Lect. Dr. Mirela Mihaela Cîmpeanu CANDIDAT : Sorin Lazăr Iași 2017 Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Ia și Facultatea de Biologie Specializarea… [619754]

Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Ia și
Facultatea de Biologie

LUCRARE DE DISERTAȚIE

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC :
Lect. Dr. Mirela Mihaela Cîmpeanu

CANDIDAT: [anonimizat]
2017

Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Ia și
Facultatea de Biologie
Specializarea Genetică moleculară

TESTUL MICRONUCLEILOR
ÎN EVALUAREA EFECTULUI POLUĂRII
APELOR LA SPECII DE PEȘTI

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC :
Lect. Dr. Mirela Mihaela Cîmpeanu

CANDIDAT: [anonimizat]
2017

Cuprins :

Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 1
Capitolul I. Stresul oxidativ cauzat de mediul înconjurător la oganismele acvatice .. 2
I.1. Factori i de mediu ………………………….. ………………………….. ………………………… 3
I.2. Pesticidele ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 6
Capitolul II . Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………….. 10
II.1. Metoda Squash ………………………….. ………………………….. ………………………… 10
II.2. Extracția ADN -ului din țesut animal – protocolul cu Fenol – Cloroform ….. 12
II.3. Electroforeza în gel de agaroză cu bromură de etidiu ………………………….. … 19
Capitolul III . Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. …………. 23
Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 30
Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 31

1
Introducere

Peștii sunt organisme acvatice expuse la o mare varietate de poluanți de
diferite concentrații și sunt cunoscuți ca bioindicatori în poluarea apelor deoarece
aceștia acumulează substanțele din mediu proces numit bioacumulare (B.A. Markert,
A.M. Breure & H.G. Zechmeister).
Factorii de mediu induc modificări organismelor vii, atât la nivel celular și
molecular, ce pot fi reversibile sau permanente. Cei mai importanți factori ce pot
produce aste modificări organismelor acvatice sunt temperatura, oxigenul, salinitatea,
dar și prezența unor substanțe chimice (insecticide, erbicide și fungicide) (V. I.
Lushchak, 2010) .
Cele mai studiate spe cii de peșt i sunt cele de interes economic. Testul
micronucleilor este folosit în geno toxicologie pentru a evidenția prezența compușiilor
genotoxici și efectul lor la nivel molecular.
Obiectivul acestui studiu este de a oferi noi informații asupra modificărilor
produse la nivelul nucleilor celulelor din branhii la specia de pești (Carassius gibelio )
din mediul natural.
Vreau să îi mulțumesc doamnei coordonator, Lect. Dr. Mirela Mihael a
Cîmpeanu, pentru timpul și ajutorul acordat în realizarea lucrării de față, atât în timpul
lucrului în laborator, cât și în timpul petrecut pentru a -mi oferi sugestii.
Vreau să îi multumesc și domnului Conf. Dr. Habil. Dragoș Lucian G organ și
doctorandu lui Ovidiu Alexandru Popescul pentru ajutorul ș i îndrumarea di n
laboratorul de Genetică moleculară.

2
Capitolul I. Stresul oxidativ cauzat de mediul înconjurător la
organismele acvatice

Oxigenul reactiv este prezent și indispensabil în viața aerobă. Raportul dintre
producerea și eliminarea oxigenului duce la o stare de echilibru ce poate fi ușor
perturbat și ca urmare să producă modificări la nivel celular, proces numit „stres
oxidativ”. Schimbările factorilor de medi u, cum ar fi temperatura, nivelul oxigenului
și salinitatea pot induce stresul oxidativ în condiții normale sau artificiale prin
inducerea dezechilibrului între producția și eliminarea oxigenului reactiv (V. I.
Lushchak, 2010) .
În mediul acvatic, stresul oxidativ poate fi ușor indus de către poluanți, cum ar
fi ionii metalelor tranziționale (cupru, crom, mercur, arsenic), pesticidele (insecticide,
erbicide, fungicide) (V. I. Lushchak, 2010) .
În ultimii ani, cercetarea în biologie a radicalilor liberi a fo st reorientată de la
modul descriptiv de acțiune la mecanismele moleculare care sporesc toleranța (V. I.
Lushchak, 2010) .
Oxigenul reactiv induce modificări multiple la nivelul ADN -ului și s -au
urmărit elaborarea unor tehnici pentru evaluarea acestui proc es cum ar fi formarea
bazelor oxidate (8 -oxoguanina) ce poate fi măsurată prin tehnici HPLC (Kelly et al.,
2008) sau imun (Bespalov et al., 1999). Măsurarea 8 -oxoguninei a fost aplicată
animalelor acvatice (Malins et al., 1996; Gielazyn et al., 2003; Gryg oryev et al.,
2008). Analiza Comet, ce poate reflecta varietatea modificărilor ADN -ului, a fost
aplicată cu succes în pești (Toyoizumi et al., 2008; Cavalcante et al., 2008; Caliani et
al., 2009) și alte animale acvatice (Petridis et al. , 2009; Binelli et al., 2009).

3
I.1. Factori i de mediu

Temperatura

Temperatura afectează toate organismele vii și în cazul animalelor ectotermice
are un efect critic. Scăderea sau creșterea temperaturii mediului induc stresul oxidativ
prin diferite mecanisme. Creșterea temperaturii duce la un consum ridicat de oxigen
și stimulează porcesele metabolice, determinând stresul oxidativ prin produșii
secundari obținuți în urma metabolismulu i intensificat (V. I. Lushchak, 2010) .
Creșterea temperaturii mediului înconj urător, induce stresul oxidativ în
broaște ( Bagnyukova et al., 2003), pești (Parihar și Dub ey, 1995; Heise et al., 2006 ;
Lushchak și Bagny ukova, 2006 ) și alte animale acvatice (Verlecar et al., 2007;
Bocchetti et al ., 2008). În conformitate cu intensificarea metabolismului oxidativ
menționat mai sus se poate aștepta scăderea riscului de inducere a stresului oxidativ
la o temperatură scăzută. În unele cazuri, scăderea temperat urii mediului poate
determina stresul oxid ativ la pești (Malek et al., 2004) și la Semibalanus balanoides
(Niyogi et al., 2001).

Nivelul de oxigen

Atât temperatura, cât și disponibilitatea oxigenului sunt parametri esențiali
pentru distribuția hidrobionților. Nivelurile crescute de O 2 măresc generarea tipurilor
de oxigen reactiv datorită probabilității sporite de scăpare a electronilor din lanțurile
de transport de electroni pentru combinarea cu oxigen ul molecular. Cu toate acestea,
organismele posedă mecanisme adaptive specifice pentru a prev eni consecințele
negative ale nivelelor ridicate de oxigen din mediu. La nivelul comportamentului,
acestea pot evita zonele suprapuse de oxigen, în timp ce la nivelul organismului,
acestea pot reduce capacitatea lo r de a extrage oxigen de mediu (V. I. Lush chak,
2010) .

4
În literatură se mențioanză că e xpunerea la hiperoxie induce la diferite specii
de pești, cum ar fi Carassius auratus (Lushchak et al., 2005 ), Salmo salar (Olsvik et
al., 2005) și Solea senegalensis (Salas -Leiton et al. , 2009). Rezultate asemănătoare
au fost raportate la Adamussium colbecki și Pecten jacobaeus (Viarengo et al., 1995)
și Anthopleura elegantissima (Dykens et al., 1992). Prin urmare, este clar că nivelul
crescut de oxigen extern este un inductor al stresulu i oxidativ la animalele acvatice
(V. I. Lushchak, 2010) .
Concentrația scăzută a oxigenului poate reduce șansa producerii d e radicali
liberi în organisme. S căderea concentrațiilor de oxigen din mediul înconjurător poate
provoca stres oxidativ. E xpunerea la anoxie duce la o creștere a activității SOD
(superoxid dismutaza) și catalază în ficat (Lushchak et al., 2001), care a fost folosită
ca o demonstrație a ideii de "pregătire pentru stres oxidativ" (Hermes -Lima et al.,
1998). Această ipoteză afirmă că în or ganismele evoluționiste adaptate la tranzițiile
dintre condițiile externe normale și cele extreme, o expunere la cele extreme induce
răspunsul adaptiv care îi ajută să supraviețuiască la recuperare. Hipoxia duce la o
creștere a activității SOD ș i catalază în ficatul de Cyprinus carpio (Lushchak et al.,
2005).
Stresul oxidativ indus de hipoxie a fost confirmat parțial la Oryzias latipes
(Oehlers et al., 2007), în care hipoxia a dus la creșterea nivelul ui de glutation -S-
transferază . În alte lucrări, hipoxi a a crescut activitățile catalazei și glutationului
peroxidază la Corbicula fluminea (Vidal et al., 2002).

Salinitatea

În organismele acvatice, schimbarea de salinitate determină o varietate de
răspunsuri fiziologice, cum ar fi hormonii legați de stres, stimulând metabolismul
energetic și tulburarea echilibrului electrolitic. Stresul indus de schimbarea salinității
a fost asociat cu generarea oxigenului reactiv , provocând daune oxidative (Liu et al.,
2007). Într-un studiu, c reveții (Litopenaeus van namei ) au fost supuși unei salinități
acută (30 ‰ față de 5, 15, 30 și 50% ) timp de 24 de ore și s -au observat schimbări în
activitățile superoxid dismutazei , catalaz ei, glutation -peroxidazei și Na+/K+.
Suplimentarea dietei cu doze inerte de vitamina E a s porit rezistența creveților la

5
modificările acute ale salinității, în timp ce dozele sale mai mari nu au fost eficiente.
Aceste rezultate au demonstrat că schimbarea salinității ar putea fi toxică datorită
inducției stresului oxidativ, iar vitamina E poate fi utilă pentru a preveni scenariul
periculos în aceste condiții (Liu et al., 2007).
Într-un experiment s -au expus indivizi de Paralichthys olivaceus timp de 48
de ore la ap a de mare (35 ‰) și 17,5, 8,75, 4 și 0 ‰ prin adăugarea apei subterane și
s-au studiat expresia glutation -peroxidazei și glutation -S-transferazei prin tehnica
qPCR Markeri ai stării fiziologice a peștilor. Ei au concluzionat că ambele enzime
studiate au jucat un rol important în detoxifierea oxigenului reactiv (Choi et al., 2008).
La aclimatizarea treptată a sturionilor Acipenser naccarii din apa dulce până
la apa de mare (35 ‰ salinitate), activitățile catalazei, glutation -peroxidazei și
superoxid dismutazei și nivelurile de peroxid de lipide au fost măsurate în sânge, ficat
și inim ă (Martínez -Alvarez et al., 2002). După 20 de zile la 35% salinitate,
osmolalitatea plasmei, constantele eritrocitare și conținutul de apă musculară au
revenit la valori obișnuite pentru salinitatea scăzută a mediului, indicând faptul că
procesele osmoregu latorii și -au atins obiectivul. Cu toate acestea, valorile
cortizolului, activitățile enzimatice antioxidante din sânge, peroxidarea lipidică din
plasmă și proteinele hepatice nu au revenit la valorile inițiale, arătând că procesele
osmoregulatorii au prov ocat modificări fiziologice substanțiale la nivelul peștilor
(Martínez -Alvarez et al., 2002).

Ionii metalelor tranzitionale

Ionii metalici sunt cunoscuți indu ctori ai stresului oxidativ. Ei pot stimula
producția de oxigen reactiv prin intermediul a două mecanisme diferite. Prima este
legată de interferența proceselor legate de metal e, iar cea de -a doua de generarea
radicali lor liberi de ioni cu valență variabilă. De fapt, cel de -al doilea mod poate, de
asemenea, să interfereze cu primul, dar de obicei principala atenție este acordată
efectelor ionilor metalici cu valență variabilă (V. I. Lushchak, 2010) .

6
Informațiile privind generarea stresului oxidativ în hidrobionți de către ionii
metalelor de tranziție sunt abundente. Capacita tea acestor ioni de a schimba starea de
valență este de fapt cea mai importantă proprietate a acestui grup de ioni (V. I.
Lushchak, 2010) .
Cei mai importan ți și studia ți ioni sunt fierul, cupru l, crom ul, mercur ul și
arsen icul, toți producând stres oxidati v în concentrații scăzute sau ridicate (V. I.
Lushchak, 2010) .

I.2. Pesticidele

Pesticidele sunt agenți fizici, chimici sau biologici destinați uciderii unei
plante nedorite și a unor dăunători animale. Clasele principale de pesticide sunt:
insecticide, erbicide și fungicide. Este important de observat că majoritatea
pesticidelor sunt agenți sintetici, noi pentru mediul în conjurător și pentru oameni și
efectele lor asupra sistemelor bi ologice sunt puțin previzibile (V. I. Lushchak, 2010) .
Dupa V. I. Lushchak ( 2010) , acest grup de substanțe toxice poate induce
stresul oxidativ prin mai multe mecanisme:
 Fiind capabil e să intre în cicluri redox ( oxidare reversibilă), acceptând sau
donând elec troni constituenților celulari și pot crește nivelul oxigenului
reactiv,
 La metabolismul celular unele dintre pesticide pot conduc e la scăderea
potențialului antioxidant .
 Anumite pesticide pot inactiva enzimele antioxidante și asociate, ceea ce duce
la scăderea potențialului antioxidant;
 Interferența cu pr ocesele de furnizare a energiei poate reduce suplimentul
pentru metabolism și detoxifiere
 Modificarea proceselor vitale de bază, cum ar fi transc rierea și traducerea, în
mod ne direct, poate spori nivelul oxigenului reactiv .

7
Insecticide le

Acest grup include nu numai insecticide, ci și acaricide. Majoritatea
insecticidelor sunt compuși organofos fați (OP) utilizați pentru combaterea insectelor
pe culturi, gospodării, produse depozitate și tratarea infecțiilor parazitare externe ale
peștilor și animalelo r. Mecanismul cunoscut de acțiune este legat de inhibarea
enzimei acetilcholinesteraz ei (AChE), care este responsabilă pentru întreruperea
transmiterii impulsului nervos . Acesta este efectul principal al organofosfa ților la
vertebrate și ne vertebrate (V. I . Lushchak, 2010) .
Efectele lor prin blocarea hidrolizei neurotransmitatorului acetilcolină (ACh)
la sinapsele neuronale c entrale și periferice și conduc la acumularea excesivă de ACh
și la activarea recep torilor ACh (Shih și McDonough, 1997). Efectele to xice ale
organofosfa ților se crede că se datorează, în mare măsură, hiperactivității sistemului
colinergic ca urmare a acumulării ACh în fantele sinaptice. Pauza semnalizării
neuronale și endocrine conduc e la influx intracelular de Ca2+, declanșând activar ea
enzimelor proteolitice, sintazei oxidului nitric și generarea de radicali liberi (Beal,
1995), rezultând stres oxidativ. Deoarece metabolizarea organofosfaț ilor (în special,
diclorvos) în ficat este legată de consumul d e glutation, putând să declanșeze stresul
oxidativ (V. I. Lushchak, 2010) .
Mai multe lucrări au descris inducerea stresului oxidativ la peștii tratați cu
organofosfați . De exemplu, sa constatat că diclorvos ul induce stresul oxidativ la crap
(Cyprinus carpio ) și somnul pitic (Ictalurus nebulosus ) (Hai et al., 1997) și în
anghilele europene (Anguilla anguilla ) (Pena-Llopis et al., 2003) și trichlorfon în
Oreochromis niloticus (Thomaz et al., 2009).
Mecanismele efecte lor toxice ale altor grupuri de insecticide, hidrocarburile
clorurate incluzând lindanul și DDT ( Diclor -Difenil -Tricloretanul ) par a fi implicate
în inducerea stresului oxidativ în linia celulară de la o tumoră cutanată a crapului
Cyprinus carpio (Ruiz -Leal ș i George, 2004) și hepatocitele de la Hoplias
malabaricus (Filipak Neto et al., 2008). Mecanismele implicate aici pot fi legate de
generarea de radicali liberi după activarea metabolică cu inducția enzimatică a P450
prin DDT și produsele rezultat e pot intra în oxidare reve rsibilă (Harada et al., 2003).

8
Inducerea stresului oxidativ poate fi secundară activării metabolice și poate fi
un factor cheie în hepatocarcinogeneza inițiată de DDT și poate juca un rol important
în pro movarea și progresia tumorilo r (V. I. Lushchak, 2010) .

Erbicidele

Două grupe de erbicide vor fi analizate aici: prima este cunoscută ca fiind
direct responsabilă pentru amplificarea generării de radicali liberi, cum ar fi Paraquat
cunoscut și ca V iologen, care intră în cicluri red ox și generând în mod constant oxigen
reactiv , iar a doua, inactivează enzime antioxidante cum ar fi aminotriazol și
ditiocarbamați (V. I. Lushchak, 2010) .
Sa demonstrat că Paraquat provoacă stres oxidativ în Channa punctata (Parvez
și Raisuddin, 2006), Danio rerio (Bretaud et al., 2004) ș i Oncorhynchus mykiss
(Stephensen et al., 2002).
Al doilea grup de erbicide constă din mai multe clase de compuși cunoscuți a
fi în principal inhibitori ai enz imelor antioxidante, cum ar fi superoxid dismutaza și
catalază. Mecanismul considerat a fi responsabil pentru inducerea stresului oxidativ
prin DDC (dietilditiocarbamat ) este legat de extracția ionilor de cupru din centrul
activ al superoxid dismutazei care conține Cu, Zn. Molinatul a indus, de ase menea,
stresul oxidativ la Anguilla anguilla (Peñna -Llopis et al., 2001).
Este important să se menționeaze că erbicidele pot să își exercite activitatea
biologică prin inducerea stresului oxidativ. În Carassius auratus , Roundup, un
erbicid pe bază de glifosat, a provocat stres oxidativ la concentrații foarte mici
(Lushchak et al., 2009 ).

Fungicidele

Probabil, compuși i care conțin cupru sunt printr e cele mai importante
fungicide. S-a constatat că hexaclorbenze nul (HCB) sau perclorobenzenul induce
stresul oxid ativ în f icat și creierul la specia Cyprinus carpio (Song et al., 2006).
Deși utilizarea hexaclorbenzenul a fost interzisă la nivel global în temeiul
Convenției de la Stockholm privind poluanții organici persistenți, este unul dintre cei

9
mai răspândiți poluanți organici persistenți, deoarece este încă eliberat în mediu ca
produs secundar în multe procese industriale. Hexaclorbenzenul se poate lega de
citocr omi și nu este ușor metabolizat , detașând astfel lanțul de transport al
electronului de activitatea mono -oxigenazică și, în consecință, favorizând producerea
de specii reactive (V. I. Lushchak, 2010) .
Pentaclorfenolul, unul dintre metaboliții principali ai hexaclorbenzenul , este o
sursă puternică de oxigen reactiv în timpul metabolizării sale (V. I. Lushchak, 2010) .
Gruparea fungicidelor azolice, în special procloraz este un fungicid de contact
cu spectru larg. Proclorazul poate genera efecte adverse asupra organismelor acvatice,
în special a modulației activităților en zimatice ale citoc romului P450 (V. I. Lushchak,
2010) .

10
Capitolul II. Materiale ș i metode

II.1. Metoda Squash

S-a utilizat protocolul standard după Weili Cai et al. (2010) și a fost adaptat
pentru țesutul branhial de la Carassius gibelio .

Materiale necesare :
• 10 pești (branhii de Carassius gibelio )
• Pahare Berzelius
• Lame și lamele
• Alcool etilic 70%
• Fixator 3 :1 (Acid acetic glacial :Alcool etilic 98%)
• Colorant orcein ă
• Hârtie de filtru
• Microscop optic Novex
• Ulei de imersie

Modul de lucru:

Indivizii de Carassius gibelio au fost recolta ți din județul Tulcea, din bazinul
Dunării.
De la indivizii de Carassius gibelio se preleveaz ă arcurile branhiale, se spală
și se introduc în pahare Berzelius cu alcool etilic 70%.
Se lasă 24 de ore în alcool etilic 70 %, după care se scot arcurile branhiale și se
pun în alte pahare Berzelius cu fixator 3:1 (acid acetic glacial:Alcool etilic 98%).
Se păstrează în fixator până când vor fi utilizate pentru realizarea preparatelor
microscopice. Pentru realizarea preparatel or microscopice, se prelevează lamele
brahniale de pe arcur ile branhiale și se pun pe lamă într -o picătură de colorant
(orceină).

11
Lamelele branhiale se fragmentează, iar apoi se pune lamela de sticlă pentru a
realiza preparatul microscopic. Se aplică presiune pentru a etala preparatul sub
lamelă. Excesul de colorant se îndepărtează cu hârtie de filtru (Figura 1) .
Se viziualizează preparatul sub microscopul optic Novex.

A B

C D

E
Figura 1. Metoda squash pentru branhii de Carassius gibelio. A – recoltarea
lamelelor branhiale, B – colorant orceină, C – etalarea unei lamele branhiale pe
lamă, D – Colorarea lamelei branhiale, E – Presarea preparatului dintre lama și
lamelă.

12
II.2. Extr acția ADN -ului din țesut animal – protocolul cu Fenol –
Cloroform

Tehnica este folosită pentru extragerea ADN total din țesuturi proaspete,
congelate sa u păstrate în etanol (Ausubel et al ., 1995).

Materiale necesare:

1. Tampon pentru liza celulară:
Conține: Tris HCl 50mM (pH=8), SDS 1,0%, EDTA 25mM.

Pentru 50ml, într -o eprubetă se introduc 25ml H2O miliQ (apă distilată filtrată
prin filtru de carbon, schimbător de ioni etc.) autoclavată, la care se adaugă 2,5ml
soluție stoc 1M Tris HCl (pH=8), 5ml 10% SDS, 2,5ml 0,5M EDTA. Se completează
volumul cu H2O miliQ până la 50ml și se introduce într -un tub Corning nou cu
volumul de 50ml, neautoclavat.

Soluții stoc:

 Soluție Tris -HCl 1M (pH=8): – cantitățile sunt calculate pentru un volum
de 100ml;
– se dizolvă 12,11g Tris în 80ml H2O miliQ;
– se corectează pH -ul la 8 cu HCl;
– se autoclavează.

 Soluție Tris -EDTA (TE) (pH=8,0): -cantitățile sunt considerate pentru un
volum de 100ml;
– într-o eprubetă de 100ml se introduce 1ml soluție stoc Tris -HCl 1M (pH=8 );
– 200μl EDTA 0,5M;
– se completează cu H2O -miliQ până la 100ml și se autoclavează.

13
 Soluție NaOH 10N (100ml):
– se cântăresc 40g NaOH
– se adaugă 70ml H2O -miliQ autoclavată și se agită până la dizolvare;
– se aduce volumul la 100ml;
– nu se autoclavează.

 Soluție SDS 10% (dodecil sulfat de sodiu):
– se introduc 10g SDS în 80ml H2O -miliQ autoclavată și se încălzește soluția la 80șC
pentru o mai bună dizolvare;
– se ajustează pH -ul la 7,2 (dacă este necesar), utilizând HCl;
– se aduce volumul l a 100ml cu H2O -miliQ;
– nu se autoclavează.
 Soluție EDTA 0,5M (etilendiaminotetraacetat: sare disodică ):
– se cântăresc 18,61g EDTA, peste care se adaugă 80ml H2O -miliQ;
– se agită puternic și se adaugă 1ml soluție NaOH 10N;
– se adaugă NaOH până când soluț ia devine alcalină (pH=8,0), iar EDTA este dizolvat
complet.
– se aduce volumul la 100ml cu H2O -miliQ și se autoclavează;

Modul de lucru:

Se etichetează tuburi Eppendorf de 1,5ml autoclavate, în care se introduc câte
500μl soluție tampon (tampon pentru liză). Tuburile se țin închise, până în momentul
introducerii țesutului. Se cântăresc între 20 – 200mg de țesut proaspăt, congelat sau
conservat în alcool etilic 95% (în acest caz, țesutul se usucă înainte de cântărire, pe
hârtie de filtru) (Figura 2).

14

Figura 2 . Branhii pentru prelevarea țesutului și extracția de ADN .

Fragmentul de țesut se așează pe o lamă sterilă și se taie mărunt cu un bisturiu
sau cu o lamă, sterilizate. Dacă fragmentul este mic (dacă provine de la un individ de
1 – 2cm), ac eastă etapă nu este necesară.
Se introduc fragmentele de țesut în tubul Eppendorf (de 1,5ml) corespunzător,
care conține 500μl soluție tampon pentru liză. Această etapă se repetă pentru toți
indivizii. În fiecare tub, se adaugă câte 10μl proteinază K (10 μl reprezintă
echivalentul a 200μg proteinază dintr -o soluție stoc 20mg/ml care este preparată și
congelată la – 20șC). Se agită fiecare probă pe un vortex și se păstrează peste noapte
în etuvă la 37șC.
În ziua următoare, sub nișă, în fiecare tub de 1,5ml se ada ugă 600μl de soluție
fenol : cloroform : alcool izoamilic (25 : 24 : 1), până la semnul superior al tubului.
Se agită tuburile timp de 30 – 60 secunde, apoi se centrifughează (utilizând o
centrifugă de masă), la o turație 8000 rotații/minut, ti mp de 4 minute. În timpul
centrifugării, se etichetează noi tuburi Eppendorf de 1,5ml. La sfârșitul centrifugării,
tuburile prezintă o fază inferioară de culoare gălbuie care conține solventul organic,
o fază superioară care conține ADN și o fază intermedi ară unde sunt depozitate toate
resturile pe care dorim să le elimi năm din soluția de ADN (Figura 3).

15

Figura 3. Separarea celor trei faze .

Dacă această fază intermediară este foarte ma re, se repetă spălarea cu
fenol:cloroform: alcool izoamilic urmată de centrifugare. Dacă fazele sunt bine
separate, se trece la etapa următoare.
Se separă faza superioară a fiecărui tub, în noile tuburi etichetate; – pentru
aceasta se utilizează o pipetă, cu ajutorul căreia se extrag 700μl de ADN. Dacă
pipetarea se face re pede, iar concentrația ADN este foarte mare în faza superioară a
tubului, în momentul pipetării, se pot extrage resturi ale fazei intermediare.
Se extrage faza superioară din fiecare tub menținându -le deschise sub nișă, iar
la sfârșit, se adaugă câte 550 μl cloroform. Se agită tuburile timp de 30 – 60 secunde,
apoi se centrifughează la 8000 rotații/minut, timp de 3 minute, utilizând o centrifugă
de masă (Figura 4). În timpul centrifugării, se etichetează noi tuburi.

16

Figura 4. Cele trei faze dupa adaugar ea cloroformului .

Se separă fazele superioare rezultate în urma centrifugării, în noile tuburi, în
același mod ca în etapa precedentă, având grijă să nu se preia nimic din faza
intermediară de separare (Figura 5).

Figura 5. Separarea fazei superioare ( stanga) de fazele intermediare și inferioare
(dreapta).

17
Se adaugă 1 ml etanol rece 95% (păstrat la -20șC) în noile tuburi după separare
până la semnul superior al fiecărui tub. Se agită tuburile și se lasă la temperatura de –
20șC, timp de 30 – 60 minute, timp în care se va forma un precipitat albicios (ADN
total) pe fundul tuburilor (Figura 6).

Figură 6. Precipitarea ADN -ului în etanol
(http://www.popsci.com/scitech/article/2009 -03/science -forensics ).

După precipitarea ADN, se centrifughează tuburile la 10.000 rotații/minut,
timp de 5 minute, pentru sedimentare (Figura 7).
Se elimină supernatantul și se așează tuburile deasupra unei hârtii de filtru,
astfel încât să se scurgă ultimele picături de alcool.
Urmează uscarea peletelor, mutând tuburile, de schise, într -o centrifugă cu
vacuum, unde sunt menținute timp de 10 minute, cu temperatura în scădere. Dacă în
acest interval de timp sedimentele nu sunt uscate, se mai lasă tuburile încă 5 minute
în centrifugă.
După uscarea peletelor, se adaugă în fiecar e tub câte 200μl soluție TE
(pH=8,0) și se resuspendă manual sau pipetând de câteva ori. Pentru o mai bună
resuspensie, se pot lăsa între 15 și 30 minute la temperatura camerei, la 37șC sau timp

18
mai îndelungat la 4șC. După resuspendarea peletelor de ADN, c onținutul fiecărui tub
este repartizat în trei tuburi de câte 1,5ml (etichetate anterior), punând câte 50μl din
soluția resuspendată.
Din cele trei tuburi ale unei probe, unul se păstrează la 4șC, iar celelalte două
se congelează ( -20șC – -80șC).

Figura 7. Sedimentarea ADN -ului.

19
II.3. Electroforeza în gel de agaroză cu bromură de etidiu

Electroforeza în gelul de agaroză reprezintă metoda standard de analiză a
acizilor nucleici. Deplasarea moleculelor se face în prezența unui curent electric
(acizii nucleici sunt încărcați negativ datorită prezenței grupărilor fosfat și migrează
spre elect rodul încărcat pozitiv). Mobilitatea electroforetică este influențată de
urmatorii factori: concentrația de agaroză, conformația moleculei de ADN
(monocatenar, bicatenar sau superrasucit), prezența compusului fluorescent în gel,
tamponul utilizat, tipul d e agaroză și voltajul aplicat.
Tehnica se foloseste pentru determinarea purității ADN -ului sau ARN -ului, la
verificarea existenței produșilor rezultați în urma PCR -ului sau la analiza
fragmentelor rezultate dupa clivarea enzimatică (cu ajutorul enzimel or de restrictie)
a ADN -ului.
Fragmentele analizate pot avea marimi între 1000 și 23000 pb (perechi de
baze). Unul dintre avantajele acestei tehnici este acela că ADN -ul nu este denaturat,
păstrându -și intacte elementele structurale. Pentru a evita fragm entarea ulterioară a
ADNului manipularea trebuie facută în așa fel încât să se evite contaminarea cu
amprente, picături, salivă sau microorganisme. Din acest motiv se preferă utilizarea
de materiale sterile (vârfuri, etc). Cele mai folosite sisteme tampon (pH 8) pentru
electroforeza în gelul de agaroză sunt: TAE (Tris -acetat 40 mM, EDTA 1 mM), TBE
(Tris – borat 45 mM, 1 mM EDTA), TPE (Tris -fosfat 90 mM, EDTA 2 mM).
Soluțiile tampon pentru electroforeză se păstrează sub forma unor stocuri
concentrate (10X -50X) și păstrate la temperatura camerei. Tamponul de încărcare are
în componență un colorant (albastru de bromfenol sau rosu de crezol 0,25%) care
permite vizualizarea frontului de migrare și zaharoza (40%) sau glicerină (30%)
pentru a asigura o vâscozitat e corespunzatoare la aplicarea probei. Benzile sunt
vizualizate cu compuși fluorescenți (bromura de etidiu sau SYBR Green) prin iradiere
cu lumin ă UV. Sensibilitatea variaza între 100 pg si 1 ng/band ă. Datorit ă faptului c ă
acești coloran ți se intercaleaz ă între bazele ADN -ului dublu catenar, sensibilitatea
detec ției depinde de lungimea lan țului acizilor nucleici.

20
Mod ul de lucru :

 Se toarn ă gelul (0,3 -3% agaroz ă în TBE; TBE -tampon) în camera de
separare; î n prealabil se plaseaz ă doua di stanța toare din material plastic
care permit delimitarea gelului;
 Se incalzeste amestecul timp de 60 sec la microunde;
 Se răceste soluția la 50 °C (temperatura este controlat ă cu ajutorul unui
termom etru digital) și se adaugă 0,5 µl bromur ă de etidiu 1 mg/ml
(substanță fluorescent ă care se unește î n special cu ADN -ul dublu catenar
permițâ nd vizualizarea fragmentelor de ADN separate);
 Se așează pieptăn ul la o dista nta de 1 cm de camera în care se află așezat
electrodul încă rcat negativ, dup ă care se toarn ă ameste cul răcit la 50 °C și
se așteaptă cca 20 min., timp în care gelul se solidifică (Figura 8);

Figura 8. Gelul de agatoză solidificat .

21
 Se îndepărtează distanțatoarele din plastic și piaptănul.
 Se acopera gelul cu solutie tam pon (TBE) aproximativ 2 -3 mm.
 Se aplic ă probele de analizat (preparate cu soluția tamponului de încărcare)
și probele de referință (amestec de molecule de ADN cu dimensiuni
cunoscute – soluție standard 100 pb ș i 1 Kb) (Figura 9).

Figura 9. Gelul de agaroză cu probele aplicate în elect roforeză.

 Se migrează probele timp de 40 min la 90V ș i 75 mA (Figura 10 ).

22

Figura 10. Benzile de ADN migrate după electroforeză .

 Se îndepartează soluția tampon, se vizualizează benzile separate prin
excita re la 254 nm (la întuneric).

23
Capitolul III . Rezultate și discuții

• Au fost luați în considerare micronucleii care sunt mai mici de 1/5 – 1/20 decât
nucleii, de dimensiuni sferice.
• Nucleii și micronucleii au fost analizați și contorizați în urma observațiilor
făcute la microscopul opti c, la obiectivul cu imersie (x1000).
• S-au obținut poze originale cu preparatele microscopice (Figura 1 1, Figura 1 2,
Figura 1 3, Figura 1 4 și Figura 1 5).
• S-a obținut o frecvență mare de micronuclei în tesutul branhial.
• S-a realizat electroforeza ADN -ului total și s-a observat fragmentarea
nucleară.

Figura 11 . Țesut branhial, lamele branhiale (Carassius gibelio ), x400, colorant
orceină .

24

Figura 1 2. Celule branhiale ș i micronuclei (indicați cu săgeți) (Carassius gibelio ),
x1000 cu ulei de imersie, colorant orceină .

Figura 1 3. Celule branhiale și micronuclei (indicați cu săgeți) (Carassius gibelio ),
x1000 cu ulei de imersie, colorant orceină .

25

Figura 1 4. Celule branhiale, nuclei și m icronuclei (indicați cu săgeți) (Carassius
gibelio .), x1000 cu ulei de imersie, colorant orceină .

26

Figura 1 5. Eritrocite nucleate și m icronucleu (indicat cu săgeată) (Carassius
gibelio ), x1000 cu ulei de imersie, colorant orceină .

27
Frecvența micronucleilor

Din preparatele realizate, s -au viziualizat câte 3 lame și 3 câmpuri vizuale
pentru fiecare individ. S -au contorizat și analizat celulele cu nucleu normal și celulele
cu micronuclei . Toate datele obținute se pot observa în Tabelu l 1.

Tabelul 1. Cuantificarea micronucleilor și nucleilor la specia Carassius gibelio .
Individ Lamă Câmp vizual 1
Nuclei/
Micronuclei Câmp vizual 2
Nuclei/
Micronuclei Câmp vizual 3
Nuclei/
Micronuclei Total
Nuclei Total
micronuclei
Individ
1 Lama 1 68/3 51/3 70/2 189 8
Lama 2 112/6 70/3 75/2 257 11
Lama 3 53/2 46/1 60/2 159 5
Individ
2 Lama 1 61/2 62/2 34/1 156 5
Lama 2 53/2 47/2 31/1 131 5
Lama 3 45/2 68/5 11/0 124 7
Individ
3 Lama 1 82/1 57/3 48/2 187 6
Lama 2 175/8 80/2 132/4 287 14
Lama 3 87/2 86/4 55/3 248 9
Individ
4 Lama 1 76/3 110/1 97/3 281 7
Lama 2 165/3 67/1 150/4 382 8
Lama 3 114/3 63/3 105/4 282 10
Individ
5 Lama 1 64/1 40/0 58/1 162 2
Lama 2 69/2 108/3 80/4 257 9
Lama 3 43/3 64/3 78/4 185 10
Individ
6 Lama 1 71/3 51/2 47/1 169 6
Lama 2 131/4 84/4 46/2 261 10
Lama 3 41/1 34/1 70/3 145 5
Individ
7 Lama 1 62/2 55/1 74/4 191 7
Lama 2 45/3 46/1 23/1 114 5
Lama 3 79/3 68/1 50/3 197 7
Individ
8 Lama 1 60/3 124/4 54/3 238 10
Lama 2 160/3 87/3 96/4 343 10
Lama 3 61/2 36/1 78/3 175 6
Individ
9 Lama 1 135/5 110/9 67/8 312 22
Lama 2 40/1 67/4 52/3 159 8
Lama 3 113/4 67/2 73/2 253 8
Individ
10 Lama 1 47/1 64/1 51/2 162 4
Lama 2 59/1 67/1 50/1 176 3
Lama 3 40/2 91/4 95/5 226 11
Total 6408 238

28
După cuantificarea micronucleilor , s-a realizat frecvența acestora și s -a obținut
o frecvența de 3.71% (Figura 1 6), iar literatura de specialitate se menționează că în
condiții de laborator sub acțiunea unor xenobiotici apar cu o frecvență de 1,8%
(Hayashi et al. ) sau 2,26% ( Cavas ) la Carassius sp .

Figura 1 6. Frecvența micronucleilor la nivelul branhiilor la Carassius gibelio .

29
Extrac ția de ADN total

În urma analizei extracției de ADN și electrofozei în gelul de agaroză (1%) cu
bromură de etidiu, s -a observat că există o fragmentare nucleară mare (Figura 1 7).

Figura 1 7. Fragmentare nucleară în gel de agaroză (1%) cu bromură de etidiu

30
Concluzii

• Rezultatele au arătat că, pe langă aspectele de fragmentare nucleară (care pot
fi datorate și preparării materialului prin tehnica squash), apar cu o frecvenț ă
semnificativă și micronuclei care denotă prezența în apă a unor xenobiotici
care au influențat procesul de r eplicare al ADN -ului și diviziunea celulară.
• S-au obținut poze originale cu micronuclei la specia Carassius gibelio .
• Frecvența micronucleilor este de 3,71%, iar literatura de specialitate
menționează că în condiții de laborator sub acțiunea unor xenobiotici există o
frecvență de 1,8% ( Hayashi et al. ) sau 2,26% ( Cavas ) la specii de Carassius
sp.
• Extracția de ADN total și electroforeza a aratăt că există o fragmentare
nucleară mare .

31
Bibliografie

1. Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith,
J.A., Struhl, K. , 1995 . Protocols in Molecular Biology , 3rd editon., Unit 2.1:
page 2 -3.
2. Bagnyukova, T.V., Storey, K.B., Lushchak, V.I., 2003. Induction of oxidative
stress in Rana ridibunda during recovery from win ter hibernation . J. Therm.
Biol. 28, 21–28.
3. Beal, M.F., 1995. Aging, energy, and oxidative stress in neurodegenerative
diseases . Ann. Neurol. 38, 357 –366.
4. Bespalov, I.A., Bond, J.P., Purmal, A.A., Wallace, S.S., Melamede, R.J., 1999.
Fabs specific for 8 -oxoguanine: control of DNA binding . J. Mol. Biol. 293,
1085 –1095.
5. Binelli, A., Cogni, D., Parolini, M., Riva, C., Provini, A., 2009. In vivo
experiments for the evaluation of genotoxic and cytotoxic effects of triclosan
in Zebra mussel hemocytes . Aquat. Toxi col. 91, 238 –244
6. Bocchetti, R., Lamberti, C.V., Pisanelli, B., Razzetti, E.M., Maggi, C.,
Catalano, B., Sesta, G., Martuccio, G., Gabellini, M., Regoli, F., 2008.
Seasonal variations of exposure biomarkers, oxidative stress responses and
cell damage in the clams. Tapes philippinarum, and mussels, Mytilus
galloprovincialis, from Adriatic sea . Mar. Environ. Res. 66, 24 –26.
7. Bretaud, S., Lee, S., Guo, S., 2004. Sensitivity of zebrafish to environmental
toxins implicated in Parkinson’s disease. Neurotoxicol . Ter atol. 26, 857 –864.
8. Caliani, I., Porcelloni, S., Mori, G., Frenzilli, G., Ferraro, M., Marsili, L.,
Casini, S., Fossi, M.C., 2009. Genotoxic effects of produced waters in
mosquito fish ( Gambusia affinis) . Ecotoxicology 18, 75 –80.
9. Cavalcante, D.G., Martinez, C.B., Sofia, S.H., 2008. Genotoxic effects of
Roundup on the fish Prochilodus lineatus . Mutat. Res. 655, 41 –46.
10. Cavas, T., 2008. In vivo genotoxicity of mercury chloride and lead acetate:
Micronucleus test on acridine orange sta ined fish cells . Ed. Elsevier, Food and
Chemical Toxicology 46, 352 –358.

32
11. Choi, C.Y., An, K.W., An, M.I., 2008. Molecular characterization and mRNA
expression of glutathione peroxidase and glutathione S -transferase during
osmotic stress in olive flounder (P aralichthys olivaceus). Comp. Biochem.
Physiol. A 149, 330 –337.
12. Dykens, J.A., Shick, J.M., Benoit, C., Buettner, G.R., Winston, G.W., 1992.
Oxygen radical production in the sea anemone Anthopleura elegantissima and
its endosymbiotic algae . J. Exp. Biol. 168, 219 –241.
13. F.Ausubel,; Brent, R.; Kingston, R.; Moore, D.; Seidman, J.G.; Smith,
J.;Struhl, K. Short , 1995 . Protocols in Molecular Biology , 3rd editon., Unit
2.1: page 2 -3.
14. Filipak Neto, F., Zanata, S.M., Silva de Assis, H.C., Nakao, L.S., Randi, M.A.,
Oliveira Ribeiro, C.A., 2008. Toxic effects of DDT and methyl mercury on the
hepatocytes from Hoplias malabaricus . Toxicol. In Vitro 22, 1705 –1713.
15. Gielazyn, M.L., Ringwood, A.H., Piegorsch, W.W., Stancyk, S.E., 2003.
Detection of oxidative DNA damage in isolated marine bivalve hemocytes
using the comet assay and formamidopyrimidine glycosylase (Fpg). Mutat.
Res. 542, 15 –22.
16. Grygoryev, D., Moskalenko, O., Zimbrick, J.D., 2008. Non-linear effects in
the formation of DNA damage in medaka fish fibroblast cell s caused by
combined action of cadmium and ionizing radiation . Dose Response 6, 283 –
298.
17. Hai, D.Q., Varga, S.I., Matkovics, B., 1997b. Organophosphate effects on
antioxidant system of carp (Cyprinus carpio) and catfish (Ictalurus
nebulosus) . Comp. Biochem. Physiol. C 117, 83 –88.
18. Harada, T., Yamaguchi, S., Ohtsuka, R., Takeda, M., Fujisawa, H., Yoshida,
T., Enomoto, A., Chiba, Y., Fukumori, J., Kojima, S., Tomiyama, N., Saka,
M., Ozaki, M., Maita, K., 2003. Mechanisms of promotion and progression of
preneopl astic lesions in hepatocarcinogenesis by DDT in F344 rats . Toxicol.
Pathol. 31, 87 –98.

33
19. Hayashi, M., Ueda, T., Uyeno, K., Wada, K., Kinae, N., Saotome, K., Tanaka,
N., Takai, A., Sasaki, Y.F., Asano, N., Sofuni, T., Ojima, Y., 1998.
Development of genotoxi city assay systems that use aquatic organisms . Ed.
Elsevier, Mutation Research 399 , 125–133.
20. Heise, K., Puntarulo, S., Nikinmaa, M., Abele, D., Pörtner, H.O., 2006a.
Oxidative stress during stressful heat exposure and recovery in the North Sea
eelpout Zoarces viviparus L. J. Exp. Biol. 209, 353 –363.
21. Hermes -Lima, M., Storey, J.M., Storey, K.B., 1998. Antioxidant defenses and
metabolic depression. The hypothesis of preparation for oxidative stress in
land snails . Comp. Biochem. Physiol. B 120, 437 –448.
22. Kelly, M.C., White, B., Smyth, M.R., 2008. Separation of oxidatively
damaged DNA nucleobases and nucleosides on packed and monolith C18
columns by HPLC -UV-EC. J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life
Sci. 863, 181 – 186.
23. Liu, Y., Wang, W.N., Wang, A.L., Wang, J.M., Sun, R.Y., 2007. Effects of
dietary vitamin E supplementation on antioxidant enzyme activities in
Litopenaeus vannamei ( Boone, 1931 ) exposed to acute salinity changes .
Aquaculture 265, 351 –358.
24. Lushchak, O.V., Kubrak, O.I., Storey, J.M., Store y, K.B., Lushchak, V.I.,
2009b. Low toxic herbicide Roundup induces mild oxidative stress in goldfish
tissues . Chemosphere 76, 932 –937.
25. Lushchak, V.I., 2010. Aquatic Toxicology, Environmentally induced oxidative
stress in aquatic animals . Ed. Elsevier B.V.
26. Lushchak, V.I., Bagnyukova, T.V., 2006. Effects of different environmental
oxygen levels on free radical processes in fish . Comp. Biochem. Physiol. B
144, 283 – 289.
27. Lushchak, V.I., Bagnyukova, T.V., Husak, V.V., Luzhna, L.I., Lushchak,
O.V., Storey, K.B., 2005a. Hyperoxia results in transient oxidative stress and
an adaptive response by antioxidant enzymes in goldfish tissues . Int. J.
Biochem. Cell Biol. 37, 1670 –1680.

34
28. Lushchak, V.I., Bagnyukova, T.V., Husak, V.V., Luzhna, L.I., Lushchak,
O.V., Storey, K.B ., 2005a. Hyperoxia results in transient oxidative stress and
an adaptive response by antioxidant enzymes in goldfish tissues. Int. J.
Biochem. Cell Biol. 37, 1670 –1680.
29. Lushchak, V.I., Bagnyukova, T.V., Lushchak, O.V., Storey, J.M., Storey,
K.B., 2005b. Hypoxia and recovery perturb free radical processes and
antioxidant potential in common carp (Cyprinus carpio) tissues . Int. J.
Biochem. Cell Biol. 37, 1319 –1330.
30. Lushchak, V.I., Lushchak, L.P., Mota, A.A., Hermes -Lima, M., 2001.
Oxidative stress and antiox idant defenses in goldfish Carassius auratus during
anoxia and reoxygenation . Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 280,
100–107.
31. Malek, R.L., Sajadi, H., Abraham, J., Grundy, M.A., Gerhard, G.S., 2004. The
effects of temperature reduction on gene expression and oxidative stress in
skeletal muscle from adult zebrafish . Comp. Biochem. Physiol. C 138, 363 –
373.
32. Malins, D.C., Polissar, N.L., Garner, M.M., Gunselman, S.J., 1996. Mutagenic
DNA base modifications are correlated with lesions in nonneoplasti c hepatic
tissue of the English sole carcinogenesis model . Cancer Res. 56, 5563 –5565.
33. Markert, B.A., Breure, A.M., Zechmeister, H.G., 2003 . Bioindicators &
Biomonitors, Principles, Concepts and Applications . Ed. Elsevier Science Ltd.
34. Martínez -Alvarez, R.M. , Hidalgo, M.C., Domezain, A., Morales, A.E.,
García -Gallego, M., Sanz, A., 2002. Physiological changes of sturgeon
Acipenser naccarii caused by increasing environmental salinity . J. Exp. Biol.
205, 3699 –3706.
35. Niyogi, S., Biswas, S., Sarker, S., Datta, A.G ., 2001. Seasonal variation of
antioxidant and biotransformation enzymes in barnacle, Balanus balanoides,
and their relation with polyaromatic hydrocarbons . Mar. Environ. Res. 52,
13–26.

35
36. Oehlers, L.P., Perez, A.N., Walter, R.B., 2007. Detection of hypoxia -related
proteins in medaka (Oryzias latipes) brain tissue by difference gel
electrophoresis and de novo sequencing of 4 -sulfophenyl isothiocyanate –
derivatized peptides by matrix -assisted laser desorption/ionization time -of-
flight mass spectrometry . Comp. Biochem. Physiol. C 145, 120 –133.
37. Olsvik, P.A., Kristensen, T., Waagbø, R., Rosseland, B.O., Tollefsen, K.E.,
Baeverfjord, G., Berntssen, M.H., 2005 . mRNA expression of antioxidant
enzymes (SOD, CAT and GSH -Px) and lipid peroxidative stress in liver of
Atlantic salmon (Salmo salar) exposed to hyperoxic water during
smoltification . Comp. Biochem. Physiol. C 141, 314 –323.
38. Parihar, M.S., Dubey, A.K., 1995. Lipid peroxidation and ascorbic acid status
in respiratory organs of male and female freshwater catfish Heteropneustes
fossilis exposed to temperature increase . Comp. Biochem. Physiol. C 112,
309–313.
39. Parvez, S., Raisuddin, S., 2006. Effects of paraquat on the freshwater fish
Channa punctata (Bloch): non -enzymatic antioxidants as biomarkers of
exposure . Arch . Environ. Contam. Toxicol. 50, 392 –397.
40. Pena -Llopis, S., Ferrando, M.D., Pena, J.B., 2003. Increased recovery of brain
acetylcholinesterase activity in dichlorvos -intoxicated European eels Anguilla
anguilla by bath treatment with N -acetylcysteine . Dis. Aq uat. Organ. 55, 237 –
245.
41. Pena -Llopis, S., Pena, J.B., Sancho, E., Fernandez -Vega, C., Ferrando, M.D.,
2001. Glutathione -dependent resistance of the European eel Anguilla anguilla
to the herbicide molinate . Chemosphere 45, 671 –681.
42. Petridis, P., Jha, A.N., Langston, W.J., 2009. Measurements of the genotoxic
potential of (xeno -) oestrogens in the bivalve mollusc Scrobicularia plana,
using the Comet assay . Aquat. Toxicol. 94 (1), 8 –15.
43. Rickwood, D., Hames, B.D.,1984. Gel electrophoresis of nucleic acids:a
practical approach . IRL Press, Oxford.

36
44. Ruiz -Leal, M., George, S., 2004 . An in vitro procedure for evaluation of early
stage oxidative stress in an established fish cell line applied to investigation
of PHAH and pesticide toxicity. Mar. Environ. Res. 58, 631 –635.
45. Sabzar, A.D. , Abdul, R.Y., Masood -ul-Hassan, B., Farooq, A. G.,
Farooz, A.B., 2014. Investigation of the genotoxicity of endosulfan to
freshwater Cyprinid fish Crucian carp (Carassius carassius L.) using the
micronucleus and chromosomal aberration as biomarkers. Ed. Archana
Sharma Foundation of Calcutta.
46. Salas -Leiton, E., Cánovas -Conesa, B., Zerolo, R., López -Barea, J., Ca˜navate,
J.P., Alhama, J., 2009. Proteomics of juvenile senegal sole (Solea
senegalensis) affected by gas bubble disease in hyperoxygenated ponds . Mar.
Biotechnol. 11, 473 –487.
47. Shih, T.M., McDonough, J.H., 1997. Neuroche mical mechanisms in soman –
induced seizures . J. Appl. Toxicol. 17, 255 –264.
48. Song, S.B., Xu, Y., Zhou, B.S., 2006. Effects of hexachlorobenzene on
antioxidant status of liver and brain of common carp (Cyprinus carpio ).
Chemosphere 65, 699 –706.
49. Stephensen, E. , Sturve, J., Förlin, L., 2002. Effects of redox cycling compounds
on glutathione content and activity of glutathione -related enzymes in rainbow
trout liver . Comp. Biochem. Physiol. C 133, 435 –442.
50. Thomaz, J.M., Martins, N.D., Monteiro, D.A., Rantin, F.T., Kalinin, A.L.,
2009. Cardiorespiratory function and oxidative stress biomarkers in Nile
tilapia exposed to the organophosphate insecticide trichlorfon (NEGUVON) .
Ecotoxicol. Environ. Saf. 72, 1413 –1424.
51. Toyoizumi, T., Deguchi, Y., Masuda, S., Kinae, N., 2 008. Genotoxicity and
estrogenic activity of 3,3 _-dinitrobisphenol A in goldfish . Biosci. Biotechnol.
Biochem. 72, 2118 –2123.
52. Verlecar, X.N., Jena, K.B., Chainy, G.B., 2007. Biochemical markers of
oxidative stress in Perna viridis exposed to mercury and te mperature . Chem.
-Biol. Interact. 167, 219 –226.

37
53. Viarengo, A., Canesi, L., Garcia Martinez, P., Peters, L.D., Livingstone, D.R.,
1995. Prooxidant processes and antioxidant defence systems in the tissues of
the Antarctic scallop (Adamussium colbecki) compare d with the
Mediterranean scallop (Pecten jacobaeus). Comp. Biochem. Physiol. B 111,
119–126.
54. Vidal, M.L., Bassères, A., Narbonne, J.F., 2002. Influence of temperature, pH,
oxygenation, water -type and substrate on biomarker responses in the
freshwater clam Corbicula fluminea (Müller). Comp. Biochem. Physiol. C
132, 93 –104.
55. Weili Cai, Ye Jin, Jack Girton, Jorgen Johansen, and Kristen M. Johansen,
2010. Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for
Antibody Labeling. Journal of Visualized Experiments , (36): 1748.