SPECIALIZAREA MEDICINĂ GENERALĂ DISCIPLINA BIOFICĂ și FIZICĂ MEDICALĂ LUCRARE DE LICENȚĂ “BIOSENZORI PENTRU ANALIZA PARAMETRILOR BIOFIZICI DIN AERUL… [623554]

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE
“GRIGORE T. POPA” IAȘI
FACULTATEA DE MEDICINĂ
SPECIALIZAREA MEDICINĂ GENERALĂ
DISCIPLINA BIOFICĂ și FIZICĂ MEDICALĂ

LUCRARE DE LICENȚĂ
“BIOSENZORI PENTRU ANALIZA
PARAMETRILOR BIOFIZICI DIN AERUL
EXPIRAT ”

Coordonator științific
Prof. Dr. ȘTEFĂ NESCU CIPRIANA

Absolvent: [anonimizat]
2018

2
CUPRINS

I. INTRODUCERE 4
II. STADIUL CUNOAȘTERII 5
II.1 Elementele esențiale de biofizică ale sistemului respirator 5
II.2 Astmul bronșic 12
II.2.1 Bazele fiziologice ale astmului și relația cu parametrii
diagnostici 12
II.2.2 Diagnosticul pozitiv, diferențial și stadializarea astmului
bronșic 22
II.2.3 Astmul bronșic și biomarkerii din aerul expirat 23
II.3 Biosenzori 26
II.3.1 Noțiuni introductive 26
II.3.2 Principiul de funcționare al biosenzorilor pe bază de albastru
de Prusia 29
II.3.3 Senzori electrochimici. Exemple și aplicații 30
III. PARTE PERSONALĂ 32
III.1 Scopul lucrării 32
III.2 Obiectivele lucrării 32
III.3 Materiale și metode 36
III.3.1 Materiale 36
III.3.2 Instrumente și metode 37
III.4 Rezultate și discuții 42
III.4.1 Prepararea nanoparticulelor de aur (AuNP) 42
III.4.2 Modificarea suprafeței electrozilor serigrafiați acoperiți cu aur
cu 2,2'-(etilendioxi)dietantiol (HS -CH 2CH 2OCH 2CH 2OCH 2CH 2-SH;
PEG ), nanoparticule de aur (AuNP) și albastru de Prusia (PB)
(electrozi notați cu: SPE -PB-AuNP -PEG) 44
III.4.3 Activitatea electrochimică a electrozilor modificați SPE -PEG –
AuNP -PB 47
III.4.4 Activitatea electrocatalitică a electrodului SPE -PEG -AuNP –
PB în detecția H 2O2 48
III.4.5 Detecția H 2O2 în funcție de numărul de AuNP depuse pe
suprafața electrodului modificat cu PEG 56
III.4.6 Detecția H 2O2 din condensul de aer expirat 58
III.5 Concluzii 67
IV. ANEXE 70
V. BIBLIOGRAFIE 73

3
Listă de abrevieri

EBC – condens de aer expirat ;
VC – voltametrie ciclică ;
PB – albastru de Prusia (Prussian blue) ;
PW – alb de Prusia (Prussian white) ;
BG – verde de Berlin (Berlin green) ;
AuNP – nanoparticule de aur ;
PEG – polietilen glicol ;
H2O2 – peroxid de hidrogen ;
LBL – multistrat format prin depunerea succesivă a unor straturi polimerice ;
SPE – electrod serigrafiat imprimat pe ecran cu aur ;
SPE / PB – electrod serigrafiat imprimat pe ecran cu aur și albastru de Prusia ;
SPE-PEG / PB – electrod serigrafiat imprimat pe ecran cu aur modificat cu polietilen glicol și
albastru de Prusia ;
SPE-PEG -AuNP / PB – electrod serigrafiat imprimat pe ecran cu aur modificat cu polietilen
glicol, nanoparticule de aur și albastru de Prusia ;
SPE-PEG -Au / PBdrop – electrod serigrafiat imprimat pe ecran cu aur modificat cu
polietilen glicol, nanoparticule de aur și albastru de Prusia depus din picătură;
Electrod A – electrod serigrafiat imprimat p e ecran cu aur modificat cu polietilen glicol, cu
densitate mare de nanoparticule de aur și albastru de Prusia depus prin picurare ;
Electrod B – electrod serigrafiat imprimat pe ecran cu aur modificat cu polietilen glicol, cu
densitate mică de nanoparticule de aur și albastru de Prusia depus prin picurare ;
Sq – rugozitate a supraf eței;
Q – sarcină electrică (Coulomb , C);
AFM – microscopi e de forț ă atomic ă (Atomic Force Microscopy) ;
TEM – microscopie electronică de transmisie (Transmission Electr on Microscopy) ;
DLS – dispersi e dinamică a luminii (Dynamic Light Scattering) .

4
I. INTRODUCERE

Bolile pulmonare, inclusiv astmul, sunt responsabile pentru aproximativ 250.000 de decese în
fiecare an la nivel mondial. În prezent, tratamentul pentru afecțiunile respiratorii se bazează în
principal pe informațiile oferite de performanța funcțională a plămânului, în loc să utilizeze
datele patologice despre inflamația pulmonară. Indicatorii care pot furniza informații din aerul
expirat, cum ar fi peroxi dul de hidrogen (H 2O2), par să aib ă valori crescute înainte ca pacienții
astmatici să fie conștienți de o criză iminentă.
În acest context, lucrarea vizează dezvoltarea unui dispozitiv care să analizeze condensul
rezultat din aerul expirat pentru depistar ea bolilor pulmonare, evolu ția acestora sub tratament,
sau depistarea precoce a crizelor astmatice.
Obiectivul principal al lucr ării de licen ță a fost dezvoltarea unui biosenzor prin analiza
electrochimic ă a H 2O2 din condensul de aer expirat folosin d elec trozi electrochimici
serigrafia ți de aur a c ăror suprafa ță a fost modificat ă cu nanoparticule de aur și albastru de
Prusia (Prussian blue , Fe 7(CN) 18), acesta din urmă fiind un catalizator excelent pentru
detectarea H 2O2 la concentrații mici. În plus, a fost propusă o abordare diferită față de
dispozitivul tradițional de colectare a aerului expirat. Pentru a crește selectivitatea, limita de
detecție și sensibilitatea electrozilor serigrafia ți din aur, ace știa au fost modi ficați pe suprafa ța
activ ă cu st raturi de polietilenglicol (PEG) și nanoparticule de aur (AuNP) , prezent ând
rezultate promițătoare în detec ția sensibil ă a H 2O2 din probele reale de aer respirat colectate.

5
II. STADIUL CUNOAȘTERII

II.1. Elementele esențiale de biofizică ale sistemului respirator
Inspirația (inhalarea) este mișcarea aerului din mediul exterior prin căile respiratorii până la
nivel alveolar.
Expirația este eliminarea aerului din plămâni.
Ciclul respirator = inspirație + expirație
În timpul ciclului respirator ventricolul drept împinge sângele în arterele pulmonare până în
arteriole și capilarele care inconjoară alveolele.
La o persoană adultă sănătoasă 4 litri de aer intră și ies din alveole în fiecare minut, în timp ce
5 litri de sânge sunt pompați de inimă în circulația pulmonară. În timpul efortului fizic
cantitatea de aer ventilat prin plămâni crește de 20 de ori, iar cantitatea de sânge de 5 -6 ori.
În timpul inspirației aerul trece prin cavitatea nazală (sau bucală) în faringe ; faringele se
divizează în esofag (calea alimentară spre stomac) și laringe (parte a sistemului respirator). La
nivelul laringelui se găsesc corzile vocale: 2 lame de țesut elastic dispuse orizontal, cu rol în
producerea sunetelor prin vibrația lor (fig. 1) .
Cavitatea nazală + cavitatea orală + faringe + laringe = CĂILE AERIENE
(RESPIRATORII) SUPERIOARE
Laringele se continuă cu traheea care se ramifică în cele 2 bronhii (dreaptă și stângă) pentru
fiecare plămân. Bronhiile se ramifică în peste 20 generații de bronhiole (fig. 2) :
terminale → respiratorii → canale (ducte) alveolare → saci alveolari
Bronhiol ele sunt înconjurate de țesut muscular neted care prin contracție/relaxare modifică
diametrul lumenului.
Căile respiratorii inferior de laringe se numesc CĂI RESPIRATORII INFERIOARE (fig.
3) și se împart în:
 zona de conducere : de la trahee până la începutul bronhiolelor respiratorii;
 zona respiratorie : dincolo de bronhiolele respiratorii, care conține alveolele și unde
se produce schimbul de gaze.

6
Particulele străine sunt reținute la nivelul cavității nazale cu ajutorul firelor de păr și a
mucusului .

Figura 1. Reprezentare schematică a aparatului respirator ( adaptat după Gilroy et al. 2008 ).

7

Figura 2. Plămânii și aparatul respirator (adaptat după Pocock and Richards 2006) .

Epiteliul căilor respiratorii, până la nivel de bronhiole respiratorii, conține cili cu direcția spre
faringe ; de asemenea conține glande care secretă mucus. Particulele străine (praf de exemplu)
sunt impregnate cu mucus și împinse, prin mișcarea cililor, către faringe și esofag pentru a fi
înghițite. Acest mecanism este foarte important în protejarea plă mânilor împotriva corpilor
străini și mai ales a bacteriilor care pot ajunge, prin aerul inspirat, în plămâni. Fumatul
afectează mișcarea ciliară iar tusea fumătorului conține mult mucus.

8

Figura 3. Reprezentarea schematică a sistemului respirator (adapta t după Gilroy et al. 2008) .

Zona de conducere are următoarele funcții:
1. opune o rezistență scăzută (prin contracția mușchilor netezi din p ereții căilor respiratorii
și prin forțele fizice) fluxului de aer;
2. efect de îndepărtare a microbilor, toxicelor, particulelor străine , cu ajutorul cililor,
mucusului și macrofagelor;
3. încălzește și umidifică aerul inspirat;
4. intervine în fonație prin corzile vocale.
Epiteliul de la nivelul c ăilor respiratorii secret ă un fluid apos care permite mucusului s ă se
deplaseze; producerea acestui mucus este afectată în fibroza chistică cu osbtrucție secundară.
Constricția bronhiolară secundară iritațiilor previne migrarea partic ulelor la nivel pulmonar.
Zona respiratorie = zona alveolară
Alveolele sunt mici saci care se deschid în lumenul bronhiolelor (fig. 4) . Peretele alveolar este
căptușit cu un strat de celule epiteliale turtite (celule alveolare tip I); între aceste celule se
găsesc celulele alveolare tip II care produc surfactant cu acțiune tensioactivă .

9

Figura 4. Saci alveolari. Detaliu structural exterior și în secțiune (adaptat dupa Gilroy et al.
2008) .
Peretele alveolar conține capilare și un spațiu mic interstiți al, care însă poate lipsi. Astfel ,
membranele bazale alveolare și endoteliul capilar fuzionează. Suprafața totală alveolară în
contact cu capilarele se mărește foarte mult (ar putea acoperi un teren de tenis). Această
suprafață imensă și finețea p ereților permit schimbul rapid de gaze (O2 și CO 2) prin difuziune
(fig. 5) . În unii p ereți alveolari există pori care permit circulația aerului între alveole.

Figura 5 . Schimbul de O 2 și CO 2 la nivelul alveolar și celular (adaptat după Pocock and
Richards 2006) .

10
Valori normale ale volumelor respiratorii (ml) :
500 – volum curent (VC)
3000 – volum inspirator de rezervă (VIR)
1200 – volum expirator de rezervă (VER)
1200 – volum rezidual (VR)
(femei  80% din valorile de mai sus, corespunzătoare pentru bărbați )
Capacitate inspiratorie (CI) = VC + VIR
Capacitate vitală (CV) = VC + VIR + VER
Capacitate funcțională reziduală (CFR) = VER + VR
Capacitate pulmonară totală (CPT) = CV + VR
Volumul expirator maxim pe secundă ( VEMS ) se determină pe expirograma forțată: inspir
maxim urmat de apnee inspiratorie și expir maxim, toate sub control voluntar.
Volume și capacit ăți statice :
1. Capacitatea vitala (CV) – reprezintă cantitatea maximă de gaz care poate fi mobilizată
într-o singură mișcare ventilatorie și este o sumă de volume.
Determinarea CV se poate face prin examen spirografic (fig. 6) sau prin pneumotahografie
integrată volumic. Pe traseul spirografic se masoară și subdiviziunile CV: volumul curent
(VC) , volumul inspirator de rezervă (VIR) și volumul expirator de rezervă (VER).
2. Capacitatea inspiratorie (CI ) – volumul maxim de aer care poate fi inspirat când a paratul
toraco – pulmonar iși schimbă poziția de expir de repaus la inspir maxim.
Se calculează pe spirogramă ca sum ă VC + VIR
3. Capacitatea reziduală funcțională (CRF) – volumul de gaz care se găsește în plămâni în
poziția de repaus expirator. CRF reprezintă volumul de gaz în care pătrunde, se amestecă și se
diluează aerul inspirat înainte de a intra în schimb gazos cu sângele.
Determinarea CRF se face prin:
 metoda diluț iei gazelor inerte (N 2, He) ;
 metoda pletismografică (body plethysmography ).
4. Volumul rezidual (VR) – este volumul de gaz care rămâne în plămâni la sfârșitul unei
expirații complete (forțate).
VR nu poate fi evacuat din plămâni la subiectul în viață, astfel încât valoarea acestui volum se
află:
 prin calcul: VR = CRF – VER;

11
 prin metoda diluție i (N2 , He) în respirație unică, în circuit deschis.
5. Capacitatea pulmonara totală (CPT) – este volumul de gaz conținut în plămâni la
sfârșitul unui inspir complet (poziție inspiratorie maximă).
Determinarea CPT se face:
 prin calcul: CPT = CV + VR , sau CPT = CI + CRF;
 prin metoda diluției He prin respirație unică în circuit deschis ;
 prin metoda radiologică: măsurarea CPT pe radiografii toracice, efectuate în proiecții
postero – anterioară și laterală, cu subiectul în apnee după un inspir maximal, eventual
prelucrarea computerizată a rezultatului.

Figura 6. Spirogramă (Capacitate inspiratorie, CI = VC + VIR ; Capacitate vitală, CV = VC +
VIR + VER ; Capacitate funcțională reziduală , CFR = VER + VR ; Capacitate pulmonară
totală , CPT = CV + VR = CI + CRF ; Volum residual, VR = CRF – VER .

12
II.2. Astmul bronșic
II.2.1 Bazele fiziologice ale astmului și relația cu parametrii diagnostici
Definiție : Astmul bronșic (AB) este o boală inflamatorie cronică a căilor aeriene caracterizată
prin hiperreactivitate bronșică la stimuli diverși, cu episoade recurente de bronhospasm care
se exprimă clinic prin dispnee expiratorie cu wheezing și tuse (Koterba and Saltoun 2012;
Myers and Tomasio 2011) .
AB are o evoluție cronică, cu crize și perioade intercritice de aca lmie (asimptomatice). Crizele
pot avea durată variabilă , de la câteva minute la câteva ore, urmate de perioade asimptomatice
sau cu un grad variabil de obstrucție bronșică. Crizele de AB pot avea intensitate diferită, cea
mai severă formă de exprimare clinică fiind starea de rău astmatic (Blakey and Wardlaw
2012; Greenberg et al. 2012; Papiris et al. 2009) .
Din punct de vedere evolutiv AB se clasifică în: intermitent sau persistent, cu grade de
severitate de la ușor la sever și cu r iscul transformării formei intermitente în persistent ă
(National Asthma Education and Prevention Program Expert Panel Report 2007) (National
Asthma Education and Prevention Program 2007; Urbano 2 008).
Elementele definitorii ale astmului sunt:
 afecțiune inflamatorie cronică a căilor aeriene ;
 hiperreactivitate bronșică nespecifică la stimuli variați ;
 episoade recidivante de bradipnee expiratorie: tuse + wheezing + sibilante ;
 survenind în specia l noaptea sau dimineața devreme ;
 reversibile parțial sau total, spontan sau sub tratament .
Hiperreactivitatea bronșică este definită prin (Fireman 2003; Sonnappa et al. 2011) :
 sensibilitate endogenă crescută a căilor aeriene față de o multitudine de stimuli
(histamină, acetilcolină) care, la nivelul căilor aeriene normale, nu provoacă răspuns
bronhomotor;
 se accentuează prin expuneri repetate la stimulii incitatori;
 poate fi tranzitorie (de ex. după anumite infecții virale) sau permanentă (accentuată
cu ocazia acutizărilor bron șitice).
Epidemiologie
Astmul bronșic este diagnosticat la aproximativ 5 -10% din populație, jumătate din cazuri
debutând înaintea vârstei de 10 ani și o altă treime înainte de 40 de ani (Katz et al. 1999; Pesut

13
et al. 2011; Zalewska et al. 2013) . La copii raportul masculin/feminin este de 2/1, egalizarea
pe sexe producându -se în jurul vârstei pubertații (Papadopoulos et al. 2012) .
Etiologie
Clasificare etiolo gică (Koterba and Saltoun 2012) :
 Astmul alergic exogen (extrinsec) – IgE mediat
Este definit ca o reacție alergică la un antigen față de care bolnavul este sensibilizat specific și
care este prezent în mediul său ambiant (exogen).
 Astmul non -alergic
 astmul endogen sau infecțios (intrinsec);
 astmul iritativ fizic sau chimic;
 astmul provocat de efort;
 alte forme de astm cu geneză neprecizată și varianta de astm exprimată prin tuse.
Astmul alergic este diagnosticat frecvent la pacienți cu antecedente personale și/sau familiale
de afecțiuni alergice (urticarie, diferite forme de eczemă, rinită alergică), în contextul unei
predispoziții genetice numită atopie. La acești bolnavi testele cutanate și re spiratorii la diverse
antigene sunt pozitive, iar nivelul seric al IgE este crescut (Franova et al. 2013) . Relația dintre
AB și rinita alergică, dermatita atopică, alergiile alimentare este bine cuan tificată la pacienții
atopici și realizează așa numitul „marș atopic “ (Fig. 7).

Figura 7. Incidența atopiilor la copii funcție de vârstă (după Barnetson and R ogers 2002) .

14
Mecanismul AB alergic este IgE dependent (Fig. 8) , obstrucția căilor aeriene fiind declanșată
la câteva minute după expunerea la alergen; uneori un nou episod bronhoconstrictor se poate
produce la 6 -10 ore dupa contactul inițial cu alergenul, fenomen denumit reacție tardivă.

Figura 8. Evoluția IgE – dependentă a atopiilor (Bieber et al. 2012 ).

În declanșarea răspunsului inflamator de la nivelul căilor respiratorii intervin: mastocitele,
eozinofilele, limfocitele și celulele epiteliale, rolul neutrofilelor și macrofagelor fiind mai
puțin definit (Bos sé et al. 2009; Hussain et al. 2011; Hyde et al. 2009) . Mediatorii eliberați cu
rol major în cascada reactivă sunt reprezentați de histamin ă, bradikinin ă, leucotrienele C, D și
E, factorul activator plachetar și prostaglandinele E2, F2 alfa și D2. Acești mediatori
determină bronhoconstricție, congestie vasculară și edem (Baraldo et al. 2011; Long et al.
2009; Pitchford et al. 2008) . Leucotrienele produc în plus creșterea producției de mucus și
afectează tr ansportul mucociliar. Epiteliul căilor aeriene reprezintă ținta atacului, dar
contribuie și la cascada inflamatorie, amplificând bronhoconstricția prin eliberarea de
endotelină și vasodilatația prin producerea de oxid nitric, prostaglandine E2 și acid 15 –
hidroxieicosatetraenoic rezultat din metabolismul acidului arahidonic.
În mod cu totul particular, la bolnavii astmatici se selecționează și se activează în bronhii o
subpopulație de limfocite Th – Th2 caracterizate prin profilul specific de mediatori elibe rați:
citokine codificate de gene de pe cromozomul (5). Marca imunologică a astmului alergic este
produția excesivă de citokine tip Th2 (IL -3, IL -4, IL -5 și IL -13, GM -CSF) ca răspuns la un
alergen. Prin IL -3 sunt stimulate mastocitele, prin IL -5 și prin GM -CSF se recrutează și se

15
activează eozinofilele, iar IL -4 este responsabilă de apariția unei clone de limfocite B
secretoare de IgE specific pentru alergenul respectiv (Fig. 9) .

Figura 9. Patogenia astmului bronșic (adaptare dup ă National Asthma E ducation and
Prevention Program 2007) .

IgE specific secretate sunt citofile și se leagă de receptorii cu afinitate mare (FceRI) care se
găsesc în special pe suprafața mastocitelor și a bazofilelor, precum și de receptorii cu afinitate
mică (FceRII) ce se găsesc pe suprafața macrofagelor, eozino filelor și a altor celule
(Anderson 2010; Rasmussen et al. 2002) .
Inflamația cronică a căilor aeriene
Eozinofilele sunt considerate efectorul principal în infla mația cronică persistentă din astm,
acționând prin intermediul următorilor mediatori: mediatori preformați (MBP – proteina
bazică majoră, ECP – proteina cationică eozinofilică , EPO – peroxidaza eozinofilică și EDN –
neuropeptidaza derivată din eozinofil e), radicali liberi derivați din oxigen (RLDO) și derivați
ai metabolismului acidului arachidonic, în principal cisteinleucotrienele, factori de creștere
fibrogenici și citokine de tip LTh2 (IL3, IL5, GM -CSF) (Gherasim 2002; Rasmussen et al.
2002) .
Mediatorii principali ai reacției de tip tardiv sunt cisteinleucotrienele acționând prin:
bronhoconstricție (efect de 103 ori mai intens decât al histaminei), vasodilatație cu creșterea
permeabilit ății și exudare plasmatică cu edem, creșterea secreției de mucus și hi perreactivitate

16
bronșică. Particulare pentru reacția tardivă sunt efectele citotoxice asupra epiteliului bronșic,
în special ale MBP și RLDO, iar stimularea miofibroblastelor cu sintez ă de fibronectină și
colagen contribuie la procesul de remodelare bronși că (Anderson 2010; Gherasim 2002;
Rasmussen et al. 2002) . Trei componente ale sistemului nervos autonom joacă un rol în
controlul tonusului căilor aeriene și al secrețiilor ace stora: sistemul colinergic, via nervul vag;
sistemul adrenergic și sistemul nonadrenergic noncolinergic (NANC) sau sistemul
peptidergic. Fiecare din tre acestea, împreun ă cu/sau mediatorii inflamației, sunt implicate în
geneza astmului.
Remodelarea căilor aeriene este definită ca alterarea structurii căilor aeriene determinată de
prezența procesului inflamator cronic și constă în: creșterea masei musculare prin hiperplazie
și hipertrofie; hipertrofia glandelor mucoase; îngroșarea laminei reticularis prin de punerea de
colagen sub membrana bazală; dilatarea vaselor sanguine subepiteliale.
Tablou clinic
Clasificare clinică :
 Astm intermitent : criza de astm bronșic
 Astm persistent (astm intrinsec): pacientul are simptome bronhospastice permanente, de
diverse grade de severitate
 Stare de rău astmatic
Astmul bronșic se caracterizează din punct de vedere clinic prin triada: dispnee, tuse și
wheezing , cu apariție episodică și reversibilitate cel puțin partială.
Anamneza poate evidenția istoric de atopie, eczeme, rinită alergică, polipoză nazală (în cazul
astmului alergic), intercurențe respiratorii, administrare de antiinflamatorii nesteroidiene,
factori de risc profesional, efort etc.
În astmul alergic, manifestările se produc în prezența unor alergene variabile : praf de cas ă
(Dermatophagoides pteronyssimus), polenuri (graminee, chiparos, ar țar, etc.), făină
(Dermatophagoides farinae), aerosoli chimici vaporizați, alergeni casnici (detergenți), p ăr de
animale (pisici, câini) (Arshad et al. 2001; Bateman et al. 2008) .
În astmul non -alergic, trigger -ul este reprezentat de infecții virale (virus sincițial respirator,
parainf luenzae tip III, rhinovirus), efort fizic, administrare de medicamente (antiinflamatoare
nesteroidiene), coloranți (tartrazina), expunere profesională, poluare atmosferică (SO 2, ozon),
exercițiul fizic, fumat, emoții intense.

17
Debutul crizei este precedat uneori de catar r espirator și anunțat de o senzație de constricție
toracică, adesea însoțită de tuse seacă, neproductivă. Simptomatologia apare sau se intensifică
în cursul nopții sau dimineața la trezire. Respirația devine zgomotoasă, cu wheezing și expir
prelungit, pe fo ndul unei polipnei moderate. Toracele este hiperinflat, hipersonor, cu bazele
coborâte și cu mobilitate redus ă. Murmurul vezicular este diminuat iar ralurile sibilante,
prezente în ambele faze ale respirației, sunt fine, cu tonalitate înaltă. Cordul este t ahicardic,
iar tensiunea arterială sistolică are tendință de creștere. Datorită presiunii intratoracice
negative, poate să apară un puls paradoxal.
La sfârșitul crizei dispneea se reduce treptat, persistând timp de câteva ore expirul prelungit și
câteva raluri sibilante și subcrepitante bazal („zgomotul de porumbar“). Treptat, începe să
apară expectorația mucoasă, redusă cantitativ și foarte vâscoasă, în care se pot observa mici
sferule („spută perlată“).
Examenul microscopic al sputei poate pune în evidență, mai ales în astmul alergic, spirilele
Cushmann, corpi Creola și cristalele Charcot -Leyden.
Formele severe dezvoltă o insuficiență respiratorie acută, dominată de dispnee intensă și
cianoză. Bolnavii nu pot tuși deoarece inspirul este foarte scurt iar expirul lung, ineficient,
toracele fiind practic blocat în inspir, cu amplitudinea mișcărilor respiratorii foarte mult
redusă. Murmurul vezicular es te diminuat, cu puține raluri sibilante fine, deoarece fluxul
aerian prin conductele aeriene este foarte dificil. Bolnavii sunt ortopneici, cianotici,
tahicardici, cu puls paradoxal, anxioși și cu senzația de „moarte iminentă”. Această stare,
cunoscută și ca starea de de rău astmatic ori astmul acut grav al adultului, necesită măsuri
de terapie intensivă și chiar protezare ventilatorie.
Astmul medicamentos este provocat de aspirină sau alte antiinflamatoare nonsteroidiene,
beta-blocante, penicilină, morfină etc.
Astmul de efort este provocat de efortul fizic, care poate declanșa crize de bronhospasm
legate de condiționarea termică a aerului inhalat.
Astmul secundar bolilor sistemice poate însoți vasculitele de tipul maladiei Wegener sau
angeitei alerg ice și granulomatoase Churg -Strauss.
Astmul cu dispnee continuă este o formă gravă, observată la as tmaticii în vârstă, evoluând
spre insuficiență respiratorie cronică.

18
Factori care au rol în etiopatogenia AB (Moneret -Vautrin 2010; Stassen et al. 2012) :
A. Factori de mediu
1. Alergia la:
 praful de casă ;
 polen ;
 fungi i atmosferici: mucegaiurile și levurile ;
 alergenii de origine animală (descuamări de epidermă de om și animale, peri, pene,
lână) și vegetală (bumbac) ;
 alergenii profesionali (pulberi, poluare) .
Alergia la praful de casă (în special la componentele de acarieni) este cea mai frecventă
cauză a astmului alergic!
2. Infecția bronșică
 virală : influenza, parainfluenza, virusul sincițial respirator ;
 bacteriană : pneumococul Haemophillus influenzae , stafilococul auriu .
3. Fumatul (inclusiv cel pasiv)
4. Expuneri profesionale – principalele medii industriale în care apar cazuri de astm bronșic
sunt: prezența de săruri de metale (plumb, crom, nichel), pulberi vegetale și de lemn (stejar,
cedru), industria farmaceutică (antibiotice, piperazină, enzime pancreatice), industria chimică
și cea a maselor plastice (diisocianat de toluen, persulfați, acid ftal ic etc.), industria
detergenților și a produselor pentru spălare (l iposistem), zootehnie și industria de prelucrare a
pieilor de animale (Bogdan 2008; Katz et al. 1999) .
5. Poluar ea din casă/atmosferică: în mediul urban și în zonele industriale poluarea
atmosferică este responsabilă de apariția unor cazuri de astm bronșic în special prin ozon, SO 2
și NO 2.
B. Factori endogeni (intrinseci)
 obezitatea ;
 sexul (incidență mai mare a astmului la băieți în copilărie și adolescență și mai
ridicată la femei la vârsta adultă) ;
 factori genetici : riscul crește dacă unul (sau ambii) părinți este astmatic (Anderson
2012; Cullinan 2009) .

19
Predispoziția genetică intervine în secreția de IgE, modularea hiperreactivității bronșice, în
secreția de citokine și orientarea răspunsului imun (Th1/Th2) precum și în răspunsul
receptorilor beta2 adrenergici la stimulare (Anderson 2012; Cullinan 2009) .
Factori declanșatori ai crizei de astm :
 alergici : praf de casă, polen, mucegaiuri, dejecții sau fanere de păsări și animale,
medicamente, conservanți, detergenți, vopsele, poluanți atmosferici ;
 infecțioși ;
 efort ul fizic: este un factor precipitant al crizelor de astm, dependent de temperatur a și
umiditatea aerului inspirat; cu cât ventilația este mai intens ă și aerul mai rece, cu at ât
severitataea crizelor este mai mare, în condiții de poluare atmosferică crescută (Gibson
et al. 2013; 2018 GINA Report) ;
 endocrini : sarcin ă, tulburări menstruale ;
 stres ul psihic : factorii emoționali pot interacționa cu diateza astmatică, ameliorând
sau agravând crizele, printr -un mecanism complex cu implicarea activității eferente
vagale ;
 unele medicamente : pot induce crize de astm bronșic aspirina și antagoniștii beta –
adrenergici; antiinflamatoarele nesteroidiene pot produce crize de astm prin efectul
de favorizare a sintezei de leucotriene consecutiv inhibiției ciclooxigenazei (Asamoto
et al. 1999; Chan 1995) .
Fiziopatologie
Elementul central în astm este limitarea fluxului de aer în căile aeriene ca urmare a îngustării
calibrului lor, aparută pe fondul hiperreactivit ății bronșice (Rasmussen et al. 2002) .
Mecanismele obstrucției bronșice cu limitarea fluxului de aer (Fig. 10) sunt:
 bronhoconstricția (pe fondul hiper -reactivității bronșice) , hipersecreția de mucus cu
formarea de dopuri intraluminale , exudatul inflamator intraluminal;
 edemul peretelui bronșic;
 remodelarea peretelui bronșic.
Limitarea fluxului de aer are corespondent funcțional sindromul obstructiv, definit prin
creșterea rezistenței la flux și scăderea debitelor expiratorii instantanee și medii. Obstru cția
din astmul bronșic se caracterizează prin reversibilitate spontană sau după un medicament
bronhodilatator (ameliorarea cu peste 12% față de valorile ini țiale) și variabi litate în timp
(valori mult modificate la interval de minute, ore, inclusiv pe parcursul aceleiași zile), cel mai
bine evidențiată prin monitorizarea PEF. În obstrucțiile moderate sau severe se asociază

20
hiperinflația când cresc volumele pulmonare (volumul rezidual în special) iar volumele
mobilizabile pot scădea (capacitatea vital ă) (Anderson 2010; Copula et al. 2006; Weiler et al.
2007) .
O altă caracteristică a AB este hiperreactivitatea bronșică la o varietate de stimuli având
drept consecință îngustarea lumenului căilor aeriene (Copula et al. 2006) .

Figura 10. Mecanismele bronhoconstricției datorate expunerii la alergeni (după Kroegel
2009) .

Obstrucția căilor aeriene din astm se însoțește de hipoxemie ; hiperventilația indusă de
hipoxemi e tinde să scadă nivelul PaCO 2 (hipocapnie ). Transferul gazos prin membrana
alveolocapilară este în mod caracteristic nemodificat în astm, criteriu de diagnostic diferențial

21
cu BPOC (unde transferul gazos este scăzut proporțional cu gradul de emfizem) (Anderson
2010; National Asthma Education and Prevention Program 2007) .
Diagnostic paraclinic
1. Spirograma/spirometria : probele fun cționale ventilatorii arată valori scăzute ale volumului
expirator forțat în prima secundă (FEV1) și/sau a volumului expirator de vârf ( „peak
expiratory flow rate ” – PEF), cu reversibilitate spontană sau sub tratament. Se mai poate
evalua și rata maximă a fluxului expirator obținută atunci când se atinge ½ din capacitatea
vitală expirată forțat (MEF50) , parametru care arată prezența unei obstrucții pe căile aeriene
mici. Raportul procentual dintre FEV1 și capacitatea vitală expirată forțat ( „forced expiratory
vital capacity ” – FVC) este scăzut, constituind un argument pentru diagnostic. Variabilitatea
PEF este caracteristică astmului bronșic, valorile crescând cu peste 20% după administrarea
de bronhodilatator (beta -2 adrenomimetic) cu durată scurtă de acțiune și prezentând variații
diurne de circa 20% (10% atunci când se fac două determinari în aceeași zi) (Anderson 2012;
Zynger et al.) . În acest fel, măsurarea zilnică a PEF timp de 2 -3 săptămâni poate stabili
diagnosticul la pacienții asimptomatici. Capacitatea reziduală funcțională și volumul rezidual
sunt crescute, demonstrând sindromul de hiperinflație. PEF poate să scadă cu circa 15% î n 5-6
minute de la debutul unui efort fizic, iar la pacienți cu forme u șoare, între crize valorile PEF
pot fi normale.
2. Testul de reversibilitate la bronhodilatator : ameliorarea cu 15% sau mai mult a PEF după
administrarea de beta -2 adrenomimetic cu dura tă scurtă de acțiune Totuși, în formele severe
persistente, cu obstrucție bronșică fixă, reversibilitatea se poate demonstra numai după 2
săptămâni de tratament cu corticoid inhalator.
3. Evidențierea hiperreactivității bronșice se face prin testul de pro vocare cu metacolină sau
histamină (la pacienții cu spirometrie normală). În caz de pozitivitate se înregistrează scăderea
PEF cu 15 -20% (reversibilă după administrarea de bronhodilatator).
4. Explorarea imagistică prin radiografie pulmonară este important ă pentru diagnosticul
diferențial. Între crize radiografia pulmonară este normală, iar în cursul exacerbărilor
moderate/severe apar semne de hiperinflație pulmonară cu hipertransparență pulmonară,
aplatizarea diafragmelor, orizontalizarea coastelor și creș terea spațiului clar retrosternal.
5. Determinarea gazelor sangvine nu este esențială în diagnosticul sau monitorizarea
pacientului astmatic între crize. În cadrul unei crize moderate se înregistrează alcaloză

22
respiratorie, în timp ce exacerbările severe se caracterizează prin hipoxemie cu hipocapnie.
Când apare hipercapnia se indică ventilația mecanică.
6. Explorarea biologică :
 hemograma este de obicei normală, dar circa 25% din tre pacienți pot prezenta
eozinofilie sanguină;
 IgE serice sunt crescute la astmaticii atopici ;
 testarea alergologică și determinarea IgE specifice.

II.2.2 Diagnostic ul pozitiv, diferențial și stadializarea astmului bronșic
Diagnosticul pozitiv și diferențial
Diagnosticul pozitiv este susținut pe triada dispnee expiratorie, tuse și wheezing, asociată
stetacustic cu prezența ralurilor sibilante, cu apariți e episodică și recurentă, spațiată de
perioade asimptomatice. Episoadele de bronhospasm sunt declanșate fie de alergene
respiratorii, fie de alți factori -trigger nealergici (infecție, efort, poluanți atmosferici, agenți
farmacologici, factori profesionali) și se caracterizează funcțional prin scăderea FEV1, PEF și
raportului FEV1/FVC (%) cu reversibilitate spontană sau sub tratament.
Demonstrarea variabilit ății PEF este caracteristică, acesta crescând cu peste 15% în 15 -20 de
minute după administrarea de beta -2 adrenomimetic.
Diagnosticul diferențial implică la copii excluderea corpilor străini traheobronșici,
mucoviscidoze i, bronșiectaziilor, refluxului gastroesofagian, malformațiilor vasculare. La
adult trebuie excluse bronhopatia cronică obstructivă, tromboembolismul pulmonar,
insuficiența cardiacă, afecțiuni în sfera ORL, refluxul gastroesofagian, tumorile sau corpii
straini endobronșici.
Stadializarea astmului bronșic
Severitatea AB este apreciată în funcție de frecvența episoadelor de bronhospasm, manifestări
nocturne, gradul de limitare a activit ăților fizice uzuale) , datele explorărilor funcționale
(valorile PEF și FE V1 și gradul lor de variabilitate (National Heart Lung and Blood Institute –
Third Expert Panel on the Management of Asthma) (National Asthma Education and
Prevention Program 2007) . AB poate fi intermitent și persistent ușor, moderat și respectiv,
sever (Tabel I) .

23

Tabel I. Stadializarea gravității astmului în raport cu datele clinice și funcționale
(conform „ Guidelines for the diagnosis and management of asthma ”) (Gherasim 2002) .

II.2.3. Astmul bronșic și biomarkerii din aerul expirat
Estimările recente arată că în jur de 300 de milioane de oameni de toate vârstele , rasele și
genurile suferă de diverse boli pulmonare, inclusiv astm, iar diferite forme de astm sunt din ce
în ce mai frecvente atât la copii, cât și la adulți (Kharitonov and Barnes 2002) . Astmul este
responsabil pentru aproximativ 250.000 de decese în fiecare an la ni vel mondial. Bolile
pulmonare, cum ar fi astmul, implică inflamația cronică și stresul oxidativ. Stresul oxidativ
este definit ca dezechilibrul dintre oxidanți și capacitățile a ntioxidante. Perturbarea st ării
redox normal e a țesutului pulmonar poate provoca efecte toxice prin producerea de peroxizi
(cum ar fi H 2O2) și oxid nitric (NO). Severitate Simptome Date Func ționale
Intermitent (I) – Mai rar de 1/săptămână
– Simptome nocturne mai rar de 2/lună
– Asimptomatic între exacerbări sau numai
exacerbări scurte – PEF sau FEV1: ≥80% din
valorile teoretice
– Variabilitate PEF sau FEV1:
< 20%
Persistent
ușor (II) – Simptome mai frecvent de 1/săptămână
dar mai rar de 1/ zi
– Exacerb ările pot afecta activitatea și somnul
– Simptome nocturne mai frecvent de 2/lună – PEF sau FEV1 : ≥ 80% din
valorile teoretice
– Variabilitate PEF sau FEV1:
20-30%
Persistent
moderat (III) – Simptome zilnice
– Exacerbările pot afecta activitatea și somnul
– Simptome nocturne mai frecvent de
1/săpt ămână
– Utilizare zilnică de beta2 -agoniști adeno –
mimetici , inhala tor cu durată scurtă de acțiune – PEF sau FEV1: 60 -80% din
valorile teoretice
– Variabilitate PEF sau FEV1 :
> 30%
Persistent
sever (IV) – Simptome zilnice
– Exacerbări frecvente
– Simptome nocturne frecvente
– Limitarea activit ății fizice – PEF sau FEV1 : ≤ 60% din
valorile teoretice
– Variabilitate PEF sau FEV1 :
> 30%

24
Un mod neinvaziv de monitorizare a inflamației și a stresului oxidativ la pacienții cu astm
bronșic este reprezentat de analiza unor biomarkeri din aerul expirat, cum ar fi gazele expirate
și condensatele.
Analiza compușilor organici volatili din aerul expirat de o persoană reprezintă o metodă
modernă, rapidă și neinvazivă pentru screening -ul pe scară largă în evaluarea unei afecțiuni
(Boots et al. 2012; Buszewski et al. 2007; Konvalina and Haick 2014) . Teste respiratorii au
fost utilizate în evaluarea unor boli grave cum ar fi diferite tipuri de cancer, bolile Parkinson
și Alzheimer, tuberculoza, scleroz a mul tiplă și boala renală cronică (Broza and Haick 2013;
Hakim et al. 2012) .
Metodele analitice convenționale acceptate pentru determinarea biomarkerilor din aerul
expirat, cum ar fi: spectrome tria de masă, spectrofotometria, chemiluminescența,
cromatografia și electroforeza capilară au costuri ridicate, complexitate mare, necesită
personal instruit și laborator specializat. Analizarea aerului respirat implică un proces
complex, în mai multe eta pe, fiecare pas având propriile sale avantaje și dezavantaje în ceea
ce privește performanța.
În ultimii ani, o atenție deosebită a fost acordată metodelor care utilizează senzori pe bază de
nanomateriale, deoarece permit dezvoltarea de detectoare foarte sensibile, rapide, ieftine și nu
necesită personal specializat în exploatarea și interpretarea rezultatelor. Astfel se poate realiza
un design precis pentru a răspunde relației proprietăți – selectivitate (dimensiune nanometrică,
compoziție chimică, proprietăți fizice, chimice și optice), reducându -se costurile de fabricație
și ale exploatării metodei.
Diferite nanomateriale au fost utilizate în construcția unor elemente de detectare a
substanțelor volatile din aerul expirat, cum ar fi nanoparticule și nanofire din diferite
materiale și nanotuburi de carbon, prezentând avantaje în ceea ce privește raportul mare între
suprafață și volum, alegerea unei compoziții chimice adecvate, unicitate a proprietatilor optice
și electrice (Tisch and Haick 2010) . Totodată, nanomaterialele, datorită dimensiunii
nanometrice, sunt sensibile la entități cu dimensiuni similare, iar prin combinarea acestora cu
elemente de recunoaștere țintită se pot construi „dispozitive” care pot fi utilizate ca senzori cu
receptori specifici (tip „lacăt-cheie ”) cu sensibilitate ridicată (limita de detec ție în domeniul
ppm), sau ca senzori care au sensibilitate mai scăzută, denumiți „nasuri electronice” , care sunt
utilizați de obicei pentru caracterizarea unor probe necun oscute (Marom et al. 2012; Röck et
al. 2008) .

25
În acest context, analiza biomarkerilor din condensul de aer expirat reprezintă o nou ă
frontieră în diagnosticarea medicală, deoarece este o modalitate neinvazivă și necostisitoare
de a evalua anumite boli sau de a monitoriza răspunsul la un anumit tratament (Caffarelli et al.
2012) .
Fiziologic, aerul exp irat este constituit predominant din vapori de apă și particule aerosolizate,
generate de fluidul care căptușește căile respiratorii (ALF). Prin răcirea vaporilor de
respirație, se obține condensul de aer expirat (EBC), care poate fi colectat și a cărui
compoziție biochimică s -a dovedit a fi foarte similară cu ALF. Sensibilitatea crescută a
metodelor de detecție a biomarkerilor și tehnica simplă au impus EBC ca o abordare nouă și
importantă în diagnosticare.
Peroxidul de hidrogen din aerul expirat (H 2O2) este un marker analiz at în multe studii recente,
deoarece s -a dovedit a nu fi descompus de enzimele antioxidante (Kharitonov and Barnes
2002) . Evalu area EBC -ului colectat de la pacienți cu diferite afecțiuni inflamatorii pulmonare
a evidențiat prezența H 2O2 într-un nivel ridicat, corelat cu numărul de eozinofile din bronhii.
Peroxidul de hidrogen (H 2O2) și nitritul (NO 2) au fost raportați cu valori mari în stadiul
prodromal al crizei astmatice, intervenind în monitorizarea clinico -terapeutică a pacienților cu
astm br onșic (Franova et al. 2013) .
Producția de O 2 și implicit formarea de H 2O2 este dependentă de prezența reacției inflamatorii.
H2O2 traversează membranele biologice și este preluat de vaporii de apă din aerul expirat ,
fiind astfel un marker important în evaluarea stresului oxidativ la nivel pulmonar.
S-a demonstrat existența unei diferențe semnificative între concentrația H 2O2 în EBC recoltat
la pacienții astmatici și la persoane sănătoase (Franova et al. 2013) . Pacienții diagnosticați cu
astm bronșic au o concentrație medie de 0,127±0,08 μmol/ L, în timp ce non -astmaticii au o
concentrație medie de 0,024 ± 0,016 μmol/L în aerul expirat; concentrația H2O2 s-a dovedit a
fi corelată cu iminența crizei astmatice (Emelyanov et al. 2001) .
Condensul de aer expirat ( „exhaled breath condensate ”, EBC) reprezintă o abordare simplă și
neinvazivă de colectare a fluidelor de la nivelul căilor respiratorii. EBC conține numeroși
compuși organici și anorganici, biomarkeri ai inflamați ei pulmonare, cu valori variabile în
diferite boli pulmonare: astmul bronșic, boala pulmonară obstructivă cronică (BPOC),
bronșiectazia, infecțiile pulmonare și cancerul pulmonar.

26
Evoluția metodelor de colectare a probelor combinată cu dezvoltarea unor tehnici cât mai
sensibile și mai simple pentru analiza biomarkerilor pot fi extrem de utile în monitorizarea
inflamației pulmonare sau evaluarea răspunsului la un anumit tratament .
II.3. Biosenzori
II.3.1. No țiuni introductive
Pe lângă metodele de analiză existente, care sunt costisitoare si limitate la un laborator
specializat, abordările electrochimice au unele avantaje: sensibilitate ridicată, răspuns rapid,
cost redus, operare simplă, chiar și în afara laboratorului. Posibilitatea de miniaturizare , atât a
electrozilor (fabricați prin serigrafiere) cât si a potențiostatului (minipotențiostat), modificarea
chimică inovativă a suprafeței electrozilor pentru analiza unei game variat e de compuși,
permit construirea de dispozitive portabile care facilitează efectuarea de analiz e inclusiv în
afara laboratorului specializat.
În contextul acestei lucrări, accentul se va pune pe:
1. Dezvoltarea/sinteza unor noi materiale de electrod corelate cu electrochimia suprafeței,
astfel încât să asigur e detecția analitului de interes (H 2O2) cu o sensibilitate cât mai înaltă ,
pentru a face posibilă cuantificarea din probe fluide recoltate de la pacienți cu afecțiuni
inflamatorii respiratorii;
2. Dezvoltarea senzorilor electrochimici pentru detecția sensibilă, rapidă și simplă a H 2O2
considerat ca fiind un indicator al afecțiunilor respiratorii .
Metode electrochimice pentru detectarea H 2O2
Peroxidul de hidrogen (H 2O2) este important deoarece (Karyakin 2001) :
 este un produs secundar al oxidazelor (= enzime care sunt incluse in mai mult de
90% din biosenzorii existenți pe bază de enzime sau în kituri analitice);
 se poate detecta electrochimic la potențial scăzut utilizand mediatori electrochimici
care ofera o s ensibilitate ridicată și o selectivitate ridicată în prezența altor compuși
ușor oxidabili .
Au fost dezvoltate numeroase metode analitice pentru detectarea H 2O2, inclusiv tehnici
electrochimice (Anastassiou et al. 2004) . Măsurările electrochimice se referă la răspunsul unui
electrod (curent sau tensiune) pentru un semnal de intrare (tensiune sau curent) care produce
un proces chimic la suprafața electrodului, respectiv la interfata solid/lichid. Acestea oferă
posibilitatea de a caracteriza și de a cuantifica diferiți compuși chimici (prin informații

27
termodinamice sau cinetice) prin u tilizarea curentului sau a tensiunii ca forme de excitație.
Pentru a îmbunătăți limitele de selectivitate și de sensibilitate ale determinărilor
electrochimice, au fost luate în considerare diferite materiale și tehnici de modificare a
electrodului.
Există însă și unele dezavantaje legate de tehnica propriu -zisă. În primul rând, imobilizarea
optimă a materialului/enzimei, astfel încât să asigure o bună stabilitate biosenzorului, este un
proces foarte complicat. Activitatea enzimatică poate fi ușor afectată de micile modificări ale
condițiilor de funcționare, cum ar fi temperatura, pH -ul, produșii de reacție toxici, ceea ce
poate conduce la stabilitate și reproductibilitate reduse. În plus, enzimele sunt reactivi
costisitori și, astfel, măresc costurile anal izei.
Dezvoltarea unui nou senzor non-enzimatic pentru H 2O2 reprezintă un interes major de
cercetare, existând recenzii recent publicate privind analiza electrochimică a H 2O2 pe bază de
nanoparticule metalice (Chen et al. 2013; Pingarrón et al. 2008; Rad et al. 2011) și
electrocatalizatori pentru oxidarea/reducerea H 2O2 (Chaubey and Malhotra 2002; Zen et al.
2003) .
Din aceste studii rezultă că electrocatalizatorul cu cea mai bună activitate față de reducerea
H2O2 este Fe7(CN) 18, cunoscut sub denumirile de albastru de Prusia , hexacianoferat feric,
Prussian Blue (PB) și care, datorită activității sale ridicate, selectivității și proprietăților
biocatali tice, este considerat o „peroxidază artificială ” (Karyakin et al. 1998) . PB a fost
utilizat în construirea unui număr mare de biosenzori bazați pe enzime de tipul oxida zelor
pentru a nalize clinice, de mediu și alimentare (Ricci and Palleschi 2005) . Detectarea selectivă
a H 2O2 prin reducerea acestuia în prezența electrodului electrochimic modificat cu PB a fost
demonstrată pe ntru prima dată în 1994 de către grupul lui Karyakin (Karyakin et al. 1994) .
Unul dintre principalele avantaje ale utiliz ării PB pentru detectarea H 2O2 este că sinteza
chimică a PB se poate realiza direct pe suprafața electrodului electrochimic folosit pentru
detecția H 2O2. Aproape toate procedurile adoptate pentru depunerea PB se bazează pe o
metodă chimică care implică reacția simplă dintre clorura ferică și fericianur ă, rezultând, în
cele mai multe cazuri, un exces de PB depus într-un strat gros, cu stabilitate scăzută (Karyakin
et al. 2000; Li et al. 2007; Ricci et al. 2003) .
O altă abordare pentru sintez a PB implică aplicarea unui potențial electrochimic constant
(Garjonyte and Malinauskas 2000) sau ciclic (Chi and Dong 1995; Itaya et al. 1982; Zeng et

28
al. 2008) la electrodul pe care se dorește depunerea acestuia, electrod care este imersat într -o
soluție de ioni ferici și fericianat.
Depunere a PB pe suprafața electrodului poate fi reali zată, de asemenea, prin auto -asamblare,
metod ă ce este caracterizată prin alternanța adsorbției electrostatice a componentelor încărcate
(Millward et al. 2001) . Karyakin și col. (Karyakin and Chaplin 1994) au studiat
electrodepunerea filmelor de polipirol -PB în diferite condiții de voltametrie ciclică, arătând că
morfologia acestora poate fi modific ată prin schimbarea condiț iilor electrochimice. Li și col .
(Li et al. 2007) au raportat integrarea PB împreună cu nanotuburile de carbon cu mai mulți
pereți într -o matrice polimerică de poli (4 -vinilpiridină) în construirea de senzori
electrochimici cu sensibilitate îmbunătățită pentru detectia H2O2. A fost semnalată în
literatură și formare a de filme compozite de tip PB/polianilină/nanotuburi de carbon prin
electrodepunere pas cu pas pe suprafața unui electrod (Zou et al. 2007) , în timp ce un
compozit format din oxid de grafen ă, PB și chitosan a fost preparat printr -un proces cu o
singură etapă (Gong et al. 2013) .
Progrese importante în obținerea materialelor de electrod au fost făcute prin includerea in
matrici anorganice obținute prin metoda sol -gel (Doroftei et al. 2014; Lev et al. 1 997; Opallo
2002) . Aceste materiale oferă mai multe avantaje față de polimerii organici, incluzând
rigiditatea fizică, inerția chimică, umflarea neglijabilă în soluții apoase sau organice,
stabilitatea fotochimică și termică și transparența optică.
Miecznikowski și col . (Miecznikowski et al. 2000) au investigat hexacianoferatul de fier ca
dopant în silice în condițiile unui experiment voltammetric în stare solidă, demonstrând că
centrele redox de fier hexacianoferrat încapsulate par să fie în starea coloidală dispersată si nu
sub forma unui film polimeric rigid.
Nanoparticulele de aur (AuNP) depu se pe suprafața unui electrod sunt obiectul a numeroase
studii cu aplicații în biologie și medicină, inclusiv diagnostic, terapie și profilaxie. Mulți
cercetători au folosit nanoparticule de aur (AuNP) conjugate cu proteine sau PB pentru a
dezvolta electro zi modificați pentru detectia H 2O2, posedând avantaje certe, cum ar fi:
imobilizare ușoară pe suprafața electrodului, marind suprafata activa a electrodului (Qiu et al.
2007; Yagati et al. 2012) .
Formarea și structura albastrului de Prusia (PB)
PB este produs în mod tipic în urma unei reacți i dintre doi compuși, K4[FeII(CN) 6] și FeCl 3, în
care atomii de fier prezintă stări diferite de oxidare :

29
4FeIII+Cl3 + 3K 4[FeII+(CN) 6]IV- → Fe 4III+[FeII+(CN) 6]3IV- + 12KCl (1)
PB insolubil

FeIII+Cl3 + K 4[FeII+(CN) 6] IV- → KFeIII+[FeII+(CN) 6] IV- + 3KCl (2)
PB solubil
KFeIII+[FeII+(CN) 6] este forma solubilă a PB în timp ce Fe 4[Fe(CN) 6]3 este forma insolubilă a
PB, dar pentru o bună activitate catalitică a PB existența ambelor forme este necesară. PB
insolubil nu poate prezenta conductivitate ionică deoarece nu are ioni de K+ în structura sa, în
schimb PB solubil prezintă o mobilitate ion ică ridicată a ionului K+ datorită puterii de
hidratare (Miecznikowski et al. 2000) . Aceste caract eristici nu se referă la solubilitatea reală
în apă (de fapt, ambele forme sunt insolubile), ci mai degrabă indică ușurința cu care ionii de
potasiu migrează de la o specie chimică la alta (Ricci and Palleschi 2005) .
Structura cristalină a PB a fost discutată inițial de Keggin și Miles (Keggin and Mil es 1936)
pe baza modelelor de difracție a pulberii. Forma solubilă a PB are o structură cubică de bază
constând din fier (II) și fier (III) alternant, localizat pe o față a cubului centrat pe față ( Fig.
11), astfel încât ionii de fier (III) sunt înconju rați octaedric cu atomi de azot, iar ionii de fier
(II) sunt înconjurați de atomi de carbon. Forma insolubilă diferă prin faptul că ionii ferici
înlocuiesc ionii de potasiu în locurile interstițiale.

Figura 1 1. Structura cubică a PB propusă de Keggin și Miles (Keggin and Miles 1936) .

II.3.2. Principiul de func ționare al biosenzorilor pe baz ă de albastru de Prusia

30
Pentru caracterizarea filmului de PB , în detecția electrochimică este utilizat semnalul generat
de transferul de electroni care apare la oxidarea ionului Fe2+ în Fe3+ sau la reducerea Fe3+ în
Fe2+. Ellis și col. (Ellis et al. 2002) au presupus inițial că în procesul electrochimic este
implicată forma solubilă a PB, iar reacțiile ele ctrochimice de la interfața PB/electrod sunt de
tipul:

KFe3+[FeII+(CN) 6]IV- + K+ (din KCl) + e- ↔ K 2FeII+[FeII+(CN) 6]IV- (3)
PB solubil (e c. 2) Prussian White (PW)
KFeIII+[FeII+(CN) 6]IV- ↔ K 1/3 [FeIII+(CN) 6]2/3 [FeII+(CN) 6]1/3 + 2/3K+ (din KCl) + 2/3e- (4)
PB solubil (e c. 2) Berlin Green (BG)
Itaya și col. (Itaya et al. 2002) au demonstrat ulterior existența unui alt tip de reacții
electro chimice :
Fe4III+[FeII+(CN) 6]3 IV- + 4K+ (as KCl) + 4e- ↔ K 4Fe4II+[Fe2+(CN) 6]3IV- (5)
PB insolubil (e c. 1) Prussian White
Fe4III+[FeII+(CN) 6]3 IV- + 3A- – 3e- ↔ Fe 4III+[FeIII+(CN) 6A-]3IV- (6)
PB insolubil (e c. 1) Berlin Green
unde A- reprezinta specia anionică (in cazul nostru Cl-).
Aceste observații au stat la baza explicării rolului dublu (de electrocatalizator și de mediator
al transferului de electroni) al PB ca material de electrod electroactiv, conducând la utilizarea
extensivă a acestuia în fabricarea de (bio)senzori pentru aplicații electro analitice.
Activitatea catalitică a PB pentru detectarea H 2O2
PB gener ează un interes permanent datorită capacit ății sale de a cataliza reducerea H 2O2 la un
potențial scăzut (Ricci and Palleschi 2005) , mecanismul electrocatalitic propus fiind de forma:
2K2FeII+[FeII+(CN) 6] + H 2O2 + 2H+ ↔ 2KFeIII+[FeII+(CN) 6] + 2H 2O + 2K+ (7)
Prussian White (ec . 3, 5) PB solubil – film
KFeIII+[FeII+(CN) 6] + K+ + e- ↔ K 2FeII+[FeII+(CN) 6] (8)
PB solubil – film Prussian White

II.3.3. Tipuri de senzori electrochimici

31
Senzorii electrochimici serigrafiați (Fig. 12) pot fi modificați chimic la suprafata prin atasare
de nanomateriale structurate pe bază de Au (AuNP), asigurandu -se sensibilitatea și uneori
specificitatea măsurătorilor și pot fi folositi într-un ansamblu com pact și ușor de utilizat în
orice mediu, chiar si înafara unui laborator specializat. Probele lichide de condensat de aer
expirat (EBC) vor fi colectate de la pacienți cu afecțiuni pulmonare pentru a stabili o corelație
între concentrația acestora și stadi ul bolii. De asemenea, senzorii vor evalua dacă nivelurile
de H 2O2 din EBC pot diferenția persoanele cu boli pulmonare de persoanele sănătoase,
reprezentând o procedură de screening populațional.

a) b)
Figura 12. Senzo ri serigrafiați miniaturizați: a) din carbon; b) din aur.

32

III. PARTE PERSONALĂ

III.1. Scopul lucrării
Teza de licență "Biose nzori pentru analiza parametrilor biofizici din aerul expirat "
vizează dezvoltarea unui dispozitiv care să analizeze condensul de aer expirat al
pacienților diag nosticați cu astm .

III.2 Obiectivele lucrării
Obiectivul principal al proiectului constă în dezvoltarea unui senzor pentru detec ția
H2O2, considerat biomarker prezent în condensul de aer expirat (EBC) , care poate fi
determinat prin analiz ă electrochimică , mai precis prin u tilizarea tehnicii de voltametrie
ciclic ă (CV).
Electrozii folosiți sunt de tip serigrafiat din aur ( Fig. 12 ) și modificati cu polietilen glicol și
cu nanoparticule de aur ( SPE-PEG -AuN P), pe care s -a albastru de Prusia (Prussian Blue,
PB). PB este un catalizator redox util pentru identificarea și cuantificarea analitului
studiat ( H2O2), astfel rezultând senzorul SPE-PEG -AuNP / PB . Au fost testate diferite
metode de depunere a PB pe electrodul modificat, precum și electroliții și soluțiile de
preparare a PB pentru îmbunătățirea selectivității și a limitei de detecție a H2O2 (Tabel
1II).

Tabel III. Configuratii ale supraf eței electrodului modificat
Tip de electrod Material depus pe suprafata *
Electrod serigrafiat de Au AuNP -PEG

33

Obiectivul știintific al tezei de licen ță const ă în realiza rea unui senzor electrochimic pentru
detec ția H 2O2 prin dezvoltarea/sinteza unor noi materiale de electrod, care să asigure o
specificitate și sensibilitate crescută în detecția electrochimică a H 2O2 (Fig.13).
Îndeplinirea obiectivului a presupu s selecția și sinteza materialelor de electrod, utilizarea unor
tehnici electrochimice de detecție a le H2O2 din probe de aer expirat, colectarea probelor de aer
expirat de la pacienți si voluntari sănătoși .
PB-AuNP -PEG
PBdrop-AuNP -PEG
* PB – Prussian Blue; PB drop PB depus din picatura la suprafata
modificata; AuNP – nanoparticule de aur; PEG – poliethilen glicol.

34

Figura 13. Schema sintetic ă a procesului de colectare și analiz ă a biomarkerului H 2O2
prin detec ție electrochimic ă.
Strategia de realizare a obiectivului este structurată în două etape, fiecare incluzând mai multe
activități:

1. Materiale și condiții optime pentru detecția electrochimică a H2O2

35
H2O2 poate fi oxidat ă sau redus ă electrochimic la suprafața electrozilor solizi, dar pentru a
micșora suprapotențialul aplicat și pentru a crește cinetica transferului de electroni, se
folosește o gamă largă de mediatori redox și electrocatalizatori. Dintre aceștia, PB și analog ii
lui (nickel hexaciano ferat) , în diferite combinații și arhitecturi , sunt intens studiați și utiliza ți
datorită activit ății catalitic e a acestora față de reducerea H 2O2 (ecuațiile 3 -8). În cadrul acestei
etape au fost propus e următoarele activități:
– Studiul reducerii electrocatalitice a H 2O2 folosind AuNP atașate pe suprafața
electrozilor serigrafiați prin intermediul polietilen glicolului α,ω -funcționalizat cu
grupări tiolice. Sensibilitatea și stabilitatea senzorului electrochimic pentru detecția
H2O2 cu PB (Doroftei et al. 2014) ar putea fi semnificativ îmbunătățită dacă
depunerea de PB nu se realizează direct pe electrozii serigr afiați de aur, ci pe o
acoperire intermediară având proprietăți optimizate. Au fost analizate în acest scop
diferite combinații cu PEG și AuNP. Comportamentul redox al materialului rezultat
în urma acoperirii suprafeței electrodului a fost investigat prin tehnici electrochimice
(voltametrie ciclic ă), în absența și în prezența analitului de interes (H 2O2). S-a studiat
stabilitatea electrochimică a electrodului nou creat precum și sensibilitatea și
stabilitatea operațională a determinărilor.
– Studiul reduceri i electrocatalitice a H 2O2 după depunerea PB pe electrozi serigrafiați
din aur modificați cu polietilen glicol (ca matrice polimeră suport) și AuNP .
Depunerea PB pe suprafața electrodului modificat de tip SPE-PEG -AuNP a fost
realizată comparativ atât prin imersarea acestuia în soluția de PB cât și prin depunere
în picătur ă. Comportamentul redox al electrozilor astfel modificați a fost de
asemenea investigat prin tehnici electrochimic e (voltametrie ciclică) , atât în absența
cât și în prezența H 2O2. Stabilitatea electrochimică, sensibilitatea și stabilitatea
operațională a determinărilor au fost la rândul lor examinate.
– Optimizarea materialelor de electrod obținute pe baza caracteristicilor morfologice și
electrochimice ale acestora . Toate materialele obținute au fost caracterizate
morfologic cu ajutorul microscopiei electronice de baleiaj (SEM) și a spectroscopiei
de raze X prin dispersie de energie (EDX) pentru a evalua relațiile dintre morfologie,
structură, modalitățile de procesare și proprietățile electroactive rezultate. Răspunsul
senzorilor electrochimici construiți a fost evaluat în aceleași condiții prin voltametrie
ciclică, iar varianta optimă di n punct de vedere al stabilității, sensibilității și
reproductibilității răspunsului înregistrat a fost utilizată î n analiza probelor reale de
EBC .

36

2. Investigarea proprietăților setului de senzori electrochimici pentru H 2O2
Pentru a demonstra performanțe le analitice a le senzorilor obținuți , s-a realizat cuantificarea
comparativă a H2O2 din probe reale de EBC colectate de la pacienți cu boli respiratorii și
subiecți sănătoși. Studiul clinic a primit aprobarea de la Comisia de Etică a Spitalului Clinic
de Pneumoftiziologie Iași (aviz nr. 69, Anexa I). Aceast ă etapă a fost implementat ă prin
realizarea a două activități:
– Construcția senzorului pentru detecția H 2O2 la nivel de laborator. Dintre tipurile de
electrozi construiți și testați se va alege varianta cu sensibilitatea cea mai mare și
limita de detecție cea mai joasă, care va fi utilizată în conexiune cu un potențiostat
pentru a crea varianta de laborator a echipamentului pentru det ecția H2O2 din probe
de EBC.
– Validarea proprietăților setului de senzori pentru H 2O2 dezvoltați în condiții de
funcționare pe probe reale de EBC, colectate de la pacienți sau voluntari sănătoși.

III.3. Materiale și metode
III.3.1. Materiale
Clorura ferică (FeC l3 • 6H 2O), hexacianatul feros (K 4[Fe(CN) 6]), acetat ul de potasiu, HC l
(35% m/v), H 2SO 4 (99,999% m/v), soluți a apoasă de fosfat dibazic (NaH 2PO 4), KC l, NaC l,
H2O2 (30% m/v), 2,2' -(etilendioxi)dietantiol ul (HS-CH 2CH 2OCH 2CH 2OCH 2CH 2-SH; PEG) ,
KMnO 4, HAuCl 4 x 3H 2O, dimetilformamida (DMF) și citrat ul de sodiu au fost achiziționate
de la Sigma Aldrich și utilizate fără purific ări suplimentare . Soluțiile de H2O2 au fost
preparate proaspăt, înainte de utilizare, prin diluarea soluției stoc de H2O2 30% cu apă
deionizată. Concentrația soluție i de H 2O2 a fost determinată prin titrare a cu permanganat de
potasiu (KMnO 4) a unui volum cunoscut de soluție apoasă de H2O2 30%. Toate soluțiile
tampon fosfat (PBS) au fost preparate conform tabelului IV.
Tabel IV. Valorile de pH ale soluțiilor tampon de fosfat de sodiu (la 25°C; KCl 0,1 M) .
pH % Na 2HPO 4 % NaH 2PO 4

37
5.7 6.5 93.5
6.0 12.3 87.7
6.1 15.0 85.0
6.7 43.5 56.5
6.8 49.0 51.0
6.9 55.0 45.0
7.0 61.0 39.0
7.1 67.0 33.0
7.2 72.0 28.0

III.3.2. Instrumente și metode
Noțiuni de electrochimie
Un metal sau semiconductor imersat într -o soluție de electrolit constituie un electrod.
Electrozii sunt caracterizați de potentialul electrostatic care se stabilește la interfața metal –
soluție de electrolit.
Poten țialul de electrod reprezintă diferen ța de poten țial ce apare între un electrod și
electrolit ca urmare a schimbului de sarcini electrice ce are loc între ei. Această diferen ță
de poten țial se datorează faptului că poten țialul chimic al ionilor metalici în solu ție este diferit
de cel al ionilor din metal (metalele pot fi considerate și ele ionizate). Ionii metalici trec din
faza în care poten țialul chimic este mai mare în faza în care poten țialul chimic este mai mic
(Gligor and Unguresan 2009) .

Voltametria ciclică

38
Voltametria constă în urmărirea răspunsului de curent al electrodului studiat la baleierea
liniara a potențialului. Forma curbelor I = f(ε) este diferită pentru procesele reversibile și cele
ireversibile de electrod. Parametrii importanți ai unei voltamograme reversibile sunt:
– curentul de pic (anodic și catodic), I pa, Ipc;
– potențialul de pic (anodic și c atodic), ε p,a, εp,c;
– potențialul formal ε0’, definit pentru un cuplu reversibil ca: ε0’= (ε p,a + εp,c)/2
– distanța dintre potențialele de pic (Δε p) [M07]: Δε p = εp,a – εp,c
O voltamogramă tipică pentru un sistem reversibil în soluție este prezentată în figura 14
(Murgulescu and Radovici 1986) .

Figura 14. Voltamograma ciclică pentru un sistem reversibil în soluție ( după Murgulescu și
Radovici, 1986 ).

În afară de suprafața electrodului și de numărul de electroni schimbați, curentul care trece prin
electrod va depinde de concentrație, coeficientul de difuzie și viteza de baleiaj.
Celula electrochimică utilizată în voltametria ciclică conține trei electrozi: electrodul de lucru,
electrodul de referință și contraelectrodul. Speciile electroactive reacționează la suprafața
electrodului de lucru. Electrozi i de lucru pot fi confecționați din diferite materiale de electrod
(cărbune sticlos, platină, grafit, mercur, aur, etc). Dintre aceștia, electrozii cu film de mercur
sunt rar utilizați datorită ușurinței cu care se oxidează mercurul. În experimentele curen te au

39
fost utilizați electrozi serigrafiați miniaturizați acoperiți cu aur ( Fig. 15a ) conectati si
controlati de sistemul electrochimic Potentiostat AUTOLAB PGSTAT302N ( Fig. 15b ).

(a)

(b)
Figura 15. Electrod serigrafiat de aur ( a); Sistemul electrochimic AUTOLAB PGSTAT302N
(ECO CHEMIE Utrecht, Olanda) (b).

40

Un experiment de voltametrie ciclică necesită o soluție fară oxigen dacă potențialul folosit
coboară sub potențialul de reducere al oxigenului (0,682 V) (Standard Reduction Potential
Table ). Îndep ărtarea oxigenului din proba supus ă analizei se realizeaz ă prin barbotarea unui
gaz inert în interiorul soluției, cu câteva minute înainte de efectuarea experimentului.
Instalațiile moderne sunt computerizate, permițând achiziția datelor în calculator. Semnalul
este transmis prin potențios tatul celulei care conține cei trei electrozi și este înregistrat pe
calculator. Programe speciale permit prelucrarea voltamogramelor obținute. Măsurătorile prin
voltametrie ciclic ă (CV) au fost efectuat e utilizând sistemul electrochimic AUTOLAB
PGSTAT302N de la ECO CHEMIE Utrecht, Olanda și IVIUM STATS ( Fig. 15b).
Sistemul de centrifugare de înaltă performanță Avanti J -30 I (Backman Coulter, US A) a
fost utilizat pentru separarea prin centrifugate a tuturor soluțiilor coloidale.
Microscopia de forta atomica (AFM) a fost realizată pe un echipament Pro -M Scanning
Microscope Probe (NT -MDT, Rusia) cu consolă dreptunghiulară NSG03 (NT -MDT, Rusia).
Determinările au fost realizate în aer, la temperatura camerei (230C), în modul
atingere/baleire, cu o viteză de scan are de 6 μm/s. Au fost analizate diferite dimensiuni de
scanare pornind de la 50 x 50 µm2 la 500 x 500 nm2 (nanoparticulele de aur au fost observate
cu ușurință atunci când a fost utilizată o lungime de scanare de 700 nm). Pentru achiziția și
prelucrarea imaginilor a fost utilizat softul Solver Nova v.1.26.0.1443.
Microscopia electronică de transmisie (TEM) a fost efectuată pe un echipament Hitachi
HT7700 cu suport de criogenie, care funcționează la 100 kV cu rezoluție înaltă și difracție,
permițând obține rea de date experimentale referitoare la morfologia, dimensiunile și
caracterul de cristalinitate al particulelor. Pregătirea probelor: o picătură de probă sonicată a
fost plasată pe o rețea acoperită cu carbon.
Dispersia dinamic ă a luminii (DLS) a fost utilizată pentru determinarea d iametrului
hidrodinamic al nanoparticulelor de aur cu ajutorul unui echipament de tip Delsa Nano C
(Beckman Coulter , US A), care permite analiza soluțiilor coloidale ce conțin particule având
dimensiuni cuprinse între 0.6 nm ș i 7 µm.
Spectrele de absorbție în UV -Vis ale soluțiilor coloidale conținând nanoparticule de aur au
fost obținute cu un spectrometru LAMBDA 35 (Perkin Elmer, USA) prin scanarea
domeniului de lungimi de undă cuprins între 400 și 800 nm .

41
Prepararea nanoparticulelor de aur (AuNP)
O metodă standard pentru prepararea suspensiei coloidale de aur monodispers este după cum
urmează (Frens 1973) : 5,12 mg HAuC l4 x 3H 2O (greutate moleculară: 78,766) au fost
adăugate în 20 m L apă deionizată. În fiecare 10 m L din această soluție s -au adăugat 0,5%
(m/v) și respectiv 1% ( m/v) citrat de sodiu. Soluțiile au fost încălzite până la fierbere,
menținându-se aceast ă temperatur ă timp de 30 de minute, când culorile acestora au devenit
roșu și respectiv albastru -violet. Soluțiile au fost apoi răcite la temperatura camerei, cu agitare
continuă și depozitate la 40C. Luând în considerare culo rile dezvoltate în cursul preparării se
poate deduce c ă în solu ția de culoare ro șie exist ă nanoparticule de aur de aproximativ 40-50
nm, iar în cea albastru -violet sunt prezente nanoparticule de aur de aproximativ 20 nm
(ElKaoutit et al. 2012) . Fiecare soluție conține 1,28 mg Au într-un volum de 10 ml (0,128
mg/m L). Soluțiile au fost centrifugate la o viteză de 15000 rotații/min, iar solidele rezultate au
fost redispersate de 3 ori în apă deionizată și sonicate 10 min ute înainte de centrif ugare.
Volumul final al fiecărei soluții apoase a fost de 10 mL , cu o concentrație de aproximativ 1,2
mg Au la 10 mL (0,12 mg/mL). Dimensiunile nanoparticulelor au fost determinate prin
măsurători de difuzi e dinamic ă a luminii (DLS) și prin microscopie electronică de transmisie
(TEM) . Pentru toate experimentele s -a utilizat soluția de culoare roșie care conține
nanoparticule de aur de formă relati v sferică, având un diametru mediu de aproximativ 50 nm.
Modificarea electrodului serigrafiat acoperit cu aur (SPE) cu AuNP -PEG (SPE -PEG –
AuNP)
Pe discul de lucru al electrodului serigrafiat acoperit cu aur (SPE) au fost adăugați 0,5 μL de
PEG la temperatura camerei, astfel încât câte una din grupele tiolice ( -SH) terminale
echivalente din fiecare oligomer PEG să poată reacțion a cu suprafața de aur a electrodului.
După 2 ore de contact electrodul a fost clătit cu e tanol pentru eliminarea excesului de reactanți
și uscat la temperatura camerei timp de 2 ore . 0,5 μL din soluția roșie sau ro șu-violet au fost
în continuare adăuga ți pe discul electrodului pentru ca grup ările tiolice terminale ale PEG
rămase libere pe suprafa ța electrodului s ă reacționeze cu nanoparticulele de aur din soluția
adăugată. Electrodul a fost menținut la temperatura camerei timp de 2 ore , după care a fost
clătit cu apă deionizată și din nou lăsat timp de câteva ore la temperatura camerei.
Modificarea SPE-PEG -AuNP cu albastru de Prusia (SPE -PEG -AuNP/PB)
Soluția apoas ă a precursorului de PB conține FeCl3 (1.0 mM ), K4Fe(CN) 6 (1.0 mM ), KCl (0.1
M) și HCl (0.025 M ) (Qiu et al. 2007) și a fost depus ă pe suprafa ța modificat ă a electrozilor
serigrafia ți (SPE-PEG -AuNP ) prin două metode distincte :

42
(i) electrozii SPE -PEG -AuNP au fost imersați în solu ția precurso are a PB (această
metodă nu este foarte fiabilă, deoarece electrodul de referință este, de asemenea,
scufundat în solu ția precurso are a PB, fapt ce poate conduce la erori
experimentale deoarece referința ar putea fi impurificat ă cu PB);
(ii) 6 µL soluție apoasă de precursor PB a fost picurată pe electrodul SPE -PEG –
AuNP, dup ă care electrodul a fost men ținut la temperatur a camerei timp de 30
minute (pentru finaliz area reac ției de formare a PB), spălat de două ori cu apă
deionizată și uscat la temper atura camerei . Notația pentru această configurație
este SPE -PEG -AuNP/PBdrop.

Prelevarea probelor biologice de aer expirat condensat (EBC) s-a realizat cu sistemul
Sistemul "Turbo DECCS" – MEDIVAC, Italia (procedură discutată in subcapitolul III.3.5.).

Prelucrarea statistică a datelor obținute pentru concentrațiile de H 2O2 din probele EBC s -a
realizat cu ajutorul software -ului GraphPad Prism 6 (GraphPad software, Inc.). Cele două
grupuri (donatori sănătoși vs. pacienți cu astm ) au fost comparate folosind testul t nepereche.
Au fost calculate valori p bilaterale, iar p < 0,05 (*) a fost considerat statistic semnificativ.

III.4. Rezultate și discuții
III.4.1. Prepararea nanoparticulelor de aur (AuNP)
Pentru prepararea suspensiei coloidale monodisperse de nanoparticule aur a fost utilizată o
procedură standard (Frens 1973) : 5,12 mg HAuCl 4 x 3H 2O au fost aduse în soluție cu 20 m L
apă deionizată , după care s-a adăugat citrat de sodiu 0,5% (m/v) . Soluția rezultată a fost
încălzită la fierbere timp de 30 min ute, când culoarea solu ției a devenit roșie. Soluția a fost
apoi răcită la temperatura camerei, sub agitare continuă și depozitată la 40C. Pentru utilizar e
dispersia coloidală a fost centrifugată la 15000 rotații/min, precipitatul solid a fost recuperat și
redispersat de 3 ori în apă deionizată, iar solu ția final ă a fost supus ă sonic ării pentru 10
minute. Volumul final al soluției a fost de 10 mL , cu o conc entrație de aproximativ 0,12 mg
Au/mL.

43

Figura 1 6. Imaginea TEM (A), curba DLS (B) și spectrul UV -Vis (C) corespunz ătoare
nanoparticu lelor de aur (AuNP) sintetizate .

Din intensitatea culorii roșii a soluției se poate deduce că aceasta conține nanoparticule de aur
cu un diametru mediu de aproximativ 50 nm (Frens 1973) . Dimensiunile și forma aproximativ
sferică a nanoparticulelor de aur au fost confirmate prin microscopie ele ctronică de transmisie
(TEM), măsurători dinamice de dispersie ale luminii (DLS) și spectroscopie UV -Vis ( Fig.
16).

44
III.4.2. Modificarea suprafeței electrozilor serigrafiați acoperiți cu aur cu 2,2' –
(etilendioxi)dietantiol (HS -CH 2CH 2OCH 2CH 2OCH 2CH 2-SH; PEG), nanoparticule de
aur (AuNP) și albastru de Prusia (PB) (electrozi notați cu: SPE -PB-AuNP -PEG)
Pentru a mări suprafața specifică a electrodului serigrafiat acoperit cu aur, am propus
modificarea suprafeței electrodului prin ata șarea de nanoparticule sferice de aur cu diametrul
mediu de 50 nm prin intermediul unui agent de leg ătură pe baz ă de etilenglicol
bifunc ționalizat cu grup ări tiolice (PEG) pentru a preveni agregarea AuNP și pentru a asigura
imobilizarea albastrului de Prusia. Modificarea supra feței cu PEG și AuNP va cataliza
reducerea electrochimică a H 2O2 la potențiale reduse și, de asemenea, va asigura transferul
rapid al electronilor c ătre suprafa ța electrodului (Qiu et al. 2007) .
În acest context, pe discul de lucru al SPE (Fig. 15A) au fost ad ăugați 0,5 µL PEG
bifunc ționalizat cu grup ări tiolice ( -SH). O parte din grup ările tiolice formeaz ă legături
covalente cu aurul din structura electrodului (Au -S-) la temperatura camerei (Daniel and
Astruc 2004) . Dup ă 1 oră electrodul a fost clătit de mai multe ori cu etanol pentru a îndep ărta
restul de PEG ne legat, apoi uscat la temperatura camerei timp de 4 ore. Urm ătoarea etap ă a
constat în imobilizarea AuNP. În acest scop, pe discul electrodului au fost adăuga ți 0,5 µL
soluție AuNP (concentra ție 0,12 mg Au/mL) , apoi electrodul a fost menținut la temperatura
camerei timp de 2 ore, sp ălat cu apă deionizată și din nou menținut câteva ore la temperatura
camerei. Peste suprafa ța modificat ă cu PEG și AuNP s -a adăugat albastru de Prusia pentru a
asigura reducerea electrochimică a H 2O2 la potențiale reduse . După cum s-a menționat
anterior, depunerea PB a fost realizată prin dou ă metode:
(i) electrozii modifica ți au fost imersați într -o soluție de PB 10 mM;
(ii) 6 µL de soluție PB ( 10 mM ) au fost picura ți pe suprafa ța de lucru a electrodului
modificat cu PEG și AuNP . După 30 min ute electrodul a fost spăla t cu apă deionizată și
uscat la temperatura camerei. Solu ția de albastru de Prusia (PB) a fost ob ținută prin
amestecarea soluțiilor acide ( HCl, 10 mM) de FeCl 2 (10 mM ), respectiv K 4 [Fe (CN) 6]
(10 mM) într-un raport molar de 1:1 (ecua țiile 1 -8).
Reprezentarea schematic ă a modific ării suprafe ței electrodului serigrafiat acoperit cu aur este
prezentat ă în figura 17.

45

Figura 17. Reprezentarea schematică a modificării electrodului serigrafiat acoperit cu Au
(SPE -PB-AuNP -PEG) .

Trebuie menționat faptul c ă au fost prepara ți și electrozi modifica ți numai cu PEG și PB
(SPE -PB-PEG) sau numai cu PB (SPE -PB) prin picurarea a 6 µL de soluție PB 10 mM pe
suprafața de lucru a electrodului modificat anterior cu PEG, respectiv a electrodului inițial,
nemodificat (SPE) .
Analiza topografică a suprafeței electrozilor modifica ți cu AuNP prin intermediul PEG
bifuncționalizat cu grup ări tiolice a fost monitorizată cu ajutorul microscopiei de forț ă
atomic ă (AFM) (Fig. 18). Măsurătorile au fost realizate în aer, la temperatura camerei (230C),
cu o viteză de scanare de 6 μm/s. Au fost analizate suprafe țe de diferite dimensiuni, pornind
de la 50 x 50 µm2 și până la 500 x 500 nm2.
În figura 18 sunt prezentate imaginile AFM 2D și 3D ale suprafețelor electrozilor din aur
modifica ți la suprafa ță cu PEG bifuncționalizat cu grup ări tiolice și AuNP.
Pentru a imobiliza un număr diferit de AuNP pe suprafața electrodului modificat cu PEG s -au
folosit două soluții coloidale de AuNP de concentrații diferite, rezult ând electrozii SPE -PEG –
AuNP -A și SPE -PEG -AuNP -B.

46

Figura 1 8. Imaginile AFM 2D și 3D ale AuNP imobilizate pe SPE prin intermediul PEG
bifuncționalizat cu grup ări tiolice: AuNP imobilizat din soluții apoase concentrate (electrod
SPE-PEG -AuNP -A) (a, c) ; AuNP imobilizat din solu ții apoase diluate (electrod SPE -PEG –
AuNP -B) (d, f) ; dimensiunile AuNP determinate din profilurile secțiunilor transver sale luate
de-a lungul liniilor solide din imaginile 2D (b, e) .

Din imaginile AFM 2D și 3D (Fig. 18 a, c, d, f) se observ ă că numărul de AuNP este mai
mare atunci când acestea au fost depus e din solu ție coloidal ă de 0,12 mg Au/mL (Fig. 18 a, c).
În acest caz s -au imobilizat aproximativ 85 AuNP pe o suprafață de 700 x 700 nm2 (~121
AuNP/μm2), cu o rugozitate medie rezultantă de 8,8 nm. Num ărul de AuNP ata șat pe
suprafa ța electrodului din solu ția coloidal ă de AuNP (Fig. 18 d, f) în concentra ție de 0,012 mg
Au/mL este de aproximativ 35 AuNP / 700 x 700 nm2 (~50 AuNP/μm2), iar rugozitatea medie
este de 10 nm. Valoarea medie a rugozității (Sq) calculată pentru electrodul c e prezintă o
concentrație mai ridicată de AuNP (Fig. 18 c) este mai mică în compara ție cu cea obținută
pentru electrodul cu concentrație mai scăzută de AuNP (Fig. 18 f) datorită aplatizării
reliefului de suprafață indusă de o acoperire mai mare cu nanoparticule.

47
Din profilurile secțiunilor transversale (Fig. 18 b, e) se poate observa c ă AuNP prezint ă
diametre medii de aproximativ 45 nm, observație care este în deplină concordanță cu
rezultatele obținute prin DLS și TEM (Fig. 16).

III.4.3. Activitatea electrochimic ă a electrozilor modifica ți SPE -PEG -AuNP -PB
Comportamentul redox al electrozilor modifica ți a fost evaluat prin voltametrie ciclic ă, într-o
soluție apoasă acidă de electrolit formată din HCl 0,1 M și KC l 0,1 M . În figura 1 9 este
prezentată comparativ varia ția picurilor redox în func ție de materialul utilizat pentru
modificarea electrozilor: (i) PB adsorbit pe suprafața electrodului de aur (SPE -PB); (ii) PB
adsorbit pe suprafa ța electrozilor serigrafia ți de aur modifica ți cu dit iol PEG (SPE – PEG -PB);
(iii) PB depus prin adsorb ție fizic ă pe suprafa ța electrozilor prin picurarea a 6 µL soluție PB
10 mM (SPE -PEG -AuNP -A-PBdro p).

Figura 1 9. Voltamogramele ciclice inregistrate pentru electrozii modificati in moduri diferite
SPE –PEG -AuNP -A-PBdrop (linie albastra), SPE – PB (linie roșie), SPE – PEG – PB (linie gri).
PB a fost depus prin adsorbtie fizica pe suprafata electrozilor prin picurarea a 6 µL de soluție
10 mM PB. Viteza de scanare 50 mV/s.

48
Voltamogramele ciclice prezint ă un pic de oxidare în jurul poten țialului de 0,105 V și unul de
reducere la aproximativ 0,054 V caracteristice transferului electronic al PB (conform ecua ției
3). Valoarea curentului de pic variaz ă în func ție de natura materialului depus pe suprafa ța
electrodului de lucru. Se p oate observa c ă activitatea redox cea mai bun ă o prezint ă electrodul
SPE-PEG -AuNP -PB, urmat de elctrodul SPE-PB și SPE -PEG -PB.
Caracterul redox amplificat al electrodului SPE –PEG -AuNP -A-PB se explica prin faptul ca
nanoparticulele de aur atasate la supra fata electrodului conduc la marirea suprafetei active a
electrodului si implicit a cantitatii de PB depuse. De asemenea, nanoparticulele de aur
amplifica transferul electronic dintre PB si electrod, avand efect sinergic. In timpul scanării
anodice a electrodului SPE -PB-AuNP -PEG în soluție apoasă acida (0,1 M HCl) cu electrolit
(0,1 M KCl), nanoparticulele de aur determina o crestere a fluxului de electroni spre suprafata
electrodului (ecuatia 9) (Kumar and Joseph 2014) , conducand la scaderea pH -ul interfacial.
De mentionat ca prezenta electrolitului (KCl) in celula electrochimica asigura procesul redox
al PB (conform ecuatiilor 3 -6).

Au0 + 3H 2O → Au(OH) 3 + 3H+ + 3e- (9)

III.4.4. Activitatea electrocatalitică a electrodului SPE -PEG -AuNP -PB în detecția H 2O2
Activitatea electrocatalitic ă a electrodului SPE -PEG -AuNP -A-PBdrop a fost comparat ă cu cea
a electrodului nemodificat pe care s -a depus PB (SPE -PB) și cu cea a electrodului modificat
numai cu PEG pe care s -a depus PB (SPE -PEG -PB).
Comportamentul redox a l electrodului nemodificat acoperit cu PB în func ție de concentra ția
de H 2O2 arată că picul de reducere din diagramele de voltametrie ciclic ă (Fig. 20) crește odată
cu cre șterea concentra ției de H 2O2. Se remarcă de asemenea faptul că , la concentrații mici de
H2O2, pot fi observate doar modificări subtile.

49

Figura 20. Diagramele de voltamerie ciclic ă pentru electrodul SPE -PB
la diferite concentra ții de H 2O2 în solu ție apoas ă acidă de HCl ( 0,1 M ) și KCl :
0,1 mM (negru); 0,2 mM (verde); 0,6 mM (albastru ); 4,4 mM (roșu) .

Atunci când suprafața electrodului este acoperită cu PEG, o cantitate mai mică de PB este
adsorbită pe suprafață (după clătirea electrodului) , ceea ce explică picurile mai pu țin intense
din voltamograma ciclica (Fig. 21) comparativ cu cea din figura 20 pentru electrodul SPE -PB.
Aceast ă concluzie este sus ținută și de rezultatele prezentate în figura 1 9, care indică faptul că
decalajul dintre vârfurile de oxidare și reducere este considerabil mai mic în cazul electrodului
SPE-PEG -PBdrop comparativ cu SPE -PB. Vârful de reducere al electrodului SPE -PEG –
PBdrop crește proporțional cu concentra ția de H 2O2 din celula electrochimic ă.

50

Figura 21. Diagramele de voltamerie ciclică pentru electrodul SPE -PEG -PB
la diferite concentrații de H 2O2 în soluție apoasă acidă de HCl (0,1 M) și KCl:
0,1 mM (negru); 0,2 mM (verde); 0,6 mM (albastru); 4,4 mM (roșu) .

În situa ția celor doi electrozi analizați (SPE -PB și SPE -PEG -PB) nu se produc variații
notabile ale vârfului de reducere pentru concentra ții mici ale H2O2 din probele analizate. Din
experimente le prezentate in figurile 1 9-21 se poate concluziona că semnalele specifice ale
electrodului SP E-PB în solu ție apoas ă acidă cu electrolit , atât în absen ța cât și în prezen ța
H2O2, depind de cantitatea de albastru de Prusia adsorbit pe suprafața electrodului. În plus, un
factor determinant îl joac ă și aria de contact dintre suprafa ța electrodulului și PB.
În concluzie, electrozii mentiona ți (SPE -PB și SPE -PEG -PB) nu sunt satisfăcători pentru a fi
luați în considerare pentru detec ția apei oxigenate din probele biologice deoarece concentra ția
acestor probe î n H2O2 este de ordinul µ M.
Pentru a cre ște capacitatea de detec ție a H 2O2 în concentra ții mici în probele de analizat s -a
propus legarea chimic ă a nanoparticulelor de aur presintetizate prin intermediul grup ărilor
tiolice nereac ționate de la suprafa ța electrodului de aur acoperit c u PEG. Trebuie amintit c ă,
după cum se poate observa în figura 19 , răspunsul acestui tip de electrod a fost superior la
determina rea activit ății electrochimic e.

51
Adsorb ția PB pe suprafa ța electrozilor modifica ți de tip SPE-PEG -AuNP -A s-a realizat în
doua moduri: ( a) prin imersarea electrozilor SPE -PEG -AuNP -A în solu ția de PB, rezult ând
electrozii notați SPE-PEG -AuNP -A-PBimersat și (b) prin depunerea a 6 µL din solu ția de PB
pe suprafa ța modificat ă a electrodului, atunci când au rezultat electrozii notați c u SPE-PEG –
AuNP -A-PBdrop.
În figura 22 este prezentat comportamentul redox și răspunsul electrodului modificat de tip
SPE-PEG -AuNP -A-Pbimersat la peroxid de hidrogen în func ție de concentrația analitului
(H2O2) din celula electrochimic ă.

Figura 22. Voltamogramele ciclice ale electrozilor SPE -PEG -AuNP -A-PBimersat
în funcție de concentrația H 2O2 în soluție apoasă acidă de HCl (0,1 M) și KCl:
0,1 mM (linie gri); 0,2 mM (linie verde); 0,6 mM (linie albastr ă) și 4,4 mM (linie ro șie).

Se observă în a cest caz o creștere a picurilor de reducere/oxidare odată cu creșterea
concentrației de H 2O2, produc ându-se o dependență liniară între concentrația de peroxid de
hidrogen și picurile de reducere din diagramele de voltametrie ciclică corespunzăt oare. În
plus, se poate remarca apariția unui pic adițional la 0,25 V, care este specific reducerii aurului,

52
ceea ce confirmă faptul că electrozii modificați cu AuNP pot produce efecte electrochimice
suplimentare.
Pentru a evita contaminarea electrodului d e referință (Fig. 15A) , PB a fost depus prin
picurarea a 6 µL din soluția de albastru de Prusia numai pe suprafața de lucru a electrodului
modificat în prealabil cu PEG și AuNP, rezultând electrodul notat cu SPE -PEG -AuNP -A-
PBdrop. Comportamentul redox și r ăspunsul electrodului SPE -PEG -AuNP -A-Pbdrop în
funcție de concentrația H 2O2 sunt redate în figura 23 .

Figura 23. Voltamograma ciclică a SPE -PEG -AuNP -A-PBdrop
în funcție de concentrația H 2O2 în soluție apoasă acidă de HCl (0,1 M) și KCl:
2 mM (a); 4 mM (b); 8 mM (c) .

După cum se observă în figura 23 , curentul picului de reducere crește odată cu creșterea
concentrației de H 2O2.
Comparând cele două tipuri de electrozi (SPE -PEG -AuNP -A-PBimersat și SPE -PEG -AuNP –
A-PBdrop), răspunsul electrochimic este mai bun atunci când PB a fost depus prin imersarea
electrodului în soluția PB (Fig. 24) . Acest aspect poate fi explicat prin adsorbția unei cantități
mai mari de mediator PB pe AuNP în urma imersării electrodului în soluția de PB comparativ

53
cu cantitatea de PB adsorbită la picurarea unei soluții de PB pe suprafața de lucru a
electrodului. Trebuie notat faptul că vârfurile redox sunt foar te stabile după un număr mare de
reutilizari pentru ambii electrozi (SPE -PEG -AuNP -A-PBimersat și SPE -PEG -AuNP -A-
PBdrop), așa cum se poate observa și din figura 25 .

Figura 24. Voltamogramele ciclice obținute cu electrozii modificați de tip:
SPE-PEG -AuNP -A-Pbimersat (a) și SPE -PEG -AuNP -A-PBdrop (b),
în soluții apoase acide de HCl (0,1 M) și KCl (0,1 M) .

54

Figura 25. Stabilitatea electrozilor modificați de tip:
SPE-PEG -AuNP -A-PBimersat (A) și SPE -PEG -AuNP -A-PBdrop (B)
după 10 scanări consecutive în soluții apoase acide de HCl (0,1 M) și KCl (0,1 M) .

55
Calibrarea electrozilor modificați de tip SPE -PEG -AuNP -A-PBdrop și SPE -PEG -AuNP -A-
PBimersat a fost efectuată prin adăugări succesive de H 2O2 în soluția de electrolit HCl (0,1
M) și KCl (0,1 M), iar raspunsul electrochimic a fost repreze ntat in functie de concentratie
(Fig. 26 , 27).

Figura 26. Curbele de calibrare ale senzorilor modificați SPE -PEG -AuNP -A-PBdrop
în soluții apoase acide de HCl (0,1 M) și KCl (0,1 M) pentru diferite concentrații de H 2O2.

Figura 27. Curbele de calibrare ale senzorilor modificați SPE -PEG -AuNP -A-PBimersat în
soluții apoase acide de HCl (0,1 M) și KCl (0,1 M) pentru diferite concentrații de H 2O2.

56
După cum se poate remarca din figurile 26 și 27 , sensibilitatea cea mai bun ă este demonstrat ă
de electrodul S PE-PEG -AuNP -A-PBdrop. Intervalul liniar de raspuns pentru H 2O2 a fost
cuprins în ambele cazuri între 0,001 µM și 1,2 mM . Tinând cont de datele din literatură care
precizează valori foarte mici de apă oxigenată in probele de EBC, in figurile 26 și 27 este
prezentat doar domeniul de concentrații foarte mici (de la 0.001 la 1,2 µM) (Emelyanov et al.
2001) .

III.4.5. Detecția H 2O2 în funcție de numărul de AuNP depuse pe suprafața electrodului
modificat cu PEG
În continuarea di scuției referitoare la morfologia de suprafață a electrozilor modificați cu PEG
și un număr diferit de AuNP ( secțiunea III.3.2 ), este necesară , de asemenea , și o analiză a
efectului manifestat de numărul de AuNP ata șate pe suprafa ța electrodului asupra detec ției
electrochimic e a H 2O2 din soluții apoase acide de HCl (0,1 M) și KCl (0,1 M) .
În acest sens , pe electrozii caracteriza ți din punct de vedere morfologic în figura 1 8, nota ți cu
SPE-PEG -AuNP -A (~121 AuNP/μm2, rugozitate medie 8,8 nm ; diametr u medi u ~ 45 nm) și
SPE-PEG -AuNP -B (~50 AuNP/μm2; rugozitate medie 10 nm ; diametr u medi u ~ 45 nm ), a
fost depus PB prin picurarea a 6 µL pe suprafa ța de lucru , rezult ând electrozii SPE -PEG –
AuNP -A-PBdrop și SPE -PEG -AuNP -B-PBdrop. Se preferă metoda prin picurare pentru a
evita eventualele erori care pot apare din contaminarea electrodului de referință și a cont ra-
electrodului.
Analizele electrochimice s -au realizat in picatura, adăugand 100 µL electrolit (0,1 M HCI +
0,1 M KCI) pe suprafata electrozilor si înregistrand voltamogramele ciclice inainte si dupa
adaugarea solutiei de H 2O2 (Fig. 28a și 2 9a). Reducerea peroxidului de hidrogen conduce la o
crestere a inaltimii picului de reducere, iar aceasta crestere este proportionala cu concentratia
(Fig. 28 b, c și 2 9 b, c).

57

Figura 28. Voltamogramele ciclice ale electrodului SPE -PEG -AuNP -A-PBdrop în solu ție de
electrolit (HCl 0,1 M + KCl 0,1 M) și concentra ții în H2O2 de: 0 µL (a); 2 µL (b); 6 µL (c).

Figura 29. Voltamogramele ciclice ale electrodului SPE -PEG -AuNP -B-PBdrop în soluție de
electrolit (HCl 0,1 M + KCl 0,1 M) și concentrații în H 2O2 de: 0 µL (a); 2 µL(b); 6 µL(c).

Se poate observa din figura 2 8 că, după adăugarea a 2 µL de H 2O2, vârful de reducere crește
cu 8×10-5 A (80 μA) pentru electrodul SPE -PEG -AuNP -A-Pbdrop ( ~121 AuNP/μm2; Fig.
28b), în timp ce pentru electrodul SPE -PEG -AuNP -B-Pbdrop ( ~50 AuNP/μm2; Fig. 28c)

58
vârful de reducere crește cu 6×10-5 A (60 μA). Acest rezultat evidențiază faptul că răspunsul
electrodului este influentat de numărul de AuNP imobilizate pe suprafața electrodului, fiind
cu atat mai mare cu cat numarul de particule este mai mare.
În concluzie, studiile prezentate recomand ă utilizarea electrodul ui SPE-PEG -AuNP -A-
PBdrop în detec ția electrochimic ă a apei oxigenate din probele de aer expirat condensat,
prezent ând sensibilitate fa ță de H 2O2 în intervalul de concentrații 0,01-1,2 mM și stabilitate
ridicat ă.

III.4.6. Detec ția H 2O2 din condensul de aer expirat
Colectarea probelor de aer expirat de la pacien ți diagnostica ți cu astm și donatori
sănătoși
Fiziologia și anatomia sistemului respirator face dificilă obținerea probelor din profunzimea
plămânilor. În prezent, pentru a evalua patologia plămânilor, se folosesc proceduri variind de
la tehnici de imagistică (non -invazive) la biopsii de țesut (invazi ve). Problema principală a
metodelor invazive este că acestea nu pot fi repetate frecvent din cauza riscurilor asociate cu
aceste proceduri. Colectarea probelor de aer expirat prin condensare (EBC) este o metodă
rapidă, repetabilă, neinvazivă și simplă, ca re monitorizează biomarkerii căilor respiratorii ale
pacienților cu patologie pulmonară .
Condensul de aer expirat (EBC) este obținut în mod obișnuit prin înghețarea sau răcirea
aerului expirat în condiții de respirație spontană. Procedura de colectare nu are nici o influență
asupra funcției căilor respiratorii sau a inflamației (Corradi et al. 2003) . Colectarea probelor
de EBC este o modalitate ieftina, ușoară și complet neinvazivă pentru a studia moleculele
non-volatile din aerul expirat.
Probele studiate au fost colectate cu aju torul sistemului "Turbo DECCS" – MEDIVAC, Italia
(Fig. 30A). Colectarea probelor de aer expirat condensate (EBC) nu este invazivă și nu face
decât să canalizeze expirația într -un circuit special de colectare de unică folosință numit
DECCS ( Fig. 30B), plasat în răcitorul TURBO. Timpul de eșantionare este cuprins în mod
normal între 5 și 15 min ute.

59

A B
Figura 30. Sistemul "Turbo DECCS" (MEDIVAC, Italia), (A); fiolă sterilă de unică folosință
pentru colectarea probelor tip DECCS 14 ST (B).

Scopul sistemului "Turbo DECCS" este acela de a optimiza metodologia de eșantionare a
aerului expirat prin condensare, și anume condensul de aer expirat (EBC), atât pe subiecții
conștienți, cât și pe cei ventilați, care sunt parțial sau total necooperan ți.
Această metod ă este neinvazivă, fiind ideală pentru studiul bolilor pulmonare, precum și
pentru bolile pulmonare induse de substanțe toxice inhalatorii .
Probele de EBC pot fi conservate la -800C și pot fi supuse examinării prin sisteme de
diagnostic cum ar fi: gaz cromatografie cuplată cu spectrometrie de masă (GC -MS), testul
ELISA, teste electrochimice, etc., permițând diagnosticarea bolilor pulmonare prin
identificarea compușilor volatili sau cu o volatilitate scăzută diluați în condensul de aer
expirat (EBC). Unii dintre compușii identificați pot fi biomarkeri g enerați de inflamația și
stresul oxidativ produse de celulele din căile respiratorii.
Sistemul "Turbo DECCS" prezintă un potențial deosebit pentru viitor, fiind ideal în scopul
colect ării probelor în mod neinvaziv pentru studii de biomarkeri respiratori i, esențiali în
cercetare a și complementarea diagnosticului pulmonar. Aceasta reprezintă o nouă abordare a
diagnosticării precoce a inflamației, respinger ii transplantului, deterior ării celular e sau a
stresul ui datorat ventilație i artificial e, etc.

60
Sistemul "Turbo DECCS" poate fi utilizat în domenii de cercetare medicală cum ar fi:
 Medicină Ocupațională și de Mediu
 Pneumologie
 Pediatrie
 Oncologie
 Alergologie
De asemenea, sistemul "Turbo DECCS" poate fi utilizat cu profit și eficiență în așa -numitele
„aplicații clinice ” precum:
 analiza căilor respiratorii periferice prin compararea oricăr or indicii de inflamație și
niveluri de stres oxidativ găsite ;
 determinarea biomarkerilor și a efectul ui substanțelor pneumotoxice inhalate asupra
subiecților expuși ;
 identificarea de noi biomarkeri ai bolilor pulmonare, inclusiv cancer pulmonar, cu
posibilitate de confirmare clinică ;
 studii de proteomică, metabolomică, metalomică etc.
Sistemul "Turbo DECCS" se bazează pe un dispozitiv special denumit răcitor TURBO,
conc eput și fabricat în urma unor sugestii tehnice și metodologice oferite de standardele
ATS/ERS. Sistemul este simplu de utilizat, nu necesit ă personal de specialitate și utilizează
fiole de unică folosință DECCS pentru asigura rea prelevării igienice și stocării probelor .
Temperatura de condensare este reglabilă și nu necesită răcire externă. Sistemul este u șor de
transportat și de manevrat ( Fig. 31). Opțional , sistemul poate fi conecta t la un spirometru
pentru controlul parametrilor respirației.

61

Figura 31. Sistemul „Turbo DECCS” în modulul de transport.

Proveniența probelor biologice
Au fost colectate probe rezultate prin condensarea aerului expirat de la 7 cazuri de pacienți
voluntari diagnosticați cu astm (bărbați si femei cu vârste cuprinse între 50 și 70 ani) și 3 de
donatori sănătoși (2 bărbați, 1 femeie) cu v ârste de 24, 28 ani și, respectiv, 34 ani nefumători.
Pacienții diagnosticați cu astm sunt sub tratament specific în Spitalul Clinic de
Pneumoftiz iologie Iași. Atât colectarea cât și analiza electrochimică sunt metode neinvazive.
Acest studiu de cercetare a fost aprobat și Comisia de Etică a Spitalului Clinic de
Pneumoftiziol ogie Iași (aviz nr. 69, Anex ă). Consimțământul informat în scris a fost obținut
de la toți voluntarii înainte de inițierea oricăror proceduri legate de studiu (după modelul din
Anex ă). De subliniat faptul c ă cercetările ulterioare au fost aprobate în mod etic de către
comitetul etic loc al (atașat în Anex ă) și efectuate în conformitate cu valorile stabilite de
principiile etice Helsinki pentru cercetarea medicală care implică subiecți umani.
Determinarea conținutului de H 2O2 din probele de EBC prin voltametrie ciclică
Pentru detectarea peroxidului de hidrogen din condensul de aer expirat (EBC) prin metode
electrochimice (voltametrie ciclic ă) a fost utilizat electrodul notat SPE-PEG -AuNP -A-PBdrop
care a prezentat o sensibilitate crescut ă pentru determinarea H2O2 din solu ții solutii standa rd
(Fig. 32).

62
După cum se poate observa din figura 32 , se poate observa ca inaltimea picului de reducere al
voltamogramei obtinute cu electrodul SPE -PEG -AuNP -A-PBdrop in 100 μL electrolit
inregistreaza valoarea de -0,49×10-3 A = -0,49 mA, iar in prezenta probei EBC creste la
valoarea de -0,51×10-3 A = -0,51 mA. Cresterea ∆i = 0,02 mA a curentului de reducere după
adăugarea a 50 μL de condensat din aerul expirat (EBC) se datorează reducerii apei oxigenate
din probă. Deplasare a picului de reducere spre valori mai mici de potential indică o
modificare a pH -ului soluției, precum și efectul unor posibili interferenți existenți în
compoziția probei. Din curba de etalonare care reprezinta intensitatea picului de reducere in
functie de concentratia de apa oxigenata din solutia de electrolit ( Fig. 26 ), se poate estima prin
extrapolare concentratia apei oxigenate din celula electrochimica continand proba EBC ca
fiind 0, 35 μM ca fiind corespondenta unui curent de reducere de 0,02 mA. Concentratia reala
a probei de EBC este de 150/50 ori mai mare, adica 0,35 μM x 3 = 1,05 μM H 2O2.

Figura 32. Voltamograme ciclice ale electrodului SPE -PEG -AuNP -A-PBdrop
în 100 μL electroli t (HCl 0,1 M + KCl 0,1 M), fără (linie punctată), respectiv cu adăugare a 7
μL EBC colectat (linie continuă).

În literatura de specia litate sunt semnalate concentraț ii de H 2O2 din EBC pentru pacienț ii cu
astm bronsic ca fiind în jurul valorii de 0,127 μM, iar pentru oamenii s ănătoși cu aproxima ție
în jurul valorii de 0,024 μM (Emelyanov et al. 2001) .

63
O serie de 7 probe recoltate de la pacien ți cu astm , precum și 3 probe recoltate de la donatori
sănătoși au fost evaluate utiliz ând senzorul dezvoltat SPE-PEG -AuNP -A-Pbdrop. În figura 33
sunt prezentate voltamogramele ciclice înregistrate în condi țiile optimizate și prezentate
anterior. În cazul probelor de la indivizii s ănătoși, curentul picului de reducere se situeaz ă în
jurul valorii de -0,491 mA. În cazul pr obelor colectate de la bolnavi, curentul picului de
reducere este cuprins între -0,507 mA ș i -0,552 mA, conform tabelului V .

64

Figura 33. Serie de 10 voltamograme ciclice obtinute cu electrodul SPE -PEG -AuNP -A-
PBdrop pentru 7 probe recoltate de la pacien ți cu astm (linii colorate) și 3 probe recoltate de la
donatori s ănătoși (linii negre)

Tabel V. Valorile picului de reducere înregistrate cu electrodul SPE -PEG –
AuNP -A-PBdrop pentru 7 probe recoltate de la pacienți cu astm ș i 3 probe
recoltate de la donatori sănătoși.
Provenința probei EBC Ipic
(µA) ∆I=i 0-i1
(µA)
H2O2
(µM)

sănătos 1 -492 11 0,57
sănătos 2 -491 9 0,51
sănătos 3 -491 9 0,51
pacient 1 -512 22 1,35
pacient 2 -507 18 1,02
pacient 3 -510 23 1,38
pacient 4 -511 20 1,05

65
pacient 5 -552 42 2,40
pacient 6 -526 36 2,10
pacient 7 -551 43 2,43
i0 – înălțime pic în absen ța probei
i1 – înălțime pic în prezenț a probei

Compar ând datele ob ținute cu cele semnalate în literatur ă se poate concluziona c ă rezultatele
proprii sunt comparabile cu cele din literatura (Emelyanov et al. 2001) . Este important de
menționat că rezultatele obținute evindențiază diferen țe majore între concentraț ia de H 2O2 din
EBC de la bolnavii diagnosticați și subiecții sănătoși (de aproximativ 5 ori).
Ca și consecință a bolii, din prelucrarea statistică a datelor reprezentate în Tabelul V, se poate
observa o creștere a conținutului de H 2O2 în cazul pacienților cu astm și BPOC comparativ cu
donatorii sănătoși (Tabelul VI) .

Tabel VI. Prelucrarea statistică a concentrației de H 2O2 din condensul de aer
expirat de la două grupe de subiecți: donatori sănătoși (3 probe) vs. pacienți
diagnosticați cu astm (7 probe).
Proveniența probei EBC H2O2
(µM) Testul t nepereche
(valoarea p)
Sănătos 0,5300 ± 0.0200
0.0146 (*)
Pacient 1,676 ± 0.2334
Pentru toate datele a fost calculată media ± SEM (eroarea standard a mediei).
Testul t nepereche a fost utilizat și o valoare a lui p < 0,05 a fost considerată statistic
semnificativă.

Pentru a demonstra ca al ți compuși din proba de EBC colectat ă nu interferă cu H 2O2 în ceea
ce privește rezultatele voltamogramel or ciclice, conducând la valori eronate, a fost testat și
nitritul (NO 2-) prezent in prob ă. Așa cum se poate observa în figura 34, vârfurile de oxidare
ale NO 2- apar în jurul valorii de 0,5 V, suficient de departe de vârful de reducere obișnuit al
H2O2 (~ 0 V) pentru a nu influența în vreun fel detectarea H 2O2.

66

Figura 3 4. Voltamograme ciclice ale electrodului SPE-PEG -AuNP -A-PBdrop în 100 μL
electrolit ( HCl 0,1 M + KCl 0,1 M ) în absența (linie punctată) sau prezența NO2- (linie
continuă ). Curba f ără picuri de reducere/oxidare corespunde electrodul ui SPE-PEG -AuNP.

Literatura (Guidelli et al. 2002; Li et al. 2013) sugereaz ă că reacția de oxidare a anionului
nitrit (NO 2-) în prezen ța PB conduce la ob ținerea ionului nitrat (NO 3-) în regiunea
poten țialului de 0.5 V, conform schemei de reac ții (Adekunle et al. 2011; Armijo et al. 2007) :
Fe2+Fe3+Fe3+
Fe3+e-
NO2OH2NO3NO2 H+
NO2OH2 NO3 H+NO2 Fe3+Fe3+Fe3+Fe3+e- NO2
e-
Fe3+
Fe3+e-Fe2+Fe3+/ [ ] /[ ]+
+- -2 2 + +
-2+-++ / [ ] / [ ]+-+
+
/[ ]+ / [ ]

67
III.5. Concluzii
 Modificarea electrodului serigrafiat din aur (SPE) a fost realizat ă prin cuplarea chimic ă
a PEG bifunc ționalizat cu grup ări tiolice terminale (-SH), capabil sa reactioneze atât cu
aurul din structura electrodului cât și cu nanoparticulele de aur depuse, forma nd legături
covalente Au-S-PEG -S-Au(NP) . Pe suprafa ța modificată a electrodului a fost adsorbit
ulterior a lbastru de Prusia (PB) , care asigur ă reducerea electrochimică a peroxidului de
hidrogen (H 2O2). Structurile poroase ale matricei PEG pot asigura un mediu de protecție
și creștere a suprafeței disponibile pentru depozitarea PB, conducând la îmbunătățirea
stabilit ății electrochimice. Experimentele electrochimice au demonstrat proprietăți
electrochimice bune și activitate electroanalitic ă pentru detectarea H 2O2.
 Electrozii serigrafia ți din aur modificați cu AuNP prin intermediul PEG au permis : (a)
un transfer rapid al electronilor la suprafa ța electrodului; (b) imobilizarea unei cantități
mari de PB; (c) reducerea electrochimică a H 2O2 la potențiale reduse ( rol
electro catali tic).
 Dimensiunile nanoparticulelor sintetizate au fost confirmate prin intermediul
spectroscopiei UV -Vis, a tehnic ii de difuzie dinamică a luminii (DLS) și microscopi ei
electronic e de transmisie (TEM). Microscopia d e forță atomică (AFM) a permis
numărarea AuNP depuse pe suprafața electrodului de lucru ( ~121 AuNP/μm2 în cazul
SPE-PEG -AuNP -A și ~50 AuNP/μm2 pentru SPE -PEG -AuNP -B).
 Albastru l de Prus ia a fost depus atât prin imersarea electrodului SPE -PEG -AuNP -A în
soluția de PB (SPE -PEG -AuNP -A-Pbimersat) cât și prin picurarea soluției de PB pe
suprafața de lucru a electrodului (SPE -PEG -AuNP -A-Pbdrop). Deși metoda de imersie
a condus la o reacție electrochimică mai bună, senzorul nu a fost utilizat în continuare
pentru detecția H 2O2 din probele biologice datorită problemel or potențiale legate de
contaminarea electrodului de referință.
 Atașarea AuNP pe suprafa ța electrodului prin intermediul PEG mărește foarte mult
suprafața electroactivă, conducând la cre șterea canti tății de PB adsorbit ă pe suprafa ța de
lucru a electrodului și în consecință la amplifica rea răspunsul ui electric atunci când în
electrolit se g ăsește H 2O2.
 Suprafața electroactivă și răspunsurile redox ale electrozilor sunt puternic dependente de
numărul AuNP.

68
 Prin testarea detec ției NO 2- cu senzorul SPE-PEG -AuNP -A-PBdrop s -a demonstrat că
acesta prezintă o valoare diferită a picului de oxidare ( ~0,5V) față de cel de reduce re al
H2O2 și deci nu poate in fluența detect ia H 2O2.
 S-a demonstrat că electrodul SPE -PEG -AuNP -A-PBdrop este suficient de sensibil
pentru detec ția H2O2 din condensul de aer expirat colectat de la pacien ți diagnostica ți cu
astm , concentrația acesteia fiind de aproximativ 2 µ M, și de aproximativ 5 ori mai mare
decât la subiec ții sănătoși.

Perspective
În studiile viitoare, cercet ările trebuie sa aib ă în vedere testarea unui număr mai mare de
probe biologice colectate de la pacien ți diagnostica ți cu astm și donatori s ănătoși pentru
validarea electrozilor SPE -PEG -AuNP -A-PBdrop și, de asemenea, aprofunda rea
studiilor în vederea diferen țierii gravit ății bolii și a aplic ării metodei în urm ărirea
evolu ției bolii în decursul terapiei acesteia .

69
IV. ANEXE
Consimțământ informat de participare
Nume participant__________________________________________ Cod _____________
Adresa_______________________________________________Telefon _______________

Prin acest formular vă invităm să participați într -un studiu de cercetare.
Vă rugăm să citiți cu atenție informațiile furnizate. Înainte de a decide dacă veți participa
sau nu, va trebui să înțelegeți scopul, utilitatea, riscurile și ce aveți de făcut în legătură cu
acest studiu. Dacă veți fi de acord să participați, vă rugăm să semnați formularul de
consimțământ informat. Dacă nu veți semna acest acest formular veți putea primi în
continuare îngrijiri medicale dar nu ca parte a acestui studiu. Veți primi o copie semnată a
acestui document.

Informații despre studiu

1. Scopul studiului: Sunteți invitat să participați la un studiu de cercetare privind
demonstrarea utilității biomarkerilor din condensul aerului expirat, ca parametri predictivi
pentru depist area astmului bronșic sau bronhopneumopatie cronic obstructive (BPOC).
Acest studiu va include persoane din zona Moldovei, care se adresează Spitalului Clinic
de Pneumologie Iași.
2. Proceduri: Dacă veți fi de acord să luați parte la acest studiu, sunteți rug at/tă să
respirati normal in dispozitivul Turbo DECCS. Colectarea probelor se va realiza cu un
dispozitiv "Turbo DECCS" (MEDIVAC, Italia) special creat pentru colectarea aerului expirat
prin condensare. Eșantionarea probelor de aer expirat condensate (EBC) nu este invazivă și nu
face decât să canalizeze expirația într -un circuit special de colectare de unică folosință numit
DECCS, plasat în răcitorul TURBO. Participarea dumneavoastră va dura 5 minute.
Vom analiza proba prin tehnici speciale, pentru a demons tra existența unei diferențe
semnificative între concentrația H 2O2 în EBC recoltat la pacienții cu patologii pulmonare și la
persoane sănătoase, de exemplu pacienții diagnosticați cu astm bronsic au o concentrație
medie de 0,127±0,08 μmol/L, în timp ce non -astmaticii au o concentrație medie de 0,024 ±
0,016 μmol/L în aer ul expirat; concentrația H 2O2 s-a dovedit a fi corelată cu iminența crizei
astmatice.
3. Posibile riscuri: Acest studiu implică un risc minim.

70
4. Tratamente medicale disponibile: Pe parcursul spitalizării/consultației veți primi
tratament conform recomandă rilor medicului dumneavoastră curant.
5. Posibile beneficii: Veți beneficia de rezultatul cercetării noastre, iar noi vom suporta
toate costurile acestei analize, care nu se face de regulă în spital. Rezultatele obținute vor
aduce date noi, de interes ști ințific național și internațional, privind noțiunile cu privire la
tratamentul și rezistența la medicația antituberculoasă.
6. Considerații financiare: Nu există o recompensă financiară sau materială pentru
participarea la studiu. Acest studiu nu implică costuri suplimentare din partea dumneavoastră.
7. Confidențialitate: Toate datele personale obținute din foile de observație vor fi păstrate
confidențial. În acest sens fiecare persoană inclusă va primi un cod. Informațiile medicale
rezultate din participa rea dumneavoastră pot fi puse la dispoziția Instituției care găzduiește
studiul, a Comisiei de Etică, și/sau a altor persoane/instituții, dacă legea o cere, cu păstrarea
anonimatului.
Datele obținute din foile de observație vor fi înregistrate sub nume de cod într -o bază de
date și vor fi folosite exclusiv pentru prelucrarea statistică.
8. Informații despre proprietatea și utilizarea datelor: Rezultatele obținute în cadrul
acestui studiu vor fi publicate în reviste științifice și/sau cu ocazia unor proxime manifestări
științifice internaționale, urmând ca autorii lucrărilor să menționeze afilierea la Universitatea
de Medicină și Farmacie „Grigore T. Popa” Iași.
9. Terminarea înrolării în studiu: Sunteți liber să decideți dacă veți dori sau nu să
participați până la finalul acestui studiu. Nu veți pierde nici un beneficiu la care sunteți
îndreptățit dacă nu veți accepta participarea. Nu există consecințe în cazul retragerii din acest
studiu.
10. Cunoașterea rezultatelor: Dacă doriți să cunoașteți rezultatele acestui studiu sau
dacă aveți alte întrebări legate de participarea dumneavoastră la studiu, puteți contacta
cercetătorul principal: Pinteala Tudor , U.M.F. “Grigore T. Popa” Iași, e -mail:
tudor.pinteala@gmail.com , tel: 0731550503

Prin semnarea acestui document confirmați că sunteți de acord să participați la
studiu.

Am citit și am înțeles ceea ce este scris în acest formular de consimțământ și sunt de
acord ca, de bună voie, să particip în studiul descris. Primesc o copie a acestui formular.
Data, loc ……………………………………..

71

Semnătura participantului………………… Semnătura medicului …………………

72