SCREENING -UL GENETIC AL BOLNAVILOR CU CANCER COLORECTAL PENTRU MUTAȚIILE SOMATICE A GENELOR EGFR, KRAS ȘI BRAF TEZA DE MASTERAT Domeniul de formare… [620300]

UNIVERSITATEA ACADEMIEI DE ȘTIINȚE A MOLDOVEI
FACULTATEA ȘTIINȚE ALE NATURII
CATEDRA BIOLOGIE

LOZOVANU ANA

SCREENING -UL GENETIC AL BOLNAVILOR CU CANCER COLORECTAL PENTRU
MUTAȚIILE SOMATICE A GENELOR EGFR, KRAS ȘI BRAF

TEZA DE MASTERAT

Domeniul de formare profesională 42 Științe ale Naturii
Program de masterat biologie moleculară

Conducător științific: Stratan Valentina
Doctor în biologie

Autor: Lozovanu Ana
BM2m

Admis la susținere
Șef catedră:
conf. univ., Bacal Sfetlana

Chișinău -2017

2
CUPRINS

ADNOTARE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 4
INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 6
1. CANCERUL COLORECTAL ASPECTE MORFOPATOLOGICE PRECUM ȘI ASPECTE
MOLECULARE A GENELOR EGFR, KRAS, BRAF ………………………….. ………………………….. …………………… 9
1.1 Date sta tistice privind CCR în Republica Moldova ………………………….. ………………………….. ……………… 9
1.2 Antomia intestinului Gros ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 11
1.3 Criterii de diagnostic stadializare a CCR ………………………….. ………………………….. ………………………….. 13
1.4 Profilul molecular a cancerului colorectal ………………………….. ………………………….. …………………………. 15
1.4.1 Localizarea moleculară a genelor EGFR,KRAS și BRAF precum și funcția acestora. …………………… 15
1.5 Genele EGFR, KRAS, BRAF și calea de semnalizare RAS -RAF -MAPK ………………………….. …………. 17
1.6 Structura moleculară a genelor MLH1, MSH2 și Calea de reparare a ADN -ului / inac tivarea genelor
MMR ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 20
Calea de reparare a ADN -ului / inactivarea genelor MMR ………………………….. ………………………….. ……….. 21
1.7 Rolul inhibării EGFR în cancerul colorectal și tratamentul medicamentos în CCR …………………………. 22
2. MATERIALE ȘI METODE FOLOSITE ÎN REALIZAREA PROIECTULUI DE CERCETARE …………. 24
2.1 Configurarea setărilor experimentului și startul reacției. ………………………….. ………………………….. ……. 28
2.2 Termenii majori utilizați în analiza PCR în Timp Real. ………………………….. ………………………….. ………. 29
2.3 Modificarea bisulfidică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 30
3. REZULTATE ȘI DISCUȚII OBȚINUTE ÎN URMA PROIECTULUI DE CERCETARE …………………… 33
3.1 Descrierea succintă a genelor EGFR,KRAS,BRAF și stabilirea implicării acestora în indicarea
personalizată preparatelor țintă. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 33
3.2 Studiu de caz privind Supravețuire pacienților cărora li s -a administrat cetuximab …………………………. 36
3.3 Mutațiile evaluate în cadrul genei EGFR, KRAS,BRAF ………………………….. ………………………….. …….. 41
3.4 Descrierea grupelor de pacienți incluși în studiu ………………………….. ………………………….. ……………….. 42
CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 47
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 49
ANEXE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 52
DECLARAȚIA PRIVIND ASUMAREA RĂSPUNDERII ………………………….. ………………………….. …………. 60

3
LISTA ABREVIERILOR
EGFR – epidermal growth factor receptor = receptorul pentru factorul de creștere epidermică
KRAS – Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
BRAF – B-Raf Proto -Oncogenă, Serine/Threonine Kinază
MLH1 -Genă ce codifică proteina de reparare ADN
MSH2 – Genă ce codifică proteina de reparare ADN
CRC – Cancer colorectal
GTP -ază- enzimă Guanozin trifosfază
GEFs -Guanine nucleotide exchange factors
GTP – Guanozin trifosfat
MAPK – mitogen -activated protein kinases
ERK – extracellular signal -regulated kinases
TNM – sistem de stadializare,invazie a țesutului adiacent (T), implicarea nodulilor limfatici (N) și
metastazarea sau răspîndirea cancerului la nivelul altui organ din corp (M)
GDP – Guanozin difosfat
GEF – factori de schimb de nucleotide de gu anină
Grb2 – Growth factor receptor -bound protein 2
SOS1 – Son of sevenless homolog 1
PMS2 -Mismatch repair endonuclease PMS2
(MMR) – gene de repararea nepotrivirilor
HNPCC – hereditary nonpolyposis colorectal cancer

4
ADNOTARE
Numele și prenumele autorului: Ana Lozovanu
Denumirea tezei : SCREENING -UL GENETIC AL BOLNAVILOR CU CANCER
COLORECTAL PENTRU MUTAȚIILE SOMATICE A GENELOR EGFR, KRAS ȘI BRAF
Program de master :Biologie moleculară
Structura lucrării:
Cuvinte cheie: EGFR, KRAS, BRAF,mutații, canc er colorectal, Sindromul Lynch, Metilare,
MLH1,MSH2, Terapie personalizată, Cetuximab, agresivitatea tumorii, recurență
Scopul lucrării: Teza conține 23 figuri, 6 tabele și 3 capitole
Studiul profilelor muat aționale a genelor EGFR, KRAS, BRAF la pacienții cu cancer colorectal
pentru stabilirea strategiei de tratament
Obiectivele lucrării:
 Stabilirea naturii genetice a genelor EGFR, KRAS, BRAF și gradul de implicarea în căile de
reglaj a funcțiilor celulelor.
• Stabilirea importanței determinării mutațiilor genelor EGFR, KRAS și BRAF pentru alegerea
tratamentului de precizie.
• Analiza variației acumulării mutațiilor somatice la pacienți cu CCR spontan și la pacienții cu
predispunere familială conform criteriilor Amsterdam.
• Analiza profilului genetic pentru genele studiate la pacienții cu CCR și corelarea mutațiiolor
acestora cu metilarea genelor reparatoare ADN MLH1, MSH2 la pacienții cu predispunere
familială către CCR.
Materiale și metode: Real Time PCR, Soft încorporat Real -Time pentru interpretarea datelor,
Modificare bisulfidică, Electrogoreză, Metode statistice de interpretare a datelor .
Importanța teoretică și practică a lucrării:
Studiu respectiv va permite identificarea unor aspecte moleculare în evoluția cancerului colorectal
prin implicarea factorilor epigenetici ca proces important în acumularea mutațiilor somatice , cu
posibilitatea aplicării lor în practica oncologică și facilitarea luării deciziilor clinice și de tratament .
De asemenea studui va stabili diferențele de acumulare a mutațiilor somatice în adenocarcinoame
sporadice față de celulele cancerigene la pacienții cu predispoziție familială.

5
ANNOTATION
Name and surname of the author: Ana Lozovanu
Title of the thesis: GENETIC SCREENING OF COLORECTAL CANCER DISEASES FOR
SOMATIC MUTATION OF GENES EGFR, KRAS AND BRAF
Master Program: Molecular Biology
Project Structure : The thesis contains 23 figures, 6 tables and 3 chapters
Key words: EGFR, KRAS, BRAF, mutations, colore ctal cancer, Lynch syndrome, Methylation,
MLH1, MSH2, Personalized therapy, Cetuximab, tumor aggressiveness, recurrence
Project Purpose: Study of Mutation Profiles of EGFR, KRAS, BRAF Genes in Colorectal Cancer
Patients to Establish Treatment Strategy
Project objectives:
• Establishing the genetic nature of the EGFR, KRAS, BRAF genes and the degree of involvement
in the pathways of cell functions.
• Establishing the importance of determining mutations in the EGFR, KRAS and BRAF genes for
the choice of p recision treatment.
• Analysis of the variation in the accumulation of somatic mutations in patients with spontaneous
Colorectal cancer and in patients with familial predisposition according to the Amsterdam criteria.
• Analysis of the genetic profile of the ge nes studied in patients with CRC and their mutation
correlation with the methylation of DNA repair gene MLH1, MSH2 in patients wit h familial
predisposition to CRC .
Materials and methods: Real Time PCR, Real -Time Embedded Software for Data Interpretat ion,
Bisulfide Modification, Electrophoresis , Statistical Data Interpretation Methods .
Theoretical and Practical Importance of the Poject:
This study will allow the identification of molecular aspects in the evolution of colorectal cancer
through the invo lvement of epigenetic factors as an important process in the accumulation of
somatic mutations, with the possibility of their application in oncological practice and facilitating
clinical and therapeutic decisions. Also, studies will determine the differen ces in the accumulation
of somatic mutations in sporadic adenocarcinomas to carcinogenic cells in patients with familial
predisposition.

6
INTRODUCERE
Patogeneza cancerului colorectal variază în concordan ță cu evenimentele genetice sau
epigenetice, car e sunt legate unele cu altele prin grade diferite. Astfel procesele genetice și
epigenetice sunt direct responsabile de evenimente specifice în decursul evoluției somatice
Darwiniene a cancerului colorectal. Carcinogeneza ca proces de transformare a celulei normale în
celulă canceroasă impli că mai multe etape iar natura lor este diferită. Aceasta implică mutații
somatice în genomul celulei cît și acumularea modificărilor epigenetice ( metilarea genelor și
inactivarea acestora) fie induse de factori exteriori fie care apar spont an în timpul replicării celulare .
Cu atât mai mult, genomul celular poate dobândi evenimente epigenetice apte de a conduce la
modificări chimice ale genomului și a cromatinei. Fiecare astfel de mutație pare a conferi celulei
recipiente u n anumit avantaj față de alte celule . Înțelegerea caracteristicilor de bază a acestui proces
evoluționar au implicații evidente și importante atât pentru cercetare științifică cât și cea clinică .
Datele statistice arată că practicarea medicinei de precizie bazate pe profilarea molecular -genetică a
tumorilor, conduce la creșteri semnificative a indicatorilor ratei de supraviețuire globale și a ratei de
supraviețuire fără progresie a pacienților cu anumite sub -tipuri de tumori. Aplicarea testelor genetice
permite identificarea și urmărirea familiilor de risc, care necesită o supraveghere vigilentă și
recomandări speciale din partea medicului pentru micș orarea riscului de apariție a cancerului.
Studiul respectiv va elucida doar un aspect al cumulării mutațiilor somatice ce va oferi răspunsul
privind importanța cunoașterii statutului mutațional al genelor EGFR KRAS și BRAF în alegerea
strategiei corecte de tratament în cancerul colorectal precum și activității genelor de reparate ADN
MLH1, MSH2 în vederea a reduce rii numărul de mutații a genelor incluse în studiu . Studiu va
clarifica gradul de acumulare a mutațiilor somatice în dependență de tipul adenocarcinoamelor
spontane sau cu predispunere familială.
Celulele canceroase se bazează pe semnalizare a rețelelor care auto -furnizează suficiente
semnale de creștere , contrar semnalele lor apoptozei sau inhibitor ilor de creștere. A cest lucru se
datoreaz ă mai multor mutații active în protooncogene și în geneler supresoare tumorale care duc la
pierdere funcțională a acestora. Genele KRAS și BRAF sunt “drivere” oncogenice majore ale
cancerului colorectal (CRC). KRAS, o mică GTP -ază, acționează ca un releu central pentru
semnalele provenite de la receptori tirozin kinazici cum ar fi familia EGFR în epiteli ul intesti nal și
în multe alte țesuturi [1 ]. Receptor tirozin kinaze stimulează activitatea KRAS prin GEFs (Guanine
nucleotide exchange factors) care activează KRAS prin favorizarea legării GTP. BRAF este o serin –
treonin kinază care poate fi activată prin KRAS și reprezintă elementul de nivel superior al cascadei

7
kinazice RAF -MEK -ERK (MAPK). Semnalele MAPK reglează proliferarea, diferențierea,
motilitatea celulară și alte aspecte ale activității celulare prin fosforilarea multor substraturi ERK,
cum ar fi componentele de citoschelet și factori de transcripție. KRAS poate activa, deasemenea și
prin alte căi de semnalizare în plus față de cascada MAPK. Una dintre acestea este axa PIK3CA –
AKT -mTOR, care regleaza procesul de translație și supraviețuirea celulară . Împreună, cascada MEK
si căile de semnalizare intersectate formeaza o rețe a extrem de conectatată în CCR[1 ]. Țînînd cont
de căile de semnalizare în care se implică genele menționate anterior precum și importanța acestora
în stabilirea evoluției nemijoloc ite a CCR și identificarea unor targhet -uri terapeutice s -a propus
următorul scop și obiective a studiului:
Scop:
Studiul profilelor muataționale a genelor EGFR, KRAS, BRAF la pacienții cu cancer
colorectal pentru stabilirea strategiei de tratament
Obiective:
• Stabilirea naturii genetice a genelor EGFR, KRAS, BRAF și gradul de implicarea în căile de
reglaj a funcțiilor celulelor.
• Stabilirea importanței determinării mutațiilor genelor EGFR, KRAS și BRAF pentru alegerea
tratamentului de precizie .
• Analiza variației acumulării mutațiilor somatice la pacienți cu CCR spontan și la pacienții cu
predispunere familială conform criteriilor Amsterdam.
• Analiza profilului genetic pentru genele studiate la pacienții cu CCR și corelarea mutațiiolor
acestora cu metilarea genelor reparatoare ADN MLH1, MSH2 la pacienții cu predispunere
familială către CCR.
Obținerea informației genetice din întregul genom în scopul formării deciziilor clinice, este
mai puțin potrivită din cauza costurilor mari/exagerate și a numă rului vast de variante genetice cu
implicare clinică necunoscută. Din aspectele date, evaluarea simultantă a gene lor asociate cu
cancerul devine mai relevantă din punct de vedere aplicativ. Tehnicile de amplificare și detectare a
acidului nucleic sunt prin tre cele mai valoroase instrumente ale cercetării biologice de astăzi.
Tehnica Real -Time PCR utilizînd probele TaqMan este concepută pentru a fi sensibilă, specifică și

8
ușor de utilizat. Testele TaqMan Mutation Detection sunt produse de de Ta qMan PCR (tehnologia
castPCR) specifică alelei, pentru a detecta și măsura mutațiile somatice în gene asociate cancerului .
Utilizarea genelor EGFR, KRAS și BRAF respective în studierea evoluției somatice a
cancerului colorectal și respectiv căilor de semnalizare i mplicate ar putea identifica noi marke ri
specific stadiului bolii, ținte terapeutice, sau utilizarea combinațiilor de variante genetice cunoscute
pentru caracterizarea moleculară a stadiilor de carcinogeneză în cancerul colorectal.
Prezicerea stadiului bol ii din punct de vedere molecular și a prognosticului este vitală pentru
alegerea unui plan terapeutic optim și, în special, pentru identificarea pacienților cu risc crescut care
ar avea indicație de terapie adjuvantă. Factorii de prognostic cu cea mai mare pondere în cancerul
colorectal sunt în continuare factorii histopatologici. Dintre aceștia, în primul rând stadiul tumoral,
dar și gradul de diferențire și tipul histologic sunt fa ctori bine cunoscuți în prezent, pe cînd aspectele
moleculare și implicarea acestora în procesul de tratament a CCR abia se studiază pentru a fi
implimentate în Republica Moldova.
Aspectele moleculare care determină evoluția somatică Darwiniană a cancerului colorectal
de la celula normală la celula neoplastică și inclusiv prog resia aberațiilor genetice și epigenetice sunt
nu până la urmă cunoscute.
Acest studiu se concentrează pe histopat ologia carcinomului colorectal și asocierea acestora
cu gradul de evenimente genetice și epigenetice cît și corelația dintre ele pentru aleger ea corectă a
strategiei de tratament .
Studiu respectiv va permite identificarea unor aspecte moleculare în evoluția cancerului
colorectal prin implicar ea factorilor epigenetici ca proces important în acumularea mutațiilor
somatice , cu posibilitatea aplicării lor în practica oncologică și facilitarea luării deciziilor clinice.

9
1. CANCERUL COLORECTAL ASPECTE MORFOPATOLOGICE PRECUM
ȘI ASPECTE MOLECULARE A GENELOR EGFR, KRAS, BRAF
Cancerul este o problemă de sănătate publică majoră atît la nivel glo bal, regional cît și
național. Cancerul reprezintă deja principala cauza de deces în multe țari cu venituri înalte și o cauză
majoră a morbidității și mortalității în majoritatea țărilor lumii. Ca grup de maladie, cancerul este
cea mai importantă cauză de deces la nivel mondial, cu un număr de decese care depășesc cele
cauzate de boală cardiacă ischemică sau de orice alt grup de boli specifice [2].
1.1 Date statistice privind CCR în Republica Moldova
În Republica Moldova cancerul reprezintă același pattern specific celui mondial și ocupă
locul doi printre principalele cauzele de deces ale populației (după decesele cauzate de bolile
aparatului circulator). Caracteristic țării noastre este depistarea tumorala tardivă în circa jumătate de
cazuri și concentrare a serviciilor de tratament specializat în municipiul Chișinău, fapt ce
influențează negativ șansele de supraviețuire a persoanei, mortalitatea prin cancer și produce
creșterea considerabilă a costurilor de tratament a acestei boli și altor costuri sociale, asociate
maladiei: excluderea persoanei din activitatea socio -economică, îngrijire, timp și resurse din partea
altor mem bri ai familiei, transport etc [2]..
În Republica Moldova tumorile ocupă locul doi printre principalele cauzele de deces a
populației, ș i înregistrează anual circa 2800 de Ani d e Viață Pierduți prematuri. La fel, ca și î n țările
europene incidenta și mortalitatea prin cancer sunt în continuă creștere și comparativ cu anul 1970
acestea s -au dublat (Figura 1 .1.1).

10
Figura 1 .1.1. Incidența și mortalitatea prin tumori maligne în Republica Moldova, l a 100 mii
populație, 1970 -2014
Cancerul colorectal (CCR) reprezintă 15% din toate cancerele, a treia cauză de deces prin
neoplazii în întreaga lume cu circa 400.000 de decese anual. Inc idența netă a CCR în țările Uniunii
Europene este de 58/100.000/an, iar mortalitatea este de 30/100.000 locuitori/an [1]. În Republica
Moldova incidența, prevalența și mortalitatea a CCR este în continuă creștere( Fig.1. 1.2), astfel,
devine elucidată importanța majoră a problemelor legate de diagnosticul, tratamentul și profilaxia
CCR [2,1].

Fig.1.1.2 Incidența, prevalența, mortalitatea a CCR în Republica Moldova conform Cancer
Registru
Pacienții diagnosticați cu CCR în stadii incipiente I și II sunt tratați în mod corespunzător la
IMSP Institutul Oncologic, au o bună șansă de a fi vindecați și de a supravețui. Din păcate
procentajul de pacienți diagnosticați în stadiul I și II este scăz ut în Republica Moldova. Aproximativ
37% sînt diagnosticați în stadiI avansate (Tab.1.1.1) [2].

28,21 28,47 31,93 33,77 35,58 139,51 141,27 147,39 149,73 158,87
20,56 21,73 23,09 23,59 26,53
020406080100120140160180
2012 2013 2014 2015 2016Incidența
Prevalența
Mortalitatea

11
Tab.1 .1.1 Depistarea după stadii cu tumori maligne inclusive tumorile maligne ale rectului și
colonului în Republica Moldova anii 2005 -2014
Anul Stadii
I II III IV
c.a % c.a % c.a % c.a %
2005 672 9,7 1415 20,4 1922 27,6 1839 26,5
2006 747 10,1 1447 19,7 2092 28,4 1990 27,0
2007 779 10,4 1386 18,5 2035 27,1 2098 28,0
2008 865 11,4 1572 20,7 1965 25,8 2129 28,0
2009 917 11,4 1684 20,9 2121 26,4 2267 28,2
2010 892 11,4 1598 20,4 1947 24,8 2410 30,7
2011 1123 13,9 1651 20,4 1926 23,8 2083 25,8
2012 1283 15,6 1795 21,9 1983 24,2 2077 25,3
2013 1153 13,7 1738 20,6 1977 23,4 2301 27,3
2014 1443 16,3 1883 21,3 1818 20,5 2340 26,4
Se observă o îmbunătățire indicilor de depistare precoce a persoanelor cu CCR, ceea ce se
datorează creșterii nivelului de diagnostic a cancerului colorectal î n cadrul Institutului Oncologic (
98,2% din tumorile maligne sînt diagnosticate în cadrul Centrului Consultativ Diagnostic a IMSP
IO) [3].
1.2 Antomia intestinului Gros
Este a doua porțiune a intestinului , continuă intestinului subțire și se deschide la exterior
prin orificiul anal. Are în medie o lungime de 1,60m, diametrul lui este de 7 cm la origin e și
descrește pe porținea terminală la 3 -3,5cm. Intestinul gros înconjoară ca o ramă intestinal subțire și
se împarte în cec, colon(cu subdiviziunile sale: ascendent, transvers, descendent, sigmoidian) și rect.
Aceste împărțiri se fac după așezările topog rafice și a schimbărilor de directive a fiecărui segment.
Teniile colonului sunt trei benzi musculare late de aproximatic 0,5 cm. Acestea pornesc de la
inserția apendicelui vermiform, se desfășoară dea lungul cecului și colonului și își pierd
individualita tea la nivelul rectului continuîndu -se cu stratul musc ular longitudinal al acestuia [4].
Peretele intestinului gros este constituit din patru tunici caracteristici canalului alimentar.
Tunica seroasă este reprezentată la nivelul cecului, colonuluiși a pri mei porțiuni a rectului de către
peritoneu, la nivelul ultemei porțiuni a rectului de către o adventitia, dedesubt la peritoneu este

12
dublat de o pătură subțire de țesut conjunctiv lax stratul subseros. Peritoneul se comport ă diferit în
dependent de segmen tal de intestine la care ne referim.
Tunica musculară este considerate a fi formată din 2 straturi musculare, stratul exter n are firbre
longitudinale grupa te în cele trei tenii, între tenii se găse sc alte fibre longitudinale car e sunt extreme
de rare și subțiri. Stratul intern este continuu, uniform și are fibre dispuse circular.
Stratul submucosare o structură obișnuită, acesta conține vase limfatice, sangvine, formațiuni
nervoase, precum și foliculi limfatici solitari.
Tunica mucoasă e mai groasă decît a intestinului subțire, nu are nici plice circulare nici vilozități
intestinale ( Fig.1.2.1 ).
Cînd intestinal gros este gol mucoasa formează o serie de cute care dispar la umplerea
intestinului. Mucoasa are o serie de foliculi limfatici solitari. Ca str uctură mucoasa este formată
dintr -un epiteliu cilindric cu numeroase glande și dintr -un corion cu infiltrații limfoide.
Limfaticele joacă un rol în patologia regiunii. Ele iau naștere din rețelele de capilare limfatice situate
sub tunica musculară [4].

Fig.1. 2.1 Structura anatomică și straturile musculare a Intestinului Gros

13
1.3 Criterii de diagnostic stadializare a CCR
O dificultate în diagnosticul precoce al CCR îl reprezintă lipsa simptomelor specifice (dureri
abdominale, tulburări de transit, hemo ragii digestive inferioare), acestea apărînd și în afecțiuni
benigne. Odată cu stabilirea și evoluția policlonală a CCR acesta are mai multe căi de extindere ceea
ce presupune invazia altor organe și a altor regiuni.
Căi de extindere a CCR:
a) invazie dire ctă (extindere circulară, longitudinală, în profunzime, invazia capilarelor limfatice și
venoase și invazie perineurală);
b) diseminare limfatică ( adenopatii perirectale, la 40 -70% cazuri, ulterior dea lungul axelor arteriale
majore);
c) diseminare hemato genă ( drenaj în sistemul port, ficat centrul de elective al metastazelor, cu
excepția rectului inferior și al canalului anal care drenează prin sistemul venei cave inferioare,
primul sediu al metastazelor în acest caz este plămînul, alte sedii ale metasta zelor sunt ovarele, osul,
suprarenalele sistemul nervos central.
d) diseminare transperitoneală ( rezultă carcinomatoză peritoneală)
e) intraoperatorie ( evitarea acesteia presupune o tehnică chirurgicală de înaltă performanță) [5].
În momentul depistării cancerului se utilizează diferite metode pentru evaluarea gradului de
extindere a tumorii process numit stadializare.
Determinarea stadiului este fundamental pentru luarea deciziei corecte cu privire la
tratament și pentru a determina prognoasticul pacien tului ( cu cît stadiul mai mic cu atît prognosticul
mai bun).Cel mai des stadializare se realizează de două ori. După examinările clinice și radiologice
medicii stabilesc stadiul și după intervenția chirurgicală prin examinarea histopatologică a tumorii
extirpate. Examinarea histopatologică trebuie să examinarea tuturor marginilor de rezecție a
specimenului chirurgical pentru a evalua dacă tumarea s -a extins în afara țesutului rezectat. Sunt
cunoscute mai multe sisteme de stadializare precum:
1. TNM
2.ASTLER -COLLER( DUKES modificată)
Cel mai adesea se folosește sistemul de stadializare TNM. Prin conbinația dintre mărimea
tumorii și gradul de invazie a țesutului adiacent (T), implicarea nodulilor limfatici (N) și
metastazarea sau răspîndirea cancerului la nivelul altui organ din corp (M) (Tab. 1.3.1), în timpul
stadializării chirurgicale pentru a determina cu exacticitate numărul de ganglioni limfatici implicați,
trebuie extirpate cel puțin 12 ganglioni limfatici [6].
Tab 1.3.1 Criterii de stadializar a CCR conform sistemului de stadializare TNM

14
Stadiu Definiție Categorie
Stadiul 0 Carcinom in situ: o tumoare malignă limitată la nivelul mucoasei și
care nu invadează submucoasa Cancer
colorectal
localizat Stadiul I Tumoarea invadează submucoasa sau stratul muscular
Stadiul IIA Tumoarea invadează stratul muscular pînă în subseroasă sau pînă în
țesuturile învecinate din spatial intraperitoneal
Stadiul II B Tumoarea penetrează peritoneul invadează direct organe sau structure
din spatial intraperit oneal
Stadiul III Tumoarea a produs metastaze în ganglioni limfatici regionali. Stadul
III este împărțit în diverse stadia în dependent de gradul de invazie a
tumorii locale și de numărul de ganglioni cu metastaze
Stadiul IIIA: tumoarea invadează submu coasa sau starul muscular și
s-a răspîndit în 1 -3 ganglioni limfatici regionali
Stadiul IIIB: tumoarea invadează subseroasa, peritoneul visceral sau
organelle învecinate și s -a răspîndit la 1 -3 ganglioni limfatici
regionali
Stadiul IIIC: tumoarea indiffer ent de gradul de invazie locală s -a
răspîndit la 4 sau mai mulți ganglioni limfatici regionali
Stadiul IV Tumoarea s -a răspîndit la organele îndepărtate, indifferent de gradul
de invazie locală, și/sau de răspîndirea la ganglionii limfatici
regionali Cancer
colorectal
avansat
Depistarea cancerului în stadii tardive necesită cheltuieli mari pentru tratament, pentru
reabilitarea pacienților cu rezultate slabe în ceea ce privește supravețuirea. Povara socioeconomică și
condițiile financiare limitare agravează situația în RM. Exis tă multe studii la nivel mondial care
demonstrează eficacitatea screening -ului cancerului colorectal. Studii organizate în ceea ce privește
screening -ul cancerului colorectal au demonstrat potențialul său de a reduce incidența prin tratarea
leziunilor pr ecanceroase cît și mortalitatea prin tratarea stadiilor incipiente, creșterea supravețuirii.
Colonoscopia este metoda de referință care permite atît examinarea completă a mucoasei intestinale
cît și depistarea precoce și profilaxia cancerului. Ea permite de a depista și a înlătura polipii precum
și a efec tua biopsia tumorii colonului [3 ].
În transformarea mucoasei sănătoase în cancer intervin atît factorii de mediu cît și cei
genetici. Polipii adenomatoși sunt precursorii a peste 90% din cancerele colorec tale, cel mai adesea

15
pentru cele situate la nivelul colonul ui sting. Riscul malignizării este mai mare pentru polipii cu
nivelul de displazie mare de natură viloasă sau tubulo -viloasă și de dimensiuni mai mari de 1 cm.
Profilaxia presupune depistarea polipilor și înlăturarea celor voluminoși.
Pe lîngă factorii de mediu și factorii genetici familiali multe modificări genetice sunt dobîndite pe
parcursul vieții și apar în în polipi cu di menșiuni mai mari de 1 cm ceea ce și es te cheia malignizării
acestora.
1.4 Profilul molecular a cancerului colorectal
Cancerul colorectal se dezvoltă ca urmare a acumulării progresive a modificărilor genetice și
epigenetice care duc la transformarea epite liul colonului normal la adenocarcinomul de colon. Acest
proces de carcinogeneză a colonului, care a fost denumit pas secvențial de polip -carcinom, se
consideră că are în mod obișnuit peste 10 -15 ani și implică modificări histologice și moleculare
concomit ente. Modificările moleculare implică spre exemplu schimbări în secvența ADN a unei
gene (eveniment numit muație), modificarea numărului sau pierderea de cromozomi ( eveniment
numit instabilitate cromozomială) și modificări a lungimii repetitive specifice ale ADN -ului
(eveniment numit instabilitatea a microsateliților). Realizarea profilului molecular este o tehnică de
revelare a întregului set de gene exprimate într -o celulă sau într -un țesut. Această tehnică se
folosește din ce în ce mai mult pentru a det ermina profilul genelor și al alterațiilor genetice
exprimate în cancer. Comaprarea așa numitor profiluri moleculare cu anumite tipuri de cancer și
corelarea acestora cu informațiile clinice ajută medicii să înțeleagă originea cancerului, potențialul
său d e metastazare, capacitatea de răspuns la tratament și probabilitatea de recurență. Pentru
cancerul de colon s -au descris mai multe alterări ale genelor, spre exemplu mutațiile genelor KRAS ,
mutațiile genelor BRAF, MLH1 etc[6]. Prezența sau absemța acestor profiluri moleculare ajută la
clasificarea tumorilor colorectale și la stabilirea tratamentului optim.
1.4.1 Localizarea moleculară a genelor EGFR,KRAS și BRAF precum și funcția acestora.
EGFR
Localizarea citogenetică: 7p11.2, care este brațul scurt(p) al cromozomului 7 la poziția 11.2 (fig.
1.4.1.1 )
Localizarea molecular ă: Perechi de baze de la 55,019,032 pînă 55207338 pe cromozomul 7 [7].
Proteina atribuită genei EGFR:
Mărimea: 1210 aminoacizi
Masa moleculară: 134277 Da

16

Fig. 1.4.1.1 Localizarea citogenetică a genei EGFR
Func ția normală a genei: Gena EGFR furnizează instrucțiuni pentru realizarea unei proteine
receptor denumite receptorul factorului de creștere epidermic, care acoperă membrana celulară astfel
încât un capăt al protei nei să rămână în interiorul celulei, iar celălalt capăt să provină de la suprafața
exterioară a celulei. Această poziționare permite receptorului să se atașeze (se leagă) de alte
proteine, numite liganzi, în afara celulei și să primească semnale care ajută celulele să răspundă
mediului înconjurător [8]. Liganzii și receptorii se potrivesc împreună ca cheile și lacătul. Receptorul
factorului de creștere epidermal se leagă la cel puțin șapte liganzi diferiți. Legarea unui ligand la un
receptor al factorului de creștere epidermal permite receptorului să se atașeze la o proteină receptor
de proximitate (care dimerizează), activând complexul receptor. Ca rezultat, căile de semnalizare din
cadrul celulei sunt declanșate, care promovează creșterea și divizarea celul elor (proliferarea) și
supraviețuirea celulară [7,32].
KRAS
Localizarea citogenetică: 12p12.1, brațul scurt (p) al cromozomului 12 în poziția 12.1 (fig 1.4.1.2 )
Localizarea moleculară: perechile de bază 25,204,789 până la 25,252,093 pe cromozomul 12

Fig.1. 4.1 .2 Localizarea citogenetică a genei KRAS

Funcția normală a genei: Gena KRAS ofer ă instrucțiuni pentru sinteza unei proteine numite
K-Ras, care este implicată în principal în reglarea diviziunii celulare. Ca parte a unei căi de
semnalizare cun oscută sub numele de cale RAS / MAPK, proteina transmite semnale din afara
celulei către nucleul celulei. Aceste semnale instruiesc celula să crească și să împartă sau să se
maturizeze și să preia funcții specializate (diferențiere). Proteina K -Ras est e o GTPază, ceea ce

17
înseamnă că convertește o moleculă numită GTP într-o altă moleculă numită GDP . Proteina K -Ras
acționează ca un întrerupător și este pornit și oprit de moleculele GTP și GDP. Pentru transmiterea
semnalelor, proteina K -Ras trebuie pornit ă prin atașarea (legarea) a unei moleculă de GTP. Proteina
K-Ras este dezactivată (inactivată) at unci când convertește GTP la GDP . Când prote ina este legată
de GDP, nu transmite semnale către nucleul celulei. Gena KRAS aparține unei clase de gene
cunoscute sub numele de oncogene. Când sunt mutate, oncogenele au potențialul de a determina
celulele normale să devină canceroase. Gena KRAS este în familia Ras de oncogene, care include și
alte două gene: HRAS și NRAS. Aceste proteine joacă roluri importante în div iziunea celulară,
diferențierea celulelor și auto -distrugerea celulelor (apoptoza) [7].

BRAF
Localizarea citogenetică: 7q34,brațul lung (q) al cromozomului 7 în poziția 34 (fig. 1.4.1.3 )
Localizarea moleculară: perechi de bază 140,719,331 până la 140,924,764 pe cromozomul 7

Fig. 1.4.1.3 Localizarea citogenetică a genei BRAF
Funcția normală a genei: Gena BRAF oferă instrucțiuni pentru sinteza unei proteine care
ajută la transmiterea semnalelor chim ice din afara celulei către nucleul celulei. Această proteină face
parte dintr -o cale de semnalizare cunoscută sub numele de cale RAS / MAPK, care controlează
câteva funcții importante ale celulelor. În mod specific, calea RAS / MAPK reglează creșterea și
diviziunea (proliferarea) celulelor, procesul prin care celulele mature îndeplinesc funcții specifice
(diferențiere), mișcarea celulară (migrația) și auto -distrugerea celulelor (apoptoza). Semnalizarea
chimică prin această cale este esențială pentru dezvol tarea normală înaintea dividerii. Gena BRAF
aparține unei clase de gene cunoscute sub numele de oncogene. Când sunt mutate, oncogenele au
potențialul de a determina celulele normale să devină canceroase [7].
1.5 Genele EGFR, KRAS , BRAF și calea de semnalizare RAS -RAF -MAPK
Una dintre cele mai proeminente proto -oncogene în carcinogeneza colonului este a membru
al familiei de gene RAS, KRAS2. KRAS2 este cel mai frecvent membru supus procesului de

18
mutageneză din familia RAS în cancerului de colon, deși mutațiile NRAS sunt, de asemenea,
observate într -un procent mic de cancer de colon. KRAS2 este alcătuit din patru exoni care produc
fie o peptidă de 188, fie 189 -aminoacidzi, în funcție de faptul dacă cel de -al patrulea exon supus
procesului de spliceing alternativ. Proteina codificată de KRAS2 ar e trei domenii:
(1) leagă guanozin trifosfat sau difosfat (GTP / GDP),
(2) atașază proteina la partea interioară a membranei plasmatice după modificarea posttranslațională
a capătului carboxi terminal,
(3) in teracționează cu țintele celulare [9].
KRAS2 inactivă leagă GDP, iar la activarea sa GDP -ul este schimbat pentru GTP. KRAS2
activat interacționează apoi cu molecule de semnalizare din aval pentru a propaga proliferarea
celulelor. KRAS2 activat este, în m od normal, imediat dezactivat prin hidroliza GTP intrinsecă.
Mutațiile oncogene ale KRAS2 distrug activitatea GTP -azei KRAS2 și îi permit să rămână într -o
stare activă. De fapt, cele mai frecvente mutații observate în cancerele umane implică codonii 12, 1 3
și 61, care corespund ariilor din domeniile de legare a GTP – /GDP în proteina KRAS2. Consecința
acestor mutații este că aproximativ 30% din proteina KRAS2 se află în starea legată de GTP
comparativ cu mai puțin de 0,3% în celulele cu KRAS2 de tip sălbati c. Fracțiunea crescută a
KRAS2 activat conduce la activarea căii de semnalizare RAS -RAFMAPK, care promovează
proliferarea celulelor și creșterea supraviețuirii, precum și alte efecte protumorigenice [10,33].
Activarea căii începe atunci când un semnal se leagă la un receptor de proteină tirozin
kinază. Receptorul factorului de creștere epidermic (EGFR) și receptorul factorului de creștere
derivat din plachete (PDGFR) sunt cei mai cunoscuți receptori din cale. Legarea unui ligand la
receptorul EGF induce oligomerizarea receptorului, un procedeu care are ca rezultat juxtapunerea
domeniilor catalitice citoplasmatice într -o manieră care permite activarea activității kinazei și
transfosforilarea. Proteinele adaptoar e, cum ar fi Grb2, sunt acum capabile să recunoască domenii de
omologie secvență 2 (SH2), cum ar fi Shc, care, la rândul lor, recrutează factori de schimb de
nucleotide de guanină (GEF) cum ar fi SOS -1 sau CDC25 la membrana celulară. GEF devine
capabil să interacționeze cu proteinele Ras la membrana celulară pentru a promova o schimbare
conformațională și schimbul de GDP pentru GTP. După activarea Ras, Raf este recrutat la
membrana celulară prin legarea la domeniul I al Ras și, de asemenea, prin legarea lip idelor. Raf este
cel mai bine caracterizat Ras efector și este membru al unei familii de serin / treonin kinaze, care
include Raf -1, A -Raf și B -Raf. Activarea cu Raf stimulează o cascadă de semnalizare prin

19
fosforilarea MAPK care fosforilează și activează succesiv protei nele din aval cum ar fi ERK1
(Fig.1. 5.1.) [34].
Semnalele Ras / Raf / MAPK sunt complexe, existând numeroși pași în care să se țintească
terapii concepute să interfereze cu semnalizarea. Direcționarea căii Ras / Raf / MAPK ar putea fi
realiz ată prin:
1. Inhibarea expresiei proteinei Ras.
2. Inhibarea localizării membranei prin modificări sau trafic post -translațional.
3. Blocarea interacțiunii Ras cu GEF și intensificarea interacțiunilor Ras / GAP.
4. Direcțion area K -ras oncogene (terapii imunologice împotriva K -ras mutante).
5. Inhibarea țintelor din aval ale K -ras cum ar fi Raf și MEK.
Faza I și studiile clinice de fază II care testează aceste abordări sunt în curs de desfășurare [9,35].

Fig.1. 5.1. Activarea ERK este critică pentru un număr mare de răspunsuri celulare induse de Ras.
ERK1 și ERK2 fosforilează și activează o varietate de factori nucleari de transcripție și kinaze.

20

1.6 Structura moleculară a genelor MLH1, MSH2 și Calea de reparare a ADN -ului /
inactivarea genelor MMR

Localizarea citogenetică: 3p22.2, brațul scurt (p) al cromozomului 3 din poziția 22.2 (Fig. 1.6.1)
Localizarea moleculară: perechi de baze de 36,993,350 până la 37,050,846 pe cromozomul 3

Fig. 1.6.1 Localizarea citogenetică a genei MLH1
Gena MLH1 codifică sinteza unei proteine care joacă un rol esențial în repararea ADN -ului.
Această proteină ajută la corectarea greșelilor care se fac atunci când ADN -ul este copiat (replicarea
ADN -ului) în pregătire a pentru diviziunea celulară. Proteina MLH1 se unește cu o altă proteină
numită PMS2 (produsă din gena PMS2), pentru a forma un complex proteic. Acest complex
coordonează activitățile altor proteine care repară greșelile produse în timpul replicării ADN -ului.
Reparațiile se fac prin eliminarea unei secțiuni de ADN care conține greșeli și înlocuirea secțiunii cu
o secvență ADN corectată. Gena MLH1 este un membru al unui set de gene cunoscute sub numele
de gene de reparare nepotrivire (MMR) [8]..
MSH2
Localiz area citogenetică: 2p21 -p16.3, brațul scurt (p) al cromozomului 2 între pozițiile 21 și 16.3
(fig.1.6.2 )
Localizarea moleculară: perechi de bază 47.403.067 până la 47.634.501 pe cromozomul 2

Fig.1.6.2 Localizarea citogenetică a genei MSH2

21

Calea de re parare a ADN -ului / inactivarea genelor MMR
Instabilitatea genomică apare din cauza inactivării mecanismelor normale utilizate de celulă
pentru a -și menține fidelitatea ADN -ului. Defectele din două sisteme care reglementează fidelitatea
ADN -ului, sistemul MMR și repararea bazei de excizie (BER) au fost identificate în subgrupurile
independente ale cancerului de colon. Sistemul de reparare a neconcordanței ADN (cunoscut și ca
sistemul MMR) constă dintr -un complex de proteine care recunosc și repară nepotrivi rile de bază ale
perechilor care apar în timpul replicării ADN -ului [11].
Fenomenul fictiv care reglează expresia genelor fără implicarea în modificarea codului de
bază al ADN -ului este definit ca fiind epigenetic. Modificările epigenetice au fost din ce î n ce mai
recunoscute ca fiind comune și probabil patogene într -o varietate de forme de cancer. Metilarea
ADN -ului, cel mai frecvent studiat fenomen epigenetic care pare să fie modificat în cancer, este
prezent în mod normal în majoritatea genomului și est e menținut în modele relativ stabile, care sunt
stabilite în timpul dezvoltării. Semnificația acestor modificări epigenetice a fost un punct de
controversă substanțială. De exemplu, dacă metilarea aberantă este, în general, o cauză sau un efect
al formării cancerului, rămâne nerezolvată, deoarece mecanismul responsabil pentru metilarea
aberantă a ADN nu a fost încă identificat. Cu toate acestea, există date substanțiale că metilarea
aberantă a cel puțin unor gene, cum ar fi ML H1, este patogenică în cancer. Inactivarea MLH1, un
membru al sistemului MMR, joacă, un rol de inițiere în patogeneza cancerelor de colon [12].

Sindromul Lynch numit și cancer colorectal nonpolipozic ereditar
HNPCC este o tulburare autosomal -dominantă în care pacienții afectați dezvolt ă un număr
mic de polipi adenomatoși colorectali și prezintă un risc crescut de cancer colorectal. Sindromul
HNPCC a fost în mod tradițional diagnosticat pe baza istoricului familial al malignității. Au fost
stabilite criteriile inițiale Amsterdam care de finesc un HNPCC familial. Pacienții care suferă de
această boală prezintă anumite mutații genetice care determină eșecul mecanismelor de reparare a
ADN -ului. În consecință o tumoare colorectală benignă poate evolua în cancer într -un rit m mai
accentuat decît la pacienții care nu au sindromul Lynch [12].
Criteriile Amsterdam II
Acestea definesc cerințele minime pentru un diagnostic clinic al sindromului Lynch / (cancerul
colorectal nonpolipozic ereditar (HNPCC))

22
Aici ar trebui să fie cel pu țin trei rude cu un cancer asociat cu Lynch / HNPCC (cancer al
colorectului, endometrului, intestinului subțire, ureterului sau pelvisului renal) precu și să se
respecte următoarele situații:
• Trebuie să fie o relație de prim grad cu celelalte două
• Trebuie să fie afectate cel puțin două generații succesive
• Cel puțin un pacient ar trebui să fie diagnosticat înainte de vârsta de 50 de ani
• Polipoza adenomatoasă familială ar trebui exclusă
• Tumorile trebuie verificate prin examen patologic [13].
1.7 Rolul inhibării EGFR în cancerul colorectal și tratamentul medicamentos în CCR
Receptorul factorului de creștere epidermal (EGFR), cunoscut și ca receptorul ErbB1 sau
HER1, este membru al familiei de proteine ErbB care constă, de asemenea, din ErbB2 (HER2 /
neu), ErbB3 (HER3) și ErbB4 (HER4). Acești receptori declanșează modalitățile de semnalizare
complexe și interdependente care, atunci când sunt dereglementate, pot duce la transformări
maligne. EGFR a fost identificat în anii 1980 ca o oncogenă celulară . Expresia EGFR a fost corelată
cu diferite procese celulare implicate în carcinogeneza, cum ar fi proliferarea celulelor, inhibarea
apoptozei, angiogeneza, motilitatea celulară și metastazarea, iar supraexpresia sa a fost asociată cu
prognostic slab. Acti varea EGFR joacă, de asemenea, un rol în rezistența la chimioterapie și
radioterapie [14,15] ..
Tratamentul medicamentos în CCR
Tratamentul radical al pacienților cu CCR reprezintă unica șansă de vindecare. Tratamentul
paliativ este îndreptat spre ameliorarea calității vieții la pacienții cu CC inoperabil. Tratamentul
CCR constă în exereza tumorii în limitele securității oncologice , exereza Mt și Rc rezecabile,
chimio – și radioterapie pre – și postoperatorie conform schemelor moderne de tratament indicate în
protocoalele clinice naționale.
Terapia biologică țintită denumește utilizarea terapeutică a substanțelor specia l create care ar
interfera cu p rocesul de creștere a celulelor tumorale.
Cetuximab este un anticorp monoclonal chimeric de tip IgG1 produs în tr-o linie de celule de
mamifer (Sp2/0) prin tehnologia ADN -ului recombinant [16].
Cetuximab și panitumumab sunt anticorpi monocl onali care acționează ca antagoniști ai receptorului
factorului de creștere epidermal(EGFR), o structură de pe suprafața tuturor celulelor normale care le
ajută să crească. Celulele colorectale au pe suprafață cantități mari de EGFR astfel legarea

23
cetuxima b sau panitumumab de EGFR interferează cu creșterea celulelor tumorale și produce
moartea acestora [17].
Ragorafenib este o terpie orală țintită, un inhibitor de multikinază care țintește receptorii de tirozin
kinază care sunt reglatori cheie în procesel e normale din celule netumorale, dar care au deasemene
un rol critic în dezvoltarea și progresia tumorii [17,30 ].
Realizarea profilului molecular al tumorii ajută la stabilirea celei mai potrivite variante de terapie
combinantă. Circa 50% din cancerele colo rectale metastatice au o anumită mutație în KRAS iar 5 –
10% au mutația în BRAF. Combinația dintre cetuximab și alte medicamente de linia1 este
recomandat pentru pacienții ce au mutație în KRAS,BRAF. Cetuximab și panitumumab nu sunt
active împotriva tumorilo r cu mutația BRAF [6,30,36 ].

24
2. MATERIALE ȘI METODE FOLOSITE ÎN REALIZAREA PROIECTULUI
DE CERCETARE
Reacția de polimerizare în lanț (PCR) este una dintre cele mai puternice tehnologii din
domeniul biologiei moleculare. Folosind PCR, secvențele specifc din cadrul ADN sau cADN pot fi
copiate sau "amplificate" de mii de ori folosind -use polimerază ADN termică stabilă și cicluri
termice.
Avantajele PCR în timp real includ:
• Capacitatea de a monitoriza progresul reacției PCR așa cum apar e în timp real;
• Abilitatea de a măsura cu precizie cantitatea de amplicon la fiecare ciclu, care permite
cuantificarea foarte exactă a cantității de ADN folosit;
• O gamă dinamică sporită de detectare;
• Amplificarea și detectarea apar într -un singur tub , eliminând manipulările post -PCR [18].
Analizele de detecție a mutației TaqMan detectează și măsoară mutațiile somatice în Genele
care sunt asociate cu cancerul. Testele sunt compatibile cu diferite tipuri de probe, cum ar fi linii
celulare, mostre de țes ut FFPE și mostre de țesut înghețat proaspăt. Analizele de detectare a mutației
TaqMan sunt realizate de tehnologia castPCR, care se referă la TaqMan Competitive Allele -Specific
PCR. Tehnologia castPCR este foarte specifică și sensibilă și poate detecta ș i cuantifica cantități
mici de ADN mutant într -o probă care conține canti tăți mari de ADN de tip sălbatic. Toate țintele de
mutaționale provin din baza de date cuprinzătoare COSMIC. Selecția mutațiilor și a genelor incluse
în studiu sa bazat pe frecvența ap ariției și a contribuției principalilor cercetători în domeniul
cancerului.
Fiecare analiză conține:
• ASP un primer specific pentru alele care detectează alela mutantă ;
• un blocant de oligonucleotide MGB care suprimă alela de tip sălbatic ;
• LSP un primer specific pentru locus ;
• o sondă MGB marcată cu coloranți TaqMan FAM specific unui locus (fig 2.1) [19]..

25

Fig 2.1 Analiza alelelor mutante folosind tehnologia castPCR. ASP – Primer specific alelei, ASB –
Blocat or specific pentru allele (MGB), LST – sonda TaqMan specifică Locus ului , LSP – primer
specific Locus ului.
Analizele genetice de referință detectează genele în care se găsesc mutațiile țintă. Concepute
pentru a amplifica o regiune lipsită de mutație și polimorfism a genei țintă. Într-un experiment de
detectare a mutației, o probă cu mutație necunoscută este detectată în timp real folosindu -se
instrumentul Real TimePCR individual cu unul sau mai multe teste care detecrează alele mutante în
cadrul unei gene ș i gena de referință corespunzătoare. După amplificare, valorile CT sunt
determinate de software -ul instrumentului Real Time PCR Applied Biosystems. Fișierele de date
care conțin valorile probelor CT pot fi exportate din software -ul instrumentului și importate î ntr-un
instrument de analiză a datelor (Fig 2.2). Graficele de amplificare sunt create atunci când semnalul
fluorescent din fiecare probă este reprezentat grafic față de numărul ciclului; Prin urmare, graficele
de amplificare reprezintă acumularea de produ s pe durata experimentului PCR în timp real [18,19].
Etapele experimentului de detectare a mutațiilor genelor EGFR, KRAS și BRAF:
Se combină gADN purificat cu una sau mai multe teste(primeri) ale alelelor mutante și un test de
referință genetică corespunz ător. Pentru fiecare PCR în timp real, combinați gDNA cu TaqMan
Genotyping Master Mix. Mixul principal conține AmpliTaq Gold ADN Polymerază, UP (Ultra
Pure), dNTP -uri și tampon necesare pentru reacțiile qPCR. Se exportă tabelul cu rezultate din
software -ul sistemului RT PCR ca fișiere .csv sau .txt sau. xls [19]..

26

Fig 2.2 Graficele de amplificare. Gena de referință precum și mutațiile gene care sunt detectate.
Pentru studiu nemijlocit s -a folosit ADN -ul extras din următoarele probe:
 4 probe de țesut tumoral (adenocarcinoame confirmate histopatologic) parafinizate
 4 probe de țesut tumoral de la
pacienți cu suspiciune către sindromul
Lynch care corespundeau criteriilor
Amsterdam
 1 probă o probă de sînge de la
pacient un pacient din cei 4 care au
suspiciune către sidromul Lynch
Pentru extragere ADN s -a folosit
următoarele Kituri de extragere
Pentru țesutul parafinizat: PureLink
Genomic DNA Mini Kit, tehnologia de
izolare: coloana de siliciu. Deparafinizare
țesutului sa realizat prin adăugarea în
tubul ce conținea 8 secțiuni de țesut

Fig.2.3 Secțiuni de țesut tumoral parafinizat în tuburi
eppendorf 1,5ml

27
parafinizat (Fig. 2.3 ) a 1ml de xilen și prin spălarea consecutivă de două ori a țesutului deparafinizat
cu alcool etilic de 96% după care s -a urmat protocolul clasic de extragere conform intrucțiunilor.

Pentru țesutul proaspăt și sînge : GeneJET Genomic DNA Purification Kit,
Tehnologia de izolare: coloana de siliciu.
Atît țesutul parafinizat cît și cel proaspăt s -a lăsat pentru liza celulară peste noapte.
Cuantificarea ADN -ului s -a realizat folosind -use spectofotometru Qubit 3.0 utilizând testele de
cuantificare bazate pe fluorescență foarte sensibile. Coloranții fluorescenți utilizați în aceste teste
emit semnale numai atunci când sunt legați de molecule țintă specifice, chiar și la concentrații
scăzute, reducând astfel efectele contaminanților, inclusiv ADN sau ARN degradat. Designul
integrat al instrumentului și al testelor are ca rezultat o cuantificare care este mult mai sensibilă
decât absorbanța UV, făcând acest sistem esențial pentru cuantificarea probelor. Testul Qubit®
dsDNA BR Assay Kit (Fig 2.4 ) este foarte selectiv pentru ADN dublu catenar (dsDNA) și este
proiectat să fie exact pentru concentrația inițială a probei de la 100 pg / μl la 1000 ng / μl. [20]. Kitul
furnizează reactiv de analiză concent rați, buffer de diluție și standarde pre -diluate de ADN.
Valoarea limită inferioar ă de gDNA
recomandată pentru reacție pentru
probele de țesut FFPE este m ai mare
decât pentru alte tipuri de probe
deoarece probele de țesut FFPE
conțin șablon ADN încrucișat,
fragmenta t și deteriorat. Ținînd cont
că pobele din studiu erau și
parafinizate și proaspete s -a stabilit
ca cantitatea de 20 ng de ADN să fie
folosit din ambele tipuri de probe.
Experimentul de detectare a
mutațiilor
Se prepară amestecul PCR și placa PCR după cum urmează:
Pentru fiecare probă, se calculează numărul total de reacții necesare (Tab.2.1) .
Calculați volumul total necesar pentru fiecare componentă. Volum pentru 1 reacție × număr total de
reacții. Includeți volumul suplimentar de 10 % pentru a compensa erorile de pipetare [18,19]..
Fig. 2.4 Spectrofotometru Qubit 3.0 și kitul de cuantificare
ADN

28
Tab.2.1 Componentele și volumul necesar pentru o reacție PCR( Real Time)
Componentele Volumul pentru o reacție
TaqMan Genotyping Master Mix, 2x 10.0 μL
Prepared gDNA sample 2.0 – 4.0 μL (20ng)

H2O Pînă la volumul de 18 μL
Volumul total al supermixului 18 μL

Se adaugă volumul adecvat de super -amestec (18.0 μL ) în fiecare godeu de reacție al unei
plăci PCR . Se adaugă volumul adecvat(2 μL ) de TaqMan primeri pentru detecțiea mutație (alela
mutantă sau analiza de referință a genei) (Fig. 2. 5). Se acoperă placa cu un film adeziv optic, apoi
placa se centrifughează pentru scurt timp pentru se acumula conținutul la baza plăcii l și pentru a
elimina bulele de aer.

2.1 Configurarea setărilor experimentului și startul reacției.
În software -ul sistemului PCR în timp real: se selectează tipul experimentului: Cuantificare
absolută . Pentru fiecare godeu care conține o reacție, se aplică numele eșantionului, numele testului
și numele țintei de detecție.
Numele Reporter -ului și a Quencher -ului : analize de detecție a mutagenei TaqMan, colorantul
FAM este reporterul iar non -fluorescent sau NFQ -MGB este Quencherul. Volumul fiecărei probe
este de 20 μL . Se respectă termociclurile conform (Tab.2.1 ) [19].
Fig.2.5 Prime ri specifici mutațiilor genelor EGFR,
KRAS,BRAF (TaqMan Mutation dectection Assay)

29
Tab.2.1 Termociclurile de amplificare pentru detecția mutațiilor.
Stadiu Temperatura Timp
min:sec Cicluri Colectarea datelor
1 95 °C 10:00 1 Nu
2 92 °C 00:15 5 Nu
58 °C 01:00 Nu
3 92 °C 00:15 40 Nu
60 °C 01:00 FAM

2.2 Termenii majo ri utilizați în analiza PCR în Timp R eal.
Linia de bază (baseline)
Linia de bază a reacției PCR în timp real se referă la nivelul semnalului în timpul ciclurilor inițiale
ale PCR, cicluri de obicei de la 3 la 15, în care există o mică schimbare a semnalului fluorescen t.
Semnalul de nivel scăzut al liniei de bază poate fi asimilat cu fundalul sau cu "zgomotul" reacției.
Linia de bază în PCR în timp real este determinată empiric pentru fiecare reacție, prin analiza
utilizatorului sau prin analiza automată a graficului de amplificare. Linia de bază trebuie stabilită cu
atenție pentru a permite o determinare precisă a ciclului de prag (Ct), definit mai jos. Determinarea
de bază ar trebui să țină cont de suficiente cicluri pentru a elimina fundalul găsit în ciclurile timpuri i
de amplificare, dar nu ar trebui să includă ciclurile în care semnalul de amplificare începe să crească
deasupra fundalului. Atunci când se compară diferite reacții sau experimente PCR în timp real, linia
de bază ar trebui să fie în același mod pentru fi ecare [18]..
Pragul de detecție
Pragul reacției PCR în timp real este nivelul semnalului care reflectă o creștere semnificativă
statistic față de semnalul de bază calculat. Este setat să distingă semnalul relevant de amplificare de
fundal. De obicei, softw are-ul pentru instrumente PCR în timp real stabilește pragul la 10 ori
deviația standard a valorii de fluorescență a liniei de bază. Cu toate acestea, poziționarea pragului
poate fi stabilită în orice punct din faza exponențială a PCR.
Ct (ciclul de prag)
Ciclul de prag (Ct) este numărul de ciclu la care semnalul fluorescent al reacției traversează pragul.
Ct este utilizat pentru a calcula numărul inițial de copie a ADN -ului, deoarece valoarea Ct este
invers proporțională cu valoarea inițială a țintei. De exemplu, prin compararea rezultatelor PCR în

30
timp real din eșantioane conținând cantități diferite de țintă, o probă cu o cantitate dublă față de
cantitatea de pornire va produce un Ct un ciclu mai devreme decât un eșantion care conținea
jumătate de copii de țintă înainte de amplificare. Aceasta presupune că PCR funcționează la o
eficiență de 100% (adică, cantitatea de produs se dublează perfect în timpul fiecărui ciclu) în ambele
reacții. Pe măsură ce dimensiunea șablonului scade, numărul de ciclu la care se vede amplificarea
semnificativă crește.
Cuantificarea relativă
Cuantificarea relativă descrie un experiment PCR în timp real în care expresia unei gene de interes
într-o probă (adică, tratată) este comparată cu exprimarea. Aceeași genă într -o altă probă (adică,
netratată). Rezultatele sunt exprimate ca schimbări multiple (creștere sau descreștere) în exprimarea
tratamentului în raport cu cel netratat. O genă normalizatoare (cum ar fi β -actina) este utilizată ca un
control pentru variabilitatea experiment ală în acest tip de cuantificare [18,19].
2.3 Modificarea bisulfidică
Metilarea ADN este un mecanism epigenetic care apare prin adăugarea unei grupări metil
(CH3) la ADN, modificând adesea funcția genelor. Cel mai larg procedeu de metilare a ADN -ului
este caracterizat prin adăugarea covalentă a grupării metil la atomul de carbon 5 al ciclului citozinic
rezultând 5 -metilcitozină (5 -mC), cunoscută și ca a "cincea bază azotată" a ADN -ului. Aceste
grupu ri de metil se extind în șanțul major al ADN -ului și inhibă transcripția [21].
Evaluare modificărilor epigenetice a genelor MLH1, MSH2 s -a realiz at la un singur pacient
suspect către cancerul colorectal nonpolipozic ereditar care deținea cele mai multe mutații în genele
EGFR, KRAS și BR AF pentru a studia corelarea dintre metilarea genelor de reparare ADN și
mutațiile somatice în genele EGFR KRAS și BRAF. Pentru aceaasta s -a folosit Kitul de modificare
bisulfidică Ep iJET Bisulfite Conversion Kit, i ar pentru amplificare s -a folosit p rimer i specifici (Tab
2.3.1) genelor MLH1,MSH2 metilate și nemetilate.

31
Tab. 2.3 .1 Primerii genelor MLH1, MSH2 pentru determinarea metilării genelor enunțate la pacient
cu suspiciune către sindromul Ly nch.
Numele primerilor Succesiunea bazelor azotate5’ ->3’ Conținutul GC
MLH1_unmet_fwd TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT(29) 27,6%
MLH1_unmet_rev ACCACCTCATCATAACTACCCACA (24) 45,8%
MLH1_met_fwd ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC (24) 45,8%
MLH1_met_rev CCTCATCGTAACTACCCGCG (20) 60%
MSH2_unmet_fwd GTTGTTGTGGTTGGATGTTGTTT (23) 39,1%
MSH2_unmet_rev CAACTACAACATCTCCTTCAACTACACCA
(29) 41,4%
MSH2 _met_fwd TCGTGGTCGGACGTCGTTC (19) 63,2%
MSH2_met_rev CAACGTCTCCTTCGACTACACCG (23) 56,5%

Kitul de conversie a bisulfidică Thermo Scientific EpiJET este proiectat pen tru conversia
simplă și sigură bisulfidică a ADN -ului pentru an aliza de metilare. În reacția bisulfit ică toate
citozinele nemetilate sunt deaminate și transformate în uracil, în timp ce citozinele metilate rămân
neschimbate. Ci tozinele nemeti late transformate cu bisulfit sunt d etectate ca timine în următoarea
reacție PCR (Fig 2.3.1 ). Kitul de conversie bisulfidică EpiJET integrează denaturarea ADN -ului
termic și reacțiile de conversie bisulfit într -o singură etapă. Această etapă poate fi efectuată după un
protocol lung sau scurt, în funcție de aplicarea în aval a ADN modificat. ADN -ul transformat este
legat de o membrană a unei micro -coloane pentru desulfonarea pe coloană și etapele ulterioare de
purificare a ADN -ului. ADN -ul transformat este eluat într -un volum mic de tampon de eluare și este
adecvat pentru analiza stării de metilare [21].

Fig2.3.1 Schema detectării modificării bisulfidice

32
Cantitatea inițială a ADN -ului folosită a fost 200 ng. Se adaugă 20 μL de probă de ADN conținând
200 ng ADN genomic purificat într -un tub PCR. Dacă un volum de probă de ADN este mai mic de
20 μL, adăugați apă, grad de biologie moleculară, la proba ADN de până la20 μL.
Se adăugă 120 μL de soluție de reactiv de Modificare
preparat peste 20 μL de probă de ADN într -un tub PCR.
Tuburile PCR se plasează într -un termo -ciclu și se
continuă cu Protocolul A (1 -98°C/ 10 min. 2 -60°C/ 150
min) pentru a efectua denaturarea și conversia bisulfidică
a ADN -ului (Fig. 2.3.2 ).
Purificarea ADN -ului se realizează pe coloane
prin adăugarea 400 μL Binding Buffer, după care se
spală de două ori cu soluție de spălare, apoi se adaugă
200 μL desulfonation buffer după care se realizează
spălarea cu soluții de spălare conținute de kitul de
modificare bisulfidică. Eluarea ADN -ului se realizează în
tuburi eppedorf prin adăugarea în coloană a 10 μL buffer
de eluție și centrifugare. ADN -ul m odificat se folosește
în reacția PCR pentru amplificarea fragmentelor de
interes astfel se conbină Platinum PCR SuperMix cu
primerii specifici genelor evaluate. Platinum PCR SuperMix deține componentele necesare pentru
amplificarea template -urilor de acid nucleic prin reacția în lanț a polimerazei (PCR). Amestecul
conține anticorp anti -Taq ADN polimerază, Mg ++, dNTPs și ADN -polimerază Taq recombinantă la
concent rații suficiente pentru a permite amplificarea în timpul PCR.
După realizarea reacției de polimerizare, produsul de amplificare se vizualizează pe gel de agaroză
2% (E-Gel SizeSelect Gel) [22].

Fig.2.3.2 Realizarea conversie
bisulfidice folosinduse Termo -Ciclu
Veriti 96well Thermal Cicler

33
3. REZULTATE ȘI DISCUȚII OBȚINUTE ÎN URMA PROIECTULUI DE
CERCETARE
3.1 Descrierea succintă a genelor EGFR,KRAS,BRAF și stabilirea implicării acestora în
indicarea personalizată preparatelor țintă.
Pe moment ce în numeroase țări testarea genetică pentru pacienții cu cancer reprezintă un
standart clinic, pentru R epublica Moldova această procedură rămîne o provocare, în primul rînd la
nivelul exploatării profilelor moleculare ale tumorilor și a fracției de pacienți care derivă din
profilele moleculare și pot beneficia de programe de medicină personalizată. Avînd sc opul de a
determina profilele molecular – genetice ale tumorilor solide la pacienții cu cancer colorectal
avansat și pacienții cu predispunere ereditară către cancerul colo rectal sa fost propus identifi rea
țintelor terapeutice prin stabilirea mutațiilor ge nelor EGFR,KRAS,BRAF.
Modificările epigenetice fiind în continuare un subiect pe larg studiat de comunitatea
științifică s -a stabilit prezența metilări genelor MLH1, MSH2 la pacientul ales randomizat din
grupul de studiu a 4 pacienți ce aveau predispunere către CCR familial conform criteriilor
Amsterdam care prevăd că, pentru a se califica drept HNPCC, cancerul colorectal ar trebui să fie
diagnosticat în cel puțin trei membri ai familiei în două sau mai multe generații succesive, dintre
care u nul este o rudă de gradul întâi al celorlalte două și că cancerul trebuie diagnosticat înainte
Vârsta de 50 de ani în cel puțin un membru al familiei [12].
Sindromul Lynch deține circa 13 % din totalul cazurilor diagnosticate de CCR ( Fig.3.1 .1)
ceea ce îl plasează drept cea mai întîlnită formă de sindron familial CCR.

34

Fig.3.1 .1 Indicarea tipurelor de cancerului colorectal. Se indică procentajul ap roximativ
pentru fiecare cauz . Cazurile "sporadice" includ bărbați și femei în vârstă de peste 50 de ani, fără
factori de risc aparent crescuți. FAP -Polipoză adenomatoasă FAP -familială, HNPCC -cancerul
colorectal nonpolozis ereditar,IF – FH-pozitiv la istoricul familial dar include altele decât FAP sau
cancerul colorectal nonpolozis ereditar, BIF – boala intestinului inflamator .
Genele incluse în studiu sunt implicate în cea mai cunoscută cale de semnalizare
MAPK/ERK (Fig.3.1.2) care asigură dividerea celulară și supravețuirea celulelor normale. Celulele
cancerigene pe lîngă modificările genetice multi ple dețin pe suprafață un număr crescut de receptori
de creștere epidermali ceea ce le face mai susceptibili la stimulii de dividere extracelular.
Genele -cheie implicate în patogenia cancerului colorectal se împart în 3 mari categorii:
1. Proto -oncogenele – care controlează proliferarea celulară – în această categorie se
încadrează oncogena K -ras, EGFR, BRAF.
2. Genele de supresie tumorală (anti -oncogene) – cum sunt APC si p53
3. Genele implicate în repararea mutațiilor apărute în cursul replicării ( anti-mutatoare) –
hMSH2, hMLH1, hMLH2 [23]. 67%
1% 13% 18% 1% Forma sporadică FAP HNPCC IF BIF

35

Fig.3. 1.2 Caracterizare moleculară a genelor EGFR,KRAS,BRAF
Tratamentul CCR este de obicei o conbinație de terapii care acționează:
 La nivel local precum intervențiile chirurgicale și radioterapia.
 La nivel sistemic asupra celulelor canceroase din tot corpul, precum chimioterapia și
terapiile biologice țintite [6].
Studiul prezent relevă depistarea țintelor terapeutice la pacienți cu adenocarcinom stadiul IIIC
precum și la pacienții cu predispunere familială către s indromul Lynch care au dezvoltat deja
tumoare stadii avansate.
Introducerea și îmbunătățirea biomarkerilor tratamentelor care vizează receptorul factorului de
creștere epidermal (EGFR) a fost una dintre cele mai promițătoare evoluții în tratamentul oncolo gic
din ultimii 5 ani. Beneficiul inhibitorilor de tirozin kinaze EGFR (gefitinib și erlotinib) în cancerul
pulmonar este limitat la pacienții ale căror tumori conțin o mutație la situsul de legare a
medicamentului în domeniul de legare la ATP al receptoru lui și a fost semnal în îmbogățirea definită
de biomarker Din populațiile receptive. În cazul cancerului colorectal, nu apar astfel de mutații în
EGFR, dar s -a demonstrat un beneficiu clinic cu anticorpi monoclonali care se leagă la legarea
ligandului inhi bitor al domeniului receptorului extracelular (în special factorul de creștere
epidermică,) [29]. Acest beneficiu clinic, aparent limitat la pacienții ale căror tumori nu conține nici
o dovadă a unei mutații în KRAS, a fost observat pentru prima dată în st udiile non -randomizate și a

36
fost confirmat ulterior în studiile randomizate de monoterapie cu anticorpi la pacienții refractari la
chimioterapie. Este plauzibilă deoarece KRAS codifică o proteină G care este o legătură -cheie în
calea de transducție a semna lului (kinaza RAS -RAF -MAP) de la receptor la nucleu și mutațiile
observate conduc la activarea constitutivă a căii care este puțin probabil să fie afectată de receptorul
de suprafața a celulei. Alte mutații de activare, cum ar fi cele din BRAF și NRAS în c azurile de
cancer colorectal, pot avea efecte negative similare asupra eficacității terapiei vizate de EGFR.
3.2 Studiu de caz privind Supravețuire pacienților cărora li s -a administrat cetuximab
Doi anticorpi monoclonali (MoAb), Cetuximab și Panitumumab, care vizează EGFR, au fost
introduși în practica clinică pentru a trata mCRC, ambele aceste molecule se leagă de domeniul
extern al EGFR, ceea ce duce la inhibarea căilor de semnalizare din aval. Care includ axa RAS –
RAF -MAPK, care este implicată în principal în proliferarea celulelor și calea P13K -PTEN -AKT,
care este implicată în supraviețuirea și motilitatea celulelor. Eficacitatea anticorpilor monoclonali
anti-EGFR la 60 -70% dintre pacienții mCRC cu tumori wt -KRAS este încă limitată, cu rate de
răspuns între 10% și 40% , astfel există necesitatea unor biomarkeri suplimentari pentru acești
pacienți. Interesant că expresia proteinei EGFR nu a fost puternic asociată cu răspunsul clinic la
Cetuximab î n CRC. De remarcat că mutațiile KRAS și BRAF sunt cunoscute a se exclude reciproc
în cancerele colorectale. Pacienții care au suferit mutații BRAF nu răspund la terapia cu MoAb,
chiar dacă prezintă Wt KRAS, ceea ce demonstrează că WT -BRAF trebuie să răspu ndă terapiei cu
MoAbs pentru a trata mCRC [24,25 ].
Erbitux este indicat pentru tratamentul pacienților cu cancer colorectal metastatic care
prezintă gena RAS de tip sălbatic și care exprimă receptorul pentru factorul de creștere epidermică
(EGFR)
asociere cu chimioterapie pe bază de irinotecan,

prezintă intoleranță la irinotecan [16].
Aceste indica ții le găsim in formularul de indicații a administrări Cetuximab la momentul
actual, Aceste indicații se stabilesc be baza unor studii anterioare care au relevat eficiența sau
ineficiența în anumite combinații de terapii ceea ce este și prezentat în trei s tudii de mai jos.

37
Studiul 1
Phase II Trial of Cetuximab in Patients With Refractory Colorectal Cancer That Expresses the
Epidermal Growth Factor Receptor Leonard B. Saltz, Neal J. Meropol, Patrick J. Loehrer, Michael
N. Needle, Justin Kopit, Robert J. Ma yer
Scop Pentru a evalua activitatea antitumorală și toxicitatea cetuximabului cu un singur agent la
pacienții cu cancer colorectal refractar la chimioterapie ale căror tumori exprimă receptorul
factorului de creștere epidermal.
Pacienții și metodele
Faza II, studiu clinic deschis. Pacienților li s -a cerut ca expresia EGFR să fie demonstrată pe țesutul
tumoral încorporat cu parafină fixată de formalină prin colorare imunohistochimică înainte de
participarea la studiu. Pacienților li sa cerut să fi primit ir inotecan, fie singur, fie într -un regim
combinat, și să fi demonstrat eșec clinic la acest regim înainte de intrarea în studiu. Cetuximab a fost
administrat săptămânal prin perfuzie intravenoasă. Prima doză de 400 mg / m2 a fost administrată în
decurs de 2 ore. Tratamentele săptămânale ulterioare au fost administrate la o doză de 250 mg / m2
în cursul unei ore [15]..
Rezultate
Au fost tratați cincizeci și șapte de pacienți eligibili. Toate au fost evaluate pentru toxicitate și
răspuns. Cele mai frecvent întâ lnite evenimente adverse de gradul 3 până la 4, indiferent de relația
cu medicamentul de studiu, au fost o erupție cutanată asemănătoare acneei, predominant pe față și
pe trunchi superior (86% cu orice grad, 18% cu gradul 3) De astenie, oboseală, stare gen erală de rău
sau letargie (56% cu orice grad, 9% cu gradul 3). Doi pacienți (3,5%) au prezentat reacții alergice de
gradul 3 care necesită întreruperea tratamentului de studiu. Un al treilea pacient a prezentat o reacție
alergică de gradul 3 care a fost re zolvată și pacientul a continuat studiul. Diareea și nici neutropenia
nu au limitat doza la nici unul dintre cei 57 de pacienți tratați. Cinci pacienți (9%, CI 95%, 3% până
la 19%) au obținut un răspuns parțial. Douăzeci și unu de pacienți au prezentat o b oală stabilă sau
răspunsuri minore. Supraviețuirea mediană la acești pacienți tratați anterior cu cancer colorectal
refractar la chimioterapie este de 6,4 luni.
Concluzie

38
Cetuximab pe această schemă de administrare o dată pe săptămână are o activitate mode stă și este
bine tolerată ca un singur agent la pacienții cu cancer colorectal refractar chimioterapeutic, ale căror
tumori exprimă receptorul factorului de creștere epidermal. Studiile suplimentare privind cetuximab
vor evalua utilizarea cetuximabului în asociere cu tratamente de primă linie și adjuvanți pentru
această boală [15].
Studiul 2
Addition of cetuximab to oxaliplatin -based first -line combination chemotherapy for treatment of
advanced colorectal cancer: results of the randomised phase 3 MRC COIN t rial Timothy S
Maughan, Richard A Adams, Christopher G Smith, Angela M Meade, Matthew T Seymour, Richard
H Wilson, Shelley Idziaszczyk.
În studiul COIN al Consiliului de Cercetare Medicală (MRC), cetuximabul receptorului factorului
de creștere epidermal (E GFR) a fost adăugat la chimioterapia standard în tratamentul de primă linie
al cancerului colorectal avansat, în scopul evaluării efectului asupra supraviețuirii globale [26].
1630 pacienți au fost repartizați aleatoriu în grupuri de tratament (815 la terap ia standard și 815 la
adăugarea de cetuximab). Eșantioane tumorale de la 1316 (81%) pacienți au fost utilizați pentru
analize moleculare somatice; 565 (43%) au avut mutații KRAS. La pacienții cu tumori de tip
sălbatic KRAS (brațul A, n = 367, brațul B, n = 362), supraviețuirea globală nu a fost diferită între
grupurile de tratament (mediană de supraviețuire 17,9 luni în Grupul de control față de 17,0 luni (în
grupul cetuximab, HR 1,04, 95% CI 0,87 -1,23, p = 0,67). În mod similar, nu a existat niciun efect
asupra supraviețuirii fără progresia bolii (8,6 luni în grupul de control comparativ cu 8,6 luni în
grupul cu cetuximab.
Interpretare
Acest studiu nu a confirmat un beneficiu al adăugării de cetuximab la chimioterapia pe bază de
oxaliplatină în tratamentul de primă linie a pacienților cu cancer colorectal avansat (Fig.3.2.1) .
Cetuximab crește rata de răspuns, fără nici o dovadă de beneficii în cazul supraviețuirii fără
progresia bolii sau a supraviețuirii globale la pacienții de tip sălbatic KRAS sau chiar la pacienții
selectați prin analiză mutațională suplimentară a tumorilo r lor. Utilizarea cetuximabului în asociere
cu oxaliplatină și capecitabină în chimioterapia de primă linie la pacienții cu metastaze larg
răspândite nu poate fi recomandată [26].

39

Fig.3.2.1 Kaplan -Meier curbe de supraviețuire globală pentru pacienții cu (A) KRAS tip sălbatic,
(B) KRAS mutant, (C) BRAF mutant și KRAS tip sălbatic și (D) KRAS, NRAS și BRAF toate tumorile
de tip sălbatic
Studiul 3
Cetuximab Plus Irinotecan, Fluorouracil, and Leucovorin As First -Line Treatment for Metastatic
Colorectal Cancer: Updated Analysis of Overall Survival According to Tumor KRAS and BRAF
Mutation Status Eric Van Cutsem, Claus -Henning Köhne, István Láng, Gunnar Folprecht, Marek P.
Nowacki, Stefano Cascinu, Igor Shchepotin, Joan Maurel, David Cunningham, Sabine Tej par,
Michael Schlichting, Angela Zubel, Ilhan Celik, Philippe Rougier, Fortunato Ciardiello
Scop
Adăugarea cetuximabului la irinotecan, fluorouracil și leucovorin (FOLFIRI) ca tratament de primă
linie pentru cancerul colorectal metastatic (mCRC) a arătat c ă reduce riscul de progresie a bolii și

40
crește șansa de răspuns la pacienții cu boală de tip sălbatic KRAS. A fost efectuată o analiză
actualizată a supraviețuirii, incluzând pacienți suplimentari analizați pentru starea mutației tumorale.
Pacienții și metodele
Pacienții au fost repartizați aleatoriu pentru a primi FOLFIRI cu sau fără cetuximab. ADN -ul a fost
extras din probe de tumori suplimentare montate pe glisare utilizate anterior pentru a evalua expresia
receptorului factorului de creștere epiderma l. Rezultatele clinice în funcție de statutul mutațiilor
tumorale ale KRAS și BRAF au fost evaluate în seria de pacienți extinse [27].
Rezultate
Rata de constatare a pacienților analizați pentru statutul KRAS tumoral a crescut de la 45% la 89%,
mutațiile fi ind detectate la 37% din tumori. Adăugarea de cetuximab la FOLFIRI la pacienții cu
boală de tip sălbatic KRAS a determinat o îmbunătățire semnificativă a supraviețuirii globale
(median, 23,5 v 20,0 luni, raport risc [HR], 0,796, P = .0093), supraviețuirea fără progresia bolii
(mediană, 9,9 v 8,4 luni, HR, 0,696, P = 0,0012) și răspuns (rata 57,3% v 39,7%, rata de
probabilitate, 2,069, P <0,001) comparativ cu FOLFIRI singur. Au fost observate interacțiuni
semnificative între statutul KRAS și efectul tratamen tului pentru toate punctele esențiale cheie de
eficacitate. Starea mutației KRAS a fost confirmată ca un biomarker predictiv puternic pentru
eficacitatea cetuximabului plus FOLFIRI. Mutația tumorii BRAF a fost un indicator puternic al
prognosticului slab.
Concluzie
Adăugarea de cetuximab la FOLFIRI ca terapie de primă linie îmbunătățește supraviețuirea la
pacienții cu mCRC de tip sălbatic KRAS. MUTAREA tumorii BRAF este un indicator al
prognosticului slab [27].
Aprobarea uneu preparat care eventual are o țin tă terapeutică și care oferă o rată de
supravețuire considerabilă mărită este de domeniul ficțiunei în oncologie. Ceea ce și s -a demonstrat
în studiile descrise mai sus, Personalizarea medicinei nu trebuie să privească doar țintele terapeutice
dar și ansab lu de factori care modifică sau interferază cu rezultatele ceea ce denotă nu că preparatul
nu este eficient dar denotă faptul că nu s -au luat în calcul suficienți factori adiționali care au dus la
interferarea și la obținerea rezultatelor ineficiente. Comb inarea preparatelor de precizie prin crearea
schemelor de tratament individualizate ar duce semnificativ la mărire ratei de supravețuire a
pacienților cu CCR. stadii avansate.

41
3.3 Mutațiile ev aluate în cadrul genei EGFR, KRAS,BRAF

Tab.3.3.1 Mutațiile evaluate în genele KRAS,BRAF

Informație gene Alela
mutantă
nume COSMI
C ID Mutațiile
nucleotidelor Schimbul de aminoacizi
SimbolulGenei KRAS
ID genei: 3845
Transcript
NM_004985 KRAS_516_
mu 516 c.34G>T p. G12C
KRAS_517_
mu 517 c.34 G>A p.G12S
KRAS_518_
mu 518 c.34G>C p.G12R
KRAS_520_
mu 520 c.35G >T p. G12V
KRAS_521_
mu 521 c.35G>A p.G12D
KRAS_522_
mu 522 c.35G>C p.G12A
KRAS_532_
mu 532 c.38G>A p. G13D
Simbolul genei BRAF
ID genei 673
Transcript
NM_004333 BRAF_475_
mu 475 p.V600E

42
Tab.3.3.2 Mutațiile evaluate în gena EGFR care dețin cel mai mare scor FATHMN.
Un server web de mare viteză capabil să prezică consecințele funcționale ale ambelor variante de
codificare, adică variante unice de nucleotide nesinomice (nsSNVs) și variante non -codificatoare.
Pentru a facilita analiza seturilor de date genomice de cancer pe scară largă, FATHMM furnizează
predicții nerestricționat e și aproape instantanee pentru toate substituțiile posibile de aminoacizi din
proteomul uman. Astfel mutațiile evaluate în cadrul studiului dețin cel mai mare coeficient
FATHMN ceea ce le fac a fi cele mai des întîlnite mutații somatice în cancer [28,31].
3.4 Descrierea grupelor de pacienți incluși în studiu
Descrierea Cazurilor clinice incluse în studiu prin indicarea stadiului morfopatologic la pacienții cu
formele sporadice și indicarea prdispoziției familiale la pcaienții ce au respecta t criteriile
Ams terdam de predi spunere familială dar și descriere muațiilor identificate la fiecare pacient.
Caz clinic 1 Simbolul genei EGFR
ID genei :1956
Transcript
NM_005288 EGFR_ex19
dels_mu NA 19 deletions in
EGFR exon19 NA
EGFR_6213
_mu 6213 c.2582T>A p.L861Q
EGFR_6224
_mu 6224 c.2573T>G p.L858R
EGFR_6239
_mu 6239 c.2156G>C p.G719A
EGFR_6240
_mu 6240 c.2369C>T p.T790M
EGFR_6241
_mu 6241 c..2303G>T p.S768I
EGFR_6252
_mu 6252 c.2155G>A p.G719S
EGFR_6253
_mu 6253 c.2155G>T p.G719C

43
Pacient CCR 01A
Diagnostic clinic: Cancerul sigmei distale cu metastaze multiple în ficat.
Descrierea macro/microscopică: segment de intestin 9cm, 2cm de la marginea rezectului formațiune
tumoarlă 4×3,5cm vizibil infiltrează tot peretele.
Descrierea histopatologică: Adenocarcinom a intestinului diferențiere moderată cu invazii care
înfiltrează toată grosimea peretelui cu necroză și angioinvazie exul cerat cu metastaze în un ganglion
limfatic pericolar.
Gena: EGFR , mutații detectate c.2369C>T p.T790M
Caz clinic 2
Pacient CCR 02A
Diagnostic clinic: Cancerul unghiului hepatic al colonului.
Descrierea macro/microscopică: segment de intestin 50 cm, 15 cm de la marginea proximală a
rezecției, forma circulară 6cm ulcerată în formă de farfurie, vizibil infiltrează tot peretele.
Modificări de la formațiune o formă polipoidă 1cm.
Descrierea histopatologică: adenocarcinom cu diferențiere moderată a intestinul ui local cu creștere
de tip paăilar, invaziv infiltrează tot peretele cu exulcerație. Aparte adenom tubular cu proliferație.
În doi ganglioni limfatici metastază de carcinom.
Gena EGFR,m utații detectate c.2369C>T p.T790M, c.2155G>A p.G719S
Caz clinic 3
Pacient CCR 03A
Diagnostic clinic: cancer rectal
Descrierea macro/microscopică: Segment de intestin 5,5cm la 2,5cm de la marginea rezecției o zonă
ulcerată 1x2cm, ganglioni limfatici se depistează cu greu.

44
Descrierea histopatologică: Adenocarcinom moderat dif erențiat cu infiltrarea 2/3 în tunica
musculară, infiltrare limfo leucocitară în stromă. În marginile chirurgicale, elemente tumorale nu se
depistează. Metastaze în 1 ganglion limfatic paraintestinal cu calcinație.
Gena: EGFR ,mutații detectate: c.2155G>A p .G719S
Caz clinic 4
Pacient CCR04A
Diagnostic clinic: Rectul cu tumoare (tumoare malignă)
Descrierea macro/microscopică: segment de intestin 13cm, 1,5 cm de la marginea rezecției, forma
de farfurie 4cm, vizibil infiltrează tot peretele, ganglioni limfatici se depistează cu greu
Descrierea histopatologică: adenocarcinom, diferențiere moderată a intestinului, invaziv infiltrează
în stratul muscular cu exulcerație și metastaze în 1 ganglion limfatic.
Gena:EGFR, mutații detectate: c.2369C>T p.T790M

Fig. 3.4.1 Prezentarea Curbelor de amplificare obținute în urma reacției de polimerizare în timp
real la pacienții cu Adenocarcinom cu metastaze.
Caz clinic 5
Pacient CCR05L
Suspiciuni sindromul Lynch

45
Gena: KRAS, m utații detectate: c.34G>A p.G12S, c.35G>T p.G12V
Randomizat pentru pacienții cu predispunere către sindromul Lynch s -a evaluat metilarea genelor
MLH1 MSH2 în ADN -ul extras din sînge. Și s-a determinat prezența alelei genei MSH2 metilate
precum și amplific area alelei genei nemetilate MSH2 ceea ce indică că doar o alelă a genei MSH2
este inactică în procesul de reparare ADN însă activitatea acesteia nu este inhibată complet deoarece
este prezentă și alela nemetilată ce compensează și realizează activitatea d e reparare (Fig.3.4.2 ).

Fig.3.4 .2 Electroforeza ADN -ului modificat bisulfidic extras din șîngele pacientului CCR05L care
prezintă amplificarea porțiunei metilate a genei MSH2
Caz clinic 6
Pacient CCR06L
Suspiciuni sindromul Lynch
Gena: KRAS ,mutații detectate: c.35G>T p.G12V
Gena:EGFR , mutații detectate : c.2369C>T p.T790M, c.2155G>T p.G719C
Caz clinic 7
Pacient CCR07L
Suspiciuni sindromul Lynch
Gena: KRAS, Mutații detectate: c.35G>A p.G12D
Gena EGFR, Mutații detectate: c.2369C>T p.T790M
Pacient CCR05L

46
Caz clinic 8
Pacient CCR08L
Suspiciuni sindromul Lynch
Gena: KRAS, mutații detectate: c.35G>T p.G12V, c.35G>A p.G12D
Gena: EGFR. Mutații detectate: c.2369C>T p.T790M

Fig. 3.4 .3 Graficul amplificării mutațiilor genelor EGFR,KRA S,BRAF la pacienții cu predispunere
ereditară către CCR

Fig.3.4 .4 Numărul de mutații detectate la f iecare pacient inclus în studiu

47
CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI
Cancerul colorectal se dezvoltă ca urmare a acumulării progresive a modificărilor genetice și
epigenetice care duc la transformarea epiteliul colonului normal la adenocarcinomul de colon. Acest
proces de carcinogeneză a colonului, care a fost denumit pas s ecvențial de polip -carcinom, se
consideră că are în mod obișnuit peste 10 -15 ani și implică modificări histologice și moleculare
concomitente. Genele EGFR,KRAS și BRAF sunt protooncogene produsul de sinteză a cărora se
implică deirect în calea de semnaliza re MAPK/ERK prin intermediul căreia se mențin procesele
normale de dividere celulară.
Investigarea patogenezei moleculare a CRC a dat multe perspective asupra mecanismelor de
conducere a procesului de tumorigeneză și identificării multor ținte terapeutic e potențiale cu privire
la Biologie Moleculară a Cancerului de Colon. Perspectivele cheie din evaluarea geneticii
moleculare și a epigeneticii cancerului de colon includ etape a carcinogenezei, rolul central al căilor
supresoare tumorale, rolul genelor de reparare a ADN -ului și stabilitatea genomică în formarea
cancerului. Au fost realizate progrese remarcabile în înțelegerea căilor moleculare care duc la
formarea cancerului colorectal. Mutațiile care cauzează o sensibilitate crescută au fost identificate ș i
funcțiile lor au fost caracterizate. Provocarea care se află înainte este aceea de a determina cum să
aplicăm aceste informații exact. Diagnosticul și tratamentul cancerului colorectal. În plus,
transpunerea geneticii moleculare la noi modalități de diag nostic, prognostic și terapie este
promițătoare și are un impact major asupra managementului clinic al CRC. Promisiunea pentru
viitor este că acest domeniu de cercetare va da răspunsurile importante la întrebări -cheie ce țin de
medicina de precizie în CCR. Schimbările timpurii în epiteliul colonului care persistă pe tot
parcursul tumorogenezei reprezintă ținte ideale pentru intervenția chemopreventivă.
Planificare tratamentului implică o echipă interdisciplinară de profesioniști în medicină.
Aceasta presupu ne de obicei o întîlnire a diverșilor specialiști numită și un intervenție
multidiscipliară sau consiliul pentru tumori. În această întîlnire planificarea tratamentului va fi
discutată pe baza informațiilor relevante primite din analize, anamneză precum și statutului genetic.
Studiul realizat s -a axat pe caracterizarea moleculară a CCR care dețin ca factori declanșatori
mecanisme diferite Sindromul Lynch avînd ca „driver” mutagen factorii genetici moșteniți, și
Adenocarcinoamele cu metastaze care au „drive r” mutagen necunoscut astfel asociind -use mai mulți
factori declanșatori. Evenimentele genetice obținute în urma studiului sunt următoarele:

48
 Pacienții cu predispunere către sindromul Lynch dețin mai multe mutații în genelel e KRAS
și BRAF decît pacienții cu adenocarcinoma cu metastază confirmați morfopatologic chiar
dacă stadiul la formele nefamiliale este mult mai avansat, bagajul mutational la formele
familiale este mai complet ceea ce face inoportun tratamantul acestor sindroame cu
Anticorpi monoclonal pr ecum Cetuximab, Panitumumab, însă acest “bagaj mutational” vast
poate servi ca direcție strategică pentru dezvoltarea unor noi ținte terapeutice c ear ataca
formele canceroase ce dețin anume mutații în genele respective.
 Cele mai fregvente mutații sunt în tîlnite în gena EGFR în care s -au determinat mutații laa
toți pacienții incluși în studiu indifferent de factorul declanșativ al tumorilor ceea ce indică
necesitatea studiului mutațiilor genei EGFR și posibilitatea diminuării sau creșterii eficienții
tratamentului cu cetuximab.
 Metilarea genelor de reparare AND servesc drept factor important în acumularea mutațiilor
somatice în genelor EGFR,KRAS,BRAF ceia ce fac formele familiale de adenocarcinoame
să fie mai agresive și să aibă un răspuns slab la chimio terapie.
 Conform datelor obținute se conclude că pacienții cu Sindromul Lynch trebuie să dețină un
protocol de tratament total diferit față de pacienții cu adenocarcinoame deoarece utilizînd
cetuximabul ca tratament singular la acești pacieți ar fi inefici ent datorită profilului
mutațional revelat în urma studiului.
Recomandări
Să se continue studiul prin majorarea cohortei de studiu astfel s -ar putea stabili o corelare directă
dintre gradul metilării genelor MLH1,MSH2 și fregvența mutațiilor genelor EGFR, KRAS, BRAF.
Conform rezultatelor investigațiilor s-ar permite realizarea tratamentului cu anticorpi monoclonali la
pacienții cu adenocarcinom cu metastazare în noduli limfatici însă aceste învestigații nu au o valoare
finală pînă nu se fac altele sup limentare precun expresiea EGFR .
S-ar recomanda realizarea în pararle al profilului mutațional precum și al metilării genelor
MLH1,MSH2 ceea ce ar ajuta nu doar la stabilirea influenței asupra acumulării mutațiilor somatice
dar și asupra diagnosticului Si ndromului Lynch.

49
BIBLIOGRAFIE
1. Similar but different: distinct roles for KRAS and BRAF oncogenes in colorectal cancer
development and therapy resistance Markus Morkel Pamela Riemer, Hendrik Bläker, Christine
Sers, www.impactjournals.com/oncotarget , Oncotarget, Vol. 6, No. 25 July 30, 2015
2. Programul Național de control al cancerului în Republica Moldova pentru anii 2016 -2025
www.lex.justice.md/index.php?action=view&view=doc&lang=1&id=367949
3. Screening -ul cancerului colorectal în Republica Moldova Cernat V., Gîrleanu L., Donscaia A.,
Bîlba V. Revistă științifico practică INFO -MED ISSN 1810 -3936 2(28) Partea 2 2016
4. Victor Papilian – Anatomia omului. Vol. II: Splanhnologia
5.Carcinoame colorectale , Ghid de diagnostic și tratament, L. Lazar,F. Bădulescu, C. Ciobanu
Comisia de oncologie, B ucurești
6. Gautheer Boughe,Svetlana Svejdic, Cancer colorectal Ghid pentru pacienți, bazat pe Gidul de
practică medicală ESMO Seria ESMO/ACF
7. U.S.National Library of Medicine, Genetic Home Reference EGFR gene
https://ghr.nlm.nih.gov/gene/EGFR#resources
8. GeneCards Human gene dabase http://www.genecards.org/cgi -bin/carddisp.pl?ge ne=EGFR
9. Julian R. Molina The Ras/Raf/MAPK Pathway Volume 1, Issue 1,
http://www.jto.org/article/S1556 -0864(15)31506 -9/fulltext
10. GeneJet DNA Purification Kit https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K0721
11. Vasen, H., Watson, P., Mecklin, J. -P., & Lynch, H. (1999). New clinical criteria for hereditary
nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International
Collaborative Group on HNPCC. Gastroenterology 116(6), 1453 –1456
12. Vincent W. Yang, MD, PhD The Molecular Genetics of Colorectal Cancer Current
Gastroenterology Reports 1999, 1:449 –454 Current Science Inc. ISSN 1 522-8037 Copyright 1999
by Current Science Inc
13. COLORECTAL CANCER EVIDENCE -BASED CHEMOTHERAPY STRATEGIES ,
LEONARD B. SALTZ 2007 Humana Press Inc.
14. Identification of a mutation in the extracellular domain of the Epidermal Growth Factor
Receptor conf erring cetuximab resistance in colorectal cancer Clara Montagut. Alba
Dalmases,Beatriz Bellosillo, Marta Crespo, Silvia Pairet, Mar Iglesias, Marta Salido,Manuel Gallen,
Scot Marsters, Siao Ping Tsai, Nature Medine VOLUME 18 | NUMBER 2 | FEBRUARY 2012

50
15. Receptor Leonard B. Saltz, Neal J. Meropol, Patrick J. Loehrer Sr, Michael N. Needle, Justin
Kopit, and Robert J. Mayer Phase II Trial of Cetuximab in Patients With Refractory Colorectal
Cancer That Expresses the Epidermal Growth Factor Jurnal of Clinica l Oncology, VOLUME 22
NUMBER 7 APRIL 1 2004
16. Prospect: Informații pentru utilizator Erbitux 5 mg/ml soluție perfuzabilă Cetuximab Merck
KgaA Frankfurter Straße 25064293 Darmstadt,Germania
17. Protocol clinic național „Cancerul colonic” Aprobat la ședi nța Consiliului de Experți al
Ministerului Sănătății al Republicii Moldova din 31.03.2011, proces verbal nr. 2
18. Real-time PCR handbook Life technologies
19. Protocol: TaqMan Mutation Detection Assays https://www.thermofisher.com/us/en/home/life –
science/pcr/real -time-pcr/real -time-pcr-assays/taqman -mutation -detection -assays.html
20. User Guide: Qubit dsDNA BR As say Kits User Guide: Qubit dsDNA BR Assay Kits
21. EpiJET Bisulfite Conversion Kit Catalog number: K1461, Product Information
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K1461
22. User Guide: E -Gel Technical Guide
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/G661002
23. Victor Gheorghe Radu Prof. Dr. Mircea Ciurea,Teză de doctorat Aspecte local agresive ale
cancerului colorectal, Universi tatea de Medicină și Farmacie „Carol Davila” București
24. CURRENT CLINICAL ONCOLOGY Maurie Markman, MD, SERIES EDITOR, Colorectal
Cancer: Evidence -Based Chemotherapy Strategies, edited by LEONARD B. SALTZ, 2007
25. Christos S. Karapetis, M.D., Shirin Kham bata-Ford, Ph.D., Derek J. Jonker,K -ras Mutations and
Benefit from Cetuximab in Advanced Colorectal Cancer, The new england journal of medicine,
established in 1812 october 23, 2008 vol. 359 no. 1
26. Prof Timothy S Maughan, FRCR, Richard A Adams, FRCP, Ch ristopher G Smith, BSc, Angela
M Meade, Dphil, Prof Matthew T Seymour Addition of cetuximab to oxaliplatin -based first -line
combination chemotherapy for treatment of advanced colorectal cancer: results of the randomised
phase 3 MRC COIN trial
27. Eric Van Cutsem, Claus -Henning Köhne, Istva ´n La ´ng, Gunnar Folprecht, Marek P. Nowacki,
Stefano Cascinu, Igor Shchepotin, Joan Maurel, David Cunningham, Sabine Tejpar, Michael
Schlichting, Angela Zubel, Ilhan Celik, Philippe Rougier, and Fortunato Ciardiello Ce tuximab Plus
Irinotecan, Fluorouracil, and Leucovorin As First -Line Treatment for Metastatic Colorectal Cancer:

51
Updated Analysis of Overall Survival According to Tumor KRAS and BRAF Mutation Status,
Jurnal of Clinical Oncology, VOLUME 29 NUMBER 15 MAY 20 2011
28. COSMIC Catalog of somatic mutation in cancer http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic
29. Astrid Lièvre, Jean -Baptiste Bachet, Delphine Le Corre, et al. KRAS Mutation Status Is
Predictive of Response to Cetuximab Therapy in Colorectal Cancer, Cancer Res 2006;66:3992 -3995
30. Shan Muhammad1,2, Zheng Jiang1,2, Zheng Liu1,2, Kavanjit Kaur1, Xishan Wang, The role of
EGFR monoclonal antibodies (MoABs) cetuximab/panitumab, and BRAF inhibitors in BRAF
mutated colorectal cancer Journal of Gastrointestinal Oncolo gy, Vol 4, No 1 March
31. Functional Analysis through Hidden Markov Models FATHMM
https://omictools.com/functional -analysis -through -hidden -markov -models -tool
32. Targeted Therapy Drugs for Colorectal Cancer, American cancer society
https://www.cancer.org/cancer/colon -rectal -cancer/treating/targeted -therapy.html
33. Yoshihito Ohhara, Naoki Fukuda, Satoshi Takeuchi, Rio Honma, Yasushi Shimizu, Ichiro
Kinoshita, and Hirotoshi Dosaka -Akita, Role of targeted therapy in metastatic colorectal cancer,
World J Gastrointest Oncol. 2016 Sep 15; 8(9): 642 –655;
34. Targeted Thera py Drugs for Colorectal Cancer American Cancer Society
https://www.cancer.org/cancer/colon -rectal -cancer/treating/targeted -therapy.html
35. David Barras, BRAF Mutation in Colorectal Cancer: An Update upplementary Issue:
Biomarkers for Colon Cancer,B Swiss Institute of Bioinformatics, Bioinformatics Core Facility,
Lausanne, Switzerland
36. Astrid Lie `vre,1,3 Jean -Baptiste Bachet,3 Delphine Le Corre,1 Vale ´rie B oige,4 Bruno
Landi,2Jean -Franc¸ois Emile,3 Jean -Franc¸ois Co ˆte ´,1,2 Gorana Tomasic KRAS Mutation Status
Is Predictive of Response to Cetuximab Therapy in Colorectal Cancer, Cancer Res 2006;66:3992 –
3995

52

ANEXE
Anexa 1 Raporul de amplificare Real -Time Pacienți Adenocarcinoame
Block Type 96alum
Chemistry TAQMAN
Experiment File Name C:\Users \lozovanua \Desktop \CRC_4_5_6_7.eds
Experiment Run End Time 2017 -05-19 18:27:31 PM EEST
Instrument Type sds7500
Passive Reference ROX

Well Sample Name Target Name Task Reporter Quencher Cт Cт Mean Cт SD
A1 4_101160 BRAF_475_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A2 4_101160 KRAS_516_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A3 4_101160 KRAS_517_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A4 4_101160 KRAS_518_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A5 4_101160 KRAS_520_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A6 4_101160 KRAS_521_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A7 4_101160 KRAS_522_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A8 4_101160 KRAS_532_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A9 4_101160 EGFR_ex19dels_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A10 4_101160 EGFR_6213_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A11 4_101160 EGFR_6224_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A12 4_101160 EGFR_6239_ mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
B1 4_101160 EGFR_6240_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 37,34681 37,34681
B2 4_101160 EGFR_6241_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
B3 4_101160 EGFR_6252_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
B4 4_101160 EGFR_6253_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
B5 4_101160 BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 27,63549 27,56733 0,096392

53
B6 4_101160 BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 27,49917 27,56733 0,096392
B7 4_101160 KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 28,77579 28,8512 0,106656
B8 4_101160 KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 28,92662 28,8512 0,106656
B9 4_101160 EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 28,24147 28,02956 0,299682
B10 4_101160 EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 27,81766 28,02956 0,299682
B11 5_104079 BRAF_475_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
B12 5_104079 KRAS_516_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C1 5_104079 KRAS_517_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C2 5_104079 KRAS_518_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C3 5_104079 KRAS_520_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C4 5_104079 KRAS_521_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C5 5_104079 KRAS_522_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C6 5_104079 KRAS_532_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C7 5_104079 EGFR_ex19dels_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C8 5_104079 EGFR_6213_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C9 5_104079 EGFR_6224_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C10 5_104079 EGFR_6239_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C11 5_104079 EGFR_6240_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 36,94057 36,94057
C12 5_104079 EGFR_6241_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
D1 5_104079 EGFR_6252_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 37,29136 37,29136
D2 5_104079 EGFR_6253_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
D3 5_104079 BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 26,26221 26,26507 0,004045
D4 5_104079 BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 26,26793 26,26507 0,004045
D5 5_104079 KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 27,42739 27,60888 0,256655
D6 5_104079 KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 27,79036 27,60888 0,256655
D7 5_104079 EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 27,67831 27,65234 0,036722
D8 5_104079 EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 27,62638 27,6523 4 0,036722
D9 6_100283 BRAF_475_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined

54
D10 6_100283 KRAS_516_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
D11 6_100283 KRAS_517_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
D12 6_100283 KRAS_518_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E1 6_100283 KRAS_520_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E2 6_100283 KRAS_521_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E3 6_100283 KRAS_522_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E4 6_100283 KRAS_532_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E5 6_100283 EGFR_ex19dels_ mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E6 6_100283 EGFR_6213_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E7 6_100283 EGFR_6224_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E8 6_100283 EGFR_6239_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E9 6_100283 EGFR_6240_mu UNKNOWN FAM NFQ-MGB Undetermined
E10 6_100283 EGFR_6241_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E11 6_100283 EGFR_6252_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 36,87177 36,87177
E12 6_100283 EGFR_6253_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
F1 6_100283 BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 30,6046 7 29,68889 1,295105
F2 6_100283 BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 28,77311 29,68889 1,295105
F3 6_100283 KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 29,92228 29,99808 0,1072
F4 6_100283 KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 30,07388 29,99808 0,1072
F5 6_100283 EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 31,71654 31,76071 0,062464
F6 6_100283 EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 31,80488 31,76071 0,062464
F7 7_109659 BRAF_475_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
F8 7_109659 KRAS_516_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
F9 7_109659 KRAS_517_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
F10 7_109659 KRAS_518_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
F11 7_109659 KRAS_520_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
F12 7_109659 KRAS_521_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G1 7_109659 KRAS_522_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined

55
G2 7_109659 KRAS_532_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G3 7_109659 EGFR_ex19dels_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G4 7_109659 EGFR_6213_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G5 7_109659 EGFR_6224_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G6 7_109659 EGFR_6239_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G7 7_109659 EGFR_6240_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 33,87503 33,87503
G8 7_109659 EGFR_6241_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G9 7_109659 EGFR_6252_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G10 7_109659 EGFR_6253_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G11 7_109659 BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 27,1321 27,44283 0,43944
G12 7_109659 BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 27,75356 27,44283 0,43944
H1 7_109659 KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 31,64909 30,68641 1,36143
H2 7_109659 KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 29,72373 30,68641 1,36143
H3 7_109659 EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 29,95286 30,02127 0,096745
H4 7_109659 EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 30,08968 30,02127 0,096745

56

Anexa 2 Raport de amplificare Real -Time Pacienți Sindrom Lynch
Block Type 96alum
Chemistry TAQMAN
Experiment File Name C:\Users \lozovanua \Desktop \CRC_8_9_10_11.eds
Experiment Run End Time Not Started
Instrument Type sds7500
Passive Reference ROX

Well Sample Name Target Nam e Task Reporter Quencher Cт Cт Mean
A1 8_CR0003_T BRAF_475_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A2 8_CR0003_T KRAS_516_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A3 8_CR0003_T KRAS_517_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 38,40219 38,40219
A4 8_CR0003_T KRAS_518_mu UNKNOW N FAM NFQ -MGB Undetermined
A5 8_CR0003_T KRAS_520_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 28,76032 28,76032
A6 8_CR0003_T KRAS_521_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A7 8_CR0003_T KRAS_522_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A8 8_CR0003_T KRAS_532_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A9 8_CR0003_T EGFR_ex19dels_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A10 8_CR0003_T EGFR_6213_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A11 8_CR0003_T EGFR_6224_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
A12 8_CR0003_T EGFR_6239_mu UNKNOWN FAM NFQ-MGB Undetermined
B1 8_CR0003_T EGFR_6240_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
B2 8_CR0003_T EGFR_6241_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
B3 8_CR0003_T EGFR_6252_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
B4 8_CR0003_T EGFR_6253_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
B5 8_CR0003_T BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 23,90019 23,54958 0,495848
B6 8_CR0003_T KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 22,99564 22,90339 0,130454

57
B7 8_CR0003_T BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 23,19896 23,54958 0,495848
B8 8_CR0003_T KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ-MGB 22,81115 22,90339 0,130454
B9 8_CR0003_T EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 22,93926 22,90842 0,043625
B10 8_CR0003_T EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 22,87757 22,90842 0,043625
B11 9_CR0006_T BRAF_475_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
B12 9_CR0006_T KRAS_5 16_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C1 9_CR0006_T KRAS_517_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C2 9_CR0006_T KRAS_518_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C3 9_CR0006_T KRAS_520_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 34,04856 34,04856
C4 9_CR0006_T KRAS_521_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C5 9_CR0006_T KRAS_522_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C6 9_CR0006_T KRAS_532_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C7 9_CR0006_T EGFR_ex19dels_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C8 9_CR0006_T EGFR_6213_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C9 9_CR0006_T EGFR_6224_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C10 9_CR0006_T EGFR_6239_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
C11 9_CR0006_T EGFR_6240_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 36,15736 36,15736
C12 9_CR0006_T EGFR_6241_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
D1 9_CR0006_T EGFR_6252_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
D2 9_CR0006_T EGFR_6253_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 37,24241 37,24241
D3 9_CR0006_T BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 23,73396 23,7795 0,064391
D4 9_CR0006_T BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 23,82503 23,7795 0,064391
D5 9_CR0006_T KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 23,45564 23,49909 0,061441
D6 9_CR0006_T KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 23,54253 23,49909 0,061441
D7 9_CR0006_T EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 23,96419 23,90566 0,082778
D8 9_CR0006_T EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 23,84713 23,90566 0,082778
D9 10_CR009_T BRAF_475_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
D10 10_CR009_T KRAS_516_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined

58
D11 10_CR009_T KRAS_517_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
D12 10_CR009_T KRAS_518_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E1 10_CR009_T KRAS_520_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E2 10_CR009_T KRAS_521_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 39,85373 39,85373
E3 10_CR009_T KRAS_522_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E4 10_CR009_T KRAS_532_ mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E5 10_CR009_T EGFR_ex19dels_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E6 10_CR009_T EGFR_6213_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E7 10_CR009_T EGFR_6224_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E8 10_CR009_T EGFR_6239_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E9 10_CR009_T EGFR_6240_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 33,80253 33,80253
E10 10_CR009_T EGFR_6241_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E11 10_CR009_T EGFR_6252_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
E12 10_CR009_T EGFR_6253_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
F1 10_CR009_T BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 22,29098 21,66877 0,879934
F2 10_CR009_T BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 21,04656 21,66877 0,879934
F3 10_CR009_T KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 22,23305 22,13204 0,142853
F4 10_CR009_T KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 22,03103 22,13204 0,142853
F5 10_CR009_T EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 21,96151 21,81561 0,20634
F6 10_CR009_T EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 21,6697 21,81561 0,20634
F7 11_CR0010_T BRAF_475_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
F8 11_CR0010_T KRAS_516_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
F9 11_CR0010_T KRAS_517_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
F10 11_CR0010_T KRAS_518_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
F11 11_CR0010_T KRAS_520_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 36,68113 36,68113
F12 11_CR0010_T KRAS_521_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 28,17563 28,17563
G1 11_CR0010_T KRAS_522_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G2 11_CR0010_T KRAS_532_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined

59
G3 11_CR0010_T EGFR_ex19dels_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G4 11_CR0010_T EGFR_6213_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G5 11_CR0010_T EGFR_6224_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G6 11_CR0010_T EGFR_6239_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G7 11_CR0010_T EGFR_6240_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB 38,66765 38,66765
G8 11_CR0010_T EGFR_6241_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G9 11_CR0010_T EGFR_6252_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G10 11_CR0010_T EGFR_6253_mu UNKNOWN FAM NFQ -MGB Undetermined
G11 11_CR0010_T BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 21,82681 22,46266 0,899233
G12 11_CR0010_T BRAF_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 23,09851 22,46266 0,899233
H1 11_CR0010_T KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 25,32873 24,24483 1,532861
H2 11_CR0010_T KRAS_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 23,16093 24,24483 1,532861
H3 11_CR0010_T EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 23,52753 23,46638 0,086473
H4 11_CR0010_T EGFR_rf UNKNOWN FAM NFQ -MGB 23,40524 23,46638 0,086473

60

DECLARAȚIA PRIVIND ASUMAREA RĂSPUNDERII

Subsemnata ,Lozovanu Ana, absolventă a Universității Academiei de Științe a Moldovei,
ciclul masterat pe tema “SCREENING -UL GENETIC AL BOLNAVILOR CU CANCER
COLORECTAL PENTRU MUTAȚIILE SOMATICE A GENELOR EGFR, KRAS ȘI BRAF ”
a fost elaborată de mine și nu a fost prezentată niciodată la o altă facultate/ la un alt program de
masterat sau instituție de învățămînt superior din țară sau din străinătate.
De asemenea, declar că sursele utilizate în teză, inclusiv cele din internet , sunt indicate cu
respectarea regulilor de evitare a plagiatului:
 Fragmentele de text sunt reproduse întocmai și sunt scrise în ghilimele, deținînd referința
precisă a sursei;
 Redarea/ refolmularea în cuvinte proprii a textelor altor autori conține referi nța precisă;
 Rezumarea ideilor altor autori conține referința precisă a originalului.

Ana Lozovanu

Semnătura

Data