UTILIZAREA UNOR NOI TULPINI MICROBIENE CU GRADE DIFERITE DE REZISTENȚĂ LA OXITETRACICLINĂ ÎN EPURAREA UNOR APE UZATE PROVENITE DIN ACVACULTURĂ… [623087]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
BIOLOGIE MEDICALĂ

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator științific ,
Conf. dr. Gheorghe STOIAN

Masterand: [anonimizat] 2018

UNIVERSITATEA DIN BU CUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
BIOLOGIE MEDICALĂ

UTILIZAREA UNOR NOI TULPINI MICROBIENE CU
GRADE DIFERITE DE REZISTENȚĂ LA
OXITETRACICLINĂ ÎN EPURAREA UNOR APE UZATE
PROVENITE DIN ACVACULTURĂ

Coordonator științific ,
Conf. dr. Gheorghe STOIAN

Masterand: [anonimizat] 2018

CUPRINS
CAPITOLUL 1 – INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 1
CAPITOLUL 2 – STADIUL ACTUAL ÎN TEHNICILE DE TRATARE A EFLUENȚILOR DE
ACVACULTURĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 3
CAPITOLUL 3 – METODE DE TRATARE A APELOR UZATE ………………………….. ………………… 10
3.1 Tratarea mecanică a apelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 10
3.2 Tratarea chimică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 13
3.3 Tratarea biologică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 16
3.3.1 Tipuri de bacterii implicate in bioepurarea apelor ………………………….. ………………………….. ….. 19
3.4 Tratarea cuaternară ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 24
CAPITOLUL 4 – MATERIALE ȘI METODE ………………………….. ………………………….. …………………. 26
4.1 Pregatirea liofilizatului ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 26
4.2 Realizarea mediului de cultură Luria Broth ………………………….. ………………………….. …………………. 27
4.3 Izolarea și identificarea tulpinilor bacteriene ………………………….. ………………………….. ……………….. 27
4.4 Realizarea curbei de creștere a bacteriilor identificate în prezența oxitetraciclinei (OTC) ………….. 28
4.5 Testarea eficiacității de r eținere a bacteriilor a unor biofiltre în mediu lichid LB ………………………. 30
4.6 Testarea eficiacității de reținere a bacteriilor a unor biofiltre în mediu sintetic ………………………….. 33
4.7 Determinarea spectrofotometrică a concentrațiilor de ioni de amoniu, nitrat, nitrit și fosfor ……….. 34
4.7.1 Determinarea ionului de amoniu (NH 4+) ………………………….. ………………………….. ……………….. 34
4.7.2 Determinarea ionului nitrat ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 35
4.7.3 Determinarea concentrație ionului nitritului prin derivatizare cu captopril …………………………. 36
4.7.4 Determinarea concentrație de fosfor ………………………….. ………………………….. …………………….. 36
CAPITOLUL 5 – REZULTATE ȘI DISCUȚII ………………………….. ………………………….. …………………. 38
5.1. Izolarea și identificarea speciilor bacteriene ………………………….. ………………………….. ……………….. 38
5.2 Testarea eficacității de reținere a bacteriilor a unor biofiltre cu și fără OTC în medi u LB ………….. 40
5.3 Curbe de creștere bacteriană în mediu sintetic ………………………….. ………………………….. ……………… 51
5.4 Testarea eficacității de reținere a bacteriilor a unor biofiltre cu și fără OTC în mediu sintetic …….. 53
5.5 Determinarea spectrofotometrică a concentrațiilor de ioni de amoniu, nitrat, nitrit și fosfor ……….. 58

5.5.1 Evaluarea eficienței biofiltrelor în eliminarea ionilor nitrat ………………………….. ………………….. 58
5.5.2 Evaluarea eficienței biofiltrel or în eliminarea nitriților ………………………….. ……………………….. 60
5.5.3 Evaluarea eficienței biofiltrelor în eliminarea amoniului ………………………….. …………………….. 62
5.5.4 Evaluarea eficienței biofiltrelor în eliminarea fosfaților ………………………….. ………………………. 63
CAPITOLUL 6 – CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 66
CAPITOLUL 7 – BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 69

1
CAPITOLUL 1 – INTRODUCERE
La nivel global se înregi strează o creștere a gradului de contaminare a solului și apelor
subterane și de suprafață, având drept cauză, printre altele, dezvoltarea sectorului agro -industrial
ca urmare a nevoii de producere a unor cantități crescânde de hrană pentru asigurarea cere rii în
condițiile creșterii demografice [1]. Securitatea hranei este o problemă foarte importantă având
în vedere că populația globală a depășit 7,2 miliarde persoane, ritmul de creștere demografică
fiind foarte rapid. Este preconizat ca numarul locuitoril or planetei să ajungă la 9,6 miliarde în
anul 2050, circa 75% fiind populație urbana. [2]
Utilizarea irațională a resurselor naturale are implicații negative asupra ecosistemelor din
care fac parte și a celor în care sunt utilizate. Un exemplu reprezentat iv este cel al resursei de
apă: cu cât este consumată mai multă apă de către populație, cu atât mai multe ape reziduale sunt
generate și evacuate în ecosistem. Din cantitatea totală de ape reziduale generate, numai o mică
parte ajunge în stații de epurare, restul fiind direct deversate în mediu fără nicio epurare
prealabilă. Astfel, o măsură importantă în conservarea sistemelor naturale este necesitatea de
stabilire și aplicarea tehnicilor de epurare a apelor reziduale înainte ca acestea să ajungă în mediu
[3].
În acest context, acvacultura este o activitate umană care implică utilizarea unor volume
mari de apă, rezultând volume importante de ape reziduale. Acumularea de excremente și resturi
de hrană în apele destinate activităților piscicole cauzează o det erioare a calității apei, cu efecte
negative atât asupra peștilor cât și asupra mediului în general având în vedere ca apele de
acvacultură conțin cantități considerabile de azot, fosfor și materie organică care au potențial de
degradare a altor cursuri de apă [4]. Prin urmare, tratamentul de epurare al acestor ape este
esențial pentru prevenirea impactului negativ asupra mediului acvatic înconjurator, adică
prevenirea fenomenului de hipereutrofizare, și de dezvoltare a unei acvaculturi durabile la nivel
global [1].
Diferite combinații de sisteme de epurare a apelor de acvacultură au fost studiate la ferme
piscicole de ape marină și de apă dulce în cadrul unui proiect European aquaEtreat. Schema
generală de tratare implementată la toate fermele implicate în proiect a inclus o serie de unități de
tratare a apelor amplasate în diferite locații ale fermei și sedimentarea apelor piscicole astfel
încât să se obțină nămol cu peste 15% materie solidă uscată, ce poate fi valorificată ca fertilizant

2
sub forma propaspa tă sau după compostare, apele de supernatant rezultate putând fi tratate prin
construirea de delte artificiale în care solidele suspendate și materialele organice sunt consumate
de către plante acvatice, iar apele filtrate (apele de recirculare sărace în s olide suspendate) sunt
returnate în bazinele pentru creșterea peștilor.
În cele mai multe cazuri, apa filtrată de la sistemele de curgere nu este tratată, dar
conform legislatiei specifice, azotul total amoniacal (TAN) poate atinge concentrații ridicate c are
necesită tratare. Astfel, o adevarată provocare în această activitate este reprezentată de faptul că
debitul apei de acvacultură care se impune să fie tratat atinge cote ridicate, adică circa 50 -100 m3
apă reziduală / kg pește produs, deși concentrația de nutrient din debit este redusă de circa 1 mg
TAN /litru [5]
In acest context , studiile noastre au avut ca scop identificarea unor noi tulpini microbiene
cu grade diferite de rezisten ță la oxitetraciclina ș i utili zarea lor în epurarea unor ape sintetice
uzate produse în laborator ș i contaminate cu antibiotic care simulează apele uzate provenite din
acvacultură .

3
CAPITOLUL 2 – STADIUL ACTUAL ÎN TEHNICILE DE TRATARE A
EFLUENȚILOR DE ACVACULTURĂ

Metodele fizice, chimice și biologice utilizate în mod conv ențional în tratarea apelor
reziduale pot fi aplicate și sistemelor de acvacultură. Îndepărtarea solidelor dizolvate este
realizată prin sedimentare urmată de filtrare cu filtre de nisip sau prin filtrare mecanică.
Metodele biologice prin utilizarea de bio filtre scufundate, filtre de drenare, contactoare biologice
rotative precum și reactoare în pat fluidizat sunt sisteme utilizate pentru oxidarea materiei
organice, nitrificare sau denitrificare [6].
Micro -ecranele rotative cu dimensiunea porilor de 60 -200 µm sunt utilizate în mod
obișnuit în fermele piscicole din Europa [4]. Aceste metode ajută la îndepartarea fosforului însă
ele sunt metode costisitoare din punct de vedere al investiției, sunt consumatoare de energie și
necesită întreținere, acestea cresc ând costul total al tehnicii de epurare. În plus, foarte puține
cercetări cu astfel de dispozitive au fost adresate apelor rezidale de acvacultură.
Există unele cercetări care au demonstrat că sistemele de tip mlaștină pot îndepărta o
mare parte din solide le suspendate, materie organică, azot, fosfor, elemente aflate la nivel de
urme, precum și microrganisme conținute în apele reziduale [7].
Îndepartarea solidelor, a materiei organice, amoniacului și nitriților sunt criterii cheie
pentru proiectarea și dez voltarea sistemelor de recirculare. În aceste sisteme de acvacultură,
peștii pot fi crescuți la un loc cu alte organisme marine, care sunt utile pentru conversia
nutrienților în exces în produsi valoroși, făcând ca întregul sistem de acvacultură să fie fez abil
[8].
Încărcarea cu solide totale
În vederea menținerii concentrației de solide totale suspendate (TSS) la niveluri
acceptabile care să permită evacuarea sau reciclarea apei de acvacultură utilizate, este important
să se cunoască natura deșeurilor sau a componentelor poluante. In acest context, f ermele
piscicole trebuie să adopte practici de management adecvate și/sau tehnologii de tratare eficiente,
conform celor descri se de diverși specialiști [4, 9]. Unele studii și cercetări [4, 10] au arătat că
apele de acvacultură, prin caracteristicle acestora, nu pot beneficia de tehnici de tratare simple
tocmai datorită ponderii lor reduse în efluenți.

4
În plus, au fost îmbunătățite formulele de hrană și sistemele care previn pierderile de
material nutritiv. Intr oducerea în formulele de hrană a aglomerantilor de tip Alginat a îmbunătățit
semnificativ stabilitatea excrementelor de pește, favorizând formarea de deșeuri de excremente
sub formă de particule mai mari, mai aglomerate, care au un potențial de îndepărtare mecanică
mai bun, precum și rezistență îmbunătățită la difuzie sau scurgere. Acești aglomeranți nu au
efecte secundare negative asupra sănătății peștilor, nici asupra digestibilității macronutrientilor.
[11].
Cercetările prezentate de Kelly și colaborato rii săi, precum și de Bergheim și
colaboratorii săi [9, 10] au arătat ca eficiența de tratare, în sensul separării particulelor solide din
efluent, crește cu creșterea concentrației de solide totale. Eficiența de sedimentare a unei camere
de sedimentare a namolului de acvacultură a crescut astfel cu circa 58%, de la circa 1 mg solide
suspendate (SS)/minut la aproximativ 90%, adica 18 mg SS/minut, pentru același debit de
curgere.
În general, concentrația de solide în efluenții netratați proveniți de la ferm ele piscicole se
situează în domeniul 5 – 50 mg/l, acest interval fiind relativ neschimbat în ultimii 20 ani. Totuși,
valorile pot să difere semnificativ în funcție de tipul de management al sistemelor de acvacultură
[9].
Încărcarea cu nutrienți
Încărcarea cu poluanți a apelor uzate de acvacultură este variabilă, depinzând de cațiva
parametri. Unii cercetători afirmă că volumul de deșeuri generat de o fermă piscicolă este direct
dependent de temperatură [10], datorită intensificării ratei metabolismului.
În sistemele de acvacultură intensive integrate, încărcarea apelor cu compuși poluanți
precum nitrați și fosfați p oate fi redusă dacă sistemul de creșterea a peștilor include creșterea
altor organisme acvatice, precum plante ce funcționează ca biofiltre, ca re pot converti nutrienții
reziduali în produși valoroși. Astfel, c reșterea combinată de pește de acvacultură cu specii de
plante care pot asigura conversie fototrofă și heterotrofă/ierbivoră, poate crește retenția de
nutrienți în sistemul de cultură, de e xemplu de la 20 -42% azot la 29 -45% azot. Această creștere
relativ redusă se datorează speciilor ierbivore, deoarece conversia de către ierbivore diminuează
semnificativ retenția de nutrienți obținută prin conversia autotrofă. [8]
Alți poluanți prezenți în apele de acvacultură sunt deșeuri derivate din hrana peștilor,
antibiotice și unii hormoni [12]. Deșeurile derivate din hrana peștilor include componente care

5
sunt fie dizolvate, precum nutrient pe baza de fosfor și azot, fie se regăsesc sub formă solidă,
precum solidele suspendate [13].
Aceste solide suspendate pot în mod normal să conțină circa 7 -32% azot total (TN) și 30 –
40% fosfor total (TP) din apele reziduale de acvacultură. Restul de azot și fosfor este transportat
în afara fermei sub formă de fracți e dizolvată, deoarece nu este posibil ca acestea să fie separate
prin tehnicile de separare utilizate în mod obișnuit la tratarea apelor de acvacultură. [4], [9]
Concentrația de nutrienți într -un iaz piscicol crește pe măsură ce se acumulează reziduuri
de hrană și excremente, nivelurile de azot și fosfor situându -se între 0,12 – 14,7 mg/l azot
amoniacal, 0,02 – 1,5 mg/l azot de tip nitrit, 0,01 – 5,3% azot de tip nitrat și 3,1 – 17,7 mg/l fosfor
de tip fosfat [7] .
Influența tipului de hrană
Pentru facilitar ea îndepărtării particulelor poluante din apele de acvacultură trebuie
utilizate tehnologi i de tratare și de management a produșilor reziduali adecvate și eficiente. Din
aceasta cauza , un aspect foarte important în această problemă este îmbunătățirea calit ății hranei,
cu un conținut mai bogat în fosfor și proteine, reducând astfel cantitatea de excremente de pește.
De asemenea, îmbunătățirea structurii și a consistenței peleților, cu o rată de descompunere mai
redusă, precum și utilizarea de sisteme și meto de optimizate de distribuție a hranei sunt soluții
care ar reduce risipa de hrană și încărcarea ap elor cu astfel de deșeuri [4, 9].
Studiile și cercetările experimentale au arătat că dezvoltarea unor diete cu valoare
energetică ridicată, cu conținut ridicat de grăsimi dar conținut redus de carbohidrați și proteine,
precum și îmbunatățirea gradului de digestibilitate au redus semnificativ generarea de deșeuri în
fermele de somoni dupa cum d ieta standard a somonilor de crescătorie include următoarele
fracții d e componente nedigerabile, care ajung să fie excretate de pești: 13% proteine, 8%
grăsimi, 40% carbohidrați (fibre complet nedigerabile), 17% materie organică, 50% cenușă, și
23% materie uscată. Circa 40% din proteinele nedigerate sunt excretate de somon s ub formă de
azot dizolvat, adică sub formă de NH 3 și NH 4+. [14]
Studii recente au indicat faptul ca somonul tanar provenit din oceanul Atlantic are nevoie
de o porție de circa minim 11 g fosfor /kg peste. Cantitățile zilnice de nutrienți (azot și fosfor)
eliminate de peste sunt estimate cu ajutorul relației:

6
N, P eliminate zilnic = N, P alimentat – N, P asimilat (1)

unde:

N, P alimentat = porția alimentată (g) x concentratia de nutrient N, P în hrană (g/g porție) (2)
N, P asimilat = creșterea (g) x concent rația de nutrient în pește (g/gpește) (3)

Pentru un grad de conversie de 1 kg alimentat / 1 kg asimilat, cantitatea estimată a fi
excretată de un somon tânar, exprimată în g (N,P) / kg peste este de circa 33 g N total (din care
26 g azot dizolvat și 7 g azot legat de fracția solidă) și 7,5 g P total (80 -90% fosfor legat de
fracția solidă). [1 , 4, 9].
Pe baza ratei de digestibilitate estimate pentru dietele obișnuite, cantitatea de solide
suspendate din apele de acvacultură la fermele de somoni și păstră vi trebuie să fie de 150 – 200 g
SS/kg pește, pentru un grad de conversie de 0,9 -1,0 [14].
Din cele prezentate mai sus este evident că cea mai bună modalitate de a reduce
cantitatea de reziduuri în fermele de acvacultură este îmbunătățirea managementului h ranei
furnizate. În aceste condiții, capacitățile sistemelor de tratate a apelor ar putea fi minimizate,
reducând totodată costurile de capital și de operare [14].
O altă modalitate de reducere a cantității de reziduuri este oferită de dezvoltarea și
imple mentarea tehnologiei de monitorizare a hranei neconsumate [15] . De asemenea, reducerea
volumului de apă utilizată, realizată adesea prin combinarea recircularii cu adaosul de oxygen,
este o modalitate de îmbunătățire a utilizării resursei de apa și de red ucere a volumului de
efluenți uzați descărcați în mediu ca urmare a unei ef iciențe de tratare îmbunătățite [4].

7
Impactul utilizării antibioticelor în acvacultură
Antibioticele sunt o clasă de substanțe medicamentoase foarte frecvent utilizate atât în
medicina umană, medicina veterinară dar și în agricultură și acvacultură, devenind în ultimii ani
un poluant de mediu de importanță maximă, având efecte adverse pe te rmen lung asupra
ecosistemelor [16].
Aproximativ 90% din cantitatea de antibiotice consumată e ste excretată de către
organisme după o metabolizare parțială, sau chiar în totalitate fără metabolizare, ajungând în
sistemele de canalizare și în mediu sau direct în apele de acvacultură in timp ce s istemele
biologice convenționale de epurare a apelor uz ate asigură, în cazul unor tehnologii avansate, o
reducere foarte scăzută a nivelului de antibiotic din efluenți, aceste substanțe acumulându -se în
final în apele receptoare, în sediment, plante și animale. Atfel, c oncentrația de antibiotice ajunse
în apel e de suprafață din sistemul de canalizare se situează între 0,3 µg/mL și 150 µg/mL , dar
nivelul de antibiotice ajunse în mediu prin surse precum fabrici de medicamente, sisteme de
acvacultură, producători de nutrețuri concentrare este mult mai mare, de ord inal 100 – 500 mg/l
[16].
În consecință este foarte important să se efectueze studii și cercetări privind impactul
acestor substanțe asupra ecosistemelor și să se găsească opțiunile de tratare cât mai eficiente,
astfel încât să se reducă efectul negativ as upra microbiotei din mediu.
Acțiunea inhibitoare a antibioticelor asupra comunităților microbiene este cercetată și
prezentată în numeroase lucrări științifice care vizează atât eficiența de îndepărtare a acestor
compuși din apele reziduale, cât și adapta rea și/sau rezistența comunităților microbiene din
mediu la antibiotice din diferite clase (β -lactame, tetracicline, macrolide, sulfonamide, chinolone
etc.) sau chiar schimbări majore în compoziția microbiană ca rezultat al expunerii continue a
comunitățil or microbiene din apele reziduale la factorul inhibitor [17] .
Dezvoltarea domeniului acvaculturii și intensificarea activităților de pescuit industrial
înregistrate în ultimele decenii au contribuit la răspândirea unor afecțiuni bacteriene provenite
din a cvacultură, care au dus la utilizarea crescândă de medicamente antimicrobiene. Astfel au
crescut și preocupările pentru elaborarea și implementarea unor reglementări care sa controlze
strict utilizarea de antibiotice în acvacultură, foarte puține antibioti ce fiind permise a se utiliza în
acvacultură [15].

8
În acvacultură, bacteriile rezistente la antibiotice prezintă un risc semnificativ pentru
sănătatea publică prin faptul că ele crează gene rezistente care ajung să fie transferate ca gene
rezistente la age nții patogeni ce produc îmbolnăviri la om. De exemplu, genele rezistente
provenite din plasmide pot fi transferate prin conjugare de la bacteria patogenă piscicolă A.
salmonicida la bacteria patogenă Eschericha coli care este de origine umană, unele tulpin i ale
acesteia fiind patogene pentru om. Un alt exemplu de risc biologic este transferul de gene
rezistente de la patogenii Vibrio anguillarum din pești la bacteria Vibrio cholera care cauzează
holera la om. [18, 19].
Degradarea ineficientă a antibioticelo r în apele reziduale de acvacultură determină
dezvoltarea în mediu a bacter iilor rezistente la antibiotice [20]. Prin urmare, este esențial să se
cunoască modalitatea prin care design -ul și tehnologia de epurare pot influența dezvoltarea
bacteriilor rezist ente la antibiotice și răspândirea acestora în mediu.
S-a observat că în stațiile de tratare a apelor reziduale, abundența bacteriilor rezistente la
antibiotice este mai mare în influent, urmată de efluent, namolul de ferment are anaerob și în
namolul acti v [21].
Etapa de dezinfecție în tratarea apelor reziduale este importantă în controlul răspândirii
acestor bacterii rezistente la antibiotice în mediu; cu toate acestea, clorurarea poate cauza
revenirea și reactivarea acestor bacterii în efluenții secundar i [22] .
Cantitatea și tipul de antibiotice din influent determină compoziția microbiană în efluent.
De exemplu, în instalațiile de epurare care tratează ape cu conținut de penicilină, în efluent vor
predomina bacterii din genul Proteobacteria si Firmicut es, precum și din clasele Clostridia și
Bacilli. [23].
Alți cercetători au observat ca prezența tetraciclinelor, penicilinelor, sulfonamidelor,
chinolonelor și triclosanului în influent este in mod pozitiv corelată cu abundența Epsilon –
proteobacteriilor, dar negativ corelată cu prezența Beta -, Gama -proteobacteriilor și a speciilor
Firmicutes.
Ca bacterii potential rezistente la tetraciline au fost identificate următoarele: Sulfuritalea ,
Armatimonas , Prosthecobacter , Hyphomicrobium , Azonexus , Longilinea , Paracoccus ,
Novosphingobium și Rhodobacter . Tratarea apelor reziduale cu încărcare ridicată în tetracicline a
dus la creșterea abundenței și a diversității genelor de tetracilcline dar în același timp a

9
determinat scăderea răspândirii și diversității genelo r rezistente la antibiotice de non -tertacicline
[24].
O altă modalitate de reducere a cantității de reziduuri este oferită de dezvoltarea și
implementarea tehnologiei de monitorizare a hranei neconsumate [15]. De asemenea, reducerea
volumului de apă utiliz ată, realizată adesea prin combinarea recirculării cu adaosul de oxigen,
este o modalitate de îmbunatățire a utilizării resursei de apă și de reducere a volumului de
efluenți uzați descarcați în mediu ca urmare a unei ef iciențe de tratare îmbunătățite [4].

10
CAPITOLUL 3 – METODE DE TRATARE A APELOR UZATE
Metodele de tratate a apelor uzate constau în general în procedee fizice care includ filtre
de nisip și filtre mecanice. Procedeele biologice precum biofiltrele scufundate, contactoare
biologice rotative, rea ctoare în pat fluidizat etc. funcționează pe principiul oxidării materiei
organice, nitrificării sau denitrificării. Astfel, m arele dezavantaj al acestor metode este că ele
generează nămoluri, necesită consumuri energetice ridicate precum și intervenții de întreținere
frecvente. Prin urmare, dezvoltarea unei metode de tratare eficiente, necostisitoare este
imperativă în condițiile în care acvacultuaă se extinde continuu [25].
Sistemele de tip mlaștini artificiale au avantajul unei eficiențe ridicate de epur are a apei
uzate de acvacultură, dar au dezavantajul că necesită suprafețe mari de teren, având dimensiuni
de 0,7 până la 2,7 ori mai mari decât un iaz piscicol. Astfel că dacă se dorește tratarea unui
volum mare de ape de acvacultură, aceste mlaștini arti ficiale necesită suprafețe de teren
considerabile. Din acest motiv este pusă sub semnul întrebării fezabilitatea mlaștinilor artificiale
ca metodă eficientă din punct de vedere al costurilor, având în vedere că pentru atingerea
eficienței de îndepărtare a substanțelor poluante, mlaștinile au un timp de încărcare hidraulică
redus și un timp de retenție hidraulică foarte ridicat [26].
Cu toate acestea, sunt unii specialiști care afirmă că prin combinarea unei tehnici de
pretratare eficientă, adică pentru o în depărtare de solide totale suspendate TSS de 80%, cu o
mlaștină artificială de dimensiuni reduse care să proceseze încărcări hidraulice ridicate, se obține
varianta cea mai fezabilă din punct de vedere economic [27].
3.1 Tratarea mecanică a apelor
Sunt cu noscute trei tipuri principale de tratamente de recuperare a apelor uzate care
trebuie să respecte standardele și recomandările impuse: tratamente secundare capabile să obțină
apa potrivită pentru reutilizare, tratamente terțiare fără dezinfecție, cu un pr odus final care să
permită reutilizarea și tratamente complete terțiare, inclusiv pre -tratamentul pentru dezinfecție.
[28].
Filtrarea este o metodă mecanică de tratare a apelor uzate și se poate efectua cu ajutorul
tehnologiilor membranare (nanofiltrare, u ltrafiltrare și osmoza inversă) sau cu ajutorul sistemelor
extinse cu materiale de filtrare (nisip, materie organică, cărbune, filtre multistrat).

11
Membrana reprezintă o barieră selectivă care permite transportul preferențial al unui
component dintr -un am estec făcând astfel posibila separarea amestecului în două fracțiuni cu
compoziții diferite: rejectat și permeat (Fig. 1).

Fig. 1 – Separarea prin membrană [28]
Transportul prin membrană este posibil în condițiile existenței unei forțe motoare
determinată de un gradient de potențial. Astfel, forța motoare (gradientul de potențial)
responsabilă pentru separare este diferența de presiune, de temperatura, de concentrație sau de
potențial electric. De asemenea, capacitatea de separare a unui amestec depind e de
caracteristicile membranei : materialul din care este confecționată, dimensiunea porilor,
caracteristicile chimice, sarcina electrică etc. [28].
Membranele pot fi confecționate din diferite materiale: materiale polimerice , metalice,
ceramice și z eoliți si c omparativ cu procedurile convenționale de separare precum filrarea
convențională, decantarea sau centrifugarea, procedeele de separare pe bază de membrane s -au
dovedit a fi avantajoase întrucât sunt operații unitare simple și rentabile din punct de vedere
economic [29].
În cazul microfiltrării se generează separări de particule, utilizând un mecanism de
separare -cernere (Fig. 2).
Prin ultrafiltrare se obțin separări de molecule, iar această tehnică are principalul avantaj
de a oferi o barieră absolută contra patogenilor. Pe lângă tratarea apelor uzate, ultrafiltrarea este
utilizată și în indutria alimentară, farmaceutică sau chimică [29].
Atât nanofiltrarea, cât și osmo za inversă (hiperfiltrarea) generează separări de soluții cu
masă moleculară mică, utilizând o presiune osmotică mare comparativ cu microfiltrarea/
ultrafiltrarea. Acestea au ca principale domenii de aplicare tratarea apelor reziduale,
desalinizarea apei d e mare și a apelor saturate și nu în ultimul rând concentrarea unor produse
alimentar e [30].
Rejectat
Permeat
Amestec
Forța motoare

12

Fig. 2 – Separări de membrană bazate pe diferența de presiune [29]
Este bine cunoscut faptul că nanofiltrarea poate elimina într -un mod eficient ionii
multivalenți și compușii organici cu masă moleculară mai mare, cu o presiune de operare mai
mică și cu un flux de permeat mai mare decât în cazul osmozei inverse, această tehnică fiind
promițătoare pentru tratamentul avansat al apelor reziduale, având în vedere eficiența cos tului și
cerințele energetice. Performanțele nanofiltrării sunt puternic influențate de caracteristicile apei
uzate, de caracteristicile membranei și de parametrii de operare [30].
Osmoza inversă este intens studiată în literatura de specialitate, iar apa tratată în urma
acestei proceduri prezintă o calitate sup erioară. Principiul osmozei este prezentat in fig. 3. Este
de menționat faptul că presiunea osmotică depinde atât de concentrația solului (crește cu
concentrația), cât și de masa molară a acestuia (scade cu masa molară) [31].

Fig. 3 – Principiul osmozei [31]

13
Când apa recuperată este reutilizată, dezinfecția acesteia este absolut necesară deoarece
una dintre principalele limite legale obligatorii este calitatea microbiană. Tehnologiile prezentate
anterior sunt utilizate în principal pentru pregătirea ape i în vederea unei dezinfectări ușoare.
Dezinfecția are ca scop principal decontaminarea, maximizarea eliminării agenților patogeni
(distrugerea, eliminarea sau îndepărtarea acestora) până la atingerea unei limite admisibile si
crearea unei cantități cât ma i mici de produși secundari de dezinfecție [30].
3.2 Tratarea chimică
Procesele fizice și chimice de tratare a apei permit eliminarea poluanților de tipul:
compuși solizi în suspensie, metale grele, săruri anorganice etc., care nu pot fi eliminați prin
procesele convenționale de tratare biologică a apei [32]. Metodele chimice de tratare se bazează
pe interacțiile chimice ale contaminanților care trebuie eliminați din apă, precum și pe
capacitatea unor compuși chimici de a ajuta la separarea contaminaților de apă sau la
neutralizarea efectelor nocive asociate prezenței acestora. Metodele de tratare chimică se aplică
atât ca tehnologii de sine stătătoare cât și ca parte integrantă în procesul de tratare a apei prin
metode fizice [33].
Tratarea chimică consti tuie o etapă esentială în procesarea apelor uzate provenite din
diverse domenii ale industriei. Aceasta implică utilizarea de compuși chimici care pot fi împărțiți
în patru categorii distincte: neutralizatori de pH, agenți anti -spumă, coagulanți și flocula nți [34],
[32]. În general apele uzate, deversate în sistemele de canalizare ar trebui sa aibă un pH nici prea
acid nici prea bazic, ideal ar fi ca pH -ul apei sa fie netru (cca. 7), deoarece astfel este împiedicată
apăriția unor reacții chimice nedorite. A dăugarea in timpul procesării apelor uzate a unor doze
mici, atent controlate, de acizi puternici sau compusi bazici (NaOH), constituie o metodă simplă
de asigurare că pH -ul efluentului este în limite prevăzute de standardele vigoare [34]. Dacă apa
industr ială este deversată în lacuri sau în ape curgătoare, neutralizarea de pH este mult mai
importantă, deoarece un pH acid sau bazic poate să inluențeze ecosistemele locale. De asemenea,
un pH optim contribuie la limitarea procesului de coroziune a conductelor de transport al apei
[33].
Agenții anti -spumă așa cum sunt anumite uleiuri insolubile, compuși siliconici, alcooli,
stearați, glicoli (în general compuși cu văscozitate mică) împiedică formarea bulelor de aer
(spumei) în apa uzată. Prin schimbarea propr ietăților fizice ale fluidelor, spuma poate crește

14
gradul de uzură mecanică a sistemelor de pompare și poate cauza probleme de drenare a apei
prin bloca rea sitelor și filtrelor [33, 34].
Coagularea, oxidarea chimică și dezinfecția sunt considerate a fi ce le mai importante
procese de tratare a apei și a apelor uzate. Coagularea ușurează sedimentarea particulelor prin
aglomerarea particulelor din suspensie în formațiuni voluminoase care pot fi eliminate din apă
prin procedee de sedimentare sau filtrare [ 32, 35]. Aceste particule voluminoase pot avea un rol
secundar de tratare a apei prin adsorbția pe suprafața lor a poluanților solubili [36]. În general, în
tratarea chimică a apelor reziduale se folosește o varietate de coagulanți, oxidanți și
dezinfectanți.
Este cunoscut faptul că majoritatea particulelor suspendate în apele reziduale poartă
sarcină negativă în mediu apos. După adaugarea de coagulanți anorganici pe bază de săruri
metalice, aceste hidrolizează rapid formând specii cationice. Cei mai utilizaț i compuși coagulanti
sunt pe bază de sulfat feric [Fe 2(SO 4)3], sulfat de aluminiu [(Al 2(SO 4)3] și clorura ferică (FeCl 3]
[37]. Acești compuși pot reacționa cu compușii pe bază de carbonat, bicarbonat, hidroxid sau
fosfat formând săruri de Fe sau Al insolub ile [37]. Eficiența acestor coagulanți rezultă din
capacitatea lor de a forma complecși polinucleari multisarcină cu proprietăți de absorbție
îmbunătățite. Natura complecșilor formați poate fi controlată cu ajutorul Ph -ului sistemului [38].
Dupa procesul de coagulare, pentru eliminarea particulelor coloidale fin dispersate se
folosește flocularea pentru îmbunătătirea clarității apei. Procesul de coagulare/floculare este unul
din cele mai utilizate procese de separare solid/lichid pentru eliminarea solidel or dizolvate și în
suspensie, coloizilor și substanțelor organice prezente în apele reziduale industriale [39].
Floculanții utilizați în tratarea apei pot fi împărțiți în trei clase principale (Schema 1):
coagulanți/floculanți chimici, bio -floculanți nat urali și floculanți grefați [40]

15

Schema 1 – Clasificarea floculanților [40]
Pentru eliminarea metalelor grele din apă se folosesc mai multe metode fizico -chim ice de
tratare a apelor uzate (T abelul 1).
Tabelul 1 – Metode fizico -chimice de tratare a eflue ntului anorganic [41]
Nr.
crt. Tip de tratament Tip de contaminant eliminat
1 Precipitare chimică metale grele, metale bivalente
2 Coagulare -floculare metale grele și suspensii solide
3 Flotația aerului dizolvat metale grele și suspensii solide
4 Schim b de ioni compuși dizolvați, cationi/anioni
5 Ultrafiltrare compuși cu masă moleculară mare (1000 -10000 Da)
6 Nanofiltrare săruri sulfat, ioni de Ca (II) și Mg(II)
7 Osmoza inversă compuși organici si anorganici

Anumite metale precum Pb, Cd, Cu și Zn pot fi eliminate eficient din apele poluate prin
utilizarea unor liganzi difenilditiocarbamati ce prezintă o capacitate ridicată de a forma legături
cu aceste metale [42].

16
3.3 Tratarea biologică
Utilizarea proceselor biochimice cu implicarea diverselor specii microbiene în procesele
de epurare a apelor reziduale, inclusiv a celor provenite din acvacultură, este un domeniu de
cercetare de mare interes având în vedere aplicabilitatea sa p ractică deosebit de importantă [43].
Parametrii de operare ai stațiil or de epurare influențează formarea structurilor microbiene
complexe și compoziția speciilor din comunitatea microbiana. Structura speciilor microbiene din
biomasă determină căile metabolice care pot fi urmate de speciile bacteriene în sistemele de
bioepur are și, în final, calitatea apei tratate biologic.
Bioremedierea apelor de acvacultură se realizează prin mai multe metode, printre care
fitoremedierea (mlaștini artificiale, cultivarea de alge în apele reziduale etc.) și epurarea
microbiană.
Cele mai uzua le metode de bioepurare microbiana, precum și populațiile de bacterii
implicate în procesele biochimice sunt prezentate succint în continuare:
a. Metoda nămolului activ
Bioepurarea apelor uzate cu ajutorul nămolului activ este una dintre principalele metode
în tehnologiile de trat are biologică a apelor uzate, rata de îndepărtare a azotului și fosforului prin
această metodă fiind ridicată.
Metoda constă în adăugarea în sistem a bacteriilor nitrificatoare, denitrificatoare și fosfat
reducătoare, formându -se ast fel mase microbiene concentrate care absorb și descompun poluanții
din apă.
Unii cercetători au testat aplicarea acestei metode tradiționale la tratarea apelor reziduale
de acvacultură marină, studiind efectul salinității asupra eficientei procesului de b ioepurare.
Rezultatele au indicat ca salinitatea redusă afectează în mod pozitiv procesul de denitrificare.
[44].
b. Metoda cu membrane biologice
Această metodă are avantajul că este o metodă de bioremediere simplă și eficientă.
Suprafața de material filtra nt conferă condițiile optime necesare creșterii și reproducerii
microbiene. Microorganismele sunt atașate de suprafața filtrantă la nivelul căreia se realizează
adsorbția și degradarea materiei organice existentă în apele poluate, în această metodă neexist ând

17
probleme de expansiune a nămolului . Biofilmul gelatinos cu textura de mucus care se formează
la suprafața filtrului poate reduce eficient turbiditatea, conținutul de azot și de hidrogen sulfurat
din apele reziduale, reducând în același timp nivelul de consum chimic de oxigen (CCO) și
inhibând creșterea microorganismelor dăunătoare [43].
Sistemul uzual de biofilm utilizat în tratarea apelor de acvacultură include de obicei un
sterilizator UV, un generator de ozon, un separator de proteine și un filtru bi ologic. În general,
biofiltrul este suportul pe care comunitățile microbiene formează biofilmul, făcând astfel ca
suspensia să crească [45].
În general, sistemele de acvacultură intensivă utilizează pentru epurarea apelor reziduale
echipamente precum filtr e biologice scufundate, contactoare biologice rotative și filtre pe pat
fluidizat [43].
c. Metoda microbiologică cu bacterii de înaltă eficiență
Tehnologia de tratare microbiologică a apelor reziduale cu bacterii de înaltă eficiență este
o metodă ecologică ș i viabilă din punct de vedere economic, care necesită o cunoaștere și
înțelegere a tuturor microorganismelor implicate în fiecare dintre procesele biologice care au loc
pe filtrul biologic [46] .
În acvacultură, bacteriile fotosintetice pot degrada substan țele toxice precum nitriți,
hidrogen sulfurat, pot crește nivelul de oxigen dizolvat din apă îmbunătățind în același timp
transparența apei și pot fi utilizate în hrană și în aditivii de hrană a peștilor.
Cercetările privind aplicarea microorganismelor în acvacultură sunt axate în special pe
cercetări privind inhibarea bacteriilor patogene și în degradarea materiei organice.
Zhang și echipa sa de cercetare [47] au studiat efectul bacteriilor R. acidophila, R.
spheroids și T. roseopersicina asupr a speciilo r bacteriene patogene Aeromonas hydrophila și
Aeromonas caviae. Rezultatele studiilor au arătat că toate cele trei tipuri de bacterii fotosintetice
au efect inhibitor asupra acestor două specii patogene Aeromonas . De asemenea, alți cercetători
au constatat că prin această metodă rata de indepartare a azotului amoniacal si a apele reziduale a
fost de 95% [22 , 24].

18
d. Metoda cu microorganisme imobilizate (fixare biologică)
Aceasta este o metodă de bioepurare a apelor reziduale care a evoluat de la tehnologia cu
enzime imobilizate și care utilizează procese fizice și chimice de limitare a biomasei microbiene
în spații fixe, menținând astfel o activitate biologică ridicată [47].
Deoarece metoda se caracterizează prin menținerea unei concentrații de biomasă ridicate ,
rata de încărcare ridicată, producție de nămol scăzută, stabilitate ridicată și ușurința de control a
procesului, aceasta a devenit rapid una dintre cele mai interesante metode de cercetat și
experimentat.
În prezent, metoda fixării biologice este utili zată în special ca metodă de
încorporare/fixare și adsorbție. Suportul bacterian imobilizat nu trebuie să genereze o poluare
secundară în timpul procesului de epurare și trebuie să fie stabil, netoxic, cu rezistența bună la
curgerea de apă, să dovedească p erformață ridicată în transferul de masă, durată de viață ridicată
etc.
Materialul polimeric folosit în mod uzual ca suport de fixare bacteriană este agarul,
alginatul de sodiu etc. Acestea sunt ușor de descompus de către bacteriile anaerobe, astfel că
performața lor nu este atât de bună pentru a se justifica sinteza acestor materiale polimerice.
Alcoolii polivinilici PVA sunt utilizați pe scară largă ca material suport pentru imobilizarea
masei bacteriene, având ca principal avantaj stabilitatea chimică r idicată, rezistență mecanică
ridicată și preț de fabricație scăzut [47,48] .
În vederea tratării apelor de acvacultură, studiile și cercetările sunt axate în special pe
tehnologiile de fixare biologică care utilizează bacterii fotosintetice și bacterii nutr ificatoare.
Combinând tehnica utilizării de materialele de tip alcooli polivinilici PVA cu cea a
epurării cu bacterii fotosintetice, pe de o parte se îmbunătățeste capacitatea bacteriilor de
bioepurare, iar pe de altă parte se pot izola alte specii bacter iene. Astfel, Yu și echipa sa de
cercetare au combinat tehnica utilizării alcoolilor polivinilici PVA cu bacterii fotosintetice pentru
bioepurarea apei din bazine pisciole, rezultatul măsurătorilor arătând o rată de indep artare a
amoniului de peste 90% [48].

19
3.3.1 Tipuri de bacterii implicate in bioepurarea apelor
3.3.1.1 Bacterii fotosintetice
Bacteriile fotosintetice reprezintă o clasă foarte largă de bacterii care sunt capabile să -și
asigure necesarul de hrană prin fotosinteză. Ele se clasifică în două m ari grupe: bacterii
fotosintetice anoxice și bacterii fotosintetice aerobe. Principalele caracteristici ale acestora sunt
menționate în tabelul 2:
Tabelul 2 – Caracteristicile bacteriilor fotosintetice [50]
Categorie Tip Pigment Sursa de
carbon Donorul de
electroni
Bacterii anoxice Bacterii
purpurii Clorofila a si b Carbon organic
si/sau CO 2 H2, H2S, S
Bacterii verzi Clorofila c, d, e
mici cantitati
clorofila a CO 2 H2, H2S, S
Bacterii aerobe Cianobacterii Clorofila a,
ficobilina CO 2 H2O
Proclorofite Clorofila a si b CO 2 H2O

Bacterii fotosintetice anoxice
Bacteriile fotosintetice anoxice depind de donorii de electroni precum compuși cu sulf,
hidrogen molecular sau compuși organici. În general, drept sursă de azot se utilizează sărurile de
amoniu, unele specii bacteriene fiind capabile să fixeze azotul . Alte specii bacteriene
fotosintetice anoxice pot crește chemo -autotrof în condiții aerobe sau micro -aerobe, sursa de
carbon fiind reprezentată de acizii grasi, etanol, acizi organici. Aceste bacterii sunt răspândite în
apele dulci, ape sarate, ape marine și ape hipersaline. Ele se clasifică în următoarele 7 subgrupe
[51]:
– Subgrupa I : Particule de sulf se gasesc în interiorul celulei: Amoebobacter,
Chromatium, Lamprobacter, Thiocapsa, Iximprocystis, Thiocystis, Thiodictyon, Thiopedia,
Thiospirilliim;
– Subgrupa II : Globule de sulf apar in afara celulei: Ectothiorhodospira;
– Subgrupa III: Globule de sulf pot apărea și în afara celulei; cele mai multe tipuri
depind de substratul nutritiv. Ca exemple pot fi menționate Rhodobacter, Rhodocyclus,

20
Rhodomicrobium, Rhodopila, Rhodopseudomonas, Rhodospirill um, aceste celule bacteriene
crescând prin fotoasimilarea de compuși organici simpli;
– Subgrupa IV: Lipsesc membrane interne sau clorozomii, pereții celulelor de formă
spiralată nu conțin lipo -polizaharide. Celulele conțin bacterioclorofilă g și carotenoide . Nu
utilizează compuși cu sulf ca donor de electroni și sunt specii fotoheterotrofe. Ca exemplu se
poate menționa Heliobacillus;
– Subgrupa V: Globulele de sulf apar în afara celulei, dar niciodata înăuntru.
Bactericlorofila este localizată în clorozomi. Ac este bacterii asimilează substanțe organice
simple doar în prezența sulfului sau a bicarbonatilor. Exemple de astfel de bacterii:
Ancalochloris, Chlorobium, Pelodictyon, Prosthecochloris;
– Subgrupa VI: Celulele sunt dispuse în filamente multicelulare care prezinta motilitate
prin alunecare și utilizează pentru creștere substanțe organice; Exemple: Chloroflexus,
Chloronema, Heliothrix, Oscillochloris;
– Subgrupa VII: Celulele bacteriene cresc heterotrof în condiții aerobe; este exclus ca ele
să crească și în condiții anaerobe. Conțin bacterioclorofilă a și carotenoide. Ca exemplu se poate
menționa Erythrobacter.
Bacterii fotosintetice aerobe (oxice)
Bacteriile fotosintetice aerobe sunt bacterii unicelulare sau multicelulare care conțin
bacterioclorofilă a ș i realizează fotosinteza oxigenică. Ele conțin ficobilină, cu excepția grupei
proclorofitelor care nu conțin ficobilină dar conțin atât bacterioclorofila a cât și bacterioclorofila
b. Sunt în majoritate reprezentate de cianobacterii Gram -negative care prez intă doar membrană.
Nu conțin flageli dar se pot deplasa prin alunecare.
Pigmenții din structura lor sunt proteine precum ficobilina, ficoeritrina, ficocianina,
bacterioclorofila a și carotenoide dupa cum capsula de manta poate contine pigment galben sau
pigment rosu -albastru iar fotosinteza acestor specii bacteriene este oxigenică și autotrofă, dar
poate fi și chemoautotrofă [ 49-51]
Bacteriile fotosintetice aerobe se clasifică în urmatoarele 5 subgrupe [52]:
– Subgrupa I cuprinde bacterii unicelulare sau a gregate nefilamentoase de celule ținute
împreună cu ajutorul unor pereți exteriori sau unei matrici de tip gel. Diviziunea se realizează

21
prin fisiune binară pe unul, doua sau trei plane. Exemple de astfel de bacterii sunt: Gloeothece,
Synechococcus, Gloeoc apsa, Gloeobacter;
– Subgrupa II : Între membrii acestei subgrupe, diviziunea se realizeză prin fisiune
binară cu generarea de celule mai mici decat celule mama, sau prin fisiune multiplă și binară.
Exemple de bacterii din această subgrupă: Dermocorspa, Xenoc occus, Pleurocapsa;
– Subgrupa III : Fisiunea binară are loc într -un singur plan. Exemple: Spirulina,
Arthospira, Oscillatropia, Phormidium, Lyngbya;
– Subgrupa IV : Cylindrospermum, Anabaena, Nodularia, Calothrix, Nostoc.
– Subgrupa V : Fisiunea binară se produce periodic sau frecvent în mai mult de un plan,
dând naștere unor sisteme multiseriate sau ramificate. Ca exemple pot fi menționate: Stigonema,
Cyanobotrytis. Westicella, Loriella, Nostichopsis.
Bacteriile fotosintetice verzi sunt organisme strict aerobe, o bligat fotosintetice. Ele
utilizează hidrogen sulfurat H 2S, hidrogen H 2 sau tiosulfat ca donor de electroni (spre deosebire
de cianobacterii și alge care utilizează ca donor de electroni apa H 2O) și bioxid de carbon CO 2 ca
sursă de carbon [51].
Bacteriile fotosintetice purpurii sunt de două tipuri: bacteriile purpurii sulfuroase
(Chromatiaceae) care utilizează H 2S ca donor de electroni și bacteriile purpurii nesulfuroase
(Ectothiorhodaceae) al căror metabolism depinde de compușii organici din mediu, precum lipide
ce conțin acizi grasi cu catena scurtă. Majoritatea tipurilor de bacterii fotosintetice conțin
bacterioclorofilă astfel: cianobacteriile conțin bacterioclorofila a, bacteriile verzi conțin
bacterioclorofila c, d și mici cantitati a, bacteriile purpu rii conțin bacterioclorofilă a sau b. [49]
3.3.1.2 Bacterii nitrificatoare

Afinitatea pentru substrat a bacteriilor care consumă nutrienții din apele reziduale
determină compoziția speciilor bacteriene din apă. Diversitatea bacteriilor care oxidează amon iul
este ridicată în apele reziduale de natură domestică comparativ cu alte tipuri de ape uzate,
principala specie bacteriană responsabilă de nitrificare fiind Nitrosomonas sp. [52]. O altă specie
bacteriană responsabilă de nitrificare este Nitrosospira sp., abundența și echilibrul biologic între
cele două specii fiind determinate și de temperatura mediului, temperaturile mai joase favorizând
specia bacteriana Nitrosospira sp.

22
În ceea ce privește bacteriile care oxidează nitriții, creșterea și răspândirea s peciei
Nitrospira sp în apele reziduale, inclusiv a celor de acvacultură este favorizată de concentrații
reduse de oxigen dizolvat, în timp de abundență a Nitrobacter sp. Procesul e ste mai mare în
lunile de iarnă, în care nivelul de o xigen dizolvat este ma i ridicat [53]. Alți cercetători au
identificat și alte specii de bacterii care oxideză nitriții, precum Candidatus Nitrotoga arctica,
acestea putând coexista împreună cu Nitrospira sp. Speciile Nitrotoga sp. Rămân active la
concentrații de nitrit variate, prezența lor în apele reziduale fiind favorizată de temperaturi
scăzute [52] .
Microorganisme autotrofe care oxidează amoniul se regăsesc și în domeniul Archaea.
Echilibrul între microorganismele de tip Archaea care oxidează amoniul și speciile bacteriene
care oxidează amoniul depinde de concentrațiile de amoniu și apă. Astfel, în apele reziduale
bogate în amoniu precum cele provenite din stațiile de tratare municipale, abundența și
răspândirea bacteriilor este mult mai ridicată decât cea a microorganismel or Archaea, în timp ce
în apele al căror influent conține un nivel redus de amoniu s -a observa t o abundență a genelor
Archaea . Nivelul redus de Archaea este un indicator al sensibilității mai crescute a Archaea la
poluanții toxici față de speciile bacterie ne de oxidare a amoniului [52].
Succesul procesului de nitrificare este dat totuși de bacteriile heterotrofe, în ciuda
abundenței moderate sau reduse a nitrificatorilor autotrofi. În apele contaminate cu poluanți
organici și bogate în amoniu a fost observa tă creșterea și răspândirea bacteriilor nitrificatoare
heterotrofe Comamonas, Thauera, Paracoccus si Azoarcus [53]. Alte specii bacteriene
responsabile de nitrificarea heterotrofă sunt Pseudomonas sp. si Paracoccus sp. [54] .
3.3.1.3 Bacterii denitrificato are
Bacteriile denitrificatoare aparțin unei varietăți mari de grupe filogenetice, prin urmare
ele sunt dificil de investigat. În mod uzual, în apele reziduale cel mai frecvent întâlnite bacterii
denitrifiactoare sunt cele din speciile Thauera sp. [55].
Structura comunităților microbiene de bacterii denitrificatoare este influentață de tipul de
tehnologii de epurare utilizate. Astfel, cea mai mare diversitate de bacterii N 2O-reducatoare a
fost detectată în stațiile de tratare a apelor reziduale cu rezervoar e de denitrificare separate [56].
Măsurătorile efectuate la stațiile de epurare în ceea ce privește activitatea bacteriilor

23
debitrificatoare au evidentiat o denitrificare completă și o minimizare a emisiilor de oxizi azotosi
[55].
Nevoile diferite de subs trat organic specifice bacteriilor nitrificatoare și denitrificatoare
influențează distribuția spațială a acestora în reactoarele de epurare. Analizele efectuate la
sistemele de tratare a apelor contaminate cu poluanți organici au arătat că abundența bacte riilor
nitrificatoare este mai ridicată de -a lungul contactoarelor biologice rotative, în timp ce abundența
bacteriilor denitrificatoare care aparțin genului Rhodanobacter , Paracoccus , Thauera ,
și Azoarcus a fost consider abil mai scăzută în aceste zone [57].
3.3.1.4 Bacterii pentru eliminarea fosforului (organisme de acumulare polifosfați)
Îndepărtarea fosforului pe cale biologică se realizeză cu ajutorul bacteriilor care
acumulează fosfați, a căror creștere este stimulată de condiții combinate anaerobe/aer obe.
Unele bacterii sunt capabile să îndepărteze fosforul folosind nitrit sau nitrat ca acceptor
de electroni în procese de denitrificare (denumite organisme de acumulare polifosfați prin
denitrificare), ele folosind același bazin de apă cu substanțe organ ice pentru eliminarea az otului
și carbonului [58].
O astfel de specie destul de abundentă în sistemele de tratare ape este Accumulibacter sp.
care preia, în condiții anaerobe, acizii grași volatili și stochează polihidroxiacizi, simultan cu
eliberarea fosf atului și descompunerea glicogenului [59].
Altă specie bacteriană importantă, implicată în îndepărtarea fosforului, este Tetrasphaera
care nu stochează polihidroxiacizi și care consumă aminoacizi în loc de acizi grași volatili.
Această specie poate repreze nta pâna la 30 -35% din totalul speciilor comunității microbiene din
apele reziduale, în timp ce Accumulibacter sp. sunt mult mai puțin numeroase, ca. 3 -10% [20].
Prezența ambelor tipuri de bacterii de îndepărtare a fosforului depinde în mare măsură de
raportul carbon/fosfor și de rata de încărcare microbiană cu Accumulibacter sp., respectiv
Tetrasphaera sp. [63].
Alte specii bacteriene cu rol în îndepărtarea fosforului sunt Dechloromonas, capabile să
preia acetați, polifosfați și să stocheze polihidroxiaci zi, reducând nitriți/nitrați. Ponderea acestora
în comunitatea bacte riană este mult mai redusă, <3% [62].
Principalul competitor al bacteriilor de îndepartare a fosforului sunt bacteriile care
acumulează glicogen, acestea fiind în competiție cu primele în ceea ce privește consumul de

24
acizi grași volatili. Printre aceste organisme pot fi menționate Candidatus Competibacter
phosphatis (≤12 %) si Defluviicoccus vanus (9 %) [63].
Ca o concluzie generală privind diversitatea mare a populațiilor bacteriene impli cate în
descompunerea poluanților din apele reziduale, se poate afirma că îmbunătățirea gradului de
epurare a apelor poluate cu compuși organici proveniți din diverse activităti industriale, inclusiv
a celor de acvacultură, se poate realiza printr -o întele gere mai aprofundată a ecologiei
microbiene și a conexiunilor dintre speciile microbiene [64] .
3.4 Tratare a cuaternară
Scopul principal al tratamentului quaternar al apelor uzate este acela de a elimina
micropoluanții precum metalele grele, compușii organ ici toxici (peșticide, antibiotice, hormoni)
și mineralele solubile prin utilizarea plantelor, algelor, fungilor sau diferite procedee de
dezinfectare [65].
O metodă comună de tratare a apei este utilizarea de dezinfectanți chimici. Procesul de
dezinfecți e contribuie la eliminarea microorganismelor dăunătoare sănătății umane (bacterii,
virusuri), dar și pentru eliminarea sau diminuarea cantitativă a unor compuși cu miros urât [66],
[32]. Cei mai utilizați agenți chimici de dezinfecție sunt: clorul și compu și pe bază de Cl (NaClO
– hipoclorit de sodiu, ClO 2 – bioxid de Cl), bromul, iodul, permanganatul de potasiu, ioni de
argint sau de cupru, acizi și ozonul [33].
În ultimele decenii, din cauza creșterii accentuate a nivelului de poluare a apelor este
necesară găsirea de noi compuși chimici care să aibă capacitatea de a dezinfecta apa, de a
descompune contaminanții organici și anorganici din apă și apele uzate și de a elimina particulele
suspendate și metalele grele. Conform studiului efectuat de Talaiekh ozani et al . [35], compușii
chimici care îndeplinesc condițiile enumerate sunt ferații (IV) (FeO 42-).
De asemenea, tratamentul cu radiații UV sau ozon sunt două procedee performante de
eliminare a microorganismelor din apă [65].
În general, algele sunt c apabile să elimine din apele reziduale nutrienții (C, N 2, P, Ca, Fe,
Zn, Mg) prin mecanisme de biosorpție (asimilare), precipitare, volatilizare, nitrifiere, denitrifiere,
cu formare de biomasă [67]. A fost pus în evidența [68] ca N 2 și P pot fi eliminate din apele
reziduale cu ajutorul algelor la concentrații foarte mici de 2.2 mg/l, respectiv 0.15 mg/l. Shi et al

25
[69] au arătat că estrogenii naturali și sintetici pot fi eliminați în mod eficient în sistemele de
tratare a apei bazate pe alge.
Chlorella s orokiniana [72] a fost utilizată pentru eliminarea, în procente cuprinse între
60-100%, a diclofenacului, ibuprofenului, paracetamolului și metroprololului prin mecanisme de
biodegradare și fotoliză. Eliminarea N 2 și P a fost apropiată de 100% la finalul ex perimentului.
De asemenea, este cunoscut faptul că anumite alge marine sau de apă dulce sunt capabile
să rețină metalele grele din soluții apoase și să stocheze în celulele lor metale ca: magneziu (Mg),
calciu (Ca), cobalt (Co), cupru (Cu), seleniu (Se), zinc (Zn), crom (Cr) plumb (Pb), prin
mecanisme de transport biologic activ [67].
Algele albastre -verzi (cianobacterii) alături de algele verzi precum Chlorella se găsesc în
fruntea clasamentului privind eficiența în eliminarea metalelor grele din soluț ii apoase, dar și a
bacteriilor de tipul coliform i fecali (care nu pot coexista cu clorofila) [73].
Majoritatea lucrărilor de specialitate care fac referire la eficiența ridicată în eliminarea
metalelor grele a biomasei algale moarte, arată că celulele m oarte pot absorbi mai multe metale
decât celulele vii [72 , 73].
Anumite specii de fungi, așa cum sunt Trametes versicolor și Phanerochaete
chrysosporium prezintă capacitate de degradare a unor compuși activi farmaceutici și au arătat
rezultate promițătoar e la utilizarea în bioreactoare de tratare a apei [74]. P. chrysosporium a fost
utilizat cu succes în eliminarea continuă a unor analgezice și antiinflamatoare ca diclofenac,
ibuprofen, naproxen, dar și la medicamente psihiatrice precum carbamazepină [75].
In acest context studiile noastre s -au focalizat in identificarea unor noi noi tulpini
microbiene cu grade diferite de rezistenta la oxitetraciclina si u tilizarea lor in epurarea unor
apelor sintetice uzate produse in laborator si contaminate cu antibiot ic care mimeaza apele uzate
provenite din acvacultura .

26
PARTEA EXPERIMEN TAL Ă
CAPITOLUL 4 – MATERIALE ȘI METODE
4.1 Pregatirea liofilizatului
În scopul identific ării unor specii noi de microorganisme cu valențe î n epurarea apelor
uzate s -a utilizat un co nsorțiu miocrobian drept sursă de microorganisme. BFL 60 00HC – este un
produs dezvoltat de BioFuture Ltd. Irlanda ș i este format dintr -un amestec de microorganisme ce
prezintă o capacitate ridicată de a degrada diferite clase de compuși chimici din clasa
hidrocarburilor de tipul celor alifatice, aromatice si compusi organici polari. Utilizarea BFL
600HC cu diferiți nutrienți conduce la accelerarea proceselor de degradare a hidrocarburilor în
CO2 și apă [76] .
Pentru a izola o serie de microorganisme s -a real izat h idratarea liofilizatului BFL
6000HC . Procesul s-a realizat într-un pahar Berzelius cu 100 mL ap ă steril ă îmbogăț ită cu
oxigen, prin barbotare cu o pomp ă de aer (presiune: 0,010 Pa, debit: 1,5 L/min) în care s -a
adaugat o cantitate de 10 g de liofiliz at. Dup ă 4 ore s -au adă ugat 10 mL de ulei alimentar, iar
după 12 ore s -au inserat nutrienț i (5 g de fain ă de pe ște). Dup ă 24 de ore , inoculul a fost gata de
utilizare. În timpul procesului de fermentaț ie s-a verificat densitatea optică cu ajutorul
densitom etrului Biosan McFarland (Fig. 4)

Fig. 4 – Densitometru Biosan McFarland

27
4.2 Realizarea mediului de cultur ă Luria Broth
Prepararea mediului de cultur ă lichid Luria Broth (LB) s-a realizat prin c ântărirea a 10 g
de pepton ă, 5 g de NaCl, 5 g de extract de drojdie , peste care s -a adăugat 1 L de ap ă distilat ă.
Mediul de cultur ă s-a sterilizat în autoclav la 121șC (Autoclav Syste c VX -65) timp de 15 minute.
După răcire mediul a fost repartizat în tuburi de sticl ă. In mod similar, s -a procedat și în cazul
mediului de cultură solid, acesta avâ nd in plus 12 g de agar. Mediul de cultur ă solid, dup ă
sterilizare, a fost re partizat î n plăci Petri (25 mL/placă ).
4.3 Izolarea ș i identificarea tulpinilor bacteriene
Izolarea microorganismelor
S-au prelevat 100 µl de me diu lichid LB cu bacteria hidratată cu densitatea optică de 0.5
McFarland (1.5 x 108 CFU/mL) și s-a pus pe placi Petri cu mediu solid. După ce bacteriile s -au
dezvoltat pe placă, s-a efectuat însămânț area altor plăci prin tehnica epuiz ării ansei. Plăcile
însămânțate au fost incubat e la 37șC pentru 24 ore. Dup ă 24 de ore s -au izolat coloniile diferite
din punct de vedere morfologic prin însămânțare în alte pl ăci cu mediu solid.
Identificarea microorganismelor
Coloniile izolate au fost identificate folosind sistemul API 20E (Biomerieux) în mai mulți
pași: s-a realizat un inocul cu densitatea optic ă de 0.5 McFarland (1.5 x 108 CFU/mL); s -au
repartizat 5 mL de ap ă distilat ă în tăvița galeriei; galeria API 20E a fost asezat ă în tăviță; cu o
pipet ă sterilă s-a prelevat o singur ă colonie caracteristică ș i a fost emu lsionată î n mediu cu NaCl
0.85% (5mL) pentru a ob ține o suspensie omogen ă. Cu aceea și pipet ă se distribuie suspensia
bacterian ă în tuburile galeriei:
– pentru CIT, VP, GEL, s -a umpl ut atât tubul c ât și godeul;
– pentru celelalte teste s-au umplut doar tuburile;
– pentru testele ADH, LDC, ODC, H 2S, URE s-a creeat anaerobioza prin distribuirea de
ulei mineral în godeu.
S-a închis cutia de incubare, s -a incubat galeria la 37 șC, timp de 18 -24 ore. Dup ă
încheiere a perioadei de incubare s -a citit stripul galeriei consultând tabelul de citire. Dacă
numărul testelor pozitive ( înaintea adă ugării reactivilor) este mai mic de 3, se reincubeaz ă stripul
încă 24 de ore f ără a mai adăuga vreun reactiv. Dac ă 3 sau mai multe teste sunt pozitive, se

28
noteaz ă toate reac țiile spontane pe fișa de rezultate și apoi s e identific ă testele ce necesit ă
adăuga re de reactivi (TDA, IND, VP).
Identificarea este obținută cu ajutorul profilului numeric. Î n fișa de rezultate, testele sunt
împărțite în grupuri de c âte 3, fiecare grup av ând valorile 1, 2 ș i 4, deja ind icate pentru fiecare
test. Adunâ nd valorile corespunz ătoare reacț iilor pozitive din cadrul fiecarui grup, se obț ine un
număr de 7 cifre pentru cele 20 de teste ale stripului. Reac ția oxid azei constituie al 21 -lea test ș i
are valoarea 4 dac ă este pozitiv ă. Identificarea speciei bacteriene s-a realizat prin utilizarea soft –
ului de identificare apiweb.
4.4 Realizarea curbei de creștere a bacteriilor identificate în prezența oxitetraci clinei
(OTC)
Pentru a eviden ția efectul antibioticului asupra tulpinilor bacteriene identificate, s -a
realizat o curb ă de cre ștere folosin d valorile de densitate optic ă [DO] cu ajutorului unui c ititor
Elisa Tecan (Fig. 5)]. DO au fost m ăsurate la tempera tura de 25 -30°C, la o lungime de undă la
595 nm, din or ă în oră, timp de 20 h.

Fig. 5 – Cititor Tecan
Pentru acest experiment s -au folosit diferite concentra ții de oxitetraciclin ă (de uz
veterinar) [ 77]. Soluț ia ini țială de oxiteracicl ină a fost de 1% ( m/v). Curba a fost realizat ă într-o
placă cu 24 de godeuri, fiecare godeu av ând un volum de 2 mL. Primul godeu a fost umplut cu
mediu LB lichid, urm ătoarele două cu mediu LB și inocul bacterian cu DO de 0,05.
Concentraț iile folosite au fost de 0,1 µg/mL, 0 ,2 µg/mL, 0,4 µg/mL, 1 µg/mL, 2 µg/mL. Din
fiecare concentra ție au fost umplute câ te 3 godeuri.

29
Testarea viabilității .
După citirea densit ății optice, s -a realizat un test pentru viabilitate celular ă, cu re sazurină
astfel: mediul ț inut la incubat a fost tranferat î n tuburi Eppendorf (câte 1,5 mL de fiecare tub),
peste care s -a adăugat un volum de 30 µl de resazurin ă (Fig 6,7 ). Schimbarea culorii lichidului
de la albastru -închis la roz indică faptul că în acesta există celule viabile [ 78].

Fig.6 – Teste de viabilitate cu resazurină P.
aeurginosa (Rezultate personale)
Fig. 7 – Teste de viabilitate cu resazurină C.
violaceum (Rezultate personale)
Restul de lichid de 0,5 mL a fost î ndep ărtat din godeuri. P entru a vedea dacă tulpinile
bacteriene au adera t pe plac ă și dacă au format biofilm, în godeurile goale s -au adăugat 0,5 mL
de apă distilată și 50 µl de resazurin ă [fig.8]. Placa a fost pus ă pe un s haker Heidolph Titramax
101 pentru 1h la 300 de rota ții/min, iar mai apoi s -a citit DO și s -au urmarit și modifică rile de
culoare.
În urma acestui test s -au determinat concentraț iile de oxitetraciclin ă care nu î mpiedic ă
dezvoltarea bacteriilor , cele care încetinesc cre șterea lor și cele c are conduc la distrugerea lor.

30

Fig. 8 – Test cu resazurin ă – biofilm P. aeurginosa și C. violaceum : mediu LB (A1/C1); fără
OTC (A2, A3/C2,C3); 0,1 g/ml OTC (A4,A5,A6/C4,C5,C6); 0,2 g/ml OTC
(B1,B2,B3/D1,D2,D3); 0,4 g/ml OTC (B4,B5,B6/D4,D5,D6) (Rezultate personale)
4.5 Testarea eficiacității de reținere a bacteriilor a u nor biofiltre în mediu lichid LB
Dezvoltarea bacteriilor fă ră oxitetraciclin ă și cu diferite concentraț ii de oxitetraciclin ă,
precum și capacitatea de aderare la substrat, s -a făcut cu ajutorul a 6 tipuri de biofiltre de plastic
(Fig. 9)

F1 (D: 15 mm; H: 11 mm; Capacitate de
reținere apă (%): 1,18 )
F2 (D: 15 mm; H: 9,3 mm; Capacitate de
reținere apă (%): 7,51)

31

F3 (D: 15 mm; H: 8,8 mm; Capacitate de
reținere apă (%): 6,81)

F4 (D: 15 mm; H: 10,5 mm; Capacitate de
reținere apă (%): 2,32)

F5 (D: 17 mm; H: 17,9 mm; Capacitate de
reținere apă (%): 14,33 )
F6 (D: 14,8 mm; H: 14,5 mm; Capacitate de
reținere apă (%): 6,38)
Fig. 9 – Tipuri de biofiltre utilizate
a) Dezvoltarea bacteriilor f ără oxiteraciclină a fost urmarită prin introducerea acestor
biofiltre în tuburi de 50 mL cu capacul perforat pentru a permite p ătrunderea aerului, speciile de
bacterii fiind aerobe. În fiecare tub s -a pus un volum de 20 de mL de mediu lichid LB și inocul
bacterian cu DO de 0,05 . Tuburile au fost pă strate pe Shaker tim p de 7 zile la o temperatură de
30°C.
La mediul cu inocul bacterian în care au stat aceste biofiltre s -au făcut test e de viabilitate
celular ă [fig.10,11 ] și s-a măsurat ș i DO cu ajutorul unui spectofotometru UV-Vis V -570
(JASCO, JP) , la 600 de nm pentru a urmării dezvoltarea bacteriilor în prezența fiecarui filtru .
Pentru a evidenția formarea biofilmului pe fi ltrele folosite, acestea s -au câ ntărit înainte și dup ă
terminarea experiment ului.

32

Fig. 10 – Test de viabilitate biofiltru în mediu
LB fără OTC: P. aeruginosa
Fig. 11 – Test de viabilitate biofiltru în mediu
LB fără OTC: C.violaceum

Pentru a afla c âte unități formatoare de colonii (CFU) avem î ntr-un mililitru de mediu cu
inocul din fiecare tub s-a folosit densitometrul Biosan Mc Farland, care inre gistraz ă DO la 590
nm.
Filtrele din tuburi au fost puse la ultrasonicare in tuburi în 20 mL de apă distilat ă, pe o
baie cu ultrasunete (Cuva JP0205) pentru 2 min. Viabilitatea celulelor după ultrasonicare a fost
testată cu resazurină [12,13 ]. De asemenea, au fost realizate măsuratori de DO pe lichidele din
tuburi (Cititor Tecan) la 550 nm, incubate și agitate timp de 30 de secunde înainte de citire în
același echipament .

Fig.12 – Teste de viabilitate cu resazurină
efectuate pe lichid după ultrasonicar ea filtrelor
P.aeruginosa
Fig.13 – Teste de viabilitate cu resazurină
efectuate pe lichid după ultrasonicarea filtrelor
C. violaceum

33
b) Dezvoltarea bacteriilor în prezenț a antibioticului a fost testat ă tot în tuburi cu mediu
LB lichid, î n acelea și con diții ca și cele f ără oxitetraciclină , fiind testate î n ace lași mod pentru
viabilitatea celular ă și aderarea la biofiltre ca la subpunctul a) . In fiecare tub, pentru fiecare
biofiltru au fost puse diferi te concentraț ii de antibiotic: 0,1 µg/mL, 0,2 µg/mL ș i 0,4 µg/mL,
păstrându-se DO a inoculului bacterian la 0 ,05.
4.6 Testarea eficiacității de reținere a bacteriilor a unor biofiltre în mediu sintetic
După stabilirea unei concentra ții de oxitetraciclin ă, agreat ă de bacterii s -a realizat un
mediu sintetic – pentru un litru de mediu s-a folosit o solu ție stock cu pH= 5,8, în care s -au pus
10 mL din fiecare solu ție de MgSO 4 ( 23,6 g/100mL), Ca(N O3)2 (13,6 g/100mL), KHPO 4 (13,6
g/mL), KNO 3 (10,1 g/mL), 10 mL [Micronutrienti H 3BO 3 (2,86 g/l), MgCl 2 (1,82 g /l), ZnSO 4
(0 ,22 g/l), NaMoO 4 (0,09 g/l), CuSO 4 (0,09 g/l)] , 10 mL Fe -EDTA [(0,121 g/250mL FeCl 3),
EDTA (0,375 g/250mL)], 400 mL solu ție cu extract de drojdie și bactopepton ă și 560 mL de apă
distilat ă [79]. Modul de caracterizare al biofiltrelor a fost identic cu cel de la pct. 3.1.5.
Pe acest mediu s -a realizat o curb ă de creș tere a bacteriilor, pentru 20 de ore, din or ă în
oră, pentru a verifica dac ă bacteriile se dezvolt ă la fel de bine ca în mediul LB, dar și pentru a
vedea dac ă concentra țiile agre ate de aceste specii r ămân acelea și ca în mediul LB. Testele au fost
identice cu cele de la pct. 3.1.4 – test cu resazurin ă pentru identificarea și formarea de biofilm
(Fig. 14) , pentru testarea viabilit ății a lichidu lui în care au stat biofiltrele (Fig. 15,16) și testarea
viabilit ății dupa ultrasonicare (fig.17). În tuburi le cu biofiltre și mediu sintetic s -a utilizat
concentrația de 0,2 µg/mL OTC (Fig. 18). Concentrați a a fost aleasă pe baza rezultatelor testelor
din curba de creștere (Fig.19) .

Fig. 14 – Test de viabilitate – formarea de
biofilm în mediu sintetic: 0,2 g/ml OTC

Fig. 15 – Teste de viabilitate cu resazurină –
mediu sintetic cu inocul bacterian de P.
aeurginosa , cu diferite concentrații de OTC

34

Fig. 16 – Teste de viabilitate cu resazur ină–
mediu sintetic cu inocul bacterian de
C.violaceum , cu diferite concentrații de OTC
Fig. 17 – Teste de viabilitate cu resazurină
efectuate pe lichid cu P.aeruginosa și C.
violaceum după ultrasonicarea filtrelor

Fig. 18 Tuburi cu filtre în mediu si ntetic: 0,2
µg/mL OTC
Fig. 19 – Test de viabilitate cu resazurină,
inocul bacterian în mediu sintetic cu diferite
concentrații de OTC: 0,1 g/ml OTC
(A4,A5,A6/C4,C5,C6); 0,2 g/ml OTC
(B1,B2,B3/D1,D2,D3); 0,4 g/ml OTC
(B4,B5,B6/D4,D5,D6)
4.7 Determina rea spectrofotometric ă a concentra țiilor de ioni de amoniu, nitrat, nitrit și
fosfor
4.7.1 Determinarea ionului de amoniu (NH 4+)
Principiul metodei de determinare a ionului de amoniu are la bază reacția amoniacului
(NH 3) cu fenat în soluție alcalină [ 80]. Pentru realizarea curbei de calibrare s -a folosit o soluți e
stock de 100 ppm de NH4 -N și apă distilată, realizându -se 5 soluțiii corespunzătoare
concentrațiilor din tabelul 3:

35
Tabelul 3 – Soluții standard pentru realizarea curbei de calibrare
Soluți e standard Soluție stock de 100 ppm
(mL) Apă distilată
(mL) Concentrația
(µg NH4 -N/L)
1 0,1 9,9 1000
2 0,075 9,925 750
3 0,050 9,950 500
4 0,025 9,975 250
5 0 10 0
Peste fi ecare prob ă de soluție standard, precum și peste proba cu inocul bacterian î n
mediu sintetic s-au adăugat 40 µl soluție de fenol -alcool (1 g de fenol în etanol 95% adus la
volum constant de 10 mL), 40 µl soluție de nitroprusiat de sodiu (0,5 g de nitroprusiat de sodiu
în apă distilată și adus la volum constant de 10 mL) și 100 µl reactiv oxidant (Rivex – hipoclorit
de sodiu). După amestecare, soluțiile au fost ținute în repaus timp de 1h, agitându -se periodic. La
terminarea perioadei de r epaus a fost masurata DO pe fiecare soluție la 630 nm, folosindu -se ca
referinț ă apa di stilată. Valorile de DO au fost folosit e pentru generarea curbei de calibrare. Curba
de calibrare a fost folosită pentru determinarea concentrație de ion de amoniu din proba cu inocul
bacterian în mediu sintetic.
4.7.2 Determinarea ionului nitrat
Reacția de nitrare a acidului salicilic în condiții foarte acide formează cu complex ce
prezintă o absorbanță maximă la 410 nm în soluții bazice (pH> 12). Absorbția cromoforului este
direct proporțională cu cantitatea de nitrat -N prezentă. Ionii de amoniu , nitrit și clorură nu
interferează [ 81].
Pentru realizarea curbei de calibrare de det erminare a cantității de ion nitrat s -au
pregatit 6 soluț ii standard folosind o soluție stock de 0,25 g/L NO 3-N (Tabelul 4 ):
Tabelul 4 – Soluții standard pentru realizar ea curbei de calibrare
Soluții standard Soluție stock de
0,25 g/L NO 3-N
(mL) Apă distilată
(mL) Concentrație
(µg NO 3-N/0,25 ml )
1 0,25 0 62,5
2 0,20 0,05 50
3 0,15 0,10 37,5
4 0,10 0,15 25
5 0,05 0,20 12,5
6 0 0,25 0

36
Peste fiecare probă de soluți e standard , precum și peste proba cu inocul bacterian în
mediu sintetic, s -au adăugat 0,8 ml soluție de acid salicilic – H2SO 4 (0,5 g acid salicilic în 10 mL
de H 2SO 4). Probele au fost lăsate în repaus la temperatura camerei timp de 20 de minute, apo i s-
au adăugat 19 m L de soluție de NaOH 2N. Pe probele aduse la temperatura camerei s -au realizat
măsurători de DO la 410 nm, folosindu -se ca referință apa distilată. Curba de calibrare a fost
folosită pentru determinarea concentrație de ion nitrat din proba cu inocul bacterian în mediu
sintetic.
4.7.3 Determinarea concentrație ionului nitritului prin derivatizare cu captopril
Azotatul de sodiu nitrozilează rapid captoprilul în condiții acide, ceea ce duce la
producerea unui derivat cu benzile de absorbție depen dente de concentrație la 333 nm și 546 nm
[82].
Pentru realizarea curbei de calibrare de determinare a cantității de ion nitrit s -au
pregatit 6 soluții standard folosind o soluție standard de azotat de sodiu (Tabelul 5 ) și apă
acidulată.
Tabelul 5 – Soluții standard pentru realizarea curbei de calibrare
Soluție standard Soluție standard NaNO 3
(mL) Apă acidulată (mL)
1 0 0,5
2 0,1 0,4
3 0,2 0,3
4 0,3 0,2
5 0,4 0,1
6 0,5 0
Peste fiecare probă de soluție standard, precum și peste proba cu inocul bac terian în
mediu sintetic, s -au adăugat 0,05 ml reactiv captopril, după care soluția standard s-a agitat și s -a
masurat DO la 333 nm, pentru a se genera curba de calibrare. Curba de calibrare a fost folosită
pentru determinarea concentrație de ion nitrit di n proba cu inocul bacterian în mediu sintetic.
4.7.4 Determinarea concentrație de fosfor
Pentru realizarea curbei de calibrare de determinare a cantității fosfor s -au pregatit 6
soluții standard folosind o soluție standard de fosfor cu o concentrație de P 20 µg /mL și apă
distilată (Tabelul 6 ), măsurandu -se DO la 660 nm (față de apă distilată)

37
Tabelul 6 – Soluții standard pentru realizarea curbei de calibrare
Soluții standard Soluție standard P
(mL) Apă distilată
(mL) Concentrație P
(µg/mL)
1 0 4 0
2 0,25 3,75 5
3 0,50 3,50 10
4 0,75 3,25 15
5 1 3 20
6 1,25 2,75 25

Peste fiecare probă de soluție standard, precum și peste proba cu inocul bacterian în
mediu sintetic, s -au pipetat câte 0,8 ml soluție de molibdat de amoniu (2,5% în H 2SO 4 5N) și 0,2
ml de soluție reducătoare de eiconogen (6 g metabisulfit de sodiu, 0,2 g sulfit de sodiu și 0,1 g
acid 1 -amino -2-naftol -4-sulfonic dizolvat în apă și adusă la 80 ml volum final).

38
CAPITOLUL 5 – REZULTATE ȘI DISCUȚ II
5.1. Izolarea și identificarea s peciilor bacteriene
După hidratarea liofilizatului, speciile bacetriene au fost însămânțate în placi cu mediu
solid LB. Pe aceste placi au crescut două colonii diferite morfologic (I și II) . Aceste colonii au
fost izolate și însăm ânțate pe placi diferite (Fig . 20-22). Pe prima placă (Fig.20 ) s-a dezvoltat o
colonie cu formă circulară cu margini întregi , cu aspect cremos de culoare galben -pai, ce prezintă
un fenomen de f luorescență în lumină UV (Fig. 21 ).

Fig. 20 – Placă însămânțată cu colonia I
Fig. 21 – Fluorescența în lumină UV a
coloniei I
Cea de -a doua placă a prezentat o colonie mare (cca. 4 cm), cu suprafață turtită, margini
lobate și formă ne regulată de culoare albă (Fig. 22 ). Această specie nu a prezenta fluorescență l
alumina UV.

Fig. 22 – Placă însămânțată cu colonia II
Speciile izolate au fost identificate cu ajutorul testului API 20E (Fig. 23,24) și folosind
softul apiweb conform caruia a fost identificată în colonia I specia Pseudomonas aeruginosa (Ps)
(% ID: 98 %), iar în colonia II specia Chromobacterium violaceum (Cv) (% ID: 94 %).

39
P. aeruginosa este reprezentată de bacili mobili Gram -negativi, facultativ anaerobi, citrat,
catalază și oxidază pozitiv, habitatul acestora fiind în sol, apă, pe pielea omului etc.; Se dezvoltă
în atmosferă n ormală, dar și în atmosferă cu oxigen scăzut, colonizând astfel multe medii
naturale și artificiale [83]; Metabolizează o gamă largă de substante organice -sursa de carbon,
este capabilă să descompună hidrocarburile și a fost folosită pentru a descompune ul eiul din
scurgerile de petrol [84]; prezintă rezistență intrinsecă la antibiotice, unele tulpini ale acestei
specii având si o multirezistență la antibiotice; are capacitatea de a forma biofilme [85].
Chromobacterium violaceum este o specie mobilă, cocobac ilară, Gram negativă,
facultativ anaerobă, catalază și oxidază pozitiv; Fermenteaza glucoza, trehaloza, N –
acetilglucozamina și gluconatul, dar nu si L -arabinoza, D -galactoza si D -maltoza; Sintetizează
un antibiotic natural, violaceina, ce confera un luciu metalic violet închis coloniilor crescute în
mediu solid, colonii care sunt netede, usor convexe [86]. Unele specii izolate pot demonstra un
nivel ridicat de rezistență la o gama largă de antibiotice [87].
Fenomenul de fluorescența observat în cazul coloni ei I este specifică speci ei P.
aeruginosa , fiind în acord cu rezultatele testului API 20E [ 88].

Fig. 23 – Test Api20E – P. Aeruginosa

Fig. 24 – Test Api20E – C.Violaceum

40
5.2 Testarea eficacității de reținere a bacteriilor a unor biofiltre cu și fă ră OTC în mediu
LB
În graficul din figura 25 este reprezentată variația masei de film bacterian în funcție de
tipul de filtru utilizat și de specia de bacterii luată în lucru.

Fig. 25 – Variația masei de biofilm în funcție de tipul de filtru și de specia de bacterii . Fără OTC.
Pentru specia P. aeruginosa se observ ă o depunere substanțială de biomasă microbiană
pe filtrele F5 și F6, adică circa 0,05 grame în valoare medie, în timp ce depunerea microbiană pe
filtrele F2, F3 și F4 este mult mai redusă, de ci rca 0,01 g, fiind ușor mai pronunțată pentru filtrul
F3. Cea mai slabă depunere de masă microbiană pe suportul filtrant s -a înregistrat pentru filtrul
F1. O comportare asemănătoare în ceea ce privește afinitatea masei microbiene pentru
materialele filtrant e s-a observat și în cazul speciei C. violaceum , cea mai mare reținere pe filtru
înregistrându -se pentru filtrul F5, adică circa 0,078 g. Filtrele F4 și F6 au prezentat o încărcare
microbiană bună, adică o bună reținere de masă microbiană, de circa 0,06 g în valoare medie,
afinitatea speciei C. violaceum fiind ușor mai pronunțată pentru filtrul F6. Filtrele F1, F2 și F3 au
prezentat o eficiență de reținere a speciei C. violaceum relativ redusă, de circa 0,02 g masa
bacteriană, însă semnificativ mai bună dec ât eficiența de reținere înregistrată pentru specia P.
aeruginosa.
Aceste rezultate de evaluare gravimetrică a eficienței de reținere sunt foarte importante în
practica industrială în deciderea asupra tipului de biofiltru care poate oferi o epurare mai
eficientă a apei uzate în funcție de anumite specii bacteriene cu abundență ridicată în mediul
acvatic specific [ 46].

41
Efectul utilizării antibioticului oxitetraciclină asupra eficienței de epurare a apelor de
acvacultură prin folosirea biofiltrelor, pentru ape inoculate cu bacterii din speciile P. aeruginosa ,
respectiv C.violaceum, este repreze ntat în graficele din figurile 26 si 27 . Pentru aceste
experimente s -au utilizat trei concentrații diferite de antibiotic: 0,1 µg/mL , 0,2 µg/mL și 0,4
µg/mL . Utilizare a oxitetraciclinei în cercetările privind eficiența de bioepurare a fost selectată
având la bază studii de literatură [ 77].
Se constată că pentru specia P. aeruginosa , o concentrație de antibiotic oxitetraciclină de
0,1 µg/mL în mediul de cultură a avut c a efect o intensificare de 3 -4 ori a reținerii de masă
microbiană pe filtru, față de cazul utilizării biofiltrelor în mediu de cultură fără adaos de
antibiotic. În contradicție cu această comportare, adaosul de oxitetraciclină de concentrație 0,1
µg/mL a produs o reducere a depunerii de masă bacteriană pe filtrele F5 și F6, față de cazul în
care mediul de cultură nu a fost tratat cu antibiotic. Această comportare indică faptul că utilizarea
de antibiotice în apele reziduale crește eficiența de filtrare biol ogică a unor biofiltre și scade
eficiența altor biofiltre, pentru specia bacteriană P. aeruginosa. Tratarea cu antibiotic OTC nu a
afectat eficiența de biofiltrare a filtrului F2, dar a crescut de circa 5 ori încărcarea bacteriană pe
filtrul F1, față de ex perimentul anterior, fără aplicarea de antibiotic. O concentrație de antibiotic
de 0,2 µg/mL OTC are o comportare similară ca în cazul utilizării concentrației de 0,1 µg/mL ,
eficiența de reținere pe biofiltre fiind afectată negativ față de mediul de cultur ă netratat.
Concentrația de 0,4 µg/mL antibiotic OTC a facilitat reținerea de masă bacteriană din specia P.
aeruginosa pe filtrul F1, dar pentru toate celelalte filtre eficiența de bioepurare în apele tratate cu
antibiotic OTC de concentrație 0,4 µg/mL este diminuată cu 10 -60%.

Fig. 2 6 – Variația masei de film cu tipul de filtru pentru mediul inculat cu P. aeruginosa
și tratat cu OTC

42
În cazul speciei C. violaceum , utilizarea de antibiotic OTC de concentrație 0,1 µg/mL nu
a afectat eficiența de bioepurare a filtrelor F1, F2 și F3 dar a redus semnificativ reținerea de masă
bacteriană pe filtrele F4, F5 și F6 (Fig . 27). Concentrația de OTC de 0,2 µg/mL a avut ca efect o
intensificare de 2,5 ori a reținerii de masă bacteriană pe filtrul F1, celelalte filtre n efiind afectate
într-o măsură vizibilă.
Același efect de intensificare a efectului pentru biofiltrul F1, însă ușor mai redus, s -a
constatat și în cazul utilizării de antibiotic OTC de concentrație 0,4 µg/mL. Pentru toate celelalte
biofiltre, utilizarea de antibiotic în mediul de cultură a redus eficiența de bioepurare a acestora cu
50-80% față de situația în care mediul de cultură nu a conținut antibiotic.
Această observație experimentală indică faptul că prezenta antibioticelor în mediul de
cultură în ca re se află specii bacteriene de diverse tipuri, reduce nivelul de eficiență al biofiltrelor
pentru speciile bacteriene care se dovedesc sensibile la antibioticul prezent în mediu. [16, 77].

Fig. 27 – Variația masei de film cu tipul de filtru pentru mediu l inculat cu C.violaceum
și tratat cu OTC
Figura 28 prezintă răspunsul biofiltrelor la efectul antibioticului OTC de concentrație 0,1
µg/mL , pentru cele două specii bacteriene utilizate. Un efect de intensificare al eficienței de
reținere a speciei P. aer uginosa s-a observat pentru filtrele F3 și F4, in timp ce eficiența de
reținere a speciei C. violaceum a fost mai pronunțată pentru filtrul F1.

43

Fig. 28 – Efectul antibioticului de 0,1 µg/mL asupra eficienței biofiltrelor în funcție de speciile
bacteriene utilizate
În figurile 29 și 30 de mai jos este prezentat efectul antibioticului OTC de concentrație
0,2 µg/mL asupra eficienței de reținere a biofiltrelor pentru cele două specii bacteriene studiate.
Ca și în cazul concentrației de 0,1 µg/mL , și aici s -a observat un efect general de diminuare a
potențialului de bioepurare prin intermediul biofiltrelor ca urmare a utilizării de antibiotice,
eficiența de bioepurare fiind invers proporțională cu nivelul de concentrație de antibiotic utilizat,
cu excepția biof iltrului F1 în care utilizarea de antibiotic OTC de concentrații 0,2 µg/mL și 0,4
µg/mL a produs o îmbunătățire a reținerii de biomasă bacteriană pe suportul filtrant.

Fig. 29 – Efectul antibioticului de 0,2 µg/mL asupra eficienței biofiltrelor în funcți e de speciile
bacteriene utilizate

44
Comparând comportarea celor două specii bacteriene la diferitele concentrații de
antibiotic din mediul de cultură, se poate afirma că specia C. violaceum a fost mai puternic
influențată de efectul antibioticului OTC decât specia P. aeruginosa , în sensul dezvoltării unei
încărcări de masă microbiană pe suporturile filtrante mai redusă, exceptând biofiltrele F1 si F6,
ca urmare a unei sensibilități mai mari a C. violaceum la antibioticul luat in lucru.

Fig. 30 – Efectul antibioticului de 0,4 µg/mL asupra eficienței biofiltrelor în funcție de speciile
bacteriene utilizate
Influența concentrației antibioticului OTC asupra dezvoltării bacteriene, precum și
capacitatea de reținere a fiecărui biofiltru au fost evaluate prin de terminarea densității optice a
lichidului reprezentat de mediul de cultură tratat cu antibiotic. Masa bacteriană care nu a fost
reținută de biofiltre se regăsește în mediul de cultură, dezvoltarea acesteia putând fi astfel
investigată.
În graficele din fig ura 31 este reprezentată densitatea optică a speciei P. aeruginosa
prezentă în mediul de cultură lichid, tratat cu antibiotic în diferite concentrații, adică 0,1 µg/mL ,
0,2 µg/mL și 0,4 µg/mL , după îndepărtarea biofiltrelor cu masa bacteriană reținută parț ial.
Se observă că o concentrație de OTC de 0,1 µg/mL în mediul de cultură a determinat o
scădere a valorilor densității optice a mediului lichid cu masă bacteriană pentru toate biofiltrele
cu excepția biofiltrului F4 în care încărcarea mediului cu specia P. aeruginosa este ușor mai
mare față de mediul netratat cu antibiotic. Același comportament de scădere a încărcării
microbiene în mediul de cultură lichid se observă și pentru o concentrație de antibiotic de 0,2

45
µg/mL , cu excepția biofiltrului F4 unde cr eșterea densității optice a lichidului încărcat microbian
a fost semnificativ mai mare față de mediul de cultură netratat. La o concentrație de antibiotic
mai mare, adică 0,4 µg/mL , s-a înregistrat o tendință de creștere a densității optice pentru mediile
lichide care au conținut biofiltrele F1, F2 și F3, în timp ce mediul în care a fost amplasat
biofiltrul F4 a înregistrat o creștere a densității optice, iar mediile expuse biofiltrelor F5 si F6 au
păstrat o scădere aproape nesemnificativă a densității opti ce față de concentrația de antibiotic de
0,2 µg/mL .

Fig. 31 – Variația densității optice a mediului cu P. aeruginosa la diferite concentrații de
antibiotic
O creștere a densității optice pentru mediile cu specia bacteriana P. aeruginosa tratate cu
antib iotic OTC în concentrație mai ridicată, de 0,4 µg/mL , ar putea fi pusă pe seama acomodării
speciei bacteriene cu antibioticul din mediu, efectul negativ al antibioticului fiind mai pronunțat
la concentrații mai mici.
Aspecte privind acomodarea speciilor b acteriene la antibioticul prezent în mediu au fost
prezentate în numeroase cercetări, rezultatele obținute în această lucrare fiind in concordanță cu
cele menționate în alte studii [ 16, 18].
În cazul speciei bacteriene C.violaceum (Fig. 32) , efectul antibi oticului OTC este diferit
față de efectul prezentat anterior, în sensul că o concentrație mică, de 0,1 µg/mL, nu a afectat
negativ creșterea și dezvoltarea masei microbiene în mediul lichid, cu excepția probei în care a
fost imersat filtrul F2. Pentru toat e celelalte probe, s -a observat o creștere accentuată a încărcării
microbiene la această concentrație de antibiotic, urmată de o staționare a dezvoltării masei

46
microbiene pentru nivelul de concentrație 0,2 µg/mL față de nivelul 0,1 µg/mL, tendința de
creșt ere a dezvoltării masei microbiene fiind prezentă și pentru un nivel de antibiotic de 0,4
µg/mL, cu excepția mediului de cultură în care a fost amplasat filtrul F3, specia C. violaceum
fiind afectată negativ de prezența antibioticului în concentrația 0,4 µ g/mL.

Fig. 32 – Variația densității optice a mediului cu C.violaceum la diferite concentrații de antibiotic
Din aceste experimente comparative pentru cele două specii microbiene, se poate
concluziona că tipul de antibiotic utilizat și prezent în mediul d e cultură, sau în apele de
acvacultră în aplicațiile practice, afectează diferit încărcarea microbiană, speciile bacteriene
reacționând diferit , având sensibilitate diferită la tipuri diferite de antibiotice. [ 16].
Biofiltrele utilizate în experimentele de bioepurare au fost testate în ceea ce privește
capacitatea lor de reținere biomasă microbiană. În acest sens, după extragerea filtrelor din
mediile de cultură pentru care s -a determinat încărcarea microbiană la diferite nivele de
antibiotic din mediu, s -a trecut la evaluarea gradului de încărcare a biofiltrelor prin analize
gravimetrice ale biofiltrelor și analiza densității optice a soluției apoase rezultate prin spălarea
biofiltrelor în câte 20 ml apă distilată, în recipienți de 50 ml, aceștia fiind ampl asați în baie de
apă cu ultrasunete.
Conform procedurii anterioare, s -a evaluat gradul de încărcare microbiană a apelor de
spălare, prin determinarea densității optice pentru fiecare soluție rezultată după spălarea
biofiltrului, pentru cele două specii ba cteriene. În graficele din figura 33 este prezentată

47
densitatea optică a apelor de spălare în care masa bacteriană depusă pe biofiltre a fost transferată
în soluție.

Fig. 33 – Variația densității optice a apelor de spălare cu P. aeruginosa descărcat de p e biofiltre,
la diferite concentrații de antibiotic
Se observă că pentru specia P. aeruginosa , nivelul de încărcare microbiană a apelor de
spălare scade ușor pentru concentrația de antibiotic de 0,1 µg/mL , după care crește ușor cu
creșterea concentrației d e antibiotic, cu excepția apelor rezultate la spălarea biofiltrului F1 care
înregistrează o creștere accentuată a nivelului de densitate optică. Aceasta creștere se explică prin
faptul că antibioticul din mediul de cultură a afectat negativ masa bacteriană depusă pe biofiltre
și a slăbit rezistența acestei specii care a putut fi ușor îndepărtată prin metoda cu ultrasunete.
[46].
În cazul speciei C. violaceum , se observă din figura 34 aceeași tendință de scădere a
nivelului de masă bacteriană din soluțiile de spălare încărcate cu masă bacteriană eliminată de pe
filtre prin ultrasonicare, excepție făcând filtrul 2 care prezină o depunere abundentă ce a fost ușor
eliminată prin ultrasonicare și apoi transferată în apele de spălare. Și pentru această specie
bacteriană, antibioticul OTC în concentrație mai redusă a contribuit la slăbirea rezistenței speciei
C. violaceum depusă pe filtru, aceasta fiind ușor desprinsă de pe filtru și transferată în apele de
spălare.
Concentrațiile de antibiotic de 0,2 µg/mL și 0,4 µg/mL nu au avut aceeași influență
accentuată asupra încărcării microbiene pe biofiltre precum efectul antibioticului de concentrație

48
mai mică, ceea ce înseamnă că specia bacteriană este capabilă să se acomodeze cu acest agent
toxic și să își adapteze cre șterea și dezvoltarea la con dițiile de mediu cu antibiotic [16].

Fig. 34 – Variația densității optice a apelor de spălare cu C. violaceum descărcat de pe biofiltre, la
diferite concentrații de antibiotic
Evaluarea încărcării microbiene a mediilor de cult ură cu cele două specii bacteriene s -a
realizat și prin determinarea CFU/ml cu ajutorul unui densitometru Mc Farland. Numărarea CFU
s-a realizat pentru fiecare concentr ație de antibiotic. In figura 35 este prezentată variația CFU/ml
pentru specia P. aerugi nosa la diferite concentrații de antibiotic, iar in figura 3 6 este prezentată
variația CFU/ml pentru specia C. violaceum .
Din graficele reprezentate în figura 35 se observă că comportarea speciei P. aeruginosa
în ceea ce privește numărul de CFU/ml este di ferită pentru 3 din cele 6 biofiltre utilizate. Astfel,
mediile de cultură în care au fost amplasate biofiltrele F1, F2 și F3 au prezentat o scădere a
CFU/ml la concentrații de antibiotic de 0,1 µg/mL și 0,2 µg/mL, în timp ce filtrele F4, F5 și F6
au preze ntat o creștere accentuată a CFU/ml la concentrații de 0,1 µg/mL și 0,2 µg/mL,
concentrația de 0,4 µg/mL afectând într -o măsură mult mai mică nivelul de încărcare microbiană
din mediul lichid.
În ceea ce privește specia C. violaceum, în graficele din figu ra 36 se observă că mediile
de cultură au prezentat o creștere foarte accentuată a numărului de CFU/mL pentru toate cele 6
biofiltre utilizate în experimentele de bioepurare, la o concentrație de antibiotic de 0,1 µg/mL,
urmată de o scădere mai ușoară a nu merului de CFU/ml la concentrația de antibiotic de 0,2

49
µg/mL, pentru concentrația de 0,4 µg/mL evoluția CFU/ml fiind aproape nesemnificativă, cu
excepția mediului cu biofiltru F1 în care s -a observat o scădere accentuată a numărului de
CFU/ml.

Fig. 35 – Variația CFU a mediului cu P. aeruginosa la diferite concentrații de antibiotic

Fig. 36 – Variația CFU a mediului cu C.violaceum la diferite concentrații de antibiotic
Pentru fiecare specie bacteriană luată în lucru și la diferite concentrații de antibio tic OTC,
s-a realizat curba de creștere celulară, cu ajutorul unui cititor Tecan, determinarea efectuându -se
pe o durată totală de 20 ore, cu citirea valorilor la fiecare oră. Pentru acest experiment s -a utilizat
inocul cu densitate optică de 0,05 u.a. Pen tru acest experiment s -a utilizat o placă specială, cu 24
godeuri, primul godeu conținând doar mediul de cultură, următoarele două godeuri având mediul

50
de cultură inoculat cu cate o specie bacteriană, iar câte trei godeuri fiind încărcate cu probele de
mediu inoculate, la cate o concentrație de antibiotic diferită.
În graficul din fig. 37 este prezentată variația densității optice pentru specia bacteriană P.
aeruginosa , pe durata de 20 ore. Se observă că nivelele de antibiotic 0,1 µg/mL , 0,4 µg/mL , 1
µg/mL și 2 µg/mL nu afectează sau au un efect foarte slab asupra densității optice la specia P.
aeruginosa pe durata celor 20 de ore de experiment , în timp ce mediul de cultură netratat cu
antibiotic, precum și cel tratat cu o concentrație de 0,2 µg/mL prezintă o creștere accentuată a
densității optice în primele 4 ore de la demararea experimentului, urmând ca pe parcurs acest
nivel de creștere (proba netratată), respectiv ușoară scădere (0,2 µg/mL ) să se atenueze.

Fig. 37 – Variația densității optice a probelo r cu P. aeruginosa cu durata de lucru, la concentrații
diferite de antibiotic
Rezultatele exprimate grafic indică faptul că mediile de cultură conținând specia
bacteriană C.violaceum (fig 38 ), și tratate cu antibiotic în concentrație de 0,2 µg/mL nu sunt
afectate de această concentrație de antibiotic, procesul de bioepurare putându -se desfășura la
eficiență ridicată și în prezența de antibiotic, dar concentrații de antibiotic OTC mai mici, sau
mai mari, de până la 2 µg/mL sunt puternic inhibate de prezența antibioticului în mediul
bacterian. Prin urmare, bioepurarea se desfășoară cu dificultate, la randamente scăzute, existând
chiar riscul ca procesul de descompunere pe cale biologică a reziduurilor organice din apele
uzate să fie compromis, ca urmare a inhi bării ireversibile a masei bacteriene implicate în
procesele de biodescompunere [16].

51

Fig. 38 – Variația densității optice a probelor cu C. violaceum cu durata de lucru, la concentrații
diferite de antibiotic
5.3 C urbe de creștere bacteriană în mediu si ntetic
În secțiunea următoare este prezentată creșterea bacteriană pentru specia P. aeruginosa
cultivată pe mediu sintetic, modalitatea de lucru și investigațiile efectuate urmând aceleași
proceduri ca în cazul utilizării de mediu bazal. Scopul acestui exp eriment a fost de a studia
modul în care specia bacteriană reacționează la mediul specific.
În figura 39 este prezentată curba de creștere bacteriană exprimată prin variația densității
optice a mediului sintetic pe durata de lucru, în condiții de lipsă ant ibiotic și la diferite
concentrații de antibiotic oxitetraciclină.
Din imagine se observă că pe durata experimentului, proba martor reprezentată de mediul
sintetic fără inocul si fără antibiotic, precum si probele tratate cu antibiotic OTC in diferite
concentrații nu au prezentat o creștere bacteriană semnificativă, densitatea optică și implicit
dezvoltarea masei microbiene crescând foarte ușor cu creșterea concentrației de antibiotic. Se
observă astfel efectul inhibitor al antibioticului asupra încărcării microbiologice a mediului
sintetic. În schimb, proba de mediu sintetic inoculat cu P. aeruginosa dar netratată cu antibiotic a
prezentat o creștere accentuată, constantă, a masei microbiene în mediul de cultură pe toată
durata experimentului. Este evident că lipsa antibioticului a permis aceasta creștere microbiană
în mediul apos, deci în practica industrială specia P. aeruginosa va putea să participe la
descompunerea eficientă a nutrienților și a altor poluanți fără a fi inhibată de OTC. Pe de altă

52
parte, prezenta OTC reduce substanțial potențialul de bioepurare cu implicarea acestei specii
microbiene.

Fig. 39 – Variația densității optice a probelor cu P. aeruginosa pe mediu specific cu durata de
lucru, la concentrații diferite de antibiotic
În figura 4 0 este prezentată curba de creștere bacteriană a speciei C. violaceum pe mediu
sintetic, pe toată durata experimentului, în absența și în prezența de antibiotic OTC. La fel ca în
cazul speciei P. aeruginosa analizată anterior, se observă aceeași influență și efect inhibitor al
antibioticului asupra dezvoltării masei bacteriene de C. violaceum , efect care afectează negativ
procesele de bioepurare în apele tratate cu antibiotic. De asemenea, ca în cazul anterior, proba de
mediu sintetic inoculat cu C. violac eum dar netratată cu antibiotic a prezentat o creștere
accentuată, a masei microbiene în mediul de cultură pe toată durata experimentului, cu o ușoară
stagnare după 8 ore de la demararea experimentului.
Se poate afirma și în acest caz că și specia microbia nă C. violaceum este inhibată de
prezența antibioticului în mediul sintetic; în activitățile industriale de bioepurare, prezența
antibioticului OTC în mediul acvatic ar reduce mult eficiența și durata procesului de bioepurare.
[16, 18]

53

Fig. 40 -Variația densității optice a probelor cu C. violaceum pe mediu specific cu durata de
lucru, la concentrații diferite de antibiotic
5.4 Testarea eficacității de reținere a bacteriilor a unor biofiltre cu și fără OTC în mediu
sintetic
Biofiltrele expuse în mediul s intetic au fost extrase din mediu, urmărindu -se prin metode
gravimetrice și metode optice eficiența de bioepurare a acestora. Astfel, prin cântărirea
biofiltrelor a putut fi determinată cantitatea de biomasă r eținută de acestea. În figura 41 se poate
obser va cantitatea de biomasă din cele două specii microbiene reținută de cele 6 biofiltre luate în
lucru.

Fig. 41 – Cantitatea de biomasă reținută pe cele 6 filtre

54
Se observă că biofiltrele F1, F2, F3, F5 și F6 au reținut o cantitate mai mare de masă
bacteri ană din specia C. violaceum , cu excepția biofiltrului F5 care a fost mai eficient pentru
specia P. aeruginosa . Toate cele 6 biofiltre sunt dispozitive apte a fi utilizate în procesele de
bioepurare a apelor reziduale cu încărcare microbiană din speciile ba cteriilor luate în lucru.
Densitatea optică a lichidului reprezentat de mediul sintetic și bacteriile de inocul, după
îndepărtarea biofiltrelor din tuburi, este prez entata în graficul din figura 42 .

Fig. 42 – Densitatea optică a mediului sintetic inocula t, în funcție de filtrul utilizat
Din aceasta imagine se observă că ambele specii bacteriene au prezentat o evoluție
pozitivă în ceea ce privește dezvoltarea masei microbiene în mediu sintetic. Deși o parte din
aceasta masă bacteriană a fost reținută și de zvoltată pe biofiltre, în mediul lichid există biomasă
activă în dezvoltare, capabilă să consume poluanții din ape și să asigure o bioepurare a mediului
lichid [44].
Încărcarea bacteriană de pe biofiltrele expuse în mediu sintetic a fost determinată după
extragerea filtrelor, spălarea loc prin metoda cu ultrasunete si evaluarea densității optice a apelor
de spălare, ca în cazul prezentat in secțiunile anterioare în care s -a utilizat mediu bazal lichid.
Biomasa bacteriană din cele două specii P. aeruginosa și C. violaceum depuse pe cele 6 filtre a
fost determinată optic prin analizarea apelor de spăl are a biofiltrelor. În figura 43 se poate
observa gradul de reținere biomasă microbiană de către cele 6 filtre luate în lucru.

55

Fig. 43 – Densitatea optică a ape lor de spălare cu biomasa depusă pe filtre, în funcție de filtrul
utilizat
Eficiența de bioepurare a biofiltrelor este mai ridicată pentru specia bacteriană C.
violaceum , cantitatea de biomasă din această specie depusă pe biofiltre fiind mai ridicată decâ t în
cazul speciei P. aeruginosa , cu excepția biofiltrului F6 la care s -a observat o activitate mai bună
pentru specia P. aeruginosa .
Un nivel mai ridicat de masă bacteriană depusă pe biofiltre asigură un grad de bioepurare
al apelor reziduale mai avansat , masa bacteriană fiind substratul care consumă nutrienții și
poluanții din apă. Cu cat incărcarea microbiană pe biofilm este mai ridicată, cu atât eficiența de
bioepurare a biofiltrului este mai bună. În cazul experimentului de față, eficiența de bioepura re
cea mai ridicată a fost dovedită de biofiltrul F6, care a asigurat o dezvoltare favorabilă a masei
microbiene pentru ambele specii microbiene luate în studiu.
Viabilitatea celulară în mediul sintetic a fost evaluată prin prelevarea a câte 2 ml mediu
sintetic, realizându -se o probă de control (martor), două probe inoculate cu câte o specie
bacteriană dar fără antibiotic și câte 3 probe de mediu sintetic inoculat, tratate cu diferite
concentrații de OTC.
Pentru evidențierea viabilității celulare în mediul sintetic s -a utilizat colorant rezasurină
(Fig. 14 -17, 19, vz. 4.1.5) , pentru fiecare probă realizându -se măsurători de densitatea optică. În
figura 44 sunt reprezentate grafic rezultatele măsurătorilor de densitate optică pentru probele de
mediu sintetic, inoculate cu P. aeruginosa fără antibiotic și tratat e cu antibiotic OTC la diferite
concentrații : 0,1 µg/mL , 0,2 µg/mL și 0,4 µg/mL .

56
Se observă că dezvoltarea microbiană a fost semnificativ mai accentuată pentru proba de
mediu sintetic inoculată cu P. ae ruginosa dar netratată cu antibiotic. O concentrație de 0,1
µg/mL OTC a redus la jumătate creșterea microbiană a acestei specii în mediu sintetic, în timp ce
concentrații de antibiotic mai ridicate au afectat serios, în mod negativ, dezvoltarea microbiană.

Fig. 44 – Dezvoltarea speciei P. aeruginosa în mediu sintetic, cu ș i fără antibiotic
Din figura 45 se poate observa că specia microbiană C. violaceum prezintă același
comportament precum specia P. aeruginosa , densitatea optică a probei de mediu sintetic
netratată cu antibiotic fiind mult superioară celor înregistrate pentru probele tratate cu antibiotic.

Fig. 45 – Dezvoltarea speciei C. violaceum în mediu sintetic, cu și fără antibiotic

57
Aceste date experimentale sunt în deplină concordanță cu studiile de literatură prezentate
în capitolul documentar, care indică efectul inhibitor al antibioticelor din mediu asupra
procesului de bioepurare efectuat de diferite specii bacteriene [ 16, 18].
Nivelul de aderare al biomasei bacteriene la suportul sintetic s -a determinat după
evacuarea mediului sintetic și spălarea plăcii suport cu apă distilată, urmată de agitare și evaluare
a încărcării microbiene în apele de spălare, pentru toate cazurile luate în lucru, adică probă
control și probe de mediu sintetic inocula te cu cele două specii bacteriene, precum si probe
tratate cu dife rite concentrații de antibiotic [24]
În imaginea din figura 46 este prezentată densitatea optică a apelor rezultate după
spălarea plăcii cu godeuri, pentru specia microbiană P. aeruginosa . Din reprezentarea grafică se
observă că un nivel redus de antibiotic, adică 0,1 µg/mL , dar si un nivel ridicat de 0,4 µg/mL , nu
au afectat aderarea microbiană a acestei specii bacteriene, dar concentrația de antibiotic 0,2
µg/mL a avut ca efect o creștere a densității celulare în apele de spălare de peste 100% față de
mediul apos netratat, deci concentrația de 0,2 µg/mL a slăbit rezistența microbiană a speciei
depuse pe suportul plăcii, rezultând transferul acesteia in mediul apos.

Fig. 46 – Încărcarea mi crobiană cu P. aeruginosa a mediu lui apos, cu ș i fără antibiotic
În figura 47 este reprezentată grafic încărcarea microbiană cu specia C. violaceum a
mediului apos rezultat după eliminarea mediului sintetic cu și fără antibiotic OTC, spălarea plăcii
și eva luarea nivelului de aderare al speciei C. violaceum la suportul plăcii. Rezultatele
experimentate indică același comportament al speciei C. violaceum din punct de vedere al
aderării la suportul placăă, ca și specia P. aeruginosa . Și în acest caz, concentra ția de antibiotic

58
0,2 µg/mL a avut ca efect o creștere a densității celulare în apele de spălare față de mediul apos
netratat, dar nivelul de aderare al speciei C. violaceum la suport este usor mai ridicat fata de
specia P. aeruginosa .

Fig. 47 – Încăr carea microbiană cu C. aeruginosa a mediului apos, cu ș i fără antibiotic
5.5 Determinarea spectrofotometrică a concentrațiilor de ioni de amoniu, nitrat, nitrit și
fosfor
5.5.1 Evaluarea eficienței biofi ltrelor în eliminarea ionilor nitrat
Această secțiune prezintă variația concentrației ionilor nitrat (exprimați sub formă de azot
nitrat) pentru mediile de cultură inoculate cu P. aeruginosa , respectiv cu C. violaceum , pentru
toate cele 6 tipuri de biofiltre imersate în mediu.
Evaluarea s -a efectuat prin det erminarea densității optice la 410 nm a soluțiilor de mediu
inoculat, pe baza curbei de calibrare realizate din valorile densităților optice obținute pentru
următoarele concentrații de ioni nitrat în 0,25 ml mediu lichid: 0 µg, 12,5 µg, 25 µg, 37,5 µg, 50
µg, 62,5 µg. În figura 48 este prezentată curba de calibrare utilizată pentru determinarea
concentrațiilor de nitrat corespunzătoare valorilor densităților optice măsurate pentru fiecare
probă cu inocul bacterian.

59

Fig. 48 – Curba de calibrare la concen trații de nitrat definite
Densitatea optică a probei martor, adică a mediului de cultură fără inocul bacterian, a fost
de 2,07 u.a., care corespunde unei concentrații de nitrat de 40,69 µg NO 3-N/0.25 ml.
În tabelul 7 sunt prezentate valorile densităților optice măsurate pentru fiecare biofiltru
imersat în mediu de cultură, pentru cele două tipuri de specii bacteriene. Cu ajutorul curbei de
calibrare au fost determinate concentrațiile de nitrat corespunzătoare.
Tabel ul 7 – Densități optice și concentrații de ioni nitrat în mediile inoculate
Tip filtru DO la 410 nm (u.a) Concentrație (µg NO3 -N/0.25 ml)
P. aeruginosa C. violaceum P. aeruginosa C. violaceum
F1 1.176 1.342 22.6 25.9
F2 1.963 1.347 38.4 26.0
F3 1.255 1.268 24.2 24.4
F4 1.273 1.263 24.5 24.3
F5 1.272 1.263 24.5 24.3
F6 1.231 1.252 23.7 24.1
Din datele prezentate în tabelul 7, se observă că față de concentrația inițială de 40,69 µg
NO 3-N/0.25 ml existentă în mediul de cultură fără inocul, prezența inoculului bacterian a
determinat o scăder e accentuată a concentrației ionilor nitrat, până la un minim de 22.6 µg NO 3-
N/0.25 ml pentru mediul inoculat cu P. aeruginosa și încărcat cu filtrul F1, respectiv un minim
de 24.1 µg NO 3-N/0.25 ml pentru mediul inoculat cu C. violaceum și încărcat cu filt rul F6. O
reducere mai slabă a concentrației de nitrat, adică o activitate bacteriană mai redusă, a fost

60
înregistrată pentru filtrul F2 în mediul cu P. aeruginosa. De asemenea, filtrul F2 a avut o
activitate mai slabă și pentru mediul inoculat cu C. violac eum, toate celelalte filtre dovedind
eficiență de bioepurare relativ bună în ceea ce privește consumul de nitrat de către speciile
bacteriene utilizate.
Reducerea concentrației de nitrat în mediile de cultură, de la 40,69 µg NO 3-N/0.25 ml la
un minim de 2 2.6 µg NO 3-N/0.25 ml, se explică prin faptul că ambele tipuri de bacterii P.
aeruginosa si C. violaceum sunt bacterii denitrificatoare, utilizînd azot de tip azotat în procesele
metabolice specifice, participând astfel la eliminarea acestui nutrient din me diul apos [ 54].
Aceste rezultate indică faptul că biofiltrele bacteriene sunt dispozitive eficiente în fixarea
de masă bacteriană capabilă să consume nitratul din mediile de cultură, putând fi utilizate cu
succes în aplicațiile practice de bioepurare [ 46], având în vedere că nitratul este unul dintre
principalii nutrienți responsabil de eutrofizare dacă nu este eliminat din apele reziduale, iar
biofiltrele studiate pot asigura un grad de reducere nitrat de circa 50%. [ 57]
5.5.2 Evaluarea eficienței biofiltr elor în eliminarea nitriților
În imaginea din figura 49 este prezentată curba de calibrare realizată pentru determinarea
pe baza măsurătorilor de densitate optică la 630 nm, a concentrațiilor de nitrit în mediile de
cultură.
Valorile concentrațiilor de ni trit, exprimate sub formă de azot nitric, au fost determinate
din curba de calibrare pentru fiecare mediu de cultură inoculat cu P. aeruginosa , respectiv C.
violaceum .
Pentru trasarea curbei de calibrare s -au utilizat următoarele concentrații de ioni nitr it
exprimați sub formă de azot nitric pe litru (µg NO 2-N/L): 0 µg, 250 µg, 500 µg, 750 µg, 1000
µg. Mediul de cultură fără inocul microbian a prezentat o densitate optică la 630 nm de 0,403
u.a., corespunzătoare unei concentrații de ioni de nitrit de 647,3 µg NO 2-N/L.

61

Fig. 49 – Curba de calibrare la concentrații de nitrit definite
Rezultatele măsurătorilor experimentale indică o scădere foarte accentuată a concentrației
de nitrit din mediul de cultură la probele inoculate cu cele două specii bacteriene ( Tabelul 8).
Tabelul 8 – Densități optice și concentrații de ioni nitrat în mediile inoculate
Tip filtru DO la 630 nm (u.a) Concentrație (µg NO 2-N/L)
P. aeruginosa C. violaceum P. aeruginosa C. violaceum
F1 0.065 0.085 83.8 117.8
F2 0.075 0.106 100.0 152.7
F3 0.077 0.081 104.8 111.3
F4 0.071 0.052 94.2 62.7
F5 0.097 0.096 137.5 136.5
F6 0.080 0.079 108.7 106.7

Cea mai mare scădere, de circa 10 ori față de concentrația de nitrit inițială în mediul fără
inocul, s -a înregistrat pentru mediul de cultur ă inoculat cu specia C. violaceum , prin utilizarea
filtrului F4. În cazul mediului inoculat specia P. aeruginosa , cea mai mare reducere a
concentrației de nitrit, de circa 8 ori, s -a obținut pentru mediul de cultură în care a fost utilizat
filtrul F4. Aces te rezultate indică o eficiență foarte ridicată de bioepurare cu biofiltre a apelor
reziduale încărcate cu nutrienți de tip nitriți, rezultate în concordanță cu cel e obținute de alți
cercetători [51, 89].

62
Speciile bacteriene P. aeruginosa și C. violaceum sunt foarte active pe biofiltrele
amplasate in aceste medii apoase și prezintă o activitate metabolică foarte accentuată în ceea ce
privește utilizarea de nitriți ca sursă de azot în dezvoltarea biomasei microbiene, atât biofiltrele,
cât și speciile bacteri ene luate în lucru fiind foarte eficiente în procesele de tratare a apelor
reziduale și a celor de acvacultură care prezintă concentrații ridicate de nitriți [ 46].
5.5.3 Evaluarea eficienței biofiltrelor în eliminarea amoniului
Variația concentrației ionil or de amoniu (exprimați sub formă de azot amoniacal) pentru
mediile de cultură inoculate cu P. aeruginosa , respectiv cu C. violaceum , pentru toate cele 6
tipuri de biofiltre imersate în mediu a fost determinata tot prin metode optice, pe baza
determinării densității optice la 333 nm a soluțiilor de mediu inoculat. A fost trasată curba de
calibrare cu ajutorul valorilor densităților optice obținute pentru următoarele concentrații de ioni
amoniu: 0 mM, 0,2 mM, 0,4 mM, 0,6 mM, 0,8 mM, 1 mM.
În figura 50 este prezentată curba de calibrare utilizată pentru determinarea
concentrațiilor de amoniu corespunzătoare valorilor densităților optice măsurate pentru fiecare
probă cu inocul bacterian de tip P. aeruginosa , respectiv C. violaceum .

Fig. 50 – Curba de cali brare la concentrații de amoniu definite
Proba martor de mediu de cultură fără inocul bacterian a prezentat o valoarea densității
optice la 333 nm de 0,601, ceea ce corespunde unei con centrații de ioni de amoniu de 0,999 mM.

63
În tabelul 9 sunt prezentate v alorile densităților optice măsurate pentru fiecare biofiltru
imersat în mediu de cultură, pentru cele două tipuri de specii bacteriene. Concentrațiile de
amoniu corespunzătoare sunt prezentate in tabel și au fost obținute pe baza curbei de calibrare.
Tabelul 9 – Densități optice și concentrații de ioni amoniu în mediile inoculate
Tip filtru DO la 333 nm (u.a) Concentrație (mM)
P. aeruginosa C. violaceum P. aeruginosa C. violaceum
F1 0.602 0.602 1.000 1.000
F2 0.600 0.602 0.997 0.999
F3 0.602 0.602 0.999 1.000
F4 0.615 0.602 1.023 0.999
F5 0.602 0.545 1.000 0.898
F6 0.546 0.602 0.900 1.000
Rezultatele concentrațiilor de amoniu din mediile de cultură inoculate indică o ineficiență
a biofiltrelor și a speciilor bacteriene P. aeruginosa și C. violaceu m în reducerea azotului
amoniacal, ceea ce înseamna că aceste specii bacteriene nu utilizeză amoniu în procesele lor
metabolice, ci folosesc nitrații și nitriții ca sursă de azot pentru dezvoltarea masei bacteriene. O
ușoara eficiență de reducere a azotulu i amoniacal s -a înregistrat pentru mediul de cultură inoculat
cu P. aeruginosa și încărcat cu filtrul F6, precum și pentru mediul inoculat cu C. violaceum și
încărcat cu filtrul F5. Aceste reduceri sunt însă nesemnificative pentru eficiența proceselor de
bioepurare.
În aplicațiile practice, pentru îndepărtarea azotului amoniacal din apele reziduale, alte
specii bacteriene denitrificatoare trebuie să fie utilizate ca masă bacteriană, care să lucreze în
sinergie cu speciile bacteriene denitrificatoare cu act ivitate ridicată pentru azotul de tip nitrat și
nitrit. [ 7, 10 ]
5.5.4 Evaluarea eficienței biofiltrelor în eliminarea fosfaților
Curba de calibrare realizată pentru determinarea pe baza măsurătorilor de densitate optică
la 660 nm, a concentrațiilor de fos fați în mediile de cultură este prezentată în imaginea din figura
51. Valorile concentrațiilor de fosfați au fost determinate din curba de calibrare pentru fiecare
mediu de cultură inoculat cu P. aeruginosa , respectiv C. violaceum .

64
Pentru trasarea curbei de calibrare au fost utilizate valorile densităților optice obținute
pentru soluții apoase de medii de cultură având următoarele concentrații definite de fosfor de tip
fosfat: 0 µg/ml, 5 µg/m L, 10 µg/m L, 15 µg/m L, 20 µg/m L, 25 µg/m L.
Concentrația de fosfor sub formă de ioni fosfat din mediul de cultură fără prezența
inoculului microbian a fost de 4,69 g/mL, concentrație care a fost determinată din curba de
calibrare pentru o valoare măsurată a densității optice la 333 nm de 0,367.

Fig. 51 – Curba de cali brare la concentrații de fosfor definite
În tabelul 10 sunt prezentate concentrațiile de fosfor de tip ioni fosfat din mediile de
cultură inoculate cu speciile bacteriene P. aeruginosa și C. violaceum , pentru fiecare tip de
biofiltru luat în lucru.
Tabel ul 10 – Densități optice și concentrații de ioni amoniu în mediile inoculate
Tip filtru DO la 660 nm (u.a) Concentrație ( g/ml)
P. aeruginosa C. violaceum P. aeruginosa C. violaceum
F1 0.274 0.248 3.34 2.96
F2 0.290 0.282 3.56 3.45
F3 0.187 0.169 2.06 1.80
F4 0.308 0.295 3.83 3.65
F5 0.167 0.231 1.78 2.71
F6 0.315 0.311 3.93 3.88

65
Analizând datele înregistrate în tabel, se observă că toate biofiltrele utilizate în mediile de
cultură inoculate cu cele două specii bacteriene au determinat o reducere de până la 3 ori a
nivelului de fosfați din mediu. Astfel, specia P. aeruginosa a prezentat cea mai bună activitate
microbiană în reducerea fosfaților în mediul de cultură în care a fost imersat biofiltrul F5, adică o
reducere a concentrației de fosfat de la 4,69 g/mL la 1,78 g/mL, în timp ce specia C.
violaceum a fost mai activă în mediul de cultură cu filtrul F3, determinând o reducere a fosfaților
de la 4,69 g/mL la 1,80 g/mL. Rezultatele experimentale concordante, privind eficiența
filtrelor biologice în îndepărtatea fosfaților au fost prezent ate și la capitolul documentar [58-61].
Din rezultatele obținute se poate concluziona că ambele specii microbiene utilizate în
experimentele de evaluare a eficienței de îndepărtare a fosforului au dovedit o activ itate ridicată
în eliminarea fosforului din mediile de cultură, deci sunt specii bacteriene fosfat reducătoare,
capabile să utilizeze ionii fosfat în desfășurarea proceselor metabolice.
De asemenea, filtrele biologice F1 – F6 s-au dovedit eficiente în fix area acestor specii
bacteriene, putând fi utilizate în practica industrială pentru bioepurarea apelor reziduale încărcate
cu fosfați.

66
CAPITOLUL 6 – CONCLUZII
Utilizarea proceselor biochimice cu implicarea diverselor specii microbiene în procesele
de epurare a apelor reziduale este un domeniu de cercetare de mare interes având în vedere
aplicabilitatea sa practică deosebit de importantă ;
Între activitățile industriale, acvacultura este un domeniu care implică utilizarea unor
volume mari de apă, rez ultând volume importante de ape reziduale. Acumularea de excremente
și resturi de hrană în apele destinate activităților piscicole cauzează o deterioare a calității apei,
cu efecte negative atât asupra peștilor cât și asupra mediului în general, având în v edere că apele
de acvacultură conțin cantități considerabile de azot, fosfor și materie organică care au potențial
de degradare a altor cursuri de apă. Prin urmare, tratamentul de epurare al acestor ape este
esențial pentru prevenirea impactului negativ as upra mediului acvatic înconjurator, adică
prevenirea fenomenului de eutrofizare și de dezvoltare a unei acvaculturi durabile la nivel global ;
Din punct de vedere al evaluării poluanților generați de acvacultură, azotul și fosforul
sunt componenții cu pond erea cea mai mare în poluarea apei, la care se adaugă produși reziduali
pe bază de azot din excrementelele peștilor. Descompunerea acestor compuși reziduali pe bază
de azot este de importanță majoră în acvacultură, având în vedere toxicitatea amoniului și a
nitriților, dar și riscul de eutrofizare a mediului prin poluarea cu nutrienți ;
Metodele fizice, chimice și biologice utilizate în mod convențional în tratarea apelor
reziduale pot fi aplicate și sistemelor de acvacultură. Metodele biologice prin utiliz area de
biofiltre scufundate, filtre de drenare, contactoare biologice rotative precum și reactoare în pat
fluidizat sunt sisteme utilizate pentru oxidarea materiei organice , nitrificare sau denitrificare;
Un poluant de mediu de importanță maximă este repr ezentat de antibiotice, acestea fiind
foarte frecvent utilizate și în acvacultură, avand efecte adverse pe t ermen lung asupra
ecosistemelor. Sistemele biologice convenționale de epurare a apelor uzate asigură, in cazul unor
tehnologii avansate, o reducere foarte scazută a nivelului de antibiotice din efluenți.
Acțiunea inhibitoare a antibioticelor asupra comunităților microbiene este cercetată și
prezentată în numeroase lucrări știintifice care vizează atât eficiența de îndepărtare a acestor
compuși din ape le reziduale, cât și adaptarea și/sau rezistența comunităților microbiene din
mediu la antibiotice din diferite clase;

67
Cercetarea de față s -a axat pe evaluarea eficienței de bioepurare a apelor de acvacultură
prin utilizarea a șase tipuri de biofiltre micr obiene, amplasate în medii de cultură diverse (mediu
bazal, mediu specific), medii care au fost inoculate cu două tipuri de bacterii frecvent răspîndite
în apele reziduale, P. aeruginosa și C. violaceum , aceste bacterii fiind implicate în procesele de
bioepurare prin consumul de nutrienți pe bază de azot și fosfor. Au fost evaluate atât eficiența
biofiltrelor încărcate cu aceste specii bacteriene în medii de cultură, cât și efectul inhibitor al
antibioticului oxitetraciclină în diverse concentrații, prin ut ilizarea de tehnici gravimetrice și
optice de determinare a încărcării microbiene în mediile apoase de cultură și pe filtrele biologice.
De asemenea, a fost studiat modul în care acest antibiotic afectează eficiența de bioepurare a
filtrelor în ceea ce pri vește eliminarea nitraților, nitriților, amoniului și fosfaților.
Rezultatele experimentale au indicat faptul că prezența antibioticului oxitetraciclină în
mediul de cultură în care se află cele două specii microbiene, a redus nivelul de eficiență al
biofi ltrelor, bacteriile P. aeruginosa și C. violaceum dovedindu -se sensibile la concentraț ii mari
al antibioticul ui luat în studiu. Aceste concluzii obținute pe baza experimentelor sunt în
concordanță cu cele menționate în alte studii și cercetări, conform că rora antibioticele prezente în
mediu afectează negativ eficiența de bioepurare a dispozitivelor și speciilor bacteriene implicate
în epurarea biologică ;
De asemenea, s -a constatat că tipul de antibiotic utilizat și prezent în mediul de cultură,
sau în ape le de acvacultră în aplicațiile practice, afectează diferit încărcarea microbiană, speciile
bacteriene reacționând diferit și având sensibilitate diferită la tipuri diferite de antibiotice ;
Un nivel mai ridicat de masă bacteriană depusă pe biofiltre asigur ă un grad de bioepurare
al apelor reziduale mai avansat, masa bacteriană fiind substratul care consumă nutrienții și
poluanții din apă. Cu cât incărcarea microbiană pe biofilm este mai ridicată, cu atât eficiența de
bioepurare a biofiltrului este mai bună ;
În ceea ce privește eficiența biofiltrelor în eliminarea nitraților, rezultate au indicat faptul
că biofiltrele bacteriene sunt dispozitive eficiente în fixarea de masă bacteriană capabilă să
consume nitratul din mediile de cultură, putând fi utilizate cu succes în aplicațiile practice de
bioepurare, având în vedere că nitratul este unul dintre principalii nutrienți responsabil de
eutrofizare dacă nu este eliminat din apele reziduale. Biofiltrele studiate pot asigura un grad de

68
reducere nitrat de circa 50% , ambele specii bacteriene fiind eficiente în reducerea nivelului de
nitrați din apele reziduale;
Speciile bacteriene P. aeruginosa și C. violaceum sunt foarte active pe toate cele șase
biofiltre luate în studiu și în ceea ce privește reducerea nitriților, atât biofiltrele, cât și speciile
bacteriene P. aeruginosa și C. violaceum fiind foarte eficiente în procesele de tratare a apelor
reziduale și a celor de acvacultură bogate în nitriți.
Pe de altă parte, rezultatele experimentale au indicat o ineficienț ă a biofiltrelor și a
speciilor bacteriene P. aeruginosa și C. violaceum în reducerea azotului amoniacal. În aplicațiile
practice, pentru îndepărtarea azotului amoniacal din apele reziduale, alte specii bacteriene
denitrificatoare trebuie să fie utilizate ca masă bacteriană activă ;
Studiul eficienței biofiltrelor inoculate cu speciile bacteriene P. aeruginosa și C.
violaceum a arătat că ambele specii microbiene utilizate în experimente au dovedit o activitate
ridicată în eliminarea fosforului din mediile de cultură, deci sunt specii bacteriene fosfat
reducătoare, capabile să utilizeze ionii fosfat în desfășurarea proceselor metabolice, filtrele
biologice utilizate fiind eficiente în fixarea acestor specii bacteriene, putând fi utilizate în
practica industria lă pentru bioepurarea apelor reziduale încărcate cu fosfați.

69
CAPITOLUL 7 – BIBLIOGRAFIE
[1] Ariel E., Turcios J . P.. Sustainable Treatment of Aquaculture Effluents —What Can We Learn
from the Past for the Future?, Sustainability , 6, 836-856 ( 2014)
[2] UN. Human development report 201 6. Available online: http://hdr.undp.org/en/2016 -report
(accessed on 15 aprilie 2018);
[3] Turcios A.E. Evaluación de la calidad de las aguas residuales provenientes de la planta de
tratamiento Aurora II con fines de rieg o en el cultivo de frijol ( Phaseolus vulgaris L.). Master
Thesis, Universidad de San Carlos de Guatemala, Guatemala, June 2011 ;
[4] Cripps S.J., Bergheim A., Solids management and removal for intensive land -based
aquaculture production systems , Aquacultur al Engineering , 22, 33–56 (2000 )
[5] Martins C.I.M. , Eding E.H., Verdegem M.C.J. , Heinsbroek L.T.N. , Schneider O., Blancheton
J.P., Roque d’Orbcastel E., Verreth J.A.J. , New developments in recirculating aquaculture
systems in Europe: A perspective on envi ronmental sustainability , Aquacultural Engineering, 43
(3) 83-93 (2010)
[6] Van Rijn J., The potential for integrated biological treatment system in recirculating fish
culture , Aquaculture , 139, 181 –201 ( 1996 )
[7] Lin Y.F., Jing S.R., Lee D.Y., Wang T.W., Nutrient removal from aquaculture wastewater
using a constructed wetlands system , Aquaculture, 209, 169 –184 ( 2002 )
[8] Schneider O., Sereti V., Eding E.H., Verreth J.A.J., Analysis of nutrient flows in integrated
intensive aquaculture systems , Aquacultura l Engineering , 32, 379 –401 (2005)
[9] Bergheim A., Cripps S.J., Liltved H.A., System for the treatment of sludge from land -based
fish-farms. , Aquat. Living Resour., 11, 279 –287 (1998 )
[10] Kelly L.A., Bergheim A., Hennessy M.M., Predicting out put of ammoni um from fish farms ,
Water Res. , 28, 1403 –1405 (1994)
[11] Brinker A.; Koppe W., Rösch R., Optimised effluent treatment by stabilised trout faeces ,
Aquaculture , 249, 125 –144 ( 2005 )
[12] Tacon A.G.J., Phillips M.J., Barg U.C., Aquaculture feeds and the envir onment: The Asian
experience , Water Sci. Tech., 31, 41–59 (1995 )
[13] Losordo T.M., Westers H., System carrying capacity and flow estimation . In Aquaculture
Water Reuse Systems: Engineering Design and Management ; Timmons, M.B., Losordo, T.M.,
Eds.; Elsevie r: Amsterdam, The Netherlands, 9 –60 (1994)
[14] Åsgård T., Hillestad M., Technological and Nutritional Aspects of Safe Food Production.
Eco-Friendly Aquafeed and Feeding . In Proceedings of the Symposium Victam 98, Utrecht, The
Netherlands, 13 –14 May p. 1 6 (1998)

70
[15] Summerfelt S.T., Holland K.H., Hankins J.A., Durant M.D., A hydroacoustic waste feed
controller for tank systems. , Water Sci. Tech., 31, 123 –129 (1995 )
[16] Cetecioglu Z ., Atasoy M ., Biodegradation and inhibitory effects of antibiotics on bio logical
wastewater treatment systems , Capitol de carte in: Toxicity and Biodegradation testing, Humana
Press , pag. 29 -55 (2018)
[17] Kummerer K., Pharmaceuticals in the Environment: sources, fate, effects and risks , Editura
Springer, Berlin , pag. 29 , (2013 )
[18] Romero J., Feijoo C.G., Navarrete P. , Capitol carte Antibiotics in Aquaculture – Use, Abuse
and Alternatives , pag. 159 -198 (2012)
[19] Nakajima T., Suzuki M., Harada K., Inoue M., Mitsuhashi S., Transmission of R plasmids
in Vibrio anguillarum to V ibrio cholera . Microbiology and Immunology . 27, 195-198 (1983)
[20] Rizzo L ., Manaia C ., Merlin C ., Schwartz T., Dagot C., Ploy M.C., Michael I., Fatta –
Kassinos D., Urban wastewater treatment plants as hotspots for antibiotic resistant bacteria and
genes s pread into the environment: A review , Sci. Total Environ. , 447, 345 –360 (2013)
[21] Yang Y ., Li B ., Zou S ., Fang H.H.P, Zhang T. , Fate of antibiotic resistance genes in sewage
treatment plant revealed by metagenomic approach , Water Resources., 62, 97–106 (2014)
[22] Huang J .J., Hu H .Y., Tang F ., Li Y., Lu S.Q., Lu Y. Inactivation and reactivation of
antibiotic -resistant bacteria by chlorination in secondary effluents of a municipal wastewater
treatment plant , Water Resources , 45, 2775 –2781 (2011)
[23] Li D ., Qi R ., Yang M ., Zhang Y., Yu T. Bacterial community characteristics under long –
term antibiotic selection pressures , Water Resources, 45, 6063 –6073 (2011)
[24] Huang K ., Tang J ., Zhang X .X., Xu K., Ren H., A comprehensive insight into tetracycline
resista nt bacteria and antibiotic resistance genes in activated sludge using next -generation
sequencing , International Jorunal of Molecular Sciences, 15, 10083 –10100 (2014)
[25] Zachritz W.H.; Jacquez R.B., Treating intensive aquaculture recycled water with a
constructed wetlands filter system , Constructed Wetlands for Water Quality Improvement, 609–
613 (1993)
[26] Lin Y.F.; Jing S.R., Lee D.Y., Chang Y., Chen Y., Performance of a constructed wetland
treating intensive shrimp aquaculture wastewater under high hyd raulic loading rate , Environ.
Pollut. 134, 411–421 (2005)
[27] Sindilariu P.D., Brinker A., Reiter R., Factors influencing the efficiency of constructed
wetlands used for the treatment of intensive trout farm effluent, Ecol. Eng,. 35, 711 –722 (2009)
[28] S algot M ., Folch M ., Unit S .S., Wastewater treatment and water reuse , Environmental
Science & Health , (2018 )

71
[29] Malmali M., Askegaard J., Sardari K., Eswaranandam S., Sengupta A, Wickramasinghe
S.R., Evaluation of ultrafiltration membranes for treating po ultry processing wastewater ,
Journal of Water Process Engineering, 22 , 218 -226 (2018) ;
[30] Li K., Wang J., Liu J., Wei Y., Chen M., Advanced treatment of municipal wastewater by
nanofiltration: Operational optimization and membrane fouling analysis , Jour nal of
environmental science, 43, 106-117 (2018)
[31] George J.S., Ramos A., Shipley H.J., Tanning facility wastewater treatment: Analysis of
physical –chemical and reverse osmosis methods , Journal of Environmental Chemical
Engineering, 3, 969-976 (2015)
[32] Thy T., Basic Water and Wastewater Treatment (book). Ch.6 – Chemical treatment
processes – Butterworths Basic Series – Elsevier Ltd. ISBN: 978 -0-408-70937 -8 (1990 )
[33] Cheremisinoff N.P.., Handbook of water and wastewater treatment technologies .
Butter worth -Heinemann – Elsevier Group. ISBN: 0 -7506 -7498 -9 (2002 )
[34] How to optimize wastewater dosing . Filtration+Separation, 54 (5), 30 -32 (2017)
[35] Talaiekhozani A., Talaei M.R. , Rezania S. An overview on production and application of
ferrate (VI) for c hemical oxidation, coagulation and disinfection of water and wastewater ,
Journal of Environmental Chemical Engineering, 5, 1828 -1842 (2017)
[36] Talaie A.R. , Parametric study of petroleum compounds biodegradation using
microorganisms , Sci. Re. Azad. Uni. B ranch Ahvaz, 21 (75), 20 –27 (2008)
[37] Parmar K.A. , Praja S., Patel R., Dabhi Y.. Effective use of ferroussulfate and alum as a
coagulant in treatment of dairy intry wastewater . ARPN Journal of Engineering Applied
Sciences 6 (9), 42 -45 (2011)
[38] Bratby J.. Coagulation and Flocculation in Water and Wastewater Treatment – Ediția a III -a.
ISBN: 9781780407494 (2016)
[39] Renault F., Sancey B., Charles J., Morin -Crini N., Badot P.-M., Winterton P., Crini G.,
Chitosan flocculation of cardboard -mill secondary b iological wastewater . Chem. Eng. J. , 155,
775–783 (1999)
[40] Lee C.S., Robinson J., Chong M.F. . A review on application of floculants in wastewater
treatment. Procces Safety and Environmental Protection, 92, 489 -508 (2014)
[41] Kurniawan T.A., Chan G. Y.S ., Lo W.-H., Babel S.. Physico –chemical treatment techniques
for wastewater laden with heavy metals , Chemical Engineering Journal, 118, 83-98 (2006)
[42] Abu -El-Halawa R., Zabin S.A.. Removal efficiency of Pb, Cd, Cu and Zn from polluted
water using dithio carbamate ligands , Journal of Taibah University of Science, 11, 57-65 (2017)

72
[43] Xu H., You S., A Review on Treatment of Aquaculture Wastes , The 2nd International
Conference on Education Technology, Management and Humanities Science (ETMHS 2016),
pag. 748 -751 (2016)
[44] Intrasungkha N ., Keller J ., Blackall L .L. Biological nutrient removal efficiency in treatment
of saline wastewater , Water Science and Technology, 6, 183-190 (1999)
[45] Gutierrez -Wing M .T., Malone R .F., Biological filters in aquaculture: T rends and research
directions for freshwater and marine applications , Aquacultural Engineering, 3, 163-171 (2006)
[46] Schreier H .J., Mirzoyan N ., Saito K .. Microbial diversity of biological filters in
recirculating aquaculture systems , Current Opinion in Biotechnology, 3, 318-325 (2010)
[47] Zhang X ., Jin Y ., Chen Y ., The effect of photosynthetic bacteria on the growth of fish
pathogenic bacteria , Chinese Journal of Ecological Agriculture, 3, 659 -663 (2002)
[48] Yu P. , Wang L . On photosynthetic bacteria, isolation, identification and immobilized and in
application of pond water quality purification , Biotechnology, 35 -44 (1995)
[49] Bacteria History and Classification
http://www.biologydiscussion.com/bacteria/photosynthetic -bacteria/photosynthetic -bacteria –
history -and-classification -microbiology/65555
[50] Limpiyakorn T ., Kurisu F ., Yagi O. Quantification of ammonia -oxidizing bacteria
populations in full -scale sewage activated sludge systems and assessment of system variables
affecting their performance , Water Science and Technology, 54(1), 91 –99 (2006)
[51] Huang Z ., Gedalanga P .B., Asvapathanagul P . Influe nce of physicochemical and
operational parameters on Nitrobacter and Nitrospira communities in an aerobic activated
sludge bioreactor , Water Resources, 44, 4351 –4358 (2010)
[52] Lücker S ., Schwarz J ., Gruber -Dorninger C . Nitrotoga -like bacteria are previo usly
unrecognized key nitrite oxidizers in full -scale wastewater treatment plants , ISME Journal, 9(3),
708–720 (2015)
[53] Wang X ., Hu M ., Xia Y . Pyrosequencing analysis of bacterial diversity in 14 wastewater
treatment systems in China , Bioresource Techn ology , 78(19), 7042 –7047 (2012)
[54] Cydzik -Kwiatkowska A ., Wojnowska -Baryła I. Nitrogen -converting communities in
aerobic granules at different hydraulic retention times (HRTs) and operational modes , World
Journal of Microbiological Biotechnologies, 31, 75–83 (2015)
[55] Jiang X ., Ma M ., Li J . Bacterial diversity of active sludge in waste -water treatment
plant , Earth Sci Front, 15, 163–168 (2008)
[56] Jaranowska P ., Cydzik -Kwiatkowska A ., Zielińska M. Configuration of biological
wastewater treatment line a nd influent composition as the main factors driving bacterial

73
community structure of activated sludge , World Journal of Microbiological Biotechnologies ,
b(7), 1145 –1153 (2013)
[57] Peng X ., Guo F ., Ju F . Shifts in the microbial community, nitrifiers and d enitrifiers in the
biofilm in a full -scale rotating biological contactor , Environmental Sciences and Technologies ,
48(14), 8044 –8052 (2014)
[58] Carvalho G ., Lemos P .C., Oehmen A . Denitrifying phosphorus removal: linking the process
performance with the m icrobial community structure , Water Resources, 41, 4383 –4396 (2007)
[59] Oehmen A ., Lemos P .C., Carvalho G . Advances in enhanced biological phosphorus
removal: from micro to macro scale , Water Resources, 41, 2271 –2300 (2007)
[60] Gu A .Z., Saunders A ., Nee thing J .B., Functionally relevant microorganisms to enhanced
biological phosphorus removal performance at full -scale wastewater treatment plants in the
United States , Water Environmental Resources , 88, 688–698 (2008)
[61] Mielczarek A .T., Nguyen H .T.T., Nielsen J .L. Population dynamics of bacteria involved in
enhanced biological phosphorus removal in Danish wastewater treatment plants , Water
Resources, 47, 1529 –1544 (2013)
[62] Kong Y .H., Xia Y ., Nielsen J .L., Structure and function of the microbial communi ty in a
full-scale enhanced biological phosphorus removal plant , Microbiol SGM , 153, 4061 –4073
(2007)
[63] Saunders A .M., Oehmen A ., Blackall L .L., The effect of GAOs (glycogen accumulating
organisms) on anaerobic carbon requirements in full -scale Australi an EBPR (enhanced
biological phosphorus removal) plants , Water Sciences and Technology, 47(11), 37–43 (2003)
[64] Cydzik -Kwiatkowska A., Zielińska M., Bacterial communities in full -scale wastewater
treatment systems , World Jornal of Microbiology and Bio technology, 32, 66-78 (2016)
[65] Abdel -Raouf N., Al -Homaidan A.A. , Ibraheem I.B.M. , Microalgae and wastewater
treatment , Saudi Journal of Biological Sciences, 19, 257 -275 (2012)
[66] Talaiekhozani A., Bagheri M., Goli A., Talaei Khozani M.R. , An overview of principles of
odor production, emission, and control methods in wastewater collection and treatment systems ,
J. Environ. Manage. 170, 186 –206 (2016)
[67] Vo Hoang Nhat P., Ngo H.H. , Guo W.SChang ., S.W. , Nguyen D.D. , Nguyen P.D., Bui
X.T., Zhang X.B. , Guo J.B., Can algae -based technologies be an affordable green process for
biofuel production and wastewater remediation? , Bioresurce Technology, 256, 491 -501 (2018)
[68] Boelee N.C. , Temmink H., Janssen M., Buisman C.J.N. , Wijffels R.H. , Nitrogen and
phosph orus removal from municipal wastewater effluent using microalgal biofilms , Water
Research, 45, 5925 –5933 (2011)

74
[69] Shi W., Wang L., Rousseau D.P.L. , Lens P.N.L ., Removal of estrone, 17 -ethinylestradiol,
and 17-estradiol in algae and duckweed -based was tewater treatment systems, Environ. Sci.
Pollut. Res. 17, 824 –833 (2010)
[70] de Wilt A., Butkovskyi A., Tuantet K., Leal L.H., Fernandes T.V., Langenhoff A., Zeeman
G., Micropollutant removal in an algal treatment system fed with source separated wastewa ter
streams , Journal of Hazardous Materials, 304, 84-92 (2016)
[71] Patrick K. Top Ten Natural Ways to Remove Heavy Metals .
https://www.naturalne ws.com/026885_natural_zeolite_heavy_metals.html – Accesat 29.05.2018
[72] Singh L., Pavankumar A.R. , Lakshmanan R.. Effective removal of Cu2+ ions from aqueous
medium using alginate as biosorbent , Ecol. Eng . , 38, 119 –124 (2012)
[73] Shamshad I., Khan S., Waqas M., Ahmad N., Ur-Rehman K., Khan K., Removal and
bioaccumulation of heavy metals from aqueous solutions using freshwater algae , Water Science
& Technology, 71 (1), 38 -44 (2015)
[74] Castellet -Rovira F., Lucas D., Villagrasa M., Rodríguez -Mozaz S., Barcelo D., Sarra M.,
Stropharia rugosoannulata and Gymnopilus luteofolius. Promising fungal species for
pharmaceutical biodegradation in contaminated water , J. Environ. Manag. , 396 -404 (2007)
[75] Mir -Tutusaus J.A., Baccar R., Caminal G., Sarra M.. Can wh ite-rot fungi be a real
wastewater treatment alternative for organic micropollutants removal? A review . Water
Research, 138, 137 -151 (2018)
[76] https://www.environmental -expert.com/downloads/model -bfl-6000hc -biological -products –
brochure -675430
[77] Bebak -Williams J. Bullock G., Carson M.C. Oxytetracycline residues in a freshwater
recirculating system . Aquaculture, 205, 221 -230 (2002)
[78] Cze kanska E.M. Assessment of Cell Proliferation with Resazurin -Based Fluorescent Dye.
In: Stoddart M. (eds) Mammalian Cell Viability. Methods in Molecular Biology (Methods and
Protocols), vol 740. Humana Press (2011)
[79] Cowgill U.M., Milazzo, D.P. The cultu ring and testing of two species of duckweed Aquatic
Toxicology and Hazard Assessment: vol. 12, ASTM STP 1027, U.M. Cowgill and L.R.
Williams, Eds. American Society for Testing and materials, Phila. 379 -391, (1989)
[80] Koroleff, F. Determination of ammonia . In Methods of Seawater Analysis (K. Grasshoft,
ed.). Verlag Chemie, pp. 126 -133 (1976)
[81] Cataldo et al. (1975) Rapid colorimetric determination of nitrate in plant tissues by nitration
of salicylic acid. Commun. Soil Science and Plant Analysis 6(1) 71 -80
[82] Miranda K., Espey M., Wink D. A Rapid, Simple Spectrophotometric Method for
Simultaneous Detection of Nitrate and Nitrite , Nitric Oxide, 5, 62-71 (2001)

75
[88] Wu W., Jin Y., Bai F., Jin S. Molecular Medical Microbiology (2nd Edition), Capitolul 41 –
Pseudomonas aeruginosa , Academic Press – Vol. 2, 753 -767 (2015)
[83] Balcht A, Smith R Pseudomonas aeruginosa: Infections and Treatment. Informa Health
Care. pp. 83–84 (1994)
[84] Itah A., Essien J. Growth Profile and Hydrocarbonoclastic Potential of Mic roorganisms
Isolated from Tarballs in the Bight of Bonny, Nigeria . World Journal of Microbiology and
Biotechnology. 21 (6–7) 1317 –1322 (2005)
[85] Gerard, Funke, Case (2016). Microbiology: An Introduction (12th ed.). Pe arson Education.
p. 54 (2016)
[86] Kodach L.L., Bos C.L., Durán N., Peppelenbosch M.P., Ferreira C.V., Hardwick J.C.
Violacein synergistically increases 5 -fluorouracil cytotoxicity, induces apoptosis and inhibits
Akt-mediated signal transduction in human colorectal cancer cells . Carcinogenes is 27 (3) 508 –
16 (2006).
[87] de Siqueira I.C., Dias J., Ruf H., Ramos E.A., Maciel E.A., Rolim A., Labur L.,
Vasconcelos L., Silvany C. Chromobacterium violaceum in siblings, Brazil . Emerging Infect.
Dis. 11 (9) 1443 –1145 (2005)
[88] Huang X., Yang C., Lui Y., Wang H., Li Z. Research Progress of Photosynthetic Bacteria
in Water Pollution Governance . China Biotechnology, 34 (11) 119 -124 (2014)
[89] Foy R.H.; Rosell R. Loadings of nitrogen and phosphorus from a Northern Ireland fish
farm . Aquaculture 96, 17–30 (1991)