Leuciscus cephalus Oncorhynchus keta Coregonus lavaretus Coregonus [623383]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI FACULTATEA DE BIOLOGIE SPECIALIZAREA BIOLOGIE LUCRARE DE LICENȚĂ Coordonator științific: Prof. Univ. Dr. Otilia Zărnescu Absolvent: [anonimizat]-George Porumb 2017

2 UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI FACULTATEA DE BIOLOGIE SPECIALIZAREA BIOLOGIE STRUCTURA ÎNVELIȘURILOR OVOCITARE LA VERTEBRATELE INFERIOARE ȘI ROLUL LOR ÎN PROCESUL DE FECUNDARE Coordonator științific: Prof. Univ. Dr. Otilia Zărnescu Absolvent: [anonimizat]-George Porumb 2017

3 CUPRINS I. INTRODUCERE …………………………………………………………………………………………………… 4 CAPITOLUL I ………………………………………………………………………………………………………….. 5 CARACTERIZAREA ÎNVELIȘURILOR OVOCITARE LA VERTEBRATELE INFERIOARE ………………………………………………………………………………………………………….. 5 I.1. CARACTERIZAREA ZONEI RADIATA LA PEȘTII OSOȘI ………………………….. 5 I.1.1. Zona Radiata Externă …………………………………………………………………………………… 9 I.1.2. Zona Radiata Internă …………………………………………………………………………………. 12 I.1.3. Micropilul ………………………………………………………………………………………………… 15 I.1.4. Rolul în fecundare al zonei radiata la teleosteeni ………………………………………….. 18 I.2. CARACTERIZAREA ANVELOPEI VITELINE LA AMFIBIENI …………………. 21 I.2.1. Învelișul gelatinos ……………………………………………………………………………………… 22 I.2.2. Învelișul ovarian. ……………………………………………………………………………………….. 23 I.2.3. Învelișul celomic. ………………………………………………………………………………………. 23 I.2.4. Rolul în fecundare al anvelopei viteline la amfibieni ……………………………………… 24 II. MATERIALE ȘI METODE………………………………………………………………………………… 26 II.1. Animale ……………………………………………………………………………………………………….. 26 II.2. Analiza histologică ……………………………………………………………………………………….. 26 II.3. Măsurători micrometrice ……………………………………………………………………………… 29 II.4. Analiza statistică a datelor ……………………………………………………………………………. 30 III. REZULTATE ȘI DISCUȚII………………………………………………………………………………. 31 CONCLUZII …………………………………………………………………………………………………………… 50 BIBLIOGRAFIE …………………………………………………………………………………………………….. 52

4 I. INTRODUCERE Lucrarea de față își propune să prezinte principalele aspecte teoretice și practice în ceea ce privește structura și grosimea învelișurilor ovocitare la pești și amfibieni. Dezvoltarea tehnologiilor de reproducere pentru managementul peștilor și amfibienilor necesită cunoașterea factorilor care afectează reproducerea diferitelor specii. Tehnologiile de reproducere sunt utilizate din ce în ce mai frecvent pentru producerea de pești și amfibieni pentru hrană, cercetare sau pentru menținerea biodiversității prin programele de conservare a speciilor. Una din tehnologiile de reproduce pentru pești și amfibieni este fertilizarea artificială, în care se folosesc ovule și spermatozoizi proaspeți și congelați. Succesul procesului de fertilizare depinde în mare măsură de capacitatea spermatozoizilor de a traversa anvelopa vitelină pentru a ajunge la oolemă. Din acest motiv cunoașterea particularităților structurale ale anvelopelor viteline la pești și amfibieni poate fi utilă în asigurarea unei rate mari de succes în cursul reproducerii artificiale la speciile de interes economic. Prin procesul de ovogeneza are loc formarea ovocitelor, care la pești și amfibieni parcurg următoarele etape: ovogonie, ovocit previtelogenic timpuriu, ovocit previtelogenic cu alveole corticale, ovocit vitelogenic timpuriu, ovocit vitelogenic târziu și ovocit matur. Învelișurile ovocitare în timpul dezvoltării sunt străbătute de mii de microvili care provin din ovocit și din celulele foliculare, aceștia facilitând transferul de nutrienți și de factori de creștere, ajutând ovocitul să crească și să se dezvolte. Datorită prezenței învelișului ovocitar care variază de la o specie la alta, atât din punct de vedere al grosimii cât și al structurii, acesta joacă un rol important în procesul de fertilizare dar si de dezvoltare embrionară, protejând embrionul de polispermie. În cazul mamiferelor, zona pellucida reprezintă un sistem de securitate biologică care ecranează spermatozoizii ce sosesc, selectându-l doar pe cel compatibil, iar ulterior protejează embrionul de polispermie. În cazul peștilor, învelișul ovocitar și anume zona radiata prezintă și această capacitate, însă pești prezintă o structură esențială numită micropil care permite trecerea doar a unui singur spermatozoid, astfel împiedicându-se polispermia ulterioară a embrionului. La amfibieni polispermia este evitată prin apariția în cursul ovogenezei a unui înveliș gelatinos. Scopul acestui studiu a fost analiza structurii și grosimii anvelopei viteline la diferite specii de pești: Cyprinus carpio, Danio rerio, Carassius auratus gibelio, Esox lucius, Polyodon spathula și Huso huso dar și la specii de amfibieni: Pleurodeles waltl, Pelobatus fuscus și Bufo bufo, în vederea caracterizării diferențelor interspecifice.

5 CAPITOLUL I CARACTERIZAREA ÎNVELIȘURILOR OVOCITARE LA VERTEBRATELE INFERIOARE Ovocitele vertebratelor inferioare sunt înconjurate de un înveliș dens de glicoproteine, care joacă un rol important în procesul de fertilizare și de dezvoltare embrionară. Acest înveliș poartă denumirea de zona radiata (ZR) la teleosteeni și anvelopă vitelină la amfibieni (Lindsay și colab., 2002). Morfologia învelișului ovocitar variază între specii și reflectă adaptarea acestora la condițiile de mediu (Ravaglia și Maggese, 2002). Principala funcție a învelișurilor ovocitare este reprezentată de transportul vitelogeninei, precursorul vitelusului, în stadiile timpurii de dezvoltare, fixarea ovocitelor de substrat, atracția spermatozoizilor, prevenirea polispermiei și asigurarea unei protecții mecanice în timpul perioadelor de reproducere, fertilizare și post-fertilizare. Pentru embrionii în curs de dezvoltare, anvelopa vitelină permite schimbul de gaze și de substanțe nutritive din mediul extern (Ali și colab., 2013). I.1. CARACTERIZAREA ZONEI RADIATA LA PEȘTII OSOȘI Zona Radiata este un înveliș situat între membrana plasmatică a ovocitului (oolemă) și a epiteliului folicular. Aceasta este în general o matrice extracelulară ce prezintă în structura sa canale ale porilor, ocupate de microvilii ovocitului și de prelungirile celulelor foliculare (Heidari și colab., 2009). Numele de zona radiata se datorează prezenței acestor canale radiale. Prin intermediul acestor canale substanțele intră sau ies din ovocit în cursul dezvoltării (Kunz, 2004). Zona radiata apare pentru prima dată la baza microvililor ovocitari. Microvilii celulelor foliculare apar mai întâi în etapa a II-a de dezvoltare, iar numărul microvililor crește pe parcursul procesului de vitelogeneză (Abraham și colab., 1984). Speciile de Hippocampus erectus și Syngnathus fuscus în timpul formării anvelopei viteline primare prezintă niște microvili lungi care proiemină în spațiul dintre oolemă și celulele foliculare. Acest spațiu este produs când celulele foliculare se îndepărtează de suprafața ovocitului în timpul perioadei de creștere timpurie (etapa II). Microvilii ovocitului matur (stadiul IV) sunt subțiri și posedă un interior mai dens decât microvilii ovocitelor din

6 stadiul II și III. Microvilii pe parcursul tuturor etapelor de diferențiere prezintă un miez de microfilamente de actină. Microvilozitățile care apar în stadiile incipiente de maturare ovocitară sunt lipsite de substanța intermicrovilară, aceasta substanță apare sub forma unei material omogen abia în stadiul II de dezvoltare (Anderson, 1967). Fig. 1. Structuri în formă de deget (FS) proieminând în spațiul perivitelin (PvS) la Liza aurata observate la microscopul electronic. FE= epiteliu folicular. (După Shabanipour și Heidari, 2004). În cazul speciei de Rutilus frisii kutum, microvilii încep să se formeze pe suprafața ovocitului la începutul etapei vitelogenice. Microvilii care au trecut prin porii canalelor zonei radiata, apar sub forma unui deget de mănușă (Fig. 1). Se pare că există o relație strânsă între procesul de vitelogeneză și structura zonei radiata, inclusiv proiecțiile microvilare în ovocitul de Rutilis frisii kutum. Este posibil ca microvilii să ofere o suprafață extinsă pentru a transporta precursorii vitelini prin intermediul zonei radiata (Heidari și colab., 2009). Învelișul ovocitar în timpul dezvoltării este străbătut de mii de microvili proveniți din ovocit și din celulele foliculare. Acești microvili permit ovocitului să crească datorită transferul de nutrienți și factori de creștere. La Synbranchus marmoratus microvili de pe suprafața ovocitului se extind prin anvelopa vitelină și se proiectează adânc în spațiile extracelulare ale celulelor foliculare suprapuse. Acești microvili par să se sfârșească în interiorul canalelor radiale, cum a fost demonstrat și în cazul altor specii și se presupune că acest aspect se datorează faptului că microvilii foliculari sunt formați și introduși în canalele radiale în fazele târzii ale formării învelișului ovocitar (Ravaglia și Magesse, 2002). Porii de pe suprafața externă a zonei radiata a ovocitelor mature de Poecilia sphenops și Hypophthalmichthys nobilis sunt rotunzi și dispersați uniform (Fig. 2), în număr mult mai

7 mare și de dimensiune mult mai mică decât porii de pe suprafața interioară. După fertilizarea acestor ovocite, grosimea și numărul porilor se reduce (Ali și colab., 2014). Fig. 2. Aspectul porilor zonei radiata în microscopia electronică la Hypophthalmichthys nobilis. EX=suprafața exterioară a zonei radiata; P=Pori; ZR=zona radiata; CA=alveole corticale (După Ali și colab., 2014). Fig. 3a-b. Aspectul zonei radiata în microscopia electronică scanning la Danio rerio Aspectul porilor (Pr) pe suprafața exterioară a ZR după îndepărtarea epiteliului folicular (a). Secțiune transversală la nivelul porilor (Pr) zonei radiata (b). EX=suprafața exterioară a zonei radiata; L= lamelă; ZR= zona radiata; Pc=canalele porilor cu margini crenate; In= suprafața internă (După Kaviani, 2013). În cursul secționarii anvelopei viteline de Danio rerio s-au observat niște striații care sunt de fapt canalele porilor (Fig. 3.a). Aceste canale sunt inițial de mică adâncime, dar în cursul dezvoltării ovocitului acestea de adâncesc. Marginile crenelate ale canalelor (Fig. 3.b)

8 au funcție necunoscută, dar se presupune că ar avea rol de susținere. Atunci când ovocitele devin mature, microvilii si canalele de multe ori dispar. La Danio rerio, zona radiata prezintă un model similar de dezvoltare, care indică importanța sa pentru transferul nutrienților. Pierderea configurației zonei radiata după etapa vitelogenică, cum ar fi reducerea grosimii și a numărului de canale cu pori confirmă rolul său principal nutritiv, care se transformă ulterior într-un strat protector (Kaviani și colab., 2013). Kunz (2004) precizează că zona radiata a diferitelor specii de teleosteeni prezintă diferite modele. Ovocitele speciei de Perca fluviatilis prezintă o zonă radiata fin striată. Acesta a precizat că punctele observate pe anvelopa de Perca fluviatilis și Acerina vulgaris reprezintă deschiderile în formă de pâlnie ale canalelor radiale, poziționate în mijlocul fiecărei rețele hexagonale (numite fațete) a unui reticul. Canalele se deschid la suprafața interioară a stratului și acestea sunt mult mai scurte la Acerina decât la Perca. În cazul salmonidelor s-a observat niște puncte opace pe anvelopa vitelină. Aceste puncte sunt aranjate într-un model șagrin. Ovocitele de păstrăv și somon prezintă o zonă radiata fin striată (Kunz, 2004). Anvelopa ovocitului matur de știucă (Esox reticulatus) este înconjurată de o membrană transparentă, cu puncte fine, aranjate în mod regulat în linii circulare care se intersectează. La contactul cu apa, anvelopa se separă în două straturi: cel exterior este foarte subțire, iar cel interior, mai gros, prezintă dungi radiale fine. La Gasterosteus pungitius și Gasterosteus leirus s-a observat că membrana internă prezintă o structură fină și cu regularitate punctată. (Kunz, 2004) Studiile ulterioare au indicat o distincție clară între cele două sisteme radiale ale anvelopei de Perca sp. Canalele care trec prin porțiunea exterioară a oului, au un contur dublu pentru fiecare perete, și este umplut cu material. A fost confirmat faptul că anvelopa speciei de Perca sp. este formată din două straturi și că ambele sunt traversate de canale (Kunz, 2004). La nivelul suprafeței exterioară și interioară a anvelopei de Leuciscus erythrophthalmus s-au evidențiat niște puncte care au fost mai pronunțate la Esox reticulatus și cel mai evident la Cyprinus carpio (Fig. 2). Acest aspect ar sugera faptul că acest strat este străbătut de canale mici, și că punctele sunt "o expresie optică" a deschiderilor în formă de pâlnie (Kunz, 2004). Prin analiza anvelopei a 27 de teleosteeni de apă dulce s-a stabilit diferența dintre cele două anvelope: cea din interior, pe care o numim acum zona radiata și stratul vâscos de la exterior. La nivelul zonei radiata s-au remarcat niște structuri punctate iar pe baza

9 observațiilor microscopice s-a stabilit că anvelopa tuturor peștilor este traversată de la interior spre exterior de canale ale porilor. În ovocitele tinere, canalele radiale ale porilor sunt foarte spiralate. Specia Osmerus eperlanus prezintă o structură punctată și s-a sugerat că această structură punctată rezultă din porii canalelor care sunt foarte fine (Kunz, 2004). În cazul speciei Pseudosciaena crocea, microvilii conectează ovocitul și celulele granuloasei care sunt omniprezente pe toata durata procesului de formare. Putem presupune că microvilii sunt esențiali pentru formarea zonei radiata. La bibanul de China (Perca schrenkii) cercetatorii au descoperit o mulțime de proiecții sub forma unor tentacule formate dintr-un material coloidal transparent. Aceste structuri cresc suprafata de absorbție a ovocitelor și facilitează transportul nutrienților în mod direct către ovocit sau indirect prin intermediul celulelor foliculare. În concluzie, microvilii joacă un rol important în fomarea zonei radiata și în transportul nutrienților între celulele ovocitului și celulele foliculare. Se presupune că prezența microvililor este principalul motiv pentru care specii diferite au diferite tipuri de anvelope viteline (Xiao-Xin Ma și colab., 2011). I.1.1. Zona Radiata Externă Zona Radiata externă este numită învelișul vitelin extern sau zona vitelină exterioară. Stratul zonei radiata externe este de aproximativ 25-59 µm grosime (Tabel I.1) și constă dintr-o rețea de fibrile filamentoase longitudinale care se termină în niște proeminențe helicoidale ca niște șuruburi pe suprafața acestui strat. Fibrilele sunt grupuri de filamente, care sunt adesea aranjate și îmbinate împreună în interiorul anvelopei viteline pentru a forma niște ramificații. A fost raportat un epistrat subțire care conține fibre situate între zona radiata externă și zona radiata internă a ovocitelor la sturioni Acipenser gueldenstaedtii și Acipenser naccarii (0,5 µm grosime). Prezența acestui strat a fost confirmată și la Huso huso, Acipenser baerii, Acipenser gueldenstaedtii, și Acipenser stellatus prin microscopie eletronică de transmisie (Siddique și colab., 2014) Prin microscopia optică s-a demonstrat că specia de Liza aurata prezintă o zonă radiata striată în timpul vitelogenezei timpuri. O constatare similară s-a raportat și pentru Hemiodus sp. În timpul vitelogenezei târzii s-au observat striuri ale zonei radiata la speciile de Serranus cabrilla și Serranus atricauda. Zona radiata a speciei de Liza aurata prezintă o linie striată ce reprezintă un canal cu porii care se deschid la ambele capete. Canalele zonei radiata observate în timpul vitelogenezei pot fi implicate în transferul precursorilor vitelini spre ovocit. Vitelogenina, precursorul vitelusului ajunge la ovocit prin intermediul porilor.

10 Existența acestor pori la ovocitele adezive și non-adezive a fost legată de modificările metabolice (oxigenare) în ovocit după depunerea pontei. Proiecțiile poroase asemănătoare unui deget până la sfârsitul etepei de IV-a de dezvoltare a ovocitului, au o lungime de 45-50 µm. Aceste schimbări structurale ale zonei radiata au fost corelate cu apariția unor structuri in formă de mugure care mai târziu apar sub forma unor structuri în fomă de deget de mănușă (Fig.4). Alungirea proiecțiilor zonei radiata a fost însoțită și de creșterea numărului de pori în timpul stadiului IV care a intensificat și intrarea precursorilor vitelini prin pori (Fig.4) (Shabanipour și Heidari, 2004). Fig. 4. Aspectul structurilor în formă de deget în zona radiata la Liza aurata. Imagine realizată la microscopul electronic. FS=structuri în formă de deget; P=pori. (După Shabanipour și Heidari, 2004). Kunz (2004) a observat că zona radiata la Perca sp., Scomber sp. și Raniceps sp. este formată din două straturi. Prin microscopia electronică s-a demonstrat că cele două straturi au ultrastructură diferită și s-a confirmat faptul că, zona radiata externă este mai subțire decat cea interna. La cele mai multe familii de teleosteeni zona radiată internă este considerată mai groasă decât cea externa, ca de exemplu la Salvelinus fontinalis, Agonus cataphractus, Perca fluviatilis, Salmo gairdneri, Lutjanus synagris și Zoarces viviparus. Salmonidele prezintă un exterior cu "condensări" osmiofilice care, înainte de ovulație fuzionează și formează o bandă densă compactă situată între două straturi mai puțin electrono-dense. Suprafața externă a patru specii de Oncorhynchus a arătat un model hexagonal de deschideri ale porilor, care au fost deschise la O. nerka, dar închise ca un inel îngroșat la speciile de O. gorbuscha, O. keta, O.

11 kisutch și O. tshawytscha. La Cynolebias cyprinodon zona externă este formată dintr-un strat omogen. Tabel I. 1. Grosimea anvelopei viteline la teleosteeni
aAli și colab., 2014; bSiddique și colab., 2014; cLitscher și Wassarman, 2014; dKunz, 2014; eJiang și colab., 2013; fAli și colab., 2013; gKaviani și colab., 2013; hShanibapour și Hossayni, 2010; iHeidari, 2009; jMekkawy și Osman, 2006; kShabanipour și Heidari, 2004; lHyllner, 1994. Denumire științifică Ordin Familie Grosime
anvelopă
vitelină
(μm) Poeci lia sphenops Cyprinodontiformes Poeciliidae 1a Danio rerio Cypriniformes Cyprinidae 1,6g Zoarces viviparus Perciformes Zoarcidae 2-3 μmd Dermogenys pusillus Beloniformes Zenarchopteridae 2-3 μmd Claris gariepinus Siluriformes Clariidae 4,6 μmj Oncorhy nchus mykiss Salmoniformes Salmonidae 5 μml Amphioxus sp. Amphioxiformes Asymmetrinidae 6 μmc Hypophthalmichthys nobilis Cypriniformes Cyprinidae 6,5 μma Clupea harengus Clupeiformes Clupeidae 6-8 μmd Cyprinus carpio Cypriniformes Cyprinidae 8 µmh Liza aurata Mugiliformes Mugilidae 11 μmk Rutilus kutum Cypriniformes Cyprinidae 14,9 μmi Pleuronectes platessa Pleuronectiformes Pleuronectidae 15 μmd Acipenser stellatus Acipenseriformes Acipenseridae 20 µmb Siniperca chuatsi Perciformes Percichthyidae 25,5-26,3 μme Acipenser gueldenstaedti Acipenseriformes Acipenseridae 20-30 µmb Cyclopterus lumpus Scorpaeniformes Cyclopteridae 60 μmd Agonus cataphractus Scorpaeniformes Agonidae 70-80 μmd Acipenser persicus Acipenseriformes Acipenseridae 161,62 μmf

12 Fig. 5. Reprezentarea schematică a zonei radiata la Acipenser transmontanus. TC= celule tecale; BL=lamină bazală; GC=celulele granuloase; FE=epiteliu folicular; Al=strat adeziv; Zre=zona radiata xternă; Zri=zona radiata internă; CMP=membrană citoplasmatică; mv=microvili; CG=granule corticale; PG=granule de pigment. (Adaptată după Murata și colab., 2014). Murata și colab., 2014 au identificat la specia Acipenser transmontanus că zona radiata este formată din 2 straturi, zona radiata externă și internă (Fig. 5), L1, L2, L3, L4 făcând parte din zona radiata internă. La genul Cichlasoma zona externă conține, doar un singur strat dens subțire și omogen iar la Dermogenys pusillus prezintă un strat foarte subțire neregulat. Brachydanio sp. și Anguilla anguilla au doar un singur strat electrono-dens și omogen (Kunz, 2014). I.1.2. Zona Radiata Internă Zona radiata internă sau anvelopa vitelină internă este stratul cel mai intim al învelișului ovocitar și este strâns asociat cu oolema. Zona radiata internă are de obicei 14-25 µm grosime. Grosimea acestui strat a fost raportată ca având 12 µm grosime La A. transmontanus și 20 µm în A. naccarii. Acest strat este format din mai multe fibrilele

13 longitudinale, mai mici în diametru decât cele ale zonei radiata externe și mai strâns împachetate. Similar zonei radiata externă, proiecțiile helicoidale ale canalelor nu au fost observate în interiorul zonei radiata interne. Zona radiata internă apare în microscopia electronică, separată de ooplasmă printr-o zonă subțire electrono-densă prin care se proiectează numeroși microvili din oolemă. Mai mulți autori au raportat prezența microvililor și a numeroase excrescențe ale cortexului citoplasmatic care umple spațiul dintre oolemă și zona radiata internă. Acest material este denumită "matricea extra-ovocitară". Deoarece matricea extra-ovocitară este în apropiere de zona radiata internă, microvili intră prin canalele sale. Granulele corticale sunt strâns cuplate cu oolema și situate chiar sub matricea extra-ovocitară pe toată suprafața acestuia, în timp ce granulele de pigment sunt depozitate lângă granule corticale. Granulele corticale și granule de pigment sunt rotunde, elipsoidale, de multe ori neregulate, și aranjate de obicei în una sau două rânduri (Siddique și colab., 2014). Fig. 6. Aspectul zonei radiate în microscopia optică la Acipenser persicus. ZRi=zona radiata internă; ZRe= zona radiata externă; PVS=spațiu perivitelin; PO=ooplasma pigmentată periferic; O=ooplasmă; YM=vitelus; C=canalele porilor (După Ali și colab., 2013). Pe măsură ce ovocitul continuă să crească și să se dezvolte, anvelopa vitelină (în cursul dezvoltării corionice) crește în grosime și complexitate. Materialul suplimentar (zona radiata internă este aparent secretată de ovocite și depozitată sub zona radiata externă) (Fig. 6). Materialul se deosebește în mod clar de zona radiata externă din punctul de vedere al densității electronice și de compoziția acestuia. Întrucât zona radiata externă este granulată,

14 straturile inferioare tind să fie fibrilare sau filamentoase cu componente care prezintă relații arhitecturale complexe (Dumont și Brummett, 1985). Kunz (2004) a sugerat că zona radiata internă prezintă două tipuri structuri: tipul Salmonidae, în care numărul straturilor crește continuu până la ovulație, iar tipul Cyprinodont, în care zona radiata internă prezintă mai întâi un cadru reticular (fascicule de filamente), care este schimbat ulterior în lamele. Matricea internă a ovocitului de Salmo fontinalis prezintă o structură omogenă. La începutul vitelogenezei, striațiile apar în zona radiata și sunt orientate tangențial pe suprafața oului. Din moment ce acestea sunt înclinate într-o direcție și apoi în altă direcție, apare un model numit "spic". Autorii sugerează că acest aranjament dispus alternativ este responsabil pentru formarea de "nervuri" în spirală aranjate în jurul canalelor porilor. La Ciprinodonte ovocitul vitelogenic de Fundulus heteroclitus prezintă zona radiata internă compusă din fibrile aranjate într-un model de tip "spic" iar ovocitul de Fundulus heteroclitus și Pleuronectes platessa prezintă o rețea care în cele din urmă se va contopi și va produce 6-7 straturi electronodense (Tabel I. 2). Oncorhynchus gorbuscha prezintă stratul intern compus din numeroase lamele scurte și discontinue, aceste tipuri de lamele se găsesc și la mai multe specii de somon din Pacific. Suprafața interioară a zonei radiata internă la această specie prezintă o textură fibroasă și un aranjament regulat ale deschiderii interioare ale canalelor porilor din zona radiata (Kunz, 2004). Zona radiata internă la Esox lucius, este alcătuită din lamele osmiofilice dispuse alternativ cu interlamele de aproximativ aceeași grosime. La Cynolebias belotti zona radiata internă a fost descrisă ca având o structură alcătuită din "pachete". Zona internă (numită Z3) la Hipocampului erectus și Syngnathus fuscus afișează o rețea reticulară, care devine multilamelată inainte de ovulație. În zona radiata internă la Cichlasoma sp. prezența lamelor, conferă un model de îndoituri iar la ciprinidele din Rusia aceasta este alcătuită din fibre dispuse sub formă de pachete (Kunz, 2004). În cazul speciei Synbranchus marmoratus zona radiata internă devine mai groasă (aproximativ 10-11 µm) și prezintă o structură multilamelară cu straturi alternative de diferite densități (Ravaglia și Maggese, 2002). Analizele biochimice au relevat că zona radiata a pestilor este formată din polizaharide și glicoproteine. Zona radiata externă este bogată în polizaharide în timp ce zona radiata internă în proteine (Kunz, 2004).

15 Tabel I. 2. Numărul de straturi ale anvelopei viteline la teleosteeni Denumire științifică Ordin Familie Număr de
straturi Oreochromis niloticus Perciformes Cichlidae 1d Trachinotus ovatus Perciformes Carangidae 1e Liza aurata Mugiliformes Mugilidae 1a Rutilus frisii kutum Cypriniformes Cyprinidae 1a Cyprinus blicca Cypriniformes Cyprinidae 3f Blennius viviparus Perciformes Blenniidae 3f Carassius auratus Cypriniformes Cyprinidae 3e Hippocampus erectus Syngnathiformes Syngnathidae 3a Syngnathus fuscus Syngnathiformes Syngnathidae 3a Serrasalmus spilopleura Characiformes Characidae 3a Larimichthys cr ocea Perciformes Sciaenidae 3c Siniperca chuatsi Perciformes Percichthyidae 3b Syngnathus scovelli Syngnathiformes Syngnathidae 3g Acipenser transmontanus Acipenseriformes Acipenseridae 4a Claris gariepinus Siluriformes Clariidae 4e aAli și colab., 2014; bJiang și colab., 2013; c Xin Ma și colab., 2011; d Shanibopour și colab., 2009; eMekkawy și Osman, 2006; fKunz, 2004; gRavaglia și Maggese, 2002. I.1.3. Micropilul Micropilul este o structură specială situată la polul animal al ovocitului, acesta permite trecerea unui singur spermatozoid pentru a fuziona cu oolema. In timpul dezvoltarii ovocitului, micropilul, cuprinde un vestibul și un canal micropilar. Canalul este astupat de o celulă micropilară. Această asociere constituie aparatul micropilar, care are o structură similară în cadrul unei familii sau unui gen (Heidari și colab., 2009). Celula micropilară este echipată cu o singură proeminență în partea apicală, care este atașată la suprafața polului animal al ovocitului prin intermediul desmozomilor. Proiecția cuprinde numeroși microtubuli și formează o barieră pentru depunerea anvelopei viteline, care are ca rezultat formarea unui canal micropilar (Kunz, 2004).

16 Fig. 7. Structura micropilului în microscopia electronică la Pethia conchonius (După Amanze și Iyengar, 1990). Micropilul speciei Pethia conchonius prezintă o regiune micropilară ce constă dintr-o zonă nelipicioasă de captare a spermatozoizilor de aproximativ 20 μm în diametru și o suprafață de 314 de μm2. În centrul zonei de captare a spermatozoidului este un vestibul în formă de pâlnie, cu un diametru de maxim 4,5 μm la intrarea în micropil și mai puțin de 1 μm la nivelul gropiței micropilare. Zona de captare a spermatozoidului este un sistem format din 7-10 canale micropilare și de muchii care se scurg direct în vestibul (Fig. 7) (Amanze și Iyengar, 1990). Ovocitele de sturioni conțin numeroase micropile sub formă de pâlnie iar canalele acestora sunt înguste în apropierea locului de intrare a spermatozoidului în regiunea polului animal. Deschiderea interioară a canalului micropilar este mult mai îngustă decât deschiderea în formă de pâlnie. Deschiderea interioară a canalului micropilar este puțin mai mare decât diametrul acrozomului și nu este suficient de mare pentru a permite mai multor spermatozoizi să intre în micropil (Siddique și colab., 2014). Micropilul situat în anvelopa oului de pește este singura conexiune pentru ca spermatozoidul să comunice cu oolema (Otani și colab., 2009) iar aspectul micropilului poate fi corelat cu lipsa acrozomului în spermatozoizii (Kunz, 2004). Kunz, 2004 a descris patru tipuri de micropil (Tabel I.3): • Tipul I, prezintă o adâncitură sau pâlnie (vestibul) pe suprafața ovocitului, care duce la un canal scurt, care se deschide pe suprafața interioară a anvelopei. • Tipul II cu o depresiune de mică adâncime ca o farfurioară (o groapă netedă) care duce într-un canal lung.

17 • Tipul III are doar un canal. • Tipul IV cu două vestibule (exterior și interior) situate la suprafața ovocitului și un canal scurt. Tabel I.3. Tipurile de micropil la diferite specii de teleosteeni Tip I Tip II Tip III Tip IV

Leuciscus cephalus Oncorhynchus keta Coregonus lavaretus Coregonus
macrophthalmus Gobio gobio Brachydanio rerio C. nas us C. wartmanni Noemacheilus
barbatulus Salvelinus alpinus C. oxyrhynchus Phoxinus phoxinus Salmo salar C. pidschian Tinca tinca Chionobathiscus
dewitti C. fera Cichlasoma meeki Cyprinus carpio C. macrophthalmus C. nigrofasciatum Carassius
caras sius C. wartmanni Leuciscus rutilus Esox lucius Scorpaena scrofa Salmo gairdneri Julis turcia S. trutta Julis vulgaris
Crenilabrus sp. Salvelinus fontinalis Heliasis chromis Engraulis japonicus Gasterosteus sp. Pagrus major Chionodrac o myersi Anguilla japonica
Esox reticulatus zr-zona radiata, zri-zona radiata internă, zre-zona radiata externă (După Kunz, 2004). Micropilul de Gasterosteus este de tipul I. Acesta are forma unui inel înconjurat de o structură asemănătoare unei deschideri de tip pâlnie. Micropilul speciei Pungitius tymensis este o adâncitură în formă de pâlnie, cu o mică deschidere interioară și o margine îngroșată la deschiderea interioară și exterioară. Micropilul speciei Perca fluviatilis are forma unei rozete în jurul deschiderii interioare a canalului. Ovocitele de Perca fluviatilis sunt atașate unul de

18 celălalt într-un tub de plasă. Beneficiile acestui aranjament sunt pentru a preveni alipirea micropilelor la contactul dintre ovocite. (Kunz, 2004). În general, rolul micropilului este de a ajuta procesul de fertilizare. Micropilele sunt situate exclusiv în regiunea polului animal, care este în apropierea nucleului, astfel încât, după intrarea în canalul micropilului, spermatozoidul poate penetra cu ușurință ovocitul. Numărul mare de micropile din ovocitele de sturion cresc șansele de fertilizare. Celula micropilară determină structura micropilului și poziția sa pe suprafața ovocitului în timpul ovogenezei. Sub deschiderea micropilului pe suprafața ovocitului, există un grup de microvili. După cum s-a menționat, numărul de micropile variază semnificativ între speciile de acipenseride și chiar printre ouăle de la aceeași femelă. Dimensiunea câmpului micropilar este corelat pozitiv cu numărul de micropile din fiecare ou. Distanța dintre două micropile nu este mai mare de 100 μm (Kunz, 2004). Canalul micropilar traversează stratul interior al anvelopei viteline (zona radiata internă), iar diametrul capătului interior al canalului micropilar este puțin mai mare decât lățimea capului spermatozoizilor. Ca și la alte specii de pești, baza canalului micropilar în ovocitele de sturioni este suficient de largă pentru trecerea unui singur spermatozoid. Canalul micropilar într-un ovocit de Cyprinus carpio este mai mare decât capul spermatozoidui, dar ovocitul de Cyprinus carpio nu posedă multiple micropile. Micropilele sunt de ajutor în procesul de fertilizare și, de asemenea, furnizează un sistem eficient pentru blocarea polispermiei. Atunci când un spermatozoid penetrează ovocitul, se formează în micropil conul de fertilizare (Kunz, 2004). I.1.4. Rolul în fecundare al zonei radiata la teleosteeni Ovulul si sperma teleosteenilor au evoluat împreună și sunt bine adaptate pentru a efectua o fertilizarea rapidă, monospermică și specifică speciei respective. Unele dovezi au arătat că fertilizarea este facilitată de prezența unui atractant in regiunea micropilară a anvelopei. Astfel, structura corionului asigură ca un singur spermatozoid să ia contact cu ovulul; polispermia este prevenită, iar fertilizarea monospermică este facilitată.

19
Fig. 8. Reprezentarea schematică a mecanismului de blocare al polispermiei și de fecundare al ovocitului la Acipenseridae. (a) deschiderea interioară a micropilului; (b) forma de con a micropilului impiedică trecerea mai multor spermatozoizi; (c) conținutul granulelor corticale resping și imobilizează spermatozoizii supranumerali; (d) după formarea completă a spațiului vitelin, enzimele secretate de granule corticale determină întărirea zonei radiata și blocarea situsurilor de intrare a spermatozoidului (După Siddique și colab., 2014). În cazul în care oul de teleostean este penetrat de un spermatozoid, ovulul răspunde prin exocitoza granulelor corticale și apariția unui spațiu perivitelin evident. Corionul anterior moale, care, înainte de fertilizare a fost strâns legat de plasmalema oului, se separă de acesta, se întărește, și se întinde. Factorii care au fost implicați în întărirea anvelopei includ ionii de calciu, componente eliberate din granulele corticale, și o enzimă de întărire sau o fosfolipidă derivată din membrana oului (Fig. 8) (Dumont și Drummet, 1985). Înainte și în timpul procesului de fertilizare, transformarea anvelopei viteline sau zonei radiata în anvelopă de fertilizare implică modificări morfologice comune mai multor specii de pești. Grosimea anvelopei viteline în regiunea polului animal scade ca urmare a ovulației. La speciile de sturion, zona radiata este mai subțire la polul animal (aproximativ 20 μm pentru A. stellatus și 20-30 μm pentru A. gueldenstaedti) decât în alte zone ale zonei radiata (Siddique și colab., 2014). Spermatozoizii speciei Rhombosolea retiaria încep să înoate viguros într-o suspensie de apă de mare. Diametru orificiului exterior și lungimea micropilului speciei Rhombosolea retiaria sunt cuprinse între 7-8 μm și 20-25 μm iar diametrul regiunii interioare a canalului micropilar este de 1,5 μm. Contactul dintre spermatozoizi și suprafața anvelopei viteline este foarte rapid. La 5 minute după înseminare, spermatozoizii au fost observați în apropierea micropilului (Fig. 9). Capetele spermatozoizilor vin foarte aproape de deschiderea

20 micropilului, iar interiorul micropilului fiind umplut la aproximativ 10-20 de secunde după înseminare.
Fig. 9. Reprezentarea schematică a contactului spermatozoidului cu micropilului la Pseudopleuronectes americanus (A) și Clupea harengus (B) (După Yanagimachi, 2013). În condiții normale, primul spermatozoid care a intrat în micropil a pătruns și în ooplasmă, iar restul spermatozoizilor sunt eliminați afară din micropil (de către fluidul din spațiul perivitelin) după ce ovocitul a fost activat de către spermatozoid. La 2-3 minute după intrare spermatozoidului în oolema ovocitului, jumatatea interioară a canalului micropilar s-a închis iar jumătatea exterioară rămâne încă deschisă (Yanagimachi și colab., 2013).

21 I.2. CARACTERIZAREA ANVELOPEI VITELINE LA AMFIBIENI Anvelopa vitelină este cel de-al doilea înveliș ovocitar cu care vine în contact spermatozoidul în timpul fertilizării la amfibieni. În fertilizare, anvelopa vitelină este modificată de conținutul eliberat de granulele corticale care acționează prin blocarea polispermiei. Anvelopa vitelină a speciei Cynops pyrrhogaster este compusă din șase componente majore și din 3 straturi care pot fi detectate imunologic. Aceasta dobândește capacitatea de a lega spermatozoidul în oviduct. Anvelopa vitelină a ovocitului se leagă numai de spermatozoidul care a suferit reacția acrozomală iar această capacitate de legare a spermatozoidului lipsește în ovocitul fertilizat (Watanabe și Onitake, 2002). Anvelopa vitelină a speciei de Xenopus începe să se formeze între suprafața ovocitului și celulele foliculare timpurii în timpul dezvoltării ovocitului (etapa II). La început zone izolate de material fibrilar, devin apoi continue pe suprafața ovocitului. Prin microscopie electronică s-a demonstrat că anvelopa vitelină este punctată de niște pori relativi mari sau de canale prin care macrovilii lungi din celulele folicului trec pentru a lua contact cu ovocitul. Astfel, anvelopa vitelină este o structură poroasă și permite trecerea moleculelor relativ mari (inclusiv feritină, dextran, peroxidază de hrean, dioxid de toriu) din sistemul circulator al foliculului la suprafața ovocitului. La salamandre anvelopa vitelină este formată din două straturi: un strat proximal și distal .(Dumont și Brummett, 1985). Matricea extracelulară (ECM) care înconjoară ovocitul anurelor este compusă dintr-un înveliș gelatinos, o anvelopă vitelină și un spațiu perivitelin care separă învelișul de oolemă. Ambele straturi sunt importante pentru fertilizare. Anvelopa vitelină este o singură structură care există în mai multe forme înrudite. În cazul speciei Xenopus laevis, există patru forme distincte ale anvelopei: anvelopa ovariană a ovocitului în timp ce acesta este încă în ovar, învelișul celomic asociat cu ovocitul ovulat care se găsește în celom, anvelopa vitelină a ovocitului și anvelopa fertilizată asociată cu ovulul fertilizat. Toate cele patru forme au o ultrastructură unică. Ele prezintă o compoziție macromoleculară diferită cu exceptia învelișului celomic și învelișului oviductal care au aceeași compoziție macromoleculară (Hedrick și Nishihara, 1991).

22 I.2.1. Învelișul gelatinos Învelișul gelatinos este esențial pentru fertilizare și dezvoltare. Interacțiile dintre spermatozoid și ovocit au loc în invelișul gelatinos, acesta având și rolul de a împiedica excesul spermatozoizilor la suprafața ovocitelor atunci când acestea sunt depuse în apă. Stratul gelatinos prezent la suprafața ovocitului este adesea lipicios și face posibilă ca ovocitele să adere la substrat. Acest strat are rol antibacterian până la sfârșitul embriogenezei (Watanabe și Onitake, 2002). Fig. 10. Învelișul gelatinos la Cynops pyrrhogaster observat în microscopia optică. jelly=înveliș gelatinos; egg= ovocit (După Watanabe și Onitake, 2002). Învelișul gelatinos este compus din structuri fibroase care formează mai multe straturi (Fig. 10). Matricea stratului gelatinos este secretată în porțiunea posterioară a oviductului. Aceste substraturi joacă un rol distinct în fertilizare și dezvoltare. Morfologic învelișul gelatinos al ovocitelor de amfbian este format din trei sau mai multe straturi care variază în funcție de specie. Aceste straturi au fost denumite J1, J2 și J3. Fiecare strat prezintă reacții de colorare histochimice diferite, dar în general glicoproteinele sunt componentele majore. Analiza învelișului gelatinos de la specia de Rana sp. a arătat un număr semnificativ de polizaharide (Dumont și Brummett, 1985). La tritonul, Cynops pyrrhogaster stratul gelatinos este împărțit în șase straturi, ultimul strat fiind lipicios (Watanabe și Onitake, 2002). La Xenopus laevis cele 3 straturi sunt compuse din 8 glicoproteine glicozilate. Fiecare strat având o compoziție unică, iar glicoproteinele care compun un strat individual nu sunt distribuite uniform în aceste straturi. Învelișului gelatinos al ovocitului are rol important în furnizarea de nutrienți embrionului în curs de dezvoltare dar și de a preveni polispermia (prezintă carasteristici

23 imunologice). Acesta este sintetizat și secretat de oviduct sub influența și controlul hormonilor. La trecerea prin oviduct ovocitul capătă straturi succesive și unice de înveliș gelatinos (Dumont și Brummett, 1985). I.2.2. Învelișul ovarian. Biosinteza macromoleculară a anvelopei viteline începe în stadiul I al ovogenezei iar asamblarea moleculară într-o structură vizibilă extracelulară are loc în stadiul al II-lea. Formarea anvelopei viteline este completă în stadiul V al ovogenezei. Suprafața unui ovocit izolat în stadiul VI are aspectul unei împletituri de fascicule fibroase cu pori care duc în tuneluri în care prelungirile macrovililor străbat anvelopa vitelină. Aceste tuneluri sunt produse atunci când matricea anvelopei este formată prin ansamblarea fibrelor în jurul prelungirilor microvilare. Atât prelungirile celulelor foliculare cât și microvilii ovocitului se retrag din anvelopa vitelină înainte de ovulație. Învelișul ovarian este compus din trei tipuri de fibre diferite care diferă ca mărime și poziție. Cele mai mari fibre sunt de aproximativ 15 nm în diametru și sunt grupate în mănunchiuri care au un diametru de 75-100 nm (Hedrick și Nishihara, 1991). I.2.3. Învelișul celomic. Învelișul celomic al ovocitului ovulat este lipsit de celule foliculare si de prelungirile microvililor care sunt substanțial mai scurți. La Xenopus laevis, învelișul celomic prezintă fibrile grupate în mănunchiuri mai laxe decât în învelișul ovarian, aceste fascicule fibroase se încrucișeză unul cu altul și se îmbină (Hedrick și Nishihara, 1991). Pe baza microscopiei electronice s-a remarcat că anvelopa vitelină a ovocitului celomic, prezintă un aspect mult mai fin decât cel al ovocitului ovarian. Celulele foliculare se detașează de pe suprafața anvelopei viteline înainte de ovulație, aceasta sugerând faptul că netezirea suprafeței poate fi rezultatul aceluiași factor sau factori care determină dizolvare relației dintre celulele foliculare, anvelopă vitelină și/sau ovocit. Spre deosebire de filamentele bine fixate de ovocitele ovariene, filamentele ovocitului celomic sunt mai bine strânse în pachete mai mari și aranjate mai mult aleator. Anvelopa ovocitului celomic împiedică pătrunderea spermatozoidului și prin urmare fecundarea (Dumont și Brummett, 1985).

24 I.2.4. Rolul în fecundare al anvelopei viteline la amfibieni Fertilizarea ovocitelor celomice care nu au dobândit stratul gelatinos este posibilă numai în condiții foarte specifice și stricte. Atunci când ovocitele prezintă doar stratul J1 rata de fertilizare este foarte mică. Spermatozoidul nu este capabil de a intra și de a penetra acest strat. Ovocitul matur al speciei Notophthalmus viridescens este înconjurat de cinci învelișuri gelatinoase pe măsură ce se deplasează prin oviduct. Fertilizarea este internă iar polispermia este normală. La Rana și Xenopus succesul fertilizării crește odată cu creșterea numărului de straturi gelatinoase. În cazul salamandrelor și al altor specii de amfibieni, hidratarea învelisului gelatinos este un factor foarte important pentru penetrarea spermatozoidului (Dumont și Brummett, 1985). La contactul cu spermatozoidul ce declanșează eliberarea conținutului granulelor corticale iar anvelopa vitelină este convertită în anvelopă de fertilizare (Hedrick și Nishihara, 1991).
Fig. 11. Reprezentarea schematică a situsurilor de interacție dintre spermatozoid și anvelopa vitelină la triton (Cynops pyrrhogaster) și broască (Xenopus laevis) (Adaptată după Watanabe și Onitake, 2002). Ovocitul de Cynops pyrrhogaster este foarte ușor fertilizat dacă se inseminează direct spermatozoizi pe suprafața ovocitului. Atunci când ovocitele obținute din oviduct sunt inseminate, ovocitele sunt fertilizate normal, chiar dacă nu sunt prezente toate straturile gelatinoase care înconjoară ovocitul. Reacția acrozomală a spermatozoidului este indusă în

25 apropierea sau în interiorul anvelopei viteline la Bufo și la Xenopus. La Bufo arenarum vezicula acrozomală se menține în substanța gelatinoasă a ovocitului iar reacția acrozomală a spermatozoidului este indusă în anvelopa vitelină. La Xenopus laevis, activitatea necesară pentru inducerea reacției acrozomale a spermatozoidului este localizată în oviduct. Aceasta sugerează că substanța care induce reacția acrozomală se adaugă la anvelopa vitelină înainte de a fi înconjurată de învelișul gelatinos. La speciile de Discoglosus pictus, Pleurodeles walti și Cynops pyrrhogaster reacția acrozomală a spermatozoidului se observă în stratul gelatinos (Fig. 11) (Watanabe and Onitake, 2002).

26 II. MATERIALE ȘI METODE II.1. Animale Observațiile microscopice s-au realizat pe 6 specii de pești și pe 3 specii de amfibieni (Tabel II.1). Tabel II.1. Speciile de pești studiate și stadiile ovocitare la care s-a calculat grosimea anvelopei viteline
II.2. Analiza histologică De la fiecare specie s-au prelevat fragmente de ovar care au fost fixate, la temperatura camerei în fixatorul Bouin. După fixare, țesutul a fost deshidratat prin concentrații crescătoare de alcool etilic, clarificat în toluen, inclus în parafină și secționat la un microtom MicroTec CUT 4060, la o grosime de 6 µm. Specia Ordinul Familia Stadiul de dezvoltare
ovocit Pești Polyodon spathula Ovocit vitelogenic târziu Huso huso Ovocit vitelogenic târziu
Cyprinus carpio Ovocit cu a lveole corticale
Ovocit vitelogenic timpuriu
Ovocit vitelogenic târziu Esox lucius Ovocit vitelogenic târziu Danio rerio Ovocit cu alveole corticale
Ovocit vitelogenic târziu Carassius auratus gibelio Ovocit vitelogenic târziu Amfibieni Bufo buf o Ovocit vitelogenic târziu Pleurodeles waltl Ovocit vitelogenic târziu Pelobates fuscus Ovocit vitelogenic timpuriu

27 Secțiunile de țesut au fost colorate cu Hematoxilină-eozină-albastru alcian (pH 2,5) și Azan Heidenhain. Lamele histologice colorate cu Azan au provenit din colecția laboratorului de Histologie și embriologie animală. Colorația Hematoxilină-Eozină-Albastru alcian pH 2,5 Albastrul alcian (8GX) este un colorant bazic, utilizat pentru evidențierea mucopolizaharidelor sau glicozaminoglicanilor. Afinitatea colorantului pentru grupările anionice depinde foarte mult de pH. La pH 2,5 colorantul se leagă la nivelul grupărilor carboxil și sulfat ale esterilor, colorând astfel în albastru glicoproteinele carboxilate și mucopolizaharidele acide sulfatate și carboxilate. Hematoxilina este un colorant natural, din grupul flavonoizilor. Aceasta colorează structurile bazofile (nuclei, reticul endoplasmic rugos) în albastru-violet. Eozina, derivat halogenat al fluoresceinei, este un anion și se comportă ca un colorant acid. Citoplasma și majoritatea fibrelor țesutului conjunctiv sunt colorate în diferite nuanțe de roz și roșu cu eozina (Kiernan, 2008). Rezultatele colorației: ooplasma se colorează în roz cu eozină, alveolele corticale în albastru cu albastru Alcian iar nucleii în mov cu Hematoxilină. Modul de lucru 1. Deparafinarea secțiunilor prin trei băi de toluen, 5 min/baie. 2. Hidratarea secțiunilor prin trei băi succesive de etanol de concentrații descrescătoare (100%, 96%, 70%), 5 min/baie. 3. Incubare în apă distilată, 2 băi a câte 5 min/baie. 4. Colorare cu Albastru alcian, pH 2,5, 30 minute. 5. Spălarea cu o soluție de 3% acid acetic glacial. 6. Spălare apă de robinet, 3 minute. 7. Spălare apă distilată, 1 minut. 8. Colorare Hematoxilină, 10 minute. 9. Spălare apa de robinet, 5 minute, a câte 2 minute/baie 10. Spălare apă distilată, 2 minute. 11. Colorare 1% Eozină, 10 minute. 12. Spălare apă de robinet, 5 băi, a câte 2 minute/baie 13. Spălare apă distilată, 2 minute. 14. Deshidratarea secțiunilor în etanol de concentrații crescătoare (70%, 96%, 100%), 5 minute/baie.

28 15. Clarificarea secțiunilor prin trecerea lor prin 3 băi succesive de toluen, 5 minute/baie. 16. Montare în balsam de Canada. Fig. 1. Etapele de lucru ale colorației Hematoxilină-Eozină-Albastru Alcian, pH-2,5. Colorația Azan Heidenhain Acesta colorație folosește doi coloranți, azocarmin și albastru de anilina Heidenhain. Azocarminul este un colorant citologic acid care colorează nucleul. Albastrul de anilina Heidenhain este un amestec albastru de metilen, albastru de metil și albastru acid, folosit ca un colorant anionic folosit pentru contrastarea secțiunilor după mordansarea cu acid fosfotungstic (Kiernan, 2008). Rezultatele colorației: alveolele corticale se colorează în albastru, vitelusul în portocaliu la ovocitele vitelogenice timpurii și în roșu la ovocitele vitelogenice târzii. Modul de lucru 17. Deparafinarea secțiunilor prin trei băi de toluen, 5 min/baie. 18. Hidratarea secțiunilor prin trei băi succesive de etanol de concentrații descrescătoare (100%, 96%, 70%), 5 min/baie. 19. Incubare în apă distilată, 5 min. 20. Incubarea secțiunilor cu o soluție apoasă de 1% azocarmin, o oră la 550C.

29 21. Spălare apă distilată, 2 băi a câte 5 min/baie. 22. Incubarea secțiunilor 1 minut, cu o soluție de 1% anilină în etanol 70%. 23. Incubarea secțiunilor într-o soluție de 1% acid acetic glacial în etanol 95%. 24. Incubarea secțiunilor într-o soluție de 5% acid fosfotungstic, 30 minute. 25. Spălarea secțiunilor cu apă distilată. 26. Incubarea secțiunilor în soluția albastru de anilină Heidenhain, 1 oră. 27. Spălarea secțiunilor cu apă distilată, 1 minut 28. Deshidratarea secțiunilor în etanol de concentrații crescătoare (70%, 96%, 100%). 29. Clarificarea secțiunilor în toluen, 3 băi a câte 5 minute/baie. 30. Montare în balsam de Canada.
Fig. 2. Etapele de lucru ale colorației Azan Heidenhain. II.3. Măsurători micrometrice S-au realizat măsurători pentru stabilirea dimensiunii anvelopelor viteline și a ovocitelor în diferite stadii de dezvoltare. Măsurătorile au fost realizate la microscopul optic, cu ajutorul unui micrometru ocular și a unei lame micrometrice cu diviziuni de 0,01 mm (CarlZeiss Jena, Germania). Pentru măsurarea grosimii anvelopei viteline s-a folosit obiectivul 10x, 20x, 40x, 100x. Pentru măsurarea diametrului ovocitar s-a folosit obiectivul 4x, 10x, 20x, 40x.

30 II.4. Analiza statistică a datelor Datele statistice au fost realizate folosind funcțiile statistice, disponibile în programul Microsoft Excel 2011. Datele redate prin intermediul graficelor reprezintă mediile și deviațiile standard. Analiza diferențelor statistice s-a realizat în programul Microsoft Excel folosind testul t-Student, one tail, pentru fiecare pereche de interes. Diferențele semnificative statistic au fost considerate la valori ale lui *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001.

31 III. REZULTATE ȘI DISCUȚII Observațiile microscopice privind structura și grosimea învelișurilor ovocitare au fost realizate pe diferite stadii de dezvoltare ale ovocitelor la pește: Polyodon spathula, Huso huso, Cyprinus carpio, Danio rerio, Carassius auratus gibelio și Esox lucius și pe ovocite de amfibieni: Bufo bufo, Pelobates fuscus și Pleurodeles waltl. La pești și amfibieni în cursul ovogenezei ovocitele parcurg următoarele stadii: ovogonie, ovocit previtelogenic timpuriu, ovocit previtelogenic cu alveole corticale, ovocit vitelogenic timpuriu, ovocit vitelogenic târziu și ovocit matur. În tabelul III.1. sunt prezentate diametrul ovocitar și diametrul anvelopei viteline la speciile luate în studiu. Tabel III. 1. Diametrul ovocitar și grosimea anvelopei viteline la speciile de pești și amfibieni luate în studiu.
*Valorile sunt reprezetate prin medie±deviația standard. Specie Stadiu ovocit Diametru
ovocit ( μm) Grosime înveliș
ovocitar ( μm) Pești
Cyprinus ca rpio Previtelogenic cu alveole
corticale 25,9±3,24 0,275±0,09 Vitelogenic timpuriu 27,6±4,88 0,35±0,12 Vitelogenic târziu 35,76±2,48 0,825±0,120 Danio rerio Previtelogenic cu alveole
corticale 47,5±15,62 0,64±0,33 Vitelogenic târziu 76,6±9,29 1,3±0, 48 Carassius
auratus gibelio Vitelogenic târziu 84,6±7,35 1,22±0,355 Esox lucius Vitelogenic târziu 159±25,77 1,675±0,42 Polyodon
spathula Vitelogenic târziu 180±12,96 3,225±0,65 Huso huso Vitelogenic târziu 200,75±33,10 6,875±2,11 Amfibieni Bufo buf o Vitelogenic târziu 110,25±18,61 0,21±0,05 Pleurodeles waltl Vitelogenic târziu 92±16,61 0,145±0,057 Pelobates fuscus Vitelogenic timpuriu 39±3,71 0,172±0,046

32 În ovarele speciilor de pești luate în studiu au fost identificate următoarele tipuri de celule germinale: ovogonii, ovocite previtelogenice timpuri, ovocite previtelogenice cu alveole corticale, ovocite vitelogenice timpurii și ovocite vitelogenice târzi. Ovogonia are formă sferică sau poligonală și nu prezintă zona radiata. Ovocitele previtelogenice timpuri au formă ovală sau rotundă, cu un nucleu mare, central (Fig. 1). Nucleolii sunt situați la periferia nucleului sau atașați de membrana nucleară. Ooplasma este granulată și intens bazofilă. În acest stadiu ovocitul este înconjurat de un epiteliu folicular aplatizat iar zona radiata nu se observă în microscopia optică. Fig. 1. Ovocit previtelogenic timpuriu de Cyprinus carpio. Colorație Hematoxilină-Eozină- Albastru alcian, pH-2,5, x400. Cf=celule foliculare; n=nucleoli; N=nucleu; O=ooplasmă. Ovocitele previtelogenice cu alveole corticale sunt sferice, cu un diametru mediu de 25,9±3,24 μm la Cyprinus carpio (Tabel III.1) și 47,5±15,62 μm la Danio rerio (Tabel III.1). Nucleu este central și conține 15-20 de nucleoli la periferie. În acest stadiu citoplasma este plină cu alveole corticale care se dispun concentric. Alveolele corticale sunt sferice sau ovale și prezintă în interior fie un material slab eozinofil, fie un material cu afinitate pentru Albastrul Alcian (Fig. 2a). Pe măsură ce ovocitul se mărește, crește și numărul alveolelor corticale iar ooplasma este mai puțin bazofilă. În acest stadiu se observă pentru prima data în microscopia optică zona radiata între epiteliul folicular și oolemă (Fig. 2b). Aceasta apare ca un strat subțire, cu o grosime de 0,275±0,09 μm la Cyprinus carpio (Tabel III.1) și 0,64±0,33 μm la Danio rerio (Tabel III.1).

33 Fig. 2 a-b. Ovocit previtelogenic cu alveole corticale de Cyprinus carpio (a) și Danio rerio (b). Colorație Hematoxilină-Eozină-Albastru Alcian, pH-2,5, x400 (a), x470 (b). Cf=celule foliculare; n=nucleoli; N=nucleu; Ac=alveole corticale; ZR=zona radiata; O=ooplasmă.
Fig. 3a-b. Zona radiata (săgeată) în microscopia optică la ovocitul cu alveole corticale de Cyprinus carpio (a) și Danio rerio (b). Colorație Hematoxilină-Eozină-Albastru Alcian, pH-2,5, x4800 (a), x1880 (b). Observațiile noastre au indicat că zona radiata este vizibilă în microscopia optică pentru prima dată la ovocitele cu alveole corticale, la speciile de Cyprinus carpio (Fig. 3a) și Danio rerio (Fig. 3b). Acest aspect este susținut și de alți autori care confirmă în studiile lor că zona radiata la speciile Siniperca chuatsi (Qin Jiang și colab., 2009), Pseudosciaena crocea (Ma și colab., 2011) și Acipenser persicus (Ali și colab., 2013) a fost vizibilă începând cu stadiul de ovocit cu alveole corticale.

34 Studiile realizate până în prezent au indicat că proteinele zonei radiata la peștii teleosteeni sunt sintetizate în ficat la Oncohynchus mykiss (Oppen-Berntsen și colab., 1992a), Gadus morhua (Oppen-Berntsen și colab., 1992b) și Salmo salar (Oppen-Berntsen și colab., 1999) în timp ce la Oryzias latipes (Lee și colab., 2002), Pseudopleuronectes americanus (Lyons și colab., 1993) și Sparus aurata (Del-Giacco și colab., 1998) aceste glicoproteine sunt sintetizate în ovar. În ceea ce privește grosimea zonei radiata la ovocitele previtelogenice cu alveole corticale la cele 2 specii studiate am constatat că, zona radiata la Cyprinus carpio este semnificativ mai subțire (P=0,005; P<0,01) și mai densă decât cea de la Danio rerio, deși ovocitele de Danio rerio au un diametru mai mare (Fig. 4). Fig. 4. Grosimea zonei radiata la Cyprinus carpio și Danio rerio la ovocitele previtelogenice cu alveole corticale. Valorile sunt reprezetate prin medie±deviația standard. Se remarcă o diferență statistică semnificativă între grosimea anvelopei viteline la cele două specii (**P<0,01). Ovocitele vitelogenice timpurii la Cyprinus carpio au un diametru mediu de 27,6±4,88 μm (Tabel III.1). Nucleul ovocitar are un contur neregulat și dispus central (Fig. 5a). Diametrul nucleului a crescut foarte mult în comparație cu stadiul anterior. Nucleolii sunt mari și dispuși la periferia nucleului. Granulele de vitelus sunt împrăștiate în toată citoplasma celulei și apar fie roșii cu colorația cu Hematoxilină-Eozină-Albastru Alcian, pH 2,5 fie

35 portocalii cu colorația Azan Heidenhain (Fig. 5b). În acest stadiu zona radiata are o grosime de 0,35±0,12 μm (Tabel III.1).
Fig. 5a-b. Ovocit vitelogenic timpuriu de Cyprinus carpio. Colorație Hematoxilină-Eozină- Albastru Alcian, pH-2,5, x770 (a) și Azan Heidenhain, x400 (b). Cf=celule foliculare; n=nucleoli; N=nucleu; Ac=alveole corticale; ZR=zona radiata;V=vitelus. Ovocitele vitelogenice târzi au un diametru de 35,76±2,48 μm la Cyprinus carpio (Tabel III.1), 76,6±9,29 μm la Danio rerio (Tabel III.1) și 84,6±7,35 μm la Carassius auratus gibelio (Tabel III.1). Vitelusul este împrăștiat în toată citoplasma ovocitului (Fig. 6a-b). Zona radiata are o grosime de 0,825±0,120 μm la Cyprinus carpio (Tabel III.1), 1,3±0,48 μm la Danio rerio (Tabel III.1) și 1,22±0,355 μm la Carassius auratus gibelio (Tabel III.1). La ovocitul vitelogenic târziu de Carassius auratus gibelio, se observă la polul animal micropilul (Fig. 7).

36 Fig. 6a-b. Ovocit vitelogenic târziu de Cyprinus carpio (a), Danio rerio (b). Colorație Azan Heidenhain x400 (a, c) și Hematoxilină-Eozină-Albastru alcian, pH-2,5, x400 (b). Cf=celule foliculare; n=nucleoli; N=nucleu; Ac=alveole corticale; ZR=zona radiata; V=vitelus; M=micropil; P=pori. Fig. 7. Ovocit vitelogenic târziu de Carassius auratus gibelio. Colorație Azan Heidenhain, x400. M=micropil. În ceea ce privește diametrul ovocitar, se observă că diametrul ovocitelor din familia Cyprinidae este mai mic, în comparație cu Esox luciu, Polyodon spathula și Huso huso (Fig. 8). Diametrul ovocitelor de Cyprinus carpio este semnificativ mai mic, decât diametrul ovocitelor de Carassius auratus gibelio (P=0,000000002; P<0,001), Danio rerio (P=0,00000008; P<0,001), Esox lucius (P=0,00000005; P<0,001), Polyodon spathula (P=0,000000000004; P<0.001) și Huso huso (P=0,0000000001; P<0,001). De seamenea, se observă că diametrul ovocitelor de Carassius auratus gibelio este semnificativ mai mic decât

37 diametrul ovocitelor de Danio rerio (P=0,008231871; P<0,001), Esox lucius (P=0,000012; P<0,001), Polyodon spathula (P=0,0000000035; P<0,001) și Huso huso (P=0,0000016; P<0,001). În ceea ce privește diametrul ovocitelor de Danio rerio se observă că diametrul ovocitelor este semnificativ mai mic decât diametrul ovocitelor de Esox lucius (P=0,0000044; P<0,001), Polyodon spathula (P=0,0000000095; P<0,001) și Huso huso (P=0,00000049; P<0,001). Diametrul ovocitelor de Esox lucius este semnificativ mai mic decât diametrul ovocitelor de Polyodon spathula (P=0,02; P<0,05) și Huso huso (P=0,0002; P<0,001). Între Polyodon spathula și Huso huso se remarcă faptul că diametrul ovocitelor de Polyodon spathula este semnificativ mai mic (P=0,03; P<0,05). Analiza anvelopei viteline la cele șase specii de pești osoși a indicat că zona radiata este mai subțire în cadrul speciilor din familia Ciprinidae (Cyprinus carpio, Danio rerio, Carassius auratus gibelio), în comparație cu Esox lucius, familia Esocidae, și speciile de condrostei Polyodon spathula și Huso huso (Fig. 9). Aceste rezultate indică o corelație între diametrul ovocitar și grosimea zonei radiata (Fig. 10a-b), astfel încât ovocitele vitelogenice târzii cu diametrul cel mai mare au și zona radiata cea mai groasă. Diametrul zonei radiata la Cyprinus carpio este semnificativ mai mic în comparație cu Crassius auratus gibelio (P=0,002; P<0,01), Danio rerio (P=0,003; P<0.01), Esox lucius (P=0,0001; P<0,001), Polyodon spathula (P=0,0000003, P<0,001) și Huso huso (P=0,0000002, P<0,001). Grosimea zonei radiata la Carassius auratus gibelio este semnificativ mai mică decât zona radiata la Esox lucius (P=0,02; P<0.05), Polyodon spathula (P=0,00000018, P<0,001) și Huso huso (P=0,0000085; P<0,001). Zona radiata este semnificativ mai subțire la Danio rerio în comparație cu Polyodon spathula (P=0,0000016; P<0,001) și Huso huso (P=0,0000051; P<0,001). De asemenea, zona radiata la Esox lucius este semnificativ mai subțire decât la Polyodon spathula (P=0,000041; P<0,001) și Huso huso (P=0,0000043; P<0,001). O diferență semnificativă se observă și între zona radiata de la Polyodon spathula și Huso huso (P=0,000087; P<0,001).

38 Fig. 8. Diametrul ovocitelor vitelogenice târzii la diferite specii de pești osoși. Valorile sunt reprezetate prin medie±deviația standard. Se remarcă o diferență statistică semnificativă între diametrul ovocitelor la Cyprinus carpio și Carassius auratus gibelio (***P<0,001), Danio rerio (***P<0,001), Esox lucius (*** P<0,001), Polyodon spathula (***P<0.001) și Huso huso (*** P<0,001). Între Carassius auratus gibelio și Danio rerio (***P<0,001), Esox lucius (***P<0,001), Polyodon spathula (***P<0,001) și Huso huso (***P<0,001). Între Danio rerio și Esox lucius (*** P<0,001), Polyodon spathula (***P<0,001) și Huso huso (***P<0,001), între Esox lucius și Polyodon spathula (*P<0,05) și Huso huso (***P<0,001), dar și între Polyodon spathula și Huso huso (*P<0,05).

39 Fig. 9. Grosimea zonei radiata la diferite specii de pești osoși. Valorile sunt reprezetate prin medie±deviația standard. Se remarcă o diferență statistică semnificativă între grosimea zonei radiata la Cyprinus carpio și cele trei specii de ciprinide ,Crassius auratus gibelio (**P<0,01), Danio rerio (** P<0.01), dar și între Esox lucius (***P<0,001), Polyodon spathula (***P<0,001) și Huso huso (***P<0,001). Diferențe statistice se observă și între Carassius auratus gibelio și Esox lucius (*P<0.05), Polyodon spathula (***P<0,001) și Huso huso (***P<0,001). Între Danio rerio și Polyodon spathula (***P<0,001) și Huso huso (*** P<0,001). Esox lucius și Polyodon spathula (*** P<0,001) și Huso huso (***P<0,001). O diferență semnificativă se observă și între Polyodon spathula și Huso huso (*** P<0,001). Aceste diferențe de grosime pot fi explicate pe baza faptului că peștii din familia Cyprinidae sunt specii pelagice iar Esox lucius, Polyodon spathula și Huso huso sunt specii demersale. În general speciile pelagice își depun ovocitele în ape deschise, la suprafața acestora iar speciile demersale își depun ovocitele pe fundul apei, printre pietre și vegetația acvatică. Se consideră că, grosimea zonei radiata a ovocitelor demersale de Esox lucius, Polyodon spathula și Huso huso, conferă acestora o protecție mai mare față de factorii mecanici de pe fundul apei. Acest aspect este susținut și de alți autori (Sano și colab., 2017),

40 care au observat că ouăle salmonidelor prezintă un înveliș foarte gros deoarece acestea sunt depuse pe albia râurilor, printre pietre, unde sunt expuse frecvent factorilor mecanici. În plus, Kaviani și colab., 2013, confirmă faptul că ovocitele pelagice au o zonă radiata subțire în timp ce ovocitele demersale au un înveliș ovocitar foarte gros și complex. Fausto și colab., 2004 precizează că structura și grosimea zonei radiata la teleosteeni variază între specii și reflectă adaptările la diferite condiții ecologice. Din punct de vedere structural, zona radiata din jurul ovocitelor de teleosteeni are o structură diferită de cea a speciilor de acipenseride. Fig. 10. Curba de creștere a diametrului ovocitar (a) și a zonei radiata (b) la ovocitele vitelogenice târzii.

41 Fig. 11. a-f. Aspectul zonei radiata la ovocitele vitelogenice târzii de Cyprinus carpio (a), Danio rerio (b), Carassius auratus gibelio (c), Esox lucius (d), Polyodon spathula (e), Huso huso (f). Colorație Azan Heidenhain, x6400 (a) și Hematoxilină-Eozină-Albastru Alcian, pH-2,5, x6000 (b), x4000 (c), x2400 (d), x1600 (e), x1880 (f).ZR=zona radiata; ZRi=zona radiata internă; ZRe= zona radiata externă; Z1, Z2, Z3= straturi.

42 Speciile de Polyodon spathula și Huso huso prezintă o zonă radiata dublă, una la exterior de unde și denumirea de zona radiata externă și una la interior. Zona radiata internă este formată din 2 straturi (Fig. 11e-f) cu morfologie identitică (Z1 și Z2) din punct de vedere histologic, separate printr-un strat clar la Polyodon spathula și un strat mai difuz la Huso huso. Acest aspect, a mai fost raportat la Huso huso de către Falahatkar și colab., 2013. Prezența a două zone la nivelul anvelopei ovocitare a fost raportat pentru 6 specii din familia Salmonidae (Schmehl și Graham, 1987), pentru Leiognathus equulus (Moharram și colab., 2015) și pentru Acipenser baerii (Zelazowska și Fopp-Bayat, 2017). Observațiile noastre au indicat diferențe în grosimea zonei radiata la cele două specii de condrostei, care aparțin aceluiași ordin, dar din familii diferite, familia Polyodontidae în cazul Polyodon spathula și familia Acipenseridae în cazul Huso huso. Huso huso prezintă o zona radiată externă foarte groasă, în comparație cu zona radiată externă a speciei de Polyodon spathula (Fig. 12). Diametrul zonei radiata externă este semnificativ mai mic la Polyodon spathula în comparație cu Huso huso (P=0,00000015; P<0,001). Fig. 12. Grosimea zonei radiata externă la Polyodon spathula și Huso huso. Valorile sunt reprezentate prin medie±deviația standard. Se remarcă o diferență statistică semnificativă între grosimea zonei radiata externă la Polyodon spathula și Huso huso (***P<0,001).

43 Diferențe între cele două specii de condrostei au fost observate și în cazul grosimii zonei radiata interne. Dacă diferența de grosime dintre zona radiata externă prezentă la Huso huso și cea de la Polyodon spathula a fost de 6,76 µm în cazul zonei radiata interne este mult mai mică, de aproximativ 1,92 µm (Fig. 13). Grosimea zonei radiata internă la Polyodon spathula este semnificativ mai subțire decât la Huso huso ( P=0,000049; P<0,001). Fig. 13. Grosimea zonei radiata internă la Polyodon spathula și Huso huso. Valorile sunt reprezetate prin medie±deviația standard. Se remarcă o diferență statistică semnificativă între grosimea zonei radiata internă la Polyodon spathula și Huso huso (***P<0,001). În cazul speciilor de teleosteeni luate în studiu începând cu stadiile vitelogenice apar evidente în zona radiata striații transversale care reprezintă canale în care se găsesc microvilii ovocitari și prelungirile celulelor foliculare (Fig. 14a-d). Astfel de canale au fost raportate anterior la Cyprinus carpio (Shabanipour și Hossayni, 2010), Clarias gariepinus (Mekkawy și Osman, 2006) și Liza aurata (Koç, 2010). Studiile de microscopie electronică au indicat că aceste canale ale zonei radiata adăpostesc microvilii ovocitari și prelungirile celulelor foliculare (Ravaglia și Magesse, 2002; Jaramillo și colab., 2015). Spre deosebire de speciile de teleosteeni, la cele două specii de condrostei striațiile care reprezintă canalele zonei radiata sunt vizibile doar în zona radiata internă (Fig. 10e-f). Observațiile histologice au indicat prezența unei structuri micropilare la nivelul

44 polului animal al ovocitelor mature de Cyprinus carpio (Fig. 15b) și Carassius auratus gibelio (Fig. 15a). Micropilele au formă circulară sau ovală, iar canalul micropilar este localizat în centrul său. Regiunea micropilară este curbată, aceasta fiind ocupată de către celula micropilară. Acest micropil este de tip II, doarece are o gropiță uniformă și un canal micropilar lung.
Fig. 14a-d. Porii zonei radiata în ovocitele vitelogenice târzii de Cyprinus carpio (a, d), Danio rerio (b) și Carassius auratus gibelio (c). Colorație Hematoxilină-Eozină, Albastru Alcian, pH-2,5, x6000 (b, c) și Azan Heidenhain x6000 (a, d). ZR= zona radiata; P=pori; S=striuri. Potrivit autorilor, Esmaeili și Gholamifard, 2011, numărul, forma, tipul de micropil dar și structura învelișului ovocitar și grosimea acesteia au fost utilizate în studii taxonomice. În studiile noastre, am constatat că ovocitele nefertilizate de Cyprinus carpio și Carassius auratus gibelio prezintă un singur micropil la nivelul polului animal. Prezența unui singur

45 micropil a fost raportată și la Leuciscus cephalus și Gobio gobio (Kunz, 2004).
Fig. 15a-b. Alcătuirea micropilului la Carassius auratus gibelio (a) și Cyprinus carpio (b). Colorație Azan Heidenhain x770 (a) și Hematoxilină-Eozină-Albastru alcian, pH-2,5, x470 (b). Ef=epiteliu folicular; ZR=zona radiata; Cm=celulă micropilară; Cmp=canal micropilar. Potrivit lui Mable și colab., 2011 majoritatea peștilor osoși prezintă un singur micopil, însă există specii din familia Acipenseridae care prezintă mai multe micropile. Spre exemplu în studiul lor, Siddique și colab., 2013 au identificat la speciile de Acipenser transmontanus 3-15 micropile, Acipenser gueldenstaedtii mai mult de 30 de micropile și respectiv la Huso huso 51 de micropile. Existența unui singur micropil în ovocitele de Cyprinus carpio și Carassius auratus gibelio poate fi unul dintre mecanismele care împiedică polispermia, deoarece s-a demonstat că ovocitele cu mai multe micropile au un potențial teoretic mai mare pentru polispermie datorită micropilelor multiple decât ovocitele cu un singur micropil. Tipul de micropil este un alt caracter pentru identificarea ovocitelor de pește. Kunz, 2004 descrie în lucrarea sa 4 tipuri de micropile: tipul I ce prezintă o adâncitură care duce spre un canal scurt, tipul II cu o depresiune mică ca o farfurioară care duce într-un canal lung, tipul III cu un canal și tipul IV cu două vestibule și un canal scurt. Observațiile noastre au arătat că micropilul de Cyprinus carpio și Carassius auratus gibelio trebuie clasificat în tipul II, deoarece micropilele au o gropiță plană, ca o farfurioară și un canal mai lung decât cel de tip I. Acest tip de micropil a fost raportat și la alte specii de ciprinide și anume Brachydanio

46 rerio (Kunz, 2004). La amfibieni în cursul ovogenezei ovocitele parcurg următoarele stadii: ovogonie, ovocite previtelogenic timpuriu, ovocit previtelogenic cu alveole corticale, ovocit vitelogenic timpuriu, ovocit vitelogenic târziu și ovocit matur. În ovarul speciilor studiate de noi au fost prezente doar ovocite vitelogenice. Ovocitele vitelogenice timpuri prezintă un diametru de 39±3,71 μm (Tabel III.1). Nucleul este central (Fig. 16) și prezintă la periferie nucleoli. Citoplasma este granulară iar anvelopa vitelină are o grosime de 0,1725±0,046 μm (Tabel III.1). Anvelopa vitelină este foarte subțire, fiind strans asociată cu oolema (Fig. 17).
Fig. 16. Ovocit vitelogenic timpuriu de Pelobates fuscus. Colorație Hematoxilină-Eozină, x600. N=nucleu, n= nucleoli; AV=anvelopă vitelină,
Fig. 17. Aspectul anvelopei viteline la Pelobates fuscus. Colorație Hematoxilină-Eozină. x4800. AV= anvlopă vitelină; Cf= celule foliculare.

47 Ovocitele vitelogenice târzi au un diametru de 110,25±18,61 μm la Bufo bufo (Tabel III.1) și respectiv 92±16,61 μm la Pleurodeles waltl (Tabel III.1). În aceste ovocite nucleul se deplasează spre polul animal al celulei iar pigmenții sunt situați în citoplasma periferică, conferindu-i ovocitului o culoare maro închisă sau chiar neagră la Bufo bufo (Fig. 18b). Nucleolii de mici dimensiuni rămân în apropierea membranei nucleare ușor pliate la Pleurodeles waltl (Fig. 18a), la Bufo bufo aceștia sunt absenți. Vitelogeneza este intensă iar vitelusul ocupă toată citoplasma. Anvelopa vitelină înconjoară la exterior celula și este dispusă sub forma unui strat foarte subțire, aceasta având o grosime medie de 0,21±0,05 μm la Bufo bufo (Tabel III.1) și 0,145±0,057 μm la Pleurodeles waltl (Tabel III.1).
Fig. 18a-b. Ovocit vitelogenic târziu de Bufo Bufo (a) și Pleurodeles waltl (b). Colorație Hematoxilină-Eozină, x400 (a,b). N=nucleu, AV=anvelopă vitelină, V=vitelus; PA=pol animal; PV=pol vegetal. Spre deosebire de Pelobates fuscus, anvelopa vitelină la Bufo Bufo și Pleurodeles waltl a fost observată doar la ovocitele vitelogenice târzii, aceasta fiind reprezentată de un strat foarte subțire ce aderă intim de oolemă (Fig. 19). Studiile realizate pe Xenopus laevis au indicat că și în cazul amfibienilor formarea învelișului ovocitar începe din stadiul de ovocit previtelogenic (Hyllner, 1994). Analiza comparativă a grosimii anvelopei viteline la cele două specii de amfibieni a indicat că anvelopa vitelină la urodele, respectiv a speciei Pleurodeles waltl este mai subțire decât cea a anurelor (Bufo bufo), acest aspect fiind în concordanță cu diametrul ovocitului, care la Pleurodeles waltl este mai mic decât la Bufo bufo. Diametrul ovocitului este semnificativ mai mic la Pleurodeles waltl decât la Bufo bufo (P=0,03; P<0,05)(Fig. 20) iar

48 grosimea anvelopei viteline la Pleurodeles waltl este semnificativ mai subțire decât anvelopa vitelină la Bufo bufo (P=0,018; P<0,05)(Fig. 21).
Fig. 19. Aspectul anvelopei viteline la Pleurodeles waltl. Colorație Hematoxilină-Eozină, x3080. AV=anvelopă vitelină; Cf=celule foliculare. Fig. 20. Diametrul ovocitului Pleurodeles waltl și Bufo bufo. Valorile sunt reprezetate prin medie±deviația standard. Se remarcă o diferență statistică semnificativă între diametrul la cele două specii (*P<0,05).

49 Fig. 21. Variația anvelopei viteline la Pleurodeles waltl și Bufo bufo. Valorile sunt reprezetate prin medie±deviația standard. Se remarcă o diferență statistică semnificativă între grosimea anvelopei viteline la cele două specii (*P<0,05). Analiza comparativă a grosimii anvelopei viteline în ovocitele vitelogenice la diferite specii de pești și amfibieni a indicat că cel mai gros înveliș ovocitar este prezent la condrostei și anume la Huso huso (Fig. 22) și cea mai subțire la amfibieni și anume la urodele (Pleurodeles waltl). În ceea ce privește diametrul zonei radiata la peștii osoși se observă că diametrul zonei radiata la Cyprinus carpio este semnificativ mai mic în comparație cu Crassius auratus gibelio (P=0,002; P<0,01), Danio rerio (P=0,003; P<0.01), Esox lucius (P=0,0001; P<0,001), Polyodon spathula (P=0,0000003, P<0,001) și Huso huso (P=0,0000002, P<0,001). Grosimea zonei radiata la Carassius auratus gibelio este semnificativ mai mică decât zona radiata la Esox lucius (P=0,02; P<0.05), Polyodon spathula (P=0,00000018, P<0,001) și Huso huso (P=0,0000085; P<0,001). Zona radiata este semnificativ mai subțire la Danio rerio în comparație cu Polyodon spathula (P=0,0000016; P<0,001) și Huso huso (P=0,0000051; P<0,001). De asemenea, zona radiata la Esox lucius este semnificativ mai subțire decât la Polyodon spathula (P=0,000041; P<0,001) și Huso huso (P=0,0000043; P<0,001). O diferență semnificativă se observă și între zona radiata de la Polyodon spathula și Huso huso (P=0,000087; P<0,001). În cazul amfibienilor, diametrul anvelopei viteline este semnificativ mai mic la Pleurodeles waltl în comparație cu speciile de teleosteeni și anume cu Cyprinus carpio (P=0,00000001; P<0.001), Carassius auratus gibelio (P=0,0000039, P<0,001), Danio rerio (P=0,000014, P<0,001), Esox lucius (P=0,00000093, P<0,001) dar și între Bufo bufo (P=0,03; P<0,05). În cazul grosimii anvelopei viteline, la Bufo

50 bufo, aceasta este semnificativ mai subțire în comparație cu Cyprinus carpio (P=0,000004; P<0,001), Carassius auratus gibelio (P=0,0000025, P<0,001), Danio rerio (P=0,000029; P<0,001) și Esox lucius (P=0,0000043; P<0,001). Fig. 22. Comparație între grosimea învelișului ovocitar la peștii osoși si la amfibieni. Valorile sunt reprezetate prin medie±deviația standard. Se remarcă o diferență statistică semnificativă între grosimea zonei radiata la Cyprinus carpio și cele trei specii de ciprinide ,Crassius auratus gibelio (**P<0,01), Danio rerio (** P<0.01), dar și între Esox lucius (***P<0,001), Polyodon spathula (***P<0,001) și Huso huso (***P<0,001). Diferențe statistice se observă și între Carassius auratus gibelio și Esox lucius (*P<0.05), Polyodon spathula (***P<0,001) și Huso huso (***P<0,001). Între Danio rerio și Polyodon spathula (***P<0,001) și Huso huso (*** P<0,001). Esox lucius și Polyodon spathula (*** P<0,001) și Huso huso (***P<0,001). O diferență semnificativă se observă și între Polyodon spathula și Huso huso (*** P<0,001). În cazul amfibienilor, se remarcă o diferență semnificativă la Pleurodeles waltl în comparație cu Cyprinus carpio (***P<0.001), Carassius auratus gibelio (*** P<0,001), Danio rerio (***P<0,001), Esox lucius (***P<0,001) dar și între Bufo bufo (*P<0,05). Diferențe statistice se observă si la Bufo bufo, cu Cyprinus carpio (***P<0,001), Carassius auratus gibelio (***P<0,001), Danio rerio (***P<0,001) și Esox lucius (***P<0,001)

51 CONCLUZII • Analizele histologice și măsurătorile micrometrice au indicat diferențe între speciile de pești și amfibieni. La vertebratele inferioare de tipul peștilor și amfibienilor, speciile cu cea mai groasă anvelopă vitelină au fost reprezentate de sturioni, în timp ce la amfibieni a fost identificată cea mai subțire anvelopă vitelină. Acest aspect sugerează că pe parcursul evoluției are loc o reducere a grosimii anvelopei viteline. • Grosimea mai mare a anvelopei viteline la pești poate fi corelată cu prezența micropilelor, orificii prin care spermatozoizii ajung la oolemă în momentul fecundării. Se poate sugera că absența acestor structuri la amfibineni a condus la reducerea anvelopei viteline astfel încât aceasta să poată fi penetrată de spermatozoizi. • Structura anvelopei viteline la teleosteeni se corelează cu modul de depunere a pontei, în sensul că speciile pelagice de tipul celor din familia Cyprinidae prezintă anvelope viteline mai subțiri decît speciile demersale (Esox lucius), care au anvelope viteline mai groase care protejează oul de alterările mecanice.

52 BIBLIOGRAFIE 1. Abraham M., Hilge V., Lison, S., Tibika H., 1984. The cellular envelope of oocytes in teleosts. Cell Tissue Res. 235:403–410. 2. Amanze, D. Iyengar, A., 1990. The micropyle – a sperm guidance-system in teleost fertilization. Development 109:495–500. 3. Anderson E., 1967. The formation of the primary envelope during oocyte differentiation in teleosts. J Cell Biol. 35:193–212. 4. Del-Giacco L, Vanoni C, Bonsignorio D, Duga S, Mosconi G, Santucci A, Cotelli F, 1998. Identification and spatial distribution of the mRNA encoding the gp49 component of the gilthead sea bream, Sparus aurata, egg envelope. Mol Reprod Dev. 49:58–69. 5. Dumont, J.M., and Brummett, A.R., 1985. Egg envelopes in vertebrates, În:Developmental Biology, A Comprehensive Synthesis: Oogenesis. Vol. 1. L. Browder. Editura Plenum Press, New York, 235-288. 6. Esmaeili H. R., Gholamifard A., 2012. Ultrastructure of the chorion and the micropyle of an endemic cyprinid fish, Cyprinion tenuiradius Heckel, 1849 (Teleostei: Cyprinidae) from southern Iran. Iran J Fish Sci. 11:657–665. 7. Fausto A. M., Picchietti S., Taddei A. R., Zeni C., Scapigliati G., Mazzini M., Abelli L., 2004. Formation of the egg envelope of a teleost, Dicentrarchus labrax (L.): immunochemical and cytochemical detection of multiple components. Anat Embryol. 208:43–53. 8. Goksøyr, A., & Male, R., 2006. Endocrine disrupters and the aquatic environment : studies on mechanisms of toxicity and influence on nuclear receptor signalling pathways in fish. Endocr Disruptors 3:57–68. 9. Hedrick, J. L., Nishihara, T., 1991. Structure and function of the extracellular matrix of anuran eggs. J. Electron Microsc. Tech.17:319–335. 10. Heidari, B., Shabanipour, N., Savari, A., Yavari, V., Hosseini, N., 2009. The oocyte development of Kutum , Rutilus frisii kutum, K . with special emphasis on the zona radiata structure. Anim. Reprod. Sci. 98:465–472. 11. Hyllner S.J., Silversand C., Haux C., 1994. Formation of the vitelline envelope precedes the active uptake of vitellogenin during oocyte development in the rainbow rrout, Oncorhynchus mykiss. Mol. Reprod. Dev. 39:166-175.

53 12. Jaramillo, R., Garrido, O., Goicoechea, O., Molinari, E., 2015. Comparative study of ultrastructural changes on morphology of chorion during development of two salmonid species (Salmo salar and Oncorhynchus kisutch ). Global Journal of Marine Science 1:1–9. 13. Jiang Y. Q., Zhang T.T., Yang W. X., 2009. Formation of zona radiata and ultrastructural analysis of egg envelope during oogenesis of chinese perch Siniperca chuatsi. Micron 41:7-14. 14. Jiang, Y. Q., Zhang, T. T., Yang, W. X., 2010. Formation of zona radiata and ultrastructural analysis of egg envelope during oogenesis of chinese perch Siniperca chuatsi. Micron 41:7–14. 15. Kaviani, E. F., Shabanipour, N., Mirnategh, S. B., 2013. Light and electron microscope structural study of the zona radiata in the oocyte of zebrafish (Danio rerio). J. Electron Microsc. 62:377–382. 16. Kiernan J.A., 2008. Histological and histochemical methodes. Theory and practice, Fourth Edition. Editura Scion Publishing Ltd., Oxfordshire, U.K. 17. Koc, N. D., 2010. A study on ultrastructure of zona radiata during oocyte development of zebrafish (Danio rerio). Journal of FisheriesSciences.com 4:144–151. 18. Kunz, Y. W., 2004. Developmental Biology of Teleost Fishes. Editura Springer Netherlands. 19. Lee C., Na J., Lee K., Park K., 2002. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquat Toxicol. 61:233–241. 20. Lindsay L. L., Yang J. C. Hedrick J. L., 2002. Identification and characterization of a unique Xenopus laevis egg envelope component, ZPD. Develop. Growth Differ., 44:205–212. 21. Lyons C.E., Payette K.L., Price J.L., Huang R.C.C, 1993. Expression and structural-analysis of a teleost homolog of a mammalian zona-pellucida gene. J Biol Chem. 268:21351–21358. 22. Ma X. X, Zhu J.Q., Zhou H., Yang W. X., 2012. The formation of zona radiata in Pseudosciaena crocea revealed by light and transmission electron microscopy. Micron 43:435-444. 23. Mable B. K., Alexandrou M. A., & Taylor, M. I., 2011. Genome duplication in amphibians and fish: An extended synthesis. J. Zool. 284:151–182. 24. Mekkawy, I. A. A., Osman, A. G. M., 2006. Ultrastructural studies of the morphological variations of the egg surface and envelopes of the african catfish

54 Clarias gariepinus (Burchell, 1822) before and after fertilisation, with a discussion of the fertilisation mechanism. Sci. Mar. 70:23–40. 25. Moghaddam, A., Shahrbanoo O., Nader N., 2013. Study of the zona radiata structure in oocytes of the persian sturgeon (Acipenser persicus) before and after fertilization. Jurnal of the Persian Gulf 4:1-8. 26. Moghaddam, A., Shahrbanoo O., Nader S., 2014. Comparative study on the structure of zona radiata in pre- and post-fertilized mature eggs of the viviparous molly (Poecilia sphenops) and the oviparous bighead carp (Hypophthalmichthys nobilis). Journal of the Persian Gulf 5: 57-62. 27. Moharram, S. G., Rabah, S., Al-Ghorair, A. F., 2015. Observation on the ultrastructural alternations in ova of Leiognathus equulus. (Perciformes) from AL-Shabab Lagoon, in Jeddah province. IOSR J Pharm Biol Sci.10:2319–7676. 28. Murata K., ConteF. S., McInnisE., Fong T. H., Cherr G. N., 2014. Identification of the origin and localization of chorion (egg envelope) proteins in an ancient fish, the white sturgeon, Acipenser transmontanus. Biol. Reprod. 90:132–132. 29. Oppen-Berntsen D.O, Arukwe A, Yadetie F, Lorens JB, Male R, 1999. Salmon eggshell protein expression: A marker for environmental estrogens. Mar Biotechnol. 1:252–260. 30. Oppen-Berntsen D.O, Gram-Jensen E, Walther BT, 1992a. Zona radiata proteins are synthesized by rainbow trout (Oncohynchus mykiss) hepatocytes in response to oestradiol-17β. J Endocrinol. 135:293–302. 31. Oppen-Berntsen D.O, Hyllner SJ, Haux C, Helvik JV, Walther BT, 1992b. Eggshell zona radiata proteins from cod (Gadus morhua) extra-ovarian origin and induction by estradiol-17β. J Dev Biol. 36:247–254. 32. Otani S., Iwai T., Nakahata S., Sakai C., Yamashita M., 2009. Artificial fertilization by intracytoplasmic sperm injection in a teleost fish, the medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 80:175–183. 33. Ravaglia, M. A., Maggese, M. C., 2002. Oogenesis in the swamp eel Synbranchus marmoratus (Bloch, 1795) (Teleostei; Synbranchidae). Ovarian anatomy, stages of oocyte development and micropyle structure. Biocell, 26:325–337. 34. Sano K., Kawaguchi M., Katano K., Tomita K., Inokuchi M., Nagasawa T., Yasumasu S., 2017. Comparison of egg envelope thickness in teleosts and its relationship to the sites of ZP protein synthesis. J. Exp. Zool. B Mol. Dev. Evol. 328:240–258.

55 35. Schmehl M.K., Graham E.F., 1987. Comparative ultrastructure of the zona radiata from eggs of six species of salmonids. Cell Tissue Res. 250:513-519. 36. Shabanipour, N., Heidari, B., 2004. A histological study of the zona radiata during late oocyte developmental stages in the caspian eea mugild, Liza aurata (Risso, 1810). Int J Morphol. 21:191–195. 37. Shabanipour, N., Hossayni, S. N., 2010. Histological and ultrastructural study of Zona Radiata in oocyte of common carp Cyprinus carpio (Linnaeus 1758). Micron, 41:877–881. 38. Siddique, M. A. M., Cosson, J., Psenicka, M., Linhart, O., 2014. A review of the structure of sturgeon egg membranes and of the associated terminology. J Appl Ichthyol. 30:1246-1255. 39. Turker H., Takemura A., 2011. Effects of environmental contaminants and natural substances on vitellogenesis in tilapia primary hepatocytes. Turkish J Fish Aquat Sci. 11:539-545. 40. Watanabe, A., Onitake, K., 2002. The urodele egg-coat as the apparatus adapted for the internal fertilization. Zool. Sci. 19:1341–1347. 41. Yanagimachi, R., Cherr, G., Matsubara, T., Andoh, T., Harumi, T., Vines, C., Kaneshiro, K., 2013. Sperm attractant in the micropyle region of fish and insect eggs. Biol. Reprod. 88:1–11. 42. Żelazowska M., Fopp-Bayat D., 2017. Previtellogenic and vitellogenic oocytes in ovarian follicles of cultured siberian sturgeon Acipenser baerii (Chondrostei, Acipenseriformes). J. Morphol. 278:50–61.