aceasta permite izolarea rapidă și
ieftină și identificara unei varietăț i de s ubstanțe necunoscute [35].
Spre deosebire de alte metode cromato grafic e, aparatura și accesoriile folosite sunt mai ușor de
realizat și procurat, de asemenea , nu sunt pretențioase la păstrare și utilizare. Un alt avantaj este acela
că pot fi prelucra mai m ulte probe în același timp [30].

23
4. Micotoxine

4.1. Noțiuni generale
Micotoxinele sunt metaboliți secundari produși de fungi filamentoși precum Aspergillus sau
Fusarium . Apariția micotoxinelor în hrana oamenilor sau a animalelor este un potențial pericol pent ru
sănătate . În condiții umede, cerealele sunt vulnerab ile la infecții cu ciuperci [39, 40].
Termenul de micotoxină derivă de la grecescul „mykes”ce înseamnă ciupercă (fung) și latinescul
„toxicum” ce înseamnă otravă [30].
Multe micotoxine sunt extrem de t oxice și au fost dovedite ca fiind teratogene, mutagene și
cancerigene. Cele mai cancerigene micotoxine găsite cel mai frecvent în cereale sunt: Aflatoxina B1 (AB1),
Ochratoxina A (OTA), Toxina T-2 (T -2) și Zearaleno ne (ZEN). AB1 a fost verificată ca avâd potențial în
provocarea can cerului de ficat, iar OTA are capacitatea de a provoca intumescenț a (umflarea) hepatică și
renală [41].

4.2. Tipuri de micotoxine
Micotoxicozele pot fi provocate de : aspergili (aflatoxicoză, ochratoxicoză, clavacitoxicoză,
stergimat ocistinotoxicoză), fusarii, penicilini [42, 43].
Aflatoxinele sunt un grup de mico toxine, metaboliți secundari produși de Aaperrgillus flavus și A.
Paraditicus. Printre aceste, aflatoxina B1 (Figura 4.2.1 .), aflatoxina B2 (Figura 4.2.2.) , aflatoxina G1 (Figura
4.2.3.) , aflatoxina G2 (Figura 4.2.4.) , aflatoxina M1 (Figura 4.2.5.) și aflatoxina M 2 (Figura 4.2.6.) , sunt
considerate cangerigene umane de grup 1 de către Agenția Internațională de Cercetare a Cancer ului încă
din anul 1993, datorită hepatotoxicități i, teratogenității, mutagenității și carcinogenității. Aflatoxinele
contaminează alimente precum: arahidele, orezul, porumbul și orzul, amenințân grav siguranța
agroalimentară și sănătatea umană [44].

24

Figura 4.2.1. Aflatoxina B1 – structură [45, 46] Figura 4.2.2. Aflatoxina B2 – structură [45, 47]

Figura 4.2.3. Aflatoxina G1 – structură [45] Figura 4.2.4. Aflatoxina G2 – structură [45]

Figura 4.2.5 . Aflatoxina M1 – structură [45, 47] Figura 4.2.6 . Aflatoxina M2 – structură [45]

Ochratoxina A (OTA) (Figura 4.2.7.) este o micotoxină produsă de Aspergillus ochraceus,
Aspergill us niger și Penici llium verrucosum, ce contaminează alimente precum: cereale, boabe de cafea,
fasole, struguri și fructe uscate. OTA este una dintre cele mai toxice și mai răspândite compo nente din
grupul ochratoxinelor. Aceasta poate avea efecte toxicologice specifice prec um: nefrotoxic, teratogenic,

25
neurotoxic, hepat otoxic și imunotoxic și se consideră faptul că ar crește stresu l oxidativ la nivel celular
[48, 49].

Figura 4.2.7 . Ochratoxina A – structură [46]

Toxina T -2 (Figura 4.2.8.) , o trichotechenă de tip A, este produsă în principal de specia
Fusarium. Este un contaminant omniprezent al cerealelor și al alimentelor procesate, care apar în special
în zone le climatice reci sau în condiții de depozitare umedă. Manifestările acestei toxicități sunt: greață,
amețeli, frisoane, vărsături și dureri abdominale, sindrom de șoc. T -2 este asociat ă cu afectarea acidului
dezoxiribonucleic (ADN), inducerea apoptozei și inhibarea sintezei proteinelor [50].

Figura 4.2.8 . Toxina T -2 – structură [51]

26
Partea specială
5. Studiu privind nivelul de cunoștințe al studenților privind tehnicile cromato grafice

5.1. Scop
Scopul chestionarului este de a evidenția cunoștințele studenț ilor cu privire la cromatografi e, ca
metodă de separare în general și ca aplicații speciale în domeniul analizei micotoxinelor.
Chestionarul (Anexa 1) este format din 30 de întrebări cu răspus simplu sau multiplu și 18
întrebări cu răspuns tip Adevărat / F als.

5.2. Selecția loturilor
Loturile de studiat sunt formate din studenți de la programele de studiu : licență și master,
diferiți ani și diferite specializări. Chestionarele au fost distribuite studenților după orele de curs sau
laborator, rezultând o distri buție foarte variată, atât între cele două loturi, cât și între specialzările din
fiecare lot în parte.
Primul lot este format din 90 de studenți din cadrul Facultății de Alimentație și Turism,
Universitatea Transilvania din Brașov (Tabel 5 .2.1.) .
Tabel 5 .2.1. Distribuția studenților din cadrul Facultății de Alimentație și Turism, Universitatea
Transilvania din Brașov , repartizați în funcție de: programul de studiu, specializare și an universitar
Program de
stdiu Specializare Anul 1 Anul 2 Anul 3 Anul 4
Licență CEPA 10 studenți – 11 studenți –
EPI – – 9 studenți –
IPA 7 studenți – 3 studenți 10 studenți
IMAPA – – 19 studenți –
IMIT 4 studenți – – 2 studenți
Master MOEAT 4 studenți – – –
SPCCPA 11 studenți – – –

27
 Licență:
o CEPA – Controlul și Expertiza Produselor A limentare
o EPI – Echipamente pentru Procese Industriale
o IPA – Ingineria Produselor Alimentare
o IMAPA – Ingine rie și Management în Alimentație Publică și Agroturism
o IMIT – Inginerie și Management în Industria Turismului
 Master:
o MOEAT – Management în Ospitalitate și Eco – Agroturism
o SPCCPA – Sisteme de Procesare și Controlul Calității Produselor Agroalimentare
Cel de -al doilea lot este format din 62 de studenți aparținând Facultății de Chimie și Inginerie
Chimică, Universitatea Babeș – Bolyai din Cluj – Napoca (Tabel 5 .2.2.) .
Tabel 5 .2.2. Distribuția studenților din cadrul Facultății de Chimie și Inginerie Chimică , Universitatea
Babeș – Bolyai din Cluj – Napoca repartizați, în funcție de: programul de studiu, specializare și an
universi tar
Program de
stdiu Specializare Anul 1 Anul 2 Anul 3
Licență Chimie 20 studenți – 3 studenți
Master Chimie clinică 21 studenți 18 studenți –

5.3. Rezultate și discuții
Pe baza răspunsurilor studenților, pentru fiecare întrebare au fost reprezentat e graf ic și
procentual cunoștințele acestora, comparând cele două lotur i. Cu albastru au fost evidențiate
răspunsurile studențlor de la Facultatea de Alimentație și Turism din cadrul Universității Transilvania din
Brașo v, notat cu UTBv – AT, iar cu roșu, au fost reprezentate răspunsurile studenților de la Facultatea de
Chimie și Inginerie Chimică, Universitatea Babeș – Bolyai din Cluj – Napoca , notat cu UBBCj – Chimie .

28
 Caracterizarea loturilor în funcție de vârstă și gen:

Figura 5.3.1. Distribuția studenți lor Facultății de Alimentație și Turism, Universitatea Transilvania Brașov,
în funcție de gen

Figura 5.3.2 . Distribuția studenților Facul tății de Chimie și Inginerie Chimică, Universitatea Babeș – Bolyai
din Cluj – Napoca , în funcție de gen

29

Figura 5.3.3. Repartizarea studenților Facultății de Alimentație și Turism, Universitatea Transilvania
Brașov, în funcție de vârstă

Figura 5.3.4. Repartizare studenților Facul tății de Chimie și Inginerie Chimică, Universitatea Babeș –
Bolyai din Cluj – Napoca , în funcție de vârstă

30
 Întrebări cu caracter general despre cromatografie :

Figura 5.3.5. Distribuția răspunsurilor loturilor de studiu în funcție de cunoștințele lor privind
cromatografia

Figura 5.3.6. Distribuția răspunsurilor loturilor de st udiu în funcție de sursele de informare despre
tehnicile cromatografice

31
Metoda cromatografică se definește ca fiind o metod ă fizico -chimică de separare [20* ].

Figura 5.3.7 . Distribuția răspunsurilor celor două loturi în funcție de cunoștințele referito are la d efiniția
metodei cromatografice

În funcție de natura fazei staționare, se disting mai multe tipuri de cromatografii de lichide:
cromatografia lichid – lichid cu fază normală, cromatografia lichid – lichid cu fază inversă, precum și
cromatografia lichid – svolid [4].

Figura 5.3.8 . Distribuția răspunsurilor participanților la studiu în funcție de cunoștințele acestora cu privire
la clasificarea cromatografiei de lichide în funcție de natura fazei staționare

32
Dependent de mecanismul de separare, c romatografia de lichide se clasifică în: cromatografie
de excludere sterică, cromatografie prin schimb ionic, cromatografie de afinitate și cromatografie chirală
[4].

Figura 5 .3.9. Repartizarea răspunsurilor studenților chestionați cu privire la clasific area cromatografiei de
lichide , dependent de mecanismul de sep arare

Conform literaturii de specialitate [13], există două tipuri de cromatografie planară:
cromatografia pe hârtie și cromatografia pe strat subțire.

Figura 5 .3.10. Repartizarea răspunsuri lor participanților studiului în funcție de cunoștințele lor referitor la
tehnicile cromatografiei planare

33

Elementele componente ale unui cromatograf sunt: sistemul de pomapre, injectorul, coloana
cromatografică, detector ul și înregistratorul [ 20].

Figura 5 .3.11. Distribuția răspunsurilor celor două loturi dependent de cunoștințele studenților referitor la
componentele unui cromatograf

În funcție de faza mobilă,cromatografia se clasifică în: cromatografia de lichide și cromatografia
de gaz [4].

Figura 5 .3.12. Distribuția răspunsurilor loturilor chestionate cu privire la cunoștințele acestora despre
clasificarea cromatografiei în funcție de faza mobilă

34

Figura 5 .3.13. Repartizarea răspunsurilor celor două loturi cu privire la afirmația falsă despre clasificarea
cromatografiei în funcție de faza staționară

 Întrebări cu caracer specific referitor la cromatografia pe strat subțire :

Cromatografia pe strat subțire este o tehnică atât calit ativă cât și semicant itativă [52].

Figura 5 .3.14. Distribuția răspunsurilor loturilor de studiu referitor la cunoștințele acestora despre tipul de
analiză al cromatografiei pe strat subțire

35
Conform literaturii de specialitate, natura fazei staționare în cromatografia pe strat subțire
poate fi: similară celei folosi te în cromatografia pe coloană, silica gel, silicagel – C8, alumină [ 20].

Figura 5 .3.15. Repartizarea răspunsurilor studenților chestionați în funcție de cunoștinț ele acestora
despre natura fazei staționare în cromatografia pe strat subțire

Domeniile d e aplicabiliate ale cromatografiei pe strat subțiresunt următoarele: poluanți,
insecicide și pesticide, medicamente, alcaloizi, precum și substanțe organice [ 20].

Figura 5 .3.16. Repartizarea răspunsurilor studenților chestionați cu privire la domeniile d e aplicabilitate
ale cromatografiei pe strat subțire

36
Unele dintre avantajele cromatografiei pe strat subțire sunt: simp litatea și accesi bilitatea
metodei, posibilitatea analizei simultane a mai multor probe, dar și rapidit atea metodei [ 20].

Figura 5 .3.17 . Distribuția răspunsurilor loturilor studiate în funcție de cunoștințele acestora referitor la
avantajele cromatografiei pe strat subțire

Valoarea factorului de retenție (Rf), în cromatografia pe strat subțire, are următoarele
proprietăți: reprezintă m ăsurarea vitezei de deplasare a zonelor de substanță față de cea a frontului de
developare, Rf = Xs / Xd, unde Xs reprezintă distanța migrată de analit, măsurată de la start până la
mijlocul spotului, iar Xd reprezintă distanța migrată de developant, dista nțele Xs și Xd măsurate
exprimându -se în mm [20 ].

Figura 5 .3.18. Distribuția răspunsurilor loturilor în funcție de cunoștinșele acestora cu privire la valoarea
Rf a cromatografiei pe strat subțire

37
În cromatografia pe strat subțire, valoarea Rf este cu prinsă între limitele 0 și 1 [20 ].

Figura 5 .3.19. Repartiția ră spunsurilor loturilor de studiu în funcție de cu noștințele acestora despre
valoarea Rf în cromatografia pe strat subțire

Factorii carea afectează această valoare (Rf) sunt următorii: calitate a, natura grosimea și gradul
de activitate al fazei staționare, compoziția fazei mobile, natura substanței de analizat, temperatura,
precum și gradul de saturare al camerei de developa re [5 2].

Figura 5 .3.20. Repartiția răspunsurilor stu denților din lotur ile de studiu , cu privire la factorii care
afectează valoarea Rf

38
Cromatografia pe strat subțire a fost descoperită mai târziu decât cromatografia pe coloană și
cea pe hârtie [ 20].

Figura 5 .3.21. Repartizarea răspunsurilor studenților chestionați în func ție de cunoștințele acestora cu
privire la istoria cromatografiei pe strat subțire

Metoda cromatografiei pe strat subțire este o rapidă, prin urmare nu este o tehnică over -night .

Figura 5 .3.22. Distribuția răspunsurilor loturilor de studiu cu privire la afirmația falsă despre durata
tehnicii cromatografice pe strat subțire

39
Cromatografia pe strat subțire permite separări de ordinul sutimilor de microame (0,01 μg) [20 ].

Figura 5. 3.23. Distribuția răspunsurilor studenților din loturile de studiu în funcție de cunoștințele lor
despre limita inferioară de detecție a cromatografiei pe strat subțire

Cromatografia pe strat subțire permite aplicarea metodei atât la separarea substanțelor
liposolublie, cât și a celor hidrosolubile [ 20].

Figura 5 .3.24 Distribuția răspun surilor studenților chestionați în funcție de cunoștințele lor despre
aplicabilitatea cromatografiei pe strat subțire

40
Procesul de developare presupune deplasarea fazei mobile prin stratul fazei mobile.

Figura 5 .3.25. Repartizarea răspunsurilor loturilor studiate în funcție de răspunsurile acestora la afirmația
eronată referitoare la definiția developării

Durata developării reprezintă timpul necesar pentru ca faza mobilă să parcurgă o anumită
distanță de la linia de start, suficientă pentru realizarea separării [20 ].

Figura 5 .3.26. Distribuția răspunsurilor studențil or aparținând celor două loturi în funcție de cunoștințele
acesptora despre durata developării

41
Structura și particularitatea adsorbanților folosiți influeanțează deurata de separare a
compușilor în cromatografia pe strat subțir e, aceasta fiind mai scăzută [ 20].

Figura 5 .3.27. Repartizarea răspunsurilor studenților din cele două loturi de studiu în funcție de
cunoștințele acestora referitor la influența separării compușilor în cromatografia pe strat subțirea de
către structura și particularitățile adsorbanților

Adsorbanții sau diferita substanțe lichide îmbibate într -un suport solid adsorbant reprezintă
faza staționară a cromatografiei pe strat subțire.

Figura 5 .3.28. Repartiția răspunsurilor loturilor de stud iu la afirmația falsă în funcție de cunoștințele
acestora referitor la definiția adsorbanților (fazei mobile)

42
Developantul sau amestecul de solvenți / dizolvanți reprezintă faza mobilă acromatografiei pe
strat subțire.

Figura 5 .3.29. Repartiția răspunsurilor studenților aparținând celor dou loturi la afirmația falsă referitoare
la definiția developantului

Liantul reprezintă acea substanță utilizată p entru fixarea adsorbantului pe plăcile de sticlă ale
cromatografiei pe strat subțire [ 20].

Figura 5 .3.30. Distribuția răspunsurilor loturilor de studiu în funcție de cunoștințele lor referitoare la
definiția liantului

43
Migrarea reprezintă deplasarea subst anțelor din amestecul de separat, împreună cu faza mobilă
de-a lungul fazei staținare [ 20].

Figura 5 .3.31. Distribuția răspunsurilor loturilor de studiu în funcție de cunoștințele studenților
chestionați, referitor la definiția procesului de migrare

 Întrebări cu caracter general referitor rla micotoxine și modul lor de detecție:

Figura 5 .3.32. Distribuția răspunsurilor loturilor de studiu în funcție de cunoștințele lor privind toxicologia
și micotoxinele

44

Figura 5 .3.33. Distribuția răspunsurilor lo turilor de studiu în funcție de sursele lor de informare privind
toxicologia și micotoxinele

Factorii răspunzături de dezvoltarea micețilorși producerea de micotoxine sunt:
umiditatea, temperatura, aerația,precum și capacitatea genică a acestora [46].

Figura 5 .3.34. Repartizarea răspunsurilor studenților aparținând celor două loturi în funcție de nivelul lor
de cunoștințe despre factorii care pr voacă dezvoltarea miceților și apariția micotoxinelor

45
Măsurile profilactice și curative în cazul micotoxicoz elor sunt următoarele: preîntâmpinarea
mucegăirii furajelor și alimentelor, recoltarea furajelor în timp optim și uscarea artificială, precum și
reducerea la minimum a condițiilor favorabile invaziei micotice [4 6].

Figura 5 .3.35. Distribuția răspunsurilo r loturilor studiate, în funcție de nivelul de cunoștințe asupra
măsurilor profilactice și curative în cazul micotoxicozelor

Metodele de detecție ale micotoxinelor din produsele alimentare sunt: cromatografia pe strat
subțire, cromatografia de gaz, imuno cromatografia cu latex lateral, cromatografia de gaz cuplată cu
spectrometru de masă, metode electrochimice [53].

Figura 5 .3.36. Distribuția răspunsurilor studenților chestionați în funcție de cunoștințele lor privind
metodele de detecție ale micotoxinel or

46
Plantele cu risc micologic sunt: grâul, porumbul, strug uriii, nuci și fructe uscate [5 3].

Figura 5 .3.37. Distribuția răspunsurilor loturilor studiate dependent de cunoștințele acestora referitor la
plantele cu risc micologic

Printre genurile de fun gi producătoare de micotoxine se numără și: Asperg illus, Penicilinum,
Fusarium [53 ].

Figura 5 .3.38. Repartizarea răspunsurilor studenților chestionați în funcție de cunoștințele lor despre
genurile de fungi producătoare de micotoxine

47
Principalele micot oxine sunt: Aflatoxine, Ochratoxina A, Fumarosina, Zearalenone, Citrinina,
Alcaloizi i din cornul secarei (ergot) [5 4].

Figura 5 .3.39. Repartizarea răspunsurilor loturilor de studiu în funcție de cunoștințele acestora referitor la
principalele micotoxine cunoscute

Principalele clase de Aflato xine sunt: B1, B2, G1, G2, M [5 4].

Figura 5 .3.40. Repartizarea răspunsurilor celor două loturi în funcție de cunoștințele studenților referitor
la principalele clase de Aflatoxine

48
Micotoxicozele pot fi acute sau c ronice. Toxicitatea acută are, în general, un debut rapid și un
răspuns toxic evident, în schim, toxicitatea cronică este caracterizată prin exounerea la doze mici de -a
lungul unei perioade lungi de timp, ducânde la ef ecte în general ireversibile [5 4].

Figura 5 .3.41. Repartizarea răspunsurilor stucenților participanți la studiu în funcție de cunoștințele lor
referitor la clasificarea micotoxicozelor

Manifestările toxicității cronice sunt: inducerea cancerului, toxicitatea la nivel renal, dar și
supr esia imunității [5 4].

Figura 5 .3.42. Repartiția răspunsurilor loturilor de studiu în funcție de cunoștințele studenților referitor la
manifestările toxicității cronice

49
Manifestările toxicității acute sunt: sindrom ul Turkey X, ergotismul uman [5 4].

Figura 5.3.43. Repartizarea răspunsurilor loturilor studiate în funcție de cunoștințele acetora referitor la
manifestările toxicității acute

Micotoxinele sunt produși secundari de metabolism elaborați de fungi filamentoși toxigeni
printr -o serie de reacții cat alizate de enzime în condiții specifice [53].

Figura 5 .3.44. Distribuția răspunsurilor studenților chestionați în funcție de cunoștințele despre natura
micotoxinelor

50
S-au descoperit aproximativ 300 – 400 micotoxine ce aparțin a 24 de grupe chimice de toxine
[53].

Figura 5.3.45 . Distribuția răspunsurilor loturilor de studiu în funcție de cunoștințele lor cu privire la
numărul micotoxinelor existente

Majoritatea ciupercilor sunt aerobe.

Figura 5.3.46 . Distribuția răspunsurilor celor două loturi la a firmația falsă referitoare la modiul în care se
dezvoltă ciupercile

51
O singură specie de mucegai poate produce mai multe micotoxine și mai multe specii de
mucegai pot produce aceeași micotoxină [53].

Figura 5.3.47 . Distribuția răspunsurilor loturilor de studiat în funcție de cunoștințele lor referitor la modul
de producere al micooxinelor

Micotoxinele pot apărea în lanțul alimentar ca urmare a infecțiilo fungice , fie prin hrana omului,
fie prin hrana animalelor.

Figura 5.3.48 . Distribuția răspunsu rilor studenților chestionați la afirmația falsă referitoare la modul de
contaminare al omului cu micotoxine

52
5.4. Concluzii partiale
În urma acestui chestionar reiese nivelul de cunoștințe al studenților Facultății de Chimie și
Inginerie C himică, Universitatea Babeș – Bolyai din Cluj – Napoca și al studenților Facultății de
Alimentație și Turism, Universitatea Transilvania din Brașov , referitor la tehnicile de separare
cromatografice în mod general și cromatografia pe strat subțire, în mod special, dar și asupr a
micotoxinelor.
Spre deosebire de studenții Facultății de Alimentație și Turism , studenții Facultății de Chimie și
Inginerie C himică au avut răspunsuri apropiate de cele reale întru -un procentaj mai mare la toate
întrebările din toate cele trei subcategor ii:
– întrebări cu caracter general despre cromatografie;
– întrebări cu caracter specific despre cromatografia pe strat subțire;
– întrebări cu caracter general despre micotoxine și modul lor de detecție.

53
6. Metoda cromatografiei pe strat su bțire pen tru detecția micotoxinelor

Unele determinări experimentale s -au realizat în laboratoarele de bioc himie din Facultatea de
Medicină din Brașov și alte experimente ș i respectiv interpretarea datelor s -au realizat în laboratoarele
Facultății de Chimie si Ingi nerie Chim ică din Universitatea Babeș – Bolyai din Cluj – Napoca, sub
îndrumarea doamnei ș ef lucră ri dr . Simona Codruța Cobzac.
Ca o completare a studiului, s -au realizat determinări enzimatice ale micotoxinelor, pentu a
evidenția avantajele cromatografie i pe strat subțire comparativ cu alte metode.

6.1. Detecția de Aflatoxină B2 ( AB2 ) și Ochratoxină A ( OTA ) prin cromatografia pe strat subțire

6.1.1. Principiul metodei
Această metodă constă în plasarea unui spot de probă pe stratul subțire ce conține materialul
adsorbant atașat pe o placă cromato grafic ă, confecționată din sticlă, hârtie de filtru, aluminiu sau plastic,
aceasta reprezentând faza staționară. Placa este apoi inserată într -o cameră cromato grafic ă (Figura
6.1.1 .1.) , ce conține un amestec de solvenți, den umit și developant, acesta reprezentând faza mobilă.
Prin capilaritate, developantul, irigând stratul poros migrează ascendent prin stratul subțire, provocând
separarea. Proba constă dintr -un amestec de substanțe și ingrediente inactive. Aceste componente vor
avea afinitate variabilă față de matricea adsorbantă și vor migra împreună cu developantul cu diferite
viteze. După ce migrarea developantului este completă, componentele individuale pot fi vizualizate prin
tratament chimic sau absorbanță ultravioletă (UV). Distanța de migrare a componentelor este
caracteristică pentru fiecare compus, prin urmare ingredientul activ poate fi recunoscut prin c omparație
cu un standard [3 8, 55 ].

54

Figura 6.1.1. 1. Camera cromato grafic ă în cromatografia pe strat subțire

6.1.2. Reacti vi și materiale necesare
– Placă cromato grafic ă 20 x 10 cm HPTLC Silica gel 60 (Figura 6 .1.2.1.)
– Soluție etalon amestec: OTA 5µg / mL + AB2 3,3 µg / mL NaOH (soluție stoc)
– Extract de cafea
– Soluție salină 5% : 1,25 g NaCl + 25 mL H 2O
– Metanol

Figura 6 .1.2.1. HPTLC Silica gel 60

55
Aparatură utilizată:
– Cântar : Adventurer Pro OHAUS (Figura 6.1.2. 2.)
– Sonicator : TRANSSONIC T310 (Figura 6 .1.2.3.)
– Centrifugă
– Aplicator proba: LINOMAT 5 CAMAG (Figura 6 .1.2.4.)
– Termostat : CAMAG TLC PLATE HEATER III (Figura 6 .1.2.5.)
– Aparat vizualizare în UV (Figura 6. 1.2.6.)

Figura 6 .1.2. 2. Cântar Adventurer Pro OHAUS

Figura 6 .1.2.3. Sonicator TRANSSONIC T310

56

Figura 6 .1.2.4. Aplicator probă LINOMAT 5 CAMAG

Figura 6.1.2.5. Termostat: CAMAG TLC PLATE HEATER III

Figura 6. 1.2.6. Aparat vizualizare în UV

57
6.1.3. Mod de lucru
S-au prepara t două tipuri de extract de cafea:
– Extract MeOH, s-a realizat dintr -un gram de cafea și 10 mL metanol, divolvat în soni cator timp de
15 minute , apoi centrifugat 10 minute la 4000 de rotații pe minut (RPM), utilizându -se
supernatantul ;
– Extract Na HCO 3 (bicarbonat de sodiu) , s-a obține dintr -un gram de cafea și 10 mL soluție salină
5% , obținută în același mod ca primul extra ct.
Faza staționară a fost reprezent ată de o placă cromato grafic ă 20 x 10 cm HPTLC Sil ica gel 60,
iar faza mobilă ternară, compusă din : acetat de etil : benzen : acid formic, cu un raport de 30 : 1,5 : 0,5 (90
: 4,5 : 1,5), cu un volum total de 96 mL .
Pe placa cromato grafică au fost aplicate 18 probe, (Tabel 6 .1.3.1.) printre care și probele de
testat obținute din extractul de cafea astfel:
– Proba 1 a fost compusă din 50 µL soluție stoc și 50 µL extract MeOH ;
– Proba 2 a fost obținută din 50 µL soluție stoc ș i 50 µL extract NaHCO 3.
S-a aplică pe placă soluția stoc (etalon) în cantități diferite și în dublu exemplar pentru
determinarea curbelor de calibrare, ce pot fi utilizate pentur interpolare cu analize de probe reale.
Tabel 6 .1.3.1. Repartizare probelor pe placa cromato grafic ă
Nr. probă Probă Cantitate (µL)
1. Blank MeOH 10
2. Etalon 3
3. Etalon 5
4. Etalon 8
5. Etalon 12
6. Etalon 15
7. Proba 1 – Extract MeOH + etalon 20
8. Proba 1 – Extract MeOH + etalon 20

58
9. Proba 1 – Extract MeOH + etalon 20
10. Proba 2 – Extract NaHCO 3 + etalon 20
11. Proba 2 – Extract NaHCO 3 + etalon 20
12. Proba 2 – Extract NaHCO 3 + etalon 20
13. Etalon 3
14. Etalon 5
15. Etalon 8
16. Etalon 12
17. Etalon 15
18. Blank H 2O 10

Aplicarea spotului s-a realizat , la o distanță de aproximati 1 cm (0,94 cm), spotul având o
dimensiune de 0,54 cm iar între ele fiind o distanță de 0,4 cm; cu un aplicator semiautomat (aplicarera
spoturilor sa realizat automa) (Figura 6.1.3.1 .). Specificațiile a cestui aparat sunt următoa rele:
– Volumul seringii este de 100 mL
– Viteza de aplicare este de 90 mL / s
– Predozare, 0,5 µL .

Figura 6.1.3.1. Aplicarea automată a spoturilor pe placa cromatografică

59
După aplicara probei, placa a fost lăsată la termostat , la o temperatură de 63ș C, pentr u uscarea
probelor (Figura 6 .1.3.2 .).

Figura 6 .1.3.2. Placa cromato grafic ă la termostat

Următorul pas a constat în migrarea propriu -zisă a pro belor. Placa cromato grafic ă a fost inserată
în camera de developare ce conține a faza mobilă prezentată anterio r (Figura 6 .1.3.3 .). Placa a fost lăsată
în cameră, până când frontul de developare a ajuns la o distanță de 1,5 cm de marginea superioară a
plăcii. După developare, placa a fost lăsată din nou la termostat.

Figura 6 .1.3.3 . Camera cromato grafic ă și proce sul de developare

Vizualizarea spoturilor s -a realizat prin absorbanță ultravioletă, la o lungime de undă de 254 nm
(Figura 6 .1.3.4 .), respectiv 365 nm (Figura 6 .1.3.5 .) și în vizibil (Figura 6 .1.3.6 .).

60

Figura 6 .1.3.4 . Vizualizare spot UV 254 nm

Figura 6 .1.3.5 . Vizualizare spot UV 365 nm

Figura 6 .1.3.6 . Vizualizare spot în vizibil

61
6.1.4. Interpretarea rezultatelor
Pentru inerpretarea rezultatelor obținute s -a utilizat Soft ware – ul Image Decipher ce utilizează
imagini format tip BMP (Figura 6.1.4.1.) , (Figura 6.1.4.2.) . Următorul pas constă în inversarea imaginii
originale în alb – negru (Figura 6.1.4. 3.); apoi încărcarea imaginii pentru analizare (Figura 6.1.4. 4.), ce va fi
transferată în fereastra de schimbare a parametrilor de procesare . Soft ware – ul utilizează o combinație
între doi parametrii de procesare: contrast și strălucire ce permite modificări între -100 și 100 pentru
ambi i parametrii (Figura 6.1.4. 5.). Acest soft permite modificarea imaginii în patru canale de culori diferite:
gri, roșu, ver de și albastru (Figura 6.1.4. 6.). Din aceste canale, au fost utilizate doar trei dintre ele, cel roșu
fiind exclus din cauza lipsei sugestivității [39].

Figura 6.1.4.1. Primul pas în utilizarea Software – ului Image Deciphe r constă în deschiderea unei im agini
format tip BMP (Captură de ecran)

Figura 6.1.4.2. Imagini utilizate format BMP, Ochratoxina A și Aflatoxina B2, vizualizare UV 365 nm

62

Figura 6.1.4.3 . Inversarea imaginii originale în alb – negru (Captură de ecran)

Figura 6.1.4.4 . Încărcar ea imaginii pentru analizare (Captură de ecran)

63

Figura 6.1.4. 5. Software Image Decipher cu modificarea parametrilor de procesare: strălucire (Brightness)
și contrast (Contrast) (Captură de ecran)

64

Figura 6.1.4. 6. Cele patru canale de culori diferit e ale S oftware – ului: gri, roșu, verde și albastru (Captură
de ecran)

S-a rea lizat i nterpretare rezultatelor pentru vizualizara UV la o lungime de undă de 365 nm .
 Prima interpretare s -a realizat fără modificarea parametrilor de procesar. S -a efectuat o c urbă de
calibrare (arie spot / concentrație) cu o ecuație de ordinul doi, cât și una liniară, obținute pentru
ambele tipuri de micotoxine , în trei canale: gri, verde și albastru.

65

Figura 6.1.4.7 . Curbele de calibrare pentru AB2, fără modificarea parametil or de procesare, în canal gri

Figura 6.1.4.8 . Curbele de calibrare pentru AB2, fără modificarea parametilor de procesare, în canal verde

66

Figura 6.1.4.9 . Curbele de calibrare pentru AB2, fără modificarea parametilor de procesare, în canal
albastru

Figura 6.1.4.10 . Curbele de calibrare pentru OTA, fără modificarea parametilor de procesare, în ca nal gri

67

Figura 6.1.4.11 . Curbele de calibrare pentru OTA, fără modificarea parametil or de procesare,
în canal verde

Figura 6.1.4.12 . Curbele de cali brare pentru OTA, fără modificarea parametilor de procesare,
în canal albastru

68
 A doua interpretare s -a realizat cu modificarea parametrilor de procesar e astfel: strălucire (b40) și
contrast (c10). S-a efectuat o curbă de calibrare (arie spot / concentrați e) cu o ecuație de ordinul doi,
cât și una liniară, obținute pentru ambele tipuri de micotoxine , în trei canale: gri, verde și albastru.

Figura 6.1.4.13 . Curbele de calibrare pentru AB2, cu modificarea parametrilor de procesare:
strălucire (b40) și cont rast (c10) , în canal gri

69

Figura 6.1.4.14 . Curbele de calibrare pentru AB2, cu modificarea parametrilor de procesare:
strălucire (b40) și contrast (c10), în canal verd

Figura 6.1.4.15 . Curbele de calibrare pentru AB2, cu modificarea parametrilo r de procesare:
strălucire (b40) și co ntrast (c10), în canal albastru

70

Figura 6.1.4.16 . Curbele de calibrare pentru OTA, cu modificarea parametrilor de procesare: strălucire
(b40) ș i contrast (c10), în canal gri

Figura 6.1.4.17 . Curbele de calibrare p entru OTA, cu modificarea parametrilor de procesare:
strălucire (b40) și contrast (c10), în canal verde

71

Figura 6.1.4.18 . Curbele de calibrare pentru OTA, cu modificarea parametrilor de procesare:
strălucire (b40) și contrast (c10), în canal albastru

 A treia interpretare s -a realizat cu modificarea parametrilor de procesar astfel: strălucire (b70) și
contrast (c0). S-a efectuat o curbă de calibrare (arie spot / concentrație) cu o ecuație de ordinul doi,
cât și una liniară, obținute pentru ambele tipuri de micotoxine , în trei canale: gri, verde și albastru
pentu OTA, iar pentru AB2, doar gri și albastru deoarece în canalul verde imaginea era neconcludentă.

72

Figura 6.1.4.19 . Curbele de calibrare pentru AB2, cu modificarea parametrului de procesare
strălu cire (b70), în canal gri

Figura 6.1.4.20 . Curbele de calibrare pentru AB2, cu modificarea parametrului de procesare
strălucire (b70), în canal albastru

73

Figura 6.1.4.21 . Curbele de calibrare pentru OTA, cu modificarea parametrului de procesare
strălu cire (b70), în canal gri

Figura 6.1.4.22 . Curbele de calibrare pentru OTA, cu modificarea parametrului de procesare
strălucire (b70), în canal verde

74

Figura 6.1.4.23 . Curbele de calibrare pentru OTA, cu modificarea parametrului de procesare
stră lucir e (b70), în canal albastru

6.1.5. Concluzii parțiale
S-au efectuat curbe de calibrare ale Ochratoxinei A și Aflatoxinei B2 în diferite condiții
experimentale referitor la canalele de culoari utilizate și parametrii de procesare (contrast și strălucire):
– fără mo dificarea parametrilor de procesare în trei canale: gri, verde și albastru pentru
ambele tipuri de micotoxine;
– cu modificarea parametrilor de procesare: strălucire (b40) și (c10) , în trei canale: gri, verde
și albastru pentru ambele tipuri de micotoxine;
– cu modificarea parametrului de cprocesare strălucire (b70) , în trei canale: gri, verde și
albastru pentru ambele tipuri de micotoxine;
Cele mai bune rezultate obținute pentru detecția Ochratoxinei A au fost prin modificarea
parametrilor strălucire (b40) și contrast (c10), în canal verde, cu un coeficient de corelație R2 = 0,997
pentru ecuația liniară și R2 = 1 pentru ecuația polinomială de ordinul doi. Pentru Aflatoxina B2, cel mai
bun rezultat s -a obținut fără modificarea parametrilor de procesare în canal verde cu un coeficient de
corelație R2 = 0,997 pentru ecuația liniară și cu modificarea parametrilor de procesare: strălucire (b40) și
contrast (c10) în canal verde cu un coeficient de corelație R2 = 1 pentru ecuația polinomială de ordinul doi.

75
6.2. Metoda enzi matică ELISA pentru detecția Aflaoxinei B1 (AB1 )

6.2.1. Principiul metodei
Acest test este realizat în plăci cu godeuri ELISA, ce au fost căptușite cu Ig G de capră anti –
iepure. Probele sau standardul, conjugatul enzimatic Aflatoxină B1 și anticorpii de iepure a nti – Aflatoxină
B1 sunt adăugați în godeuri. În timpul incubației, anticorpii anti – Aflatoxină B1 se leagă de Ig G fixată și
împreună cu conjugatul enzimatic Aflatoxină B1 competiționează pentru legarea de anticorpul anti –
Aflatoxină B1. După ce se real izează acestă reacție, materialul nelegat este îndepărtat în procesul de
spălare. Activitatea enzimei legate este determinat ă prin adăugarea unei cantități fixe de substrat
cromogenic. Conjugatul enzimatic legat schimbă substratul incolor într -un produs al bastru. Reacția
substratului este oprită de adăugarea acidului sulfuric, ce duce la schimbarea culorii din albastru în
galben . Absorbanța este măsurată spectrofotometric (450 nm) și intensitatea culorii este invers
proporțională cu concentrația inițială de Aflatoxină B1 din probă. Concentrația probei este calculată pe
baza curbei de calibrare derivată din standarde, a că ror concentrație este cunoscută [ 56].

6.2.2. Reactivi și materiale necesare
 Componentele kit -ului:
o Placă de microtitrare (1 x 96 godeuri) căptuși tă cu anticorpi Ig G de iepure ;
o Soluții standard Aflatoxină B1 ELISA Kit (EuroClone) (volum 1 mL / standard): 0 ng/mL, 0.1 ng/mL,
0.2 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.8 ng/mL, 1.6 ng/mL ;
o Soluții standard Aflatoxină B1 test enzimatic pentru analiza cantitativă Kit (RIDA SCREEN) (volum
1,3 mL / standard): 0 ppb, 1ppb, 5 ppb, 20 ppb, 50 ppb ;
o Anticorp anti – Aflatoxină B1 (volum 11 mL) ;
o Conjugatul enzimatic Aflatoxină B1 (volum 6 mL) ;
o Soluție tampon pentru spălare (volum 50 mL) ;
o Soluție cr omogen (substratul ) (volum 22 mL );
o Soluție stop (volum 6 mL) .

76
 Alte materiale:
o Micropipetă precisă 10 -200 µL cu vârfuri potrivite ;
o Micropipetă multicanal 50 -200 µL cu vârfuri potrivite ;
o Cititor pentru placa de microtitrare cu filtru de 450 nm ;
o Metanol ;
o Apă distilată ;
o Tub Eppendorf ;
o Pahar Berz elius ;
o Cilindru gradat ;
o Cronometr ;
o Hârtie absorbantă ;
o Mănuși de unică folosință ;
o Mască chirutgicală;
o Halat de laborator.

6.2.3. Mod de lucru
Prepararea soluțiilor :
– Soluție tampon pentru spălare : se diluează de 10 ori concentrația 1:10 folosind apă distilată ( ex. 1 mL
+ 9 mL) ;
– Soluție metanol 33% : se diluează 1:3 folosind apă deionizată (ex. 30 mL + 60 mL) .
În primul godeu s -au adăugat 200 µL apă distilată ce reprezintă proba Blank. În cel de -al doilea
godeu, pentru standard ul cu concentrație 0 (MB – Maximum Bind ing), s -au adăugat 50 µL apă distilată,
apoi, în godeurile următoare, s -au adăugat câte 50 µ din fiecare standard, pentru realizarea curbelor de
calibrare.
În fiecare godeu, exceptând proba Blank, s -au adăugat 50 µ L de conjugat enzimatic, peste care
s-au a băugat 100 µL de anticorp anti – Aflatoxină B1, de asemenea exceptând proba blank. Acest pas

77
trebuie realizat foarte repede, de aceea a fost utilizată pipeta multicanal. S -a mixat ușor prin balansarea
manuală a plăcii.
Următorul pas a constat în incubare a timp de 20 de minute la temperatura camerei (20 – 25șC),
la întuneric. După incubare, s -a aruncat lichidul din godeuri și s-a îndepărtat excesul de lichid prin
întoarcerea plăcii pe suprafața hârtiei absorbante.
Secvențele de spălare s -au realizat astfel: s-a umplut fiecare godeu cu sistemul tampon pentru
spălare diluat, cu aproximativ 300 µL/godeu, s -au golit godeurile prin întoarcerea plăcii, repetându -se
procesul de spălare de 4 ori, apoi îndepărtându -se excesul de lichid cu ajutorul hârtiei absorbante.
Utilizând micropipeta multicanal, s -au adăugat 200 µL de soluție cromogen în fiercare godeu,
inclusiv în proba Blank , rezultând un produs albastru (Figura 6.2 .3.1.), apoi s -a incubat timp de 20 de
minute la temperatura camerei, la întuneric. După acet pro ces, s-au adăugat 50 µL/godeu de soluție
stop, apoi culoarea se schimbă din albastru în galben (Figura 6.2 .3.2.) . S-a mixat ușor prin balansarea
manuală a plăcii. Fiecare probă s -a efect uat în triplicat și s -a realizat media aritemetică a rezultatelor
obținute pentru cele trei determinări ale fiecărei probe (Blank, MB, standard) .

Figura 6 .2.3.1. Produsul albastu obținut prin adăugarea conjugatului enzimatic peste substratul incolor

Figura 6.2 .3.2. Virajul culorii din albastru în galben obținut prin adăugarea acidului sulfuric
(soluția stop) , ce are rolul de a opri reacția

78
6.2.4. Interpretarea rezultatelor
Absorbanța a fost măsurată folosind un cititor de microplăci ce deține un filtru de 450 nm.
Valorile necunoscute a concentrațiilor totale de Aflatoxină î n probe sunt determinate din curba
de calibrar e obținute prin formula (aplicată pentru fiecare standard) [56]:

Figura 6.2.4.1. Ecuația logaritmică a curbei de calibrare pentru A flatoxina B1, dependentă de concentrația
AB1 (ng/mL) și media extincțiilo r măsurate la o lungime de undă de 450 nm

79

Figura 6.2.4.2. Ecuația liniară a curbei de calibrare pentru Aflatoxina B1, dependentă de logaritmul
concentrației AB1 și media extincțiilor măsurate la o lungime de undă de 450 nm

Figura 6.2.4.3. Ecuația lo garitmică a curbei de calibrare pentru Aflatoxina B1, dependentă de concentrația
AB1 (ng/mL) și valorile obținute prin formula Es/Emb*100 , exprimate procetual

80

Figura 6.2.4.4. Ecuația liniară a curbei de calibrare pentru Aflatoxina B1, dependentă de logar itmul
concentrației AB1 și valorile obținute prin formula Es/Emb*100, exprimate procetual

6.2.5. Concluzii parțiale
S-au real zat patru curbe de calibrare din care au reieșit patru ecuații ce pot fi folosite, prin
interpolare, pentur probe reale:
– Ecuația logarit mică a curbei de calibrare pentru Aflatoxina B1, dependentă de
concentrația AB1 (ng/mL) și media extincțiilor măsurate la o lungime de undă de 450
nm;
– Ecuația liniară a curbei de calibrare pentru Aflatoxina B1, dependentă de logaritmul
concentrației AB1 ș i media extincțiilor măsurate la o lungime de undă de 450 nm ;
– Ecuația logaritmică a curbei de calibrare pentru Aflatoxina B1, dependentă de
concentrația AB1 (ng/mL) și valorile obținute prin formula Es/Emb*100, exprimate
procetual ;
– Ecuația liniară a curbei de calibrare pentru Aflatoxina B1, dependentă de logaritmul
concentrației AB1 și valorile obținute prin formula Es/Emb*100, exprimate procetual .
Toate cele patru ecuații au un coeficient de corelație R2 = 0,9982.

81
7. Concluzii finale
Cromatografia pe strat s ubțire este o metodă de separare cu aplicabilitate foarte mare în diferite domenii:
detecția poluanților, metalelor grele, separarea aminoacizilor, clasificarea fracțiilor lipidice și nu numai. Această
metodă este utulizată datorită simplității ei, costuri lor reduse și datorită faptului că nu necesită o aparatură
laborioasă, putănd fi confecționată ușor, având un timp scurt de efectuare și obținere a rezultatelor. Printre toate
acestea, cromatografia pe strat subțire este o metodă foarte sensibilă putând of eri rezultate atât calitative, cât și
semicantitative.
Această tehnică se poate utiliza și pentru detecția micotoxinelor, acestea fiind metaboliți secundari
produși de fungi filamentoși precum Aspergillus, Fusarium, Penicilium. Detecția micotoxinelor este foarte
importantă, deoarece acestea se pot găsi în cereale precum grâu, porumb, orez, orz, contaminând hrana animalelor
și amenințând siguranța agroalimentară și sănătatea omului. Acestae pot fi găsite și în alte alimente precum: alune,
arahide, boabe de cafea, fasole, struguri și fructe uscate. Impactul micotoxinelor asupra sănătății omului este foarte
mare, avănd efecte hepatotoxice, teratogene, mutagene, cancerigene și pot provoca reacții alergice.
În urma studiului privind nivelul cunoș tințelor studenț ilor privind la tehnicile cromatografice și noțiuni
generale despre micotoxine, reiese faptul că studenții Facultății de Chimie și Inginerie Chimică, Universitatea Babeș
– Bolyai din Cluj – Napoca dețin mai multe informații cu privire la această temă, spre deosebire de studenții
Facultății de Alimentație și Turism, Universitatea Transilvania din Brașov.
În partea experimentală s -au efectuat experimente pentru determinarea curbelor de calbrare a
Ochratoxinei A și aflatoxinei B2, prin cromatografia pe strat s ubțire și Aflatoxinei B1, prin metoda enzimatică ELISA.
Curbele de calibrare pot fi utilizate, prin interpolare, pentru probe reale. În interpretarea rezultatelor cromatografiei
pe strat subțire , s-a utilizat Software – ul Image Descipher, ce utilizează do i parametri de procesare (strălucire și
contrast) și patru canale de culoare (gri, roșu, verde și albastu). Cei mai buni parametrii utilizați au fost: strălucire
(b40) și contrast (c10) în canal verde pentru detecția Ochratoxinei A, iar pentru detecți Afl atoxinei B2, cele mai bune
rezultate s -au obținut fără modificarea parametrilor de procesare în canal verde și cu modificarea parametrilor:
străluciraț (b40) și contrast c(10) în canal verde.
Părți din lucrare au fost comunicate la conferința AFCO Brașov 2018 cu titul „STRATEGII INOVATIVE DE
DETEVȚIE CROMATOGRAFICĂ PE STRAT SUBȚIRE A MICOTOXINELOR” , și la sesiunea de comunicări științifice
studențești.

82
Anexa 1
Chestionar
Numele meu este Năstase Diana, sunt studentă în cadrul Facultății de Medicină din cad rul
Universității Transilvania Brașov, programul de studii Laborator clinic, anul III. Acest chestionar va
reprezenta o parte a lucrării mele de licența și va evidenția cunoștințele studenților cu privire la
cromatografie, ca metodă de separare în general și cu aplicații speciale în domeniul analizei
micotoxinelor.
Întrebările sunt cu răspuns simplu sau multiplu. Datele dumneavoastră vor rămâne
confidențiale.

1. Genul dumneavoastră:
a. Masculin
b. Feminin

2. Vârsta dumneavoastră: …………….. (ani împliniți)

3. Facultatea: …………………………………………………………………………………………………………….. …………………………….

4. Programul de studii (specializare, an): ….. ………………………………… ………. ………………………………………………

5. Indicați dacă aveți cunoștințe despre tehnicile cromato grafic e de separare (răspuns unic):
a. Nu am informații
b. Foarte puține
c. Puține
d. Multe
e. Foarte multe

6. Indicați sursele dumneavoastră de informa re cu privire la tehnicile cromato grafice de separare
(răspuns multiplu):
a. Învățământ universitar
b. Articole științifice
c. Articole din reviste medicale
d. Cărți de specialitate
e. Internet
f. Cunoștințe / prieteni

83
g. Nu am informații despre tehnici cromato grafic e de sepa rare

7. Indicați dacă aveți cunoștințe cu privire la toxicologie și micotoxine (răspuns unic):
a. Nu am informații
b. Foarte puțin
c. Puțin
d. Mult
e. Foarte mult

8. Indicați sursele dumneavoastră de informare cu privire la toxicologie și micotoxine (răspuns
multiplu):
a. Învă țământ universitar
b. Articole științifice
c. Articole din reviste medicale
d. Cărți de specialitate
e. Internet
f. Cunoștințe / prieteni
g. Nu am informații

9. Indicați ce reprezintă metoda cromato grafică (răspuns unic):
a. Metodă fizico – chimică de separare a substanțelor d intr-un amestec
b. Metodă spectrometrică de analiză
c. Metodă voltmetrică de analiză
d. Niciun răspuns nu este corect
e. Toate răspunsurile sunt corecte
f. Nu știu

10. Indicați exemple de cromatografii de lichide, în funcție de natura fazei staționare (răspuns
multiplu):
a. Cromatografia lichid -lichid cu faze normale
b. Cromatografia lichid -lichid cu faze inverse
c. Cromatografia gaz -lichid
d. Cromatografia gaz -solid
e. Cromatografia lichid -solid
f. Niciun răspuns nu e corect

84
g. Toate răspunsurile sunt corecte
h. Nu știu

11. Indicați exemple de cro matografii de lichide, în funcție de mecanismul de separare (răspuns
multiplu):
a. Cromatografia de excludere sterică
b. Cromatografia prin schimb ionic
c. Cromatografia de afinitate
d. Cromatografia chirală
e. Cromatografia gaz -lichid
f. Cromatografia gaz -solid
g. Niciun răs puns nu e corect
h. Toate răspunsurile sunt corecte
i. Nu știu

12. Indicați exemple de tehnici de cromatografie planară (răspuns multiplu):
a. Cromatografia lichid -lichid
b. Cromatografia lichid -solid
c. Cromatografia pe hârtie
d. Cromatografia prin excludere sterică
e. Cromato grafia pe strat subțire
f. Cromatografia de afinitate
g. Niciun răspuns nu este corect
h. Toate răspunsurile sunt corecte
i. Nu știu

13. Indicați elementele componente ale unui cromatograf (răspuns multiplu):
a. Sistemul de pompare
b. Lampă
c. Injector
d. Coloană
e. Flacără
f. Detector
g. Înregistrator
h. Amplificator

85
i. Niciun răspuns nu este corect
j. Toate răspunsurile sunt corecte
k. Nu știu

14. Indicați ce tip de analiză este cromatografia pe strat subțire (răspuns multiplu):
a. Analiză calitativă
b. Analiză cantitativă
c. Analiză semicantitativă
d. Niciun ră spuns nu este corect
e. Toate răspunsurile sunt corecte
f. Nu știu

15. Natura fazei staționare în cromatografia pe strat subțire (răspuns multiplu):
a. Este similară celei folosite în cromatografia pe coloană
b. Poate fi silicagel
c. Poate fi silicagel -C8
d. Poate fi alumin a
e. Niciun răspuns nu este corect
f. Toate răspunsurile sunt corecte
g. Nu știu

16. Indicați domeniile de aplicabilitate ale cromatografiei pe strat subțire, pentru detecții de (răspuns
multiplu):
a. Poluanți
b. Insecticide și pesticide
c. Medicamente
d. Alcaloizi
e. Substanțe or ganice
f. Niciun răspuns nu este corect
g. Toate răspunsurile sunt corecte
h. Nu știu

17. Indicați avantajele cromatografiei pe strat subțire (răspuns multiplu):
a. Simplitatea și accesibilitatea metodei
b. Posibilitatea analizei simultane a mai multor probe

86
c. Rapiditatea m etodei
d. Niciun răspuns nu este corect
e. Toate răspunsurile sunt corecte
f. Nu știu

18. În cromatografia pe strat subțire valoarea Rf (răspuns multiplu):
a. Măsoară viteza de deplasare a zonelor de substanță față de cea a frontului de developant
(faza mobila)
b. Rf =
, unde X s – distanța migrată de analit, măsurată de la start până la mijlocul
spotului ; Xd – distanța migrată de developant (faza mobilă)
c. Rf =
, unde X s – deplasarea substanței studiate ; Xd – deplasarea developantului
d. Măsurarea valorilor X s și X d se realizează în mm (distanț ele X s și X d masurate se exprimă în
mm)
e. Niciun răspuns nu este corect
f. Toate răspunsurile sunt corecte
g. Nu știu

19. În cromatografia pe strat subțire, valoarea Rf este cuprinsă între limitele (răspuns unic):
a. -1 ≤ Rf ≤ 1
b. -1 ≤ Rf ≤ 0
c. 0 ≤ Rf ≤ 1
d. Niciun răspuns nu este corect
e. Nu stiu

20. Indicați factorii care afectează valoarea Rf (răspuns multiplu):
a. Calitatea, natura, grosimea și gradul de activitate al fazei staționare
b. Compozitia fazei mobile
c. Natura substanței de ana lizat
d. Temperatura
e. Gradul de saturare al camerei de developare
f. Niciun răspuns nu este corect
g. Toate răspunsurile sunt corecte
h. Nu știu

87
21. Indicați care sunt factorii răspunzători de dezvoltarea miceților și producerea de micotoxine
(răspuns multiplu):
a. Umidit atea
b. Temperatura
c. Aerația
d. Capacitatea genetică a acestora
e. Niciun răspuns nu este corect
f. Toate răspunsurile sunt corecte
g. Nu știu

22. Indicați măsurile profilactice și curative în caz de micotoxicoze (răspuns multiplu):
a. Preîntâmpinarea mucegăirii furajelor și alimentelor
b. Recoltarea furajelor în timp optim și uscarea artificială
c. Creșterea gradului de umiditate
d. Reducerea la minimum a condițiilor favorabile invaziei micotice (ameliorarea tehnicilor de
recoltare, depozitare, consarvare și preparare a nutrienților)
e. Niciun răspuns nu este corect
f. Toate răspunsurile sunt corecte
g. Nu știu

23. Indicați metodele de detecție ale micotoxinelor din produsele alimentare (răspuns multiplu):
a. Cromatografia pe strat subțire (TLC)
b. Cromatografia de gaz (GC)
c. Citometria în flux (Flow cy tometry)
d. Imunocromatografie cu flux lateral
e. Cromatografie de gaz cuplată cu spectrometru de masă (GC -MS)
f. Metode electrochimice
g. Niciun răspuns nu este corect
h. Toate răspunsurile sunt corecte
i. Nu știu

24. Indicați plantele cu risc micologic (răspuns multiplu):
a. Grâu
b. Porumb
c. Struguri

88
d. Nuci și fructe uscate
e. Niciun răspuns nu este corect
f. Toate răspunsurile sunt corecte
g. Nu știu

25. Indicați cele trei genuri de fungi producători de micotoxine (răspuns multiplu):
a. Aspergillus
b. Penicilinum
c. Enterococcus
d. Corynebacterium
e. Fusarium
f. Pseudomonas
g. Niciun răspuns nu este corect
h. Toate răspunsurile sunt corecte
i. Nu știu

26. Indicați principalele micotoxine (răspuns multiplu):
a. Aflatoxine
b. Ochratoxina A
c. Fumarosina
d. Zearalenone
e. Citrinină
f. Alcaloizii din cornul secarei (ergot)
g. Niciun răspuns nu est e corect
h. Toate răspunsurile sunt corecte
i. Nu știu

27. Indicați principalele clase de aflatoxine (răspuns multiplu):
a. Aflatoxine A
b. Aflatoxine B 1
c. Aflatoxine B 2
d. Aflatoxine G 1
e. Aflatoxine G 2
f. Aflatoxine M
g. Niciun răspuns nu este corect

89
h. Toate răspunsurile sunt corecte
i. Nu știu

28. Indicați clasificarea micotoxicozelor (răspuns multiplu):
a. Acute sau cronice
b. Toxicitatea acută are, în general, un debut rapid și un răspuns toxic evident
c. Toxicitatea cronică are, în general, un debut rapid și un răspuns toxic evident
d. Toxicitatea cronică este caracterizată prin expunerea la doze mici de -a lungul unei
perioade lungi de timp, ducând la efecte în general ireversibile
e. Toxicitatea acută este caracterizată prin expunerea la doze mici de -a lungul unei perioade
lungi de timp, ducând la can cer și alte efecte, în general ireversibile
f. Niciun răspuns nu este corect
g. Toate răspunsurile sunt corecte
h. Nu știu

29. Indicați manifestările toxicității cronice (răspuns multiplu):
a. Inducerea cancerului
b. Toxicitate la nivel renal
c. Supresia imunității
d. Sindromul Turkey X
e. Ergotismul uman
f. Niciun răspuns nu este corect
g. Toate răspunsurile sunt corecte
h. Nu știu

30. Indicați manifestările toxicității acute (răspuns multiplu):
a. Inducerea cancerului
b. Toxicitate la nivel renal
c. Supresia imunității
d. Sindromul Turkey X
e. Ergotismul uman
f. Niciun răspuns nu este corect
g. Toate răspunsurile sunt corecte
h. Nu știu

90
Marcați cu X în tabelul următor, în coloana A dacă răspunsul este adevărat sau în coloana F dacă
răspunsul este fals:
Nr.crt A F
1. În funcție de faza mobilă, cromatografia se clasifică în: cromatografia de lichid și
cromatografia de gaz.
2. În funcție de faza staionară, cromatografia se clasifică în: cromatografia de lichid
și cromatografia de gaz.
3. Cromatografia pe strat subțire a fost introdusă în practica curentă m ai târziu
decât cromatografia pe coloană și cea pe hârtie.
4. Tehnica cromatografiei pe strat subțire este o tehnică over -night.
5. Metoda cromatografiei pe strat subțire permite separări de ordinul sutimilor de
micrograme (0,01 μg).
6. În croma tografia pe strat subțire există posibilitatea aplicării metodei atât la
separarea substanțelor hidrosolubile, cât și a celor liposolubile.
7. Developarea reprezintă procesul de deplasare a fazei staționare prin stratul
fazei mobile.
8. Durata devel oparii reprezintă timpul necesar pentru ca faza mobilă să parcurgă
o anumită distanță de la linia de start, suficientă pentru realizarea separării.
9. Durata scurtă de separare a compușilor în cromatografia pe strat subțire se
datorează structurii și p articularităților adsorbanților folosiți.
10. Adsorbanții, ca atare, sau diferite substanțe lichide îmbibate într -un suport solid
adsorbant reprezintă faza mobilă a cromatografiei pe strat subțire.
11. Developantul sau amestecul de solventi/dizolvan ți reprezintă faza staționară a
cromatografiei pe strat subțire.
12. Liantul este acea substanță folosită pentru a fixa adsorbantul pe plăcile de sticlă
ale cromatografiei pe strat subțire.
13. Migrarea reprezintă deplasarea substanțelor din amestec ul de separat,
împreună cu faza mobilă, de -a lungul fazei staționare.
14. Micotoxinele sunt produși secundari de metabolism elaborați de fungi
filamentoși toxigeni printr -o serie de reactii catalizate de enzime in conditii
specifice.
15. Exista cca . 300 – 400 micotoxine ce apartin a 24 de grupe chimice de toxine.
16. Cele mai multe ciuperci sunt anaerobe.
17. O singura specie de mucegai poate produce mai multe micotoxine și mai multe
specii de mucegai pot produce aceeași micotoxina.
18. Micotoxinele pot apărea în lanțul alimentar ca urmare a infecțiilor bacteriene, fie
prin hrana omului, fie prin hrana animalelor.

91
Referințe bibilio fice

1. Seader JD, Henley EJ, Roper DK . Adsorption, Ion Exchange, Chromatography, and Electrophoresis.
În: Separation Process Principles Chemical and Biochemical Operations 3rd Edition. John Wiley &
Sons, Inc.; 2011: 577, 587, 596, 597
2. Coskun O. , Separation techniques: Chromatography. North Cl in Istanb . 2016; 3(2): 156 –160
3. Poole CF, Poole SK. Fundamental relationships of chromatography; Thin – layer chromatography.
În: Chromatography today. Amsterdam -Lausanne -New York -Oxford -Shannon -Tokyo: ELSEVIER
SCIENCE B.V.; 1997: 2 -4, 54, 649 -729
4. Coman G, Badea M. Metode cromatografice. În: Elemente de chimie analitică. Brașov: Editura
Universității ”Transilvania”; 2015: 59 -75
5. Giddings JC, Keller RA. Chromatography. Encyclopaedia Britanica (Accesat în 6 septembrie, 2017,
la <URL: https://www.britannica.com/science/chromatography#ref80505 >)
6. Beneke K. Friedrich (Fritz) Feigl und die Geschichte der Chromatographie und der Tüpfelanalyse.
1999 (Accesat în 18 septembrie, 2017, la < URL: http://www.uni –
kiel.de/anorg/lagaly/group/klausSchiver/Feigl.pdf >)
7. Etter LS. M.S. Tswett and the Invention of Chromatography. 2003 ( Accesat în 18 septembrie,
2017, la < URL: http://files.pharmtech.com/alfresco_images/pharma/2014/08/22/4c389281 –
51ae -48c6 -94e5 -c533cbbbd574/article -69718.pdf >)
8. ***History of Chromatography (Accesat în 6 septembrie, 2017, la < URL:
http://chromatographyscience.blogspot.com/p/history -of-chromatography.html >)
9. ***Chromatographic method s (Accesat în 6 septembrie, 2017, la < URL:
https://web.njit.edu/~kebbekus/analysis/4CHROMAT.htm >)
10. Heftmann E. History of chromatography and electrophoresis. În: Heftmann E, eds. Journ al of
chromatography library – volume 22 A Chromatography: Fundamentals and Applications of
Chromatographic and Electrophoretic Methods. Part A: Fundamentals and Techniques.
Amsterdam – Oxford – New York: Elsevier Scie ntific Publishing Company; 1983: A19 – A23

92
11. Ettre LS, Issaq HJ, Berezkin VG, Roeraade J, Sherma J. Chromatography: The Separation Technique
of Twentieth Century; Mikhail Semenovich Tswett: The Father of Modern Chromatography; From
Crushed Bricks to Microchips; Thin Layer Chromatography. În: Is saq HJ, eds. A Century of
Separation Science. New York – Basel: Marcel Dekker, INC; 2002: 7, 19 -21, 39 -40, 49 -63
12. Jandera P, Churáček j. The mobile phase and chromatographic behaviour under istori conditions.
În: Journal of chromatography libra – volume 31 gradient elution in column liquid
chromatography theory and practice. Amsterdam – Oxford – New York – Tokyo: Elsevier Science
Publishers B.V.; 1985: 15 -16
13. Atanasiu V, Coman G, Cristina T. Cromatografia. În: Coman G, eds. Manual de lucrări practice de
bioch imie medicală. Brașov: Reprografia Universitat ii Transilvania din Brasov ; 1993: 54 – 59
14. http://www.separationprocesses.com/Adsorption/CG_Fig003.htm – pentru F igura 2.42 . Accesat
în 12 septembrei, 2017
15. Ismail I,Fawzy AS, Ahmad MI, Aly HF, Nomura M, Fujii Y. Isotope effects of neodymium in
different ligands exchange systems studied by ion exchange dispacement chromatography.
Journal of Advanced Research. 2013; 4:129 -135
16. Jungbauer A, Mcchold C. Chromatographyn of proteins. În: Heftmann E, eds. Chromatography 6th
edition fundamental and applications of chromatography and related differential migration
methods part B: applications . Amsterdam – Boston – Heidelberg – London – New York – Oxford
– Paris – San Diego – San Francisco – Singapore – Sydney – Tokyo: ELSEVIER B.V.; 2004: 712
17. Calderon M, Baumann WJ. Gel permeation chromatography of natural hydroxy lipids on Sephadex
LH – 20. Journal of Lipid Research. 1970; 11:167 -169
18. Stastna M, Van Eyk JE. Protein Separation: Liquid Chromatography. În: Van Eyk JE, Dunn MJ, eds.
Clinical Proteomics From Diagnosis to Therapy . Weinheim: WILEY -VCH Verlag GmbH & Co. KgaA;
2008: 37 -38
19. Hage DS, Clarke W. Affinity Chromatography: An Overview. În: Cazes J, eds. Edcyclopedia of
Chromatography. New York – Basel: MARCEL DEKKER, INC.; 2001: 19 -22

93
20. Pelloni -Tamaș V, Iohan F. Aspecte introductive în cromatografie în strat subțire; Meecanismul de
separare a substanțelor prin cromatografia în strat subțire; Adsorbanți folosiți în cromatografia în
strat subțire. În: Pelloni -Tamaș V, eds. Cromatografia în strat subțire. București: Editura tehnică;
1971: 9 -13, 15 -18, 28, 34 -36
21. Shantha NC, Napolitano GE. Lipid analysis using thin -layer chromatography and the Iatroscan. În:
Hamilton RJ, eds. Lipid analysis in oils and fats. Londra – Weinheim – New York – Tokyo –
Melbourne – Madras: BLACKIE ACADEMIC & PROFESSIONAL Chapman & Hall; 1998: 1 -34
22. Kuluza F, Kigera S, Jähnke RWO, Heide L. Use of thin -layer chromatography to detect co unterfeit
sulfadoxine/pyrimetamine tablets with the wrong activa ingedient in Malawi. Khuluza et al Malar
J. 2016; 15:215
23. Svendsen AB, Verpoorte R. Absorbants, solvent systems and TLC techniques. În: JOURNAL OF
CHROMATOGRAPHY LIBRERY – volume 23A chromatog raphy of alkaloids part A: thin -layer
chromatography. Amsterdam – Oxford – New York: ELSEVIER SCIENTIFIC PUBLISHING
COMPANY;1983: 3 -9
24. Bernard -Savary P, Pool CF. Instrument platforms for thin -layer chromatography. Journal of
Chromatography A. 2015; 1421: 18 4-202
25. http://www.bio -rad.com/en -ro/applications -technologies/introduction –
chromatography?ID=LUSMIS7OP – pentru Figura 3.3.1. Accesat în 6 marti e, 2018
26. Matysik E, Woźniak A, Paduch R, Rejdak R, Beata P, Donica H. The New TLC Method for
Separation and Determination of Multicomponent Mixtures of Plant Extracts. 2016 (Accesat în 6
martie, 2018, la < URL: https://www.hindawi.com/journals/jamc/2016/1813581/ >)
27. Poole CF. Thin -layer chromatography: challenges and opportunities. Journal of Chromatography
A. 2003; 1000: 963 -984
28. Bhawani SA, Albishri HM, Khan ZA, Irahim MNM, Mohammad A. Surfact ant Modified/Mediated
Thin -Layer Chromatographic System for the Analysis of Amino Acids. 2013 (Accesat în 9 mai,
2018 la < URL: https://www.hindawi.com/journals/jamc/2013/973280/ >)

94
29. https://nptel.ac.in/courses/102103047/module4/lec21/1.html – pentru Figura 3.5.1 . Accesat în
6 martie, 2018
30. Bodoga P, Măruțoiu C, Coman M -V. Faze staționare; Faze mobile. În: Cromatografia p e strat
subțire Analiza poluanților. București: Editura Tehnică; 1995: 26 -27, 37 -38
31. Nielsen SS. Analysis of Food Contaminants, Residues, and Chemical constituents of Concern. În:
Food Analysis Fifth Edition. Indiana: Springer International Publishing; 2017 : 582 -584
32. Lin L, Zhang J, Wang P, Wang Y, Chen J. Thin -layer chromatography of mycotoxins and
comparison with other chromatographic methods. Journal of Chromatography A. 1998; 815: 3 -20
33. Yu H, Le HM, Kaale E, Long KD, Layloff T, Lumetta SS, Cunningham BT. C haracterization of drug
authenticity using thin -layer chromatography image with a mobile phone. Journal fo
pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2016; 125: 85 -93
34. Raymond K, Rinaldo P. From Art to Science: Oligoszccharide Analysis by MALDI -TOF Mass
Spectr ometry Finally Replaces 1 -Dimensional Thin -Layer Chromatography. Clinical Chemistry .
2013; 59:9 : 1297 -1298
35. Bravo de Languna IH, Marantes FJT, Luna -Freires KR, Mioso R. Extraction of Nutraceuticals from
Sirulina (Blue -Green Alga): A Bioorganic Chemistry P ractice Using Thin -Layer Chromatography.
The International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 2015; 43(5): 366 -369
36. Panveliwalla D, Lewis B, Wootton IDP, Tabaqchli S. Determination of individual bile acids in
biological fluids by thin -layer chroma tography and fluorimetry. J. clin. Path. 1970; 23: 309 -314
37. Kang Y, Wu T, Chen W, Li l, Du Y. A novel metastable state nanoparticle -enhanced Raman
spectroscopy coupled with thin layer chromatography for determination of multiple pesticide.
Food Chemistry. 2018; 270: 494 -501
38. Kagan IA, Flythe MD. Thin -layer Chromatographic (TLC) Separation and Bioassaya of Plant
Extracts to Identify Antimicrobial Compounds . Journal of Visualized Experiments . 2014; 85:
e51411
39. Casoni D, Badea M, Bros I, Cobzac SCA. Investigation on image processing paramers for plate
evaluation in TLC analysis of mycotoxins. STUDIA UBB CHEMIA. 2017; LXII, 3: 89 -102

95
40. Zhao X, Li R, Zhou J, He C, Zheng Y, Wu W, Zhang H. Separation and purification of deoxynialenol
(DON) mycotoxin from wheat culture using a simple two -step silica gel column chromatography.
Journal of Integrative Agriculture. 2016; 15(3): 694 -701
41. Chen Y, Meng X, Zhu Y, Shen M, Lu Y, Cheng J, Xu Y. Rapid detection of four mycotoxins in corn
using a microfluidicis and microarray -based im munoassay system. Talanta. 2018;186: 299 -305
42. James A, Zikankuba VL. Mycotoxins contamination in mize alarms food safety in sud -Sahara
Africa. Food Control . 2018; 90: 372 -381
43. Xu L, Zhang Z, Zhang Q, Li P. Mycotoxin Determination in Foods Using Advanced Sens ors Based
on Antibodies or Aptamers. Toxins. 2016; 8:239
44. Ouyang S, Zhang Z, He T, Li P, Zhang Q, Chen X, Wang D, LI H, Tang X, Zhang W. An On -Site, Ultra –
Sesitiv, Qua ntitative Sensing Method for the Determination of Total Aflatoxin in Peanut and Rice
Based on Quantum Dot Nanobeads Strip. Toxin. 2017; 9:137
45. Pandey AK, Rajput YS, Sharma R, Singh D. Immobilized aptamer on gold electode senses trace
amount of aflatoxi M1. Appl Nanosci. 2017; 7:893 -903
46. Bennett JW, Klich M. Mycotoxins. Clinical Microbiology Revie w. 2003; 16(3): 497 –516
47. Schoenhard GL, Lee DJ, Howell SE, Pawlowski NE, Libbey LM, Sinnhuber RO. Aflatoxin B1
Metabolism to Aflatoxicol and Dervatives Lethal to Bacillus subtilis GSY 1057 by Rainbow Trout
(Salmo gairdneir ) Liver. CANCER RESEARCH . 1976; 36: 2040 -2045
48. Badea M, Floroian L, Restain P, Cobzac SAC, Moga M. Ochratoxin A Detection on Antibody –
Immobilized on BSA -Functionalized Gold Electrodes. PLoS ONE. 2016; 11(7): e0160021
49. Kupski L, Badiale -Furlong. Principal components analysis: An innovative appr oach to estblish
interferences in ochratoxin A detection. Food Chemistry. 2015; 177:354 -360
50. Zhang X, Wu C, Wen K, Jiang H, Shen J, Zhang S, Wang Z. Comparison of Fluorescent Microsperes
and Colloidal Gold as Labels in Lateral Flow Immunochromatographic Ass ays for the Detection of
T-2 Toxin. Molecules. 2016; 21:21
51. Zhang J, Zhang H, Liu S, WU W, Zhang H. Comparison of Anorectic Potencies of Type A
Ttichothecenes T -2 Toxin, Diacetoxyscirpenol, and Neosolaniol. Toxins (Basel) . 2018; 10(5):179

96
52. Jercan E. Cromatog rafia plană. În: Metode de separat în chimie analitică . București: Editura
Tehnică; 1971: 272 -273
53. Dobre AA. Impactul micotoxinelor asupra lanțului alimentar. Metode moderne de analiză și
control al conținutului de fungi și micotoxine din produsele alimenta re. INNO -FOOD SEE (Accseat
în 27 noiembrie, 2017, la <URL:
https://www.innofoodsee.eu/downloads/constanta_prezentare_alina_dobre.pdf >)
54. Ștefanu E, Gherdan A, Gherg ariu S, Popescu O. Micotoxicozele. În: Ghergariu S eds. Toxicologie și
toxicoze . București: Editura Didactică și pedagogică; 1977: 220 -225
55. Saslis -Lagoudakis CH, Bruun -Lund S, Iwanycki NE, Seberg O, Petersen G, Jäger AK, Rønsted N.
Identification of common horsetail (Equisetum arvense L.; Equisetaceae) using Thin Layer
Chromatography versus DNA barcoding. Nature. 2015; 5:11942 (Accesat în 9 mai, 2018, la < URL:
https://www.nature.com/articles/srep11942 >)
56. EuroClone serving science through innovation AFLATOXIN B1ELISA KIT For the Quantitative
analysis of Aflatoxin B1 in grains, nuts, cottonseeds, cereals and feeds. Code EEM001096 Format
96 tests