Electroforeza proteinelor serice este o metodă de separare și cuantificare a [619485]

Electroforeza proteinelor serice este o metodă de separare și cuantificare a
proteinelor serice pe baza proprietăților lor fizice, cu o mare aplicabilitate clinică, fiind
utilă în evaluarea unor patologii diverse: inflamații acute și cronice, boli maligne,
afecțiuni hepatice, afecțiuni renale, etc.[1]
Când proteinele migrează întru -un câmp electric, deplasarea pe traseul electroforeric
și poziția benzilor rezultate în urma migrării proteinelor depinde de doi factori cheie: pH –
ul izoelectric a protei nei și pH -ul tamponului de migrare. În urma migrării în camp
electric, pe traseul electroforetic se descriu 5 fracțiuni: albumina, alfa -1, alfa -2, beta si
gama.[1].
Proteinograma este o investigție de rutină, relativ ieftină, foarte utilă în depistarea u nor
patologii cronice. Una din indicațiile efectuării proteinogramei are în vedere bolnavii
diagnosticați cu mielom multiplu, macroglobulinemie Waldenström sau amiloidoză. În
cazul acestora, valoarea proteinelor monoclonale de obicei depășește 3 g/dl, și se
recomandă efectuarea proteinogramei o dată la 1 -2 luni.[2]
Efectuarea proteinogramei este de asemenea utilă pentru pacienții ce acuză dureri ale
spatelui, bolnavi ce suferă de osteoporoză sau de neuropatii periferice sau cei care au
VSH-ul crescut. Ele ctroforeza proteinelor serice este utilă de asemenea pentru
evaluarea bolnavului cronic ce suferă de hipoalbuminemie, gamopatie policlonală, pod
beta-gama, ciroză hepatică, ciroza biliară primară.[3]

1. Proprietățile fizico -chimice ale proteinelor

1.1. Punctul izoelectric al proteinelor

Majoritatea proteinelor sunt electroliți amfoteri, având atât proprietăți ale bazelor, cât
și ale acizilor. În fiecare proteină există numeroase grupări aminice și carboxilice libere,
aparținând aminoacizilor diamino monocarboxilici, respectiv celor
monoaminodicarboxilici. În cursul titrării unei proteine, există o valoare de pH la care
încărcatura aparentă este zero, și anume punctul izoelectric al proteinei. Acesta se
evidențiază experimental prin lipsa migrării în câmpul electric. La punctul izoelectric,
sarcina netă a moleculei proteice este nulă , iar solubilitatea proteinei este minimă [4].

1.2. Migrarea în camp electric

Din cauza numărului mare de sarcini purtate, proteinele sunt polielectroliți . În câmp
electric ionii se vor deplasa spre polul de semn contrar, fenomen numit electroforeză
[5].

1.3 . Funcția tampon a proteinelor

Proteinele, ca și aminoacizii, au capacitate tampon datorită existenței grupărilor
aminice (slab acide) protonate și a grupărilor carboxilice (slab acide) disociate.
Sistemele tampon realizate de proteine sunt foarte sensibile și eficiente. Astfel, circa
38% din capacitatea de tamponare a plasmei sanguine este asigurată de
hemoglobină.[6]

2. Electroforeza proteinelor serice

2.1. Generalități privind electroforeza proteinelor serice

Electroforeza este o metodă de separare a proteinelor bazată pe proprietățile
fizico -chimice ale acestora. Serul este aplicat pe un mediu specific, și este supusă
ulterior acțiunii curentului electric. Proprietăți precum încărcătura electrică (pozitivă s au
negativă), forma și mărimea proteinei stau la baza separării electroforetice a proteinelor
serice. Pe baza acestei comportǎri, dacǎ un amestec de proteine este plasat într -un
câmp electric, proteinele cu sarcinǎ negativǎ migreazǎ spre anod, cele cu sarc inǎ
pozitivǎ spre catod, iar cele pentru care pH -ul soluției de migrare reprezintǎ tocmai pH
izoelectric vor rǎmâne pe linia de start [7].
Există numeroase tehnici de separare electroforetică a proteinelor, acestea
diferențiindu -se unele de altele prin me toda folosită. Proteinele sunt colorate și se
apreciază semicantitativ prin densitometrie.. Separarea ulterioară a subclaselor de
proteine se realizează prin marcajul lor cu anticorpi monoclonali (tehnicile de
imunofluorescenta și imunofixare). [7]. Sepa rarea electroforetică cu succes a proteinelor
din ser sau alte compartimente se bazează pe eterogenitatea încarcaturii moleculelor
[8].

2.2. Primele tehnici de migrare în câmp electric a proteinelor serice

Analiza proteinelor în scopuri clinice a început la mijlocul secolului 19. Schmidt a
folosit termenul de globuline pentru a descrie proteine ce nu au solubilitate bună la apă.
La începutul secolului 20, proteinele au fost împărțite în albumină și globuline. [9]
Această clasificare avea la bază precipitarea globulinelor la adăugarea sulfatului de
sodiu peste proteinele serice. În urma acestui proces rezultă un reziduu de culoare
albă, descris ulterior ca și albumină, după ce sarea era îndepărtată prin dializă si apa se
evapora. Mult timp raportu l albumina -globuline a fost un mod de de evaluare a
patologiei ficatului [9].
Mobilitatea electroforetică proteinelor, ce implică un mediu lichid, a fost pentru prima
dată studiată de către Arne Tiselius în 1930. Pentru aceste studii, Tiselius a concep ut
pentru prima dată o celulă de migrare a proteinelor în forma de ‘U’. Aceasta tehnică a

reprezentat primul pas pentru definirea principalelor fracțiuni proteice din serul uman:
albumina, alfa1, alfa 2, beta și gama globuline[10].

2.3 Albumina

Album ina este sintetizată de celulele parenchimului hepatic și reprezintă cel mai
important component proteic din plasmă, lichidul cefalorahidian și urină. Rolul principal
al albuminei este de proteină cărăus, dar mai îndeplinește și alte funcții, precum
mențin erea presiunii osmotice [10].
Prin tehnica de electroforeză în gel de agaroză valoarea fracțiunii albuminei variază
substanțial în funcție de afinitatea proteinelor transportate de albumină și a albuminei
față de colorantul aplicat [11].
Creșteri ale valo rii albuminei se datorează de cele mai multe ori deshidratării. În
schimb, scăderea cantității acestei proteine are multiple cauze. Creșterea altor fracțiuni
precum alfa, beta și gama duc la scăderea falsă a valorii albuminei, aceasta ramânând
în realitate în parametrii normali.
Scăderea albuminei fără modifcarea majoră a altor fracțiuni este asco ciată cu
malnutriție sau sindroamele nefrotice ( albumina se pierde prin urină). Astfel, albumina
constituie un indicator global al stării de nutriție a organismului, în special la persoanele
vârstnice cu diverse afecțiuni cronice [12].
Modificări ale aspe ctului albuminei în graficul electroforetic includ modificări în partea
anodală a prealbuminei, având ca efect divizarea fracțiunii de albumină în 2 fracțiuni .
Această modificare se traduce în bisalbuminemie. Aceasta este o afecțiune genetică
codominantă autosomală, relativ rară, ce presupune modificari ușoare în secvența de
aminoacizi a albuminei, ce duce la aspectul divizat al albuminei în electroforeza capilară
[12]. Componenta anormală a albuminei poate fi localizată la catod sau la anod.
Localizarea l a catod a fracțiunii este ascociată cu o hiperlipidemie masivă,
hiperbilirubinemie, ciroză [13].

2.4. Fracțiunea alfa

În fracțiunea alfa migrează proteinele de fază acută. Aceste proteine cresc de la 50%
la 300% în inflamația acută și scad dramatic în hepatita acută, afecțiuni cronice ale
ficatului sau pierderea severă de proteine. Fracțiunea alfa se împarte în alfa -1 globulin e
și alfa -2 globulin e [14].
Scăderi ale fracțiunii alfa -1 s-au asociat cu deficiența de alfa -1-antiptripisna, o
deficiența în sin tetizarea de globuline datorată unor afecțiuni ale ficatului. Alți
constituenți ai acestei fracțiuni sunt thyroid -binding globulinele și transcortina. Creșteri
ale acestei fracțiuni se observă în mare parte în inflamația acută, afecțiuni maligne,
alcoolis mul cronic sau a unor afecțiuni autoimmune precum lupusul eritematos
sistemic . Modificările fiziologice ale alfa1 globulinei își au de cele mai multe originea în
variația fenotipică a alfa -1 antitripsinei [15].
Ceruloplasmina, alfa -2-macroglobulina și ha ptoglobulina sunt principalii constituenti
ai fracțiunii alfa -2. Creșterii ale alfa -2 globulinei sunt asociate cu reacțiile de fază
acută.[15]
Alfa-2 macroglobulina este un inhibitor endoproteazic cu spectru larg, putând inactiva
aproape toate tipurile de serin -, tiol -, metal – și carboxil proteaze. Această
macroglobulină este componentul major al fracțiunii alfa -2. Enzimele se leagă și
clivează regiunea „momeală” formându -se astfel un complex covalent în care alfa -2
macroglobulina suferă o modificare conf ormațională formând alfa -2 macroglobulina
activată care se leagă de receptorii specifici de pe macrofage. Alfa -2 macroglobulina
crește în sindromul nefrotic, ceea ce se caracterizează prin pierderea prin urină a
proteinelor cu greutate moleculară mare, pr ecum albumina. Astfel, alfa -2
macroglobulina suferă creșterii semnificative , compensând pierderea albuminei, și
contribuind astfel la menținerea presiunii osmotice [16].
Haptoglobulina leagă hemoglobina liberă, inhibând activitatea sa oxidativă. În urma
hemolizei se eliberează hemoglobină liberă, ce este legată de către haptogloblină.
Complexul haptoglobină -hemoglobină este îndepărtat de către sistemul
reticuloendotelial. Haptoglobulina se găsește la majoritatea mamiferelor și este produsă
de către celule le hepatice. Haptoglobulina este o proteină de fază acută, ceea ce
explică creșterea sa în procese inflamatorii precum infecții, arsuri, alergii, etc.[17]

2.5 Fracțiunea beta

Fracțiunea beta se poate subampărti în beta 1 și beta 2. Fracțiunea beta 1 este
compusă în mare parte din transferină, iar beta 2 conține beta -lipoproteine, IgA, IgM și
uneori și IgG, împreună cu proteinele complement -în funcție de tehnica utilizată.[18]
Scăderi ale fracțiunii beta s -au desc ris în afecțiunile autoimune, în glomerulonefrită
membranoproliferativă ce cauzează consumarea proteinelor complement. Creșterea
acestei fracțiuni este prezentă atunci când se înregistrează creșterea IgA sau are loc o
reacție de fază acută. Astfel, în ca zul în care fracțiunea beta -2 este mai crescută
comparativ cu fracțiunea beta 1, se recomandă testarea probei respective prin tehnici
de imunofixare și gamopatie monoclonală [18].
Modificări ale fracțiunii beta s -au înregistrat la pacienții ce urmeaza un tratament cu
heparină sau cei cu dializă, probele provenite de la aceștia necoagulându -se complet.
Fibinogenul se gasește în plasmă, dar lipsește în ser. Dacă se lucrează din ser se
evidentiaza o bandă care reprezinta fibrinogenul, între fracțiunea beta și cea a gama
globulinei, mimând astfel prezența unei proteine monoclonale. Alte false modificări ale
fracțiunii beta se datorează unor substanțe exogene, precum tratamentul cu antibiotice
sau radioterapia. [19].
Proteinele monoclonale în regiunea beta s unt de cele mai multe ori de tipul IgA sau
lanțuri ușoare libere. Astfel în cazul proteinelor monoclonale, IgA migrează de cele mai
multe ori în interzona beta -gama. [20].

2.6. Fracțiunea gama

Această fracțiune prezintă un mare interes din punct de vedere clinic, datorită
frecvenței gradientelor monoclonale. Imunoglobulinele sunt în mare parte singurele
proteine prezente în fracțiunea gama [20].
Hipogamaglobulinemia se traduce în scăderea imunoglobulinelor din ser, în mare
parte IgG. O scădere a pro ducției de anticorpi la un răspuns antigenc este asociată cu
afecțiuni hematologice sau autoimune, precum și deficiențe imune, care se manifestă

prin infecții recurente. Cauzele cel mai frecvent întâlnite ale deficiențelor imune sunt
reprezentate de agamag lobulinemia X -linkată sau deficiența de IgA [21]
Creșteri ale fracțiunii gama – hipergamaglobulinemiile pot fi întalnite în inflamații
cronice, boli autoimune, afecțiuni hepatice sau boli maligne (boala Hodkins), în
limfoame maligne, leucemii limfoide cron ice, mielom multiplu) și în amiloidoză.[21]
Gamopatiile monoclonale se caracterizează prin sinteza unei cantități importante de
imunoglobuline perfect identice din punct de vedere structural și funcțional, numite
paraproteine. Aceste paraproteine rezultă î n urma activității secretorii a plasmocitelor,
transformate malign. Pe electroforeză, prezența acestor paraproteine se traduce prin
apariția unor vârfuri (peack -uri) – benzi proteice formate din imunglobulinele care au
mobilități electroforetice identice. [21, 22]

3. Proteinograma în patologie

3.1. Proteinograma în mielomul multiplu

Mielomul multiplu se caracterizează prin proliferarea malignă a plasmocitelor în
măduva osoasă. În această formă de cancer se observă creșterea anormală a unui tip
de imunoglobulină. Imunoglobulina secretată în exces se poate observa pe traseul

electrofore tic prin prezența unui benzi suplimentare în zona gama (dar poate migra
pana la fractiunea alfa -2) sub formă de gradient monoclonal .[22, 23]
Electroforeza proteinelor serice este un punct de plecare pentru depistarea multor
patologii, printer care și mielomul multiplu. În acestă boală malignă, o atenție
suplimentară se acordă zonei gama din traseul proteinogramei. Această fracțiune este
compusă în mare parte din imunoglobuline, mai exact A, M și G . Clasa
imunoglobulinelor monoclonale poate fi stabilită relativ riguros cu ajutorul localizării
acestora. Astfel, Ig A este poziționată în zona gama 2 -3, Ig M în gama 1 și Ig G în gama
3. Gamopatia policlonală presupune o creștere uniformă a zonei gama,ceea ce apare
de obicei ca și răspuns . [24]

3.2. Prote inograma în sindromul inflamator cronic

O caracteristică comună a traseelor electroforetice din sindromul inflamator cronic
este prezența hipergamaglobulinemiei policlonale. [25]
La pacienții cu sindrom inflamator cronic s -a observant creșterea f racțiunii alfa -2 și
fracțiunii gama, precum și scăderea albuminei. Creșterea policlonală a
imunoglobulinelor este asociată cu inflamația cronică. Astfel, creșterea policlonală a
gama – globulinelor cu fracțiuni suplimentare oligoclonale în zona gama sugerea ză o
inflamație cronică. Fra cțiunile suplimentare oligoclonale sunt specifice pacienților cu
compexe imune circulante/boli autoimune. În timpul proliferării oligoclonale a celulelor B
datorate unei inflamații cronice, de exemplu, clonele rezultate în urma proliferării nu
ating simultan concentrații egale, înregistrându -se astfel, pe traseul electroforetic, mai
multe peak -uri.[26]

3.3. Proteinograma în sindromul inflamator acut

În cazul bolnavilor cu sindrom inflamator acut, s -au înregistrat concentrații ridicate
pentru un grup de proteine sintetizate de hepatocite, numite reactanții de fază acută.
Acestea sunt însoțite de manifestări clinice precum leucocitoză sau febră. Astfel , o data
cu creșterea concentrației acestor proteine, are loc concomitent scăderea concentrației

altor proteine.. Hipoalbuminemia este asociată cu inflamația acută, însoțită de creșterea
alfa-1 globuline lor și alfa -2 globulin elor. Reactanți i de fază acută precum C3, proteina C
reactivă sau amiloidul A, deși își măresc considerabil concentrația în ser, nu au efecte
dramatice asupra traseului electroforetic, concentrațiile lor fiind prea scăzute.[27]
Modificarile pattern -ului sintetic al ficatului în inflamaț iile acute se realizează sub efectul
IL-6.[28]
În cazul pacienților cu afecțiuni inflamatorii s -a observant creșterea fracțiunii alfa din
proteinogramă. În inflamația acută fra cțiunile alfa -1 si alfa -2 sunt crescute.[28].
Fracțiunea alfa -1 este constituită din alfa -1 antitripisină în proporție de 90 %. Aceasta
este un reactant de fază acută, iar concentrațiile sale cresc în sindromul inflamator acut.
În inflamația acută, alfa -2 macroglobulina și haptoglobulina au valori crescute, acestea
migrând în zona fracțiunii alfa -2.[29]

3.4. Proteinograma în sindromul nefrotic

Sindromul nefrotic se caracterizează prin distrugerea nefronului și pierderea, prin
urmare, a proteinelor prin urină. Albumina, alfa -1 glicoproteina, alfa -1 antitripsina,
transfe rina sunt proteine de dimensiuni mari care se pierd în urină prin afectarea
glomeruluil renal. La acești bolnavi, este prezenta și hipoalbuminemia, datorită pierderii
ei prin urină. [30]
Astfel, pierderea albuminei și a altor proteine prin urină are ca și consecință sinteza
crescută de proteine precum alfa -2 macroglobulina și beta -lipoproteina. Acestea fiind
proteine de dimensiuni relativ mari, nu trec cu o ușor prin filtrul renal, conseciința fiind
creșterea fracțiunii alfa -2 pe traseul electroforeic . Hipercolesterolemia este de
asemenea frecventă în cazul bolnavilor cu sindrom nefrotic, ca urmare a sintetizării în
exces a beta -lipoproteinei.[31]

3.5. Proteinograma în ciroza hepatică
Modificările electroforetice la bolnavii cu ciroză hepatica au în vedere în primul rând
scăderea concentrației proteinelor sintetizate de ficat ca urmare a distrugerii
hepatocitelor. Astfel se poate observa la acești bolnavi hipoalbuminemia, scăderea

hapto globulinei și cel mai reprezentativ pentru acești bolnavi este prezența podului
beta-gama .[31]
Podul beta – gama în ciroză rezultă din creșterea policlonală a concentrației de Ig A,
aceasta migrând din regiunea gama, mascând astfel zona fracțiunii beta. Astfel o
concetrație crescută de Ig A este frecvent întalnită la pacienții cu ciroză.
Cauza hipergamaglobulinemiei este și creșterea policlonală considerabilă și a Ig G și Ig
M, completând astfel și formarea podului beta -gama. [31]

3.6. Markerii inflam atori și importanța dozării acestora

Proteina C reactivă este o proteină sintezată de hepatocite, care migrează în zona
fracțiunii gama pe traseul electroforetic. Concentrația acesteia în ser crește ca și
răspuns la procesele inflamatorii acute, pro ducția sa hepatică și a celorlalte proteine de
fază acută ( 1-antitripsina, 1-glicoproteina acidă, haptoglobina, ceruloplasmina,
fibrinogenul) fiind stimulate de interleukina -6, factorul de necroză tumorala (TNF),
interferonii alfa și beta, precum și factorul de activare plachetara (PAF). Transferina va
fi înglobată de macrofage, iar C3 se consuma de cele mai multe ori.[32]
Proteina C reactivă își marește concentrația în ser de la 100 până la 1000 de ori,
reprezentând fidel procesul inflamator. PCR -ul este o opsonină, facilitând endocitoza
bacteriană.[32]
Viteza de sedimentare a hematiilor este utilă în dignosticul clinic al inflamației,
creșterea sa fiind atribuită concentrației crescute a unor proteine plasmatice precum
fibrinogenul sau imunoglobulinele. Spre deosebire de proteina C reactivă, VSH -ul crește
la un timp mai îndelungat de la instalarea inflamației.[33]
În special infecț iile acute, dar și cele cronice sunt asociate cu leucocitoză în sângele
periferic. Fenomenul leucocitozei este asociat cu infecțiile, acestea migrând din
circulație în țesuturi.[33]